ES2362931T3 - Anticuerpos humanos específicos contra kdr y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une selectivamente al receptor que contiene el dominio de inserto quinasa (KDR) humano, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende regiones determinantes de complementariedad representadas por la SEC ID Nº: 81 en la CDRL1; la SEC ID Nº: 82 en la CDRL2; la SEC ID Nº: 83 en la CDRL3; la SEC ID Nº: 13 en la CDRH1; la SEC ID Nº: 14 en la CDRH2; y la SEC ID Nº: 15 en la CDRH3.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos humanos que se unen a KDR, que bloquean la unión de KDR al receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y que neutralizan la activación de KDR. Los anticuerpos se usan para tratar enfermedades neoplásicas y trastornos hiperproliferativos, y pueden usarse en solitario o en combinación con otros antagonistas de VEGFR, y con antagonistas del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

Antecedentes de la invención

La angiogénesis es un proceso altamente complejo de desarrollo de nuevos vasos sanguíneos que implica la proliferación y migración de, y la infiltración tisular por células endoteliales capilares de vasos sanguíneos preexistentes, el ensamblaje celular en estructuras tubulares, la unión de ensamblajes tubulares de reciente formación a sistemas vasculares de circuito cerrado y la maduración de los vasos capilares recién formados.

La angiogénesis es importante en procesos fisiológicos normales, incluyendo el desarrollo embrionario, el crecimiento folicular y la cicatrización de heridas, así como en afecciones patológicas, tales como el crecimiento de tumores, y en enfermedades no neoplásicas que impliquen una neovascularización anormal, incluyendo glaucoma neovascular (Folkman, J. y Klagsbrun, M., Science, 235: 442-7 (1987). Otras patologías incluyen, pero sin limitación, enfermedades neoplásicas incluyendo, pero sin limitación, tumores sólidos, aterosclerosis y otras enfermedades inflamatorias, tales como artritis reumatoide y afecciones oftalmológicas tales como retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con la edad. Las afecciones o enfermedades a las que contribuye una angiogénesis persistente o descontrolada se han denominado enfermedades dependientes de la angiogénesis o asociadas a la angiogénesis.

Un medio para controlar dichas enfermedades y afecciones patológicas comprende restringir el suministro de sangre a aquellas células implicadas en mediar o causar la enfermedad o afección, por ejemplo, ocluyendo los vasos sanguíneos que la suministran a las porciones de los órganos en las que están presentes tumores. Dichas estrategias requieren que se identifique el sitio del tumor y generalmente se limitan al tratamiento en un solo sitio, o en un pequeño número de sitios. Una desventaja adicional de la restricción mecánica directa del suministro sanguíneo es que se desarrollan vasos sanguíneos colaterales, a menudo bastante rápidamente, restaurando el suministro de sangre al tumor.

Otras estrategias se han centrado en la modulación de factores que están implicados en la regulación de la angiogénesis. Aunque normalmente inactiva, la proliferación endotelial vascular está altamente regulada, incluso durante la angiogénesis. El VEGF es un factor que se ha implicado como regulador de la angiogénesis in vivo (Klagsbrun, M. y D’Amore, P., Annual Rev. Physiol., 53: 217-39 (1991)).

Un mitógeno específico de células endoteliales, VEGF, actúa como inductor de la angiogénesis, promoviendo específicamente la proliferación de células endoteliales. Es una glicoproteína homodimérica que consiste en dos subunidades de 23 kD. Se han identificado cuatro isoformas monoméricas diferentes de VEGF resultantes de un corte y empalme alternativo de ARNm. Estas incluyen dos formas unidas a membrana (VEGF206 y VEGF189) y dos formas solubles (VEGF165 y VEGF121). El VEGF165 es la isoforma más abundante en todos los tejidos humanos excepto en la placenta.

El VEGF se expresa en tejidos embrionarios (Breier y col., Development, 114: 521-32 (1992)), macrófagos y queratinocitos epidérmicos en proliferación durante la cicatrización de heridas (Brown y col., J. Exp. Med 176: 13759 (1992)), y puede ser responsable del edema tisular asociado con inflamación (Ferrara y col., Endocr. Rev., 13: 1832 (1992)). Los estudios de hibridación in situ han demostrado altos niveles de expresión de VEGF en varias líneas tumorales humanas, incluyendo glioblastoma multiforme, hemangioblastoma, otras neoplasias del sistema nervioso central y sarcoma de Kaposi asociado con SIDA (Plate, K. y col., Nature, 359: 845-8 (1992); Plate, K. y col., Cancer Res., 53: 5822-7 (1993); Berkman, R. y col., J. Clin. Invest., 91: 153-9 (1993); Nakamura, S. y col., AIDS Weekly, 13

(1) (1992)). También se han encontrado altos niveles de expresión de VEGF en placas y lesiones ateroscleróticas y en células inflamatorias.

El VEGF media su efecto biológico a través de receptores de VEGF de alta afinidad que se expresan de forma selectiva en células endoteliales durante, por ejemplo, la embriogénesis (Millauer, B. y col. Cell, 72: 835-46 (1993)) y la formación de tumores, y que se han implicado en la modulación de la angiogénesis y en el crecimiento de tumores. Estos receptores comprenden un dominio citosólico de tirosina quinasa que inicia la ruta de señalización implicada en el crecimiento celular.

Los receptores de VEGF típicamente son tirosina quinasas de tipo receptor de clase III caracterizadas por tener varios bucles de tipo inmunoglobulina, típicamente 5 ó 7, en sus dominios de unión a ligando de receptor extracelular aminoterminal (Kaipainen y col., J. Exp. Med., 178: 2077-88 (1993)). Las otras dos regiones incluyen una región

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

transmembrana y un dominio catalítico intracelular carboxiterminal interrumpido por una inserción de secuencias interquinasa hidrófilas de diversas longitudes, denominada dominio de inserto quinasa (Terman y col., Oncogene, 6: 1677-83 (1991)). Los receptores de VEGF incluyen el receptor tirosina quinasa tipo fms (flt-1), o VEGFR-1, secuenciado por Shibuya y col., Oncogene, 5: 519-24 (1990), el receptor que contiene el dominio de inserto quinasa/quinasa de hígado fetal (KDR/flk-1), o VEGFR-2, descrito en el documento WO 92/14248, presentado el 20 de febrero de 1992 y Terman y col., Oncogene, 6: 1677-83 (1991) y secuenciado por Matthews y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88: 9026-30 (1991), aunque otros receptores también pueden unirse a VEGF. Otro receptor tirosina quinasa, VEGFR-3 (flt-4), se une a los homólogos de VEGF VEGF-C y VEGF-D, y es importante en el desarrollo de vasos linfáticos.

La liberación de VEGF por una masa tumoral estimula la angiogénesis en células endoteliales adyacentes. Cuando el VEGF se expresa por la masa tumoral, las células endoteliales adyacentes a las células tumorales VEGF+ regularán positivamente la expresión de receptores de VEGF, por ejemplo, VEGFR-1 y VEGFR-2. Se cree en general que KDR/VEGFR-2 es el transductor de señales de VEGF principal que da como resultado la proliferación de células endoteliales, migración, diferenciación, formación de tubos, aumento de la permeabilidad vascular y mantenimiento de la integridad vascular. VEGFR-1 posee una actividad quinasa mucho más débil y es incapaz de generar una respuesta mitogénica cuando se estimula por VEGF, aunque se une a VEGF con una afinidad que es aproximadamente 10 veces superior a KDR. VEGFR-1 también se ha implicado en la migración inducida por VEGF y factor de crecimiento de placenta (P1GF) de monocitos y macrófagos y en la producción de factor tisular.

Se expresan altos niveles de VEGFR-2, por ejemplo, por células endoteliales que infiltran gliomas (Plate, K. y col. (1992)), y están específicamente reguladas positivamente por el VEGF producido por glioblastomas humanos (Plate,

K. y col. (1993)). El descubrimiento de altos niveles de expresión de VEGR-2 en células endoteliales asociadas a glioblastoma (GAEC) sugiere que la actividad del receptor se induce durante la formación del tumor, puesto que los transcritos de VEGFR-2 apenas son detectables en células endoteliales cerebrales normales, indicando la generación de un bucle paracrino de VEGF/VEGFR. Esta regulación positiva está confinada a las células endoteliales vasculares en estrecha proximidad con el tumor. El bloqueo de la actividad de VEGF con anticuerpos monoclonales anti-VEGF (AcM) neutralizantes da como resultado la inhibición del crecimiento de xenoinjertos de tumor humano en ratones atímicos (Kim, K. y col. Nature, 362: 841-4 (1993)), sugiriendo un papel directo para el VEGF en la angiogénesis relacionada con tumores.

Por consiguiente, se han desarrollado antagonistas de VEGFR para tratar tumores vascularizados y otras enfermedades angiogénicas. Estos han incluido anticuerpos neutralizantes que bloquean la señalización por receptores de VEGF expresados en células endoteliales vasculares para reducir el crecimiento de tumores por bloqueo de la angiogénesis a través de un bucle paracrino dependiente del endotelio. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.365.157 (Rockwell y col.), y los documentos WO 00/44777 (Zhu y col.), WO 01154723 (Kerbel); WO 01/74296 (Witte y col.), WO 01/90192 (Zhu), WO 03/002144 (Zhu) y WO 03/000183 (Carmeliet y col.).

También se han encontrado receptores de VEGF en algunas células no endoteliales, tales como células tumorales que producen VEGF, en las que se genera un bucle autocrino independiente del endotelio para mantener el crecimiento del tumor. Por ejemplo, el VEGF se expresa casi de forma invariable por todas las líneas celulares de leucemia establecidas y leucemias humanas recién aisladas. Además, el VEGFR-2 y el VEGFR-1 se expresan por ciertas leucemias humanas. Fielder y col., Blood 89: 1870-5 (1997); Bellamy y col., Cancer Res. 59728-33 (1999). Se ha demostrado que un bucle autocrino de VEGF/VEGFR-2 humano media la supervivencia y la migración de células de leucemia in vivo. Dias y col., J. Clin. Invest. 106: 511-21 (2000); y documento WO 01/74296 (Witte y col.). De forma similar, la producción de VEGF y la expresión de VEGFR también se han descrito para algunas líneas celulares de tumores sólidos in vitro. (Véase, Sato, K. y col., Tohoku J. Exp. Med., 185: 173-84 (1998); Ishii, Y., Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi: 47: 133-40 (1995); y Ferrer, F. A. y col, Urology, 54: 567-72 (1999)). Se ha demostrado además que los AcM contra VEGFR-1 inhiben un bucle autocrino de VEGFR/VEGFR-1 humano en células de carcinoma de mama. Wu, y col., "Monoclonal antibody against VEGFR1 inhibits flt1-positive DU4475 human breast tumor growth by a dual mechanism involving anti-angiogenic and tumor cell growth inhibitory activities," AACR NCI EORTC International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics, 29 Oct.-2 Nov. 2001, Resumen nº 7.

Lu y col (International Journal of Cancer, NY; Estados Unidos; Vol. 97, En. 2002, páginas 393-399) describe fragmentos Fab humanos de alta afinidad aislados dirigidos contra KDR a partir de una biblioteca en fago de anticuerpos.

Continúa existiendo la necesidad de agentes que inhiban la actividad receptora de VEGF para tratar o prevenir enfermedades o afecciones dependientes de receptor de VEGF, inhibiendo por ejemplo la angiogénesis patogénica

o el crecimiento de tumores a través de la inhibición del bucle paracrino y/o autocrino de VEGF/VEGFR.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos humanos y porciones de los mismos que se unen a KDR, bloquean la unión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a KDR y neutralizan la activación de KDR, como se define por las reivindicaciones. La invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une selectivamente a un receptor que contiene un dominio de inserto quinasa (KDR) humano, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende regiones determinantes de complementariedad representadas por la SEC ID Nº: 81 en la CDRL1; la SEC ID Nº: 82 en la CDRL2; la SEC ID Nº: 83 en la CDRL3; la SEC ID Nº: 13 en la CDRH1; la SEC ID Nº: 14 en la CDRH2; y la SEC ID Nº: 15 en la CDRH3.

Preferentemente, un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención comprende un dominio variable de cadena ligera representado por la SEC ID Nº: 53, y un dominio variable de cadena pesada representado por la SEC ID Nº: 24.

Un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención se selecciona preferentemente del grupo que consiste en un anticuerpo de cadena sencilla, un Fab, un Fv de cadena sencilla, un diacuerpo y un triacuerpo.

Aspectos adicionales de la invención se refieren a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento de la invención, un vector de expresión que comprende un polinucleótido de SEC ID Nº: 52 y una célula huésped recombinante que comprende dicho vector de expresión.

Los anticuerpos se usan para tratar enfermedades neoplásicas, incluyendo, por ejemplo, tumores sólidos y no sólidos. Los anticuerpos también pueden usarse para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos. Por consiguiente, la invención proporciona procedimientos de neutralización de la activación de KDR, procedimientos de inhibición del crecimiento de tumores, incluyendo la inhibición de la angiogénesis asociada a tumores, y procedimientos de tratamiento de otros trastornos relacionados con la angiogénesis. También se proporcionan kits que tienen anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos que se unen a receptores de VEGR.

Los anticuerpos pueden usarse en solitario o en combinación con otros antagonistas de VEGFR y/o inhibidores de la angiogénesis, tales como, por ejemplo, antagonistas del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR). La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos.

Abreviaturas -VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular; bFGF, factor de crecimiento de fibroblastos básico, KDR, receptor que contiene un dominio de inserto quinasa (también denominado receptor de VEGF 2); FLK-1, quinasa de hígado fetal 1; scFv, Fv de cadena sencilla; HUVEC, células endoteliales de vena umbilical humana; PBS, solución salina tamponada con fosfato 0,01 M (pH 7,2); PBST, PBS que contiene Tween-20 al 0,1%; AP, fosfatasa alcalina; EGF, factor de crecimiento epidérmico; VE y VL, dominio variable de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, respectivamente.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la identificación y expresión de fragmentos Fab anti-KDR humanos. Figura 1A: Patrones de digestión con BstN I de cuatro Fab anti-KDR neutralizantes. Figura 1B: Análisis de SDS-PAGE de fragmentos Fab purificados en condiciones no reductoras. Carril 1, D1F7; Carril 2, D2C6; Carril 3, D1H4; Carril 4, D2H2.

La Figura 2 representa la unión a KDR, el bloqueo de la interacción KDR/VEGF y el bloqueo de la interacción Flk-1/VEGF por fragmentos Fab anti-KDR humanos. Figura 2A: Unión dependiente de la dosis de Fab anti-KDR humano a KDR inmovilizado. Figura 2B: Inhibición de la unión de KDR a VEGF inmovilizado por Fab anti-KDR. Figura 2C: inhibición de la unión de Flk-1 a VEGF inmovilizado por Fab anti-KDR. Se incubaron diversas cantidades de proteínas Fab con una cantidad fija de KDR-AP (2B) o Flk-1-AP (2C) en solución a temperatura ambiente (TA) durante 1 h.

La Figura 3 representa el mapeo de epítopos para los fragmentos Fab anti-KDR. KDR-AP, sus variantes de deleción de dominio-AP y Flk-1-AP se capturaron en una placa de 96 pocillos y se incubaron con fragmentos Fab anti-KDR humanos. Los datos se presentan respecto a la unión de los fragmentos Fab a KDR de longitud completa.

La Figura 4 representa la inhibición de la mitogenia de HUVEC inducida por VEGF por fragmentos Fab anti-KDR humanos. Se añadieron diversas cantidades de fragmentos Fab anti-KDR a pocillos por duplicado y se incubaron a 37 ºC durante 1 h, después de lo cual se añadió VEGF a los pocillos a una concentración final de 16 ng/ml. Las células se recogieron y se determinó la radiactividad incorporada en el ADN.

La Figura 5 representa la inhibición de la migración estimulada por VEGF de células de leucemia humanas por los fragmentos Fab anti-KDR. Figura 5A: El VEGF promueve la migración de células HL60 y HEL de una forma dependiente de la dosis. Figura 5B: Inhibición de la migración estimulada por VEGF de células de leucemia humanas por los fragmentos Fab anti-KDR. La cantidad de KDR-AP que se unió al VEGF inmovilizado se cuantificó por incubación de las placas con sustrato AP y lectura de A405 nm.

La Figura 6 representa la unión a KDR y el bloque de la interacción de KDR/VEGF por anticuerpos anti-KDR humanos. Figura 6A: Unión dependiente de la dosis de anti-KDR a KDR inmovilizado. Se incubaron diversas cantidades de anticuerpos a temperatura ambiente durante 1 h en placas de 96 pocillos revestidas con KDR. Figura 6B: Inhibición de la unión de KDR a VEGF inmovilizado por anticuerpos anti-KDR humanos. Se incubaron diversas cantidades de los anticuerpos con una cantidad fija de KDR-AP en solución a temperatura ambiente durante 1 hora.

La Figura 7 representa la inhibición de la unión de VEGF y la mitogenia inducida por VEGF de HUVEC. Figura 7A: Inhibición de la unión de VEGF radiomarcado a KDR de superficie celular por anticuerpos anti-KDR humanos. Diversas cantidades de anticuerpos anti-KDR se mezclaron con 2 ng de VEGF165 marcado con 125I y se añadieron a una monocapa confluente al 80-90% de células HUVEC. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h, se lavaron y se determinó la radiactividad unida. Figura 7B: Inhibición de la mitogenia de HUVEC inducida por VEGF por anticuerpos anti-KDR humanos. Se incubaron diversas cantidades de anticuerpos anti-KDR humanos con células HUVEC durante 1 h, seguido de la adición de VEGF. Se recogieron células y se determinó la radiactividad incorporada en el ADN.

La Figura 8 representa la expresión de KDR y VEGF por células de leucemia humanas. Figura 8A: Se determinaron los niveles de ARNm seleccionado mediante RT-PCR. Carril 1: Marcadores de peso molecular; 1000, 850, 650, 500, 400 pb; Carril 2: Control negativo; Carril 3: Células HL60 (promielocíticas); Carril 4: Células HEL (megacariocíticas); Carril 5: Células U937 (histiocíticas); Carril 6: HUVEC. Figura 8B: Secreción de VEGF por células de leucemia humana cultivadas con FCS al 10% o en medio sin suero.

La Figura 9 representa la inhibición de la migración estimulada por VEGF de células de leucemia humana por anticuerpos anti-KDR humanos. Figura 9A: Células HL60. Figura 9B: Células HEL. Figura 9C: Células U937.

La Figura 10 representa la inhibición del progreso de la leucemia in vivo según se determinó por los índices de supervivencia. Ratones NOD-SCID irradiados a dosis subletal se inocularon con 2 x 107 células HL60 y se trataron con diversas dosis de IMC-1C11, IMC-2C6 o IMC-1121 por inyección intraperitoneal.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos de acuerdo con las reivindicaciones que se unen específicamente a un dominio extracelular de VEGFR-2 (KDR). Los anticuerpos comprenden regiones flanqueantes de VH y VL humanas (FW), así como regiones determinantes de complementariedad (CDR) humanas. Preferentemente, los dominios variables VH y VL completos son humanos o derivados de secuencias humanas. Por ejemplo, un dominio variable de la invención puede obtenerse a partir de un linfocito de sangre periférica que contenga un gen de región variable reorganizado. Como alternativa, porciones de dominios variables tales como CDR y regiones FW pueden proceder de diferentes secuencias humanas. En otro ejemplo, un dominio variable VH humano está codificado por un segmento génico VH humano y una secuencia sintética para la región CDR3H (es decir, un segmento génico DH-JH sintético). Así mismo, un domino variable VL humano puede estar codificado por un segmento génico VL humano y una secuencia sintética para la región CDR3L (es decir, un segmento génico JL sintético).

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen aquellos cuyas características de unión se han mejorado por mutación directa, procedimientos de maduración por afinidad, presentación en fago o transposición de cadenas. La afinidad y especificidad pueden modificarse o mejorarse mutando CDR y explorando para sitios de unión a antígeno que tengan las características deseadas (véase, por ejemplo, Yang y col, J. Mol. Biol., 254: 392-403 (1995)). Las CDR se mutan de una diversidad de formas. Una forma es aleatorizar restos individuales o combinaciones de restos de modo que en una población de sitios de unión a antígeno de otro modo idénticos, los veinte aminoácidos se encuentran en posiciones particulares. Como alternativa, se inducen mutaciones sobre una variedad de restos de CDR por procedimientos de PCR propensa a errores (véase, por ejemplo, Hawkins y col., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)). Por ejemplo, los vectores de presentación en fago que contienen genes de la región variable de la cadena ligera y pesada pueden propagarse en cepas mutantes de E. coli (véase, por ejemplo Low y col., J. Mol. Biol., 250: 359-368 (1996)). Estos procedimientos de mutagénesis son ilustrativos de los muchos procedimientos conocidos por un experto en la materia.

Los anticuerpos se unen a KDR y neutralizan la activación, por ejemplo, bloqueando la dimerización del receptor y/o la unión a VEGF. Los anticuerpos de la invención pueden usarse para neutralizar la activación de VEGFR in vitro o in vivo uniéndose a un dominio extracelular de un receptor de VEGF. Los dominios extracelulares de un receptor de VEGF incluyen, por ejemplo, un dominio de unión a ligando en una porción extracelular del receptor. In vivo, los anticuerpos inhiben la angiogénesis y/o reducen el crecimiento de tumores.

Los anticuerpos son proteínas que reconocen y se unen a un antígeno o sustancia específica. Los anticuerpos de la presente invención se unen a KDR al menos tan fuertemente como el ligando natural. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con un anticuerpo (Kd) mide la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión a anticuerpo. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre un anticuerpo con su antígeno. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un epítopo con su sitio de unión a antígeno en el anticuerpo como con la valencia del anticuerpo. La valencia se refiere al número de sitios de unión a antígeno que tiene una inmunoglobulina para un epítopo particular. Por ejemplo, un anticuerpo monovalente tiene un sitio de unión para un epítopo particular. Un determinante antigénico o epítopo es el sitio en un antígeno en el que se une un anticuerpo dado. Son valores típicos de K 105 a 1011 litros/mol. Se considera que cualquier K inferior a 104 litros/mol indica una unión que es inespecífica. La inversa de K se denomina Kd. (La Kd también puede denominarse constante de disociación). Cuanto menor sea el valor de Kd, más fuerte será la fuerza de unión entre un determinante antigénico y el sitio de unión a anticuerpo.

El ligando natural de KDR es VEGF humano. El VEGF se une a KDR con una afinidad (Kd) de aproximadamente 0,93 nM. Para obstaculizar la unión de VEGF a KDR, un anticuerpo anti-KDR debería unirse a KDR al menos tan fuertemente como VEGF. En otras palabras, el anticuerpo anti-KDR tiene que competir con éxito con el VEGF con respecto a su unión a KDR. Un anticuerpo con una Kd de como mucho 5 nM se considera que se une tan fuertemente como el ligando natural. Los anticuerpos de la invención se unen a KDR preferentemente con una afinidad de como mucho aproximadamente 4 nM, más preferentemente con una afinidad de como mucho 3 nM, más preferentemente con una afinidad de como mucho 2 nM y, opcionalmente, con una afinidad de como mucho aproximadamente 1 nM. La avidez de anticuerpos bivalentes, por supuesto, será superior a la afinidad. Los anticuerpos bivalentes se unen a KDR preferentemente con una avidez superior a 0,5 nM, más preferentemente superior a 0,25 nM y, opcionalmente, superior a 0,1 nM.

Los anticuerpos de la invención neutralizan KDR (Véanse los Ejemplos). En la presente memoria descriptiva, neutralizar un receptor significa disminuir y/o inactivar la actividad quinasa intrínseca del receptor para transducir una señal. Un ensayo fiable para la neutralización de KDR es la inhibición de la fosforilación del receptor.

La presente invención no está limitada a ningún mecanismo particular de neutralización de KDR. El mecanismo seguido por un anticuerpo no es necesariamente el mismo que el seguido por otro. Algunos mecanismos posibles incluyen impedir la unión del ligando de VEGF al dominio de unión extracelular del KDR e impedir la dimerización u oligomerización de receptores. Sin embargo, no pueden descartarse otros mecanismos.

Los anticuerpos de la invención incluyen, pero sin limitación, anticuerpos de origen natural, fragmentos bivalentes tales como (Fab’)2, fragmentos monovalentes tales como Fab, anticuerpos de cadena sencilla, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de dominio único, anticuerpos de cadena sencilla multivalente, diacuerpos, triacuerpos y similares que se unen específicamente con antígenos.

Los anticuerpos de cadena sencilla monovalente (es decir, scFv) incluyen un fragmento de cadena pesada variable de anticuerpo (VH) unido a un fragmento de cadena ligera variable de anticuerpo (V1) por un engarce peptídico que permite que los dos fragmentos se asocien para formar un sitio de unión a antígeno funcional (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778 (Ladner y col.), documento WO 88/09344, (Huston y col.). El documento WO 92/01047 (McCafferty y col.) describe la presentación de fragmentos scFv en la superficie de paquetes de presentación genética recombinantes solubles, tales como bacteriófagos. Un anticuerpo de cadena sencilla con un engarce (L) puede representarse como VL-L-VH o VH-L-VL.

Cada dominio de los anticuerpos de la presente invención puede ser un dominio variable de cadena ligera o pesada de anticuerpo completo, o puede ser un equivalente funcional o un mutante o derivado de un dominio de origen natural, o un dominio sintético construido, por ejemplo, in vitro usando una técnica tal como la descrita en el documento WO 93/11236 (Griffiths y col.). Por ejemplo, es posible unir entre sí dominios correspondientes a dominios variables de anticuerpo que carezcan de al menos un aminoácido. La característica de caracterización importante es la capacidad de cada dominio para asociarse con un dominio complementario para formar un sitio de unión a antígeno. Por consiguiente, las expresiones “fragmento de cadena ligera/pesada variable” no debería interpretarse que excluyen variantes que no tengan un efecto material sobre cómo funciona la invención.

Los equivalentes funcionales de la invención incluyen polipéptidos con secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales que la secuencia de aminoácidos de las regiones variable o hipervariable de los anticuerpos de KDR de longitud completa. La expresión “sustancialmente la misma” secuencia de aminoácidos se define en el presente documento como una secuencia con una homología de al menos el 70%, preferentemente de al menos aproximadamente el 80% y, más preferentemente, de al menos aproximadamente el 90% con otra secuencia de aminoácidos, según se determinó por el procedimiento de búsqueda FASTA de acuerdo con Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-8 (1988).

Los anticuerpos de dominio único tienen un solo dominio variable que es capaz de unirse eficazmente al antígeno. Se conocen en la técnica ejemplos de anticuerpos en los que a la afinidad y especificidad de unión contribuye principalmente el uno o el otro dominio variable. Véase, por ejemplo, Jeffrey, P.D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

90: 10310-4 (1993), que desvela un anticuerpo anti-digoxina que se une a digoxina principalmente por la cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, pueden identificarse dominios de anticuerpo sencillos que se unan bien a receptores de VEGF. Dichos dominios de anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de anticuerpos de origen natural, o bibliotecas de presentación en fago de Fab o scFv. Se entiende que, para generar un anticuerpo de un solo dominio a partir de un anticuerpo que comprende un dominio VH y VL, pueden desearse ciertas sustituciones de aminoácidos fuera de las regiones CDR para aumentar la unión, expresión o solubilidad. Por ejemplo, puede ser deseable modificar restos aminoacídicos que, de otro modo, estarían enterrados en la interfaz VH-VL.

Más recientemente, se han descubierto en camélidos (camellos, dromedarios y llamas) anticuerpos que son homodímeros de cadenas pesadas. Estos anticuerpos de cadena pesada están desprovistos de cadenas ligeras y del primer dominio constante. (Véase, por ejemplo Muyldermans, S., 2001, J. Biotechnol. 74: 277-302). Los fragmentos de unión a antígeno de tamaño reducido están bien expresados en bacterias, se unen a antígenos con gran afinidad y son muy estables. Las bibliotecas de presentación en fago de anticuerpos de dominio único (es decir, que tienen un solo dominio variable que puede ser un dominio variable de cadena ligera o de cadena pesada) pueden producirse y explorarse de la misma forma que bibliotecas de scFv y Fab. Los armazones para dichos anticuerpos de dominio único pueden ser dominios variables humanos o de ratón modificados. Se señala que los anticuerpos de dominio único pueden unirse a antígeno en una diversidad de modos de unión a antígeno. Es decir, las interacciones de antígeno-anticuerpo primarias no se limitan a los restos aminoacídicos correspondientes a las CDR de anticuerpos que contienen VH-VL, y pueden tenerse en cuenta interacciones de unión fuera de restos de CDR al optimizar las características de unión de dichos anticuerpos.

Los anticuerpos de cadena sencilla carecen de algunos o todos los dominios constantes de los anticuerpos completos de los que proceden. Por lo tanto, pueden superar algunos de los problemas asociados con el uso de anticuerpos completos. Por ejemplo, los anticuerpos de cadena sencilla tienden a estar libres de ciertas interacciones no deseadas entre regiones constantes de cadena pesada y otras moléculas biológicas. Además, los anticuerpos de cadena sencilla son considerablemente más pequeños que los anticuerpos completos y pueden tener una mayor permeabilidad que los anticuerpos completos, permitiendo que los anticuerpos de cadena sencilla se localicen y se unan a sitios de unión a antígeno diana más eficazmente. Además, los anticuerpos de cadena sencilla pueden producirse a relativamente gran escala en células procariotas, facilitando de este modo su producción. Además, el tamaño relativamente pequeño de los anticuerpos de cadena sencilla hace menos probable que provoquen una respuesta inmune no deseada en un destinatario que los anticuerpos completos.

Los engarces peptídicos usados para producir los anticuerpos de cadena sencilla pueden ser péptidos flexibles seleccionados para asegurar que pueda producirse un plegamiento tridimensional apropiado de los dominios VL y VH una vez que están unidos, para mantener la especificidad de unión a molécula diana del anticuerpo anti-KDR de longitud completa. En general, el extremo carboxilo terminal de la secuencia de VL o VH puede unirse covalentemente mediante dicho engarce peptídico al extremo terminal de aminoácido de una secuencia VH o VL complementaria. El engarce es generalmente de 10 a 50 restos aminoacídicos. Preferentemente, el engarce es de 10 a 30 restos aminoacídicos. Más preferentemente, el engarce es de 12 a 30 restos aminoacídicos. Más preferentemente, es un engarce de 15 a 25 restos aminoacídicos. Un ejemplo de dichos péptidos de engarce incluye (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3.

Los anticuerpos de cadena sencilla, que tienen cada uno un dominio VH y VL unido covalentemente por un primer engarce peptídico, pueden unirse covalentemente por al menos un engarce peptídico más para formar un anticuerpo de cadena sencilla multivalente. Los anticuerpos de cadena sencilla multivalentes permiten la construcción de fragmentos de anticuerpo que tengan la especificidad y avidez de anticuerpos completos, pero carezcan de las regiones constantes de los anticuerpos de longitud completa.

Los anticuerpos multivalentes pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos. El término especificidad se refiere al número de tipos diferentes de determinantes antigénicos a los que puede unirse un anticuerpo particular. Si el anticuerpo se une a un solo tipo de determinante antigénico, el anticuerpo es monoespecífico. Si el anticuerpo se une a diferentes tipos de determinantes antigénicos, entonces el anticuerpo es multiespecífico.

Por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla multivalente biespecífico permite el reconocimiento de dos tipos diferentes de epítopos. Los epítopos pueden estar ambos en el KDR. Como alternativa, un epítopo puede estar en el KDR y el otro epítopo puede estar en otro antígeno.

Cada cadena de un anticuerpo de cadena sencilla multivalente incluye un fragmento de cadena ligera variable y un fragmento de cadena pesada variable y está unido por un engarce peptídico a al menos otra cadena. El engarce peptídico está compuesto por al menos quince restos aminoacídicos. El número máximo de restos aminoacídicos es de aproximadamente cien. En una realización preferida, el número de dominios VL y VH es equivalente. Preferentemente, el engarce peptídico (L1) que une los dominios VH y VL para formar una cadena y el engarce peptídico (L2) que une dos o más cadenas para formar un scFv multivalente tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos.

Por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla bivalente puede representarse de la forma siguiente: VL-L1-VH-L2-VLL1-VH; o VL-L1-VH-L2-VH-L1-VH; o VH-L1-VL-L2-VH-L1-VL; o VH-L1-VL-L2-VL-L1-VH.

Los anticuerpos de cadena sencilla multivalentes que son trivalentes o más tienen uno o más fragmentos de anticuerpo unidos a un anticuerpo de cadena sencilla bivalente por engarces peptídicos adicionales. Un ejemplo de un anticuerpo de cadena sencilla trivalente es:

VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH.

Dos anticuerpos de cadena sencilla pueden combinarse para formar un diacuerpo, también conocido como dímero bivalente. Los diacuerpos tienen dos cadenas y dos sitios de unión y pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. Cada cadena del diacuerpo incluye un dominio VH conectado a un dominio VL. Los dominios están conectados con engarces que son lo bastante cortos para evitar el emparejamiento entre dominios en la misma cadena, dirigiendo de este modo el emparejamiento entre dominios complementarios en diferentes cadenas para recrear los dos sitios de unión a antígeno. Por consiguiente, una cadena de un diacuerpo biespecífico comprende una VH de una primera especificidad y una VL de una segunda especificidad, mientras que la segunda cadena comprende una VH de la segunda especificidad y una VL de la primera especificidad. El engarce peptídico incluye al menos cinco restos aminoacídicos y no más de diez restos aminoacídicos, por ejemplo, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2. (SEC ID Nº: 19.) La estructura del diacuerpo es rígida y compacta. Los sitios de unión a antígeno están en extremos opuestos de la molécula.

Tres anticuerpos de cadena sencilla pueden combinarse para formar triacuerpos, también conocidos como trímeros trivalentes. Los triacuerpos se construyen con el extremo de aminoácido terminal de un dominio VL o VH directamente fusionado al extremo carboxilo terminal de un dominio VL o VH, es decir, sin ninguna secuencia de engarce. El triacuerpo tiene tres cabezas de Fv con los polipéptidos dispuestos de una forma cíclica cabeza con cola. Una conformación posible del triacuerpo es plana, con los tres sitios de unión localizados en un plano en un ángulo de 120 grados entre ellos. Los triacuerpos pueden ser monoespecíficos, biespecíficos y triespecíficos.

Preferentemente, los anticuerpos de la presente invención contienen las seis regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo completo, aunque también son funcionales anticuerpos que contienen menos que todas dichas regiones, tal como tres, cuatro o cinco CDR.

Para minimizar la inmunogenicidad de anticuerpos que se unen a receptores de VEGF, la presente invención proporciona anticuerpos que comprenden secuencias de dominio constante y variable humano. Los anticuerpos proceden de una fuente humana y se unen a un dominio extracelular de KDR y neutralizan la activación del receptor. Puede prepararse ADN que codifica anticuerpos humanos por recombinación de ADN que codifica regiones constantes humanas y ADN que codifica regiones variables derivadas de seres humanos. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden obtenerse por exploración de bibliotecas que consisten en combinaciones de dominios variables de cadena pesada y cadena ligera humana. Los ácidos nucleicos a partir de los que se expresan los anticuerpos pueden mutarse somáticamente o ser secuencias de línea germinal derivadas de linfocitos B sin sensibilización previa.

El ADN que codifica anticuerpos humanos puede prepararse por recombinación de ADN que codifica regiones constantes y regiones variables humanas, distintas de CDR, derivadas sustancialmente o exclusivamente de las regiones de anticuerpo humano correspondientes, y ADN que codifica CDR derivadas de un ser humano.

Las fuentes adecuadas de ADN que codifican fragmentos de anticuerpos incluyen cualquier célula, tal como hibridomas y células de bazo, que exprese el anticuerpo de longitud completa. Otra fuente son anticuerpos de cadena sencilla producidos a partir de una biblioteca de presentación en fago como se conoce en la técnica.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser o pueden combinar miembros de cualquier clase de inmunoglobulina, tal como IgG, IgM, IgA, IgD, o IgE, y las subclases de las mismas.

La proteína usada para identificar anticuerpos de unión a VEFGR de la invención es habitualmente KDR, y normalmente está limitada al domino extracelular de KDR. El dominio extracelular de KDR puede estar libre o conjugado con otra molécula.

En los ejemplos a continuación se aislaron anticuerpos anti-KDR de alta afinidad que bloquean la unión de VEGF a KDR a partir de una biblioteca de presentación en fago construida a partir de genes de la región variable de cadena ligera y cadena pesada humana. Más del 90% de los clones recuperados después de tres rondas de selección son específicos para KDR. Las afinidades de unión para KDR de los Fab explorados están en el intervalo nanomolar, que son tan elevadas como las de varios anticuerpos monoclonales anti-KDR bivalentes producidos usando la tecnología de hibridomas.

Los anticuerpos de la presente invención pueden fusionarse a restos aminoacídicos adicionales. Dichos restos pueden ser una etiqueta peptídica, quizá para facilitar el aislamiento, o pueden ser una secuencia señal para la secreción del polipéptido a partir de una célula huésped tras la síntesis. Convenientemente, se usan péptidos líder secretores, que son aminoácidos unidos al extremo N-terminal de un polipéptido para dirigir el movimiento del polipéptido fuera del citosol.

La presente invención también proporciona ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con la invención y diversos repertorios de dicho ácido nucleico.

Los anticuerpos de la invención neutralizan la activación de KDR. Una medida de la neutralización de KDR es la inhibición de la actividad tirosina quinasa del receptor. La inhibición de tirosina quinasa puede determinarse usando procedimientos bien conocidos. Los anticuerpos de la presente invención generalmente causan la inhibición o regulación de acontecimientos de fosforilación. Por consiguiente, los ensayos de fosforilación son útiles en la determinación de anticuerpos útiles en el contexto de la presente invención. La inhibición de tirosina quinasa puede determinarse midiendo el nivel de autofosforilación del receptor de quinasa recombinante y/o la fosforilación de sustratos naturales o sintéticos. La fosforilación puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo específico para fosfotirosina en un ensayo de ELISA o en una transferencia de western. Algunos ensayos para actividad tirosina quinasa se describen en Panek y col., J. Pharmacol. Exp. Thera, 283: 1433-44 (1997) y Batley y col, Life Sci., 62: 143-50 (1998).

Además, pueden utilizarse procedimientos para detección de la expresión de proteína, en los que las proteínas que se están midiendo están reguladas por la actividad tirosina quinasa de KDR. Estos procedimientos incluyen inmunohistoquímica (IHC) para la detección de la expresión de proteína, hibridación in situ fluorescente (FISH) para la detección de la amplificación génica, ensayos de unión a radioligando competitivos, técnicas de inmunotransferencia de matriz sólida, tales como transferencias de Northern y Southern, reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) y ELISA. Véase, por ejemplo, Grandis y col., Cancer, 78: 1284-92. (1996); Shimizu y col., Japan J. Cancer Res., 85: 567-71 (1994); Sauter y col., Am. J. Path., 148: 1047-53 (1996); Collins, Glia, 15: 289-96 (1995); Radinsky y col., Clin. Cancer Res., 1: 19-31 (1995); Petrides y col., Cancer Res., 50: 3934-39 (1990); Hoffmann y col., Anticancer Res., 17: 4419-26 (1997); Wikstrand y col, Cancer Res., 55: 3140-48 (1995).

Pueden utilizarse ensayos in vivo. Por ejemplo, puede observarse inhibición de receptor tirosina quinasa mediante ensayos mitogénicos usando líneas celulares estimuladas con ligando de receptor en presencia y ausencia de inhibidor. Por ejemplo, pueden usarse células HUVEC (ATCC) estimuladas con VEGF para ensayar la inhibición de VEGFR. Otro procedimiento implica ensayar la inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan VEGF usando, por ejemplo, células tumorales humanas inyectadas en un ratón. Véase la Patente de Estados Unidos Nº

6.365.157 (Rockwell y col.).

En los procedimientos de la presente invención, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención se administra a un mamífero que lo necesite. El término “administrar”, como se usa en la presente memoria, significa administrar los anticuerpos de la presente invención a un mamífero por cualquier procedimiento que pueda conseguir el resultado buscado. Pueden administrarse, por ejemplo, por vía intravenosa o por vía intramuscular. Aunque los anticuerpos humanos de la invención son particularmente útiles para la administración a seres humanos, pueden administrarse a otros mamíferos también. El término “mamífero”, como se usa en el presente documento, pretende incluir, pero sin limitación, seres humanos, animales de laboratorio, mascotas domésticas y animales de granja. La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de anticuerpo de la presente invención que, cuando se administra a un mamífero, es eficaz para producir el efecto terapéutico deseado, tal como inhibiendo la actividad quinasa.

Aunque sin desear quedar ligado a mecanismo particular alguno, las enfermedades y afecciones que pueden tratarse o prevenirse mediante los presentes procedimientos incluyen, por ejemplo, aquellas en las que una angiogénesis patógena o el crecimiento de un tumor se estimula a través de un bucle autocrino y/o paracrino de VEGFR.

La neutralización de la activación de un receptor de VEGF en células endoteliales o no endoteliales, tales como células tumorales, puede realizarse in vitro o in vivo. La neutralización de la activación por VEGF de un receptor de VEGF en una muestra de células que expresan receptor de VEGF comprende poner en contacto las células con un antagonista, por ejemplo, un anticuerpo de la invención. Las células se ponen en contacto in vitro con el antagonista, por ejemplo, el anticuerpo, antes de, simultáneamente o después de añadir VEGF a la muestra de célula.

In vivo, un anticuerpo de la invención se pone en contacto con un receptor de VEGF por administración a un mamífero, preferentemente un ser humano. Un procedimiento de neutralización in vivo es útil para inhibir el crecimiento de tumores, la angiogénesis asociada con el crecimiento de tumores u otra afección patológica asociada con la angiogénesis, en un mamífero. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención son agentes inmunoterapéuticos antiangiogénicos y antitumorales.

Los tumores que pueden tratarse incluyen tumores primarios y tumores metastásicos, así como tumores resistentes al tratamiento. Los tumores resistentes al tratamiento incluyen tumores que dejan de responder o son resistentes al tratamiento con agentes quimioterápicos solamente, anticuerpos solamente, radiación sólo o combinaciones de los mismos. Los tumores resistentes al tratamiento también incluyen tumores que parecen inhibirse por tratamiento con dichos agentes, pero que vuelven a presentarse a los cinco años, a veces hasta diez años o más tiempo después de interrumpirse el tratamiento.

Los anticuerpos de la presente invención son útiles para tratar tumores que expresan receptores de VEGF, especialmente KDR. Dichos tumores son característicamente sensibles al VEGF presente en su entorno, y pueden producir además y estimularse por VEGF en un bucle estimulador autocrino. El procedimiento es por lo tanto eficaz para tratar un tumor sólido o no sólido que no esté vascularizado, o que todavía no esté sustancialmente vascularizado. Los ejemplos de tumores sólidos que pueden tratarse por consiguiente incluyen carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, carcinoma colorrectal, carcinoma pancreático, glioma y linfoma. Algunos ejemplos de dichos tumores incluyen tumores epidermoides, tumores escamosos, tales como tumores de cabeza y cuello, tumores colorrectales, tumores de próstata, tumores de mama, tumores de pulmón incluyendo tumores pulmonares microcíticos y no microcíticos, tumores pancreáticos, tumores de tiroides, tumores de ovario y tumores de hígado. Otros ejemplos incluyen sarcoma de Kaposi, neoplasias del SNC, neuroblastomas, hemangioblastomas capilares, meningiomas y metástasis cerebrales, melanoma, carcinomas y sarcomas gastrointestinales y renales, rabdomiosarcoma, glioblastoma, preferentemente glioblastoma multiforme y leiomiosarcoma. Los ejemplos de cánceres de piel vascularizados para los que son eficaces los antagonistas de la presente invención incluyen carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales y carcinomas de piel que pueden tratarse por supresión del crecimiento de queratinocitos malignos, tales como queratinocitos malignos humanos.

Los ejemplos de tumores no sólidos incluyen leucemia, mieloma múltiple y linfoma. Algunos ejemplos de leucemias incluyen leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfocítica aguda (LLA) y leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia eritrocítica o leucemia monocítica. Algunos ejemplos de linfomas incluyen linfoma de Hodgkin y no Hodgkin.

Los resultados experimentales descritos a continuación demuestran que los anticuerpos de la invención bloquean específicamente la estimulación inducida por VEGF de KDR (VEGFR-2) en células de leucemia. Los estudios in vivo descritos también a continuación muestran que los anticuerpos eran capaces de inhibir significativamente el crecimiento de tumores en ratones atímicos.

Un cóctel de antagonistas de receptores de VEGF, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, proporciona un tratamiento especialmente eficaz para inhibir el crecimiento de células tumorales. El cóctel puede incluir antagonistas de VEGFR distintos de anticuerpos, y puede tener tan pocos como 2, 3 ó 4 antagonistas de receptores, y tantos como 6, 8 ó 10.

En otro aspecto de la invención, se usan anticuerpos anti-KDR para inhibir la angiogénesis. La estimulación de VEGFR del endotelio vascular está asociada con enfermedades angiogénicas y vascularización de tumores. Típicamente, el endotelio vascular se estimula de una forma paracrina por VEGF de otras fuentes (por ejemplo, células tumorales).

Por consiguiente, los anticuerpos anti-KDR humanos son eficaces para tratar a sujetos con tumores o neoplasias vascularizadas o enfermedades angiogénicas. Dichos tumores y neoplasias incluyen, por ejemplo, tumores malignos y neoplasias, tales como blastomas, carcinomas o sarcomas, y tumores y neoplasias altamente vasculares. Los cánceres que pueden tratarse mediante los procedimientos de la presente invención incluyen, por ejemplo, cánceres del cerebro, tracto genitourinario, sistema linfático, estómago, renal, colon, laringe y pulmón y hueso. Los ejemplos no limitantes incluyen además tumores epidermoides, tumores escamosos, tales como tumores de cabeza y cuello, tumores colorrectales, tumores de próstata, tumores de mama, tumores de pulmón, incluyendo adenocarcinoma pulmonar y tumores pulmonares microcíticos y no microcíticos, tumores pancreáticos, tumores de tiroides, tumores de ovario y tumores de hígado. El procedimiento también se usa para el tratamiento de cánceres de piel vascularizados, incluyendo carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales y cánceres de piel que pueden tratarse suprimiendo el crecimiento de queratinocitos malignos, tales como queratinocitos malignos humanos. Otros cánceres que pueden tratarse incluyen sarcoma de Kaposi, neoplasias del SNC (neuroblastomas, hemangioblastomas capilares, meningiomas y metástasis cerebrales), melanoma, carcinomas y sarcomas gastrointestinales y renales, rabdomiosarcoma, glioblastoma, incluyendo glioblastoma multiforme y leiomiosarcoma.

Un aspecto adicional de la presente invención incluye procedimientos de tratamiento o prevención de afecciones patológicas caracterizadas por una angiogénesis excesiva, que implica, por ejemplo, la vascularización y/o inflamación, tales como aterosclerosis, artritis reumatoide (AR), glaucoma neovascular, retinopatía proliferativa, incluyendo retinopatía diabética proliferativa, degeneración macular, hemangiomas, angiofibromas y psoriasis. Otros ejemplos no limitantes de enfermedad angiogénica no neoplásica son retinopatía de prematuridad (fibroplasia retrolenticular), rechazo de injerto corneal, diabetes mellitus insulinodependiente, esclerosis múltiple, miastenia grave, enfermedad de Chron, nefritis autoinmune, cirrosis biliar primaria, pancreatitis aguda, rechazo de aloinjerto, inflamación alérgica, dermatitis de contacto y reacciones de hipersensibilidad retardada, enfermedad inflamatoria del intestino, choque séptico, osteoporosis, artrosis, defectos cognitivos inducidos por inflamación neuronal, síndrome de Osler-Weber, reestenosis e infecciones fúngicas, parasitarias y víricas, incluyendo infecciones por citomegalovirus.

La identificación de dicha enfermedad está bien dentro de la capacidad y conocimiento de un experto en la materia. Por ejemplo, los individuos humanos que estén padeciendo una enfermedad angiogénica o neoplásica clínicamente significativa o que estén en riesgo de desarrollar síntomas clínicamente significativos son adecuados para la administración de los presentes anticuerpos de receptores de VEGF. Un experto en la materia puede determinar fácilmente, por ejemplo, mediante el uso de ensayos clínicos, del examen físico y de la historia médica/familiar si un individuo es un candidato para dicho tratamiento.

Además, se incluye el uso de los presentes anticuerpos in vivo e in vitro para procedimientos de diagnóstico o de investigación que son bien conocidos en la técnica.

Los presentes anticuerpos anti-KDR pueden administrarse para tratamientos terapéuticos a un paciente que padece un tumor o una afección patológica asociada a angiogénesis en una cantidad suficiente para prevenir, inhibir o reducir la progresión del tumor o afección patológica. La progresión incluye, por ejemplo, el crecimiento, invasividad, metástasis y/o reaparición del tumor o afección patológica. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una dosis terapéuticamente eficaz. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del sistema inmune del propio paciente. Los programas de dosificación también variarán con la patología y el estado del paciente y, típicamente, variarán de una sola dosificación en embolada o infusión continua a múltiples administraciones al día (por ejemplo, cada 4-6 horas), o según se indique por el médico que lo trate y la afección del paciente. Debería señalarse, sin embargo, que la presente invención no se limita a ninguna dosis particular.

Pueden administrarse anticuerpos anti-KDR en combinación con uno o más agentes antineoplásicos distintos. Para ejemplos de terapias de combinación, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.217.866 (Schlessinger y col) (Anticuerpos anti-EGFR en combinación con agentes antineoplásicos); documento WO 99/60023 (Waksal y col.) (Anticuerpos anti-EGFR en combinación con radiación). Puede usarse cualquier agente antineoplásico adecuado, tal como un agente quimioterápico o radiación. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen, pero sin limitación, cisplatino, doxorubicina, paclitaxel, irinotecán (CPT-11), topotecán o una combinación de los mismos. Cuando el agente antineoplásico es radiación, la fuente de la radiación puede ser externa (terapia de radiación de haz externo -EBRT) o interna (braquiterapia -BT) al paciente que se esté tratando. La dosis de agente antineoplásico administrado depende de numerosos factores incluyendo, por ejemplo, el tipo de agente, el tipo y la gravedad del tumor que se esté tratando y la vía de administración del agente. Debería enfatizarse, sin embargo, que la presente invención no está limitada a ninguna dosis particular.

Adicionalmente, pueden administrarse anticuerpos anti-KDR de la invención con anticuerpos que neutralicen otros receptores implicados en el crecimiento de tumores o la angiogénesis. Un ejemplo de dicho receptor es el receptor VEGFR-1/Flt-1. En una realización de la invención, un anticuerpo anti-KDR se usa en combinación con un antagonista de receptor que se une específicamente a VEGF-1. Son particularmente preferidas proteínas de unión a antígeno que se unen al dominio extracelular de VEGFR-1 y bloquean la unión por uno o ambos de sus ligandos, VEGF y PIGF, y/o neutralizan la activación inducida por VEGF o inducida por P1GF de VEGFR-1. Por ejemplo, el AcM 6.12 es un scFv que se une a VBGFR-1 expresado en superficie celular y soluble. El scFv 6.12 comprende los dominios VL y VH del anticuerpo monoclonal de ratón AcM 6.12. Una línea celular de hibridoma que produce el AcM

6.12 se ha depositado en la ATCC con el número PTA-3344 de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes y el reglamento conforme al mismo (Tratado de Budapest).

Otro ejemplo de dicho receptor es EGFR. En una realización de la presente invención, se usa un anticuerpo anti-KDR en combinación con un antagonista de EGFR. Un antagonista de EGFR puede ser un anticuerpo que se una a EGFR o un ligando de EGFR e inhiba la unión de EGFR a su ligando. Los ligandos para EGFR incluyen, por ejemplo, EGF, TGF-α anfirregulina, EGF de unión a heparina (HB-EGF) y betarrecululina. Se cree que EGF y TGF-α son los ligandos endógenos principales que dan como resultado la estimulación mediada por EGFR, aunque se ha demostrado que TGF-α es más potente para promover la angiogénesis. Debería apreciarse que el antagonista de EGFR puede unirse externamente a la porción extracelular de EGFR, que puede o no inhibir la unión del ligando, o internamente al dominio tirosina quinasa. Los ejemplos de antagonistas de EGFR que se unen a EGFR incluyen, sin limitación, moléculas biológicas tales como anticuerpos (y equivalentes funcionales de los mismos) específicos para EGFR y moléculas pequeñas, tales como inhibidores de quinasa sintéticos que actúan directamente sobre el dominio citoplasmático de EGFR.

Otros ejemplos de receptores de factor de crecimiento implicados en la oncogénesis son los receptores para factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), factor de crecimiento de tipo insulina (IGFR), factor de crecimiento nervioso (NGFR) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR).

En una realización alternativa adicional, el antagonista de VEGFR puede administrarse en combinación con uno o más adyuvantes adecuados, tales como, por ejemplo, citocinas (IL-10 e IL-13, por ejemplo) u otros inmunoestimulantes. Véase, por ejemplo, Larrivée y col., anteriormente. Debería apreciarse sin embargo, que la administración de un solo anticuerpo anti-KDR es suficiente para prevenir, inhibir o reducir la progresión del tumor de una forma terapéuticamente eficaz.

En una terapia de combinación, el anticuerpo anti-KDR se administra antes, durante o después de comenzar la terapia con otro agente, así como cualquier combinación de los mismos, es decir, antes y durante, antes y después, durante y después, o antes, durante y después de comenzar la terapia con agente antineoplásico. Por ejemplo, el anticuerpo anti-KDR puede administrarse entre 1 y 30 días, preferentemente 3 y 20 días, más preferentemente entre 5 y 12 días antes de comenzar la terapia de radiación.

En la presente invención, puede usarse cualquier procedimiento o vía adecuada para administrar anticuerpos anti-KDR de la invención y, opcionalmente, coadministrar agentes antineoplásicos y/o antagonistas de otros receptores. Las vías de administración incluyen, por ejemplo, administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. La dosis de antagonista administrado depende de numerosos factores incluyendo, por ejemplo, el tipo de antagonistas, el tipo y la gravedad del tumor que se esté tratando y la vía de administración de los antagonistas. Debería enfatizarse, sin embargo, que la presente invención no está limitada a ningún procedimiento o vía de administración particular.

Se señala que un anticuerpo anti-KDR puede administrarse como un conjugado, que se une específicamente al receptor y administra una carga útil tóxica letal después de la internalización del ligando-toxina.

Se entiende que los anticuerpos anti-KDR de la invención, cuando se usan en un mamífero con el fin de una profilaxis o tratamiento, se administrarán en forma de una composición que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que aumenten la vida útil o eficacia de las proteínas de unión. Las composiciones de la inyección pueden, como se sabe bien en la técnica, formularse para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada de la administración de principio activo al mamífero.

También se proporcionan kits para inhibir el crecimiento de tumores y/o la angiogénesis que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-KDR humano. Los kits pueden contener además cualquier antagonista adecuado de, por ejemplo, otro receptor de factor de crecimiento implicado en la oncogénesis o angiogénesis (por ejemplo, VBGPR-1/Flt-1, BGFR, PDGFR, IGFR, NGFR, FGFR, etc., como se ha descrito anteriormente). Como alternativa, o además, los kits pueden comprender además un agente antineoplásico. Los ejemplos de agentes antineoplásicos adecuados en el contexto de la presente invención se han descrito en la presente memoria. Los kits pueden comprender además un adyuvante, habiéndose descrito también ejemplos anteriormente.

Un anticuerpo anti-KDR de la invención puede unirse químicamente o biosintéticamente a uno o más agentes antineoplásicos o antiangiogénicos.

Se contemplan además anticuerpos anti-KDR a los que se unen restos indicadores o diana. Los restos indicadores son los primeros miembros de parejas de unión. Los agentes antineoplásicos, por ejemplo, se conjugan con segundos miembros de dichas parejas y, de este modo, se dirigen al sitio en el que se une el anticuerpo anti-KDR. Un ejemplo común de dicha pareja de unión es avidina y biotina. La biotina se conjuga con un anticuerpo anti-KDR y, de este modo, proporciona una diana para un agente antineoplásico u otro resto que se conjuga con avidina o estreptavidina. Como alternativa, la biotina u otro resto de este tipo se une a un anticuerpo anti-KDR de la invención y se usa como indicador, por ejemplo, en un sistema de diagnóstico en el que un agente productor de señal detectable se conjuga con avidina o.

Por consiguiente, los presentes antagonistas de receptores pueden usarse por lo tanto in vivo e in vitro para procedimientos de investigación, diagnóstico, profilácticos o tratamiento que son bien conocidos en la técnica.

Ejemplos

Los Ejemplos y Ejemplos de referencia que siguen se exponen para contribuir a la comprensión de la invención, pero no pretenden ni debería interpretarse que limiten su alcance de ningún modo. Los ejemplos no incluyen descripciones detalladas de procedimientos convencionales, tales como los empleados en la construcción de vectores y plásmidos, la inserción de genes que codifican polipéptidos en dichos vectores y plásmidos, o la introducción de plásmidos en células huésped. Dichos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la materia y se describen en numerosas publicaciones incluyendo Sambrook, J., y Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Ejemplo I. Producción de Fab humano

Ejemplo I(a). Proteínas y líneas celulares

Se obtuvieron HUVEC de cultivo primario del Dr. S. Rafii en el Cornell Medical Center, Nueva York, y se mantuvieron en medio EBM-2 (Clonetics, Walkersville, MD) a 37 ºC, CO2 al 5%. Las proteínas de fusión solubles, KDR-fosfatasa alcalina (AP), sus variantes de deleción de dominio de inmunoglobulina (Ig) y Flk-1-AP se expresaron en NIH 3T3 transfectadas de forma estable y se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad usando un anticuerpo monoclonal inmovilizado contra AP, como se describe por Lu y col., J. Biol. Chem.

275: 14321-30 (2000). La proteína VEGF165 se expresó en baculovirus y se purificó siguiendo los procedimientos descritos en Zhu y col., Cancer Res. 58: 3209-14 (1998). Las líneas celulares de leucemia, HL60 y HEL se mantuvieron en RPMI que contenía suero fetal de ternera al 10%.

Ejemplo I(b). ELISA de fago

Se escogieron clones TG1 individuales y se cultivaron a 37 ºC en placas de 96 pocillos y se rescataron con fago auxiliar M13K07, como se ha descrito anteriormente. La preparación de fago amplificado se bloqueó con 1/6 volumen de leche al 18%/PB8 a temperatura ambiente durante 1 h y se añadió a placas de microtitulación de 96 pocillos Maxi-sorp (Nunc) revestidas con KDR-AP o AP (1 µg/ml x 100 µl). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 h las placas se lavaron 3 veces con PBST y se incubaron con un conjugado de conejo anti-fago M13-HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Las placas se lavaron 5 veces, se añadió sustrato de peroxidasa TMB (KPL, Gaithersburg, MD) y la absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Ejemplo I(c). Análisis del patrón de BstN I en ADN y secuenciación de nucleótidos

La diversidad de los clones de Fab anti-KDR después de cada ronda de selección se analizó mediante patrones de digestión con enzimas de restricción (es decir, huellas de ADN). El inserto de gen de Fab de clones individuales se amplificó por PCR usando cebadores: PUC19 inverso, 5’ AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’; y fdtet seq, 5’ GTCGTCTTTCCAGACGTTAGT 3’. El producto amplificado se digirió con una enzima de corte frecuente, BstN I, y se analizó en un gel de agarosa al 3%. Las secuencias de ADN de clones representativos de cada patrón de digestión se determinaron por secuenciación con didesoxinucleótidos.

Ejemplo I(d). Expresión y purificación de fragmentos Fab solubles

Se usaron plásmidos de clones individuales para transformar un huésped de E. coli no supresor HB2151. La expresión de los fragmentos Fab en HB2151 se indujo por cultivo de las células en medio 2YTA que contenía isopropil-1-tio-β-D-galactopiranósido 1 mM (IPTG, Sigma) a 30 ºC. Se preparó un extracto periplásmico de las células resuspendiendo el sedimento celular en Tris 25 mM (pH 7,5) que contenía sacarosa al 20% (p/v), NaCl 200 mM, EDTA 1 mM y PMSF 0,1 mM, seguido de incubación a 4ºC con agitación suave durante 1 h. Después de la centrifugación a 15.000 rpm durante 15 min, la proteína Fab soluble se purificó a partir del sobrenadante por cromatografía de afinidad usando una columna de Proteína G siguiendo el protocolo del fabricante (Amersham Pharmacia Biotech).

Ejemplo I(e). Selección de Fab anti-KDR humano a partir de una biblioteca de presentación en fago

Se usó para la selección una gran biblioteca de presentación en fago de Fab humano que contenía 3,7 x 1010 clones (DeHaard y col., J. Biol. Chem. 274: 18218-30 (1999)). La biblioteca consiste en genes de cadena ligera variable y genes de cadena pesada variable de anticuerpo amplificados por PCR fusionados a genes de cadena ligera constante humana (κ y λ) y ADN que codifica el dominio CH1 de cadena pesada de IgG1, respectivamente. Ambas construcciones de cadena ligera y pesada están precedidas por una secuencia señal -pelB para la cadena ligera y secuencia señal de gen III para la cadena pesada. Las construcciones de cadena pesada codifican además una porción de la proteína de gen III para la presentación en fago, una etiqueta de hexahistidina y una etiqueta c-myc de 11 aminoácidos de longitud seguida de un codón ámbar (TAG). Las etiquetas de hexahistidina y c-myc pueden usarse para la purificación o detección. El codón ámbar permite la presentación en fago usando huéspedes supresores (tales como células TG1) o producción de fragmentos Fab en forma soluble cuando se transforman en un huésped no supresor (tal como células HB2151).

La reserva de la biblioteca se cultivó hasta la fase logarítmica, se rescató con fago auxiliar M13-KO7 y se amplificó durante una noche en medio 2YTAK (2YT que contenía 100 µg/ml de ampicilina y 50 µg/ml de kanamicina) a 30 ºC. La preparación de fago se precipitó en PEG al 4%/NaCl 0,5 M, se resuspendió en leche desnatada al 3%/PBS que contenía 500 µg/ml de proteína AP y se incubó a 37 ºC durante 1 h para capturar fagos que presentasen fragmentos Fab anti-AP y bloquear otra unión inespecífica.

Tubos Maxisorp Star revestidos con KDR-AP (10 µg/ml en PBS) (Nunc, Rosklide, Dinamarca) se bloquearon primero con leche al 3%/PBS a 37 ºC durante 1 h y después se incubaron con la preparación de fago a temperatura ambiente durante 1 h. Los tubos se lavaron 10 veces con PBST (PBS que contenía Tween 20 al 0,1%), seguido de 10 veces con PBS. El fago unido se eluyó a temperatura ambiente durante 10 min con 1 ml de una solución recién preparada de trietilamina 100 mM (Sigma, St. Louis, MO). El fago eluido se incubó con 10 ml de células TG1 en fase semilogarítmica a 37 ºC durante 30 min en reposo y 30 min en agitación. Las células TG1 infectadas se sedimentaron y se sembraron en varias placas de 2YTAG grandes y se incubaron durante una noche a 30 ºC. Todas las colonias cultivadas en las placas se rasparon en de 3 a 5 ml de medio 2YTA, se mezclaron con glicerol (concentración final al 10%), se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -70 ºC. Para la siguiente ronda de selección, se añadieron 100 µl de la reserva de fago a 25 ml de medio 2YTAG y se cultivaron hasta fase semilogarítmica. El cultivo se rescató con fago auxiliar M13K07, se amplificó, se precipitó y se usó para la selección siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, con concentraciones reducidas de KDR-AP inmovilizado sobre el inmunotubo y un número aumentado de lavados después del procedimiento de unión.

Se realizaron un total de tres rondas de selección sobre KDR inmovilizado, con concentraciones de proteína y un número de lavados variables después del procedimiento de unión inicial. Después de cada ronda de selección, se escogieron aleatoriamente 93 clones y se ensayaron por ELISA de fago para determinar su unión a KDR. Se escogieron setenta de los 93 clones (75%) después de la segunda selección, y más del 90% de los clones se recuperados después de la tercera selección eran positivos en la unión a KDR, sugiriendo una alta eficacia del procedimiento de selección. Los segmentos de ADN que codifican Fab de los 70 agentes de unión identificados en la segunda selección se amplificaron, se digirieron con BstN I, y se compararon para patrones de huella genética. Se observaron un total de 42 patrones diferentes, indicando una diversidad excelente del Fab anti-KDR aislado. El examen de reactividad cruzada demostró que 19 de los 42 anticuerpos eran agentes de unión a KDR específicos, mientras que los 23 anticuerpos restantes se unían tanto a KDR como a su homólogo murino, Flk-1. Se consiguió una selección adicional con un ensayo de unión a VEGF competitivo en el que se determinó la unión de KDR soluble a VEGF inmovilizado en presencia o ausencia de los fragmentos Fab anti-KDR. El ensayo identificó cuatro clones Fab que eran capaces de bloquear la unión entre VEGF y KDR. Tres eran agentes de unión específicos de KDR y uno presentaba reactividad cruzada con Flk-1. La generación de huellas de ADN y el análisis de secuenciación confirmaron que los cuatro anticuerpos de bloqueo de KDR/VBGF eran diferentes (Figura 1A) con secuencias de aminoácidos y ADN únicas.

Las secuencias de aminoácidos para CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y VL para los cuatro clones de ejemplo de referencia se proporcionan en la Tabla 1.

Tabla 1 -Secuencias de CDR de Fab humanos que se unen a KDR

Clon

CDR1 CDR2 CDR3

Cadena ligera

D2C6

RASQSVSSYLA (SEC ID Nº: 1) DSSNRAT (SEC ID Nº: 2) LQHNTFPFT (SEC ID Nº: 3)

D2H2

RASQGISSRLA (SEC ID Nº: 4) AASSLQT (SEC ID Nº: 5) QQANRFPPT (SEC ID Nº: 6)

DIH4

AGTTTDLTYYDLVS (SEC ID Nº: 7) DGNKRPS (SEC ID Nº: 8) NSYVSSRFYV (SEC ID Nº: 9)

D1F7

SGBTSWGTNTAN (SEC ID Nº: 10) NNNQRPS (SEC ID Nº: 11) AAWDDSLNGHWV (SEC ID Nº: 12)

Cadena pesada

D2C6

GFTFSSYSMN (SEC ID Nº: 13) SISSSSSYIYYADSVKG (SEC ID Nº: 14) VTDAFDI (SEC ID Nº: 15)

D2H2

GFTFSSYSMN (SEC ID Nº: 13) SISSSSSYIYYADSVKG (SEC ID Nº: 14) VTDAFDI (SEC ID Nº: 15)

D1H4

GFTFSSYSMN (SEC ID Nº: 13) SISSSSSYIYYADSVKG (SEC ID Nº: 14) VTDAFDI (SEC ID Nº: 15)

D1F7

GGTFSSYAIS (SEC ID Nº: 16) GGHFIFGTANYAQKFQG (SEC ID Nº: 17) GYDYYDSSGVASPPDY (SEC ID Nº: 18)

Las secuencias completas para las cadenas VH y VL se presentan en el Listado de Secuencias. Para el ejemplo de referencia D1F7, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VH se presentan mediante las SEC ID Nº: 19 y 20, respectivamente, y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 21 y 22.

Para el ejemplo de referencia D2C6, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VH se representan mediante las SEC ID Nº: 23 y 24, respectivamente, y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VL se representan 5 mediante las SEC ID Nº: 25 y 26.

Para el ejemplo de referencia D2H2, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VH se representan mediante las SEC ID Nº: 30 y 31, respectivamente, y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 32 y 33.

Para el ejemplo de referencia D1H4, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VH se representan mediante 10 las SEC ID Nº: 27 y 24, respectivamente, y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 28 y 29.

Se creó una segunda biblioteca combinando la cadena pesada sencilla del ejemplo de referencia D2C6 con una población diversa de cadenas ligeras derivadas de la biblioteca original. Se identificaron diez Fab adicionales, denominados SA1, SA3, SB10, SB5, SC7, SD2, SD5, SF2, SF7 y 1121. Las secuencias de nucleótidos y 15 aminoácidos para VL de los diez Fab están representadas de la forma siguiente. Para el ejemplo de referencia SA1, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 34 y 35. Para el ejemplo de referencia SA3, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 36 y 37. Para el ejemplo de referencia SB10, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 38 y 39. Para el ejemplo de referencia SB5, las secuencias de nucleótidos y 20 aminoácidos para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 40 y 41. Para el ejemplo de referencia SC7, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 42 y 43. Para el ejemplo de referencia SD2, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 44 y 45. Para el ejemplo de referencia SD5, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 46 y 47. Para el ejemplo de referencia SF2, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos 25 para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 48 y 49. Para el ejemplo de referencia SF7, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 50 y 51. Para el ejemplo 1121, las

5

10

15

20

25

30

secuencias de nucleótidos y aminoácidos para VL se representan mediante las SEC ID Nº: 52 y 53. Las secuencias de CDR de VL se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2 -Secuencias de CDR de cadena ligera de Fab humanos que se unen a KDR

Clon

CDR1 CDR2 CDR3

SA1

TGSHSNFGAGTDV (SEC ID Nº: 54) GDSNRPS (SEC ID Nº: 55) QSYDYGLRGWV (SEC ID Nº: 56)

SA3

RASQNINNYLN (SEC ID Nº: 57) AASTLQS (SEC ID Nº: 58) QQYSRYPPT (SEC ID Nº: 59)

SB10

TGSSTDVGNYNYIS (SEC ID Nº: 60) DVTSRPS (SEC ID Nº: 61) NSYSATDTLV (SEC ID Nº: 52)

SBS

TGQSSNIGADYDVH (SEC ID Nº: 63) GHNNRPS (SEC ID Nº: 64) QSYDSSLSGLV (SEC ID Nº: 65)

SC7

RASQDISSWLA (SEC ID Nº: 66) AASLLQS (SEC ID Nº: 67) QQADSFPPT (SEC ID Nº: 68)

SD2

RASQSIKRWLA (SEC ID Nº: 69) AASTLQS (SEC ID Nº: 70) QQANSFPPT (SEC ID Nº: 71)

SD5

SGSRSNIGAEHYEVQ (SEC ID Nº: 72) GDTNRPS (SEC ID Nº: 73) QSYDTSLRGPV (SEC ID Nº: 74)

SF2

TGSSSNIGTGYDVH (SEC ID Nº: 75) AYTNRPS (SEC ID Nº: 76) QSFDDSLNGLV (SEC ID Nº: 77)

SF7

TGSHSNFGAGTDVH (SEC ID Nº: 78) GDTHRPS (SEC ID Nº: 79) QSYDYGLRGWV (SEC ID Nº: 80)

1121

RASQGIDNWLG (SEC ID Nº: 81) DASMLDT (SEC ID Nº: 82) QQAKAFPPT (SEC ID Nº: 83)

Ejemplo de referencia II. Ensayos

Ejemplo de referencia II(a). Unión a KDR cuantitativa y bloqueo de la interacción de KDR/VEGF.

En un ensayo de unión directo, se añadieron diversas cantidades de proteínas Fab solubles a placas de microtitulación Maxi-sorp de 96 pocillos revestidas con KDR y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h, después de lo cual las placas se lavaron 3 veces con PBST. Las placas se incubaron después a temperatura ambiente durante 1 h con 100 µl de un conjugado de conejo anti-anticuerpo Fab humano-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc., West Grove, PA). Las placas se lavaron y se revelaron siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para el ELISA de fago. En un ensayo de bloqueo de KDR/VEGF competitivo, se mezclaron diversas cantidades de proteínas Fab con una cantidad fija de KDR-AP (100 ng) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Las mezclas se transfirieron después a placas de microtitulación de 96 pocillos prerrevestidas con VBGF165 (200 ng/pocillo) y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h adicionales, después de lo cual las placas se lavaron 5 veces y se añadió el sustrato para AP (p-nitrofenil fosfato, Sigma). La absorbancia a 405 nm se midió para cuantificar las moléculas de KDR-AP unidas (8). La CI50, es decir, la concentración de proteína Fab necesaria para una inhibición del 50% de la unión de KDR a VEGF, se calculó después.

Los cuatro clones de bloqueo de VEGF (D2C6, D2H2, D1H4, D1F7) se expresaron como Fab soluble y se purificaron a partir de extractos periplásmicos de E. coli mediante cromatografía de afinidad de Proteína G. El rendimiento de las proteínas Fab purificadas de estos clones variaba de 60 a 400 µg/litro de cultivo. El análisis de SDS-PAGE de cada preparación de Fab purificado producía una sola banda de proteína con el tamaño molecular esperado (Figura 1B).

La Figura 2 muestra la unión dependiente de la dosis de los fragmentos Fab anti-KDR a receptor inmovilizado según se ensayó mediante un ELISA de unión directa. Los clones D2C6 y D2H2 eran agentes de unión más eficaces, seguidos por los clones D1H4 y D1F7. Los cuatro Fab también bloquean la unión de KDR a VEGF inmovilizado (Figura 2B). Las concentraciones de anticuerpo necesarias para un 50% de inhibición de la unión de KDR a VEGF son de aproximadamente 2 nM para los clones D2C6, D2H2 y D1H4 y de 20 nM para el clon D1F7. Sólo el clon D1F7 bloquea la unión del VEGF a Flk-1 (Figura 2C) con una CI50 de aproximadamente 15 nM.

Ejemplo de referencia II(b). Análisis de BIAcore del scFv soluble

Las cinéticas de unión de proteínas Fab solubles a KDR se midieron por resonancia de plasmón superficial usando un biodetector BIAcore (Pharmacis Biosensor). La proteína de fusión KDR-AP se inmovilizó sobre una microplaca detectora y se inyectaron proteínas Fab solubles a concentraciones que variaban de 1,5 nM a 100 nM. Se obtuvieron sensogramas a cada concentración y se evaluaron usando un programa, BIA Evaluation 2.0, para determinar las constantes de velocidad kon y koff. La Kd se calculó a partir de la relación de las constantes de velocidad kofflkon.

Los tres fragmentos Fab específicos de KDR se unen a receptor inmovilizado con una Kd de 2 a 4 nM (Tabla 3). El

5

10

15

20

25

30

35

40

clon con reactividad cruzada, D1F7, tiene una Kd de 45 nM, que es de aproximadamente 10 a 15 veces más débil que las de los clones específicos de KDR. Cabe señalar que, aunque la Kd global para los tres fragmentos Fab específicos de KDR es similar, la cinética de unión individual, es decir, la kon y koff, para estos anticuerpos es bien diferente, por ejemplo, D2C6 posee la velocidad de asociación más rápida mientras que D1H4 tiene la velocidad de disociación más lenta (Tabla 3).

Tabla 3 -Cinética de unión de los cuatro fragmentos Fab anti-KDR humanos neutralizantes

Clon

kon (104 M -1S -1) koff (10 -4S -1) Kd (nM)

Hu-2C6 Fab

27,3 ± 8,6* 5,38 ± 0,54 1,97

Hu-2H2 Fab

12,4 ± 29 4,87 ± 0,18 3,93

Hu-1H4 Fab

5,55 ± 0,59 1,53 ± 0,22 2,76

Hu-1F7 Fab

4,14 ± 1,21 18,7 ± 2,12 45,2

*Todos los números se determinaron mediante análisis de BIAcore y representan la media ± ET de al menos tres determinaciones separadas.

Ejemplo de referencia II(c). Mapeo de epítopos de unión

La producción de variantes de deleción de dominio de tipo Ig extracelular KDR se ha descrito anteriormente (Lu y col. (2000)). En un ensayo de mapeo de epítopos, se inmovilizó primero KDR-AP de longitud completa, fusiones con AP de dos variantes de deleción de dominio de Ig de KDR y Flk-1-AP sobre una placa de 96 pocillos (Nunc) usando un anticuerpo de conejo anti-AP (DAKO-immunoglobulins Glostrup, Dinamarca) como reactivo de captura. Después, la placa se incubó con diversas proteínas Fab anti-KDR a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de incubación con un conjugado de anticuerpo de conejo anti-Fab humano-MP. La placa se lavó y se reveló como se ha descrito anteriormente.

Los epítopos de unión de los fragmentos Fab anti-KDR se mapearon usando el KDR de longitud completa y dos variantes de deleción de dominio de Ig de KDR. KDR(1-3) es una variante de KDR que contiene los tres primeros dominios de Ig N-terminales. KDR (3) es una variante que sólo contiene el tercer domino de Ig. Como se muestra en la Figura 3, los clones D2C6 y D1H4 se unen igual de bien a KDR, KDR(1-3) y KDR(3), localizando por lo tanto su epítopo o epítopos de unión dentro del dominio 3 de Ig. Los clones D2H2 y D1F7 se unen muchos más eficazmente a KDR de longitud completa y KDR (1-3), indicando un epítopo o epítopos de unión más amplios dentro de los dominios de Ig de KDR 1 a 3. Sólo el clon D1F7 presenta reactividad cruzada con Flk-1.

Ejemplo de referencia II(d). Ensayo antimitogénico

Se sembraron HUVEC (5 x 103 células/pocillo) sobre placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (Wallach, Inc., Gaithersburg, MD) en 200 µl de medio BBM-2 sin VEGF, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o factor de crecimiento epidérmico (EGF) y se incubaron a 37 ºC durante 72 h. Se añadieron diversas cantidades de proteínas Fab a pocillos por duplicado y se preincubaron a 37 ºC durante 1 h, después de lo cual se añadió VEGF165 a una concentración final de 16 ng/ml. Después de 18 h de incubación, se añadieron 0,25 µCi de [3H]TdR (Amersham) a cada pocillo y se incubaron durante 4 h adicionales. Las células se lavaron después una vez con PBS, se trataron con tripsina y se recogieron sobre un filtro de vidrio (Printed Filtermat A, Walach) con un recolector de células (Harvester 96, MACH III, TOMTEC, Orange, CT). La membrana se lavó tres veces con H2O y se secó al aire. Se añadió líquido de centelleo y se determinó la radiactividad incorporada en el ADN en un contador de centelleo (Wallach, Contador de Centelleo Microbeta Modelo 1450).

La capacidad del Fab anti-KDR humano para bloquear la actividad mitogénica estimulada por VEGF en HUVEC se muestra en la Figura 4. Los cuatro fragmentos Fab humanos inhibían la síntesis de ADN inducida por VEGF en HUVEC de una forma dependiente de la dosis. La concentración de Fab que inhibía el 50% (CE50) de la incorporación de [3H]-TdR estimulada por VEGF en HUVEC es de aproximadamente 0,5 nM para los clones D2C6 y D1H4, 0,8 nM para el clon D2H2 y 15 nM para el clon D1F7. Los controles incluían VEGF solamente (1500 cpm) y medio sencillo (60 cpm). Se ensayaron pocillos por duplicado. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos separados.

Ejemplo II(e). Ensayo de migración de leucemia

Se lavaron células HL60 y HEL tres veces con medio RPMI 1640 sencillo sin suero y se suspendieron en el medio a 1 x 106/ml. Se añadieron alícuotas de 100 µl de suspensión celular a insertos transpocillo de tamaño de poro de 3 µm para células HL60, o insertos transpocillo de tamaño de poro de 8 µm para células HEL (Costar®, Coming Incorporated, Corning, NY) y se incubaron con las proteínas Fab anti-KDR (5 µg/ml) durante 30 min a 37 ºC.

Después los insertos se pusieron en los pocillos de placas de 24 pocillos que contenían 0,5 ml de RPMI 1640 sin suero con o sin VEGF165. La migración se llevó a cabo a 37 ºC, CO2 al 5% durante 16-18 h para células HL60, o durante 4 h para células HEL. Las células migradas se recogieron de los compartimentos inferiores y se contaron con un contador Coulter (Modelo Z1, Coulter Electronics Ltd., Luton, Inglaterra).

El VEGF indujo migración de células HL60 y HEL de una forma dependiente de la dosis consiguiéndose una estimulación máxima a 200 ng/ml (Figura 5A). Todos los fragmentos Fab anti-KDR inhibían significativamente la migración estimulada por VEGF de células HL60 y HEL (Figura 5B). Como control, un fragmento Fab de C225, un anticuerpo dirigido contra el receptor de BGF, no mostraba un efecto inhibidor significativo en este ensayo.

Ejemplo III. Producción de IgG

Ejemplo III(a). Construcción de vectores para la expresión de IgG

Se construyeron vectores separados para la expresión de cadena pesada y cadena ligera de IgG. Los genes de VL clonados se digirieron y se ligaron en el vector pKN100 (MRC). Los genes de VH clonados se digirieron y se ligaron en el vector pGID105 que contenía el dominio constante de cadena pesada de IgG I (γ) humano. El pKN100 y el pGID105 están disponibles en MRC. Las construcciones se examinaron por digestión con enzima de restricción y se verificaron por secuenciación con didesoxinucleótido. En ambos casos, la expresión está bajo el control del promotor de HCMV y terminaba mediante una secuencia de terminación artificial.

Los genes de cadena ligera y pesada ensamblados se clonaron después en los vectores de expresión Lonza GS pEE6.1 y pEE12.1. Se recombinaron vectores de cadena ligera y pesada en vectores individuales para la transfección estable de células CHO y células NSO. Las células transfectadas se cultivaron en glutamina sin medio y expresaban anticuerpos a niveles tan altos como de 1 g/l.

Ejemplo III(b). Producción y caracterización de IgG anti-KDR humana

Tanto el IMC-2C6 como el IMC-1121 se produjeron en líneas celulares NSO transfectadas de forma estable y cultivadas en condiciones sin suero, y se purificaron a partir de un cultivo celular discontinuo usando cromatografía de afinidad de Proteína A. La pureza de las preparaciones de anticuerpos se analizó mediante SDS-PAGE y las concentraciones se determinaron mediante ELISA, usando un anticuerpo anti-Fc humano como agente de captura y un conjugado de anticuerpo anti-cadena κ humana-peroxidasa de rábano picante (HRP) como agente de detección. Se usó un anticuerpo de uso clínico, IMC-C225, como patrón para la calibración. El nivel de endotoxina de cada preparación de anticuerpo se examinó para asegurar que los productos estuvieran libres de contaminación por endotoxinas.

Se evaluaron anticuerpos anti-KDR para determinar su unión a KDR y el bloqueo de la unión de VBGF. En el ensayo de unión directa, se añadieron diversas cantidades de anticuerpos a placas de microtitulación Maxisorp de 96 pocillos revestidas con KDR (Nunc, Roskilde, Dinamarca) y se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante 1 h, después de lo cual las placas se lavaron 3 veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,1%. Después, las placas se incubaron a TA durante 1 h con 100 µl de un conjugado de conejo anti-FC de IgG humana-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc., West Grove, PA). Las placas se lavaron y se revelaron como anteriormente. Se compararon los anticuerpos humanos IMC-2C6 e IMC-1121 con IMC-1C11 (anticuerpo de ratón específico para KDR) e IMC-C225 (un anticuerpo quimérico específico para EGFR). Los anticuerpos anti-KDR se unen a KDR de una forma dependiente de la dosis, siendo IMC-1121 el agente de unión más fuerte (Figura 6A).

La eficacia de los anticuerpos anti-KDR para bloquear la unión de KDR a VBGF se midió con un ensayo de competición. Se mezclaron diversas cantidades de anticuerpos con una cantidad fija de KDR-AP (100 ng) y se incubaron a TA durante 1 h. Después, las mezclas se transfirieron a placas de microtitulación de 96 pocillos previamente revestidas con VBQF165 (200 ng/pocillo) y se incubaron a TA durante 2 h adicionales, después de lo cual las placas se lavaron 5 veces y se añadió el sustrato para AP (p-nitrofenil fosfatasa, Sigma), seguido por lectura de la absorbancia a 405 nm para cuantificar las moléculas de KDR-AP unidas. La CI50, es decir, la concentración de anticuerpo necesaria para una inhibición del 50% de la unión de KDR a VEGF, se calculó después. Los anticuerpos anti-KDR bloqueaban fuertemente la unión de KDR a VBGF (Figura 6B), con una potencia similar. La CI50 es de aproximadamente 0,8 a 1,0 nM para los tres anticuerpos. El anticuerpo de control, IMC-C225 (anti-EGFR humano) no se une a KDR y no bloquea la interacción de KDR/VEGF.

La afinidad o avidez del anticuerpo se determinó mediante análisis de BIAcore, como anteriormente. Las cinéticas de unión, es decir, la constante de la velocidad de asociación (kon) y la constante de la velocidad de disociación (koff) de los anticuerpos anti-KDR se midieron y se calculó la constante de disociación Kd (Tabla 4).

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 4 -Cinética de unión de anticuerpos anti-KDR

Anticuerpo

kon (104 M -1S -1) koff(10 -4S -1) Kd(nM)

scFv p1C11 de referencia

7,7 ± 2,1* 1,0 ± 0,09 1,4+0,3

IMC-1C11 de referencia

13,4 ± 2,9 0,37 ± 0,13 0,27 ± 0,06

Fab Hu-2C6 de referencia

17,1 ± 5,7 5,5 ± 0,76 3,6 ± 1,7

IgG IMC-2C6 de referencia

21,2, ± 8,1 0,43 ± 0,03 0,20 ± 0,01

Fab Hu-1121

29,6 ± 7,3 0,31 ± 0,06 0,11 ± 0,02

IgG IMC-1121

47,9 ± 2,4 0,25 ± 0,04 0,05 ± 0,01

*Todos los números se determinaron mediante análisis de BIAcore y representan la media ± ET de al menos tres determinaciones por separado.

IMC-1C11 se une a KDR inmovilizado con una constante de disociación (Kd) de 0,27 nM, aproximadamente 5 veces superior a su homólogo Fab. La Kd para IMC-2C6 es de 0,2 nM, que es aproximadamente 18 veces superior a la del Fab Hu-2C6 monovalente principalmente debido a una mejora en la velocidad de disociación. La maduración por afinidad de Hu-2C6 conducía a Fab Hu-1121 con una mejora de 33 veces en la Kd (de 3,6 nM a 0,11 nM). La conversión de Fab Hu-1121 en IgG bivalente, IMC-1121, dio como resultado un aumento de aproximadamente 2 veces en la actividad de unión global.

Ejemplo III(c). Inhibición de la unión de VEGF a células y de la mitogénesis estimulada por VEGF de HUVBC

En un radioinmunoensayo basado en células, se mezclaron diversas cantidades de anticuerpos anti-KDR con una cantidad fija (2 ng) de VEGF165 marcado con 125I (R & D Systems) y se añadió a una monocapa confluente al 80-90% de HUVEC cultivadas en una placa de microtitulación de 96 pocillos. La placa se incubó a TA durante 2 h, se lavó 5 veces con PBS frío y se contaron las cantidades de radiactividad que se unían a las células endoteliales. Como se muestra en la Figura 7A, los anticuerpos anti-KDR competían eficazmente con VBGF radiomarcado por la unión a HUVEC. Los datos representan las medias ± DT para determinaciones por triplicado.

Los anticuerpos también bloqueaban la mitogénesis de HUVEC estimulada por VEGF de una forma dependiente de la dosis (Figura 7B). Como se ha descrito anteriormente para los Fab, diversas cantidades de los anticuerpos anti-KDR se preincubaron primero con HUVEC privadas de factor de crecimiento (5 x 103 células/pocillo) a 37 ºC durante 1 h, después de lo cual se añadió VEGF165 a una concentración final de 16 ng/ml. Después de 18 h de incubación, se añadió 0,25 µCi de [3H]-TdR (Amersham) a cada pocillo y se incubó durante 4 h adicionales. Las células se lavaron, se recogieron y la radiactividad incorporada en el ADN se determinó en un contador de centelleo. IMC-1121, el anticuerpo con la mayor afinidad, es el inhibidor más eficaz con una DE50, es decir, la concentración que da como resultado un 50% de inhibición de la incorporación de [3H]-TdR, de aproximadamente 0,7 nM, en comparación con la de 1,5 nM para tanto IMC-1C11 como IMC-2C6.

Ejemplo IV. Inhibición de células de leucemia y progresión de la leucemia

Ejemplo IV(a). Expresión de VEGF y BDR por células de leucemia

Se examinó la expresión de VEGF y KDR mediante RT-PCR en tres líneas celulares de leucemia mieloide: HL60 (promielocítica); HEL (megacariocítica); y U937 (histiocítica). Se usaron los cebadores siguientes para amplificar VEGF, Flt-1, KDR, y el control interno, α-actina: VEGF directo: 5’-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3’ (SEC ID Nº: 86), e inverso: 5’-CCTGGTGAGAGATCTGGTTC-3’ (SEC ID Nº: 87); Flt-1 directo: 5’-TTTGTGATTTTGGCCTTGC-3’ (SEC ID Nº: 88), e inverso: 5’-CAGGCTCATGAACTTGAAAGC-3’ (SEC ID Nº: 89); KDR directo: 5’GTGACCAACATGGAGTCGTG-3’ (SEC ID Nº: 90), e inverso: 5’-CCAGAGATTCCATGCCACTT-3’ (SEC ID Nº: 91); α-actina directo: 5’-TCATGTTTGAGACCTTCAA-3’ (SEC ID Nº: 92), e inverso: 5’-GTCTTTGCGGATGTCCACG-3’ (SEC ID Nº: 93). Los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1%. Como se muestra en la Figura 8A, las tres líneas son positivas para la expresión de VEGF, y HL60 y HEL, pero no U937, también son positivas para la expresión de KDR. Las tres líneas celulares también son positivas para la expresión de Flt-1, según se detectó mediante RT-PCR (no se muestra).

La producción de VEGF se examinó para las tres líneas celulares de leucemia cultivadas en FCS al 10% o condiciones sin suero. Las células de leucemia se recogieron, se lavaron con medio RPMI 1640 sencillo y se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 x 105/ml con o sin adición de FCS al 10%. Las células se cultivaron a 37 ºC durante 72 h, después de lo cual se contó el número total de células usando un contador Coulter (Modelo Z1, Coulter Electronics Ltd., Luton, Inglaterra) y la concentración de VEGF en el sobrenadante se determinó usando un kit de ELISA (Biosource International, Camarillo, CA). Las células de leucemia secretan una cantidad significativa de VEGF cuando se cultivan in vitro (Figura 8B) y las células tanto HL60 como U937 producían más VEGF en condiciones de privación de suero.

Ejemplo IV(b). Inhibición de la migración de células de leucemia inducida por VEGF

Se realizaron ensayos de migración de células de leucemia como se ha descrito en el Ejemplo II(e) con las tres líneas celulares de leucemia. La migración se llevó a cabo durante 16-18 h para células HL60 o durante 4 h para células HEL y U937.

Las tres líneas celulares de leucemia migran en respuesta a VEGF (Figura 9). La incubación con anticuerpos anti-KDR inhibía, de una forma dependiente de la dosis, la migración inducida por VEGF de células HL60 y HEL (Figura 9A y 9B), pero no tenían efecto sobre la migración de células U937 que no expresan KDR (Figura 9C). Sin embargo, la migración inducida por VEGF de células U937 se inhibía eficazmente por un anticuerpo anti-Flt-1 humano, el AcM 612 (Figura 9C). Como se esperaba, el anticuerpo anti-EGFR, IMC-C225, no mostraba efectos sobre la migración inducida por VEGF de células de leucemia humanas.

Ejemplo IV(b). Inhibición del desarrollo de leucemia in vivo

Se usaron ratones NOD-SCID del mismo sexo (hembras) de 6 a 8 semanas de edad en todos los experimentos. Los

137Cs

ratones se irradiaron con 3,5 Gy de una fuente de rayos gamma a una velocidad de dosis de aproximadamente 0,9 Gy/min y se inocularon por vía intravenosa con 2 x 107 células HL60. Tres días después de la inoculación de tumor, se trataron grupos de 7 a 9 ratones dos veces por semana con diversas dosis de anticuerpos IMC-1C11, IMC-2C6 o IMC-1121 mediante inyección intraperitoneal. Se observó a los ratones diariamente para determinar signos de toxicidad y se registró el tiempo de supervivencia. Para el análisis estadístico, se usó el ensayo de Mann-Whitney Rank Sum unilateral no paramétrico.

Todos los ratones no tratados murieron en 17 días (Figura 10, tiempo medio de supervivencia, 14 ± 3 días). A esta alta carga tumoral, el tratamiento con IMC-1C11 a 200 µg/ratón/inyección aumentaba moderadamente la supervivencia, pero todos los ratones morían en 35 días (supervivencia media: 21 ± 7 días; mediana de la supervivencia 19 días, respectivamente. p = 0,03 en comparación con el grupo de control). El IMC-2C6 proporcionado a la misma dosis de 200 µg/ratón/inyección prolongaba significativamente la supervivencia de ratón a 34 ± 12 días (mediana = 29 días. p < 0,01 en comparación con el control y p = 0,01 en comparación con el grupo tratado con IMC-1C11). El anticuerpo con la mayor afinidad, IMC-1121, demostró un efecto antileucemia mucho más fuerte, particularmente con respecto a IMC-1C11. Los ratones tratados con IMC-1121 sobrevivían 63 ± 12 días (mediana = 60 días. p < 0,001 en comparación con los grupos tratados tanto con IMC-1C11 como con IMC-2C6). A una menor dosis de anticuerpo ensayado (100 µg/ratón/inyección), el IMC-1121 también era más eficaz. Los ratones tratados con la menor dosis de IMC-1121 sobrevivían 46 ± 16 días (mediana = 41 días). No se observaron toxicidades manifiestas en ninguno de los animales tratados con anticuerpo durante todo el transcurso del experimento.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> ImClone Systems Incorporated

<120> Anticuerpos humanos específicos contra KDR y usos de los mismos

<130> 11245/47876

<140> PCT/US03/06459

<141> 04-03-2003

<150> 60/361.783

<151> 04-03-2002

<160> 93

<170> wordPerfect 8.0 para windows

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Humana

<400> 1

<210> 2

imagen1

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 2

imagen1

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Humana

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Humana

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Humana

<400> 6

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> Humana

<400> 7

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana <400> 8

imagen1

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Humana

<400> 9

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> Humana

<400> 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 11

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> Humana

<400> 12

<210> 13

<211> 10

<212>PRT

<213> Humana

<400> 13

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> Humana

<400> 14 <210> 15

imagen1

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> Humana

<400> 16

<210> 17

<211> 18

<212> PRT

<213> Humana

<400> 17

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> Humana

<400> 18

imagen1

<210> 19

<211> 375

<212> ADN

<213> Humana

<400> 19

imagen1

<210> 20

<211> 125

<212> PRT

<213> Humana

<400> 20

imagen2

<210> 21

<211> 333

<212> ADN

<213> Humana

<400> 21

imagen1

5

<210> 22

<211> 111

<212> PRT

<213> Humana

10

<400> 22

imagen1

15 <210> 23

<211> 348

<212> ADN

<213> Humana

20 <400> 23

imagen1

<210> 24

<211> 116

<212> PRT

<213> Humana

<400> 24

imagen2

<210> 25

<211> 321

<212> ADN

<213> Humana

<400> 25

imagen3

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> Humana

<400> 26

imagen1

15

<210> 27

<211> 348

<212> ADN

<213> Humana

20

<400> 27

imagen1

<210> 28

<211> 330

<212> ADN

<213> Humana

<400> 28

imagen2

<210> 29

<211> 110

<212> PRT

<213> Humana

<400> 29

imagen1

10 <210> 30

<211> 348

<212> ADN

<213> Humana

15 <400> 30

imagen1

<210> 31

<211> 116

<212> PRT

<213> Humana

<400> 31

imagen4

<212> ADN

<213> Humana

<400>

32 15

<210> 33

<211> 107

<212> PRT

<213> Humana

<400> 33

<210> 34

<211> 333

<212> ADN

<213> Humana

<400> 34

<210> 36

<211> 321

<212> ADN

<213> Humana

<400> 36

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> Humana

<400> 37

<212> ADN

<213> Humana

<400>

38 10

imagen1

imagen3

imagen1

15

<210> 35

<211> 111

<212> PRT

<213> Humana

20

<400> 35

imagen1

imagen2

imagen5

imagen1

<210> 39

<211> 110

<212> PRT

<213> Humana

<400> 39

imagen1

<210> 40

<211> 333

<212> ADN

<213> Humana

<400> 40

imagen2

<210> 41

<211> 111

<212> PRT

<213> Humana

<400> 41

imagen1

<210> 42

<211> 321

<212> ADN

<213> Humana

<400> 42

imagen2

<210> 43

<211> 107

<212> PRT

<213> Humana

<400> 43

imagen1

<210> 44

<211> 321

<212> ADN

<213> Humana

<400> 44

imagen2

<210> 45

<211> 107

<212> PRT

<213> Humana

<400> 45

imagen1

<210> 46

<211> 333

<212> ADN

<213> Humana

<400> 46

imagen2

<210> 47

<211> 111

<212> PRT

<213> Humana

<400> 47

imagen1

<210> 48

<211> 333

<212> ADN

<213> Humana

<400> 48

imagen2

<210> 49

<211> 111

<212> PRT

<213> Humana

<400> 49

imagen1

<210> 50

<211> 333

<212> ADN

<213> Humana

<400> 50

imagen2

<210> 51

<211> 111

<212> PRT

<213> Humana

<400> 51

imagen1

<210> 52

<211> 321

<212> ADN

<213> Humana

<400> 52

imagen2

<210> 53

<211> 107

<212> PRT

<213> Humana

<400> 53

imagen1

<210> 54

<211> 13

<212> PRT

<213> Humana

<400> 54

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 55

<210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> Humana

<400> 56

<210> 57

<211> 11

<212> PRT

<213> Humana

<400> 57

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 58

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 58

imagen1

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> Humana

<400> 59

<210> 60

<211> 14

<212> PRT

<213> Humana

<400> 60

imagen1

imagen1

<210> 61

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 61

<210> 62

<211> 10

<212> PRT

<213> Humana

<400> 62

<210> 63

<211> 14

<212> PRT

<213> Humana

<400> 63

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 64 <210> 65

imagen1

<211> 11

<212> PRT

<213> Humana

<400> 65

imagen1

<210> 66

<211> 11

<212> PRT

<213> Humana

<400> 66

<210> 67

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 67

<210> 68

<211> 9

<212> PRT

<213> Humana

<400> 68

<210> 69

<211> 11

<212> PRT

<213> Humana

<400> 69

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 70

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 70 <210> 71

imagen1

<211> 9

<212> PRT

<213> Humana

<400> 71

<210> 72

<211> 14

<212> PRT

<213> Humana

<400> 72

imagen1

imagen1

<210> 73

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 73

<210> 74

<211> 11

<212> PRT

<213> Humana

<400> 74

<210> 75

<211> 14

<212> PRT

<213> Humana

<400> 75

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 76

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 76

imagen1

<210> 77

<211> 11

<212> PRT

<213> Humana <400> 77

imagen1

<210> 78

<211> 14

<212> PRT

<213> Humana

<400> 78

imagen1

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 79

<210> 80

<211> 11

<212> PRT

<213> Humana

<400> 80

<210> 81

<211> 11

<212> PRT

<213> Humana

<400> 81

<210> 82

<211> 7

<212> PRT

<213> Humana

<400> 82

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 83

<211> 9

<212> PRT

<213> Humana

<400> 83

imagen1

<210> 84

<211> 2351

<212> ADN

<213> Humana

<400> 84

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 85

<211> 764

<212> PRT

<213> Humana

<400> 85

48

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 86

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de amplificación para VEGF

<400> 86

imagen1

<210> 87

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de amplificación para VEGF

<400> 87

imagen1

<210> 88

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de amplificación para Flt-1

<400> 88

imagen1

<210> 89

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de amplificación para Flt-1

<400> 89

imagen1

<210> 90

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de amplificación para KDR

<400> 90

imagen1

<210> 91

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de amplificación para KDR

<400> 91

imagen1

<210> 92

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de amplificación para KDR

<400> 92

imagen1

<210> 93

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de amplificación para KDR

<400> 93

imagen1

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une selectivamente al receptor que contiene el dominio de inserto quinasa (KDR) humano, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende regiones determinantes de complementariedad representadas por la SEC ID Nº: 81 en la CDRL1; la SEC ID Nº: 82 en la CDRL2; la SEC ID Nº: 83 en la CDRL3; la SEC ID Nº: 13 en la CDRH1; la SEC ID Nº: 14 en la CDRH2; y la SEC ID Nº: 15 en la CDRH3.

2. 2.

   El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera representado por la SEC ID Nº: 53 y un dominio variable de cadena pesada representado por la SEC ID Nº: 24.

3. 3.

   El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo de cadena sencilla, un Fab, un Fv de cadena sencilla, un diacuerpo y un triacuerpo.

4. 4.

   Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. 5.

   El polinucleótido de la reivindicación 4, en el que la secuencia de nucleótidos comprende la SEC ID Nº: 52.

6. 6.

   Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5.

7. 7.

   Una célula huésped recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 6.

8. 8.

   La célula huésped recombinante de la reivindicación 7, que produce un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 24 y un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 53.

9. 9.

   Un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en terapia.

10. 10.

    Un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de enfermedades neoplásicas.

11. 11.

    Un anticuerpo para el uso de la reivindicación 10, en el que la enfermedad neoplásica es un tumor del colon, un tumor de mama o un tumor no sólido.

12. 12.

    Un anticuerpo para el uso de la reivindicación 10 u 11, en el que la enfermedad neoplásica es un tumor que sobreexpresa KDR.

13. 13.

    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. 14.

    Un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso antes, durante o después de comenzar la terapia con otro agente seleccionado de un antagonista de VEGFR-1, un antagonista de EGFR, un agente quimioterápico o radiación en el tratamiento de una enfermedad neoplásica.