JP2001503976A

JP2001503976A - 樹状細胞の成熟を補助する胸腺微環境の生産法

Info

Publication number: JP2001503976A
Application number: JP51776698A
Authority: JP
Inventors: エフヘインズ，バートン; ディーペイテル，ダヴァルクマール; エースミス，クレイトン; ディエゴミラールズ，ジー
Original assignee: デュークユニヴァーシティ
Priority date: 1996-10-10
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2001-03-27
Also published as: EP0931138A4; AU4814997A; EP0931138A1; CA2268284A1; WO1998015615A1

Abstract

(57)【要約】本発明は一般的に胸腺微環境に関し、特に胸腺微環境の生産法に関する。本発明はさらに、in vitroで生産された胸腺微環境を用いた先天的及び後天的免疫不全症を治療する方法に関する。実際に後天的免疫不全症においては、悪性腫瘍及び自己免疫疾患、同様にAIDSで生じるような伝統的なＴ細胞免疫不全疾患で見られるような症候群が存在する。

Description

【発明の詳細な説明】樹状細胞の成熟を補助する胸腺微環境の生産法本出願は、1996年10月10日に提出された米国仮出願第60/031,445号由来の優先権を主張し、その全内容は参考としてここに取り込まれる。技術分野本発明は一般的に、造血幹細胞由来の樹状細胞の成熟を補助する胸腺微環境、特にin vitroでの胸腺微環境の生産法に関する。本発明はさらに、悪性腫瘍及び自己免疫疾患、並びにAIDSで生じるような伝統的なＴ細胞免疫不全疾患を含む、先天的及び後天的免疫不全症を治療する方法に関する。背景樹状細胞は、リンパ組織及び非リンパ組織に広く配置されている抗原提示細胞 (APC)である(Steinman et al,Advances in Experimental Medicine & Biology 3 29:1-9(1993);Steinman,Experimental Hematology 24:859-62(1996);Young et a l,Stem Cells 14:376-87(1996);Steinman et al,Immunological Reviews 156:25 -37(1997))。樹状細胞のいくつかの異なるサブセットが、抹消血液、皮膚、リンパ器官及び胸腺において示されている(Caux et al,Blood Cell Biochemistry 7: 263-301(1996);Cuax et al,J.Exp.Med.184:695-706(1996);Caux et al,J.Immuno l.155:5427-5435(1995);Chu et al,Br.J.Cancer.Suppl 23:S4-10(1994))。樹状細胞はさまざまな形態学的外観を有し、高レベルのMHCクラスＩ及びIIを発現し、抗原をプロセッシングしＴ細胞を活性化する潜在的な能力を有する(Wettendor ff et al,Adv.Exp.Med.Biol.378:371-374(1995);Wu et al,J.Exp.Med.184:903-1 1(1996);Shortman et al,Ann.Rev.Immunol.14:29-47(1996);Res et al,J.Exp.Me d.185:141-51(1997);Mommaas et al,Eur.J.Immunol.25:520-5(1995);Mackensen et a l,Blood 86:2699-2707(1995);Caux et al,J.Exp.Med.180:1841-7(1994))。それらはまた、微生物、新生物及び移植された器官に対する効果的な免疫応答を生ずることにおいて必須の役割を演じるようであり、寛容の誘導において重要な役割を演じるであろう(Steinman et al,Advances in Experimental Medicine & Biol ogy 329:1-9(1993),Steinman,Ann.Rev.Immunol.9:271-96(1991))。胸腺内で成熟された樹状細胞は、胸腺外樹状細胞と生物学的に区別されるようである(Shorman et al,Ciba Found.Symp.204:130-41(1997);Shorman et al,Adv. Exp.Hed.Biol.378:21-9(1995);Saunders et al,J.Exp.Med.184:2185-96(1996);A rdavin et al,Nature 362:761-3(1993);Ardavin et al,Immunology Letters 38: 19-25(1993);Ardavin et al,Eur.J.Immunol.22:859-62(1992);Suss et al,J.Exp .Med.183:1789-96(1996);Winkel et al,Immunology Letters 40:93-9(1994))。i n vitroでGM-CSF、TNF-α、及び他のサイトカインと共に培養された骨髄、末梢血液、及び臍帯血(UCB)造血幹細胞は、典型的に一次的な骨髄性細胞マーカーを発現する単球及び樹状細胞の両者を含む混合カルチャーを生産する(Caux et al, Blood Cell Biochemistry 7:263-301(1996);Caux et al,J.Exp.Med.184:695-706 (1996);Caux et al,J.Immunol.155:5427-5435(1995);Caux et al,Nature 360:25 8-61(1992);Rosenzwajg et al,Blood 87:535-44(1996);Szabolcs et al,Blood 8 7:4520-30(1996);Young et al,J.Exp.Med.182:1111-1119(1995))。対照的に、胸腺樹状細胞は、通常リンパ細胞のマーカーと考えられる分子を発現する(Steinma n et al,Immunological Reviews 156:25-37(1997);Shortmen et al,Adv.Exp.Med .Biol.378:21-9(1995);Saunders et al,J.Exp.Med.184:2185-96(1996);Ardavin et al,Nature 362:761-3(1993);Ardavin et al,Immunology Letters 38:19-25(1 993);Ardavin et al,Eur.J.Immunol.22:859-62(1992);Winkel et al,Immunology Letters 40:93-9(1994);Li et al,Exp.Hematol 23:21-5(1995);Maraskovsky et al,J.Exp.Med.184:1953-62(1996);Sotzik et al,J.Immunol.152:3370-7(1994); Ardavin et al,Immunology Today 18:350-61(1997);Lafontaine et al,Cellular Immunology 142:238-251(1992))。さらに胸腺樹状細胞幹細胞は、リンパ細胞及び胸腺樹状細胞の両者を生産すると報告されている(Saunders et al,J.Exp.Med. 184:2185-96(1996);Ardavin et al,Nature 362:761-3(1993);Li et al,Exp.Hema tol 23:21-5(1995):Shortman et al,Ann.Rev.Immunol.14:29-47(1996))。これらの観察により、胸腺樹状細胞は胸腺外樹状細胞よりリンパ細胞に緊密に関連していることが示された。胸腺内樹状細胞の成育と成熟もまた、胸腺外樹状細胞の成熟におけるサイトカインの重要性より様々なサイトカインによって支配されている。 Saunders et alは、ネズミ「低CD4」胸腺幹細胞が、TNF-α、IL-1β、IL-3、IL- 7及びSCFの組み合わせを用いてin vitroで胸腺型樹状細胞に成熟することを示した(Saunders et al,J.Exp.Med.184:2185-96(1996))。対照的に、末梢血液及び骨髄幹細胞からの樹状細胞の生成には、GM-CSFが必要とされた(Caux et al,Blood Cell Biochemistry 7:263-301(1996);Caux et al,Nature 360:258-61(1992);Rei d et al,J.Immunol.149:2681-2688(1992);Santiago-Schwarz et al,J.Leukoc.Bi ol.52:274-81(1992);Strunk et al,Blood 87:1292-1302(1996))。胸腺樹状細胞はまた、胸腺外樹状細胞より様々な機能的性質を有する。特に胸腺樹状細胞は、胸腺内においてＴ細胞ネガティブ選択及び寛容誘導の過程に関与していると考えられる(Steinman et al,Immunological Reviews 156:25-37(1997);Shortman et al,Adv.Exp.Med.Biol.378:21-9(1995);Colic et al,Develop Immunol.5:37-51(1 996);Tanaka et al,Eur J.Immunol.23:2614-21(1993);Doueketal,Internat.Immu nol.8:1413-20(1996))。併せて考えるとこれらの観察により、胸腺樹状細胞が区別される成熟性質、イムノ表現型性質及び機能的性質を有する樹状細胞のサブセットを構成していることが示される。現在では、胸腺樹状細胞生物学を評価するほとんどの研究は、ヒト胸腺樹状細胞は効率的に単離し培養することが困難であることも起因して、ネズミモデルを利用している。例えば、Barcena et alが、ヒト胎児胸腺器官カルチャー(FTOC) が、樹状細胞形態を示す単球細胞へのヒト胎児肝CD34⁺lin^-細胞の成熟を助けることを示している(Barcena et al,J.Exp.Med.180:123-32(1994))一方で、ほとんど存在しない推定の樹状細胞のみが十分に特徴付けされるように回収された。もう一つの研究においては、Res et alは個々のヒトCD34⁺CD38^dim胸腺細胞がFTOC においてＴ細胞及びNK細胞の両者に分化し得、GM-CSF及びTNFαと共にin vitro で培養した場合に樹状細胞へ成熟することを示した(Res et al,Blood 87:5196-2 06(1996))。しかしながら、CD34⁺CD38^dim細胞の胸腺外カルチャーが樹状細胞の生成に必要とされるため、胸腺内または胸腺外幹細胞からの樹状細胞の成熟の介在を演じている胸腺の役割は不明確なままである。結論として、ヒト胸腺樹状細胞生物学の特定の面は、特徴付けされていないままである。本発明の前に、胸腺微環境におけるin vitroで胸腺樹状細胞を生成するFTOC以外の実験系は存在しない。本発明は、造血幹細胞から胸腺樹状細胞を生成するために用い得る系を提供する。発明の目的 in vitroでの胸腺微環境を提供することが本発明の一般的な目的である。ヒト胸腺移植、及び胸腺樹状細胞の形成における使用に適した胸腺微環境を提供することが本発明の特異的な目的である。先天性または後天性免疫不全疾患または障害の治療法を提供することが本発明のもう一つの目的である。上記記載の目的は、in vitroでの胸腺微環境を生産する方法、及び同じものを用いて造血幹細胞から樹状細胞を生成する方法を提供する本発明によって達成される。本発明のさらなる目的及び利点は、以下の記載から明確になるであろう。図面の簡単な説明図１Ａ−Ｆ。ヒト胸腺間質細胞を用いた共培養によるCD34⁺CD38^-lin-及びCD34⁺ CD38⁺lin-臍帯血細胞からのCD1a⁺細胞の生成。CD34⁺CD38^-lin-及びCD34⁺CD38⁺l in-細胞を、図１Ａに示された区分を用いた蛍光活性化細胞ソーティング(FACS) を用いてlin-UCB細胞から分離した。ソートされたCD34⁺CD38⁺lin-細胞(ゲートR1 )のソート後分析が図１Ｂに示されており、ソートされたCD34⁺CD38^-lin-細胞(ゲートR2)のソート後分析が図１Ｃに示されている。混合胸腺間質細胞（主にTE細胞で5-30%TF細胞）を用いた共培養の２１日後、CD34⁺CD38^-lin-UCB細胞はおよそ 40倍に増大し、細胞表面ＣD1aを得た（図１Ｆ）。CD34⁺CD38⁺Iin-UCB細胞もまた細胞表面CD1aを得たが（図１Ｅ）、胸腺間質を用いて共培養されたCD34⁺CD38^-lin-UCB 細胞よりも少ない程度であった。存在するデータは５の実験を表す。図２Ａ−２Ｔ。２１日間の胸腺間質単一層上で培養されたCD34⁺CD38^-lin-UCB 細胞から由来するCD1a⁺細胞の表現型。細胞は示されているように(FITC,PEまたはCy)FITCまたはPE及び相補的な蛍光分子を用いてラベルされたモノクローナル抗体に接合されたCD1aを用いた２または３色の染色のために加工された。ヒストグラムは、CD1a+細胞上に区分された試験抗体（太線）及びアイソタイプマッチコントロール抗体（細線）の蛍光強度を示す。結果は各試験抗体について３回より多い実験を表す。図３Ａ及び３Ｂ。胸腺間質細胞単一層上でCD34⁺38^-lin-またはCD34⁺CD38⁺lin- UCB細胞からin vitroで生産されたCD1a⁺CD14^-細胞は、異質遺伝子型混合リンパ球反応(MLR)における適した刺激因子である。２１日間胸腺間質細胞単一層で成育され、FACSによって分離された放射線照射CD1a⁺CD14^-及びCD1a^-CD14⁺細胞を、異なる刺激因子に対する応答因子の割合で異種遺伝子型単球欠損末梢血液単核細胞を刺激するために用いた。実施された2のものの代表的な実験が示されている。エラーバーは示された実験において三重のウェルの平均±標準偏差である。図１Ａには、CD34⁺CD38^-lin-UCB幹細胞から由来するCD1a⁺CD14^-及びCD1a^-CD14⁺細胞によって誘導されたチミジン取り込み（CD4+応答因子Ｔ細胞単独のバックグランドより小さい分当たりのカウントで）が示されている。CD1a+CD14-細胞はCD1a -CD14+細胞よりもMLRにおいてより有意な増殖を誘導する(全ての刺激因子：応答因子割合でp<0.001)。図１Ｂはより成熟したCD34⁺CD38⁺lin-UCB幹細胞から由来するCD1a⁺CD14^-及びCD1a^-CD14⁺細胞によって誘導されるチミジン取り込みを示す。CD34⁺CD38⁺lin-UCBから生産されたCD1a⁺CD14^-細胞もまたMLRにおける適した刺激因子であるが、CD34⁺CD38^-lin-幹細胞から生成されるものよりも能力は低い(p =0.001)。CD34⁺CD38^-lin-幹細胞から生成されるCD1a^-CD14⁺細胞は、MLRにおいて能力のある刺激因子ではない。図４Ａ−４Ｆ。胸腺間質上で成育されたDCは、TNF-αに応答して分化したDCのマーカーを得る。回収の前に４８時間10ng/ml TNF-αと共に刺激の存在下（図４Ｄ−４Ｆ）及び不存在下（図４Ａ−４Ｃ）で３週間胸腺間質単一層内で培養されたCD34⁺CD38^-lin-UCB細胞の表現型が示されている。TNF-αで処理されていない細胞と比較した場合、TNF-αで処理されたCD34+CD38-lin-細胞のより高いパーセンテージが、CD86,CD80及びCD83を含むDCのマーカーを発現する。データは実施された2の実験を表す。図５Ａ−５Ｄ。人工的な毛細管系で培養されたヒト胸腺上皮(TE)細胞及び胸腺線維芽細胞(TF)は、ヒト胸腺微環境を発生反復する小節内で凝集する。ヒトTE細胞及び生後の胸腺由来のTFをin vitroで培養し、人工的な毛細管系で95 TE:5 TF の割合で混合した。２から６週間で、TEとTFは線維芽細胞によって封入された織り合わされたパターンでTE細胞を含む小節内に凝集した(N=10)。抗ケラチンmAbA E-3（図５Ａ及び図５Ｃ）及び抗間質mAb TE7（図５Ｂ及び図５Ｄ）を用いた間接的免疫蛍光によって染色された代表的な小節の低電力（図５Ａおよび図５Ｂ）及び高電力（図５Ｃ及び図５Ｄ）の顕微鏡写真が示されている。三角形は小節を取り囲む繊維状カプセルを指し、矢印は連続切片においてロゼットを形成する胸腺上皮の残りの部分を指す。データは10の実験を表す。図６Ａ及び６Ｂ。臍帯血幹細胞は、in vitroで胸腺小節において樹状形態を有するCD1a⁺細胞に分化する。４週間の培地単独で培養された（図６Ａ）またはlin (-)臍帯血(UCB)細胞と共に培養された（図６Ｂ）胸腺間質小節の切片における抗 CD1a mAb Nal/34の反応性が示されている。UCB細胞と共に培養された胸腺間質小節は樹状形態を有する多くのCD1a⁺細胞を含む一方で、培地単独で培養された胸腺間質小節はいかなるCD1a⁺細胞をも含まないことに注意せよ。図６Ｂにおける単一のCD1a⁺細胞の樹状プロセスは、矢印によって示されている。CD1a⁺細胞は細胞質CD3-,CD33^lo及びCD83-であり、それらはこれらの細胞が早期樹状系列細胞であるという理論に一致する。データは３の実験を表す。発明の詳細な説明本発明は培養胸腺細胞由来の胸腺微環境のin virtoの生産法、及び同じものを用いた哺乳動物、例えば免疫不全に苦しんでいる哺乳動物の免疫系を再構成する方法に関する。本発明はまた、上記胸腺微環境を用いた造血細胞からの胸腺樹状細胞の生成法に関する。本発明の胸腺微環境の生産に用いるのに適した胸腺上皮細胞は、新鮮なまたは冷凍した胎児または出生後の胸腺組織のそれぞれから培養しうる。胸腺上皮細胞は、例えばSinger et al,Human Immunol.13:161(1985)及びSinger et al,J.Inve st.Dermatol.92:166(1989)に記載されているように培養され単離されうる。培養培地は、EGF,FGF,IGF,及びTGFα／βのような様々な増殖因子、及びインスリン、及び／またはIL-6,IL-8及びIFN-γのようなサイトカインのいずれかを含む。そのように由来した細胞を、例えばDMSOのような凍結防止剤を含む培地においてすぐに用いるかまたは凍結して貯蔵する。上記記載のように、本発明は一つの実施態様として、胸腺間質、特にヒト胸腺間質由来の胸腺微環境の生産法に関し、同じものを用いた一次的な造血幹細胞の樹状細胞への成熟を助ける方法に関する。この実施態様にしたがって、上記記載のようにヒト胸腺組織から得られた胸腺間質細胞（胸腺線維芽細胞及び胸腺上皮細胞）は、例えば培養培地にヒドロコルチゾン(Singer et al,Human Immunol.13 :161(1985))またはデオキシグアノシンのような他のＴ細胞枯渇試薬(Hong,Clin. Immunol.Immunopathol.40:136(1986))を加え過度の洗浄によって、Ｔ細胞が枯渇されている。胸腺上皮細胞に相対的な胸腺線維芽細胞の数の減少は、例えば相補的介在性溶解及び／または放射線照射NIH 3T3線維芽細胞の培養層上で成育によって影響される。上記記載のように調製された胸腺間質細胞カルチャーの単一層は樹状細胞生産のため直接的に用い得、または胸腺間質細胞は、三次元細胞凝集物または小節（実施例１参照）を生産するために人工毛細管系（例えば場合によりProNectin^TMF のコーティングを用いて）において培養されうる。実施例１に記載された方法に加えて、様々な無重力培養法または、低または無剪断ストレスを有する三次元細胞凝集物の生産法もまた、胸腺細胞増殖を最適化するために用い得る。回転壁管 (RWV)法(Schwartz et al,J.Tiss.Cult.Meth.14:51(1992);Tsao et al,The Physi ologist 35:549(1992))は、卵巣ガン細胞(Becker et al,J.Cell.Biochem.51:283 (1993))、一次唾液腺細胞(Lewis et al,J.Cell Biochem.51:265(1993))、正常小腸上皮(Goodwin et al,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.202:181(1993))、及び胚腎細胞 (Goodwin et al,J.Cell Biochem 51:301(1993))を含む多くの上皮細胞タイプの三次元増殖を示している。RWV法は低剪断を維持する一方で、羽根車攪拌バイオリアクターに匹敵する微重力を作り出すので(Spaulding et al,J.Cell.Biochem. 51:149(1993))、この系は植え付けるのに適した機能的な胸腺間質のin vitro増殖のために用いられる。（予備的データは回転培養系（羽根車攪拌バイオリアクター）における増殖及び組織形成は、マイクロキャリアーの減少した凝集とマイクロキャリアー上の細胞配置を引き起こす増大した剪断力(>5-7 dynes/cm²)という剪断力によって制限される。）上記記載の胸腺間質カルチャーを用いた共培養のために適した幹細胞は、ヒト臍帯血、骨髄及びGCSF固定化末梢血液幹細胞(Siena et al,Exp.Hem.23:1463(199 5)(G-PBCS)から得られる。好ましい幹細胞は、CD34⁺CD38^-lin-またはCD34⁺CD38⁺ lin-である。上記細胞は、商業的に入手可能な系列枯渇抗体カクテルと、技術認識細胞ソーティング法を用いて企図したソースから単離されうる（実施例１参照）。実施例１に提示されるデータは、血清フリー培地における胸腺間質単一層上で共培養された臍帯血CD34⁺CD38^-lin-及びcd34⁺CD34⁺lin-造血幹細胞が、胸腺樹状細胞の表現型的、形態的及び機能的性質を有する細胞に発展することを示す。実施例１にも記載されるように、上記示されるように生産される胸腺小節は、幹細胞が小節内へ移動し小節内で分化するような条件下で、幹細胞を用いて該小節をインキュベートすることによって造血幹細胞から樹状細胞を形成することを助ける。ここに記載される胸腺微環境の生産に用いられる胸腺間質細胞は、生成される胸腺樹状細胞の収率及び活性を増大しうるCD40リガンド及びflt-3-リガンドのような様々な因子（例えば分泌因子または表面結合因子）を発現するために遺伝学的に操作されうる。レトロウイルスベクターも、様々な他の操作法と同様に、遺伝学的操作を効果的にするために用い得る。さらに胸腺間質細胞は、特異的なMH C分子を発現するように選択され／デザインされうる。胸腺間質細胞は、形成される造血細胞内に遺伝学的物質をトランスファーするためのパッケージング系として用い得る(Liu et al,Cell 86:367(1996))。上記細胞は例えば、感染に対して防御する能力において（HIVを用いた感染に対して防御するための特異的なMHC 分子）、または感染に対する抵抗性において（HIVを用いた感染を妨げるCCR5ミューテーション）、受容者のものに対して優れた免疫系を再構成するために用い得る。もう一つの実施態様として、本発明は固定化ヒト胸腺上皮細胞、及びそれを生産するための方法に関する。固定化ヒト胸腺上皮間質、及び上記間質から由来する個々のクローン系を確立することは、いくつかの理由のため有用である。ヒト胸腺樹状細胞生産を助ける間質の容易に入手可能であり不変のソースは、実験内の変化を減少し、研究のための胸腺樹状細胞を生産するロジスティックを改良する。固定化胸腺上皮間質系は臨床上の使用のために特に特徴付けられ実証されており、胸腺樹状細胞の生産をスケールアップするために拡大しうる。さらに、胸腺樹状細胞生産の工程で重要であるサイトカインの同定が、上記系の発展により助けられている。本発明のこの実施態様にしたがって、胸腺幹におけるヒト胸腺上皮細胞が、これらの系が増殖しうる通過の数を増大するために、パピローマウイルスE6E7遺伝子のレトロウイルスベクター遺伝子トランスファーを介して固定化しうる(Furuk awa et al,Am.J.Pathol.148:1763(1996);LePoole et al,I，Vitro Cell.& Devel .Biol.Animal 33:42(1997))。TE750と名付けられた一つの上記系は、ブタペスト条約の名の下にAmerican Type Culture Collection,12301 Parklaen Drive,Rock ville,MD 20852,USAに1997年10月10日に寄託され、登録番号を与えられた。 TE750細胞のような細胞が胸腺樹状細胞の生成を助けることを示すために、臍帯血由来のCD34⁺CD38^-lin^-細胞と共に共培養した。CD1a⁺CD14^-HLA DR⁺細胞が生成され、固定化胸腺上皮もまた始原幹細胞から胸腺樹状細胞の形成を助けうることが示された。これらの固定化細胞が可溶性因子を通じて胸腺樹状細胞の生成を助けることを示すために、CD34⁺CD38^-lin^-細胞をTranswellカルチャーの挿入物内におき、細胞−細胞接触を妨げる透過性膜によって胸腺上皮から分離した。標準的な胸腺上皮細胞共培養において成育した細胞と比較して全体の細胞数は減少する一方で、CD1a⁺CD14^-HLA^-DR⁺細胞はTranswellカルチャーにおいて容易に同定されうる。同様な観察は、一次的非固定化胸腺上皮間質を含む共培養物を用いてもなされた。これらの発見は、一次及び固定化胸腺上皮間質の両者によって生産される可溶性因子が、始原幹細胞から胸腺樹状細胞を形成することを助けることを示す。本発明の胸腺間質細胞は、既定義及び未定義の両者の上記因子のソースとして用いられ得る。これらの発見はまた、細胞表面結合因子が胸腺樹状細胞の生成の増幅において重要であることをも示す。C-kitリガンド及びflt-3-リガンドはこの活性を説明する筋の通った候補である(Siena et al,Exp.Hem.23:1463(1995);Sza bolcs et al,J.Immunol.154:5851(1995))。もう一つの実施態様として、本発明は自己免疫疾患を治療するまたは予防する方法に関する。本発明のこの実施態様は、胸腺樹状細胞が自己反応性Ｔ細胞のネガティブな選択において必須の役割を果たすという事実から起因する。したがって、例えば糖尿病または多発性硬化症といった自己免疫疾患（または他の自己免疫疾患）された樹状細胞は、治療または予防プロトコールにおいて用い得る。例として糖尿病を考慮すると、インスリン及び他の島細胞自己抗原（GAD65,GA D67及びICA69を含む）は胸腺において発現され、インスリンmRNAの胸腺内発現は疾患感受性部位によって調節される(Atkinson et al,New Engl.J.Med.331:1428( 1994);Pugliese et al,Nat.Genetics 15:293(1997))。これらの抗原の胸腺発現は、島細胞反応性Ｔ細胞のネガティブな選択及び寛容を介在しうる。寛容が生じるために、これらの抗原はいかなる胸腺間質細胞タイプにおいても大変高いレベルで発現されねばならず、またはそれらはネガティブ選択において特異化される細胞（好ましくは樹状細胞）によって発現されなければならない。本実施態様にしたがって、糖尿病誘発抗原（インスリンのような）を用いてex vivoで増殖されパルスされた樹状細胞は、タイプＩ糖尿病を予防または治療するために用いられ得る。特異的に、好ましくは患者自身の骨髄の幹細胞から生じ、糖尿病誘発抗原(またはコード配列)(Khoury et al,J.Exp.Med.182:357(1995))を用いてパルスされた樹状細胞は、この疾患を治療または予防するために用い得る。上記細胞は静脈内または胸腺内に投与されうる。同様なアプローチは他の自己免疫疾患を治療するためにも用いられ得る。例えば多発性硬化症の場合には、上記記載のように生産された樹状細胞は、ミエリン塩基性タンパク質を用いてパルスされうる。さらなる実施態様として、本発明はここに記載されるように調製された樹状細胞を用いたガンワクチンの生産法に関する。様々なネズミの研究により、in vit roで腫瘍抗原を用いてパルスされ腫瘍を有する動物内にイノキュレートされた場合、脾臓または骨髄から生成または単離された樹状細胞が、大変効力のあるガンワクチンとして機能することが示されている(Porgador et al,J.Exp.Med.182:25 5(1995);Mayordomo et al,Nat.Med.1:1297(1995);Boczkowski et al,J.Exp.Med. 184:465(1996);Alijagic et al,Eur.J.Immunol.25:3100(1995);Bernhard et al, Can.Res.55:1099(1995);Yang et al,Cell.Imnlunol.179:84(1997);Lotze,Ann.Su rg.226:1(1997);Engleman,Biol.Bone Marrow Transp.2:115(1996);Murphy et al ,Prostate 29:371(1996);Tjoa et al,Prostate 27:63(1995);Vieweg et al,Surg .?Oncol.Clin.N.A.4:203(1995);Nair et al.Inter.J.Can.70:706(1997))。より最近いくつかのグループは、樹状細胞ワクチンが安全で効果的に投与され得るかどうかを示すためにデザインされた臨床試験を始めている。これらの試験の大半は、樹状細胞が末梢血液単核細胞から単離または生成されている(Horse et al,A nn.Surg.226:6(1997);Englman,Biol.Bone Marrow Transp.2:115(1996))。最近、血清フリー培地を用い、マクロファージ調製培地を加え、化学療法剤及び／またはサイトカインを用いて治療された後の抹消血液単核細胞を回収することを含む、末梢血液からの樹状細胞の生成の収率、安全性及び効率を改良するためのいくつかの方法が記載されている(Morse et al,Ann.Surg.226:6(1997);Bender et al ,J.Immnol.Meth.196:121(1996);Romani et al,J.Immunol.Meth.196:137(1996);M araskovsky et al,J.Exp.Med.184:1953(1996))。非成熟樹状細胞は成熟樹状細胞よりも適した抗原プロセッサーであるので、非成熟樹状細胞は、樹状細胞ワクチンにおける細胞台として好ましい(Morse et al,Ann.Surg.226:6(1997);Ronlani et al,J.Immunol.Meth.196:137(1997))。この実施態様にしたがって、本発明にしたがって生産された非成熟胸腺樹状細胞は、腫瘍抗原（例えばMAGE,CEA及びhe r-2/neu）(Boon et al,J.Exp.Med.183:725(1996)),または同じものをコードする核酸(RNAまたはDNA)を用いて、例えば標準的な方法によってパルスされる。該パルスされた細胞は、存在する腫瘍を治療するために、または増大した危険を有する患者における腫瘍形成をよぼうするためにワクチン接種治療において用いられ得る(Boon et al,J.Exp.Med.183:725(1996);Hsu et al,Nature Med.2:52(1996)) 。本発明のまたさらなる実施態様において、上記記載のように生産される胸腺微環境は、DiGeorge症候群、Ataxia-TelangiestasiaおよびNezelof's疾患（先天的免疫不全症）、及びAIDS並びに切除化学療法後のガンのような後天的免疫不全症候群を制限することなく含む、先天的及び後天的免疫不全症を治療するための胸腺移植において用いられ得る(mackall et al,N.Engl.J.Med.332:143(1995))。本胸腺微環境は、網または前腕、大腿部及びふくらはぎの各筋肉を制限することなく含む容易に接近可能な筋肉内への移植を含む様々な方法によって患者内に移植されうる。本発明の特定の面は、以下に続く非制限的な実施例においてより詳細に記載される。実施例１ヒト胸腺間質における樹状細胞形成実験の詳細胸腺間質カルチャー：胸腺上皮(TE)細胞及び胸腺線維芽細胞(TF)を外植法によって培養し、記載されたようなNIH 3T3線維芽細胞培養層上で、67％DMEM(Gibco BRL,Grand Island,NY),22% F12(Gibco BRL),5% Fetal Clone II血清(HyClone,Lo gan,Utah),0.4μg/mlヒドロコルチゾン,5μg/mlインスリン,11ng/ml組換えヒト表皮増殖因子(Collaborative Biomedical,Bedford MA),0.18μMアデノシン,10^-1 ⁰ Mコレラ毒素(ICN Biomedicals,Aurora,OH),0.25μg/mlフンギゾン(fungizone) 及び50μg/mlゲンタマイシン(TE培地)を含む栄養培地で増殖させた(Singer et a l,J.Invest.Dermatol.92:166-176(1989),Singer et al,Hum.Immunol.13:161-76( 1985))。ヒト胸腺組織を、矯正心臓血管手術を受けた子供由来の廃棄された組織のとして、the Department of Pathology,Duke University Medical Centerから得た。胸腺間質細胞（胸腺線維芽細胞及びTE細胞）をTE培地での培養によってＴ細胞と分離し、過度に洗浄した。細胞を迅速に用いるか、胸腺間質微環境の再構築のための増殖及び使用の前に7.5% DMSO含有培地において凍結して貯蔵した。混合した胸腺線維芽細胞を、PBSにおいて0.02％EDTAを用いた処理によってTE細胞単一層から除去し、引き続きmAb 1B10を用いて完全に介在される溶解をなし、該mAbはヒト線維芽細胞上の細胞表面抗原に結合する(Singer et al,J.Invest.De rm atol.92:166-176(1989))。TE細胞調製は、ケラチンマーカーAE-3に対して>95%ポジティブであり、CD1a,CD7及びCD14に対してネガティブであった。臍帯血CD34+C D38-細胞を用いて共培養のために、2.5 X 10⁵TE細胞を放射線照射NIH 3T3線維芽細胞培養層上で24穴プレートに接種し、一度細胞が融合したら2500cGyを用いて放射線照射した。胸腺線維芽細胞(TF)を外植法によって得て、NIH 3T3培養層の不存在下でTE培地で成育させた。典型的にはTFはTE細胞より早く成長し、第一の通過によって〜98%精製された。この研究で用いられるTFカルチャーは、M38に対して≧98%ポジティブであり、AE3に対して＜2%ポジティブであり、そしてCD1a,C D7及びCD14に対してネガティブであった。蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)による系列欠損と幹細胞単離：ヒト臍帯血 (UCB)をthe Department of Obstetrics and Gynecology of Duke University Me dical Center由来の廃棄物として得た。これらの研究で用いられるUCBは、抗擬固性クエン酸バッファーを含む滅菌ボトルに集められ、集めた後１８時間以内に加工された。外血液をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を用いて1:2に希釈し、赤血球を1% Hespan(DuPont Pharma,Wilmington,DE)を用いて室温で擬集させた。非凝集白血球を集め、残余の赤血球を10mM Tris-HCl,pH7.2及び200mM EDTA を含む0.17M NH4Clにおいて37℃で溶血させた。系列欠損のため、白血球画分を4 %胎児ウシ血清(FCS)を含むPBS中で6-8 X10⁷胞/mlにし、製品の説明書にしたがって商業的な抗体カクテル及び磁気コロイドの添加を通じて欠損させた(CD34⁺Step Sep富裕化カクテル、StemCell Technologies,Vancouver,BC)。細胞、抗体及び磁気コロイドの混合物を、ラップを巻いた磁石に入ったカラムを通して系列標識化細胞を除去した。カラムを通過した細胞(lin^-細胞)を回収し、10% FCSを有するダルベッコ修飾MEM(DMEM)で洗浄し、氷上で貯蔵した。蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)のために、lin^-細胞をペレット化し、100 μlのPBS/2% FCSに再懸濁し、20-30分抗CD34及び抗CD38を用いてインキュベートした。PBS/2% FCSでの３度の洗浄後、細胞をFACStar Plus細胞ソーター(Becton Dickinson)にソートし、100% FCSを含む滅菌ポリスチレンチューブに集めた。ソート後分析を、分離チューブに回収されフローサイトメーターで再分析された残りの10%の細胞で実施した。ソートされた幹細胞及び胸腺間質単一層の共培養：ソートされたCD34⁺38^-lin- またはCD34⁺CD38⁺lin-細胞を、10³から10⁴細胞／ウェルで放射線照射された融合胸腺間質単一層上で加え、1mLの血清フリー培地で培養した。この培地は、80% I MDH(Gibco BRL),20% BIT 9500(StemCell Technologies),1mg/mlグルタミン,40mg /Lリポタンパク質(Sigma)及び0.1% メルカプトエタノールを用いて作製された。 0.5mLの上清を注意深く除去し、それを新鮮な培地と交換することによって細胞に毎週３回栄養を与えた。抗体試薬：以下の抗原に対するmAbを、間接的免疫蛍光染色に対して用いた：P 3x63/Ag8(IgG1,American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD由来);C Dla(Nal-34,Andrew McMichael由来)(McMichael et al,Eur.J.Immunol.9:205-10( 1979));CD2(35.1,ATCC),CD3(Leu4,Becton Dickinson,Mountain View,CA),CD4(Le u3a,ATCC),CD7(3Ale)(Haynes et al,Proc.Natl.Acad.Sci.76:5829-33(1979)),CD 14(LeuM3)(Dimitriu-Bona et al,J.Imnlunol.130:145-52(1983)),AF3(TT Sun由来のケラチン)(Woodcock-Mitchell et al,J.Cell.Biol.95:580-88(1982)),1B10( 線維芽細胞)(Singer et al,J.Invest.Dermatol.92:166-176(1989)),M38(Ｉ型プロコラーゲンのC末端領域)(McDonal et al,J.Clin.Invest.78:1237-44(1986))、及びフルアレセイン接合ヤギ抗マウスIg(Kirkegaard & Perry Laboratories,Gai thersburg,MD)。以下の抗原に対する直接的接合抗体もまた、細胞表面抗原の多色分析のために用いた：CD2(leu5,FITC),CD3(Ieu4,PerCP),CD5(leu1,PE),CD7(1e u9,FITC),CD8(SK1,FITC),CD11c(S-HCL-3,PE),CD14(MfP9,FITC),CD16(B73.1,FITC ),CD19(leu12,FITC),CD25(2A3,FITC),CD33(1euM9,PE),CD34(HPCA2,FITC,PE and Cy),CD38(leu17,PE),CD56(leu19,PE),CD80(L307.4,PE)HLA-DR(L243,FITC),Becto n Dickinson Immunocytometry System由来のIgG1(X40,FITC and PE)(BDIS,San J ose,CA);CD1a(T6,PE),CD4(T4,PE),及びCoulter(Hialeah,FL)由来のCD83(HB15a,P E);Immunotech,Inc.(Westbrook,ME)由来のCD3(UCHTI,Cy);CD1a(HT149,FITC),CD2 (PRA-2.10,Cy),CD40(5C3,FITC),CD86(2331(FUN-1),FITC),CD95(DX2,FITC),HLA A ,B,C(G46-2.6,FITC)及びPharMingen,Inc.(San Diago,CA)由来のIgG1(MOPC-21,Cy ):及びDako Corporation(Carpenteria,CA)由来のCD8(DK25,RPE-Cy5)及びCD13(F0 831,FITC)。フローサイトメトリーを用いた表現型分析：培養細胞のFACS分析のために、細胞を胸腺単一層をバラバラにしないように穏やかに再懸濁し、ペレット化し100 μlのPBS/4% FCSに再懸濁し、氷上に放置した。フルオレセイン接合抗体を細胞懸濁液に直接加えた。4℃で20-30分のインキュベートの後、該細胞をPBS/4% FCS で３回洗浄した。必要であれば、該細胞をPBS/2% FCS中の1%ホルムアルデヒドで固定した。不適切なアイソタイプマッチmAbを、ネガティブコントロールとして用いた。表面染色の定量を、FACScan及びFACScalibur(Becton-Dickinson)で、フルオレセイン励起のため488アルゴンレーザーを用いて実施した。データをCe1ll Questソフトウェアー(Becton Dickinson)を用いて分析した。全ての実験において、アイソタイプマッチコントロール抗体を用いて染色された細胞が、該細胞の <1%がポジティブと考えられるようにカーソルをセットするために用いられた。顕微鏡：ソートされた細胞を100RPMで３分Shadon細胞遠心分離器(Shadon Sout hern Instrument Co.,Sewickley,PA)を用いてガラススライド上で遠心分離した。サイトスピンを空気乾燥し、Wright Giemsa染色を用いて染色し、光学顕徴鏡によって調べた。透過型電子顕微鏡のために、胸腺小節及びソートされた細胞を 150nMカコジル酸ナトリウムバッファープラス2.5mM CaCl₂,pH7.2中の2%グルタルアルデヒドを用いて固定し、洗浄し、1%アガーに寝かせた。固定後１時間氷上で 2%四酸化オスミウムプラス1%フェロシアン化カリウムを用いた後、ブロックをカコジル酸バッファーを用いて洗浄し、引き続き200mM酢酸ナトリウム,pH5.2を用いて洗浄した。サンプルを酢酸ナトリウムバッファーで1%酢酸ウラニルを用いて１時間ひとまとめにして染色した。エタノールを用いた脱水後、該ペレットをEM BED 812(EM Sciences,Fort Washington,PA)を用いて浸透させ、それの中に寝かせた。90nmの切片をReichart Ultracut Eミクロトーンでカットし、酢酸ウラニルを用いて染色し、Satoリードが引き続き、洗浄してPhilips EM300電子顕微鏡( Philips,Eindhoven,The Netherlands)を用いて調べた。混合リンパ球反応：健康なドナーから得た異質遺伝子型反応性PBMC(1.5X10⁵) を、96穴U字底組織培養プレートに10% FCSまたは10%ヒトAB血清を補ったRPMI 16 40内で培養した。放射線照射された(3500rads)ソートされたCD1a+CD14-及びCD1a -CD14+細胞を200μlの全容量で1.5X10²(1:1000)から1.5X10⁴(1:10)の段階的容量で加えた。９６時間後の細胞増殖を、各ウェルに1μCi(37kBq)の[メチル³H]チミジン(NEN-Dupont,Boston,MA)を加えることによって定量した。16時間後該細胞をフィルター上に集め、放射性活性をシンチレーションカウンターで測定し、その結果を三重のサンプルに対する平均cpmとして提示した。胸腺間質微環境小節の形成：培養胸腺間質細胞を、毛細管に対する間質細胞の接着を促進するためにProNectin^TMFのコーティングを用いて人工的毛細管系(Ce1 1max;Cellco,Inc.,Germantown,MD)に共培養した。20-100X10⁶胸腺間質細胞（抗ケラチン抗体AE-3を用いた反応性によって95%TE細胞、そして抗プロコラーゲン抗体M38を用いた反応性によって5%TF細胞）を、12mlの毛細管外スペースで毛細管小節当たり植えた。TE培地(Singer et al,Hum.Immunol.13:161-76(1985))を、 10ml/分の割合で毛細管を通じて押し込んだ。2-6週内に、1-2mmの小節が毛細管小節の毛細管外スペースに視覚的観察によって容易に明らかになった。滅菌パイプカッターを用いて単位ごとにカットすることによって小節を回収した。外小節を滅菌ラバーポリスマンを用いて剥ぎ取ることによって毛細管から分離し、5% F CSを含むDMEを用いて洗浄した。103から104細胞／ウェルでソートされたCD34+38 -lin-またはCD34+CD38+lin-細胞を、およそ10ミクロ小節／ウェルを含む24穴プレート上に加え、1mLの血清フリー培地で培養した。結果 CD34+臍帯血細胞は胸腺間質細胞単一層上でCD1a+細胞に分化する：ヒト胸腺間質が造血幹細胞からDCの形成を助けるかどうかを測定するために、CD34⁺CD38^-li n-(図１ＡにおけるR2)及びCD34⁺CD38⁺lin-臍帯血細胞（図１ＡにおけるR1）を、滅菌細胞ソーティング、及び前もって確立された放射線照射ヒト胸腺間質単一層を用いた共培養によって単離した(Herbein et al,Stem Cells(Dayt)12:187-97(1 994),Terstappen et al,Blood777:1218-27(1991))。共培養の前に、ソートされた集団は98%より高い純度を有し（図１Ｂ及び１Ｃ）そして>98%CD1a-であった（図１Ｄ）。21日間の血清フリー培地における胸腺単一層を用いた共培養に引き続き、CD34⁺CD38^-細胞は43±17倍(N=3)に増殖し、CD34⁺CD38⁺細胞は32±16倍(N=3) に増殖した。血清フリー培地単独で培養されたUCB幹細胞は増殖もせず形態学的な変化もなかった。共培養した細胞の免疫学的表現型分析により、ヒトDCの以前に記載されたのと同様なCD1a⁺CD14^-HLA-DR⁺細胞（図１及び２）の数の存在が明らかにされた(Caux et al,Blood Cell Biochemistry 7:263-301(1996))。CD34+CD38-細胞から生成されたCD1a⁺CD14^-細胞のパーセンテージは、5-15%(平均8.2% N=3)の範囲であり、CD34+CD38-細胞から生成されたものは2-10％(平均4.8% N=3)の範囲であった。CD1a+CD14-細胞はCD34+CD38-lin-及びCD34+CD38+1in-集団の両者から生成されうるという観察は、これらの細胞タイプの両者が胸腺間質単一層におけるDC内で形成されうることを示唆した。胸腺間質内で増殖したCD34+細胞の形態：胸腺単一層において成育したCD1a+細胞がDCであることを確認するために、CD34+CD38-lin-及びCD34+CD38+lin-臍帯細胞の両者から21日の培養の後生成されたCD1a⁺CD14^-細胞を、FACSによって単離し光学及び電子顕微鏡によって調べた。CD1a-CD14+細胞はまた、コントロールとして機能する両カルチャーからソートされた。ソートされた細胞の分析により、97 %より大きい純度が明らかにされた。光学顕微鏡によってCD1a⁺CD14^-細胞は不規則な形態で複数の樹状プロセスを持った形態を有した。EMによる超構造の観察により、CD1a⁺CD14^-細胞が真正染色質の小葉に分かれたまたはでこぼこの核、及び粗面小胞体とよく発達したゴルジ装置を有するきれいな細胞質を有することが示された。これらの細胞はBirbeck小胞を含んでいなかった。これらの発見は、これらの細胞が成熟胸腺タイプDCであるということと一致する。対照的に、両前駆体タイプ由来のコントロールCD1a^-CD14⁺細胞はマクロファージの形態学的外観を有し、でこぼこの核と小胞の多い細胞質を有し、細胞質樹状突起の証拠は存在しなかった。胸腺間質において増殖したCD1a+細胞の免疫学的表現型：胸腺単一層上でUCB幹細胞から生成されたDCをよりよく特徴付けるために、極端な表現型評価をマルチパラメーターFACS分析を用いて実施した（図２）。CD34+CD38-lin-UCB細胞から胸腺間質上で生成されたCD1a⁺細胞は、表面CD3,CD8,CD19,CD25,CD34及びCD95に対してネガティブであり、CD2,CD4,CD11c,CD13,CD16,CD33,CD38,CD40,CD45,CD49 e, CD80,CD83,CD86,MHCクラスＩ及びMHCクラスIIを発現した。抗原提示細胞として機能する胸腺間質において生成されたCD1a+CD14-及びCD1a -CD14+細胞の分析：胸腺間質上で生成された推定のDCがＴ細胞を活性化できるかどうかを測定するために、CD1a+CD14-及びCD1a-CD14+細胞をFACSによってソートし異種遺伝子型MLRにおいて試験した。CD1a+CD14-細胞は、CD1a-CD14+細胞よりM LRにおいてずっと潜在的な刺激因子であった（図３）。さらに、CD34+CD38-lin- UCB細胞から生成されたCD1a+CD14-細胞は、CD34+CD38+lin-細胞から生成されたC D1a+CD14-細胞よりも細胞当たりの標準でMLRのより潜在的な刺激因子であった（図３）。これはより原始的な幹細胞がDCのより多くの数を生産するだけでなく、これらのDCがより成熟した幹細胞から生成されるDCとは質的に異なることを示唆する。胸腺DC上のTNF-aの効果：胸腺間質と共培養されたCD34+CD38-lin-UCB幹細胞上でのCD1a及びCD14発現の分析により、細胞のいくつかの表現型的樹状集団の存在が明らかにされた。この観察の一つの可能性のある説明として、共培養が発達の複数の段階でDCを含むことが考えられる。この仮説を試験するために、共培養物を以前にDC成熟因子と記載されたTNF-α(10ng/ml)を用いて48時間処理した(Caux et al,Blood Cell Biochemistry 7:263-301(1996),Caux et al,J.Exp.Hed.184: 695-706(1996),Caux et al,Nature360:258-61(1992))。TNF-α処理は、CD34+CD3 8-lin-幹細胞から由来する数多くの細胞上でCD1a,CD83,CD80及びCD86の発現を誘導した（図４５）。さらにこれらの細胞のほとんどは樹状細胞形態を示した。CD 34+CD38+lin-細胞を用いて確立された共培養物のTNF-α処理は成熟DCマーカーを有する細胞の画分の増大を引き起こす一方で、DCマーカーを発現する全ての細胞が観察されるわけではなく、CD1a-CD33⁺細胞の有意な数が観察された。これは、これらのカルチャーが非DCミエロイド細胞の有意な画分を含むことを示唆した。これは、TNF-αを用いて処理されたCD34+CD38+lin-共培養物において異なる成熟段階の好中球及びマクロファージを含むたくさんのミエロイド系列細胞を明らかにする光学顕微鏡観察によって確認された。培養胸腺上皮細胞及び胸腺線維芽細胞由来の胸腺微環境小節の形成：胸腺間質単一層は胎児胸腺器官で見られるような再凝集カルチャーの充分に分化した能力を有していないので(Barcena et al,J.Exp.Med.180:123-32(1994),Res et al,Bl ood 87:5196-206(1996),Spits et al,Blood 85:2654-70(1995))、そして研究のため十分なヒト胎児胸腺を得ることが困難なため、カルチャー系は培養された出生後TE細胞及び胸腺線維芽細胞の三次元凝集を形成するために発達した。人工的毛細管系における共培養の2-6週後、ヒト胸腺線維芽細胞及びTE細胞は造血細胞の存在しない胸腺間質微環境に一致する形態及び表現型を有する1-2mmの小節を形成するために凝集した(N=10)(図５)。該小節は、プロコラーゲンポジティブ線維芽細胞の一層によって封入された線維芽細胞マトリックス（TE7によって同定された）におけるTE細胞（ケラチンポジティブ）を含んだ。透過型電子顕微鏡によって、該胸腺間質小節はたくさんのデスモソーム及びヘミ−デスモソームを含み、そのことは小節内の上皮細胞月有情の胸腺で見られるものと同様のネットワークを連結し形成しうることを示す(Haynes et al,J.Exp.Med.159:1149-68(1984 ),Haynes et al,J.Immunol.132:2678(1984))。小節内のTE細胞は、mAb STE1,TE2及び11.24(CD44v9)との反応性の欠如によって測定されるように最終的に分化せず(Patel et al,J.Clin.Immunol;.15:80-92( 1995))、そしてそれらはHassall's体を形成しない。このパターンはひどい合併した免疫不全症を有する患者の胸腺間質で見られるものと同様である(Haynes et al,J.Exp.Med.159:1149-68(1984),Patel et al,Int.Immunol.6:247-254(1996)) にレビューされている）。 CD34+臍帯血細胞はDC形態を有するCD1a+細胞内に胸腺小節において分化する：胸腺小節の機能的状態を試験するために、臍帯血造血細胞前駆体がin vitroで小節内に移動しそこで分化するかどうかについての評価をなした。lin-UCB細胞を3 7℃で血清フリー培地において24穴平底プレートにおいて胸腺小節とインキュベートした。胸腺小節との共培養の28日後に、該小節をＴ及びNK細胞(CD1a,CD3,CD 7)、幹細胞(CD33,CD34)、ミエロイド細胞(CD14)、及びDC(CD1a,CD83)のマーカーに対して分析した。UCB幹細胞の不存在下で培養された小節もまた分析した。CD3 またはCD7を発現する細胞は間接的免疫蛍光によって該小節において検出されなかった。しかしながら、lin-UCB細胞を用いて接種された小節における樹状形態を有する多くのCD1a^bright細胞が存在した（図６Ｂ）が、UCB細胞なしで培養された小節内には存在しなかった（図６Ａ）。CD1a^bright細胞はCD33^lo及びCD83- であった。さらに０日目では、lin-細胞はCD1aを発現せず、CD1a⁺細胞が小節内の幹細胞の分化から由来し、lin-集団に混在した樹状細胞の自発的な増殖から由来したものではないことを示唆した。併せて考えると、これらの発見は幹細胞が胸腺小節内に移動し、胸腺間質小節はCD34+lin-UCB細胞のDCへの発達を助けることができることを示す。実施例２スローターニング側面管(STLV)(Synthecon,Inc.,Friendwood,TX)を、TE細胞及び胸腺線維芽細胞(TF)の増殖及び分化についての低液体剪断力の有用性を評価するために用い得る（典型的には0.81dyn/cm²;Tsao et al,The Physiologist 35:5 49(1992))。GHで満たされたSTLVを（表１）Vytodex-3ミクロキャリアービーズ（コラーゲンコート化デキストラン,Pharmacia)を用いて10細胞／ビーズの濃度でイノキュレートしうる。ビーズに対してTFまたはTE細胞のそれぞれの付着の後、該管を７日間、0.51dyn/cm2から0.92dyn/cm2の範囲の計算された剪断力で回転しうる(Tsao et al,Yhe Physiologist 35:549(1992);Goodwin et al,Proc.Soc.Exp .Biol.Med.202:181(1993))。等量のビーズを1-2日ごとに除去し、細胞数と生存能をGoodwin et al,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.202:181(1993)の方法によって計測する。凝集形成を光学顕微鏡及び走査型電子顕微鏡の下での視覚的観察によって評価する。上皮細胞分化の状態を測定するために、間接的免疫学的蛍光研究を、ミクロキャリアーの凍結切片に対するmAb STE1,STE2,A3D8及び11.24を用いて(Pa tel et al,Int.Immunol.7:277(1995))、またはコラゲナーゼ処理によりCytodex- 3ビーズから遊離した細胞に対する免疫学的蛍光及びフローサイトメトリーによって実施する。表１胸腺上皮(TE)栄養培地の構成成分構成成分最終濃度提供者 DMEM ６７％ Gibco F12 ２２％ Gibco 胎児クローンII ５％ HyClone ヒドロコルチゾン 0.4μg/ml Calibiochem コレラ毒素 10^-10M Schwarz/Mann インスリン 0.1351.U./ml Sigma アデニン 0.18μM Sigma ピルビン酸ナトリウム 110μg/ml Gibco EGF^* 11.2μg/ml Amgen フンギゾン 247ng/ml Gibco ゲンタマイシン 50μg/ml Whitaker ^*組換えヒトEGF TE細胞を成育することについての問題の一つは、二次元的組織カルチャー系におけるTE細胞よりも急速に分裂する線維芽細胞の過剰増殖にある。TF及びTE細胞の成育は、実施例１に示されているように平面の表面におけるよりも定住カセットにおいて異なる。線維芽細胞過剰増殖の問題は、線維芽細胞特異的mAB 1B10を用いた処理の後相補的に介在される溶解によってTFの系を浄化することによって回避しうる(Singer,J.Invest.Dermatol.92:166(1989))。しかしながら胸腺線維芽細胞は、TE細胞増殖に対して刺激性である。それ故線維芽細胞の過剰増殖を避けるがTE細胞増殖及び組織構造に対するその影響を維持するために、TF及びTE細胞を最適なTE細胞に対するTFの割合を決定すべくSTLV内のCytodex-3ミクロキャリアービーズに対して異なる割合(1:1,1:5及び1:25)で共培養しうる。細胞数、生存能及び分化状態を、上記のように評価する。TF細胞を、細胞標本または切片に対する抗ケラチン抗体mAb AE-3との反応性によって、またはCD104及びCD105に対する抗体を用いてフローサイトメトリーによってTE細胞から分別する。TE細胞は細胞質ケラチン及びCD104を発現する一方で、TFは発現しない。TFは表面CD105を発現する。組織構造を評価するために、免疫学的蛍光を、mAb AE3(TE細胞に対するラベル）、TE'(TFに対するラベル)及びSTE1とSTE2(TE細胞の分化状態を評価するため）を用いてビーズの凍結切片で実施する。TE細胞（TF細胞はない）はトノフィラメント及びデスモソームを含むので、TE細胞からTF細胞を容易に分別しうる透過型電子顕微鏡によって組織構造を分析する。 EGF、インスリン及びIL-6はヒトTE細胞に対する増殖因子であり、これらの因子の組み合わせはTE細胞の増殖を改良する。Le et al,J.Exp.Med.174:1147(1991 )は、TGF-αがTE細胞に対する増殖因子であり、TGF-βはTE細胞増殖に対して阻害的であることを提案する。IL-8はTE細胞に対するオートクリン増殖因子であり、または表面分子の発現に影響する。TE細胞カルチャーの増殖及び寿命の割合を増大するために、EFG,FGF,TGF-α,TGF-β,IL-6及びIL-8を、TE細胞及び／または線維芽細胞増殖を補うために単独でまたは組み合わせて用い得る。これらの因子は増殖及び分化に影響するだけではなく、Ｔ細胞形成に関与するアドヘシン及び MHC分子の発現にも影響する。これらの因子の効果を、TE細胞上に発現された表面分子の発現に対する間接的免疫学的蛍光及びフローサイトメトリーによって測定する。前駆体または成熟Ｔ細胞がミクロ重力で成育する胸腺間質組織に移動するかを確立するために、胸腺間質移植片を以前に報告された方法を用いてSCIDマウスの腎カプセルの下に移植する(Barry et al,J.Exp.Med.173:167(1991))。SCIDマウスを内生NK細胞活性を終わらせるために抗アジアロGM-1を用いて処理する。該移植片に移動する自己及び異種胸腺細胞の能力を、50X10⁶胸腺細胞のIP注入によって試験する。移植片への移動を抗ヒトCD2,CD3,CD4,CD6,CD7及びCD8mAbを用いてI Fによって評価する（全てＴ細胞形成の異なる段階で胸腺細胞に特異的である）。ミクロ重力において成育する胸腺間質細胞カルチャーが、in vitroで胸腺細胞分化を誘導するために機能するかどうかを測定しうる。自己胸腺細胞、三重ネガティブ(CD3-4-8-,CD7+)及び二重ポジティブ(CD31o4+8+)の両者の非成熟集団を、 Be cton-Dickinson FACStar^Plus上でのパンニング及び蛍光活性化細胞ソーティング (FACS)の組み合わせによって細胞表面抗原の発現に基づいて精製する。非成熟胸腺細胞を、Narishigiミクロマニピュレーターを用いて自己間質組織（ミクロ重力でin vitroで成育された）内に注入し、コントロールとして自己胸腺の欠失塊内に注入する。in vitroでの培養後、４週間間隔で回収した組織の等量を、CD1, CD2,CD3,CD4,CD6,CD7及びCD8に対するmAbを用いて凍結切片に対するIFによってＴ細胞の分化について分析する。上記引用された全ての文書は、参考として完全にここで取り込まれる。当業者は、形態及び詳細において様々な変化が本発明の真の範囲から離れることなくなされうることを、本開示を読むことから理解しうるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/21 Ａ６１Ｋ 39/21 39/245 39/245 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 25/00 25/00 31/18 31/18 31/22 31/22 35/00 35/00 37/06 37/06 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者ペイテル，ダヴァルクマールディーアメリカ合衆国ノースキャロライナ 27712 ダーハムディアチェイスウィンド 3012 (72)発明者スミス，クレイトンエーアメリカ合衆国ノースキャロライナ 27707 ダーハムユニヴァーシティドライブ 3611 アパートメント 13アール (72)発明者ミラールズ，ジーディエゴアメリカ合衆国ノースキャロライナ 27278 ヒルズボローセイントメリーズロード 6904

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト樹状細胞を生成する方法であり、 (i)ヒトドナーから胸腺細胞を摘出すること (ii)工程(i)由来の摘出細胞を培養すること (iii)ヒト造血幹細胞が樹状細胞に発達するような条件下で上記幹細胞に工程(ii )から生じた細胞をさらすことを含む方法。２．工程(ii)から生じた細胞が胸腺間質単一層として存在する請求項１記載の方法。３．工程(ii)から生じた細胞が胸腺間質小節として存在する請求項１記載の方法。４．工程(iii)において、工程(ii)から生じた上記細胞を上記幹細胞と接触させる請求項１記載の方法。５．上記(ii)の上記培養が、上記摘出物に存在するＴ細胞を欠損するような条件下でなされる請求項１記載の方法。６．上記さらすことがin vitroでなされる請求項１記載の方法。７．上記さらすことがin vivoでなされる請求項１記載の方法。８．上記幹細胞が臍帯血、骨髄または末梢血液から得られる請求項１記載の方法。９．上記幹細胞がlin-細胞である請求項１の方法。 10．上記幹細胞がCD34⁺lin-細胞である請求項１の方法。 11．ヒト樹状細胞を生成する方法であり、ヒト造血幹細胞が上記樹状細胞に発達するような条件下で上記幹細胞に固定化ヒト胸腺上皮細胞をさらすことを含む方法。 12．上記胸腺上皮細胞がパピローマウイルスE6E7遺伝子をコードするベクターを含む請求項１１記載の方法。 13．上記胸腺上皮細胞を上記幹細胞と接触させる請求項１１記載の方法。 14．パピローマウイルス遺伝子をコードするベクターを含むヒト胸腺上皮細胞。 15．上記パピローマ遺伝子がE6E7遺伝子である請求項１４記載のヒト胸腺細胞。 16．上記細胞がTE750細胞である請求項１４記載のヒト胸腺細胞。 17．請求項１または１１記載の方法によって生産される樹状細胞。 18．自己免疫疾患を治療または予防する方法であり、 (i)免疫応答を上記疾患に向ける抗原、または上記抗原をコードする核酸を、上記抗原が上記樹状細胞の表面に提示されるような条件下で、請求項１７記載の樹状細胞内に導入すること、及び (ii)上記治療または予防がなされるような条件下で上記治療または予防の必要のある患者内に工程(i)から生ずる上記樹状細胞を導入することを含む方法。 19．上記自己免疫疾患が糖尿病または多発性硬化症である請求項１８記載の方法。 20．ガンを治療または予防する方法であり、 (i)腫瘍抗原、または上記抗原をコードする核酸を、上記抗原が上記樹状細胞の表面に提示されるような条件下で、請求項１７記載の樹状細胞内に導入すること、及び (ii)上記治療または予防がなされるような条件下で上記治療または予防の必要のある患者内に工程(i)から生ずる上記樹状細胞を導入することを含む方法。 21．宿主による移植片の拒絶を予防する方法であり、 (i)上記移植片の免疫学的反応性抗原、または上記抗原をコードする核酸を、抗原が上記樹状細胞の表面に提示されるような条件下で、請求項１７記載の樹状細胞内に導入すること、及び (ii)上記予防がなされるような条件下で上記宿主内に工程(i)から生ずる上記樹状細胞を導入することを含む方法。 22．病原体を有する患者の感染から生ずる疾患を治療または予防する方法であり、 (i)上記病原体の抗原、または上記抗原をコードする核酸を、上記抗原が上記樹状細胞の表面に提示されるような条件下で、請求項１７記載の樹状細胞内に導入すること、及び (ii)上記治療または予防がなされるような条件下で上記患者内に工程(i)から生ずる上記樹状細胞を導入することを含む方法。 23．上記病原体がウイルスまたは微生物である請求項２２記載の方法。 24．上記病原体がCMV,EBVまたはHIVである請求項２３記載の方法。