JP3017320B2 - ヒト造血幹細胞 - Google Patents
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明の分野は造血幹細胞の単
離、再生及び使用である。
離、再生及び使用である。
【0002】
【従来の技術】哺乳類の血液細胞は並はずれて多様な範
囲の活性を提供する。血液細胞はリンパ球系、骨髄系及
び赤血球系をはじめとするいくつかの系(lineag
e)に分けられる。B細胞及びT細胞を含むリンパ球系
は抗体の産生、細胞免疫系の調節、血液中の外来物質の
検出、宿主にとって外来性の細胞の検出等を提供する。
囲の活性を提供する。血液細胞はリンパ球系、骨髄系及
び赤血球系をはじめとするいくつかの系(lineag
e)に分けられる。B細胞及びT細胞を含むリンパ球系
は抗体の産生、細胞免疫系の調節、血液中の外来物質の
検出、宿主にとって外来性の細胞の検出等を提供する。
【0003】単球、顆粒球、巨核球及び他の細胞を包含
する骨髄系、例えば、血液流中の外来物質の存在を監視
し、腫瘍細胞(neoplastic cells)に
対しての保護を与え、血流中の外来物質を除去し、血小
板を生産する。赤血球系は酸素運搬体として作用する赤
血球を供給する。
する骨髄系、例えば、血液流中の外来物質の存在を監視
し、腫瘍細胞(neoplastic cells)に
対しての保護を与え、血流中の外来物質を除去し、血小
板を生産する。赤血球系は酸素運搬体として作用する赤
血球を供給する。
【0004】血液細胞の性質、形態、特性及び機能の多
様性にも拘らず、自己再生することができ、かつ成長因
子へ接すること(exposure)によって特定の系
になることができる単一の先祖があると現在考えられて
いる。
様性にも拘らず、自己再生することができ、かつ成長因
子へ接すること(exposure)によって特定の系
になることができる単一の先祖があると現在考えられて
いる。
【0005】幹細胞集団は骨髄中の総白血球数の小さな
パーセンテージしか構成しない。加えて、現在のところ
分化細胞に関与するどれぐらいの数のマーカーが幹細胞
上に存在するのか分らない。先祖の活性の幾分の増強を
与えると報告されたあるマーカーはクラスIIHLA
(特にJI−43と名づけられたモノクローナル抗体に
よって認識される保存DRエピトープ(抗原決定基))
である。
パーセンテージしか構成しない。加えて、現在のところ
分化細胞に関与するどれぐらいの数のマーカーが幹細胞
上に存在するのか分らない。先祖の活性の幾分の増強を
与えると報告されたあるマーカーはクラスIIHLA
(特にJI−43と名づけられたモノクローナル抗体に
よって認識される保存DRエピトープ(抗原決定基))
である。
【0006】しかしながら、これらのマーカーは多数の
系に付された(committed)造血細胞(hem
atopoietic cells)上に見い出されて
いる。幹細胞CD34上に存在することが示された1つ
のマーカーはかなりの数の系統に付された先祖上にも見
い出されている。特に、B細胞(CD19+)及び骨髄
系細胞(CD33+)はCD34+集団の80−90%
を構成する。しかも、CD3,8,10,15,19,
20及び33の組合せはすべてのCD34+細胞の>9
0%を標識する(mark)であろう。
系に付された(committed)造血細胞(hem
atopoietic cells)上に見い出されて
いる。幹細胞CD34上に存在することが示された1つ
のマーカーはかなりの数の系統に付された先祖上にも見
い出されている。特に、B細胞(CD19+)及び骨髄
系細胞(CD33+)はCD34+集団の80−90%
を構成する。しかも、CD3,8,10,15,19,
20及び33の組合せはすべてのCD34+細胞の>9
0%を標識する(mark)であろう。
【0007】従って、幹細胞である骨髄中の細胞の総数
の小さな集団、より分化した細胞とは別個の幹細胞に関
与するマーカーの不確かさ(unertainty)、
生物学的アッセイのヒト幹細胞に対する一般的無能力の
観点から、幹細胞の同定及び精製はつかまえどころがな
かった。
の小さな集団、より分化した細胞とは別個の幹細胞に関
与するマーカーの不確かさ(unertainty)、
生物学的アッセイのヒト幹細胞に対する一般的無能力の
観点から、幹細胞の同定及び精製はつかまえどころがな
かった。
【0008】最近、マウス幹細胞が精製された形態では
ないが少なくとも高度に濃縮された形態で得られたが、
そこでは骨髄から得られた約30より少ない細胞が致命
的に照射されたマウスの造血系のすべての系を再構成す
ることができた。実際、1個の注入された細胞でもすベ
ての造血系を再構成することができるであろう。
ないが少なくとも高度に濃縮された形態で得られたが、
そこでは骨髄から得られた約30より少ない細胞が致命
的に照射されたマウスの造血系のすべての系を再構成す
ることができた。実際、1個の注入された細胞でもすベ
ての造血系を再構成することができるであろう。
【0009】Thy−1分子はラット、マウス及びヒト
の脳及び造血系に存在する高度に保存されたタンパク質
である。これらの種はこの抗原を区別をつけて(dif
ferentially)発現するが、この分子の真の
機能は知られていない。しかしながら、 Thy−1分
子はラット及びマウスの造血幹細胞上で同定された。こ
の蛋白質はまたヒトの骨髄細胞上にも存在し、造血幹細
胞の選択に有用である。
の脳及び造血系に存在する高度に保存されたタンパク質
である。これらの種はこの抗原を区別をつけて(dif
ferentially)発現するが、この分子の真の
機能は知られていない。しかしながら、 Thy−1分
子はラット及びマウスの造血幹細胞上で同定された。こ
の蛋白質はまたヒトの骨髄細胞上にも存在し、造血幹細
胞の選択に有用である。
【0010】ヒトの造血幹細胞の同定に対して強い関心
がよせられている。幹細胞を手にすることによりその自
己再生に関与する成長因子の同定が可能になるであろ
う。加えて、(1)幹細胞の特定の系統への献身(de
dication)の初期の工程、(2)かかる献身の
防止、及び(3)幹細胞増殖の負の制御、に関与する未
発見の成育因子があるかもしれない。
がよせられている。幹細胞を手にすることによりその自
己再生に関与する成長因子の同定が可能になるであろ
う。加えて、(1)幹細胞の特定の系統への献身(de
dication)の初期の工程、(2)かかる献身の
防止、及び(3)幹細胞増殖の負の制御、に関与する未
発見の成育因子があるかもしれない。
【0011】幹細胞を利用できると、骨髄移植のみなら
ず骨髄の移植と共に他の器官の移植に非常に有用であ
る。幹細胞は遺伝子治療の重要なターゲットであり、そ
こでは挿入された遺伝子が幹細胞を移植した個人の健康
を促進する。
ず骨髄の移植と共に他の器官の移植に非常に有用であ
る。幹細胞は遺伝子治療の重要なターゲットであり、そ
こでは挿入された遺伝子が幹細胞を移植した個人の健康
を促進する。
【0012】加えて、幹細胞を単離できると、リンパ腫
及び白血病、さらには他の腫瘍状態、例えば胸癌の治療
に役立つかも知れない。かくして、実質的に純粋である
かまたは純粋な形態でヒト造血幹細胞を単離することに
向けての世界的規模での努力がなされてきた。
及び白血病、さらには他の腫瘍状態、例えば胸癌の治療
に役立つかも知れない。かくして、実質的に純粋である
かまたは純粋な形態でヒト造血幹細胞を単離することに
向けての世界的規模での努力がなされてきた。
【0013】
【従来の技術】米国特許4714680はヒト幹細胞を
含有する組成物を記述している。ヨーロッパ特許公開
(EPA)89.304651.6はマウス幹細胞の単
離を記述している。そこで引用された文献も参照された
い。造血系先祖の分析はWhitlock及びWitt
e,PNAS USA(1982)79:3608及び
Whitlockら、Cell(1987)48:10
09によって報告されている。
含有する組成物を記述している。ヨーロッパ特許公開
(EPA)89.304651.6はマウス幹細胞の単
離を記述している。そこで引用された文献も参照された
い。造血系先祖の分析はWhitlock及びWitt
e,PNAS USA(1982)79:3608及び
Whitlockら、Cell(1987)48:10
09によって報告されている。
【0014】Thy−1は齧歯動物の骨髄細胞を再構成
することについての表面マーカーである(Berman
及び Braush Exp. Hematol.(1
985)13:1952及び Goldschneid
erら、J.Exp.Med.(1978)148:1
351)。Mueller−Sieburgら、Cel
l(1986)44:653はThy−1 Lin−マ
ウス造血幹細胞及び制御希釈(limitdiluti
on)の使用を記述している。
することについての表面マーカーである(Berman
及び Braush Exp. Hematol.(1
985)13:1952及び Goldschneid
erら、J.Exp.Med.(1978)148:1
351)。Mueller−Sieburgら、Cel
l(1986)44:653はThy−1 Lin−マ
ウス造血幹細胞及び制御希釈(limitdiluti
on)の使用を記述している。
【0015】
【発明の概要】ヒト造血幹細胞の実質上均質な組成物の
単離をもたらす方法が提供される。この方法は予め定め
られた分離方法及び単離された細胞からの各造血系の発
生を確立するバイオアッセイを採用する。
単離をもたらす方法が提供される。この方法は予め定め
られた分離方法及び単離された細胞からの各造血系の発
生を確立するバイオアッセイを採用する。
【0016】ヒト幹細胞は(1)幹細胞を欠く宿主の造
血系の再生、(2)病気にかかっており、骨髄の取り出
し、幹細胞の単離及び幹細胞の再移植(re−engr
aftment)に先立つ薬物または照射による個々体
の治療によって治療し得る宿主、(3)種々の造血細胞
の生産、(4)幹細胞自己再生に関与する成育因子の検
出及び評価、(5)造血細胞系の発生、及び造形系の発
生に関与する因子についてアッセイ、及び(6)自系幹
細胞における遺伝子置換による遺伝病の治療に、用途を
見い出す。
血系の再生、(2)病気にかかっており、骨髄の取り出
し、幹細胞の単離及び幹細胞の再移植(re−engr
aftment)に先立つ薬物または照射による個々体
の治療によって治療し得る宿主、(3)種々の造血細胞
の生産、(4)幹細胞自己再生に関与する成育因子の検
出及び評価、(5)造血細胞系の発生、及び造形系の発
生に関与する因子についてアッセイ、及び(6)自系幹
細胞における遺伝子置換による遺伝病の治療に、用途を
見い出す。
【0017】
【具体的態様の説明】実質上特定の系統に捧げられた
(付された)(dedicated)細胞及び系への献
身(dedication)に関与するマーカーを有す
る細胞を含有しないヒト幹細胞組成物が提供され、そこ
で、幹細胞は再生し分化して種々の造血系を生成させる
ことができる。
(付された)(dedicated)細胞及び系への献
身(dedication)に関与するマーカーを有す
る細胞を含有しないヒト幹細胞組成物が提供され、そこ
で、幹細胞は再生し分化して種々の造血系を生成させる
ことができる。
【0018】実質上均質な組成物は分化細胞と関連する
マーカーを欠き、他方幹細胞に関連するエピトープの特
性を示す細胞の選択的単離によって、及び定められた培
養系で、異なる造血細胞系をもたらす、単離した幹細胞
を再生することによって得ることができる。
マーカーを欠き、他方幹細胞に関連するエピトープの特
性を示す細胞の選択的単離によって、及び定められた培
養系で、異なる造血細胞系をもたらす、単離した幹細胞
を再生することによって得ることができる。
【0019】幹細胞は抗体によって同定される特異的な
エピトープ部位と関連するマーカーの存在、及びある種
の抗体の結合の欠如によって同定されるある種のマーカ
ーの不存在によって特徴づけられる。
エピトープ部位と関連するマーカーの存在、及びある種
の抗体の結合の欠如によって同定されるある種のマーカ
ーの不存在によって特徴づけられる。
【0020】選択を幹細胞に特異的なマーカーを用いて
行うことは必要ない。負の選択(細胞の除去)と正の選
択(細胞の単離)の組合せを用いることによって実質上
均質な幹細胞組成物を得ることができる。
行うことは必要ない。負の選択(細胞の除去)と正の選
択(細胞の単離)の組合せを用いることによって実質上
均質な幹細胞組成物を得ることができる。
【0021】望まれる場合には、最初に「比較的粗い」
分離によって大部分の分化細胞を除去することも可能で
ある。細胞の由来は骨髄;胎児、新生児もしくは大人や
他の造血細胞源、例えば胎児肝臓、末梢血液、臍帯血等
であることができる。
分離によって大部分の分化細胞を除去することも可能で
ある。細胞の由来は骨髄;胎児、新生児もしくは大人や
他の造血細胞源、例えば胎児肝臓、末梢血液、臍帯血等
であることができる。
【0022】例えば、まず最初に、多数の系統に付され
た(committed)細胞、すなわちT細胞、B細
胞、(プレB及びB細胞)、骨髄単球細胞等の系をはじ
めとする造血系の大部分の細胞集団、または巨核球、肥
満細胞、好酸球及び好塩基球等の少数の細胞集団を除去
するために磁気ビーズ分離を用いることができる。
た(committed)細胞、すなわちT細胞、B細
胞、(プレB及びB細胞)、骨髄単球細胞等の系をはじ
めとする造血系の大部分の細胞集団、または巨核球、肥
満細胞、好酸球及び好塩基球等の少数の細胞集団を除去
するために磁気ビーズ分離を用いることができる。
【0023】望ましくは、全造血細胞の少なくとも約7
0%、通常少なくとも80%が除去される。初期の段階
ではあらゆる献身した(dedicated)細胞クラ
ス、特にマイナー集団メンバーを除去する必要はない。
通常、区分け(sorting)に先立って血小板及び
赤血球を除去する。
0%、通常少なくとも80%が除去される。初期の段階
ではあらゆる献身した(dedicated)細胞クラ
ス、特にマイナー集団メンバーを除去する必要はない。
通常、区分け(sorting)に先立って血小板及び
赤血球を除去する。
【0024】プロトコル中に正の選択があるので正に選
択されるマーカーを欠く系統に付された細胞は取り残さ
れる。しかしながら、すべての系統に付された細胞系に
対する負の選択があるのが好ましく、その結果最終の正
の選択において存在する系統に付された細胞の数を最小
にすることができる。
択されるマーカーを欠く系統に付された細胞は取り残さ
れる。しかしながら、すべての系統に付された細胞系に
対する負の選択があるのが好ましく、その結果最終の正
の選択において存在する系統に付された細胞の数を最小
にすることができる。
【0025】幹細胞はその多くの場合、CD34+,C
D3−,CD7−,CD8−,CD10−,CD1
4−,CD15−,CD19−,CD20−,CD33
−及びThy−1+であることによって特徴づけられ
る。幹細胞が高度に濃縮された細胞組成物はCD3
4+,CD10−,CD19−,及びCD33−であ
り、より特定的にはさらに CD3−及び CD8−で
あり、好ましくはさらにThy−1+である。
D3−,CD7−,CD8−,CD10−,CD1
4−,CD15−,CD19−,CD20−,CD33
−及びThy−1+であることによって特徴づけられ
る。幹細胞が高度に濃縮された細胞組成物はCD3
4+,CD10−,CD19−,及びCD33−であ
り、より特定的にはさらに CD3−及び CD8−で
あり、好ましくはさらにThy−1+である。
【0026】CD3−,8−,10−,19−,20−
及び33−は Lin−という。CD10/19/20
マーカーはB細胞と関連を有し、CD3/4/8マーカ
ーはT細胞と関連を有し、CD4/15/33細胞マー
カーは骨髄系細胞と関連を有する。Thy−1マーカー
はヒトT細胞には欠如している。
及び33−は Lin−という。CD10/19/20
マーカーはB細胞と関連を有し、CD3/4/8マーカ
ーはT細胞と関連を有し、CD4/15/33細胞マー
カーは骨髄系細胞と関連を有する。Thy−1マーカー
はヒトT細胞には欠如している。
【0027】また、ヒトCD34+についてはローダミ
ン(rhodamine)123が細胞を高いサブセッ
トと低いサブセットに分けることができる。マウス幹細
胞に関してのローダミン123の使用の記述について
Spangrude,(1990)Proc.Nat
l.Acad.Sci.87,7433を参照された
い。好ましくは細胞はローダミン低(low)である。
ン(rhodamine)123が細胞を高いサブセッ
トと低いサブセットに分けることができる。マウス幹細
胞に関してのローダミン123の使用の記述について
Spangrude,(1990)Proc.Nat
l.Acad.Sci.87,7433を参照された
い。好ましくは細胞はローダミン低(low)である。
【0028】主題の幹細胞を得るには、骨髄または他の
造血源中の他の細胞から希な多能性のヒト幹細胞を単離
することが必要である。まず、骨髄細胞は骨髄源、例え
ば腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊椎または他の骨腔(bon
e cavity)から得ることができる。ヒト造血幹
細胞の他の入手源は胚卵黄包、胎児肝臓、胎児及び成人
の脾臓、成人末梢血液及び臍帯血をはじめとする血液を
包含する。
造血源中の他の細胞から希な多能性のヒト幹細胞を単離
することが必要である。まず、骨髄細胞は骨髄源、例え
ば腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊椎または他の骨腔(bon
e cavity)から得ることができる。ヒト造血幹
細胞の他の入手源は胚卵黄包、胎児肝臓、胎児及び成人
の脾臓、成人末梢血液及び臍帯血をはじめとする血液を
包含する。
【0029】胎児骨または他の骨源からの骨髄の単離に
際しては、骨から洗い出す(flush)のに適当な溶
液を用いることができ、かかる溶液は平衡塩溶液であ
り、一般に約5−25mMの低濃度の許容し得る緩衝液
と一緒にしたウシ胎児血清もしくは他の天然性因子を補
った平衡塩溶液であるのが好都合である。好都合な緩衝
液はヘペス(Hepes)、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液
等である。他の方法として常法に従って骨から骨髄を吸
引することができる。
際しては、骨から洗い出す(flush)のに適当な溶
液を用いることができ、かかる溶液は平衡塩溶液であ
り、一般に約5−25mMの低濃度の許容し得る緩衝液
と一緒にしたウシ胎児血清もしくは他の天然性因子を補
った平衡塩溶液であるのが好都合である。好都合な緩衝
液はヘペス(Hepes)、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液
等である。他の方法として常法に従って骨から骨髄を吸
引することができる。
【0030】34+ Thy+ Lin−細胞の形態学
的評価は多能性の先祖である「幹細胞」が中位のサイズ
であることを示している。光散乱評価は「幹細胞」が低
い側面散乱(side scatter)を有する芽細
胞のプロフィールを有することを示している。
的評価は多能性の先祖である「幹細胞」が中位のサイズ
であることを示している。光散乱評価は「幹細胞」が低
い側面散乱(side scatter)を有する芽細
胞のプロフィールを有することを示している。
【0031】これらの観察は「幹細胞」が独特の密度プ
ロフィールを有することを示している。密度分別された
ヒト骨髄からの低密度画分はCD34+ Thy+ L
in−細胞について富化されていることが見い出され
た。
ロフィールを有することを示している。密度分別された
ヒト骨髄からの低密度画分はCD34+ Thy+ L
in−細胞について富化されていることが見い出され
た。
【0032】最初に、系統に付された細胞を除去するこ
とによって細胞を分離するために種々の技術を用いるこ
とができる。特定の細胞系及び/または分化の段階と関
連するマーカー(表面膜タンパク質)を同定するのにモ
ノクローナル抗体が特に有用である。
とによって細胞を分離するために種々の技術を用いるこ
とができる。特定の細胞系及び/または分化の段階と関
連するマーカー(表面膜タンパク質)を同定するのにモ
ノクローナル抗体が特に有用である。
【0033】粗分離に備えて固体支持体に抗体を付着さ
せる。用いられる分離技術は回収する画分の生存能力の
保持を最大にするものであるべきである。「比較的粗
い」分離、すなわち、存在する、マーカーを有する総細
胞の10%まで、通常約5%以下、好ましくは約1%以
下が保持されるべき細胞集団と共に残存するような分離
のため、種々の異なる効能の技術を用いることができ
る。
せる。用いられる分離技術は回収する画分の生存能力の
保持を最大にするものであるべきである。「比較的粗
い」分離、すなわち、存在する、マーカーを有する総細
胞の10%まで、通常約5%以下、好ましくは約1%以
下が保持されるべき細胞集団と共に残存するような分離
のため、種々の異なる効能の技術を用いることができ
る。
【0034】用いられる特定の技術は分離効率、方法の
細胞毒性、作業の容易さ及び速度、及び高性能の器具及
び/または技術的熟練の必要性による。
細胞毒性、作業の容易さ及び速度、及び高性能の器具及
び/または技術的熟練の必要性による。
【0035】分離方法は抗体で被覆した磁性ビーズを用
いる磁気分離、アフィニィティークロマトグラフィー、
モノクローナル抗体に結合させるかモノクローナル抗体
と組み合わせて用いる細胞毒、例えば補体と細胞毒、固
体マトリックス、例えばプレートに付着させた抗体によ
る「えり分け」(panning)、または他の簡便な
技術を包含する。
いる磁気分離、アフィニィティークロマトグラフィー、
モノクローナル抗体に結合させるかモノクローナル抗体
と組み合わせて用いる細胞毒、例えば補体と細胞毒、固
体マトリックス、例えばプレートに付着させた抗体によ
る「えり分け」(panning)、または他の簡便な
技術を包含する。
【0036】正確な分離を与える技術は性能の程度、例
えば複数の色彩チャネル低アングル及び鈍い光散乱を検
出するチャネル、インピーダンスチャネル等を変化させ
ることができる蛍光活性化細胞区分け機(fluore
scence activated cell sor
ters)を包含する。
えば複数の色彩チャネル低アングル及び鈍い光散乱を検
出するチャネル、インピーダンスチャネル等を変化させ
ることができる蛍光活性化細胞区分け機(fluore
scence activated cell sor
ters)を包含する。
【0037】用い得る1つの手順は骨髄からの細胞を短
時間、低下した温度、一般に約4℃で特定の細胞型に対
して特異的な抗体、例えばT細胞決定子(determ
inant)についてはCD3及び8の飽和レベルで培
養した後の最初の段階にあり、ついで細胞を胎児子ウシ
血清(FCS)緩衝剤(cushion)で洗浄する。
時間、低下した温度、一般に約4℃で特定の細胞型に対
して特異的な抗体、例えばT細胞決定子(determ
inant)についてはCD3及び8の飽和レベルで培
養した後の最初の段階にあり、ついで細胞を胎児子ウシ
血清(FCS)緩衝剤(cushion)で洗浄する。
【0038】ついで細胞を上記した如き緩衝剤培地に懸
濁し、抗体または抗体−抗原複合体に特異的な種々のタ
ンパク質を用いる特定の決定子についての抗体によって
細胞を分離する。
濁し、抗体または抗体−抗原複合体に特異的な種々のタ
ンパク質を用いる特定の決定子についての抗体によって
細胞を分離する。
【0039】簡便には、抗体は直接的分離を可能にする
磁気ビーズ、支持体に係合させたアビジンもしくはスト
レプトアビジンで除去し得るビオチン、蛍光活性化細胞
区分け機について用いることができる蛍光色素等のマー
カーと結合させることができ、これによって特定の細胞
型の分離が容易になる。残存する細胞の生存にとって不
当に有害でないいずれの技術も用い得る。
磁気ビーズ、支持体に係合させたアビジンもしくはスト
レプトアビジンで除去し得るビオチン、蛍光活性化細胞
区分け機について用いることができる蛍光色素等のマー
カーと結合させることができ、これによって特定の細胞
型の分離が容易になる。残存する細胞の生存にとって不
当に有害でないいずれの技術も用い得る。
【0040】便利には、成熟細胞マーカーを欠く細胞の
一般に少なくとも50%、好ましくは少なくとも約70
%の実質的富化の後、蛍光活性化細胞区分け機(FAC
S)または他の高特異性を有する方法によって細胞を分
離し得る。特に好都合なFACSについては多色分析
(muli−color analyses)を用いる
ことができる。
一般に少なくとも50%、好ましくは少なくとも約70
%の実質的富化の後、蛍光活性化細胞区分け機(FAC
S)または他の高特異性を有する方法によって細胞を分
離し得る。特に好都合なFACSについては多色分析
(muli−color analyses)を用いる
ことができる。
【0041】特定の抗原に対する染色のレベルをもとに
して細胞を分離できる。第1の分離では少なくとも約1
×1010、好ましくは少なくとも約3×1010の細
胞から始め、CD34に対する抗体を1つの蛍光色素で
標識し、他方種々の系統に付された細胞に対する抗体は
別個の蛍光色素に結合させる。
して細胞を分離できる。第1の分離では少なくとも約1
×1010、好ましくは少なくとも約3×1010の細
胞から始め、CD34に対する抗体を1つの蛍光色素で
標識し、他方種々の系統に付された細胞に対する抗体は
別個の蛍光色素に結合させる。
【0042】多色分析に用い得る蛍光色素はフィコエリ
スリン(藻紅素)、アロフィコシアニン(alloph
ycocyanines)等のフィコビリタンパク質
(phycobiliproteins)、フルオレセ
イン、テキサスレッド(Texas red)等を包含
する。
スリン(藻紅素)、アロフィコシアニン(alloph
ycocyanines)等のフィコビリタンパク質
(phycobiliproteins)、フルオレセ
イン、テキサスレッド(Texas red)等を包含
する。
【0043】各系は別個の工程で分離できるが、望まし
くはCD34または同等のマーカーについて系をポジテ
ィブに選択するときに同時に分離する。一般に得られる
細胞数はもとの細胞の約1%より少であり、一般的には
約0.5%より少であり、0.2%以下という低さにす
ることもできる。
くはCD34または同等のマーカーについて系をポジテ
ィブに選択するときに同時に分離する。一般に得られる
細胞数はもとの細胞の約1%より少であり、一般的には
約0.5%より少であり、0.2%以下という低さにす
ることもできる。
【0044】ついで細胞をさらに Thy+についてポ
ジティブに選択することによって分離するが、ここでは
細胞は一般にもとの細胞の0.5%より少なくなり、一
般的には0.01−0.5%の範囲となる。死んだ細胞
と結合する色素〔ヨウ化プロピジウム(propidi
um)、LDS〕を用いることによって細胞を死んだ細
胞に対して分離できる。
ジティブに選択することによって分離するが、ここでは
細胞は一般にもとの細胞の0.5%より少なくなり、一
般的には0.01−0.5%の範囲となる。死んだ細胞
と結合する色素〔ヨウ化プロピジウム(propidi
um)、LDS〕を用いることによって細胞を死んだ細
胞に対して分離できる。
【0045】望ましくは、細胞は2%胎児子ウシ血清を
含有する培地中に回収する。アフィニティーカラム等の
正確な分離を可能にする、ポジティブ選択のための他の
技術を用いることができる。この方法は非−幹細胞集団
の約20%より少ない、好ましくは約5%より少ない残
量への除去を可能にする。
含有する培地中に回収する。アフィニティーカラム等の
正確な分離を可能にする、ポジティブ選択のための他の
技術を用いることができる。この方法は非−幹細胞集団
の約20%より少ない、好ましくは約5%より少ない残
量への除去を可能にする。
【0046】CD34+ Lin−及びCD34+ L
in− Thy−1+はFACS分析によって低い側面
散乱及び低い前方散乱(forward scatte
r)プロフィールを有する。細胞スピン(cytosp
in)プレパラート(preparations)は成
熟リンパ球系細胞及び成熟顆粒球との間のサイズを有す
る幹細胞を示す。細胞は光散乱性のみならず種々の細胞
表面抗原の発現(expression)に基いて選択
し得る。
in− Thy−1+はFACS分析によって低い側面
散乱及び低い前方散乱(forward scatte
r)プロフィールを有する。細胞スピン(cytosp
in)プレパラート(preparations)は成
熟リンパ球系細胞及び成熟顆粒球との間のサイズを有す
る幹細胞を示す。細胞は光散乱性のみならず種々の細胞
表面抗原の発現(expression)に基いて選択
し得る。
【0047】本発明にとって分離の特定の順序は重要で
ないと考えられるが、示される順序が好ましい。好まし
くは、幹細胞に関連を有するマーカーのポジティブ分離
及び系統に付された細胞に関与するマーカーについての
ネガティブ選択を用いて、まず粗い分離によりついで精
密な分離により細胞を分離する。この分離の後、多系潜
在能力及び高められた自己再生能力を有する細胞組成物
についての選択を行う。
ないと考えられるが、示される順序が好ましい。好まし
くは、幹細胞に関連を有するマーカーのポジティブ分離
及び系統に付された細胞に関与するマーカーについての
ネガティブ選択を用いて、まず粗い分離によりついで精
密な分離により細胞を分離する。この分離の後、多系潜
在能力及び高められた自己再生能力を有する細胞組成物
についての選択を行う。
【0048】90%より多くの、通常は約95%より多
くのヒト幹細胞を含有する組成物はこの方法によって得
ることができ、そこでは目的とする幹細胞をCD3
4+,Lin−及び Thy+であること並びに細胞再
生及び種々の造血系のすべてのメンバーの発生を与える
ことができることによって同定する。
くのヒト幹細胞を含有する組成物はこの方法によって得
ることができ、そこでは目的とする幹細胞をCD3
4+,Lin−及び Thy+であること並びに細胞再
生及び種々の造血系のすべてのメンバーの発生を与える
ことができることによって同定する。
【0049】究極的に、単一の細胞を幹細胞組成物から
得ることができ、細胞が生体内の適当な環境に位置する
(be located)ことを保証することができる
なら、免疫欠損のヒトの長期再生に用いることができ
る。
得ることができ、細胞が生体内の適当な環境に位置する
(be located)ことを保証することができる
なら、免疫欠損のヒトの長期再生に用いることができ
る。
【0050】主題の組成物は適当な培養〔骨髄系細胞の
生産のためにはヒドロコルチゾンを供給する培養(デク
スター(Dexter)型培養と結びつける)、ヒドロ
コルチゾンを欠く培養においてBリンパ球(Whitl
ock−Witte型培養と結びつける)〕によって、
骨髄系及びリンパ球系細胞を生産することが見い出され
ている。各培養において、種々の株AC3またはAC6
から生ずるマウスまたはヒトのストローマ細胞(str
omal cells)が提供され、このストローマ細
胞は、ヒト幹細胞等を維持する能力について選択するこ
とによってマウスもしくはヒトの胎児骨髄から導かれる
ものである。細胞を培養するのに用いる培地はIMDM
(Iscoveの改良Dulbecco培地)、IMD
MとRPMIの50:50混合物等の一定の栄養の豊富
な(enriched)培地であることが適当であり、
一般に塩類、アミノ酸類、ビタミン類、5×10−5M
2−ME、ストレプトマイシン/ペニシリン及び10%
胎児子ウシ血清より構成され、また時々、一般に1週間
に少なくとも約1〜2回取り替える。
生産のためにはヒドロコルチゾンを供給する培養(デク
スター(Dexter)型培養と結びつける)、ヒドロ
コルチゾンを欠く培養においてBリンパ球(Whitl
ock−Witte型培養と結びつける)〕によって、
骨髄系及びリンパ球系細胞を生産することが見い出され
ている。各培養において、種々の株AC3またはAC6
から生ずるマウスまたはヒトのストローマ細胞(str
omal cells)が提供され、このストローマ細
胞は、ヒト幹細胞等を維持する能力について選択するこ
とによってマウスもしくはヒトの胎児骨髄から導かれる
ものである。細胞を培養するのに用いる培地はIMDM
(Iscoveの改良Dulbecco培地)、IMD
MとRPMIの50:50混合物等の一定の栄養の豊富
な(enriched)培地であることが適当であり、
一般に塩類、アミノ酸類、ビタミン類、5×10−5M
2−ME、ストレプトマイシン/ペニシリン及び10%
胎児子ウシ血清より構成され、また時々、一般に1週間
に少なくとも約1〜2回取り替える。
【0051】特に、ヒドロコルチゾンを用いたある培養
から細胞をヒドロコルチゾンを含まない他の培養に移行
させ、ついで異なる培養細胞中の異なる系のメンバーの
生産を実証することによって、幹細胞の存在及びその維
持が支持される。このようにして、骨髄系細胞とB細胞
の両方の生産を同定し得る。
から細胞をヒドロコルチゾンを含まない他の培養に移行
させ、ついで異なる培養細胞中の異なる系のメンバーの
生産を実証することによって、幹細胞の存在及びその維
持が支持される。このようにして、骨髄系細胞とB細胞
の両方の生産を同定し得る。
【0052】T細胞への分化を実証するため胎児胸腺を
単離し、これを約25℃で4〜7日培養して、胎児胸腺
のリンパ球系集団を実質上涸渇させる。ついでテストす
る細胞を胸腺組織にマイクロ注入すると、注入された集
団のHLAが胸腺のHLAと不適当に組み合わされる
(不整合化される)。ついで胸腺組織をEPA 032
2 240に記載されたscid/scidマウスに移
植、特に腎包(kidney capsul)中に移植
する。
単離し、これを約25℃で4〜7日培養して、胎児胸腺
のリンパ球系集団を実質上涸渇させる。ついでテストす
る細胞を胸腺組織にマイクロ注入すると、注入された集
団のHLAが胸腺のHLAと不適当に組み合わされる
(不整合化される)。ついで胸腺組織をEPA 032
2 240に記載されたscid/scidマウスに移
植、特に腎包(kidney capsul)中に移植
する。
【0053】赤血球細胞については、BFU−E単位を
同定する技術、例えば細胞が赤血球系直系を発生させ得
ることを実証するメチルセルロース培養〔Metcal
f(1977)、Recent Results in
Cancer Research 61.Sprin
ger−Verlag、ベルリン、1−227頁〕を用
いるのが適当である。
同定する技術、例えば細胞が赤血球系直系を発生させ得
ることを実証するメチルセルロース培養〔Metcal
f(1977)、Recent Results in
Cancer Research 61.Sprin
ger−Verlag、ベルリン、1−227頁〕を用
いるのが適当である。
【0054】骨髄系及びB細胞能力を同定するにあた
り、テストする集団をまずヒドロコルチゾン含有培養に
導入し、かかる培養において6週間増殖させるのが適当
である。用いる培地は10%FCS、10%ウマ血清、
ストレプトマイシン/ペニシリン、グルタミン及び5×
10−7Mヒドロコルチゾンを含有する RPMI 1
640とIMDMの50:50混合物よりなる。
り、テストする集団をまずヒドロコルチゾン含有培養に
導入し、かかる培養において6週間増殖させるのが適当
である。用いる培地は10%FCS、10%ウマ血清、
ストレプトマイシン/ペニシリン、グルタミン及び5×
10−7Mヒドロコルチゾンを含有する RPMI 1
640とIMDMの50:50混合物よりなる。
【0055】6週間の間に、先祖細胞の不存在下ではす
べての成熟細胞は死滅するであろうことが予想される。
6週間の終りに、骨髄細胞が依然として観察されるな
ら、骨髄細胞への絶えざる分化を提供する先祖細胞が存
在していると結論できる。
べての成熟細胞は死滅するであろうことが予想される。
6週間の終りに、骨髄細胞が依然として観察されるな
ら、骨髄細胞への絶えざる分化を提供する先祖細胞が存
在していると結論できる。
【0056】ついでこの時点で培地を変えてヒドロコル
チゾンを欠く培地としB細胞の増殖を奨励する。3−4
週間待ってFACS分析によってB細胞の存在を実証す
ることにより、以前に骨髄系細胞を生産することができ
た先祖細胞がB細胞を生産することもできると結論でき
る。
チゾンを欠く培地としB細胞の増殖を奨励する。3−4
週間待ってFACS分析によってB細胞の存在を実証す
ることにより、以前に骨髄系細胞を生産することができ
た先祖細胞がB細胞を生産することもできると結論でき
る。
【0057】ヒドロコルチゾンの存在下に増殖させたヒ
ト造血系細胞は少なくとも4ケ月維持できる。同様にヒ
ドロコルチゾンの不存在下に増殖させたヒト造血系細胞
は少なくとも4ケ月骨髄系細胞のみならずBリンパ球
(CD19+)を含有する。
ト造血系細胞は少なくとも4ケ月維持できる。同様にヒ
ドロコルチゾンの不存在下に増殖させたヒト造血系細胞
は少なくとも4ケ月骨髄系細胞のみならずBリンパ球
(CD19+)を含有する。
【0058】先祖造血幹細胞が実質上濃縮された組成物
を提供するこれらの培養から、CD34+ Lin−,
CD34+ Thy+,Thy+ Lin−またはCD
34+ Thy+ Lin− について区分することが
できる。
を提供するこれらの培養から、CD34+ Lin−,
CD34+ Thy+,Thy+ Lin−またはCD
34+ Thy+ Lin− について区分することが
できる。
【0059】これらの培養から得られるCD34+ L
in−,CD34+,Thy+ Thy+ Lin−ま
たはCD34+ Thy+ Lin−細胞は上述のアッ
セイにおいてB細胞、T細胞及び骨髄単球細胞を生じさ
せる。
in−,CD34+,Thy+ Thy+ Lin−ま
たはCD34+ Thy+ Lin−細胞は上述のアッ
セイにおいてB細胞、T細胞及び骨髄単球細胞を生じさ
せる。
【0060】多能性のヒト幹細胞は以下の如く定義でき
る:(1)すべての定められた血液リンパ球系の系にお
いて子孫を生じる、及び(2)限られた数の細胞が、重
い免疫無防備状態のヒト宿主を、細胞再生による多能性
造血幹細胞を含めてのすべての血液細胞型及びそれらの
先祖において、十分に再構成することができる。
る:(1)すべての定められた血液リンパ球系の系にお
いて子孫を生じる、及び(2)限られた数の細胞が、重
い免疫無防備状態のヒト宿主を、細胞再生による多能性
造血幹細胞を含めてのすべての血液細胞型及びそれらの
先祖において、十分に再構成することができる。
【0061】主題の組成物においては、全骨髄移植物中
に含まれる幹細胞の数(〜107)に比較して、約 1
07の総計より少ない細胞、通常 106より少ない細
胞を用いて免疫無防備状態のヒト宿主を再構成すること
ができる。幹細胞が自己再生できる適切な場所で適切な
シーディング(seeding)が起こるのを保証する
のにある数の細胞が必要とされる。
に含まれる幹細胞の数(〜107)に比較して、約 1
07の総計より少ない細胞、通常 106より少ない細
胞を用いて免疫無防備状態のヒト宿主を再構成すること
ができる。幹細胞が自己再生できる適切な場所で適切な
シーディング(seeding)が起こるのを保証する
のにある数の細胞が必要とされる。
【0062】自己再生のための適当な場所でシーディン
グされるのに必要とされる細胞の数は50個より小であ
り、合計約20細胞以下という低い数でも上述の条件を
全うすることができる。
グされるのに必要とされる細胞の数は50個より小であ
り、合計約20細胞以下という低い数でも上述の条件を
全うすることができる。
【0063】かくして、もっともはじめの先祖である多
能性幹細胞についての標準セットに基いて主題組成物は
これらの要求を満足することができる。さらに骨髄細胞
の分析に基づいて、主題細胞は骨髄細胞の約0.01〜
0.1%、特に0.01〜0.05%の範囲内にあると
考えられる。
能性幹細胞についての標準セットに基いて主題組成物は
これらの要求を満足することができる。さらに骨髄細胞
の分析に基づいて、主題細胞は骨髄細胞の約0.01〜
0.1%、特に0.01〜0.05%の範囲内にあると
考えられる。
【0064】幹細胞が単離されたら、それらは次のよう
にして増殖させることができる。すなわち、骨髄細胞、
胎児胸腺または胎児肝臓から得られそしてこれらのスト
ローマ細胞との共存培養により幹細胞維持と関連する成
長因子の分泌を提供するストローマ細胞等のごときスト
ローマ細胞からのコンディショニング培地中で成長させ
ることによって増殖させることができる。
にして増殖させることができる。すなわち、骨髄細胞、
胎児胸腺または胎児肝臓から得られそしてこれらのスト
ローマ細胞との共存培養により幹細胞維持と関連する成
長因子の分泌を提供するストローマ細胞等のごときスト
ローマ細胞からのコンディショニング培地中で成長させ
ることによって増殖させることができる。
【0065】あるいは、ストローマ細胞が同種異系(a
llogeneic)であるかまたは移植物に対し異種
(xenogeneic)である場合、幹細胞の増殖を
支持する維持因子を含有する培地中で増殖させてもよ
い。
llogeneic)であるかまたは移植物に対し異種
(xenogeneic)である場合、幹細胞の増殖を
支持する維持因子を含有する培地中で増殖させてもよ
い。
【0066】共存培養で用いる前に、混合ストローマ細
胞調製物から、望ましくない細胞を除去するため適当な
モノクローナル抗体を用いて、例えば抗体−毒素複合
体、抗体及び補体等を用いて、造血細胞を除去すること
ができる。別法としてストローマ細胞系が同種異系であ
るか移植物に対し異種であってもよいクローン化したス
トローマ細胞系を用いることができる。
胞調製物から、望ましくない細胞を除去するため適当な
モノクローナル抗体を用いて、例えば抗体−毒素複合
体、抗体及び補体等を用いて、造血細胞を除去すること
ができる。別法としてストローマ細胞系が同種異系であ
るか移植物に対し異種であってもよいクローン化したス
トローマ細胞系を用いることができる。
【0067】本細胞組成物は種々の方法で使用すること
ができる。該細胞はナイーブ(naive)なので、照
射されたホスト及び/または、化学療法を受けたホスト
を十分に再構成する(reconstitute)のに
用いることができる。
ができる。該細胞はナイーブ(naive)なので、照
射されたホスト及び/または、化学療法を受けたホスト
を十分に再構成する(reconstitute)のに
用いることができる。
【0068】また該細胞は種々の因子、例えばエリトロ
ポイエチン、コロニー刺激因子(例えばGM−CSF,
G−CSF,M−CSF)、インターロイキン(例えば
IL−1,−2,−3,−4,−5,−6,−7,−8
等)、白血病抑制因子(LIF)、スティール因子(S
teel Factor)(Stl)等を用いることに
よって、本細胞を成熟させ、増殖させ、及び1以上の選
ばれた系へ分化させることを通して特定の系のための細
胞源として用いることができ、あるいは幹細胞と関連す
るストローマ細胞は適当な系統に入る。幹細胞はまた造
血細胞の分化及び成熟に関与する因子の単離及び評価に
用いることができる。
ポイエチン、コロニー刺激因子(例えばGM−CSF,
G−CSF,M−CSF)、インターロイキン(例えば
IL−1,−2,−3,−4,−5,−6,−7,−8
等)、白血病抑制因子(LIF)、スティール因子(S
teel Factor)(Stl)等を用いることに
よって、本細胞を成熟させ、増殖させ、及び1以上の選
ばれた系へ分化させることを通して特定の系のための細
胞源として用いることができ、あるいは幹細胞と関連す
るストローマ細胞は適当な系統に入る。幹細胞はまた造
血細胞の分化及び成熟に関与する因子の単離及び評価に
用いることができる。
【0069】かくして、幹細胞はコンディション化培地
等の培地の活性を測定するアッセイ、また細胞成長活性
のための流体、特定の直系の献身との関連等を評価する
アッセイに用いることができる。
等の培地の活性を測定するアッセイ、また細胞成長活性
のための流体、特定の直系の献身との関連等を評価する
アッセイに用いることができる。
【0070】幹細胞は遺伝病の治療に用いることができ
る。造血細胞に関連する遺伝病は自己のまたは同種異系
の支質細胞の遺伝子欠損(genetic defec
t)を訂正する(correct)ための遺伝子修飾に
よって治療できる。
る。造血細胞に関連する遺伝病は自己のまたは同種異系
の支質細胞の遺伝子欠損(genetic defec
t)を訂正する(correct)ための遺伝子修飾に
よって治療できる。
【0071】例えばB−サラセミア(地中海貧血)、鎌
状細胞貧血、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、リコンビ
ナーゼ(recombinase)欠乏症、リコンビナ
ーゼ調節遺伝子欠乏症等の病気を、野性型遺伝子の幹細
胞への相同もしくはランダム組換えによる導入によって
治療することができる。
状細胞貧血、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、リコンビ
ナーゼ(recombinase)欠乏症、リコンビナ
ーゼ調節遺伝子欠乏症等の病気を、野性型遺伝子の幹細
胞への相同もしくはランダム組換えによる導入によって
治療することができる。
【0072】同種異系の幹細胞については遺伝子欠損が
ない正常細胞を治療に用いることができる。遺伝子治療
の他の適応は薬物耐性遺伝子の導入によって正常幹細胞
に利点を有せしめ、選択的圧力、例えば多薬物耐性遺伝
子(MDK)を受けやすくすることである。
ない正常細胞を治療に用いることができる。遺伝子治療
の他の適応は薬物耐性遺伝子の導入によって正常幹細胞
に利点を有せしめ、選択的圧力、例えば多薬物耐性遺伝
子(MDK)を受けやすくすることである。
【0073】造血細胞と関連性を有する病気以外の病気
であっても、その病気がホルモン、酵素、インターフェ
ロン、因子等の特定の分泌産物の欠如に関するものであ
るなら治療できる。適切な調節開始領域を用いることに
よって、欠損タンパク質の誘導生産を、タンパク質の生
産が、かかるタンパク質を正常に生産する細胞型とは異
なる細胞型による生産であっても、天然の生産に匹敵す
るように、行うことができる。
であっても、その病気がホルモン、酵素、インターフェ
ロン、因子等の特定の分泌産物の欠如に関するものであ
るなら治療できる。適切な調節開始領域を用いることに
よって、欠損タンパク質の誘導生産を、タンパク質の生
産が、かかるタンパク質を正常に生産する細胞型とは異
なる細胞型による生産であっても、天然の生産に匹敵す
るように、行うことができる。
【0074】リボザイム、アンチセンスまたは他のメッ
セージを挿入して特定の遺伝子産物または病気、特に血
液リンパ性疾患へのかかりやすさを抑制することも可能
である。
セージを挿入して特定の遺伝子産物または病気、特に血
液リンパ性疾患へのかかりやすさを抑制することも可能
である。
【0075】別法として、T細胞レパートリーからT細
胞受容体の特定可変領域を除去することも望み得る。相
同組換え、または発現を防止するアンチセンスもしくは
リボザイム配列を用いて特定のT細胞受容体の発現を抑
制し得る。
胞受容体の特定可変領域を除去することも望み得る。相
同組換え、または発現を防止するアンチセンスもしくは
リボザイム配列を用いて特定のT細胞受容体の発現を抑
制し得る。
【0076】HIV,HTLV−I及びII等の血液性
病原体に対しては幹細胞を遺伝子的に修飾して幹細胞ま
たは幹細胞から分化させた細胞中の病原体の増殖を防止
するアンチセンス配列もしくはリボザイムを導入するこ
とができる。
病原体に対しては幹細胞を遺伝子的に修飾して幹細胞ま
たは幹細胞から分化させた細胞中の病原体の増殖を防止
するアンチセンス配列もしくはリボザイムを導入するこ
とができる。
【0077】哺乳動物細胞での組換えの方法は Mol
ecular Cloning,ALaborator
y Manual(1989) Sambrook,F
ritsch及びManiatis,Cold Spr
ing Harbor,NYに記載されている。
ecular Cloning,ALaborator
y Manual(1989) Sambrook,F
ritsch及びManiatis,Cold Spr
ing Harbor,NYに記載されている。
【0078】該細胞は液体窒素温度で凍結し、長時間貯
蔵し、解凍し、再使用することができる。細胞は通常1
0%DMSO、70%自己血漿(2500radで照
射)、20%Tc199(組織培養培地)中で貯蔵す
る。
蔵し、解凍し、再使用することができる。細胞は通常1
0%DMSO、70%自己血漿(2500radで照
射)、20%Tc199(組織培養培地)中で貯蔵す
る。
【0079】細胞はプログラムに組み込み得る冷凍機中
液体窒素中− 180℃で凍結する。解凍後、幹細胞増
殖及び分化に関連する成育因子または支質細胞の使用に
よって細胞をふやす(expand)ことができる。以
下の実施例は例示のためであり、限定のためのものでは
ない。
液体窒素中− 180℃で凍結する。解凍後、幹細胞増
殖及び分化に関連する成育因子または支質細胞の使用に
よって細胞をふやす(expand)ことができる。以
下の実施例は例示のためであり、限定のためのものでは
ない。
【0080】実 験 材料及び方法 抗体。種々のマーカーに対する抗体が以下のようにして
得られた:CD3,8,10,14,15,19,2
0,33,34(Becton−Dickinso
n),CD33(Counter Immunolog
y),(Dalchau及びFabre,J.Exp.
Med.(1979)149:576)。CD34抗体
(IgG3)Tuek3はA.Ziegler(Leu
kocyteTyping IV;White cel
l differentiationantigens
1989,817)。
得られた:CD3,8,10,14,15,19,2
0,33,34(Becton−Dickinso
n),CD33(Counter Immunolog
y),(Dalchau及びFabre,J.Exp.
Med.(1979)149:576)。CD34抗体
(IgG3)Tuek3はA.Ziegler(Leu
kocyteTyping IV;White cel
l differentiationantigens
1989,817)。
【0081】CD3,−8,−10,−14,−15,
−19,−20,−33はFITC複合体として購入し
た。Zieglerからの抗体はフルオレセイン(F
L)、フィコエリトリン(PE)またはテキサスレッド
(TR)(Caltag)に複合化させた適切な抗−I
gG3を用いて検出した。 Thy−1抗体はフルオレ
セイン、フィコエリトリンまたはビオチン複合体であ
り、ビオチン複合体はTR,FLまたはPE−アビジン
(Caltag)を用いて検出した。
−19,−20,−33はFITC複合体として購入し
た。Zieglerからの抗体はフルオレセイン(F
L)、フィコエリトリン(PE)またはテキサスレッド
(TR)(Caltag)に複合化させた適切な抗−I
gG3を用いて検出した。 Thy−1抗体はフルオレ
セイン、フィコエリトリンまたはビオチン複合体であ
り、ビオチン複合体はTR,FLまたはPE−アビジン
(Caltag)を用いて検出した。
【0082】蛍光活性化細胞区分け機(sorter)
(FACS)分析及び区分け(sorting) Pa
rks及びHerzenberg,Meth.Enzy
mol.(1984) 108:197に記述されたよ
うに修飾した Becton−Dickinson F
ACSを用いた。2つの部分からなる(dual)レー
ザー器具は各分析細胞について記録する4つの蛍光パラ
メーター及び2つの光源散乱パラメーターを可能にす
る。
(FACS)分析及び区分け(sorting) Pa
rks及びHerzenberg,Meth.Enzy
mol.(1984) 108:197に記述されたよ
うに修飾した Becton−Dickinson F
ACSを用いた。2つの部分からなる(dual)レー
ザー器具は各分析細胞について記録する4つの蛍光パラ
メーター及び2つの光源散乱パラメーターを可能にす
る。
【0083】残りの赤血球及び死細胞及び破片は光散乱
ゲーティング(gating)及びPI(ヨウ化プロジ
ウム)染色まはた4−色分析中のみでの散乱による分析
から除外された。フルオレセインとフィコエリトリン、
及びフルオレセインとヨウ化プロピジウムの空間的重複
(spatial overlaps)に対する補正
(compensation)は記述された(Park
s及びHerzenborg(1984)、上述)よう
にして電子的に調整した。
ゲーティング(gating)及びPI(ヨウ化プロジ
ウム)染色まはた4−色分析中のみでの散乱による分析
から除外された。フルオレセインとフィコエリトリン、
及びフルオレセインとヨウ化プロピジウムの空間的重複
(spatial overlaps)に対する補正
(compensation)は記述された(Park
s及びHerzenborg(1984)、上述)よう
にして電子的に調整した。
【0084】4色染色は、結果が蛍光色素の種々の空間
的重複にかかわらず一貫している(consisten
t)ことを保証するために、異なる蛍光色素に結合させ
た同じ試薬のいくつかの組合せを用いて行った。加え
て、4色分析の結果は2及び3色分析からデータと比較
することによって較正した(be calibrate
d)。
的重複にかかわらず一貫している(consisten
t)ことを保証するために、異なる蛍光色素に結合させ
た同じ試薬のいくつかの組合せを用いて行った。加え
て、4色分析の結果は2及び3色分析からデータと比較
することによって較正した(be calibrate
d)。
【0085】細胞区分けのため、染色サンプルを区分け
操作中4℃に維持した。区分けされた滴を10%胎児子
ウシ血清(Hazelton Biologics I
nc.,Lencxa,KS)を含有するRPMI16
40中に集めた。2色ソート(sorts)は死細胞を
標識するヨウ化プロピジウム(PI)と共に、CD34
を標識するフィコエリトリン及びLIN細胞を標識する
フルオレセインを用いた。
操作中4℃に維持した。区分けされた滴を10%胎児子
ウシ血清(Hazelton Biologics I
nc.,Lencxa,KS)を含有するRPMI16
40中に集めた。2色ソート(sorts)は死細胞を
標識するヨウ化プロピジウム(PI)と共に、CD34
を標識するフィコエリトリン及びLIN細胞を標識する
フルオレセインを用いた。
【0086】両信号は単一のFACSチャネルで検出さ
れ除外された。3色ソートはCD34を標識するテキサ
スレッド、Lin細胞を標識するフィコエリトリン及び
Thy−1細胞を標識するフルオレセインを用いた。
FACSによる細胞集団の単離に続いて、サンプルをH
BSSで1:1希釈し、RCF200で10分遠心分離
し、血球計計測のため HBSS50または100μl
中に再懸濁した。
れ除外された。3色ソートはCD34を標識するテキサ
スレッド、Lin細胞を標識するフィコエリトリン及び
Thy−1細胞を標識するフルオレセインを用いた。
FACSによる細胞集団の単離に続いて、サンプルをH
BSSで1:1希釈し、RCF200で10分遠心分離
し、血球計計測のため HBSS50または100μl
中に再懸濁した。
【0087】培養アッセイは次のようにして行った。種
々のネズミのストローマ細胞系を用いたが、それらのう
ち3つはWhitlockら、cell(1978)4
8:1009−1021に記述されている。コンフルエ
ント状態のストローマ細胞層を、継代なしに組織培養培
地を5−7日毎に取り替えながら3−4週まで維持し
た。
々のネズミのストローマ細胞系を用いたが、それらのう
ち3つはWhitlockら、cell(1978)4
8:1009−1021に記述されている。コンフルエ
ント状態のストローマ細胞層を、継代なしに組織培養培
地を5−7日毎に取り替えながら3−4週まで維持し
た。
【0088】ストローマ細胞層を無血清培地で3回洗浄
し、ついで無血清培地中0.5mg/mlコラゲナーゼ
−ディスパーゼ(dispase)(Boehring
er−Mannheim,Indianapolis,
IN)の2.5ml(T−25フラスコ)を上からかけ
た(be overlaid)。培養細胞を37℃で1
5−30分培養し、ついで酵素含有培地中の細胞を集
め、血清を含有する RPMI−1640培地を加え
た。
し、ついで無血清培地中0.5mg/mlコラゲナーゼ
−ディスパーゼ(dispase)(Boehring
er−Mannheim,Indianapolis,
IN)の2.5ml(T−25フラスコ)を上からかけ
た(be overlaid)。培養細胞を37℃で1
5−30分培養し、ついで酵素含有培地中の細胞を集
め、血清を含有する RPMI−1640培地を加え
た。
【0089】支質細胞をパスツールピペットでピペッテ
ィングすることにより懸濁し、もとの細胞濃度の1/5
〜1/50で直接培養した。一般に、1:10で継代培
養した融合性皮質層は5−7日後に再び融合状態(co
nfluency)に達した。1穴あたり30〜0.3
細胞の限定希釈培養によってサブクローンを得た。ヒト
ストローマ細胞系を同様に処理した。
ィングすることにより懸濁し、もとの細胞濃度の1/5
〜1/50で直接培養した。一般に、1:10で継代培
養した融合性皮質層は5−7日後に再び融合状態(co
nfluency)に達した。1穴あたり30〜0.3
細胞の限定希釈培養によってサブクローンを得た。ヒト
ストローマ細胞系を同様に処理した。
【0090】ヒト胎児骨髄の細胞懸濁液は妊娠10−1
8週の胎児の長骨から調製した。骨を縦に裂き、骨髄腔
を表面削り刃で削る。ついで骨をRPMI−1640中
コラゲナーゼ/ディスパーゼの1mg/ml溶液中に入
れる。
8週の胎児の長骨から調製した。骨を縦に裂き、骨髄腔
を表面削り刃で削る。ついで骨をRPMI−1640中
コラゲナーゼ/ディスパーゼの1mg/ml溶液中に入
れる。
【0091】骨を37℃で30分インキュベートし、つ
いで骨髄腔を培地(ペニシリン/ストレプトマイシン、
2−ME及び5%FCSを含有するRPMI−164
0)をどっと流して洗い(be flushed)造血
系細胞を除去する。別法として、骨髄腔からコラゲナー
ゼ/ディスパーゼ処理なしに骨髄を洗い出す。
いで骨髄腔を培地(ペニシリン/ストレプトマイシン、
2−ME及び5%FCSを含有するRPMI−164
0)をどっと流して洗い(be flushed)造血
系細胞を除去する。別法として、骨髄腔からコラゲナー
ゼ/ディスパーゼ処理なしに骨髄を洗い出す。
【0092】16−20週妊娠胎児の肝臓から細胞懸濁
液を調製する。肝臓を切り刻み、ついでピペッティング
して細胞をとき放す。ついで細胞懸濁液をFicoll
勾配上に加えて肝細胞、赤血球及び細胞破片を除去す
る。ついで造血系細胞を回収する。
液を調製する。肝臓を切り刻み、ついでピペッティング
して細胞をとき放す。ついで細胞懸濁液をFicoll
勾配上に加えて肝細胞、赤血球及び細胞破片を除去す
る。ついで造血系細胞を回収する。
【0093】成人の骨髄を骨髄吸引液から得、ついで使
用前に処理して赤血球を除く。マウスもしくはヒトのス
トローマ細胞系の予め確立した融合性層の上に上記ヒト
細胞を乗せることによってかさばった(bulk)培養
細胞を得る。T−25フラスコもしくは6穴プレート中
の支質細胞上に3×104〜2×105cells/m
lを、6穴プレートの各穴に3mlまたはT−25フラ
スコに5mlを添加することによって加える。
用前に処理して赤血球を除く。マウスもしくはヒトのス
トローマ細胞系の予め確立した融合性層の上に上記ヒト
細胞を乗せることによってかさばった(bulk)培養
細胞を得る。T−25フラスコもしくは6穴プレート中
の支質細胞上に3×104〜2×105cells/m
lを、6穴プレートの各穴に3mlまたはT−25フラ
スコに5mlを添加することによって加える。
【0094】50μg/mlペニシリン/50μg/m
lストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、
2mMグルタミン、5×10−52−メルカプトエタノ
ール及び10%胎児子ウシ血清を含有する、 RPMI
−1640とIMDMの50:50混合物を用いる。
lストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、
2mMグルタミン、5×10−52−メルカプトエタノ
ール及び10%胎児子ウシ血清を含有する、 RPMI
−1640とIMDMの50:50混合物を用いる。
【0095】Dexter型条件(condition
s)に対しては50μg/mlペニシリン/50μg/
mlストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウ
ム、2mMグルタミン、10%胎児子ウシ血清、20%
ウマ血清及び10−6Mヒドロコルチゾンコハク酸ナト
リウムを含有するIMDMを用いる。
s)に対しては50μg/mlペニシリン/50μg/
mlストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウ
ム、2mMグルタミン、10%胎児子ウシ血清、20%
ウマ血清及び10−6Mヒドロコルチゾンコハク酸ナト
リウムを含有するIMDMを用いる。
【0096】Dexter型培地で増殖させた骨髄細胞
によってもっぱら骨髄系分化を起こさせる。全細胞集団
でまたは細胞表面抗原の発現によって分別した細胞で培
養細胞を確立した(CD34,HLA−DR, Thy
−1、系マーカー)。
によってもっぱら骨髄系分化を起こさせる。全細胞集団
でまたは細胞表面抗原の発現によって分別した細胞で培
養細胞を確立した(CD34,HLA−DR, Thy
−1、系マーカー)。
【0097】制限希釈培養細胞をコンフルエント層とし
てマウスストローマ細胞を含有する96穴プレートを用
いて調製した。ヒト細胞をタイトレートして段階的に低
濃度で少なくとも24穴のプレートに各細胞濃度で入れ
た。ついでプレートを検査して各細胞数で陽性の穴のパ
ーセンテージを測定する。ついでデータをグラフにプロ
ットする。
てマウスストローマ細胞を含有する96穴プレートを用
いて調製した。ヒト細胞をタイトレートして段階的に低
濃度で少なくとも24穴のプレートに各細胞濃度で入れ
た。ついでプレートを検査して各細胞数で陽性の穴のパ
ーセンテージを測定する。ついでデータをグラフにプロ
ットする。
【0098】AC3及びAC6共培養細胞 マウス骨髄皮質細胞系AC3またはAC6で確立させた
共存培養細胞はヒト培養細胞のためのフィーダー(fe
eder)層として成功裏に役立ち、低細胞密度で繊維
芽細胞の過剰増殖を抑制した。
共存培養細胞はヒト培養細胞のためのフィーダー(fe
eder)層として成功裏に役立ち、低細胞密度で繊維
芽細胞の過剰増殖を抑制した。
【0099】(1) 100より大の胎児骨髄、胎児肝
臓または成人骨髄サンプルからの細胞懸濁液を20週ま
での間培養したところ、この期間中造血細胞を連続的に
生産した。このことは初期ヒト先祖すなわち幹細胞がこ
れらの培養細胞で確立されたことを示している。
臓または成人骨髄サンプルからの細胞懸濁液を20週ま
での間培養したところ、この期間中造血細胞を連続的に
生産した。このことは初期ヒト先祖すなわち幹細胞がこ
れらの培養細胞で確立されたことを示している。
【0100】(2)培養細胞はマウスストローマ細胞に
付着した小型〜中型のヒト骨髄細胞を示し、増殖は培養
の最初の1〜3週に亘って(over)起こり、その後
はかなり安定に残る。
付着した小型〜中型のヒト骨髄細胞を示し、増殖は培養
の最初の1〜3週に亘って(over)起こり、その後
はかなり安定に残る。
【0101】(3)細胞はストローマ細胞に被さった非
付着性及び付着性の細胞よりなるゆるい集合体を形成
し、他方ストローマ細胞は上層の小形〜中形の細胞であ
る。全体として、培養細胞の外観はマウスの長期培養細
胞と同様である。
付着性及び付着性の細胞よりなるゆるい集合体を形成
し、他方ストローマ細胞は上層の小形〜中形の細胞であ
る。全体として、培養細胞の外観はマウスの長期培養細
胞と同様である。
【0102】(4)細胞スピン(cytospin)及
び蛍光活性化細胞区分け機(FACS)分析はヒト血液
リンパ球系細胞の維持を示している。ヒドロコルチゾン
の不存在(Whitlock−Witte様条件)下で
培養細胞は形態学によると骨髄系、単球系及びリンパ球
系の直系の混合物である。
び蛍光活性化細胞区分け機(FACS)分析はヒト血液
リンパ球系細胞の維持を示している。ヒドロコルチゾン
の不存在(Whitlock−Witte様条件)下で
培養細胞は形態学によると骨髄系、単球系及びリンパ球
系の直系の混合物である。
【0103】細胞の大部分は骨髄系であり、多形核細胞
を成熟させる骨髄芽球と異なる。細胞の15−40%は
単核であり、これらの細胞の多くはリンパ球系の形態を
有する。
を成熟させる骨髄芽球と異なる。細胞の15−40%は
単核であり、これらの細胞の多くはリンパ球系の形態を
有する。
【0104】(5)細胞の約20−40%はCD15抗
体で染色され、また細胞の10−50%はB直系マーカ
ーCD10,CD19またはCD20で染色され、かな
りの数のB細胞を示している。CD19発現に対する胎
児骨髄から選択された細胞は培養において3週間より短
かくしか生残しない。
体で染色され、また細胞の10−50%はB直系マーカ
ーCD10,CD19またはCD20で染色され、かな
りの数のB細胞を示している。CD19発現に対する胎
児骨髄から選択された細胞は培養において3週間より短
かくしか生残しない。
【0105】培養細胞中における4週より後でのCD1
0+及びCD19+細胞の存在は初期B細胞が献身した
先祖から生じていることを示している。さらに、細胞の
1〜10%は細胞質μ H鎖に対して染色し、このこと
はプレB細胞の存在を確認している。
0+及びCD19+細胞の存在は初期B細胞が献身した
先祖から生じていることを示している。さらに、細胞の
1〜10%は細胞質μ H鎖に対して染色し、このこと
はプレB細胞の存在を確認している。
【0106】1%より小しか sIgを発現しないのに
細胞のかなりの数がCD20を発現する。このことは初
期B細胞の少数しか示された培養条件下で成熟していな
いことを示している。さらに、細胞区分けによるB細胞
(CD10,CD19)の固渇後に開始した培養は培養
開始の1週間以内におけるB細胞の発生を示している。
細胞のかなりの数がCD20を発現する。このことは初
期B細胞の少数しか示された培養条件下で成熟していな
いことを示している。さらに、細胞区分けによるB細胞
(CD10,CD19)の固渇後に開始した培養は培養
開始の1週間以内におけるB細胞の発生を示している。
【0107】(6)ヒドロコルチゾンの存在下(Dex
ter様条件)に開始した培養細胞は検出し得るT及び
B細胞を含有しておらず、FACS分析及び細胞スピン
によって実証されるように大きなパーセンテージの顆粒
球及び骨髄系細胞を含有している。
ter様条件)に開始した培養細胞は検出し得るT及び
B細胞を含有しておらず、FACS分析及び細胞スピン
によって実証されるように大きなパーセンテージの顆粒
球及び骨髄系細胞を含有している。
【0108】有系分裂形態(mitotic figu
res)の存在及びこれらの培養細胞の長期維持はある
種の活性な先祖細胞の存在を示している。これらのヒド
ロコルチゾン含有培養細胞をヒドロコルチゾンを含有し
ない培地に移した場合、2週間以内に2〜6%のCD1
9細胞が見い出される。このデータはこの共培養系にお
ける活性な先祖細胞の存在をさらに実証する。
res)の存在及びこれらの培養細胞の長期維持はある
種の活性な先祖細胞の存在を示している。これらのヒド
ロコルチゾン含有培養細胞をヒドロコルチゾンを含有し
ない培地に移した場合、2週間以内に2〜6%のCD1
9細胞が見い出される。このデータはこの共培養系にお
ける活性な先祖細胞の存在をさらに実証する。
【0109】上記の共存培養系を用いて、種々の細胞副
次集団(subpopulations)中のコロニー
形成性細胞の頻度を測定するのに用い得る制限希釈アッ
セイが開発された。頻度は穴の37%がコロニーを示さ
ない細胞数によって求める。
次集団(subpopulations)中のコロニー
形成性細胞の頻度を測定するのに用い得る制限希釈アッ
セイが開発された。頻度は穴の37%がコロニーを示さ
ない細胞数によって求める。
【0110】1つの代表的実験は全骨髄細胞の1/20
00が応答した(responded)のに対し、細胞
の1/200及び1/30,000がそれぞれCD34
+及びCD34−で応答した。
00が応答した(responded)のに対し、細胞
の1/200及び1/30,000がそれぞれCD34
+及びCD34−で応答した。
【0111】さらに、単一細胞アッセイを開発したが、
そこにおいてはFACSで単一に区分けした先祖細胞を
マウスもしくはヒトの骨髄皮質細胞フィーダー(fee
der)層を含有する96穴プレートの各穴に入れる。
そこにおいてはFACSで単一に区分けした先祖細胞を
マウスもしくはヒトの骨髄皮質細胞フィーダー(fee
der)層を含有する96穴プレートの各穴に入れる。
【0112】表7に示した結果は40のCD34+ L
IN−細胞(Lin=CD3,10,19,20,1
5,33)のうち1または80のCD34+ LIN+
細胞のうち1がコロニー形成(骨髄の0.5−1%)に
よって応答した。コロニーの分析はコロニーの40%及
び25%がそれぞれCD34+ LIN−及びCD34
+ LIN+集団において、FACS及びメチルセルロ
ース分析(Bリンパ球系、骨髄系、赤血球系)によって
決定される多能性であることを示している。
IN−細胞(Lin=CD3,10,19,20,1
5,33)のうち1または80のCD34+ LIN+
細胞のうち1がコロニー形成(骨髄の0.5−1%)に
よって応答した。コロニーの分析はコロニーの40%及
び25%がそれぞれCD34+ LIN−及びCD34
+ LIN+集団において、FACS及びメチルセルロ
ース分析(Bリンパ球系、骨髄系、赤血球系)によって
決定される多能性であることを示している。
【0113】さらに、CD34+ Thy+細胞(骨髄
の0.1−0.5%)は20穴中1穴でコロニー成長を
示す。コロニーの大部分(>70%)は多能性である。
新たな支質層へ移した後の成長に関してはCD34+
Thy+細胞がもっとも効率のよい集団である。
の0.1−0.5%)は20穴中1穴でコロニー成長を
示す。コロニーの大部分(>70%)は多能性である。
新たな支質層へ移した後の成長に関してはCD34+
Thy+細胞がもっとも効率のよい集団である。
【0114】対照的にCD34+細胞の>90%を表す
CD34+ Thy−細胞は共存培養アッセイで貧弱に
しか応答せず、400細胞中1細胞しかコロニーを形成
せず、またどれも多能性でない。 Thy+集団も成熟
直系マーカーの発現に従ってサブ分割する(subdi
uide)ことができる。
CD34+ Thy−細胞は共存培養アッセイで貧弱に
しか応答せず、400細胞中1細胞しかコロニーを形成
せず、またどれも多能性でない。 Thy+集団も成熟
直系マーカーの発現に従ってサブ分割する(subdi
uide)ことができる。
【0115】Thy+ Lin−細胞サブセット(骨髄
の0.1−0.5%)は単一細胞アッセイでよく応答す
る(1/20)がThy+ Lin+サブセットの応答
は貧弱であった(0/800)。FACS及びメチルセ
ルロースアッセイはThy+Lin−細胞に由来するコ
ロニーの>70%が多能性であることを示している。
の0.1−0.5%)は単一細胞アッセイでよく応答す
る(1/20)がThy+ Lin+サブセットの応答
は貧弱であった(0/800)。FACS及びメチルセ
ルロースアッセイはThy+Lin−細胞に由来するコ
ロニーの>70%が多能性であることを示している。
【0116】上記データは「幹細胞」がCD34及び
Thy−1を発現するが直系マーカーの発現を欠く細胞
のサブセット(subset)中に存在することを示し
ている。この表現型を有する細胞は1000の全体の骨
髄細胞中1細胞より少ない。
Thy−1を発現するが直系マーカーの発現を欠く細胞
のサブセット(subset)中に存在することを示し
ている。この表現型を有する細胞は1000の全体の骨
髄細胞中1細胞より少ない。
【0117】上述の条件下で成長する出発集団中の細胞
の頻度を求めることができる。頻度は穴の37%が成長
を示さない細胞数によって求められる。ある研究による
と区分けされなかった細胞の1/1500が応答するが
CD34+画分の1/40及びCD34−画分の1/4
000が応答する。以下の表はインビトロ培養アッセイ
についての結果を示す。
の頻度を求めることができる。頻度は穴の37%が成長
を示さない細胞数によって求められる。ある研究による
と区分けされなかった細胞の1/1500が応答するが
CD34+画分の1/40及びCD34−画分の1/4
000が応答する。以下の表はインビトロ培養アッセイ
についての結果を示す。
【0118】
【表1】
【0119】
【表2】
【0120】胎児骨髄(FBM)のFACS分離を画分
をCD34+,10+,19+及びCD34−,1
0−,19−に分割することにより行った。ついで画分
をヒドロコルチゾンの不存在下で8週間連続的に成長さ
せ、ついで骨髄系細胞及びB細胞の存在についてスクリ
ーニングする。
をCD34+,10+,19+及びCD34−,1
0−,19−に分割することにより行った。ついで画分
をヒドロコルチゾンの不存在下で8週間連続的に成長さ
せ、ついで骨髄系細胞及びB細胞の存在についてスクリ
ーニングする。
【0121】
【表3】
【0122】別法として、胎児WBMをFACSによっ
てCD34+,33−,10−,19−に分離し、細胞
をヒドロコルチゾンの不存在下で成長させる。制限希釈
を用いることによって、約10−100の細胞を共存培
養細胞中で6週間より長い間維持することができ、かつ
成熟した、骨髄系細胞及びB細胞に分化することができ
ることが見い出される。
てCD34+,33−,10−,19−に分離し、細胞
をヒドロコルチゾンの不存在下で成長させる。制限希釈
を用いることによって、約10−100の細胞を共存培
養細胞中で6週間より長い間維持することができ、かつ
成熟した、骨髄系細胞及びB細胞に分化することができ
ることが見い出される。
【0123】
【表4】
【0124】CD34,33,10分離の結果を表4に
示す。区分けした細胞集団のみならず区分けされなかっ
た細胞も分離時点(t=0)及び21日後(t=21)
に分析した。t=0でのFACS染色プロフィールの分
析は骨髄系細胞及びB細胞がCD34+ CD10−
CD33−細胞から5%より少ない汚染B及び骨髄系細
胞で有効に除去されたことを示している。
示す。区分けした細胞集団のみならず区分けされなかっ
た細胞も分離時点(t=0)及び21日後(t=21)
に分析した。t=0でのFACS染色プロフィールの分
析は骨髄系細胞及びB細胞がCD34+ CD10−
CD33−細胞から5%より少ない汚染B及び骨髄系細
胞で有効に除去されたことを示している。
【0126】対照的に21日後ではCD34+ CD1
0− CD33−の約50%がB細胞であった。さらに
t=0とt=21の間で細胞数の10倍の増加があっ
た。従って、21日間で全体として100倍のB細胞の
増加があった。さらに、B細胞の約1/3が sIgを
カッパ及びラムダL鎖2:1の比で発現する。
0− CD33−の約50%がB細胞であった。さらに
t=0とt=21の間で細胞数の10倍の増加があっ
た。従って、21日間で全体として100倍のB細胞の
増加があった。さらに、B細胞の約1/3が sIgを
カッパ及びラムダL鎖2:1の比で発現する。
【0127】この結果はB細胞がポリクローナルでEp
stein−Barrウイルス形質転換を発現しないこ
とを示している。対照的にCD34+ CD10+ C
D33+細胞は21日間に亘ってB細胞及び総細胞数の
劇的な減少を示す。この結果はCD10及び/またはC
D19を発現するCD34+細胞が長命の先祖でないこ
とを示している。
stein−Barrウイルス形質転換を発現しないこ
とを示している。対照的にCD34+ CD10+ C
D33+細胞は21日間に亘ってB細胞及び総細胞数の
劇的な減少を示す。この結果はCD10及び/またはC
D19を発現するCD34+細胞が長命の先祖でないこ
とを示している。
【0128】骨髄系細胞の分化はFACS及びメチルセ
ルロースアッセイによって分析した。FACS分析はC
D34+ CD10− CD33− 細胞サブセットに
おいて成熟骨髄系細胞の10倍の増加を示す。メチルセ
ルロースデータの分析はCFU−GM及び BFU−e
活性の90−95%が時間0でCD34+ CD10+
CD33+細胞サブセットに含有されることを示し
た。
ルロースアッセイによって分析した。FACS分析はC
D34+ CD10− CD33− 細胞サブセットに
おいて成熟骨髄系細胞の10倍の増加を示す。メチルセ
ルロースデータの分析はCFU−GM及び BFU−e
活性の90−95%が時間0でCD34+ CD10+
CD33+細胞サブセットに含有されることを示し
た。
【0129】しかしながら、21日目では、CD34+
CD10+ CD33+及びCD34+ CD10−
CD33−細胞集団はほぼ同等のCFU−GM及び
BFU−e細胞レベルを有する。従って、CD34+
CD10− CD33−細胞は培養中21日に亘ってB
細胞(CD19+ 細胞質μ+, sIg+)、骨髄系
細胞(myeloid cells)(CD15+,−
33+,CFU−GM)及び赤血球系細胞(erytn
roid cells)(BFU−e)を生じさせる能
力を有する。
CD10+ CD33+及びCD34+ CD10−
CD33−細胞集団はほぼ同等のCFU−GM及び
BFU−e細胞レベルを有する。従って、CD34+
CD10− CD33−細胞は培養中21日に亘ってB
細胞(CD19+ 細胞質μ+, sIg+)、骨髄系
細胞(myeloid cells)(CD15+,−
33+,CFU−GM)及び赤血球系細胞(erytn
roid cells)(BFU−e)を生じさせる能
力を有する。
【0130】細胞をCD34,CD10,CD19,C
D33またはCD34,CD3,CD7,CD8,CD
10,CD14,CD15,CD19,CD20,CD
33を基に分離する場合も同様な結果が得られる。CD
34+細胞を Thy−1+及び Thy−1−画分に
分けてメチルセルロース分析でアッセイすると、これら
2つの画分は表5に示すごとく同様な読取り(read
ont)を与える。
D33またはCD34,CD3,CD7,CD8,CD
10,CD14,CD15,CD19,CD20,CD
33を基に分離する場合も同様な結果が得られる。CD
34+細胞を Thy−1+及び Thy−1−画分に
分けてメチルセルロース分析でアッセイすると、これら
2つの画分は表5に示すごとく同様な読取り(read
ont)を与える。
【0131】制限希釈によって及び共存培養においてア
ッセイすると、CD34+, Thy−1+画分は1)
共存培養中に発生する(generated)B細胞の
パーセンテージ、2)制限希釈アッセイにおける応答細
胞の頻度、及び3)単一細胞アッセイにおける応答細胞
の頻度(表5及び6)によって実証されるように先祖活
性が豊富化されている。
ッセイすると、CD34+, Thy−1+画分は1)
共存培養中に発生する(generated)B細胞の
パーセンテージ、2)制限希釈アッセイにおける応答細
胞の頻度、及び3)単一細胞アッセイにおける応答細胞
の頻度(表5及び6)によって実証されるように先祖活
性が豊富化されている。
【0132】制限希釈アッセイにおいて75%陽性の穴
(well)を得るために、 Thy−1+画分は約1
/30−1/50細胞(cells)を要し、他方Th
y−1−画分は1/170−1/500細胞(cell
s)を要する。このことはThy−1+画分が先祖細胞
についてさらに濃縮されていることを示している。
(well)を得るために、 Thy−1+画分は約1
/30−1/50細胞(cells)を要し、他方Th
y−1−画分は1/170−1/500細胞(cell
s)を要する。このことはThy−1+画分が先祖細胞
についてさらに濃縮されていることを示している。
【0133】さらにインビボT細胞アッセイでアッセイ
すると Thy−1+画分はドナー由来T細胞を生じさ
せるのに対し、 Thy−1−画分は生じさせない。
すると Thy−1+画分はドナー由来T細胞を生じさ
せるのに対し、 Thy−1−画分は生じさせない。
【0134】
【表5】
【0135】
【表6】
【0136】T細胞発生についての胸腺アッセイは以下
のようにして行った。胎児胸腺断片(個々の胸腺葉)を
約1mm3のサイズで得る。前駆体細胞に対する胸腺の
生体外受容性(receptiuity)を刺激するた
めに断片を胸腺器官培養系中25℃で3−7日培養す
る。
のようにして行った。胎児胸腺断片(個々の胸腺葉)を
約1mm3のサイズで得る。前駆体細胞に対する胸腺の
生体外受容性(receptiuity)を刺激するた
めに断片を胸腺器官培養系中25℃で3−7日培養す
る。
【0137】平衡塩溶液を含有するFCS中の約100
−104細胞よりなる細胞組成物を油充填測微用スクリ
ュー操作注射器に結合させたガラス製マイクロピペット
を用いて1μlの容量で注入する。注入24時間後に、
生体外でコロニー化した胸腺断片をSCIDマウスの腎
被膜(kidney capsule)下に移植する。
−104細胞よりなる細胞組成物を油充填測微用スクリ
ュー操作注射器に結合させたガラス製マイクロピペット
を用いて1μlの容量で注入する。注入24時間後に、
生体外でコロニー化した胸腺断片をSCIDマウスの腎
被膜(kidney capsule)下に移植する。
【0138】EPA 0322240参照。注入された
細胞は胸腺と不適当に組み合わされた(mismatc
hed)HLAである。時々、受容動物を殺し、移植片
を回収する。細胞懸濁液をドナー由来Tリンパ球を(C
D3+,8+)の存在について2色免疫蛍光アッセイで
分析する。
細胞は胸腺と不適当に組み合わされた(mismatc
hed)HLAである。時々、受容動物を殺し、移植片
を回収する。細胞懸濁液をドナー由来Tリンパ球を(C
D3+,8+)の存在について2色免疫蛍光アッセイで
分析する。
【0139】
【表7】
【0140】
【表8】
【0141】上記結果は選ばれた細胞中の少しの集団が
最終的に分化したCD4+及びCD8+T細胞になるT
細胞を生じさせることを示している。 Thy−1−集
団は検出し得るレベルの分化T細胞を与えないと考えら
れる。
最終的に分化したCD4+及びCD8+T細胞になるT
細胞を生じさせることを示している。 Thy−1−集
団は検出し得るレベルの分化T細胞を与えないと考えら
れる。
【0142】ヒト骨断片は照射した(200−300r
ad(ラド))もしくは非照射のCB17 SCID/
SCIDマウスに種々の部位で(腹腔内(i.p.)、
皮下(s.c.)等)で移植できる。骨断片は少なくと
も9ケ月絶えずヒトのB、骨髄系及び赤血球系細胞を生
産しながら成長する。
ad(ラド))もしくは非照射のCB17 SCID/
SCIDマウスに種々の部位で(腹腔内(i.p.)、
皮下(s.c.)等)で移植できる。骨断片は少なくと
も9ケ月絶えずヒトのB、骨髄系及び赤血球系細胞を生
産しながら成長する。
【0143】骨断片はヒトの同種異系の先祖集団のため
の支えとなるマイクロ環境として働く。同種異系の骨髄
先祖(HLAクラスIに対し不整合(mismatc
h))を受容マウス中への移植前もしくは後に骨断片中
に注入できる。
の支えとなるマイクロ環境として働く。同種異系の骨髄
先祖(HLAクラスIに対し不整合(mismatc
h))を受容マウス中への移植前もしくは後に骨断片中
に注入できる。
【0144】先祖細胞を移植前に注入する場合には、区
分けした細胞を骨にマイクロ注入し、注入骨を室温で一
夜インキュベートし、ついで CB17 SCID/S
CIDマウス(i.p.またはs.c.)に移植する。
先祖細胞を移植後にマイクロ注入する場合には、 GB
17 SCID/SCIDマウスに骨断片を移植する
(i.p.,s.c.)。
分けした細胞を骨にマイクロ注入し、注入骨を室温で一
夜インキュベートし、ついで CB17 SCID/S
CIDマウス(i.p.またはs.c.)に移植する。
先祖細胞を移植後にマイクロ注入する場合には、 GB
17 SCID/SCIDマウスに骨断片を移植する
(i.p.,s.c.)。
【0145】6週間後、骨移植片を照射し(マウスの遮
蔽で移植片に200−1000rad)、ついで先祖細
胞を注入することができる。別法として、先祖細胞を非
照射骨断片に注入してもよい。
蔽で移植片に200−1000rad)、ついで先祖細
胞を注入することができる。別法として、先祖細胞を非
照射骨断片に注入してもよい。
【0146】骨髄アッセイの結果はCD34+細胞が事
実上すべての骨髄再生能力を有していることを示してい
る。骨髄再生能力。
実上すべての骨髄再生能力を有していることを示してい
る。骨髄再生能力。
【0147】CD34集団の副次分別はCD34サブセ
ット中の Thy+細胞(CD34細胞の5%)が該C
D34画分に事実上すべてのB細胞、骨髄系細胞及び赤
血球系先祖の活性を含有することを示した。このアッセ
イは10と10,000の細胞の間で成功裏に行うこと
ができる。表9に概略を示す。
ット中の Thy+細胞(CD34細胞の5%)が該C
D34画分に事実上すべてのB細胞、骨髄系細胞及び赤
血球系先祖の活性を含有することを示した。このアッセ
イは10と10,000の細胞の間で成功裏に行うこと
ができる。表9に概略を示す。
【0148】
【表9】
【0149】ヒト幹細胞の自己再生及び長命を評価する
ために二次移動アッセイ(secondary tra
nsfer assay)を用いることができる。ドナ
ー先祖細胞を上述の如くHLA不整合骨断片に注入す
る、2−3ケ月後、成長した(expanded)ドナ
ー細胞を「幹細胞」表現型(CD34+, Thy+,
Lin−)について再区分けする。
ために二次移動アッセイ(secondary tra
nsfer assay)を用いることができる。ドナ
ー先祖細胞を上述の如くHLA不整合骨断片に注入す
る、2−3ケ月後、成長した(expanded)ドナ
ー細胞を「幹細胞」表現型(CD34+, Thy+,
Lin−)について再区分けする。
【0150】ついでこれらの細胞を第2のHLA不整合
ドナー中に再注入する。1−3ケ月後、骨を種々の先祖
集団並びに幹細胞について評価する。このようにして、
種々の直系の造血系細胞を生じさせる「幹細胞」の長期
能力、並びに既知インプット「幹細胞」数から生じた
「幹細胞」の数を評価できる。
ドナー中に再注入する。1−3ケ月後、骨を種々の先祖
集団並びに幹細胞について評価する。このようにして、
種々の直系の造血系細胞を生じさせる「幹細胞」の長期
能力、並びに既知インプット「幹細胞」数から生じた
「幹細胞」の数を評価できる。
【0151】これによって幹細胞の自己再生について推
定できる。本アッセイにおいては本発明の幹細胞は長期
に亘る再生を与える。
定できる。本アッセイにおいては本発明の幹細胞は長期
に亘る再生を与える。
【0152】本発明が本発明に沿ったヒト造血系幹細胞
の特性において実質上均質である細胞を提供することは
上記結果から明らかである。このように、特定の因子の
適切な選択、及び幹細胞の自己再生を見込んだバイオア
ッセイの開発、及び表面マーカーによる幹細胞のスクリ
ーニングによって、実質上均質の、生育能力を有するヒ
ト造血幹細胞組成物を種々の目的のために生産すること
ができる。
の特性において実質上均質である細胞を提供することは
上記結果から明らかである。このように、特定の因子の
適切な選択、及び幹細胞の自己再生を見込んだバイオア
ッセイの開発、及び表面マーカーによる幹細胞のスクリ
ーニングによって、実質上均質の、生育能力を有するヒ
ト造血幹細胞組成物を種々の目的のために生産すること
ができる。
【0153】幹細胞は骨髄移植物中で用いることがで
き、そこで細胞から腫瘍性細胞や他の病原性の細胞、例
えばHIV−感染細胞を除去する。さらに、純粋な幹細
胞の使用は移植片−対−宿主の病気を排除するであろ
う。
き、そこで細胞から腫瘍性細胞や他の病原性の細胞、例
えばHIV−感染細胞を除去する。さらに、純粋な幹細
胞の使用は移植片−対−宿主の病気を排除するであろ
う。
【0154】さらに、細胞は適切な組換え(相同もしく
は非相同組換え)によって修飾して、遺伝子欠損を修復
し、または幹細胞中で、個々的にもしくは幹細胞一般に
ついて、天然的に欠けている遺伝的能力を供給すること
ができる。
は非相同組換え)によって修飾して、遺伝子欠損を修復
し、または幹細胞中で、個々的にもしくは幹細胞一般に
ついて、天然的に欠けている遺伝的能力を供給すること
ができる。
【0155】さらに本組成物には実質上他の細胞が存在
しないので、幹細胞組成物は再生及び分離と関連する因
子を単離し、定義するのに用いることができる。
しないので、幹細胞組成物は再生及び分離と関連する因
子を単離し、定義するのに用いることができる。
【0156】本発明で述べたすべての刊行物及び出願は
本発明が関与する分野における熟練者の熟練のレベルを
示すものである。すべての刊行物及び特許出願は各々の
刊行物または特許出願が具体的、個々的に引用により移
入されていると同じ程度にここに移入されるものであ
る。
本発明が関与する分野における熟練者の熟練のレベルを
示すものである。すべての刊行物及び特許出願は各々の
刊行物または特許出願が具体的、個々的に引用により移
入されていると同じ程度にここに移入されるものであ
る。
【0157】今や本発明は十分に説明されているので、
当業者にとって添えられた特許請求の範囲の精神または
範囲から逸脱することなく多くの変化及び修飾をなし得
ることは当業者にとって明らかであろう。
当業者にとって添えられた特許請求の範囲の精神または
範囲から逸脱することなく多くの変化及び修飾をなし得
ることは当業者にとって明らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャールス エム.バウム アメリカ合衆国,カリフォルニア 94043,マウンテン ビュー,ティレラ コート 79 (72)発明者 相原 雄幸 神奈川県横浜市南区別塩5−6−16 511号 (72)発明者 アービング ウェイスマン アメリカ合衆国,カリフォルニア 94305,パロ アルト,#711,ウェルシ ュ ロード 1170
Claims (7)
- 【請求項1】 細胞の80%以上が、ヒト造血幹細胞性
であり且つCD34+ 10- 19- 33- であることを
特徴とする細胞組成物。 - 【請求項2】 前記細胞がさらにThy−1+ であるこ
とを特徴とする、請求項1に記載の細胞組成物。 - 【請求項3】 細胞成分が自己再生でき、そしてリンパ
球系の、赤血球系の及び骨髄性単球の造血系のメンバー
への分化を行うことができることを特徴とする、請求項
1又は2に記載の細胞組成物。 - 【請求項4】 共存培養培地中で自己再生でき、少なく
ともT,B及びマクロファージの造血系のメンバーに分
化でき、系統に付された細胞の含量が5%未満である、
請求項3に記載の細胞組成物。 - 【請求項5】 共存培養培地中で自己再生でき、リンパ
球系の、骨髄細胞系の及び骨髄単球系の造血系のメンバ
ーに分化でき、且つ系統に付された細胞の含量が5%未
満である、請求項3に記載の細胞組成物。 - 【請求項6】 ヒト造血幹細胞を含んで成る細胞組成物
を得る方法において、ここで共存培養培地中で自己再生
することができ且つリンパ球系及び骨髄単球系の造血系
メンバーに分化することができる細胞が約100個未満
であり、前記方法が、ヒト造血幹細胞及び分化した細胞
の混合物を、ヒトの造血細胞であり且つCD34 + ,1
0 - ,19 - ,33 - であることを特徴とする細胞を含
んで成る実質的に均一な画分に分離することを含んで成
る方法。 - 【請求項7】 前記の分化が骨髄細胞系への分化であ
り、そして前記共存培養培地がヒドロコーチゾンを含ん
で成る、請求項6に記載の方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/502,616 US5061620A (en) | 1990-03-30 | 1990-03-30 | Human hematopoietic stem cell |
US502616 | 1990-03-30 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3133731A Expired - Fee Related JP3017320B2 (ja) | 1990-03-30 | 1991-03-29 | ヒト造血幹細胞 |
JP27952799A Expired - Fee Related JP3160600B2 (ja) | 1990-03-30 | 1999-09-30 | ヒト造血幹細胞 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP27952799A Expired - Fee Related JP3160600B2 (ja) | 1990-03-30 | 1999-09-30 | ヒト造血幹細胞 |
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US5635386A (en) * | 1989-06-15 | 1997-06-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for regulating the specific lineages of cells produced in a human hematopoietic cell culture |
US5763266A (en) * | 1989-06-15 | 1998-06-09 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietics cells |
US5605822A (en) * | 1989-06-15 | 1997-02-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods, compositions and devices for growing human hematopoietic cells |
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US5635387A (en) * | 1990-04-23 | 1997-06-03 | Cellpro, Inc. | Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors |
US5622853A (en) * | 1990-05-01 | 1997-04-22 | Becton Dickinson And Company | T lymphocyte precursor |
US5840580A (en) * | 1990-05-01 | 1998-11-24 | Becton Dickinson And Company | Phenotypic characterization of the hematopoietic stem cell |
US6631842B1 (en) * | 2000-06-07 | 2003-10-14 | Metrologic Instruments, Inc. | Method of and system for producing images of objects using planar laser illumination beams and image detection arrays |
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US6010696A (en) * | 1990-11-16 | 2000-01-04 | Osiris Therapeutics, Inc. | Enhancing hematopoietic progenitor cell engraftment using mesenchymal stem cells |
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US5464753A (en) * | 1991-03-08 | 1995-11-07 | Univ Illinois | Purification and manipulation of bone marrow and blood cells on the basis of P-glycoprotein expression |
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US5185438A (en) * | 1991-04-02 | 1993-02-09 | The Trustees Of Princeton University | Nucleic acids encoding hencatoporetic stem cell receptor flk-2 |
JP3213314B2 (ja) * | 1991-04-05 | 2001-10-02 | ボード・オブ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・ワシントン | 幹細胞因子レセプターに対するモノクローナル抗体 |
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WO1992018615A1 (en) | 1991-04-09 | 1992-10-29 | Indiana University Foundation | System and process for supporting hematopoietic cells |
JPH07501206A (ja) * | 1991-08-07 | 1995-02-09 | イェシバ・ユニバーシティ | 前駆肝細胞の増殖 |
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