WO2023118752A1 - Cellule progeniteur des lymphocytes t exprimant de maniere regulee un transgene d'interet - Google Patents

Cellule progeniteur des lymphocytes t exprimant de maniere regulee un transgene d'interet Download PDF

Info

Publication number
WO2023118752A1
WO2023118752A1 PCT/FR2022/052469 FR2022052469W WO2023118752A1 WO 2023118752 A1 WO2023118752 A1 WO 2023118752A1 FR 2022052469 W FR2022052469 W FR 2022052469W WO 2023118752 A1 WO2023118752 A1 WO 2023118752A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
progenitor
promoter
cell
expression
Prior art date
Application number
PCT/FR2022/052469
Other languages
English (en)
Inventor
Inna MENKOVA
Original Assignee
Universite Claude Bernard Lyon 1
Centre National De La Recherche Scientifique
Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale)
Centre Leon Berard
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Claude Bernard Lyon 1, Centre National De La Recherche Scientifique, Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale), Centre Leon Berard filed Critical Universite Claude Bernard Lyon 1
Publication of WO2023118752A1 publication Critical patent/WO2023118752A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • T-lymphocyte progenitor cell expressing a transgene of interest in a regulated manner
  • the invention relates to a progenitor-T cell comprising an expression cassette which allows regulated expression of a transgene of interest, depending on the stage of maturation of said progenitor-T cell.
  • the invention also relates to a cell population enriched in such progenitor-T cells, a method for preparing the progenitor-T cells, and their use in therapy.
  • Targeted immunotherapies rely on the use of immune cells or molecules that engage immune cells to treat various diseases, including cancers, infections or autoimmune disorders.
  • genetic modification of T cells to express chimeric antigen receptors that target tumor antigens has recently proven successful in the treatment of acute lymphoblastic leukemias and non-Hodgkin's lymphomas. It involves taking the patient's T cells, modifying them in vitro to make them express the chimeric antigen receptor (CAR) and re-infusing them in the same patient.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • These cells can specifically recognize, thanks to chimeric receptors, target molecules on the surface of cancer cells and mobilize the entire immune system to increase the natural response.
  • the very high cost of treatment approximately €400,000/patient
  • failures in the preparation of cell batches for some patients currently prevent this technology from being applied to all patients who need it.
  • Allogeneic approaches based on the use of T-cells from healthy donors, could address these issues.
  • Allogeneic T cells from peripheral blood donors can be used for adoptive T cell therapy.
  • the use of mature T cells has certain drawbacks.
  • the occurrence of graft versus host disease (GvHD) due to the T cell receptor (TCR) repertoire expressed by these mature cells requires genetic manipulation in order to turn off genes responsible for rejection, e.g. those of the Major Histocompatibility Complex (MHC).
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • mature T cells rapidly differentiate into short-lived effector cells, thereby limiting their therapeutic activity. cell administration Modified T-progenitors generated in vitro from hematopoietic stem cells is being considered to circumvent these problems.
  • modified progenitor-T cells migrate into the host thymus and are subject to natural selection of their TCR repertoire allowing them to develop tolerance to host antigens.
  • the continuous generation of mature T cells in vivo from the genetically modified T cell progenitors allows for better cell persistence and therefore improved therapeutic activity.
  • modified T-progenitor cells therefore requires passing these two selection steps, and in particular avoiding cell depletion during the negative selection step. Since the negative selection step is very sensitive, additional strategies to overcome depletion at this step must be exploited, for example the use of promoters that allow temporal, conditional, and therefore maturation-dependent expression.
  • the inventors propose to improve these cell therapy strategies by preventing the progenitors of T-cells expressing the transgene of interest from being depleted during the stages of thymic selection, so as to allow increased availability of the modified T-cells.
  • the present invention relates to a progenitor-T cell expressing in a regulated manner a nucleic sequence of interest. More particularly, the nucleic sequence of interest is placed under the control of an exogenous promoter induced by the Notch pathway, chosen from the promoter of VIL7RA or of BCL11B, thus allowing regulated expression according to the state of maturation of the progenitors -T.
  • the invention aims here to provide modified T-progenitors, the expression of the transgene of which is induced at certain stages of maturation and not at others (expression known as “maturation-dependent”), thus making it possible not to express the transgene during certain critical stages of thymic selection, in order to avoid cell depletion during these stages of maturation in the thymus.
  • the proposed system aims to restrict the expression of the transgene in cells engaged in the T lymphoid differentiation pathway, while avoiding the expression of the transgene at certain critical stages of thymic selections and in other non-T cell lines.
  • a first aspect of the invention relates to an isolated progenitor-T cell, preferably human, exhibiting a CD45RA+, CD7+, CD5+ phenotype, said progenitor-T cell comprising an expression cassette which comprises an exogenous promoter induced by the pathway Notch selected from the VIL7RA or BCL11B promoter, said promoter being functionally linked to a heterologous nucleic sequence of interest.
  • said cell exhibits a CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ phenotype.
  • the VIL7RA promoter sequence does not comprise the nucleic sequence SEQ ID NO: 2. In another particular embodiment, the VIL7RA promoter sequence comprises or consists of the nucleic sequence SEQ ID NO: 2.
  • the heterologous nucleic sequence of interest encodes a chimeric antigen receptor.
  • the invention also relates to a cell population enriched in T-progenitor cells as defined above, said population preferably comprising at least 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, preferably at least 90% of said T-progenitor cells.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the progenitor-T cell or the cell population.
  • the invention also relates to an expression cassette comprising the promoter region of VIL7RA operably linked to a heterologous nucleic sequence of interest, in which the promoter region of VIL7RA comprises or consists of a nucleic sequence having at least 85%, 90 %, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% sequence identity sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the nucleic sequence of interest encodes a chimeric antigen receptor or a T cell receptor.
  • the invention further relates to an expression cassette comprising the BCL11B promoter operably linked to a heterologous nucleic sequence of interest, wherein the BCL11B promoter preferably comprises or consists of a nucleic sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the nucleic sequence SEQ ID NO: 3.
  • the nucleic sequence of interest encodes a receptor chimeric antigen or T cell receptor.
  • the invention also relates to a use of an expression cassette comprising the promoter region of VIL7RA or of BCL11B functionally linked to a heterologous nucleic sequence of interest, or of a vector comprising it, for the generation of progenitor cells -T.
  • the vector is preferably a viral vector, preferably a retroviral vector, and more preferably a lentiviral vector.
  • the invention also relates to a method for preparing T-progenitor cells as defined above, comprising the following steps: a) culturing CD34+ hematopoietic stem cells in a culture medium comprising cytokines allowing the differentiation of said CD34+ cells in progenitor-T cells exhibiting a CD45RA+, CD7+, CD5+ phenotype, preferably a CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ phenotype; b) transformation or transduction of the cells before, during or after said step (a) of differentiation, with a vector comprising an expression cassette as defined above; wherein the CD34+ hematopoietic stem cells are preferably derived from umbilical cord blood, peripheral blood or bone marrow, more preferably from umbilical cord blood.
  • Another aspect of the invention relates to said progenitor-T cell, said cell population or said pharmaceutical composition, for its use in the treatment of a cancer, an infectious disease, a genetic disease, an inflammatory disease or an immune or autoimmune disease.
  • said one or more T-progenitor cells are autologous or allogeneic cells with respect to the patient to be treated, said cells preferably being allogeneic cells.
  • the invention also relates to an in vitro method for determining whether a subject is likely to respond to treatment with a pharmaceutical composition of the invention, said method comprising: a) measuring in the sample the quantity of Recent Thymic Emigrants (RET) cells , b) comparing the quantity of RTE cells measured in the sample with a reference value, c) determining whether the subject is likely to respond to treatment with a pharmaceutical composition of the invention, in which a quantity of RTE cells equal or greater than the reference value indicates a likelihood of responding to treatment.
  • RET Recent Thymic Emigrants
  • Another aspect of the invention relates to a method of treating a disease or disorder in a subject comprising: a) determining whether the subject is likely to respond to said treatment by in vitro evaluation of thymic activity in a sample blood of said subject, in particular by: measuring the quantity of Recent Thymic Emigrant (RTE) cells in the sample, comparing the quantity of RTE cells measured in the sample with a reference value, determining whether the subject is likely to respond to the treatment with a pharmaceutical composition of the invention, wherein an amount of RTE cells equal to or greater than the reference value indicates a susceptibility to respond to the treatment. b) administering to the subject likely to respond to the treatment a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition of the present invention.
  • RTE Recent Thymic Emigrant
  • the IL7RA promoter is believed to be located at positions -1257 to +89 of the gene relative to the transcription initiation site.
  • the “GfI-1” and “GABPa” transcription factors bind to the sequences 5′-TAAATCAC[AT]GCA-3′ (SEQ ID NO: 10) and repeats rich in purines (repeats (GA)) respectively.
  • the promoter contains CpG methylation islands at positions -975, -567, -497, -475, -466, -346.
  • the promoter includes the TATA box, at position -27 to -22 of the human IL7RA gene.
  • the "ATG" start codon is found at position +90.
  • Figure 2 -A Schematic representation of the protocol consisting in culturing Jurkat (lymphoid) and THP-1 (non-lymphoid) cells in the presence or absence of a Notch ligand (Delta-like 4, DLL4) for 4 days.
  • a Notch ligand Delta-like 4, DLL4
  • Figure 2-B Molecular analysis of the expression of IL7RA and HES mRNA (control) by RT-qPCR, in Jurkat cells, cultured in the presence (+) or absence (-) of DEE4.
  • Figure 2-C Molecular analysis of the expression of IL7RA and HES mRNA (control) by RT-qPCR, in THP-1 cells (non-T line), cultured in the presence (+) or absence (-) of DEE4.
  • Figure 3-A schematic representation of the cassette comprising the sequence of the VIL7RA promoter restricted (SEQ ID NO: 1, "SEQ.1”) or extended (SEQ ID NO: 2, “SEQ.2”) functionally linked to GFP, and cloned into a lentiviral vector.
  • the lentiviral vector is used to transduce Jurkat and THP-1 cells.
  • Figure 3-B analysis of the expression of the GFP protein by flow cytometry, in transduced Jurkat or THP-1 cells, depending on the promoter used: (i) control promoter (“cntrl”, corresponding to the Spleen focus promoter -forming virus "SFFV”), (ii) restricted sequence (SEQ.l) of the VIL7RA promoter or (iii) extended sequence (SEQ.2) of the VIL7RA promoter.
  • control promoter (“cntrl”, corresponding to the Spleen focus promoter -forming virus "SFFV”
  • SFFV Spleen focus promoter -forming virus
  • Figure 3-C molecular analysis of the expression of GFP mRNA by RT-qPCR, in transduced Jurkat or THP-1 cells, in the presence (+) or absence (-) of DLL4 depending on the promoter used: ( i) control promoter ("cntrl"), or (ii) restricted sequence (SEQ.1) of the VIL7RA promoter. [Fig 4]. Expression of the CAR transgene under the control of the VIL7RA promoter
  • Figure 4-A schematic representation of the cassette comprising the sequence of the VIL7RA promoter restricted (SEQ ID NO: 1, "SEQ.1”) or extended (SEQ ID NO: 2, “SEQ.2”) functionally linked to the sequence encoding a Chimeric Antigenic Receptor (CAR-GFP), and cloned into a lentiviral vector.
  • the lentiviral vector is used to transduce THP-1 cells.
  • Figure 4-B analysis of the expression of the GFP protein in the transduced THP-1 cells, by flow cytometry, according to the promoter used: (i) control promoter (SFFV promoter, “cntrl”), (ii) restricted sequence (SEQ.1) of the VIL7RA promoter or (iii) extended sequence (SEQ.2) of the VIL7RA promoter.
  • VIL7RA promoter is a strong promoter
  • Figure 6-A schematic representation of the protocol consisting in culturing CD34+ hematopoietic stem cells (HSC) in the presence or absence of a Notch ligand (Delta-like 4, DLL4) for 6 days.
  • HSC hematopoietic stem cells
  • DLL4 Notch ligand
  • Figure 6-B analysis of the expression of the endogenous IL7R protein in the presence (+) or absence (-) of DLL4 in CD34+ hematopoietic stem cells (HSC).
  • Figure 6-C Molecular analysis of IL7RA and HES mRNA expression by RT-qPCR in hematopoietic stem cells cultured in the presence (+) or absence (-) of DLL4.
  • Figure 7-A schematic representation of the cassette comprising the sequence of the VIL7RA promoter restricted (SEQ ID NO: 1, "SEQ.1") or extended (SEQ ID NO: 2, “SEQ.2”) functionally linked to the sequence encoding a Chimeric Antigenic Receptor (CAR-GFP), and cloned into a lentiviral vector.
  • the lentiviral vector is used to transduce CD34+ hematopoietic stem cells cultured in a differentiation medium.
  • Figures 7-B and 7-C analysis of GFP expression by flow cytometry, in different populations of interest: T precursors (CD45RA+CD7+, “pre-T”), CD3-negatives (CD4-CD8 - CD3-, “CD3-”) and CD3-positive (CD4-CD8-CD3+, “CD3+”), depending on the promoter used: (i) control (“cntrl”), (ii) restricted sequence (SEQ.l ) or (iii) extended sequence (SEQ.2) of the VIL7RA promoter. The mean of the 3 independent experiments is shown (B) together with data from one of the experiments (C).
  • Figure 8-A schematic representation of the cassette comprising the sequence of the VIL7RA promoter restricted (SEQ ID NO: 1, "SEQ.1") or extended (SEQ ID NO: 2, “SEQ.2”) functionally linked to the sequence encoding a Chimeric Antigenic Receptor (CAR-GFP), and cloned into a lentiviral vector.
  • the lentiviral vector is used to transduce naive CD4+ T cells cultured in the presence (+) or absence (-) of DLL4.
  • Figure 8-B analysis of the expression of VIL7RA and of the CAR-GFP transgene by flow cytometry, in naive CD4+ T cells cultured in the presence (+) or absence (-) of DLL4, depending on the promoter used: ( i) control promoter (“cntrl”) (ii) restricted sequence (SEQ.1) of the VIL7RA promoter or (iii) extended sequence (SEQ.2) of the VIL7RA promoter.
  • control promoter (“cntrl”)
  • SEQ.1 restricted sequence of the VIL7RA promoter
  • SEQ.2 extended sequence
  • Figure 9-A Example of labeling CD4-Pacif ⁇ c Blue, CD3-Alexa Fluor 700, CD8-APC-H7, CCR7 -Alexa Fluor 647 (BD Biosciences), CD45RA-PE-TexasRed, CD31-PE (Miltenyi Biotech) and CD27 -PE-Cy7 (eBioscience), LIVE/DEAD aqua fluorescent dye (Invitrogen) from whole blood samples.
  • a first aspect of the invention relates to an isolated progenitor-T cell, modified so as to comprise an expression cassette comprising an exogenous promoter induced by the Notch pathway chosen from the promoter of VIL7RA or of BCL11B, said promoter being linked in a manner functional to a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • isolated means that the progenitor cell is separated or isolated from its natural environment. This expression thus distinguishes isolated cells from cells that are an integral part of the human body.
  • the progenitor-T cell is a mammalian cell.
  • the progenitor-T cell is a human cell.
  • progenitor-T cell or "progenitor T cell” or “pro-T cell” as used herein means a T cell which has the potential to differentiate into cells having the morphological, physiological, functional and/or immunological characteristics of T cells.
  • the T-progenitor cell according to the invention corresponds to a cell having lost all differentiation potential except the potential for differentiation towards the lymphoid pathway.
  • T-progenitor cells can easily be characterized, based on the expression of surface antigens such as CD7, CD45RA, CD5, CDla, CD3, CD4, CD8. The expression of surface antigens can be easily determined, in particular by the technique of flow cytometry.
  • the T-progenitor cells according to the invention exhibit the CD45RA+, CD7+, CD5+ phenotype, preferably the CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+ phenotype.
  • the T-progenitor cells according to the invention have the following phenotype:
  • the T-progenitor cells according to the invention have the CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+, CD3-, CD4-, CD8- phenotype (T precursors).
  • Progenitor-T cells express thymic homing receptors, i.e. receptors allowing T-cells to reside in the thymus (e.g. CD5 or CXCR4, CD62L, CCR7 and CCR9), and are able to migrate in the thymus after their injection into the peripheral blood to finish their maturation there and become cells tolerated vis-à-vis a given recipient.
  • thymic homing receptors i.e. receptors allowing T-cells to reside in the thymus (e.g. CD5 or CXCR4, CD62L, CCR7 and CCR9), and are able to migrate in the thymus after their injection into the peripheral blood to finish their maturation there and become cells tolerated vis-à-vis a given recipient.
  • the progenitor-T cell is genetically modified ex vivo to express a nucleic acid sequence of interest, under the control of an exogenous promoter induced by the Notch pathway chosen from the promoter of VIL7RA or BCL11B.
  • exogenous promoter is meant a promoter which is not a promoter naturally present in the progenitor-T cell.
  • the VIL7RA promoter is not the endogenous VIL7RA promoter naturally present in the T-progenitor cell genome.
  • the BCL11B promoter according to the invention is not the endogenous BCL11B promoter naturally present in the genome of the progenitor-T cell.
  • the progenitor-T cell according to the invention comprises an expression cassette, which itself comprises: an exogenous promoter induced by the Notch pathway chosen from the promoter of VIL7RA or of BCL11B, said promoter being functionally linked to a sequence heterologous nucleus of interest.
  • nucleic sequence any sequence consisting of nucleic acids, such as deoxyribonucleic acids or ribonucleic acids.
  • operably linked refers to a juxtaposition of two nucleic acid sequences in which the sequences are in a relationship allowing them to function in the intended manner.
  • a promoter is said to be operatively/functionally linked to the coding nucleic sequence, if the linking or connection allows transcription of said nucleic sequence.
  • DNA sequences such as, for example, a promoter and a nucleic acid coding molecule, are said to be functionally linked if the nature of the linkage between sequences (1) does not result in the introduction of a frameshift, (2) does not interfere with the ability of the promoter to direct transcription of the nucleic coding region, or (3) does not interfere with the ability of the nucleic region of interest to be transcribed by the sequence of the promoter region.
  • the nucleic sequence of interest can be linked to other regulatory sequences, such as transcription enhancers, terminators, Kozak sequence, etc.
  • promoter used herein means a promoter region that controls the transcription of a particular gene, and includes a promoter and/or an enhancer.
  • a promoter is a region of DNA that initiates transcription of a particular gene. Promoters are located close to gene transcription initiation sites, on the same strand and upstream of the DNA (towards the 5' region of the sense strand). Promoters are generally around 100 to 1000 base pairs in length.
  • An enhancer is a short region (50-1500 bp) of DNA that can be bound by transcription factors to stimulate transcription of a gene. Enhancers can be found far from the genes whose expression they control ( ⁇ 1,000,000 bp).
  • the promoter is a promoter induced (or activated) by the Notch pathway.
  • a “Notch-mediated” promoter is a promoter whose transcription initiation activity will be activated by the Notch pathway.
  • the Notch protein is a receptor in its extracellular part. On contact with the ligand, the intracellular part of the Notch protein (Intracellular Notch, ICN) is cleaved and then translocated into the nucleus of the cell where it acts as a transcription factor. Depending on the physiological context, ICN associates with other proteins, and this complex binds to the promoters and/or enhancers of the target genes by promoting a dynamic context for the regulation of the target genes.
  • the Notch protein does not have its own transcriptional activity and acts as a recruitment platform for additional co-activators.
  • the inventors propose to use a promoter of a target gene of the Notch pathway, in order to allow the expression of the trans gene in the cells engaged in the T lymphoid differentiation pathway, while avoiding the expression of the transgene at certain stages thymic selections.
  • the use of such promoters advantageously makes it possible not to express the transgene during certain critical stages of thymic selection, in order to avoid the depletion of the modified progenitor-T cells, during these stages of maturation in the thymus.
  • VIL7RA and BCL11B promoters used in the context of the present invention are promoters activated by the Notch pathway.
  • Notch ligands for example delta-like 1, DLL-1 and delta-like 4, DLL-4
  • IL7RA and BCL11B are promoters activated by the Notch pathway.
  • the expression cassette of the present description may comprise a promoter (or "promoter region") derived from the IL7RA gene (also called IL7R, IL7R-alpha or CD 127 gene), preferably a promoter derived from the human IL7RA gene.
  • promoter or "promoter region” derived from the IL7RA gene (also called IL7R, IL7R-alpha or CD 127 gene), preferably a promoter derived from the human IL7RA gene.
  • the term "derived from” as used herein indicates a relationship between a first molecule and a second molecule, and generally refers to the structural similarity between the two molecules and does not require either of them to be physically generated from the other.
  • a promoter "derived" from a human IL7RA gene refers to a promoter that contains a functionally active region of the promoter of a human IL7RA gene, or a functional equivalent thereof (e.g., a variant of the promoter region containing nucleotide changes from the native sequence where the nucleotide changes do not negatively affect the transcriptional regulatory activity of the promoter).
  • the sequence of the IL7RA promoter introduced into the expression cassette corresponds to a sequence located in the region from -1257 to +89 base pairs (relative to the transcription initiation site) of the IL7RA gene.
  • nucleotides X to Y of a human IL7RA gene, is meant the nucleotides X to Y of the human IL7RA gene as referenced in the NCBI database (NCBI reference: 3575), or Ensembl (Ensembl reference: ENSG00000168685).
  • the "+1" nucleotide corresponds to the transcription initiation site.
  • the start codon (ATG) of the human IL7RA gene is thus at position +90 of exon 1.
  • the sequence of the VIL7RA promoter introduced into the expression cassette comprises the potential Notch-binding domains of the native IL7RA promoter (nucleotides -927 to -920).
  • the VIL7RA promoter used in the expression cassette comprises nucleotides -927 to -920 of the human IL7RA gene.
  • the sequence of the VIL7RA promoter used in the expression cassette of the invention comprises CpG islands capable of being demethylated under the action of Notch.
  • the VIL7RA promoter sequence used in the expression cassette may comprise nucleotides -1100 to -300 of the human IL7RA gene (region which includes several methylation sensitive CpG islands).
  • the sequence of the VIL7RA promoter used in the expression cassette can comprise the CpG islands at position -975, -567, -497, -475, -466, -346 of the promoter of the human IL7RA gene.
  • the VIL7RA promoter sequence used in the expression cassette may further comprise the NF-kB binding site, located at position -187 to -173 of the human IL7RA gene.
  • the VIL7RA promoter sequence used in the expression cassette may further comprise the TATA box, at position -27 to -22 of the human IL7RA gene.
  • the promoter sequence used in the expression cassette of the invention comprises:
  • IL7RA promoter which comprises the potential binding domains to Notch, said region corresponding for example to nucleotides -927 to -920 of the human IL7RA gene;
  • IL7RA enhancer which comprises the potential binding domain to Notch, said region corresponds for example to nucleotides +27755 to +27762 of the human IL7RA gene;
  • the promoter sequence used in the expression cassette according to the invention can also contain sequences of the IL7RA gene downstream of the transcription initiation site (downstream of nucleotide +1).
  • the promoter sequence used in the expression cassette may comprise nucleotides 1 to 10, or nucleotides 1 to +100, or nucleotides 1 to +200 of the IL7a gene.
  • the promoter of the expression cassette can include a sequence (for example of about 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600 or 1800 bp) from the region - 1257 to +200 of the human IL7RA gene.
  • the size of the promoter sequence introduced into the expression cassette does not exceed about 2 kb (e.g., does not exceed 2.2 kb) so as to allow inclusion of a large sequence. coding in the vector.
  • the sequence of the VIL7RA promoter introduced into the expression cassette according to the invention comprises or consists of a sequence comprising the nucleotides -1257 to +89 of the VIL7RA gene.
  • the sequence of the VIL7RA promoter introduced into the expression cassette comprises or consists of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, or a functional variant having at least 80%, 85%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the nucleic sequence SEQ ID NO: 1.
  • a "functional variant" of a promoter is a sequence derived from a parent promoter sequence, which has the same type of transcription initiation activity, but with a different nucleic sequence.
  • Such a functional variant can have at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5 %, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, at least 99.9 % identity with parent sequence.
  • Such a functional variant results in the same or substantially the same level of expression of a given protein operably linked thereto as the promoter from which it is derived.
  • such a functional variant can lead to an expression level equivalent to at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100 %, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 220%, 240%, 260%, 280%, 300%, 350%, 400%, 500%, or even at least 600%, relative to the level of expression obtained with the parent promoter from which it derives.
  • the VIL7RA promoter sequence introduced into the expression cassette according to the invention comprises:
  • the sequence of the VIL7RA promoter comprises or consists of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2, or a functional variant having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% , 98%, or at least 99% identity with the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • the sequence of the promoter of VIL7RA does not include the nucleic sequence SEQ ID NO: 2, nor a functional variant having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • the sequence of the VIL7RA promoter comprises the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, or a functional variant having at at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the nucleic sequence SEQ ID NO: 1, but does not include the nucleic sequence SEQ ID NO : 2, nor a functional variant having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the nucleic sequence SEQ ID NO: 2.
  • the sequence of the VIL7RA promoter comprises or consists of the nucleic sequence SEQ ID NO: 1, or a functional variant having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the nucleic sequence SEQ ID NO: 1, and comprises between 1300 and 1800 nucleotides, preferably between 1320 and 1700 nucleotides, preferably between 1340 and 1600 nucleotides, preferably between 1346 and 1500 nucleotides.
  • a human IL7RA gene refers to an IL7RA gene from any human individual. It may contain genetic variations from the specific sequences mentioned here. This disclosure contemplates all functional equivalents of the promoter sequences specifically mentioned in the application.
  • the Applicant has shown that the expression of a CAR transgene under the control of the extended VIL7RA promoter (SEQ.2) does not allow regulated expression of the transgene in a maturation-dependent manner, ie that the expression of the transgene remains stable at during T maturation. It also showed that expression under the control of this promoter is high in CD34+ hematopoietic stem cells.
  • this extended promoter of VIL7RA therefore allows expression of a transgene at a high level in a stable manner in CD34+ hematopoietic stem cells.
  • the Applicant has therefore demonstrated that this extended promoter is a strong constitutive promoter in CD34+ hematopoietic stem cells, and consequently the possibility of using the VIL7RA promoter comprising or consisting of the nucleic sequence SEQ ID NO: 2, or a functional variant , for the modification of CD34+ hematopoietic stem cells and the expression of a heterologous nucleic sequence of interest in a stable and strong manner.
  • another aspect of the invention relates to an isolated progenitor-T cell, preferably human, exhibiting a CD45RA+, CD7+, CD5+ phenotype, said progenitor-T cell comprising an expression cassette which comprises the VIL7RA promoter comprising or consisting in the nucleic sequence SEQ ID NO: 2, or a functional variant having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the nucleic sequence SEQ ID NO: 2, said promoter being functionally linked to a heterologous nucleic sequence of interest.
  • the invention therefore also relates to an expression cassette comprising the promoter region of VIL7RA operably linked to a heterologous nucleic sequence of interest, in which the promoter region of VIL7RA comprises or consists of a nucleic sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2.
  • the nucleic acid sequence of interest codes for a receptor chimeric antigen or a T cell receptor.
  • the invention also relates to a use of an expression cassette comprising the promoter region of VIL7RA or of BCL11B functionally linked to a heterologous nucleic sequence of interest in which the promoter region of VIL7RA comprises or consists of a nucleic sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% of identity with the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 2, or of a vector comprising it, for the generation of progenitor-T cells.
  • the vector is preferably a viral vector, preferably a retroviral vector, and more preferably a lentiviral vector.
  • the expression cassette of the present description may alternatively comprise a promoter derived from the human BCL11B gene.
  • a promoter "derived" from a human BCL11B gene refers to a promoter that contains a functionally active region of the promoter of a human BCL11B gene, or a functional equivalent thereof (e.g., a variant of the promoter region containing nucleotide changes from the native sequence where the nucleotide changes do not negatively affect the transcriptional regulatory activity of the promoter).
  • the sequence of the BCL11B promoter introduced into the expression cassette corresponds to a sequence located in the region from -4864 to +979 base pairs (relative to the transcription initiation site) of the BCL11B gene.
  • nucleotides -4864 to +979 of a BCL11B gene, is meant the nucleotides -4864 to +979 of the human BCL11B gene as referenced in the NCBI database (NCBI reference: 64919), or Ensembl (Ensembl reference: ENSG00000127152 ).
  • the sequence of the BCL11B promoter comprises or consists of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3, or a functional variant having at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% , 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the nucleic acid sequence SEQ ID NO:3.
  • said functional variant of the BCL11B promoter having at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the nucleic sequence SEQ ID NO: 3, comprises at most 4000 base pairs (bp), preferably at most 3000 bp.
  • said functional variant can comprise from 500 to 4000 bp, preferably from 1000 to 3000 bp, preferably from 1000 to 2000 bp.
  • the VILR7A or BCL11B promoter is operably linked to a heterologous nucleic sequence of interest.
  • the promoter sequence can be directly linked to the heterologous nucleic sequence of interest. Alternatively, the two sequences can be linked by a linker sequence.
  • heterologous nucleic acid sequence of interest is meant any heterologous sequence with respect to the promoter used.
  • the promoter is the VIL7RA promoter
  • the nucleic sequence does not code for VIL7RA.
  • the promoter is the BCL11B promoter
  • the nucleic sequence does not code for BCL11B.
  • the heterologous nucleic sequence of interest can be any sequence having a therapeutic interest when it is expressed by T-cells.
  • the invention can be used to produce additional copies of genes to enable increased T cell expression of certain gene products in vivo.
  • the nucleic sequence of interest can be a nucleic sequence coding for a therapeutic protein or a therapeutic nucleic acid.
  • the therapeutic protein or therapeutic nucleic acid when expressed by the T cell has a beneficial effect in the treatment of a human or veterinary disease or disorder.
  • the therapeutic nucleic acid is preferably a therapeutic RNA.
  • the therapeutic protein can be a peptide or a polypeptide.
  • Nucleic sequences of interest include, but are not limited to, those encoding a chimeric antigen receptor (CAR), a chimeric co-stimulatory receptor (CCR), a T-cell receptor (TCR), a cytokine, a hormone, antibody, biosensor, soluble receptor, enzyme, ribozyme, reporter, epigenetic modifier, transcriptional activator or repressor, non-coding RNA, or the like.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • CCR chimeric co-stimulatory receptor
  • TCR T-cell receptor
  • cytokine a hormone, antibody, biosensor, soluble receptor, enzyme, ribozyme, reporter, epigenetic modifier, transcriptional activator or repressor, non-coding RNA, or the like.
  • nucleic acid sequence of interest can encode, for example, a cDNA, a gene, a miRNA or IncRNA, or other.
  • the T-progenitor cells are modified to recognize an antigen such as a tumor antigen, a viral antigen or a bacterial antigen.
  • an antigen such as a tumor antigen, a viral antigen or a bacterial antigen.
  • the nucleic sequence of interest encodes a chimeric antigen receptor (CAR).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention therefore relates in particular to an expression cassette comprising the promoter region of VIL7RA operably linked to a heterologous nucleic sequence of interest, in which the nucleic sequence of interest codes for a chimeric antigenic receptor (CAR) or for a T cell receptor (TCR).
  • the promoter region of VIL7RA comprises or consists of a nucleic acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the sequence nucleic sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, preferably with the nucleic sequence SEQ ID NO: 1.
  • the promoter region of VIL7RA comprises or consists of a nucleic acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the sequence SEQ ID NO: 3.
  • CAR Chimeric Antigen Receptor
  • a CAR typically comprises an ectodomain (extracellular domain) and an endodomain (cytoplasmic domain), linked by a transmembrane domain.
  • the ectodomain expressed on the cell surface, comprises an antigen-binding domain or receptor domain and optionally a spacer (or hinge) region linking the antigen-binding domain to the transmembrane domain.
  • the transmembrane domain is typically a hydrophobic alpha helix that extends through the lipid bilayer of the cell membrane.
  • the CAR endodomain is composed of an intracellular signaling module that induces activation of T cells upon antigen binding.
  • the endodomain can include multiple signaling domains.
  • the CAR may be a "first generation", “second generation”, or “third generation” CAR (see, e.g., Sadelain et al., Cancer Discov. 3(4):388-398 (2013); Jensen et al., Immunol. Rev. 257: 127-133 (2014); Sharpe et al., Dis. Model Mech. 8(4): 337-350 (2015); Brentjens et al., Clin Cancer Res.13:5426-5435 (2007), Gade et al., Cancer Res).
  • the role of the CAR signaling domain is to transduce the activation signal to the immune cell as soon as the extracellular domain has recognized the antigen.
  • First-generation CARs contain only the CD3 chain
  • Second-generation CARs include a cytoplasmic domain containing the CD28 costimulation domain, fused to CD3 This design provides both an activation and proliferation signal to the T cell ( as a result, the cell is activated, destroys the target cell and proliferates).
  • the signaling sequences of costimulation receptors such as CD134 (TNFRSF4, 0X40), CD154 (CD40L), CD137 (4-1BB), ICOS (CD278), CD27, CD244 (2B4), were tested with success in CARs.
  • the third generation of CAR is based on the combination of two or more costimulation sequences (such as 4-1 BB-CD28-CD3Q. These receptors secrete a wider range of cytokines (including TNF ⁇ , GM-CSF and l).
  • cytokines including TNF ⁇ , GM-CSF and l
  • endodomains can be used, since so-called third-generation CARs generally have at least 2 or 3 signaling domains fused together for an additive or synergistic effect, for example.
  • the CAR has a binding domain which binds to an antigen, said antigen being associated with a disease or disorder present in the subject or which it is desired to prevent in the subject to whom the cell is administered.
  • the CAR binds a tumor associated antigen (“tumor associated antigen” in English, or TAA).
  • the antigen-binding domain of the CAR is capable of binding a TAA chosen from the following non-exhaustive list: CD19, CD20, ErbB2, Mucl, CD13, CD33, GD2, NCAM, ALK , CD52, CD160, CA-125, folate binding protein, CD5, EGFR, Vimentin, BCMA, CD138, carbonic anhydrase IX, G250, PSMA, A33
  • TAA chosen from the following non-exhaustive list: CD19, CD20, ErbB2, Mucl, CD13, CD33, GD2, NCAM, ALK , CD52, CD160, CA-125, folate binding protein, CD5, EGFR, Vimentin, BCMA, CD138, carbonic anhydrase IX, G250, PSMA, A33
  • the antigen-binding domain of the CAR is capable of binding a TAA, as listed in the table below (non-exhaustive list).
  • the antigen-binding domain of CAR is able to bind to CD19.
  • T-cell receptor refers to a molecule capable of recognizing a peptide when presented by an MHC molecule.
  • the molecule may be a heterodimer of two ⁇ and ⁇ chains (or optionally ⁇ and ⁇ ) or may be a single chain TCR construct.
  • the TCR may be a hybrid TCR comprising sequences derived from more than one species. For example, it has surprisingly been found that murine TCRs are more efficiently expressed in human T cells than human TCRs.
  • the TCR may therefore comprise human variable regions and murine constant regions.
  • TAA-specific TCRs can be easily generated by those skilled in the art using any method known in the art.
  • TAA-specific TCRs can be identified by the TCR gene capture method of Linnemann et al (Nature Medicine 19, 1534-1541 (2013)). Briefly, this method uses a high-throughput DNA-based strategy to identify TCR sequences through the capture and sequencing of genomic DNA fragments encoding TCR genes and can be used to identify TAA-specific TCRs.
  • the vector according to the invention can be any vector capable of transforming or transducing T-progenitor cells.
  • vector we mean a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked.
  • a “vector” in the present invention includes, but is not limited to, a viral vector, a plasmid, an RNA vector or a linear or circular DNA or RNA molecule which may consist of a chromosomal molecule, not chromosomal, semi-synthetic or synthetic nucleic acids.
  • Preferred vectors are those capable of autonomous replication (eposomal vector) and of expression of the nucleic acids to which they are linked (expression vectors).
  • expression cassette according to the invention can be cloned into a vector such as a plasmid, a phagemid, a cosmid, a phage derivative, or a virus.
  • the vector according to the invention is a viral vector.
  • Viral vectors include retroviruses including lentiviruses, adenoviruses, parvoviruses, adeno-associated viruses (AAV), coronaviruses, negative strand RNA viruses such as ortho-myxovirus (e.g., influenza virus ), rhabdovirus (eg, rabies and vesicular stomatitis virus), paramyxovirus (eg, measles and Sendai), positive-strand RNA viruses such as picomavirus and alphavirus, and double-stranded DNA viruses, including adenovirus, herpes virus (eg Herpes Simplex virus types 1 and 2, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus) and poxvirus (eg virus vaccinia, fowlpox virus and canarypox virus).
  • Herpes virus eg Herpes Simplex virus types 1 and 2, Epstein-Barr virus, cytomegal
  • viruses include Norwalk virus, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus, and hepatitis virus, for example.
  • retroviruses include: leukosis-sarcoma avian, mammalian type C viruses, type B, type D virus, HTLV-BLV group, lentivirus, spumavirus.
  • Viral vectors that can be used in the context of the present invention include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpesviruses and lentiviruses.
  • the vector is a lentiviral vector.
  • the retrovirus can be chosen from Moloney murine leukemia virus (MMLV), human immunodeficiency virus (HIV) or Gibbon Ape leukemia virus (GALV).
  • Suitable sequences include ITRs for AAV vectors, or LTRs for lentiviral vectors.
  • the invention also relates to an expression cassette as described above, flanked by an ITR on each side, or flanked by an LTR on each side.
  • the vector is a recombinant AAV vector whose genome comprises the expression cassette of the invention, flanked by AAV inverted terminal repeat (ITR) sequences at both ends.
  • AAV can be any serotype, for example, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV8.2, AAV9 or AAVrhlO.
  • the AAV vector is a pseudotyped vector, that is to say that its genome and its capsid are derived from AAV of different serotypes.
  • the vector according to the invention is a lentiviral vector.
  • lentiviral vectors are derived from primate or non-primate lentiviruses.
  • primate lentiviruses include human immunodeficiency virus (HIV), the causative agent of human acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), and simian immunodeficiency virus (SIV).
  • the group of non-primate lentivirals includes the slow virus visna/maedi (VMV), as well as caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV), equine infectious anemia virus (EIAV), feline immunodeficiency (FIV) and bovine immunodeficiency virus (B IV).
  • VMV slow virus visna/maedi
  • CAEV caprine arthritis-encephalitis virus
  • EIAV equine infectious anemia virus
  • FIV feline immunodeficiency
  • B IV bovine immunodeficiency virus
  • the lentivirus is derived from the HIV virus.
  • the method for producing the vector, in particular the lentiviral vector, integrating the expression cassette is well known to those skilled in the art.
  • a lentiviral vector comprising in its genome the expression cassette of the invention can be produced using a standard 4-plasmid lentiviral system.
  • cells eg HEK293T
  • cells are transfected with: (i) a plasmid comprising the expression cassette of the invention between a 3'LTR and a 5'LTR; (ii) a plasmid encoding the gag/pol proteins of HIV-1; (iii) a plasmid encoding the rev protein of HIV-1 rev; and (iv) a plasmid encoding an envelope glycoprotein (e.g. VSV-G, Vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein).
  • an envelope glycoprotein e.g. VSV-G, Vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein
  • Another aspect of the invention relates to a cell population enriched in modified progenitor-T cells, as described above.
  • enriched means that the cell population comprises a higher proportion of progenitor-T cells than the proportion of any other cell type constituting the cell population.
  • T-progenitor cells are the most represented cell type in the cell population.
  • the cell population comprises at least 40%, 50%, 60%, 70%, 80% of said T-progenitor cells.
  • the cell population comprises at least 90% of said T-progenitor cells, such as 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or even 100%.
  • Negative and positive selection methods known in the art can be used for the enrichment of progenitor-T cells according to the invention.
  • cells can be sorted on the basis of cell surface antigens using fluorescence activated cell sorting (F ACS), or magnetic cell sorting (after labeling a cell subpopulation with a particle magnet that binds cells based on the presence of a cell surface antigen).
  • F ACS fluorescence activated cell sorting
  • magnetic cell sorting after labeling a cell subpopulation with a particle magnet that binds cells based on the presence of a cell surface antigen.
  • Negative selection columns can be used to eliminate cells expressing specific surface markers.
  • Another aspect of the invention relates to the preparation of the modified progenitor-T cell and of the cell population as described above.
  • the progenitor-T cell according to the invention is preferably derived from a stem cell.
  • Stem cells can be obtained from any suitable source, including, without limitation, umbilical cord, blood, embryos, embryonic tissue, fetal tissue, and bone marrow, thymus.
  • the stem cell is a hematopoietic stem cell (HSC).
  • the stem cell is an embryonic stem cell.
  • the stem cell is an induced pluripotent stem cell (iPSC).
  • the progenitor-T cells are derived from CD34+ hematopoietic stem cells, which are preferably derived from umbilical cord blood, peripheral blood or bone marrow.
  • the CD34+ hematopoietic stem cells are derived from umbilical cord blood.
  • the stem cells used to generate the T-progenitor cells according to the invention can be obtained from the patient to be treated or from a donor.
  • the stem cells used to generate the progenitor-T cells according to the invention are obtained from a healthy donor.
  • the stem cells are preferably taken from the peripheral blood or the bone marrow of the healthy donor.
  • Donors typically receive injections of G-CSF to mobilize stem cells into the bloodstream for collection.
  • stem cells can be harvested directly from healthy donor bone marrow.
  • stem cells are collected from placental blood from the umbilical cord after childbirth.
  • a sample from the patient or healthy donor is first depleted of non-stem cells or mature cells.
  • Negative and positive selection methods known in the art can be used for hematopoietic stem cell enrichment. For example, cells can be sorted based on cell surface antigens (such as CD34+) using fluorescence activated cell sorting (F ACS), or magnetic cell sorting (after labeling a sub- population cell by a magnetic particle that binds cells based on the presence of a cell surface antigen).
  • F ACS fluorescence activated cell sorting
  • magnetic cell sorting after labeling a sub- population cell by a magnetic particle that binds cells based on the presence of a cell surface antigen.
  • Negative selection columns can be used to eliminate cells expressing specific surface markers.
  • the purification of the CD34+ HSCs can for example be carried out by the techniques marketed by means of magnetic beads (CD34+ MicroBead kit, human (Miltenyi Biotec), EasySep Human CD34 Positive Selection Kit II (Stemcell Technologies)).
  • the purity of the population enriched in CD34+ CSH cells is preferably greater than 80%, 85% or 90%, even more preferably greater than 95%, such as 96%, 97%, 98%, 99% or 100%.
  • the stem cells are then cultured under appropriate conditions to generate progenitor-T cells according to the invention.
  • the differentiation of cells i.e. the differentiation of stems into progenitor-T cells, is distinct from the maturation of progenitor-T cells into mature T cells.
  • the method thus comprises a step of culturing CD34+ hematopoietic stem cells under appropriate conditions to generate T-progenitor cells according to the invention.
  • CD34+ HSC cells are cultured under appropriate conditions to generate T-progenitor cells with the phenotype:
  • CD45RA+ CD7+, CD5+, CD1a-, CD3-, CD4-, CD8- (T progenitors) or
  • the T-progenitor cells according to the invention exhibit the CD45RA+, CD7+, CD5+ phenotype, preferably the CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+ phenotype.
  • the hematopoietic stem cells are cultured in the presence of one or more Notch ligands (such as Delta-like-1 or Delta-like-4) for a sufficient time to form T-progenitor cells.
  • Notch ligands such as Delta-like-1 or Delta-like-4
  • the stem cells are cultured in the presence of cells expressing a Notch ligand.
  • the CD34+ HSCs are cultured in the presence of an OP9 cell line or of fibroblasts expressing a Notch ligand, such as Delta-like-1 (DLL1) or Delta-like-4 (DLL4).
  • CD34+ HSC cells are cultured in the presence of an OP9 murine stromal line expressing DLL4.
  • the concentration of CSH in the culture is between 1x10 2 and 10 9 , preferably 1x10 2 to 1x10 6 , more preferably 1x10 5 to 1x10 6 , preferably between 1x10 5 and 5x10 5 .
  • the CSH cells are seeded at 100,000 cells per well and cultured on a monolayer of OP9 cells expressing Delta-like-1 or 4 (OP9-DLL1 or OP9-DLL4).
  • cytokines that promote cell engagement and differentiation into T-progenitors can also be used.
  • concentration of a cytokine in a culture is typically around 1 to 100 ng/ml.
  • cytokines that may be employed: fibroblast growth factor (FGF), including FGF-4 and FGF-2; SCF (Stem Cell factor or kit-ligand, KL); Flt-31 (Fms-like tyrosine kinase 3 ligand) and interleukin-7 (IL-7).
  • FGF fibroblast growth factor
  • SCF Stems-like tyrosine kinase 3 ligand
  • IL-7 interleukin-7
  • the cytokines used are Flt-3-ligand and IL-7.
  • the culture medium is supplemented with SCF, Flt-31 and IL-7.
  • the CD34+ HSC cells are cultured in the presence of an OP9 line expressing DLL1 or DLL4, the culture medium being supplemented with SCF, Fl
  • Stem cells can be cultured in a culture medium comprising conditioned or unconditioned medium.
  • suitable media are: X-VIVOTM 10, X-VIVOTM 15, 20, MEMa, RPMI 1640, IMDM or DMEM.
  • the culture medium is MEMa medium.
  • the culture medium may comprise serum (eg, bovine serum, fetal bovine serum, bovine calf serum, horse serum, human serum or an artificial serum substitute) or it may be serum free.
  • the serum is fetal bovine serum (FBS) or fetal calf serum (S VF).
  • the culture medium is supplemented with 20% SBF or S VF.
  • the culture conditions involve culturing the HSC cells for a period of time sufficient for the cells in the preparation to form progenitor-T cells.
  • the cells are maintained in culture generally for 4 to 50 days, preferably 5 to 25 days, preferably 10 to 21 days. Preferably, the cells are maintained in culture for about 20 days. It will be understood that the cells can be maintained for the appropriate length of time required to achieve the desired cell composition.
  • the CD34+ HSC cells are cultured in the presence of cells expressing a Notch ligand (such as OP9-DLL1 or OP9-DLL4), in a culture medium supplemented with serum (such as FBS or FCS ), cytokines (in particular IL-7 and/or Elt31), and possibly SCF.
  • a Notch ligand such as OP9-DLL1 or OP9-DLL4
  • serum such as FBS or FCS
  • cytokines in particular IL-7 and/or Elt31
  • SCF possibly SCF.
  • the present application provides a method of generating a progenitor-T cell comprising (a) culturing a sample comprising stem cells or progenitor cells with cells that express a Notch ligand, optionally in the presence of cytokines and/or growth factors and (b) isolation/purification of progenitor-T cells.
  • the cells expressing a Notch ligand are preferably OP9 cells expressing DLL1 or DLL4.
  • T-progenitor cells can be characterized by the phenotype:
  • CD45RA+ CD7+, CD5+, CD1a-, CD3-, CD4-, CD8- (T progenitors) or
  • the T-progenitor cells according to the invention exhibit the CD45RA+, CD7+, CD5+ phenotype, preferably the CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+ phenotype.
  • the method may include a step of enrichment in progenitor-T cells, for example by carrying out cell sorting by LACS or by magnetic beads, on the basis of surface antigens.
  • the cell population is enriched so as to obtain at least 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, preferably at least 90%, even more preferably at least 95% of said progenitor cells -T.
  • the cell population is enriched so as to obtain at least 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, preferably at least 90%, even more preferably at least 95% of said progenitor cells -T presenting a phenotype:
  • CD45RA+ CD7+, CD5+, CD1a-, CD3-, CD4-, CD8- (T progenitors) or
  • the T-progenitor cells according to the invention exhibit the CD45RA+, CD7+, CD5+ phenotype, preferably the CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+ phenotype.
  • the method further comprises a step of gene modification of the cells in order to obtain progenitor-T cells which include the expression cassette as described above.
  • the method further comprises a step of introducing the expression cassette as described above, into the cell.
  • the expression cassette of the invention can be introduced into cells in the form of naked DNA or integrated into an appropriate vector.
  • the expression cassette can be introduced into the target cell by any known techniques such as chemical methods (for example, transfection with calcium phosphate or lipofection using cationic lipids), non-chemical methods (for example, electroporation ), particle-based methods (e.g., magnetofection), and viral transduction using viral vectors such as adenoviral vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors, adeno-associated viral (AAV) vectors, or vectors hybrid viruses.
  • chemical methods for example, transfection with calcium phosphate or lipofection using cationic lipids
  • non-chemical methods for example, electroporation
  • particle-based methods e.g., magnetofection
  • viral vectors such as adenoviral vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors, adeno-associated viral (AAV) vectors, or vectors hybrid viruses.
  • AAV adeno-associated viral
  • the method comprises a transduction step, by means of a viral vector comprising in its genome the expression cassette of the invention.
  • the viral vector is as described above.
  • the step of introducing the expression cassette can be carried out before the step, during, or after the step of differentiating the stem cells into progenitor-T cells.
  • differentiation of stem cells into progenitor-T cells means that the cells obtained after differentiation are no longer pluripotent but are still immature. Thus, differentiation as described here is not concerned with thymic maturation which transforms immature progenitor-T cells into mature T cells.
  • the method for preparing T-progenitor cells of the invention comprises the following steps: a) culturing CD34+ hematopoietic stem cells in a culture medium comprising a Notch ligand and cytokines allowing differentiation said CD34+ cells into progenitor-T cells exhibiting a CD45RA+, CD7+, CD5+ phenotype, preferably a CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ phenotype; b) transformation or transduction of the cells before, during or after said step (a) of differentiation, with a vector comprising an expression cassette as defined in the present invention.
  • the Notch ligand is Delta-like-1 (DLL1) or Delta-like-4 (DLL4).
  • the CD34+ hematopoietic stem cells are derived from umbilical cord blood, peripheral blood or bone marrow, more preferably from umbilical cord blood.
  • the step of introducing the expression cassette preferably by transformation or transduction of a vector containing the expression cassette, can be done from undifferentiated CD34+ CSH cells.
  • the method of the invention comprises, in order, the steps of:
  • the process for preparing T-progenitor cells of the invention comprises the following steps: a) transformation or transduction of CD34+ hematopoietic stem cells with a vector comprising an expression cassette as defined in present invention; b) culturing the cells obtained in step a) in a culture medium comprising a Notch ligand and cytokines allowing the differentiation of said CD34+ cells into progenitor-T cells exhibiting a CD45RA+, CD7+, CD5+ phenotype, preferably a CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ phenotype.
  • the step of introducing the expression cassette preferably by transformation or transduction of a vector containing the expression cassette, can be done during the step of differentiation of the stem cells in T-progenitor cells.
  • the method of the invention comprises, in order, the steps of:
  • the process for preparing T-progenitor cells of the invention comprises the following steps: a) culturing CD34+ hematopoietic stem cells in a culture medium comprising a Notch ligand and cytokines allowing the differentiation of said CD34+ cells into progenitor-T cells exhibiting a CD45RA+, CD7+, CD5+ phenotype, preferably a CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ phenotype; b) transformation or transduction of the cells during said step (a) of differentiation, with a vector comprising an expression cassette as defined in the present invention.
  • the step of differentiating hematopoietic stem cells into progenitor-T cells continues after the transformation or transduction step.
  • the method for preparing T-progenitor cells of the invention comprises the following steps: a) culturing CD34+ hematopoietic stem cells in a culture medium comprising a Notch ligand and cytokines allowing the differentiation of said CD34+ cells into progenitor-T cells exhibiting a CD45RA+, CD7+, CD5+ phenotype, preferably a CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ phenotype; b) transformation or transduction of the cells with a vector comprising an expression cassette as defined in the present invention; c) differentiation of hematopoietic stem cells into modified progenitor-T cells.
  • the CD34+ HSC cells can be cultured on day D0 in the presence of cells expressing a Notch ligand such as OP9 cells expressing DLL1 or DLL4, in a culture medium preferably comprising cytokines (in particular IL 7 and/or Flt31), growth factors, and/or serum (such as FBS or FCS).
  • a Notch ligand such as OP9 cells expressing DLL1 or DLL4
  • a culture medium preferably comprising cytokines (in particular IL 7 and/or Flt31), growth factors, and/or serum (such as FBS or FCS).
  • the step of introducing the expression cassette preferably by transformation or transduction of a vector containing the expression cassette, can be carried out during the differentiation step, for example between day 0 and day 18.
  • the transformation or transduction step can be carried out between day 4 and 18, preferably between day 6 and day 15, preferably between day 7 and day 10.
  • the differentiation step stem cells into T-progenitor cells is then continued, the T-progenitor cells being preferably harvested/isolated from day 13, preferably from day 16.
  • the transformation or transduction step can be carried out between day 0 and day 4, preferably between day 0 and day 3, preferably between day 0 and day 2. According to one embodiment embodiment, the transformation or transduction step can be carried out on day 0. According to another embodiment, the transformation or transduction step can be carried out on day 1.
  • the step of introducing the expression cassette preferably by transformation or transduction of a vector containing the expression cassette, can be done at the end of the differentiation step stem cells into progenitor-T cells.
  • the method of the invention comprises, in order, the steps of:
  • the process for preparing T-progenitor cells of the invention comprises the following steps: a) culturing CD34+ hematopoietic stem cells in a culture medium comprising a Notch ligand and cytokines allowing the differentiation of said CD34+ cells into progenitor-T cells exhibiting a CD45RA+, CD7+, CD5+ phenotype, preferably a CD45RA+, CD7+ phenotype , CD5+, CD1A+; b) transformation or transduction of the T-progenitor cells after said step (a) of differentiation, with a vector comprising an expression cassette as defined in the present invention.
  • the modified T progenitor cells and the cell population enriched in T-progenitor cells according to the invention can be stored until administration to the patient.
  • the cells or the enriched cell population can be cryopreserved in a cryoprotective medium, such as a medium comprising human albumin and DMSO.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the progenitor-T cell of the invention, or the population enriched in progenitor-T cells of the invention, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the pharmaceutically acceptable carrier can be a diluent, adjuvant, excipient or vehicle with which the progenitor-T cell is administered. Its addition is intended to confer physico-chemical and/or biochemical characteristics to promote the administration of progenitor-T cells, without altering the stability and efficiency of said cells.
  • the pharmaceutical composition can for example take the form of an aqueous solution comprising the cells, in the form of a suspension or an emulsion.
  • the composition may typically be buffered at a selected pH.
  • the composition may include a pharmaceutically acceptable carrier, for example, water, saline, phosphate buffered saline, or any other carrier suitable for cell integrity and viability, and for administration of the cellular composition to a subject, in particular a human.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, water, saline, phosphate buffered saline, or any other carrier suitable for cell integrity and viability, and for administration of the cellular composition to a subject, in particular a human.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, water, saline, phosphate buffered saline, or any other carrier suitable for cell integrity and viability, and for administration of the cellular composition to a subject, in particular a human.
  • the pharmaceutical composition is preferably isotonic, ie it has
  • Such isotonic formulations generally have an osmotic pressure of about 250 mOSm to about 350 mOSm.
  • the desired isotonicity of the composition of the invention can be obtained by using sodium chloride or other pharmaceutically acceptable agents such as dextrose, boric acid, sodium tartrate or other inorganic or organic solutes.
  • the composition comprises at least two populations of T-progenitor cells according to the invention, in which each population of T-progenitor cells expresses a different heterologous nucleic sequence.
  • the composition may comprise a first population of T-progenitor cells reg- ulatedly expressing a first CAR targeting a first antigen, in association with a second population of T-progenitor cells reg- ularly expressing a second CAR targeting a second antigen.
  • composition may also contain, in addition to the T-progenitor cells according to the invention, one or more active principle(s) useful for the indication or the disease targeted.
  • active principles are present in combination with the T-progenitor cells according to the invention in quantities which are effective for the intended purpose.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises an effective quantity of T-progenitor cells according to the invention, which can be determined according to the pathology, the patient (for example according to his weight or his age) and/or the stage of the disease.
  • the administration of the cells or of the pharmaceutical composition may consist of the administration of 10 4 to 10 9 cells per kg of body weight of the patient, preferably of 10 5 to 10 6 cells/kg of body weight of the patient.
  • the cells or population of cells can be administered in one or more doses.
  • the pharmaceutical composition comprises T-progenitor cells according to the invention, in particular at least 100 cells, at least 200 cells, at least 400 cells, at least 500 cells, at least 700 cells, at least 1000 cells, at least 1500 cells, at least 2000 cells, at least 3000 cells, at least 5000 cells, at least 10,000 cells, at least 100,000 cells, at least 1 million cells, at least 10 million cells or at least 100 million T-progenitor cells according to the invention.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be stored by cryopreservation, for example in liquid nitrogen.
  • the pharmaceutical composition may also comprise one or more cryoprotective agent(s).
  • the pharmaceutical composition can comprise a CS 10 medium or any other medium containing serum and DMSO.
  • composition according to the invention can be formulated for any conventional route of administration including topical, enteral, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous or intraocular administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is administered enterally or parenterally.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is preferably administered by intravenous administration.
  • the present invention also relates to the use of the expression cassette of the invention or of a vector comprising it, for the generation of progenitor-T cells.
  • the expression cassette comprises the promoter region of VIL7RA or BCL11B operably linked to a heterologous nucleic sequence of interest.
  • the promoter region of IL7RA comprises or consists of a nucleic sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the sequence nucleic sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, preferably with the nucleic sequence SEQ ID NO: 1.
  • the promoter region of BCL11B comprises or consists of a nucleic sequence having at least 85%, 90 %, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99% identity with the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3.
  • the expression cassette of the invention is used for the generation of progenitor-T cells according to the method of preparation as described in the present invention.
  • the present invention relates to a progenitor-T cell, a population enriched in progenitor-T cells or a composition comprising said cells, for use as a medicament or for use in the treatment of a disease or disorder in a subject. It also relates to the use of a progenitor-T cell, a population enriched in progenitor-T cells or a composition comprising said cells in the manufacture of a medicament for treating a disease or disorder in a subject. Finally, it relates to a method of treating a disease or disorder in a subject comprising administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition of the present invention.
  • Treatment means any act aimed at improving the state of health of patients. “Treatment” may include, but is not limited to, alleviating or improving one or more symptoms, reducing the extent of disease, stabilizing disease state (e.g., maintaining a patient in remission), preventing disease or preventing the spread of disease, slowing disease progression, reducing the risk of disease recurrence, or remission (whether partial or complete ). Treatment can include curative or prophylactic effects. Desirable effects of treatment include decreasing the rate of disease progression, improving or alleviating disease state, and remission or improving prognosis. Relief can occur before signs or symptoms of the disease or condition appear, as well as after they appear. Thus, “treatment” may include the "prevention" of an undesirable disease or condition.
  • treating cancer includes inhibiting cancer cell growth or proliferation or killing cancer cells.
  • treating cancer includes reducing the risk or development of metastases.
  • treating a cancer may refer to preventing a relapse. Treating cancer can also refer to maintaining a subject in remission.
  • the terms “disorder” or “disease” refer to an improperly functioning organ, part or structure of the body related, for example, to genetic or developmental factors, infection, deficiency or nutritional imbalance, toxicity, or adverse environmental factors. Preferably these terms refer to a health condition or disease, e.g. a disease that interferes with normal physical or mental functions. More preferably, the term “disease” makes refers to immune and/or inflammatory diseases that affect animals and/or humans. Preferably, the term “disease” refers to cancers, infectious diseases or immune diseases.
  • the progenitor-T cell, the population enriched in progenitor-T cells or the composition comprising said cells is used in the treatment of a genetic disease, a cancer, an infectious disease or an immune disease such as innate immunodeficiency.
  • the progenitor-T cell is used in a diagnostic method.
  • the progenitor-T cell can be modified so as to express a CAR coupled to a fluorescent marker allowing the detection of a target of interest, and its use in a diagnostic method.
  • genetic disease refers to any disease related to the absence or alteration of the expression of a gene.
  • cancer as used herein is defined as a disease characterized by the rapid and uncontrolled growth of aberrant cells. Cancer cells can spread locally or through the bloodstream and lymphatic system to other parts of the body.
  • infectious diseases refers to disorders caused by organisms, such as bacteria, viruses, fungi or parasites.
  • immune disease refers to a condition in a subject characterized by cell, tissue and/or organ damage caused by an immunological reaction of the subject to its own cells, tissues and/or organs. Immune diseases include acquired and innate immunodeficiencies.
  • inflammatory disease refers to a condition in a subject characterized by inflammation, for example chronic inflammation. Autoimmune disorders may or may not be associated with inflammation.
  • the disease or disorder to be treated is a condition selected from a proliferative disease or disorder, preferably cancer; an infectious disease or disorder, preferably a viral, bacterial or fungal infection; an inflammatory disease or disorder; and an immune disease or disorder, preferably autoimmunity or autoimmune diseases.
  • Immune disorders include in particular innate and acquired immunodeficiency such as HIV infection, severe combined immunodeficiency (SCID) or post-transplant treatment.
  • the progenitor-T cell, the cell population enriched in progenitor-T cells and/or the pharmaceutical composition are suitable for the treatment of autoimmune disorders.
  • Autoimmune disorders can affect almost any organ in the subject, including but not limited to the nervous, gastrointestinal, and endocrine systems, as well as the skin and other connective tissues, eyes, blood and blood vessels.
  • the progenitor-T cell, the cell population enriched in progenitor-T cells and/or the pharmaceutical composition is intended for use in the treatment of cancer. Accordingly, the present invention also relates to methods for inhibiting the growth of cancer in a subject in need thereof and/or preventing the formation of cancer and/or the spread of cancer in a patient in need thereof.
  • the progenitor-T cell, the cell population enriched in progenitor-T cells and/or the pharmaceutical composition is intended for use in the prevention of a relapse of cancer.
  • the cancer is a solid tumor or a hematopoietic cancer.
  • the cancer is a solid tumor.
  • Hematopoietic cancers are cancers of the blood or bone marrow.
  • leukemias include leukemias, including acute leukemias (such as acute lymphoid leukemia, acute myeloid leukemia, acute myeloid leukemia, and myeloblastic, promyelocytic, myelomonocytic, monocytic, and erythroleukic leukemias), chronic leukemias (such as myelocyte) leukemia, chronic myeloid leukemia and chronic lymphoid leukemia), polycythemia vera, lymphoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma (indolent and high-grade forms), multiple myeloma, Waldenstrom's macroglobulinemia, heavy chain disease, myelodysplastic, hairy cell leukemia and myelodysplasia.
  • acute leukemias such as acute lympho
  • the T-progenitor cells of the invention are used as a therapeutic product, ideally as a "ready to use” product.
  • the term "subject" or “patient” refers to an animal, preferably a human mammal or non-human mammal such as dogs, cats, horses, cows, pigs, sheep and non-human primates, among others.
  • the subject is a human.
  • the human subject according to the invention can be a human being at the prenatal stage, a newborn, a child, an infant, an adolescent or an adult.
  • said progenitor-T cell, said cell population or said pharmaceutical composition is used in second-line treatment.
  • the present invention also relates to an in vitro method for evaluating the thymic activity of a subject comprising the measurement in the sample of the quantity of Recent Thymic Emigrant (RTE) cells, essential upstream of the administration of the cell population described above.
  • RTE Thymic Emigrant
  • the sample is a blood sample, preferably a whole blood sample.
  • the amount of RTE cells is the amount of CD4 RTE cells, the amount of CD8 RTE cells or the amount of CD4 RTE cells and CD8 RTE cells.
  • the amount of RTE cells can be measured by measuring at least the level of expression of the CD31 marker on naive T cells.
  • the quantity of RTE cells can be measured by measuring the level of expression of the CD31 marker and of one or more other markers from among CD27, CCR7 and CD45RA.
  • the quantity of RTE cells can be measured by measuring at least the level of expression of the markers CD27, CCR7, CD45RA and CD31.
  • the quantity of RTE cells is equivalent to the quantity of CD3 Ihigh cells. According to one embodiment, the quantity of RTE cells is equivalent to the quantity of CD27, CCR7, CD45RA, CD3 Ihigh cells.
  • the methods for measuring the expression of a marker are well known in the art and include, among others, flow cytometric labeling according to standard methods.
  • the amount of RTE cells can be measured by measuring the amount of signal-attached T-cell receptor excision circle (sjTREC), in particular by measuring the amount of sjTREC DNA.
  • sjTREC signal-attached T-cell receptor excision circle
  • Methods for measuring the amount of sjTREC, in particular sjTREC DNA are well known in the art and include, among others, quantification by PCR, qPCR or qRT-PCR.
  • the presence of thymic activity in said sample makes it possible to envisage a therapeutic treatment with the modified T-progenitor cells of the invention.
  • the presence of thymic activity in said sample makes it possible to determine whether the subject is likely to respond to treatment with a pharmaceutical composition of the invention.
  • the present invention therefore also relates to an in vitro method for determining whether a subject is likely to respond to treatment with a pharmaceutical composition of the invention, said method comprising: a) measuring in the sample the quantity of Recent Thymic Emigrants (RTE ), b) comparing the quantity of RTE cells measured in the sample with a reference value, c) determining whether the subject is likely to respond to treatment with a pharmaceutical composition of the invention, wherein an amount of RTE cells equal to or greater than the reference value indicates a susceptibility to respond to the treatment.
  • RTE Recent Thymic Emigrants
  • the reference value is the quantity of CD4 and/or CD8 cells in the sample taken from the subject.
  • the subject is likely to respond to treatment with a pharmaceutical composition of the invention if the amount of CD4 RTE cells is equal to or greater than 2% of the total amount of naive CD4 cells in the subject's sample. , preferably equal to or greater than 4% of the total amount of naive CD4 cells in the subject sample, preferably equal to or greater than 5% of the total amount of naive CD4 cells in the subject sample, preferably equal or greater than 8% of the total amount of naive CD4 cells in the subject sample, preferably equal to or greater than 10% of the total amount of naive CD4 cells in the subject sample.
  • the subject is likely to respond to treatment with a pharmaceutical composition of the invention if the quantity of CD8 RTE cells is equal to or greater than 10% of the total quantity of naive CD8 cells in the sample of the subject, preferably equal to or greater than 15% of the total amount of naive CD8 cells in the subject sample, preferably equal to or greater than 20% of the total amount of naive CD8 cells in the subject sample, preferably equal to or greater than 25% of the total amount of naive CD8 cells in the subject sample, preferably equal to or greater than 30% of the total amount of naive CD8 cells in the subject sample, preferably equal to or greater than 35% of the total amount of na ⁇ ve CD8 cells in the subject sample.
  • the reference value is the quantity of RTE cells in a control sample from one or more healthy subjects, ie subjects having normal thymic activity.
  • the subject is likely to respond to treatment with a pharmaceutical composition of the invention if the amount of CD4 RTE cells is equal to or greater than 10% of the amount of CD4 RTE cells in the control sample, preferably equal to or greater than 15% of the amount of CD4 RTE cells in the control sample, preferably equal to or greater than 20% of the amount of CD4 RTE cells in the control sample, preferably equal to or greater than 25% of the quantity of CD4 RTE cells in the control sample, preferably equal to or greater than 30% of the quantity of CD4 RTE cells in the control sample.
  • the subject is capable of respond to treatment with a pharmaceutical composition of the invention if the amount of CD8 RTE cells is equal to or greater than 10% of the amount of CD8 RTE cells in the control sample, preferably equal to or greater than 15% of the amount of CD8 RTE cells in the control sample, preferably equal to or greater than 20% of the amount of CD8 RTE cells in the control sample, preferably equal to or greater than 25% of the amount of CD8 cells in the control sample, preferably equal to or greater than 30% of the quantity of CD8 RTE cells in the control sample.
  • the reference value is the level of expression of the CD31 marker in the naive CD4 and/or CD8 cells in the sample from the subject. According to one embodiment, the reference value is the level of expression of the CD31 marker in naive CD4 and/or CD8 cells in a control sample from one or more healthy subjects, i.e. subjects with normal thymic activity.
  • the reference value is the level of expression of the CD31 marker in naive CD4 and/or CD8 cells in a control sample from one or more healthy subjects, i.e. subjects with normal thymic activity.
  • the subject is likely to respond to treatment with a pharmaceutical composition of the invention if the level of expression of the CD31 marker in the naive CD4 cells is equal to or greater than 10%, 15%, 20%, 25% or 30% of the expression level of the CD31 marker in the na ⁇ ve CD4 cells of the control sample.
  • the subject is likely to respond to treatment with a pharmaceutical composition of the invention if the level of expression of the CD31 marker in the naive CD8 cells is equal to or greater than 10%, 15%, 20% , 25% or 30% of the expression level of the CD31 marker in the naive CD8 cells of the control sample.
  • the reference value is the amount of sjTREC DNA in a control sample from one or more healthy subjects, i.e. subjects with normal thymic activity.
  • the present invention further relates to a method of treating a disease or disorder in a subject comprising an in vitro method for determining whether a subject is likely to respond to treatment of the present invention, and administering a composition pharmaceutical as described in the present invention.
  • the subject is at risk or is likely not to respond to treatment with the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the method therefore comprises a step of determining the subject likely to respond to said treatment.
  • the present invention further relates to a method of treating a disease or disorder in a subject comprising: a) determining whether the subject is likely to respond to said treatment by in vitro evaluation of thymic activity in a blood sample of said subject, in particular by: measuring the quantity of Recent Thymic Emigrants (RTE) cells in the sample, comparing the quantity of RTE cells measured in the sample with a reference value, determining whether the subject is likely to respond to treatment with a pharmaceutical composition of the invention, in which an amount of RTE cells equal to or greater than the reference value indicates a susceptibility to respond to the treatment. b) administering to the subject likely to respond to the treatment a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition of the present invention.
  • RTE Recent Thymic Emigrants
  • the inventors have developed a progenitor-T cell expressing in a regulated manner a nucleic sequence of interest. More specifically, the nucleic sequence of interest is placed under the control of an exogenous promoter induced by the Notch pathway, thus allowing regulated expression according to the state of maturation of the T progenitors.
  • the genetic sequence of the promoter of the IL7RA gene encoding the alpha chain of IL7R is represented in FIG. 1.
  • the sequence from the NCBI database #3575 is used as the reference sequence.
  • the “ATG” start codon for initiating protein synthesis is in position +90 of the sequence.
  • the GfI-1 and GABPa transcription factors bind to the 5'-TAAATCAC[AT]GCA-3' sequences and purine-rich repeats (repeats (GA)) respectively.
  • the promoter also contains the CpG methylation islands at positions -975, -567, -497, -475, -466, -346.
  • the promoter includes the NF-kB binding site, located at position -187 to -173 of the human IL 7RA gene.
  • the promoter includes the TATA box, at position -27 to -22 of the human IL
  • Example 1 Expression of VIL7RA is induced via the Notch pathway in lymphoid cells.
  • the cell lines used are Jurkat (immature T lymphocytes) and THP-1 (a non-lymphoid T cell line).
  • Jurkat or THP-1 cells are seeded at 100,000 cells per well in an RPMI medium (ThermoFischer Scientific) containing 10% fetal bovine serum (ThermoFischer Scientific) and 1% penicillin-streptomycin (ThermoFischer Scientific) containing or not ligand of Notch, Delta-like 4. After stimulation for 4 days, the cells are collected in dry pellets.
  • the molecular analysis of the expression of the IL7RA and HES mRNA control is carried out by RT-qPCR according to the standard protocols of the manufacturers.
  • RNA is isolated with TRIzol (ThermoFischer Scientific) according to the standard procedure.
  • the reverse transcription reaction (RT) is carried out using SuperScript VILOTM cDNA synthesis kit (ThermoFischer Scientific) and the quantitative PCR (qPCR) is carried out with PowerUp SYBR Green Master Mix (ThermoFischer Scientific) on a Light Cycler 480 device ( Rock).
  • sequences of the primers used are as follows: /£7/?4-scns 5'- TCGCTCTGTTGGTCATCTTG-3', 7L77 - antisense 5'-GGAGACTGGGCCATACGATA -3', 574-scns 5'-GGCAGACCGAGATGAATCCTCA -3', 574-antisense 5'-CAGGTCCAGGGGTCTTGGTCC-3', HES-sense 5'-AAAAATTCCTCGTCCCCGGT-3', f/ES-antiscns 5'-GGCTTTGATGACTTTCTGTGCT-3'.
  • mRNA expression is calculated according to the method Results :
  • VIL7RA promoter sequences are synthesized de novo (GeneArt Gene Synthesis service, ThermoFischer Scientific) and cloned into a lentiviral vector pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE (Addgene, catalog # 12252) by conventional digestion/ligation techniques used in molecular biology.
  • the cell lines used are Jurkat (immature T lymphocytes) and THP-1 (a non-lymphoid T cell line).
  • the Jurkat or THP-1 cells are seeded at 500,000 cells per well in an RPMI medium (ThermoFischer Scientific) containing 10% fetal bovine serum (ThermoFischer Scientific) and 1% penicillin-streptomycin (ThermoFischer Scientific) and transduced by adding the viral supernatant at 1x106 TU/mL. After 6 hours of transduction, the cells are washed twice with PBS (ThermoFischer Scientific) and resuspended in complete RPMI medium.
  • RPMI medium ThermoFischer Scientific
  • PBS ThermoFischer Scientific
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • Example 3 Expression of the CAR transgene under the control of the VIL7RA promoter.
  • the transgene corresponding to the molecule of the Chimeric Antigen Receptor (CAR) is cloned under the control of the VIL7RA promoter.
  • the CAR construction corresponds to the combination of the following elements: scFV fragment of the anti-human CD19 antibody (clone FMC63), an intracellular activation domain 4 IBB and CD3 zeta ( 3rd generation CAR, GeneArt Gene Synthesis service, ThermoFischer Scientific). This sequence is introduced into the vector described above by the standard digestion/ligation techniques used in molecular biology.
  • the THP-1 cell line is transduced and the expression of the transgene is analyzed as previously described.
  • a lentiviral vector presenting the extended sequence SEQ.2 of the VIL7RA promoter or a control vector with a strong Spleen focus-forming virus (SFFV) promoter are used to transduce the Jurkat cell line as previously described.
  • SFFV Spleen focus-forming virus
  • the percentage of transduction is >60% on the presence of a fluorescent marker Green Fluorescent Protein (GFP).
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the samples are acquired on an LSRII Fortessa cytometer (Becton Dickinson). Data are analyzed with FlowJo vl 0.7.1 software (BD Biosciences). The Mean Fluorescent Intensity (MFI) is indicated on each graph of the samples acquired simultaneously.
  • SFFV strong promoters
  • HSC CD34+ hematopoietic stem cells
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • Figure 5 shows that the promoter of VIL7RA is a strong promoter, because the expression of the GFP transgene in the transduced Jurkat lymphoid cells shows the same intensity (same mean fluorescence intensity (MFI)) and same frequency (same percentage of GFP ) than in cells transduced with the control vector (SFFV promoter).
  • MFI mean fluorescence intensity
  • VIL7RA expression is induced via the Notch pathway in hematopoietic stem cells.
  • CD34+ hematopoietic stem cells are isolated from umbilical cord blood. Briefly, blood mononuclear cells are separated by a Ficoll-Paque gradient (Cytiva Ficoll-PaqueTM, Fischer Scientific). The CD34+ cells are isolated by magnetic beads following the supplier's protocol (UltraPure CD34 kit, Miltenyi Biotec). The purity of the enriched population is >95%. The cells thus isolated are exposed or not to Notch ligand (DLL4) in the culture medium for 6 days (FIG. 6.A). Flow cytometry analysis is performed after extracellular labeling with an anti-CD 127-V450 antibody (BD Biosciences) according to the standard labeling protocol.
  • DLL4 Notch ligand
  • the samples are acquired on an LSRII Fortessa cytometer (Becton Dickinson). The data are analyzed with the FlowJo v10.7.1 software (BD Biosciences). The molecular analysis of the expression of the IL7RA and HES mRNA (control) is carried out according to the protocol previously described.
  • the CD34+ hematopoietic stem cells are purified as previously described.
  • the CD34+ cells are purified and cultured at 500,000 per well in a plate containing OP9-DLL1 feeder stromal cells in a T differentiation medium composed of: MEMa medium containing serum from the birthday wishes (20% FCS, Cytiva HyCloneTM Fetal Bovine Serum (USA), Defined) and 1% Penicillin-Streptomycin (ThermoFischer Scientific).
  • a cocktail of cytokines necessary for their activation is added: IE-7, Flt31, SCF, TPO (100 ng/mE, Bio-Techne).
  • the cells are transduced by adding the lentiviral supernatant (SFR BioSciences Gerland - Eyon Sud (UMS3444/US8) at an MOI between 20 and 50.
  • the transduction agent is ProtransduzinTM (at 15 ug/mL , JPT Peptides).
  • the preparation of the vector and of the transduction agent is made according to the supplier's protocol. 24 hours post-transduction the medium is changed for fresh medium containing IE-7, Flt31 (5 ng/mE, Bio -Techne). Half of the medium is removed twice a week and fresh medium containing twice the cytokine concentration is added.
  • CD45RA+CD7+, “pre-T”) precursors T
  • CD3-negative CD4-CD8-CD3-, “CD3-”
  • CD3-positive CD4-CD8-CD3+, “CD3+”
  • the antibodies used are all of from BD Biosciences: CDla-phycoerythrin (PE), CD45RA-PE-TexasRed, CD7-PE-Cy7, CD4-Pacific Blue, CD3-Alexa Fluor 700, CD5- allophycocyanin (APC), CD8-APC-H7. These marking protocols are standard. These samples are acquired on an ESRII Fortessa cytometer (Becton Dickinson). These data are analyzed with the FlowJo v10.7.1 software (BD Biosciences).
  • the expression of the transgene under the control of the constitutive promoter is on average 12.38% and does not vary during T maturation in vitro (average of 12.63 and 12% for the CD3- and CD3+ stages respectively ) ( Figure 7).
  • the expression of the CAR transgene under the control of the promoter at VIL7RA is on average 15.3% at the early pre-T stage, concomitant with Notch signaling, decreases in the CD3- (3 .73%) and increases in the most mature populations, CD3+ (5.7%).
  • the expression of the CAR transgene under the control of the VIL7RA promoter (SEQ.2) does not allow regulated expression of the transgene (we previously observed that this promoter presented the “leaking” profile, the expression of the transgene remains stable during T maturation (15.15% for the pre-T stage, 16.8% for the CD3- stage and 19.5% for the CD3+ stage).
  • Example 7 Expression of the endogenous IL7RA gene and of the transgene under the control of the VIL7RA promoter.
  • Naive CD4+ T cells are isolated from umbilical cord blood. Briefly, the blood mononuclear cells are separated by a Ficoll-Paque gradient (Cytiva Ficoll-PaqueTM, Fischer Scientific). The naive CD4+ cells are isolated by magnetic beads following the supplier's protocol (Naive CD4 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec). The purity of the enriched population is >97%. The cells are then transduced according to the procedure described above and are stimulated or not by Notch ligand, DLL4. After 6 days post-transduction, the expression of endogenous VIL7RA is measured by flow cytometry, as well as the expression of the transgene (based on GFP). Labeling protocols are standard. The samples are acquired on an LSRII Fortessa cytometer (Becton Dickinson). The data are analyzed with the FlowJo v10.7.1 software (BD Biosciences).
  • the expression of the transgene under the control of the control vector and of the vectors containing the sequence of the CAR transgene under the control of the VIL 7 RA promoter is not different in the absence or presence of DLL4.
  • the induction of expression of the transgene under the control of the VIL7RA promoter is cyclic and finely regulated in hematopoietic stem cells during T differentiation via the Notch pathway.
  • this regulation is no longer ensured via the Notch pathway in mature T cells, thus allowing constant expression of the transgene in mature T cells via the transcription factors described such as GfI-1 and GABPalpha.
  • the immature aspect of the cells makes it possible to envisage their use in a context where the donor and the recipient are two distinct people.
  • the regulation of the expression of the maturation-dependent CAR molecule through the use of the VIL7RA promoter will thus provide the transgenic cells with a selective advantage during the negative selection that will occur in vivo in the patient. This advantage should be confirmed in the patient, because to date there are no relevant in vitro models allowing to recapitulate the complex steps of positive and negative selection.
  • Example 8 Non-invasive measurement of thymic activity.
  • the quantity of RTE cells was measured by quantification of CD4 CD27+CCR7+CD45RA+CD31high and CD8 CD27+CCR7+CD45RA+CD31high cells following the labeling in flow cytometry described above. Data analysis was performed using GraphPad Prism software, the statistical test used was the non-parametric Kruskall-Wallis test with a Dunn's post-test. The average age of the patients is indicated in the table below (Table 2).
  • the CD27+CCR7+CD45RA+CD31high population represents the Recent Thymic Emigrants (RET) which are naive T lymphocytes expressing the CD31high marker indicating their recent emigration from the thymus. Once at the periphery, at the first contact with an antigen, this marker is down-regulated and is no longer re-expressed. It has been shown that the frequency of TENs is correlated with the amount of sjTREC DNA. sjTREC DNA resulting from the rearrangement of TCR receptor chains is a measure of T lymphopoiesis (thymic activity). It has been shown that as an individual ages, thymic activity decreases drastically in healthy subjects (V Geenen et al., J of Endocrinology (2003) 176, 305-311).
  • RET Thymic Emigrants
  • Figure 9A shows an example of CD4, CD8, CD3, CCR7, CD45RA, CD31 and CD27 staining of a whole blood sample.
  • the amount of CD4 CD3 Ihigh or CD8 CD3 Ihigh cells compared to the amount of CD4 or CD8 cells is used to determine the amount of RTE cells in the sample.
  • the results show that the untreated patients (NT Patients) statistically show the same thymic activity as the healthy donors (DS) (FIG. 9B).
  • the treated patients (TT Patients) present on average a lower thymic activity than the healthy donors (FIG. 9B). More specifically, the treated patients can be divided into 2 groups: those who exhibit thymic activity and those who do not exhibit any or who exhibit very low activity (FIG. 9C and Table 3). [Table 3]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Cellule progéniteur des lymphocytes T exprimant de manière régulée un transgène d'intérêt. L'invention concerne une cellule progéniteur-T comprenant une cassette d'expression qui permet une expression régulée d'un transgène d'intérêt, en fonction du stade de maturation de ladite cellule progéniteur-T. L'invention concerne également une population cellulaire enrichie en de telles cellules progéniteurs-T, un procédé de préparation des cellules progéniteurs-T, et leur utilisation dans une méthode de traitement.

Description

Cellule progéniteur des lymphocytes T exprimant de manière régulée un transgène d’intérêt
Domaine technique
L’invention concerne une cellule progéniteur-T comprenant une cassette d’expression qui permet une expression régulée d’un transgène d’intérêt, en fonction du stade de maturation de ladite cellule progéniteur-T. L’invention concerne également une population cellulaire enrichie en de telles cellules progéniteurs-T, un procédé de préparation des cellules progéniteurs-T, et leur utilisation en thérapie.
Arrière-plan technologique
Les immunothérapies ciblées reposent sur l'utilisation de cellules immunitaires ou de molécules qui engagent les cellules immunitaires pour traiter diverses maladies, notamment des cancers, des infections ou des désordres auto-immuns. Par exemple, la modification génétique des cellules T pour exprimer des récepteurs antigéniques chimériques qui ciblent les antigènes tumoraux a récemment fait ses preuves dans le traitement des leucémies lymphoblastiques aigues et des lymphomes non-Hodgkiniens. Il s'agit de prélever les cellules T du patient, de les modifier in vitro pour leur faire exprimer le récepteur antigènique chimérique (de l’anglais chimeric antigen receptor ou CAR) et de les re-infuser chez le même patient. Ces cellules peuvent reconnaître spécifiquement, grâce aux récepteurs chimériques, des molécules cibles à la surface des cellules cancéreuses et mobiliser l'ensemble du système immunitaire pour en augmenter la réponse naturelle. Le coût du traitement très élevé (environ 400 000€/patient) et les échecs de la préparation des lots cellulaires pour certains patients empêchent aujourd'hui d'appliquer cette technologie à l'ensemble des patients qui en ont besoin.
Les approches allogéniques, basées sur l’utilisation de cellules-T de donneurs sains, pourraient répondre à ces problématiques. Les lymphocytes T allogéniques issus du sang périphérique de donneurs peuvent être utilisés pour la thérapie adoptive par lymphocytes T. Cependant, l’utilisation de cellules-T matures présente certains inconvénients. En particulier, la survenue de la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) en raison du répertoire de récepteurs de cellules T (TCR) exprimé par ces cellules matures nécessite une manipulation génétique afin d’éteindre les gènes responsables du rejet, par exemple ceux du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH). De plus, les cellules T matures se différencient rapidement en cellules effectrices à courte durée de vie, limitant ainsi leur activité thérapeutique. L’administration de cellules progéniteurs-T modifiées, générées in vitro à partir de cellules souches hématopoïétiques est envisagée pour contourner ces problèmes. Ainsi, contrairement aux cellules T matures, les cellules progéniteurs-T modifiées migrent dans le thymus de l’hôte et sont soumises à une sélection naturelle de leur répertoire TCR leur permettant de développer une tolérance aux antigènes de l’hôte. De plus, la génération continue de cellules T matures in vivo à partir des progéniteurs de cellules T génétiquement modifiées permet une meilleure persistance des cellules et par conséquent une activité thérapeutique améliorée.
Il existe encore un besoin d’améliorer ces stratégies de thérapies cellulaires. En effet, le processus de maturation dans le thymus est accompagné de deux étapes de sélection avant la libération des lymphocytes T dans la circulation : la sélection positive et la sélection négative. La sélection positive permet de conserver seulement les lymphocytes T capables de reconnaitre des antigènes dans un contexte restreint au CMH du Soi. La sélection négative permet la destruction des lymphocytes T qui s’attaqueraient aux cellules de l’organisme (réactions autoimmunes).
La génération de cellules progéniteurs-T modifiées nécessite donc de passer ces deux étapes de sélection, et en particulier d’éviter la déplétion des cellules lors de l’étape de sélection négative. Puisque l'étape de la sélection négative est très sensible, les stratégies additionnelles pour palier la déplétion à cette étape doivent être exploitées, par exemple l'utilisation des promoteurs qui permettent l’expression temporelle, conditionnelle, donc maturation-dépendante.
Résumé de l’invention
Les inventeurs proposent d’améliorer ces stratégies de thérapie cellulaire en évitant que les progéniteurs de cellules-T exprimant le transgène d’intérêt ne soient dépiétés pendant les étapes de sélection thymique, de façon à permettre une disponibilité accrue des cellules-T modifiées.
La présente invention concerne une cellule progéniteur-T exprimant de manière régulée une séquence nucléique d’intérêt. Plus particulièrement, la séquence nucléique d’intérêt est placée sous le contrôle d’un promoteur exogène induit par la voie Notch, choisi parmi le promoteur de VIL7RA ou de BCL11B, permettant ainsi une expression régulée en fonction de l’état de maturation des progéniteurs-T. L’invention vise ici à fournir des progéniteurs-T modifiés, dont l’expression du transgène est induite à certains stades de maturation et pas à d’autres (expression dite « maturation-dépendante »), permettant ainsi de ne pas exprimer le transgène durant certaines étapes critiques de sélection thymique, afin d’éviter la déplétion des cellules lors de ces étapes de maturation dans le thymus. Le système proposé vise à restreindre l’expression du transgène dans les cellules engagées dans la voie de différenciation lymphoïde T, tout en évitant l’expression du transgène à certains stades critiques des sélections thymiques et dans d'autres lignées cellulaires non-T.
Ainsi, un premier aspect de l’invention concerne une cellule progéniteur-T isolée, de préférence humaine, présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, ladite cellule progéniteur-T comprenant une cassette d’expression qui comprend un promoteur exogène induit par la voie Notch choisi parmi le promoteur de VIL7RA ou de BCL11B, ledit promoteur étant lié de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite cellule présente un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence du promoteur de VIL7RA ne comprend pas la séquence nucléique SEQ ID NO : 2. Dans un autre mode de réalisation particulier, la séquence du promoteur de VIL7RA comprend ou consiste en la séquence nucléique SEQ ID NO : 2.
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence nucléique hétérologue d’intérêt code pour un récepteur antigènique chimérique.
L’invention vise également une population cellulaire enrichie en cellules progéniteurs-T telles que définies ci-dessus, ladite population comprenant de préférence au moins 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, de préférence au moins 90% desdites cellules progéniteurs-T.
L’invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant la cellule progéniteur-T ou la population cellulaire.
L’invention vise également une cassette d’expression comprenant la région promotrice de VIL7RA liée de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, dans laquelle la région promotrice de VIL7RA comprend ou consiste en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2. Selon un mode de réalisation particulier, la séquence nucléique d’intérêt code pour un récepteur antigénique chimérique ou un récepteur de cellule T.
L’invention concerne en outre une cassette d’expression comprenant le promoteur de BCL11B lié de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, dans laquelle le promoteur de BCL11B comprend ou consiste de préférence en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 3. Selon un mode de réalisation particulier, la séquence nucléique d’intérêt code pour un récepteur antigénique chimérique ou un récepteur de cellule T.
L’invention vise également une utilisation d’une cassette d’expression comprenant la région promotrice de VIL7RA ou de BCL11B liée de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, ou d’un vecteur la comprenant, pour la génération de cellules progéniteurs-T.
Un autre aspect de l’invention concerne un vecteur comprenant une cassette d’expression telle que définie ci-dessus. Le vecteur est de préférence un vecteur viral, de préférence un vecteur rétroviral, et plus préférentiellement un vecteur lentiviral.
L’invention concerne également un procédé de préparation de cellules progéniteurs-T telles que définies ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : a) mise en culture de cellules souches hématopoïétiques CD34+ dans un milieu de culture comprenant des cytokines permettant la différenciation desdites cellules CD34+ en cellules progéniteurs-T présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ ; b) transformation ou transduction des cellules avant, pendant, ou après ladite étape (a) de différenciation, avec un vecteur comprenant une cassette d’expression telle que définie ci- dessus ; dans lequel les cellules souches hématopoïétiques CD34+ sont de préférence issues de sang de cordon ombilical, de sang périphérique ou de moelle osseuse, plus préférentiellement de sang de cordon ombilical. Un autre aspect de l’invention concerne ladite cellule progéniteur-T, ladite population cellulaire ou ladite composition pharmaceutique, pour son utilisation dans le traitement d’un cancer, d’une maladie infectieuse, d’une maladie génétique, d’une maladie inflammatoire ou d’une maladie immunitaire ou encore auto-immune. Selon un mode de réalisation particulier, ladite ou lesdites cellules progéniteurs-T sont des cellules autologues ou allogéniques par rapport au patient à traiter, lesdites cellules étant de préférence des cellules allogéniques.
L’invention concerne également une méthode in vitro pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention, ladite méthode comprenant : a) mesurer dans l’échantillon la quantité de cellules Récents Emigrants Thymiques (RTE), b) comparer la quantité de cellules RTE mesurée dans l’échantillon avec une valeur de référence, c) déterminer si le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention, dans lequel une quantité de cellules RTE égale ou supérieure à la valeur de référence indique une susceptibilité de répondre au traitement.
Un autre aspect de l’invention concerne une méthode de traitement d’une maladie ou d’un trouble chez un sujet comprenant : a) déterminer si le sujet est susceptible de répondre audit traitement par évaluation in vitro de l’activité thymique dans un échantillon sanguin dudit sujet, en particulier par : mesurer dans l’échantillon la quantité de cellules Récents Emigrants Thymiques (RTE), comparer la quantité de cellules RTE mesurée dans l’échantillon avec une valeur de référence, déterminer si le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention, dans lequel une quantité de cellules RTE égale ou supérieure à la valeur de référence indique une susceptibilité de répondre au traitement. b) administrer chez le sujet susceptible de répondre au traitement une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition pharmaceutique de la présente invention. Brève description des figures
[Fig 1]. Schématisation du promoteur de VIL7RA
Le promoteur de \'IL7RA est considéré situé aux positions -1257 à +89 du gène par rapport au site d'initiation de la transcription. Les facteurs de transcriptions « Gfï-1 » et « GABPa » se fixent aux séquences 5'-TAAATCAC[AT]GCA-3' (SEQ ID NO : 10) et répétitions riches en purines (répétions (GA)) respectivement. Le promoteur contient des îlots de méthylation CpG aux positions -975, -567, -497, -475, -466, -346. Le promoteur comprend la TATA box, en position -27 à -22 du gène IL7RA humain. Le codon start "ATG" se trouve en position +90.
[Fig 2]. Expression de VIL7RA suite à l’activation de la voie Notch dans les cellules lymphoïdes et non lymphoïdes
Figure 2 -A : Représentation schématique du protocole consistant à cultiver les cellules Jurkat (lymphoïdes) et THP-1 (non lymphoïdes) en présence ou non d’un ligand de Notch (Delta-like 4, DLL4) pendant 4 jours.
Figure 2-B : Analyse moléculaire de l’expression de l’ARNm IL7RA et HES (contrôle) par RT- qPCR, dans les cellules Jurkat, cultivées en présence (+) ou absence (-) de DEE4.
Figure 2-C : Analyse moléculaire de l’expression de l’ARNm IL7RA et HES (contrôle) par RT- qPCR, dans les cellules THP-1 (lignée non-T), cultivées en présence (+) ou absence (-) de DEE4.
[Fig 3]. Expression du transgène GFP sous contrôle du promoteur de VIL7RA
Figure 3-A : représentation schématique de la cassette comprenant la séquence du promoteur de VIL7RA restreinte (SEQ ID NO :1, « SEQ.l ») ou élargie (SEQ ID NO :2, « SEQ.2 ») liée de manière fonctionnelle à la GFP, et clonée dans un vecteur lentiviral. Le vecteur lentiviral est utilisé pour transduire les cellules Jurkat et THP-1.
Figure 3-B : analyse de l’expression de la protéine GFP par cytométrie en flux, dans les cellules Jurkat ou THP- 1 transduites, en fonction du promoteur utilisé : (i) promoteur contrôle (« cntrl », correspondant au promoteur Spleen focus-forming virus « SFFV»), (ii) séquence restreinte (SEQ.l) du promoteur de VIL7RA ou (iii) séquence élargie (SEQ.2) du promoteur de VIL7RA. Figure 3-C : analyse moléculaire de l’expression de l’ARNm GFP par RT-qPCR, dans les cellules Jurkat ou THP-1 transduites, en présence (+) ou absence (-) de DLL4 en fonction du promoteur utilisé : (i) promoteur contrôle (« cntrl »), ou (ii) séquence restreinte (SEQ.l) du promoteur de VIL7RA. [Fig 4]. Expression du transgène CAR sous contrôle du promoteur de VIL7RA
Figure 4-A : représentation schématique de la cassette comprenant la séquence du promoteur de VIL7RA restreinte (SEQ ID NO :1, « SEQ.l ») ou élargie (SEQ ID NO :2, « SEQ.2 ») liée de manière fonctionnelle à la séquence codant un Récepteur Antigénique Chimérique (CAR- GFP), et clonée dans un vecteur lentiviral. Le vecteur lentiviral est utilisé pour transduire les cellules THP-1.
Figure 4-B : analyse de l’expression de la protéine GFP dans les cellules THP-1 transduites, par cytométrie en flux, en fonction du promoteur utilisé : (i) promoteur contrôle (promoteur SFFV, « cntrl »), (ii) séquence restreinte (SEQ.l) du promoteur de VIL7RA ou (iii) séquence élargie (SEQ.2) du promoteur de VIL7RA.
[Fig 5]. Le promoteur de VIL7RA est un promoteur fort
Analyse de l’expression de la protéine GFP par cytométrie en flux (deux réplicas), dans les cellules Jurkat transduites, en fonction du promoteur utilisé : (i) promoteur contrôle (promoteur SFFV, « cntrl »), ou (ii) séquence élargie (SEQ.2) du promoteur de VIL7RA.
[Fig 6]. Expression de VIL7RA est induite via la voie Notch dans les cellules souches hématopoïétiques
Figure 6-A : représentation schématique du protocole consistant à cultiver les cellules souches hématopoïétiques CD34+ (HSC) en présence ou non d’un ligand de Notch (Delta-like 4, DLL4) pendant 6 jours.
Figure 6-B : analyse de l'expression de la protéine IL7R endogène en présence (+) ou absence (-) de DLL4 dans les cellules souches hématopoïétiques CD34+ (HSC).
Figure 6-C : analyse moléculaire de l’expression de l’ ARNm IL7RA et HES par RT-qPCR dans les cellules souches hématopoïétiques, cultivées en présence (+) ou absence (-) de DLL4.
[Fig 7]. Expression du transgène sous contrôle du promoteur de VIL7RA au cours de la différenciation T in vitro
Figure 7-A : représentation schématique de la cassette comprenant la séquence du promoteur de VIL7RA restreinte (SEQ ID NO :1, « SEQ.l ») ou élargie (SEQ ID NO :2, « SEQ.2 ») liée de manière fonctionnelle à la séquence codant un Récepteur Antigènique Chimérique (CAR- GFP), et clonée dans un vecteur lentiviral. Le vecteur lentiviral est utilisé pour transduire les cellules souches hématopoïétiques CD34+ cultivées dans un milieu de différenciation. Figures 7-B et 7-C : analyse de l’expression de la GFP par cytométrie en flux, dans différentes populations d'intérêt : précurseurs T (CD45RA+CD7+, « pre-T »), CD3-negatifs (CD4-CD8- CD3-, « CD3- ») et CD3-positifs (CD4-CD8-CD3+, « CD3+ »), en fonction du promoteur utilisé : (i) contrôle (« cntrl »), (ii) séquence restreinte (SEQ.l) ou (iii) séquence élargie (SEQ.2) du promoteur de VIL7RA. La moyenne des 3 expériences indépendantes est représentée (B) ainsi que des données d'une des expériences (C).
[Fig 8]. Expression du gène IL7RA endogène et du transgène sous contrôle du promoteur de VIL7RA
Figure 8-A : représentation schématique de la cassette comprenant la séquence du promoteur de VIL7RA restreinte (SEQ ID NO :1, « SEQ.l ») ou élargie (SEQ ID NO :2, « SEQ.2 ») liée de manière fonctionnelle à la séquence codant un Récepteur Antigénique Chimérique (CAR- GFP), et clonée dans un vecteur lentiviral. Le vecteur lentiviral est utilisé pour transduire les cellules T CD4+ naïves cultivées en présence (+) ou absence (-) de DLL4.
Figure 8-B : analyse de l’expression de VIL7RA et du transgène CAR-GFP par cytométrie en flux, dans les cellules T CD4+ naïves cultivées en présence (+) ou absence (-) de DLL4, en fonction du promoteur utilisé : (i) promoteur contrôle (« cntrl ») (ii) séquence restreinte (SEQ.l) du promoteur de VIL7RA ou (iii) séquence élargie (SEQ.2) du promoteur de VIL7RA.
[Fig 9]. Mesure de l’activité thymique.
Figure 9-A : Exemple de marquage CD4-Pacifïc Blue, CD3-Alexa Fluor 700, CD8-APC-H7, CCR7 -Alexa Fluor 647 (BD Biosciences), CD45RA-PE-TexasRed, CD31-PE (Miltenyi Biotech) et CD27-PE-Cy7 (eBioscience), LIVE/DEAD aqua fluorescent dye (Invitrogen) d’échantillons de sang total.
Figure 9-B : mesure du pourcentage de cellules CD4 RTE (gauche) et CD8 RTE (droite) dans les échantillons de sang total de donneurs sains (DS, n=5), de patients atteints de leucémie ou lymphome non traités (Patients NT, n=4) et traités (Patients TT, n=21).
Figure 9-C : mesure du pourcentage de cellules CD8 RTE dans les échantillons de sang total de donneurs sains (DS, n=5), de patients atteints de leucémie ou lymphome non traités (Patients NT, n=4) et traités (Patients TT, n=21). Le groupe des patients traités est représenté en 2 sous- groupes : ceux qui présentent une activité thymique (n=14) et ceux qui n’en présentent pas (n=7). Description détaillée
Un premier aspect de l’invention concerne une cellule progéniteur-T isolée, modifiée de façon à comprendre une cassette d’expression comprenant un promoteur exogène induit par la voie Notch choisi parmi le promoteur de VIL7RA ou de BCL11B, ledit promoteur étant lié de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt.
Le terme « isolé » tel qu'il est utilisé ici signifie que la cellule progénitrice est séparée ou isolée de son environnement naturel. Cette expression distingue ainsi les cellules isolées des cellules faisant partie intégrante du corps humain.
De préférence, la cellule progéniteur-T est une cellule de mammifère. De préférence, la cellule progéniteur-T est une cellule humaine.
Le terme « cellule progéniteur-T » ou « cellule T progénitrice » ou « cellule pro-T » tel qu'utilisé ici signifie une cellule T qui a le potentiel de se différencier en cellules présentant les caractéristiques morphologiques, physiologiques, fonctionnelles et/ou immunologiques des cellules T. En particulier, la cellule progéniteur-T selon l’invention correspond à une cellule ayant perdu tout potentiel de différenciation sauf le potentiel de différenciation vers la voie lymphoïde. Les cellules progéniteurs-T peuvent facilement être caractérisées, en se basant sur l’expression des antigènes de surface tels que CD7, CD45RA, CD5, CDla, CD3, CD4, CD8. L’expression des antigènes de surface peut être facilement déterminée, notamment par la technique de cytométrie en flux.
Selon un mode de réalisation particulier, les cellules progéniteurs-T selon l’invention présentent le phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence le phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+.
Selon un mode de réalisation particulier, les cellules progéniteurs-T selon l’invention présentent le phénotype suivant :
- CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla-, CD3-, CD4-, CD8- (progéniteurs T) ou
- CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+, CD3-, CD4-, CD8- (précurseurs T). De préférence, les cellules progéniteurs-T selon l’invention présentent le phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+, CD3-, CD4-, CD8- (précurseurs T).
Les cellules progéniteurs-T expriment les récepteurs de homing thymiques, c’est-à-dire les récepteurs permettant aux cellules-T de résider dans le thymus (par exemple CD5 ou CXCR4, CD62L, CCR7 et CCR9), et sont capables de migrer dans le thymus après leur injection dans le sang périphérique pour y finir leur maturation et devenir des cellules tolérées vis-à-vis d'un receveur donné.
Dans le cadre de la présente invention, la cellule progéniteur-T est génétiquement modifiée ex vivo pour exprimer une séquence nucléique d’intérêt, sous le contrôle d’un promoteur exogène induit par la voie Notch choisi parmi le promoteur de VIL7RA ou de BCL11B.
Par promoteur « exogène », on entend un promoteur qui n’est pas un promoteur naturellement présent dans la cellule progéniteur-T. Ainsi, le promoteur de VIL7RA n’est pas le promoteur endogène de VIL7RA naturellement présent dans le génome de la cellule progéniteur-T. De même, le promoteur de BCL11B selon l’invention, n’est pas le promoteur endogène de BCL11B naturellement présent dans le génome de la cellule progéniteur-T.
La cellule progéniteur-T selon l’invention comprend une cassette d’expression, qui elle-même comprend : un promoteur exogène induit par la voie Notch choisi parmi le promoteur de VIL7RA ou de BCL11B, ledit promoteur étant lié de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt.
Par séquence nucléique est entendu toute séquence constituée d’acides nucléiques, tels que des acides désoxyribonucléiques ou acides ribonucléiques.
Le terme « lié de manière fonctionnelle », « fonctionnellement lié » ou « lié de manière opérationnelle » fait référence à une juxtaposition de deux séquences d’acide nucléique dans laquelle les séquences sont dans une relation leur permettant de fonctionner de la manière prévue. Par exemple, un promoteur est dit être lié de manière opérationnelle/fonctionnelle à la séquence nucléique codante, si la liaison ou la connexion permet la transcription de ladite séquence nucléique. Par exemple, des séquences d'ADN, telles que, par exemple, un promoteur et une molécule codant pour l'acide nucléique, sont dites fonctionnellement liées si la nature de la liaison entre les séquences (1) n’entraîne pas l'introduction d'un décalage du cadre de lecture, (2) n’interfère pas avec la capacité du promoteur à diriger la transcription de la région nucléique codante, ou (3) n’interfère pas avec la capacité de la région nucléique d’intérêt à être transcrite par la séquence de la région promotrice.
La séquence nucléique d’intérêt peut être liée à d’autres séquences régulatrices, telles que amplificateurs de transcription (enhancer en anglais), terminateurs, séquence Kozak etc.
Le terme « promoteur » utilisé ici signifie une région promotrice qui contrôle la transcription d’un gène particulier, et inclut un promoteur et/ou un amplificateur (ou « enhancer » en anglais). Un promoteur est une région de l’ADN qui initie la transcription d’un gène particulier. Les promoteurs sont situés à proximité des sites d'initiation de la transcription des gènes, sur le même brin et en amont de l’ADN (vers la région 5’ du brin sens). Les promoteurs ont généralement une longueur d’environ 100 à 1000 paires de bases. Un amplificateur (ou « enhancer » en anglais) est une courte région (50-1500 pb) d'ADN qui peut être liée par des facteurs de transcription pour stimuler la transcription d’un gène. Les amplificateurs peuvent être trouvés loin des gènes dont ils contrôlent l'expression (<1 000 000 pb).
Dans le contexte de la présente invention, le promoteur est un promoteur induit (ou activé) par la voie Notch. Un promoteur « induit par la voie Notch » est un promoteur dont l’activité d’initiation de la transcription sera activée par la voie Notch. La protéine Notch est un récepteur dans sa partie extracellulaire. Au contact avec le ligand, la partie intracellulaire de la protéine Notch (Intracellular Notch, ICN) est clivée puis transloquée dans le noyau de la cellule où elle joue le rôle de facteur de transcription. En fonction du contexte physiologique ICN s'associe à d'autres protéines, et ce complexe se fixe aux promoteurs et/ou amplificateurs des gènes-cibles en favorisant un contexte dynamique de la régulation des gènes-cibles. La protéine Notch ne possède pas d’activité transcriptionnelle propre et agit comme une plate-forme de recrutement de co-activateurs additionnels.
Les inventeurs proposent d’utiliser un promoteur d’un gène cible de la voie Notch, afin de permettre l’expression du trans gène dans les cellules engagées dans la voie de différenciation lymphoïde T, tout en évitant l’expression du transgène à certains stades des sélections thymiques. L’utilisation de tels promoteurs permet de manière avantageuse de ne pas exprimer le transgène durant certaines étapes critiques de sélection thymique, afin d’éviter la déplétion des cellules progéniteurs-T modifiées, lors de ces étapes de maturation dans le thymus.
Les promoteurs de VIL7RA et de BCL11B utilisés dans le contexte de la présente invention, sont des promoteurs activés par la voie Notch. En d’autres termes, la fixation des ligands de Notch (par exemple delta- like 1, DLL-1 et delta- like 4, DLL-4) au niveau de la partie extracellulaire de Notch, entraîne une augmentation d'expression des gènes IL7RA et BCL11B.
La cassette d’expression de la présente description peut comprendre un promoteur (ou « région promotrice ») dérivé du gène IL7RA (également nommé gène IL7R, IL7R-alpha ou CD 127), de préférence un promoteur dérivé du gène IL7RA humain. Le terme "dérivé de" tel qu'utilisé ici, indique une relation entre une première molécule et une seconde molécule, et fait généralement référence à la similitude structurelle entre les deux molécules et n’exige pas que l’une d’entre elles soit physiquement générée à partir de l'autre. Dans la présente invention, un promoteur « dérivé » d'un gène IL7RA humain fait référence à un promoteur qui contient une région fonctionnellement active du promoteur d'un gène IL7RA humain, ou un équivalent fonctionnel de celui-ci (par exemple, un variant de la région promotrice contenant des changements nucléotidiques par rapport à la séquence native où les changements nucléotidiques n’affectent pas négativement l'activité de régulation de la transcription du promoteur).
Selon un mode de réalisation particulier, la séquence du promoteur de IL7RA introduite dans la cassette d’expression correspond à une séquence située dans la région de -1257 à +89 paires de bases (par rapport au site d'initiation de la transcription) du gène IL7RA. Par « nucléotides X à Y » d'un gène IL7RA humain, on entend les nucléotides X à Y du gène IL7RA humain tel que référencé dans la base données NCBI (référence NCBI : 3575), ou Ensembl (référence Ensembl : ENSG00000168685). Dans le contexte de la présente invention, le nucléotide "+1" correspond au site d'initiation de la transcription. Le codon start (ATG) du gène IL7RA humain est ainsi en position +90 de l'exon 1.
Selon un mode de réalisation particulier, la séquence du promoteur de VIL7RA introduite dans la cassette d’expression comprend les domaines de liaison potentiels à Notch du promoteur IL7RA natif (nucléotides -927 à -920). Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, le promoteur de VIL7RA utilisé dans la cassette d’expression comprend les nucléotides -927 à - 920 du gène IL7RA humain. Selon un mode de réalisation particulier, la séquence du promoteur de VIL7RA utilisée dans la cassette d’expression de l’invention comprend des îlots CpG susceptibles d’être déméthylés sous l’action de Notch. Par exemple, la séquence du promoteur de VIL7RA utilisée dans la cassette d’expression peut comprendre les nucléotides -1100 à -300 du gène IL7RA humain (région qui comprend plusieurs îlots CpG sensibles à la méthylation). En particulier, la séquence du promoteur de VIL7RA utilisée dans la cassette d’expression peut comprendre les îlots CpG en position -975, -567, -497, -475, -466, -346 du promoteur du gène IL7RA humain. La séquence du promoteur de VIL7RA utilisée dans la cassette d’expression peut en outre comprendre le site de fixation à NF-kB, se trouvant en position -187 à -173 du gène IL7RA humain. La séquence du promoteur de VIL7RA utilisée dans la cassette d’expression peut en outre comprendre la TATA box, en position -27 à -22 du gène IL7RA humain.
Dans certains modes de réalisation, la séquence du promoteur utilisée dans la cassette d’expression de l’invention comprend :
- une région du promoteur IL7RA natif qui comprend les domaines de liaison potentiels à Notch, ladite région correspondant par exemple aux nucléotides -927 à -920 du gène IL7RA humain ; et
- une région de l'enhancer IL7RA natif qui comprend le domaine de liaison potentiel à Notch, ladite région correspond par exemple aux nucléotides +27755 à +27762 du gène IL7RA humain ; et
- une ou plusieurs autre(s) région(s) issues de la région promotrice du gène de VIL7RA humain.
Dans certains modes de réalisation, la séquence du promoteur utilisée dans la cassette d’expression selon l’invention, peut également contenir des séquences du gène IL7RA en aval du site d’initiation de la transcription (en aval du nucléotide +1). Par exemple, la séquence du promoteur utilisée dans la cassette d’expression peut comprendre les nucléotides 1 à 10, ou nucléotides 1 à +100, ou nucléotides 1 à +200 du gène de l’IL7a. Ainsi, le promoteur de la cassette d’expression peut inclure une séquence (par exemple d’environ 100, 200, 400, 600, 800, 1 000, 1 200, 1 400, 1 600 ou 1 800 pb) parmi la région -1257 à + 200 du gène IL7RA humain. Dans certains modes de réalisation, la taille de la séquence du promoteur introduite dans la cassette d’expression ne dépasse pas environ 2 kb (par exemple, ne dépasse pas 2,2 kb) de manière à permettre l’inclusion d’une grande séquence codante dans le vecteur. Selon un mode de réalisation préféré, la séquence du promoteur de VIL7RA introduite dans la cassette d’expression selon l’invention comprend ou consiste en une séquence comprenant les nucléotides -1257 à +89 du gène de VIL7RA.
Selon un mode de réalisation particulier, la séquence du promoteur de VIL7RA introduite dans la cassette d’expression comprend ou consiste en la séquence nucléique SEQ ID NO : 1, ou un variant fonctionnel ayant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 1.
Dans le cadre de la présente invention, un « variant fonctionnel » d’un promoteur est une séquence dérivant d’une séquence promotrice parente, qui a le même type d’activité d’initiation de la transcription, mais avec une séquence nucléique différente. Un tel variant fonctionnel peut avoir au moins 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, au moins 99,9 % d’identité avec la séquence parente. Un tel variant fonctionnel entraîne le même ou sensiblement le même niveau d’expression d’une protéine donnée liée de manière opérationnelle à celui-ci, que le promoteur dont il dérive. Par exemple, un tel variant fonctionnel peut conduire à un niveau d’expression équivalent à au moins 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 105 %, 110 %, 115 %, 120 %, 125 %, 130 %, 135 %, 140 %, 145 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 220 %, 240 %, 260 %, 280 %, 300 %, 350 %, 400 %, 500 %, ou même au moins 600 %, par rapport au niveau d’expression obtenu avec le promoteur parent dont il dérive.
Le terme « identique » et ses déclinaisons se réfèrent à l’identité de séquence entre deux molécules d’acide nucléique. Lorsqu’une position dans les deux séquences comparées est occupée par la même base, alors les molécules sont identiques à cette position. Le pourcentage d’identité entre deux séquences correspond au nombre de positions identiques entre les deux séquences divisé par le nombre de positions comparées X 100. Par exemple, si 6 des 10 positions dans deux séquences correspondent alors les deux séquences sont identiques à 60%. Généralement, une comparaison est effectuée lorsque deux séquences sont alignées pour donner une identité maximale. Divers outils bioinformatiques connus de l’homme du métier peuvent être utilisés pour aligner des séquences d’acides nucléiques telles que BLAST ou EASTA. Selon un autre mode de réalisation préféré, la séquence du promoteur de VIL7RA introduite dans la cassette d’expression selon l’invention comprend :
- Une région comprenant les nucléotides -1257 à +89 du gène de VIL7RA. et
- Une région comprenant les nucléotides +27 310 à +27 852 du gène de VIL7RA.
Selon un mode de réalisation particulier, la séquence du promoteur de VIL7RA comprend ou consiste en la séquence nucléique SEQ ID NO : 2, ou un variant fonctionnel ayant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 2.
Selon un mode de réalisation particulier, la séquence du promoteur de VIL7RA ne comprend pas la séquence nucléique SEQ ID NO : 2, ni un variant fonctionnel ayant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 2. Selon un mode de réalisation particulier, la séquence du promoteur de VIL7RA comprend la séquence nucléique SEQ ID NO : 1, ou un variant fonctionnel ayant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 1, mais ne comprend pas la séquence nucléique SEQ ID NO : 2, ni un variant fonctionnel ayant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 2.
Selon un mode de réalisation, la séquence du promoteur de VIL7RA comprend ou consiste en la séquence nucléique SEQ ID NO : 1, ou un variant fonctionnel ayant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 1, et comprend entre 1300 et 1800 nucléotides, de préférence entre 1320 et 1700 nucléotides, de préférence entre 1340 et 1600 nucléotides, de préférence entre 1346 et 1500 nucléotides.
Tel qu’utilisé ici, un gène IL7RA humain fait référence à un gène IL7RA provenant de n’importe quel individu humain. Il peut contenir des variations génétiques par rapport aux séquences spécifiques mentionnées ici. La présente divulgation envisage tous les équivalents fonctionnels des séquences promotrices spécifiquement mentionnées dans la demande. La Demanderesse a montré que l’expression d’un transgène CAR sous contrôle du promoteur à VIL7RA étendu (SEQ.2) ne permet pas d’expression régulée du transgène de manière maturation-dépendante, i.e. que l’expression du transgène reste stable au cours de la maturation T. Elle a également montré que l’expression sous contrôle de ce promoteur est élevée dans les cellules souches hématopoïétiques CD34+. L’utilisation de ce promoteur étendu de VIL7RA permet donc une expression d’un transgène à un taux élevé de manière stable dans les cellules souches hématopoïétiques CD34+. La Demanderesse a donc démontré que ce promoteur étendu est un promoteur constitutif fort dans les cellules souches hématopoïétiques CD34+, et par conséquent la possibilité d’utiliser le promoteur de VIL7RA comprenant ou consistant en la séquence nucléique SEQ ID NO : 2, ou un variant fonctionnel, pour la modification des cellules souches hématopoïétiques CD34+ et l’expression d’une séquence nucléique hétérologue d’intérêt de manière stable et forte.
Ainsi, un autre aspect de l’invention concerne une cellule progéniteur-T isolée, de préférence humaine, présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, ladite cellule progéniteur-T comprenant une cassette d’expression qui comprend le promoteur de VIL7RA comprenant ou consistant en la séquence nucléique SEQ ID NO : 2, ou un variant fonctionnel ayant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 2, ledit promoteur étant lié de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt.
L’invention concerne donc également une cassette d’expression comprenant la région promotrice de VIL7RA liée de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, dans laquelle la région promotrice de VIL7RA comprend ou consiste en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 2. Selon un mode de réalisation particulier, la séquence nucléique d’intérêt code pour un récepteur antigènique chimérique ou un récepteur de cellule T.
L’invention vise également une utilisation d’une cassette d’expression comprenant la région promotrice de VIL7RA ou de BCL11B liée de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt dans laquelle la région promotrice de VIL7RA comprend ou consiste en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 2, ou d’un vecteur la comprenant, pour la génération de cellules progéniteurs-T.
Un autre aspect de l’invention concerne un vecteur comprenant une cassette d’expression telle que définie ci-dessus. Le vecteur est de préférence un vecteur viral, de préférence un vecteur rétroviral, et plus préférentiellement un vecteur lentiviral.
La cassette d’expression de la présente description peut alternativement comprendre un promoteur dérivé du gène BCL11B humain. Dans la présente invention, un promoteur « dérivé » d’un gène BCL11B humain fait référence à un promoteur qui contient une région fonctionnellement active du promoteur d’un gène BCL11B humain, ou un équivalent fonctionnel de celui-ci (par exemple, un variant de la région promotrice contenant des changements nucléotidiques par rapport à la séquence native où les changements nucléotidiques n’affectent pas négativement l’activité de régulation de la transcription du promoteur).
Selon un mode de réalisation particulier, la séquence du promoteur de BCL11B introduite dans la cassette d’expression correspond à une séquence située dans la région de -4864 à +979 paires de bases (par rapport au site d’initiation de la transcription) du gène BCL11B. Par « nucléotides -4864 à +979 » d’un gène BCL11B, on entend les nucléotides -4864 à +979 du gène BCL11B humain tel que référencé dans la base données NCBI (référence NCBI : 64919), ou Ensembl (référence Ensembl : ENSG00000127152).
Selon un mode de réalisation particulier, la séquence du promoteur de BCL11B comprend ou consiste en la séquence nucléique SEQ ID NO : 3, ou un variant fonctionnel ayant au moins 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO :3.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit variant fonctionnel du promoteur de BCL11B ayant au moins 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO :3, comprend au maximum 4000 paires de bases (pb), de préférence au maximum 3000 pb. Par exemple, ledit variant fonctionnel peut comprendre de 500 à 4000 pb, de préférence de 1000 à 3000 pb, de préférence de 1000 à 2000 pb. Le promoteur de VILR7A ou BCL11B est lié de manière opérationnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt. La séquence promotrice peut être directement liée à la séquence nucléique hétérologue d’intérêt. Alternativement, les deux séquences peuvent être liées par une séquence liante.
Par « séquence nucléique hétérologue d’intérêt », on entend toute séquence hétérologue vis-à- vis du promoteur utilisé. En particulier, lorsque le promoteur est le promoteur de VIL7RA, la séquence nucléique ne code pas pour VIL7RA. De même, si le promoteur est le promoteur de BCL11B, la séquence nucléique ne code par pour BCL11B.
La séquence nucléique hétérologue d’intérêt peut être toute séquence ayant un intérêt thérapeutique lorsqu’elle est exprimée par les cellules-T.
Par exemple, l’invention peut être utilisée pour produire des copies supplémentaires de gènes pour permettre une expression accrue par les cellules T de certains produits géniques in vivo.
La séquence nucléique d’intérêt peut être une séquence nucléique codant pour une protéine thérapeutique ou un acide nucléique thérapeutique. La protéine thérapeutique ou l'acide nucléique thérapeutique lorsqu'il est exprimé par la cellule T a un effet bénéfique dans le traitement d’une maladie ou d’un trouble humain ou vétérinaire. L’acide nucléique thérapeutique est de préférence un ARN thérapeutique. La protéine thérapeutique peut être un peptide ou un polypeptide.
Les séquences nucléiques d’intérêt comprennent, mais sans s'y limiter, celles codant pour un récepteur antigènique chimérique (CAR), un récepteur co-stimulant chimérique (CCR), un récepteur des cellules-T (TCR), une cytokine, une hormone, un anticorps, un biocapteur, un récepteur soluble, une enzyme, un ribozyme, un rapporteur, un modificateur épigénétique, un activateur ou répresseur transcriptionnel, un ARN non codant, ou autres.
Il est entendu que la séquence nucléique d’intérêt peut coder, par exemple, un ADNc, un gène, un mi ARN ou IncRNA, ou autre.
Dans un mode de réalisation spécifique, les cellules progéniteurs-T sont modifiées pour reconnaître un antigène tel qu’un antigène tumoral, un antigène viral ou un antigène bactérien. En tant que telle, la réponse immunitaire vis-à-vis dudit antigène ciblé sera augmentée par l'administration des cellules progéniteurs-T spécifiques de l'antigène.
Selon un mode de réalisation particulier, la séquence nucléique d’intérêt code pour un récepteur antigènique chimérique (CAR en anglais).
La présente invention porte donc en particulier sur une cassette d’expression comprenant la région promotrice de VIL7RA liée de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, dans laquelle la séquence nucléique d’intérêt code pour un récepteur antigènique chimérique (CAR) ou pour un récepteur de cellules T (TCR). Selon un mode de réalisation, la région promotrice de VIL7RA comprend ou consiste en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, de préférence avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 1.
Elle concerne également une cassette d’expression comprenant le promoteur de BCL11B lié de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, dans laquelle la séquence nucléique d’intérêt code pour un récepteur antigènique chimérique ou pour un récepteur de cellules T (TCR). Selon un mode de réalisation, la région promotrice de VIL7RA comprend ou consiste en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 3.
Un "Récepteur antigènique chimérique (CAR)", tel qu'utilisé ici, désigne un récepteur artificiel de cellules T, et englobe des récepteurs modifiés qui greffent une spécificité artificielle vis-à- vis d’un antigène particulier, sur une cellule effectrice immunitaire.
Un CAR comprend typiquement un ectodomaine (domaine extracellulaire) et un endodomaine (domaine cytoplasmique), reliés par un domaine transmembranaire. L’ectodomaine, exprimé à la surface de la cellule, comprend un domaine de liaison à l’antigène ou domaine récepteur et éventuellement une région espaceur (ou charnière) liant le domaine de liaison à l’antigène au domaine transmembranaire. Le domaine transmembranaire est typiquement une hélice alpha hydrophobe qui s'étend à travers la bicouche lipidique de la membrane cellulaire. L'endodomaine du CAR est composé d'un module de signalisation intracellulaire qui induit l'activation des cellules T lors de la liaison à l'antigène. L'endodomaine peut comprendre plusieurs domaines de signalisation.
Dans des modes de réalisation spécifiques, le CAR peut être un CAR de "première génération", "deuxième génération" ou "troisième génération" (voir, par exemple, Sadelain et al., Cancer Discov. 3(4):388-398 ( 2013) ; Jensen et al., Immunol. Rev. 257 : 127-133 (2014) ; Sharpe et al., Dis. Model Mech. 8(4) : 337-350 (2015); Brentjens et al., Clin. Cancer Res.13 : 5426-5435 (2007), Gade et al., Cancer Res). Le rôle du domaine de signalisation des CAR est de transduire le signal d'activation vers la cellule immunitaire dès que le domaine extracellulaire a reconnu l’antigène. Dans la plupart des conceptions CAR mises en œuvre à ce jour, les séquences de signalisation de CD3Ç sont utilisées comme domaine de signalisation déclenchant l'activité lytique. Les CAR de première génération, ne contiennent que la chaîne CD3 Les CAR de deuxième génération comprennent un domaine cytoplasmique contenant le domaine de costimulation CD28, fusionné avec CD3 Cette conception fournit à la fois un signal d'activation et de prolifération à la cellule T (en conséquence, la cellule est activée, détruit la cellule cible et prolifère). Outre le CD28, les séquences de signalisation des récepteurs de costimulation, tels que CD134 (TNFRSF4, 0X40), CD154 (CD40L), CD137 (4-1BB), ICOS (CD278), CD27, CD244 (2B4), ont été testées avec succès dans des CAR. La troisième génération de CAR est basée sur la combinaison de deux ou plusieurs séquences de costimulation (telles que 4- 1 BB-CD28-CD3Q. Ces récepteurs sécrètent une gamme plus large de cytokines (y compris le TNFa, le GM-CSF et l’IFNy). Un ou plusieurs endodomaines peuvent être utilisés, car les CAR dits de troisième génération ont en général au moins 2 ou 3 domaines de signalisation fusionnés pour un effet additif ou synergique, par exemple.
En particulier, le CAR a un domaine de liaison qui se lie à un antigène, ledit antigène étant associé à une maladie ou à un trouble présent chez le sujet ou que l’on souhaite prévenir chez le sujet auquel la cellule est administrée. Dans un mode de réalisation particulier, le CAR lie un antigène associé à une tumeur (« tumor associated antigen » en anglais, ou TAA).
Dans un mode de réalisation particulier, le domaine de liaison à l'antigène du CAR est capable de lier un TAA choisi dans la liste non limitative suivante : CD 19, CD20, ErbB2, Mucl, CD 13, CD33, GD2, NCAM, ALK, CD52, CD160, CA-125, protéine de liaison au folate, CD5, EGFR, Vimentin, BCMA, CD138, anhydrase carbonique IX, G250, PSMA, A33 Dans un mode de réalisation particulier, le domaine de liaison à l'antigène du CAR est capable de lier un TAA, tel que listé dans le tableau ci-dessous (liste non exhaustive).
[Table 1]
Figure imgf000022_0001
Dans un mode particulier de réalisation, le domaine de liaison à l’antigène du CAR est capable de se lier à CD 19.
Un "Récepteur des lymphocytes T (TCR)", tel qu’utilisé ici, désigne une molécule capable de reconnaître un peptide lorsqu'il est présenté par une molécule du CMH. La molécule peut être un hétérodimère de deux chaînes a et P (ou éventuellement y et ô) ou peut être une construction TCR à chaîne unique. Selon un mode de réalisation, le TCR peut être un TCR hybride comprenant des séquences dérivées de plus d'une espèce. Par exemple, il a été constaté de manière surprenante que les TCR murins sont plus efficacement exprimés dans les cellules T humaines que les TCR humains. Le TCR peut donc comprendre des régions variables humaines et des régions constantes murines.
Les TCR spécifiques du TAA peuvent être générés facilement par l’homme du métier en utilisant toute méthode connue dans l’art. Par exemple, les TCR spécifiques du TAA peuvent être identifiés par la méthode de capture du gène TCR de Linnemann et al (Nature Medicine 19, 1534-1541 (2013)). En bref, cette méthode utilise une stratégie à haut débit basée sur l'ADN pour identifier les séquences TCR par la capture et le séquençage de fragments d'ADN génomique codant pour les gènes TCR et peut être utilisée pour identifier les TCR spécifiques du TAA.
Vecteur
Un autre aspect de l’invention concerne un vecteur, comprenant la cassette d’expression telle que décrite ci-dessus. Le vecteur selon l’invention peut être n’importe quel vecteur capable de transformer ou transduire les cellules progéniteurs-T.
Par « vecteur », on entend une molécule d’acide nucléique capable de transporter un autre acide nucléique auquel elle a été liée. Un "vecteur" dans la présente invention comprend, sans s'y limiter, un vecteur viral, un plasmide, un vecteur d’ARN ou une molécule d’ADN ou d’ARN linéaire ou circulaire qui peut consister en une molécule chromosomique, non chromosomique, des acides nucléiques semi-synthétiques ou synthétiques. Les vecteurs préférés sont ceux capables de réplication autonome (vecteur épisomique) et d'expression des acides nucléiques auxquels ils sont liés (vecteurs d'expression). Un grand nombre de vecteurs appropriés sont connus de l'homme du métier et disponibles dans le commerce. La cassette d’expression selon l'invention peut être clonée dans un vecteur tel qu’un plasmide, un phagémide, un cosmide un dérivé de phage, ou un virus.
Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur selon l’invention est un vecteur viral. Les vecteurs viraux comprennent les rétrovirus y compris les lentivirus, les adénovirus, les parvovirus, les virus adénoassociés (AAV), les coronavirus, les virus à ARN à brin négatif tels que l'ortho-myxovirus (par exemple, le virus de la grippe), le rhabdovirus (par exemple, le virus de la rage et de la stomatite vésiculeuse), le paramyxovirus (par exemple, la rougeole et Sendai), les virus à ARN à brin positif tels que le picomavirus et l'alphavirus, et les virus à ADN double brin, y compris l'adénovirus, le virus de l'herpès (par exemple, le virus Herpès Simplex de types 1 et 2, le virus d'Epstein-Barr, le cytomégalovirus) et le poxvirus (par exemple virus de la vaccine, virus de la variole aviaire et virus de la variole du canari). D’autres virus comprennent le virus de Norwalk, le togavirus, le flavivirus, les réovirus, le papovavirus, l'hépadnavirus et le virus de l’hépatite, par exemple. Des exemples de rétrovirus incluent : la leucose-sarcome aviaire, les virus de type C de mammifère, de type B, virus de type D, groupe HTLV-BLV, lentivirus, spumavirus.
Un certain nombre de vecteurs viraux ont été décrits pour le transfert de gènes dans des cellules de mammifères. Les vecteurs viraux utilisables dans le cadre de la présente invention comprennent, mais sans s'y limiter, les rétrovirus, les adénovirus, les virus adéno-associés, les herpèsvirus et les lentivirus. De préférence, le vecteur est un vecteur lentiviral. En particulier, le rétrovirus peut être choisi parmi le virus de la leucémie murine de Moloney (MMLV), le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) ou le virus de la leucémie de Gibbon Ape (GALV).
Comme cela est connu dans l'art, en fonction du vecteur viral, des séquences appropriées supplémentaires seront introduites dans la cassette d’expression de l'invention pour obtenir un vecteur viral fonctionnel. Les séquences appropriées comprennent les ITR pour les vecteurs AAV, ou les LTR pour les vecteurs lentiviraux. A ce titre, l’invention concerne également une cassette d'expression telle que décrite ci-dessus, flanquée d'un ITR de chaque côté, ou flanquée d’un LTR de chaque côté.
Dans certains modes de réalisation, le vecteur est un vecteur AAV recombinant dont le génome comprend la cassette d’expression de l’invention, flanquée par les séquences de répétition terminale inversée (ITR) d’AAV aux deux extrémités. L’AAV peut être de n’importe quel sérotype, par exemple, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV8.2, AAV9 ou AAVrhlO. Dans un autre mode de réalisation particulier, le vecteur AAV est un vecteur pseudotypé, c'est-à-dire que son génome et sa capside sont dérivés d’AAV de différents sérotypes.
De préférence, le vecteur selon l’invention est un vecteur lentiviral. Un avantage des vecteurs lentiviraux est qu'ils conservent la capacité à infecter les cellules qui ne se divisent pas, augmentant ainsi leur capacité à transduire une grande variété de cellules, y compris les cellules quiescentes. En particulier, le vecteur lentiviral est dérivé de lentivirus de primates ou de non- primates. Des exemples de lentivirus de primates comprennent le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), l’agent causal du syndrome d’immunodéficience acquise humaine (SIDA) et le virus de l’immunodéficience simienne (SIV). Le groupe des lentiviraux non primates comprend le « slow virus » visna/maedi (VMV), ainsi que le virus de l’arthrite-encéphalite caprine (CAEV), le virus de l’anémie infectieuse équine (EIAV), le virus de l’immunodéficience féline (FIV) et le virus de l'immunodéficience bovine (B IV). De préférence, le lentivirus est dérivé du virus VIH.
La méthode permettant de produire le vecteur, en particulier le vecteur lentiviral, intégrant la cassette d’expression est bien connue de l’homme de l’art.
A titre d’exemple, un vecteur lentiviral comprenant dans son génome la cassette d’expression de l’invention peut être produit en utilisant un système lentiviral classique à 4 plasmides. Brièvement, des cellules (par exemple HEK293T) sont transfectées avec : (i) un plasmide comprenant la cassette d’expression de l’invention entre un 3’LTR et un 5’LTR; (ii) un plasmide codant les protéines gag/pol du HIV-1 ; (iii) un plasmide codant la protéine rev du HIV-1 rev ; et (iv) un plasmide codant une glycoprotéine d'enveloppe (par exemple VSV-G, glycoprotéine d’enveloppe du virus de la stomatite vésiculeuse).
Un autre aspect de l’invention vise une population cellulaire enrichie en cellules progéniteurs- T modifiées, telles que décrites ci-dessus. Le terme « enrichie » signifie que la population cellulaire comprend une proportion de cellules progéniteurs-T supérieure à la proportion de tout autre type cellulaire constituant la population cellulaire. En d’autres termes, les cellules progéniteurs-T constituent le type cellulaire le plus représenté dans la population cellulaire.
Selon un mode particulier de réalisation, la population cellulaire comprend au moins 40%, 50%, 60%, 70%, 80% desdites cellules progéniteurs-T.
De préférence, la population cellulaire comprend au moins 90% desdites cellules progéniteurs- T, tel que 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou même 100%.
Des méthodes de sélection négative et positive connues dans l'art peuvent être utilisées pour l’enrichissement en cellules progéniteurs-T selon l’invention. Par exemple, les cellules peuvent être triées sur la base des antigènes de surface cellulaire en utilisant un tri de cellules activées par fluorescence (F ACS en anglais), ou un tri cellulaire magnétique (après marquage d'une sous-population cellulaire par une particule magnétique qui lie les cellules en fonction de la présence d’un antigène de surface cellulaire). Des colonnes de sélection négative peuvent être utilisées pour éliminer les cellules exprimant des marqueurs de surface spécifiques. Un autre aspect de l’invention concerne la préparation de la cellule progéniteur-T modifiée et de la population cellulaire telles que décrites ci-dessus.
La cellule progéniteur-T selon l’invention est de préférence dérivée d'une cellule souche. Les cellules souches peuvent être obtenues à partir de n'importe quelle source appropriée, y compris, sans limitation, le cordon ombilical, le sang, les embryons, le tissu embryonnaire, le tissu fœtal, et la moelle osseuse, le thymus. Dans un mode de réalisation, la cellule souche est une cellule souche hématopoïétique (CSH). Dans un autre mode de réalisation, la cellule souche est une cellule souche embryonnaire. Dans un autre mode de réalisation, la cellule souche est une cellule souche pluripotente induite (iPSC).
Dans un mode de réalisation préféré, les cellules progéniteurs-T sont issues de cellules souches hématopoïétiques CD34+, qui sont de préférence issues de sang de cordon ombilical, de sang périphérique ou de moelle osseuse. Dans un mode de réalisation préféré, les cellules souches hématopoïétiques CD34+ sont issues de sang de cordon ombilical.
Les cellules souches utilisées pour générer les cellules progéniteurs-T selon l’invention peuvent être obtenues à partir du patient à traiter ou d’un donneur.
Dans un mode de réalisation préféré, les cellules souches utilisées pour générer les cellules progéniteurs-T selon l’invention sont obtenues à partir d’un donneur sain. Les cellules souches sont de préférence prélevées dans le sang périphérique ou la moelle osseuse du donneur sain. Les donneurs reçoivent généralement des injections de G-CSF pour mobiliser les cellules souches dans la circulation sanguine pour la collecte. Alternativement, les cellules souches peuvent être récoltées directement à partir de la moelle osseuse du donneur sain. Selon un mode de réalisation préféré, les cellules souches sont collectées à partir du sang placentaire du cordon ombilical après un accouchement.
Typiquement, un échantillon provenant du patient ou du donneur sain est d'abord appauvri en cellules non souches ou en cellules matures. Des méthodes de sélection négative et positive connues dans l'art peuvent être utilisées pour l'enrichissement en cellules souches hématopoïétique. Par exemple, les cellules peuvent être triées sur la base des antigènes de surface cellulaire (tels que CD34+) en utilisant un tri de cellules activées par fluorescence (F ACS en anglais), ou un tri cellulaire magnétique (après marquage d'une sous-population cellulaire par une particule magnétique qui lie les cellules en fonction de la présence d’un antigène de surface cellulaire). Des colonnes de sélection négative peuvent être utilisées pour éliminer les cellules exprimant des marqueurs de surface spécifiques.
La purification des CSH CD34+ peut par exemple se faire par les techniques commercialisées au moyen des billes magnétiques (CD34+ MicroBead kit, human (Miltenyi Biotec), EasySep Human CD34 Positive Selection Kit II (Stemcell Technologies)). La pureté de la population enrichie en cellules CSH CD34+ est de préférence supérieure à 80%, à 85% ou à 90%, de manière encore plus préférée supérieure à 95%, telle que 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
Les cellules souches sont ensuite cultivées dans des conditions appropriées pour générer des cellules progéniteurs-T selon l’invention. Dans le contexte de l’invention, la différenciation des cellules, i.e. la différenciation des souches en cellules progéniteurs-T, est distincte de la maturation des cellules progéniteurs-T en cellules T matures.
Le procédé comprend ainsi une étape de mise en culture des cellules souches hématopoïétiques CD34+ dans des conditions appropriées pour générer des cellules progéniteurs-T selon l’invention. En particulier, les cellules CSH CD34+ sont cultivées dans des conditions appropriées pour générer des cellules progéniteurs-T de phénotype :
- CD45RA+, CD7+, CD5+, CD la-, CD3-, CD4-, CD8- (progéniteurs T) ou
- CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+, CD3-, CD4-, CD8- (précurseurs T).
Selon un mode de réalisation particulier, les cellules progéniteurs-T selon l’invention présentent le phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence le phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+.
De préférence, les cellules souches hématopoïétiques sont cultivées en présence d'un ou plusieurs ligands Notch (tels que Delta- like- 1 ou Delta-like-4) pendant un temps suffisant pour former des cellules progéniteurs-T.
Plus préférentiellement, les cellules souches sont cultivées en présence de cellules exprimant un ligand Notch. Dans un mode de réalisation particulier, les CSH CD34+ sont cultivées en présence d’une lignée de cellules OP9 ou de fibroblastes exprimant un ligand Notch, tel que Delta-like-1 (DLL1) ou Delta-like-4 (DLL4). Dans un mode de réalisation préféré, les cellules CSH CD34+ sont cultivées en présence d’une lignée stromale murine OP9 exprimant DLL4.
Par exemple, la concentration des CSH dans la culture est comprise entre 1x102 et 109, de préférence IxlO2 à IxlO6, plus préférablement IxlO5 à IxlO6, de préférence entre IxlO5 et 5x105. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules CSH sont ensemencées à 100 000 cellules par puits et cultivées sur une monocouche de cellules OP9 exprimant Delta-like-1 ou 4 (OP9-DLL1 ou OP9-DLL4).
Une ou plusieurs cytokines qui favorisent l'engagement et la différenciation des cellules en progéniteurs-T peuvent également être utilisées. La concentration d’une cytokine dans une culture est typiquement d'environ 1 à 100 ng/ml. Ce qui suit sont des exemples représentatifs de cytokines qui peuvent être employées : facteur de croissance des fibroblastes (FGF), y compris FGF-4 et FGF-2 ; SCF (Stem Cell factor ou kit-ligand, KL) ; Flt-31 (Fms-like tyrosine kinase 3 ligand) et interleukine-7 (IL-7). De préférence, les cytokines utilisées sont Flt-3 -ligand et IL-7. De préférence, le milieu de culture est complémenté en SCF, Flt-31 et IL-7. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules CSH CD34+ sont cultivées en présence d’une lignée OP9 exprimant DLL1 ou DLL4, le milieu de culture étant complémenté en SCF, Flt-31 et/ou IL-7.
Les cellules souches peuvent être cultivées dans un milieu de culture comprenant un milieu conditionné ou non conditionné. Des exemples de milieu approprié sont : X-VIVO™ 10, X- VIVO ™15, 20, MEMa, RPMI 1640, IMDM ou DMEM. De préférence, le milieu de culture est du milieu MEMa. Le milieu de culture peut comprendre du sérum (par exemple du sérum bovin, du sérum bovin fœtal, du sérum bovin de veau, du sérum de cheval, du sérum humain ou un substitut de sérum artificiel) ou il peut être sans sérum. De préférence, le sérum est du sérum bovin fœtal (SBF) ou du sérum de veau fœtal (S VF). De préférence, le milieu de culture est supplémenté en SBF ou S VF à 20%.
Les conditions de culture impliquent de cultiver les cellules CSH pendant une période de temps suffisante pour que les cellules de la préparation forment des cellules progéniteurs-T. Les cellules sont maintenues en culture généralement pendant 4 à 50 jours, de préférence 5 à 25 jours, de préférence de 10 à 21 jours. De préférence, les cellules sont maintenues en culture pendant environ 20 jours. On comprendra que les cellules peuvent être maintenues pendant la durée appropriée requise pour obtenir la composition cellulaire souhaitée.
Selon un mode de réalisation préféré, les cellules CSH CD34+ sont mises en culture en présence de cellules exprimant un ligand Notch (telles que OP9-DLL1 ou OP9-DLL4), dans un milieu de culture supplémenté en sérum (tel que le FBS ou SVF), en cytokines (en particulier IL-7 et/ou Elt31), et éventuellement en SCF.
En conséquence, la présente demande propose un procédé de génération d'une cellule progéniteur-T comprenant (a) la culture d'un échantillon comprenant des cellules souches ou des cellules progénitrices avec des cellules qui expriment un ligand Notch, éventuellement en présence de cytokines et/ou facteurs de croissance et (b) l'isolement/purification des cellules progéniteurs-T. Les cellules exprimant un ligand Notch sont de préférence des cellules OP9 exprimant DLL1 ou DLL4. Les cellules progéniteurs-T peuvent être caractérisées par le phénotype :
- CD45RA+, CD7+, CD5+, CD la-, CD3-, CD4-, CD8- (progéniteurs T) ou
- CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+, CD3-, CD4-, CD8- (précurseurs T).
Selon un mode de réalisation particulier, les cellules progéniteurs-T selon l’invention présentent le phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence le phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+.
Le procédé peut comprendre une étape d’enrichissement en cellules progéniteurs-T, par exemple en effectuant un tri cellulaire par LACS ou par billes magnétiques, sur la base des antigènes de surface. Selon un mode de réalisation particulier, la population cellulaire est enrichie de façon à obtenir au moins 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, de préférence au moins 90%, encore plus préférentiellement au moins 95% desdites cellules progéniteurs-T.
Selon un mode de réalisation particulier, la population cellulaire est enrichie de façon à obtenir au moins 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, de préférence au moins 90%, encore plus préférentiellement au moins 95% desdites cellules progéniteurs-T présentant un phénotype :
- CD45RA+, CD7+, CD5+, CD la-, CD3-, CD4-, CD8- (progéniteurs T) ou
- CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+, CD3-, CD4-, CD8-(précurseurs T). Selon un mode de réalisation particulier, les cellules progéniteurs-T selon l’invention présentent le phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence le phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CDla+.
Le procédé comprend en outre une étape de modification génique des cellules afin d’obtenir des cellules progéniteurs-T qui comprennent la cassette d’expression telle que décrite ci-dessus. Ainsi, le procédé comprend en outre une étape d’introduction de la cassette d’expression telle que décrite ci-dessus, dans la cellule. La cassette d’expression de l’invention peut être introduite dans les cellules sous forme d'ADN nu ou intégrée dans un vecteur approprié.
La cassette d'expression peut être introduite dans la cellule cible par toutes techniques connues telles que des méthodes chimiques (par exemple, transfection au phosphate de calcium ou lipofection à l’aide de lipides cationiques), des méthodes non chimiques (par exemple, électroporation), des méthodes basées sur des particules (par exemple, magnétofection ) et la transduction virale en utilisant des vecteurs viraux tels que des vecteurs adénoviraux, des vecteurs rétroviraux, des vecteurs lentiviraux, des vecteurs viraux adéno-associés (AAV), ou des vecteurs viraux hybrides.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé comprend une étape de transduction, au moyen d’un vecteur viral comprenant dans son génome la cassette d’expression de l’invention. Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur viral est tel que décrit ci-dessus.
L’étape d’introduction de la cassette d’expression peut être effectuée avant l’étape, pendant, ou après l’étape de différenciation des cellules souches en cellules progéniteurs-T.
Tel qu’utilisé dans la présente invention, le terme « différenciation des cellules souches en cellules progéniteurs-T » signifie que les cellules obtenues après différenciation ne sont plus pluripotentes mais sont encore immatures. Ainsi, la différenciation telle que décrite ici ne concerne pas la maturation thymique qui transforment les cellules progéniteurs-T immatures en cellules T matures.
Dans le contexte de la présente invention, la différenciation a lieu in vitro, tandis que la maturation thymique a lieu in vivo, après administration, le cas échéant, des cellules progéniteurs-T modifiées à un sujet. Selon un mode de réalisation, le procédé de préparation de cellules progéniteurs-T de l’invention comprend les étapes suivantes : a) mise en culture de cellules souches hématopoïétiques CD34+ dans un milieu de culture comprenant un ligand de Notch et des cytokines permettant la différenciation desdites cellules CD34+ en cellules progéniteurs-T présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ ; b) transformation ou transduction des cellules avant, pendant, ou après ladite étape (a) de différenciation, avec un vecteur comprenant une cassette d’expression telle que définie dans la présente invention.
Dans un mode de réalisation, le ligand de Notch est Delta- like- 1 (DLL1) ou Delta- like-4 (DLL4). Dans un mode de réalisation de l’invention, les cellules souches hématopoïétiques CD34+ sont issues de sang de cordon ombilical, de sang périphérique ou de moelle osseuse, plus préférentiellement de sang de cordon ombilical.
En particulier, l’étape d’introduction de la cassette d’expression, de préférence par transformation ou transduction d’un vecteur contenant la cassette d’expression, peut se faire à partir des cellules CSH CD34+, non différenciées. Selon ce mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend dans l’ordre les étapes de :
- collecte des cellules souches et éventuellement purification, tel que décrit ci-dessus ;
- modification génique par intégration de la cassette d’expression, tel que décrit ci-dessus ; et
- différenciation des cellules souches génétiquement modifiées en cellules progéniteurs-T selon l’invention, tel que décrit ci-dessus.
Ainsi, selon ce mode de réalisation, le procédé de préparation de cellules progéniteurs-T de l’invention comprend les étapes suivantes : a) transformation ou transduction de cellules souches hématopoïétiques CD34+ avec un vecteur comprenant une cassette d’expression telle que définie dans la présente invention ; b) mise en culture des cellules obtenues à l’étape a) dans un milieu de culture comprenant un ligand de Notch et des cytokines permettant la différenciation desdites cellules CD34+ en cellules progéniteurs-T présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+. Selon un autre mode de réalisation, l’étape d’introduction de la cassette d’expression, de préférence par transformation ou transduction d’un vecteur contenant la cassette d’expression, peut se faire lors de l’étape de différenciation des cellules souches en cellules progéniteurs-T. Selon ce mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend dans l’ordre les étapes de :
- collecte des cellules souches et éventuellement purification, tel que décrit ci-dessus ;
- initiation de la différenciation des cellules souches en cellules progéniteurs-T, tel que décrit ci-dessus.
- modification génique par intégration de la cassette d’expression, tel que décrit ci-dessus ; et
- fin de l’étape de l’étape de différenciation des cellules génétiquement modifiées, en cellules progéniteurs-T selon l’invention.
Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de préparation de cellules progéniteurs-T de l’invention comprend les étapes suivantes : a) mise en culture de cellules souches hématopoïétiques CD34+ dans un milieu de culture comprenant un ligand de Notch et des cytokines permettant la différenciation desdites cellules CD34+ en cellules progéniteurs-T présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ ; b) transformation ou transduction des cellules pendant ladite étape (a) de différenciation, avec un vecteur comprenant une cassette d’expression telle que définie dans la présente invention.
Ainsi, selon un mode de réalisation, l’étape de différenciation des cellules souches hématopoïétiques en cellules progéniteurs-T se poursuit après l’étape de transformation ou transduction.
En d’autres termes, selon un mode de réalisation, le procédé de préparation de cellules progéniteurs-T de l’invention comprend les étapes suivantes : a) mise en culture de cellules souches hématopoïétiques CD34+ dans un milieu de culture comprenant un ligand de Notch et des cytokines permettant la différenciation desdites cellules CD34+ en cellules progéniteurs-T présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ ; b) transformation ou transduction des cellules avec un vecteur comprenant une cassette d’expression telle que définie dans la présente invention ; c) différenciation des cellules souches hématopoïétiques en cellules progéniteurs-T modifiées. Selon ce mode de réalisation, les cellules CSH CD34+ peuvent être mises en culture au jour JO en présence de cellules exprimant un ligand Notch telles que les cellules OP9 exprimant DLL1 ou DLL4, dans un milieu de culture comprenant de préférence des cytokines (en particulier IL 7 et/ou Flt31), des facteurs de croissance, et/ou du sérum (tel que du SBF ou SVF). L’étape d’introduction de la cassette d’expression, de préférence par transformation ou transduction d’un vecteur contenant la cassette d’expression, peut être réalisée au cours de l’étape de différenciation, par exemple entre le jour 0 et le jour 18.
Selon un mode de réalisation, l’étape de transformation ou transduction peut être réalisée entre le jour 4 et 18, de préférence entre le jour 6 et le jour 15, de préférence entre le jour 7 et le jour 10. L’étape de différenciation des cellules souches en cellules progéniteurs-T est ensuite poursuivie, les cellules progéniteurs-T étant de préférence récolées/isolées à partir du jour 13, de préférence à partir du jour 16.
Selon un mode de réalisation, l’étape de transformation ou transduction peut être réalisée entre le jour 0 et le jour 4, de préférence entre le jour 0 et le jour 3, de préférence entre le jour 0 et le jour 2. Selon un mode de réalisation, l’étape de transformation ou transduction peut être réalisée au jour 0. Selon un autre mode de réalisation, l’étape de transformation ou transduction peut être réalisée au jour 1.
Selon un mode de réalisation alternatif, l’étape d’introduction de la cassette d’expression, de préférence par transformation ou transduction d’un vecteur contenant la cassette d’expression, peut se faire à l’issue de l’étape de différenciation des cellules souches en cellules progéniteurs- T. Selon ce mode de réalisation, le procédé de l’invention comprend dans l’ordre les étapes de :
- collecte des cellules souches et éventuellement purification, tel que décrit ci-dessus ;
- différenciation des cellules souches génétiquement modifiées en cellules progéniteurs-T, tel que décrit ci-dessus ;
- modification génique des cellules progéniteurs-T par intégration de la cassette d’expression, tel que décrit ci-dessus.
Ainsi, selon un mode de réalisation, le procédé de préparation de cellules progéniteurs-T de l’invention comprend les étapes suivantes : a) mise en culture de cellules souches hématopoïétiques CD34+ dans un milieu de culture comprenant un ligand de Notch et des cytokines permettant la différenciation desdites cellules CD34+ en cellules progéniteurs-T présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ ; b) transformation ou transduction des cellules progéniteurs-T après ladite étape (a) de différenciation, avec un vecteur comprenant une cassette d’expression telle que définie dans la présente invention.
Les cellules progéniteurs T modifiées et la population cellulaire enrichie en cellules progéniteurs-T selon l’invention peuvent être conservées jusqu’à l’administration au patient. Par exemple les cellules ou la population cellulaire enrichie peuvent être cryoconservées dans un milieu cryoprotecteur, tel qu’un milieu comprenant de l'albumine humaine et DMSO.
Un autre aspect de l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant la cellule progéniteur-T de l’invention, ou la population enrichie en cellules progéniteurs-T de l’invention, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », il faut comprendre toute substance autre que le principe actif dans un médicament. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un diluant, un adjuvant, un excipient ou un véhicule avec lequel la cellule progéniteur-T est administrée. Son addition est destinée à conférer des caractéristiques physico-chimiques et/ou biochimiques pour favoriser l’administration des cellules progéniteurs-T, sans altérer la stabilité et l’efficacité desdites cellules.
La composition pharmaceutique peut par exemple prendre la forme d’une solution aqueuse comprenant les cellules, sous forme de suspension ou d’émulsion. La composition peut être typiquement tamponnée à un pH sélectionné. La composition peut comprendre un excipient pharmaceutiquement acceptable, par exemple, de l'eau, une solution saline, une solution saline tamponnée au phosphate, ou tout autre excipient approprié pour l'intégrité et la viabilité des cellules, et pour l'administration de la composition cellulaire à un sujet, en particulier un humain. L'homme du métier peut facilement déterminer la quantité de cellules et d'additifs facultatifs dans la composition de l'invention. La composition pharmaceutique est de préférence isotonique, c'est-à-dire qu'elle a la même pression osmotique que le sang. De telles formulations isotoniques ont généralement une pression osmotique d'environ 250 mOSm à environ 350 mOSm. L'isotonie souhaitée de la composition de l’invention peut être obtenue en utilisant du chlorure de sodium ou d’autres agents pharmaceutiquement acceptables tels que le dextrose, l’acide borique, le tartrate de sodium ou d’autres solutés inorganiques ou organiques.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition comprend au moins deux populations de cellules progéniteurs-T selon l’invention, dans laquelle chaque population de cellules progéniteurs-T exprime une séquence nucléique hétérologue différente. Par exemple, la composition peut comprendre une première population de cellules progéniteurs-T exprimant de manière régulée un premier CAR ciblant un premier antigène, en association avec une deuxième population de cellules progéniteurs-T exprimant de manière régulée un deuxième CAR ciblant un deuxième antigène.
La composition peut également contenir, en plus des cellules progéniteurs-T selon l’invention, un ou plusieurs principe(s) actif(s) utile(s) pour l’indication ou la maladie visée. De tels principes actifs sont présents en combinaison avec les cellules progéniteurs-T selon l’invention dans des quantités qui sont efficaces pour le but recherché.
La composition pharmaceutique selon l’invention comprend une quantité efficace de cellules progéniteurs-T selon l’invention, qui peut être déterminée en fonction de la pathologie, du patient (par exemple en fonction de son poids ou son âge) et/ou du stade de la maladie.
L’administration des cellules ou de la composition pharmaceutique peut consister en l’administration de 104 à 109 cellules par kg de poids corporel du patient, de préférence de 105 à 106 cellules/kg de poids corporel du patient. Les cellules ou la population de cellules peuvent être administrées en une ou plusieurs doses.
Dans un autre mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend des cellules progéniteurs-T selon l'invention, notamment au moins 100 cellules, au moins 200 cellules, au moins 400 cellules, au moins 500 cellules, au moins 700 cellules, au moins 1000 cellules, au moins 1500 cellules, au moins 2000 cellules, au moins 3000 cellules, au moins 5000 cellules, au moins 10 000 cellules, au moins 100 000 cellules, au moins 1 million de cellules, au moins 10 millions de cellules ou au moins 100 millions de cellules progéniteurs-T selon l'invention.
La composition pharmaceutique selon l’invention peut être stockée par cryopréservation, par exemple dans l’azote liquide. Selon ce mode de réalisation, la composition pharmaceutique peut en outre comprendre un ou plusieurs agent(s) cryoprotecteurs(s). Par exemple, la composition pharmaceutique peut comprendre un milieu CS 10 ou tout autre milieu contenant du sérum et du DMSO.
La composition pharmaceutique selon l’invention peut être formulée pour toute voie d’administration conventionnelle incluant une administration topique, entérale, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intraoculaire.
De préférence, la composition pharmaceutique selon l’invention est administrée par voie entérale ou parentérale. Lorsqu'elle est administrée par voie parentérale, la composition pharmaceutique selon l'invention est de préférence administrée par voie d'administration intraveineuse.
La présente invention concerne également l’utilisation de la cassette d’expression de l’invention ou d’un vecteur la comprenant, pour la génération de cellules progéniteurs-T.
Dans un autre mode de réalisation, la cassette d’expression comprend la région promotrice de VIL7RA ou de BCL11B liée de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt. Dans un mode de réalisation, la région promotrice de IL7RA comprend ou consiste en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, de préférence avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 1. Dans un mode de réalisation, la région promotrice de BCL11B comprend ou consiste en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 3.
Dans un mode de réalisation, la cassette d’expression de l’invention est utilisée pour la génération de cellules progéniteurs-T selon le procédé de préparation tel que décrit dans la présente invention. La présente invention concerne une cellule progéniteur-T, une population enrichie en cellules progéniteurs-T ou une composition comprenant lesdites cellules, pour une utilisation en tant que médicament ou pour une utilisation dans le traitement d'une maladie ou d'un trouble chez un sujet. Elle concerne également l'utilisation d’une cellule progéniteur-T, d’une population enrichie en cellules progéniteurs-T ou d’une composition comprenant lesdites cellules dans la fabrication d'un médicament pour traiter une maladie ou un trouble chez un sujet. Enfin, elle concerne une méthode de traitement d'une maladie ou d'un trouble chez un sujet comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition pharmaceutique de la présente invention.
Le « traitement » désigne tout acte visant à améliorer l'état de santé des patients. Le « traitement » peut inclure, sans s’y limiter, le soulagement ou l’amélioration d’un ou plusieurs symptômes, la réduction de l'étendue de la maladie, la stabilisation de l'état de la maladie (par exemple, maintenir un patient en rémission), la prévention de la maladie ou la prévention de la propagation de la maladie, le ralentissement de la progression de la maladie, la réduction du risque de réapparition de la maladie ou la rémission (qu'elle soit partielle ou totale). Un traitement peut inclure des effets curatifs ou prophylactiques. Les effets souhaitables du traitement comprennent la diminution du taux de progression de la maladie, l'amélioration ou l'atténuation de l'état de la maladie, et la rémission ou l'amélioration du pronostic. Le soulagement peut se produire avant l’apparition des signes ou des symptômes de la maladie ou de l'affection, ainsi qu'après leur apparition. Ainsi, le "traitement" peut inclure la "prévention" d'une maladie ou d'un état indésirable. Dans un mode de réalisation particulier, le traitement d’un cancer comprend l’inhibition de la croissance ou de la prolifération des cellules cancéreuses ou la destruction des cellules cancéreuses. Dans un mode de réalisation particulier, le traitement d’un cancer comprend la réduction du risque ou du développement de métastases. Dans un autre mode de réalisation particulier, le traitement d'un cancer peut faire référence à la prévention d'une rechute. Traiter un cancer peut aussi faire référence au maintien d'un sujet en rémission.
Tels qu'ils sont utilisés ici, les termes « trouble » ou « maladie » font référence à un organe, une partie ou une structure du corps fonctionnant de manière incorrecte liés par exemple à des facteurs génétiques ou développementaux, une infection, une carence ou un déséquilibre nutritionnel, une toxicité, ou des facteurs environnementaux défavorables. De préférence, ces termes se réfèrent à un trouble de santé ou une maladie, par ex. une maladie qui perturbe les fonctions physiques ou mentales normales. Plus préférablement, le terme « maladie » fait référence à des maladies immunitaires et/ou inflammatoires qui affectent les animaux et/ou les humains. De préférence, le terme « maladie » se réfère à des cancers, des maladies infectieuses ou des maladies immunitaires.
Dans un mode de réalisation particulier, la cellule progéniteur-T, la population enrichie en cellules progéniteurs-T ou la composition comprenant lesdites cellules, est utilisée dans le traitement d’une maladie génétique, d’un cancer, d’une maladie infectieuse ou d’une maladie immunitaire telle qu’une immunodéficience innée.
Dans un mode de réalisation particulier, la cellule progéniteur-T, la population enrichie en cellules progéniteurs-T ou la composition comprenant lesdites cellules, est utilisée dans une méthode de diagnostic. Par exemple, la cellule progéniteur-T peut être modifiée de façon à exprimer un CAR couplé à un marqueur fluorescent permettant la détection d’une cible d’intérêt, et son utilisation dans une méthode de diagnostic.
Le terme « maladie génétique » désigne toute maladie liée à l’absence ou à l’altération de l’expression d’un gène.
Le terme « cancer » tel qu'utilisé ici est défini comme une maladie caractérisée par la croissance rapide et incontrôlée de cellules aberrantes. Les cellules cancéreuses peuvent se propager localement ou par la circulation sanguine et le système lymphatique vers d’autres parties du corps.
Le terme « maladies infectieuses » fait référence à des troubles causés par des organismes, tels que des bactéries, des virus, des champignons ou des parasites.
Le terme « maladie immunitaire » ou « maladie auto-immune », tel qu'il est utilisé ici, fait référence à une affection chez un sujet caractérisée par une lésion cellulaire, tissulaire et/ou d’un organe causée par une réaction immunologique du sujet envers ses propres cellules, tissus et /ou organes. Les maladies immunitaires comprennent les immunodéficiences acquises et innées. Le terme « maladie inflammatoire » fait référence à un état chez un sujet caractérisé par une inflammation, par exemple une inflammation chronique. Les troubles auto-immuns peuvent être associés ou non à une inflammation.
Dans un aspect, la maladie ou le trouble à traiter est un état choisi parmi une maladie ou un trouble prolifératif, de préférence le cancer ; une maladie ou un trouble infectieux, de préférence une infection virale, bactérienne ou fongique ; une maladie ou un trouble inflammatoire ; et une maladie ou un trouble immunitaire, de préférence une auto-immunité ou des maladies autoimmunes. Les troubles immunitaires comprennent notamment l’immunodéficience innée et acquise tels que le l’infection VIH, le déficit immunitaire combiné sévère (SCID) ou encore le traitement post-greffes.
Dans un mode de réalisation particulier, la cellule progéniteur-T, la population cellulaire enrichie en cellules progéniteurs-T et/ou la composition pharmaceutique conviennent au traitement de troubles auto-immuns. Les troubles auto-immuns peuvent affecter presque tous les organes du sujet, y compris, mais sans s'y limiter, le système nerveux, gastro-intestinal et endocrinien, ainsi que la peau et d'autres tissus conjonctifs, les yeux, le sang et les vaisseaux sanguins.
Dans un mode de réalisation particulier, la cellule progéniteur-T, la population cellulaire enrichie en cellules progéniteurs-T et/ou la composition pharmaceutique est destinée à être utilisée dans le traitement d’un cancer. Par conséquent, la présente invention concerne également des méthodes pour inhiber la croissance d’un cancer chez un sujet en ayant besoin et/ou prévenir la formation d’un cancer et/ou la propagation du cancer chez un patient en ayant besoin.
Dans un mode de réalisation particulier, la cellule progéniteur-T, la population cellulaire enrichie en cellules progéniteurs-T et/ou la composition pharmaceutique est destinée à être utilisée dans la prévention d’une rechute d’un cancer.
En particulier, le cancer est une tumeur solide ou un cancer hématopoïétique.
Selon un mode de réalisation particulier, le cancer est une tumeur solide. Les cancers hématopoïétiques sont des cancers du sang ou de la moelle osseuse. Des exemples de cancers hématologiques comprennent les leucémies, y compris les leucémies aiguës (telles que la leucémie lymphoïde aiguë, la leucémie myéloïde aiguë, la leucémie myéloïde aiguë et les leucémies myéloblastiques, promyélocytaires, myélomonocytaires, monocytaires et érythroleuciques), les leucémies chroniques (telles que la myélocyte chronique) leucémie, leucémie myéloïde chronique et leucémie lymphoïde chronique), polyglobulie essentielle, lymphome, maladie de Hodgkin, lymphome non hodgkinien (formes indolentes et de haut grade), myélome multiple, macroglobulinémie de Waldenstrom, maladie des chaînes lourdes, syndrome myélodysplasique, leucémie à tricholeucocytes et myélodysplasie .
Dans un mode de réalisation préféré, les cellules progéniteurs-T de l'invention sont utilisées en tant que produit thérapeutique, idéalement en tant que produit "prêt à l’emploi".
Tel qu’utilisé ici, le terme « sujet » ou « patient » fait référence à un animal, de préférence à un mammifère humain ou un mammifère non-humain tels que les chiens, les chats, les chevaux, les vaches, les porcs, les moutons et les primates non humains, entre autres. De préférence, le sujet est un humain. Le sujet humain selon l’invention peut être un être humain au stade prénatal, un nouveau-né, un enfant, un nourrisson, un adolescent ou un adulte.
Selon un mode de réalisation, ladite cellule progéniteur-T, ladite population cellulaire ou ladite composition pharmaceutique est utilisée en traitement de deuxième ligne.
La présente invention concerne également un procédé in vitro pour évaluer l’activité thymique d’un sujet comprenant la mesure dans l’échantillon de la quantité de cellules Récents Emigrants Thymiques (RTE), indispensable en amont de l’administration de la population cellulaire décrite ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, l’échantillon est un échantillon de sang, de préférence un échantillon de sang total.
Selon un mode de réalisation, la quantité de cellules RTE est la quantité de cellules CD4 RTE, la quantité de cellules CD8 RTE ou la quantité de cellules CD4 RTE et de cellules CD8 RTE.
Selon un mode de réalisation, la quantité de cellules RTE peut être mesurée par mesure au moins du niveau d’expression du marqueur CD31 sur des cellules T naïves. Selon un mode de réalisation particulier, la quantité de cellules RTE peut être mesurée par mesure du niveau d’expression du marqueur CD31 et d’un ou plusieurs autres marqueurs parmi CD27, CCR7 et CD45RA. Selon un mode de réalisation particulier, la quantité de cellules RTE peut être mesurée par mesure au moins du niveau d’expression des marqueurs CD27, CCR7, CD45RA et CD31.
Selon un mode de réalisation, la quantité de cellules RTE est équivalent à la quantité de cellules CD3 Ihigh. Selon un mode de réalisation, la quantité de cellules RTE est équivalent à la quantité de cellules CD27, CCR7, CD45RA, CD3 Ihigh.
Les méthodes permettant de mesurer l'expression d'un marqueur sont bien connues dans l'art et comprennent, entre autres, le marquage en cytométrie en flux selon les méthodes standards.
Selon un autre mode de réalisation, la quantité de cellules RTE peut être mesurée par mesure de la quantité de signal-joint T-cell receptor excision circle (sjTREC), en particulier par mesure de la quantité d’ADN sjTREC.
Les méthodes permettant de mesurer la quantité de sjTREC, en particulier d’ADN sjTREC, sont bien connues dans l’art et comprennent, entre autres, la quantification par PCR, qPCR ou qRT-PCR.
Dans un mode de réalisation avantageux, la présence d’activité thymique dans ledit échantillon permet d’envisager un traitement thérapeutique avec les cellules progéniteurs-T modifiées de l’invention. En effet, la présence d’activité thymique dans ledit échantillon permet de déterminer si le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention.
La présente invention concerne donc également une méthode in vitro pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention, ladite méthode comprenant : a) mesurer dans l’échantillon la quantité de cellules Récents Emigrants Thymiques (RTE), b) comparer la quantité de cellules RTE mesurée dans l’échantillon avec une valeur de référence, c) déterminer si le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention, dans lequel une quantité de cellules RTE égale ou supérieure à la valeur de référence indique une susceptibilité de répondre au traitement.
Selon un mode de réalisation, la valeur de référence est la quantité de cellules CD4 et/ou CD8 dans l’échantillon issu du sujet. Selon ce mode de réalisation, le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention si la quantité de cellules CD4 RTE est égale ou supérieure à 2% de la quantité totale de cellules CD4 naïves dans l’échantillon du sujet, de préférence égale ou supérieure à 4% de la quantité totale de cellules CD4 naïves dans l’échantillon du sujet, de préférence égale ou supérieure à 5% de la quantité totale de cellules CD4 naïves dans l’échantillon du sujet, de préférence égale ou supérieure à 8% de la quantité totale de cellules CD4 naïves dans l’échantillon du sujet, de préférence égale ou supérieure à 10% de la quantité totale de cellules CD4 naïves dans l’échantillon du sujet. Selon un autre mode de réalisation, le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention si la quantité de cellules CD8 RTE est égale ou supérieure à 10% de la quantité totale de cellules CD8 naïves dans l’échantillon du sujet, de préférence égale ou supérieure à 15% de la quantité totale de cellules CD8 naïves dans l’échantillon du sujet, de préférence égale ou supérieure à 20% de la quantité totale de cellules CD8 naïves dans l’échantillon du sujet, de préférence égale ou supérieure à 25% de la quantité totale de cellules CD8 naïves dans l’échantillon du sujet, de préférence égale ou supérieure à 30% de la quantité totale de cellules CD8 naïves dans l’échantillon du sujet, de préférence égale ou supérieure à 35% de la quantité totale de cellules CD8 naïves dans l’échantillon du sujet.
Selon un mode de réalisation, la valeur de référence est la quantité de cellules RTE dans un échantillon contrôle issu d’un ou plusieurs sujets sains, i.e. sujets ayant une activité thymique normale. Selon ce mode de réalisation, le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention si la quantité de cellules CD4 RTE est égale ou supérieure à 10% de la quantité de cellules CD4 RTE dans l’échantillon contrôle, de préférence égale ou supérieure à 15% de la quantité de cellules CD4 RTE dans l’échantillon contrôle, de préférence égale ou supérieure à 20% de la quantité de cellules CD4 RTE dans l’échantillon contrôle, de préférence égale ou supérieure à 25% de la quantité de cellules CD4 RTE dans l’échantillon contrôle, de préférence égale ou supérieure à 30% de la quantité de cellules CD4 RTE dans l’échantillon contrôle. Selon un autre mode de réalisation, le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention si la quantité de cellules CD8 RTE est égale ou supérieure à 10% de la quantité de cellules CD8 RTE dans l’échantillon contrôle, de préférence égale ou supérieure à 15% de la quantité de cellules CD8 RTE dans l’échantillon contrôle, de préférence égale ou supérieure à 20% de la quantité de cellules CD8 RTE dans l’échantillon contrôle, de préférence égale ou supérieure à 25% de la quantité de cellules CD8 dans l’échantillon contrôle, de préférence égale ou supérieure à 30% de la quantité de cellules CD8 RTE dans l’échantillon contrôle.
Selon un mode de réalisation, la valeur de référence est le niveau d’expression du marqueur CD31 dans les cellules CD4 et/ou CD8 naïves dans l’échantillon issu du sujet. Selon un mode de réalisation, la valeur de référence est le niveau d’expression du marqueur CD31 dans les cellules CD4 et/ou CD8 naïves dans un échantillon contrôle issu d’un ou plusieurs sujets sains, i.e. sujets ayant une activité thymique normale.
Selon un mode de réalisation, la valeur de référence est le niveau d’expression du marqueur CD31 dans les cellules CD4 et/ou CD8 naïves dans un échantillon contrôle issu d’un ou plusieurs sujets sains, i.e. sujets ayant une activité thymique normale. Selon ce mode de réalisation, le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention si le niveau d’expression du marqueur CD31 dans les cellules CD4 naïves est égal ou supérieur à 10%, 15%, 20%, 25% ou 30% du niveau d’expression du marqueur CD31 dans les cellules CD4 naïves de l’échantillon contrôle. Selon un autre mode de réalisation, le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention si le niveau d’expression du marqueur CD31 dans les cellules CD8 naïves est égal ou supérieur à 10%, 15%, 20%, 25% ou 30% du niveau d’expression du marqueur CD31 dans les cellules CD8 naïves de l’échantillon contrôle.
Selon un autre mode de réalisation, la valeur de référence est la quantité d’ADN sjTREC dans un échantillon contrôle issu d’un ou plusieurs sujets sains, i.e. sujets ayant une activité thymique normale.
La présente invention concerne en outre une méthode de traitement d'une maladie ou d'un trouble chez un sujet comprenant méthode in vitro pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre au traitement de la présente invention, et l’administration d’une composition pharmaceutique telle que décrite dans la présente invention. Selon un mode de réalisation, le sujet est à risque ou est susceptible de ne pas répondre au traitement par la composition pharmaceutique de la présente invention. Selon ce mode de réalisation, la méthode comprend donc une étape de détermination du sujet susceptible de répondre audit traitement.
La présente invention concerne en outre une méthode de traitement d’une maladie ou d’un trouble chez un sujet comprenant : a) déterminer si le sujet est susceptible de répondre audit traitement par évaluation in vitro de l’activité thymique dans un échantillon sanguin dudit sujet, en particulier par : mesurer dans l’échantillon la quantité de cellules Récents Emigrants Thymiques (RTE), comparer la quantité de cellules RTE mesurée dans l’échantillon avec une valeur de référence, déterminer si le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention, dans lequel une quantité de cellules RTE égale ou supérieure à la valeur de référence indique une susceptibilité de répondre au traitement. b) administrer chez le sujet susceptible de répondre au traitement une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition pharmaceutique de la présente invention.
Exemples
Les inventeurs ont mis au point une cellule progéniteur-T exprimant de manière régulée une séquence nucléique d’intérêt. Plus particulièrement, la séquence nucléique d’intérêt est placée sous le contrôle d’un promoteur exogène induit par la voie Notch, permettant ainsi une expression régulée en fonction de l’état de maturation des progéniteurs T.
Les expériences ont été réalisées avec le promoteur du gène de VIL7RA (également appelé gène « IL7R »). La séquence génétique du promoteur du gène IL7RA codant la chaîne alpha de 1TL7R est représentée à la figure 1. La séquence de la base de données NCBI #3575 est utilisée comme séquence de référence. Le codon start « ATG » d’initiation de la synthèse protéique est en position +90 de la séquence. Les facteurs de transcriptions Gfï-1 et GABPa se fixent aux séquences 5’-TAAATCAC[AT]GCA-3' et répétitions riches en purines (répétions (GA)) respectivement. Le promoteur contient également les îlots de méthylation CpG aux positions - 975, -567, -497, -475, -466, -346. Le promoteur comprend le site de fixation à NF-kB, se trouvant en position -187 à -173 du gène IL 7RA humain. Le promoteur comprend la TATA box, en position -27 à -22 du gène IL7RA humain.
Deux séquences différentes correspondant au promoteur de VIL7RA ont été testées dans ces expériences : une séquence dite « restreinte » et nommée « SEQ.l » (SEQ ID NO :1) et une séquence élargie et nommée « SEQ.2 » (SEQ ID NO : 2).
Example 1 : L’expression de VIL7RA est induite via la voie Notch dans les cellules lymphoïdes.
Matériels et Méthodes
Les lignées cellulaires utilisées sont Jurkat (lymphocytes T immatures) et THP-1 (une lignée non- lymphoïde T). Les cellules Jurkat ou THP-1 sont ensemencées à 100 000 cellules par puits dans un milieu RPMI (ThermoFischer Scientific) contenant 10% du serum fetal bovin (ThermoFischer Scientific) et 1% de pénicilline-streptomycine (ThermoFischer Scientific) contenant ou non ligand de Notch, Delta- like 4. Après une stimulation de 4 jours les cellules sont récupérées en culots secs. L’analyse moléculaire de l’expression de l’ARNm IL7RA et HES (contrôle) est effectuée par RT-qPCR selon les protocoles standards des fabricants. L’ARN total est isolé au TRIzol (ThermoFischer Scientific) selon la procédure standard. La réaction de rétrotranscription (RT) est effectuée à l’aide de SuperScript VILO™ cDNA synthesis kit (ThermoFischer Scientific) et la PCR quantitave (qPCR) est faite avec PowerUp SYBR Green Master Mix (ThermoFischer Scientific) sur un appareil Light Cycler 480 (Roche). Les séquences des amorces utilisées sont les suivantes : /£7/?4-scns 5’- TCGCTCTGTTGGTCATCTTG-3’, 7L77 -antisens 5’-GGAGACTGGGCCATACGATA -3’, 574-sens 5 ’-GGCAGACCGAGATGAATCCTCA -3’, 574-antisens 5 ’- CAGGTCCAGGGGTCTTGGTCC-3’, HES-sens 5’-AAAAATTCCTCGTCCCCGGT-3’, f/ES-antiscns 5’-GGCTTTGATGACTTTCTGTGCT-3’. L’expression de l’ARNm est calculée Selon la methode
Figure imgf000045_0001
Résultats :
Les résultats de la figure 2 démontrent que la stimulation de la voie Notch par son ligand DLL4 induit l’expression du gène-rapporteur H ES dans la ligne lymphoïde T (Jurkat) et non- lymphoïde (THP-1). En revanche, l’expression de l’ARNm de VIL7RA n’est induite que dans la lignée lymphoïde T. Ceci démontre clairement que l’expression endogène de VIL7RA sous contrôle de son promoteur n’est induite par la voie Notch que dans les populations lymphoïdes.
Example 2 : Expression du transgène GFP sous contrôle du promoteur de VIL7RA
Matériels et Méthodes
Les séquences du promoteur de VIL7RA (restreinte SEQ.l et élargie SEQ.2) sont synthétisées de novo (GeneArt Gene Synthesis service, ThermoFischer Scientific) et clonées dans un vecteur lentiviral pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE (Addgene, catalog #12252) par les techniques classiques de digestion/ligation utilisées en biologie moléculaire.
Les lignées cellulaires utilisées sont Jurkat (lymphocytes T immatures) et THP-1 (une lignée non- lymphoïde T). Les cellules Jurkat ou THP-1 sont ensemencées à 500 000 cellules par puits dans un milieu RPMI (ThermoFischer Scientific) contenant 10% du serum fetal bovin (ThermoFischer Scientific) et 1% de pénicilline-streptomycine (ThermoFischer Scientific) et transduites par ajout du surnagent viral à 1x106 TU/mL. Après 6 heures de transduction, les cellules sont lavées 2 fois au PBS (ThermoFischer Scientific) et resuspendues dans le milieu RPMI complet. Après 7 jours, l’expression du marqueur fluorescent Green Fluorescent Protein (GFP) est analysée en cytométrie en flux. Les échantillons sont acquis sur un cytomètre LSRII Fortessa (Becton Dickinson). Les données sont analysées avec le logiciel FlowJo vl 0.7.1 (BD Biosciences). L’analyse moléculaire de l’expression de l’ARNm GFP (contrôle) est effectuée selon le protocole précédemment décrit.
Résultats :
L’introduction du transgène exogène (GFP) sous contrôle du promoteur de VIL7RA (SEQ.l et 2) permet une forte expression dans les cellules Jurkat. De plus, les résultats de la qPCR montrent que la stimulation par DLL4 de ces cellules a tendance à augmenter davantage cette expression (Figure 3. B).
L’expression de la protéine GFP sous contrôle du promoteur constitutif est élevée dans les cellules THP-1. En revanche, l’expression de la GFP est faible pour la construction avec le promoteur de VIL7RA SEQ.l et 2. Les données FACS sont confirmées en qPCR (Figure 3.C). Ceci démontre que l’expression du transgène exogène sous contrôle du promoteur de VIL7RA n’est induite par la voie Notch que dans les populations lymphoïdes.
Example 3 : Expression du transgène CAR sous contrôle du promoteur de VIL7RA.
Matériels et Méthodes
Le transgène correspondant à la molécule du Chimeric Antigen Receptor (CAR) est cloné sous contrôle du promoteur de VIL7RA. La construction CAR correspond à la combinaison des éléments suivants : fragment scFV de l’anticorps anti-CD19 humain (clone FMC63), un domaine intracellulaire d’activation 4 IBB et CD3 zêta (CAR de 3eme génération, GeneArt Gene Synthesis service, ThermoFischer Scientific). Cette séquence est introduite dans le vecteur précédemment décrit par les techniques classiques de digestion/ligation utilisées en biologie moléculaire. La lignée cellulaire THP-1 est transduite et l’expression du transgène est analysée comme précédemment décrit.
Résultats
Les résultats de la figure 4 correspondent à l’expression d’un CAR-GFP sous contrôle du promoteur de 1 "IL 7 RA (SEQ .1 et 2) dans la lignée non lymphoïde THP- 1. Les résultats montrent une diminution drastique de l’expression de GFP lorsque le promoteur de VIL7RA (SEQ.l) est utilisé dans les cellules non lymphoïdes THP-1. Ces résultats sont concordants avec les résultats de qPCR (Figure 2.C) où l'expression du gène endogène de VIL7RA sous contrôle de son promoteur n’était pas induite lors de la stimulation de la voie Notch par son ligand DLL4.
Example 4 : Promoteur de VIL7RA est un promoteur fort
Matériels et Méthodes
Un vecteur lentiviral présentant la séquence élargie SEQ.2 du promoteur à VIL7RA ou un vecteur contrôle avec un promoteur fort du Spleen focus-forming virus (SFFV) sont utilisés pour transduire la lignée cellulaire Jurkat comme précédemment décrit. Au jour 7 posttransduction, le pourcentage de transduction est >60% sur la présence d'un marqueur fluorescent Green Fluorescent Protein (GFP). Les échantillons sont acquis sur un cytomètre LSRII Fortessa (Becton Dickinson). Les données sont analysées avec le logiciel FlowJo vl 0.7.1 (BD Biosciences). La Mean Fluorescent Intensity (MFI) est indiquée sur chaque graphe des échantillons acquis en simultané.
Résultat
Il est connu que l’utilisation des promoteurs forts (SFFV, EFla) est privilégiée pour la transduction lentivirale des cellules souches hématopoïétiques (HSC CD34+) et des cellules souches induites pluripotentes (iPSC). La figure 5 montre ici que le promoteur de VIL7RA est un promoteur fort, car l'expression du transgène GFP dans les cellules lymphoïdes Jurkat transduites présente la même intensité (même intensité de fluorescence moyenne (MFI)) et même fréquence (même pourcentage de GFP) que dans les cellules transduites avec le vecteur contrôle (promoteur SFFV).
Example 5 : L’expression de VIL7RA est induite via la voie Notch dans les cellules souches hématopoïétiques.
Matériels et Méthodes
Les cellules souches hématopoïétiques CD34+ sont isolées à partir du sang de cordon ombilical. Brièvement, les cellules mononuclées du sang sont séparées par un gradient de Ficoll-Paque (Cytiva Ficoll-Paque™, Fischer Scientific). Les cellules CD34+ sont isolées par billes magnétiques en suivant le protocole du fournisseur (UltraPure CD34 kit, Miltenyi Biotec). La pureté de la population enrichie est >95%. Les cellules ainsi isolées sont exposées ou non au ligand de Notch (DLL4) dans le milieu de culture pendant 6 jours (Figure 6.A). L’analyse en cytométrie en flux est réalisée après un marquage extracellulaire avec un anticorps anti-CD 127- V450 (BD Biosciences) selon le protocole de marquage standard. Les échantillons sont acquis sur un cytomètre LSRII Fortessa (Becton Dickinson). Les données sont analysées avec le logiciel FlowJo vlO.7.1 (BD Biosciences). L’analyse moléculaire de l’expression de l’ARNm IL7RA et HES (contrôle) est effectuée selon le protocole précédemment décrit.
Résultats
Dans les cellules souches hématopoïétiques (CD34+ HSC) l’activation de la voie Notch, voie- clé de la lymphopoïèse T, induit l’expression de la protéine IL7R (Figure 6.B) et de l’ARNm HES (contrôle) QML7RA (Figure 6.C). Ainsi, l’expression de VIL7RA est induite via l’activation de la voie Notch à la suite de l'interaction avec son ligand DLL-4 dans les cellules souches hématopoïétiques. Example 6 : Expression du transgène sous contrôle du promoteur de VIL7RA au cours de la différenciation T in vitro.
Matériels et Méthodes
Les cellules souches hématopoïétiques CD34+ sont purifiées comme précédemment décrit. A JO les cellules CD34+ sont purifiées et mises en culture à 500 000 par puits dans une plaque contenant des cellules stromales nourricières OP9-DLL1 dans un milieu de différenciation T composé de : milieu MEMa contenant du sérum du vœux fêtai (SVF à 20%, Cytiva Sérum de veau fœtal HyClone™ (États-Unis), défini) et 1% de pénicilline-streptomycine (ThermoFischer Scientific). A J0 un cocktail de cytokines nécessaire à leur activation est ajouté : IE-7, Flt31, SCF, TPO (100 ng/mE, Bio-Techne). Après l'activation, les cellules sont transduites par un ajout du surnageant lentiviral (SFR BioSciences Gerland - Eyon Sud (UMS3444/US8) à la MOI entre 20 et 50. E'agent de transduction est la Protransduzin™ (à 15 ug/mL, JPT Peptides). Fa préparation du vecteur et de l’agent de transduction est faite selon le protocole du fournisseur. 24 heures post-transduction le milieu est changé pour du milieu frais contenant IE-7, Flt31 (5 ng/mE, Bio-Techne). Fa moitié du milieu est enlevée 2 fois par semaine et le milieu frais contenant 2 fois la concentration en cytokines est rajoutée. Aux différents jours de la co-culture les populations d’intérêt sont analysées en cytométrie en flux : précurseurs T (CD45RA+CD7+, « pre-T »), CD3-negatifs (CD4-CD8-CD3-, « CD3- ») et CD3-positifs (CD4-CD8-CD3+, « CD3+ »). Ees anticorps utilisés sont tous de chez BD Biosciences : CDla-phycoerythrin (PE), CD45RA-PE-TexasRed, CD7-PE-Cy7, CD4-Pacific Blue, CD3-Alexa Fluor 700, CD5- allophycocyanin (APC), CD8-APC-H7. Ees protocoles de marquages sont standards. Ees échantillons sont acquis sur un cytomètre ESRII Fortessa (Becton Dickinson). Ees données sont analysées avec le logiciel FlowJo vlO.7.1 (BD Biosciences).
Résultats
F ’expression du transgène sous contrôle du promoteur constitutif (cntrl) est en moyenne de 12,38% et ne varie pas au cours de la maturation T in vitro (moyenne de 12,63 et 12% pour les stades CD3- et CD3+ respectivement) (Figure 7). En revanche, l’expression du transgène CAR sous contrôle du promoteur à VIL7RA (SEQ.l) est en moyenne de 15,3% au stade précoce des pré-T, concomitant avec la signalisation Notch, diminue dans les populations CD3- (3,73%) et augmente dans les populations les plus matures, CD3+ (5,7%). E’expression du transgène CAR sous contrôle du promoteur à VIL7RA (SEQ.2) ne permet pas d’expression régulée du transgène (nous avons précédemment observé que ce promoteur présentait le profil « leaking », l’expression du transgène reste stable au cours de la maturation T (15,15% pour le stade pré-T, 16,8% pour le stade CD3- et 19,5% pour le stade CD3+). Ces résultats démontrent que l’expression du transgène sous contrôle du promoteur de VIL7RA varie selon le stade de maturation des cellules T.
Example 7 : Expression du gène IL7RA endogène et du transgène sous contrôle du promoteur de VIL7RA.
Matériels et Méthodes
Les cellules T CD4+ naïves sont isolées à partir du sang de cordon ombilical. Brièvement, les cellules mononuclées du sang sont séparées par un gradient de Ficoll-Paque (Cytiva Ficoll- Paque™, Fischer Scientific). Les cellules CD4+ naïves sont isolées par billes magnétiques en suivant le protocole du fournisseur (Naive CD4 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec). La pureté de la population enrichie est >97%. Les cellules sont ensuite transduites selon la procédure précédemment décrite et sont stimulées ou non par ligand de Notch, DLL4. Après 6 jours posttransduction, l’expression de VIL7RA endogène est mesurée en cytométrie en flux, ainsi que l’expression du transgène (sur la base de la GFP). Les protocoles de marquage sont standards. Les échantillons sont acquis sur un cytomètre LSRII Fortessa (Becton Dickinson). Les données sont analysées avec le logiciel FlowJo vlO.7.1 (BD Biosciences).
Résultats
L’expression de la protéine endogène IL7RA ne varie pas en absence ou présence de DLL4 (ligand activant la voie Notch) (Figure 8).
De la même manière, l’expression du transgène sous contrôle du vecteur contrôle et des vecteurs contenant la séquence du transgène CAR sous contrôle du promoteur à VIL 7 RA (SEQ.1 et SEQ.2) n’est pas différente en absence ou présence de DLL4. Ceci suggère que l’induction de l’expression du transgène sous contrôle du promoteur de VIL7RA (SEQ.l) est cyclique et finement régulée dans les cellules souches hématopoïétiques au cours de la différenciation T via la voie Notch. En revanche cette régulation n’est plus assurée via la voie Notch dans les cellules T matures, permettant ainsi une expression constante du transgène dans les cellules T matures via les facteurs de transcriptions décrits tels que Gfï-1 et GABPalpha. CONCLUSIONS
Les expériences mises en œuvre démontrent que l’utilisation du promoteur de VIL7RA permet de réguler l’expression d’un transgène d’intérêt au cours des étapes de maturation des cellules T à partir des cellules souches hématopoïétiques (HSC CD34+). Plus particulièrement, cette régulation fine de l’expression du transgène permet ainsi d’éviter la déplétion des cellules T transgéniques lors des étapes de sélection thymique tout en permettant l’expression du transgène d’intérêt une fois que les cellules T sont matures. Ceci a un avantage considérable si on considère les thérapies cellulaires et géniques à base de cellules T immatures qui nécessitent, une fois injectées chez le patient, de progresser à travers les stades de maturation pour acquérir l'immunocompétence et la polyfonctionnalité. Une thérapie CAR-T allogénique dans le domaine de l’oncologie est une des applications possibles de l’invention. L’aspect immature des cellules permettant d’envisager leur utilisation dans un contexte où le donneur et le receveur sont deux personnes distinctes. La régulation de l’expression de la molécule CAR maturation- dépendante à travers l'utilisation du promoteur de VIL7RA procurera ainsi aux cellules transgènes un avantage sélectif lors de la sélection négative qui interviendra in vivo chez le patient. Cet avantage devrait être confirmé chez le patient, car à ce jour il n'existe pas de modèles in vitro pertinents permettant de récapituler les étapes complexes de sélections positive et négative.
Exemple 8 : Mesure non-invasive de l’activité thymique.
Matériels et Méthodes
Des échantillons de sang total de donneurs sains (DS, n=5), de patients atteints de leucémie ou lymphome non traités (NT, n=4) et traités (TT, n=21) ont été récoltés. Puis ils ont été traités pour un marquage en cytométrie en flux selon la méthode standard. Le marquage a été effectué avec les anticorps suivants : CD4-Pacifïc Blue, CD3-Alexa Fluor 700, CD8-APC-H7, CCR7- Alexa Fluor 647 (BD Biosciences), CD45RA-PE-TexasRed, CD31-PE (Miltenyi Biotech) et CD27-PE-Cy7 (eBioscience), LIVE/DEAD aqua fluorescent dye (Invitrogen). Les échantillons ont été acquis sur un cytomètre LSRII Fortessa (Becton Dickinson). Les données ont été analysées avec le logiciel FlowJo vlO.7.1 (BD Biosciences).
La quantité de cellules RTE a été mesurée par quantification des cellules CD4 CD27+CCR7+CD45RA+CD31high et CD8 CD27+CCR7+CD45RA+CD31high suite au marquage en cytométrie en flux décrit ci-dessus. L’analyse des données a été réalisé à l’aide du logiciel GraphPad Prism, le test statistique utilisé a été le test de Kruskall- Wallis non- paramétrique avec un post-test de Dunn’s. La moyenne d’âge des patients est indiquée dans le tableau ci-dessous (Table 2).
[Table 2]
Figure imgf000052_0001
Résultats
La population CD27+CCR7+CD45RA+CD31high représente les Récents Emigrants Thymiques (RTE) qui sont les lymphocytes T naïves exprimant le marqueur CD31high témoignant de leur émigration récente du thymus. Une fois en périphérie, au premier contact avec un antigène, ce marqueur est down-régulé et n’est plus re-exprimé. Il a été montré que la fréquence des RTE est corrélée à la quantité de l’ADN sjTREC. L’ADN sjTREC résulte du réarrangement des chaînes du récepteur TCR est une mesure de la lymphopoïèse T (de l’activité thymique). Il a été montré qu’au cours du vieillissement d’un individu, l’activité thymique diminue drastiquement chez les sujets sains (V Geenen et al., J of Endocrinology (2003) 176, 305-311).
La Figure 9A montre un exemple de marquage CD4, CD8, CD3, CCR7, CD45RA, CD31 et CD27 d’un échantillon de sang total. La quantité de cellules CD4 CD3 Ihigh ou CD8 CD3 Ihigh comparée à la quantité de cellules CD4 ou CD8 permet de déterminer la quantité de cellules RTE dans l’échantillon.
Les résultats montrent que les patients non-traités (Patients NT) présentent statistiquement la même activité thymique que les donneurs sains (DS) (Figure 9B). En revanche, les patients traités (Patients TT) présentent en moyenne une activité thymique plus basse que les donneurs sains (Figure 9B). Plus précisément, les patients traités peuvent être divisés en 2 groupes : ceux qui présentent une activité thymique et ceux qui n’en présentent pas ou qui présente une activité très faible (Figure 9C et Table 3). [Table 3]
Figure imgf000053_0001
Ce test permet donc de sélectionner les patients éligibles (i.e., présentant l’activité thymique) à l’application des thérapies CAR-T allogéniques telles qu’elles sont décrites dans la présente demande de brevet.

Claims

53 Revendications
1. Cellule progéniteur-T isolée, de préférence humaine, présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, ladite cellule progéniteur-T comprenant une cassette d’expression qui comprend un promoteur exogène induit par la voie Notch choisi parmi le promoteur de 1’ IL7RA ou de BCL11B, ledit promoteur étant lié de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt.
2. Cellule progéniteur-T isolée selon la revendication 1, ladite cellule présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+ CD1A+.
3. Cellule progéniteur-T isolée selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la séquence nucléique hétérologue d’intérêt code pour un récepteur antigènique chimérique.
4. Population cellulaire enrichie en cellules progéniteurs-T selon Tune quelconque des revendications 1-3, ladite population comprenant de préférence au moins 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, de préférence au moins 90% desdites cellules progéniteurs-T.
5. Composition pharmaceutique comprenant la cellule progéniteur-T selon Tune quelconque des revendications 1-3 ou comprenant la population cellulaire selon la revendication 4.
6. Cassette d’expression comprenant la région promotrice de VIL7RA liée de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, dans laquelle la séquence nucléique d’intérêt code pour un récepteur antigènique chimérique ou un récepteur de cellules T.
7. Cassette d’expression selon la revendication 6, dans laquelle la région promotrice de VIL7RA comprend ou consiste en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO :
2.
8. Cassette d’expression comprenant le promoteur de BCL11B lié de manière fonctionnelle à une séquence nucléique hétérologue d’intérêt, dans laquelle la séquence nucléique d’intérêt code pour un récepteur antigènique chimérique ou un récepteur de cellules T. 54
9. Cassette d’expression selon la revendication 8, dans laquelle le promoteur de BCL11B comprend ou consiste de préférence en une séquence nucléique ayant au moins 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou au moins 99% d’identité avec la séquence nucléique SEQ ID NO : 3.
10. Vecteur comprenant la cassette d’expression selon l’une quelconque des revendications 6- 9, le vecteur étant de préférence un vecteur viral, de préférence un vecteur rétroviral, et plus préférentiellement un vecteur lenti viral.
11. Utilisation de la cassette d’expression selon l’une quelconque des revendications 6 à 9 ou du vecteur selon la revendication 10, pour la génération de cellules progéniteurs-T.
12. Procédé de préparation de cellules progéniteurs-T telles que définies dans l’une quelconque des revendications 1-5, comprenant les étapes suivantes : a) mise en culture de cellules souches hématopoïétiques CD34+ dans un milieu de culture comprenant un ligand de Notch tel que Delta- like- 1 (DLL1) ou Delta-like-4 (DLL4) et des cytokines permettant la différenciation desdites cellules CD34+ en cellules progéniteurs-T présentant un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, de préférence un phénotype CD45RA+, CD7+, CD5+, CD1A+ ; b) transformation ou transduction des cellules avant, pendant, ou après ladite étape (a) de différenciation, avec un vecteur comprenant une cassette d’expression telle que définie dans les revendications 6-9 ; dans lequel les cellules souches hématopoïétiques CD34+ sont de préférence issues de sang de cordon ombilical, de sang périphérique ou de moelle osseuse, plus préférentiellement de sang de cordon ombilical.
13. Cellule progéniteur-T selon les revendications 1-3, population cellulaire selon la revendication 4, ou composition pharmaceutique selon la revendication 5, pour son utilisation dans le traitement d’un cancer, d’une maladie infectieuse, d’une maladie génétique, d’une maladie inflammatoire ou d’une maladie immunitaire ou auto-immune.
14. Cellule progéniteur-T selon les revendications 1-3, population cellulaire selon la revendication 4, ou composition pharmaceutique selon la revendication 5, ladite ou lesdites 55 cellules progéniteurs-T étant des cellules autologues ou allogéniques par rapport au patient à traiter, lesdites cellules étant de préférence des cellules allogéniques.
15. Méthode in vitro pour déterminer si un sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention, ladite méthode comprenant : a) mesurer dans l’échantillon la quantité de cellules Récents Emigrants Thymiques (RTE), b) comparer la quantité de cellules RTE mesurée dans l’échantillon avec une valeur de référence, c) déterminer si le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention, dans lequel une quantité de cellules RTE égale ou supérieure à la valeur de référence indique une susceptibilité de répondre au traitement.
16. Méthode de traitement d’une maladie ou d’un trouble chez un sujet comprenant : a) déterminer si le sujet est susceptible de répondre audit traitement par évaluation in vitro de l’activité thymique dans un échantillon sanguin dudit sujet, en particulier par :
- mesurer dans l’échantillon la quantité de cellules Récents Emigrants Thymiques (RTE),
- comparer la quantité de cellules RTE mesurée dans l’échantillon avec une valeur de référence,
- déterminer si le sujet est susceptible de répondre au traitement par une composition pharmaceutique de l’invention, dans lequel une quantité de cellules RTE égale ou supérieure à la valeur de référence indique une susceptibilité de répondre au traitement. b) administrer chez le sujet susceptible de répondre au traitement une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition pharmaceutique de la présente invention.
PCT/FR2022/052469 2021-12-21 2022-12-21 Cellule progeniteur des lymphocytes t exprimant de maniere regulee un transgene d'interet WO2023118752A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FRFR2114168 2021-12-21
FR2114168A FR3130843A1 (fr) 2021-12-21 2021-12-21 Cellule progéniteur des lymphocytes T exprimant de manière régulée un transgène d’intérêt

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023118752A1 true WO2023118752A1 (fr) 2023-06-29

Family

ID=82100339

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2022/052469 WO2023118752A1 (fr) 2021-12-21 2022-12-21 Cellule progeniteur des lymphocytes t exprimant de maniere regulee un transgene d'interet

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR3130843A1 (fr)
WO (1) WO2023118752A1 (fr)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018146297A1 (fr) * 2017-02-13 2018-08-16 Assistance Publique - Hopitaux De Paris Procédé permettant de produire des progéniteurs de lymphocytes t
WO2019018841A2 (fr) * 2017-07-21 2019-01-24 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions et procédés d'identification d'agents thérapeutiques immuno-oncologiques combinatoires
WO2020264019A1 (fr) * 2019-06-24 2020-12-30 Children's Hospital Los Angeles Surexpression de bcl11b pour amélioration de la thymopoïèse et de la fonction des cellules t chez l'humain

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018146297A1 (fr) * 2017-02-13 2018-08-16 Assistance Publique - Hopitaux De Paris Procédé permettant de produire des progéniteurs de lymphocytes t
WO2019018841A2 (fr) * 2017-07-21 2019-01-24 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions et procédés d'identification d'agents thérapeutiques immuno-oncologiques combinatoires
WO2020264019A1 (fr) * 2019-06-24 2020-12-30 Children's Hospital Los Angeles Surexpression de bcl11b pour amélioration de la thymopoïèse et de la fonction des cellules t chez l'humain

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRENTJENS ET AL., CLIN. CANCER RES., vol. 13, 2007, pages 5426 - 5435
GADE ET AL., CANCER RES
JENSEN ET AL., IMMUNOL. REV, vol. 257, 2014, pages 127 - 133
KIM HANG-RAE ET AL: "Down-Regulation of IL-7R[alpha] Expression in Human T Cells via DNA Methylation", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 178, no. 9, 18 April 2007 (2007-04-18), US, pages 5473 - 5479, XP055977480, ISSN: 0022-1767, DOI: 10.4049/jimmunol.178.9.5473 *
LI LONG ET AL: "A far downstream enhancer for murine Bcl11b controls its T-cell specific expression", vol. 122, no. 6, 8 August 2013 (2013-08-08), US, pages 902 - 911, XP055977474, ISSN: 0006-4971, Retrieved from the Internet <URL:http://ashpublications.org/blood/article-pdf/122/6/902/1375523/902.pdf> DOI: 10.1182/blood-2012-08-447839 *
NATURE MEDICINE, vol. 19, 2013, pages 1534 - 1541
RAD S. M ALI HOSSEINI ET AL: "Promoter choice: Who should drive the CAR in T cells?", PLOS ONE, 24 July 2020 (2020-07-24), San Francisco, pages e0232915 - e0232915, XP055853043, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7380635/pdf/pone.0232915.pdf> [retrieved on 20211020], DOI: 10.1371/journal.pone.0232915 *
SADELAIN ET AL., CANCER DISCOV, vol. 3, no. 4, 2013, pages 388 - 398
SHARPE ET AL., DIS. MODEL MECH., vol. 8, no. 4, 2015, pages 337 - 350
V GEENEN ET AL., J OF ENDOCRINOLOGY, vol. 176, 2003, pages 305 - 311

Also Published As

Publication number Publication date
FR3130843A1 (fr) 2023-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11124794B2 (en) Compositions and methods to treating hemoglobinopathies
EP3027755B1 (fr) Modification d&#39;une immunité antivirale médiée par les cellules t par des cellules souches et des récepteurs d&#39;antigène chimériques
Pike-Overzet et al. Correction of murine Rag1 deficiency by self-inactivating lentiviral vector-mediated gene transfer
JP2023516632A (ja) 多能性幹細胞からナチュラルキラー細胞を産生するための方法
Trobridge et al. Protection of stem cell-derived lymphocytes in a primate AIDS gene therapy model after in vivo selection
US11964027B2 (en) Method for improving retroviral transduction and gene editing in hematopoietic stem cells using cyclosporine h (CsH)
TW201100546A (en) HIV-resistant stem cells and uses thereof
KR20160075676A (ko) 방법
CA3067551A1 (fr) Procede de production de progeniteurs erythroides
CA3235572A1 (fr) Therapie genique
CA3146013A1 (fr) Lymphocytes t regulateurs modifies
Haworth et al. In vivo murine-matured human CD3+ cells as a preclinical model for T cell-based immunotherapies
US20210085707A1 (en) Improved bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies
WO2023118752A1 (fr) Cellule progeniteur des lymphocytes t exprimant de maniere regulee un transgene d&#39;interet
JP5485139B2 (ja) 遺伝子導入細胞の製造方法
US20220305098A1 (en) Ube3a for the treatment of angelman syndrome
US20210061875A1 (en) Compositions and methods for treating autoimmune disease
Ansorge et al. Towards continuous bioprocessing of lentiviral vectors
Candotti The potential for therapy of immune disorders with gene therapy
US20240218330A1 (en) Compositions for improving the transduction of cells by viral vectors
FR3079239A1 (fr) Nouvelle methode d’obtention de cellules t a partir de cellules souches pluripotentes, et leurs utilisations
EP4329772A1 (fr) Compositions pour améliorer la transduction de cellules par des vecteurs viraux
Trobridge et al. Protection of Stem Cell-Derived Lymphocytes in a Primate AIDS Gene Therapy Model
Bjurström Targeting the hematopoietic stem cell to correct osteopetrosis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22850660

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1