FR3074189A1 - Methode de generation de greffons de cellules souches hematopoietiques - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte au domaine de la thérapie cellulaire et à un procédé in vitro de génération de cellules souches hématopoïétiques transduites provenant d'un patient atteint d'une maladie avec composante inflammatoire, comprenant l'étape d'exposer des cellules CD34+ dans un milieu contenant un de la PGE2.

Description

L’invention se rapporte au domaine de la thérapie cellulaire et en particulier des greffes de cellules souches hématopoïétiques génétiquement corrigées ou non, et à la reconstitution hématologique à la suite de telles greffes.

La greffe de cellules souches issues de moelle osseuse est un traitement de choix pour le traitement de patients atteints de défaut génétiques dans les cellules sanguines. Une telle greffe peut être allogénique (à partir d’un donneur compatible pour ce qui est du HLA) mais on effectue de plus en plus de greffes autologues, par utilisation de cellules obtenues à partir du patient et corrigées par introduction in vitro de la copie correcte du gène déficitaire dans les cellules souches hématopoïétiques du patients, et l’injection de ces cellules chez le patient. Dans le cas de certaines maladies (certaines déficiences immunitaires, certaines hémoglobinopathies), il n’est pas nécessaire que l’ensemble des cellules réinjectées au patient soient corrigées. Il est toutefois nécessaire que ces cellules corrigées prolifèrent et qu’un niveau suffisant d’expression du gène thérapeutique soit atteint in vivo afin d’obtenir l’effet clinique.

Les inventeurs ont observé qu’il n’est pas toujours possible d’atteindre un tel effet, notamment lorsque la maladie du patient a une composante inflammatoire. Dans un tel cas, les inventeurs ont observé que la correction génétique des cellules par transduction avec un vecteur viral portant le gène thérapeutique est peu efficace (comme attesté par un faible nombre moyen de vecteur par cellule).

Par ailleurs, si la prise de greffe paraît satisfaisante sur la base du niveau initial de cellules sanguines corrigées et ceci pendant quelques mois après la greffe, ce niveau de cellules circulantes corrigées baisse au cours du temps, et le nombre de cellules corrigées devient trop faible après quelques mois, ce qui ne permet pas l’obtention d’une guérison clinique de la condition pathologique ciblée par ce traitement.

Sans être lié par cette hypothèse, les inventeurs supposent que les cellules du patient, étant en état de réponse à l’inflammation induite par la pathologie, sont plus résistantes à l’exposition au vecteur viral, à cause de mécanismes limitant la transduction. Par ailleurs, ces cellules seraient moins à même de survivre après réintroduction dans l’organisme.

Les inventeurs ont démontré que l’utilisation de prostaglandine E2 avant exposition des cellules des patients au vecteur viral permet d’améliorer à la fois l’efficacité de la correction des cellules (le nombre de copie de vecteur par cellule), mais aussi la survie à long terme in vivo chez le patient, permettant alors d’atteindre des niveaux cliniquement efficaces de prise des cellules ciblées .

L’invention se rapporte donc à un procédé de transformation de cellules souches hématopoïétiques, comprenant une étape de culture de ces cellules en présence de prostaglandine E2, avant exposition de ces cellules à un vecteur viral contenant un gène permettant de corriger un défaut génétique de ces cellules. Ce procédé est réalisé in vitro.

Dans un mode de réalisation préféré, les cellules présentent des marqueurs d’inflammation, notamment des marqueurs induits par une exposition aux interférons, en particulier les interférons de type I.

En particulier, les cellules présente une surexpression d’au moins un marqueur, de préférence au moins deux marqueurs, de façon plus préférée au moins trois marqueurs, de façon encore plus préférée au moins quatre marqueurs, de façon encore plus préférée au moins cing marqueurs d’inflammation tels que listés ci-dessous. Cette surexpression est observée par rapport à des cellules contrôle, notamment des cellules CD34+ prélevées sur un patient sain (qui n’expriment pas ces marqueurs). Dans la mesure où les cellules d’un patient sain n’expriment pas ces marqueurs (ou de façon très faible), la surexpression peut être entendue comme l’expression détectable de ces marqueurs, par toute méthode connue dans l’art comme la PCR quantitative.

Il existe trois types d’interférons, de type I (IFN α, β, δ, ε, ζ, κ, ν, τ, ω), II (IFN γ) et III (IFN λ). Les interférons de type I se lient au récepteur de surface cellulaire IFN-α, les interférons de type II se lient au récepteur à l’IFN-γ, les interférons de type III agissent sur un récepteur composé de IL10R2 (aussi nommé CRF2-4) et IFNLR1 (récepteur 28 de l'interleukine, aussi nommé CRF2-12).

La production d’interférons est essentiellement une réponse des cellules à des attaques bactériennes ou virales. Les interférons ont donc notamment une activité antivirale, en inhibant la réplication virale dans les cellules de l'hôte.

L’exposition des cellules aux interférons a des conséquences sur l’expression de certains gènes (gènes régulés par les interférons). Il existe une base de données relative à ces gènes (INTERFEROME, Samarajiwa et al, Nucleic Acids Res. 2009 Jan; 37(Database issue): D852-D857).

Les interférons de type I sont également connus sous l’appellation « IFNa/β », et sont des cytokines ayant une puissante activité protectrice contre les infections virales, qui exercent en outre une activité antiproliférative et immunomodulatrice. Il est donc possible que ces propriétés des interférons de type I soient responsables de la mauvaise transduction en présence d’un vecteur viral : les cellules sont déjà pré-stimulées pour répondre à une présence virale, et répondront donc de façon plus forte à la présence du vecteur viral de transduction que des cellules n’ayant pas été soumise à cette inflammation, menant ainsi à une moins bonne efficacité. Par ailleurs, les capacités prolifératives amoindries et leur moindre survie après exposition a un nouveau agent infectieux peuvent expliquer la mauvaise prise de greffe in vivo.

L’exposition de cellules à ces interférons de type I mène à une surexpression de certains marqueurs.

Le tableau I de Schoggins et Rice (Curr Opin Virol. 2011 Dec; 1(6): 519525) fournit une liste de gènes qui sont induits par l’interféron en présence d’un virus. Parmi ces gènes, on peut noter ADAR, APOBEC3, BST2 (tetherine), C6orf150(MB21D1), CD74, DDIT4, DDX58 (RIG-I), DDX60, EIF2AK2 (PKR), GBP1.GBP2, HPSE, IFI44L, IFI6/G1P3, IFIH1 (MDA5), IFIT1/2/3/5, IFITM1/2/3, IRF1, IRF7, ISG15, ISG20, MAP3K14 (NIK), MOV10, MS4A4A, MX1(MxA), MX2 (MxB), NAMPT (PBEF1), NT5C3, OAS1/2/3, OASL, P2RY6, PHF15, PML (TRIM19), RSAD2 (vipérin), RTP4, YFV, SLC15A3, SLC25A28, SSBP3, TREX1 (AGS1), TRIM5, TRIM25, SUN2 (UNC84B), etZC3HAV1 (ZAP).

La nomenclature de ces gènes est celle de Schoggins et Rice, et du projet HUGO (www.genenames.org et notamment la section relative à la nomenclature des gènes induits par l’interféron et de leurs protéines (HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC)-approved désignation of ISGs and their encoded proteins)).

On peut également noter les marqueurs IFI44 (Interferon Induced Protein 44, Accession number Q8TCB0), IFI44L (Interferon Induced Protein 44 Like, Q53G44), ISG15 (ISG15 Ubiquitin-Like Modifier, P05161), RSAD2 (Radical S

Adenosyl Méthionine Domain Containing 2, Q8WXG1), IFIT1 (Interferon Induced Protein With Tetratricopeptide Repeats 1, P09914), IFIT3 (Interferon Induced Protein With Tetratricopeptide Repeats 3, 014879), OAS1 (2'-5'-Oligoadenylate Synthetase 1, P00973), OAS2 (2'-5'-Oligoadenylate Synthetase2, P29728), OASL (2'-5'-Oligoadenylate Synthetase Like, Q15646), MX1 (Interferon-Regulated Résistance GTP-Binding Protein Mx1, P20591), STAT1 (Signal transducer and activator of transcription 1 , P42224 ) et LY6E, (Lymphocyte antigen 6E, Q16553) qui sont inductibles par les interférons.

Parmi ces marqueurs, sont particulièrement intéressants ceux décrits par Schoggins et Rice en tant que marqueurs induits en réponse au VIH, lentivirus souvent utilisés comme vecteurs de transduction.

Ainsi, la présence d’une induction de gènes généralement observés en présence d’un lentivirus est susceptible de réduire l’efficacité de la transduction par le lentivirus portant le gène de correction thérapeutique.

Ces gènes sont notamment : ADAR, APOBEC3, BST2 (tetherine), CD74, EIF2AK2 (PKR), IFI44L, IFIT1/2/3/5, IFITM1/2/3, IRF1, IRF7, ISG15, MOV10, MX2 (MxB), PML (TRIM19), RSAD2 (vipérin), TRIM5, et SUN2 (UNC84B).

Les inventeurs ont toutefois démontré la surexpression induite par l’interféron pour d’autres gènes et l’amélioration de la transduction par les lentivirus en présence de prostaglandine E2.

La prostaglandine E2 (PGE2) est un acide gras de la classe des prostaglandines, qui pourraient jouer un rôle dans l'inflammation, notamment par l’inhibition de l’activation des lymphocytes T (Wiemer et al, 2011, Journal of Immunology. 187 (7): 3663-70).

Elle a été proposée pour améliorer la transduction de cellules souches hématopoïétiques CD34+ adultes (Heffner et al, 2017, Mol Ther. pii: S15250016(17)30464-1). Dans cet article, cependant, la PGE2 est ajoutée en même temps que le vecteur viral. De même, le brevet EP 2760994 revendique l’utilisation de la PGE2 en même temps ou après ajout du vecteur viral.

La demande WO2010054271 se rapporte à l’utilisation d’un inhibiteur de PGE2 chez des patients pour améliorer la mobilisation des cellules CD34+ et à la PGE2 pour l’amélioration de la prise de greffe.

Ainsi qu’indiqué par le groupe européen de greffe de cellules souches hématopoïétiques mobilisées en circulation ou médullaires (The European Group for Blood and Marrow Transplantation), la prise de greffe (engraftmenf) est définie par l’atteinte d’un nombre de neutrophiles supérieur à 0,5 x 10⁹ /1 et stable dans le temps (présentation de Tapani Ruutu, 37èmes rencontres de ΙΈΒΝΤ, 2011, disponible sur https://www.ebmt.org/Contents/Pages/Default.aspx).

Ainsi que montré dans les exemples, les inventeurs ont pu mettre en évidence le fait que, chez les patients pour lesquels la maladie à traiter a une composante inflammatoire forte, malgré une prise de greffe documentée, les cellules hématopoïétiques corrigées ne sont pas maintenues . En revanche, la partie non corrigée du greffon se maintient. Il ne s’agit pas d’un défaut de prise de greffe, mais d’un effet de sélection négative des cellules corrigées, qui perdent leur capacité de survie et/ou d’auto-renouvellement in vivo. Cet effet n’a pas été rapporté précédemment et montre qu’il ne suffit pas d’ajouter le gène thérapeutique dans les cellules hématopoïétiques pour corriger une maladie génétique, mais qu’il convient également qu’il n’y ait pas d’attrition spécifique des cellules corrigées.

Les inventeurs ont observé un effet inattendu et non décrit de la PGE2, menant à une meilleure transduction des cellules souches hématopoïétique du patient, et à l’obtention d’un niveau thérapeutiquement efficace après greffe. Cet effet est observé sur les cellules souches hématopoïétiques provenant de patients atteints de pathologies génétiques du sang ayant une composante inflammatoire répertoriée et documentée. Les cellules sanguines pathologiques expriment des marqueurs de l’inflammation, et en particulier des marqueurs induits par les interférons, et notamment les interférons de type I. Par ailleurs, les inventeurs ont montré que la PGE2 permet d’augmenter le taux de survie des cellules après décongélation d’un greffon congelé de cellules transduites. Ceci est valable pour les cellules CD34+ et les précurseurs des lymphocytes T définis plus bas.

L’invention se rapporte ainsi à un procédé in vitro de transduction de cellules hématopoïétiques, en particulier choisies parmi les cellules CD34+ et les précurseurs de cellules T, comprenant l’étape de culture des cellules hématopoïétiques en présence de prostaglandine E2. La culture en présence de

PGE2 est préalable à l’exposition au vecteur viral destiné à la transduction des cellules hématopoïétiques présentant des marqueurs d’inflammation.

Le procédé ainsi décrit est préférentiellement mis en œuvre lorsque les cellules hématopoïétiques ont été isolées (notamment les CD34+) ou générées (les précurseurs de cellules T sont obtenus par culture in vitro de cellules CD34+ d’un patient) à partir d’un patient atteint de granulomatose septique chronique, du syndrome de Wiskott-Aldrich, de lymphohistiocytose hemophagocytaire familiale ou infecté par un Virus de l’immunodéficience Humaine (VIH). Ce patient peut ainsi nécessiter une greffe de cellules souches hématopoïétiques.

En particulier, l’invention se rapporte donc à un procédé in vitro de transduction de cellules CD34+, comprenant l’étape de culture des cellules CD34+ en présence de prostaglandine E2 (PGE2) préalablement à l’exposition au vecteur viral destiné à la transduction des cellules CD34+, caractérisées en ce que les cellules CD34+ présentent des marqueurs d’inflammation.

Un autre aspect de l’invention est un procédé de préparation de cellules souches hématopoïétiques transduites en vue d’une greffe de cellules souches hématopoïétiques chez un patient présentant une maladie des cellules du système hématopoïétique (cellules sanguines), à composante inflammatoire, comprenant

a. une étape de culture des cellules en présence de prostaglandine E2, suivie

b. d’une étape d’exposition des cellules à un vecteur viral destiné à la transduction des cellules souches hématopoïétiques.

Dans ces maladies, les cellules du système hématopoïétiques expriment des marqueurs d’inflammation, et notamment des marqueurs de gènes inductibles par des cytokines, notamment des interférons, et préférentiellement des interférons de type I.

Le vecteur viral introduit, un gène corrigeant la pathologie dans le génome des cellules souches hématopoïétiques (cellules CD34+). L’exposition à la PGE2 est préalable à l’exposition au vecteur viral, même s’il est aussi envisagé que la PGE2 soit maintenu dans le milieu de culture en présence du vecteur viral.

L’invention se rapporte ainsi à l’utilisation de la Prostaglandine E2 pour la préparation in vitro d’un greffon de cellules souches hématopoïétiques corrigées présentant une survie à long terme améliorée du greffon chez le patient présentant une pathologie des cellules du système hématopoïétique (cellules sanguines), à composante inflammatoire. Les inventeurs ont ainsi pu démontrer que cette amélioration est visible par rapport à des cellules corrigées en absence de PGE2. Dans ces modes de réalisations, la greffe est préférentiellement une autogreffe, le principe étant de réinjecter à un patient ses propres cellules corrigées pour éviter les phénomènes de rejet (greffon contre hôte).

Dans un mode de réalisation particulier, les cellules CD34+ prélevées et utilisées dans les procédés décrits plus haut et dans la présente demande proviennent d’un patient atteint de granulomatose septique chronique. Ces cellules présentent donc une mutation dans un des gènes décrits ci-dessous.

La granulomatose septique chronique est un déficit immunitaire de l'immunité non spécifique, menant à un défaut de destruction des bactéries et des champignons phagocytés par les polynucléaires neutrophiles et les macrophages. Il est lié à un déficit immunitaire primaire du métabolisme oxydatif des cellules phagocytaires (anomalie de la NADPH oxydase). Il s’agit d’une maladie héréditaire est de type récessif liée à l'X (ou autosomique récessif). Il en existe plusieurs formes génétiques différentes (mutation dans les gènes codant pour les cytochrome b-245 alpha chain - CYBA, cytochrome b-245 beta chain - CYBB, neutrophil cytosolic factor 1 - NCF1, neutrophil cytosolic factor 2 - NCF2 ou neutrophil cytosolic factor 4 - NCF4), mais la forme génétique la plus courante est celle liée à l’X, affectant le gène CYBB codant l’élément redox de l’oxydase, gp91phox ou Nox2.

Dans ce mode de réalisation, le vecteur viral envisagé dans les procédés décrits est un vecteur viral portant un acide nucléique codant pour les versions non mutées et fonctionnelles des protéines CYBA, CYBB, NCF1, NCF2 ou NCF4.

Dans un mode de réalisation particulier, le patient présente une mutation dans le gène CYBB, et le vecteur porte un acide nucléique codant pour la version fonctionnelle de la protéine CYBB.

Il convient de noter qu’à la connaissance des inventeurs, l’influence des interférons, et en particulier des interférons de type I dans cette maladie n’a pas été rapportée (l’interféron gamma peut être proposé pour aider à combattre les infections fongiques ou bactérienne des patients).

Dans un mode de réalisation particulier, le patient dont les cellules CD34+ ont été prélevées et sont utilisées dans les procédés décrits plus haut et dans la présente demande est atteint du syndrome de Wiskott-Aldrich. Ces cellules présentent donc une mutation dans un gène ci-dessous.

Le syndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) est un déficit immunitaire constitutionnel (ou primitif) faisant partie du groupe des déficits combinés de l'immunité. C'est une maladie génétique récessive liée au chromosome X secondaire à une mutation du gène WAS (protéine Uniprot P42768).

Prete et al (J Exp Med. 2013 Feb 11;210(2):355-74) ont montré que l'activation chronique des cellules dendritiques plasmacytoïdes (PDC) et les niveaux élevés d'interféron de type I jouent un rôle dans l'auto-immunité du WAS. Les patients WAS présentent notamment une expression accrue des gènes IFN de type I et de leurs cibles inductibles.

Dans ce mode de réalisation particulier, le vecteur porte un acide nucléique codant pour la version fonctionnelle de la protéine WAS.

On a aussi identifié une mutation sur le gène WIPF1 (famille de protéines interagissant avec WAS/WASL, membre 1; 2q31.2, Uniprot 043516) chez un patient avec un phénotype proche du WAS. Dans ce mode de réalisation particulier, le vecteur porte un acide nucléique codant pour la version fonctionnelle de la protéine WIPF1.

Dans un mode de réalisation particulier, le patient dont les cellules CD34+ ont été prélevées et sont utilisées dans les procédés décrits plus haut et dans la présente demande est atteint de lymphohistiocytose (LHF). Ces cellules présentent donc une mutation dans un gène ci-dessous.

Cette pathologie est caractérisée par un défaut de l’activité cytotoxique des lymphocytes NK et lymphocytes TCD8+, une suractivation des macrophages et une augmentation du taux circulant des cytokines, en conséquence de mutations de certains gènes caractéristiques des lymphohistiocytoses hémophagocytaires familiales. Ces mutations touchent des gènes codant des molécules essentielles au processus d’exocytose des granules lytiques et donc à la cytotoxicité.

Les gènes en cause sont :

PRF1 : gène de la perforine (protéine cytolytique sécrétée par les lymphocytes T CD8+) localisée sur le chromosome 10q21-22 est muté chez 15 à 50 % des patients présentant une LHF.

UNC13D : gène qui code la protéine Munc13-4 localisé sur le chromosome 17q25 normalement responsable de l’arrimage des granules cytolytiques en préparation pour la fusion avec la membrane plasmique. Environ 15 à 30 % des patients ayant une LH F présente cette mutation.

STX11 : gène localisé sur le chromosome 6q24 codant la syntaxine 11 qui participe à la fusion des membranes vésiculaire et cellulaire. Cette mutation est présente chez environ 20 % des patients d’origine turque présentant une LH F. (syntaxin binding protein 2 - STXBP2)

On observe une hypercytokinémie, notamment des interleukine 1, TNF-α et d’interférons-y (INF-γ) entraînent une intense fatigue, une sudation importante ainsi qu’une pancytopénie.

Dans ce mode de réalisation, le vecteur viral envisagé dans les procédés décrits est un vecteur viral portant un acide nucléique codant pour les versions non mutées et fonctionnelle de la protéine PRF1, UNC13D ou STX11, selon la mutation du patient.

Dans un mode de réalisation particulier, le patient est infecté par un Virus de l’immunodéficience Humaine (VIH), tel que le VIH1 ou VIH2.

L’infection par le HIV, même quand elle est bien contrôlée par les traitements anti-rétroviraux, est associée à une inflammation chronique à l’origine de la comorbidité des patients (Deeks et Phillips, BMJ. 2009 Jan 26;338:a3172; D’Ettorre et al. AIDS Res HumRetroviruses 2011;27:355-64). L’une des conséquences de cette activation immune chronique est l’altération des progéniteurs hématopoïétiques et de leur capacité à générer des lymphocytes (Sauce étal, Blood2011 ;117 :5142).

Dans ce mode de réalisation, le patient a subi une chimiothérapie, après une hémopathie maligne, une autogreffe étant effectuée comme traitement de consolidation. Si le patient est également séropositif au VIH, on peut transduire ses cellules pour introduire un gène permettant d’empêcher l’entrée du virus dans les cellules transduites, ou son intégration dans le génome de ces cellules, ou sa réplication.

Dans un autre mode de réalisation, le patient est infecté par un Virus de l’immunodéficience Humaine (VIH), résistant aux thérapies conventionelles à base d’agents antirétroviraux. Dans ce mode de réalisation, l’autogreffe à base de cellules corrigées permet un traitement du patient, alors que les autres traitements classiques sont inefficaces.

Parmi les gènes utilisés, on peut utiliser un gène codant pour un peptide C ancré à la membrane ou des ARN interférants. Les peptides C sont de puissants inhibiteurs de la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire, qui constitue l’étape-clé permettant au virus d’infecter une cellule. On peut également citer les ARN interférants (séquences nucléiques pouvant être portées par le vecteur de transduction), ciblant des gènes du VIH ou des cofacteurs cellulaires, tels que le corécepteur CCR5, les transcrits viraux vif et tat/rev (Spanevello F, Mol Ther Nucl Acids 2016 ;5 :e312). Le corécepteur cellulaire CCR5 est indispensable pour l’infection des cellules par le VIH comme démontré par le patient dit «de Berlin » (Allers, K, 2011Blood117: 2791 ; Hütter, G 2009 N Engl J Med 360: 692). Bloquer l’entrée du virus en inhibant l’expression de CCR5 permet l’accumulation de cellules protégées contre l’infection par le virus sauvage et non infectées et d’empêcher le réapprovisionnement des réservoirs du virus (Didigu C, Viruses. 2014 6:1395). On peut aussi utiliser un gène codant pour le récepteur CCR5 muté (mutation delta32) et ainsi réduire ou empêcher l’infection. Les cibles virales des ARN interférants peuvent être tous les ARN produits par le VIH importants pour la réplication virale. Les ARN interférants vont empêcher le virus de se répliquer. On peut aussi utiliser un ribozyme dirigé contre les transcrits du VIH tels que vpret tat (Mitsuyasu et al, Nat Med. 2009 15, 285-292), ou tout autre système permettant d’empêcher l’infection par le VIH, d’inhiber sa réplication du virus, d’inactiver le promoteur du virus (aptamère, protéine dominant négatif, anticorps intracellulaire, leurre viral) ou de retirer le génome du VIH de l’ADN cellulaire par un système CRISPR/Cas9, tel que décrit dans Kaminski et al (Sci Rep. 2016 Mar4;6:22555).

Dans un mode de réalisation préféré, la prostaglandine E2 est ajoutée au milieu de culture des cellules CD34+ entre 4 heures et 1 heure avant exposition des cellules au vecteur viral, de préférence entre 3 heures et 1 heure avant transduction, de préférence au moins 2 heures avant transduction ou 2 heures avant transduction.

Ainsi que mentionné plus haut, on peut maintenir la prostaglandine E2 dans le milieu de culture lors de l’étape d’exposition au vecteur viral.

La prostaglandine E2 est généralement utilisée à une concentration comprise entre 1 μΜ et 100 μΜ , généralement à 10 μΜ.

Les cellules CD34+ ont généralement été isolées à partir d’un prélèvement d’un patient pour lequel il est envisagé d’effectuer la greffe. Afin de récolter ces cellules, il est possible de mobiliser les cellules (faire migrer des cellules de la moelle dans le sang du patient) par toute méthode connue dans l’art ou d’effectuer un prélèvement directement dans la moelle osseuse du patient. Les cellules utilisées dans les procédés in vitro décrits ici peuvent aussi être un mélange de cellules mobilisées et de cellules prélevées directement dans la moelle. Les méthodes pour trier et isoler les cellules CD34+ de l’échantillon sont connues dans l’art. On peut notamment utiliser des billes magnétiques présentant un anticorps reconnaissant le CD34+ à leur surface pour ce faire.

Les cellules CD34+ sont cultivées dans tout milieu connu dans l’art apte à la culture de cellules CD34+.

Ainsi, on peut utiliser un milieu choisi parmi les milieux α-MEM, DMEM, RPMI 1640, IMDM, BME, McCoy's 5A, StemSpanTM (Stem Technologies), X-vivo 20, X-vivo 10, X-vivo 15 ou milieu de Fischer. De préférence, on utilise un milieu basal (c’est-à-dire qui permet la croissance des cellules sans qu’il soit nécessaire d’y ajouter des compléments), que l’on peut toutefois supplémenter avec du sérum, ainsi que des facteurs de croissance et des cytokines. Ainsi, on ajoute préférentiellement du sérum bovin fœtal (FBS) ou du sérum de veau fœtal (FCS), du sérum humain autologue ou du sérum humain AB dans le milieu de culture basal (on complémente généralement ce milieu avec au moins 15 % de sérum fœtal, de façon plus préférée au moins 20 %) et préférentiellement du FBS défini, c’est-à-dire de haute qualité qui a été analysé et filtré pour éviter la présence de particules virales. Il est vendu comme tel par de nombreux fournisseurs, comme le HyClone™ Defined Fêtai Bovine Sérum (FBS) de Thermo Scientific™.

On supplémente préférentiellement le milieu de culture avec des cytokines et/ou des facteurs de croissance. Ces cytokines et facteurs de croissance sont notamment choisis dans le groupe consistant en SCF (Facteur de cellules souches), thrombopoïétine (TPO, également appelée facteur de croissance et de développement des mégacaryocytes, MGDF), Flt3-Ligand (qui est un facteur de croissance hématopoïétique), l’interleukine 3 (IL-3), l’interleukine 7 (IL-7) et le surface de protamine) Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture contient au moins trois, préférentiellement au moins quatre de ces cytokines ou facteurs de croissance. On peut également utiliser un fragment de fibronectine (tel que la Retronectin®) attaché au récipient de culture, qui améliore la transduction.

On utilise généralement le même milieu pour la culture et la transduction.

La PGE2 peut également être utilisée pour la préparation de progéniteurs de lymphocytes T corrigés. L’intérêt d’injecter à la fois des cellules souches hématopoïétiques et des précurseurs de cellules T (précurseurs engagés dans la voie de différenciation lymphoïde T (progéniteurs de cellules T)) permet d’accélérer la reconstitution immunitaire, et de minorer les nombreuses complications qui influent sur le pronostic à long terme des patients greffés.

La demande de brevet WO 2016/055396 décrit des méthodes pour obtenir de tels progéniteurs de lymphocytes T, corrigés ou non. Les cellules CD34+ sont cultivées en présence d’un ligand de Notch immobilisé, et d’une fibronectine ou d’un fragment de fibronectine, contenant un motif RGD (Arginine - Glycine Aspartate), voire avec une sérine après l’aspartate, et/ou un motif CS-1 et éventuellement un domaine de liaison à l’héparine, en particulier la Retronectine®. De préférence, ledit fragment de fibronectine, contient un motif RGD (éventuellement avec une S après le D), un motif CS-1 et un domaine de liaison à l’héparine.

Afin d’engager la voie de différentiation lymphoïde T, on cultive une partie des cellules CD34+ du patient en présence de PGE2 et de cytokines, telles celles citées dans WO 2016/055396.

Ainsi, si l’on effectue l’ajout de PGE2 dans des cultures visant à engager la différentiation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) CD34+ vers les progéniteurs de lymphocytes T sans transduction par un vecteur viral (pour profiter de l’amélioration de conservation par congélation apportée par la PGE2), on ajoute au moins ou exactement trois cytokines. De préférence, ces trois cytokines sont l’lnterleukine-7 (IL-7), le SCF (Facteur de cellules souches) et le Flt-3 Ligand (facteur de croissance hématopoïétique). Dans un autre mode de réalisation préféré, on ajoute quatre cytokines, c’est-à-dire les trois cytokines mentionnées cidessus et le TPO (thrombopoïétine).

Dans un autre mode de réalisation, on vise à générer des précurseurs de lymphocytes T transduits par le même vecteur viral que celui utilisé pour le greffon principal de CSH, afin de corriger le défaut génétique du patient. Dans ce mode de réalisation particulier, on peut faire varier la nature des cytokines et facteurs de croissance au cours de la mise en œuvre du procédé. Ainsi, on peut utiliser, en plus de la PGE2, de l’IL-3, de l’IL-7, du SCF, de la TPO, et du Flt3-L dans le milieu, notamment si l’on réalise l’étape de préactivation des cellules avant ajout du vecteur viral. Lorsque l’on a retiré le vecteur viral, on peut ne supplémenter le milieu qu’avec l’IL-7, le SCF, la TPO, et le Flt3-L, en présence ou non, à cette étape, de PGE2.

Les mélanges de cytokines et facteur de croissance mentionnés ci-dessus sont suffisants pour induire la différentiation des cellules CD34+ en précurseurs de lymphocytes T et, généralement, le milieu de culture ne comprend aucune autre cytokine ou facteur de croissance.

Ainsi que vu plus haut, on peut mettre en œuvre l’invention lorsque l’on effectue à la fois la différentiation des cellules CD34+ en progéniteurs de cellules T, et la transduction desdites cellules CD34+ à l’aide d’un vecteur viral afin d’introduire le gène d’intérêt dans ces cellules. Ainsi, on cultive les cellules CD34+ en présence du ligand de Notch et du fragment de fibronectine, et au moins pendant un certain temps en présence de PGE2, puis on les expose à un surnageant viral, en maintenant l’exposition au ligand de Notch et fragment de fibronectine, et éventuellement la présence de PGE2.

On préfère en effet exposer les cellules CD34+ au ligand de Notch (notamment DL-4) et fragment de fibronectine, en présence de PGE2 puis induire la transduction, afin d’accélérer la production de cellules T in vivo (après transplantation), et de raccourcir la période de culture (7 jours au lieu de 11 jours).

Le ligand de Notch peut être le Delta-like-ligand 4 (correspondant au nom du gène DLL4) désigné par simplification Delta-like-4 ou Delta ligand 4 (abréviation DL-4) ou Delta-like-1. De préférence, il s’agit d’une forme soluble du ligand DL-4, fusionnée avec un fragment Fc d’une immunoglobuline (DL4/Fc), telle que décrite par Reimann et al (Stem Cells 2012 ; 30 :1771-1780).

Les cellules sont exposées à un vecteur viral portant un gène d’intérêt afin d’induire leur transduction et l’intégration du gène d’intérêt dans le génome des cellules. Ce vecteur viral est préférentiellement un rétrovirus, et notamment un lentivirus, permettant l’intégration du gène d’intérêt dans le génome des cellules transduites. Le gène d’intérêt désigne une séquence nucléotidique codant pour une protéine absente ou mutée chez le patient, ainsi que les éléments (promoteurs, activateurs...) permettant son expression dans les cellules transduites. De tels vecteurs et la façon de construire les gènes d’intérêt sont connus dans l’art.

Les cellules transduites (cellules souches ou progéniteurs de cellules T) obtenues sont ensuite conditionnées pour pouvoir être utilisées pour la greffe d’un patient.

Ces cellules sont généralement lavées (notamment pour supprimer tout le surnageant viral), et peuvent être purifiées. Cette purification est effectuée par lavage des cellules et suspension dans un milieu basal adapté.

Ces cellules (souches ou progéniteurs de cellules T) peuvent aussi être conditionnées dans une poche afin de pouvoir les injecter à un patient. Dans ce cas, ces cellules sont reconditionnées dans une solution saline contenant du SAH à 5% telle que albunormTM 5% 50 g/L (Octopharma, Lingolsheim, France).

Ces cellules peuvent aussi être congelées selon les méthodes connues dans l’art. Les inventeurs ont ainsi montré que l’utilisation de PGE2 lors des étapes de culture permet d’obtenir un taux de survie bien plus important après décongélation que lorsque la PGE2 n’est pas utilisée.

Ainsi, les procédés décrits ci-dessus peuvent comprendre également au moins une étape choisie parmi

a. Le lavage des cellules après transduction,

b. La congélation des cellules après transduction

c. le conditionnement des cellules transduites dans une poche pour injection à un patient.

L’invention se rapporte également à un greffon de cellules hématopoïétiques corrigées (CD34+ ou de progéniteurs de cellules T) susceptible d’être obtenu par un procédé tel que décrit ci-dessus dans lequel le nombre de copies du gène corrigeant un défaut génétique par cellule (vector copy number) est supérieur ou égal à 1,5. Ce nombre de copies du vecteur peut être calculé par des méthodes connues dans l’art.

Dans un mode de réalisation particulier, le greffon contient des cellules présentant à la fois une mutation du gène codant pour la protéine CYBA (menant à une protéine non fonctionnelle ou une absence de protéine) et une séquence génétique permettant la production de la protéine fonctionnelle.

Dans un mode de réalisation particulier, le greffon contient des cellules présentant à la fois une mutation du gène codant pour la protéine CYBB (menant à une protéine non fonctionnelle ou une absence de protéine) et une séquence génétique permettant la production de la protéine fonctionnelle.

Dans un mode de réalisation particulier, le greffon contient des cellules présentant à la fois une mutation du gène codant pour la protéine NCF1 (menant à une protéine non fonctionnelle ou une absence de protéine) et une séquence génétique permettant la production de la protéine fonctionnelle.

Dans un mode de réalisation particulier, le greffon contient des cellules présentant à la fois une mutation du gène codant pour la protéine NCF2 (menant à une protéine non fonctionnelle ou une absence de protéine) et une séquence génétique permettant la production de la protéine fonctionnelle.

Dans un mode de réalisation particulier, le greffon contient des cellules présentant à la fois une mutation du gène codant pour la protéine NCF4 (menant à une protéine non fonctionnelle ou une absence de protéine) et une séquence génétique permettant la production de la protéine fonctionnelle.

Dans un mode de réalisation particulier, le greffon contient des cellules présentant à la fois une mutation du gène codant pour la protéine WAS (menant à une protéine non fonctionnelle ou une absence de protéine) et une séquence génétique permettant la production de la protéine fonctionnelle.

Dans un mode de réalisation particulier, le greffon contient des cellules présentant à la fois une mutation du gène codant pour la protéine WIPF1 (menant à une protéine non fonctionnelle ou une absence de protéine) et une séquence génétique permettant la production de la protéine fonctionnelle.

Dans un mode de réalisation particulier, le greffon contient des cellules présentant à la fois une mutation du gène codant pour la protéine PRF1 (menant à une protéine non fonctionnelle ou une absence de protéine) et une séquence génétique permettant la production de la protéine fonctionnelle.

Dans un mode de réalisation particulier, le greffon contient des cellules présentant à la fois une mutation du gène codant pour la protéine UNC13D (menant à une protéine non fonctionnelle ou une absence de protéine) et une séquence génétique permettant la production de la protéine fonctionnelle.

Dans un mode de réalisation particulier, le greffon contient des cellules présentant à la fois une mutation du gène codant pour la protéine STX11 (menant à une protéine non fonctionnelle ou une absence de protéine) et une séquence génétique permettant la production de la protéine fonctionnelle.

Dans un mode de réalisation particulier, le greffon contient des cellules dont le génome contient une séquence génétique choisie parmi celles décrites cidessus utilisables pour le traitement de patients infectés par le VIH, notamment codant pour un peptide C inhibant la fusion du virus avec la membrane plasmique des cellules cibles et celles interférant avec l’expression du co-récepteur cellulaire CCR5 ou des protéines virales nécessaires à la réplication du VIH.

L’invention se rapporte également à l’utilisation de la Prostaglandine E2 pour la préparation in vitro d’un greffon de cellules hématopoïétiques transduites destiné à être congelé pour conservation et décongelé avant administration chez un patient présentant une maladie génétique des cellules sanguines à composante inflammatoire, ou une infection par un VIH. Ces cellules sont des CD34+ ou des précurseurs de cellules T.

L’invention se rapporte également à un greffon de cellules CD34+ ou de progéniteurs de cellules T transduites, tel que décrit ci-dessus, pour son utilisation chez un patient atteint d’une pathologie des cellules du système hématopoïétique, à composante inflammatoire, pour le traitement de cette pathologie, et notamment pour permettre une reconstitution immunitaire avec des cellules corrigées chez ce patient.

L’invention se rapporte également une méthode de traitement d’un patient atteint d’une pathologie des cellules du système hématopoïétique, à composante inflammatoire, comprenant l’étape d’administration d’un greffon de cellules CD34+ tel que décrit ci-dessus au patient.

L’invention se rapporte également une méthode de traitement d’un patient atteint d’une pathologie des cellules du système hématopoïétique, à composante inflammatoire, comprenant l’étape d’administration d’un greffon de progéniteurs de cellules T transduites tel que décrit ci-dessus.

Dans un mode de réalisation particulier, le patient est un patient atteint du syndrome de Wiskott-Aldrich.

Dans un mode de réalisation particulier, le patient est un patient atteint de lymphohistiocytose.

Dans un mode de réalisation particulier, le patient est un patient atteint de granulomatose chronique (septique)

Dans un mode de réalisation préféré, la greffe est une autogreffe (les cellules CD34+ transformées ont été initialement récupérées chez le patient, et ont été transformés par un vecteur afin d’exprimer un gène et/ou une protéine permettant de corriger un défaut génétique chez ledit patient).

Description des Figures

Figure 1 : La Figure 1 montre le suivi mensuel du nombre de vecteur par cellule (VCN) dans les cellules mononuclées (PBMC, cercles), cellules CD15+ (neutrophiles, carrés) et CD14+ (monocytes, triangles) dans le sang périphérique chez un patient atteint de granulomatose chronique (CGD) traité par thérapie génique.

Figure 2: Comparaison des résultats de transduction (mesurée en nombre de copies de vecteurs par cellules (VCN) obtenus à partir de cellules CD34+ issues du sang d’un contrôle sain mobilisé (cellules souches périphériques ou CSP), transduites avec un vecteur lentiviral en présence ou non d’interféron, après 14 jours d’expansion (A) et dans les colonies granulocytaires et monocytaires (CFUGM) obtenues par culture clonogénique en milieu semi-solide (B). « Mock » indique que les cellules ont été cultivées dans les mêmes conditions que celles qui sont transduites, mais n’ont pas été exposées au vecteur viral.

Figure 3 : Comparaison des résultats de transduction (mesurée en nombre de copies de vecteurs par cellules (VCN) après 14 jours d’expansion), de cellules CD34+ issues de CSP de deux patients CGD, transduites par un vecteur lentiviral en présence ou non de PGE2 ajoutée 2 heures avant la transduction.

Figure 4 : viabilité mesurée par coloration des cellules mortes au bleu tryptan, après décongélation des cellules CD34+ de deux patients CGD transduites par un vecteur lentiviral en présence ou non de PGE2.

EXEMPLES

Exemple 1. Une greffe classique de cellules CD34+ chez un patient atteint de granulomatose ne permet pas d’obtenir un résultat clinique efficace (perte des cellules transduites)

Un patient atteint de granulomatose septique chronique (CGD) lié à l’X a reçu une autogreffe de cellules génétiquement modifiées. Le greffon contenait

9x10⁶ CD34 / kg dont 3x10⁶ dérivées de la moelle osseuse et 6x10⁶ de la mobilisation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) dans le sang périphérique (CSP) . Le nombre de copies du vecteur intégrées dans les cellules (VCN) du greffon était de 1.

Aucun évènement contraire n’a été observé immédiatement après la greffe. La reconstitution hématologique s’est déroulée comme prévue avec une sortie d’aplasie entre J10 et J15 de la ré-injection. La circulation des monocytes et des polynucléaires neutrophiles a permis une rapide amélioration de la situation clinique, notamment sur le plan pulmonaire ce qui a rendu possible une interruption du traitement antibiotique prophylactique (4 mois après thérapie génique).

Dès le 3e mois post-thérapie génique, on a observé un déclin du nombre de monocytes et neutrophiles circulants corrigés (Fig. 1). Cette décroissance se stabilise au sixième mois après greffe entre 5 et 7%, pourcentage qui garantit encore une protection anti-infectieuse mais pas une protection anti-inflammatoire.

On a effectué une transduction de cellules CD34+ de patients atteints de granulomatose chronique avec un vecteur portant un gène de correction. On a recherché le nombre de copies du vecteur par cellule (VCN).

	FR01	FR02	FR03
	CSP	MO	CSP2	CSP1	CSP
Nombre de CD34+/kg congelées transduites	1,34 x 107	3,74 x 106	1,45 x 107	2,80x 107	3,84 x 107
VCN à J14	1,2	0,6	0,32	0,44	0,35
Tableau 1- N	ombre de copies de vecteur par cellu	e (VCN) 14 jours après

transduction

Ces résultats montrent que la transduction des cellules mène à un faible nombre de vecteur par cellule même si la greffe de cellules « prend », il y a une attrition des cellules corrigées au cours du temps, ne permettant pas un effet thérapeutique complet à long terme.

Exemple 2. Les cellules du patient présentent des marqueurs d’inflammation inductibles aux interférons de type I

On a étudié si les cellules des patients CGD (atteints de granulomatose chronique) étaient caractérisées par une dérégulation de l’expression de gênes induits par les interférons de type-l (IFN-I). Lorsqu’une cellule est exposée aux IFN-I (après infection des cellules par des pathogènes viraux ou bactériens ou suite à l’incubation in vitro en présence d’IFN-l ou en conséquence des défauts génétiques conduisant à l’expression non contrôlée des IFN-I), la cascade biochimique induite via le récepteur de l’IFN-l induit la transcription d’une centaine de gènes, la plupart codant des protéines anti-virales. La signature Interferon de type-l (IFN-I) représente la mesure de l’expression transcriptionnelle de gènes sélectionnés pour être spécifiquement induits par le récepteur unique des IFN-I (IFNAR). La détection, par PCR quantitative, de l’expression augmentée de ces gènes traduit donc la présence d’IFN-l dans le milieu cellulaire. Une signature positive peut donc traduire un contexte infectieux ou une dérégulation de l’expression des IFN-I.

L’expression quantitative de 6 gènes induits par l’IFN-l (ILI44L, IFI27, RSAD2, IFIT1, ISG15 et SIGLEC1) a été analysée dans les cellules CD34+ d’un patient CGD (patient FR02 de l’exemple 1, ayant eu deux mobilisations suite à l’échec de la transduction sur un premier prélèvement).

L’échantillon des cellules du patient FR02 montre une expression augmentée de l’ensemble des 6 gènes étudiés (entre 10 et 100 fois), par rapport à des cellules contrôle d’un patient sain.

Exemple 3. Observations chez la souris

Des échantillon de cellules transduites de moelle osseuse (MO) ou du sang périphérique (cellules souches périphériques, CSP) provenant d’un patient atteint de CGD (FR01) ont été injectés à deux groupes de souris immunodéficientes NSG conditionnées par busulfan.

Deux groupes de souris contrôles ont été transplantés le même jour :

1. Un échantillon des CSP transduites provenant d’un sujet thalassémique traité avec succès par thérapie génique (1206CL).

2. Les CD34 non transduites provenant d’un sang de cordon (ou Cord Blood, CB).

La même quantité de cellules CD34 transduites a été transplantée chez les souris, quantité par expérience légèrement supérieure à celle du sang du cordon non transduit (Tableau 2)

Echantillons	MO CGD (FR01)	CSP CGD (FR01)	CSP (1206 CL)	CD34+ CB
Nombre de souris NSG injectées	3	5	2	2
Quantité de cellules injectées par souris	458 333	460 000	460 000	300 000

Tableau 2. Groupe de souris greffées et nombre de cellules transplantées par souris. MO et CSP CGD: cellules CD34+ transduites issus de la Moelle osseuse et cellules mobilisées (CSP, cellules souches périphériques) du patient CGD FR01. CSP (1206 CL): CD34+ transduites issus de la CSP d’un patient betathalassémique traité par thérapie génique. CD34+ CB : cellules CD34+ non transduites issus d’un sang de cordon.

Les CSH médullaires et périphériques reconstituent à long terme (= 4 mois) la moelle osseuse et les organes lymphoïdes périphériques des souris immunodéficientes. Le degré de prise est statistiquement supérieur pour la moelle osseuse par rapport aux cellules mobilisées chez le même patient CGD. La prise obtenue avec les cellules mobilisées du patient CGD est comparable à celle obtenue après transplantation des cellules provenant d’un patient atteint de thalassémie majeure et greffé avec des cellules génétiquement modifiées.

Les VCN analysées sur les cellules CD45+ humaines (hCD45) totales montrent une prise très modeste des cellules CD34 transduites et greffées à partir de l’échantillon de cellules mobilisées pour le patient atteint de CGD reproduisant ainsi ce que nous avons constaté chez ce même patient.

Ces résultats sont similaires à ce qui avait été observé in vivo chez l’homme (exemple 1), et montrent que le greffon contenait bien des CSH capables de prise, d’auto-renouvellement et de différentiation in vivo.

L’absence de prise/survie des cellules transduites a permis aux inventeurs de formuler l’hypothèse que les cellules mobilisées d’un patient CGD sont dans un état biologique qui, d’une part, interfère avec le processus de transduction et d’autre part, est responsable de leur « non prise/mort cellulaire », une fois transplantées.

Exemple 4 La présence d’interféron inhibe la transduction de cellules CD34+.

Pour essayer de démontrer formellement le lien entre activation des protéines antivirales, inflammation et résistance à la transduction, des cellules CD34 normales après activation par l’interféron alpha (IFN-α) ont été transduites avec un lentivirus différent. L’activation par IFN-α des cellules CD34+ interfère avec leur transduction (Figure 2), après expansion de 14 jours (A) et dans les colonies qranulo-monocytaires (CFU-GM) (B, précurseurs des CFU-G, à l'origine des granulocytes, et des CFU-M, à l'origine des monocytes et macrophages).

Ces expériences montrent que la présence d’interférons de type I diminue l’efficacité de transduction des progéniteurs et cellules souches hématopoïétiques (CD34+) d’un donneur sain.

Exemple 5 Comparaison des résultats de transduction (TD) selon le protocole CGP mesurée en nombre de copies de vecteurs par cellules (VCN) obtenus en présence ou non de PGE2 à l’expansion à jour 14.

Des cellules CD34+ issu d’un prélèvement de CSP d’un patient atteint de CGD ont été transduites par le vecteur lentiviral G1-XCG, en présence ou non de PGE2 (introduite 2 heures avant apport du vecteur viral).

La figure 3 montre que la PGE2 permet d’améliorer le taux de transduction (VCN). On a aussi pu montrer que la PGE2 permet d’améliorer le taux de transduction de cellules contrôles mise en présence d’interféron. On retrouve alors un taux de transduction similaire à celui observé pour des cellules non exposées à l’interféron et sans PGE2.

Exemple 6. Comparaison de la prise de greffe chez des souris immunodéficientes, après transplantation des cellules souches d’un patient CGD corrigées en présence ou non de PGE2.

Des cellules CD34+ issues du sang d’un patient atteint de CGD mobilisé ont été transduites par le vecteur lentiviral G1-XCG en présence ou non de PGE2, puis greffées à des souris immunodéficientes NSG conditionnées par Busulfan (3 souris par groupe). La prise de greffe dans les organes hématopoïétiques (moelle osseuse, thymus et rate) est définie par le pourcentage de cellules CD45+ humaines 4 mois après greffe. Ce délai correspond à une prise à long terme et permet de déterminer si le greffon contient ou non des cellules souches. Le niveau de correction (VCN) avant transplantation et 4 mois après transplantation permet d’évaluer le maintien des cellules souches corrigées.

Exemple 7. La PGE2 augmente le taux de survie de cellules congelées et décongelées.

La figure 4 montre la viabilité mesurée par coloration des cellules mortes au bleu tryptan, après décongélation des cellules CD34+ de deux patients CGD transduites 10 par un vecteur lentiviral en présence ou non de PGE2. On observe que l’introduction de PGE2 avant transfection et congélation des cellules permet d’augmenter la viabilité dans l’échantillon après décongélation.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS

   1. Procédé in vitro de transduction par un vecteur viral contenant un gène permettant de corriger un défaut génétique de cellules hématopoïétiques choisies parmi les cellules CD34+ et les précurseurs de cellules T, comprenant une étape de culture des cellules hématopoïétiques en présence de prostaglandine E2 préalablement à l’exposition au vecteur viral destiné à la transduction des cellules hématopoïétiques, caractérisées en ce que les cellules hématopoïétiques présentent des marqueurs d’inflammation.
2. 2. Procédé in vitro de préparation de cellules hématopoïétiques transduites en vue d’une greffe osseuse chez un patient présentant une maladie génétique des cellules sanguines à composante inflammatoire, comprenant

   a. une étape de culture des cellules en présence de prostaglandine E2, suivie

   b. d’une étape d’exposition à un vecteur viral contenant un gène permettant de corriger un défaut génétique de ces cellules, destiné à la transduction des cellules CD34+.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdites cellules hématopoïétiques ont été isolées ou obtenues par culture in vitro de cellules CD34+ d’un patient atteint de granulomatose septique chronique, du syndrome de Wiskott-Aldrich ou de lymphohistiocytose.
4. 4. Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la prostaglandine E2 est ajoutée au milieu de culture entre 4 et 1 heure avant exposition des cellules au vecteur viral.
5. 5. Procédé selon Lune des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la prostaglandine E2 est maintenue dans le milieu de culture avec le vecteur viral.
6. 6. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu’il comprend également au moins une étape choisie parmi

   a. Le lavage des cellules après transduction,

   b. La congélation des cellules après transduction

   c. le conditionnement des cellules transduites dans une poche pour injection à un patient.
7. 7. Utilisation de la Prostaglandine E2 pour la préparation in vitro d’un greffon de cellules souches hématopoïétiques transduites par un vecteur viral contenant un gène permettant de corriger un défaut génétique de ces cellules destiné à être congelé pour conservation et décongelé avant administration chez un patient présentant une maladie génétique des cellules sanguines à composante inflammatoire.
8. 8. Utilisation-de la Prostaglandine E2 pour la préparation in vitro d’un greffon de cellules souches hématopoïétiques transduites par un vecteur viral contenant un gène permettant de corriger un défaut génétique de ces cellules, mettant en œuvre la culture de cellules souches hématopoïétiques en présence du vecteur viral, ledit greffon présentant une survie à long terme améliorée du greffon chez le patient présentant une maladie génétique des cellules sanguines à composante inflammatoire.
9. 9. Greffon de cellules hématopoiétiques transduites susceptibles d’être obtenues par un procédé selon l’une des revendications 1 à 6, dans lequel le nombre de copies du gène corrigeant un défaut génétique par cellule est supérieur ou égal à 1,5.
10. 10. Greffon selon la revendication 9, pour son utilisation pour le traitement d’une maladie génétique des cellules sanguines à composante inflammatoire.