KR20140005956A

KR20140005956A - 조혈 줄기세포의 생착을 강화하기 위한 방법

Info

Publication number: KR20140005956A
Application number: KR1020137021164A
Authority: KR
Inventors: 마이클 프레이스무스; 에바-마리아 제베딘-브란들; 크리스티안 베르크마이어; 필자 후세인
Original assignee: 에스씨아이팜 에스에이알엘
Priority date: 2011-01-13
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2014-01-15
Also published as: BR112013017878A2; CN103379907A; JP6110309B2; PT2663313T; EP2663313B1; EP2663313A1; CN103379907B; CA2824113A1; AU2012206517A1; NZ612450A; CL2013002034A1; KR101950526B1; UA113284C2; JP2014507409A; CA2824113C; BR112013017878A8; BR112013017878B1; IL227331A0; AU2012206517B2; US20130344038A1

Abstract

본 발명은 조혈 줄기세포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계 및 프로스타사이클린 유사체와 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계, 상기 세포에서 G 알파_s-시그널링을 자극하기에 충분한 기간 동안 상기 혼합물을 인큐베이션시키는 단계, 및 선택적으로 상기 자극된 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 생체외 전처리에 의해 조혈 줄기세포의 생착(engraftment)을 강화하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
추가적으로, 조혈 줄기세포 이식이 진행중인 개인의 치료에 사용하기 위한 트레프로스티닐을 포함하는 조성물이 제공된다.

Description

조혈 줄기세포의 생착을 강화하기 위한 방법{Method for enhancing engraftment of haematopoetic stem cells}

본 발명은 조혈 줄기세포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계, 프로스타사이클린 유사체와 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계, 상기 세포에서 G 알파_s-시그널링을 자극하기에 충분한 기간 동안 상기 혼합물을 인큐베이션시키는 단계, 및 선택적으로 상기 자극된 세포를 분리하는 단계를 포함하는 생체외 전처리에 의해 조혈 줄기세포의 생착(engraftment)을 강화하기 위한 신규한 방법을 제공한다.

추가적으로, 조혈 줄기세포 이식이 진행중인 개인의 치료에서 사용하기 위한 트레프로스티닐(Treprostinil)을 포함하는 조성물이 제공된다.

조혈 줄기세포(HSC)는 개인의 일생에 걸쳐서 모든 혈액 생성물을 재생하여 자손 분화로 그들의 자가-재생의 균형을 잡을 수 있는 원시 세포이다. HSC는 발달 동안 위치 내에서의 이행 및 포유동물의 일생에 걸친 순환에 의해, 혈류의 안/밖으로 이동하여 귀소(homing), 생착 및 체류(retention)의 순차적 단계로 골수 미세환경(niche)과 연계한다. 귀소는 공여자 줄기세포가 골수로 그들의 길을 찾아감에 의한 과정이며, 줄기세포의 생착은 골수에서 그들의 성장을 의미한다.

조혈 줄기세포는 이식체 수용자에서 혈액 및 면역 세포를 회복시키는 이들의 능력의 결과로서 치료적 효력을 가진다. 더불어, HSC는 뇌, 근육, 간과 같은 다른 조직을 위한 세포를 생성하는 효력을 가진다. 인간 자가 및 동종 골수 이식 방법은 백혈병, 림프종과 같은 질환 및 다른 생명을 위협하는 질환을 위한 치료요법으로서 현재 사용된다. 이들 절차를 위해서는, 생착을 위해 충분한 HSC의 존재를 보장하도록 위한 다량의 공여자 골수가 분리되어야만 한다.

조혈 줄기세포는 골수 미세환경을 조성하기 위해 Gα_s-형질도입된 시그널을 필요로 한다(1). 최근의 이들 발견은 Gα_s의 활성화가 조혈 줄기세포의 생존 및 분화를 촉진함을 보여주었던 이전의 시험관내 실험을 확증한다(2, 3). Gα_s는막-결합 포유동물 아데닐일 사이클라제의 모든 9개 이소형을 자극하는 헤테로트라이머 G 단백질의 α-서브유닛에 결합하는 구아닌 뉴클레오티드이다. Gα_s는 콜레라 톡신으로 세포를 처리함으로써 생체외/시험관 내에서 구성적으로 활성화될 수 있는데, 이는 콜레라 톡신 APD-리보실레이트 촉매적 아르기닌 잔기(R¹⁸⁶ ^/187/201/202, 아르기닌의 정확한 숫자는 Gα_s의 스플라이스 변이체에 의존함); 온전한 아르기닌 잔기가 GTP-가수분해 및 Gα_s의 결과적인 불활성화를 위해 필요하기 때문이다(4). 증강된 생착은 실제로 콜레라 톡신을 이용한 조혈 줄기세포의 전처리 이후 관찰될 수 있다: 줄기세포 제제가 콜레라 톡신으로 전처리 되었을 경우, 골수에서 약 2배 만큼의 (Lin^-) 전구 세포가 존재하였다(1).

그러나, 골수 이식이 진행중인 환자를 위한 줄기세포 제제의 경우에, 콜레라 톡신은 매우 불리할 수 있다. 콜레라 톡신(CT), 특히 이의 비-독성 B 서브유닛 오량체 모이어티(CTB)는 생체내 및 시험관내 둘 모두에서 강한 면역조절성 특성을 갖는 점막성 보조제이며, 가장 강력한 점막성 면역원 중 하나이다. 콜레라 톡신 및 CTB는 강한 장내 IgA 항체 반응 및 장기간 면역 기억을 자극한다. 이를 기반으로, CTB는 장독소생성 대장균(E. coli)에 기인한 콜레라 및 설사에 대해 최근 개발된 경구 백신에 중요한 성분이 되었다. CT 및 CTB의 강한 면역원성은 장내 점막성 표면 상의 수용체에 결합하는 이들의 능력에 의해 잘 설명될 수 있다.

추가적으로, 감염의 자연 경과 동안에 톡신 분자의 오량체 부분 B는 장내 상피 세포의 표면에 결합하며 A 서브유닛과 함께 빠르게 흡수(endocytose)된다. 일단 흡수되면, 촉매적으로 활성인 A-서브유닛은 오량체 부분 B로부터 박리되고 B-서브유닛에 의해 형성된 기공에 의해 세포로 진입한다. 일단 세포 내에 있게 되면, 이는 헤테로트라이머성 G 단백질의 Gs 알파 서브유닛을 리보실화(ribosylate)시키고, 구성적인 cAMP 생산을 초래한다. 결국 이는 소장의 루멘으로 H₂O, Na⁺, K⁺, Cl^-, 및 HCO₃ ^-의 분비를 유도하며, 빠른 탈수 및 콜레라와 관련된 다른 인자를 유도한다. 정맥내 주사되는 경우, 콜레라 톡신은 대부분의 세포에 의해 취해진다(혈액 뇌 장벽과 같은 세포만이 특정한 장벽에 의해 보호됨). 따라서, 이는 대부분의 신체 세포에서 cAMP를 증가시키고, 광범위한 부작용(빈맥 내지 혈관확장, 근육 떨림, 과혈당 등에 이름)을 야기한다.

따라서, 이들 효과는 조혈 줄기세포의 자극과 관련하여 콜레라 톡신을 인간에 대해 사용하는 것을 실현불가능하게 한다.

그러나 줄기세포 자극의 치료적 적절성은 이종 골수 이식(즉, 면역적합성 공여자로부터 수집된 조혈 줄기세포)이 진행중인 경우 중요하고 백혈병을 앓고 있는 사람의 치료, 혈액 세포 구획에 유전적 결함(예컨대, 지중해 빈혈과 같은 혈색소병증; 호중구성 과립구 기능의 결함 등)이 있는 사람의 치료를 위해 사용되는 표준 절차이다.

자가 골수 이식이 세포 독성 약물의 치료 용량 범위(therapeutic window)를 증가시켜, 고용량 강도 화학요법을 가능하게 하는데, 사용되는 표준 절차이기 때문에 또한 중요하다(5,6).

조혈 줄기세포는 모든 4개의 프로스타글란딘 E 수용체를 발현한다(EP1-4). (디메틸화된) 프로스타글란딘 E2로의 조혈 줄기세포의 전처리는 이의 생착을 강화시킨다(7,8). 이 효과는 정규적 Gα_s-의존적인 시그널링에 의해 매개되며, 단백질 키나아제 A(PKA)의 cAMP-유도된 활성화가 Wnt-의존적인 시그널과 상승작용하여 β-카테닌(9)을 안정화시킨다.

자가 골수(BM) 단핵 세포(MNC)의 이식은 Otsuka 등에 따른 토끼 모델에서 베라프로스트 나트륨에 의해 강화될 수 있었다. 상기 연구의 목적은 말초신경 및 심근허혈에서 동맥 발달을 지지하는 것이었다. 그러나, 조혈 줄기세포는 골수 세포 내 특정한 유형의 세포이다(16).

줄기세포 치료요법과 약물학적 치료의 병용은 Madonna 등에 의해 기술되어 있으며, 여기서 프로스타사이클린은 관상동맥내 투여 이후 ADSC 심근성 생착에서 시험된다(17).

Ishii M. 등은 프로스타사이클린의 서방성 방출이 중간엽 줄기세포의 전혈관형성 기능 및 허혈 조직에서 근육 세포 성장을 강화시켰음을 개시한다(18).

국제 출원 공개 WO2006/017169은 특히 프로스타사이클린-유사체를 함유할 수 있는 조직 성장을 조절하기 위한 생체적합성 코팅을 갖는 이식성 센서를 기술한다.

인간 THP1 세포에서 조직 인자, 종양 괴사 인자 및 인터류킨-1의 합성에 대한 시카프로스트(Cicaprost) 또는 일로프로스트(Iloprost)의 억제 효과는 Crutchley D. 등에 의해 기술된다(19).

이식 후 줄기세포의 국소화는 이식 성공의 중요한 결정요인이다. 현재는, 대량의 줄기세포가 이식을 위해 필요한데, 이는 줄기세포가 골수에서 성공적으로 생착되지 않고, 장기간의 골수 무형성증이 성숙한 혈액 세포의 감소를 초래하기 때문이다.

따라서 골수 이식이 진행중인 개체의 골수 미세환경으로 분리된 HSC의 귀소, 생착 및 체류를 증가시키기 위해 HSC를 자극하는 방법 및 조성물을 제공하기 위한 필요성은 여전히 충족되지 않고 있다.

이 문제점은 본 발명의 구현예에 의해 해결된다.

예를 들어, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 베라프로스트(Beraprost) 및 시카프로스트와 같은 합성적 프로스타사이클린 I2(PGI₂) 유사체가 골수에서 줄기세포의 증가된 생착을 초래하는 조혈 줄기세포에서의 cAMP 수준을 증가시킬 수 있음이 놀랍게도 밝혀졌다.

트레프로스티닐과 같은 프로스타사이클린 유사체는 프로스타글란딘 E2에 비해 하기의 다양한 장점을 제공한다:

(i) 이는 EP2-및 EP4-수용체도 자극하는 프로스타사이클린/PGI₂의 안정한 유사체이다(10). 따라서 이는 cAMP 축적을 억제하는 억제성 EP₃-수용체와 연계하지 않으면서 다중 G_s-결합 수용체를 자극하기 위한 효력을 가진다. 후자의 경우, 디메틸-PGE₂는완전 작용제(full agonist)이다(1). 반대로, 트레프로스티닐은 EP3-수용체에 대해 단지 낮은 친화성 작용제이다.

(ii) 트레프로스티닐, 일로프로스트, 베라프로스트 및 시카프로스트는 천연 프로스타사이클린 보다 대사적으로 더 안정적이기 때문에, 생체내 적용되는 경우, 이들은 더 오래 지속되는 효과를 발휘하여 더욱 효과적인 골수 생착을 지지할 수 있다.

(iii) 프로스타사이클린 유사체, 구체적으로 트레프로스티닐, 일로프로스트, 베라프로스트 및 시카프로스트의 지연/반복된 투여는 잘 용인된다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 생체외 전처리에 의해 조혈 줄기세포의 생착을 강화하기 위한 신규한 방법을 제공한다:

a. 조혈 줄기세포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계,

b. 적어도 하나의 프로스타사이클린 유사체와 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계,

c. 상기 세포에서 G 알파_s-시그널링을 자극하기에 충분한 기간 동안 상기 혼합물을 인큐베이션시키는 단계, 및 선택적으로

d. 상기 자극된 세포를 분리하는 단계.

본 발명의 구현예에 따르면, 프로스타사이클린 유사체는 트레프로스티닐, 일로프로스트, 시카프로스트 및 베라프로스트 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 군으로부터 선택된다.

본 발명의 방법에 따르면, 자극 및 비자극된 줄기세포의 혼합물이 또한 제공될 수 있다.

구체적으로, 샘플은 골수이다. 줄기세포는 일반적으로 임의의 알려진 근원일 수 있으며, 구체적으로 줄기세포는 말초 혈액, 제대혈 또는 골수로부터 분리된 HSC일 수 있다.

본 발명에 따르면, 트레프로스티닐은 산 유도체, 전구약물, 다형체 또는 이성체의 군으로부터 선택되는 유도체일 수 있다.

유사하게, 일로프로스트, 시카프로스트 또는 베라프로스트는 산 유도체, 다형체 또는 이들로부터의 이성체의 군으로부터의 유도체일 수 있다.

본 발명의 대안적인 구현예에 따르면, 샘플은 적어도 바람직하게는 콜레라 톡신 및 포스콜린으로부터 선택되는 비특이적 cAMP 활성화 작용제와 함께 적어도 하나의 프로스타사이클린 유사체와 혼합될 수 있다.

본 발명의 구체적 구현예에 따르면, 프로스타사이클린 유사체를 포함하는 조성물이 조혈 줄기세포 이식이 진행중 일 수 있는 골수 질환을 앓고 있는 개인의 치료에 사용하기 위해 제공된다.

본 발명의 구체적 구현예에 따르면, 본 조성물의 프로스타사이클린 유사체는 트레프로스티닐, 일로프로스트, 시카프로스트 또는 베라프로스트 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 군으로부터 선택된다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 조성물은 트레프로스티닐을 포함한다.

구체적으로, 개인은 백혈병, 혈액 세포 구획의 결함, 화학요법 또는 방사선 조사 이후 골수이식을 앓고 있다.

본 발명의 추가적인 구현예에 따르면, 혈액 세포 구획의 결함은 혈색소병증 또는 호중구성 과립구 기능의 결함이다.

본 발명의 조성물은 골수 이식 이후 적어도 7일 동안 프로스타사이클린 유사체를 투여함으로써 조혈 줄기세포 이식이 진행중인 골수 질환을 앓고 있는 개인의 치료를 위해 또한 사용될 수 있다. 구체적으로, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 시카프로스트 및 베라프로스트의 군으로부터 선택되는 프로스타사이클린 유사체, 더욱 바람직하게는 트레프로스티닐이 사용된다.

추가적인 구현예에 따르면, 프로스타사이클린 유사체 및 자극된 조혈 줄기세포를 포함하는 조성물이 제공된다.

추가적인 구현예에 따르면, 트레프로스티닐 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염 및 자극된 조혈 줄기세포를 포함하는 조성물이 제공된다.

구체적으로 동물 또는 동물 연구에서 사용하기 위해, 본 발명의 조성물은 포스콜린 또는 콜레라 톡신을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 기술 분야에 알려진 모든 경로에 의해 투여될 수 있으며, 구체적으로 이는 정맥내 또는 피하 투여용으로 제조된다.

프로스타사이클린 유사체는 서방성 방출 형태, 정제 또는 캡슐의 군으로부터 선택되는 경구적으로 이용가능한 형태로 제공될 수 있다.

프로스타사이클린 유사체의 양은 치료적 적용 또는 자극된 HSC를 제조하기 위한 방법에 따라 달라진다. 더욱 구체적으로, 치료적 적용의 경우, 트레프로스티닐의 효과적인 양은 적어도 1.0 ng/kg 체중이다.

도 1: 자기 비드에 의해 유지된 Lin⁺세포 집단의 특성. x-축(APC-C7-A로 표지됨)은 다음의 계통 마커에 대하여 지시된 항체의 혼합물에 의해 기록된 형광을 나타낸다: T-세포에 대하여 CD3ε, B-세포에 대하여 CD45R(=B220), 골수(단핵구/과립구) 계통에 대하여 CD11b 및 Ly-6G/Ly-6C (Gr-1), 적혈구 계통에 대하여 Ter-119. y-축은 쥐 줄기세포 인자 수용체 c-kit에 대한 항체에 대해 기록된 형광이다. 좌측 상부 4분면(c-Kit+ 및 계통 마커-음성 세포로 표기)에서는 세포의 고갈이 명백하다.
도 2: 자기 버드에 결합하지 않았던 Lin^-세포 집단의 특성. 도 1에서와 같이, x-축(APC-C7-A로 표지됨)은 다음의 계통 마커에 대하여 지시된 항체의 혼합물에 의해 기록된 형광을 나타낸다: T-세포에 대하여 CD3ε, B-세포에 대하여 CD45R(=B220), 골수(단핵구/과립구) 계통에 대하여 CD11b 및 Ly-6G/Ly-6C(Gr-1), 적혈구 계통에 대하여 Ter-119. y-축은 쥐 줄기세포 인자 수용체 c-kit에 대한 항체에 대해 기록된 형광이다. 하부 4분면(c-Kit-음성 및 계통 마커-양성 세포로 표기)에서는 세포의 고갈이 보이고, 세포는 c-Kit-양성 및 계통 마커-음성 세포가 예상되는 좌측 상부 4분면에서 대개 발견되는 것이 명백하다.
도 3은 Sca-1 및 c-Kit의 존재에 대한 Lin⁺(도 3A) 및 Lin^- 세포 집단(도 3B)의 특성을 보여준다. 패널 3A 및 3B는 자기 비드 상에 유지된 세포를 보여주며(도 1에서 특성화됨) 이는 통과액(flow through)에서 나타났다(도 2에서 특성화됨). 이들을 방법 항목에서 명시된 바와 같이 염색하였고, c-Kit(PerCP-Cy5-5-A, y-축) 및 Sca-1(PE-Cy7-A, x-축)의 존재에 대해 동시 분석하였다. 패널 A에서 분석된 계통 양성 세포가 좌 하부 4분면에서 발견되는데, 즉 이는 c-Kit 및 sSca-1 둘 다가 없는 것임이 명백하다. 대조적으로, 패널 B에서 세포는 대개 상부 4분면 내에 존재하며, 즉 세포는 조혈 줄기세포 집단 및 비-수임(non-committed) 전구세포에 대해 예상된 바와 같이 높은 수준의 c-Kit(좌 상부 4분면) 또는 c-Kit 및 Sca-1(우 상부 4분면) 둘 모두를 가진다.
도 4: 포스콜린, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 베라포스트 또는 포스콜린 및 프로스타노이드의 조합에 의한 자극 이후 (Lin^-, c-Kit⁺, Sca-1⁺) 조혈 줄기세포에서 사이클릭 AMP 축적. Lin^- 세포(7*10⁵/분석)를 방법에서 명시한 바와 같이 [³H]아데닌의 존재하에 인큐베이션시켜 아데노신 뉴클레오티드 풀(pool)을 대사적으로 사전-표지시켰다. 세포를 표시된 화합물의 부재(좌측 컬럼 0으로 표지됨) 및 존재 하에서 인큐베이션시켰다. 축적된 [³H]cAMP는 Dowex AG50-X8 및 알루미나 컬럼 상에서 순차적 크로마토그래피에 의해 정제하였고, 액체 섬광 계수법으로 정량화하였다. 데이터는 평균±S.D.이다(n=4).
도 5: (Lin^-, c-Kit⁺, Sca-1⁺) 조혈 줄기세포에서 트레프로스티닐-유도된 cAMP 축적에 대한 농도-반응 곡선. 분석 조건은 도 4에 대한 설명에서 명시된 바와 같았다. 데이터는 평균±S.D.이다(n=2).
도 6. 트레프로스티닐을 이용한 조혈 줄기세포의 생체외 처리는 치사적으로 방사선 조사된 마우스에서 골수의 강화된 생착을 유도한다. 도 3에서와 같이 준비된 조혈 줄기세포를 방법 항목에서 명시된 바와 같이 표시된 화합물(FSK, 포스콜린)으로 전처리하였다. 백혈구 계수는 FACS에 의해 측정하였다. 검사한 동물의 숫자를 나타내었다.
도 7: 골수 이식 이후 16주째에 Ly5.2 및 Ly5.1 양성 혈액 세포의 비율. Ly5.1 세포는 CTX 또는 트레프로스티닐 및 포스콜린으로 전처리하였다.
도 8: 골수 이식 이후 16주째에 Ly5.2 및 Ly5.1 양성 혈액 세포의 비율. Ly5.2 세포는 CTX 또는 트레프로스티닐 및 포스콜린으로 전처리하였다.

골수 환경으로 HSC의 귀소 및 생착을 증가시키기 위해 제공되는 방법 및 수단은 강한 생물학 및 의학적 영향(implication)을 가진다. 현재 다수의 줄기세포가 임상 이식에서 필요하기 때문에 이식 후 줄기세포의 국소화는 임상 절차에서 아주 중요하며, 따라서 다수의 공여자 세포가 필요하게 된다. 이런 방법은 또한 상당한 수의 자가 공여자 이식물이 불충분한 수의 줄기세포, 또는 HSC를 함유하기 때문에 매우 유용하다. 유사하게, 환자는 종종 조직 적합성이 있는 공여자를 찾지 못하는데, 이는 성공적인 이식을 위해 필요한 HSC의 숫자를 감소시키는 방법 및 조성물의 필요성을 강조한다. 시험관내 또는 생체외에서 HSC의 귀소 및 생착을 향상시키기 위한 능력은 공여자로부터 더 적은 세포의 수집을 가능하게 하므로, 이에 따라 골수/말초 줄기세포 수확과 관련된 시간 및 불편감을 감소시키고, 자발적인 HSC 공여자의 풀(pool)을 증가시킨다.

따라서 본 발명은 a) 조혈 줄기세포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계, b) 적어도 하나의 프로스타사이클린 유사체와 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계, c) 상기 세포에서 G 알파_s-시그널링을 자극하기에 충분한 기간 동안 상기 혼합물을 인큐베이션시키는 단계, d) 상기 자극된 세포를 분리하거나 차후에 사용, 예를 들면 치료 또는 이식을 위해 상기 자극된 세포를 함유하는 상기 혼합물을 사용하는 단계를 포함하는, HSC의 생체외 전처리에 의해 HSC의 생착을 강화하는 신규한 방법을 제공한다.

구체적으로, 프로스타사이클린 유사체는 트레프로스티닐, 일로프로스트, 베라프로스트 및 시카프로스트 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 군으로부터 선택된다.

트레프로스티닐은 프로스타사이클린의 합성 유사체이다. 트레프로스티닐은 레모듈린^TM(Remodulin^TM)으로 시판된다.트레프로스티닐은 (1R,2R,3aS,9aS)-[[2,3,3a,4,9,9a-헥사하이드로-2-하이드록시-1-[(3S)-3-하이드록시옥틸]-1H-벤즈[f]인델-5-일]옥시]아세트산 일나트륨 염이다.

일로프로스트는 "일로메딘(Ilomedine)"으로 시판되며 5-{(E)-(1S,5S,6R,7R)-7-하이드록시-6[(E)-(3S,4RS)-3-하이드록시-4-메틸-1-옥텐-6-이닐]-바이-사이클로[3.3.0]옥탄-3-일리덴}펜탄산이다.

베라프로스트는 2,3,3a,8b-테트라하이드로-2-하이드록시-1-(3-하이드록시-4-메틸-1-옥텐-6-이닐)-1H-사이클로펜타(b)벤조푸란-5-부탄산이다.

시카프로스트는 2-[(2E)-2-[(3aS,4S,5R,6aS)-5-하이드록시-4-[(3S,4S)-3-하이드록시-4-메틸노나-1,6-디이닐]-3,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로-1H-펜탈렌-2-이리덴]에톡시]아세트산이다.

본 발명의 구현예에 따르면, 적어도 2개, 구체적으로 적어도 3개의 상이한 프로스타사이클린 유사체가 상기 방법을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 또는 그 이상의 상이한 프로스타사이클린 유사체가 상기 방법을 위해 사용될 수 있다.

이 방법은, 개인에게 직접적으로 투여될 수 있고, 대량의 비선별적 cAMP 활성화 작용제로 인해 임의의 원하지 않는 부작용을 보이지 않는 자극된 줄기세포를 용이하게 제공한다.

본 발명의 추가적인 구현예에 따르면, 하기의 단계를 포함하는 생체외 전처리에 의해 조혈 줄기세포의 생착을 강화하기 위한 방법이 제공된다:

a. 조혈 줄기세포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계,

b. 프로스타사이클린 유사체 및 포스콜린을 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계,

d. 상기 자극된 세포를 분리하는 단계, 및 선택적으로

e. 상기 자극된 세포를 정제 및/또는 농축하는 단계.

본 발명의 특정한 구현예에 따르면, 프로스타사이클린 유사체 및 포스콜린의 비율은 약 1:3일 수 있다. 포스콜린 및 프로스타사이클린 유사체로 처리된 HSC는 재이식되기 전에 정제될 수 있지만, 소량의 포스콜린이 존재할 수 있으나, 임의의 부정적인 부작용을 야기하지 않을 수 있기 때문에, 이들 HSC는 또한 추가의 정제 단계 없이 재-이식될 수 있다

대안적으로, 일로프로스트, 베라프로스트 또는 시카프로스트 중 하나와 트레프로스티닐의 조합이 줄기세포에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 트레프로스티닐은 하나 이상, 예를 들면, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 다른 프로스타사이클린 유사체, 예를 들면, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 일로프로스트, 베라프로스트 또는 시카프로스트 또는 이들의 생리학적으로 허용가능한 염과 조합하여 혼합될 수 있다.

동물 연구 또는 동물의 치료에서 사용하기 위한 특정한 구현예에 따르면, 포스콜린 및/또는 콜레라 톡신과 같은 cAMP 인핸서는 인큐베이션 전에 HSC 또는 HSC/트레프로스티닐, 일로프로스트, 시카프로스트 또는 베라프로스트 혼합물에 추가적으로 혼합될 수 있다.

상기 세포에서 G 알파_s-시그널링을 자극하기 위해 필요한 기간은 알려진 방법에 따라, 예를 들면 많은 변형이 있는 다음의 cAMP 측정법을 사용하여 측정될 수 있다: RIA, 형광 공명 에너지 변화기(FRET)와 EPAC(epac1)의 병용(Ponsiouen B. et al., EMBO reports, 5, 12, 1176-1180 (2004)), 방사화학적 방법 등. G 알파_s-시그널링이 발생하는 자극된 세포는 FRET-기반 cAMP 리포터와 같은 본 기술 분야에 알려진 방법에 의해 비자극된 세포로부터 선별 또는 구별 또는 분리될 수 있다.

본 발명의 구현예에 따르면, 인큐베이션 시간은 약 1 내지 60분, 바람직하게는 약 2 내지 30분이다.

cAMP-의존적 경로는 조혈 줄기세포의 생착을 촉진하기 위해 필수적인 경로이다. 프로스타사이클린 유사체가 조혈 줄기세포에서 cAMP 상승을 촉발할 수 있음이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. 이는 다중 수용체, 즉 IP- 및 EP-수용체를 자극함으로써 이루어지고, 이에 따라 증가된 G 알파_s-시그널링으로 이어진다. 따라서, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 시카프로스트 또는 베라프로스트와 같은 프로스타사이클린 유사체는 cAMP 수준을 더욱 효과적으로 높인다. 매우 특정한 구현예에 따르면, 트레포스티닐은 본 발명의 방법에 따라 사용된 바람직한 프로스타사이클린 유사체이다.

대안적으로, 본 발명의 특정한 방법 및 조성물에서, 사이클릭 AMP(cAMP) 인핸서 또는 프로스타글란딘 EP 수용체에 대한 리간드로부터 선택되는 적어도 하나의 제제가 또한 첨가될 수 있다. cAMP 인핸서의 예는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 본 기술 분야에 알려진 것들 중에서 인큐베이션 전에 줄기세포 또는 줄기세포/트레프로스티닐 또는 줄기세포/트레프로스티닐, 일로프로스트, 시카프로스트 및/또는 베라프로스트 혼합물로 첨가될 수 있는 디부티릴 cAMP(DBcAMP), 포르볼 에스테르, 포스콜린, 스클라레린, 8-브로모-cAMP, 콜레라 톡신(CT), 아미노필린, 2,4 디니트로페놀(DNP), 노르에피네프린, 에피네프린, 이소프로테네롤, 이소부틸메틸-잔틴(IBMX), 카페인, 테오필린(디메틸잔틴), 도파민, 로리프램, 프로스타글란딘 E₁, 프로스타글란딘 E₂, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩티드(PACAP), 및 혈관활성 장관 폴리펩티드(VIP)를 포함한다. cAMP 인핸서의 예는 cAMP 및 cAMP의 유사체, 그 중에서도, 예컨대 sp-5,6-DCl-BIMPS (BIMPS)를 또한 포함한다.

본 발명의 특정한 구현예에 따르면, 포스콜린 및/또는 콜레라 톡신 또는 콜레라 톡신의 A 서브유닛이 인큐베이션 전에 줄기세포 또는 줄기세포/트레프로스티닐 혼합물에 추가적으로 혼합될 수 있다.

특정한 구현예에서, 상기 cAMP 인핸서는 동물 세포의 줄기세포 치료를 수행하기 위해 또는 줄기세포 생착의 관점에서 동물 연구를 수행하기 위해 사용된다.

프로스타사이클린 유사체와 관련하여, 본 발명에 따른 용어 "프로스타사이클린 유사체"는 또한 상기 물질의 유도체 및 유사체를 포함한다.

용어 "유사체" 또는 "유도체"는 다른 화학 물질과 구조 및 기능이 유사한 화학 분자에 관한 것으로, 종종 구조적으로 단일 요소 또는 기가 상이하며, 이는 모 화합물과 동일한 기능을 유지하는 경우 하나 이상의 기(예컨대, 2개, 3개, 또는 4개의 기)의 변형에 의해 달라질 수 있다. 이러한 변형은 숙련가에게 통상적이며, 예를 들면 첨가 또는 치환된 화학적 모이어티, 예컨대 산의 에스테르 또는 아미드, 알코올 또는 티올에 대한 벤질기와 같은 보호기, 및 아민에 대한 tert-부톡실카르보닐기를 포함한다. 또한 알킬 치환(예컨대, 메틸, 디메틸, 에틸, 등)과 같은 알킬 측쇄에 대한 변형, 측쇄의 포화 또는 불포화 수준에 대한 변형, 및 치환된 페닐 및 페녹시와 같은 변형된 기의 첨가가 포함된다. 유도체는 또한 비오틴 또는 아비딘 부분과 같은 결합체, 호스래디쉬 퍼록사이드 등과 같은 효소, 방사선 표지된, 생물발광, 화학발광, 또는 형광 부분을 포함한다. 추가로, 모이어티는 본 명세서에 기술된 제제에 첨가되어 이들의 바람직한 특성들 중에서 생체내 또는 생체외 반감기의 증가, 이들의 세포 통과 특성 증가와 같은 약동학적 특성을 변경시킬 수 있다. 약물의 다양한 바람직한 품질(예컨대, 가용성, 생체이용률, 생산성, 등)을 강화시키는 것으로 알려진 전구 약물이 또한 포함된다.

용어 "유도체"는 그의 범주내에 기능적으로 등가물이거나 기능적으로 개선된 분자를 위해 제공되는 첨가, 결실, 및/또는 치환을 포함하는 모 서열에 대하여 만들어진 이의 변형을 또한 포함한다.

본 발명의 특정한 구현예에 따르면, 트레프로스티닐 유도체는 트레프로스티닐의 산 유도체, 트레프로스티닐의 전구약물, 트레프로스티닐의 다형체 또는 트레프로스티닐의 이성체의 군으로부터 선택된다.

유사하게, 일로프로스트, 시카프로스트 또는 베라프로스트는 그들로부터의 산 유도체, 전구약물, 다형체 또는 이형체의 군으로부터의 유도체일 수 있다.

용어 "조혈 줄기세포"(HSC) 또는 더 일반적인 용어 "줄기세포"는 본 발명의 상세한 설명에서 등가의 용어로 이해되며, 일반적으로 골수(예컨대, 단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거대핵세포/혈소판, 수지상 세포), 및 림프구 계통(예컨대, T-세포, B-세포, NK-세포), 및 본 기술분야에 알려진 다른 것들을 포함하는 혈액 세포 유형을 발생시킬 수 있는 분화다능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) "줄기세포" 중 하나에 관한 것이다. "줄기세포"는 일반적으로 다중 세포 유형(즉, 다능성이 됨)을 형성하기 위한 이의 능력 및 자가 재생에 대한 이의 능력을 특징으로 한다. 그러나, 올리고능성(oligopotent) 및 단분화능성 전구세포가 또한 포함될 수 있다. "조혈"은 일반적으로 세포 분화의 과정 또는 HSC로부터 특정화된 혈액 세포의 형성에 관한 것이다. 발달 동안에, 조혈은 태아 간으로부터 골수로 전위하며, 이후 골수는 성인기 내내 조혈 부위로 남아있게 된다. 일단 골수에서 확립되면, HSC는 골강(bone cavity) 도처에 무작위적으로 분배되지 않는다. 오히려, HSC는 내골성 표면에 인접한 곳에서 전형적으로 발견된다. 성숙한 줄기세포의 숫자가 증가할수록 골 표면으로부터의 거리가 증가한다.

조혈 조직은 수임된 다능성, 올리고능성, 및 단분화능성 전구세포, 뿐만아니라, 장기간 및 단기간 재생 능력을 갖는 세포를 포함한다.

HSC를 특이적으로 함유하는 샘플은 골수일 수 있다.

HSC는 HSC를 함유하는 것으로 알려진 임의의 근원으로부터, 구체적으로 탯줄 또는 제대혈, 태반 및 골수로부터 공지 기술에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, 동물의 태아 간, 태아 비장 및 대동맥-생식선-중신(aorta-gonad-mesonephros)이 또한 가능하다. 인간 기원으로부터의 HSC는 본 발명의 방법 및 조성물을 위해 바람직하다.

예를 들면, HSC는 대퇴골, 고관절, 늑골, 흉골 및 다른 골을 포함하는 인간의 골수에서 발견될 수 있다. HSC는 골수 구획으로부터 세포가 방출되도록 유도하는 G-CSF(과립구 콜로니-자극 인자)와 같은 사이토카인으로 전-처리 후 바늘 및 시린지를 사용하여 고관절로부터, 또는 혈액으로부터 제거함으로써 직접적으로 수득될 수 있다.

HSC는 특정한 표현형 또는 유전자형 마커에 따라 확인될 수 있다. 예를 들면, HSC는 이의 작은 크기, 계통(lin) 마커의 부재, 로다민 123 (rho¹⁰) 또는 훽스트 33342와 같은 바이탈 염료로의 낮은 염색(측면 집단), 이의 표면 상에 다양한 항원성 마커의 존재에 의해 확인될 수 있으며, 이들 중 많은 것은 분화 시리즈의 클러스터(예컨대, CD5, CD11b, CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, GR-1(=Ly-6G/C), 7-4, Ter-119 및 c-kit)에 속한다. HSC는 주로 음성이다. 전형적으로 계통 수임(lineage commitment)을 검출하기 위해 사용되는 마커에 대하여 음성이므로, 종종 lin(-) 세포로서 지칭된다. 대부분의 인간 HSC는 CD5⁺, CD45R (B220)⁺, CD11⁺, GR-1⁺, CD34⁺, CD59⁺, Thyl/CD90⁺,CD38^lo ^/~, C-kit/CD117⁺, 및 lin(^-)로서 특징지어질 수 있다. 그러나, 특정한 HSC는 CD347⁺ 및 CD38⁺이기 때문에, 모든 줄기세포가 이들 조합에 의해 포함되는 것은 아니다. 또한 일부 연구는 가장 최초의 줄기세포가 세포 표면 상에 c-kit 결여일 수 있음을 제안한다.

유동 세포분석법 또는 FACS에 의한 lin(-) HSC의 정제를 위해, 예를 들면, 본 기술 분야에 알려진 것들 중에서, CD3엡실론, CD5, CD45R, CD11b, CD16, GR-1, 7-4 및 Ter-119, CD 13, CD32 및 CD33, CD71, CD 19, CD61, Mac-1(CDl lb/CD18), Gr-I, 117Ra, CD3, CD4, CD5, 및 CD8에 대한 항체들을 포함하는, 성숙한 혈액-계통 마커 항체의 어레이가 lin(+) 세포 또는 후기 다능성 전구세포(MPP)를 고갈시키기 위해 사용될 수 있다. 추가적인 정제 방법, 예를 들면 세포 표면 분자의 '시그널링 림프구 활성화 분자'(SLAM) 패밀리의 특별한 서명(signature)을 사용하는 방법이 본 기술 분야에 알려져 있다.

제대혈, 골수, 말초 혈액 유래이든 다른 근원 유래이든, HSC는 혈청과 함께 또는 혈청 없이 임의의 적합한 상업적으로 입수가능하거나 상용화된 배지에서 자라게 하거나 증량시킬 수 있다. 인간 근원으로부터의 HSC는 본 발명의 바람직한 구현예이다. 예를 들면, 특정한 구현예에서, 무혈청 배지는 알부민 및/또는 트랜스페린을 활용할 수 있다. 추가로, 사이토카인에는 그 중에서도, Flt-3 리간드, 줄기세포 인자(SCF), 및 트롬보포이에틴(TPO) 같은 것들이 포함될 수 있다. HSC는 또한 생물반응기와 같은 용기 내에서 자라게 할 수 있다. HSC의 생체외 신장을 위해 적합한 배지는 HSC 뿐만 아니라 이의 자손의 시험관내, 생체외, 및 생체내 유지, 성장 및 분화를 지지하는 것으로 나타났고, 예를 들어 림프 조직의 분해로부터 유래될 수 있는 기질 세포(예컨대, 림프세망 기질 세포)와 같은 HSC 지지 세포를 또한 포함할 수 있다.

"제대혈(cord blood)" 또는 "탯줄혈액(umbilical cord blood)"은 일반적으로 신생아 순환으로 돌아가는 신생아 유래의 비교적 적은 양(대략 180 ml 이하)의 혈액을 나타낸다. 제대혈은 HSC에 풍부하고 본 기술분야의 공지 기술에 따라 수확되어 차후 사용을 위해 저장될 수 있다.

용어 "생체외" 또는 "시험관내"는 바람직하게는 천연 조건의 최소한의 변형을 갖는, 유기체 외부의 인공적 환경에서 살아있는 조직 내에 또는 조직 상에 행해진 실험 또는 측정과 같은 유기체 외부에서 발생하는 활동을 지칭한다. 특정한 구현예에서, 이러한 조직 또는 세포는 생체외 치료를 위해 수집되고, 냉동되어, 이후에 해동될 수 있다. 살아있는 세포 또는 조직을 사용하는 수일보다 더 오래 지속되는 조직 배양 실험 또는 절차는 전형적으로 "시험관내"인 것으로 고려되지만, 이 용어는 생체외와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상술한 "생체외 투여", "생체외 치료" 또는 "생체외 치료적 사용"은 일반적으로 하나 이상의 장기, 세포, 또는 조직이 살아있거나 최근 사망한 개체로부터 수득되고, 선택적으로 정제/농축되며, 줄기 세포를 치료하기 위한 치료 또는 절차(예컨대, HSC의 생착 능력을 강화시키기 위한 본 발명의 조성물과 함께 세포를 인큐베이션시키는 것을 수반하는 생체외 투여 단계)에 노출된 후, 그 선택적 치료 또는 절차 이후에 동일하거나 상이한 살아있는 개체로 투여되는 의학적 절차를 나타낸다.

이러한 생체외 치료적 적용은 기관, 세포, 또는 조직의 투여 이후 본 발명의 조성물을 살아있는 개체로 1회 이상 투여하는 것과 같은 선택적인 생체내 치료 또는 절차적 단계를 또한 포함할 수 있다. 국소 및 전신 투여 모두는 본 기술 분야의 잘 알려진 기술에 따라서, 이들 구현예를 위해 고려된다. 트레프로스티닐의 양 또는 선택적으로 개체로 투여되는 추가적인 제제와 함께 트레프로스티닐 및 자극된 줄기 세포를 함유하는 혼합물의 양은 일반 건강, 연령, 성별, 체중, 및 약물에 대한 내성, 뿐만 아니라 트레프로스티닐 및/또는 세포 이식에 대한 반응의 정도, 중증도, 및 유형과 같은 개체의 특징에 의존한다.

본 발명의 특정한 구현예에 따르면, 조혈 줄기세포 이식이 진행중인 개인의 치료에 사용하기 위한 프로스타사이클린 유사체를 포함하는 조성물이 제공된다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 조성물은 트레프로스티닐, 일로프로스트, 시카프로스트 및 베라프로스트 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 군으로부터 선택되는 프로스타사이클린 유사체를 포함하며, 더욱 구체적으로 트레프로스티닐을 포함한다.

본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 일로프로스트, 시카프로스트 또는 베라프로스트와 함께 트레프로스티닐을 포함한다. 대안적으로, 조성물은 하나 이상의 트레프로스티닐, 시카프로스트 또는 베라프로스트 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염과 조합하여 일로프로스트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 하나 이상의 레프로스티닐, 시카프로스트 또는 일로프로스트 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염과 조합하여 베라프로스트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 하나 이상의 트레프로스티닐, 베라프로스트 또는 일로프로스트 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염과 조합하여 시카프로스트를 포함할 수 있다.

상기 개체는 임의의 골수 질환, 정상 골수가 즉 혈액 세포 및 혈액 혈소판의 생산 감소를 초래하는 악성 종양, 재생불량성 빈혈, 또는 감염에 의해 변위되는 질환을 앓고 있을 수 있다. 상기 골수 질환은 예를 들면 백혈병, 혈액 세포 구획의 결함 또는 화학요법 또는 방사선조사 치료 이후 골수 이식이 필요한 것일 수 있다.

더욱 구체적으로, 혈액 세포 구획의 결함은 지중해빈혈과 같은 혈색소병증 또는 호중구성 과립구 기능의 결함 또는 호중구성 과립구 기능의 결함일 수 있다.

예를 들면 화학요법 또는 방사선조사에 기인한 골수 질환을 앓고 있기 때문에, 골수 이식 이후 제한된 기간 동안 적어도 하나의 프로스타사이클린 유사체의 투여를 통해서 조혈 줄기세포 이식이 진행중인 개인의 치료를 위한 사용이 또한 본 발명에 포함된다.

적어도 하나의 프로스타사이클린 유사체, 하나 이상, 구체적으로 둘, 더욱 구체적으로 세개의 cAMP 인핸서와 함께 적어도 하나의 프로스타사이클린 유사체 또는 적어도 하나, 구체적으로 둘, 더욱 구체적으로 세개의 프로스타사이클린 유사체 및 자극된 줄기세포와 선택적으로 하나 이상의 cAMP 인핸서와 같은 추가적인 제제를 포함하는 혼합물을 사용하는 골수 이식이 진행중인 개체의 치료가 또한 본 발명에 포함된다.

더욱 구체적으로, cAMP 인핸서는 포스콜린일 수 있다.

적어도 하나의 프로스타사이클린 유사체는 HSC를 사용하는 골수 이식 동안에 또는 골수의 재구성 시에 인간 HSC의 생착을 강화하기 위해 사용될 수 있다. 가속화된 생착은 개체가 잠재적인 치사적 감염, 출혈 및 다른 심각한 합병증에 걸리기 쉬운 기간을 단축시킨다. 따라서, 프로스타사이클린 유사체는 (즉, 필요한 세포의 숫자를 감소시키고 골수 무형성증의 지속기간을 단축시킴으로써) 골수 생착을 강화하기 위해 공여자 골수를 전처리하기에 유용한 치료적 옵션이어야 한다.

구체적으로, 프로스타사이클린 유사체는 트레프로스티닐, 일로프로스트, 시카프로스트 또는 베라프로스트 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 군으로부터 선택된다. 더욱 구체적으로, 트레프로스티닐은 사용되기에 바람직한 프로스타사이클린 유사체이다.

골수 이식 이후에 수일 동안 프로스타사이클린 유사체로 개체의 지속적 처리는 생착을 개선시킴으로써(즉, 필요한 세포의 숫자를 감소시키고 골수 무형성증의 지속기간을 단축시킴으로써) 개선된 임상 결과를 이끌어내야 한다.

따라서, 특정한 구현예에 따르면, 처리는 이식 이후 적어도 5일, 더욱 구체적으로 적어도 10일 동안, 더욱 구체적으로 이식 이후 적어도 14일 동안 수행된다.

본 발명의 대안적인 구현예에 따르면, 하나 이상의 프로스타사이클린 유사체 및 자극된 조혈 줄기세포를 포함하는 조성물이 포함된다.

대안적으로, 특정한 구현예에서, 프로스타글란딘 EP 수용체에 대한 사이클릭 AMP(cAMP) 인핸서 또는 리간드로부터 선택되는 제제가 조성물에 첨가될 수 있다. 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 또한 포스콜린을 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 조성물은 약학적 조성물이다. 본 기술 분야에 알려진 추가적인 약학적으로 허용가능한 부형제가 상기 조성물 내에 함유될 수 있다.

프로스타사이클린 유사체의 양은 자극된 HSC를 제조하기 위한 치료 또는 방법에 좌우된다. 아주 구체적으로, 치료적 적용을 위해, 트레프로스티닐의 유효량은 적어도 1.0 ng/kg 체중이다.

본 발명의 조성물은 적용가능하며 본 기술 분야에 알려져 있는 임의의 방식에 의해 개체로 투여될 수 있다. 더욱 구체적으로, 정맥내 또는 피하 투여가 제공된다.

상기 조성물은 서방성 방출 형태, 정제 및 캡슐의 군으로부터 선택되는 경구적으로 이용가능한 형태일 수 있다.

전술한 설명은 다음의 실시예를 참조하여 더욱 온전히 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 단지 본 발명의 하나 이상의 구현예를 실시하기 위한 방법을 나타내는 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

실시예:

실시예 1

재료 및 방법

골수 줄기세포의 분리

10마리의 마우스(C57BL/6)를 경추 파열법으로 희생시켰다. 뒷다리의 긴 뼈(즉, 대퇴골 및 경골)를 근육 및 연결 조직을 제거하고, 시린지 및 27½ G 니들을 사용하여 RPMI 배지로 세척하였다. 가시적 연결 조직을 제거한 세포 현탁액을 수집하여 원심분리기 튜브로 이동시켰다. 세포를 원심분리(5분 동안 1,200 rpm/~100 g)에 의해 수확하였고, 3 mL 적혈구 용해 완충액(0.15 M NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA, 7.2 내지 7.4로 pH 조정) 내에서 재현탁하였다. 세포 현탁액을 20℃에서 2분 동안, 이어서 얼음 상에서 4분 동안 인큐베이션하였다. 그 이후에, RPMI(10 mL)를 첨가하였고 세포를 원심분리에 의해 수확하여 계수하였다. 세포의 전형적 수율은 3*10⁷/마우스였다.

세포를 10⁸개 세포 당0.1 mL 항체 용액의 비율로 CD5, CD45R(B220), CD11b, GR-1(=Ly-6G/C), 7-4, 및 Ter-119에 대하여 지시된 계통-특이적 항체를 함유하는 바이오티닐화된 항체(Miltenyi Biotec의 "Lineage Cell Depletion Kit")의 칵테일로 2.5 * 10⁸ 세포/mL의 세포 밀도에서 2% FCS(소 태아 혈청)를 함유하는 한랭 PBS(포스페이트 완충 식염수) 내에서 재현탁하였다. 세포를 항체와 함께 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션하고, 원심분리에 의해 펠렛팅(pellet)하였다. 재현탁(3.3 *10⁸ 세포/mL) 이후 2차 항-바이오틴-코팅된 마이크로비드(Miltenyi Biotec의 "Lineage Cell Depletion Kit"와 함께 제공됨, 0.2 mL/10⁸세포)를 세포 현탁액에 첨가하고 혼합물을 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션하였다.

그 이후에, 샘플을 MACS-완충액(30 mL)으로 희석하고, 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 6 mL의 MACS-완충액 내에서 재현탁하였다. 이 현탁액을 세포-적합성 플라스틱 물질로 코팅된 강자성 비드를 함유하는, 미리충전된 LS 컬럼 상으로 로딩하였다. 전형적으로 (2 mL 세포 현탁액/컬럼)에 대해 3개의 컬럼을 적용하였다. 통과액은 계통 마커-음성 세포(Lin^- 세포)를 함유하고 있으나, 계통 수임된 세포는 컬럼 상에 보유되었다. 세포를 원심분리에 의해 펠렛팅시키고 mL PBS 내에서 재현탁하였다.

전형적인 수율은 7*10⁵ Lin^- 세포/마우스였다.

형광-활성화된 세포 분류( FACS ) 분석

세포 표면 마커의 염색을 위해 적용된 항체는 다음의 출처로부터 입수하였다: 마우스 계통 패널 항체(항-CD3ε, 항-CD11b, 항-CD45R, 항-Ly-6G/Ly-6c, 항-Ter-119로부터 바이오티닐화된 내에 함유되는, BD 559971)는 Becton Dickinson Biosciences로부터 입수하였고, 친화 정제된 랫트 항-마우스 CD16/CD32(마우스 Fcγ_I/ _III 차단제, BD 553142) 및 형광 염료 스트렙트아비딘-알로피코시아닌-Cy7(스트렙트아비딘 APC-Cy7, BD554063)은 또한 Becton Dickinson Biosciences로부터 입수하였다. 피코에리트린(PE)-Cy7-표지된 항-마우스 Ly6A/E(=줄기 세포 항원-1 = Sca1) PE-Cy7(목록 번호: 25-5981-82) 및 PE-Cy5 항-마우스 CD117(c-Kit)(목록 번호: 15-1171-81)은 eBiosciences로부터 입수하였다.

MACS 직후에, 1*10⁶계통 양성 (Lin+) 및 음성 (Lin-) 세포를 FACS 튜브로 이동시키고, 50μL PBS 내의 얼음 상에서 저장하였다. 그 동안에, 다음의 FACS 항체를 희석시키고(1:50) PBS 내에서 혼합하였다: (Fc-수용체를 차단하기 위한) 정제된 CD16/CD32, 바이오티닐화된 항-CD3ε, 바이오티닐화된 항-CD11b, 바이오티닐화된 항-CD45R, 바이오티닐화된 항-Ly-6G/Ly-6C, 및 바이오티닐화된 항-Ter-119, 스트렙트아비딘-표지된 APC-Cy7, PE-Cy7-표지된 항-Sca-1, PE-Cy5-표지된 항-c-kit.

이 매스터 믹스(50μL)를 각각의 샘플에 첨가하고, 그 후 약하게 와류시켜 혼합하고 15분 동안 어두운 조건으로 4℃에서 인큐베이션하였다. 그 이후에, 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 2 mL PBS에서 세척하고, PBS에서 재현탁하였다. 샘플을 FACS Canto II(Becton Dickinson)에서 분석하였다. 게이트(gate) 절차는 다음과 같이 하였다: 살아있는 세포에 대한 게이트는 순방 및 측방 스캐터를 기록함으로써 설정하였다. 살아있는 세포는 계통 마커(즉, CD11b, CD45R, Ly-6G/Ly-6C, Ter-119)의 발현을 기초로 하여 추가적으로 식별하였다. 이는 Lin^- 세포에 대한 게이트를 정의하는 것을 가능하게 하였고, 이는 Sca-1 및 c-Kit의 발현에 대하여 추가적으로 분석하였다.

[3H] cAMP 축적 분석

Lin^-/sca1⁺- 세포를 벤질페니실린 및 스트렙토마이신 각각 0.5 mg/L, 쥐 줄기세포 인자(mSCF), 인간 Flt-3, hIL-11 50 ng/mL, m-IL3(10 ng/mL)(모두 PreProTech), 10 ㎍/mL 아데노신 데아미나제(Roche) 및 [³H]아데닌(Perkin Elmer, 1μCi/mL) 각각 50 ng/mL을 함유하는 1 mL의 줄기세포 배지(Sten Span SFEN, Stem Cell Tech #09650)에서 인큐베이션하였다. 예비-인큐베이션은 37℃에서 4시간 동안 지속하였다. 그 후, 세포를 화합물(포스콜린, 트레프로스티닐 및 다른 프로스타노이드; 콜레라 톡신)로 1시간 동안 자극하였다. 그 후, 세포를 펠레팅(100 g에서 5분)하고, 배지를 제거하고, 펠렛을 0.1 mM cAMP을 함유하는 한랭 2.5% 과염소산(0.9 mL) 내에서 용해하고, 얼음 상에 1시간 동안 고정하고, 4.2 M KOH (0.1 mL)로 중화하였다. 계통 마커-양성 세포를 비슷한 방식으로 예비-인큐베이션하였지만, 배지는 무혈청 줄기세포 배지 대신에 RMPI를 함유하였다. ATP 및 cAMP는 Dowex AG50-X8 및 중성 알루미나를 함유하는 컬럼 상에서 순차적 크로마토그래피에 의해 분리하였다(12).

포스콜린의 존재 하에서만 차이점이 나타날 수 있다는 사실은 기술적 문제이다 - 포스콜린-민감화의 부재하에서는 상이한 화합물, 즉 일로프로스트, 베라프로스트 및 트레프로스티닐 사이에서 임의의 차이점을 확인하기에는 시그널이 너무 약하다. 민감화는 이들 세포가 매우 낮은 cAMP를 함유하기 때문에 수용체 반응에 대하여 민감해진 것을 의미한다.

트레포스티닐에 대한 농도-반응 곡선(도 5)에 따르면, cAMP의 증가는 포스콜린의 첨가없이 현저함을 명확하게 보여줄 수 있다.

골수 이식:

동질유전자 수용자 마우스를 치사적 방사선조사에 적용하였다. 조혈 줄기세포의 정맥내 투여에 의해 구조되지 않는 경우, 이들 마우스는 처음 2주 이내에 사망하였다. Lin^-(Sca1⁺ 및 c-Kit⁺) 조혈 줄기세포를 상기 언급된 것과 같이 제조하였고, 10μM 트레프로스티닐, 트레프로스티닐 + 30μM 포스콜린(FSK)의 조합, 10 ㎍/mL 콜레라 톡신의 부재 및 존재하에서 1시간 동안 37℃에서 생체외 전처리하였다. 그 이후에, 세포(3x10⁵/마우스)를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 백혈구 계수는 FACS에 의해 측정하였다. 백혈구 계수는 9일째(백혈구 계수가 ~1 G/L이었음)에 시작하여 매 5일마다 측정하였다.

결과

조혈 줄기세포의 정제:

MACS-기반 절차는 자기 비드 상에 계통 마커-양성(Lin⁺) 세포를 보유하며, 계통 마커-음성 세포(Lin^-)의 회복을 가능하게 한다: 세포 집단의 본질은 FACS에 의해 특성화하였다. MACS-유지된 세포 집단은 실제로 계통-특이적 마커에 대하여 염색된 세포 내에서 풍부하였고, 줄기-세포 수용체 c-Kit/CD117가 부재하였다(도 1).

대조적으로, 컬럼 통과액으로부터 회복되었던 세포는 대부분 좌측 상부 4분면에서 발견되었는데, 이들은 높은 c-Kit 수준을 나타냈으며, APC-Cy7-A 형광이 고갈되었는데, 이는 계통 마커의 고갈을 나타내는 것이다(도 2).

세포 집단을 c-Kit 및 Sca-1(줄기세포 항원-1) 둘 모두에 대하여 추가적으로 평가하였다: 계통-양성 세포는 이들 2개의 마커가 부재하는 반면(도 3A), 계통-음성 분획은 c-Kit 또는 c-Kit 및 Sca-1의 조합을 높은 수준으로 발현하였다(도 3B).

c- Kit + 및 Sca1 ⁺ 세포에서 사이클릭 AMP 축적

조혈 줄기세포(c-Kit⁺및 Sca-1⁺ 집단, 도 3B 참고)의 아데닌 뉴클레오티드 풀은 대사적으로 [³H]아데닌으로 표지하고, 트레프로스티닐 및 다른 프로스타글란딘 수용체 작용제에 대한 이의 반응을 검사하였다. 이들 세포는 매우 온건한 cAMP 반응을 가지기 때문에, 포스콜린을 사용하여 효소를 민감화시켰다. 이 디테르펜은 아데니닐 사이클라제의 C1과 C2 도메인 사이의 유사 기질 틈에서 결합하며 자극성 G 단백질 Gα_s에 대해 더 반응적인 효소의 다양한 이소형을 만들게 된다(13-15). 도 4로부터 나타나 바와 같이, 트레프로스티닐, 베라프로스트 및 일로프로스트 그 자체는 30μM 포스콜린에 의해 유발된 규모와 대등하게 cAMP의 온건한 축적을 야기하였다. 그러나 포스콜린, 트레프로스티닐과 조합하는 경우 IP-(I 프로스타노이드) 수용체-특이적 화합물 일로프로스트 및 베라프로스트에 의해 야기된 것을 초과하는 cAMP 수준에서의 증가를 야기하였다. 이는 EP(E 프로스타노이드)-수용체에 대한 트레프로스티닐의 작용을 고려하는 경우 합리적일 수 있다(10). 트레프로스티닐은 0.1 내지 10μM의 범위에서 cAMP의 농도-의존적 축적을 야기하였다(도 5). 추측된 EC₅₀은0.3μM의 범위였다. 트레프로스티닐은 Lin⁺ 조혈 세포 분획에서 cAMP 수준을 증가시키는데 실패하였다(데이터 미기재).

( Lin ^- , c- Kit ⁺ , Sca1 ⁺ ) 조혈 줄기세포에 의한 골수의 재구성

치사적으로 방사선조사된 마우스를 3*10⁵ Lin^-, c-Kit⁺, Sca1⁺ 세포의 정맥내 주사에 의해 구조하였다. 백혈구 계수는 9일째 최저점으로부터 증가하기 시작하였고, 다음 수주일에 걸쳐 천천히 증가하였다. 조혈 줄기세포의 주사 이후 60일째에 백혈구의 수준을 적절한 종료점으로서 선택하였는데, 이는 60일 이후에는 순환하는 백혈구가 오로지 생착된 조혈 줄기세포로부터만 생산될 수 있었기 때문이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 트레프로스티닐-전처리한 조혈 줄기세포가 주사된 마우스는 비히클-처리한 조혈 줄기세포를 투여받은 마우스에 비해 순환하는 백혈구 세포의 수준이 현저하게 더 높았다(p<0.05, 비결합 데이터에 대한 t-검정).

추가적인 대조군으로서, 동물에게 다음을 주사하였다:

(i) 콜레라 톡신으로 처리한 세포, [이것이 Gαs의 가장 효과적이고 지속적인 활성자이기 때문임]

(ii) 포스콜린, [상기 언급한 바와 같이, 이것이 아데닐 사이클라제 이소형을 직접적으로 활성화시키기 때문임],

(iii) 포스콜린 및 트레프로스티닐의 조합.

이는 트레프로스티닐이 효과적인 생체외 조작으로서 확립된 양성 대조군 콜레라 톡신 만큼 효과적이었음을 증명한다(1, 2).

실시예 2

골수 줄기세포의 분리

C57BL/6 및 B6SJL 마우스를 희생시키고 골수 줄기세포를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 분리하였다.

분리한 줄기세포의 시험관내 전-처리

C57BL/6 또는 C6SJL 마우스로부터의 골수 줄기세포를 콜레라 톡신(CTX) 또는 트레프로스티닐+포스콜린(FSK)으로 시험관내에서 전처리하였고, 줄기세포는 Ly5.2 또는 Ly5.1로 표시한다.

첫번째 실험에서, C57BL/6 마우스로부터의 골수 줄기세포를 전처리 없이 사용하였고, 줄기세포를 Ly5.2로 표시하였다. C6JL로부터의 골수 줄기세포를 콜레라톡신 또는 트레프로스티닐+포스콜린으로 시험관내에서 전처리하였고, 줄기세포를 Ly5.1로 표시하였다.

비교 연구를 위해, Ly5.1+ 및 Ly5.2+ 세포의 1:1 믹스를 골수 이식에 의해 마우스 내로 도입하고, Ly5.2 및 Ly5.1 양성 혈액 세포의 비율을 처음에 측정하였다. 그리고나서, 골수 이식 이후 16주째에, 혈액 세포 증식(outgrowth)을 측정하였다. 결과는 도 7에서 나타내며, 여기서 트레프로스티닐/FSK 전처리한 세포(Ly5.1+)가 비처리한 세포 및 CT로 전처리한 세포와 비교할 때 현저하게 증가된 증식을 보임이 분명하다.

두번째 실험에서, C57BL/6로부터의 골수 줄기세포를 콜레라 톡신 또는 트레프로스티닐+포스콜린으로 시험관내에서 전처리하고 줄기세포를 Ly5.2로 표시하였다. C6JL 마우스로부터의 골수 줄기세포를 Ly5.1로 표시하였고 임의의 전처리 없이 사용하였다.

다시, 비교 연구를 위해, Ly5.1+ 및 Ly5.2+ 세포의 1:1 믹스를 골수 이식에 의해 마우스 내로 도입하고, Ly5.2 및 Ly5.1 양성 혈액 세포의 비율을 처음에 측정하였다. 그리고나서, 골수 이식 이후 16주째에, 혈액 세포 증식을 측정하였다. 결과는 도 8에서 나타내며, 여기서 트레프로스티닐/FSK 전처리한 세포(Ly5.2+)가 비처리한 세포 및 CT로 전처리한 세포와 비교할 때 현저하게 증가된 증식을 보임이 다시 분명하게 증명된다. 따라서 트레프로스티닐 및 포스콜린의 효과는 골수 세포의 기원과 독립적이라는 것이 확인될 수 있다.

따라서 트레프로스티닐 및 포스콜린의 조합은 조혈 줄기세포의 생착을 증가시키며, 콜레라 톡신으로 전처리하는 것처럼 효과적이거나 이보다 더 효과적이다.

참조문헌

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Claims

하기의 단계를 포함하는 HSC의 생체외 전처리에 의해 조혈 줄기세포(HSC)의 생착을 강화하는 방법:
a. 조혈 줄기세포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계,
b. 상기 샘플을 적어도 하나의 프로스타사이클린 유사체와 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계,
c. 상기 세포에서 G 알파_s-시그널링을 자극하기에 충분한 기간 동안 상기 혼합물을 인큐베이션시키는 단계, 및 선택적으로
d. 상기 자극된 세포를 분리하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 프로스타사이클린 유사체가 트레프로스티닐(Treprostinil), 일로프로스트(Iloprost), 시카프로스트(Cicaprost) 및 베라프로스트(Beraprost) 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로스타사이클린 유사체가 트레프로스티닐인 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 트레프로스티닐이 트레프로스티닐의 산 유도체, 트레프로스티닐의 전구약물, 트레프로스티닐의 다형체 및 트레프로스티닐의 이성체의 군으로부터 선택되는 트레프로스티닐 유도체인 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 골수인 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 바람직하게는 콜레라 톡신 및 포스콜린으로부터 선택되는 비특이적 cAMP 활성화 작용제와 함께 적어도 하나의 프로스타사이클린 유사체와 혼합된 것인 방법.
골수 질환을 앓고 있는 개인의 치료에 사용하기 위한 적어도 하나의 프로스타사이클린 유사체를 포함하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 프로스타사이클린 유사체는 트레프로스티닐, 일로프로스트, 시카프로스트 및 베라프로스트 또는 이들이 약학적으로 허용가능한 염의 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 프로스타사이클린 유사체가 트레프로스티닐 바람직하게는 트레프로스티닐의 산 유도체, 트레프로스티닐의 전구약물, 트레프로스티닐의 다형체 및 트레프로스티닐의 이성체의 군으로부터 선택되는 트레프로스티닐의 유도체인 것인 조성물.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 골수 질환이 백혈병, 혈액 세포 구획의 결함, 화학요법 또는 방사선 조사에 의해 유도된 골수 질환인 것인 조성물.
제10항에 있어서, 상기 혈액 세포 구획의 결함이 혈색소병증 또는 호중구성 과립구 기능의 결함인 것인 조성물.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 골수 이식 이후 적어도 7일 동안, 바람직하게는 적어도 10일 동안, 바람직하게는 적어도 14일 동안 프로스타사이클린 유사체를 투여함으로써 골수 질환을 앓고 있는 개체의 치료에 사용하기 위한 조성물.
적어도 하나의 프로스타사이클린 유사체 및 자극된 조혈 줄기세포를 포함하는 조성물.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 약학 조성물인 조성물.
제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 포스콜린을 추가로 포함하는 조성물.
제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내 또는 피하 투여용 형태이거나, 서방성 방출 형태, 정제 및 캡슐의 군으로부터 선택되는 경구적으로 이용가능한 형태인 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한에 따른 방법 또는 제7항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 조성물로서, 상기 줄기세포가 제대혈, 공여자 골수 또는 태반 유래인 것인 방법 또는 조성물.