ES2347543T3

ES2347543T3 - Anticuerpos humanos especificos para kdr y sus usos.

Info

Publication number: ES2347543T3
Application number: ES03711375T
Authority: ES
Inventors: Zhenping Zhu
Original assignee: ImClone LLC
Current assignee: ImClone LLC
Priority date: 2002-03-04
Filing date: 2003-03-04
Publication date: 2010-11-02
Anticipated expiration: 2023-03-04
Also published as: EP1487856B1; CY2015018I1; EP2298346A3; PT1487856E; SI1487856T1; CA2478169C; SI1916001T1; DK1487856T3; US20090142358A1; EP1916001A3; AU2003213687A8; CY1111141T1; EP1487856A4; FR15C0034I2; BE2015C027I2; EP1916001A2; CY1111629T1; EP1487856A2; HUS1500025I1; WO2003075840A2

Abstract

Anticuerpo IgG bivalente anti-KDR, en el que el anticuerpo comprende cadenas ligeras de IgG humana que comprenden cada una un dominio variable representado por ID. SEC. Nº 26 y cadenas pesadas de IgG humana que comprenden cada una un dominio variable representado por ID. SEC. Nº 24.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está dirigida a anticuerpos humanos que se unen al KDR, que bloquean la unión del KDR al receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y que neutralizan la activación del KDR. Los anticuerpos se utilizan para tratar enfermedades neoplásicas y trastornos hiperproliferativos y pueden utilizarse solos o en combinación con otros antagonistas de VEGFR y con antagonistas del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La angiogénesis es un proceso altamente complejo de desarrollo de vasos sanguíneos nuevos que implica la proliferación y la migración de conjuntos organizados de células en estructuras tubulares, la infiltración de tejidos por células endoteliales de los capilares de vasos sanguíneos preexistentes, la unión de organizaciones tubulares formadas nuevas a sistemas vasculares de circuitos cerrados y la maduración de los vasos capilares formados nuevos.

La angiogénesis es importante en los procesos fisiológicos normales que incluyen el desarrollo embrionario, el crecimiento folicular y la curación de heridas, así como en afecciones patológicas tales como el crecimiento tumoral y en enfermedades no neoplásicas que implican neovascularización anormal, incluido el glaucoma neovascular (Folkman, J. and Klagsbrun, M., Science, 235: 442-447 (1987). Otros estados de enfermedad incluyen, pero no están limitados a, las enfermedades neoplásicas, incluidos, pero no limitados a, los tumores sólidos, la ateroesclerosis y otras enfermedades inflamatorias tales como la artritis reumatoide, y afecciones oftalmológicas tales como la retinopatía diabética y la degeneración macular asociada con la edad. Las afecciones o enfermedades a las que contribuye la angiogénesis persistente o incontrolada han sido denominadas enfermedades dependientes de la angiogénesis o asociadas a la angiogénesis.

Un medio para controlar tales enfermedades y afecciones patológicas comprende restringir el suministro de sangre a las células implicadas en mediar o causar la enfermedad o afección, por ejemplo, ocluyendo los vasos sanguíneos que dan suministro a porciones de órganos en las que están presentes los tumores. Tales enfoques requieren que el sitio del tumor esté identificado y están por lo general limitados al tratamiento a un único sitio, o una pequeña cantidad de sitios. Una desventaja adicional de la restricción mecánica directa de un suministro de sangre es que se desarrollan vasos sanguíneos colaterales, a menudo muy rápidamente, que restablecen el suministro de sangre al tumor.

Otros enfoques se han centrado en la modulación de los factores que están implicados en la regulación de la angiogénesis. Aunque generalmente inactiva, la proliferación endotelial vascular está muy regulada, incluso durante la angiogénesis. El VEGF es un factor que ha sido implicado como un regulador de la angiogénesis in vivo (Klagsbrun, M. y D'Amore, P., Annual Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991)).

Un mitógeno específico de las células endoteliales, VEGF, actúa como inductor de la angiogénesis promoviendo específicamente la proliferación de células endoteliales. Es una glicoproteína homodimérica que está constituida por dos subunidades de 23 kD. Se han identificado cuatro diferentes isoformas monoméricas de VEGF resultantes del empalme alternativo del ARNm. Éstas incluyen dos formas unidas a la membrana (VEGF206 y VEGF189) y dos formas solubles (VEGF165 y VEGF121). VEGF165 es la isoforma más abundante en todos los tejidos humanos con excepción de la placenta.

VEGF se expresa en los tejidos embrionarios (Breier y col., Development, 114: 521-532 (1992)), macrófagos y en queratinocitos epidérmicos en proliferación durante la curación de heridas (Brown y col., J. Exp. Med., 176: 1375-1379 (1992)), y puede ser responsable del edema tisular asociado con la inflamación (Ferrara y col., Endocr. Rev., 13: 18-32 (1992)). Los estudios de hibridación in situ han demostrado altos niveles de expresión de VEGF en una serie de líneas de tumores humanos que incluyen el glioblastoma multiforme, el hemangioblastoma, otros neoplasmas del sistema nervioso central y el sarcoma de Kaposi asociado al SIDA (Plate, K. y col., Nature, 359: 845-848 (1992); Plate,

K. y col., Cancer Res., 53: 5822-5827 (1993); Berkman, R. y col., J. Clin. Invest., 91: 153159 (1993); Nakamura, S. y col., AIDS Weekly, 13 (1) (1992)). También se han encontrado altos niveles de expresión de VEGF en lesiones ateroscleróticas, placas y en células inflamatorias.

El VEGF media su efecto biológico a través de los receptores de VEGF de alta afinidad que se expresan selectivamente en las células endoteliales durante, por ejemplo, la embriogénesis (Millauer, B. y col. Cell, 72: 835-846 (1993)) y la formación de tumores, y que han sido implicados en la modulación de la angiogénesis y el crecimiento tumoral. Estos receptores comprenden un dominio citosólico de la tirosina cinasa que inicia la vía de señales implicada en el crecimiento celular.

Los receptores de VEGF pertenecen típicamente a la clase III de los receptores tirosina cinasa caracterizados por tener varios, típicamente 5 ó 7, bucles análogos a inmunoglobulinas en sus dominios del extremo amino terminal de unión a ligandos del receptor extracelular (Kaipainen y col., J. Exp. Med., 178: 2077-2088 (1993)). Las otras dos regiones incluyen una región transmembranaria y un dominio catalítico intracelular en el extremo carboxi terminal interrumpido por una inserción de secuencias hidrófilas de intercinasas de longitudes variables, denominado dominio de inserción de cinasas (Terman y col., Oncogene, 6: 1677-1783 (1991)). Los receptores de VEGF incluyen el receptor tirosina cinasa análogo a fms (flt-1), o VEGFR-1, secuenciado por Shibuya y col., Oncogene, 5: 519-524 (1990), el receptor que contiene el dominio de inserción de cinasas/cinasa del hígado fetal (KDR/flk-1), o VEGFR-2, descrito en el documento WO 92/14248, presentado el 20 de febrero de 1992, y Terman y col., Oncogene, 6: 1677-1683 (1991) y secuenciado por Matthews y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9026-9030 (1991), aunque otros receptores también pueden unir VEGF. Otro receptor tirosina cinasa, VEGFR-3 (flt-4), une los homólogos de VEGF, VEGF-C y VEGF-D, y es importante en el desarrollo de los vasos linfáticos.

La liberación de VEGF por una masa tumoral estimula la angiogénesis en las células endoteliales adyacentes. Cuando el VEGF es expresado por la masa tumoral, las células endoteliales adyacente a las células tumorales VEGF+ regularán de manera ascendente la expresión de los receptores de VEGF, por ejemplo, VEGFR-1 y VEGFR-2. Se cree generalmente que KDR/VEGFR-2 es el principal transductor de la señal de VEGF que da como resultado la proliferación, la migración y la diferenciación de las células endoteliales, la formación de tubos, el aumento de la permeabilidad vascular y el mantenimiento de la integridad vascular. VEGFR-1 posee una actividad cinasa mucho más débil, y es incapaz de generar una respuesta mitogénica cuando es estimulado por VEGF, aunque se une al VEGF con una afinidad que es aproximadamente 10 veces más alta que KDR. VEGFR-1 también ha sido implicado en la migración de monocitos y macrófagos inducida por VEGF y por el factor de crecimiento placentario (P1GF) y en la producción de factor tisular.

Altos niveles de VEGFR-2 son expresados, por ejemplo, por las células endoteliales que infiltran los gliomas (Plate, K. y col. (1992)), y son regulados específicamente de manera ascendente por el VEGF producido por los glioblastomas humanos (Plate, K. y col. (1993)). El hallazgo de altos niveles de expresión de VEGR-2 en las células endoteliales asociadas a glioblastomas (GAEC) sugiere que la actividad del receptor es inducida durante la formación del tumor, ya que de los transcriptos de VEGFR-2 son apenas detectables en las células endoteliales normales del cerebro, indicando la generación de un bucle paracrino VEGF/VEGFR. Esta regulación ascendente está confinada a las células del endotelio vascular en estrecha proximidad al tumor. El bloqueo de la actividad de VEGF con anticuerpos monoclonales anti-VEGF (Acm) neutralizantes da como resultado la inhibición del crecimiento de xenoinjertos de tumores humanos en los ratones atímicos (Kim, K. y col. Nature, 362: 841-844 (1993)), sugiriendo un papel directo para VEGF en la angiogénesis asociada a tumores.

Por consiguiente, se han desarrollado antagonistas de VEGFR para tratar tumores vascularizados y otras enfermedades angiogénicas. Éstos han incluido anticuerpos neutralizantes que bloquean las señales por los receptores de VEGF expresados en las células endoteliales vasculares para reducir el crecimiento tumoral por medio del bloqueo de la angiogénesis a través de un bucle paracrino dependiente del endotelio. Véase, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 6.365.157 (Rockwell y col.), los documentos WO 00/44777 (Zhu y col.), WO 01/54723 (Kerbel); WO 01/74296 (Witte y col.), WO 01/90192 (Zhu), WO 03/002144 (Zhu) y WO 03/000183 (Carmeliet y col.).

También se han encontrado receptores de VEGF en algunas células no endoteliales, tales como células tumorales productoras de VEGF, en las que se genera un bucle autocrino independiente del endotelio para dar soporte al crecimiento tumoral. Por ejemplo, VEGF es expresado casi invariablemente por todas las líneas celulares leucémicas establecidas y por las células de leucemias humanas recientemente aisladas. Además, VEGFR-2 y VEGFR-1 son expresados por determinadas leucemias humanas. Fielder y col., Blood 89: 1870-1875 (1997); Bellamy y col., Cancer Res. 59728-59733 (1999). Se ha demostrado que un bucle autocrino de VEGF/VEGFR-2 humano media la supervivencia y la migración de las células leucémicas in vivo. Dias y col., J. Clin. Invest.

106: 511-521 (2000); y documento WO 01/74296 (Witte y col.). De manera similar, también se ha informado la producción de VEGF y la expresión de VEGFR por algunas líneas celulares de tumores sólidos in vitro. (Véase, Sato, K. y col., Tohoku J. Exp. Med.,

185: 173-184 (1998); Ishii, Y., Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi: 47: 133-140 (1995); y Ferrer, F. A. y col., Urology, 54: 567-572 (1999)). Se ha demostrado además que los anticuerpos monoclonales contra VEGFR-1 inhiben un bucle autocrino de VEGFR/VEGFR-1 humano en células de carcinoma de mama. Wu, y col., “Monoclonal antibody against VEGFR1 inhibits flt1-positive DU4475 human breast tumor growth by a dual mechanism involving anti-angiogenic and tumor cell growth inhibitory activities”, AACR NCI EORTC International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics, 29 de octubre al 2 de noviembre de 2001, Resumen Nº 7.

Sigue existiendo una necesidad de agentes que inhiban la actividad del receptor de VEGF para tratar o para prevenir enfermedades o afecciones dependientes del receptor de VEGF, inhibiendo, por ejemplo, la angiogénesis patógena o el crecimiento tumoral a través de la inhibición del bucle paracrino y/o autocrino de VEGF/VEGFR. Lu y col., Int. J. Cancer: 97, 393-399 dan a conocer fragmentos anti-KDR monovalentes neutralizantes humanos de alta afinidad para el tratamiento de cáncer y de otras enfermedades en las que tiene lugar angiogénesis patológica. Lu y col. dan a conocer un Fab humano denominado D2C6 cuyas CDRL 1-3 y CDRH 1-3 son idénticas a las CDR definidas por ID. SEC. Nº 1-3 y 13-15, respectivamente. Sin embargo, el presente documento no da a conocer un anticuerpo IgG humano bivalente que comprenda dichas CDR.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona anticuerpos humanos y porciones de los mismos que se unen al KDR, bloquean la unión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) al KDR, y neutralizan la activación del KDR según se define por medio de las reivindicaciones. Los anticuerpos se usan para tratar enfermedades neoplásicas, que incluyen, por ejemplo, tumores sólidos y no sólidos. Por consiguiente, se proporcionan procedimientos para neutralizar la activación del KDR, procedimientos para inhibir el crecimiento tumoral, que incluyen la inhibición de la angiogénesis asociada a tumores y procedimientos para tratar otros trastornos relacionados con la angiogénesis. Se proporcionan kits que tienen los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos humanos que se unen a los receptores de VEGR.

Los anticuerpos pueden usarse solos o en combinación con otros antagonistas de VEGFR, y/o inhibidores de la angiogénesis tales como, por ejemplo, los antagonistas del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). También se proporcionan las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos.

Abreviaturas -VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular; bFGF, factor de crecimiento fibroblástico básico; KDR, receptor que contiene el dominio de inserción de cinasas (también conocido como receptor 2 de VEGF); FLK-1, cinasa del hígado fetal 1; scFv, Fv cadena sencilla; HUVEC, células endoteliales de la vena umbilical humanas; PBS, solución salina tamponada de fosfato 0,01 M (pH 7,2); PBST, PBS que contiene Tween-20 al 0,1%; AP, fosfatasa alcalina; EGF, factor de crecimiento epidérmico; VH y VL, dominio variable de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, respectivamente.

Por consiguiente, un primer aspecto de la invención proporciona un anticuerpo IgG anti-KDR bivalente, en el que el anticuerpo comprende cadenas ligeras de IgG humana, comprendiendo cada una un dominio variable representado por ID. SEC. Nº 26 y cadenas pesadas de IgG humana, comprendiendo cada una un dominio variable representado por ID. SEC. Nº 24.

Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo de la invención en una cantidad eficaz para usar como un medicamento para reducir el crecimiento tumoral.

Otro aspecto de la invención proporciona una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico o una cantidad terapéuticamente eficaz del receptor tirosina cinasa análogo a fms VEGFR-1 o un agente de quimioterapia para usar como un medicamento para reducir el crecimiento tumoral.

Otro aspecto de la invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo según la invención, una composición que comprende un anticuerpo según la invención y un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico, un receptor tirosina cinasa análogo a fms VEGFR-1 o un agente de quimioterapia.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra la identificación y la expresión de los fragmentos Fab anti-DKR humanos. Figura 1A: patrones de digestión de BstN I de cuatro Fab anti-KDR 5 neutralizantes. Figura 1B: análisis SDS-PAGE de los fragmentos Fab purificados bajo condiciones no reductoras. Carril 1, D1F7; Carril 2, D2C6; Carril 3, D1H4; Carril 4, D2H2.

La Figura 2 representa la unión al KDR, el bloqueo de la interacción KDR/VEGF y el bloqueo de la interacción Flk-1/VEGF por los fragmentos Fab anti-KDR humanos. Figura

10 2A: unión de Fab anti-KDR humano al KDR inmovilizado dependiente de la dosis. Figura 2B: inhibición de la unión de KDR a VEGF inmovilizado por Fab anti-KDR. Figura 2C: inhibición de la unión de Flk-1 a VEGF inmovilizado por Fab anti-KDR. Se incubaron diversas cantidades de proteínas Fab con una cantidad fija de KDR-AP (2B) o Flk-1-AP (2C) en disolución a temperatura ambiente durante 1 hora.

15 La Figura 3 representa la correlación de epítopos para los fragmentos Fab anti-KDR. KDR-AP, sus variantes AP de deleción de dominios y Flk-1-AP se capturaron en una placa de 96 pocillos y se incubaron con los fragmentos Fab anti-KDR humanos. Los datos se presentan con relación a la unión de los fragmentos Fab al KDR de longitud total.

20 La Figura 4 representa la inhibición de la mitogénesis de HUVEC inducida por VEGF por medio de los fragmentos Fab anti-KDR humanos. Se añadieron diversas cantidades de fragmentos Fab anti-KDR a pocillos por duplicado y se incubaron a 37 ºC durante 1 hora, tras lo que se añadió VEGF a los pocillos hasta una concentración final de 16 ng/ml. Se

25 recogieron las células y se determinó la radiactividad incorporada en el ADN.

La Figura 5 representa la inhibición de la migración de las células de leucemia humanas estimulada por VEGF por medio de los fragmentos Fab anti-KDR. Figura 5A: VEGF promueve la migración de las células HL60 y HEL de manera dependiente de la dosis.

30 Figura 5B: Inhibición de la migración de las células de leucemia humanas estimulada por VEGF por medio de los fragmentos Fab anti-KDR. La cantidad de KDR-AP que se unió al VEGF inmovilizado se cuantificó por incubación de las placas con el sustrato de AP y lectura a A405nm.

35 La Figura 6 representa la unión al KDR y el bloqueo de la interacción KDR/VEGF por

medio de los anticuerpos anti-KDR humanos. Figura 6A: unión del anti-KDR a KDR inmovilizado dependiente de la dosis. Se incubaron diversas cantidades de anticuerpo a temperatura ambiente durante 1 hora en placas de 96 pocillos recubiertas con KDR. Figura 6B: inhibición de la unión KDR al VEGF inmovilizado por medio de los anticuerpos anti-KDR humanos. Se incubaron diversas cantidades de anticuerpos con una cantidad fija de KDR-AP en disolución a temperatura ambiente durante 1 hora.

La Figura 7 representa la inhibición de la unión de VEGF y de la mitogénesis de HUVEC inducida por VEGF. Figura 7A: inhibición de la unión de VEGF marcado radiactivamente al KDR de la superficie celular por medio de los anticuerpos anti-KDR humanos. Se mezclaron diversas cantidades de anticuerpos anti-KDR con 2 ng de VEGF165 marcado con 125I y se añadieron a una monocapa de células HUVEC confluente al 80-90%. Se incubaron las células a temperatura ambiente durante 2 horas, se lavaron y se determinó la radiactividad unida. Figura 7B: inhibición de la mitogénesis de HUVEC inducida por VEGF por medio de los anticuerpos anti-KDR humanos. Se incubaron diversas cantidades de anticuerpos anti-KDR humanos con las células HUVEC durante 1 hora, seguido por la adición de VEGF. Se recogieron las células y se determinó la radiactividad incorporada en el ADN.

La Figura 8 representa la expresión de KDR y VEGF por células de leucemia humanas. Figura 8A: se determinaron los niveles seleccionados de ARNm por RT-PCR. Carril 1: marcadores de peso molecular; 1000, 850, 650, 500, 400 pb; Carril 2: control negativo; Carril 3: células HL60 (promielocíticas); Carril 4: células HEL (megacariocíticas); Carril 5: células U937 (histiocíticas); Carril 6: HUVEC. Figura 8B: secreción de VEGF por células de leucemia humanas cultivadas con FCS al 10% o en medio sin suero.

La Figura 9 representa la inhibición de la migración de las células de leucemia humanas estimulada por VEGF por medio de los anticuerpos anti-KDR humanos. Figura 9A: células HL60. Figura 9B: células HEL.

La Figura 10 representa la inhibición del avance de la leucemia in vivo según se determina por las tasas de supervivencia. Los ratones NOD-SCID irradiados con un nivel subletal se inocularon con 2 x 107 células HL60 y se trataron con diversas dosis de IMC1C11, de IMC-2C6 o de IMC-1121 por medio de inyección intraperitoneal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En el presente documento se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a un dominio extracelular de VEGFR-2 (KDR). Los anticuerpos comprenden regiones de las estructuras (FW) VH y VL humanas así como regiones determinantes de complementariedad (CDR) humanas. De preferencia, los dominios variables VH y VL completos son humanos o procedentes de secuencias humanas. Por ejemplo, puede obtenerse un dominio variable de la invención a partir de un linfocito de sangre periférica que contenga un gen de región variable reorganizado. Como alternativa, las porciones de los dominios variables, tales como las regiones CDR y FW, pueden proceder de diferentes secuencias humanas. En otro ejemplo, un dominio variable VH humano está codificado por un segmento de gen de VH humano y una secuencia sintética para la región CDR3H (es decir, un segmento sintético del gen de DH-JH). Asimismo, un dominio variable VL humano puede estar codificado por un segmento de gen de VL humano y una secuencia sintética para la región CDR3L (es decir, un segmento sintético del gen de JL).

Los anticuerpos incluyen aquellos cuyas características de unión se han mejorado por medio de mutación directa, procedimientos de maduración por afinidad, presentación de fagos, o mezcla de cadenas. La afinidad y la especificidad pueden modificarse o mejorarse mutando las CDR y seleccionando sitios de unión de antígenos que tengan las características deseadas (véase, por ejemplo, Yang y col., J. Mol. Biol., 254: 392-403 (1995)). La mutación de las CDR se realiza de una diversidad de maneras. Una manera es disponer aleatoriamente residuos individuales o combinaciones de residuos de modo que en una población de sitios de unión del antígeno por lo demás idénticos, los veinte aminoácidos se encuentren en posiciones específicas. Como alternativa, las mutaciones se inducen en un intervalo de residuos de CDR por procedimientos de PCR de baja fidelidad (véase, por ejemplo, Hawkins y col., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)). Por ejemplo, los vectores de presentación de fagos que contienen genes de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras pueden propagarse en cepas de mutación de

E. coli (véase, por ejemplo, Low y col., J. Mol. Biol., 250: 359-368 (1996)). Estos procedimientos de mutagénesis son ilustrativos de los numerosos procedimientos conocidos por el experto en la técnica.

Los anticuerpos se unen al KDR y neutralizan la activación, por ejemplo, bloqueando la dimerización del receptor y/o la unión de VEGF. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para neutralizar la activación de VEGFR in vitro o in vivo, al unirse a un dominio extracelular de un receptor de VEGF. Los dominios extracelulares de un receptor de VEGF incluyen, por ejemplo, un dominio de unión al ligando en una porción extracelular del receptor. In vivo, los anticuerpos inhiben la angiogénesis y/o reducen el crecimiento tumoral.

Los anticuerpos son proteínas que reconocen y se unen a un antígeno o a una sustancia específica. Los anticuerpos se unen al KDR al menos con la misma fuerza que el ligando natural. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con un anticuerpo (Kd), mide la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión del anticuerpo. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre un anticuerpo y su antígeno. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un epítopo y su sitio de unión al antígeno en el anticuerpo como con la valencia del anticuerpo. La valencia se refiere al número de sitios de unión al antígeno que tiene una inmunoglobulina para un epítopo concreto. Por ejemplo, un anticuerpo monovalente tiene un sitio de unión para un epítopo concreto. Un determinante antigénico, o epítopo, es el sitio en un antígeno al que se une un anticuerpo dado. Los valores típicos de K son 105 a 1011 litros/mol. Se considera que cualquier K inferior a 104 litros/mol indica que la unión no es específica. La recíproca de K se designa como Kd. (También puede hacerse referencia a Kd como la constante de disociación). Cuanto menor es el valor de Kd, mayor es la fuerza de la unión entre un determinante antigénico y el sitio de unión del anticuerpo.

El ligando natural del KDR es el VEGF humano. VEGF se une al KDR con una afinidad (Kd) de aproximadamente 0,93 nM. Para impedir la unión de VEGF con KDR, un anticuerpo anti-KDR debe unirse al KDR al menos con la misma fuerza que VEGF. En otras palabras, es necesario que el anticuerpo anti-KDR compita exitosamente con VEGF con respecto a la unión de KDR. Se considera que un anticuerpo con un Kd no superior a 5 nM se une con la misma fuerza que el ligando natural. Los anticuerpos de preferencia se unen a KDR con una afinidad de, como máximo, aproximadamente 4 nM, de más preferencia con una afinidad de, como máximo, aproximadamente 3 nM, de mayor preferencia con una afinidad de, como máximo, aproximadamente 2 nM, y de manera óptima con una afinidad de, como máximo, aproximadamente 1 nM. La avidez de los anticuerpos bivalentes será, por supuesto, mayor que la afinidad. Los anticuerpos bivalentes se unen de preferencia al KDR con una avidez mayor que 0,5 nM, de más preferencia mayor que 0,25 nM, y de manera óptima mayor que 0,1 nM.

Los anticuerpos de la invención neutralizan el KDR. (Véase Ejemplos.) En esta memoria descriptiva, neutralizar un receptor significa disminuir y/o inactivar la actividad cinasa intrínseca del receptor para transducir una señal. Un ensayo fiable para la neutralización del KDR es la inhibición de la fosforilación del receptor.

La presente invención no está limitada por ningún mecanismo particular de neutralización del KDR. El mecanismo seguido por un anticuerpo no es necesariamente el mismo que el seguido por otro. Algunos posibles mecanismos incluyen impedir la unión del ligando VEGF al dominio de unión extracelular del KDR e impedir la dimerización o la oligomerización de los receptores. No obstante, no pueden descartarse otros mecanismos.

Los anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos naturales, fragmentos bivalentes tales como (Fab')2, fragmentos monovalentes tales como Fab, anticuerpos de cadena sencilla, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de dominio único, anticuerpos multivalentes de cadena sencilla, fragmentos divalentes, fragmentos trivalentes, y similares que se unen específicamente a los antígenos.

Los anticuerpos monovalentes de cadena sencilla (es decir, scFv) incluyen un fragmento de cadena pesada variable del anticuerpo (VH) unido a un fragmento de cadena ligera variable del anticuerpo (VL) por un conector peptídico que permite a los dos fragmentos asociarse para formar un sitio funcional de unión al antígeno (véase, por ejemplo Patente de EEUU Nº 4.946.778 (Ladner y col.), documento WO 88/09344, (Huston y col.). El documento WO 92/01047 (McCafferty y col.) describe la presentación de los fragmentos scFv en la superficie de los empaquetamientos solubles de presentación genética recombinante, tales como bacteriófagos. Un anticuerpo de cadena sencilla con un conector (L) puede representarse como VL-L-VH o VH-L-VL.

Cada dominio de los anticuerpos puede ser un dominio variable completo de la cadena pesada o de la cadena ligera del anticuerpo, o puede ser un equivalente funcional o un mutante o derivado de un dominio natural, o un dominio sintético construido, por ejemplo, in vitro usando una técnica tal como la que está descrita en el documento WO 93/11236 (Griffiths y col.). Por ejemplo, es posible unir juntos los dominios correspondientes a los dominios variables del anticuerpo que carecen de al menos un aminoácido. El aspecto característico importante es la capacidad de cada dominio de asociarse con un dominio complementario para formar un sitio de unión del antígeno. Por consiguiente, no debe interpretarse que los términos “fragmento variable de cadena pesada/ligera” excluyan las variantes que no tienen un efecto material sobre la manera en que funciona la invención.

Los equivalentes funcionales incluyen los polipéptidos con sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos de las regiones variables o hipervariables de los anticuerpos contra KDR de longitud completa. “Sustancialmente las mismas” secuencias de aminoácidos se define en el presente documento como una secuencia con al menos el 70%, de preferencia al menos aproximadamente el 80%, y de más preferencia al menos aproximadamente el 90% de homología con otra secuencia de aminoácidos, según se determina por el procedimiento de búsqueda FASTA de acuerdo con Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988).

Los anticuerpos de dominio único tienen un solo dominio variable que es capaz de unir de manera eficaz el antígeno. Ejemplos de anticuerpos en los que la afinidad y la especificidad de unión son aportadas principalmente por uno o el otro dominio variable se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Jeffrey, P. D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10310-10314 (1993), que da a conocer un anticuerpo anti-digoxina que se une a la digoxina principalmente por la cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, pueden identificarse dominios únicos de anticuerpos que se unen bien a los receptores de VEGF. Tales dominios de anticuerpos pueden obtenerse, por ejemplo, de anticuerpos naturales

o de las bibliotecas de Fab o scFv de presentación de fagos. Se entiende que, para producir un anticuerpo de dominio único a partir de un anticuerpo que comprende un dominio VH y un dominio VL, pueden ser deseables ciertas sustituciones de aminoácidos fuera de las regiones CDR para mejorar la unión, la expresión o la solubilidad. Por ejemplo, puede ser deseable modificar los residuos de aminoácidos que estarían de otra manera ocultos en la interfase de VH-VL.

Más recientemente, se han descubierto anticuerpos que son homodímeros de cadenas pesadas en camélidos (camellos, dromedarios y llamas). Estos anticuerpos de cadenas pesadas están desprovistos de las cadenas ligeras y del primer dominio constante. (Véase, por ejemplo, Muyldermans, S., 2001, J. Biotechnol. 74: 277-302) Los fragmentos de unión del antígeno de tamaño reducido se expresan bien en bacterias, se unen al antígeno con alta afinidad y son muy estables. Pueden producirse bibliotecas de presentación de fagos de anticuerpos de dominio único (es decir, que tienen un solo dominio variable que puede ser un dominio variable de cadena ligera o de cadena pesada) y pueden cribarse de la misma manera que las bibliotecas de scFv y Fab. Las estructuras principales para tales anticuerpos de dominio único pueden ser dominios variables modificados de ratón o de ser humano. Se observa que los dominios únicos de los anticuerpos pueden unir el antígeno en una diversidad de modos de unión del antígeno. Es decir, las interacciones principales anticuerpo-antígeno no están limitadas a los residuos de aminoácidos correspondientes a las CDR de los anticuerpos que contienen VH-VL, y puede considerarse las interacciones de unión fuera de los CDR cuando se optimizan las características de unión de tales anticuerpos.

Los anticuerpos de cadena sencilla carecen de algunos o de todos los dominios constantes de los anticuerpos completos de los que proceden. Por consiguiente, pueden superar algunos de los problemas asociados con el uso de anticuerpos completos. Por ejemplo, los anticuerpos de cadena sencilla tienden a estar libres de determinadas interacciones indeseadas entre las regiones constantes de la cadena pesada y otras moléculas biológicas. Además, los anticuerpos de cadena sencilla son considerablemente más pequeños que los anticuerpos completos y puede tener mayor permeabilidad que los anticuerpos completos, que permite que los anticuerpos de cadena sencilla localicen y se unan a los sitios de unión del antígeno diana de manera más eficaz. También, los anticuerpos de cadena sencilla pueden producirse en una escala relativamente grande en células procariotas, facilitando de ese modo su producción. Además, el tamaño relativamente pequeño de los anticuerpos de cadena sencilla hace menos probable que provoquen una respuesta inmune indeseada en un receptor que los anticuerpos completos.

Los conectores peptídicos utilizados para producir los anticuerpos de cadena sencilla pueden ser péptidos flexibles seleccionados para asegurar que pueda tener lugar el plegamiento tridimensional apropiado de los dominios VL y VH una vez unidos para mantener la especificidad de unión a la molécula diana del anticuerpo anti-KDR de longitud completa. Por lo general, el extremo carboxilo terminal de la secuencia de VL o de VH puede unirse de manera covalente por medio de tal conector peptídico al aminoácido del extremo terminal de una secuencia complementaria de VH o VL. El conector tiene generalmente de 10 a 50 residuos de aminoácidos. De preferencia, el conector tiene de 10 a 30 residuos de aminoácidos. De más preferencia, el conector tiene de 12 a 30 residuos de aminoácidos. De mayor preferencia es un conector de 15 a 25 residuos de aminoácidos. Un ejemplo de tales péptidos conectores incluye (Gly-Gly-GlyGly-Ser)3.

Los anticuerpos de cadena sencilla, teniendo cada uno un dominio VH y un dominio VL unidos de manera covalente por un primer conector peptídico, pueden unirse de manera covalente por al menos otro conector peptídico más para formar al anticuerpo multivalente de cadena sencilla. Los anticuerpos multivalentes de cadena sencilla permiten la construcción de los fragmentos del anticuerpo que tienen la especificidad y la avidez de los anticuerpos completos, pero carecen de las regiones constantes de los anticuerpos de longitud completa.

Los anticuerpos multivalentes pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos. El término especificidad se refiere al número de diferentes tipos de determinantes antigénicos a los que puede unirse un anticuerpo particular. Si el anticuerpo se une solamente a un tipo de determinante antigénico, el anticuerpo es monoespecífico. Si el anticuerpo se une a diferentes tipos de determinantes antigénicos, entonces el anticuerpo es multiespecífico.

Por ejemplo, un anticuerpo multivalente biespecífico de cadena sencilla permite el reconocimiento de dos diferentes tipos de epítopos. Los epítopos pueden estar ambos en el KDR. Como alternativa, un epítopo puede estar en el KDR y el otro epítopo puede estar en otro antígeno.

Cada cadena de un anticuerpo multivalente de cadena sencilla incluye un fragmento variable de la cadena ligera y un fragmento variable de la cadena pesada, y está unida por un conector peptídico a al menos otra cadena. El conector peptídico está compuesto por al menos quince residuos de aminoácidos. El número máximo de residuos de aminoácidos es de aproximadamente cien. En una forma de realización de preferencia, el número de dominios VL y VH es equivalente. De preferencia, el conector peptídico (L1) que une los dominios VH y VL para formar una cadena y el conector peptídico (L2) que unen dos o más cadenas para formar un scFv multivalente tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos.

Por ejemplo, un anticuerpo bivalente de cadena sencilla puede representarse de la siguiente manera: VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH; o VL-L1-VH-L2-VH-L1-VH; o VH-L1-VL-L2-VH-L1-VL; o VH-L1-VL-L2-VL-L1-VH.

Los anticuerpos multivalentes de cadena sencilla que son trivalentes o más tienen uno o más fragmentos de anticuerpo unidos a un anticuerpo bivalente de cadena sencilla por conectores peptídicos adicionales. Un ejemplo de un anticuerpo trivalente de cadena sencilla es:

VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH.

Dos anticuerpos de cadena sencilla pueden combinarse para formar un fragmento divalente, también conocido como dímero bivalente. Los fragmentos divalentes tienen dos cadenas y dos sitios de unión, y pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. Cada cadena del fragmento divalente incluye un dominio VH conectado a un dominio VL. Los dominios están conectados con conectores que son suficientemente cortos para evitar el apareamiento entre los dominios en la misma cadena, dirigiendo de este modo el apareamiento entre los dominios complementarios en diferentes cadenas para reconstruir los dos sitios de unión al antígeno. Por consiguiente, una cadena de un fragmento divalente biespecífico comprende VH de una primera especificidad y VL de una segunda especificidad, mientras que la segunda cadena comprende VH de la segunda especificidad y VL de la primera especificidad. El conector peptídico incluye al menos cinco residuos de aminoácidos y no más de diez residuos de aminoácidos, por ejemplo (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2. (ID. SEC. Nº 19). La estructura del fragmento divalente es rígida y compacta. Los sitios de unión al antígeno están en los extremos opuestos de la molécula.

Tres anticuerpos de cadena sencilla pueden combinarse para formar fragmentos trivalentes, también conocidos como trímeros trivalentes. Los fragmentos trivalentes se construyen con el extremo de aminoácido terminal de un dominio VL o VH directamente fusionado al extremo carboxilo terminal de un dominio VL o VH, es decir, sin ninguna secuencia conectora. El fragmento trivalente tiene tres cabezas de Fv con los polipéptidos dispuestos de manera cíclica, cabeza con cola. Una posible conformación del fragmento trivalente es plana con los tres sitios de unión situados en un plano en un ángulo de 120 grados el uno del otro. Los fragmentos trivalentes pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o trispecíficos.

De preferencia, los anticuerpos contienen las seis regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo completo, aunque los anticuerpos que contienen menos que la totalidad de tales regiones, tales como tres, cuatro o cinco CDR, son también funcionales.

Para reducir al mínimo la inmunogenicidad de los anticuerpos que se unen a los receptores de VEGF, se proporcionan anticuerpos que comprenden secuencias humanas de los dominios variables y constantes. Los anticuerpos proceden de una fuente humana y se unen a un dominio extracelular de KDR y neutralizan la activación del receptor. El ADN que codifica los anticuerpos humanos puede prepararse recombinando el ADN que codifica las regiones constantes humanas y el ADN que codifica las regiones variables procedentes de seres humanos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden obtenerse cribando las bibliotecas constituidas por combinaciones de dominios variables de cadenas ligeras y cadenas pesadas humanos. Los ácidos nucleicos a partir de los que se expresan los anticuerpos pueden mutarse somáticamente, o pueden obtenerse de secuencias de líneas germinales de células B no estimuladas.

El ADN que codifica los anticuerpos humanos puede prepararse recombinando el ADN que codifica las regiones constantes y las regiones variables humanas, diferentes de las CDR, procedentes sustancialmente o exclusivamente de las correspondientes regiones del anticuerpo humano y el ADN que codifica las CDR procedentes de un ser humano.

Las fuentes adecuadas de ADN que codifican fragmentos de anticuerpos incluyen cualquier célula, tales como células de hibridomas y células de bazo, que expresen el anticuerpo de longitud completa. Otra fuente son los anticuerpos de cadena sencilla producidos a partir de una biblioteca de presentación de fagos como se conoce en la técnica.

Los anticuerpos pueden ser o pueden combinar miembros de cualquier clase de inmunoglobulina, tales como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, y sus subclases.

La proteína utilizada para identificar los anticuerpos que se unen al VEFGR es por lo general KDR, y está normalmente limitada al dominio extracelular de KDR. El dominio extracelular de KDR puede estar libre o conjugado a otra molécula.

En los ejemplos que se presentan a continuación se aislaron anticuerpos anti-KDR de alta afinidad, que bloquean la unión de VEGF a KDR, a partir de una biblioteca de presentación de fagos construida de genes humanos de regiones variables de cadenas pesadas y cadenas ligeras. Más del 90% de los clones recuperados después de tres ciclos de selección son específicos para KDR. Las afinidades de unión para KDR de los Fab seleccionados están en el orden de nM, que son tan altas como las de varios anticuerpos monoclonales bivalentes anti-KDR producidos usando la tecnología de hibridomas.

Los anticuerpos pueden ser fusionarse a otros residuos de aminoácidos. Tales residuos pueden ser un marcador peptídico, tal vez para facilitar el aislamiento, o pueden ser una secuencia señal para la secreción del polipéptido desde una célula huésped tras la síntesis. De manera conveniente, se usan péptidos secretores líderes, que son aminoácidos unidos al extremo N terminal de un polipéptido para dirigir el movimiento del polipéptido fuera del citosol.

También se proporcionan los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido según la invención, y diversos repertorios de tales ácidos nucleicos.

Los anticuerpos de la invención neutralizan la activación del KDR. Una medida de la neutralización del KDR es la inhibición de la actividad tirosina cinasa del receptor. La inhibición de la tirosina cinasa puede determinarse usando procedimientos muy conocidos. Los anticuerpos de la presente invención causan por lo general la inhibición o la regulación de los episodios de fosforilación. Por consiguiente, los ensayos de fosforilación son útiles para determinar los anticuerpos útiles en el contexto de la presente invención. La inhibición de la tirosina cinasa puede determinarse midiendo el nivel de autofosforilación del receptor de cinasa recombinante, y/o la fosforilación de sustratos naturales o sintéticos. La fosforilación puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo específico para fosfotirosina en un ensayo de ELISA o en una transferencia Western. Algunos ensayos para determinar la actividad tirosina cinasa están descritos en Panek y col., J. Pharmacol. Exp. Thera., 283: 1433-1444 (1997) y Batley y col., Life Sci.,

62: 143-150 (1998).

Además, pueden usarse los procedimientos para detectar la expresión de proteínas, en los que las proteínas a medir están reguladas por la actividad tirosina cinasa de KDR. Estos procedimientos incluyen la inmunohistoquímica (IHC) para la detección de la expresión de proteínas, la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) para la detección de la amplificación de genes, los ensayos de unión competitiva de radioligandos, las técnicas de transferencia con matriz sólida, tales como las transferencias Northern y Southern, la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y ELISA. Véase, por ejemplo, Grandis y col., Cancer, 78: 1284-1292. (1996); Shimizu y col., Japan J. Cancer Res., 85: 567-571 (1994); Sauter y col., Am. J. Path., 148: 1047-1053 (1996); Collins, Glia, 15: 289-296 (1995); Radinsky y col., Clin. Cancer Res., 1: 19-31 (1995); Petrides y col., Cancer Res., 50: 3934-3939 (1990); Hoffmann y col., Anticancer Res., 17: 4419-4426 (1997); Wikstrand y col., Cancer Res., 55: 3140-3148 (1995).

También pueden utilizarse ensayos in vivo. Por ejemplo, la inhibición del receptor tirosina cinasa puede observarse por medio de ensayos mitogénicos usando líneas celulares estimuladas con el ligando del receptor en presencia y en ausencia de inhibidor. Por ejemplo, pueden usarse células HUVEC (ATCC) estimuladas con VEGF para realizar ensayos de inhibición del VEGFR. Otro procedimiento implica probar la inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan VEGF, usando por ejemplo, células tumorales humanas inyectadas en un ratón. Véase, Patente de EEUU Nº 6.365.157 (Rockwell y col.).

En los procedimientos de la presente invención, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención a un mamífero que lo necesita. El término “administrar” según se utiliza en el presente documento significa suministrar los anticuerpos de la presente invención a un mamífero por cualquier procedimiento que pueda conseguir el resultado buscado. Pueden administrarse, por ejemplo, por vía intravenosa o intramuscular. Aunque los anticuerpos humanos de la invención son particularmente útiles para la administración a seres humanos, también pueden administrarse a otros mamíferos. El término “mamífero” según se utiliza en el presente documento pretende incluir, pero no está limitado a, seres humanos, animales de laboratorio, animales domésticos y animales de granja. “Cantidad terapéuticamente eficaz” significa una cantidad de anticuerpo de la presente invención que, cuando se administra a un mamífero, es eficaz para producir el efecto terapéutico deseado, tal como inhibir la actividad cinasa.

Sin la intención de estar ligados a ningún mecanismo particular, las enfermedades y afecciones que se pueden tratar o prevenir por medio de los presentes procedimientos incluyen, por ejemplo, aquellas en las que la angiogénesis patógena o el crecimiento tumoral son estimulados a través de un bucle paracrino y/o autocrino de VEGFR.

La neutralización de la activación de un receptor de VEGF en células endoteliales o no endoteliales, tales como células tumorales, puede llevarse a cabo in vitro o in vivo. Neutralizar la activación por VEGF de un receptor de VEGF en una muestra de células que expresan el receptor de VEGF comprende poner las células en contacto con un antagonista, por ejemplo, un anticuerpo, de la invención. Las células se ponen en contacto in vitro con el antagonista, por ejemplo, el anticuerpo, antes, simultáneamente o después de añadir el VEGF a la muestra de células.

In vivo, un anticuerpo de la invención se pone en contacto con un receptor de VEGF por medio de la administración a un mamífero, de preferencia un ser humano. Un procedimiento de neutralización in vivo es útil para inhibir el crecimiento tumoral, la angiogénesis asociada con el crecimiento tumoral u otras afecciones patológicas asociadas con la angiogénesis, en un mamífero. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención son agentes de inmunoterapia antiangiogénica y antitumoral.

Los tumores que pueden ser tratados incluyen tumores primarios y tumores metastásicos, así como tumores refractarios. Los tumores refractarios incluyen los tumores que no responden o que son resistentes al tratamiento con agentes de quimioterapia solos, anticuerpos solos, radiación sola o sus combinaciones. Los tumores refractarios también abarcan los tumores que parecen ser inhibidos por el tratamiento con tales agentes, pero que vuelven a presentarse hasta cinco años, a veces hasta diez años o más después de la interrupción del tratamiento.

Los anticuerpos de la presente invención son útiles para tratar los tumores que expresan receptores de VEGF, en especial KDR. Tales tumores son característicamente sensibles al VEGF presente en su entorno, y pueden además producir y ser estimulados por el VEGF en un bucle autocrino de estimulación. El procedimiento es, por consiguiente, eficaz para tratar un tumor sólido o no sólido que no esté vascularizado, o que no esté aún sustancialmente vascularizado. Los ejemplos de tumores sólidos que pueden ser tratados adecuadamente incluyen el carcinoma de mama, el carcinoma de pulmón, el carcinoma colorrectal, el carcinoma pancreático, el glioma y el linfoma. Algunos ejemplos de tales tumores incluyen los tumores epidermoides, tumores escamosos, tales como los tumores de la cabeza y del cuello, los tumores colorrectales, tumores de próstata, tumores de mama, tumores de pulmón, incluidos los tumores microcíticos y no microcíticos de pulmón, tumores pancreáticos, tumores de tiroides, tumores ováricos y tumores del hígado. Otros ejemplos incluyen el sarcoma de Kaposi, los neoplasmas del SNC, los neuroblastomas, los hemangioblastomas capilares, los meningiomas y las metástasis cerebrales, el melanoma, los carcinomas y los sarcomas gastrointestinales y renales, el rabdomiosarcoma, el glioblastoma, de preferencia el glioblastoma multiforme y el leiomiosarcoma. Los ejemplos de cánceres vascularizados de la piel para los que son eficaces los antagonistas de la presente invención incluyen el carcinoma de células escamosas, el carcinoma de células basales y los cánceres de piel que pueden tratarse suprimiendo el crecimiento de los queratinocitos malignos, tales como los queratinocitos malignos humanos.

Los ejemplos de tumores no sólidos incluyen leucemia, mieloma múltiple y linfoma. Algunos ejemplos de leucemias incluyen la leucemia mieloide aguda (AML), la leucemia mieloide crónica (CML), la leucemia linfocítica aguda (ALL), la leucemia linfocítica crónica (CLL), la leucemia eritrocítica o la leucemia monocítica. Algunos ejemplos de linfomas incluyen el linfoma de Hodgkin y el linfoma no Hodgkin.

Los resultados experimentales que se describen a continuación demuestran que los anticuerpos de la invención bloquearon específicamente la estimulación de KDR (VEGFR-2) inducida por VEGF en células de leucemia. Los estudios in vivo que también se describen a continuación muestran que los anticuerpos fueron capaces de inhibir significativamente el crecimiento tumoral en ratones atímicos.

Un cóctel de antagonistas del receptor de VEGF, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, proporciona un tratamiento especialmente eficaz para inhibir el crecimiento de células tumorales. El cóctel puede incluir antagonistas del VEGFR diferentes de anticuerpos y puede tener tan pocos como 2, 3 ó 4 antagonistas de receptores, y tantos como 6, 8 ó 10.

En otro aspecto de la invención, los anticuerpos anti-KDR se utilizan para inhibir la angiogénesis. La estimulación del VEGFR del endotelio vascular está asociada con enfermedades angiogénicas y con la vascularización de tumores. Típicamente, el endotelio vascular es estimulado de una manera paracrina por VEGF de otras fuentes (por ejemplo, células tumorales).

Por consiguiente, los anticuerpos anti-KDR humanos son eficaces para tratar sujetos con tumores o neoplasmas vascularizados o enfermedades angiogénicas. Tales tumores y neoplasmas incluyen, por ejemplo, los tumores y neoplasmas malignos, tales como blastomas, los carcinomas o sarcomas y los tumores y neoplasmas altamente vasculares. Los cánceres que pueden tratarse por medio de los procedimientos de la presente invención incluyen, por ejemplo, los cánceres del cerebro, tracto genitourinario, sistema linfático, estómago, renales, del colon, laringe y pulmón y hueso. Ejemplos no limitantes incluyen además los tumores epidermoides, tumores escamosos, tales como los tumores de la cabeza y del cuello, los tumores colorrectales, tumores de próstata, tumores de mama, tumores de pulmón, incluidos el adenocarcinoma de pulmón y los tumores microcíticos y no microcíticos de pulmón, los tumores pancreáticos, tumores de tiroides, tumores ováricos y los tumores del hígado. El procedimiento también se utiliza para el tratamiento de los cánceres vascularizados de la piel, incluidos el carcinoma de células escamosas, el carcinoma de células basales y los cánceres de piel que pueden tratarse suprimiendo el crecimiento de queratinocitos malignos, tales como queratinocitos malignos humanos. Otros cánceres que pueden tratarse incluyen el sarcoma de Kaposi, los neoplasmas del SNC (neuroblastomas, hemangioblastomas capilares, meningiomas y metástasis cerebrales), el melanoma, los carcinomas y sarcomas gastrointestinales y renales, el rabdomiosarcoma, el glioblastoma, incluido el glioblastoma multiforme y el leiomiosarcoma.

También se proporcionan procedimientos para tratar o para prevenir afecciones patológicas caracterizadas por angiogénesis excesiva, que incluyen, por ejemplo, la vascularización y/o la inflamación, tales como la ateroesclerosis, la artritis reumatoide (AR), el glaucoma neovascular, la retinopatía proliferativa, incluida la retinopatía diabética proliferativa, la degeneración macular, los hemangiomas, los angiofibromas y la psoriasis. Otros ejemplos no limitantes de enfermedad angiogénica no neoplásica son la retinopatía del prematuro (fibroplasia retrolental), el rechazo del injerto de córnea, la diabetes mellitus dependiente de insulina, la esclerosis múltiple, la miastenia gravis, la enfermedad de Crohn, la nefritis autoinmune, la cirrosis biliar primaria, la pancreatitis aguda, el rechazo de aloinjertos, la inflamación alérgica, la dermatitis y las reacciones de hipersensibilidad retardada, la enfermedad intestinal inflamatoria, el choque séptico, la osteoporosis, la osteoartritis, los defectos cognitivos inducidos por la inflamación neuronal, el síndrome de Osler-Weber, la reestenosis y las infecciones fúngicas, parasitarias y virales, incluidas las infecciones por citomegalovirus.

La identificación de tales enfermedades está dentro de la capacidad y los conocimientos del experto en la técnica. Por ejemplo, los individuos humanos que están sufriendo una enfermedad neoplásica o angiogénica clínicamente significativa o que están en riesgo de desarrollar síntomas clínicamente significativos son adecuados para la administración de los presentes anticuerpos para el receptor de VEGF. Un médico clínico experto en la técnica puede determinar fácilmente, por ejemplo, por medio del uso de pruebas clínicas, exploración física y antecedentes médicos/familiares, si un individuo es un candidato para tal tratamiento.

Por otra parte, está incluido el uso de los presentes anticuerpos in vivo e in vitro para procedimientos de investigación o de diagnóstico, que son muy conocidos en la técnica.

Los presentes anticuerpos anti-KDR pueden administrarse para los tratamientos terapéuticos a un paciente que sufre una afección patológica asociada a la angiogénesis

o un tumor en una cantidad suficiente para prevenir, inhibir o reducir la progresión del tumor o de la afección patológica. La progresión incluye, por ejemplo, el crecimiento, la invasividad, la metástasis y/o la recurrencia del tumor o de la afección patológica. A una cantidad adecuada para conseguir esto se la define como dosis terapéutica eficaz. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado del general del propio sistema inmunitario del paciente. Las programaciones de dosis también variarán con el estado de enfermedad y el estado general del paciente, y estarán típicamente en el intervalo desde una sola dosificación en bolo o infusión continua hasta múltiples administraciones por día (por ejemplo, cada 4-6 horas), o según lo indicado por el médico tratante y la afección del paciente. Debe observarse, sin embargo, que la presente invención no está limitada a ninguna dosis particular.

En una forma de realización de la invención, los anticuerpos anti-KDR pueden administrarse en combinación con otro u otros agentes antineoplásicos. Para ejemplos de terapias de combinación, véase, por ejemplo, Patente de EEUU Nº 6.217.866 (Schlessinger y col.) (Anti-EGFR antibodies in combination with antineoplastic agents); documento WO 99/60023 (Waksal y col.) (Anti-EGFR antibodies in combination with radiation). Puede usarse cualquier agente antineoplásico adecuado, tal como un agente de quimioterapia o radiación. Los ejemplos de agentes de quimioterapia incluyen, pero no están limitados a, cisplatino, doxorubicina, paclitaxel, irinotecan (CPT-11), topotecan o una de sus combinaciones. Cuando el agente antineoplásico es la radiación, la fuente de la radiación puede ser externa (terapia de radiación de haz externo -EBRT) o interna (braquiterapia -BT) al paciente a tratar. La dosis administrada del agente antineoplásico depende de numerosos factores, que incluyen, por ejemplo, el tipo de agente, el tipo y la gravedad del tumor a tratar y la vía de administración del agente. Debe ponerse de relieve, sin embargo, que la presente invención no está limitada a ninguna dosis particular.

Además, los anticuerpos anti-KDR de la invención pueden administrarse con anticuerpos que neutralicen otros receptores implicados en el crecimiento tumoral o la angiogénesis. Un ejemplo de tales receptores es el receptor VEGFR-1/Flt-1. En una forma de realización de la invención, se usa un anticuerpo anti-KDR en combinación con un antagonista de receptores que se une específicamente a VEGFR-1. Resultan particularmente de preferencia las proteínas de unión al antígeno que se unen al dominio extracelular de VEGFR-1 y bloquean la unión por uno o ambos de sus ligandos, VEGF y P1GF, y/o neutralizan la activación de VEGFR-1 inducida por VEGF o inducida por PIGF. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal mAb 6.12 es un scFv que se une al VEGFR-1 soluble y expresado en la superficie de la célula. ScFv 6.12 comprende los dominios VL y de VH del anticuerpo monoclonal mAb 6.12 de ratón. Una línea de células de hibridoma que producen mAb 6.12 se ha depositado con número de referencia PTA-3344 del ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest en el International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure y las regulaciones del mismo (Tratado de Budapest).

Otro ejemplo de tales receptores es EGFR. En una forma de realización de la presente invención, se usa un anticuerpo anti-KDR en combinación con un antagonista de EGFR. Un antagonista de EGFR puede ser un anticuerpo que se una a EGFR o un ligando de EGFR y que inhiba la unión de EGFR a su ligando. Los ligandos para EGFR incluyen, por ejemplo, EGF, TGF-α anfiregulina, EGF de unión a heparina (HB-EGF) y betarecullulina. Se cree que EGF y TGF-α son los ligandos endógenos principales que dan lugar a la estimulación mediada por EGFR, aunque se ha mostrado que TGF-α es más potente para promover la angiogénesis. Debe apreciarse que el antagonista de EGFR puede unirse externamente a la porción extracelular de EGFR, que puede o no inhibir la unión del ligando, o internamente al dominio de tirosina cinasa. Los ejemplos de antagonistas de EGFR que se unen al EGFR incluyen, sin limitación, moléculas biológicas, tales como anticuerpos (y sus equivalentes funcionales) específicos para EGFR, y moléculas pequeñas, tales como inhibidores sintéticos de cinasa que actúan directamente en el dominio citoplásmico del EGFR.

Otros ejemplos de receptores de factores de crecimiento implicados en la tumorigénesis son los receptores para el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), el factor de crecimiento análogo a la insulina (IGFR), el factor de crecimiento nervioso (NGFR) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR).

En otra forma de realización alternativa, el antagonista de VEGFR puede administrarse en combinación con uno o más coadyuvantes adecuados, tales como, por ejemplo, citocinas (IL-10 e IL-13, por ejemplo) u otros estimuladores inmunitarios. Véase, por ejemplo, Larrivée y col., supra. Debe apreciarse, sin embargo, que la administración de solamente un anticuerpo anti-KDR es suficiente para prevenir, inhibir o reducir la progresión del tumor de una manera terapéuticamente eficaz.

En una terapia de combinación, el anticuerpo anti-KDR se administra antes, durante o después de comenzar la terapia con otro agente, así como cualquiera de sus combinaciones, es decir, antes y durante, antes y después, durante y después, o antes, durante y después de comenzar la terapia con el agente antineoplásico. Por ejemplo, el anticuerpo anti-KDR puede administrarse entre 1 y 30 días, de preferencia entre 3 y 20 días, de más preferencia entre 5 y 12 días antes de comenzar la terapia de radiación.

En la presente invención, puede usarse cualquier procedimiento o vía de administración adecuados para administrar los anticuerpos anti-KDR de la invención y, opcionalmente, para administrar conjuntamente agentes antineoplásicos y/o antagonistas de otros receptores. Las vías de administración incluyen, por ejemplo, la administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. La dosis administrada del antagonista depende de numerosos de factores, que incluyen, por ejemplo, el tipo de antagonista, el tipo y la gravedad del tumor a tratar y la vía de administración de los antagonistas. Debe ponerse de relieve, sin embargo, que la presente invención no está limitada a ningún procedimiento o vía de administración particular.

Se observa que un anticuerpo anti-KDR de la invención puede administrarse como un conjugado, que se une específicamente al receptor y suministra una carga útil tóxica, letal tras la internalización del ligando-toxina.

Se entiende que los anticuerpos anti-KDR de la invención, cuando se utilizan en un mamífero con el fin de profilaxis o tratamiento, se administrarán bajo la forma de una composición que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de los siguientes: agua, solución salina, solución salina tamponada de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como sus combinaciones. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además pequeñas cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsivos, conservantes o tampones, que mejoran el período de validez o la eficacia de las proteínas de unión. Las composiciones de la inyección pueden formularse, como se conoce bien en la técnica, para proporcionar liberación rápida, sostenida o retardada del ingrediente activo después de la administración al mamífero.

También se proporcionan kits para inhibir el crecimiento tumoral y/o la angiogénesis que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-KDR humano. Los kits pueden contener además cualquier antagonista adecuado de, por ejemplo, otro receptor del factor de crecimiento implicado en el tumorigénesis o la angiogénesis (por ejemplo, VEGFR-1/Flt-1, EGFR, PDGFR, IGFR, NGFR, FGFR, etc., como se describió anteriormente). Como alternativa, o además, los kits de la presente invención pueden comprender además un agente antineoplásico. Los ejemplos de agentes antineoplásicos adecuados en el contexto de la presente invención han sido descritos en el presente documento. Los kits de la presente invención pueden comprender además un coadyuvante, los ejemplos también han sido descritos anteriormente.

Un anticuerpo anti-KDR de la invención puede unirse químicamente o de manera biosintética a uno o más agentes antineoplásicos o antiangiogénicos.

También están contemplados los anticuerpos anti-KDR a los que están unidos restos diana o informadores. Los restos diana son los primeros miembros de pares de unión. Los agentes antineoplásicos, por ejemplo, se conjugan a segundos miembros de tales pares y de ese modo se dirigen al sitio donde está unido el anticuerpo anti-KDR. Un ejemplo común de tales pares de unión es el de adivina y biotina. En una forma de realización de preferencia, la biotina se conjuga a un anticuerpo anti-KDR, y de ese modo proporciona una diana para un agente antineoplásico u otro resto que está conjugado a la avidina o a la estreptavidina. Como alternativa, se une biotina u otro de tales restos a un anticuerpo anti-KDR de la invención y se utiliza como informador, por ejemplo en un sistema de diagnóstico en el que un agente que produce una señal detectable está conjugado a la avidina o a la estreptavidina.

Por consiguiente, los presentes antagonistas de receptores pueden usarse de este modo, in vivo e in vitro, para procedimientos de investigación, de diagnóstico, profilácticos o de tratamiento, que son muy conocidos en la técnica.

EJEMPLOS

Los Ejemplos y Ejemplos de referencia que se presentan a continuación se exponen para ayudar en la comprensión de la invención pero no pretenden ser, y no deben interpretarse como, limitantes de su alcance en ningún modo. Los Ejemplos no incluyen descripciones detalladas de procedimientos convencionales, tales como los utilizados en la construcción de vectores y plásmidos, la inserción de genes que codifican polipéptidos en tales vectores y plásmidos, o la introducción de plásmidos en las células huésped. Tales procedimientos son muy conocido por los expertos en la técnica y están descritos en numerosas de publicaciones que incluyen Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Ejemplo 1. Producción de Fab humano

Ejemplo 1(a). Proteínas y líneas celulares.

Se obtuvieron células HUVEC de cultivo primario del Dr. S. Rafii en el Cornell Medical Center, Nueva York, y se mantuvieron en medio EBM-2 (Clonetics, Walkersville, MD) a 37 ºC, CO2 al 5%. Las proteínas de fusión solubles, KDR-fosfatasa alcalina (AP), sus variantes de deleción de dominios de inmunoglobulina (Ig), y Flk-1-AP, fueron expresados en NIH 3T3 transfectado de manera estable y se purificaron a partir de los sobrenadantes del cultivo celular por cromatografía de afinidad usando un anticuerpo monoclonal inmovilizado para AP como está descrito por Lu y col., J. Biol. Chem. 275: 14321-14330 (2000). La proteína VEGF165 se expresó en baculovirus y se purificó siguiendo los procedimientos descritos en Zhu y col., Cancer Res. 58: 3209-3214 (1998). Las líneas celulares de leucemia, HL60 y HEL, se mantuvieron en RPMI que contenía suero de ternera fetal al 10%.

Ejemplo 1(b). ELISA para fagos.

Se recogieron clones individuales de TG1 y se cultivaron a 37 ºC en placas de 96 pocillos y se rescataron con el fago auxiliar M13K07 como se describió anteriormente. La preparación amplificada del fago se bloqueó con 1/6 volumen de leche al 18%/PBS a temperatura ambiente durante 1 hora y se añadió a placas de microvaloración del 96 pocillos Maxi-sorp (Nunc) recubiertas con KDR-AP o AP (1 µg/ml x 100 µl). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavaron las placas 3 veces con PBST y se incubaron con un conjugado de fago anti-M13 de conejo-HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Las placas se lavaron 5 veces, se añadió el sustrato de la peroxidasa, TMB (KPL, Gaithersburg, MD), y se leyó la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Ejemplo 1(c). Análisis del patrón de digestión del ADN con BstNI y secuenciación de nucleótidos.

Se analizó la diversidad de los clones de Fab anti-KDR después de cada ciclo de selección por los patrones de digestión con enzima de restricción (es decir, las huellas dactilares del ADN). Se amplificó el inserto del gen de Fab de clones individuales por medio de PCR usando los cebadores: PUC19 inverso, 5’ AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’; y fdtet seq, 5’ GTCGTCTTTCCAGACGTTAGT 3’. El producto amplificado se digirió con una enzima de corte frecuente, BstN I, y se analizó en un gel de agarosa al 3%. Las secuencias del ADN de clones representativos de cada patrón de digestión se determinaron por secuenciación de didesoxinucleótidos.

Ejemplo 1(d). Expresión y purificación de los fragmentos Fab solubles.

Se usaron plásmidos de clones individuales para transformar un huésped no supresor de

E. coli HB2151. La expresión de los fragmentos Fab en HB2151 se indujo cultivando las células en medio 2YTA que contenía isopropil-1-tio-β-D-galactopiranósido 1 mM (IPTG, Sigma) a 30 ºC. Se preparó un extracto periplásmico de las células resuspendiendo el sedimento celular en Tris 25 mM (pH 7,5) que contenía sacarosa al 20% (peso/volumen), NaCl 200 mM, EDTA 1 mM y PMSF 0,1 mM, seguido por la incubación a 4 ºC con agitación suave durante 1 hora. Después de la centrifugación a 15.000 rpm durante 15 minutos, se purificó la proteína Fab soluble del sobrenadante por cromatografía de afinidad usando una columna de proteína G siguiendo el protocolo del fabricante (Amersham Pharmacia Biotech).

Ejemplo 1(e). Selección de Fab anti-KDR humano de la biblioteca de presentación de fagos.

Se usó una gran biblioteca de presentación de fagos Fab humano que contenía 3,7 x 1010 clones (DeHaard y col., J. Biol. Chem. 274: 18218-18230 (1999)) para la selección. La biblioteca está constituida por los genes de regiones variables cadenas ligeras y los genes de regiones variables de cadenas pesadas de anticuerpos amplificados por PCR fusionados a los genes de regiones constantes de cadenas ligeras (κ y λ) humanos y al ADN que codifica el dominio CH1 de cadena pesada de IgG1, respectivamente. Ambas construcciones, las de cadena pesada y de cadena ligera, están precedidas por una secuencia señal -pelB para la cadena ligera y la secuencia señal del gen III para la cadena pesada. Las construcciones de cadena pesada codifican además una porción de la proteína del gen III para la presentación de fagos, un marcador de hexahistidina, y un marcador c-myc de 11 aminos de longitud, seguido por un codón ámbar (TAG). Los marcadores de hexahistidina y c-myc pueden utilizarse para la purificación o la detección. El codón ámbar permite la presentación de fagos usando huéspedes supresores (tales como células TG1) o la producción de fragmentos Fab en forma soluble cuando está transformado en un huésped no supresor (tal como las células HB2151).

Se cultivó la población de la biblioteca a fase logarítmica, se rescató con el fago auxiliar M13-KO7 y se amplificó durante la noche en medio 2YTAK (2YT que contiene 100 µg/ml de ampicilina y 50 µg/ml de kanamicina) a 30 ºC. La preparación de fagos se precipitó en PEG al 4%/NaCl 0,5 M, se resuspendió en leche desnatada al 3%/PBS que contenía 500 µg/ml de la proteína AP y se incubó a 37 ºC durante 1 hora para capturar los fagos que presentaban fragmentos Fab anti-AP y para bloquear otras uniones no específicas.

Los tubos Maxisorp Star (Nunc, Rosklide, Dinamarca) recubiertos con KDR-AP (10 µg/ml en PBS) se bloquearon primero con leche al 3%/PBS a 37 ºC durante 1 hora y a continuación se incubaron con la preparación de fagos a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavaron los tubos 10 veces con PBST (PBS que contiene Tween-20 al 0,1%) seguido por 10 veces con PBS. Se eluyeron los fagos unidos a temperatura ambiente durante 10 minutos con 1 ml de una disolución recién preparada de trietilamina 100 mM (Sigma, St. Louis, MO). El fago eluido se incubó con 10 ml de células TG1 en fase semilogarítmica a 37 ºC durante 30 minutos en reposo y 30 minutos con agitación. Las células TG1 infectadas se centrifugaron y se plaquearon en varias placas grandes de 2YTAG y se incubaron durante la noche a 30 ºC. Se rasparon todas las colonias crecidas en las placas y se colocaron en 3 a 5 ml de medio 2YTA, se mezcló con glicerol (concentración final del 10%), se separaron alícuotas y se almacenaron a -70 ºC. Para el siguiente ciclo de selección, se añadieron 100 µl de la población de fagos a 25 ml de medio 2YTAG y se cultivaron hasta la fase semilogarítmica. El cultivo se rescató con el fago auxiliar M13K07, se amplificó, se precipitó y se utilizó para selección siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, con concentraciones reducidas de KDR-AP inmovilizado en el inmunotubo y mayor número de lavados después del proceso de unión.

Se realizó un total de tres ciclos de selección sobre KDR inmovilizado, con concentraciones variables de proteína y número de lavados después del proceso de unión inicial. Después de cada ciclo de selección, se recogieron 93 clones aleatoriamente y se probó con el ELISA para fagos la unión a KDR. Setenta de los 93 clones (el 75%) recogidos después de la segunda selección, y más del 90% de los clones recuperados después de la tercera selección fueron positivos para la unión a KDR, sugiriendo una alta eficiencia del proceso de selección. Se amplificaron los segmentos de ADN que codificaban Fab de los 70 clones de unión identificados en la segunda selección, se digirieron con BstN I y se compararon para evidenciar los patrones de huella dactilar. Se observó un total de 42 patrones diferentes, indicando una excelente diversidad del Fab anti-KDR aislado. El examen de reactividad cruzada demostró que 19 de los 42 anticuerpos eran específicos para la unión a KDR, mientras que los 23 anticuerpos restantes se unieron tanto a KDR como a su homólogo murino, Flk-1. Se consiguió otra selección con un ensayo competitivo de unión a VEGF en el que se determinó la unión de KDR soluble a VEGF inmovilizado en presencia o en ausencia de los fragmentos Fab anti-KDR. El ensayo identificó cuatro clones de Fab que eran capaces de bloquear la unión entre VEGF y KDR. Tres eran específicos de unión a KDR y uno reaccionó de manera cruzada con Flk-1. La huella dactilar del ADN y el análisis de secuenciación confirmaron que los cuatro anticuerpos bloqueadores de KDR/VEGF eran diferentes (Figura 1A) con secuencias de ADN y de aminoácidos únicas.

Las secuencias de aminoácidos para CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y VL para los cuatro clones se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1 – Secuencias de CDR de los Fab humanos seleccionados de unión a KDR

Clon: CDR1 CDR2 CDR3

Cadena ligera

D2C6: RASQSVSSYLA (ID. SEC. Nº l) DSSNRAT (ID. SEC. Nº 2) LQHNTFPPT (ID. SEC. Nº 3)

D2H2: RASQGISSRLA (ID. SEC. Nº 4) AASSLQT (ID. SEC. Nº 5) QQANRFPPT (ID. SEC. Nº 6)

D1H4: AGTTTDLTYYDLVS (ID. SEC. Nº 7) DGNKRPS (ID. SEC. Nº 8) NSYVSSRFYV (ID. SEC. Nº 9)

D1F7: SGSTSNIGTNTAN (ID. SEC. Nº 10) NNNQRPS (ID. SEC. Nº 11) AAWDDSLNGHWV (ID. SEC. Nº 12)

Cadena pesada

D2C6: GFTFSSYSMN (ID. SEC. Nº 13) SISSSSSYIYYADSVKG (ID. SEC. Nº 14) VTDAFDI (ID. SEC. Nº 15)

D2H2: GFTFSSYSMN (ID. SEC. Nº 13) SISSSSSYIYYADSVKG (ID. SEC. Nº 14) VTDAFDI (ID. SEC. Nº 15)

D1H4: GFTFSSYSMN (ID. SEC. Nº 13) SISSSSSYIYYADSVKG (ID. SEC. Nº 14) VTDAFDI (ID. SEC. Nº 15)

D1F7: GGTFSSYAIS (ID. SEC. Nº 16) GGIIPIFGTANYAQKFQG (ID. SEC. Nº 17) GYDYYDSSGVASPFDY (ID. SEC. Nº 18)

5 Las secuencias completas para las cadenas de VH y VL se presentan en el Listado de secuencias. Para el ejemplo de referencia D1F7, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VH están representadas por ID. SEC. Nº 19 y 20 respectivamente, y las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 21 y22. 25

10 Para D2C6, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VH están representadas por ID. SEC. Nº 23 y 24 respectivamente, y las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 25 y 26.

15 Para el ejemplo de referencia D2H2, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos

para VH están representadas por ID. SEC. Nº 30 y 31 respectivamente, y las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 32 y 33.

Para el ejemplo de referencia D1H4, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos 5 para VH están representadas por ID. SEC. Nº 27 y 24 respectivamente, y las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 28 y 29.

Se creó una segunda biblioteca de ejemplos de referencia combinando la cadena pesada sencilla de D2C6 con una diversa población de cadenas ligeras procedentes de la 10 biblioteca original. Se identificaron otros diez Fab de ejemplos de referencia, designados SA1, SA3, SB10, SB5, SC7, SD2, SD5, SF2, SF7 y 1121. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL de los diez Fab están representadas como se expone a continuación. Para SA1, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 34 y 35. Para SA3, las secuencias de nucleótidos y de 15 aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 36 y 37. Para SB10, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 38 y 39. Para SB5, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 40 y 41. Para SC7, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 42 y 43. Para SD2, las 20 secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 44 y 45. Para SD5, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 46 y 47. Para SF2, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 48 y 49. Para SF7, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC.

25 Nº 50 y 51. Para 1121, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para VL están representadas por ID. SEC. Nº 52 y 53.

Las secuencias de CDR de VL se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2. Secuencias de las CDR de cadena ligera de Fab humanos de unión a KDR

Clon: CDR1 CDR2 CDR3

SA1: TGSHSNFGAGTDV (ID. SEC. Nº 54) GDSNRPS (ID. SEC. Nº 55) QSYDYGLRGWV (ID. SEC. Nº 56)

SA3: RASQNINNYLN (ID. SEC. Nº 57) AASTLQS (ID. SEC. Nº 58) QQYSRYPPT (ID. SEC. Nº 59)

(continuación)

Clon: CDR1 CDR2 CDR3

SB10: TGSSTDVGNYNYIS (ID. SEC. Nº 60) DVTSRPS (ID. SEC. Nº 61) NSYSATDTLV (ID. SEC. Nº 62)

SB5: TGQSSNIGADYDVH (ID. SEC. Nº 63) GHNNRPS (ID. SEC. Nº 64) QSYDSSLSGLV (ID. SEC. Nº 65)

SC7: RASQDISSWLA (ID. SEC. Nº 66) AASLLQS (ID. SEC. Nº 67) QQADSFPPT (ID. SEC. Nº 68)

SD2: RASQSIKRWLA (ID. SEC. Nº 69) AASTLQS (ID. SEC. Nº 70) QQANSFPPT (ID. SEC. Nº 71)

SD5: SGSRSNIGAHYEVQ (ID. SEC. Nº 72) GDTNRPS (ID. SEC. Nº 73) QSYDTSLRGPV (ID. SEC. Nº 74)

SF2: TGSSSNIGTGYDVH (ID. SEC. Nº 75) AYTNRPS (ID. SEC. Nº 76) QSFDDSLNGLV (ID. SEC. Nº 77)

SF7: TGSHSNFGAGTDVH (ID. SEC. Nº 78) GDTHRPS (ID. SEC. Nº 79) QSYDYGLRGWV (ID. SEC. Nº 80)

1121: RASQGIDNWLG (ID. SEC. Nº 81) DASNLDT (ID. SEC. Nº 82) QQAKAFPPT (ID. SEC. Nº 83)

Ejemplo II. Ensayos

5 Ejemplo II(a). Unión cuantitativa a KDR y bloqueo de la interacción KDR/VEGF.

En un ensayo de unión directa, se añadieron diversas cantidades de proteínas Fab solubles a placas de microvaloración Maxisorp de 96 pocillos recubiertas con KDR y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, tras lo cual se lavaron las placas 3 10 veces con PBST. A continuación se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 hora con 100 µl de un conjugado de anticuerpo Fab anti-humano de conejo-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc., West Grove, PA). Se lavaron las placas y continuación se desarrollaron siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para el ELISA de fagos. En un ensayo competitivo de bloqueo de KDR/VEGF, se mezclaron 15 diversas cantidades de proteínas Fab con una cantidad fija de KDR-AP (100 ng) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación se transfirieron las mezclas a placas de microvaloración de 96 pocillos cubiertas previamente con VEGFR165

(200 ng/pocillo) y se incubaron a temperatura ambiente durante otras 2 horas, tras lo cual se lavaron las placas 5 veces y se añadió el sustrato para AP (p-nitrofenil fosfato, Sigma). Se midió la absorbancia a 405 nm para cuantificar las moléculas de KDR-AP unidas (8). A continuación se calculó la IC50, es decir, la concentración de proteína Fab requerida para inhibir el 50% de unión de KDR a VEGF.

Los cuatro clones bloqueadores de VEGF (ejemplo D2C6 y ejemplos de referencia D2H2, D1H4, D1F7) se expresaron como Fab soluble y se purificaron de extractos periplásmicos de E. coli por cromatografía de afinidad con proteína G. El rendimiento de las proteínas Fab purificadas de estos clones varió desde 60 a 400 µg/litro de cultivo. El análisis SDSPAGE de cada preparación purificada de Fab dio a única banda de proteína con el tamaño molecular esperado (Figura 1B).

La Figura 2 muestra la unión de los fragmentos Fab anti-KDR al receptor inmovilizado dependiente de la dosis según se ensaya por medio de un ELISA de unión directa. Los clones D2C6 y D2H2 se unen de manera más eficaz, seguidos por los clones D1H4 y D1F7. Los cuatro Fab bloquean la unión de KDR a VEGF inmovilizado (Figura 2B). Las concentraciones de anticuerpo requeridas para el 50% de inhibición de unión de KDR a VEGF son de aproximadamente 2 nM para los clones D2C6, D2H2 y D1H4 y 20 nM para el clon D1F7. Solamente el clon D1F7 bloquea la unión de VEGF a Flk-1 (Figura 2C), con una CI50 de aproximadamente 15 nM.

Ejemplo II (b). Análisis BIAcore del scFv soluble.

La cinética de unión de las proteínas Fab solubles al KDR se midió por resonancia de plasmones de superficie usando un biosensor BIAcore (Pharmacia Biosensor). La proteína de fusión KDR-AP se inmovilizó sobre un chip sensor y las proteínas Fab solubles se inyectaron en concentraciones en el intervalo desde 1,5 nM hasta 100 nM. Se obtuvieron los sensorigramas con cada concentración y se evaluaron usando un programa, BIA Evaluation 2.0, para determinar las constantes de velocidad kon y koff.Kd se calculó a partir de la relación de los constantes de velocidad koff/kon.

Los tres fragmentos Fab específicos de KDR se unen al receptor inmovilizado con Kd de 2 a 4 nM (Tabla 3). El clon que muestra reacción cruzada, D1F7, tiene una Kd de 45 nM, que es aproximadamente 10 a 15 veces más débil que las de los clones específicos de KDR. Es significativo que, aunque la Kd global para los tres fragmentos Fab específicos de KDR es similar, la cinética de unión individual, es decir, la kon y la koff, para estos anticuerpos son absolutamente diferentes, por ejemplo, D2C6 posee la velocidad de asociación más rápida, mientras que D1H4 tiene la velocidad de disociación más lenta (Tabla 3).

Tabla 3. Cinética de unión de los cuatro fragmentos Fab anti-KDR humanos neutralizantes

Clon: kon (104 M-1s-1) koff (10-4 s-1) Kd (nM)

Fab Hu-2C6: 27,3 ± 8,6* 5,38 ± 0,54 1,97

Fab Hu-2H2 de referencia: 12,4 ± 2,9 4,87 ± 0,18 3,93

Fab Hu-1H4 de referencia: 5,55 ± 0,59 1,53 ± 0,22 2,76

Fab Hu-1F7 de referencia: 4,14 ± 1,21 18,7 ± 2,12 45,2

* Todos los valores están determinados por análisis BIAcore y representan la media ± EE de al menos tres determinaciones separadas.

Ejemplo II(c). Obtención de mapas de epítopos de unión.

10 La producción de variantes de deleción de dominios análogos a Ig extracelulares de KDR se ha descrito previamente (Lu y col. (2000)). En un ensayo de obtención de mapas de epítopos, KDR-AP de longitud total, las fusiones Ap de dos variantes de deleción de dominios Ig de KDR y Flk-1-AP se inmovilizaron en primer lugar sobre una placa de 96 pocillos (Nunc) usando un anticuerpo anti-AP de conejo (DAKO-Immunoglobulins,

15 Glostrup, Dinamarca) como reactivo de captura. A continuación se incubó la placa con diferentes proteínas Fab anti-KDR a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por la incubación con un conjugado de anticuerpo Fab anti-humano de conejo-HRP. Se lavó la placa y se desarrolló como se describió anteriormente.

20 Se obtuvieron los mapas de los epítopos de unión de los fragmentos Fab anti-KDR usando el KDR de longitud total y dos variantes de deleción de dominios de Ig de KDR. KDR(1-3) es una variante de KDR que contiene los primeros tres dominios de Ig del extremo N terminal. KDR(3) es una variante que contiene solamente el tercer dominio de Ig. Según se muestra en la Figura 3, los clones D2C6 y D1H4 se unen igualmente bien a

25 KDR, KDR(1-3) y KDR(3), localizando de este modo su(s) epítopo(s) de unión dentro del dominio 3 de Ig. Los clones D2H2 y D1F7 se unen con mucha más eficacia a KDR de longitud total y a KDR(1-3), indicando un epítopo(s) de unión más amplio(s) dentro de los dominios 1 a 3 de Ig de KDR. Solamente el clon D1F7 reacciona de manera cruzada con Flk-1.

Ejemplo II (d). Ensayo antimitogénico.

Se plaquearon células HUVEC (5 x 103 células/pocillo) en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (Wallach, Inc., Gaithersburg, MD) en 200 µl de medio EBM-2 sin VEGF, factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) o factor de crecimiento epidérmico (EGF) y se incubaron a 37 ºC durante 72 horas. Se añadieron diversas cantidades de proteínas Fab a los pocillos por duplicado y se preincubaron a 37 ºC durante 1 hora, tras lo que se añadió VEGF165 hasta una concentración final de 16 ng/ml. Después de 18 horas de incubación, se añadieron 0,25 µCi de [3H] TdR (Amersham) a cada pocillo y se incubaron durante otras 4 horas. Se lavaron las células una vez con PBS, se trataron con tripsina y se recogieron sobre un filtro de vidrio (Printed Filtermat A, Walach) con un recolector de células (Harvester 96, MACH III, TOMTEC, Orange, CT). La membrana se lavó tres veces con H2O y se secó al aire. Se añadió el líquido de centelleo y se determinó la radiactividad incorporada en el ADN en un contador de centelleo (Wallach, Microbeta Scintillation Counter Modelo 1450).

La capacidad del Fab anti-KDR humano para bloquear la actividad mitogénica estimulada por VEGF en HUVEC se muestra en la Figura 4. Los cuatro fragmentos Fab humanos inhibieron la síntesis de ADN inducida por VEGF en HUVEC de una manera dependiente de la dosis. La concentración de Fab que inhibió el 50% (CE50) de incorporación de [3H] TdR estimulada por VEGF en HUVEC, es de aproximadamente 0,5 nM para los clones D2C6 y D1H4, 0,8 nM para el clon D2H2, y 15 nM para el clon D1F7. Los controles incluyeron VEGF solo (1500 cpm) y medio solo (60 cpm). Se ensayaron los pocillos por duplicado. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos separados.

Ejemplo II(e). Ensayo de migración de células de leucemia.

Se lavaron células HL60 y HEL tres veces con medio RPMI 1640 sin suero y se suspendieron en el medio a razón de 1 x 106/ml. Se añadieron alícuotas de 100 µl de suspensión de células a insertos transpocillo de poro de 3 µm para las células HL60, o a insertos transpocillo de poro de 8 µm para las células HEL (Costar®, Corning Incorporated, Corning, NY) y se incubaron con las proteínas Fab anti-KDR (5 µg/ml) durante 30 minutos a 37 ºC. A continuación se colocaron los insertos en pocillos de placas de 24 pocillos que contenían 0,5 ml de medio RPMI 1640 sin suero con o sin VEGF165. La migración se llevó a cabo a 37 ºC, CO2 al 5% durante 16-18 horas para las células HL60, o durante 4 horas para las células HEL. Las células migradas se recogieron de los compartimentos inferiores y se realizó el conteo con un contador Coulter (Modelo Z1, Coulter Electronics Ltd., Luton, Inglaterra).

VEGF indujo la migración de las células HL60 y HEL de una manera dependiente de la dosis, consiguiéndose la estimulación máxima con 200 ng/ml (Figura 5A). Todos los fragmentos Fab anti-KDR inhibieron significativamente la migración de las células HL60 y HEL estimulada por VEGF (Figura 5B). Como control, un fragmento Fab de C225, un anticuerpo dirigido contra el receptor de EGF, no mostró efecto inhibidor significativo en este ensayo.

Ejemplo III. Producción de IgG

Ejemplo III(a). Construcción de vectores para la expresión de IgG.

Se construyeron vectores separados para la expresión de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas de IgG. Los genes clonados de VL se digirieron y se ligaron en el vector pKN100 (MRC). Los genes clonados de VH se digirieron y se ligaron en el vector pGID105 que contenía el dominio constante de cadena pesada (γ) de IgG I humana. pKN100 y pGID105 están disponibles de MRC. Las construcciones se examinaron por medio de digestión con enzimas de restricción y se verificaron por secuenciación de didesoxinucleótidos. En ambos casos, la expresión está bajo el control del promotor de HCMV y finaliza por una secuencia de terminación artificial.

A continuación se clonaron los genes ensamblados de las cadenas pesadas y ligeras en los vectores de expresión pEE6.1 y pEE12 de Lonza GS. 1. Los vectores de cadenas pesadas y ligeras se recombinaron en un vector único para la transfección estable de células CHO y células NSO. Las células transfectadas se cultivaron en medio sin glutamina y expresaron anticuerpos en niveles tan altos como 1 g/l.

Ejemplo III (b). Producción y caracterización de IgG anti-KDR humana.

Tanto IMC-2C6 como el ejemplo de referencia IMC-1121 se produjeron en líneas celulares NSO transfectadas de manera estable cultivadas bajo condiciones sin suero, y se purificaron del cultivo celular discontinuo usando cromatografía de afinidad con proteína A. La pureza de las preparaciones de anticuerpos se analizó por SDS-PAGE, y las concentraciones se determinaron por ELISA, usando un anticuerpo Fc anti-humano como agente de captura y un conjugado de anticuerpo anti-cadena κ humana-peroxidasa de rábano picante (HRP) como agente de detección. Se usó un anticuerpo de nivel clínico, IMC-C225, como patrón para la calibración. Se examinó el nivel de endotoxinas de cada preparación de anticuerpos para asegurar que los productos estaban libres de contaminación por endotoxinas.

Los anticuerpos anti-KDR se evaluaron para verificar la unión a KDR y el bloqueo de la unión de VEGF. En el ensayo de unión directa, se añadieron diversas cantidades de anticuerpo a placas de microvaloración de 96 pocillos Maxi-sorp (Nunc, Roskilde, Dinamarca) recubiertas con KDR y se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante 1 hora, tras lo cual se lavaron las placas 3 veces con PBS que contenían Tween-20 al 0,1%. A continuación, se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 hora con 100 µl de un conjugado de Fc de IgG anti-humano de conejo-HRP (Jackson Immuno Research Laboratory Inc., West Grove, PA). Las placas se lavaron y se desarrollaron como anteriormente. Los anticuerpos humanos IMC-2C6 e IMC-1121 se compararon con IMC-1C11 (un anticuerpo de ratón específico para KDR) e IMC-C225 (un anticuerpo quimérico específico para EGFR). Los anticuerpos anti-KDR se unen a KDR de una manera dependiente de la dosis, siendo IMC-1121 el que se une con más fuerza (Figura 6A).

La eficacia de los anticuerpos anti-KDR para bloquear la unión de KDR a VEGF se midió con un ensayo de competición. Se mezclaron diversas cantidades de anticuerpos con una cantidad fija de KDR-AP (100 ng) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación se transfirieron las mezclas a placas de microvaloración de 96 pocillos cubiertas previamente con VEGF165 (200 ng/pocillo) y se incubaron a temperatura ambiente durante otras 2 horas, tras lo cual se lavaron las placas 5 veces y se añadió el sustrato para AP (p-nitrofenil fosfato, Sigma), seguido por la lectura de la absorbancia a 405 nm para cuantificar las moléculas de KDR-AP unidas. A continuación se calculó la CI50, es decir, la concentración de anticuerpo requerida para inhibir el 50% de la unión de KDR a VEGF. Los anticuerpos anti-KDR bloquearon fuertemente la unión de KDR a VEGF (Figura 6B), con potencia similar. La CI50 es de aproximadamente 0,8 a 1,0 nM para los tres anticuerpos. El anticuerpo de control, IMC-C225 (anti-EGFR humano) no se

5 une al KDR, y no bloquea la interacción KDR/VEGF.

La afinidad o la avidez de los anticuerpos se determinaron por medio del análisis BIAcore, como anteriormente. La cinética de unión, es decir, la constante de velocidad de asociación (kon) y la constante de velocidad de disociación (koff), de los anticuerpos anti

10 KDR se midieron y se calculó la constante de disociación, Kd (Tabla 4).

Tabla 4 -Cinética de unión de los anticuerpos anti-KDR

Anticuerpo: kon (104 M-1s-1) koff (10-4s-1) Kd (nM)

scFv p1C11: 7,7 ± 2,1* 1,0 ± 0,09 1,4 ± 0,3

IMC-1C11: 13,4 ± 2,9 0,37 ± 0,13 0,27 ± 0,06

Fab Hu-2C6: 17,1 ± 5,7 5,5 ±`0,76 3,6 ± 1,7

IgG IMC-2C6: 21,1 ± 8,1 0,43 ± 0,03 0,20 ± 0,01

Fab Hu-1121: 29,6 ± 7,3 0,31 ± 0,06 0,20 ±`0,02

IgG IMC-1121: 47,9 ± 2,4 0,25 ± 0,04 0,05 ± 0,01

* Todos los valores están determinados por análisis BIAcore y representan la media ± EE de al menos tres determinaciones separadas.

IMC-1C11 se une a KDR inmovilizado con una constante de disociación (Kd) de 0,27 nM, aproximadamente 5 veces más alta su Fab equivalente. La Kd para IMC-2C6 es de 0,2

15 nM, que es aproximadamente 18 veces más alta que la del Fab Hu-2C6 monovalente, principalmente debido a una mejora en la velocidad de disociación. La maduración de la afinidad de Hu-2C6 dio lugar a Fab Hu-1121 con una mejora de 33 veces en la Kd (desde 3,6 nM hasta 0,11 nM). La conversión del Fab Hu-1121 en IgG bivalente, IMC-1121, dio como resultado un aumento de aproximadamente 2 veces en la avidez de unión global.

20 Ejemplo III(c). Inhibición de la unión de VEGF a células y de la mitogénesis de HUVEC estimulada por VEGF.

En un radioinmunoensayo basado en células, se mezclaron diversas cantidades de 25 anticuerpos anti-KDR con una cantidad fija (2 ng) de VEGF165 marcado con 125I (R & D Systems) y se añadieron a una monocapa confluente al 80-90% de células HUVEC cultivadas en una placa de microvaloración de 96 pocillos. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas, se lavó 5 veces con PBS frío y se midió la cantidad de radiactividad unida a las células endoteliales. Según se muestra en la Figura 7A, los anticuerpos anti-KDR compitieron de manera eficaz con el VEGF marcado radiactivamente por la unión a HUVEC. Los datos representan las medias ± DE para determinaciones por triplicado.

Los anticuerpos también bloquearon la mitogénesis de HUVEC estimulada por VEGF de una manera dependiente de la dosis (Figura 7B). Como se describió anteriormente para los Fab, diversas cantidades de anticuerpos anti-KDR se preincubaron en primer lugar con células HUVEC privadas de factor de crecimiento (5 x 103 células/pocillo) a 37 ºC durante 1 hora, tras lo que se añadió VEGF165 hasta una concentración final de 16 ng/ml. Después de 18 horas de incubación, se añadieron 0,25 µCi de [3H]-TdR (Amersham) a cada pocillo y se incubaron durante otras 4 horas. Se lavaron las células, se recogieron y se determinó la radiactividad incorporada en el ADN en un contador de centelleo. IMC1121, el anticuerpo con la afinidad más alta, es el inhibidor más eficaz con una DE50, es decir, la concentración que da como resultado el 50% de inhibición de incorporación de [3H]-TdR, de aproximadamente 0,7 nM, en comparación con la de 1,5 nM para IMC-1C11 y para IMC-2C6.

Ejemplo IV. Inhibición de las células leucémicas y de la progresión de la leucemia

Ejemplo(a). Expresión de VEGF y KDR por las células de leucemia.

Los autores de la invención examinaron la expresión de VEGF y KDR, por RT-PCR, en tres líneas celulares le leucemia mieloide: HL60 (promielocítica); HEL (megacariocítica); y U937 (histiocítica). Se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar VEGF, Flt-1, KDR y el control interno, α-actina: VEGF directo: 5’-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3’ (ID. SEC. Nº 86), e inverso: 5’-CCTGGTGAGAGATCTGGTTC-3’ ( ID. SEC. Nº 87); Flt-1 GTCTTTGCGGATGTCCACG-3’ (ID. SEC. Nº 93). Los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1%. Según se muestra en la Figura 8A, las tres líneas son positivas para la expresión de VEGF, y HL60 y HEL, pero no U937, son también positivas para la expresión de KDR. Las tres líneas celulares también son positivas para la expresión de Flt-1 según lo detectado por RT-PCT (no se muestra).

directo:: 5’-TTTGTGATTTTGGCCTTGC-3’ (ID. SEC. Nº 88), e inverso: 5’

CAGGCTCATGAACTTGAAAGC-3’: (ID. SEC. Nº 89); KDR directo: 5’

GTGACCAACATGGAGTCGTG-3’: (ID. SEC. Nº 90), e inverso: 5’

CCAGAGATTCCATGCCACTT-3’: (ID. SEC. Nº 91); α-actina directo: 5’

TCATGTTTGAGACCTTCAA-3’: (ID. SEC. Nº 92), e inverso: 5’

La producción de VEGF se examinó para las tres líneas celulares cultivadas bajo condiciones de medio con FCS al 10% o sin suero. Las células de leucemia se recogieron, se lavaron con el medio RPMI 1640 solo y se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 x 105/ml, con o sin la adición de FCS al 10%. Las células se cultivaron a 37 ºC durante 72 horas, tras lo que se realizó el conteo del número de células usando un contador Coulter (Modelo Z1, Coulter Electronics Ltd., Luton, Inglaterra) y se determinó la concentración de VEGF en el sobrenadante usando un kit de ELISA (Biosource International, Camarillo, CA). Las células de leucemia secretan cantidad significativa de VEGF cuando se cultivan in vitro (Figura 8B) y tanto las células HL60 como las U937 produjeron más VEGF bajo condiciones de privación de suero.

Ejemplo IV(b). Inhibición de la migración de las células de leucemia inducida por VEGF.

Los ensayos de migración de células de leucemia, como se describen en el Ejemplo Il(e), se realizaron con las tres líneas celulares de leucemia. La migración se llevó a cabo durante 16-18 horas para las células HL60, o durante 4 horas para las células HEL y U937.

Las tres líneas celulares de leucemia migran en respuesta a VEGF (Figura 9). La incubación con los anticuerpos anti-KDR inhibió, de una manera dependiente de la dosis, la migración de las células HL60 y HEL inducida por VEGF (Figura 9A y 9B), pero no tuvo efecto sobre la migración de las células U937 que no expresan KDR (Figura 9C). Sin embargo, la migración de las células U937 inducida por VEGF, fue inhibida eficazmente por un anticuerpo anti-Flt-1 humano, Mab 612 (Figura 9C). Según lo esperado, el anticuerpo anti-EGFR, IMC-C225, no mostró efecto sobre la migración de las células de leucemia humanas inducida por VEGF.

Ejemplo IV(b). Inhibición del crecimiento de la leucemia in vivo.

Se usaron ratones NOD-SCID de 6 a 8 semanas de edad, del mismo sexo (hembras) en todos los experimentos. Se irradiaron los ratones con 3,5 Gy de una fuente de rayos gamma de 137Cs a una dosis de aproximadamente 0,9 Gy/minuto y se les inocularon 2 x 107 células HL60 por vía intravenosa. Tres días después de la inoculación del tumor, grupos de 7 a 9 ratones se trataron dos veces por semana con diversas dosis de los anticuerpos IMC-1C11, IMC-2C6 o IMC-1121 por medio de inyección intraperitoneal. Los ratones se observaron diariamente para analizar los signos de toxicidad y se registraron los tiempos de supervivencia. Para el análisis estadístico, se usó la prueba no paramétrica, unilateral, de suma de categorías de Mann-Whitney.

Todos los ratones sin tratar murieron en el plazo de 17 días (Figura 10, tiempo medio de supervivencia, 14 ± 3 días). Con esta alta carga tumoral, el tratamiento con el ejemplo de referencia IMC-1C11 a 200 µg/ratón/inyección aumentó de manera moderada la supervivencia pero todos los ratones murieron en el plazo de 35 días (supervivencia media: 21 ± 7 días; mediana de supervivencia: 19 días, respectivamente. p = 0,03 comparado con el grupo de control). IMC-2C6, administrado en la misma dosis de 200 µg/ratón/inyección, prolongó significativamente la supervivencia de los ratones hasta 34 ± 12 días (mediana = 29 días. p < 0,01 comparado con el control y p = 0,01 comparado con el grupo tratado con IMC-1C11). El anticuerpo con la afinidad más alta, ejemplo de referencia IMC-1121, demostró un efecto antileucémico mucho más fuerte, particularmente comparado con IMC-1C11. Los ratones tratados con IMC-1121 sobrevivieron 63 ± 12 días (mediana = 60 días. p < 0,001 comparado con los grupos tratados con IMC-1C11 y con IMC-2C6). Con una dosis de anticuerpo más baja probada (100 µg/ratón/inyección), IMC-1121 fue también más eficaz. Los ratones tratados con la dosis más baja de IMC-1121 sobrevivieron 46 ± 16 días (mediana = 41 días). No se observaron toxicidades evidentes en ninguno de los animales tratados con anticuerpos a lo largo del curso del experimento.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Zhu, Zhenping

<120> Anticuerpos humanos específicos para KDR y sus usos

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<140> no asignado

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5 10: tcatgtttga gaccttcaa 19 <210> 93 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador de amplificación para KDR

15: <400> 93 gtctttgcgg atgtccacg 19

Claims

Reivindicaciones

1.

Anticuerpo IgG bivalente anti-KDR, en el que el anticuerpo comprende cadenas ligeras de IgG humana que comprenden cada una un dominio variable representado por ID. SEC. Nº 26 y cadenas pesadas de IgG humana que comprenden cada una un dominio variable representado por ID. SEC. Nº 24.
2.

El anticuerpo IgG anti-KDR de la reivindicación 1, en el que las cadenas pesadas son cadenas pesadas (γ) de IgG I.
3.

Un anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2 en una cantidad eficaz para uso como medicamento para reducir el crecimiento tumoral.
4.

El anticuerpo de la reivindicación 3, en el que el tumor es un tumor del colon, un tumor de mama o un tumor no sólido.
5.

El anticuerpo de la reivindicación 3 ó 4, en el que el tumor sobreexpresa KDR.
6.

Una cantidad eficaz de un anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2 en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del receptor de factor de crecimiento epidérmico o una cantidad terapéuticamente eficaz de receptor tirosina cinasa análogo a fms, VEGFR-1, o un agente de quimioterapia para uso como medicamento para reducir el crecimiento tumoral.
7.

Composición que comprende un anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8.

La composición según la reivindicación 7, que además comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del receptor de factor de crecimiento epidérmico o una cantidad terapéuticamente eficaz de receptor tirosina cinasa análogo a fms, VEGFR-1, o un agente de quimioterapia.
9.

Composición que comprende un anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2 y un antagonista del receptor de factor de crecimiento epidérmico, un receptor tirosina cinasa análogo a fms, VEGFR-1, o un agente de quimioterapia.
10.

Uso de un anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2 en una cantidad eficaz para la fabricación de un medicamento para reducir el crecimiento tumoral.
11.

Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2 en

5 combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del receptor de factor de crecimiento epidérmico o una cantidad terapéuticamente eficaz de receptor tirosina cinasa análogo a fms, VEGFR-1, o un agente de quimioterapia para la fabricación de un medicamento para reducir el crecimiento tumoral.