KR20160075676A - 방법 - Google Patents

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루이기 날디니
베른하르트 루돌프 젠트너
에리카 조나리
프란세스코 보카라테
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오스페달레 산 라파엘 에스.알.엘.
폰다지오네 텔레톤
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Abstract

조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단으로부터 임상적 사용을 위한 치료 세포 집단을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포의 시작 집단으로부터 CD38을 실질적으로 발현하지 않지만, CD34를 발현하는 세포의 집단을 분리시키고, 분리된 세포 집단을 벡터로 형질도입시켜 치료 세포 집단을 획득하는 것을 포함한다.

Description

방법{METHOD}
발명의 분야
본 발명은 조혈 줄기 세포(HSC) 및 조혈 전구 세포에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 HSC의 유전적 변형을 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전자 요법에서 유전적으로 변형된 조혈 줄기 및 전구 세포의 사용을 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
발명의 대한 배경
조혈 시스템은 다양한 성숙 세포 계통의 세포의 복잡한 체계이다. 이들은 병원체로부터의 보호를 제공하는 면역계의 세포, 신체를 통해 산소를 운반하는 세포 및 상처 치유와 관련된 세포를 포함한다. 모든 이들 성숙 세포는 임의의 혈액 세포 계통으로 자가-재생하고 분화할 수 있는 조혈 줄기 세포(HSC)의 풀로부터 유래된다.
HSC는 전체 조혈 시스템을 보충시키는 능력을 가짐에 따라, 이들은, 예를 들어, 혈액독성 발작, 예를 들어, 방사선요법 또는 화학요법 후의 이식, 또는 백혈병 세포의 대치술을 위해 이용될 수 있다.
조혈 세포 이식(HCT)은 여러 유전 및 후천 장애에 대한 치료 요법이다. 그러나, 동종이형 HCT는 매치되는 공여자의 불량한 가용성, 및 면역 기능이상의 현저한 및 장기-작용 상태에 의해 유발되는 이식편대숙주병(GvHD) 및 감염성 합병증과 대부분 관련되는 동종이형 절차와 관련된 사망률에 의해 제한된다.
유전적으로 변형된 자가 HSC의 이식을 기초로 한 유전자 요법 접근법은 동종이형 HCT에 비해 잠재적으로 개선된 안전성 및 효능을 제공한다. 이들은 매치되는 공여자가 없는 환자와 특히 관련된다.
줄기 세포 유전자 요법의 개념은 비교적 적은 수의 줄기 세포의 유전적 변형을 기초로 한다. 이들은 자가-재생을 겪음으로써 신체에서 장기간 지속되고, 유전적으로 "교정된" 프로제니의 많은 수를 발생시킨다. 이는 환자의 생애 나머지 동안 교정된 세포의 연속적 공급을 보장한다. HSC는 유전자 요법에 대한 특히 매력적인 표적인데, 이는 이들이 분화됨에 따라 이들의 유전적 변형이 모든 혈액 세포 계통으로 통과될 것이기 때문이다. 또한, HSC는, 예를 들어, 골수, 가동화된 말초 혈액 및 제대혈로부터 용이하게 안전하게 획득될 수 있다.
HSC 및 이들의 프로제니의 효과적인 장기간 유전자 변형은 HSC 기능에 영향을 미침이 없이 유전체로의 교정 DNA의 안정적인 통합을 가능케 하는 기술을 필요로 한다.
장기간 이익은 조건화된 골수를 재증식시켜 모든 조혈 계통의 교정된 혈액 세포를 발생시킬 수 있는 충분히 높은 수의 변형된 HSC의 이식을 필요로 한다. 따라서, 자가 HSC는 이식 절차가 모든 환자에게 이용가능하게 만들고, GvHD을 발생시키는 면역학적 적합성 문제를 회피하게 만들고, 최소의 면역억제 조건화 요법을 가능케 하여, 따라서 감염성 합병증을 강하게 감소시킨다.
렌티바이러스-기반 HSC 유전자 요법 시도는 유전적 질병을 치료하는데 있어서 이들의 치료 잠재성을 입증하였다. 그러나, HSC의 유전적 변형에 이용되는 방법에는 어려움이 남아있다.
현재의 HSC 유전자 요법 프로토콜(예를 들어, 문헌[Cartier N et al. Science 2009;326:818-823; Cavazzana-Calvo M et al. Nature 2010;467:318-322; Biffi A et al. Science 2013;341:1233158; Aiuti A et al. Science. 2013;341:1233151])은 HSC 유전적 변형 과정 동안 2-4일의 생체 외 배양을 이용한다. 더 긴 배양 시간은 통상적으로 더 높은 형질도입 수준을 발생시킨다. 그러나, 생체 외 배양은 HSC 기능에 부정적으로 영향을 미치며, 이러한 부정적 효과는 배양 기간과 명백히 서로 관련이 있다(Guenechea G et al. Blood 1999;93:1097-1105; Xu R et al. Transfusion 2001;41:213-218; Mazurier F et al. Blood 2004;103:545-552; Ahmed et al. Blood 2004;103:2079-2087; Glimm H et al. Exp. Hematol. 2005;33:20-25; Kallinikou K et al. Br. J. Haematol. 2012;158:778-787). HSC의 생체 외 확장을 개선시키는데 대해 일부 진전이 이루어졌으나(Zhang CC et al. Blood 2008;111:3415-3423; Boitano AE et al. Science 2010;329:1345-1348; Delaney C et al. Nat. Med. 2010;16:232-236; Himburg HA et al. Nat. Med. 2010;16:475-482; Csaszar E et al. Cell Stem Cell 2012;10:218-229; Walasek MA et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2012;1266:138-150), 발생된 프로토콜은 임상적 번역에 대한 여러 난점을 제공하고, 가변적이고 종종 불충분하게 재현성인 결과를 제공하며, 관련된 임상적 환경에서 증명되는 것을 여전히 필요로 한다. 결과로서, HSC 유전자 요법의 상황에서의 생체 외 배양은 가능한 한 짧게 유지되어야 한다.
따라서, 배양 시간을 최소화시키면서 조혈 줄기 세포의 효과적인 유전적 변형을 가능케 하는 개선된 프로토콜을 고안할 필요가 있다. 또한, 개선된 프로토콜은 임상적 사용을 위해 적합화될 필요가 있다.
발명의 개요
본 발명자는 CD34+CD38- HSC가 이들이 높은 순도로 제공되는 경우 더욱 효과적인 형질도입을 겪는 것을 예기치 않게 밝혀내었다. 본 발명자는 임상적 사용에 적합한 방식으로 이들 세포를 정제하고 형질도입시키기 위한 프로토콜을 개발하였다.
본 발명자는 또한 프로스타글란딘 E2 및 이의 유도체가 CD34+ 및 CD34+CD38- HSC로의 유전자 전달의 효율을 증가시키는 것을 발견하였다.
이들 예기치 않은 발견은 적용된 벡터의 양에서의 감소 및 생체외 배양의 최소화를 가능케 하는 증가된 형질도입 효율을 발생시킨다.
이들 발견으로부터 계속하여, 본 발명자는 형질도입된 고도로 정제된 장기간 재증식하는 세포(예를 들어, CD34를 발현하나, CD38을 발현하지 않는 세포)와 조작되지 않은 전구 세포(예를 들어, CD38을 발현하는 세포)의 공동-이식을 기초로 하는 혁신적인 프로토콜을 개발하였다. 이러한 프로토콜은 하기에 의해 유전자 요법의 안전성 및 효능을 개선시킬 수 있다:
1. 형질도입 효율 증가;
2. 대상체로 주입되는 것이 필요한 통합 로드(integration load)를 낮추는, 형질도입되는 것이 필요한 세포의 수 감소;
3. 신속한 혈액 회복 보장.
또한, 본 발명자는 또한 형질도입된 조혈 전구 세포의 이식을 기초로 하는 혁신적인 프로토콜을 개발하였다.
본 발명의 첫번째 양태에 따르면, 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단으로부터 임상적 사용을 위한 치료 세포 집단을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포의 시작 집단으로부터 CD38을 실질적으로 발현하지 않으나, CD34를 발현하는 세포의 집단을 분리시키는 단계, 및 분리된 세포 집단을 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터로 형질도입시켜 치료 세포 집단을 획득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단으로부터 CD38-발현 세포를 분리시키는 단계;
b. CD38을 발현하지 않는 단계 (a)에서 획득된 세포의 집단으로부터 CD34-발현 세포를 분리시키는 단계;
c. 단계 (b)에서 획득된 CD34-발현 세포 집단을 벡터로 형질도입시켜 치료 세포 집단을 획득하는 단계.
또 다른 구체예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단과 CD38에 대해 반응성인 작용제를 접촉시키는 단계;
b. CD38-비반응성 세포로부터 CD38-반응성 세포를 분리시키는 단계;
c. 단계 (b)에서 획득된 CD38-비반응성 세포와 CD34에 대해 반응성인 작용제를 접촉시키는 단계;
d. CD34-비반응성 세포로부터 CD34-반응성 세포를 분리시키는 단계로서, CD34-반응성 세포가 형질도입 세포 집단을 형성하는, 단계;
e. 형질도입 세포 집단을 벡터로 형질도입시켜 치료 세포 집단을 획득하는 단계.
치료 세포 집단은 CD34+CD38- 표현형을 가질 수 있다.
한 구체예에서, 벡터는 관심 뉴클레오티드를 포함하거나, 자체가 관심 뉴클레오티드이다.
한 구체예에서, 분리된 CD38-발현 세포 또는 CD38-반응성 세포 또는 이의 일부는 유지되어 지지 세포 집단을 형성한다. 지지 세포 집단은 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형을 가질 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 세포 집단을 벡터로 형질도입시키는 단계는 약 44시간 이상 동안 세포를 배양하는 것을 포함한다. "세포 집단을 벡터로 형질도입시키는 단계"는 예비-자극 및 벡터 노출 단계로 이해되어야 한다. 예를 들어, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 44-66시간, 44-60시간, 44-54시간 또는 44-48시간 동안 배양될 수 있다. 한 구체예에서, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 66, 60, 54, 48 또는 44시간 동안 배양된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 벡터를 이용한 세포 집단을 형질도입시키는 단계는 약 44시간 미만 동안 세포를 배양(즉, 예비-자극 및 벡터 접촉 동안)하는 것을 포함한다. 예를 들어, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 12-42시간, 12-36시간, 12-24시간 또는 12-18시간 동안 배양될 수 있다. 한 구체예에서, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 42, 36, 30, 24, 18 또는 12시간 동안 배양된다. 바람직하게는, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 동안 약 24시간 동안 배양된다.
본 발명의 한 구체예에서, 프로스타글란딘 E2 또는 이의 유도체는 형질도입 효율을 증가시키기 위해 본 발명의 방법에서 이용된다.
프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체(예를 들어, 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2(dmPGE2))는 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안, 바람직하게는 상기 단계의 예비-자극 단계 동안 세포의 집단에 첨가될 수 있다. 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체는 예비-자극 단계의 시작시에 또는 예비-자극 단계 동안 첨가될 수 있다. 예를 들어, 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체는 벡터에 대한 세포 집단의 노출 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12시간 전에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체는 벡터에 대한 세포의 노출 약 2시간 전에 예비-자극 단계 동안 세포의 집단에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체는 벡터에 대한 노출과 동시에 세포 집단에 첨가된다.
본 발명의 한 구체예에서, 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단은 조직 샘플로부터 획득된다.
또 다른 구체예에서, 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단은 가동화된 말초 혈액, 골수 또는 제대혈로부터 획득된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 치료 세포 집단을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 지지 세포 집단을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제의 존재하에서 본 발명의 치료 세포 집단 또는 지지 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 의약에서 사용하기 위한 치료 세포 집단 및/또는 지지 세포 집단을 제공한다.
한 구체예에서, 치료 세포 집단은 본 발명의 지지 세포 집단과 함께 투여된다.
또 다른 구체예에서, 치료 세포 집단은 지지 세포 집단의 투여 전에 대상체에 투여된다.
또 다른 구체예에서, 치료 세포 집단은 지지 세포 집단의 투여와 동시적으로 또는 동시에 대상체에 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 치료 및 지지 세포 집단을 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 치료 세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 치료 세포 집단 및 본 발명의 지지 세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
바람직하게는, 치료는 유전자 요법에 의한 치료이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 요법에서 사용하기 위한 조혈 전구 세포 집단을 제공하며, 조혈 전구 세포 집단은 관심 뉴클레오티드로 형질도입된 것이다.
관심 뉴클레오티드를 이용한 형질도입 단계는, 예를 들어, 본원에 기재된 세포 형질도입 방법 중 임의의 방법을 이용할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 요법에서 사용하기 위한 조혈 전구 세포 집단을 제공하며, 상기 세포는 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함하는 세포의 집단으로부터 분리된 후, 관심 뉴클레오티드로 형질도입된 것이다.
한 구체예에서, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int 표현형을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형을 갖는다. 따라서, 조혈 전구 세포 집단은, 예를 들어, CD34+CD38- 표현형의 세포를 포함하지 않을 수 있다.
또 다른 구체예에서, 형질도입된 전구 세포 집단은 조혈 줄기 세포의 집단, 예를 들어, CD34+CD38- 표현형을 갖는 세포의 집단과 함께 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 조혈 전구 세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 유전자 요법의 방법을 제공하며, 조혈 전구 세포 집단은 관심 뉴클레오티드로 형질도입된 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 환자에서 트랜스진 발현 기간을 조절하는 방법을 제공하며, 트랜스진 발현 기간은 CD38 발현 수준을 기초로 하여 형질도입된 조혈 줄기 및/또는 전구 세포를 선택적으로 투여함으로써 조절된다. 증가된 트랜스진 발현 기간은 CD38 발현의 감소된 수준을 갖는 세포를 투여함으로써 달성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 조혈 줄기 또는 전구 세포를 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터로 형질도입시키는 경우 유전자 전달 효율을 증가시키기 위한 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체의 용도를 제공한다.
한 구체예에서, 프로스타글란딘 E2 유도체는 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2이다.
프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체(예를 들어, 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2(dmPGE2))은 예비-자극 단계 동안 세포의 집단에 첨가될 수 있다. 한 구체예에서, 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체는 예비-자극 단계 시작시에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체는 예비-자극 단계 동안 첨가된다.
예를 들어, 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체는 벡터에 대한 세포의 집단의 노출 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12시간 전에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체는 벡터에 대한 세포의 노출 약 2시간 전에 예비-자극 단계 동안 세포의 집단에 첨가된다.
또 다른 구체예에서, 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체는 벡터에 대한 노출과 동시에 세포의 집단에 첨가된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포의 집단을 벡터, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키는 방법을 제공하며, 세포 집단을 벡터로 형질도입시키는 단계는 약 44시간 이상 동안 세포를 배양하는 것을 포함한다. "세포 집단을 벡터로 형질도입시키는 단계"는 예비-자극 및 벡터 노출 단계로 이해되어야 한다. 예를 들어, 세포의 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 44-66시간, 44-60시간, 44-54시간 또는 44-48시간 동안 배양될 수 있다. 한 구체예에서, 세포의 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 66, 60, 54, 48 또는 44시간 동안 배양된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 집단을 벡터, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키는 방법을 제공하며, 세포 집단을 벡터로 형질도입시키는 단계는 약 44시간 미만 동안 세포를 배양(즉, 예비-자극 및 벡터 접촉 동안)하는 것을 포함한다. 예를 들어, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 12-42시간, 12-36시간, 12-24시간 또는 12-18시간 동안 배양될 수 있다. 한 구체예에서, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 42, 36, 30, 24, 18 또는 12시간 동안 배양된다. 바람직하게는, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 24시간 동안 배양된다.
본원에 기재된 치료 세포 집단을 제조하는 방법의 단계는 다양한 순서로 수행될 수 있음이 인지될 것이다. 따라서, 치료 세포 집단을 제조하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a. 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단으로부터 CD34-발현 세포를 분리시키는 단계;
b. CD34를 발현하는 단계 (a)에서 획득된 세포 집단으로부터 CD38-발현 세포를 분리시키는 단계;
c. 단계 (b)에서 획득된 CD38을 발현하지 않는 세포 집단을 벡터로 형질도입시켜 치료 세포 집단을 획득하는 단계.
CD38을 발현하는 단계 (b)에서 획득된 세포 또는 이의 일부는 유지되어 지지 세포 집단을 형성할 수 있다.
본 출원은 지지 세포 집단의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 한 양태에서, 본원에 언급된 지지 세포 집단은 상기 규정된 바와 같은 지지 세포 집단으로 대체될 수 있다.
대안적으로, CD38을 발현하는 단계 (b)에서 획득된 세포 또는 이의 일부는 벡터로 형질도입될 수 있다. 상기 형질도입된 세포는 요법에서 이용(예를 들어, 대상체에 투여됨)될 수 있다. 이러한 접근법은 대상체로의 유전자(예를 들어, 치료 유전자)의 일시적 전달(예를 들어, 암 유전자 요법에서 사용하기 위함)을 가능케 할 수 있다.
도 1
(A) 제대혈 또는 성체 골수(Lonza)로부터의 CD34+ 세포가 해동되었고, 12시간 동안 SCF, FLT3L, TPO 및 IL6로 예비-자극되었고, 항-CD34, 항-CD133 및 항-CD38 항체로 염색되었고, 막대 그래프의 x-축 상에 표시된 부분모집단으로 FACS-분류되었다. SORT-LV 프로토콜은 분류 12시간 후에 렌티바이러스 벡터(PGK.GFP, 108 TU/mL)를 이용한 형질도입을 포함하는 한편, LV-SORT 프로토콜에서, 벌크 CD34+ 세포는 예비-자극 24시간 후에 렌티바이러스 벡터 형질도입된 후, 다음날 분류된다. 형질도입 효율은 차별화 조건에서의 시험관내 배양 14일 후의 벡터 카피수(VCN) 분석(집락 형성 검정 또는 액체 배양) 또는 배양 7일 후의 흐름세포측정법 분석(녹색 막대 그래프, 하부 좌측 패널)에 의해 측정되었다. 골수의 경우, VCN은 전체 집락 생성, 또는 현미경 안내 하에서 단일 집락을 플러킹(plucking)함으로써 개별적으로 골수양 및 적혈구 집락 모두에 대해 결정되었다.
(B) 4개의 제대혈 공여체(Lonza)로부터의 CD34+ 세포가 해동되었고, 2개의 그룹으로 나누어졌다: 벌크: CD34+ 세포; 줄기: 벌크로부터 획득된 분류된 CD34+CD38- 세포(CD38 게이트: 가장 낮은 10%; CD38 항체: IB2-PEVio770, Miltenyi). 둘 모두의 그룹은 100　ng/mL의 SCF, 100 ng/mL의 FLT3L, 50 ng/mL의 TPO, 50 ng/mL의 IL-6이 보충된 Stem span 혈청 비함유 배지(SFEM) 중에서 106 세포/mL의 밀도로 배양 상태로 두어지고, 18시간 동안 예비-자극되었다. 형질도입이 108 TU/mL의 PGK.GFP 렌티바이러스 벡터로 수행되었다. 세포가 치사량에 가깝게 방사선 조사된 8주령 NSG 마우스로 주입되었다(벌크: 1.26 x 105 세포/마우스; n=6; 줄기: 1.8 x 104 세포/마우스; n=6). 벡터 카피수는 인간 세포에 특이적인 프라이머를 이용하여 이식 3개월 후에 말초 혈액 유핵 세포에 대해 수행된 qPCR에 의해 평가되었다.
(C) (B)에 기재된 헤마토키메릭(hematochimeric) 마우스로부터의 BM에 대한 이식 20주 후에 수행된 VCN. 전체 CD34+ 세포에 관한 CD34+CD38- 세포로의 유전자 전달의 가장 높은 수준이 각각의 시작 집단으로부터 유래되는 이종이식편에서 장기간 유지된다.
도 2
전체 제대혈(40 mL)이 Ospedale san Raffaele의 승인된 프로토콜에 따라 C-섹션 전달 후에 제정맥으로부터 수거되었다.
단핵 세포(2 x 108)가 피콜에 의해 분리되었고, 계통 항체의 칵테일 및 CD38(Miltenyi, Cat 130-092-263)로 표시되었다. 양성으로 표지된 세포(108)가 자기 마이크로비드에 연결되었고, LD 컬럼(Miltenyi)에 의해 분리되었다.
유통(flow-through)(108 Lin-/CD38- 세포)은 CD34 마이크로비드(Miltenyi)와 함께 인큐베이션되었고, CD34+CD38- 세포는 MS 컬럼 상에서 농축되었다.
NSG 마우스에서 CD38+ 및 CD38- 부분모집단의 조혈 생산량의 추적을 가능케 하기 위해, Lin+/CD38+(첫번째 컬럼) 및 CD34+CD38- 분획(두번째 컬럼)이 CD34에 대해 FACS-분류되었다(각각 매우 순수한 CD34+CD38+ 및 CD34+CD38- 세포 생성).
재분석은 CD38-/low 및 CD38+ 세포로의 효과적인 비드-기반 분리를 나타낸다. 이들 분획은 이후 GFP- 및 OFP- 발현 렌티바이러스 벡터로 차별적으로 표시되고, 1:5 비(CD34+38- : CD34+38+)로 혼합되고, n=4 NSG 마우스로 주입되었다. GFP/OFP 키메라현상이 28주 동안 후속되었다.
도 3
NSG 마우스에서의 모델링 줄기/전구체 공동-이식: 골수 CD38- 대 CD38high.
CD34+ 성체 골수 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)가 CD34+CD38- (+/-) 및 CD34+CD38hi (+/hi) 세포로 분류되었고, 16시간 동안 SCF(300 ng/mL), Flt3L(300 ng/mL), TPO(100 ng/mL), IL6(60 ng/mL) 및 dmPGE2(10 μM)를 함유하는 Stem Span SFEM에서 예비-자극되었고, GFP-LV (+/-) 또는 OFP-LV (+/hi)로 형질도입되었다. 형질도입 24시간 후, 세포는 하기와 같이 8주령의 치사량에 가깝게 방사선 조사된 NSG 마우스로 주입되었다:
그룹 1: 마우스(n=3) 당 27,000 CD34+CD38- 세포;
그룹 2: 마우스(n=3) 당 248,000 CD34+CD38hi 세포;
그룹 3: 마우스(n=3) 당 27,000 CD34+CD38- 및 248,000 CD34+CD38hi 세포.
말초 혈액에서 시간 경과에 걸쳐 생착(그룹 1, 2, 3) 및 키메라현상(그룹 3)이 모니터되었고, 이식 18주 후에 조혈 기관이 분석되었다.
도 4
(A) NSG 마우스에서의 모델링 줄기/전구체 공동-이식: 가동화된 말초 혈액 CD38- 대 CD38intm1 대 CD38intm2 대 CD38hi.
본 발명자는 증가하는 수준의 CD38 발현을 갖는 4개의 서브셋(CD34+/CD38-; CD34+/CD38int1; CD34+/CD38int2; CD34+/CD38hi)으로 CD34+ MPB를 분류하였고, 16시간 동안 SCF(300 ng/mL), Flt3L(300 ng/mL), TPO(100 ng/mL), IL6(60 ng/mL) 및 dmPGE2(10 μM)를 함유하는 Stem Span SFEM에서 이들 서브셋을 예비-자극시켰고, 서브셋을 CD34+/CD38-: GreenFP.LV; CD34+/CD38int1: CherryFP.LV; CD34+/CD38int2: CyanFP.LV; CD34+/CD38hi OrangeFP.LV의 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입 24시간 후, 세포는 하기와 같이 8주령의 치사량에 가깝게 방사선 조사된 NSG 마우스로 주입되었다:
그룹 1: 마우스(n=6) 당 129,000 CD34+/CD38- 세포;
그룹 2: 마우스(n=7) 당 869,000 전구 세포(각각의 집단이 전구체 혼합물에 33% 기여하는, CD34+/CD38int1, CD34+/CD38int2 및 CD34+/CD38hi 세포의 합계);
그룹 3: 마우스(n=6) 당 129,000 CD34+/CD38- 및 869,000 풀링된 전구 세포의 혼합물.
말초 혈액에서 시간 경과에 따라 생착(그룹 1, 2, 3) 및 키메라현상(그룹 3)이 모니터되었다.
(B) G-CSF-가동화된 말초 혈액 CD34+ 세포가 CD38 발현 수준에 따라 분류되었고, 다양한 분획이 상기 도 4(A)에 기재된 바와 같이 다양한 형광 단백질을 발현하는 4개의 렌티바이러스 벡터에 의해 표시되었다. 차별적으로 표시된 분획이 풀링되었고(도 4(A)에서 도 3에 해당함), 8주령의 치사량에 가깝게 방사선 조사된 NSG 마우스로 주입되었다. N=2 가동화된 말초 혈액 공여체(Stem Cell Technologies로부터 구매한 CD34+ 세포), 2개의 독립적 실험.
시간 경과에 걸친 CD38 하위분획으로부터 인간 이식까지의 상대 기여가 제시된다(시점 당 n=10 마우스, 실험 1로부터 6마리 및 실험 2로부터 4마리; 평균 +/- sem).
실험 1: 그룹 3, 마우스(n=6) 당 129,000 CD34+CD38-(0-12%) 및 869,000 CD34+CD38low-intm-high(12-100%) 풀링된 전구 세포의 혼합물.
실험 2: 그룹 3, 마우스(n=4) 당 149,000 CD34+CD38-(0-12%) 및 1,320,000 CD34+CD38low-intm-high(12-100%) 풀링된 전구 세포의 혼합물.
도 5
(A) 제대혈 CD34+ 세포에 대한 dmPGE2의 효과(시험관 내).
n=4 제대혈 공여체(Lonza)로부터의 CD34+ 세포가 해동되고, 10 μM dmPGE2의 존재 또는 부재하에서 18시간 동안 100 ng/mL의 SCF, 100 ng/mL의 FLT3L, 50 ng/mL의 TPO, 50 ng/mL의 IL6가 보충된 Stem span 혈청 비함유 증식 배지(SFEM)에서 배양(예비-자극)되었다. 예비-자극 후, 세포는 24시간 동안 108　TU/mL의 렌티바이러스 벡터와 함께 인큐베이션되었다. 세포는 이후 IMDM + 10% FCS에서 14일 동안 시험관 내에서 배양(n=5 반복)된 후, 벡터 카피수(VCN)가 문헌[Gentner, B. et al. (2009) Nat. Methods 6: 63-6]에 기재된 바와 같이 qPCR에 의해 측정되었다. dmPGE2 예비-자극은 유전자 전달에서 50% 증가를 발생시켰다.
(B) G-CSF-가동화된 CD34+ 말초 혈액 줄기 세포에 대한 dmPGE2의 효과(시험관 내).
3개의 가동화된 말초 혈액 공여체의 N=6 형질도입. 세포가 해동되고, 300 ng/mL의 SCF, 300 ng/mL의 FLT3L, 100 ng/mL의 TPO, 60　ng/mL의 IL-3의 사이토카인의 존재하에서 106 세포/mL의 밀도로 혈청 비함유의 상업적 배양 배지(예를 들어, CellGro)에 재현탁되고, dmPGE2의 부재(대조군, Ctrl) 또는 존재하에서 18시간 동안 예비 자극되었다. 12-24시간 동안 108　TU/mL의 렌티바이러스 벡터(3개의 상이한 배치)로 형질도입이 수행되었다. IMDM 및 10% FCS에서의 시험관 내 배양 14일 후에 qPCR에 의해 벡터 카피수가 평가되었다. 상대 VCN(대조군에 대해 표준화됨)이 제시된다.
(C) 렌티바이러스 벡터에 의한 인간 HSPC의 형질도입능(transducability)에 대한 dmPGE2 자극의 시기의 효과.
상기 효과는 dmPGE2가 LV 노출 2시간 전(t=-2h: VCN에서 100% 증가)에 첨가되는 경우에 최대화되는 것으로 보이는 한편, 해동 시간(t=-16h)에 dmPGE2를 첨가하는 것은 (A) 및 (B)에 제시된 실험과 유사한 ~50% VCN 증가를 발생시켰다. 이러한 실험은 1개의 제대혈 및 1개의 가동화된 말초 혈액 공여체에 대해 수행되었고, 상대 VCN이 제시된다(이의 각각의 대조군에 대해 표준화됨).
(D) 생체 외에서 dmPGE2 자극에 의해 획득된 증가된 벡터 카피수가 이종이식 후에 제대혈 유래 CD34+ 세포의 프로제니에서 장기간 유지된다.
제대혈 CD34+ 세포가 해동되었고, 18시간 동안 100 ng/mL의 SCF, 100 ng/mL의 FLT3L, 50 ng/mL의 TPO, 50 ng/mL의 IL-6가 보충된 Stem span 혈청 비함유 배지(SFEM)에서 배양 상태(106 세포/mL)에 두어지고(예비-자극), 이후 24시간 동안 108 TU/mL의 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 세포가 치사량에 가깝게 방사선 조사된 8주령 NSG 마우스(마우스 당 1.5-3 x 105 세포)로 주입되고, 인간 세포에 특이적인 프라이머를 이용하여 표시된 시점에서 각각의 그룹의 마우스의 풀링된 혈액 또는 골수에서 벡터 카피수(VCN)가 분석되었다. 3회의 반복 실험이 제시된다. 좌측 그래프: 세포가 PGK.TRAIL LV로 형질도입되고, 10 μM dmPGE2(dmPGE2 그룹, n=5 마우스) 또는 DMSO(대조군, n=5 마우스)가 해동 후(벡터 첨가와 관련하여 t=-16 h)에 직접 첨가되었다. 중간 그래프: 세포가 PGK.TRAIL LV로 형질도입되고, 10 μM dmPGE2(dmPGE2 그룹 n=5) 또는 DMSO(대조군; n=8)가 벡터 첨가 120분 전(t=-2 h)에 첨가되었다. 중간 그래프: 세포는 PGK.OFP LV로 형질도입되고, 10 μM dmPGE2(dmPGE2 그룹 n=5) 또는 DMSO(대조군; n=5)가 벡터 첨가 120분 전(t=-2 h)에 첨가되었다. 모든 3개의 실험에서, 시험관 내에서 관찰된 형질도입에서의 이점은 이종이식 18주 후까지 장기간 안정적으로 유지되었다.
(E-G) 생체외 dmPGE2 자극에 의해 획득된 증가된 벡터 카피수는 특정 배양 조건이 이용되는 경우에만, 즉, 전체 배양 시간을 44시간 미만까지 감소시키는 경우에만 성체 공급원(예를 들어, 가동화된 말초 혈액)으로부터의 CD34+ 세포의 프로제니에서 장기간 유지된다.
G-CSF 가동화된 말초 혈액(mPB)으로부터의 CD34+ 세포가 해동되고, SCF(300 ng/mL), FLT3L(300 ng/mL), TPO(100 ng/mL) 및 IL-3(60 ng/mL)가 보충된 CellGro 배지에서 배양 상태(106 세포/mL)에 두어졌다. 세포는 108 TU/mL의 용량의 gp91phox를 코딩하는 3세대 렌티바이러스 벡터(만성 육아종병)의 유전자 요법에 적합한 벡터)로 형질도입되었다. mPB CD34+ 세포의 생체외 형질도입에 사용된 다양한 프로토콜이 (E)에 예시되어 있고, 이는 dmPGE2의 존재(P1, P2, P3) 또는 부재(P0, P4), dmPGE2 첨가 시기(해동 후: P1, P2; 형질도입 120분 전: P3) 및 배양 기간(24시간: P2, P4 대 44시간: P0, P1, P3)과 관련하여 상이하다.
(F) 공여체 1로부터의 10 x 106개의 CD34+ mPB 세포가 해동되었고, 4개의 동등한 부분으로 나누어지고, P0, P1, P2 또는 P3에 따른 산업-등급 생성(Molmed Spa)으로부터의 SP146/gp91.cogp91phox.126T LV로 형질도입되었다. 시간 0에서 배양 상태에 놓인 5x105 세포의 증식물이 마우스 당 주입되었다(실제 수: 마우스 당 P0 3.66 x 10^5; P1: 마우스 당 4.66 x 10^5; P2: 마우스 당 3.0 x 10^5; P3: 마우스 당 4.86 x 10^5). 마우스는 이식 20주 후에 안락사되었다. BM은 플러싱(flushing)되었고, 동일 그룹에 속하는 마우스로부터 풀링되었고(P0, P1, P2: 그룹 당 n=5; P3: 그룹 당 n=3), 마우스 세포에 대해 고갈되었다. 농축된 인간 세포는 이후 인간 세포에 특이적인 프라이머를 이용한 벡터 카피수(VCN) 분석(5 기술 반복)에 적용되었다. 본페로니(Bonferroni) 시험후 보정을 이용한 일원 분산 분석에 의해 통계학이 수행되었고, 이는 P2 조건에서 장기간 재증식 세포로의 VCN에서 ~50% 증가를 나타낸다.
두번째 공여체 (G)로부터의 mPB CD34+ 세포를 이용하여 반복 실험이 수행되었다. 15 x 106개의 CD34+ mPB 세포가 해동되고, 4개의 동등한 부분으로 나누어지고, 프로토콜 P0, P1(44 h -/+ dmPGE2) 또는 P4, P2(24h -/+ dmPGE2)에 따른 lab-등급 생성물로부터 유래되는 SP146/gp91.gp91phoxTGT.126T LV(CGD 유전자 요법에 적합한 벡터)로 형질도입되었다. 시간 0에서 배양 상태에 놓인 9x105 세포의 증식물이 마우스 당 주입되었다(실제 수: 마우스 당 P0 10 x 105; P1: 마우스 당 8.2 x 105; P4: 마우스 당 4.5 x 105; P2: 마우스 당 5.3 x 105). VCN이 인간 세포에 특이적인 qPCR 검정을 이용하여 이식 13주 후에 각각의 단일 마우스로부터의 BM 세포에 대해 분석되었다. 첫번째 실험과 일치하게, P1 조건은 P1 프로토콜이 시험관 내 판독을 이용하여 VCN을 증가시킨 MPB CD34+ 전구 세포(도 5B 참조)와 아주 대조적으로, 그리고 "표준" 배양 프로토콜과 관련된 dmPGE2가 장기간 재증식 세포에서 VCN을 증가시킨 제대혈(도 5D)과 대조적으로 성체 공급원으로부터의 장기간 재증식 세포에서 dmPGE2에 의해 매개된 형질도입 효율에서 지속된 증가를 발생시키지 않았다. 예기치 않게, 본 발명자는 24시간까지 MPB CD34+ 세포 배양 프로토콜을 단축(P2)하는 것은 장기간 재증식 세포에서 dmPGE2의 형질도입-촉진 효과를 구조하였을 뿐만 아니라 44시간 표준 프로토콜에 의해 달성된 수준 위로 충분히 형질도입을 증가시킨 것을 발견하였다. 가능한 설명은 하기를 포함한다:
● LV 형질도입에 대한 증식허용의 범위가 16-24시간까지 제한되는 HSC(전구체에 대해서는 아님)에 대한 dmPGE2의 노출 시간-의존 효과(이러한 가설과 일치하게, 통계적으로 유의하지 않지만, dmPGE2 노출이 P1과 관련하여 연기된 P3 프로토콜은 VCN에서 일부 증가를 암시할 수 있다; 도 5F 참조)
● dmPGE2 자극에 민감하나, 배양 상태에서 24시간 후에 생착 잠재성을 상실한 것, 및 dmPGE2에 둔감하나, 배양 상태에서 생착 잠재성을 더 잘 유지시키고, 이에 따라 더 긴 배양 상태에서 우세한 것의 기능적으로 상이한 HSC 종의 존재.
도 6
dmPGE2의 사용은 성체 골수로부터의 CD34+, CD34+CD38- HSC 및 CD34+CD38+ 전구 세포로의 유전자 전달을 증가시킨다.
실험은 다음과 같이 수행되었다: N=3 골수 공여체(Lonza)로부터의 CD34+ 세포가 해동되고, 18시간 동안 300 ng/mL의 SCF, 300 ng/mL의 FLT3L, 100 ng/mL의 TPO, 60 ng/mL의 IL3에서의 예비-자극 조건하에서 Stem span 혈청 비함유 증식 배지(SFEM)에서 배양 상태에 투었다. 세포는 이후 3개의 그룹으로 나누어졌다: 벌크 CD34+, CD34+CD38-, CD34+CD38+(BD Bioscience로부터의 CD38-APC 항체를 이용한 표지 후에 MoFlow 세포측정기에서 FACS-분류됨). 본 발명자는 이후 dmPGE2(10 μM) 또는 DMSO를 배양물에 첨가하고, 또 다른 16시간 동안 세포를 예비-자극시킨 후, 이들을 108 TU/mL의 GFP-발현 렌티바이러스 벡터(LV.PGK.GFP)로 형질도입시켰다. IMDM+10%FCS에서 14일 동안 액체 배양(좌측) 또는 집락 형성 세포(CFC) 검정(우측; 800 세포/mL methocult 플레이팅하고, 14일 후에 집락 증식을 분석함)으로 시험관내 배양 검정이 수행되었다. 벡터 카피수는 문헌[Gentner B et al. Nat. Methods 2009;6:63-66]에 기재된 바와 같이 qPCR에 의해 평가되었다.
도 7
배양된/형질도입된 CD34+CD38- 줄기 세포와 배양되지 않은 CD34+CD38int /+ 전구 세포의 공동-투여 모델링.
G-CSF-가동화된 말초 혈액 세포가 백혈구성분채집술에 의해 획득되었고, CD34+ 세포에 대해 농축되었고, FACS(MoFlo XDP 분류기 및 CD38 PE-Vio770 Miltenyi 항체)에 의해 더욱 원시 CD38- 줄기 세포 분획(0-7% CD38 백분위수) 및 CD38int /+ 전구 세포 분획(13-100% CD38 백분위수)으로 분류되었다. 각각의 분획의 다수의 분취량이 동결되었다.
(A) CD34+CD38-(Stem) 분획이 해동되었고, 106 세포/mL의 밀도로 300 ng/mL의 SCF, 300 ng/mL의 FLT3L, 100　ng/mL의 TPO, 60 ng/mL의 IL-3 및 10 μM의 dmPGE2가 보충된 Stem Span 혈청 비함유 증식 배지(SFEM)에 재현탁되었다. 세포는 20시간 동안 예비-자극(도표 내 회색 박스)되었고, 도표에 제시된 바와 같이 24시간(적색 박스) 동안 PGK.GFP 렌티바이러스 벡터(108 TU/mL)로 형질도입되었다. 배양된/유전자-변형된 줄기 세포는 이후 1:8의 비로 새로이 해동된 CD34+CD38int /+ 전구체와 혼합되고, 8주령의 치사량에 가깝게 방사선 조사된 NSG 마우스에 주입되었다(마우스 당 47,400 CD34+CD38- / 327,000 배양되지 않은 전구 세포, n=6). 줄기 구획의 형질도입 효율은 CD34+CD38- 줄기 세포로만 이식된 NSG 마우스(n=6)에서 측정된 바와 같이 생체 내에서 95%였다. 좌측 그래프는 배양된 CD34+CD38- 세포로부터 유래되는 세포에 대한 대용 마커로서의 표시된 시점에서의 인간 이식편 내의 GFP+ 세포(속이 채워진 원)의 백분율, 및 배양되지 않은 전구 세포 이식편으로부터 유래되는 세포에 대한 대용 마커로서의 GFP- 세포(속이 빈 원)의 백분율을 제시한다. HSC-유래 조혈을 반영하는 시점인 BMT 24주 후, 약 60%의 이식편은 GFP+였고, 따라서 CD34+CD38- 줄기 세포 분획으로부터 유래되었다. 이러한 도면은 B 세포(CD19+), 골수양 세포(CD33+) 및 CD34+ HSPC를 포함하는 모든 계통(우측 그래프)에 대해 유사하였다. 다른 한편으로, 장기 이식편의 30-40%는 도 4에 기재된 연구에 비해 예기치 않게 높았던 분획인 CD34+CD38int /+ 전구체로부터 유래된 것으로 보인다. 또한, 이는 도 4B에 기재된 연구에서의 9주에 반해 줄기 세포 기여와 전구 세포 기여 사이의 평형이 도달되기 전에 15주가 걸렸다(도 7A).
(B) 매우 농축된 유전자-변형된 HSC 및 배양되지 않은 전구 세포 지지체의 주입을 기초로 한 유전자 요법 프로토콜을 개선시키기 위해, 본 발명자는 CD34+CD38- 세포에서의 HSC 기능의 더 나은 유지를 가능케 하기 위해 줄기 세포 대 전구 세포의 비(1:5 대 1:10) 및 배양 조건(24시간까지 배양 시간 감소, IL3와 같은 전구 세포 사이토카인을 회피함)을 조정하였다. (A)에서와 동일한 공여체로부터의 CD34+CD38-(Stem) 세포가 해동되고, 106/mL로 300 ng/mL의 SCF, 300 ng/mL의 FLT3L, 100　ng/mL의 TPO 및 10 μM의 dmPGE2가 보충된 CellGro 배지에 재현탁되고, 16시간 동안 예비-자극되었다(도표 내 회색 박스). 도표에 제시된 바와 같이 8시간(적색 박스) 동안 108 TU/mL의 PGK.GFP 렌티바이러스 벡터로 형질도입이 수행되었다. 배양된/유전자-변형된 줄기 세포는 이후 1:5(마우스 당 46,500 CD34+CD38- / 232,500 배양되지 않은 전구 세포, n=5) 또는 1:10(마우스 당 46,500 CD34+CD38- / 465,000 배양되지 않은 전구 세포, n=5)의 비로 새로이 해동된 CD34+CD38int/+ 전구체와 혼합되었고, 8주령의 치사량에 가깝게 방사선 조사된 NSG 마우스에 주입되었다. 상부 그래프는 배양된 CD34+CD38- 세포로부터 유래되는 세포에 대한 대용 마커로서의 표시된 시점에서의 인간 이식편에서의 GFP+ 세포(속이 채워진 원)의 백분율, 및 배양되지 않은 전구 세포 이식편으로부터 유래되는 세포에 대한 대용 마커로서의 GFP- 세포(속이 빈 원)의 백분율을 제시한다. 형질도입된 CD34+CD38- 줄기 세포로부터의 훨씬 더 신속한 기여가 인지되었고, 이는 12주에서 이미 70%(도 7A에서의 40%에 비함)까지 도달하였다. GFP+ 세포의 분획은 1:5 또는 1:10의 줄기/전구체 비와 상관 없이 단기 조혈 계통(CD33+ 또는 CD34+ 세포)에서 유사하였다(하부 그래프). 이들 데이터는 짧은 배양 시간이 매우 기능성인 유전자-변형된 HSC를 획득하는데 중요하다는 개념을 뒷받침한다.
도 8
유전자 요법 동안의 유전자-변형된 세포의 지속성 맞춤화(Tailoring).
(A) 안정적인 장기간 트랜스진 발현은 형질도입된 CD34+CD38- 세포와 함께 형질도입되지 않은 CD34+CD38+/ int 전구 세포를 투여함으로써 달성된다. 이러한 접근법은 유전 장애를 치료하기 위해 잘 적합화될 수 있다.
(B) 일시적 단기간 트랜스진 발현은 형질도입된 CD34+CD38+/ int 전구 세포와 함께 형질도입되지 않은 CD34+CD38- 세포를 투여함으로써 달성된다.
(C) 일시적 중기 발현은 형질도입된 CD34+CD38int /lo 세포와 함께 형질도입되지 않은 CD34+CD38- 세포를 투여함으로써 달성된다.
(B) 및 (C)에 제시된 접근법은 종양을 표적화시키기 위해 충분히 적합화될 수 있다.
이들 도면은 2개의 독립적 실험(공여체 1: n=21 마우스; 공여체 2: n=12 마우스)으로부터의 데이터를 제시한다.
도 9
HSPC 분획의 생착에 대한 생체 외 배양 시간의 영향(B 및 C: 전체 CD34+HSPC; D: CD34+CD38- HSPC; E: CD34+CD38int/+ 전구 세포)
(A) 시험된 생체 외 배양 조건의 도표. 모든 실험은 백혈구성분채집술에 의해 수거된 G-CSF 가동화된 말초 혈액(mPB) 줄기 세포에 대해 수행되었다. 세포는 해동되고, 회색 박스에 의해 도표에 표시된 바와 같이 24시간(표준) 또는 16시간(단기) 동안 300 ng/mL의 SCF, 300 ng/mL의 FLT3L, 100 ng/mL의 TPO, 60 ng/mL의 IL-3가 보충된 혈청 비함유 배지에서 배양 상태(106 세포/mL)에 두었다. 형질도입은 적색 박스(더 어두운 박스)에 의해 표시된 바와 같이 20시간(표준) 또는 8시간(단기 프로토콜) 동안 108 TU/mL의 3세대 렌티바이러스 벡터로 수행되었다. 동등한 수의 세포(생체 외 배양의 시작시의 투입 수에 따름)가 치사량에 가깝게 방사선 조사된 8주령 NSG 마우스에 주입되었고, 생착이 시간 외로 모니터되었다. 본페로니 시험후 보정을 이용한 이원 분산 분석에 의해 통계학이 수행되었다.
(B) (좌측) 표준 또는 단기 프로토콜(5x105 mPB CD34+ 세포의 증식물로 각각 주입된 그룹 당 n=5 마우스)에 따라 조작된 SP146/gp91.cogp91phox.126T LV 형질도입된 mPB CD34+ 세포를 이용한 이종이식 후 표시된 시점에서의 NSG 마우스의 말초 혈액(PB) 및 골수(BM)에서의 인간 CD45+ 생착. (우측) 생착 수준은 각각의 마우스로 주입된 CD34+ 세포의 실제 수에 대해 표준화되었다. 이러한 수는 세포가 시험관 내에서 증식시키기 위해 더 적은 시간을 가지므로 단기 배양 프로토콜에 대해 더 낮았다.
(C) (B)에 기재된 것과 유사한 반복 실험은 더 짧은 기간(24시간 대 44시간) 동안 배양된 CD34+ 세포는 유의하게 증가된 재증식 잠재성을 갖는 것을 입증하였다.
(D) 단기(n=6 마우스, 마우스 당 4.7x104 세포) 또는 표준 프로토콜(n=6 마우스, 마우스 당 4.7x104 세포)에 따라 조작된 PGK.GFP LV 형질도입된 mPB CD34+CD38- 줄기 및 초기 전구 세포를 이용한 이종이식 후 표시된 시점에서의 NSG 마우스의 말초 혈액(PB) 및 골수 흡인물(BMasp)에서의 인간 CD45+GFP+ 생착. CD38-의 수준은 항-CD38 항체(IB6-PE-Vio770, Miltenyi)와 함께 인큐베이션되고, 가장 낮은 CD38 발현 세포(0-7% 간격, 0은 가장 낮은 발현 세포이고, 100%는 가장 높은 발현 세포임)로부터 시작하는 경우 CD38 염색의 수준에 따라 등급화된 CD34+ 세포의 7%로 규정되었다.
(E) 표준(n=4 마우스) 또는 단기 프로토콜(n=5 마우스)에 따라 조작된 PGK.GFP LV 형질도입된 mPB CD34+CD38int /+ 전구 세포를 이용한 이종이식 후 표시된 시점에서의 NSG 마우스의 말초 혈액(PB) 및 골수 흡인물(BMasp)에서의 인간 CD45+ 생착. 또한, n=5 마우스는 새로이 해동된(배양되지 않은) CD34+CD38int /+ 전구 세포로 이종이식되었다. 마우스에 5x105 mPB CD34+CD38int /+ 세포의 동등물이 주입되었다. CD38int /+의 수준은 항-CD38 항체(IB6-PE-Vio770, Miltenyi)와 함께 인큐베이션되고, 가장 높은 CD38 발현 세포(13-100% 간격, 0은 가장 낮은 발현 세포이고, 100%는 가장 높은 발현 세포임)로부터 시작하는 경우 CD38 염색의 수준에 따라 등급화된 CD34+ 세포의 87%로 규정되었다.
도 10
임상 유전자 요법 적용을 위해 사용되는 잠재적 형질도입 프로토콜의 도표. 프로토콜 A, B, C 및 D가 바람직한 프로토콜이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 구체예는 이제 비제한적인 실시예에 의해 기재될 것이다.
본 발명의 실시는 달리 표시하지 않는 한 화학, 분자생물학, 미생물학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이며, 이는 당업자의 능력 내이다. 이러한 기술은 문헌에서 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[J.　Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, NY; B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; 및, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg (1992) Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press]을 참조하라. 이들 일반 문헌 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명의 첫번째 양태에 따르면, 임상적 사용을 위한 치료 세포 집단을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 세포는 CD34를 발현하나, CD38을 실질적으로 발현하지 않는다. 상기 세포는 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단으로부터 제조된다. 상기 방법은 세포의 시작 집단으로부터 CD38을 실질적으로 발현하지 않지만 CD34를 발현하는 세포의 집단을 분리시키는 단계, 및 분리된 세포 집단을 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터로 형질도입시켜 치료 세포 집단을 획득하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 벡터는 관심 뉴클레오티드를 포함한다.
치료 세포 집단은 대상체로 투여되는 경우 치료 효과를 발생시키는 세포의 집단으로 이해되어야 한다. 치료 효과는 대상체의 질병 또는 장애를 개선시키거나 실질적으로 치료하거나, 질병 또는 장애의 추가 제시를 감소시키거나 실질적으로 예방하는 것일 수 있다. 예를 들어, 유전체 서열분석을 통해 유전 장애를 확인하고, 치료 세포 집단의 투여를 통해 장애 제시를 예방할 수 있다. 치료 세포 집단은 유전자 요법에 유용한 유전자를 포함할 수 있다.
"임상 사용"은 치료 세포 집단이 동물 대상체, 바람직하게는 인간 대상체로 투여될 수 있는 형태로 제조되는 것으로 이해되어야 한다.
조혈 줄기 세포
줄기 세포는 많은 세포 유형으로 분화할 수 있다. 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포는 전능성으로 공지되어 있다. 포유동물에서, 접합체 및 초기 배아 세포만이 전능성이다. 줄기 세포는 모두는 아닌 대부분의 다세포 유기체에서 발견된다. 이들은 유사분열 세포 분열을 통해 이들을 재생시키고, 다양한 범위의 특화된 세포 유형으로 분화하는 능력을 특징으로 한다. 2개의 광범위한 유형의 포유동물 줄기 세포는 주머니배의 내부 세포 덩이로부터 분리되는 배아 줄기 세포, 및 성체 조직에서 발견되는 성체 줄기 세포이다. 발달하는 배아에서, 줄기 세포는 특화된 배아 조직 모두로 분화할 수 있다. 성체 유기체에서, 줄기 세포 및 전구 세포는 특화된 세포를 보충하나, 또한 재생 기관, 예를 들어, 혈액, 피부 또는 장 조직의 일반적인 전환을 유지시키는 신체에 대한 복구 시스템으로 작용한다.
조혈 줄기 세포(HSC)는, 예를 들어, 말초 혈액, 골수 및 제대혈에서 발견될 수 있는 다능성 줄기 세포이다. HSC는 임의의 혈액 세포 계통으로 자가-재생 및 분화할 수 있다. 이들은 모든 조혈 조직(예를 들어, 골수, 비장 및 가슴샘)에서 전체 면역계, 및 적혈구 및 골수양 계통을 재집락화시킬 수 있다. 이들은 조혈 세포의 모든 계통의 일생의 생성을 제공한다.
조혈 전구 세포는 특정 유형의 세포로 분화하는 능력을 갖는다. 그러나, 줄기 세포와 대조적으로, 이들은 이미 훨씬 더 특이적이며, 이들은 이들의 "표적" 세포로 강제로 분화된다. 줄기 세포와 전구 세포의 차이는 줄기 세포는 무기한적으로 복제할 수 있는 반면, 전구 세포는 제한된 수의 횟수로만 분열할 수 있다는 점이다. 조혈 전구 세포는 기능성 생체내 검정(즉, 이식 및 이들이 연장된 기간에 걸쳐 모든 혈액 계통을 발생시킬 수 있는지의 여부의 입증)에 의해서만 HSC로부터 엄격하게 구별될 수 있다.
분화된 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포에 비해 더욱 특화된 세포이다. 분화는 유기체가 단일 접합체로부터 조직 및 세포 유형의 복합 시스템으로 변화함에 따라 다세포 유기체의 발달 동안 발생한다. 분화는 또한 성체에서의 일반적인 과정이며, 성체 줄기 세포는 분열하고, 조직 복구 및 일반 세포 전환 동안 완전히 분화된 딸세포를 발생시킨다. 분화는 세포의 크기, 형태, 막 전위, 대사 활성 및 신호에 대한 반응성을 극적으로 변화시킨다. 이들 변화는 주로 유전자 발현에서의 매우 조절된 변형으로 인한 것이다. 즉, 분화된 세포는 특정 구조를 갖고, 특정 유전자의 활성화 및 비활성화를 포함하는 발달 과정으로 인해 특정 기능을 수행하는 세포이다. 여기서, 분화된 세포는 조혈 계통, 예를 들어, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거대핵세포/혈소판, 수지상 세포, T-세포, B-세포 및 NK-세포의 분화된 세포를 포함한다. 예를 들어, 조혈 계통의 분화된 세포는 발현되지 않거나, 분화되지 않은 세포에 비해 더 적은 정도로 발현되는 세포 표면 분자의 검출에 의해 줄기 세포 및 전구 세포로부터 구별될 수 있다. 적합한 인간 계통 마커의 예는 CD33, CD13, CD14, CD15(골수양), CD19, CD20, CD22, CD79a (B), CD36, CD71, CD235a(적혈구), CD2, CD3, CD4, CD8 (T), CD56 (NK)를 포함한다.
HSC 공급원
본 발명의 한 구체예에서, 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단은 조직 샘플로부터 획득된다.
예를 들어, HSC는 성체 및 태아 말초 혈액, 제대혈, 골수, 간 또는 비장으로부터 획득될 수 있다. 바람직하게는, 이들 세포는 말초 혈액 또는 골수로부터 획득된다. 이들은 성장 인자 처리에 의해 생체내에서 세포의 가동화 후에 획득될 수 있다.
가동화는, 예를 들어, G-CSF, 플레릭사포르(plerixaphor) 또는 이들의 조합물을 이용하여 수행될 수 있다. 다른 작용제, 예를 들어, NSAID, CXCR2 리간드(Grobeta) 및 디펩티딜 펩티다제 억제제는 또한 가동화 작용제로서 유용할 수 있다.
줄기 세포 성장 인자 GM-CSF 및 G-CSF의 이용가능성과 함께, 대부분의 조혈 줄기 세포 이식 절차는 이제 골수로부터가 아니라 말초 혈액으로부터 수거된 줄기 세포를 이용하여 수행된다. 말초 혈액 줄기 세포를 수거하는 것은 더 큰 이식편을 제공하고, 이식편을 수거하기 위해 공여체가 일반 마취에 적용되는 것을 필요로 하지 않고, 생착까지 더 짧은 시간을 발생시키며, 더 낮은 장기간 재발률을 제공할 수 있다.
골수는 표준 흡인 방법(항정-상태 또는 가동화 후)에 의하거나, 차세대 수거 도구(예를 들어, Marrow Miner)를 이용함으로써 수거될 수 있다.
또한, HSC는 또한 유도된 다능성 줄기 세포로부터 유래될 수 있다.
HSC 특징
HSC는 통상적으로 흐름세포측정법 절차에 의해 낮은 전방 산란 및 측방 산란 프로파일의 HSC이다. 일부는 미토콘드리아 활성의 결정을 가능케 하는 로다민 표지화에 의해 입증된 바와 같이 대사적으로 조용하다. HSC는 특정 세포 표면 마커, 예를 들어, CD34, CD45, CD133, CD90 및 CD49f를 포함할 수 있다. 이들은 또한 CD38 및 CD45RA 세포 표면 마커의 발현이 결핍된 세포로 규정될 수 있다. 그러나, 이들 마커의 일부의 발현은 HSC의 발달 단계 및 조직-특이적 상황에 좌우된다. "측면 집단 세포(side population cell)"로 언급되는 일부 HSC는 흐름세포측정법에 의해 검출되는 바와 같이 Hoechst 33342 염료를 배제한다. 따라서, HSC는 이들의 확인 및 분리를 가능케 하는 서술적 특징을 갖는다.
음성 마커
CD38은 인간 HSC에 대한 가장 확립되고 유용한 단일 음성 마커이다.
인간 HSC는 또한 계통 마커, 예를 들어, CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD24, CD36, CD56, CD66b, CD271 및 CD45RA에 대해 음성일 수 있다. 그러나, 이들 마커는 HSC 농축과 함께 사용되는 것을 필요로 할 수 있다.
음성 마커는 인간 HSC는 이들 마커의 발현이 결핍된 것으로 이해되어야 한다.
양성 마커
CD34 및 CD133는 HSC에 대한 가장 유용한 양성 마커이다.
일부 HSC는 또한 계통 마커, 예를 들어, CD90, CD49f 및 CD93에 대해 양성이다. 그러나, 이들 마커는 HSC 농축과 함께 이용되는 것을 필요로 할 수 있다.
양성 마커는 인간 HSC가 이들 마커를 발현하는 것으로 이해되어야 한다.
따라서, 세포의 치료 집단은 CD34+CD38-일 수 있다. 추가 분리는, 예를 들어, CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+ 세포를 획득하기 위해 수행될 수 있다.
세포의 분리
세포의 집단을 분리시키는 것은 표현형 또는 특징을 나타내지 않거나 이를 덜한 정도로 나타내는 다른 세포로부터 특정 표현형 또는 특징을 나타내는 세포의 집단의 정제를 나타낸다. 예를 들어, 특정 마커(예를 들어, CD38)를 발현하지 않는 세포의 집단은 세포의 시작 집단으로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 또는 또한, 또 다른 마커(예를 들어, CD34)를 발현하지 않는 세포의 집단이 분리될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단으로부터 CD38-발현 세포를 분리시키는 단계;
b. CD38을 발현하지 않는 단계 (a)에서 획득된 세포의 집단으로부터 CD34-발현 세포를 분리시키는 단계;
c. 단계 (b)에서 획득된 CD34-발현 세포 집단을 벡터로 형질도입시켜 치료 세포 집단을 획득하는 단계.
특정 마커(예를 들어, CD38 또는 CD34)를 발현하는 세포의 집단을 분리시키는 것은 상기 마커에 결합하는 작용제를 이용함으로써 달성될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단과 CD38에 대해 반응성인 작용제를 접촉시키는 단계;
b. CD38-비반응성 세포로부터 CD38-반응성 세포를 분리시키는 단계;
c. 단계 (b)에서 획득된 CD38-비반응성 세포와 CD34에 대해 반응성인 작용제를 접촉시키는 단계;
d. CD34-비반응성 세포로부터 CD34-반응성 세포를 분리시키는 단계로서, CD34-반응성 세포가 형질도입 세포 집단을 형성하는, 단계;
e. 형질도입 세포 집단을 벡터로 형질도입시켜 치료 세포 집단을 획득하는 단계.
특정 마커, 예를 들어, CD38 또는 CD34에 대해 반응성인 작용제는 상기 마커에 실질적으로 특이적으로 결합하는 작용제로 이해되어야 한다.
본 발명의 한 구체예에서, CD38 또는 CD34에 대해 반응성인 작용제는 각각 항-CD38 또는 항-CD34 항체이다.
본원에서 이용되는 바와 같은 항체는 완전 항체 또는 선택된 표적에 결합할 수 있는 항체 단편, 예를 들어, Fv, ScFv, F(ab') 및 F(ab')2, 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 공학 처리된 항체, 예를 들어, 키메라, CDR-이식 및 인간화 항체, 및 파지 디스플레이 또는 대안적 기술을 이용하여 생성된 인공적으로 선택된 항체를 나타낸다.
또한, 고전적 항체에 대한 대안, 예를 들어, "아비바디(avibody)", "아비머(avimer)", "안티칼린(anticalin)", "나노바디(nanobody)" 및 "DARPin"이 또한 본 발명에서 이용될 수 있다.
따라서, 예를 들어, CD38-반응성 세포는 CD38 마커를 발현하고, 따라서 CD38-반응성 작용제에 결합하는 세포로 이해되어야 한다. 역으로, CD38-비반응성 세포는 실질적으로 CD38 반응성 작용제에 결합하지 않는다. 동일한 이해가 유추에 의해 CD34-반응성 및 비반응성 세포에 적용될 수 있다.
특정 마커에 대해 반응성인 작용제는 당 분야에 공지된 다수의 기술 중 임의의 기술을 이용하여 확인 가능하게 되도록 표지될 수 있다. 반응성 작용제는 본질적으로 표지될 수 있거나, 이에 대해 표지를 컨쥬게이션시킴으로써 변형될 수 있다. 컨쥬게이션은 반응성 작용제 및 표지가 작동 가능하게 연결되는 것으로 이해되어야 한다. 이는 반응성 작용제 및 표지가 둘 모두가 이들의 기능이 실질적으로 방해받지 않고 수행하는 것을 가능하게 하는 방식(예를 들어, 마커에 대한 결합, 형광 확인 가능화, 또는 자기장에 배치되는 경우 분리를 가능케 함)으로 함께 연결되는 것을 의미한다. 컨쥬게이션의 적합한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 당업자에 의해 용이하게 확인 가능해질 수 있다.
표지는, 예를 들어, 표지되는 작용제 및 결합되는 임의의 세포가 이의 환경으로부터 정제되거나(예를 들어, 반응성 작용제는 자기 비드, 또는 친화성 태그, 예를 들어, 아비딘으로 표지될 수 있음), 검출되거나, 정제되고 검출되도록 할 수 있다. 표지로 사용하기에 적합한 검출 가능한 마커는 형광단(예를 들어, 녹색, 체리색, 청록색 및 오렌지색 형광 단백질) 및 펩티드 태그(예를 들어, His 태그, Myc 태그, FLAG 태그 및 HA 태그)를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 항-CD38 및/또는 항-CD34 항체는 자기 비드에 컨쥬게이션된다.
또 다른 구체예에서, 항-CD38 및/또는 항-CD34 항체는 검출 가능한 마커에 컨쥬게이션된다.
또 다른 구체예에서, 검출 가능한 마커는 형광단이다.
특정 마커를 발현하는 세포의 집단을 분리시키기 위한 다수의 기술은 당 분야에 공지되어 있다. 이들은 자기 비드-기반 분리 기술(예를 들어, 폐쇄-순환 자기 비드-기반 분리), 흐름세포측정법, 형광-활성화 세포 분류(FACS), 친화성 태그 정제(예를 들어, 친화성 컬럼 또는 비드, 아비딘-표지된 작용제를 분리시키기 위해 상기 비오틴 컬럼을 이용함) 및 현미경검사-기반 기술을 포함한다.
한 구체예에서, CD38-발현 세포 및/또는 CD34-발현 세포는 자기 비드-기반 분리 또는 흐름세포측정법을 이용하여 분리된다.
또 다른 구체예에서, CD38-반응성 세포 및/또는 CD34-반응성 세포는 자기 비드-기반 분리 또는 흐름세포측정법을 이용하여 분리된다.
또한, 다양한 기술의 조합, 예를 들어, 자기 비드-기반 분리 단계 후 흐름세포측정법에 의한 하나 이상의 추가(양성 또는 음성) 마커에 대한 생성된 세포 집단의 분류를 이용하여 분리를 수행할 수 있다.
임상 등급 분리는, 예를 들어, CliniMACS® 시스템(Miltenyi)을 이용하여 수행될 수 있다. 이는 폐쇄-순환 자기 비드-기반 분리 기술의 예이다.
또한, 염료 배제 특성(예를 들어, 측면 집단 또는 로다민 표지) 또는 효소 활성(예를 들어, ALDH 활성)이 HSC에 대해 농축시키기 위해 이용될 수 있는 것이 예견된다.
전류 자기 비드-기반 분리 기술을 이용하는 경우, 음성 분리 단계(즉, CD38-발현 세포의 고갈)가 양성 분리 단계(즉, CD34-발현 세포의 농축)에 선행해야 하는 것이 바람직하다. 그러나, 대안적 기술, 예를 들어, 진보된 흐름세포측정법 기술(예를 들어, 폐쇄-순환 FACS)과 함께 음성 및 양성 분리 단계 둘 모두를 동시에 수행하는 것이 가능할 수 있음이 예견된다.
그러나, 음성 분리 단계(즉, CD38-발현 세포의 고갈) 전에 양성 분리 단계(즉, CD34-발현 세포의 농축)를 수행하는 것이 또한 가능하다.
본 발명의 세포의 집단은 CD38 발현 수준에 따라 분획으로 분리될 수 있다. CD38 발현 수준은 당 분야에 공지된 적합한 기술, 예를 들어, 흐름세포측정법 기술을 이용하여 정량될 수 있다(예를 들어, 도 4 참조). 예를 들어, CD38 발현 수준은 IB6 클론 또는 유사한/동등한 시약을 이용한 항체 염색에 의해 측정될 수 있다.
세포에 의한 CD38 발현의 양은 발현 수준 백분율에 의해 표현될 수 있고, 0%는 가장 낮은 발현 세포이고, 100%는 가장 높은 발현 세포이다.
세포의 집단은 CD38 발현 수준을 기초로 하여 부분모집단(예를 들어, CD34+ 집단으로부터 유래되는 부분모집단)으로 분류되거나 분리될 수 있다. 세포의 집단은 순서대로 증가하는 수준의 CD38 발현을 갖는 CD38-, CD38int1, CD38int2 또는 CD38+ 부분모집단으로 분류되거나 분리(예를 들어, 전체 CD34+ 집단은 CD38 발현/염색 강도에 따라 등급화됨)될 수 있다. 예를 들어(CD34+ 세포에 대한 분석을 예비-게이팅(pre-gating)시키는 경우), CD38- 표현형을 갖는 세포의 집단은 CD38 발현 수준을 기초로 하여 세포의 가장 낮은 10% 내에 포함될 수 있고; CD38int1 표현형을 갖는 세포의 집단(CD38int /lo로도 언급됨)은 CD38- 세포 다음으로 세포의 가장 높은 30% 내에 포함될 수 있고; CD38int2 표현형을 갖는 세포의 집단(CD38+/ int로도 언급됨)은 CD38int1 세포 다음으로 세포의 가장 높은 30% 내에 포함될 수 있고; CD38+ 표현형을 갖는 세포의 집단(CD38hi로도 언급됨)은 CD38int2 세포 다음으로 세포의 가장 높은 30% 내에 포함될 수 있다.
따라서, CD38- 표현형을 갖는 세포의 집단은, 예를 들어, CD38 발현의 약 0-12% 범위, 예를 들어, 약 0-10% 범위 내에 포함될 수 있다.
CD38int1 표현형을 갖는 세포의 집단(CD38int /lo로도 언급됨)은, 예를 들어, CD38 발현의 약 10-40% 범위, 예를 들어, 약 12-40% 또는 약 13-40% 범위 내에 포함될 수 있다.
CD38int2 표현형을 갖는 세포의 집단(CD38+/ int로도 언급됨)은, 예를 들어, CD38 발현의 약 40-70% 범위, 예를 들어, 약 41-70% 범위 내에 포함될 수 있다.
CD38+(CD38hi로도 언급됨) 표현형을 갖는 세포의 집단은, 예를 들어, CD38 발현의 약 70-100% 범위, 예를 들어, 약 71-100% 범위 내에 포함될 수 있다.
당업자는 본원의 개시를 기초로 하여 의도된 용도에 따라 CD38 발현 수준을 기초로 하여 세포의 집단을 용이하게 선택할 수 있다. 확실히, 당업자는 CD38 발현의 개시된 수준이 요망되는 용도에 따라 약간 조정될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다.
바람직한 구체예에서, CD38- 집단(줄기 세포-함유 분획)은 CD38 발현의 0-10% 범위를 갖는 것으로 규정되고; CD38int1 집단(단기 내지 중기 재증식 능력을 갖는 다능성 전구체-함유 분획)은 CD38 발현의 10-40% 범위를 갖는 것으로 규정되고; CD38int2 집단(단기 재증식 능력을 갖는 전구체-함유 분획)은 CD38 발현의 40-70% 범위를 갖는 것으로 규정되고; CD38+ 집단(유의한 재증식 능력이 실질적으로 결여된 전구 세포)은 CD38 발현의 70-100% 범위를 갖는 것으로 규정된다.
이들 세포 분획은 또한 필요에 따라 조합될 수 있다. 예를 들어, CD38int1 및 CD38int2 분획은 조합되어 CD38int 분획(CD38 발현의 약 10-70% 범위 내에 포함됨)을 형성할 수 있고; CD38int1, CD38int2 및 CD38+ 그룹은 조합되어 CD38low - intm -high(CD38int/+로도 언급됨) 분획(CD38 발현의 약 10-100% 범위, 예를 들어, 약 12-100% 또는 약 13-100% 범위 내에 포함됨)을 형성할 수 있다.
벡터
벡터는 한 환경으로부터 또 다른 환경으로의 존재물의 전달을 가능케 하거나 촉진하는 도구이다. 본 발명에 따르면, 예를 들어, 재조합 핵산 기술에서 사용되는 일부 벡터는 존재물, 예를 들어, 핵산의 세그먼트(예를 들어, 이종성 DNA 세그먼트, 예를 들어, 이종성 cDNA 세그먼트)가 표적 세포로 전달되는 것을 가능케 한다. 벡터는 세포 내에서 이종성 핵산(DNA 또는 RNA)을 유지시키거나, 핵산의 세그먼트를 포함하는 벡터의 복제를 촉진하거나, 핵산의 세그먼트에 의해 인코딩된 단백질의 발현을 촉진하는 목적으로 제공될 수 있다. 벡터는 비-바이러스 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 재조합 핵산 기술에서 사용되는 벡터의 예는 플라스미드, 염색체, 인공 염색체 및 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 또한, 예를 들어, 네이키드 핵산(예를 들어, DNA)일 수 있다. 이의 가장 간단한 형태에서, 벡터 자체는 관심 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있으며, 이는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절인자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 당 분야에 공지된 다양한 기술, 예를 들어, 형질전환 및 형질도입을 이용하여 세포로 도입될 수 있다. 여러 기술, 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 배큘로바이러스 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터를 이용한 감염, 핵산의 직접 주입 및 바이올리스틱(biolistic) 형질전환이 당 분야에 공지되어 있다.
비-바이러스 전달 시스템은 DNA 트랜스펙션 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 여기서, 트랜스펙션은 유전자를 표적 세포로 전달하기 위한 비-바이러스 벡터를 이용한 과정을 포함한다.
통상적인 트랜스펙션 방법은 전기천공, DNA 바이올리스틱, 지질-매개 트랜스펙션, 치밀 DNA-매개 트랜스펙션, 리포솜, 면역리포솜, 리포펙틴, 양이온성 작용제-매개 트랜스펙션, 양이온성 표면 양쪽성물질(CFA)(Nature Biotechnology 1996 14; 556) 및 이들의 조합을 포함한다.
또한, 본 발명은 유전자 표적화 프로토콜, 예를 들어, DNA-변형 작용제의 전달을 이용할 수 있다.
바이러스 벡터
한 구체예에서, 바이러스 벡터가 본 발명에서 이용된다.
또 다른 구체예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 벡터이다.
또 다른 구체예에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터
본 발명에서 이용되는 레트로바이러스 벡터는 임의의 적합한 레트로바이러스로부터 유래될 수 있거나, 임의의 적합한 레트로바이러스로부터 유래 가능해질 수 있다. 많은 수의 다양한 레트로바이러스가 확인되었다. 예로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 후지나미(Fujinami) 육종 바이러스(FuSV), 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스(Mo MLV), FBR 뮤린 골육종 바이러스(FBR MSV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨슨(Abelson) 뮤린 백혈병 바이러스(A-MLV), 조류 골수세포종 바이러스-29(MC29) 및 조류 적혈모구증 바이러스(AEV)를 포함한다. 레트로바이러스의 상세한 목록은 문헌[Coffin et al. (1997) "Retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763]에서 발견될 수 있다.
레트로바이러스는 2개의 부류, 즉, "단순" 및 "복합"으로 광범위하게 나누어질 수 있다. 레트로바이러스는 심지어 7개의 그룹으로 추가로 나누어질 수 있다. 이들 그룹 중 5개는 종양발생 잠재성을 갖는 레트로바이러스이다. 남아 있는 2개의 그룹은 렌티바이러스 및 스푸마바이러스이다. 이들 레트로바이러스의 개관은 문헌[Coffin et al (1997)]의 같은 장에 제시되어 있다.
레트로바이러스 및 렌티바이러스 유전체의 기본 구조는 많은 공통의 특징, 예를 들어, 5' LTR 및 3' LTR을 공유하며, 이들 사이 또는 내에 유전체가 패키징될 수 있도록 하는 패키징 신호, 프라이머 결합 부위, 숙주 세포 유전체로의 통합을 가능케 하는 통합 부위 및 패키징 성분을 인코딩하는 gag, pol 및 env 유전자가 위치되며, 이들은 바이러스 입자의 어셈블리에 필요한 폴리펩티드이다. 렌티바이러스는 HIV 내에 추가 특징, 예를 들어, rev 및 RRE 서열을 가지며, 이는 감염된 표적 세포의 핵으로부터 세포질로의 통합된 프로바이러스의 RNA 전사물의 효과적인 유출을 가능케 한다.
프로바이러스에서, 이들 유전자는 장 말단 반복(LTR)으로 언급되는 영역에 의해 둘 모두의 말단에 측접된다. LTR은 프로바이러스 통합 및 전사를 담당한다. LTR은 또한 인핸서-프로모터 서열로 작용하며, 바이러스 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
LTR 자신은 U3, R 및 U5로 언급되는 3개의 성분으로 나누어질 수 있는 동일한 서열이다. U3는 RNA의 3' 말단에 대해 독특한 서열로부터 유래된다. R은 RNA의 양 말단에서 반복된 서열로부터 유래되며, U5는 RNA의 5' 말단에 대해 독특한 서열로부터 유래된다. 3개 성분의 크기는 다양한 레트로바이러스 중에서 매우 다양할 수 있다.
결손 레트로바이러스 벡터 유전체에서, gag, pol 및 env는 부재하거나, 기능적이지 않을 수 있다. RNA의 양 말단에서 R 영역은 반복된 서열이다. U5 및 U3는 각각 RNA 유전체의 5' 및 3' 말단에서의 독특한 서열이다.
본 발명에서 사용되는 통상적인 레트로바이러스 벡터에서, 복제에 필수적인 하나 이상의 단백질 코딩 영역의 적어도 일부는 바이러스로부터 제거될 수 있다. 이는 바이러스 벡터를 복제-결손으로 만든다. 바이러스 유전체의 일부는 또한 벡터 유전체 내의 조절 제어 영역 및 리포터 모이어티에 작동 가능하게 연결된 모이어티를 조절하는 후보를 인코딩하는 라이브러리에 의해 대체되어 표적을 분열하지 않는 숙주 세포로 형질도입할 수 있고/있거나 이의 유전체를 숙주 유전체로 통합시킬 수 있는 모이어티를 조절하는 후보를 포함하는 벡터를 생성시킬 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터의 더 큰 그룹의 일부이다. 렌티바이러스의 상세한 목록은 문헌[Coffin et al (1997) "Retroviruses" Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763]에서 발견될 수 있다. 요컨대, 렌티바이러스는 영장류 및 비-영장류 그룹으로 나누어질 수 있다. 영장류 렌티바이러스의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 자가-면역결핍 증후군(AIDS)의 원인 작용제, 및 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비-영장류 렌티바이러스 그룹은 원형 "슬로우 바이러스" 비스나/매디 바이러스(VMV), 뿐만 아니라 관련 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV) 및 더욱 최근에 기재된 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 및 소 면역결핍 바이러스(BIV)를 포함한다.
렌티바이러스 패밀리는 렌티바이러스가 분열하는 세포 및 분열하지 않는 세포 둘 모두를 감염시키는 능력을 갖는 점에서 레트로바이러스와 상이하다(Lewis et al (1992) EMBO J 11(8):3053-3058 및 Lewis and Emerman (1994) J Virol 68 (1):510-516). 대조적으로, 다른 레트로바이러스, 예를 들어, MLV는 분열하지 않거나 느리게 분열하는 세포, 예를 들어, 근육, 뇌, 폐 및 간 조직을 구성하는 세포를 감염시킬 수 없다.
본원에서 사용되는 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래 가능한 적어도 하나의 성분 부분을 포함하는 벡터이다. 바람직하게는, 상기 성분 부분은 벡터가 세포를 감염시키거나, 유전자를 발현하거나, 복제되는 생물학적 메커니즘과 관련된다.
렌티바이러스 벡터는 "비-영장류" 벡터, 즉, 주로 영장류, 특히 인간을 감염시키지 않는 바이러스로부터 유래된 벡터일 수 있다.
비-영장류 렌티바이러스의 예는 영장류를 천연적으로 감염시키지 않는 렌티바이러스과 패밀리의 임의의 일원일 수 있으며, 이는 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 매디 비스나 바이러스(MVV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)를 포함할 수 있다.
바이러스 벡터는 EIAV로부터 유래될 수 있다. EIAV는 렌티바이러스의 가장 간단한 유전체 구조를 갖는다. gag, pol 및 env 유전자에 더하여, EIAV는 3개의 다른 유전자 tat, rev, 및 S2를 인코딩한다. Tat는 바이러스 LTR의 전사 활성제로 작용하고(Derse and Newbold (1993) Virology 194(2):530-536 및 Maury et al (1994) Virology 200(2):632-642), rev는 rev-반응 요소(RRE)를 통한 바이러스 유전자의 발현을 조절하고 조화시킨다(Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111). 이들 2개의 단백질의 작용 메커니즘은 영장류 바이러스에서의 유사한 메커니즘과 대체로 유사한 것으로 생각된다(Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111). S2의 기능은 공지되어 있지 않다. 또한, 막횡단 단백질의 시작시에 env 코딩 서열로 스플라이싱된 tat의 첫번째 엑손에 의해 인코딩되는 EIAV 단백질인 Ttm이 확인되었다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 바이러스 벡터는 최소 바이러스 유전체를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "최소 바이러스 유전체"는 관심 뉴클레오티드 서열로 표적 숙주 세포를 감염시키고, 이를 형질도입시키고, 이를 전달하는데 필요한 기능성을 제공하기 위해 필수 요소를 보존시키고 비-필수 요소를 제거하도록 바이러스 벡터가 조작된 것을 의미한다. 이러한 전략의 추가 세부사항은 WO 1998/017815호에서 발견될 수 있다.
그러나, 숙주 세포/패키징 세포 내에서 바이러스 유전체를 생성시키는데 사용되는 플라스미드 벡터는 숙주 세포/패키징 세포에서 유전체의 전사를 유도하기 위해 레트로바이러스 유전체에 작동 가능하게 연결된 전사 조절성 조절 서열을 포함할 것이다. 이들 조절성 서열은 전사된 레트로바이러스 서열과 관련된 천연 서열, 즉, 5' U3 영역일 수 있거나, 이들은 이종성 프로모터, 예를 들어, 또 다른 바이러스 프로모터, 예를 들어, CMV 프로모터일 수 있다. 일부 렌티바이러스 유전체는 효과적인 바이러스 생성을 위한 추가 서열을 필요로 한다. 예를 들어, 특히 HIV의 경우, rev 및 RRE 서열이 포함될 수 있다. 그러나, rev 및 RRE에 대한 필요조건은 코돈 최적화에 의해 감소되거나 제거될 수 있다. 이러한 전략의 추가 세부사항은 WO 2001/079518호에서 발견될 수 있다. rev/RRE 시스템과 동일한 기능을 수행하는 대안적 서열이 또한 공지되어 있다. 예를 들어, rev/RRE 시스템의 기능성 유사체가 메이슨 파이저(Mason Pfizer) 원숭이 바이러스에서 발견된다. 이는 항시적 운반 요소(CTE)로 공지되어 있으며, 이는 감염된 세포에서 인자와 상호작용하는 것으로 생각되는 유전체 내의 RRE-타입 서열을 포함한다. 세포 인자는 rev 유사체로서 생각될 수 있다. 따라서, CTE는 rev/RRE 시스템에 대한 대안으로 이용될 수 있다. 공지되어 있거나 이용가능하게 되는 임의의 다른 기능성 동등물이 본 발명과 관련될 수 있다. 예를 들어, HTLV-I의 Rex 단백질이 HIV-1의 Rev 단백질을 기능적으로 대체할 수 있는 것이 또한 공지되어 있다. Rev 및 RRE는 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 벡터에서 부재하거나 비-기능성일 수 있고, 대안적으로 rev 및 RRE는 존재할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 벡터는 바이러스 인핸서 및 프로모터 서열이 결실된 자가-비활성화(SIN) 벡터를 이용할 수 있다. SIN 벡터가 생성될 수 있고, 야생형 벡터의 효능과 유사한 효능으로 생체 내에서 분열하지 않는 세포를 형질도입시킨다. SIN 프로바이러스에서의 장 말단 반복(LTR)의 전사 비활성화는 복제-적격 바이러스에 의한 가동화를 방지해야 한다. 이는 또한 LTR의 임의의 시스-작용 효과를 제거함으로써 내부 프로모터로부터의 유전자의 조절된 발현을 가능케 해야 한다.
예를 들어, 자가-비활성화 레트로바이러스 벡터 시스템은 3' LTR의 U3 영역 내의 전사 인핸서 또는 인핸서 및 프로모터를 결실시킴으로써 작제되었다. 한 라운드의 벡터 역전사 및 통합 후, 이들 변화는 5' 및 3' LTR 둘 모두로 카피되어 전사적으로 비활성화 프로바이러스를 생성시킨다. 그러나, 상기 벡터 내의 LTR에 대해 내부의 임의의 프로모터(들)은 여전히 전사적으로 활성일 것이다. 이러한 전략은 내부적으로 위치된 유전자로부터의 전사시 바이러스 LTR 내의 인핸서 및 프로모터의 효과를 제거하기 위해 이용되었다. 상기 효과는 증가된 전사 또는 전사의 억제를 포함한다. 이러한 전략은 또한 3' LTR로부터 유전체 DNA로의 하류 전사를 제거하기 위해 이용될 수 있다. 이는 내인성 종양유전자의 우발성 활성화를 방지하는데 중요할 수 있는 인간 유전자 요법에서 특히 중요하다. 문헌[Yu et al., (1986) PNAS 83: 3194-98; Marty et al., (1990) Biochimie 72: 885-7; Naviaux et al., (1996) J. Virol. 70: 5701-5; Iwakuma et al., (1999) Virol. 261: 120-32; Deglon et al., (2000) Human Gene Therapy 11: 179-90].
복제하지 않는 렌티바이러스 벡터
복제-결손 렌티바이러스 벡터 유전체에서, gag, pol 및 env는 부재하거나 기능적이지 않을 수 있다.
본 발명에서 사용된 통상적인 렌티바이러스 벡터에서, 복제에 필수적인 하나 이상의 단백질 코딩 영역의 적어도 일부는 바이러스로부터 제거될 수 있다. 이는 바이러스 벡터를 복제-결손으로 만든다. 바이러스 유전체의 일부는 또한 표적의 분열하지 않는 숙주 세포를 형질도입시킬 수 있고/있거나 이의 유전체를 숙주 유전체로 통합시킬 수 있는 관심 뉴클레오티드(NOI)를 포함하는 벡터를 생성시키기 위해 NOI에 의해 대체될 수 있다.
한 구체예에서, 렌티바이러스 벡터는 WO 2007/071994호에 기재된 바와 같은 통합되지 않는 벡터이다.
렌티바이러스 벡터는 "비-영장류" 벡터, 즉, 영장류, 특히 인간을 주로 감염시키지 않는 바이러스로부터 유래되는 벡터일 수 있다.
아데노바이러스 벡터
본 발명의 또 다른 구체예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 아데노바이러스는 RNA 중간체를 통해 진행하지 않는 이중 가닥의 선형 DNA 바이러스이다. 유전학적 서열 상동성을 기초로 하여 6개의 하위그룹으로 나누어진 50개 초과의 다양한 아데노바이러스의 인간 혈청형이 존재한다. 아데노바이러스의 천연 표적은 호흡기 및 위장 상피이며, 이는 일반적으로 단지 약한 증상을 발생시킨다. 혈청형 2 및 5(95% 서열 상동성을 가짐)는 아데노바이러스 벡터 시스템에서 가장 흔히 사용되며, 이는 일반적으로 소아에서의 상기도 감염과 관련된다.
아데노바이러스는 외피 비보유의 규칙적 정20면체이다. 통상적인 아데노바이러스는 140 nm의 캡시드화된 DNA 바이러스를 포함한다. 바이러스의 정20면체 대칭은 152개의 캡소미어: 240개의 헥손 및 12개의 펜톤으로 구성된다. 입자의 코어는 DNA 복제를 위한 프라이머로 작용하는 말단 단백질(TP)과 5' 말단에서 공유적으로 회합되는 36 kb의 선형 듀플렉스 DNA를 함유한다. DNA는 역방위 말단 반복(ITR)을 가지며, 이들의 길이는 혈청형에 따라 다양하다.
아데노바이러스는 인간 및 비-인간 기원의 광범위한 세포 유형의 생체 내 및 시험관 내 형질도입이 가능하다. 이들 세포는 호흡기 기도 상피 세포, 간세포, 근육 세포, 심장 근육세포, 윤활막세포, 일차 유방 상피 세포 및 유사분열 후 말단 분화된 세포, 예를 들어, 뉴런을 포함한다.
아데노바이러스 벡터는 또한 분열하지 않는 세포를 형질도입시킬 수 있다. 이는 폐 상피 내의 감염된 세포가 느린 전환 속도를 갖는 질병, 예를 들어, 낭성섬유증에 대해 매우 중요하다. 실제로, 병에 걸린 성인 낭성섬유증 환자의 폐로의 낭성섬유증 전달체(CFTR)의 아데노바이러스-매개 전달을 이용하는 여러 시도가 진행 중이다.
아데노바이러스는 유전자 요법 및 이종성 유전자의 발현을 위한 벡터로 이용되었다. 큰(36 kb) 유전체는 8 kb 이하의 외래 삽입 DNA를 수용할 수 있고, 보충 세포주에서 효과적으로 복제하여 1012 이하의 매우 높은 역가를 발생시킬 수 있다. 따라서, 아데노바이러스는 일차 비-복제성 세포에서 유전자의 발현을 연구하기 위한 최고의 시스템 중 하나이다.
아데노바이러스 유전체로부터의 바이러스 또는 외래 유전자의 발현은 복제하는 세포를 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 수용체 매개 세포내이입에 의해 세포로 진입한다. 세포 내부 진입시, 아데노바이러스 벡터는 숙주 염색체로 드물게 통합된다. 대신, 이들은 숙주 핵 내에서 선형 유전체로서 에피솜으로(숙주 유전체와 독립적으로) 기능한다. 그러므로, 재조합 아데노바이러스의 사용은 숙주 유전체로의 무작위 통합과 관련된 문제를 경감시킨다.
아데노 -관련 바이러스 벡터
아데노-관련 바이러스(AAV)는 본 발명에서 사용하기에 매력적인 벡터 시스템인데, 이는 높은 빈도의 통합을 갖고, 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있기 때문이다. 이는 AAV를 조직 배양에서 포유동물 세포로의 유전자의 전달을 위해 유용하게 만든다. AAV는 감염력에 대해 넓은 숙주 범위를 갖는다. rAAV 벡터의 생성 및 사용에 관한 세부사항은 미국 특허 번호 5,139,941호 및 미국 특허 번호 4,797,368호에 기재되어 있다.
재조합 AAV 벡터는 마커 유전자 및 인간 질병과 관련된 유전자의 시험관 내 및 생체 내 형질도입을 위해 성공적으로 사용되어 왔다.
단순 헤르페스 바이러스 벡터
단순 헤르페스 바이러스(HSV)는 뉴런을 천연 감염시키는 외피 보유 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 이는 외래 DNA의 큰 섹션을 수용할 수 있고, 이는 HSV를 벡터 시스템으로서 매력적이게 만들고, 뉴런으로의 유전자 전달을 위한 벡터로 이용되어 왔다.
치료 절차에서의 HSV의 사용은 이들이 용해 주기를 확립할 수 없도록 상기 균주가 약화되는 것을 필요로 할 것이다. 특히, HSV 벡터가 인간에서의 유전자 요법을 위해 사용되는 경우, 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 필수 유전자로 삽입되어야 한다. 이는 벡터 바이러스가 야생형 바이러스와 조우하는 것이므로, 야생형 바이러스로의 이종성 유전자의 전달이 재조합에 의해 발생할 수 있다. 그러나, 폴리뉴클레오티드가 필수 유전자로 삽입되는 한, 이러한 재조합 전달은 또한 수용체 바이러스 내의 필수 유전자를 삭제할 것이며, 재조합 적격 야생형 바이러스 집단으로의 이종성 유전자의 "이탈(escape)"을 방지할 것이다.
관심 뉴클레오티드
본 발명에서 사용되는 벡터는 바람직하게는 관심 뉴클레오티드를 포함한다.
바람직하게는, 관심 뉴클레오티드는 치료 효과를 발생시킨다.
적합한 NOI는 효소, 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 항체, 항-산화 분자, 공학 처리된 면역글로불린-유사 분자, 단쇄 항체, 융합 단백질, 면역 공동-자극성 분자, 면역조절성 분자, 항-센스 RNA, 마이크로RNA, shRNA, siRNA, 리보자임, miRNA 표적 서열, 표적 단백질의 트랜스도메인(transdomain) 음성 돌연변이, 독소, 조건 독소, 항원, 종양 억제인자 단백질, 성장 인자, 전사 인자, 막 단백질, 표면 수용체, 항암 분자, 혈관작용 단백질 및 펩티드, 항-바이러스 단백질 및 리보자임, 및 이들의 유도체(예를 들어, 관련된 리포터 그룹을 갖는 유도체)를 인코딩하는 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. NOI는 또한 프로드러그 활성화 효소를 인코딩할 수 있다.
NOI의 한 예는 지중해빈혈/낫적혈구병의 유전자 요법에 사용될 수 있는 베타-글로빈 사슬이다.
NOI는 또한 골수양 계통에서 긴급하지 않은/선택 유전자 교정을 필요로 하는 다른 질병, 예를 들어, 만성육아종병(CGD, 예를 들어, gp91phox 트랜스진), 백혈구 부착 결손, 진행성 중증 감염이 없는 환자에서의 다른 포식세포 장애 및 유전성 골수 기능부진 증후군(예를 들어, 판코니 빈혈) 뿐만 아니라 원발성 면역결핍(SCID)의 치료에 유용한 것을 포함한다.
지지 세포 집단
고도로 정제된 HSC가 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터에 의해 유의하게 더욱 형질전환가능하다는 본 발명의 예기치 않은 발견은 본 발명자로 하여금 HSC 유전자 요법 프로토콜의 근본적으로 새로운 설계를 평가하도록 촉구시켰다. 새로운 프로토콜은 HSC-농축 분획(예를 들어, CD34+ 세포와 관련하여 농축된 HSC 함량을 갖는 치료 세포 집단) 및 전구체 함유 분획(지지 세포 집단)으로의 시작 세포 집단(예를 들어, 가동화된 말초 혈액, 골수 또는 제대혈로부터 획득된 것)의 분리를 포함한다. 전구체 함유 분획은 생체 외 조작이 없이 동결될 수 있고, 이는 골수절제식 조건화 후에 혈액학적 회복을 부스팅시키기 위해 대상체에 주입될 수 있다. 고도로 정제된 HSC 함유 분획은 본원에 기재된 바와 같은 "최소" 생체 외 배양을 이용하여 형질도입될 것이며, 이는 표준 CD34+ 세포 형질도입 프로토콜과 관련하여 배양 시간 및 벡터 용량을 감소시킨다.
본 발명의 한 구체예에서, 분리된 CD38-발현 세포 또는 CD38-반응성 세포 또는 이들의 일부는 유지되어 지지 세포 집단을 형성한다. 이러한 집단은 CD38int1, CD38int2 및/또는 CD38+ 분획을 포함할 수 있다.
치료 및/또는 지지 세포 집단은 이후의 이식 전에 저장을 촉진하기 위해 이들의 제조 후에 동결될 수 있다. 지지 세포 집단이 치료 세포 집단을 제조하기 위한 방법의 초기 단계에서 분리됨에 따라, 이는 분리 후, 바람직하게는 분리 직후에 가능한 한 신속히 동결되어야 하는 것이 바람직하다. 생활력을 유지시키기 위해 세포를 동결시키는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
동결된 세포는 사용을 위해 필요한 경우, 예를 들어, 대상체로의 투여를 위해 해동될 수 있다.
세포 형질도입
벡터를 이용한 세포 집단의 형질도입은 세포가 벡터에 노출되는 배양의 두번째 단계 전에 예비-자극 단계를 이용할 수 있다. 예비-자극 단계 동안, 세포는, 예를 들어, 줄기 세포 인자(SCF), FLT3 리간드(FLT3L) 및 트롬보포이어틴(thrombopoietin)(TPO), 및 임의로 IL3, IL6, IL11, M-CSF, FGF-1, IGF-2, IGFBP2, ANGPTL3 또는 5를 포함하는 배양 배지에서 배양될 수 있다.
세포의 집단은, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 치료 세포 집단, CD34+CD38- 세포의 집단, 조혈 줄기 세포의 집단 또는 조혈 전구 세포의 집단일 수 있다.
바람직하게는, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
하기 기재되는 표준 또는 단기 프로토콜은 본원에 기재된 방법 동안 수행될 수 있다. 그러나, 표준 및 단기 프로토콜 둘 모두가 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 이용하여 세포의 집단을 형질도입시키는 임의의 방법 동안 수행될 수 있음이 또한 인지될 것이다. 이는 본 발명에 대한 추가 양태를 제공한다.
벡터를 이용한 세포 집단의 형질도입은 세포가 대상체로의 투여 전에 44시간 이상의 배양을 겪는 표준 프로토콜을 이용하여 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 벡터를 이용하여 세포 집단을 형질도입시키는 단계가 약 44시간 이상 동안 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법("표준" 프로토콜)을 제공한다. "벡터를 이용하여 세포 집단을 형질도입시키는 단계"는 예비-자극 및 벡터 노출 단계로 이해되어야 한다.
예를 들어, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 44-66시간, 44-60시간, 44-54시간 또는 44-48시간 동안 배양될 수 있다. 한 구체예에서, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 66, 60, 54, 48 또는 44시간 동안 배양된다.
그러나, 본 발명자는 배양 시간이 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 둘 모두의 기능성 생착 능력에 부정적으로 영향을 미치는 것을 밝혀내었다. 따라서, 본 발명자는 생착에서의 개선과 형질도입 효율에서의 상응하는 감소의 균형을 맞춘 단기 형질도입 프로토콜을 개발하였다.
따라서, 본 발명은 벡터를 이용하여 세포 집단을 형질도입시키는 단계가 세포를 약 44시간 미만 동안 배양하는 것을 포함하는 방법("단기" 프로토콜)을 제공한다.
예를 들어, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 12-42시간, 12-36시간, 12-24시간 또는 12-18시간 동안 배양될 수 있다. 한 구체예에서, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 42, 36, 30, 24, 18 또는 12시간 동안 배양된다. 바람직하게는, 세포 집단은 벡터를 이용한 형질도입 단계 동안 약 24시간 동안 배양된다.
표준 또는 단기 프로토콜에서, 예비-자극 단계는, 예를 들어, 약 12, 14, 16, 18 또는 22시간 기간일 수 있다. 바람직하게는, 예비-자극 단계는 약 16시간 기간이다.
표준 또는 단기 프로토콜에서, 벡터 노출 단계는, 예를 들어, 약 8, 10, 12, 14 또는 16시간 기간일 수 있다. 바람직하게는, 벡터 노출 단계는 약 8시간 기간이다.
표준 또는 단기 프로토콜에서, 벡터를 이용하여 세포 집단을 형질도입시키는 단계는 대상체로의 세포의 투여 전 예비-자극 및 벡터 노출 단계를 반복하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 예비-자극 후, 벡터 노출 후, 두번째 예비-자극 단계 후, 두번째 벡터 벡터 노출 단계를 겪을 수 있다.
바람직하게는, 벡터를 이용하여 세포 집단을 형질도입시키는 단계 동안 세포 배양 배지는 IL3을 포함하지 않는다.
프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체(예를 들어, 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2(dmPGE2))이 예비-자극 단계 동안 세포의 집단에 첨가될 수 있다. 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체가 예비-자극 단계 시작 시에, 또는 예비-자극 단계 동안 첨가될 수 있다. 예를 들어, 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체가 벡터에 대한 세포 집단의 노출 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12시간 전에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체가 벡터에 대한 세포의 노출 약 2시간 전에 예비-자극 단계 동안 세포 집단에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체가 벡터에 대한 노출과 동시에 세포 집단에 첨가된다.
바람직한 형질도입 프로토콜은 실시예 8에 기재되어 있다.
약학적 조성물
본 발명은 본 발명의 치료 세포 집단 및/또는 지지 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 세포는 대상체로의 투여를 위해 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제형화될 수 있다. 적합한 담체 및 희석제는 등장성 염수 용액, 예를 들어, 인산염-완충 염수를 포함하고, 잠재적으로 인간 혈청 알부민을 함유한다.
세포 치료 생성물의 취급은 바람직하게는 세포 치료를 위한 FACT-JACIE 국제 표준에 따라 수행된다.
조혈 줄기 세포 이식
본 발명은 의약에서 사용하기 위한, 예를 들어, 유전자 요법에서 사용하기 위한 치료 세포 집단을 제공한다.
상기 사용은 조혈 줄기 세포 이식 절차의 일부일 수 있다.
조혈 줄기 세포 이식(HSCT)은 골수(이 경우에는 골수 이식으로 공지됨) 또는 혈액으로부터 유래된 혈액 줄기 세포의 이식이다. 줄기 세포 이식은 혈액 또는 골수의 질병, 또는 특정 유형의 암을 갖는 사람에 대해 가장 흔히 수행되는 혈액학 및 종양학 분야에서의 의학적 절차이다.
HSCT의 많은 수용자는 화학요법을 이용한 연장된 치료로부터 이익을 얻지 못하거나 화학요법에 대해 이미 내성인 다발골수종 또는 백혈병 환자이다. HSCT에 대한 후보는 환자가 선천 결함, 예를 들어, 결함이 있는 줄기 세포를 갖는 중증 복합 면역결핍 또는 선천성 중성구감소증을 갖는 소아 환자, 및 또한 출생 후에 줄기 세포를 상실한 재생불량빈혈을 갖는 아동 또는 성인을 포함한다. 줄기 세포 이식으로 치료되는 다른 질환은 낫적혈구병, 골수형성이상증후군, 신경모세포종, 림프종, 유잉육종, 섬유조직형성 소 원형 세포 종양 및 호지킨병을 포함한다. 더욱 최근에는, 더 적은 선량의 예비 화학요법 및 방사선을 필요로 하는 비-골수절제식 또는 소위 "미니 이식(mini transplant)" 절차가 개발되었다. 이는 HSCT가 통상적인 치료 요법에 견디기에는 너무 약한 것으로 달리 간주되는 노인 및 다른 환자에서 수행되는 것을 가능케 한다.
본 발명의 한 구체예에서, 치료 세포 집단은 본 발명의 지지 세포 집단과 함께 투여된다.
한 구체예에서, 본 발명의 치료 세포 집단 및/또는 지지 세포 집단은 자가 줄기 세포 이식 절차의 일부로서 투여된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 치료 세포 집단 및/또는 지지 세포 집단은 동종이형 줄기 세포 이식 절차의 일부로서 투여된다.
자가 줄기 세포 이식 절차는 세포의 시작 집단(치료 및/또는 지지 세포 집단이 유래됨)이 치료 및/또는 지지 세포 집단이 투여되는 대상체와 동일한 대상체로부터 획득되는 것으로 이해되어야 한다. 이전에 논의된 바와 같이, 자가 이식 절차가 유리한데, 이는 이들이 면역학적 부적합과 관련된 문제를 회피하고, 유전학적으로 매치된 공여체의 이용가능성과 관계가 없는 대상체에 이용 가능하기 때문이다.
동종이형 줄기 세포 이식 절차는 세포의 시작 집단(치료 및/또는 지지 세포 집단이 유래됨)이 치료 및/또는 지지 세포 집단이 투여되는 대상체와 상이한 대상체로부터 획득되는 것으로 이해되어야 한다. 바람직하게는, 공여체는 면역학적 부적합의 위험을 최소화시키기 위해 세포가 투여되는 대상체와 유전학적으로 매치될 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 치료 세포 집단은 지지 세포 집단의 투여 전에 대상체에 투여된다.
치료 세포 집단은, 예를 들어, 지지 세포 집단의 투여 약 1-72, 12-60 또는 24-48시간 전, 예를 들어, 지지 세포 집단의 투여 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 60 또는 72시간 전에 대상체에 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 치료 세포 집단은 지지 세포 집단의 투여와 동시적으로 또는 동시에 대상체에 투여된다.
치료 및 지지 세포 집단의 적합한 용량은 치료적 및/또는 예방적으로 효과적인 용량이다. 투여되는 용량은 대상체 및 치료되는 질환에 좌우될 수 있고, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
지지 세포 집단 내의 CD34+CD38+ 세포의 가능한 용량은 kg 당 약 400만 내지 500만 개의 세포일 수 있다. 이러한 용량은 골수절제식 조건화 후에 알맞은 단기 생착을 보장해야 한다.
따라서, 본 발명의 지지 세포 집단이 CD34+ 세포에 대해 농축되지 않음에 따라, 지지 세포 집단의 가능한 표적 용량은 kg 당 약 5000만 내지 10억 개의 CD38+ 유핵 세포, 예를 들어, kg 당 약 1억 개의 세포(5%의 CD34+ 세포 농도로 추정함)일 수 있다. 예를 들어, 가동화된 말초 혈액으로부터 유래된 세포의 가능한 용량은 kg 당 약 1억 내지 5억 개의 세포일 수 있는 한편, 골수로부터 유래된 세포의 가능한 용량은 kg 당 약 5000만 내지 2억 개의 세포일 수 있다.
치료 세포 집단의 가능한 용량은 kg 당 약 10만 내지 200만 개의 세포, 예를 들어, kg 당 약 50만 내지 100만 개의 세포일 수 있다.
치료:지지 세포 집단의 전체 비는 임상적 상황 및 지지 세포 집단이 제조되는 방식에 좌우된다. 지지 세포 집단이 사전 CD34 농축 없이 CD38 선택(예를 들어, 백혈구성분채집술 또는 골수 수거)에 의해 제조되는 경우, 치료:지지 세포 집단의 전체 비는 약 1:100-1:1000, 예를 들어, 약 1:500 또는 1:100일 수 있다. 내부에 함유한 CD34+ 세포의 절대 수를 기초로 하여 지지 세포 집단을 투여(CD34+ 예비-농축이 수행되거나 수행되지 않건 간의 여부와 독립적임)하는 것이 바람직하다.
한 구체예에서, 대상체가 골수절제식 조건화를 겪는 경우, 세포의 용량은 지지 세포 집단에서 투여되는 CD34+ 세포의 수가 약 5-15x이고, 바람직하게는 치료 세포 집단에서 투여되는 CD34+ 세포의 수가 5-10x가 되도록 조정될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 대상체에 투여되는 CD34+CD38- 세포 대 배양되지 않은 CD34+CD38+ 전구 세포의 비는 약 1:10 또는 1:5일 수 있다.
투여되는 지지 세포 집단은 환자 체중 kg 당 약 250만 내지 300만 개의 CD34+ 세포의 최소 절대수를 포함할 수 있다.
대상체가 골수절제식 조건화를 겪지 않는 경우, 치료 세포 집단은 대상체에 단독으로 투여(즉, 지지 세포 집단이 필요하지 않을 수 있음)될 수 있다.
본 발명의 치료 및/또는 지지 세포 집단은 WO 1998/005635호에 나열된 장애의 치료에서 유용할 수 있다. 참조의 용이성을 위해, 상기 목록의 일부가 이제 제공된다: 암, 염증 또는 염증 질병, 피부과 장애, 열, 심장혈관 효과, 출혈, 응고 및 급성기 반응, 악액질, 식욕부진, 급성 감염, HIV 감염, 충격 상태, 이식편대숙주 반응, 자가면역병, 재관류 손상, 수막염, 편두통 및 아스피린-의존성 항혈전증; 종양 성장, 침범 및 확산, 혈관형성, 전이, 악성, 복수 및 악성 흉막 삼출; 대뇌 허혈, 허혈성 심장 질환, 골관절염, 류마티스 관절염, 골다공증, 천식, 다발성 경화증, 신경변성, 알츠하이머병, 죽상경화증, 뇌졸중, 혈관염, 크론병 및 궤양성 대장염; 치주염, 치은염; 건선, 아토피성 피부염, 만성 궤양, 표피 박리증; 각막 궤양, 망막병증 및 수술 상처 치유; 비염, 알레르기 결막염, 습진, 아나필락시스; 재협착, 울혈성 심부전, 자궁내막증, 동맥경화증 또는 엔도스클러로시스(endosclerosis).
또한, 또는 대안적으로, 본 발명의 치료 및/또는 지지 세포 집단은 WO 1998/007859호에 나열된 장애의 치료에서 유용할 수 있다. 참조의 용이성을 위해, 상기 목록의 일부가 이제 제공된다: 사이토카인 및 세포 증식/분화 활성; 면역억제 또는 면역자극 활성(예를 들어, 인간 면역 결핍 바이러스에 의한 감염을 포함하는 면역 결핍 치료; 림프구 성장의 조절; 암 및 많은 자가면역병의 치료, 및 이식 거부 방지 또는 종양 면역 유도를 위함); 조혈의 조절, 예를 들어, 골수양 또는 림프양 질병의 치료; 뼈, 연골, 힘줄, 인대 및 신경 조직의 촉진, 예를 들어, 상처 치유, 화상, 궤양 및 치주병 및 신경변성 치유를 위함; 난포-자극 호르몬의 억제 또는 활성화(생식능력의 조절); 화학주성/화학운동성 활성(예를 들어, 손상 또는 감염 부위에 특정 세포 유형을 가동화시키기 위함); 지혈 및 혈전용해 활성(예를 들어, 혈우병 및 뇌졸중을 치료하기 위함); 항염증 활성(예를 들어, 패혈 쇼크 또는 크론병을 치료하기 위함); 항미생물제; 예를 들어, 대사 또는 거동의 조정자; 진통제; 특정 결핍 장애 치료; 예를 들어, 인간 또는 수의 의학에서의 건선의 치료.
또한, 또는 대안적으로, 본 발명의 치료 및/또는 지지 세포 집단은 WO 1998/009985호에 나열된 장애의 치료에서 유용할 수 있다. 참조의 용이성을 위해, 상기 목록의 일부가 이제 제공된다: 대식세포 억제 및/또는 T 세포 억제 활성 및 이에 따른 항염증 활성; 항-면역 활성, 즉, 염증과 관련되지 않은 반응을 포함하는 세포성 및/또는 체액성 면역 반응에 대한 억제 효과; 세포외 기질 성분 및 섬유결합소에 부착하는 대식세포 및 T 세포의 능력 억제 뿐만 아니라 T 세포에서의 상향조절된 fas 수용체 발현; 원치 않는 면역 반응 및 염증, 예를 들어, 관절염, 예를 들어, 류마티스 관절염, 과민성, 알레르기 반응, 천식, 전신 홍반 루푸스, 콜라겐 질환 및 다른 자가면역 질환과 관련된 염증, 죽상경화증, 동맥경화증, 죽상경화성 심장병, 재관류 손상, 심장 정지, 심근경색증, 혈관 염증성 장애, 호흡 곤란 증후군 또는 기타 심폐 질환과 관련된 염증, 소화 궤양, 궤양대장염 및 위장관의 다른 질환, 간섬유증, 간경화증 및 다른 간 질환, 갑상샘염 또는 다른 샘의 질환, 사구체신염 또는 다른 신장 및 비뇨기 질환, 중이염 또는 다른 이비인후과 질환, 피부염 또는 다른 피부 질환, 치주병 또는 다른 치과 질환, 고환염 또는 부고환고환염, 불임, 고환 외상 또는 다른 면역-관련 고환 질환, 태반 기능이상, 태반 기능부전, 습관유산, 자간증, 자간전증 및 다른 면역 및/또는 염증-관련 부인과 질환, 후방 포도막염, 중간 포도막염, 전방 포도막염, 결막염, 맥락망막염, 포도막망막염, 시신경염, 안구내 염증, 예를 들어, 망막염 또는 낭포 황반부종, 교감 안염, 공막염, 색소성 망막염과 관련된 염증, 퇴행성 퐁듀병(degenerative fondus disease)의 면역 및 염증 성분, 눈 외상의 염증 성분, 감염, 증식 유리체망막병증, 급성 허혈성 시신경병증, 과도한 흉터형성, 예를 들어, 녹내장 여과 수술 후 과도한 흉터형성에 의해 야기된 안구 염증, 안구 이식 및 다른 면역 및 염증-관련 안구 질환에 대한 면역 및/또는 염증 반응, 중추신경계(CNS) 또는 임의의 다른 기관 둘 모두에서의 자가면역 질병 또는 질환 또는 장애와 관련된 염증, 이로울 수 있는 면역 및/또는 염증 억제, 파킨슨병, 파킨슨병의 치료로부터의 합병증 및/또는 부작용, AIDS-관련 치매 복합 HIV 관련 뇌병증, 데빅병, 시덴함 무도병, 알츠하이머병 및 CNS의 다른 퇴행성 질병, 질환 또는 장애, 뇌졸증의 염증 성분, 소아마비 후 증후군, 정신과 질환, 척수염, 뇌염, 아급성 경화성 범뇌염, 뇌척수염, 급성 신경병증, 아급성 신경병증, 만성 신경병증, 길랑-바레 증후군, 시덴함 무도병, 중증근육무력증, 가성뇌종양, 다운증후군, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증의 면역 및 염증 성분, CNS 압박 또는 CNS 외상 또는 CNS의 감염의 염증 성분, 근위축 및 근육퇴행위축의 염증 성분, 및 중추신경계 및 말초신경계의 면역 및 염증 관련 질병, 질환 또는 장애, 외상후 염증, 패혈 쇼크, 감염성 질병, 수술, 골수 이식의 염증성 합병증 또는 부작용 또는 다른 이식 합병증 및/또는 부작용, 예를 들어, 바이러스 담체에 의한 감염으로 인한 유전자 요법의 염증성 및/또는 면역 합병증 및 부작용, 또는 AIDS와 관련된 염증 억제, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 억제 또는 저해, 천연 또는 인공 세포, 조직 및 기관, 예를 들어, 각막, 골수, 기관, 렌즈, 페이스메이커(pacemaker), 천연 또는 인공 피부 조직의 이식의 경우에서의 이식 거부의 예방 및/또는 치료를 위해 단핵구 또는 림프구의 양의 감소에 의한 단핵구 또는 백혈구 증식 질병, 예를 들어, 백혈병의 치료 또는 개선.
키트
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 치료 및 지지 세포 집단을 포함하는 키트를 제공한다.
치료 및 지지 세포 집단은 적합한 용기 내에 제공될 수 있다.
키트는 또한 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
조혈 전구 세포 이식
본 발명은 유전자 요법에서 사용하기 위한 조혈 전구 세포를 제공하며, 조혈 전구 세포 집단은 관심 뉴클레오티드로 형질도입된 것이다.
본 발명자가 제시한 바와 같이, 상기 전구 세포는 단기 생착을 제공한다. 따라서, 상기 유전자 요법은 대상체에서 비-영구적 효과를 제공할 것이다. 예를 들어, 상기 효과는 형질도입된 조혈 전구 세포의 투여 후 1-6개월로 제한될 수 있다. 상기 접근법의 장점은 치료적 개입의 자기-한정 특성으로 인한 더 나은 안전성 및 용인성일 것이다.
따라서, 본 발명자는 유전자-변형된 세포의 지속성을 맞춤화시킬 수 있다(실시예 3 참조). 예를 들어, 하기와 같이 관심 뉴클레오티드의 발현이 요망되는 기간에 따라 다양한 조건의 치료를 위해 다양한 세포 집단이 투여될 수 있음이 예견된다:
1. 장기: 유전 질병의 치료를 위한 CD34+CD38- 세포(예를 들어, 0-10% 백분위수);
2. 중기: 약 3-4개월의 치료 기간(예를 들어, 항암 단백질의 미세환경 표적화된 전달을 위함)을 위한 CD34+CD38int /lo 세포(예를 들어, 12-40% 백분위수);
3. 단기: 약 1-2개월의 치료 기간(예를 들어, 항암 단백질의 미세환경 표적화된 전달을 위함)을 위한 CD34+CD38+/ int 세포(예를 들어, 41-70% 백분위수).
또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 요법에서 사용하기 위한 조혈 전구 세포 집단을 제공하며, 상기 세포는 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 포함하는 세포의 집단으로부터 분리된 후, 관심 뉴클레오티드로 형질되입된 것이다.
상기 조혈 전구 세포 유전자 요법은 후천 장애, 예를 들어, 암의 치료를 위해 적합화될 수 있으며, 여기서 (잠재적으로 독성의) 관심 항암 뉴클레오티드의 시간-제한된 발현은 상기 질병을 근절시키기에 충분할 수 있다.
조혈 전구 세포 유전자 요법에서의 적용에 특히 적합한 관심 뉴클레오티드는, 예를 들어, 인터페론-알파2b, 다른 타입-1 인터페론, 다른 면역-자극 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-12), 아폽토시스-유도 트랜스진, 예를 들어, TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL) 및 종양 미세환경-파괴 인자를 포함한다.
한 구체예에서, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int 표현형을 가지며, 예를 들어, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int 표현형에 대해 농축된 것이다.
CD34+CD38int 표현형을 갖는 세포의 집단은 흐름세포측정법 방법을 이용하여 분리될 수 있다. 조혈 전구 세포의 CD38int 집단은 흐름세포측정법에 의해 결정시 CD38 발현의 10-70% 범위 내로 함유될 수 있다(예를 들어, 실시예 3 및 도 4 참조 - 여기서 CD38int 집단은 CD38int1 및 CD38int2로 추가로 분리되었다). 조혈 줄기 세포는 CD38 발현의 0-10% 범위 내로 함유될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형을 가지며, 예를 들어, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형에 대해 농축된 것이다. 따라서, 예를 들어, 전구 세포 집단은 실질적으로 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 세포를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 형질도입된 전구 세포 집단은 조혈 줄기 세포, 예를 들어, 변형되지 않은 조혈 줄기 세포의 집단과 함께 투여된다. 조혈 줄기 세포는 CD34+CD38- 표현형을 가질 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 요법에서 사용하기 위한 CD34+CD38int 표현형을 갖는 세포의 집단, 예를 들어, CD34+CD38int 표현형을 갖는 세포에 대해 농축된 세포의 집단을 제공하며, 상기 세포 집단은 관심 뉴클레오티드로 형질도입된 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 요법에서 사용하기 위한 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형을 갖는 세포의 집단, 예를 들어, CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형을 갖는 세포에 대해 농축된 세포의 집단을 제공하며, 상기 세포 집단은 관심 뉴클레오티드로 형질도입된 것이다. 따라서, 예를 들어, 전구 세포 집단은 실질적으로 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 세포를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 요법에서 사용하기 위한 조혈 전구 세포 집단을 제공하며, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int 표현형을 가지며(예를 들어, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int 표현형에 대해 농축된 것이며), 관심 뉴클레오티드로 형질도입된 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 요법에서 사용하기 위한 조혈 전구 세포 집단을 제공하며, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형을 가지며(예를 들어, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형에 대해 농축된 것이며), 관심 뉴클레오티드로 형질도입된 것이다. 따라서, 예를 들어, 전구 세포 집단은 실질적으로 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 세포를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 임상적 사용을 위한 조혈 전구 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 포함하는 세포의 집단으로부터 조혈 전구 세포의 집단을 분리하고, 분리된 세포 집단을 관심 뉴클레오티드로 형질도입시키는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int 표현형을 가지며, 예를 들어, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int 표현형에 대해 농축된 것이다.
또 다른 구체예에서, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형을 가지며, 예를 들어, 조혈 전구 세포 집단은 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형에 대해 농축된 것이다. 따라서, 예를 들어, 전구 세포 집단은 실질적으로 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 세포를 포함할 수 있다.
치료 방법
본 발명의 상황에서 예방에 대한 언급은 예방적 치료와 더욱 일반적으로 관련되나, 치료에 대한 본원의 모든 언급은 치료적, 완화적 및 예방적 치료를 포함하는 것이 인지되어야 한다. 포유동물, 특히 인간의 치료가 바람직하다. 인간 및 수의 치료 둘 모두가 본 발명의 범위 내이다.
프로스타글란딘
조혈 줄기 또는 전구 세포를 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터로 형질도입시키는 경우 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체가 유전자 전달 효율을 증가시키기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 프로스타글란딘 E2 유도체는 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2이다.
유도체는 조혈 줄기 세포를 벡터로 형질도입시키는 경우 프로스타글란딘 E2가 유전자 전달 효율을 증가시키는 이의 기능을 여전히 보유하면서, 바람직하게는 안정성 및 활성과 같은 특성을 개선시키기 위해 당 분야에 공지된 다수의 기술 중 임의의 기술에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다.
프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체가 본원에 기재된 양태 및 구체예 중 임의의 양태 및 구체예에서 프로스타글란딘 수용체 효능제, 예를 들어, EP4 수용체에 대해 작용하는 소분자 약물로 치환될 수 있음이 또한 예견된다.
실시예
실시예 1
고도로 정제된 HSC는 렌티바이러스 벡터에 의해 더욱 형질도입 가능하다.
본 발명자는 조혈 줄기 및 전구 세포 집단에 대한 마이크로RNA의 차별적 효과를 연구하였다. 이 때문에, CD34+CD38- 및 CD34+CD38+ 제대혈 HSPC를 렌티바이러스 miRNA 스폰지 또는 과발현 벡터로 형질도입시켰다(데이터는 제시하지 않음). 예기치 않으며, 당 분야에서 널리 추정되는 것과 반대로, 본 발명자는 더욱 원시적인 CD34+CD38- HSC-농축된 서브셋으로의 1.5배 증가된 유전자 전달을 인지하였다. 본 발명자는 마커 유전자를 발현하는 생물학적 중성 벡터를 이용하여 다수의 제대혈 및 성체 골수 공여체에 대해 상기 관찰을 독립적으로 확인하였으며, 이는 벌크 CD34+ 또는 CD34+CD38+ 세포 형질도입에 비해 분류된 CD34+CD38- HSC-농축된 분획으로의 1.5 내지 2배 증가된 유전자 전달 효율을 입증한다(도 1(A)).
벌크 CD34+ HSPC는 CD38- 세포의 작은 서브셋을 함유하므로, 본 발명자는 더욱 원시적인 세포의 상기 증가된 형질도입능이 또한 벌크 배양물 내에서 유지되는지의 여부, 또는 상기 효과를 관찰하기 위해 예비-분류가 필요한지의 여부를 시험하고자 하였다. 따라서, 본 발명자는 분류-LV 프로토콜(먼저 CD38 부분모집단의 분류 후, 예비-자극 24시간 후의 렌티바이러스 벡터 형질도입)과 LV-분류 프로토콜(24시간 예비-자극 후, 렌티바이러스 벡터 형질도입, 및 형질도입 24시간 후의 CD38 부분모집단의 분류)의 병행 비교를 하였다. CD38- 세포의 증가된 형질도입이 또한 LV-분류 그룹에서 명백했던 한편, 상기 효과는 분류가 형질도입 전에 수행된 경우 유의하게 더 컸다(도 1(A)).
따라서, 고도로 정제된 HSC-농축된 부분모집단에 대한 작업은 형질도입과 관련하여 명백한 장점을 제공한다.
본 발명자는 벌크 CD34+ 세포와 반대되는 예비-정제된 CD34+CD38- HSPC로의 증가된 유전자 전달이 이종이식 후에 생체 내에서 유지되는 것을 확인하였다(도 1(B)). 이들 데이터는 상기 효과가 조혈 줄기 세포의 수준에서 발생하며, 유전자 요법을 받는 환자에서 장기간 지속될 수 있음을 암시한다.
실시예 2
CD38 및 CD34 각각에 대한 비드 -기반의 순차적 음성/양성 선택은 우수한 NSG 생착 잠재성을 갖는 세포의 정제를 가능케 한다.
CD38 및 CD34 각각에 대한 비드-기반의 순차적 음성/양성 선택의 실행가능성을 시험하기 위해, 본 발명자는 인간 제대혈 단핵 세포에 상업적으로 이용 가능한 CD38 선택 키트를 적용시켰고, 경쟁적 이식에 의해 NSG 마우스에서 CD38-(양성 선택에 의해 CD34에 대해 추가로 농축됨) 및 CD38+ 분획의 생착 잠재성을 시험하였다(도 2). 본 발명자는 1세대의 최적화되지 않은 선택 프로토콜을 이용하였으나, 본 발명자는 CD38- 분획에 대한 생착 장점을 명백히 입증할 수 있었다. CD38- 세포는 이식의 20% 미만을 구성하였으나, 장기간 생착의 70-80%가 이러한 분획으로부터 유래되었으며, 이는 상기 정제 프로토콜의 추가 최적화의 동기를 제공하였다.
실시예 3
NSG 마우스에서의 분할 이식 모델링
유전적으로 변형된 장기간 재증식 세포와 단기 전구 세포의 공동-이식을 모델링하기 위해, 본 발명자는 한 세트의 형광 단백질 발현 렌티바이러스 벡터(LV)를 이용하여 줄기 세포 농축 분획 및 다양한 전구 세포 분획을 차별적으로 표시하고, 경쟁적 및 비-경쟁적 환경 둘 모두에서 NSG 마우스에서 생착 동역학을 연구하였다.
먼저, CD34+ 성체 골수 HSPC를 CD34+CD38-(+/-) 및 CD34+CD38hi(+/hi) 세포로 분류하고, 16시간 동안 SCF(300 ng/mL), Flt3L(300　ng/mL), TPO(100 ng/mL), IL6(60 ng/mL) 및 dmPGE2(10 μM)를 함유하는 Stem Span SFEM에서 예비-자극시키고, GFP-LV(+/-) 또는 OFP-LV(+/hi)로 형질도입시켰다. 형질도입 24시간 후, 세포를 하기와 같이 8주령의 치사량에 가깝게 방사선 조사된 NSG 마우스에 주입하였다:
그룹 1: 마우스(n=3) 당 27,000 +/- 세포;
그룹 2: 마우스(n=3) 당 248,000 +/hi 세포;
그룹 3: 마우스(n=3) 당 27,000 +/- 및 248,000 +/hi 세포.
생착(그룹 1, 2, 3) 및 키메라현상(그룹 3)이 말초 혈액에서 시간 경과에 따라 모니터되었고, 조혈 기관이 이식 18주 후에 분석되었다(도 3).
본 발명자는 CD34+/CD38hi 세포가 이식 3주 후의 단기에서조차도 마우스에서 생착되지 않은 것을 발견하였다. 그룹 3에서, 본 발명자는 OFP-양성 CD34+/CD38hi 세포와 GFP-양성 CD34+/CD38- 세포를 혼합하였고, 본 발명자는 표시된 조혈 부분모집단(HSC: CD34+CD38-CD90+CD45RA-; MPP: CD34+CD38-CD90-CD45RA-; MLP: CD34+CD38-CD90-CD45RA+)에서 시간 경과에 따라 GFP/OFP 키메라현상을 추적하였다. 놀랍게도, CD34+/CD38hi 유래 세포는 모든 시점 동안 뿐만 아니라 골수 및 비장에서 거의 부재하였다(후자는 제시하지 않음).
본 발명자는 CD34+/CD38- 세포가 단기 뿐만 아니라 장기로 전부는 아닌 대부분의 SCID 재증식 잠재성을 함유하는 것으로 결론 내렸다.
다음으로, 본 발명자는 CD34+ 가동화 말초 혈액(MPB) 세포(Stem Cell Technologies로부터 구입함)로 이동하였는데, 이는 이것이 소아 환경에 비해 유전자 요법 프로토콜 개선이 더욱 시급히 요구되는 성인 환자에서 바람직한 HSC 공급원이기 때문이다(도 4). 본 발명자는 CD34+ MPB를 증가하는 수준의 CD38 발현을 갖는 4개의 서브셋(CD34+/CD38-; CD34+/CD38int1; CD34+/CD38int2; CD34+/CD38hi)으로 분류하고, 이들 서브셋을 16시간 동안 SCF(300 ng/mL), Flt3L(300 ng/mL), TPO(100 ng/mL), IL6(60 ng/mL) 및 dmPGE2(10 μM)를 함유하는 Stem Span SFEM에서 예비-자극하고, 서브셋을 +/-: GreenFP.LV; +/int1: CherryFP.LV; +/int2: CyanFP.LV; +/hi: OrangeFP.LV의 LV로 형질도입시켰다. 형질도입 24시간 후, 세포를 하기와 같이 8주령의 치사량에 가깝게 방사선 조사된 NSG 마우스에 주입하였다:
그룹 1: 마우스(n=6) 당 129,000 +/- 세포;
그룹 2: 마우스(n=7) 당 869,000 전구 세포(각각의 집단이 전구체 혼합물의 33%에 기여하는, +/int1, +/int2 및 +/hi 세포의 합);
그룹 3: 마우스(n=6) 당 129,000 +/- 및 869,000 풀링된 전구 세포의 혼합물.
생착(그룹 1, 2, 3) 및 키메라현상(그룹 3)이 말초 혈액에서 시간 경과에 따라 모니터되었다(도 4(A)).
CD34+CD38hi(+/hi) 세포는 가장 이른 시점에서 NSG 마우스에서 작지만 검출 가능한 생착 잠재성을 나타내었고, 이들의 산출은 이후에 소멸되었다. 흥미롭게도, MPB로부터의 CD34+CD38-(+/-) 집단은 이식 3주 후에 작은 조혈 산출을 나타내었다. 대신, 이러한 시점에서의 단기 생착은 CD34+CD38int 세포에 의해 대부분 유지되었다(int2 > int1). 다양한 분획의 기여가 이식 9-15주 후에 변화하였고, 그룹 1 및 그룹 3은 이제 인간 CD45+ 세포 생착의 유사한 수준을 나타내었다. 모든 줄기 및 전구 세포 집단의 혼합물이 이식된 그룹 3에서, CD34+CD38-(+/-) 집단은 huCD45+의 >70-80%에 기여하였고, huCD13+ 생착의 >98%에 기여한 반면, +/int1은 B 세포의 약 20-10%에 기여하였다. +/int2 및 +/hi 세포는 9 및 15주 시점에서 조혈에 대한 유의한 기여를 나타내지 않았다.
본 발명자는 MPB로부터의 CD34+CD38-(+/-) 세포가 모두가 아닌 대부분의 장기 SCID 재증식 잠재성을 함유하는 반면, 단기 재증식이 CD34+/CD38int2 -high(첫번째 웨이브(wave)) 및 CD34+/CD38int1 세포(두번째 웨이브)에 의해 제공되는 것으로 결론 내렸다. 이는 G-CSF-가동화 MPB 유래 CD34+CD38- 세포(모든 CD34+ 세포의 10%)의 유전적 변형이 유전자-변형된 세포에 의한 모두가 아닌 대부분의 장기 생착을 달성하기에 충분하다는 원리의 증거를 제공한다. 형질도입 배양물 내에 CD34+/CD38int 세포를 포함시키는지 아닌지의 선택은 형질도입된 세포에 의한 조혈의 획득이 달성될 필요가 있는 기간에 좌우된다. 대신, CD34+/CD38int2 세포는 단기 생착을 제공하며, 조건화 후에 조혈 회복을 부스팅시켜, 유전자 요법을 받는 환자에서 감염성 및 출혈성 합병증의 위험을 감소시키는 배양되지 않은 유전자 변형되지 않은 지지 세포로서 제공되는 이상적인 집단이다.
더 긴 기간에 걸쳐 도 4(A)에 제시된 연구를 지속하는 것은 추가 통찰을 제공한다. 도 4(B)는 안정적인 HSC-유래 조혈을 측정하는 장기 판독을 제공하는 24주까지의 연구의 지속을 제시한다. 또한, 본 발명자는 또 다른 가동화된 말초 혈액 공여체를 이용하고, CD38 분획을 표시하는 렌티바이러스 벡터로 변경한 반복 실험을 수행하였다.
이러한 장기 분석은 장기 생착의 >95%가 배양된 CD34+ 가동화 말초 혈액 HSPC의 CD38- 분획(가장 낮은 12% CD38 발현 세포)으로부터 유래되는 것을 확증한다. 이들 데이터는 또한 다양한 수준의 CD38 발현에 의해 규정된 전구체 집단의 생착 동역학을 뒷받침하며, CD38int /lo(12-40% CD38 백분위수) 세포는 4개월의 시간 범위에 걸쳐 약간의 감쇠와 함께 3주에서 이들의 가장 높은 기여를 제공하였고; CD38+/int(41-70% CD38 백분위수) 세포는 2개월의 시간 범위에 걸쳐 신속한 감쇠와 함께 3주에서 이들의 가장 높은 기여를 제공하였다. CD38hi(71-100% CD38 백분위수) 세포는 3주에서 낮은 생착을 제공하였다.
이들 데이터는 이제 본 발명자가 유전자-변형된 세포의 지속성을 맞춤화시키는 것을 가능케 한다:
● 장기: 유전 질병의 치료를 위한 CD34+CD38- 세포(0-10% 백분위수);
● 중기: 3-4개월의 치료 기간(예를 들어, 항암 단백질의 미세환경 표적화된 전달을 위함)을 위한 CD34+CD38int /lo 세포(12-40% 백분위수);
● 단기: 1-2개월의 치료 기간(예를 들어, 항암 단백질의 미세환경 표적화된 전달을 위함)을 위한 CD34+CD38+/int 세포(41-70% 백분위수).
실시예 4
프로스타글란딘 E2는 NSG 재증식 잠재성을 갖는 인간 조혈 줄기 및 전구 세포로의 유전자 전달을 증가시킨다.
프로스타글란딘 E2(PGE2)의 항-아폽토시스 특성을 활용하기 위해(Pelus LM et al. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2011;96:3-9), 본 발명자는 스트레스(동결/해동 주기, 독성 벡터를 이용한 형질도입, 전기천공)에 노출된 CD34+ HSPC를 장기 작용 PGE2 동족체 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2(dmPGE2; Cayman Chemical, Cat 14750)으로 처리하였다. 예기치 않게, 본 발명자는 dmPGE2 처리 후에 제대혈(도 5(A)) 및 성체 골수(도 6)로부터의 CD34+ 또는 CD34+CD38- HSPC로 1.5배 증가된 유전자 전달 효율을 발견하였다. 벡터 카피수(VCN)에서의 이러한 차이는 NSG 마우스로의 세포의 이식 후 4개월 이상에 걸쳐 유지되었고, 생착 수준은 dmPGE2 처리에 의해 부정적으로 영향을 받지 않았다.
본 발명자는 G-CSF-가동화 CD34+ 말초 혈액 줄기 세포가 또한 dmPGE2로 예비-자극되는 경우 렌티바이러스 벡터에 의해 더욱 효과적인 형질도입을 겪는 것을 확인하였다(도 5(B)).
또한, 본 발명자는 렌티바이러스 벡터에 의한 인간 HSPC의 형질도입에 대한 dmPGE2 자극의 시기의 효과를 연구하였다. 상기 효과는 dmPGE2가 LV 노출 2시간 전에 첨가되는 경우 최대화되는 것으로 보인다(도 5(C)).
또한, 본 발명자는 생체 외에서 dmPGE2 자극에 의해 획득된 증가된 벡터 카피수가 이종이식 18주 후까지 장기간 유지되는 것을 추가 실험에서 확인하였다(도 5(D)).
요컨대, 본 발명자는 더욱 원시적인 HSC 제조물이 VSVg-슈도타입의 3세대 렌티바이러스 벡터에 의해 더욱 형질도입 가능하며, 이의 효과가 dmPGE2를 이용한 예비-자극에 의해 추가로 향상될 수 있음을 본원에서 처음으로 제시한다. 본 발명자는 이들 개선을 생체 외 조작에 통합시킨 혁신적인 HSC 유전자 요법 프로토콜을 고안하였다. 본 발명자는 제대혈, 골수 및 가동화된 말초 혈액으로부터의 인간 HSC에 대해 상기 새로운 프로토콜을 시험하였고, 최신 NSG 이종이식 모델을 이용한 CD38 발현에서의 정량적 차이를 기초로 한 면역표현형적으로 규정된 CD34+ 가동화 말초 혈액 집단의 다계통 재구성 동역학을 처음으로 디콘볼루션(deconvolution)시키고, 신속한 단기 재증식 잠재성을 갖는 전구체로부터 장기 다계통 생착 세포(전체 CD34+ 세포의 <10%)를 분리시켰다. 이러한 프로토콜은 개선된 생체 외 배양, 배양되지 않은 전구체에 의해 유지되는 신속한 혈액 회복 및 환자로의 더 적은 통합 용량의 주입을 통해 정성적으로 더 나은 유전자-변형된 HSC 분획을 제공함으로써 안전성을 개선시킬 것이다. 이는 또한 벡터 용량에서의 실질적 감소를 가능케 함으로써 HSC 유전자 요법의 지속성을 개선시킬 것이다.
실시예 5
임상 프로토콜(문헌[Biffi A et al. Science 2013;341:1233158]로부터 적합화됨): 내부 SOP에 따라 일반 마취를 이용하여 멸균 조건하에서 장골능선으로부터 전체 골수를 수거하였다. 대안적으로, 환자는 백혈구성분채집술 6-9시간 전에 단일 용량의 플레릭사포르와 함께 또는 이러한 플레릭사포르 없이 -3일로부터 시작하여 5-10 ㎍/kg의 G-CSF에 의한 HSPC 가동화를 겪었다. 전용 백에 수거되고, 밀봉되고, 확인된 수거된 골수 또는 가동화된 말초 혈액을 이후 GMP 시설로 옮겼다. GMP 조건에서 제조업체의 절차(Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany)에 따라 면역자기 비드를 이용한 음성/양성 선택에 의해 세포 정제를 수행하였다. 정제된 세포를 이후 GMP-등급의 사이토카인이 보충된 혈청 비함유 배지(상기 참조) 중에서 레트로넥틴-코팅된 VueLife 백(American Fluoroseal, Gaithersburg, MD) 내에서 배양하고, 40-60시간의 전체 배양 시간 동안 30-100의 감염다중도로 GMP-등급의 정제된 벡터에 1회 또는 2회 노출시켰다. 형질도입 절차 종료시, 형질도입된 CD34+ 세포를 수거하고, Cell Grow 배지로 세척하고, 환자로의 주입을 위해 2-10 × 106 세포/mL의 농도로 염수 용액에 재현탁시켰다. 형질도입 종료시, 상기와 같은 클론원성 검정, 흐름세포측정법 및 시험관 내 배양을 위해 세포의 분획을 수거하였다. 세포를 품질 관리 시험에 따른 배치 방출시 주입 시간까지 4℃에서 유지시켰다(결과는 생활력, 면역표현형, 내독소, 큰 T Ag DNA, 미코플라스마에 대해 주입시에 이용가능함).
실시예 6
배양된/형질도입된 CD34 + CD38 - 줄기 세포와 배양되지 않은 CD34 + CD38 int /+ 전구 세포의 공동-투여 모델링.
도 7에 제시된 데이터는 배양되지 않은 CD34+CD38int /+ 가동화 말초 혈액 전구 세포(Progenitors)와 유전자-변형된 CD34+CD38- HSPC(Stem)의 조합된 이식에 관한 것이다. 이러한 실험은 배양되지 않은 CD34+CD38int /+(13-100% CD38 백분위수) 전구체가 배양된/형질도입된 CD34+CD38int /+ 세포와 관련하여 더 길게 지속되고, 더 높은 재증식 능력을 갖는 것을 입증한다.
이는 하기를 의미한다:
1. 세포의 지지 집단으로서 환자에 제공된 새로운 전구체는 유전자 요법 환자에서 조혈 회복을 촉진시키고 강화시켜, 이에 따라 요법 후 첫번째 달에서 감염성 및 출혈성 합병증의 위험을 실질적으로 감소시킬 것이다;
2. 유전자-변형된 줄기 대 새로운 전구체의 비(현재 1:8)가 효과적인 장기간 유전자 표시를 개선시키기 위해 줄기 세포에 유리하도록 조정(예를 들어, 1:5)될 수 있다;
3. 유전자-변형된 CD34+CD38- 세포와의 경쟁을 감소시키기 위해 CD34+CD38int1 집단의 일부가 지지 세포 집단으로부터 제거될 수 있다;
4. 매우 기능적인 유전자-변형된 HSC를 획득하기 위해 짧은 배양 시간이 중요하다. 유전자-변형된 HSC의 기능적 특성을 개선시키는 것은 1:5 및 1:10 비 둘 모두에 대해 생체 내에서 CD34+ 및 CD33high 세포에서 유사한 유전자-표시에 의해 제시된 바와 같이 요점 (2) 및 (3)에 기재된 개입을 덜 중요하게 만든다(도 7B 참조).
실시예 7
도 5, 7 및 9의 데이터는 배양 시간이 가동화된 말초 혈액으로부터의 줄기 세포 및 전구 세포 둘 모두의 기능적 생착 능력에 부정적으로 영향을 미치는 것을 입증한다. 배양 시간을 24시간으로 감소시키는 것은 배양의 유해한 영향을 완화시킬 수 있고, 의학적 유전자 요법 산물의 품질을 개선시킬 수 있다. dmPGE2의 사용은 짧은 24시간 생체 외 조작 프로토콜에서 HSC의 효과적인 형질도입을 가능케 하고(도 5), 이에 따라 이후의 유전자 요법 연구에서 상기 프로토콜을 수행하기 위한 확실한 이론적 근거를 형성한다. 이들 데이터는 또한 줄기 세포 이식물을 투여하기 위해 이용되는 표준 척도인 CD34 세포수가 감소된 정보 값을 갖는 것을 의미하는데, 이는 연장된 생체 외 배양으로부터의 CD34+ 세포가 단기간 동안 배양된 새로운 CD34+ 세포 또는 CD34+ 세포와 기능적으로 동등하지 않기 때문이다. 확실히, 본 발명자가 44시간 배양과 관련하여 24시간 배양으로부터의 더 적은 CD34+ 세포를 주입하였으나, 24시간 배양 프로토콜이 더 높은 수준의 장기간 생착을 제공하였다.
실시예 8
가동화된 말초 혈액(G-CSF 및/또는 플레릭사포르 또는 새로운 연구 가동화 작용제로 가동화됨) 또는 골수로부터의 CD34+CD38- HSPC로의 효과적인 유전자 전달을 획득하기 위한 바람직한 형질도입 프로토콜
논의된 프로토콜은 도 10에 제시된다.
참조 프로토콜: 2히트(Hit) 표준-66h: CD34+ 세포의 형질도입을 위한 현재 기준 프로토콜인 표준 2 히트 프로토콜(66시간)로 형질도입된 CD34+CD38- 세포(Biffi, A et al. (2013) Science 341: 1233158; Scaramuzza, S. et al. (2013) Mol . Ther . 21: 175-84).
본 발명자가 시험한 1히트-44h 프로토콜(도 7 및 9 참조)은 차선인 것으로 밝혀졌고, 추가로 추구되지 않을 것이다.
하기 프로토콜이 참조보다 우수한 것으로 예상되며, CD34+CD38- 세포의 유전적 변형을 위한 바람직한 프로토콜이다:
프로토콜 A: IL3-비함유 배지에서 "단일 히트" 프로토콜(38시간)로 형질도입된 CD34+CD38- 세포;
프로토콜 B: LV 노출 120분 전에 dmPGE2 노출된, IL3-비함유 배지에서 "단일 히트" 프로토콜(38시간)로 형질도입된 CD34+CD38- 세포;
프로토콜 C: IL3-비함유 배지에서 단축된 "단일 히트" 프로토콜(24시간)로 형질도입된 CD34+CD38- 세포;
프로토콜 D: LV 노출 120분 전에 dmPGE2 노출된, IL3-비함유 배지에서 단축된 "단일 히트" 프로토콜(24시간)로 형질도입된 CD34+CD38- 세포.
CD34+CD38- 세포는 고려되는 기술적 옵션 중 하나(예를 들어, 마이크로칩-기반 분류 또는 비드-기반 순차적 선택)에 따라 가동화된 말초 혈액 또는 골수로부터 정제될 것이며, 약 106 세포/ml의 밀도로 배양/형질도입 배지에 플레이팅될 것이다. 임상 등급 LV(107 내지 108 TU/mL, 적용에 따름)가 계획에 배치된 시점에서 첨가될 것이다. 프로토콜 B 및 D에서, dmPGE2는 계획에 배치된 바와 같이 LV 노출 120분 전에 배양물에 첨가될 것이다. 배양의 예견된 종료시(실험 계획 참조), 세포는 세척될 것이고, 냉동보존되거나 직접 환자 투여를 위해 준비(약물 제품)될 것이다.
MPB CD34 + 세포 형질도입 동안의 환경 조건
인큐베이터
배양은 세포 배양 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 유지될 것이다.
배양 접시
레트로넥틴(Retronectin)-코팅된 플레이트 또는 백
예비-자극/형질도입 배지
참조 프로토콜: 사용 전에 멸균-여과된(0.22 ㎛), 페니실린/스트렙토마이신 및 SCF 300ng/ml, FLT3L(300ng/ml), TPO(100ng/ml), IL3(60ng/ml)가 보충된 CellGro(CellGenix) 배지.
프로토콜 A, B, C, D: 사용 전에 멸균-여과된(0.22 ㎛), 페니실린/스트렙토마이신 및 SCF 300ng/ml, FLT3L(300ng/ml), TPO (100ng/ml)가 보충된 CellGro(CellGenix) 배지(또는 조혈 줄기 세포의 배양에 적합한 다른 임상 등급 배지). 프로토콜에 배치된 바와 같이 dmPGE2(10 μM)가 일부 그룹에 첨가된다.
바람직하게는, 약물 제품은 적합한 환자 조건화 후에 골내 주입된다. 임의로, 지지 세포의 적합한 용량(적합한 용량의 정의: 비-골수절제식 조건화의 경우 0; 골수절제식 조건화의 경우, CD38- 프렙(prep)에 함유된 CD34+ 세포의 수와 관련하여 CD38+ 프렙으로부터의 CD34+ 세포의 수의 5x-10x, 환자 체중 kg 당 250만 내지 300만의 최소 절대수)이, 바람직하게는, 약물 제품의 주입 1-2일 후에 정맥내 투여될 수 있다. 대안적으로, 약물 제품은, 바람직하게는, 지지 세포와의 공동-투여로 정맥내 투여될 수 있다.
상기 명세서에 언급된 모든 간행물은 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정한 바람직한 구체예와 관련하여 기재되었으나, 청구된 바와 같은 본 발명은 상기 특정 구체예로 과도하게 제한되지 않아야 하는 것이 이해되어야 한다. 확실히, 생화학 및 생물공학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내인 것으로 의도된다.

Claims (47)

  1. 세포의 시작 집단으로부터 CD38을 실질적으로 발현하지 않으나, CD34를 발현하는 세포의 집단을 분리시키는 단계, 및 분리된 세포 집단을 벡터로 형질도입시켜 치료 세포 집단을 획득하는 단계를 포함하는, 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단으로부터 임상 사용을 위한 치료 세포 집단을 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    a. 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단으로부터 CD38-발현 세포를 분리시키는 단계;
    b. CD38을 발현하지 않는 단계 (a)에서 획득된 세포의 집단으로부터 CD34-발현 세포를 분리시키는 단계;
    c. 단계 (b)에서 획득된 CD34-발현 세포 집단을 벡터로 형질도입시켜 치료 세포 집단을 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    a. 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단과 CD38에 대해 반응성인 작용제를 접촉시키는 단계;
    b. CD38-비반응성 세포로부터 CD38-반응성 세포를 분리시키는 단계;
    c. 단계 (b)에서 획득된 CD38-비반응성 세포와 CD34에 대해 반응성인 작용제를 접촉시키는 단계;
    d. CD34-비반응성 세포로부터 CD34-반응성 세포를 분리시키는 단계로서, CD34-반응성 세포가 형질도입 세포 집단을 형성하는, 단계;
    e. 형질도입 세포 집단을 벡터로 형질도입시켜 치료 세포 집단을 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 세포 집단이 CD34+CD38- 표현형을 갖는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 시작 집단이 가동화된 말초 혈액, 골수 또는 제대혈로부터 획득되는 방법.
  6. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 또는 CD34에 대해 반응성인 작용제가 각각 항-CD38 또는 항-CD34 항체인 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 항-CD38 및/또는 항-CD34 항체가 자기 비드 또는 검출 가능한 마커에 컨쥬게이션되는 방법.
  8. 제 2항 또는 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, CD38-발현 세포 및/또는 CD34-발현 세포가 자기 비드-기반 분리 또는 흐름세포측정법을 이용하여 분리되는 방법.
  9. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, CD38-반응성 세포 및/또는 CD34-반응성 세포가 자기 비드-기반 분리 또는 흐름세포측정법을 이용하여 분리되는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 바이러스 벡터가 관심 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 집단을 벡터로 형질도입시키는 단계가 약 44시간 미만 동안 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  14. 제 2항, 제 4항 내지 제 8항 또는 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 CD38-발현 세포 또는 이의 일부가 유지되어 지지 세포 집단을 형성하는 방법.
  15. 제 3항 내지 제 7항 또는 제 9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 CD38-반응성 세포 또는 이의 일부가 유지되어 지지 세포 집단을 형성하는 방법.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 지지 세포 집단이 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형을 갖는 방법.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 치료 세포 집단.
  18. 제 14항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 지지 세포 집단.
  19. 제 17항의 치료 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물.
  20. 제 18항의 지지 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물.
  21. 제 17항에 있어서, 의약에서 사용하기 위한 치료 세포 집단.
  22. 제 17항에 있어서, 치료 세포 집단이 제 18항의 지지 세포 집단과 함께 투여되는 의약에서 사용하기 위한 치료 세포 집단.
  23. 제 18항에 있어서, 지지 세포 집단이 제 17항의 치료 세포 집단과 함께 투여되는 의약에서 사용하기 위한 지지 세포 집단.
  24. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 자가 줄기 세포 이식 절차 또는 동종이형 줄기 세포 이식 절차의 일부로서 투여되는 치료 세포 집단.
  25. 제 23항에 있어서, 자가 줄기 세포 이식 절차 또는 동종이형 줄기 세포 이식 절차의 일부로서 투여되는 지지 세포 집단.
  26. 제 21항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 지지 세포 집단의 투여 전에 치료 세포 집단이 대상체에 투여되는 치료 또는 지지 세포 집단.
  27. 제 22항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 지지 세포 집단의 투여와 동시적으로 또는 동시에 치료 세포 집단이 대상체에 투여되는 치료 또는 지지 세포 집단.
  28. 제 17항 및 제 18항의 치료 및 지지 세포 집단을 포함하는 키트.
  29. 제 17항의 치료 세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  30. 제 17항의 치료 세포 집단 및 제 18항의 지지 세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 지지 세포 집단의 투여 전에 치료 세포 집단이 대상체에 투여되는 방법.
  32. 제 30항에 있어서, 지지 세포 집단의 투여와 동시적으로 또는 동시에 치료 세포 집단이 대상체에 투여되는 방법.
  33. 관심 뉴클레오티드로 형질도입된, 유전자 요법에서 사용하기 위한 조혈 전구 세포 집단.
  34. 유전자 요법에서 사용하기 위한 조혈 전구 세포 집단으로서, 상기 세포가 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 포함하는 세포의 집단으로부터 분리된 후, 관심 뉴클레오티드로 형질도입된, 조혈 전구 세포 집단.
  35. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, CD34+CD38int 표현형을 갖는 조혈 전구 세포 집단.
  36. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형을 갖는 조혈 전구 세포 집단.
  37. 제 33항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입된 전구 세포 집단이 조혈 줄기 세포의 집단과 함께 투여되는 조혈 전구 세포 집단.
  38. 조혈 전구 세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 유전자 요법의 방법으로서, 조혈 전구 세포 집단이 관심 뉴클레오티드로 형질도입된, 방법.
  39. 조혈 전구 세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 유전자 요법의 방법으로서, 상기 세포가 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 포함하는 세포의 집단으로부터 분리된 후, 대상체로의 투여 전에 관심 뉴클레오티드로 형질도입된, 방법.
  40. 제 38항 또는 제 39항에 있어서, 조혈 전구 세포 집단이 CD34+CD38int 표현형을 갖는 방법.
  41. 제 38항 또는 제 39항에 있어서, 조혈 전구 세포 집단이 CD34+CD38int1, CD34+CD38int2 및/또는 CD34+CD38+ 표현형을 갖는 방법.
  42. 제 38항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입된 전구 세포 집단이 조혈 줄기 세포의 집단과 함께 투여되는 방법.
  43. 환자에서 트랜스진(transgene) 발현 기간을 조절하는 방법으로서, 트랜스진 발현의 기간이 CD38 발현 수준을 기초로 하여 형질도입된 조혈 줄기 세포 및/또는 전구 세포를 선택적으로 투여함으로써 조절되는, 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 증가된 트랜스진 발현 기간이 감소된 수준의 CD38 발현을 갖는 세포를 투여함으로써 달성되는 방법.
  45. 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포를 벡터로 형질도입시키는 경우 유전자 전달 효율을 증가시키기 위한 프로스타글란딘 E2 또는 프로스타글란딘 E2 유도체의 용도.
  46. 제 45항에 있어서, 프로스타글란딘 E2 유도체가 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2인 용도.
  47. 제 45항 또는 제 46항에 있어서, 조혈 줄기 세포의 형질도입이 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 방법의 일부로서 수행되는 용도.
KR1020167013639A 2013-10-24 2014-10-24 방법 KR20160075676A (ko)

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