JP3160600B2 - ヒト造血幹細胞 - Google Patents

ヒト造血幹細胞

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の分野は造血幹細胞の
単離、再生及び使用である。
【０００２】
【従来の技術】哺乳類の血液細胞は並はずれて多様な範
囲の活性を提供する。血液細胞はリンパ球系、骨髄系及
び赤血球系をはじめとするいくつかの系(lineage) に分
けられる。Ｂ細胞及びＴ細胞を含むリンパ球系は抗体の
産生、細胞免疫系の調節、血液中の外来物質の検出、宿
主にとって外来性の細胞の検出等を提供する。
【０００３】単球、顆粒球、巨核球及び他の細胞を包含
する骨髄系、例えば、血液流中の外来物質の存在を監視
し、腫瘍細胞(neoplastic cells)に対しての保護を与
え、血流中の外来物質を除去し、血小板を生産する。赤
血球系は酸素運搬体として作用する赤血球を供給する。
【０００４】血液細胞の性質、形態、特性及び機能の多
様性にも拘らず、自己再生することができ、かつ成長因
子へ接すること(exposure)によって特定の系になること
ができる単一の先祖があると現在考えられている。
【０００５】幹細胞集団は骨髄中の総白血球数の小さな
パーセンテージしか構成しない。加えて、現在のところ
分化細胞に関与するどれぐらいの数のマーカーが幹細胞
上に存在するのか分らない。先祖の活性の幾分の増強を
与えると報告されたあるマーカーはクラスIIHLA(特に J
I-43と名づけられたモノクローナル抗体によって認識さ
れる保存ＤＲエピトープ（抗原決定基))である。
【０００６】しかしながら、これらのマーカーは多数の
系に付された(committed) 造血細胞(hematopoietic cel
ls) 上に見い出されている。幹細胞CD34上に存在するこ
とが示された１つのマーカーはかなりの数の系統に付さ
れた先祖上にも見い出されている。特に、Ｂ細胞（CD19
+ ) 及び骨髄系細胞（CD33+ ) はCD34+ 集団の80−90％
を構成する。しかも、CD３，８，10，15，19，20及び33
の組合せはすべてのCD34+ 細胞の＞90％を標識する(mar
k)であろう。
【０００７】従って、幹細胞である骨髄中の細胞の総数
の小さな集団、より分化した細胞とは別個の幹細胞に関
与するマーカーの不確かさ(unertainty)、生物学的アッ
セイのヒト幹細胞に対する一般的無能力の観点から、幹
細胞の同定及び精製はつかまえどころがなかった。
【０００８】最近、マウス幹細胞が精製された形態では
ないが少なくとも高度に濃縮された形態で得られたが、
そこでは骨髄から得られた約30より少ない細胞が致命的
に照射されたマウスの造血系のすべての系を再構成する
ことができた。実際、１個の注入された細胞でもすべて
の造血系を再構成することができるであろう。
【０００９】Thy-1分子はラット、マウス及びヒトの脳
及び造血系に存在する高度に保存されたタンパク質であ
る。これらの種はこの抗原を区別をつけて(differentia
lly)発現するが、この分子の真の機能は知られていな
い。しかしながら、 Thy-1分子はラット及びマウスの造
血幹細胞上で同定された。この蛋白質はまたヒトの骨髄
細胞上にも存在し、造血幹細胞の選択に有用である。
【００１０】ヒトの造血幹細胞の同定に対して強い関心
がよせられている。幹細胞を手にすることによりその自
己再生に関与する成長因子の同定が可能になるであろ
う。加えて、（１）幹細胞の特定の系統への献身(dedic
ation)の初期の工程、（２）かかる献身の防止、及び
（３）幹細胞増殖の負の制御、に関与する未発見の成育
因子があるかもしれない。
【００１１】幹細胞を利用できると、骨髄移植のみなら
ず骨髄の移植と共に他の器官の移植に非常に有用であ
る。幹細胞は遺伝子治療の重要なターゲットであり、そ
こでは挿入された遺伝子が幹細胞を移植した個人の健康
を促進する。
【００１２】加えて、幹細胞を単離できると、リンパ腫
及び白血病、さらには他の腫瘍状態、例えば胸癌の治療
に役立つかも知れない。かくして、実質的に純粋である
かまたは純粋な形態でヒト造血幹細胞を単離することに
向けての世界的規模での努力がなされてきた。
【００１３】
【従来の技術】米国特許 4714680はヒト幹細胞を含有す
る組成物を記述している。ヨーロッパ特許公開(EPA)89.
304651.6はマウス幹細胞の単離を記述している。そこで
引用された文献も参照されたい。造血系先祖の分析はWh
itlock及びWitte, PNAS USA (1982) 79：3608及びWhit
lockら、Cell (1987) 48：1009によって報告されてい
る。
【００１４】Thy-1は齧歯動物の骨髄細胞を再構成する
ことについての表面マーカーである（Berman及び Braus
h Exp. Hematol. (1985) 13：1952及び Goldschneider
ら、J.Exp.Med. (1978) 148 ：1351) 。 Mueller-Siebu
rgら、Cell (1986) 44：653 はThy-1 Lin- マウス造血
幹細胞及び制御希釈(limitdilution) の使用を記述して
いる。
【００１５】
【発明の概要】ヒト造血幹細胞の実質上均質な組成物の
単離をもたらす方法が提供される。この方法は予め定め
られた分離方法及び単離された細胞からの各造血系の発
生を確立するバイオアッセイを採用する。
【００１６】ヒト幹細胞は（１）幹細胞を欠く宿主の造
血系の再生、（２）病気にかかっており、骨髄の取り出
し、幹細胞の単離及び幹細胞の再移植(re-engraftment)
に先立つ薬物または照射による個々体の治療によって治
療し得る宿主、（３）種々の造血細胞の生産、（４）幹
細胞自己再生に関与する成育因子の検出及び評価、
（５）造血細胞系の発生、及び造形系の発生に関与する
因子についてアッセイ、及び（６）自系幹細胞における
遺伝子置換による遺伝病の治療に、用途を見い出す。
【００１７】
【具体的態様の説明】実質上特定の系統に捧げられた
（付された)(dedicated)細胞及び系への献身(dedicatio
n)に関与するマーカーを有する細胞を含有しないヒト幹
細胞組成物が提供され、そこで、幹細胞は再生し分化し
て種々の造血系を生成させることができる。
【００１８】実質上均質な組成物は分化細胞と関連する
マーカーを欠き、他方幹細胞に関連するエピトープの特
性を示す細胞の選択的単離によって、及び定められた培
養系で、異なる造血細胞系をもたらす、単離した幹細胞
を再生することによって得ることができる。
【００１９】幹細胞は抗体によって同定される特異的な
エピトープ部位と関連するマーカーの存在、及びある種
の抗体の結合の欠如によって同定されるある種のマーカ
ーの不存在によって特徴づけられる。
【００２０】選択を幹細胞に特異的なマーカーを用いて
行うことは必要ない。負の選択（細胞の除去）と正の選
択（細胞の単離）の組合せを用いることによって実質上
均質な幹細胞組成物を得ることができる。
【００２１】望まれる場合には、最初に「比較的粗い」
分離によって大部分の分化細胞を除去することも可能で
ある。細胞の由来は骨髄；胎児、新生児もしくは大人や
他の造血細胞源、例えば胎児肝臓、末梢血液、臍帯血等
であることができる。
【００２２】例えば、まず最初に、多数の系統に付され
た(committed) 細胞、すなわちＴ細胞、Ｂ細胞、（プレ
Ｂ及びＢ細胞）、骨髄単球細胞等の系をはじめとする造
血系の大部分の細胞集団、または巨核球、肥満細胞、好
酸球及び好塩基球等の少数の細胞集団を除去するために
磁気ビーズ分離を用いることができる。
【００２３】望ましくは、全造血細胞の少なくとも約70
％、通常少なくとも80％が除去される。初期の段階では
あらゆる献身した(dedicated) 細胞クラス、特にマイナ
ー集団メンバーを除去する必要はない。通常、区分け(s
orting) に先立って血小板及び赤血球を除去する。
【００２４】プロトコル中に正の選択があるので正に選
択されるマーカーを欠く系統に付された細胞は取り残さ
れる。しかしながら、すべての系統に付された細胞系に
対する負の選択があるのが好ましく、その結果最終の正
の選択において存在する系統に付された細胞の数を最小
にすることができる。
【００２５】幹細胞はその多くの場合、CD34+ ， CD
3- ， CD7- ， CD8- ，CD10- ，CD14-，CD15- ，CD1
9- ，CD20- ，CD33- 及び Thy-1+ であることによって
特徴づけられる。幹細胞が高度に濃縮された細胞組成物
はCD34+ ，CD10- ，CD19- 及びCD33 - であり、より特定
的にはさらに CD3- 及び CD8- であり、好ましくはさら
に Thy-1+ である。
【００２６】CD3- ， 8- ，10- ，19- ，20- 及び33-
は Lin- という。CD10／19／20マーカーはＢ細胞と関連
を有し、CD３／４／８マーカーはＴ細胞と関連を有し、
CD４／15／33細胞マーカーは骨髄系細胞と関連を有す
る。 Thy-1マーカーはヒトＴ細胞には欠如している。
【００２７】また、ヒトCD34+ についてはローダミン(r
hodamine)123が細胞を高いサブセットと低いサブセット
に分けることができる。マウス幹細胞に関してのローダ
ミン123 の使用の記述について Spangrude, (1990) Pro
c.Natl.Acad.Sci.87, 7433を参照されたい。好ましくは
細胞はローダミン低(low) である。
【００２８】主題の幹細胞を得るには、骨髄または他の
造血源中の他の細胞から希な多能性のヒト幹細胞を単離
することが必要である。まず、骨髄細胞は骨髄源、例え
ば腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊椎または他の骨腔(bone ca
vity) から得ることができる。ヒト造血幹細胞の他の入
手源は胚卵黄包、胎児肝臓、胎児及び成人の脾臓、成人
末梢血液及び臍帯血をはじめとする血液を包含する。
【００２９】胎児骨または他の骨源からの骨髄の単離に
際しては、骨から洗い出す(flush)のに適当な溶液を用
いることができ、かかる溶液は平衡塩溶液であり、一般
に約５−25mMの低濃度の許容し得る緩衝液と一緒にした
ウシ胎児血清もしくは他の天然性因子を補った平衡塩溶
液であるのが好都合である。好都合な緩衝液はヘペス(H
epes) 、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等である。他の方法
として常法に従って骨から骨髄を吸引することができ
る。
【００３０】34+ Thy+ Lin- 細胞の形態学的評価は多
能性の先祖である「幹細胞」が中位のサイズであること
を示している。光散乱評価は「幹細胞」が低い側面散乱
(side scatter)を有する芽細胞のプロフィールを有する
ことを示している。
【００３１】これらの観察は「幹細胞」が独特の密度プ
ロフィールを有することを示している。密度分別された
ヒト骨髄からの低密度画分はCD34+ Thy+ Lin- 細胞に
ついて富化されていることが見い出された。
【００３２】最初に、系統に付された細胞を除去するこ
とによって細胞を分離するために種々の技術を用いるこ
とができる。特定の細胞系及び／または分化の段階と関
連するマーカー（表面膜タンパク質）を同定するのにモ
ノクローナル抗体が特に有用である。
【００３３】粗分離に備えて固体支持体に抗体を付着さ
せる。用いられる分離技術は回収する画分の生存能力の
保持を最大にするものであるべきである。「比較的粗
い」分離、すなわち、存在する、マーカーを有する総細
胞の10％まで、通常約５％以下、好ましくは約１％以下
が保持されるべき細胞集団と共に残存するような分離の
ため、種々の異なる効能の技術を用いることができる。
【００３４】用いられる特定の技術は分離効率、方法の
細胞毒性、作業の容易さ及び速度、及び高性能の器具及
び／または技術的熟練の必要性による。
【００３５】分離方法は抗体で被覆した磁性ビーズを用
いる磁気分離、アフィニィティークロマトグラフィー、
モノクローナル抗体に結合させるかモノクローナル抗体
と組み合わせて用いる細胞毒、例えば補体と細胞毒、固
体マトリックス、例えばプレートに付着させた抗体によ
る「えり分け」(panning) 、または他の簡便な技術を包
含する。
【００３６】正確な分離を与える技術は性能の程度、例
えば複数の色彩チャネル低アングル及び鈍い光散乱を検
出するチャネル、インピーダンスチャネル等を変化させ
ることができる蛍光活性化細胞区分け機(fluorescence
activated cell sorters) を包含する。
【００３７】用い得る１つの手順は骨髄からの細胞を短
時間、低下した温度、一般に約４℃で特定の細胞型に対
して特異的な抗体、例えばＴ細胞決定子(determinant)
についてはCD３及び８の飽和レベルで培養した後の最初
の段階にあり、ついで細胞を胎児子ウシ血清(FCS) 緩衝
剤(cushion) で洗浄する。
【００３８】ついで細胞を上記した如き緩衝剤培地に懸
濁し、抗体または抗体−抗原複合体に特異的な種々のタ
ンパク質を用いる特定の決定子についての抗体によって
細胞を分離する。
【００３９】簡便には、抗体は直接的分離を可能にする
磁気ビーズ、支持体に係合させたアビジンもしくはスト
レプトアビジンで除去し得るビオチン、蛍光活性化細胞
区分け機について用いることができる蛍光色素等のマー
カーと結合させることができ、これによって特定の細胞
型の分離が容易になる。残存する細胞の生存にとって不
当に有害でないいずれの技術も用い得る。
【００４０】便利には、成熟細胞マーカーを欠く細胞の
一般に少なくとも50％、好ましくは少なくとも約70％の
実質的富化の後、蛍光活性化細胞区分け機(FACS)または
他の高特異性を有する方法によって細胞を分離し得る。
特に好都合なFACSについては多色分析(muli-color anal
yses) を用いることができる。
【００４１】特定の抗原に対する染色のレベルをもとに
して細胞を分離できる。第１の分離では少なくとも約１
×1010、好ましくは少なくとも約３×1010の細胞から始
め、CD34に対する抗体を１つの蛍光色素で標識し、他方
種々の系統に付された細胞に対する抗体は別個の蛍光色
素に結合させる。
【００４２】多色分析に用い得る蛍光色素はフィコエリ
スリン（藻紅素）、アロフィコシアニン(allophycocyan
ines) 等のフィコビリタンパク質(phycobiliproteins)
、フルオレセイン、テキサスレッド(Texas red) 等を
包含する。
【００４３】各系は別個の工程で分離できるが、望まし
くはCD34または同等のマーカーについて系をポジティブ
に選択するときに同時に分離する。一般に得られる細胞
数はもとの細胞の約１％より少であり、一般的には約0.
５％より少であり、0.２％以下という低さにすることも
できる。
【００４４】ついで細胞をさらに Thy+ についてポジテ
ィブに選択することによって分離するが、ここでは細胞
は一般にもとの細胞の0.５％より少なくなり、一般的に
は0.01−0.５％の範囲となる。死んだ細胞と結合する色
素〔ヨウ化プロピジウム(propidium) 、ＬＤＳ〕を用い
ることによって細胞を死んだ細胞に対して分離できる。
【００４５】望ましくは、細胞は２％胎児子ウシ血清を
含有する培地中に回収する。アフィニティーカラム等の
正確な分離を可能にする、ポジティブ選択のための他の
技術を用いることができる。この方法は非−幹細胞集団
の約20％より少ない、好ましくは約５％より少ない残量
への除去を可能にする。
【００４６】CD34+ Lin- 及びCD34+ Lin- Thy-1+ は
FACS分析によって低い側面散乱及び低い前方散乱(forwa
rd scatter) プロフィールを有する。細胞スピン(cytos
pin)プレパラート(preparations)は成熟リンパ球系細胞
及び成熟顆粒球との間のサイズを有する幹細胞を示す。
細胞は光散乱性のみならず種々の細胞表面抗原の発現(e
xpression)に基いて選択し得る。
【００４７】本発明にとって分離の特定の順序は重要で
ないと考えられるが、示される順序が好ましい。好まし
くは、幹細胞に関連を有するマーカーのポジティブ分離
及び系統に付された細胞に関与するマーカーについての
ネガティブ選択を用いて、まず粗い分離によりついで精
密な分離により細胞を分離する。この分離の後、多系潜
在能力及び高められた自己再生能力を有する細胞組成物
についての選択を行う。
【００４８】90％より多くの、通常は約95％より多くの
ヒト幹細胞を含有する組成物はこの方法によって得るこ
とができ、そこでは目的とする幹細胞をCD34+ ， Lin-
及びThy+ であること並びに細胞再生及び種々の造血系
のすべてのメンバーの発生を与えることができることに
よって同定する。
【００４９】究極的に、単一の細胞を幹細胞組成物から
得ることができ、細胞が生体内の適当な環境に位置する
(be located)ことを保証することができるなら、免疫欠
損のヒトの長期再生に用いることができる。
【００５０】主題の組成物は適当な培養〔骨髄系細胞の
生産のためにはヒドロコルチゾンを供給する培養（デク
スター(Dexter)型培養と結びつける）、ヒドロコルチゾ
ンを欠く培養においてＢリンパ球（Whitlock-Witte型培
養と結びつける）〕によって、骨髄系及びリンパ球系細
胞を生産することが見い出されている。各培養におい
て、種々の株AC３またはAC６から生ずるマウスまたはヒ
トのストローマ細胞(stromal cells) が提供され、この
ストローマ細胞は、ヒト幹細胞等を維持する能力につい
て選択することによってマウスもしくはヒトの胎児骨髄
から導かれるものである。細胞を培養するのに用いる培
地はIMDM（Iscoveの改良Dulbecco培地）、IMDMとRPMIの
50：50混合物等の一定の栄養の豊富な(enriched)培地で
あることが適当であり、一般に塩類、アミノ酸類、ビタ
ミン類、５×10-5M 2-ME、ストレプトマイシン／ペニシ
リン及び10％胎児子ウシ血清より構成され、また時々、
一般に１週間に少なくとも約１〜２回取り替える。
【００５１】特に、ヒドロコルチゾンを用いたある培養
から細胞をヒドロコルチゾンを含まない他の培養に移行
させ、ついで異なる培養細胞中の異なる系のメンバーの
生産を実証することによって、幹細胞の存在及びその維
持が支持される。このようにして、骨髄系細胞とＢ細胞
の両方の生産を同定し得る。
【００５２】Ｔ細胞への分化を実証するため胎児胸腺を
単離し、これを約25℃で４〜７日培養して、胎児胸腺の
リンパ球系集団を実質上凅渇させる。ついでテストする
細胞を胸腺組織にマイクロ注入すると、注入された集団
のＨＬＡが胸腺のＨＬＡと不適当に組み合わされる（不
整合化される）。ついで胸腺組織をEPA 0322 240に記載
されたscid／scidマウスに移植、特に腎包(kidney caps
ul) 中に移植する。
【００５３】赤血球細胞については、 BFU-E単位を同定
する技術、例えば細胞が赤血球系直系を発生させ得るこ
とを実証するメチルセルロース培養〔Metcalf(1977) 、
Recent Results in Cancer Research 61.Springer-Verl
ag、ベルリン、１−227 頁〕を用いるのが適当である。
【００５４】骨髄系及びＢ細胞能力を同定するにあた
り、テストする集団をまずヒドロコルチゾン含有培養に
導入し、かかる培養において６週間増殖させるのが適当
である。用いる培地は10％ FCS、10％ウマ血清、ストレ
プトマイシン／ペニシリン、グルタミン及び５×10-7Ｍ
ヒドロコルチゾンを含有する RPMI 1640とIMDMの50：50
混合物よりなる。
【００５５】６週間の間に、先祖細胞の不存在下ではす
べての成熟細胞は死滅するであろうことが予想される。
６週間の終りに、骨髄細胞が依然として観察されるな
ら、骨髄細胞への絶えざる分化を提供する先祖細胞が存
在していると結論できる。
【００５６】ついでこの時点で培地を変えてヒドロコル
チゾンを欠く培地としＢ細胞の増殖を奨励する。３−４
週間待ってFACS分析によってＢ細胞の存在を実証するこ
とにより、以前に骨髄系細胞を生産することができた先
祖細胞がＢ細胞を生産することもできると結論できる。
【００５７】ヒドロコルチゾンの存在下に増殖させたヒ
ト造血系細胞は少なくとも４ケ月維持できる。同様にヒ
ドロコルチゾンの不存在下に増殖させたヒト造血系細胞
は少なくとも４ケ月骨髄系細胞のみならずＢリンパ球
（CD19+ ）を含有する。
【００５８】先祖造血幹細胞が実質上濃縮された組成物
を提供するこれらの培養から、CD34 + Lin- ，CD34+ T
hy+ ， Thy+ Lin- またはCD34+ Thy+ Lin- について
区分することができる。
【００５９】これらの培養から得られるCD34+ Lin- ，
CD34+ Thy+ ， Thy+ Lin- またはCD34+ Thy+ Lin-
細胞は上述のアッセイにおいてＢ細胞、Ｔ細胞及び骨髄
単球細胞を生じさせる。
【００６０】多能性のヒト幹細胞は以下の如く定義でき
る：（１）すべての定められた血液リンパ球系の系にお
いて子孫を生じる、及び（２）限られた数の細胞が、重
い免疫無防備状態のヒト宿主を、細胞再生による多能性
造血幹細胞を含めてのすべての血液細胞型及びそれらの
先祖において、十分に再構成することができる。
【００６１】主題の組成物においては、全骨髄移植物中
に含まれる幹細胞の数（〜107)に比較して、約 107の総
計より少ない細胞、通常 106より少ない細胞を用いて免
疫無防備状態のヒト宿主を再構成することができる。幹
細胞が自己再生できる適切な場所で適切なシーディング
(seeding) が起こるのを保証するのにある数の細胞が必
要とされる。
【００６２】自己再生のための適当な場所でシーディン
グされるのに必要とされる細胞の数は50個より小であ
り、合計約20細胞以下という低い数でも上述の条件を全
うすることができる。
【００６３】かくして、もっともはじめの先祖である多
能性幹細胞についての標準セットに基いて主題組成物は
これらの要求を満足することができる。さらに骨髄細胞
の分析に基づいて、主題細胞は骨髄細胞の約0.01〜0.１
％、特に0.01〜0.05％の範囲内にあると考えられる。
【００６４】幹細胞が単離されたら、それらは次のよう
にして増殖させることができる。すなわち、骨髄細胞、
胎児胸腺または胎児肝臓から得られそしてこれらのスト
ローマ細胞との共存培養により幹細胞維持と関連する成
長因子の分泌を提供するストローマ細胞等のごときスト
ローマ細胞からのコンディショニング培地中で成長させ
ることによって増殖させることができる。
【００６５】あるいは、ストローマ細胞が同種異系(all
ogeneic)であるかまたは移植物に対し異種(xenogeneic)
である場合、幹細胞の増殖を支持する維持因子を含有す
る培地中で増殖させてもよい。
【００６６】共存培養で用いる前に、混合ストローマ細
胞調製物から、望ましくない細胞を除去するため適当な
モノクローナル抗体を用いて、例えば抗体−毒素複合
体、抗体及び補体等を用いて、造血細胞を除去すること
ができる。別法としてストローマ細胞系が同種異系であ
るか移植物に対し異種であってもよいクローン化したス
トローマ細胞系を用いることができる。
【００６７】本細胞組成物は種々の方法で使用すること
ができる。該細胞はナイーブ(naive) なので、照射され
たホスト及び／または、化学療法を受けたホストを十分
に再構成する(reconstitute)のに用いることができる。
【００６８】また該細胞は種々の因子、例えばエリトロ
ポイエチン、コロニー刺激因子（例えばGM-CSF, G-CSF,
M-CSF) 、インターロイキン（例えばIL-1, -2, -3, -
4, -5, -6, -7, -8等）、白血病抑制因子(LIF) 、ステ
ィール因子(Steel Factor)(Stl) 等を用いることによっ
て、本細胞を成熟させ、増殖させ、及び１以上の選ばれ
た系へ分化させることを通して特定の系のための細胞源
として用いることができ、あるいは幹細胞と関連するス
トローマ細胞は適当な系統に入る。幹細胞はまた造血細
胞の分化及び成熟に関与する因子の単離及び評価に用い
ることができる。
【００６９】かくして、幹細胞はコンディション化培地
等の培地の活性を測定するアッセイ、また細胞成長活性
のための流体、特定の直系の献身との関連等を評価する
アッセイに用いることができる。
【００７０】幹細胞は遺伝病の治療に用いることができ
る。造血細胞に関連する遺伝病は自己のまたは同種異系
の支質細胞の遺伝子欠損(genetic defect)を訂正する(c
orrect) ための遺伝子修飾によって治療できる。
【００７１】例えばＢ−サラセミア（地中海貧血）、鎌
状細胞貧血、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、リコンビ
ナーゼ(recombinase) 欠乏症、リコンビナーゼ調節遺伝
子欠乏症等の病気を、野性型遺伝子の幹細胞への相同も
しくはランダム組換えによる導入によって治療すること
ができる。
【００７２】同種異系の幹細胞については遺伝子欠損が
ない正常細胞を治療に用いることができる。遺伝子治療
の他の適応は薬物耐性遺伝子の導入によって正常幹細胞
に利点を有せしめ、選択的圧力、例えば多薬物耐性遺伝
子(MDK) を受けやすくすることである。
【００７３】造血細胞と関連性を有する病気以外の病気
であっても、その病気がホルモン、酵素、インターフェ
ロン、因子等の特定の分泌産物の欠如に関するものであ
るなら治療できる。適切な調節開始領域を用いることに
よって、欠損タンパク質の誘導生産を、タンパク質の生
産が、かかるタンパク質を正常に生産する細胞型とは異
なる細胞型による生産であっても、天然の生産に匹敵す
るように、行うことができる。
【００７４】リボザイム、アンチセンスまたは他のメッ
セージを挿入して特定の遺伝子産物または病気、特に血
液リンパ性疾患へのかかりやすさを抑制することも可能
である。
【００７５】別法として、Ｔ細胞レパートリーからＴ細
胞受容体の特定可変領域を除去することも望み得る。相
同組換え、または発現を防止するアンチセンスもしくは
リボザイム配列を用いて特定のＴ細胞受容体の発現を抑
制し得る。
【００７６】HIV, HTLV-Ｉ及びII等の血液性病原体に対
しては幹細胞を遺伝子的に修飾して幹細胞または幹細胞
から分化させた細胞中の病原体の増殖を防止するアンチ
センス配列もしくはリボザイムを導入することができ
る。
【００７７】哺乳動物細胞での組換えの方法は Molecul
ar Cloning, A Laboratory Manual(1989) Sambrook, Fr
itsch及びManiatis, Cold Spring Harbor, NYに記載さ
れている。
【００７８】該細胞は液体窒素温度で凍結し、長時間貯
蔵し、解凍し、再使用することができる。細胞は通常10
％DMSO、70％自己血漿(2500radで照射）、20％Tc199(組
織培養培地）中で貯蔵する。
【００７９】細胞はプログラムに組み込み得る冷凍機中
液体窒素中− 180℃で凍結する。解凍後、幹細胞増殖及
び分化に関連する成育因子または支質細胞の使用によっ
て細胞をふやす(expand)ことができる。以下の実施例は
例示のためであり、限定のためのものではない。
【００８０】実 験 材料及び方法 抗体。種々のマーカーに対する抗体が以下のようにして
得られた：CD３，８，10，14，15，19，20，33，34(Bec
ton-Dickinson), CD33(Counter Immunology),(Dalchau
及びFabre, J.Exp.Med.(1979) 149 ：576)。CD34抗体(I
gG3)Tuek３はA.Ziegler (Leukocyte Typing IV；White
cell differentiation antigens 1989,817)。
【００８１】CD３，−８，−10，−14，−15，−19，−
20，−33はFITC複合体として購入した。 Zieglerからの
抗体はフルオレセイン（ＦＬ）、フィコエリトリン（Ｐ
Ｅ）またはテキサスレッド（ＴＲ)(Caltag) に複合化さ
せた適切な抗−IgG3を用いて検出した。 Thy-1抗体はフ
ルオレセイン、フィコエリトリンまたはビオチン複合体
であり、ビオチン複合体はＴＲ，ＦＬまたはＰＥ−アビ
ジン(Caltag)を用いて検出した。
【００８２】蛍光活性化細胞区分け機(sorter)(FACS)分
析及び区分け(sorting) Parks及びHerzenberg, Meth.Enzymol. (1984) 108：197
に記述されたように修飾した Becton-Dickinson FACS
を用いた。２つの部分からなる(dual)レーザー器具は各
分析細胞について記録する４つの蛍光パラメーター及び
２つの光源散乱パラメーターを可能にする。
【００８３】残りの赤血球及び死細胞及び破片は光散乱
ゲーティング(gating)及びＰＩ（ヨウ化プロジウム）染
色まはた４−色分析中のみでの散乱による分析から除外
された。フルオレセインとフィコエリトリン、及びフル
オレセインとヨウ化プロピジウムの空間的重複(spatial
overlaps)に対する補正(compensation)は記述された(P
arks及びHerzenborg (1984) 、上述）ようにして電子的
に調整した。
【００８４】４色染色は、結果が蛍光色素の種々の空間
的重複にかかわらず一貫している(consistent)ことを保
証するために、異なる蛍光色素に結合させた同じ試薬の
いくつかの組合せを用いて行った。加えて、４色分析の
結果は２及び３色分析からデータと比較することによっ
て較正した(be calibrated) 。
【００８５】細胞区分けのため、染色サンプルを区分け
操作中４℃に維持した。区分けされた滴を10％胎児子ウ
シ血清(Hazelton Biologics Inc., Lencxa, KS) を含有
するRPMI1640中に集めた。２色ソート(sorts) は死細胞
を標識するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と共に、CD34を
標識するフィコエリトリン及びＬＩＮ細胞を標識するフ
ルオレセインを用いた。
【００８６】両信号は単一のFACSチャネルで検出され除
外された。３色ソートはCD34を標識するテキサスレッ
ド、Ｌｉｎ細胞を標識するフィコエリトリン及び Thy-1
細胞を標識するフルオレセインを用いた。FACSによる細
胞集団の単離に続いて、サンプルをHBSSで１：１希釈
し、 RCF 200で10分遠心分離し、血球計計測のため HBS
S50または 100μｌ中に再懸濁した。
【００８７】培養アッセイは次のようにして行った。種
々のネズミのストローマ細胞系を用いたが、それらのう
ち３つはWhitlockら、Cell (1978) 48：1009−1021に記
述されている。コンフルエント状態のストローマ細胞層
を、継代なしに組織培養培地を５−７日毎に取り替えな
がら３−４週まで維持した。
【００８８】ストローマ細胞層を無血清培地で３回洗浄
し、ついで無血清培地中0.５mg／mlコラゲナーゼ−ディ
スパーゼ(dispase)(Boehringer-Mannheim, Indianapoli
s, IN)の2.５ml（T-25フラスコ）を上からかけた(be ov
erlaid) 。培養細胞を37℃で15−30分培養し、ついで酵
素含有培地中の細胞を集め、血清を含有する RPMI-1640
培地を加えた。
【００８９】支質細胞をパスツールピペットでピペッテ
ィングすることにより懸濁し、もとの細胞濃度の１／５
〜１／50で直接培養した。一般に、１：10で継代培養し
た融合性皮質層は５−７日後に再び融合状態(confluenc
y)に達した。１穴あたり30〜0.３細胞の限定希釈培養に
よってサブクローンを得た。ヒトストローマ細胞系を同
様に処理した。
【００９０】ヒト胎児骨髄の細胞懸濁液は妊娠10−18週
の胎児の長骨から調製した。骨を縦に裂き、骨髄腔を表
面削り刃で削る。ついで骨を RPMI-1640中コラゲナーゼ
／ディスパーゼの１mg／ml溶液中に入れる。
【００９１】骨を37℃で30分インキュベートし、ついで
骨髄腔を培地（ペニシリン／ストレプトマイシン、2-ME
及び５％ FCSを含有するRPMI-1640)をどっと流して洗い
(beflushed)造血系細胞を除去する。別法として、骨髄
腔からコラゲナーゼ／ディスパーゼ処理なしに骨髄を洗
い出す。
【００９２】16−20週妊娠胎児の肝臓から細胞懸濁液を
調製する。肝臓を切り刻み、ついでピペッティングして
細胞をとき放す。ついで細胞懸濁液をFicoll勾配上に加
えて肝細胞、赤血球及び細胞破片を除去する。ついで造
血系細胞を回収する。
【００９３】成人の骨髄を骨髄吸引液から得、ついで使
用前に処理して赤血球を除く。マウスもしくはヒトのス
トローマ細胞系の予め確立した融合性層の上に上記ヒト
細胞を乗せることによってかさばった(bulk)培養細胞を
得る。T-25フラスコもしくは６穴プレート中の支質細胞
上に３×104 〜２×105cells／mlを、６穴プレートの各
穴に３mlまたはT-25フラスコに５mlを添加することによ
って加える。
【００９４】50μｇ／mlペニシリン／50μｇ／mlストレ
プトマイシン、１mMピルビン酸ナトリウム、２mMグルタ
ミン、５×10-5２−メルカプトエタノール及び10％胎児
子ウシ血清を含有する、 RPMI-1640とIMDMの50：50混合
物を用いる。
【００９５】Dexter型条件(conditions)に対しては50μ
ｇ／mlペニシリン／50μｇ／mlストレプトマイシン、１
mMピルビン酸ナトリウム、２mMグルタミン、10％胎児子
ウシ血清、20％ウマ血清及び10-6Ｍヒドロコルチゾンコ
ハク酸ナトリウムを含有するIMDMを用いる。
【００９６】Dexter型培地で増殖させた骨髄細胞によっ
てもっぱら骨髄系分化を起こさせる。全細胞集団でまた
は細胞表面抗原の発現によって分別した細胞で培養細胞
を確立した（CD34，HLA-DR， Thy-1、系マーカー）。
【００９７】制限希釈培養細胞をコンフルエント層とし
てマウスストローマ細胞を含有する96穴プレートを用い
て調製した。ヒト細胞をタイトレートして段階的に低濃
度で少なくとも24穴のプレートに各細胞濃度で入れた。
ついでプレートを検査して各細胞数で陽性の穴のパーセ
ンテージを測定する。ついでデータをグラフにプロット
する。
【００９８】AC３及びAC６共培養細胞 マウス骨髄皮質細胞系AC３またはAC６で確立させた共存
培養細胞はヒト培養細胞のためのフィーダー(feeder)層
として成功裏に役立ち、低細胞密度で繊維芽細胞の過剰
増殖を抑制した。
【００９９】（１） 100より大の胎児骨髄、胎児肝臓ま
たは成人骨髄サンプルからの細胞懸濁液を20週までの間
培養したところ、この期間中造血細胞を連続的に生産し
た。このことは初期ヒト先祖すなわち幹細胞がこれらの
培養細胞で確立されたことを示している。
【０１００】（２）培養細胞はマウスストローマ細胞に
付着した小型〜中型のヒト骨髄細胞を示し、増殖は培養
の最初の１〜３週に亘って(over)起こり、その後はかな
り安定に残る。
【０１０１】（３）細胞はストローマ細胞に被さった非
付着性及び付着性の細胞よりなるゆるい集合体を形成
し、他方ストローマ細胞は上層の小形〜中形の細胞であ
る。全体として、培養細胞の外観はマウスの長期培養細
胞と同様である。
【０１０２】（４）細胞スピン(cytospin)及び蛍光活性
化細胞区分け機(FACS)分析はヒト血液リンパ球系細胞の
維持を示している。ヒドロコルチゾンの不存在（Whitlo
ck-Witte様条件）下で培養細胞は形態学によると骨髄
系、単球系及びリンパ球系の直系の混合物である。
【０１０３】細胞の大部分は骨髄系であり、多形核細胞
を成熟させる骨髄芽球と異なる。細胞の15−40％は単核
であり、これらの細胞の多くはリンパ球系の形態を有す
る。
【０１０４】（５）細胞の約20−40％はCD15抗体で染色
され、また細胞の10−50％はＢ直系マーカーCD10，CD19
またはCD20で染色され、かなりの数のＢ細胞を示してい
る。CD19発現に対する胎児骨髄から選択された細胞は培
養において３週間より短かくしか生残しない。
【０１０５】培養細胞中における４週より後でのCD10+
及びCD19+ 細胞の存在は初期Ｂ細胞が献身した先祖から
生じていることを示している。さらに、細胞の１〜10％
は細胞質μ Ｈ鎖に対して染色し、このことはプレＢ細
胞の存在を確認している。
【０１０６】１％より小しか sIgを発現しないのに細胞
のかなりの数がCD20を発現する。このことは初期Ｂ細胞
の少数しか示された培養条件下で成熟していないことを
示している。さらに、細胞区分けによるＢ細胞（CD10，
CD19）の凅渇後に開始した培養は培養開始の１週間以内
におけるＢ細胞の発生を示している。
【０１０７】（６）ヒドロコルチゾンの存在下（Dexter
様条件）に開始した培養細胞は検出し得るＴ及びＢ細胞
を含有しておらず、FACS分析及び細胞スピンによって実
証されるように大きなパーセンテージの顆粒球及び骨髄
系細胞を含有している。
【０１０８】有系分裂形態(mitotic figures) の存在及
びこれらの培養細胞の長期維持はある種の活性な先祖細
胞の存在を示している。これらのヒドロコルチゾン含有
培養細胞をヒドロコルチゾンを含有しない培地に移した
場合、２週間以内に２〜６％のCD19細胞が見い出され
る。このデータはこの共培養系における活性な先祖細胞
の存在をさらに実証する。
【０１０９】上記の共存培養系を用いて、種々の細胞副
次集団(subpopulations)中のコロニー形成性細胞の頻度
を測定するのに用い得る制限希釈アッセイが開発され
た。頻度は穴の37％がコロニーを示さない細胞数によっ
て求める。
【０１１０】１つの代表的実験は全骨髄細胞の１／2000
が応答した(responded) のに対し、細胞の１／200 及び
１／30,000がそれぞれCD34+ 及びCD34- で応答した。
【０１１１】さらに、単一細胞アッセイを開発したが、
そこにおいてはFACSで単一に区分けした先祖細胞をマウ
スもしくはヒトの骨髄皮質細胞フィーダー(feeder)層を
含有する96穴プレートの各穴に入れる。
【０１１２】表７に示した結果は40のCD34+ LIN- 細胞
(Lin＝CD３，10，19，20，15，33）のうち１または80の
CD34+ LIN+ 細胞のうち１がコロニー形成（骨髄の0.５
−１％）によって応答した。コロニーの分析はコロニー
の40％及び25％がそれぞれCD34+ LIN- 及びCD34+ LIN
+ 集団において、FACS及びメチルセルロース分析（Ｂリ
ンパ球系、骨髄系、赤血球系）によって決定される多能
性であることを示している。
【０１１３】さらに、CD34+ Thy+ 細胞（骨髄の0.１−
0.５％）は20穴中１穴でコロニー成長を示す。コロニー
の大部分（＞70％）は多能性である。新たな支質層へ移
した後の成長に関してはCD34+ Thy+ 細胞がもっとも効
率のよい集団である。
【０１１４】対照的にCD34+ 細胞の＞90％を表すCD34+
Thy- 細胞は共存培養アッセイで貧弱にしか応答せず、
400細胞中１細胞しかコロニーを形成せず、またどれも
多能性でない。 Thy+ 集団も成熟直系マーカーの発現に
従ってサブ分割する(subdiuide) ことができる。
【０１１５】Thy+ Lin- 細胞サブセット（骨髄の0.１
−0.５％）は単一細胞アッセイでよく応答する（１／2
0）が Thy+ Lin+ サブセットの応答は貧弱であった
（０／800)。FACS及びメチルセルロースアッセイは Thy
+ Lin- 細胞に由来するコロニーの＞70％が多能性であ
ることを示している。
【０１１６】上記データは「幹細胞」がCD34及び Thy-1
を発現するが直系マーカーの発現を欠く細胞のサブセッ
ト(subset)中に存在することを示している。この表現型
を有する細胞は1000の全体の骨髄細胞中１細胞より少な
い。
【０１１７】上述の条件下で成長する出発集団中の細胞
の頻度を求めることができる。頻度は穴の37％が成長を
示さない細胞数によって求められる。ある研究によると
区分けされなかった細胞の１／1500が応答するがCD34+
画分の１／40及びCD34- 画分の１／4000が応答する。以
下の表はインビトロ培養アッセイについての結果を示
す。
【０１１８】
【表１】
【０１１９】
【表２】
【０１２０】胎児骨髄(FBM) のFACS分離を画分をCD3
4+ ，10+ ，19+ 及びCD34- ，10- ，19 - に分割するこ
とにより行った。ついで画分をヒドロコルチゾンの不存
在下で８週間連続的に成長させ、ついで骨髄系細胞及び
Ｂ細胞の存在についてスクリーニングする。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】別法として、胎児ＷＢＭをFACSによってCD
34+ ，33- ，10- ，19- に分離し、細胞をヒドロコルチ
ゾンの不存在下で成長させる。制限希釈を用いることに
よって、約10−100 の細胞を共存培養細胞中で６週間よ
り長い間維持することができ、かつ成熟した、骨髄系細
胞及びＢ細胞に分化することができることが見い出され
る。
【０１２３】
【表４】
【０１２４】CD34，33，10分離の結果を表４に示す。区
分けした細胞集団のみならず区分けされなかった細胞も
分離時点（ｔ＝０）及び21日後（ｔ＝21）に分析した。
ｔ＝０でのFACS染色プロフィールの分析は骨髄系細胞及
びＢ細胞がCD34+ CD10- CD33 - 細胞から５％より少ない
汚染Ｂ及び骨髄系細胞で有効に除去されたことを示して
いる。
【０１２５】対照的に21日後ではCD34+ CD10- CD33- の
約50％がＢ細胞であった。さらにｔ＝０とｔ＝21の間で
細胞数の10倍の増加があった。従って、21日間で全体と
して100倍のＢ細胞の増加があった。さらに、Ｂ細胞の
約１／３が sIgをカッパ及びラムダＬ鎖２：１の比で発
現する。
【０１２６】この結果はＢ細胞がポリクローナルでEpst
ein-Barrウイルス形質転換を発現しないことを示してい
る。対照的にCD34+ CD10+ CD33+ 細胞は21日間に亘って
Ｂ細胞及び総細胞数の劇的な減少を示す。この結果はCD
10及び／またはCD19を発現するCD34+ 細胞が長命の先祖
でないことを示している。
【０１２７】骨髄系細胞の分化はFACS及びメチルセルロ
ースアッセイによって分析した。FACS分析はCD34+ CD10
- CD33- 細胞サブセットにおいて成熟骨髄系細胞の10倍
の増加を示す。メチルセルロースデータの分析はCFU-GM
及び BFU-e活性の90−95％が時間０でCD34+ CD10+ CD33
+ 細胞サブセットに含有されることを示した。
【０１２８】しかしながら、21日目では、CD34+ CD10+
CD33+ 及びCD34+ CD10- CD33- 細胞集団はほぼ同等のCF
U-GM及び BFU-e細胞レベルを有する。従って、CD34+ CD
10-CD33- 細胞は培養中21日に亘ってＢ細胞（CD19+ 細
胞質μ+ ， sIg+ ）、骨髄系細胞(myeloid cells)(CD15
+ ，−33+ ，CFU-GM）及び赤血球系細胞(erytnroid cel
ls)(BFU-e)を生じさせる能力を有する。
【０１２９】細胞をCD34，CD10，CD19，CD33またはCD3
4，CD３，CD７，CD８，CD10，CD14，CD15，CD19，CD2
0，CD33を基に分離する場合も同様な結果が得られる。C
D34+ 細胞を Thy-1+ 及び Thy-1- 画分に分けてメチル
セルロース分析でアッセイすると、これら２つの画分は
表５に示すごとく同様な読取り(readont) を与える。
【０１３０】制限希釈によって及び共存培養においてア
ッセイすると、CD34+ ， Thy-1+ 画分は１）共存培養中
に発生する(generated) Ｂ細胞のパーセンテージ、２）
制限希釈アッセイにおける応答細胞の頻度、及び３）単
一細胞アッセイにおける応答細胞の頻度（表５及び６）
によって実証されるように先祖活性が豊富化されてい
る。
【０１３１】制限希釈アッセイにおいて75％陽性の穴(w
ell)を得るために、 Thy-1+ 画分は約１／30−１／50細
胞(cells) を要し、他方 Thy-1- 画分は１／170 −１／
500細胞(cells) を要する。このことは Thy-1+ 画分が
先祖細胞についてさらに濃縮されていることを示してい
る。
【０１３２】さらにインビボＴ細胞アッセイでアッセイ
すると Thy-1+ 画分はドナー由来Ｔ細胞を生じさせるの
に対し、 Thy-1- 画分は生じさせない。
【０１３３】
【表５】
【０１３４】
【表６】
【０１３５】Ｔ細胞発生についての胸腺アッセイは以下
のようにして行った。胎児胸腺断片（個々の胸腺葉）を
約１mm3 のサイズで得る。前駆体細胞に対する胸腺の生
体外受容性(receptiuity) を刺激するために断片を胸腺
器官培養系中25℃で３−７日培養する。
【０１３６】平衡塩溶液を含有するＦＣＳ中の約 100−
104 細胞よりなる細胞組成物を油充填測微用スクリュー
操作注射器に結合させたガラス製マイクロピペットを用
いて１μｌの容量で注入する。注入24時間後に、生体外
でコロニー化した胸腺断片をSCIDマウスの腎被膜(kidne
y capsule)下に移植する。
【０１３７】EPA 0322240参照。注入された細胞は胸腺
と不適当に組み合わされた（mismatched)HLAである。時
々、受容動物を殺し、移植片を回収する。細胞懸濁液を
ドナー由来Ｔリンパ球を（CD３+ ，８+ ）の存在につい
て２色免疫蛍光アッセイで分析する。
【０１３８】
【表７】
【０１３９】
【表８】
【０１４０】上記結果は選ばれた細胞中の少しの集団が
最終的に分化したCD４+ 及びCD８+Ｔ細胞になるＴ細胞
を生じさせることを示している。 Thy-1- 集団は検出し
得るレベルの分化Ｔ細胞を与えないと考えられる。
【０１４１】ヒト骨断片は照射した(200−300rad（ラ
ド))もしくは非照射の CB17 SCID／SCIDマウスに種々の
部位で（腹腔内(i.p.)、皮下(s.c.)等）で移植できる。
骨断片は少なくとも９ケ月絶えずヒトのＢ、骨髄系及び
赤血球系細胞を生産しながら成長する。
【０１４２】骨断片はヒトの同種異系の先祖集団のため
の支えとなるマイクロ環境として働く。同種異系の骨髄
先祖（ＨＬＡクラスＩに対し不整合(mismatch)) を受容
マウス中への移植前もしくは後に骨断片中に注入でき
る。
【０１４３】先祖細胞を移植前に注入する場合には、区
分けした細胞を骨にマイクロ注入し、注入骨を室温で一
夜インキュベートし、ついで CB17 SCID／SCIDマウス
（i.p.またはs.c.）に移植する。先祖細胞を移植後にマ
イクロ注入する場合には、 GB17 SCID／SCIDマウスに骨
断片を移植する（i.p.，s.c.）。
【０１４４】６週間後、骨移植片を照射し（マウスの遮
蔽で移植片に 200−1000rad)、ついで先祖細胞を注入す
ることができる。別法として、先祖細胞を非照射骨断片
に注入してもよい。
【０１４５】骨髄アッセイの結果はCD34+ 細胞が事実上
すべての骨髄再生能力を有していることを示している。
骨髄再生能力。
【０１４６】CD34集団の副次分別はCD34サブセット中の
Thy+ 細胞（CD34細胞の５％）が該CD34画分に事実上す
べてのＢ細胞、骨髄系細胞及び赤血球系先祖の活性を含
有することを示した。このアッセイは10と10,000の細胞
の間で成功裏に行うことができる。表９に概略を示す。
【０１４７】
【表９】
【０１４８】ヒト幹細胞の自己再生及び長命を評価する
ために二次移動アッセイ(secondarytransfer assay)を
用いることができる。ドナー先祖細胞を上述の如くＨＬ
Ａ不整合骨断片に注入する、２−３ケ月後、成長した(e
xpanded)ドナー細胞を「幹細胞」表現型（CD34+ ， Thy
+ ， Lin- ）について再区分けする。
【０１４９】ついでこれらの細胞を第２のＨＬＡ不整合
ドナー中に再注入する。１−３ケ月後、骨を種々の先祖
集団並びに幹細胞について評価する。このようにして、
種々の直系の造血系細胞を生じさせる「幹細胞」の長期
能力、並びに既知インプット「幹細胞」数から生じた
「幹細胞」の数を評価できる。
【０１５０】これによって幹細胞の自己再生について推
定できる。本アッセイにおいては本発明の幹細胞は長期
に亘る再生を与える。
【０１５１】本発明が本発明に沿ったヒト造血系幹細胞
の特性において実質上均質である細胞を提供することは
上記結果から明らかである。このように、特定の因子の
適切な選択、及び幹細胞の自己再生を見込んだバイオア
ッセイの開発、及び表面マーカーによる幹細胞のスクリ
ーニングによって、実質上均質の、生育能力を有するヒ
ト造血幹細胞組成物を種々の目的のために生産すること
ができる。
【０１５２】幹細胞は骨髄移植物中で用いることがで
き、そこで細胞から腫瘍性細胞や他の病原性の細胞、例
えばＨＩＶ−感染細胞を除去する。さらに、純粋な幹細
胞の使用は移植片−対−宿主の病気を排除するであろ
う。
【０１５３】さらに、細胞は適切な組換え（相同もしく
は非相同組換え）によって修飾して、遺伝子欠損を修復
し、または幹細胞中で、個々的にもしくは幹細胞一般に
ついて、天然的に欠けている遺伝的能力を供給すること
ができる。
【０１５４】さらに本組成物には実質上他の細胞が存在
しないので、幹細胞組成物は再生及び分離と関連する因
子を単離し、定義するのに用いることができる。
【０１５５】本発明で述べたすべての刊行物及び出願は
本発明が関与する分野における熟練者の熟練のレベルを
示すものである。すべての刊行物及び特許出願は各々の
刊行物または特許出願が具体的、個々的に引用により移
入されていると同じ程度にここに移入されるものであ
る。
【０１５６】今や本発明は十分に説明されているので、
当業者にとって添えられた特許請求の範囲の精神または
範囲から逸脱することなく多くの変化及び修飾をなし得
ることは当業者にとって明らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャールス エム．バウム アメリカ合衆国，カリフォルニア 94043，マウンテン ビュー，ティレラ コート 79 (72)発明者 相原 雄幸 神奈川県横浜市南区別塩５−６−16 511号 (72)発明者 アービング ウェイスマン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94305，パロ アルト，＃711，ウェルシ ュ ロード 1170 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/00 - 5/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＣＤ３４+ 及びＴｈｙ−１+ であること
    を特徴とするヒト造血幹細胞の組成物。
  2. 【請求項２】 ＣＤ３４+ ，Ｔｈｙ−１+ 及びＬｉｎ-
    であることを特徴とする請求項１に記載の細胞組成物。
  3. 【請求項３】 細胞の９０％より多くがＣＤ３４+ ，Ｔ
    ｈｙ−１+ 及びＬｉｎ- であることを特徴とする請求項
    ２に記載の細胞組成物。
  4. 【請求項４】 細胞組成物が自己再生でき、そしてリン
    パ球系の、赤血球系の及び骨髄性単球の造血系のメンバ
    ーへの分化を行うことができることを特徴とする、請求
    項１〜３のいずれか１項に記載の細胞組成物。
  5. 【請求項５】 共存培養培地中で自己再生でき、少なく
    ともＴ，Ｂ及びマクロファージの造血系のメンバーに分
    化でき、系統に付された細胞の含量が５％未満である、
    請求項４に記載の細胞組成物。
  6. 【請求項６】 共存培養培地中で自己再生でき、リンパ
    球系の、骨髄細胞系の及び骨髄単球系の造血系のメンバ
    ーに分化でき、且つ系統に付された細胞の含量が５％未
    満である、請求項４に記載の細胞組成物。
  7. 【請求項７】 ストローマ細胞、並びに幹細胞及び分化
    細胞を含むヒト造血細胞を含んで成る共存培養物であっ
    て、該共存培養物は請求項１〜６のいずれか１項に記載
    のヒト造血幹細胞の組成物を含んで成り、前記幹細胞の
    約１００未満が共存培養培地中で自己再生することがで
    き、そしてリンパ球系、骨髄細胞系及び骨髄単球系の造
    血系のメンバーに分化することができることを特徴とす
    る共存培養物。
  8. 【請求項８】 前記分化が骨髄細胞系への分化であり、
    そして前記共存培養培地がヒドロコーチゾンを含んで成
    る、請求項７に記載の共存培養物。
  9. 【請求項９】 ＣＤ３４及びＴｈｙ−１マーカーを有す
    る細胞をポジティブに選択することを特徴とする、ヒト
    造血幹細胞が濃縮された細胞集団を得る方法。
  10. 【請求項１０】 前記細胞がＬｉｎ- であることをさら
    に特徴とする、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 細胞混合物を、ＣＤ３４+ に対するモ
    ノクローナル抗体及びＴｈｙ−１に対するモノクローナ
    ル抗体であって蛍光標識に結合したものと混合し、そし
    てこの蛍光標識により、ＣＤ３４+ Ｔｈｙ−１+ である
    ことを特徴とする細胞画分を分離することにより分離を
    行う、請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記ＣＤ３４+ Ｔｈｙ−１+ 細胞画分
    を、系統マーカーのパネルに対して特異的な抗体のパネ
    ルであって蛍光標識したものと混合し、そしてＬｉｎ-
    画分を単離する工程をさらに含む、請求項９に記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】 ヒト造血幹細胞を含んで成りそして系
    統は付された細胞が５％未満である細胞組成物であっ
    て、前記造血幹細胞がＴｈｙ−１+ ，ＣＤ３４+ である
    ことを特徴とし、自己再生することができ、そしてリン
    パ系細胞の、赤血球系細胞の及び骨髄単球系の造血系の
    メンバーに分化することができ、そして外来ＤＮＡを含
    んで成る、ことを特徴とする細胞組成物。
  14. 【請求項１４】 ヒト造血幹細胞を含んで成る細胞組成
    物を得る方法において、ここで約１００個未満の細胞が
    共培養培地中で自己再生することができ且つリンパ球系
    及び骨髄単球系の造血系メンバーに分化することがで
    き、前記方法が、ヒト造血幹細胞及び分化した細胞の混
    合物分離して、ヒトの造血細胞であり且つＣＤ３４+ 及
    びＴｈｙ−１+ であることを特徴とする細胞を含んで成
    る実質的に均一な画分を得ることを含んで成る方法。
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