ES2925224T3 - Anticuerpos monoclonales humanos contra EphA4 y su uso - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona nuevos anticuerpos monoclonales de EphA4 completamente humanos con distintas características de unión. También se describen fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos, formas biespecíficas de estos anticuerpos y conjugados de estos anticuerpos. Además, se describen ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos biespecíficos y conjugados. Estos anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos biespecíficos, conjugados, ácidos nucleicos y vectores son de utilidad para identificar y tratar a un sujeto con una enfermedad o afección que implica una señalización mediada por EphA4 anormal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos monoclonales humanos contra EphA4 y su uso

Antecedentes de la invención

Esta solicitud se refiere a anticuerpos monoclonales (AcM) y fragmentos de unión a antígeno u otros derivados de los mismos que se unen específicamente a EphA4, así como al uso de estos anticuerpos/fragmentos/derivados para diagnosticar y tratar enfermedades y estados que implican la señalización de EphA4 desregulada, tales como tumores, trastornos neurodegenerativos y trastornos del estado de ánimo.

La familia de receptores hepatocelulares que producen eritropoyetina (Eph) son tirosina cinasas receptoras que se unen a ligandos anclados a la membrana celular y se expresan al menos en cerebro, corazón, pulmón, músculo, riñón, placenta, páncreas (Fox, et al, Oncogene (1995) 10:897) y melanocitos (Easty et al., Int. J. Cancer (1997) 71:1061). Los receptores Eph se dividen en dos subclases, EphA y EphB (codificados por los loci genéticos denominados EPHA y EPHB 15, respectivamente), basándose en la similitud de secuencia y su afinidad de unión tanto para los ligandos de efrina-A unidos a glicosilfosfatidilinositol como para los ligandos de efrina-B unidos a la transmembrana. Existen nueve EphA (EphA1-8 y EphA10) en los seres humanos. La unión del ligando a EphA4 da como resultado la fosforilación de tirosina y crea una región de unión para proteínas con dominios de Src de homología 2/3 (SH2/SH3).

EphA4 se ha vinculado con varias patologías y este receptor se ha identificado como una diana farmacológica prometedora. Se ha considerado la modulación de la unión de EphA4-efrina en el tratamiento de diferentes estados patológicos.

Por ejemplo, EphA4 se expresa en la superficie de las plaquetas humanas, donde fomenta la estabilización del trombo (Prevost, et al. Proc Natl Acad Sci USA (2005) 102: 9820-9825). Se detecta en diferentes tipos de células cancerosas (Ashida, et al. Cancer Res (2004) 64: 5963-5972), así como en las células endoteliales tumorales (Yamashita, et al. J. Biol Chem (2008) 283: 18926-18936). Se ha documentado que EphA4 está regulado por incremento en cáncer de mama, cáncer de esófago, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago y cáncer de páncreas (Miyazaki, et al., BMC Clin Pathol (2013) 13: 19; Giaginis, et al., BMC Clin Pathol (2014)14: 8).

También se ha investigado la interferencia con el sistema EphA/efrina-A para tratar enfermedades del sistema nervioso central (SNC). Por ejemplo, Carmona et al (Carmona, M.A., et al. Proc Natl Acad Sci US (2009) 106:12524-9) examina el impacto de la inhibición de EphA4 sobre el transporte de glutamato. Otros estudios han identificado inhibidores de EphA4 como posibles candidatos terapéuticos para el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica (Van Hoecke, A., et al. Nat Med (2012) 18: 1418-1422) y lesión de la médula espinal (Goldshmit, Y., et al. PLoS One (2011) 6: e24636). Los receptores Eph también son importantes para la regulación del desarrollo de la sinapsis y la plasticidad sináptica (Klein, R. Nat Neurosci (2009) 12: 15-20; Pasquale, E.B. Cell (2008) 133: 38-52). Mientras que EphB mejora el desarrollo de la sinapsis a través de su interacción con los receptores NMDA (Sheffler-Collins, S.I. y Dalva, M.B Trends in Neurosciences (2012) 35: 293-304; Dalva, M.B., et al. (2000) Cell 103, 945-956), EphA4, que se expresa principalmente en el hipocampo adulto, actúa como un regulador negativo de la neurotransmisión y la plasticidad sináptica del hipocampo (Murai, K.K. y Pasquale, E.B. Glia (2011) 59: 1567-1578). La activación de EphA4 por sus ligandos, efrinas, desencadena la señalización directa a través de la inducción de la agrupación de receptores y la autofosforilación (Pasquale, E.B. Nat Rev Mol Cell Biol (2005) 6: 462-475). Esto conduce a la retracción de las espinas dendríticas a través de la activación de RhoA dependiente de la cinasa dependiente de ciclina 5 (Cdk5) y la reducción de la adhesión celular (Fu, W.Y., et al. Nat Neurosci (2007) 10, 67-76). EphA4 también provoca la eliminación de los receptores AMPA sinápticos y de superficie durante la plasticidad homeostática, una forma de plasticidad que garantiza que la respuesta neuronal esté dentro del intervalo óptimo, proporcionando así estabilidad a la red neuronal (Chen, Y., Fu, A.K.Y. e Ip, N.Y. Cellular Signalling (2012) 24: 606­ 611; Fu, A.K., et al. Nat Neurosci (2011) 14: 181-189). Curiosamente, los individuos con déficits cognitivos leves presentan una expresión de EphB y EphA4 desregulada (Simon, A.M., et al. J Alzheimers Dis (2009) 17: 773-786). Más recientemente, se ha investigado el vínculo entre la señalización de EphA4 y el fracaso sináptico inducido por Ap en la enfermedad de Alzheimer (EA). EphA4 media las disfunciones sinápticas del hipocampo en la EA y demuestra que el bloqueo del dominio de unión a ligando de EphA4 revierte el deterioro sináptico en modelos de ratón con EA (Fu, A.K., et al, Proc Natl Acad Sci USA (2014) 111:9959-9964).

Por tanto, EphA4 se identifica como una diana terapéutica importante para enfermedades y trastornos del SNC, así como para diversos cánceres del cuerpo. Los documentos WO 2007/102383 y WO 2005/048917 dan a conocer anticuerpos contra EphA4 en general, mientras que la presente invención da a conocer anticuerpos que se unen específicamente al dominio de unión a ligando de EphA4 humano. Estos anticuerpos pueden usarse para el diagnóstico y tratamiento de un sujeto con una enfermedad neurodegenerativa (EA, EP, e La , EM, etc.), trastornos afectivos tales como depresión, así como diversas formas de cánceres, incluyendo cánceres del SNC. Algunas de estas indicaciones se describen con mayor detalle a continuación. Estas enfermedades representan una necesidad global urgente ya que actualmente no existen tratamientos terapéuticos eficaces para tratar estos estados.

La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por un deterioro gradual pero progresivo del aprendizaje y la memoria, y es una de las principales causas de mortalidad en los ancianos. Actualmente, se estima que 35 millones de personas en todo el mundo están afectadas por la enfermedad, pero se espera que esta cifra aumente significativamente hasta 100 millones para 2050 debido a la mayor esperanza de vida. No existe cura y la fisiopatología de la enfermedad aún es relativamente desconocida. Sólo existen cuatro fármacos aprobados por la FDA disponibles para los pacientes con EA, pero estos sólo alivian los síntomas en lugar de alterar la patología de la enfermedad (no pueden revertir el estado ni prevenir un deterioro adicional) y son ineficaces en estados graves. Por tanto, el tratamiento terapéutico temprano es crítico en el tratamiento de la EA. La investigación ha confirmado que la EA afecta al cerebro mucho antes de que se manifiesten los síntomas reales de pérdida de memoria o deterioro cognitivo. Sin embargo, no existen herramientas de diagnóstico para la detección temprana y, cuando se diagnostica EA a un paciente usando los métodos actuales, que implican una evaluación clínica subjetiva, los síntomas patológicos ya se encuentran en un estado avanzado.

La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más prevalente después de la EA. La EP es un trastorno neurodegenerativo que afecta principalmente al sistema nervioso motor. Los síntomas motores de la enfermedad son el resultado de la muerte de las células que generan dopamina en la sustancia negra, una región del mesencéfalo. Los síntomas de la enfermedad más obvios están relacionados con el movimiento, que incluyen temblores, rigidez, lentitud de movimiento y dificultad para caminar y marchar. A medida que avanza la enfermedad, el pensamiento y el comportamiento se ven afectados, y comúnmente se produce demencia en los estadios avanzados de la enfermedad. La depresión es el síntoma psiquiátrico más común asociado con la enfermedad. El principal signo patológico de la enfermedad es la acumulación de a-sinucleína en inclusiones denominadas cuerpos de Lewy en las neuronas y la muerte de las células que generan dopamina en la sustancia negra. Actualmente, la EP se diagnostica a través de síntomas clínicos, que incluyen temblores, bradicinesia, rigidez y desequilibrio postural, ya que aún no se encuentran disponibles pruebas o marcadores de diagnóstico fiables para la EP. En todo el mundo, se estima que ~ 7 millones de personas tienen EP. Además, se prevé que el número de casos aumentará significativamente debido al envejecimiento de la población. En los EE. UU., se prevé que el número de pacientes con EP casi se duplicará; pero el mayor crecimiento ocurrirá en los países en desarrollo de Asia, tales como China, que se prevé que tendrán una estimación de 5 millones de casos para el 2030. Sin embargo, la prevalencia real de la EP es difícil de evaluar porque la enfermedad generalmente no se diagnostica hasta que la enfermedad ha progresado hasta un estado avanzado debido a limitaciones en los métodos de diagnóstico.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA), también conocida como enfermedad de Lou Gehrig, es la enfermedad de la motoneurona más común con una incidencia de 1 a 2 por cada 100.000 y un riesgo de por vida de 1:800. La ELA se caracteriza por una pérdida progresiva de motoneuronas de la médula espinal, del tronco encefálico y de la corteza cerebral, lo que con el tiempo conduce a parálisis y la muerte dentro de los dos a cinco años posteriores al diagnóstico. Los sujetos con ELA tienen debilidad rápidamente progresiva debido a atrofia muscular y espasticidad muscular, dificultad para hablar (disartria), tragar (disfagia) y respirar (disnea). Aunque el orden y la frecuencia de los síntomas varían de una persona a otra, con el tiempo la mayoría de los pacientes no pueden caminar ni usar las manos y los brazos, y pierden la capacidad de hablar y tragar la comida. La mayoría de las personas con ELA mueren por insuficiencia respiratoria, generalmente dentro de los tres a cinco años desde la aparición de los síntomas. La mediana de tiempo de supervivencia desde la aparición hasta la muerte es de aproximadamente tres años, y sólo el 4 % de los pacientes con este estado sobreviven más de 10 años. Aproximadamente el diez por ciento de los casos de ELA son formas familiares que son el resultado de mutaciones que provocan enfermedades monogénicas altamente penetrantes. Se han identificado algunos genes específicos asociados con estas formas de ELA, incluyendo muchas mutaciones conocidas en el gen de la superóxido dismutasa 1, SOD1 (Pasinelli y Brown, Nat Rev Neurosci (2006) 7:710-23). También se ha descubierto que las mutaciones con pérdida de función en el gen EPHA4 se asocian con una supervivencia más prolongada de los pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA) (van Hoecke et al., Nat Med. (2012)18(9):1418-22).

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad degenerativa inflamatoria en la que el sistema inmunitario ataca y daña la vaina de mielina que protege las células nerviosas del cerebro y de la médula espinal del SNC, impidiendo así la comunicación de las células nerviosas dentro del SNC. La enfermedad se caracteriza por diversos síntomas que pueden incluir visión borrosa, pérdida del equilibrio, mala coordinación, habla farfullante, temblores, entumecimiento, cansancio extremo, problemas de memoria y concentración, parálisis y ceguera. No existe ninguna cura conocida para la EM, mientras que los tratamientos clínicos tienen como objetivo mejorar la función después de un ataque y prevenir nuevos ataques. Sin embargo, los fármacos actuales son moderadamente eficaces y tienen efectos secundarios adversos. En todo el mundo, se estima que alrededor de 2,3 millones de personas están afectadas por la EM. Sin embargo, la EM generalmente se diagnostica en función de los signos y síntomas, e incluso en combinación con pruebas de laboratorio y obtención de imágenes médicas de apoyo, el diagnóstico es difícil. Esto es especialmente cierto en los primeros estadios cuando los síntomas son invisibles o similares a otros estados médicos.

La depresión clínica es un trastorno grave y debilitante. Según la Organización Mundial de la Salud, se estima que 350 millones de personas en todo el mundo padecen un trastorno depresivo grave y ya se ha convertido en la principal causa de incapacidad en todo el mundo. Además, se estima que la depresión clínica afectará al 17 % de la población al menos una vez en la vida. La edad media de aparición, según varios estudios, es a finales de la veintena y aproximadamente el doble de mujeres que de hombres notifican depresión clínica. La depresión puede tratarse, pero la mayoría de las personas no reciben la atención ni el apoyo que necesitan. Además, varios medicamentos aprobados por la FDA están disponibles para mejorar los síntomas depresivos. Sin embargo, las respuestas de los pacientes a la medicación varían y se han solicitado tratamientos más eficaces.

Dada la alta prevalencia de enfermedades y estados que implican la señalización de EphA4, existe una clara necesidad de desarrollar nuevos anticuerpos que puedan unirse a EphA4 humano con una alta afinidad y con efectos deseables, por ejemplo, mejorando o suprimiendo la señalización mediada por EphA4 en virtud de su unión a EphA4. Estos anticuerpos son herramientas valiosas para el diagnóstico y/o tratamiento de diversas enfermedades y estados que implican la señalización de EphA4 desregulada. Tales enfermedades y trastornos incluyen diversos tipos de cánceres, enfermedades neurodegenerativas (tales como enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis múltiple (EM), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y trastorno afectivo tal como la depresión. La presente invención aborda estas y otras necesidades relacionadas.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4 y un dominio variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a EphA4.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es una IgG. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno es un fragmento de unión a antígeno scFv, Fv, Fab o F(ab)2. En algunas realizaciones, el anticuerpo de esta invención es un anticuerpo biespecífico que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o el anticuerpo biespecífico del mismo se conjuga con una molécula efectora, que puede ser un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente, un radiomarcador, avidina, biotina o una enzima, o que puede ser una toxina o un agente quimioterápico, tal como una exotoxina de Pseudomonas.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de polinucleótido que codifica para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o para el anticuerpo biespecífico o para el conjugado de polipéptido de fusión del mismo. Opcionalmente, la secuencia que codifica para el polinucleótido está unida operativamente a un promotor, especialmente un promotor heterólogo. En algunas realizaciones, se proporciona un casete de expresión que comprende la secuencia de polinucleótido descrita anteriormente. En algunas realizaciones, la secuencia que codifica para el polinucleótido o el casete de expresión está presente como parte de un vector, tal como un vector viral. En algunas realizaciones, el vector o casete de expresión está presente en una célula huésped de una manera transitoria o permanente.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método de detección ex vivo de la presencia de un tumor en un sujeto. El método comprende estas etapas: poner en contacto ex vivo una muestra biológica del sujeto que se sospecha que tiene el tumor con una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico o conjugado descritos en el presente documento; y detectar la unión del anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico, en el que un aumento en la unión del anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado en comparación con un control indica que el sujeto tiene el tumor. En algunas realizaciones, el control es un patrón de referencia o la unión del anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico a una muestra de un sujeto sano que no padece ningún tumor. En algunas realizaciones, el tumor es un carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago y cáncer de páncreas. En algunas realizaciones, la muestra es sangre, suero, plasma, esputo o una muestra de biopsia.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de un sujeto con un tumor, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico o conjugado descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el tumor es un carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago y cáncer de páncreas. En algunas realizaciones, el tratamiento comprende reducir el volumen del tumor o disminuir la metástasis.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un método de detección ex vivo de la presencia de o la evaluación del riesgo de desarrollar neurodegeneración o un trastorno afectivo en un sujeto. El método comprende estas etapas: poner en contacto ex vivo una muestra biológica de un sujeto con una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico o conjugado descritos en el presente documento; y detectar la unión del anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico o conjugado a EphA4, en el que un aumento en la unión del anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado a EphA4 en la muestra biológica en comparación con un control indica que el sujeto tiene o está en un riesgo elevado de desarrollar la neurodegeneración o el trastorno afectivo. En algunas realizaciones, el control es un patrón de referencia o la unión del anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado a EphA4 en una muestra de un sujeto sano que no padece ni está en riesgo de desarrollar neurodegeneración ni ningún trastorno afectivo. En algunas realizaciones, la neurodegeneración es EA, EP, EM o ELA, que puede ser familiar o esporádica. En algunas realizaciones, el trastorno afectivo es depresión.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de un sujeto con neurodegeneración o un trastorno afectivo, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico o conjugado descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la neurodegeneración es EA, EP, EM o ELA (incluyendo ELA familiar o esporádica). En algunas realizaciones, el trastorno afectivo es depresión. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal es IgG1 m105.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o conjugado descritos en el presente documento, un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado, y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para liberación sostenida.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, a las composiciones farmacéuticas y a los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o de animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. ELISA de fagos policlonales de fagos de la biblioteca, 1a ronda, 2a ronda y 3a ronda de cribado. Se añadieron fagos a pocillos recubiertos con EphA4 de ratón o EphA4 humano. Para la detección se usó Ac anti-fago M13 conjugado con HRP.

Figura 2. Unión de IgG1 E1 (m101), E2, E5 (m105) y E19 (m119) a EphA4 de ratón y humano medida mediante ELISA. Se añadieron IgG1 diluidas en serie a los pocillos recubiertos con EphA4. Para la detección se usó Ac anti-FLAG conjugado con HRP.

Figura 3. Unión de IgG1 m101, m105 y m119 a EphA4 de ratón y humano medida mediante ELISA. Se añadieron IgG1 diluidas en serie a los pocillos recubiertos con EphA4. Para la detección se usó Ac anti-Fab conjugado con HRP.

Figura 4. Las IgG1 m101, m105 y m119 reconocen el dominio de unión a ligando (LBD) de EphA4 humano. Se purificaron las proteínas recombinantes del LBD de EphA4 y se sometieron a análisis mediante inmunotransferencia de tipo Western usando las IgG1 indicadas.

Figura 5. Las IgG1 m101, m105 y m119 presentan una fuerte afinidad de unión hacia el LBD de EphA4. Se llevaron a cabo experimentos de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) incubando proteína de LBD de Eph 20 |iM en la célula con anticuerpos 1 |iM. (A) La IgG humana no mostró unión; (B) m101 mostró afinidad de unión con Kd=~83,0 nM; (C) m105 mostró una fuerte afinidad de unión con Kd=~8,6 nM; (D) m119 mostró afinidad de unión con Kd=~16,8 nM.

Figura 6. Las IgG1 m101, m105 y m119 bloquean la interacción efrina-A1/EphA4. El gráfico indica que las 3 IgG1 pudieron bloquear la interacción entre el dominio extracelular de EphA4 de ratón con efrina-A1 de ratón, en un intervalo nanomolar (CI50: m101 = 0,71 nM; m105 = 0,35 nM; y m119 = 1,81 nM).

Figura 7. IgG1 m105 muestra especificidad en el bloqueo de la interacción EphA4-ligando. La inhibición de EphA4 de ratón con diferentes ligandos fue indicada por el valor de CI50 (m-efrina-A1: 0,34 nM; m-efrina-A5: 22,69 nM; efrina-B2: 1,81 nM). m105 no pudo reconocer el EphB2 de ratón y bloqueó su interacción con efrina-B2.

Figura 8. Unión de IgG1 m101 a células que expresan EphA4. Se incubaron células 293T o células 293T transfectadas con EphA4 de ratón con IgG1 m101 o ligando de EphA4 natural efrina-A5-Fc. Para la detección se usó Ac anti-IgG humana conjugado con FITC.

Figura 9. IgG1 m119 induce la fosforilación de tirosina de EphA4 en neuronas corticales cultivadas. Se trataron neuronas corticales a 7 DIV con 2 |ig/ml de m101 (101), m105 (105), m119 (119) y efrina-A1 (A1) como control positivo. Se recogieron las células y se sometieron a inmunoprecipitación y análisis mediante inmunotransferencia de tipo Western usando los anticuerpos indicados.

Figura 10. IgG1 m105 inhibe la activación de EphA4 inducida por efrina-A1. (A) m105 atenúa la fosforilación de EphA4 inducida por efrina-A1 de una manera dependiente de la dosis. (B) Cuantificación de P-Tyr de EphA4 después de la inmunoprecipitación; ANOVA unilateral con pruebas de la t a posteriori, ***p<0,001 frente a IgG+Fc; ###p<0,001 frente a IgG+A1. (C) Cuantificación de fosforilación de Tyr602 de EphA4; ANOVA unilateral con pruebas de la t a posteriori, *p<0,05 frente a IgG+Fc, #p<0,05 frente a IgG+A1.

Figura 11. Ap reduce la ubicación conjunta de los receptores EphA4 marcados con m105 con PSD-95. Las imágenes fluorescentes muestran las neuronas del hipocampo cultivadas (-18-20 DIV) tratadas con Ap 500 nM en diferentes puntos de tiempo, tal como se indica. Se sometieron a inmunotinción las células con IgG1 m105 y anticuerpo PSD-95. El gráfico muestra una disminución de EphA4 ubicado conjuntamente con PSD-95. NEphA4(n) representa el número de ubicaciones (o los recuentos de ubicaciones) mediante obtención de imágenes de superresolución. Este número refleja sólo la abundancia relativa de EphA4 (N) pero no es el número exacto de proteínas ni siguiera el número de etiquetas fluorescentes, ya que cada molécula de tinte puede cambiar muchas veces durante la obtención de imágenes.

Figura 12. m105 inhibe la función biológica de la señalización mediada por EphA4. m105 suprime la agrupación de EphA4 inducida por efrina-A1 en neuronas del hipocampo cultivadas de una manera dependiente de la dosis. La CI50 de m105 en la inhibición de las agrupaciones de EphA4 mediadas por erina-A1 fue de 4,16 |ig/ml.

Figura 13. El bloqueo de la señalización de EphA4 por el anticuerpo m105 rescata el deterioro de la neurotransmisión mediado por oligómeros AP(¹-⁴²). El anticuerpo m105, que bloquea la interacción de EphA4 endógeno y efrina-A, rescata la reducción de la frecuencia mediada por oligómeros APfi-⁴²) (500 nM) de mEPSC. Se trataron neuronas del hipocampo cultivadas (22 DIV) con m1052 |ig/ml durante 30 minutos antes de APfi-⁴²) 500 nM durante 24 h.

Definiciones

Administración: la introducción de una composición en un sujeto por una vía elegida. Por ejemplo, si la vía elegida es intravenosa, la composición se administra introduciendo la composición en una vena del sujeto.

Esclerosis lateral amiotrófica (ELA): una enfermedad también denominada enfermedad de Lou Gehrig, enfermedad de Charcot o enfermedad de la motoneurona que es una enfermedad neurodegenerativa progresiva y mortal provocada por la degeneración de las motoneuronas. El trastorno provoca debilidad y atrofia muscular en todo el cuerpo, ya que tanto las motoneuronas superiores como las inferiores se degeneran y mueren de modo que ya no inervan los músculos. Los músculos se debilitan gradualmente, se atrofian y desarrollan fasciculaciones (espasmos) debido a la desnervación. Con el tiempo, el cerebro pierde por completo su capacidad para iniciar y controlar el movimiento voluntario. La enfermedad no debilita necesariamente el funcionamiento mental del paciente. Por lo general, los sujetos en los estadios avanzados de la enfermedad conservan los mismos recuerdos, la personalidad e inteligencia que tenían antes de su aparición. La ELA se clasifica en dos grupos, ELA familiar y ELA esporádica. La ELA de “aparición tardía” se desarrolla en personas mayores de 60 años. La ELA de “aparición temprana” se desarrolla en sujetos menores de 60 años.

Los primeros síntomas de la ELA pueden incluir espasmos, calambres o rigidez de los músculos; debilidad muscular que afecta a un brazo o una pierna; y/o habla farfullante y nasal. Estas molestias generales se convierten luego en una debilidad o atrofia más obvia. Las partes del cuerpo afectadas por los primeros síntomas de la ELA dependen de qué músculos del cuerpo se dañen primero. Aproximadamente el 75 % de las personas experimentan ELA de “aparición en las extremidades”. Por lo general, en la ELA de “aparición en las extremidades” los síntomas aparecen primero en una extremidad. En algunos sujetos, los síntomas afectan inicialmente a una de las piernas y los pacientes experimentan incomodidad al caminar o correr o notan que das un traspiés o tropiezan más a menudo. Otros pacientes con aparición en las extremidades ven primero los efectos de la enfermedad en una mano o un brazo, ya que experimentan dificultades con tareas simples que requieren destreza manual, tales como abrocharse una camisa o escribir. Aproximadamente el 25 % de los casos de ELA son ELA de “aparición bulbar”. Estos pacientes notan en primer lugar dificultad para hablar con claridad; su habla se vuelve confusa y farfullante. La nasalidad y la pérdida de volumen son con frecuencia los primeros síntomas; le siguen dificultad para tragar y la pérdida de la movilidad de la lengua. Con el tiempo, se experimentan la pérdida total del habla y la incapacidad para proteger las vías respiratorias al tragar.

Independientemente de la parte del cuerpo afectada en primer lugar por la enfermedad, la debilidad y atrofia muscular se extiende a otras partes del cuerpo a medida que avanza la enfermedad. Los pacientes experimentan una dificultad creciente para moverse, tragar (disfagia) y hablar o formar palabras (disartria). Los síntomas de la afectación de las motoneuronas superiores incluyen músculos tensos y rígidos (espasticidad) y reflejos exagerados (hiperreflexia), incluyendo un reflejo nauseoso hiperactivo. Un reflejo anómalo denominado comúnmente signo de Babinski (el dedo gordo del pie se extiende hacia arriba a medida que se estimula la planta del pie) también indica daño de las motoneuronas superiores. Los síntomas de la degeneración de las motoneuronas inferiores incluyen debilidad y atrofia muscular, calambres musculares y espasmos musculares fugaces que pueden observarse debajo de la piel (fasciculaciones). Alrededor del 15-45 % de los pacientes experimentan un afecto pseudobulbar, también conocido como “inestabilidad emocional”, que consiste en reír, llorar o sonreír de manera incontrolable.

Se usa RILUZOLE™ (Rilutek) para tratar la ELA. Se cree que este fármaco reduce el daño a las motoneuronas disminuyendo la liberación de glutamato. Los ensayos clínicos con pacientes con ELA mostraron que el riluzol prolonga la supervivencia varios meses y puede tener un mayor beneficio de supervivencia para aquellos con una aparición bulbar. El fármaco también extiende el tiempo antes de que el paciente necesite ventilación asistida.

Amplificación: de una molécula de ácido nucleico (tal como una molécula de ADN o ARN), se refiere al uso de una técnica que aumenta el número de copias de una molécula de ácido nucleico en una muestra. Un ejemplo de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa, en la que una muestra biológica recogida de un sujeto se pone en contacto con un par de cebadores oligonucleotídicos, en condiciones que permiten la hibridación de los cebadores con un molde de ácido nucleico en la muestra. Los cebadores se extienden en condiciones adecuadas, se disocian del molde y luego se aparean de nuevo, se extienden y se disocian para amplificar el número de copias del ácido nucleico. El producto de amplificación puede caracterizarse mediante electroforesis, patrones de escisión de endonucleasas de restricción, hibridación o ligamiento de oligonucleótidos y/o secuenciación de ácidos nucleicos usando técnicas convencionales. Otros ejemplos de amplificación incluyen la amplificación por desplazamiento de cadena, tal como se da a conocer en la patente estadounidense n.° 5.744.311; amplificación isotérmica sin transcripción, tal como se da a conocer en la patente estadounidense n.° 6.033.881; amplificación por reacción en cadena de reparación, tal como se da a conocer en el documento WO 90/01069; amplificación por reacción en cadena de la ligasa, tal como se da a conocer en el documento EP-A-320308; amplificación por reacción en cadena de la ligasa de relleno de huecos, tal como se da a conocer en la patente estadounidense n.° 5.427.930; y amplificación sin transcripción de ARN NASBA™, tal como se da a conocer en la patente estadounidense n.° 6.025.134.

Animal: organismos vertebrados multicelulares vivos, categoría que incluye, por ejemplo, mamíferos y aves. El término mamífero incluye tanto mamíferos humanos como no humanos. De manera similar, el término “sujeto” incluye tanto sujetos humanos como veterinarios.

Anticuerpo: un ligando polipeptídico que comprende al menos una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera o cadena pesada que reconoce específicamente y se une específicamente a un epítopo de un antígeno, tal como EphA4 humano y/o EphA4 de ratón, o un fragmento del mismo. Las moléculas de inmunoglobulina se componen de una cadena pesada y una ligera, de las que cada una tiene una región variable, denominada región pesada variable (V^h) y región ligera variable (V^l). Juntas, en un anticuerpo nativo, la región V^h y la región V^l se unen al antígeno reconocido por el anticuerpo. En algunas realizaciones, sólo se requiere el dominio variable de cadena pesada. Por ejemplo, los anticuerpos de camélidos que se producen de manera natural que sólo consisten en una cadena pesada son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera (véanse, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448, 1993; Sheriff et al., Nat. Struct. Biol., 3:733-736, 1996).

Los anticuerpos incluyen inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de unión a antígeno se conocen bien en la técnica, tales como los anticuerpos con un solo dominio (por ejemplo, anticuerpos de dominio VH), fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'², proteínas Fv de cadena sencilla (“scFv”) y proteínas Fv estabilizadas con disulfuro (“dsFv”). Una proteína scFv es una proteína de fusión en la que una región variable de cadena ligera de una inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de una inmunoglobulina están unidas por un ligador, mientras que en las dsFv, las cadenas se han mutado para introducir un enlace disulfuro para estabilizar la asociación de las cadenas. El término también incluye formas modificadas por ingeniería genética tales como anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (tales como anticuerpos biespecíficos). Véanse también Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3a ed., W. H. Freeman & Co., Nueva York, 1997.

Normalmente, una inmunoglobulina que se produce de manera natural tiene cadenas pesadas (H) y cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Existen dos tipos de cadenas ligeras, lambda (X) y kappa (^k). Existen cinco clases principales de cadenas pesadas (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.

Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable (las regiones también se conocen como “dominios”). En combinación, las regiones variables de cadena pesada y ligera se unen específicamente al antígeno. Las regiones variables de cadena ligera y pesada contienen una región “de entramado” interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”. Se ha definido la extensión de la región entramado y de las CDR. Véanse, por ejemplo, Kabat et al. (véase, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Sociales, 1991) y la base de datos ImMunoGeneTics (IMGT) (véase, Lefranc, Nucleic Acids Res 29:207-9, 2001; y //imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanIg;). La base de datos de Kabat ahora se mantiene en línea (ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). Las secuencias de las regiones de entramado de diferentes cadenas ligeras o pesadas se conservan relativamente dentro de una especie, tal como seres humanos. La región de entramado de un anticuerpo, es decir, las regiones de entramado combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.

Las CDR son principalmente responsables de unirse a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan normalmente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas de manera secuencial comenzando desde el extremo N-terminal, y también se identifican normalmente por la cadena en la que se ubica la CDR particular. Por tanto, una CDR3 de V^h (^o H-CDR3) se ubica en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una CDR1 de Vl (o L-CDR1) es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra. Un anticuerpo que se une a EphA4, por ejemplo, tendrá una secuencia específica de la región V^h y la región Vl y, por tanto, secuencias de CDR específicas. Anticuerpos con diferentes especificidades (es decir, diferentes sitios de combinación para diferentes antígenos) tienen diferentes CDR. Aunque son las CDR las que varían de un anticuerpo a otro, sólo un número limitado de posiciones de aminoácidos dentro de las CDR están implicadas directamente en la unión a antígeno. Estas posiciones dentro de las CDR se denominan residuos determinantes de especificidad (SDR).

Las referencias a “V^h” o “VH” se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo la de un Fv, scFv, dsFv o Fab. Las referencias a “V^l” o “VL” se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, incluyendo la de un Fv, scFv, dsFv o Fab.

Un “anticuerpo monoclonal” o un “AcM” es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B o por una célula en la que se han transfectado los genes de cadena ligera y pesada de un solo anticuerpo. Los AcM se producen mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, produciendo células híbridas que forman anticuerpos a partir de una fusión de células de mieloma con células inmunitarias del bazo. Los AcM incluyen AcM humanizados.

Un “anticuerpo quimérico” tiene residuos de entramado de una especie, tal como ser humano, y las CDR (que generalmente confieren unión a antígeno) de otra especie, tal como un anticuerpo murino que se une específicamente a EphA4.

Un anticuerpo “humano” (también denominado anticuerpo “completamente humano”) es un anticuerpo que incluye regiones de entramado humanas y todas las CDR de una inmunoglobulina humana. En un ejemplo, el entramado y las CDR son de la misma secuencia de aminoácidos de cadena ligera y/o pesada humana originaria. Sin embargo, los entramados de un anticuerpo humano pueden modificarse por ingeniería para incluir las CDR de un anticuerpo humano diferente. Una inmunoglobulina “humanizada” es una inmunoglobulina que incluye una región de entramado humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, de ratón, rata o sintética). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina “donante” y la inmunoglobulina humana que proporciona el entramado se denomina “aceptora”. En una realización, todas las CDR son de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. No es necesario que estén presentes regiones constantes, pero si lo están, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente el 85-90 %, tal como aproximadamente el 95 % o más idénticas. Por tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de las secuencias de inmunoglobulina humana natural. Un “anticuerpo humanizado” es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y de cadena pesada humanizada. Un anticuerpo humanizado se une al mismo antígeno que el anticuerpo donante que proporciona las CDR. El entramado aceptor de una inmunoglobulina o un anticuerpo humanizados puede tener un número limitado de sustituciones por aminoácidos tomados del entramado donante. Los AcM humanizados u otros pueden tener sustituciones de aminoácidos conservativas adicionales que sustancialmente no tienen ningún efecto sobre la unión a antígeno u otras funciones de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas humanizadas pueden construirse por medio de ingeniería genética (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.585.089).

Afinidad de unión: afinidad de un anticuerpo por un antígeno. En una realización, la afinidad se calcula mediante una modificación del método de Scatchard descrito por Frankel et al., Mol. Immunol., 16:101-106, 1979. En otra realización, la afinidad de unión se mide mediante una tasa de disociación de antígeno/anticuerpo. En otra realización, se mide una alta afinidad de unión mediante un radioinmunoensayo de competencia. En otra realización, la afinidad de unión se mide mediante ELISA. Un anticuerpo que “se une específicamente” a un epítopo antigénico, tal como y epítopo de EphA4 humano y/o EphA4 de ratón con una alta afinidad, y no se une significativamente a otros epítopos no relacionados.

Anticuerpo biespecífico: una molécula recombinante que se compone de dos restos de unión a antígeno diferentes y, en consecuencia, se une a dos epítopos antigénicos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos incluyen moléculas unidas química o genéticamente de dos restos de unión a antígeno. Los restos de unión a antígeno pueden unirse usando un ligador. Los restos de unión a antígeno pueden ser anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno (por ejemplo, Fab, scFv), eAd o combinaciones de los mismos. Un anticuerpo biespecífico puede incluir uno o más dominios constantes, pero no incluye necesariamente un dominio constante.

Agentes quimioterápicos: cualquier agente químico con utilidad terapéutica en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por un crecimiento celular anómalo. Tales enfermedades incluyen tumores, neoplasias y cáncer, así como enfermedades caracterizadas por un crecimiento hiperplásico, tales como la psoriasis. En una realización, un agente quimioterápico es un agente de uso en el tratamiento de un linfoma, una leucemia u otro tumor. En una realización, un agente quimioterápico es un compuesto radiactivo. Un experto en la técnica puede identificar fácilmente un agente quimioterápico de uso (véase, por ejemplo, Slapak y Kufe, Principles of Cancer Therapy, capítulo 86 en Harrison's Principles of Internal Medicine, 14a edición; Perry et al., Chemotherapy, cap. 17 en Abeloff, Clinical Oncology 2a ed., © 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer, L., Berkery, R. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer, D.S., Knobf, M.F., Durivage, H.J. (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993). La quimioterapia de combinación es la administración de más de un agente para tratar el cáncer. Un ejemplo es la administración de un anticuerpo que se une a EphA4 o a un fragmento del mismo usado en combinación con un compuesto radiactivo o químico.

Variantes conservativas: las sustituciones de aminoácidos “conservativas” son aquellas sustituciones que no afectan ni disminuyen sustancialmente la afinidad de una proteína, tal como un anticuerpo que se une específicamente a EphA4. Por ejemplo, un anticuerpo humano que se une específicamente a EphA4 puede incluir como máximo aproximadamente 1, como máximo aproximadamente 2, como máximo aproximadamente 5 y como máximo aproximadamente 10, o como máximo aproximadamente 15 sustituciones conservativas y unirse específicamente al polipéptido EphA4. El término variación conservativa también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido original no sustituido, siempre que el anticuerpo se una específicamente a EphA4. Las sustituciones no conservativas son aquellas que reducen una actividad o unión a EphA4.

Las tablas de sustituciones de aminoácidos conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien por los expertos en la técnica. Los siguientes seis grupos son ejemplos de aminoácidos que se consideran sustituciones conservativas entre sí:

1) alanina (A), serina (S), treonina (T);

2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);

3) asparagina (N), glutamina (Q);

4) arginina (R), lisina (K);

5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); y

6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W).

Poner en contacto: colocación en asociación física directa; incluye tanto en forma sólida como líquida.

Citotoxicidad: la toxicidad de una molécula, tal como una inmunotoxina, para las células destinadas a ser seleccionadas como diana, a diferencia de las células del resto de un organismo. En una realización, por el contrario, el término “toxicidad” se refiere a la toxicidad de una inmunotoxina para las células distintas de las que son las células destinadas a ser seleccionadas como diana por el resto de direccionamiento de la inmunotoxina, y el término “toxicidad animal” se refiere a la toxicidad de la inmunotoxina para un animal por toxicidad de la inmunotoxina para células distintas de las destinadas a ser seleccionadas como diana por la inmunotoxina.

Variante degenerada: en el contexto de la presente divulgación, una “variante degenerada” se refiere a un polinucleótido que codifica para un polipéptido, tal como el polipéptido n EphA4 o un anticuerpo que se une a EphA4, que incluye una secuencia que está degenerada como resultado del código genético. Existen 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón. Por tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas se incluyen siempre que no se modifique la secuencia de aminoácidos del polipéptido, tal como el polipéptido EphA4 o el anticuerpo que se une a EphA4, que está codificado por la secuencia de nucleótidos. Diagnóstico: identificar la presencia o naturaleza de un estado patológico, tal como, pero sin limitarse a, cáncer o ELA. Los métodos de diagnóstico difieren en su sensibilidad y especificidad. La “sensibilidad” de un ensayo de diagnóstico es el porcentaje de individuos enfermos que dan positivo en la prueba (porcentaje de verdaderos positivos). La “especificidad” de un ensayo de diagnóstico es uno menos la tasa de falsos positivos, donde la tasa de falsos positivos se define como la proporción de personas sin la enfermedad que dan positivo en la prueba. Si bien es posible que un método de diagnóstico en particular no proporcione un diagnóstico definitivo de un estado, es suficiente si el método proporciona una indicación positiva que ayude en el diagnóstico. “Pronóstico” es la probabilidad de desarrollo (por ejemplo, gravedad) de un estado patológico, tal como cáncer o ELA.

Molécula efectora: la porción de una molécula quimérica destinada a tener un efecto deseado en una célula a la que se dirige la molécula quimérica. La molécula efectora también se conoce como resto efector (EM), agente terapéutico o agente de diagnóstico, o términos similares. Los agentes terapéuticos incluyen compuestos tales como ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, aminoácidos o derivados, glicoproteínas, radioisótopos, lípidos, hidratos de carbono o virus recombinantes. Los restos terapéuticos y de diagnóstico de ácidos nucleicos incluyen ácidos nucleicos antisentido, oligonucleótidos derivatizados para reticulación covalente con ADN simple o dúplex y oligonucleótidos que forman tríplex. Alternativamente, la molécula unida a un resto de direccionamiento, tal como un anticuerpo anti-EphA4, puede ser un sistema de encapsulación, tal como un liposoma o una micela que contiene una composición terapéutica tal como un fármaco, un ácido nucleico (tal como un ácido nucleico antisentido) u otro resto terapéutico que pueda protegerse de la exposición directa al aparato circulatorio. Los medios de preparación de liposomas unidos a anticuerpos se conocen bien por los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.957.735; y Connor et al., Pharm. Ther. 28:341-365, 1985). Los agentes o restos de diagnóstico incluyen radioisótopos y otros marcadores detectables. Los marcadores detectables útiles para tales fines también se conocen bien en la técnica e incluyen isótopos radiactivos tales como 35S, 11C, 13N, 15O, 18F, 19F, 99mTc, 131I, 3H, 14C, 15N, 90Y, 99Tc, 111In y 125I, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes y enzimas.

(Eph)A4 hepatocelular que produce eritropoyetina: una tirosina cinasa receptora que se expresa en cerebro, corazón, pulmón, músculo, riñón, placenta, páncreas (Fox, et al, Oncogene 10:897, 1995) y melanocitos (Easty, et al., Int. J. Cáncer 71:1061, 1997). EphA4 se une a ligandos anclados a la membrana celular (efrinas A1, A2, A3, A4, A5, B2 y B3; Pasquale, Curr. Opin. in Cell Biology, 1997, 9:608; también ligandos B61, AL1/RAGS, LERK4, Htk-L y Elk-L3; Martone, et al., Brain Research 771:238, 1997), y la unión a ligando conduce a la autofosforilación de EphA4 en residuos de tirosina (Ellis, et al., Oncogene 12:1727, 1996). La fosforilación de tirosina de EphA4 crea una región de unión para proteínas con dominios de Src de homología 2/3 (SH2/SH3), tales como la tirosina cinasa citoplasmática p59fyn (Ellis, et al., mencionado anteriormente; Cheng, et al., Cytokine and Growth Factor Reviews 13:75, 2002). A continuación se proporcionan secuencias de aminoácidos a modo de ejemplo de EpHA4 humano y de ratón.

Dominio de anticuerpo modificado por ingeniería (eAd): también conocido como “anticuerpo con un solo dominio”, esta molécula es un dominio de anticuerpo variable monomérico único. La región variable incluye regiones determinantes de complementariedad (CDR), que confieren especificidad de unión, y regiones de entramado, que son aquellas partes del dominio variable distintas de las CDR. Generalmente, un eAd tiene un peso molecular de sólo 12-15 kDa y, por tanto, es más pequeño que un AcM con dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras (aproximadamente 150-160 kDa) y fragmentos Fab (aproximadamente 50 kDa). En una realización, un eAd incluye un dominio de cadena pesada variable con H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3, y se une específicamente a un antígeno diana, pero no incluye CDR de cadena ligera ni ningún dominio variable de cadena ligera. Los eAd se expresan altamente en cultivos de células microbianas, muestran propiedades biofísicas favorables, incluyendo solubilidad y estabilidad térmica, y son muy adecuados para la selección y maduración por afinidad mediante sistemas de selección in vitro tales como la presentación en fago. Los eAd también son bioactivos como monómeros y, debido a su pequeño tamaño y estabilidad inherente, pueden formatearse para dar moléculas más grandes para crear fármacos con semividas séricas prolongadas u otras actividades farmacológicas. Un eAd puede incluir cualquier región de entramado adecuada y puede ser humano o humanizado.

Epítopo: un determinante antigénico. Estos son grupos químicos o secuencias de péptidos particulares en una molécula que son antigénicos, es decir, que provocan una respuesta inmunitaria específica. Un anticuerpo se une específicamente a un epítopo antigénico particular en un polipéptido, tal como EphA4 humano y/o EphA4 de ratón.

Expresado: traducción de un ácido nucleico para dar una proteína. Las proteínas pueden expresarse y permanecer intracelulares, convertirse en un componente de la membrana de la superficie celular o secretarse en la matriz o el medio extracelular.

Casete de expresión: un constructo de ácido nucleico, generado de manera recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de una secuencia de polinucleótido particular en una célula huésped. Un casete de expresión puede formar parte de un plásmido, genoma viral o fragmento de ácido nucleico. Normalmente, un casete de expresión incluye un polinucleótido que va a transcribirse (por ejemplo, uno que codifica para un anticuerpo anti-EphA4 o un fragmento de unión del mismo), unido operativamente a un promotor.

Secuencias de control de expresión: secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión de una secuencia de ácido nucleico heteróloga a la que está unida operativamente. Las secuencias de control de expresión están unidas operativamente a una secuencia de ácido nucleico cuando las secuencias de control de la expresión controlan y regulan la transcripción y, cuando sea apropiado, la traducción de la secuencia de ácido nucleico. Por tanto, las secuencias de control de expresión pueden incluir promotores apropiados, potenciadores, terminadores de la transcripción, un codón de iniciación (es decir, ATG) delante de un gen que codifica para una proteína, una señal de corte y empalme para intrones, el mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traducción apropiada del ARNm y codones de terminación. El término “secuencias de control” pretende incluir, como mínimo, componentes cuya presencia puede influir en la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias asociadas de fusión. Las secuencias de control de expresión pueden incluir un promotor.

Un promotor es una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. También se incluyen aquellos elementos promotores que son suficientes para hacer que la expresión génica dependiente del promotor pueda controlarse para ser específica del tipo de célula, específica del tejido o inducible por señales o agentes externos; tales elementos pueden ubicarse en las regiones 5' o 3' del gen. Se incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles (véase, por ejemplo, Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987). Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como pL del bacteriófago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y similares. En una realización, cuando se clona en sistemas de células de mamífero, pueden usarse promotores derivados del genoma de células de mamífero (tal como el promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (tal como la repetición terminal larga del retrovirus; el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7.5K del virus de la vaccinia). También pueden usarse promotores producidos mediante técnicas de síntesis o de ADN recombinante para proporcionar la transcripción de las secuencias de ácido nucleico.

Región de entramado: secuencias de aminoácidos interpuestas entre las CDR. Las regiones de entramado incluyen regiones de entramado ligeras variables y pesadas variables. Las regiones de entramado sirven para mantener las CDR en una orientación apropiada para la unión a antígeno.

Células huésped: células en las que puede propagarse un vector y expresar su ADN. La célula puede ser procariota o eucariota. El término también incluye cualquier progenie de la célula huésped objeto. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica a la célula parental, ya que pueden producirse mutaciones durante la replicación. Sin embargo, tal progenie se incluye cuando se usa el término “célula huésped”.

Respuesta inmunitaria: una respuesta de una célula del sistema inmunitario, tal como una célula B, una célula T o un monocito, a un estímulo. En una realización, la respuesta es específica para un antígeno particular (una “respuesta específica de antígeno”). En una realización, una respuesta inmunitaria es una respuesta de células T, tal como una respuesta CD4+ o una respuesta CD8+. En otra realización, la respuesta es una respuesta de células B y da como resultado la producción de anticuerpos específicos.

Inmunoconjugado: un enlace covalente de una molécula efectora con un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o anticuerpo biespecífico. La molécula efectora puede ser un marcador detectable o una inmunotoxina. Los ejemplos específicos no limitativos de toxinas incluyen, pero no se limitan a, abrina, ricina, exotoxina de Pseudomonas (PE, tal como PE35, PE37, PE38 y p E40), toxina diftérica (DT), toxina botulínica o toxinas modificadas de las mismas, u otros agentes tóxicos que inhiben directa o indirectamente el crecimiento celular o destruyen células. Por ejemplo, PE y DT son compuestos altamente tóxicos que normalmente provocan la muerte por toxicidad hepática. Sin embargo, PE y DT pueden modificarse en una forma para su uso como inmunotoxina eliminando el componente de direccionamiento nativo de la toxina (tal como el dominio Ia de PE y la cadena B de DT) y reemplazándolo por un resto de direccionamiento diferente, tal como un anticuerpo. Una “molécula quimérica” es un resto de direccionamiento, tal como un ligando o un anticuerpo, conjugado (acoplado) con una molécula efectora. El término “conjugado” o “unido” se refiere a convertir dos polipéptidos en una molécula polipeptídica contigua. En una realización, un anticuerpo se une a una molécula efectora. En otra realización, un anticuerpo unido a una molécula efectora se une además a un lípido u otra molécula, a una proteína o un péptido para aumentar su semivida en el cuerpo. El enlace puede ser por medios químicos o recombinantes. En una realización, el enlace es químico, en el que una reacción entre el resto de anticuerpo y la molécula efectora ha producido un enlace covalente formado entre las dos moléculas para formar una molécula. Opcionalmente, puede incluirse un ligador peptídico (secuencia peptídica corta) entre el anticuerpo y la molécula efectora. Debido a que los inmunoconjugados se prepararon originalmente a partir de dos moléculas con funcionalidades independientes, tales como un anticuerpo y una molécula efectora, a veces también se denominan “moléculas quiméricas”. Por tanto, el término “molécula quimérica”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un resto de direccionamiento, tal como un ligando o un anticuerpo, conjugado (acoplado) con una molécula efectora. Los inmunoconjugados son moléculas que no se producen de manera natural.

Péptido inmunogénico: un péptido que comprende un motivo específico de alelo u otra secuencia, tal como una repetición N-terminal, de modo que el péptido se unirá a una molécula de CMH e inducirá una respuesta de linfocitos T citotóxicos (“CTL”) o una respuesta de células B (por ejemplo, producción de anticuerpos) contra el antígeno del que se deriva el péptido inmunogénico.

En una realización, los péptidos inmunogénicos se identifican usando motivos de secuencia u otros métodos, tales como determinaciones de redes neurales o polinomiales, conocidos en la técnica. Normalmente, se usan algoritmos para determinar el “umbral de unión” de los péptidos para seleccionar aquellos con puntuaciones que les dan una alta probabilidad de unirse con una determinada afinidad y que serán inmunogénicos. Los algoritmos se basan en los efectos sobre la unión a CMH de un aminoácido particular en una posición particular, los efectos sobre la unión del anticuerpo de un aminoácido particular en una posición particular o los efectos sobre la unión de una sustitución particular en un péptido que contiene motivos. Dentro del contexto de un péptido inmunogénico, un “residuo conservado” es uno que aparece con una frecuencia significativamente más alta de la que se esperaría por distribución aleatoria en una posición particular en un péptido. En una realización, un residuo conservado es uno en el que la estructura del CMH puede proporcionar un punto de contacto con el péptido inmunogénico. En un ejemplo específico no limitativo, un polipéptido inmunogénico incluye una región de EphA4 humano, o un fragmento del mismo, en el que el polipéptido que se expresa en la superficie celular de una célula huésped que expresa el polipéptido EphA4 humano de longitud completa.

Condiciones inmunológicamente reactivas: incluye una referencia a las condiciones que permiten que un anticuerpo generado contra un epítopo particular se una a ese epítopo en un grado detectablemente mayor que, y/o la exclusión sustancial de, la unión a sustancialmente todos los demás epítopos. Las condiciones inmunológicamente reactivas dependen del formato de la reacción de unión del anticuerpo y normalmente son las que se utilizan en los protocolos de inmunoensayo o las condiciones encontradas in vivo. Véase Harlow y Lane, citado anteriormente, para una descripción de los formatos y las condiciones de los inmunoensayos. Las condiciones inmunológicamente reactivas empleadas en los métodos son “condiciones fisiológicas” que incluyen referencia a condiciones (tales como temperatura, osmolaridad, pH) que son típicas dentro de un mamífero vivo o una célula de mamífero. Si bien se reconoce que algunos órganos están sujetos a condiciones extremas, el entorno en el interior del organismo e intracelular normalmente se encuentra alrededor de pH 7 (es decir, de pH 6,0 a pH 8,0, más normalmente de pH 6,5 a 7,5), contiene agua como disolvente predominante. y existe a una temperatura superior a 0 °C e inferior a 50 °C. La osmolaridad está dentro del intervalo que respalda la viabilidad y proliferación celular.

Inhibir o tratar una enfermedad: inhibir el desarrollo completo de una enfermedad o un estado, por ejemplo, en un sujeto que está en riesgo de padecer una enfermedad tal como un tumor (por ejemplo, un cáncer tal como cáncer de mama) o una enfermedad de la motoneurona tal como ELA. “Tratamiento” se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o estado patológico después de que ha comenzado a desarrollarse. Tal como se usa en el presente documento, el término “mejora”, con referencia a una enfermedad o un estado patológico, se refiere a cualquier efecto beneficioso observable del tratamiento. El efecto beneficioso puede evidenciarse, por ejemplo, por una aparición tardía de los síntomas clínicos de la enfermedad en un sujeto susceptible, una reducción de la gravedad de algunos o todos los síntomas clínicos de la enfermedad, una progresión más lenta de la enfermedad, una reducción en el número de metástasis, una mejora en la salud o el bienestar general del sujeto, o por otros parámetros bien conocidos en la técnica que son específicos de la enfermedad particular. Un tratamiento “profiláctico” es un tratamiento administrado a un sujeto que no presenta signos de una enfermedad o que presenta sólo signos tempranos con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar una patología.

Aislado: un componente biológico “aislado”, tal como un ácido nucleico, una proteína (incluyendo anticuerpos) o un orgánulo, se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en el entorno (tal como una célula) en el que el componente se produce de manera natural, es decir, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y las proteínas que se han “aislado” incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante métodos de purificación convencionales. El término también incluye ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante expresión recombinante en una célula huésped, así como ácidos nucleicos sintetizados químicamente. En algunas realizaciones, el componente biológico es al menos el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % puro.

Marcador: un compuesto o una composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con otra molécula, tal como un anticuerpo o una proteína, para facilitar la detección de esa molécula. Los ejemplos específicos no limitativos de marcadores incluyen etiquetas fluorescentes, enlaces enzimáticos e isótopos radiactivos. En un ejemplo, un “anticuerpo marcado” se refiere a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. Por ejemplo, el marcador es un marcador detectable, tal como la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). Se conocen en la técnica y pueden usarse diversos métodos de marcaje de polipéptidos y glicoproteínas. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionucleótidos (tales como 35S, 11C, 13N, 15O, 18F, 19F, 99mTc, 131I, 3H, 14C, 15N, 90Y, 99Tc, 111In y 125I), marcadores fluorescentes (tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, fósforos de lantánidos), marcadores enzimáticos (tales como peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (tales como secuencias de un par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo) o agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio. En algunas realizaciones, los marcadores se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico.

Ligador: en algunos casos, un ligador es un péptido, tal como dentro de un fragmento de unión a anticuerpo (tal como un fragmento Fv), que sirve para unir indirectamente la cadena pesada variable a la cadena ligera variable. “Ligador” también puede referirse a un péptido que sirve para unir un resto de direccionamiento, tal como un anticuerpo, a una molécula efectora, tal como una citotoxina o un marcador detectable. Los términos “conjugar”, “unir”, “enlazar” o “ligar” se refieren a convertir dos polipéptidos en una molécula polipeptídica contigua, o unir covalentemente un radionúclido u otra molécula a un polipéptido, tal como un scFv. En el contexto específico, los términos incluyen una referencia a unir un ligando, tal como un resto de anticuerpo, a una molécula efectora. La unión puede ser por medios químicos o recombinantes. “Medios químicos” se refiere a una reacción entre el resto de anticuerpo y la molécula efectora de manera que se forma un enlace covalente entre las dos moléculas para formar una molécula.

Mamífero: este término incluye tanto mamíferos humanos como no humanos. De manera similar, el término “sujeto” incluye tanto sujetos humanos como veterinarios.

Neoplasia, tumor maligno, cáncer o tumor: una neoplasia es un crecimiento anómalo de tejido o células que es el resultado de una división celular excesiva. El crecimiento neoplásico puede producir un tumor. La cantidad de tumor en un individuo es la “carga tumoral” que puede medirse como el número, volumen o peso del tumor. Un tumor que no produce metástasis se denomina “benigno”. Un tumor que invade el tejido circundante y/o puede producir metástasis se denomina “maligno”. Los ejemplos de tumores hematológicos incluyen leucemias, incluyendo leucemias agudas (tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (tal como leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolentes y de alto grado), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.

Los ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, tumor maligno linfoide, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cánceres de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor de testículo, seminoma, carcinoma de vejiga y tumores del SNC (tales como un glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofariogioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma del acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma). En varios ejemplos, un tumor es carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago y cáncer de páncreas.

Ácido nucleico: un polímero compuesto de unidades de nucleótidos (ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, variantes estructurales que se producen de manera natural relacionadas y análogos sintéticos que no se producen de manera natural de los mismos) unidos mediante enlaces fosfodiéster, variantes estructurales que se producen de manera natural relacionadas y análogos sintéticos que no se producen de manera natural de los mismos. Por tanto, el término incluye polímeros de nucleótidos en los que los nucleótidos y los enlaces entre ellos incluyen análogos sintéticos que no se producen de manera natural, tales como, por ejemplo y sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quiral, 2-O-metilribonucleótidos, ácidos peptidonucleicos (PNA) y similares. Tales polinucleótidos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automático. El término “oligonucleótido” se refiere normalmente a polinucleótidos cortos, generalmente no mayores de aproximadamente 50 nucleótidos. Se entenderá que cuando una secuencia de nucleótidos está representada por una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), esta también incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en la que “U” reemplaza “T”.

La notación convencional se usa en el presente documento para describir secuencias de nucleótidos: el extremo izquierdo de una secuencia de nucleótidos monocatenaria es el extremo 5'; la dirección izquierda de una secuencia de nucleótidos bicatenaria se denomina dirección 5'. La dirección de la adición 5' a 3' de nucleótidos a los transcriptos de ARN nacientes se denomina dirección de transcripción. La cadena de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm se denomina “cadena codificante”; las secuencias de la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que un ARNm transcrito a partir de ese ADN y que están ubicadas en 5' con respecto al extremo 5' del transcripto de ARN se denominan “secuencias aguas arriba”; las secuencias de la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en 3' con respecto al extremo 3' del transcripto de ARN codificante se denominan “secuencias aguas abajo”.

“ADNc” se refiere a un ADN que es complementario o idéntico a un ARNm, en forma monocatenaria o bicatenaria. “Codificación” se refiere a la propiedad inherente de secuencias de nucleótidos específicas en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, para servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia de nucleótidos definida (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia de aminoácidos definida y las propiedades biológicas resultantes de la misma. Por tanto, un gen codifica para una proteína si la transcripción y traducción del ARNm producido por ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Puede hacerse referencia a que tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y se proporciona habitualmente en listas de secuencias, como la cadena no codificante, usada como molde para la transcripción, de un gen o ADNc codifican para la proteína u otro producto de ese gen o ADNc. A menos que se especifique lo contrario, una “secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos” incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican para la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas y ARN pueden incluir intrones.

“Ácido nucleico recombinante” se refiere a un ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos que no están unidas de manera natural. Esto incluye vectores de ácido nucleico que comprenden un ácido nucleico amplificado o ensamblado que puede usarse para transformar una célula huésped adecuada. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico recombinante se denomina “célula huésped recombinante”. Luego, el gen se expresa en la célula huésped recombinante a producir, tal como un “polipéptido recombinante”. Un ácido nucleico recombinante también puede tener una función no codificante (tal como un promotor, origen de replicación, sitio de unión al ribosoma, etc.). Una primera secuencia es “antisentido” con respecto a una segunda secuencia si un polinucleótido cuya secuencia es la primera secuencia se hibrida específicamente con un polinucleótido cuya secuencia es la segunda secuencia. Los términos usados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos incluyen “secuencia de referencia”, “seleccionada de”, “ventana de comparación”, “idéntica”, “porcentaje de identidad de secuencia”, “sustancialmente idéntica”, “complementaria” y “sustancialmente complementaria”.

Para la comparación de secuencias de secuencias de ácido nucleico, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Se usan los parámetros de programa por defecto. Los métodos de alineación de secuencias para la comparación se conocen bien en la técnica. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA. 85:2444, 1988, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds 1995 suplemento)).

Un ejemplo de algoritmo útil es PILEUP. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360, 1987. El método usado es similar al método descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989. Usando PILEUP, una secuencia de referencia se compara con otras secuencias de prueba para determinar el porcentaje de la relación de identidad de secuencia usando los siguientes parámetros: valor de hueco por defecto (3,00), valor de longitud de hueco por defecto (0,10) y huecos finales ponderados. PILEUP puede obtenerse del paquete de software de análisis de secuencias de GCG, tal como la versión 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395, 1984.

Otro ejemplo de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAsT 2.0, que se describen en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990 y Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1977. El software para realizar análisis de BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (ncbi.nlm.nih.gov/). El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. El programa BLASTP (para secuencias de aminoácidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989).

Unida operativamente: una primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor, tal como el promotor de CMV, está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Generalmente, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, están en el mismo marco de lectura.

Péptido: cadena de aminoácidos de entre 3 y 30 aminoácidos de longitud. En una realización, un péptido tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 aminoácidos. En aún otra realización, un péptido tiene una longitud de aproximadamente 11 a aproximadamente 20 aminoácidos. En aún otra realización, un péptido tiene una longitud de aproximadamente 9 a 12 aminoácidos.

Un “péptido EphA4 humano” es una serie de residuos de aminoácidos contiguos de una proteína EphA4 humana. Un “péptido EphA4 de ratón” es una serie de residuos de aminoácidos contiguos de una proteína EphA4 de ratón. En un ejemplo, con respecto a las composiciones inmunogénicas que comprenden un péptido EphA4 humano, el término se refiere además a variaciones de estos péptidos en los que hay sustituciones conservativas de aminoácidos, siempre que las variaciones no alteren en más de aproximadamente el 20 % (tal como no más de aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 5 % o aproximadamente el 10 %) la capacidad del péptido para producir una respuesta de células B o, cuando se une a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I, para activar linfocitos T citotóxicos contra células que expresan proteína EphA4 humana de tipo silvestre. La inducción de CTL usando péptidos sintéticos y los ensayos de citotoxicidad de ^cT^l se enseñan, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.662.907.

Modificaciones de péptidos: los polipéptidos, tales como los polipéptidos EphA4, incluyen realizaciones sintéticas de péptidos descritos en el presente documento. Además, los análogos (moléculas orgánicas no peptídicas), los derivados (moléculas peptídicas funcionalizadas químicamente obtenidas a partir de las secuencias peptídicas dadas a conocer) y las variantes (homólogos) de estas proteínas pueden utilizarse en los métodos descritos en el presente documento. Cada polipéptido se compone de una secuencia de aminoácidos, que pueden ser o bien aminoácidos L y/o bien D, que se producen de manera natural y de otro modo.

Los péptidos pueden modificarse mediante una variedad de técnicas químicas para producir derivados que tienen esencialmente la misma actividad que los péptidos no modificados y, opcionalmente, que tienen otras propiedades deseables. Por ejemplo, los grupos de ácido carboxílico de la proteína, ya sean carboxilo-terminales o de cadena lateral, pueden proporcionarse en forma de una sal de un catión farmacéuticamente aceptable o esterificarse para formar un éster C¹-C¹⁶, o convertirse en una amida de fórmula NR¹R² en la que R¹ y R² son cada uno independientemente H o alquilo C¹-C¹⁶, o combinarse para formar un anillo heterocíclico, tal como un anillo de 5 ó 6 miembros. Los grupos amino del péptido, ya sean amino-terminales o de cadena lateral, pueden estar en forma de una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable, tal como HCl, HBr, acético, benzoico, toluenosulfónico, maleico, tartárico y otras sales orgánicas, o puede modificarse a alquilo C¹-C¹⁶ o dialquilamino o convertirse adicionalmente en una amida.

Los grupos hidroxilo de las cadenas laterales del péptido pueden convertirse en alcoxilo C¹-C¹⁶ o un éster C¹-C¹⁶ usando técnicas bien reconocidas. Los anillos fenilo y fenólico de las cadenas laterales del péptido pueden estar sustituidos con uno o más átomos de halógeno, tales como flúor, cloro, bromo o yodo, o con alquilo C¹-C¹⁶, alcoxilo C¹-C¹⁶, ácidos carboxílicos y ésteres de los mismos, o amidas de tales ácidos carboxílicos. Los grupos metileno de las cadenas laterales del péptido pueden extenderse a alquilenos C²-C⁴ homólogos. Los tioles pueden protegerse con uno cualquiera de varios grupos protectores bien reconocidos, tales como los grupos acetamida. Los expertos en la técnica también reconocerán métodos para introducir estructuras cíclicas en los péptidos EphA4 para seleccionar y proporcionar restricciones conformacionales a la estructura que dan como resultado una estabilidad mejorada.

Se prevén realizaciones peptidomiméticas y organomiméticas, en las que la disposición tridimensional de los constituyentes químicos de tales péptidomiméticos y organomiméticos imita la disposición tridimensional de la estructura principal del péptido y las cadenas laterales de los aminoácidos componentes, dando como resultado tales péptidomiméticos y organomiméticos de un polipéptido EPHA4 que tiene una capacidad medible o mejorada para generar una respuesta inmunitaria. Para aplicaciones de modelado por ordenador, un farmacóforo es una definición tridimensional idealizada de los requisitos estructurales para la actividad biológica. Los peptidomiméticos y organomiméticos pueden diseñarse para adaptarse a cada farmacóforo con el software de modelado informático actual (usando el diseño de fármacos asistido por ordenador o CADD). Véanse Walters, “Computer-Assisted Modeling of Drugs”, en Klegerman & Groves, eds., 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press, Buffalo Grove, IL, págs. 165-174 y Principles of Pharmacology Munson (ed.) 1995, cap. 102, para obtener descripciones de las técnicas usadas en CADD. También se incluyen miméticos preparados usando tales técnicas.

Agente farmacéutico: un compuesto químico o una composición que puede inducir un efecto terapéutico o profiláctico deseado cuando se administra de manera apropiada a un sujeto o a una célula.

Portadores farmacéuticamente aceptables: los portadores farmacéuticamente aceptables de uso son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a edición, 1975, describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de los anticuerpos dados a conocer en el presente documento.

En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales comprenden habitualmente fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para composiciones sólidas (tales como formas de polvo, píldora, comprimido o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas que van a administrarse pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes reguladores del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitano.

Prevenir, tratar o mejorar una enfermedad: “prevenir” una enfermedad se refiere a inhibir el desarrollo completo de una enfermedad. “Tratar” se refiere a un tratamiento terapéutico que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o un estado patológico después de que ha comenzado a desarrollarse, tal como una reducción en la carga tumoral, una disminución en el número de tamaño de las metástasis o un aumento en la motricidad. “Mejorar” se refiere a la reducción en el número o la gravedad de los signos o síntomas de una enfermedad, tal como un tumor o ELA. Promotor: un promotor es una matriz de secuencias de control de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Un promotor incluye secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción, por ejemplo, en el caso de un promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor también incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distales que pueden ubicarse hasta varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción. Se incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles (véase, por ejemplo, Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987).

Pueden usarse ejemplos específicos y no limitativos de promotores que incluyen promotores derivados del genoma de células de mamífero (tales como el promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (tales como la repetición terminal larga del retrovirus; el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7.5K del virus de la vaccinia). También pueden usarse promotores producidos mediante técnicas de síntesis o de ADN recombinante. Puede insertarse un polinucleótido en un vector de expresión que contiene una secuencia promotora que facilita la transcripción eficaz de la secuencia genética insertada del huésped. El vector de expresión contiene normalmente un origen de replicación, un promotor, así como secuencias de ácido nucleico específicas que permiten la selección fenotípica de las células transformadas.

Purificado: el término purificado no requiere pureza absoluta; más bien, está destinado como un término relativo. Por tanto, por ejemplo, una preparación de péptido purificada es una en la que el péptido o la proteína está más enriquecido que el péptido o la proteína en su entorno natural dentro de una célula. En una realización, una preparación se purifica de manera que la proteína o el péptido represente al menos el 50 % del contenido total de péptido o proteína de la preparación.

Los polipéptidos EphA4 dados a conocer en el presente documento, los anticuerpos que se unen específicamente a EphA4, los fragmentos de unión a antígeno y los anticuerpos biespecíficos pueden purificarse mediante cualquiera de los medios conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo Guide to Protein Purification, ed. Deutscher, Met. Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, 1990; y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, Nueva York, 1982. La purificación sustancial indica la purificación de otras proteínas u otros componentes celulares. Una proteína sustancialmente purificada es al menos el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 % o el 98 % pura. Por tanto, en un ejemplo específico no limitativo, una proteína sustancialmente purificada está libre en un 90 % de otras proteínas u otros componentes celulares.

Recombinante: un ácido nucleico recombinante es uno que tiene una secuencia que no se produce de manera natural o que tiene una secuencia que se produce mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo. Esta combinación artificial a menudo se logra mediante síntesis química o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética.

Toxinas recombinantes: proteínas quiméricas en las que un grupo de direccionamiento celular, tal como un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno o un anticuerpo biespecífico, se fusiona con una toxina (Pastan et al., Science, 254:1173-1177, 1991). Si el resto de direccionamiento celular es la porción Fv de un anticuerpo, la molécula se denomina inmunotoxina recombinante (Chaudhary et al., Nature, 339:394-397, 1989). El resto de la toxina está alterado genéticamente de modo que no puede unirse al receptor de la toxina presente en la mayoría de las células normales. Las inmunotoxinas recombinantes destruyen selectivamente las células que son reconocidas por el dominio de unión a antígeno. Estas toxinas e inmunotoxinas recombinantes pueden usarse, por ejemplo, para tratar un tumor, por ejemplo, un tumor en el que se expresa EphA4 humano. Las toxinas recombinantes no se producen de manera natural.

Muestra (o muestra biológica): una muestra biológica que contiene ADN genómico, ARN (incluyendo ARNm), proteína o combinaciones de los mismos, obtenida de un sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, sangre periférica, tejido, células, orina, saliva, biopsia de tejido, aspiración con aguja fina, muestra quirúrgica y material de autopsia. En un ejemplo, una muestra incluye una biopsia de tejido de HCC.

Identidad de secuencia: la similitud entre las secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico se expresa en términos de la similitud entre las secuencias, también denominada identidad de secuencia. La identidad de secuencia se mide con frecuencia en términos de porcentaje de identidad (o similitud u homología); cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Los homólogos o las variantes de un polipéptido o una molécula de ácido nucleico poseerán un grado relativamente alto de identidad de secuencia cuando se alineen usando métodos convencionales.

Los métodos de alineación de secuencias para la comparación se conocen bien en la técnica. Diversos programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988; y Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994, presenta una consideración detallada de los métodos de alineación de secuencias y cálculos de homología.

La herramienta de búsqueda de alineaciones local básica del NCBI (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990) está disponible de varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD) y en Internet, para su uso en relación con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Una descripción de cómo determinar la identidad de la secuencia usando este programa está disponible en la página web del NCBI en Internet.

Los homólogos y las variantes de una Vl o una Vh de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido EphA4 se caracterizan normalmente por poseer al menos aproximadamente el 75 %, por ejemplo, al menos aproximadamente el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia contada sobre la alineación de longitud completa con la secuencia de aminoácidos del anticuerpo usando Blast 2.0 del NCBI, blastp con huecos establecido en los parámetros por defecto. Para las comparaciones de secuencias de aminoácidos de más de aproximadamente 30 aminoácidos, se emplea la función de secuencias Blast 2 usando la matriz BLOSUM62 por defecto establecida en los parámetros por defecto (coste de existencia de hueco de 11 y un coste de hueco por residuo de 1). Al alinear péptidos cortos (menos de alrededor de 30 aminoácidos), la alineación debe realizarse usando la función de secuencias Blast 2, empleando la matriz PAM30 establecida en los parámetros por defecto (hueco abierto de 9, penalizaciones de hueco de extensión de 1). Las proteínas con una similitud aún mayor con las secuencias de referencia mostrarán porcentajes de identidad crecientes cuando se evalúen mediante este método, tal como al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia. Cuando se compara menos de la secuencia completa para determinar la identidad de secuencia, los homólogos y las variantes poseerán normalmente una identidad de secuencia de al menos el 80 % en ventanas cortas de 10-20 aminoácidos, y pueden poseer identidades de secuencia de al menos el 85 % o al menos el 90 % o el 95 % dependiendo de su similitud con la secuencia de referencia. Los métodos para determinar la identidad de secuencia en ventanas tan cortas están disponibles en la página web del NCBI en Internet. Un experto en la técnica apreciará que estos intervalos de identidad de secuencia se proporcionan únicamente como guía; es muy posible que puedan obtenerse homólogos fuertemente significativos que estén fuera de los intervalos proporcionados.

Agente de unión específico: un agente que se une sustancialmente sólo a una diana definida. Por tanto, un agente de unión específico de EphA4 es un agente que se une sustancialmente a un polipéptido EphA4, tal como EphA4 humano y/o de ratón. En una realización, el agente de unión específico es un anticuerpo monoclonal humano, un fragmento de unión a antígeno del mismo o un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al polipéptido EphA4.

El término “se une específicamente” se refiere, con respecto a un antígeno tal como EphA4, a la asociación preferencial de un anticuerpo u otro ligando, en su totalidad o en parte, con una célula o un tejido que porta ese antígeno y no a células o tejidos que carecen de ese antígeno, tales como una célula que expresa un EphA diferente. Por supuesto, se reconoce que puede producirse un determinado grado de interacción no específica entre una molécula y una célula o un tejido no diana. Sin embargo, la unión específica puede distinguirse como mediada por el reconocimiento específico del antígeno. Aunque los anticuerpos selectivamente reactivos se unen al antígeno, pueden hacerlo con baja afinidad. Por otro lado, la unión específica da como resultado una asociación mucho más fuerte entre el anticuerpo (u otro ligando) y las células que portan el antígeno que entre el anticuerpo (u otro ligando) unido y las células que carecen del antígeno. La unión específica da como resultado normalmente un aumento de más de 2 veces, tal como más de 5 veces, más de 10 veces o más de 100 veces de la cantidad de anticuerpo u otro ligando unido (por unidad de tiempo) a una célula o un tejido que porta el polipéptido EphA4 en comparación con una célula o un tejido que carece del polipéptido. La unión específica a una proteína en tales condiciones requiere un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína particular. Una variedad de formatos de inmunoensayo son apropiados para seleccionar anticuerpos u otros ligandos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase sólida se usan de manera rutinaria para seleccionar AcM específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988), para una descripción de los formatos y las condiciones de inmunoensayo que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica.

Sujeto: organismos vertebrados multicelulares vivos, una categoría que incluye tanto sujetos humanos como veterinarios, incluyendo mamíferos humanos y no humanos.

Cantidad terapéuticamente eficaz: cantidad de una sustancia específica suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto que está tratándose. Por ejemplo, esta puede ser la cantidad necesaria para inhibir o suprimir el crecimiento de un tumor. En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz es la cantidad necesaria para eliminar, reducir el tamaño o prevenir la metástasis de un tumor. Cuando se administra a un sujeto, se usará generalmente una dosificación que logrará concentraciones en el tejido diana (por ejemplo, en tumores) que se ha demostrado que logran un efecto deseado in vitro.

Toxina: una molécula que es citotóxica para una célula. Las toxinas incluyen abrina, ricina, exotoxina de Pseudomonas (PE), toxina diftérica (DT), toxina botulínica, saporina, restrictocina o gelonina, o toxinas modificadas de las mismas. Por ejemplo, PE y DT son compuestos altamente tóxicos que normalmente provocan la muerte por toxicidad hepática. Sin embargo, PE y DT pueden modificarse en una forma para su uso como inmunotoxina eliminando el componente de direccionamiento nativo de la toxina (tal como el dominio Ia de PE o la cadena B de DT) y reemplazándolo por un resto de direccionamiento diferente, tal como un anticuerpo.

Vector: una molécula de ácido nucleico que se introduce en una célula huésped, produciendo así una célula huésped transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permitan replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica.

A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Los términos en singular “un/uno”, “una” y “el/la” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se pretende que la expresión “A o B” incluya A, B y tanto A como B, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, “que comprende A o B” significa que incluye A, B o “A y B”. Debe entenderse además que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos y todos los valores de peso molecular o masa molecular dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan para su descripción. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de la presente divulgación, a continuación se describen métodos y materiales adecuados.

Descripción detallada de la invención

I. Introducción

La presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a EphA4, así como fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos (tales como anticuerpos de cadena sencilla, Fab o F(ab’)2, regiones variables de la cadena pesada o ligera, es decir, VH o VL), formas biespecíficas de estos anticuerpos y conjugados (incluyendo los que están en forma de proteínas de fusión) de estos anticuerpos/fragmentos con una o más moléculas efectoras. Además, se dan a conocer ácidos nucleicos que codifican para estos anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos biespecíficos y conjugados en forma de proteínas de fusión. En algunas realizaciones, se dan a conocer vectores que incluyen estos ácidos nucleicos y células huésped que incluyen estos vectores. En realizaciones adicionales, las composiciones farmacéuticas incluyen estos anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos biespecíficos, conjugados, ácidos nucleicos y vectores. Estos anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos biespecíficos, conjugados, ácidos nucleicos y vectores son útiles para identificar y tratar a un sujeto con un tumor, y también son útiles para identificar y tratar a un sujeto con una enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, EA, EP, ELA, EM, etc.) o un trastorno afectivo tal como depresión.

Más específicamente, esta divulgación abarca varios anticuerpos EphA4 monoclonales completamente humanos con distintas actividades. Las IgG1 m101, m105 y m119 reconocen específicamente el dominio de unión a ligando de EphA4. Por ejemplo, IgG1 m105 inhibe específicamente la interacción de EphA4 con efrina-A/B pero no interfiere con la interacción entre efrina-B y el receptor EphB2. Los anticuerpos también presentan una fuerte afinidad de unión al dominio de unión del ligando de EphA4. Las IgG1 m101 y m119 se unen a EphA4 humano y de ratón con una CE50 de 1 nmol/l, mientras que la IgGl m105 se une a EphA4 humano y de ratón con CE50 subnanomolar. Además, IgG1 m119 actúa como un anticuerpo agonista al estimular la activación de EphA4, mientras que IgG1 m105 actúa como un antagonista de EphA4 que atenúa la activación de EphA4 inducida por efrina-A1. La actividad antagonista de IgG1 m105 convierte a este anticuerpo en una herramienta terapéutica potencialmente muy eficaz para tratar enfermedades neurodegenerativas tales como EA, EP, EM o ELA. IgG1 m105 no afecta la unión de EphB y sus ligandos, y muestra una actividad antagonista diferencial hacia EphA4 con diferentes miembros de ligandos relacionados. El anticuerpo muestra especificidad en su actividad antagonista. IgG1 m105 se une a los receptores EphA4 en las neuronas tras la estimulación por Ap, el principal agente que provoca el deterioro sináptico en la EA. Según el mejor conocimiento de los presentes inventores, este es el primer anticuerpo EphA4 antagonista. Aunque varios documentos de patente anteriores describen diversos anticuerpos EphA4, ninguno es similar a los anticuerpos monoclonales completamente humanos de esta divulgación. Por ejemplo, el documento US 7.604.799 da a conocer anticuerpos agonistas de EphA4. Sin embargo, estos anticuerpos anteriores son diferentes de los anticuerpos de la presente divulgación. No sólo tienen diferentes secuencias de aminoácidos de CDR, estos anticuerpos anteriores también carecen de EphA4 de unión de alta afinidad y la especificidad de los anticuerpos de esta invención. De manera similar, los anticuerpos dados a conocer en los documentos US 8.003.098 y 20090191211A1 no se informa que tengan actividades antagónicas.

II. Anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno

La presente divulgación da a conocer anticuerpos anti-EphA4 novedosos. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno se dan a conocer en el presente documento que se unen específicamente a EphA4, tal como EphA4 humano y de ratón. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a EphA4 con una afinidad de unión de 0,1 x 10-8M, al menos aproximadamente 0,3 x 10-8M, al menos aproximadamente 0,5 x 10-8M, al menos aproximadamente 0,75 x 10-8 M, al menos aproximadamente 1,0 x 10-8 M, al menos aproximadamente 1,3 x 10-8 M al menos aproximadamente 1,5 x 10-8M, o al menos aproximadamente 2,0 x 10-8 M.

En una realización, EphA4 humano tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como

MAGIFYFALF SCLFGICDAVTGSRVYPANEVTLLDSRSVQ GELGWIASPL EGGWEEVSIM DEKNTPIRTYQVCNVMEPSQNNWLRTDWIT REGAQRVYIE IKFTLRDCNS LPGVMGTCKE TFNLYYYESDNDKERFIRENQFVKIDTIAADESFTQVDIG DRIMKLNTEI RDVGPLSKKG FYLAFQDVGACIALVSVRVFYKKCPLTVRN LAQFPDTITGADTSSLVEVRGSCVNNSEEK DVPKMYCGAD GEWLVPIGNC LCNAGHEERS GECQACKIGYYKALSTDATCAKCPPHSYSV WEGATSCTCD RGFFRADNDAASMPCTRPPSAPLNLISNVN ETSVNLEWSS PQNTGGRQDI SYNWCKKCGAGDPSKCRPC GSGVHYTPQQNGLKTTKVSI TDLLAHTNYT FEIWAVNGVS KYNPNPDQSVSVTVTTNQAAPSSIALVQAK EVTRYSVALAWLEPDRPNGVILEYEVKYYE KDQNERSYRI VRTAARNTDI KGLNPLTSYVFHVRARTAAGYGDFSEPLEVTTNTVPSRII GDGANSTVLLVSVSGSWLVVILIAAFVIS RRRSKYSKAKQEADEEKHLNQGVRTYVDPF TYEDPNQAVREFAKEIDASC IKIEKVIGVG EFGEVCSGRL KVPGKREICVAIKTLKAGYT DKQRRDFLSEASIMGQFDHP NIIHLEGWT KCKPVMIITEYMENGSLDAF LRKNDGRFTV IQLVGMLRGI GSGMKYLSDM SYVHRDLAARNILVNSNLVC KVSDFGMSRVLEDDPEAAYT TRGGKIPIRWTAPEAIAYRK FTSASDVWSY GIVMWEVMSY GERPYWDMSNQDVIKAIEEG YRLPPPMDCP IALHQLMLDCWQKERSDRPK FGQIVNMLDK LIRNPNSLKRTGTESSRPNT ALLDPSSPEF SAWSVGDWL QVIKMDRYKD NFTAAGYTTL EAWHVNQE (SEQIDNO:1)

Véase también el n.° de registro de GENEBANK AAH26327.1, tal como estaba disponible el 30 de julio de 2005.

En realizaciones adicionales, EphA4 de ratón tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como:

MDEKNTPIRT YQVCNVMEAS QNNWLRTDWI TREGAQRVYI EIKFTLRDCN SLPGVMGTCK ETFNLYYYES DNDKERFIRE SQFGKIDTIAADESFTQVDI GDRIMKLNTE IRDVGPLSKK GFYLAFQDVGACIALVSVRVFYKKCPLTVRNLAQFPDTIT GADTSSLVEVRGSCVNNSEE KDVPKMYCGADGEWLVPIGN CLCNAGHEEQNGECQACKIGYYKALSTDAS CAKCPPHSYS VWEGATSCTC DRGFFRADNDAASMPCTRPP SAPLNLISNVNETSVNLEWS SPQNTGGRQD ISYNWCKKC GAGDPSKCRP CGSGVHYTPQQNGLKTTRVS ITDLLAHTNYTFEIWAVNEV SKYNPSPDQSVSVTVTTNQAAPSSIALVQAKEVTRYSVALAWLEPDRPNGVILEYEVKYY EKDQNERSYR IVRTAARNTD IKGLNPLTSYVFHVRARTAAGYGDFSEPLEVTTNTVPSRI IGDGANSTVL LVSVSGSWLWILIAAFVI SRRRSKYSKAKQEADEEKHLNQGVRTYVDP FTYEDPNQAVREFAKEIDAS CIKIEKVIGVGEFGEVCSGRLKVPGKREICVAIKTLKAGY TDKQRRDFLS EASIMGQFDH PNIIHLEGWTKCKPVMIIT EYMENGSLDAFLRKNDGRFT VIQLVGMLRG IGSGMKYLSDMSYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGMSRVLEDDPEAAY TTRGGKIPIRWTAPEAIAYRKFTSASDVWS YGIVMWEVMS YGERPYWDMS NQDVIKAIEE GYRLPPPMDC PIALHQLMLD CWQKERSDRP KFGQIVNMLD KLIRNPNSLK RTGSESSRPN TALLDPSSPE FSAWSVGDW LQAIKMDRYK DNFTAAGYTT LEAWHMSQD DLARIGITAI THQNKILSSVQAMRTQMQQMHGRMVPV (SEQIDNO:2)

Véase también el n.° de registro de GENEBANK AAH04782, 3 de octubre de 2003.

En algunas realizaciones, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una o más de las CDR de cadena pesada de m10l. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de m101 es:

OVOLOOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYYMHWVROAPGOGLEWMGGHPIF

GTANYAOKFOGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATAPMVCSSTSCYLR

GFDYWGOGTLVTVSS

(SEQ ID NO:3, en la que las CDR se indican con negrita y subrayado)

Por tanto, en algunas realizaciones el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye uno o más de los aminoácidos 26-33 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3, los aminoácidos 51-58 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3 y/o los aminoácidos 97­ 115 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3. En realizaciones adicionales el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye los aminoácidos 26-33 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3, los aminoácidos 51-58 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3, y los aminoácidos 97-115 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3. En realizaciones adicionales, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3. En todas estas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a EphA4.

En realizaciones adicionales, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una o más de las CDR de cadena pesada de m105. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de m105 es:

EVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVROAPGOGLEWMGG1IP1FG

TANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARELLYCSSTSCGTH

GFDIWGQGTMVTVSS

(SEQ ID NO:4, en la que las CDR se indican con negrita y subrayado)

Por tanto, en algunas realizaciones el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye uno o más de los aminoácidos 26-33 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4, los aminoácidos 51-58 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4, y/o los aminoácidos 97­ 115 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4. En realizaciones adicionales el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye los aminoácidos 26-33 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4, los aminoácidos 51-58 de SEQ ID NO:4, y los aminoácidos 97-115 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4. En realizaciones adicionales, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4. En todas estas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a EphA4.

En realizaciones adicionales, el fragmento de unión a antígeno o anticuerpo de dominio variable de cadena pesada incluye una o más de las CDR de cadena pesada de m119. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de m119 es:

EIVLTQ SPLSLP VTPGEP ASISCRS SOSLLHGN GYNYLDWYLOKPGO SPQLLIYLGSN RASGVPDRF SGSGSGTDFTLKISRVEAED VGVYY CMO ALOTPWTF GOGTK VEIK

(SEQ ID NO:5, en la que las CDR se indican con negrita y subrayado)

Por tanto, en algunas realizaciones el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye uno o más de los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5, los aminoácidos 55-57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5, y/o los aminoácidos 94­ 100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5. En realizaciones adicionales, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye realizaciones la cadena pesada del anticuerpo incluye uno o más de los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5, los aminoácidos 55-57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5, y los aminoácidos 94­ 100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5. En realizaciones adicionales, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5. En todas estas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a EphA4.

En algunas realizaciones, el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una o más de las CDR de cadena ligera de m101. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de m101 es:

DVVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSSOSLLHSNGYNYLDWYLOKPGOSPOLLIYLGS NRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMOALOTPITFGOGTRLEIK

(SEQ ID NO:6, en la que las CDR se indican con negrita y subrayado)

Por tanto, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede incluir uno o más de los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6, aminoácidos 55-57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6, y/o los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6. En algunas realizaciones, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6, los aminoácidos 55-57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6, y los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6. En realizaciones adicionales, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6. En todas estas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a EphA4.

En algunas realizaciones, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una o más de las CDR de cadena ligera de m105. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de m105 es:

DVVMTQ SPL SLP VTPGEP ASISCRS SOSLLHSNGYNYLDWYLOKPGO SPOLLIYLGS NRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMOALOTPLAFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:7, en la que las CDR se indican con negrita y subrayado)

Por tanto, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede incluir uno o más de los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7, los aminoácidos 55­ 57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7, y/o los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7. En algunas realizaciones, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7, los aminoácidos 55-57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7, y los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7. En realizaciones adicionales, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7. En todas estas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a EphA4.

En algunas realizaciones, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una o más de las CDR de cadena ligera de m119. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de m105 es:

EIVLTQ SPL SLP YTPGEP ASISCRS SOSLLHGNGYNYLDWYLOKPGO SPQLLIYLGSN RAS GYPDRF S GS GS GTDF TLKISRVE AED Y G Y Y Y CMO ALOTP WTF GOGTK VEIK

(SEQ ID NO:8 en la que las CDR se indican con negrita y subrayado)

Por tanto, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede incluir uno o más de los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8, los aminoácidos 55­ 57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8, y/o los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8. En algunas realizaciones, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8, los aminoácidos 55-57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8, y los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8. En realizaciones adicionales, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8. En todas estas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a EphA4.

Los anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos dados a conocer en el presente documento pueden ser completamente humanos. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos incluyen una región de entramado humana. Las regiones de entramado de cadena pesada pueden ser una o más de las regiones de entramado en SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 (estas secuencias incluyen secuencias de CDR así como secuencias de entramado). Sin embargo, las regiones de entramado de cadena pesada pueden ser de otra fuente. Las regiones de entramado de cadena ligera pueden ser una o más de las regiones de entramado expuestas en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8. Sin embargo, las regiones de entramado de cadena ligera pueden ser de otra fuente. En algunas realizaciones el uso de regiones de entramado humanas reduce una respuesta a un anticuerpo cuando se usa terapéuticamente. Las formas quiméricas de los anticuerpos dados a conocer también se proporcionan en las que una o más de la región de entramado de cadena pesada y/o las regiones de entramado de cadena ligera son de otra especie, tales como un anticuerpo de ratón, rata o conejo. En algunas realizaciones, las regiones de entramado se seleccionan para que tengan baja inmunogenicidad.

Cualquier dominio variable de cadena pesada dado a conocer en el presente documento puede combinarse con cualquier región de dominio variable de cadena ligera dada a conocer en el presente documento, el anticuerpo monoclonal proporcionado o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a EphA4. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno incluye uno de:

a) un dominio variable de cadena pesada que incluye los aminoácidos 26-33 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3, los aminoácidos 51-58 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3, y/o los aminoácidos 97-115 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3 y un dominio variable de cadena ligera que incluye los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6, los aminoácidos 55-57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6, y/o los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6;

b) un dominio variable de cadena pesada que incluye los aminoácidos 26-33 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4, los aminoácidos 51-58 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4, y/o los aminoácidos 97-115 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4 y un dominio variable de cadena ligera que incluye los aminoácidos 27-37 de SEQ ID NO:7, los aminoácidos 55-57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7, y/o los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7; o

c) un dominio variable de cadena pesada que incluye los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5, los aminoácidos 55-57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5, y/o los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID nO:5 y a dominio variable de cadena ligera que incluye los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8, los aminoácidos 55-57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8, y/o los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8.

En otras realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno incluye uno de:

a) un dominio variable de cadena pesada que incluye los aminoácidos 26-33 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3, los aminoácidos 51-58 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3, y los aminoácidos 97-115 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3 y un dominio variable de cadena ligera que incluye los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6, los aminoácidos 55-57 de SEQ ID NO:6, y los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6;

b) un dominio variable de cadena pesada que incluye los aminoácidos 26-33 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4, los aminoácidos 51-58 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4, y los aminoácidos 97-115 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4 y un dominio variable de cadena ligera que incluye los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7, los aminoácidos 55-57 de SEQ ID NO:7, y los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7; o

c) un dominio variable de cadena pesada que incluye los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5, los aminoácidos 55-57 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5, y los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5 y un dominio variable de cadena ligera que incluye los aminoácidos 27-37 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8, los aminoácidos 55-57 de SEQ ID NO:8, y los aminoácidos 94-100 de la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8.

En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno incluye uno de:

a) un dominio variable de cadena pesada la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:3 y un dominio variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:6;

b) un dominio variable de cadena pesada la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4 y un dominio variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7; o

c) un dominio variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:5 y un dominio variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:8.

Los anticuerpos monoclonales dados a conocer en el presente documento pueden ser de cualquier isotipo. El anticuerpo monoclonal puede ser, por ejemplo, un anticuerpo IgM o IgG, tal como IgG-i, IgG², IgG³ o una IgG⁴. La clase de un anticuerpo que se une específicamente a EphA4 puede cambiarse con otro (por ejemplo, IgG puede cambiarse a IgM), según procedimientos bien conocidos. El cambio de clase también puede usarse para convertir una subclase de IgG en otra, tal como de IgG¹ a IgG².

Los fragmentos de anticuerpos están abarcados en la presente divulgación, tal como Fab, F(ab^')2 y Fv que incluyen una región variable de cadena pesada y cadena ligera y que pueden unirse al determinante epitópico en EphA4. Estos fragmentos de anticuerpo conservan la capacidad de unirse selectivamente con el antígeno. Los fragmentos de unión a antígeno pueden incluirse en un anticuerpo biespecífico. Estos fragmentos de unión a antígeno incluyen: (1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento monovalente de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo, puede producirse mediante digestión del anticuerpo completo con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada;

(2) Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo puede obtenerse tratando el anticuerpo completo con pepsina, seguido por reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo;

3) (Fab')², el fragmento del anticuerpo que puede obtenerse tratando el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reducción posterior; (Fab^')2 es un dímero de dos fragmentos Fab' unidos por dos enlaces disulfuro;

(4) Fv, un fragmento modificado por ingeniería genética que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas; y

(5) Anticuerpo de cadena sencilla (tal como scFv), definido como una molécula modificada por ingeniería genética que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, unidas por un ligador polipeptídico adecuado como una molécula de cadena sencilla fusionada genéticamente.

6) Un dímero de un anticuerpo de cadena sencilla (scFV²), definido como un dímero de un scFV. Esto también se ha denominado “minianticuerpo”.

Los métodos para producir estos fragmentos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988). En varios ejemplos, la región variable incluida en el anticuerpo es la región variable de m610.27. En un grupo de realizaciones, los anticuerpos tienen CDR de Vh de m610.27, o una combinación de estas CDR, tal como se comentó anteriormente.

En un grupo adicional de realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos Fv, que son normalmente de aproximadamente 25 kDa y contienen un sitio de unión a antígeno completo con tres CDR por cada cadena pesada y cada cadena ligera. Para producir estos anticuerpos, la V^h y la V^l puede expresarse a partir de dos constructos de ácido nucleico individuales en una célula huésped. Si la V^h y la V^l se expresan de forma no contigua, las cadenas del anticuerpo Fv se mantienen normalmente juntas mediante interacciones no covalentes. Sin embargo, estas cadenas tienden a disociarse tras la dilución, por lo que se han desarrollado métodos para reticular las cadenas mediante glutaraldehído, disulfuros intermoleculares o un ligador peptídico. Por tanto, en un ejemplo, el Fv puede ser un Fv estabilizado con disulfuro (dsFv), en el que la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera están unidas químicamente por enlaces disulfuro.

En un ejemplo adicional, los fragmentos Fv comprenden cadenas de V^h y V^l conectadas por un ligador peptídico. Estas proteínas de unión a antígeno de cadena sencilla (scFv) se preparan mediante la construcción de un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican para los dominios de V^h y V^l conectados por un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión, que se introduce posteriormente en una célula huésped tal como E. coli. Las células huésped recombinantes sintetizan una única cadena polipeptídica con un ligador peptídico que une los dos dominios V. Los métodos para producir scFv son conocidos en la técnica (véanse Whitlow et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, vol. 2, página 97, 1991; Bird et al., Science 242:423, 1988; la patente estadounidense n.° 4.946.778; Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993; y Sandhu, citado anteriormente). También se contemplan los dímeros de un anticuerpo monocatenario (scFV²).

Los fragmentos de anticuerpos pueden prepararse mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo o mediante expresión en E. coli de ADN que codifica para el fragmento. Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse por digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos mediante métodos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden producirse mediante escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5s denominado F(ab')². Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol y, opcionalmente, un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes Fab' 3.5S. Alternativamente, una escisión enzimática usando pepsina produce dos fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fc directamente (véanse la patente estadounidense n.° 4.036.945 y la patente estadounidense n.° 4.331.647 y las referencias contenidas en las mismas; Nisonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., Methods in Enzymology, vol. 1, página 422, Academic Press, 1967; y Coligan et al. en las secciones 2.8.1-2.8.10 y 2.10.1­ 2.10.4).

También pueden usarse otros métodos de escisión de anticuerpos, tales como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadena ligera-pesada, la escisión adicional de fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.

Un experto se dará cuenta de que pueden producirse variantes conservativas de los anticuerpos. Tales variantes conservativas empleadas en fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos dsFv o en fragmentos scFv, retendrán los residuos de aminoácido críticos necesarios para el plegamiento y la estabilización correctos entre las regiones V^h y la V^l, y conservará las características de carga de los residuos con el fin de conservar el bajo pl y la baja toxicidad de las moléculas. Las sustituciones de aminoácidos (tal como como máximo uno, como máximo dos, como máximo tres, como máximo cuatro o como máximo cinco sustituciones de aminoácidos) pueden realizarse en las regiones V^h y V^l para aumentar el rendimiento. Las tablas de sustitución conservativa de aminoácidos que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas por un experto habitual en la técnica (véase anteriormente). Por tanto, un experto en la técnica puede revisar fácilmente las secuencias mostradas anteriormente, identificar una sustitución conservativa y producir la variante conservativa usando técnicas moleculares bien conocidas.

También se proporcionan anticuerpos biespecíficos en el presente documento. Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce reticulando dos (o más) anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y/o dominios eAd de anticuerpos modificados por ingeniería diferentes para crear anticuerpos biespecíficos. Los agentes reticulantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos claramente reactivos separados por un espaciador apropiado (tales como éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncionales (tales como suberato de disuccinimidilo). Tales ligadores están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, Ill. Por tanto, dos de los anticuerpos EphA descritos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden combinarse para formar un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno dados a conocer también pueden combinarse con un eAd para producir un anticuerpo biespecífico.

En el presente documento se proporcionan conjugados de los anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos dados a conocer. Los polipéptidos contienen normalmente una variedad de grupos funcionales; tales como ácido carboxílico (COOH), amina libre (-NH²) o grupos sulfhidrilo (-SH), que están disponibles para la reacción con un grupo funcional adecuado en un anticuerpo para dar como resultado la unión de la molécula efectora. Alternativamente, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico se derivatiza para exponer o unir grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatización puede implicar la unión de cualquiera de varias moléculas ligadoras tales como las disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, IL. El ligador puede ser cualquier molécula usada para unir el anticuerpo a la molécula efectora. El ligador puede formar enlaces covalentes tanto con el anticuerpo como con la molécula efectora. Los ligadores adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, ligadores de carbono de cadena lineal o ramificada, ligadores de carbono heterocíclicos o ligadores peptídicos. Cuando el anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico y la molécula efectora son polipéptidos, los ligadores pueden unirse a los aminoácidos constituyentes a través de sus grupos laterales (por ejemplo, a través de un enlace disulfuro a cisteína) o los grupos carboxilo y amino en el carbono alfa de los aminoácidos terminales. De hecho, pueden usarse métodos similares para formar un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multivalente, tal como uniendo un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno a otro anticuerpo de interés.

Los anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos y anticuerpos biespecíficos dados a conocer en el presente documento que se unen específicamente a EphA4 pueden derivatizarse para su unión a otra molécula (tal como otro péptido o proteína). En general, los anticuerpos o una porción de los mismos se derivatizan de modo que la unión a EphA4 no se vea afectada de manera adversa por la derivatización o el marcaje. El anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico puede unirse funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, para formar un anticuerpo biespecífico), un agente de detección, un agente farmacéutico, una toxina y/o una proteína o péptido que puede mediar en la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).

Pueden usarse medios de unión tanto covalentes como no covalentes para la unión de una molécula efectora. El procedimiento para unir una molécula efectora a un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico varía según la estructura química del efector. En algunas circunstancias, es deseable liberar la molécula efectora del anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico cuando el inmunoconjugado ha alcanzado su sitio diana. Por tanto, en estas circunstancias, los inmunoconjugados comprenderán uniones que son escindibles en las proximidades del sitio diana. La escisión del ligador para liberar la molécula efectora del anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico puede ser provocada por la actividad enzimática o las condiciones a las que se somete el inmunoconjugado dentro de la célula diana o cerca del sitio diana. En vista del gran número de métodos que se han informado para unir una variedad de compuestos de radiodiagnóstico, compuestos radioterapéuticos, marcadores (tales como enzimas o moléculas fluorescentes), fármacos, toxinas y otros agentes, un experto en la técnica podrá determinar un método adecuado para unir un agente dado a un anticuerpo u otro polipéptido.

En varias realizaciones, el ligador puede incluir un elemento espaciador que, cuando está presente, aumenta el tamaño del ligador de tal manera que se aumenta la distancia entre la molécula efectora o el marcador detectable y el anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno). Los ligadores a modo de ejemplo son conocidos por el experto en la técnica, e incluyen los enumerados en las patentes estadounidenses n.os 7.964.5667, 498.298, 6.884.869, 6.323.315, 6.239.104, 6.034.065, 5.780.588, 5.665.860, 5.663.149, 5.635.483, 5.599.902, 5.554.725, 5.530.097, 5.521.284, 5.504.191, 5.410.024, 5.138.036, 5.076.973, 4.986.988, 4.978.744, 4.879.278, 4.816.444 y 4.486.414, tanto como las publicaciones de patentes estadounidenses n.os 20110212088 y 20110070248.

Un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico que se une específicamente a EphA4 puede marcarse con un resto detectable. Los agentes de detección útiles incluyen compuestos fluorescentes, incluyendo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, fósforos de lantánidos y similares. También se usan marcadores bioluminiscentes, tales como luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarilla fluorescente (YFP). Un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico también puede marcarse con enzimas que son útiles para la detección, tales como peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Puede detectarse una enzima detectable añadiendo reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción que puede discernirse. Por ejemplo, cuando está presente el agente peroxidasa de rábano picante, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es visualmente detectable. Un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico también puede marcarse con biotina y detectarse mediante medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. Cabe señalar que la propia avidina puede marcarse con una enzima o un marcador fluorescente.

Un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico puede marcarse con un agente magnético, tal como gadolinio. Un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico también pueden marcarse con lantánidos (tales como europio y disprosio) y manganeso. Las partículas paramagnéticas, tales como el óxido de hierro superparamagnético, también se usan como marcadores. Un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico también puede marcarse con un epítopo de polipéptido predeterminado reconocido por un indicador secundario (tal como secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo). En algunas realizaciones, los marcadores se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico.

Un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico también puede marcarse con un aminoácido radiomarcado. El radiomarcador puede usarse tanto con fines diagnósticos como terapéuticos. Por ejemplo, el radiomarcador puede usarse para detectar EphA4 mediante rayos X, espectros de emisión u otras técnicas de diagnóstico. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes radioisótopos o radionúclidos: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I. En algunas realizaciones, estos conjugados se usan para el tratamiento de un tumor, por ejemplo, un carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago y cáncer de páncreas. En otras realizaciones, estas toxinas se usan para tratar la esclerosis lateral amiotrófica.

Los anticuerpos monoclonales, el fragmento de unión a antígeno y los anticuerpos biespecíficos pueden conjugarse con agentes terapéuticos, tales como agentes quimioterápicos para producir un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC). En varias realizaciones, pueden conjugarse diversos agentes quimioterápicos con los anticuerpos proporcionados para generar un conjugado. En algunas realizaciones, estos conjugados se usan para el tratamiento de un tumor, por ejemplo, un carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago y cáncer de páncreas.

Las toxinas pueden emplearse con un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico que se une específicamente a EphA4, y fragmento de unión a antígeno de estos anticuerpos. Las toxinas a modo de ejemplo incluyen exotoxina de Pseudomonas (PE), ricina, abrina, toxina diftérica y subunidades de las mismas, ribotoxina, ribonucleasa, saporina y caliqueamicina, así como toxinas botulínicas A a F. Estas toxinas son bien conocidas en la técnica y muchas están fácilmente disponibles de fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Las toxinas contempladas también incluyen variantes de las toxinas (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.079.163 y 4.689.401). En algunas realizaciones, estos conjugados se usan para el tratamiento de un tumor, por ejemplo, un carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago y cáncer de páncreas. En otras realizaciones, estas toxinas se usan para tratar la esclerosis lateral amiotrófica.

La saporina es una toxina derivada de Saponaria officinalis que interrumpe la síntesis de proteínas inactivando la porción 60S del complejo ribosómico (Stirpe et al., Bio/Technology, 10:405-412, 1992). Sin embargo, la toxina no tiene un mecanismo para la entrada específica en las células y, por tanto, requiere la conjugación con un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno) que reconoce una proteína de la superficie celular que se internaliza para que las células la absorban de manera eficiente.

La toxina diftérica se aísla de Corynebacterium diphtheriae. Normalmente, la toxina diftérica para uso en inmunotoxinas se muta para reducir o eliminar la toxicidad inespecífica. Un mutante conocido como CRM107, que tiene una actividad enzimática completa pero una toxicidad inespecífica notablemente reducida, se conoce desde la década de 1970 (Laird y Groman, J. Virol. 19:220, 1976) y se ha usado en ensayos clínicos en humanos. Véase, la patente estadounidense n.° 5.792.458 y la patente estadounidense n.° 5.208.021.

La ricina es la lectina RCA60 de Ricinus communis (semilla de ricino). Para los ejemplos de ricina, véanse patente estadounidense n.° 5.079.163 y la patente estadounidense n.° 4.689.401. La aglutinina de Ricinus communis (RCA) se presenta en dos formas denominadas RCA⁶⁰ y RCA¹²⁰ según sus pesos moleculares de aproximadamente 65 y 120 kD, respectivamente (Nicholson y Blaustein, J. Biochim. Biophys. Acta 266:543, 1972). La cadena A es responsable de inactivar la síntesis de proteínas y destruir las células. La cadena B une la ricina a los residuos de galactosa de la superficie celular y facilita el transporte de la cadena A al citosol (Olsnes et al., Nature 249:627-631, 1974 y patente estadounidense n.° 3.060.165).

Las ribonucleasas también se han conjugado con moléculas de direccionamiento para su uso como inmunotoxinas (véase Suzuki et al., Nat. Biotech. 17:265-70, 1999). Las ribotoxinas a modo de ejemplo tales como a-sarcina y restrictocina se comentan, por ejemplo, en Rathore et al., Gene 190:31-5, 1997; y Goyal y Batra, Biochem. 345 Pt 2:247-54, 2000. Las caliqueamicinas se aislaron por primera vez a partir de Micromonospora echinospora y son miembros de la familia de antibióticos antitumorales enediina que provocan roturas de doble cadena en el ADN que conducen a la apoptosis (véase, por ejemplo, Lee et al., J. Antibiot. 42:1070-87,1989). El fármaco es el resto tóxico de una inmunotoxina en ensayos clínicos (véase, por ejemplo, Gillespie et al., Ann. Oncol. 11:735-41,2000).

La abrina incluye lectinas tóxicas de Abrus precatorius. Los principios tóxicos, abrina a, b, c y d, tienen un peso molecular de desde aproximadamente 63 hasta 67 kD y se componen de dos cadenas polipeptídicas unidas por disulfuro A y B. La cadena A inhibe la síntesis de proteínas; la cadena B (abrina-b) se une a los residuos de D-galactosa (véanse, Funatsu et al., Agr. Biol. Chem. 52:1095, 1988; y Olsnes, Methods Enzymol. 50:330-335, 1978). En una realización, la toxina es exotoxina de Pseudomonas (PE) (patente estadounidense n.° 5.602.095). Tal como se usa en el presente documento, PE incluye PE nativa de longitud completa (que se produce de manera natural) o una PE que se ha modificado. Tales modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a, la eliminación del dominio la, diversas deleciones de aminoácidos en los dominios Ib, II y III, sustituciones de un solo aminoácido y la adición de una o más secuencias en el extremo carboxilo terminal (por ejemplo, véase Siegall et al., J. Biol. Chem.

264:14256-14261, 1989).

La PE empleada con los anticuerpos proporcionados puede incluir la secuencia nativa, fragmentos citotóxicos de la secuencia nativa y variantes modificadas de manera conservativa de la PE nativa y sus fragmentos citotóxicos. Los fragmentos citotóxicos de PE incluyen aquellos que son citotóxicos con o sin posterior procesamiento proteolítico o de otro tipo en la célula diana. Los fragmentos citotóxicos de PE incluyen PE40, PE38 y PE35. Para obtener una descripción adicional de PE y variantes de la misma, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.892.827; 5.512.658; 5.602.095; 5.608.039; 5.821.238; y 5.854.044; el documento WO 99/51643; Pai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3358-3362, 1991; Kondo et al., J. Biol. Chem., 263:9470-9475, 1988; Pastan et al., Biochim. Biophys. Acta, 1333:C1-C6, 1997. En algunos ejemplos, la PE es PE38.

También se contemplan en el presente documento variantes de PE resistentes a proteasa y variantes de PE con inmunogenicidad reducida, tal como, pero son limitarse a, PE-LR, PE-6X, PE-8X, PE-LR/6X y PE-LR/8X (véanse, por ejemplo, Weldon et al., Blood 113(16):3792-3800, 2009; Onda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(32): 1131111316, 2008; los documentos WO 2007/016150, WO 2009/032954 y WO 2011/032022).

En algunos ejemplos, la PE es una variante que es resistente a la degradación lisosómica, tal como PE-LR (Weldon et al., Blood 113(16):3792-3800, 2009; documento WO 2009/032954). En otros ejemplos, la PE es una variante denominada PE-LR/6X (documento WO 2011/032022). En otros ejemplos, la PE es una variante denominada PE-LR/8M (documento WO 2011/032022).

Un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico también puede derivatizarse con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo, o un grupo hidrato de carbono. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, tal como para aumentar la semivida sérica o para aumentar la unión al tejido.

El número promedio de restos de moléculas efectoras o marcadores detectables por anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno) en un conjugado puede variar, por ejemplo, desde 1 hasta 20 restos por anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno). Para algunos conjugados, el número promedio de restos de moléculas efectoras o marcadores detectables por anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno) puede estar limitado por el número de sitios de unión en el anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno). Por ejemplo, cuando la unión es un tiol de cisteína, un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno) puede tener sólo uno o varios grupos tiol de cisteína, o puede tener sólo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales puede unirse un ligador. En determinadas realizaciones, el número promedio de restos de moléculas efectoras o marcadores detectables por anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno) en un conjugado oscila entre 1 y aproximadamente 8; entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6; entre aproximadamente 3 y aproximadamente 5; entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4; entre aproximadamente 3,1 y aproximadamente 3,9; entre aproximadamente 3,2 y aproximadamente 3,8; entre aproximadamente 3,2 y aproximadamente 3,7; entre aproximadamente 3,2 y aproximadamente 3,6; entre aproximadamente 3,3 y aproximadamente 3,8; o entre aproximadamente 3,3 y aproximadamente 3,7. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.498.298. El número promedio de restos de moléculas efectoras o marcadores detectables por anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno) en preparaciones de conjugados puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectroscopía de masas y ensayo ELISA.

La carga (por ejemplo, razón molécula efectora/anticuerpo) de un conjugado puede controlarse de diferentes formas, por ejemplo, mediante: (i) limitar el exceso molar de compuesto intermedio molécula efectora-ligador o reactivo ligador con respecto al anticuerpo, (ii) limitar el tiempo o la temperatura de reacción de conjugación, (iii) condiciones reductoras parciales o limitativas para la modificación del tiol de cisteína, (iv) modificar por ingeniería mediante técnicas recombinantes la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de manera que el número y la posición de los residuos de cisteína se modifique para controlar el número o la posición de las uniones de ligador-molécula efectora (como tioMab o tioFab preparados tal como se da a conocer en el documento WO2006/034488).

III. Ácidos nucleicos y células huésped

Los ácidos nucleicos que codifican para las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena ligera y pesada dados a conocer también se proporcionan en el presente documento. La molécula de ácido nucleico puede ser un ADNc. Un experto en la técnica puede producir fácilmente moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican para los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno dados a conocer, usando las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento y el código genético. Además, un experto en la técnica puede construir fácilmente una variedad de clones que contengan ácidos nucleicos funcionalmente equivalentes, tales como ácidos nucleicos que difieren en secuencia pero que codifican para la misma secuencia de proteína. Por tanto, en el presente documento se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican para los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno dados a conocer y sus componentes, conjugados, formas biespecíficas y conjugados.

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno, conjugados y anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a EphA4 pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, la clonación de secuencias apropiadas o mediante síntesis química directa mediante métodos tales como el método del fosfotriéster de Narang et al., Met. Enzymol. 68:90-99, 1979; el método del fosfodiéster de Brown et al., Met. Enzymol. 68:109-151, 1979; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862, 1981; el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetra. Letts. 22(20): 1859-1862, 1981, por ejemplo, usando un sintetizador automático tal como se describe en, por ejemplo, Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984; y, el método de soporte sólido de la patente estadounidense n.° 4.458.066. La síntesis química produce un oligonucleótido monocatenario. Este puede convertirse en ADN bicatenario mediante hibridación con una secuencia complementaria o mediante polimerización con una ADN polimerasa usando la cadena sencilla como molde. Un experto reconocerá que aunque la síntesis química de ADN se limita generalmente a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas mediante la ligación de secuencias más cortas.

Los ácidos nucleicos a modo de ejemplo que codifican para anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno, conjugados y anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a EphA4 pueden prepararse mediante técnicas de clonación. Ejemplos de técnicas apropiadas de clonación y secuenciación, e instrucciones suficientes para dirigir a expertos en la técnica a través de muchos ejercicios de clonación se encuentran Sambrook et al., citado anteriormente, Berger y Kimmel (eds.), citado anteriormente y Ausubel, citado anteriormente. La información de productos de los fabricantes de reactivos biológicos y equipos experimentales también proporciona información útil. Tales fabricantes incluyen SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia Amersham (Piscataway, NJ), CLONTE^c H Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza), Invitrogen (San Diego, CA) y Applied Biosystems (Foster City, CA), así como muchas otras fuentes comerciales conocidas por los expertos.

Los ácidos nucleicos también pueden prepararse mediante métodos de amplificación. Los métodos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), el sistema de replicación de secuencia autosostenida (3SR). Una amplia variedad de métodos de clonación, células huésped y metodologías de amplificación in vitro son bien conocidas por los expertos en la técnica.

En un ejemplo, el uso de un anticuerpo se prepara insertando el ADNc que codifica para una región variable de un anticuerpo en un vector que comprende el ADNc que codifica para una molécula efectora (EM), tal como una enzima o un marcador. La inserción se realiza de modo que la región variable y la EM se lean en el marco de modo que se produzca un polipéptido continuo. Por tanto, el polipéptido codificado contiene una región Fv funcional y una región EM funcional. En una realización, el ADNc que codifica para una enzima se une a un scFv de modo que la enzima se ubique en el extremo carboxilo terminal del scFv. En varios ejemplos, el ADNc que codifica para una peroxidasa de rábano picante o una fosfatasa alcalina, o un marcador polipeptídico de interés se une a un scFv de modo que la enzima (o marcador polipeptídico) se ubica en el extremo amino terminal del scFv. En otro ejemplo, el marcador se ubica en el extremo amino terminal del scFv. En un ejemplo adicional, el ADNc que codifica para la proteína o el marcador polipeptídico se une a una región variable de cadena pesada de un anticuerpo, de modo que la enzima o el marcador polipeptídico se ubican en el extremo carboxilo terminal de la región variable de cadena pesada. La región variable de cadena pesada puede unirse posteriormente a una región variable de cadena ligera del anticuerpo usando enlaces disulfuro. En aún otro ejemplo, el ADNc que codifica para una enzima o un marcador polipeptídico se une a una región variable de cadena ligera de un anticuerpo, de modo que la enzima o marcador polipeptídico se ubica en el extremo carboxilo terminal de la región variable de cadena ligera. La región variable de cadena ligera puede unirse posteriormente a una región variable de cadena pesada del anticuerpo usando enlaces disulfuro.

Una vez que se aíslan y clonan los ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno y/o anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a EphA4, la proteína puede expresarse en una célula modificada por ingeniería recombinante, tal como células de bacterias, plantas, levaduras, insectos y mamíferos usando un vector de expresión adecuado. Pueden expresarse in vitro una o más secuencias de ADN que codifican para el anticuerpo o un fragmento del mismo mediante transferencia de ADN a una célula huésped adecuada. La célula puede ser procariota o eucariota. El término también incluye cualquier progenie de la célula huésped objeto. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica a la célula parental, ya que pueden producirse mutaciones durante la replicación. Se conocen en la técnica métodos de transferencia estable, lo que significa que el ADN foráneo se mantiene continuamente en el huésped. Los hibridomas que expresan los anticuerpos de interés también están abarcado por esta divulgación.

Las secuencias de polinucleótidos que codifican para los anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno, conjugados y anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a EphA4 pueden unirse operativamente a secuencias de control de expresión. Una secuencia de control de expresión unida operativamente a una secuencia codificante se une de manera que la expresión de la secuencia codificante se logre en condiciones compatibles con las secuencias de control de expresión. Las secuencias de control de expresión incluyen, pero no se limitan a, promotores apropiados, potenciadores, terminadores de la transcripción, un codón de iniciación (es decir, ATG) delante de un gen que codifica para una proteína, señal de corte y empalme para intrones, mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traducción adecuada de ARNm y codones de terminación.

Las secuencias de polinucleótidos que codifican para el anticuerpo, anticuerpo marcado o fragmento funcional del mismo pueden insertarse en un vector de expresión que incluye, pero no se limita a, un plásmido, virus u otro vehículo que puede manipularse para permitir la inserción o incorporación de secuencias y puede expresarse en o bien procariotas o bien eucariotas. Los huéspedes pueden incluir organismos microbianos, de levadura, insectos y mamíferos. Los métodos de expresión de secuencias de ADN que tienen secuencias eucariotas o virales en procariotas son bien conocidos en la técnica. Se conocen en la técnica vectores de ADN plasmídico y viral biológicamente funcionales que pueden expresarse y replicarse en un huésped.

La transformación de una célula huésped con ADN recombinante puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica. En las que el anfitrión es procariota, tal como E. coli, las células competentes que pueden captar ADN pueden prepararse a partir de células recogidas después de la fase de crecimiento exponencial y tratarse posteriormente con el método de CaCl² usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, puede usarse MgCh o RbCl. La transformación también puede realizarse después de formar un protoplasto de la célula huésped si se desea, o mediante electroporación.

Cuando el huésped es un eucariota, pueden usarse tales métodos de transfección de ADN como coprecipitados de fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación, inserción de un plásmido encerrado en liposomas o vectores de virus. Las células eucariotas también pueden transformarse conjuntamente con secuencias de polinucleótidos que codifican para el anticuerpo, anticuerpo marcado o fragmento funcional (unión a antígeno) del mismo y una segunda molécula de ADN foráneo que codifica para un fenotipo seleccionable, tal como el gen de timidina cinasa del herpes simple. Otro método es usar un vector viral eucariota, tal como el virus de los simios 40 (SV40) o el virus del papiloma bovino, para infectar o transformar de manera transitoria células eucariotas y expresar la proteína (véase, por ejemplo, Eukaryotic Vector virals, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Un experto en la técnica puede usar fácilmente sistemas de expresión tales como plásmidos y vectores de uso en la producción de proteínas en células que incluyen células eucariotas superiores tales como líneas celulares COS, CHO, HeLa y de mieloma.

El aislamiento y la purificación del polipéptido expresado de manera recombinante pueden llevarse a cabo por medios convencionales que incluyen cromatografía preparativa y separaciones inmunológicas. Una vez expresado, el anticuerpo, anticuerpo marcado o fragmento funcional del mismo puede purificarse según procedimientos convencionales de la técnica, que incluyen precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna y similares (véase, en general, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982). En el presente documento se dan a conocer composiciones sustancialmente puras de al menos aproximadamente el 90 al 95 % de homogeneidad, y puede usarse del 98 al 99 % o más de homogeneidad con fines farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad deseada, si van a usarse terapéuticamente, los polipéptidos deben estar sustancialmente libres de endotoxinas.

Se han descrito métodos para la expresión de anticuerpos de cadena sencilla y/o el replegamiento a una forma activa apropiada, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla, de bacterias tales como E. coli y son bien conocidos y son aplicables a los anticuerpos dados a conocer en el presente documento. Véanse, Buchner et al., Anal. Biochem.

205:263-270, 1992; Pluckthun, Biotechnology 9:545, 1991; Huse et al., Science 246:1275, 1989 y Ward et al., Nature 341:544, 1989.

A menudo, las proteínas heterólogas funcionales de E. coli u otras bacterias se aíslan de los cuerpos de inclusión y requieren solubilización usando desnaturalizantes fuertes y replegamiento posterior. Durante la etapa de solubilización, tal como se conoce bien en la técnica, debe estar presente un agente reductor para separar los enlaces disulfuro. Un tampón a modo de ejemplo con un agente reductor es: Tris 0,1 M pH 8, guanidina 6 M, EDTA 2 mM, DTE (ditioeritritol) 0,3 M. La reoxidación de los enlaces disulfuro puede producirse en presencia de reactivos de tiol de bajo peso molecular en forma reducida y oxidada, tal como se describe en Saxena et al., Biochemistry 9: 5015-5021, 1970, y especialmente tal como se describe en Buchner et al., citado anteriormente.

La renaturalización se logra normalmente mediante dilución (por ejemplo, 100 veces) de la proteína desnaturalizada y reducida en tampón de replegamiento. Un tampón a modo de ejemplo es Tris 0,1 M, pH 8,0, L-arginina 0,5 M, glutatión oxidado (Gs SG) 8 mM y EDTA 2 mM.

Como una modificación del protocolo de purificación de anticuerpos de dos cadenas, las regiones de cadena pesada y ligera se solubilizan y reducen por separado y luego se combinan en la disolución de replegamiento. Se obtiene un rendimiento a modo de ejemplo cuando estas dos proteínas se mezclan en una razón molar tal que no se exceda un exceso molar de 5 veces de una proteína sobre la otra. Puede añadirse glutatión oxidado en exceso u otros compuestos oxidantes de bajo peso molecular a la disolución de replegamiento después de que se complete el intercambio redox.

Además de los métodos recombinantes, los anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno, conjugados y anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a EphA4 que se dan a conocer en el presente documento también pueden construirse en su totalidad o en parte usando síntesis de péptidos convencional. La síntesis en fase sólida de los polipéptidos de menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud puede lograrse uniendo el aminoácido C-terminal de la secuencia a un soporte insoluble seguido por la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia. Las técnicas para la síntesis en fase sólida se describen en Barany y Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, parte A. págs. 3-284; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963, y Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., 1984. Las proteínas de mayor longitud pueden sintetizarse por condensación de los extremos terminales amino y carboxilo de fragmentos más cortos. Los métodos para formar enlaces peptídicos mediante la activación de un extremo carboxilo terminal (tal como mediante el uso del reactivo de acoplamiento N,N'-dicilohexilcarbodimida) son bien conocidos en la técnica.

VI. Composiciones y métodos terapéuticos

Se proporcionan composiciones que incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos biespecíficos y/o conjugados de los mismos que se unen específicamente a EphA4 y un portador. Se proporcionan composiciones que incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos biespecíficos y/o conjugados que se unen específicamente a EphA4 en un portador. Las composiciones pueden prepararse en formas de dosificación unitarias para la administración a un sujeto, tal como un sujeto con un tumor, un trastorno neurodegenerativo o un trastorno del estado de ánimo. Las composiciones pueden formularse para liberación sostenida.

En algunas realizaciones, el sujeto tiene un tumor que incluye tumores malignos. Cualquier tumor que exprese, especialmente sobreexprese EphA4 puede tratarse usando los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos biespecíficos y conjugados dados a conocer en el presente documento. El tumor puede ser, por ejemplo, un carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago y cáncer de páncreas.

En otras realizaciones, el sujeto tiene un trastorno neurodegenerativo tal como enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis múltiple (EM) o esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Un ejemplo de una enfermedad de este tipo es una enfermedad de la motoneurona, tal como las enfermedades G12 en la clasificación CIE-10 de la OMS. En algunas realizaciones, la enfermedad de la motoneurona es una enfermedad del asta anterior. En realizaciones adicionales, la enfermedad de la motoneurona es la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o la atrofia muscular espinal (AME). En otras realizaciones, el sujeto tiene un trastorno afectivo tal como depresión. En algunos casos, los pacientes que reciben la administración de la composición terapéutica de esta divulgación aún no presentan ningún síntoma definitivo de las enfermedades pertinentes; más bien, puede considerarse que tienen un riesgo aumentado de desarrollar una enfermedad de este tipo en un momento posterior debido a, por ejemplo, un nivel anómalamente muy alto de expresión de EphA4 (por ejemplo, según lo determinado por los métodos de diagnóstico de esta divulgación). Dicho de otro modo, las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse con fines terapéuticos así como con fines profilácticos.

Sin querer limitarse a la teoría, en algunas realizaciones, los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos biespecíficos y conjugados pueden unirse a EphA4, tal como EphA4 humano y/o de ratón, e inhibir una actividad de EphA4, tal como la actividad tirosina cinasa. En algunas realizaciones, los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos biespecíficos y conjugados bloquean la autofosforilación de EphA4, lo que conduce a una señalización celular reducida. En algunas realizaciones, la célula es una motoneurona, tal como en un sujeto con ELA. En otras realizaciones, la célula es una célula tumoral, tal como en un sujeto con cáncer.

En algunas realizaciones, el sujeto tiene ELA, que puede ser ELA familiar o ELA esporádica. El sujeto puede tener ELA de aparición en las extremidades o ELA de aparición bulbar. En otras realizaciones, el sujeto tiene EA. En algún ejemplo no limitativo, el sujeto puede tener ELA o EA de “aparición tardía”, que se desarrolla en individuos mayores de 60 años. Por tanto, el sujeto puede tener más de 60, 65, 70, 75, 80 u 85 años. En otros ejemplos no limitativos, el sujeto puede tener ELA o Ea de “aparición temprana”, que se desarrolla en sujetos de 60 años de edad o menos. Por tanto, el sujeto puede ser un sujeto adulto de 18 a 60 años, tal como un sujeto que tenga entre 20, 25, 30, 35, 35, 40, 45, 50, 55 años y 60 años. El sujeto puede ser un adulto joven (por ejemplo, de 20 a 39 años), de mediana edad (por ejemplo, de 40 a 64 años), o un anciano (por ejemplo, de más de 65 años). El sujeto también puede tratarse con RILUZOLE™ (Rilutek), o el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, conjugado o anticuerpo biespecífico puede administrarse en ausencia de tratamiento con RILUZOLE™ (Rilutek).

La cantidad y la programación de la administración quedan a discreción del médico encargado para lograr los fines deseados. El anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado puede formularse para administración sistémica o local (tal como intratumoral). En un ejemplo, la composición farmacéutica se formula para administración parenteral, tal como administración intravenosa. En otros ejemplos, la composición farmacéutica se formula para administración intramuscular.

Las composiciones para administración pueden incluir una disolución del anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado, o un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado, disuelto en un portador farmacéuticamente aceptable, tal como un portador acuoso. En algunos ejemplos, el anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno, conjugado o anticuerpo biespecífico se une a EphA4 e interfiere con la señalización para mejorar la supervivencia, tal como en un sujeto con ELA o un tumor. Puede usarse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Estas disoluciones son estériles y generalmente están libres de materias indeseables. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste del pH y de tamponamiento, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de anticuerpo en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del sujeto.

Una composición farmacéutica típica para administración intravenosa incluye aproximadamente de 0,1 a 10 mg de anticuerpo por sujeto por día. Pueden usarse dosificaciones desde 0,1 hasta aproximadamente 100 mg por sujeto por día, particularmente si el agente se administra en un sitio aislado y no en el aparato circulatorio o el sistema linfático, tal como en una cavidad corporal o en la luz de un órgano. Los métodos reales para preparar composiciones administrables serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 19a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1995).

El anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado puede proporcionarse en forma liofilizada y rehidratarse con agua estéril antes de la administración, aunque también se proporcionan en disoluciones estériles de concentración conocida. Después, la disolución de anticuerpo se añade a una bolsa de infusión que contiene cloruro de sodio al 0,9 %, USP, y se administra normalmente en una dosificación de desde 0,5 hasta 15 mg/kg de peso corporal. Se dispone de una experiencia considerable en la técnica en la administración de fármacos de anticuerpos, que se han comercializado en los EE.UU. desde la aprobación de RITUXAN® en 1997. Los anticuerpos pueden administrarse mediante infusión lenta, en lugar de mediante una inyección intravenosa lenta o bolo intravenoso. En un ejemplo, se administra una dosis de carga más alta, administrándose dosis de mantenimiento posteriores a un nivel más bajo. Por ejemplo, puede infundirse una dosis de carga inicial de 4 mg/kg a lo largo de un periodo de unos 90 minutos, seguido por dosis de mantenimiento semanales durante 4-8 semanas de 2 mg/kg infundidos a lo largo de un periodo de 30 minutos si la dosis anterior se toleró bien.

También puede administrarse a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado. Un enfoque para la administración de ácidos nucleicos es la inmunización directa con a Dn plasmídico, tal como con un plásmido de expresión de mamífero. La secuencia de nucleótidos que codifica para el anticuerpo dado a conocer puede colocarse bajo el control de un promotor para aumentar la expresión de la molécula. La inmunización mediante constructos de ácido nucleico se conoce bien en la técnica y se enseña, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.643.578 y la patente estadounidense n.° 5.593.972 y la patente estadounidense n.° 5.817.637. La patente estadounidense n.° 5.880.103 describe varios métodos de suministro de ácidos nucleicos que codifican para péptidos inmunogénicos u otros antígenos a un organismo. Los métodos incluyen la administración liposomal de los ácidos nucleicos.

En otro enfoque para usar ácidos nucleicos, también pueden expresarse mediante vectores o huéspedes virales atenuados o vectores bacterianos. Pueden usarse virus de la vaccinia recombinantes, virus adenoasociados (AAV), virus del herpes, retrovirus, citogmegalovirus, poxvirus u otros vectores virales para expresar el anticuerpo. Por ejemplo, se describen vaccinia en la patente estadounidense n.° 4.7220848. BCG (bacilo de Calmette-Guérin) proporciona otro vector para la expresión de los anticuerpos dados a conocer (véase Stover, Nature 351:456-460, 1991).

En una realización, un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo monoclonal dado a conocer que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado se introduce directamente en las células para su expresión. Por ejemplo, el ácido nucleico puede cargarse en microesferas de oro mediante métodos convencionales e introducirse en la piel mediante un dispositivo tal como un cañón de genes Heliosa de Bio-Rad. Los ácidos nucleicos pueden estar “desnudos” y consisten en plásmidos bajo el control de un promotor fuerte.

Normalmente, el ADN se inyecta en el músculo, aunque también puede inyectarse directamente en otros sitios. Las dosificaciones para inyección son habitualmente de alrededor de 0,5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, y normalmente son de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.589.466).

En un ejemplo, el sujeto es humano. El anticuerpo puede administrarse a un mamífero no humano con un tumor que expresa un receptor EphA4 con el que el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, conjugado o anticuerpo biespecífico produce reacción cruzada (tal como un ratón, un primate, un macaco cangrejero o un macaco de la India). El anticuerpo también puede administrarse a un animal que es un sistema modelo para ELA. Cabe señalar que los modelos animales, tales como los modelos de ratón y primate, pueden ser útiles para evaluar el mecanismo de acción y confirmar la eficacia terapéutica de los anticuerpos.

El anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado, puede administrarse a un sujeto que tiene una enfermedad o trastornos en los que se ha demostrado o se sospecha que la presencia de niveles altos de actividad del receptor de EphA4 es responsable de la fisiopatología de la enfermedad o trastorno o es un factor que contribuye a un empeoramiento de la enfermedad o trastorno. Por consiguiente, se espera que la inhibición de la actividad de EphA4, o las células que expresan el receptor, alivien los síntomas y/o la progresión del trastorno. Tales trastornos pueden evidenciarse, por ejemplo, por un aumento en los niveles de receptor para EphA4 en la superficie celular o por una mayor cantidad de EphA4 en un sujeto que padece el trastorno.

El anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado puede ralentizar o inhibir el crecimiento de células, tales como las células tumorales, o bien sea in vivo o bien in vitro. En las aplicaciones in vivo, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo a un sujeto en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento de un tumor o para inhibir un signo o síntoma del tumor. Los sujetos adecuados pueden incluir aquellos con un tumor que expresa el receptor EphA4, tal como los que padecen un carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago y cáncer de páncreas. En algunos ejemplos, el método provoca que el tumor no aumente de peso o volumen o que disminuya de peso o volumen. En un ejemplo adicional, el método provoca una reducción de la metástasis.

El anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado puede administrarse a un sujeto con una enfermedad de la motoneurona, tal como, pero sin limitarse a, ELA, tales como ELA familiar o esporádica. Los sujetos de interés se dieron a conocer anteriormente. El anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado pueden usarse para disminuir la actividad de EphA en las motoneuronas. En algunas realizaciones, se ralentiza la progresión de la enfermedad. El anticuerpo monoclonal puede usarse para determinar los niveles de expresión de EphA4 asociados con ELA, o puede usarse la expresión disminuida de EphA4 para monitorizar la respuesta a la terapia.

Normalmente, se evaluarán uno o más síntomas o parámetros para comprobar la progresión de la enfermedad de la motoneurona en el sujeto. El tratamiento puede reducir la debilidad y/o atrofia muscular. El tratamiento puede disminuir uno o más síntomas como dificultad para moverse, tragar (disfagia) y hablar o formar palabras (disartria). El tratamiento también puede disminuir la tensión y rigidez de los músculos (espasticidad) y los reflejos exagerados (hiperreflexia), incluyendo la reducción del reflejo nauseoso. El tratamiento puede alterar el signo de Babinski (el dedo gordo se extiende hacia arriba cuando se estimula la planta del pie), lo que indica que se disminuye el daño de la motoneurona superior. El tratamiento puede retrasar o reducir la degeneración de las motoneuronas y retrasar o reducir la debilidad y atrofia muscular, los calambres musculares y los espasmos fugaces que pueden observarse debajo de la piel (fasciculaciones). El tratamiento también puede reducir el afecto pseudobulbar, también conocido como “inestabilidad emocional”, reduciendo así los episodios de risa, llanto o sonrisas incontrolables.

Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general de salud del paciente. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado, o el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado, es la que proporciona o bien un alivio de un(os) síntoma(s) o una mejoría objetivamente identificable según lo observado por el médico u otro observador cualificado. En algunas realizaciones, el tratamiento reduce significativamente las células, por ejemplo, disminuyendo la actividad tirosina cinasa de EphA4 y/o la autofosforilación de EphA4.

Las composiciones dadas a conocer pueden administrarse junto con otro agente, tal como un agente para el tratamiento de la ELA, de manera simultánea o secuencial. En ejemplos específicos no limitativos, el sujeto tiene ELA y se administra al sujeto otro agente para el tratamiento de ELA. En ejemplos específicos no limitativos, también se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de RILUZOLE™ (Rilutek).

Para el tratamiento de un tumor, la composición dada a conocer puede administrarse con un agente quimioterápico. Actualmente se conocen en la técnica muchos agentes quimioterápicos. En una realización, los agentes quimioterápicos se seleccionan del grupo que consiste en inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, agentes antisupervivencia, modificadores de la respuesta biológica, antihormonas, por ejemplo, agentes antiandrógenos y antiangiogénesis.

Los agentes antiangiogénesis, tales como inhibidores de MMP-2 (metaloproteinasa de matriz 2), inhibidores de MMP-9 (metaloproteinasa de matriz 9) e inhibidores de COX-II (ciclooxigenasa II), pueden usarse junto con los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y conjugados dados a conocer para el tratamiento de un tumor. Los ejemplos de inhibidores de COX-II útiles incluyen CELEBREX™ (alecoxib), valdecoxib y rofecoxib. Los ejemplos de inhibidores de metaloproteinasas de matriz útiles se describen en los documentos WO 96/33172, WO 96/27583, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, publicación de patente europea 606.046, publicación de patente europea 931.788, documentos WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, patente estadounidense n.° 5.863.949, patente estadounidense n.° 5.861.510 y publicación de patente europea 780.386. En un ejemplo, los inhibidores de Mm P no inducen artralgia tras la administración. En otro ejemplo, el inhibidor de MMP inhibe de manera selectiva MMP-2 y/o MMP-9 en relación con las otras metaloproteinasas de matriz (tal como MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, m Mp-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, ^m M^p-12 y MMP-13). Algunos ejemplos específicos de inhibidores MMP de uso son AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830, ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclopentil)-amino]-propiónico; hidroxiamida del ácido 3-exo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico; hidroxiamida del ácido (2R,3R)-1-[4-(2-cloro-4-fluoro-benciloxi)-bencenosulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxílico; hidroxiamida del ácido 4-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxílico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclobutil)-amino]-propiónico; hidroxiamida del ácido 4-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxílico; hidroxiamida del ácido (R)-3-[4-(4-cloro-fenoxi)bencenosulfonilamino]-tetrahidro-piran-3-carboxílico; hidroxiamida del ácido (2R,3R)-1-[4-(4-fluoro-2-metil-benciloxi)-bencenosulfonil]-3-hidroxi-3-metilpiperidin-2-carboxílico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilH1-hidroxicarbamoil-1-metil-etil)-amino]-propiónico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilH4-hidroxicarbamoiltetrahidro-piran-4-il)-amino]-propiónico; hidroxiamida del ácido 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxaiciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico; hidroxiamida del ácido 3-endo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-8-oxa-iciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico; e hidroxiamida del ácido (R)-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencenosulfonilamino]-tetrahidro-furan-3-carboxílico; y sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos.

El anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado dados a conocer, o un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado, también puede usarse con inhibidores de la transducción de señales, tales como agentes que pueden inhibir las respuestas de EGF-R (receptor del factor de crecimiento epidérmico), tales como anticuerpos EGF-R, anticuerpos EGF y moléculas que son inhibidores de EGF-R; inhibidores de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), tales como receptores de VEGF y moléculas que pueden inhibir VEGF; e inhibidores del receptor de erbB2, tales como moléculas orgánicas o anticuerpos que se unen al receptor de erbB2, por ejemplo, HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). Se describen inhibidores de EGF-R en, por ejemplo, en los documentos WO 95/19970, ^w O 98/14451, ^w O 98/02434, y la patente estadounidense n.° 5.747.498 (expedida el 5 de mayo de 1998). Los agentes que inhiben EGFR también incluyen, pero no se limitan a, los AcM C225 y anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. y Merck KgaA), y los compuestos ZD-1834, ZD-1838 y ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), Cl-1033 (Warner Lambert Parke Davis), C1-1033/EP 183.805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387.785 (Wyet-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), naamidina A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-11 (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), V^rC^t C-310 (Ventech Research), toxina de fusión de EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) y vacuna de EGF-R (York Medical/Centro de Inmunología Molecular (CIM)).

También pueden usarse inhibidores de VEGF, por ejemplo, SU-5416 y SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering) y NX-1838 (NeXstar) junto con un anticuerpo que se une específicamente a EphA4. Los inhibidores de VEGF se describen en, por ejemplo en los documentos WO 99/24440, WO 95/21613, WO 99/61422, la patente estadounidense n.° 5.834.504, el documento WO 98/50356, la patente estadounidense n.° 5.883.113, patente estadounidense n.° 5.886.020, patente estadounidense n.° 5.792.783, documentos WO 99/10349, WO 97/32856, WO 97/22596, WO 98/54093, WO 98/02438, WO 99/16755 y WO 98/02437. Otros ejemplos de algunos inhibidores de VEGF específicos son IM862 (Cytran Inc.); AcM anti-VEGF de Genentech, Inc.; y angiozima, una ribozima sintética de Ribozyme y Chiron. Estos y otros inhibidores de VEGF pueden usarse junto con un anticuerpo que se une específicamente a EphA4.

Los inhibidores del receptor ErbB2, tales como GW-282974 (Glaxo Wellcome), y los AcM AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) y 2B-1 (Chiron), pueden combinarse además con los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos biespecíficos y conjugados dados a conocer, por ejemplo los indicados en los documentos WO 98/02434, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 98/02437, WO 97/13760, WO 95/19970 y la patente estadounidense n.° 5.587.458.

Se administran administraciones únicas o múltiples de las composiciones, tal como a un sujeto con ELA o un tumor, dependiendo de la dosificación y la frecuencia que requiera y tolere el paciente. En cualquier caso, la composición debería proporcionar una cantidad suficiente de al menos uno de los anticuerpos dados a conocer en el presente documento para tratar eficazmente al paciente. La dosificación puede administrarse una vez, pero puede aplicarse de manera periódica o bien hasta que se logre un resultado terapéutico o bien hasta que los efectos secundarios justifiquen la interrupción del tratamiento. En un ejemplo, se infunde una dosis del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, anticuerpo biespecífico o conjugado durante treinta minutos cada dos días. En este ejemplo, pueden administrarse aproximadamente de una a aproximadamente diez dosis, tal como pueden administrarse tres o seis dosis cada dos días. En un ejemplo adicional, se administra una infusión continua durante aproximadamente cinco a aproximadamente diez días. El sujeto puede tratarse a intervalos regulares, tales como mensualmente, hasta que se logre el resultado terapéutico deseado. Generalmente, la dosis es suficiente para tratar o mejorar los síntomas o signos de enfermedad sin producir una toxicidad inaceptable para el paciente.

Las formulaciones parenterales de liberación controlada pueden prepararse como implantes, inyecciones oleosas o como sistemas particulados. Para obtener un resumen amplio de los sistemas de administración de proteínas, véase, Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995). Los sistemas particulados incluyen microesferas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsulas, nanoesferas y nanopartículas. Las microcápsulas contienen la proteína terapéutica, tal como una citotoxina o un fármaco, como núcleo central. En las microesferas, el agente terapéutico se dispersa por toda la partícula. Las partículas, microesferas y microcápsulas menores de aproximadamente 1 |im se denominan generalmente nanopartículas, nanoesferas y nanocápsulas, respectivamente. Los capilares tienen un diámetro de aproximadamente 5 |im, por lo que solo se administran por vía intravenosa nanopartículas. Las micropartículas tienen normalmente alrededor de 100 |im de diámetro y se administran por vía subcutánea o intramuscular. Véanse, por ejemplo, Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, págs.. 219-342 (1994); y Tice y Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. Nueva York, nY, págs.. 315-339, (1992).

Pueden usarse polímeros para la liberación controlada por iones de las composiciones dadas a conocer en el presente documento. Se conocen en la técnica diversas matrices poliméricas degradables y no degradables para su uso en la administración controlada de fármacos (Langer, Accounts Chem. Res. 26:537-542, 1993). Por ejemplo, el copolímero de bloque, polaxámero 407, existe como un líquido viscoso pero móvil a bajas temperaturas pero forma un gel semisólido a la temperatura corporal. Se ha demostrado que es un vehículo eficaz para la formulación y la administración sostenida de interleucina-2 recombinante y ureasa (Johnston et al., Pharm. Res. 9:425-434, 1992; y Pec et al., J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58-65, 1990). Alternativamente, la hidroxiapatita se ha usado como microportador para la liberación controlada de proteínas (Ijntema et al., Int. J. Pharm. 112:215-224, 1994). En aún otro aspecto, los liposomas se usan para la liberación controlada así como para el direccionamiento farmacológico del fármaco encapsulado en lípidos (Betageri et al., Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, P^a (1993)). Se conocen numerosos sistemas adicionales para la administración controlada de proteínas terapéuticas (véanse, la patente estadounidense n.° 5.055.303; patente estadounidense n.° 5.188.837; patente estadounidense n.° 4.235.871; patente estadounidense n.° 4.501.728; patente estadounidense n.° 4.837.028; patente estadounidense n.° 4.957.735; patente estadounidense n.° 5.019.369; patente estadounidense n.° 5.055.303; patente estadounidense n.° 5.514.670; patente estadounidense n.° 5.413.797; patente estadounidense n.° 5.268.164; patente estadounidense n.° 5.004.697; patente estadounidense n.° 4.902.505; patente estadounidense n.° 5.506.206; patente estadounidense n.° 5.271.961; patente estadounidense n.° 5.254.342 y patente estadounidense n.° 5.534.496).

V. Métodos y kits de diagnóstico

Se proporciona en el presente documento un método para la detección de EphA4 in vitro o in vivo. En un ejemplo, la expresión de EphA4 se detecta en una muestra biológica. La muestra puede ser cualquier muestra, incluyendo, pero sin limitarse a, tejido de biopsias, autopsias y muestras de patología. Las muestras biológicas también incluyen secciones de tejidos, por ejemplo, secciones congeladas tomadas con fines histológicos. Las muestras biológicas incluyen además líquidos corporales, tales como sangre, suero, plasma, esputo, líquido cefalorraquídeo u orina. Una muestra biológica se obtiene normalmente de un mamífero, tal como un ser humano.

En varias realizaciones, se proporciona un método para detectar un tumor o evaluar el riesgo de desarrollar un tumor tal como un carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago y cáncer de páncreas. También se proporciona un método para determinar el pronóstico de un sujeto con cualquiera de estos tumores malignos. El sujeto puede ser cualquier sujeto de interés, tal como un sujeto sospechoso de tener el tumor. Los niveles aumentados de EphA4 en la muestra del sujeto, en comparación con un control, indican que el sujeto tiene el tumor o tiene un mayor riesgo de desarrollar un tumor en un momento posterior. En ejemplos específicos no limitativos, la muestra es una muestra de sangre, suero, plasma, esputo o biopsia.

En otras realizaciones, se proporciona un método para detectar o evaluar el riesgo de desarrollar un trastorno neurodegenerativo tal como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP), la esclerosis múltiple (EM) o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Un ejemplo de tal enfermedad es una enfermedad de la motoneurona, tal como las enfermedades G12 en la clasificación CIE-10 de la OMS. En algunas realizaciones, la enfermedad de la motoneurona es una enfermedad del asta anterior. En realizaciones adicionales, la enfermedad de la motoneurona es la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o la atrofia muscular espinal (AME). En otras realizaciones, el sujeto tiene un trastorno afectivo tal como depresión. En realizaciones adicionales, la enfermedad de la motoneurona es la atrofia muscular espinal (AME). El sujeto puede ser cualquier sujeto de interés, tal como un sujeto que se sospecha que padece o tiene un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno neurodegenerativo tal como EA, EP, ^e M o ELA. Los niveles aumentados de EphA4 en la muestra del sujeto, en comparación con un control, indican que el sujeto tiene o tiene un riesgo elevado de desarrollar el trastorno, tal como la enfermedad de la motoneurona de la ELA. En ejemplos específicos no limitativos, la muestra incluye neuronas.

En realizaciones adicionales, se proporcionan métodos para determinar la aparición o la progresión de un trastorno neurodegenerativo tal como EA, EP, EM o ELA en un sujeto, que comprenden determinar los niveles de EphA4 en una muestra del sujeto. Según realizaciones adicionales específicas, los niveles y/o la actividad de EphA4 disminuidos son indicativos de una aparición retardada (en un sujeto con riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa) y/o una supervivencia aumentada y/o menos síntomas. Los niveles aumentados de EphA4 son indicativos de una aparición temprana (en un sujeto con riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa) y/o una supervivencia reducida (o duración de la enfermedad) y/o un aumento de los síntomas de la enfermedad, tal como EA, EP, EM y ELA. La enfermedad puede ser familiar o esporádica. Puede usarse la misma metodología general para determinar la aparición o progresión de un trastorno afectivo tal como la depresión en un sujeto, que comprende determinar el nivel de EphA4 en una muestra del sujeto y comparar el nivel con un control convencional o con un nivel de EphA4 previamente determinado a partir del mismo tipo de muestra. Un aumento del valor de control convencional o un valor medido previamente indica la aparición o progresión de la enfermedad.

Se proporcionan métodos para detectar EphA4 en una muestra biológica, en los que el método incluye poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo en condiciones propicias para la formación de un inmunocomplejo, y detectar el inmunocomplejo, para detectar el EphA4 en la muestra biológica. En un ejemplo, la detección de un aumento de EphA4 en la muestra indica que el sujeto tiene un tumor maligno. En otro ejemplo, la detección de un aumento de EphA4 en la muestra indica que el sujeto es propenso a metástasis. En ejemplos adicionales, el tumor es carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago y cáncer de páncreas.

La cantidad de EphA4 en la muestra puede compararse con un control. El control puede ser un patrón de referencia o una muestra de un sujeto sin el tumor o la enfermedad de la motoneurona, tal como un sujeto sano.

Siempre que se haga un diagnóstico positivo, por ejemplo, se determina que un paciente padece un tumor, un trastorno neurodegenerativo o un trastorno del estado de ánimo o tiene un mayor riesgo de desarrollar un tumor, un trastorno neurodegenerativo o un trastorno del estado de ánimo, el paciente puede estar sometido a pruebas adicionales para confirmar el hallazgo basándose en los resultados de EphA4. En algunos casos, el paciente puede recibir el tratamiento apropiado para su estado usando uno o más métodos terapéuticos o profilácticos clínicamente aprobados. Además, el paciente puede estar sometido a pruebas de seguimiento y tratamiento para mantenimiento continuo y monitorización a largo plazo.

En una realización, el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4 o al fragmento de unión a antígeno se marca directamente con un marcador detectable. En otra realización, el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4 o al fragmento de unión a antígeno (el primer anticuerpo) no está marcado y se marca un segundo anticuerpo u otra molécula que puede unirse al anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4 o al fragmento de unión a antígeno. Tal como conoce bien un experto en la técnica, se elige un segundo anticuerpo que pueda unirse específicamente a la especie y clase específicas del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el primer anticuerpo es una IgG humana, entonces el anticuerpo secundario puede ser un anticuerpo anti-IgG humana. Otras moléculas que pueden unirse a anticuerpos incluyen, sin limitación, proteína A y proteína G, de las que ambas están disponibles comercialmente.

Los marcadores adecuados para el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4 o al fragmento de unión a antígeno, y para el anticuerpo secundario, se describen anteriormente e incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, agentes magnéticos y materiales radiactivos. Los ejemplos no limitativos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa o acetilcolinesterasa. Los ejemplos no limitativos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina. Los ejemplos no limitativos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina. Un material luminiscente a modo de ejemplo no limitativo es luminol; un agente magnético a modo de ejemplo no limitativo es gadolinio, y los marcadores radiactivos a modo de ejemplo no limitativos incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.

En una realización alternativa, EphA4 puede someterse a ensayo en una muestra biológica mediante un inmunoensayo de competencia usado patrones de EphA4 marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo humano no marcado que se une específicamente a EphA4. En este ensayo, la muestra biológica, los patrones de EphA4 marcados y el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4 o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a EphA4 se combinan y se determina la cantidad de patrón de EphA4 marcado unido al anticuerpo no marcado. La cantidad de EphA4 en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de patrón de EphA4 marcado unido al anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4 o al fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a EphA4. El EphA4 puede ser EphA4 humano o de ratón, dependiendo de la muestra de interés.

Los inmunoensayos y el método dados a conocer en el presente documento pueden usarse para varios fines. En una realización, el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4 o fragmento de unión a antígeno puede usarse para detectar la producción de EphA4 por células en cultivo celular. En otra realización, el anticuerpo puede usarse para detectar la cantidad de EphA4 en una muestra biológica. El aumento de la expresión de EphA4 se asocia con varios tipos de cáncer, incluyendo un carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago y cáncer de páncreas. Por tanto, tal como se dio a conocer anteriormente, el nivel de EphA4 puede usarse para diagnosticar o determinar el pronóstico de carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago o cáncer de páncreas en un sujeto. También se sabe que el aumento de la expresión de EphA4 se correlaciona con la presencia y la gravedad de una enfermedad de la motoneurona, tal como la ELA. Por tanto, tal como se dio a conocer anteriormente, el nivel de EphA4 en una muestra de un sujeto puede usarse para diagnosticar o determinar el pronóstico de un sujeto con un trastorno de la motoneurona, tal como ELA.

En una realización, se proporciona un kit para detectar EphA4 en una muestra biológica, tal como una muestra de sangre o una muestra de biopsia. Los kits para detectar un polipéptido comprenderán normalmente un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4 o fragmento de unión a antígeno tal como cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, se incluye en el kit un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv. Para usos in vivo, el anticuerpo puede ser un fragmento scFv. En una realización adicional, el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico está marcado (por ejemplo, con un marcador fluorescente, radiactivo o enzimático).

En una realización, un kit incluye materiales instructivos que dan a conocer los medios de uso de un anticuerpo que se une específicamente a EphA4. Los materiales instructivos pueden estar escritos, en forma electrónica (tal como un disquete de computadora o disco compacto) o pueden ser visuales (tal como archivos de video). Los kits también pueden incluir componentes adicionales para facilitar la aplicación particular para la que está diseñado el kit. Por tanto, por ejemplo, el kit puede contener de manera adicional medios para detectar un marcador (tal como sustratos enzimáticos para marcadores enzimáticos, conjuntos de filtros para detectar marcadores fluorescentes, marcadores secundarios apropiados tales como un anticuerpo secundario, o similar). Los kits pueden incluir de manera adicional tampones y otros reactivos usados habitualmente para la práctica de un método particular. Tales kits y contenidos apropiados son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En una realización, el kit de diagnóstico comprende un inmunoensayo. Aunque los detalles de los inmunoensayos pueden variar con el formato particular empleado, el método de detección de EphA4 en una muestra biológica incluye generalmente las etapas de poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo que reacciona específicamente, en condiciones inmunológicamente reactivas, con un polipéptido EphA4, tal como EphA4 humano o de ratón. Se permite que el anticuerpo se una específicamente en condiciones inmunológicamente reactivas para formar un inmunocomplejo, y la presencia del inmunocomplejo (anticuerpo unido) se detecta directa o indirectamente.

El anticuerpo monoclonal que se une específicamente a EphA4, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico puede conjugarse con otros compuestos que incluyen, pero no se limitan a, enzimas, perlas magnéticas, perlas magnéticas coloidales, haptenos, fluorocromos, compuestos metálicos, compuestos radiactivos o fármacos. Los anticuerpos también pueden usarse en inmunoensayos tales como, pero sin limitarse a, radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) o ensayos inmunohistoquímicos. Los anticuerpos también pueden usarse para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Una FACS emplea una pluralidad de canales de color, canales de detección de dispersión de luz obtusa y de ángulo bajo, y canales de impedancia, entre otros niveles más sofisticados de detección, para separar o clasificar células (véase la patente estadounidense n.° 5.061.620). Cualquiera de los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno o anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a EphA4, tal como se da a conocer en el presente documento, puede usarse en estos ensayos. Por tanto, los anticuerpos pueden usarse en un inmunoensayo convencional, que incluye, sin limitación, un ELISA, un RIA, FACS, inmunohistoquímica tisular, inmunotransferencia de tipo Western o inmunoprecipitación.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para producir resultados esencialmente iguales o similares.

EphA4, el receptor de efrina, se sobreexpresa en una amplia variedad de tumores malignos humanos, incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer de estómago y carcinoma de pulmón de células no pequeñas (CPCNP). EphA4 está asociado con el crecimiento, invasión, metástasis y angiogénesis tumoral. Además, también se ha encontrado que EphA4 está asociado con la enfermedad neurodegenerativa esclerosis lateral amiotrófica (ELA), en la que un gen EphA4 defectuoso permite que los pacientes con ELA vivan considerablemente más tiempo que los pacientes con un gen intacto. La identificación y caracterización de varios anticuerpos monoclonales humanos (AcM) que se unen a EphA4 humano y EphA4 de ratón se proporciona en el presente documento. Estos AcM pueden usarse como terapias contra el cáncer y la ELA como AcM desnudos, en formatos biespecíficos y/o como conjugados anticuerpofármaco.

Ejemplo 1: expresión y purificación de 5 EphA4 recombinantes

Para seleccionar eficazmente anticuerpos de bibliotecas de fagos, se necesita un antígeno recombinante purificado, en este caso EphA4. Para aumentar la inmunogenicidad de la molécula de EphA4, tanto el gen EphA4 humano como el de ratón se fusionaron con Fc de IgG1 humano. El Fc de EphA4 humano y de ratón purificado por proteína G tenía una pureza> 95 % en un gel de poliacrilamida. La proteína de fusión EphA4-Fc de ratón purificada se usó para el cribado de una biblioteca de presentación en fago de Fab humano indiferenciado derivada de sangre humana sana.

Ejemplo 2: unión de alta afinidad de Fab a EphA4 de recombinante

La EphA4-Fc de ratón producida en células 293 Freestyle se marcó con biotina y se usó para el cribado de una gran biblioteca de Fab. Después de la tercera ronda de cribado (figura 1), se seleccionaron 200 clones y se identificaron decenas de clones positivos con secuencias diferentes. Los clones E1, E2, E5 y E19 se unieron con mayor afinidad a EphA4 tanto humano como de ratón que los otros clones y se seleccionaron para una caracterización adicional. Los Fab E1 (m101), E5 (m105) y E19 (m119) unidos a EphA4 humano y de ratón con una CE50 de 5, 2 y 20 nmol/l medida por ELISA (figura 2) se convirtieron a formatos de IgG1. Las IgG1 m101 y m119 se unieron a EphA4 humano y de ratón con la misma CE50 de 1 nmol/l, mientras que la IgG1 m105 se unió a EphA4 humano y de ratón con CE50 subnanomolar (figura 3).

Ejemplo 3: las IgG1 m101, m105 y m119 reconocen específicamente el dominio de unión a ligando de EphA4 Para investigar la propiedad de unión de las IgG1 m101, m105 y m119 a EphA4, se expresó y purificó el dominio de unión del ligando (LBD) de GST-EphA4 humano. El reconocimiento de EphA4 LBD por las 3 IgG1 m101, m105 y m119 se determinó mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. La proteína EphA4 LBD se procesó en SDS-PAGE y se inmunotransfirieron con las 3 IgG1 (figura 4). La cinética de la interacción de las 3 IgG1 y EphA4 LBD se analizó adicionalmente realizando experimentos de calorimetría de titulación isotérmica (ITC). El calor generado por la interacción de la proteína recombinante EphA4 LBD con las IgG1 se midió con un calorímetro sensible. Las IgG1 m101, m105 y m119 presentaron una fuerte afinidad de unión hacia el EphA4 LBD (figura 5). Ejemplo 4: las IgG1 m101, m105 y m119 atenúan la interacción de efrina-Al de ratón y EphA4 de ratón

El ELISA de competencia se realizó para demostrar tanto la unión de las IgG hacia EphA4 como la inhibición contra la interacción de EphA4 y su ligando efrina-A. La placa de ELISA se recubrió previamente con el dominio extracelular de la proteína recombinante EphA4 de ratón, y luego se incubó con las IgG1 m101, m105 o m119 a diferentes concentraciones, seguido de varias rondas de lavado, y finalmente se incubó con proteína quimérica efrina AI-Fc de ratón recombinante biotinilada. La interacción de EphA4 y efrina-A atenuada por las IgG1 se determinó a través del método de detección de estreptavidina-biotina. Se determinó la CI50 de las 3 IgG1. Tal como se observa en la figura 6, las 3 IgG1 pudieron bloquear la interacción entre el dominio extracelular de EphA4 de ratón con la efrina-Al de ratón, en un intervalo nanomolar (CI50: m101 = 0,71 nM; m105 = 0,35 nM; y m119 = 1,81 nM).

Ejemplo 5: IgG1 m105 atenúa específicamente la interacción de EphA4 con efrina-A/B pero no la interacción entre efrina-B y el receptor EphB2.

Para determinar la especificidad de IgG1 m105 en la atenuación de EphA4 con sus ligandos, se demostró mediante ELISA de competencia el bloqueo de la interacción de ligandos de EphA4 por IgG1 m105. El dominio extracelular de la proteína recombinante de EphA4 de ratón o el dominio extracelular de la proteína recombinante de EphB2 de ratón se incubó en primer lugar con IgG1 m105, seguido por incubación con diferentes proteínas quiméricas efrina A/efrina B-Fc de ratón recombinantes biotiniladas. A continuación, se determinó el efecto de IgG1 m105 sobre la interacción de EphA4/EphB2 y efrina-A/efrina-B mediante el método de detección de estreptavidina-biotina. Tal como se observa en la figura 7, IgG1 m105 mostró especificidad en el bloqueo de EphA4 con efrina-A y efrina B. Ejemplo 6: unión específica de AcM a EphA4 asociado a la superficie celular

Un anticuerpo terapéutico o de diagnóstico debería reconocer la proteína nativa. Diversas aplicaciones clínicas requieren diferentes tamaños y valencias de anticuerpos para obtener el mejor efecto. Por ejemplo, se prefieren los tamaños pequeños para el direccionamiento y la obtención de imágenes, mientras que los anticuerpos de tamaño completo (IgG) tienen una semivida en circulación mucho más prolongada, y algunos pueden mediar en las funciones efectoras. Por tanto, se sometió a prueba la unión de IgG1 E1 (m101) al EphA4 nativo asociado con las superficies celulares. Para estos experimentos, se transfectaron de manera transitoria células 293T con EphA4 de ratón y se sometió a prueba la unión de m101 a las células transfectadas así como a las células no transfectadas. Tal como se indica en la figura 8, m101 se unió específicamente a células EphA4-293T tan potente como el ligando natural de EphA4, efrina-A5-Fc, lo que sugiere que los AcM que se identificaron pueden unirse específicamente a EphA4 asociado a la superficie celular.

Ejemplo 7: IgG1 m 119 estimula la activación de EphA4

Las IgG1 m101, m105 y m119 se unen a EphA4 e interfieren con la interacción de EphA4 con efrinas. Se examinó su capacidad para actuar como agonistas para regular la activación de EphA4 in vivo. La activación del receptor EphA4 por las IgG1 se determinó por fosforilación de tirosina de EphA4 en neuronas corticales cultivadas tratadas con IgG1. En resumen, las neuronas corticales cultivadas se trataron con las IgG1 m101, m105 o m119 a una concentración de 2 |ig/ml. La proteína EphA4 se inmunoprecipitó con anticuerpo EphA4 de los lisados de proteína, se procesó en SDS-PAGE y luego se inmunotransfirió con anticuerpo fosforilado en tirosina (véase la figura 9). Ejemplo 8: IgG1 m105 actúa como un antagonista de EphA4 que atenúa la activación de EphA4 inducida por efrina-A l

Las IgG1 m101, m105 y m119 se unen al EphA4 LBD e interfieren con la interacción de EphA4 con efrinas. Se examinó su capacidad para actuar como antagonistas para atenuar la activación de EphA4 en neuronas cultivadas. Las neuronas corticales cultivadas a 7 DIV se pretrataron con las IgG1 indicadas antes del tratamiento con efrina-A1 preagrupada. Para m105, esto fue 2 |ig/ml para la dosis más baja (indicada como 105L) y 5 |ig/ml para la dosis más alta (indicada como 105H), mientras que m101 (101), 119 (119) e IgG fueron todos de 5 |ig/ml. A continuación, las células se recogieron y se sometieron a inmunoprecipitación y análisis de inmunotransferencia de tipo Western usando los anticuerpos indicados. Tal como se observa en la figura 10 (A), m105 atenúa la fosforilación de EphA4 inducida por efrina-Al de una manera dependiente de la dosis. Los gráficos muestran la cuantificación de P-Tyr de EphA4 después de la inmunoprecipitación (figura 10 (B)) y la cuantificación de la fosforilación de Tyr602 de EphA4 (figura 10 (C)).

Ejemplo 9: IgG1 m105 reconoce EphA4 en neuronas de hipocampo cultivadas: AB reduce la localización conjunta de receptores EphA4 marcados con m105 con marcador postsináptico PSD-95.

Tal como se muestra en la figura 11, Ap reduce la localización conjunta de los receptores EphA4 marcados con m105 con PSD-95. Las imágenes de fluorescencia muestran las neuronas de hipocampo cultivadas (-18-20 DIV) tratadas con Ap 500 nM en diferentes puntos de tiempo, tal como se indica. Las células se inmunotiñeron con IgG1 m105 y anticuerpo PSD-95. El gráfico muestra una disminución del nivel de EphA4 localizado conjuntamente con PSD-95. NEphA4(n) representa el número de localizaciones (o los recuentos de localizaciones) en imágenes de superresolución. Este número refleja sólo la abundancia relativa de EphA4(N) pero no es el número exacto de proteínas, ni siquiera el número de etiquetas fluorescentes, ya que cada molécula de tinte puede cambiar muchas veces durante la obtención de imágenes.

Ejemplo 10: el bloqueo de la señalización directa de EphA4 rescata el deterioro mediado por oligómeros ABm.47) de la transmisión sináptica.

Para examinar la capacidad de IgG1 m105 para inhibir la señalización de EphA4, se realizó un ensayo de agrupamiento de EphA4. Tal como se muestra en la figura 12, los agrupamientos de EphA4 se cuantificaron calculando la proporción del área total de los agrupamientos de EphA4 en los axones (área positiva de Tau).

El bloqueo de la señalización directa de EphA4 rescata el deterioro mediado por oligómeros AP(¹-⁴²) de la transmisión sináptica y la plasticidad sináptica mediada por oligómeros. Tal como se observa en la figura 13, el anticuerpo m105, que bloquea la interacción de EphA4 endógeno y efrina-A, rescata la reducción de la frecuencia mediada por oligómeros AP(¹-⁴²) de mEPSC (500 nM). Las neuronas de hipocampo cultivadas (22 DIV) se trataron con 2 |ig/ml de m105 durante 30 minutos antes de Ap (1-42) 500 nM durante 24 horas.

Material y métodos

Producción de proteínas EphA4. Los segmentos del gen EphA4 humano y de ratón se sintetizaron mediante Genscript (Piscataway, NJ). Los plásmidos que codifican para EphA4 humano o de ratón fusionados con Fc de IgG1y etiqueta de avidina (EphA4-Fc) se transfectaron en células 293 Freestyle (Invitrogen) para determinar la expresión transitoria, y se usó EphA4-Fc de ratón para el biocribado. La pureza de la proteína se juzgó mediante SDS-PAGE y la concentración de proteína se midió de manera espectrofotométrica (NanoVue, GE Healthcare).

Selección, expresión y purificación de los Fab específicos de EphA4 y conversión a IgG1. Una gran biblioteca de presentación en fago construida usando ADNc de PMBC de 40 voluntarios sanos y otra biblioteca de presentación en fago construida usando sangre del cordón umbilical de 10 donantes se cribaron usando proteína de fusión EphA4-Fc de ratón marcada con biotina conjugada con perlas magnéticas (Invitrogen). Se incubaron bibliotecas amplificadas de 1012 Fab presentados en fago con 5, 3 y 1 |ig de EphA4-Fc durante 2 h a temperatura ambiente durante la primera, segunda y tercera rondas de biocribado, respectivamente. Los clones que se unieron a EphA4-Fc se identificaron a partir de la tercera ronda de cribado usando ELISA de fagos policlonales y monoclonales. Los dominios de V^h y V^l de estos clones se secuenciaron y se identificaron los clones dominantes. Para la conversión en IgG1, las cadenas pesada y ligera de los Fab se amplificaron y se volvieron a clonar en el vector pDR12 (proporcionado por D. Burton, Scripps Research Institute, La Jolla, CA). Tanto los Fab como las IgG1 se expresaron tal como se describió previamente. La pureza de la proteína se estimó en>95 % mediante SDS-PAGE y la concentración de proteína se midió de manera espectrofotométrica (NanoVue, GE Healthcare).

ELISA. Las proteínas EphA4 se recubrieron en una placa de 96 pocillos (Costar) a 50 ng/pocillo en PBS durante la noche a 4 °C. Para el ELISA de fagos, se incubaron fagos de cada ronda de cribado (ELISA de fagos policlonales) o clones seleccionados al azar de las células TG1 infectadas (ELISA de fagos monoclonales) con antígeno inmovilizado. Los fagos unidos se detectaron con Ac policlonal anti-M13-HRP (Pharmacia, Piscataway, NJ). Para el ensayo de unión de Fab soluble, se usó Ac de etiqueta anti-FLAG de ratón conjugado con HRP (Sigma-Aldrich) para detectar la unión de Fab. Para el ensayo de unión de IgG1, se usó para la detección Ac anti-Fab conjugado con HRP (Sigma-Aldrich). Para el ensayo ELISA de competencia, el dominio extracelular de la proteína recombinante EphA4 de ratón o el dominio extracelular de la proteína recombinante EphB2 de ratón se recubrió previamente en la placa de ELISA y luego se incubó con diferentes IgG1 durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de varios lavados con DPBS, las proteínas EphA4 o EphB2 se incubaron con diferentes proteínas quimeras efrina-A/efrina-B-Fc recombinantes de ratón biotiniladas durante 1 hora a temperatura ambiente. La interacción de EphA4/EphB2 y efrina-A/efrina-B se determinó mediante el método de detección de estreptavidina-biotina.

Citometría de flujo. Para medir las interacciones de IgG1 con EphA4, se incubaron alícuotas de células 293T o

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   i . Un anticuerpo monoclonal completamente humano aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:4 y un dominio variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:7, en el que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a EphA4.
2. 2. El anticuerpo monoclonal aislado según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal es una IgG, o en el que el fragmento de unión a antígeno es un fragmento de unión a antígeno scFv, Fv, Fab o F(ab)2.
3. 3. Un anticuerpo biespecífico que comprende el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
4. 4. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno según una cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o el anticuerpo biespecífico según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo se conjuga con una molécula efectora.
5. 5. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico según la reivindicación 4, en el que la molécula efectora es un marcador detectable, una toxina o un agente quimioterápico.
6. 6. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno o anticuerpo biespecífico según la reivindicación 5, en el que el marcador detectable es un marcador fluorescente, un radiomarcador, avidina, biotina o una enzima, o en el que la toxina es una exotoxina de Pseudomonas.
7. 7. Una secuencia de polinucleótido que codifica para el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o para el anticuerpo biespecífico según la reivindicación 3, opcionalmente unida operativamente a un promotor.
8. 8. Un método de detección ex vivo de la presencia de un tumor en un sujeto, que comprende

   poner en contacto ex vivo una muestra biológica del sujeto con una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o del conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6; y

   detectar la unión del anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o conjugado a la muestra biológica;

   en el que un aumento en la unión del anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno, o conjugado en comparación con un control indica que el sujeto tiene el tumor.
9. 9. Una composición para su uso en el tratamiento de un tumor en un sujeto que lo necesita, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, del anticuerpo biespecífico según la reivindicación 3 o del conjugado según la reivindicación 4.
10. 10. El método según la reivindicación 8 o la composición para su uso según la reivindicación 9, en los que el tumor es un carcinoma de mama, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de estómago, o cáncer de páncreas.
11. 11. Un método de detección ex vivo de la presencia de o un riesgo elevado para desarrollar neurodegeneración o un trastorno afectivo en un sujeto, que comprende poner en contacto ex vivo una muestra biológica del sujeto con una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o del conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6; y detectar la unión del anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o conjugado a EphA4; en el que un aumento en la unión en comparación con un control indica que el sujeto tiene o está en un riesgo elevado de desarrollar la neurodegeneración o el trastorno afectivo.
12. 12. Una composición para su uso en el tratamiento de neurodegeneración o un trastorno afectivo en un sujeto que lo necesita, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, del anticuerpo biespecífico según la reivindicación 3, o del conjugado según la reivindicación 4.
13. 13. El método según la reivindicación 11 o la composición para su uso según la reivindicación 12, en los que la neurodegeneración es enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, o esclerosis lateral amiotrófica, o en los que el trastorno afectivo es depresión.
14. 14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, del anticuerpo biespecífico según la reivindicación 3 o del conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, o un vector que comprende el ácido nucleico, y un portador farmacéuticamente aceptable.