CZ20032586A3 - Kombinované metody inhibice nádorového růstu s antagonistou receptoru vaskulárního endotelového růstového faktoru - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Řešení poskytuje způsob redukce nebo inhibice růstu nádorů u savce, zahrnující ošetření savce účinným množstvím antagonisty receptoru VEGF v kombinaci s ozařováním, chemoterapií a/nebo dalším antagonistou receptoru.

CO <

CO

IO

CM

CO

CM

N

O • · · • · · · « • ·

KOMBINOVANĚ METODY INHIBICE NÁDOROVÉHO RŮSTU S ANTAGONISTOU

RECEPTORU VASKULÁRNÍHO ENDOTELOVÉHO RŮSTOVÉHO FAKTORU [01] Tato přihláška je přihláškou částečně navazující na přihlášku č. 09/798 689, podanou 2.března 2001, která je dosud v řízení a je přihláškou částečně navazující na přihlášku č. 09/401 163, podanou 22.září 1999, která je dosud v řízení a je přihláškou částečně navazující na přihlášku č.08/967 113, podanou 10.listopadu 1997, která je dosud v řízení a je částečně navazující na US patent č. 5 861 499, podaný 3.září 1996, který je částečně navazující na přihlášku č. 08/476 533, podanou 7.června 1995, která je opuštěna a je přihláškou částečně navazující na US patent č. 5 840 301, podaný 20.října 1994, který je částečně navazující na přihlášku č. 08/196 041, podanou 10.února 1994, která je opuštěna. Veškeré popisy výše citovaných předchozích přihlášek jsou zde zahrnuty formou odkazu.

OBLAST TECHNIKY [02] Předkládaný vynález se týká způsobů léčby nádorů s použitím antagonistů receptoru vaskulárního endotelového růstového faktoru (vascular endothelial growth factor,

VEGF) v kombinaci s chemoterapeutickým agens, zářením a/nebo s odlišným antagonistou receptoru růstového faktoru.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY [03] Je známo, že angiogeneze, která se týká tvorby kapilár z pre-existujících cév v embryu a dospělém organismu, je klíčovým prvkem v růstu nádorů, jejich přežívání a metastázi. Růstové faktory a jejich receptory, které zahrnují epidermální růstový faktor (epidermal growth

factor, EGF), transformační růstový faktor-α (transforming growth factor-α, TGF-a)), transformační růstový faktor-β (transforming growth factor-β ,TGF-β), kyselý a bazický fibroblastový růstový faktor (acidic and basic fibroblast growth factor, aFGF resp.FGF), růstový faktor odvozený od destiček (platelet derived growth factor, PDGF) a vaskulární endotelový růstový faktor (vascular endothelial growth factor, VEGF), hrají klíčovou roli v angiogenezi nádorů. Viz Klagsbrun & D'Amore, Annual Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991). Vazba těchto růstových faktorů ke svým receptorům na buněčném povrchu indukuje aktivaci receptorů, která iniciuje a modifikuje cesty přenosu signálu a vede k buněčné proliferaci a diferenciaci. VEGF, endotelový buněčně specifický mitogen, je mezi těmito faktory odlišný v tom, že působí jako induktor angiogeneze specifickým podněcování proliferace endotelových buněk.

[04] VEGF je homodimerní glykoprotein sestávající ze dvou podjednotek o 23 kD a je silným induktorem vaskulární permeability, stimulátorem migrace endotelových buněk a proliferace a významým faktorem pro přežití nově vytvořených krevních cév. Existují čtyři monomerní izoformy VEGF, .které vznikají z alternativního sestřihu mRNA. Izoformy zahrnují dvě formy vázané na membránu (VEGF₂o6 a VEGFisg) a dvě rozpustné formy (VEGFi₆₅ a VEGF₁₂i) . S výjimkou placenty je ve všech lidských tkáních nejhojnější izoformou VEGFies· [05] VEGF je klíčovým regulátorem vaskulogeneze, kterou je de novo růst nových krevních cév z diferenciace endotelových prekursorů (angioblastů) in šitu, a probíhá v embryonálních tkáních (Breier et al., Development (Camb.), 114: 521 (1992)), z diferenciace makrofágů, z • ·

......

proliferujicích epidermálních keratinocytů během hojení ran (Brown et al., J. Exp. Med., 176: 1375 (1992)), a může být zodpovědná za edem tkání spojený se zánětem (Ferrara et al., Endocr. Rev., 13: 18 (1992)). Hybridizační studie in šitu prokázaly vysokou expresi VEGF v řadě lidských nádorových liniích včetně multiformního glioblastomu, hemangioblastomu, neoplasmat centrálního nervového systému a s AIDS-spojeným Kaposiho sarkomu (Plate et al. (1992) Nátuře 359: 845-848 ; Plate et al. (1993) Cancer Res. 53: 5822-5827; Berkman et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 153159; Nakamura et al. (1992) AIDS Weekly, 13 (1)). Vysoké hladiny VEGF byly rovněž pozorovány v angiogenezí indukované hypoxií (Shweiki et al. (1992) Nátuře 359: 843845).

[06] Biologická odpověď VEGF je zprostředkovaná přes jeho vysoce afinitní receptory, které jsou selektivně exprimovány na endotelových buňkách během embryogeneze (Millauer, Cell, 72: 835-846 (1993)) a během tvorby nádoru. Typickými receptory VEGF (VEGFR) jsou receptory typu tyrosinkináz ze třídy III, které jsou charakteristické tím, že mají několik, typicky 5 nebo 7 smyček podobných imunoglobulinu (immunoglobulin-like loops) ve svých aminokoncových extracelulárních receptorových doménách vázajících ligand.(Kaipainen et al., J. Exp. Med., 178: 2077-2088 (1993)). Další dvě oblasti zahrnují transmembránovou oblast a karboxykoncovou intracelulární katalytickou doménu přerušenou inzercí sekvencemi hydrofilní interkinázy o variabilních délkách, která je nazývána kinázová inzertní doména (kinase insert domain) (Terman et al., Oncogene, 6: 1677-1683 (1991). Receptory VEGF zahrnují fms-like tyrosinkinázový receptor (flt-1), nebo VEGFR-1, který byl sekvenován kolektivem Shibuya et al., Oncogene, 5: 519-524 (1990), receptor obsahující kinázovou inzertní doménu/kináza fetálních jater(KDR/flk1), nebo VEGFR-2, popsaný v přihlášce WO 92/14248, podané

20. února 1992 a v Terman et al., Oncogene, 6: 1677-1683 (1991) a sekvenovaný kolektivem Matthews et al., Proč.

Nati. Acad. Sci. USA, 88: 9026-9030 (1991), ačkoliv i jiné receptory, jako neuropilin-1 a -2, se rovněž vážou s VEGF. Jiný receptor tyrosinkinázy, VEGFR-3 (flt-4), váže homology VEGF, a to VEGF-C a VEGF-D, a je významnější ve vývoji lymfatických cév.

[07] Vysoké hladiny Flk-1 jsou exprimovány endotelovými buňkami, které infiltrují gliomy (Plate et al., (1992) Nátuře 359: 845-848). Hladiny Flk-1 jsou specificky regulovány nahoru (upregulation) pomocí VEGF, produkovaným lidskými glioblastomy (Plate et al. (1993) Cancer Res. 53: 5822-5827). Nález vysokých hladin exprese Flk-1 v endotelových buňkách asociovaných s glioblastomy (glioblastoma associated endothelial cells, GAEC)) naznačuje, že aktivita receptoru je pravděpodobně indukována během tvorby nádoru, protože v normálních endotelových buňkách mozku jsou transkripty Flk-1 stěží detekovatelné. Tato regulace nahoru je omezena na vaskulární endotelové buňky v těsné blízkosti nádoru. Blokace aktivity VEGF neutralizačními anti-VEGF monoklonálními protilátkami (monoclonal antibodies, mAbs nebo Mabs) vedla k inhibici růstu lidských nádorových xenotransplantátů u holých myší (Kim et al. (1993) Nátuře 362: 841-844), což naznačuje přímou úlohu VEGF v angiogenezí spojené s nádorem.

[08] Ačkoliv ligand VEGF je v nádorových buňkách regulován nahoru a jeho receptory jsou regulovány nahoru • · · v nádorových infiltrovaných vaskulárních buňkách, je exprese ligandu VEGF a jeho receptorů v normálních buňkách, které s angiogenezí nejsou asociovány, nízká. Z tohoto důvodu nemohou být takové normální buňky dotčeny blokací interakce mezi VEGF a jeho receptory pro inhibici angiogeneze, a tudíž růstu nádoru.

[09] Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí antagonistů receptoru VEGF. Dalším předmětem tohoto vynálezu je poskytnutí způsobů inhibice angiogeneze, a tudíž inhibice nebo snížení růstu nádorů u savců, s použitím takovýchto antagonistů receptoru VEGF, výhodně pak způsobů s použitím takovýchto antagonistů receptoru VEGF kombinovaných se zářením, chemoterapií, nebo s jiným antagonistou receptoru.

STRUČNÝ SOUHRN VYNÁLEZU [10] Předkládaný vynález poskytuje způsoby redukce nebo inhibice růstu nádorů u savce podáním účinného množství kombinace antagonisty receptoru VEGF s dalším antagonistou receptoru. Rovněž jsou podle předkládaného vynálezu poskytnuty způsoby redukce nebo inhibice růstu nádorů u savců podáním účinného množství kombinace antagonisty receptoru VEGF a záření. Kromě toho poskytuje předkládaný vynález způsoby redukce nebo inhibice růstu nádorů u savců podáním účinného množství antagonisty receptoru VEGF a chemoterapeutického agens

STRUČNÝ POPIS OBRÁZKŮ [11] Obrázek 1: Western blot flk-1 (VEGFR-2)/SEAPS imunoprecipitace s monoklonální protilátkou DC-101 znázorňující, že DC-101 imunoprecipituje myší flk-1:SEAPS, nikoliv však samotný SEAPS.

• · • · • ··· ···· [12] Obrázky 2a a 2b: Obrázek 2a: Kompetitivní inhibiční zkouška prokazující účinek monoklonální protilátky DC-101 anti-flk-1 (VEGFR-2) na fosforylaci flk-1 (VEGFR-2)/fms receptoru indukovanou VEGF165 v transfekovaných buňkách 3T3 Obrázek 2b: Citlivost fosforylace flk-1 (VEGFR-2)/fms receptoru indukované VEGF k inhibici monoklonální protilátkou DC-101. Buňky C441 byly testovány při maximální stimulační koncentraci VEGFi₆₅ (40 ng/ml) v kombinaci s proměnlivými hladinami protilátky.

[13] Obrázky 3a a 3b: Obrázek 3a: Titrace fosforylace flk-1 (VEGFR-2)/fms receptoru indukované VEGF v přítomnosti mAb DC-101. Buňky C441 byly stimulovány s uvedenými koncentracemi v přítomnosti(čáry 1 až 4) nebo v nepřítomnosti (čáry 5 až 8) 5 gg/ml mAb DC-101.

Nestimulované buňky testované v přítomnosti protilátky (čára 9) slouží jako kontrola. Obrázek 3b: Je vyneseno denzitometrické zobrazení hladiny fosforylovaného receptoru ke každé z čar Obrázku 3a, vztažené ke každé koncentraci VEGF tak, aby byl zobrazen rozsah inhibice mAb při nadbytku koncentrací ligandu. Pro detekci s anti-fosfotyrosinem byly připraveny buněčné lyzáty tak, jak je popsáno v Příkladech provedení níže.

[14] Obrázek 4: Inhibice aktivace VEGF-flk-1 (VEGFR2)/fms s předem vázanou mAb DC-101. Buňky C441 byly stimulovány s uvedenými koncentracemi VEGF v nepřítomnosti (čáry 3 a 4) a v přítomnosti (čáry 5 a 6) DC-101. Nestimulované buňky (čáry 1 a 2) slouží jako kontroly. MAb byla testována s použitím dvou souborů podmínek. Pro P byly ·· • « • · · • ···· • · *

buňky předem vázány s mAb s následnou stimulací s VEGF po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Pro C byly mAb a ligand přidány simultánně a testovány tak, jak je uvedeno výše.

·· ·* ♦ · · e ··· • · · • · * ···· ·· ·« * • · · • ··*· • · [15] Obrázek 5: Fosforylace flk-1 (VEGFR-2)/fms receptoru indukovaná VEGF působením různých koncentrací monoklonální protilátky DC-101 a kondicionovanými médii z buněk glioblastomu (GB CM).

[16] Obrázek 6: FACS analýza vazby anti-flk-1 (VEGFR2) mAb k buňkám 3T3 transfekovaným flk-1 (VEGFR-2)/fms (C441). Buňky 3T3 transfekované flk-1 (VEGFR-2)/fms byly inkubovány na ledu po dobu 60 minut s 10 pg/ml anti-flk-1 (VEGFR-2) mAb DC-101, nebo s vhodným izotypem mAb 23H7 irelevantním k anti-flk-1. Buňky byly promyty a reinkubovány s 5 pg kozího anti-myšího IgG konjugovaného s FITC, promyty a analyzovány průtokovou cytometrií ke stanovení vazby protilátky. Výsledky ukazují hladinu fluorescence DC-101 vázané k buňkám C441 v porovnání s fluorescencí detekovanou s irelevantní mAb 23H7.

[17] Obrázek 7: Saturační vazba mAb DC-101 k receptoru flk-1 (VEGFR-2)/fms na transfekované buněční linii 3T3, označené C441. Konfluentní buňky C441 byly inkubovány ve 24 jamkových destičkách se zvyšujícími se koncentracemi mAb DC-101 (50 ng/ml až 2 pg/ml) po dobu 2 hodin při 4° C.

Buňky byly promyty a inkubovány s 5 μς konjugátu anti-krysí IgG-biotin. Ke stanovení vazby byly buňky promyty, inkubovány s ředěním 1:1000 streptavidín-HRP, promyty a inkubovány v kolorimetrickém detekčním systému (TMB). Výsledky reprezentují absorbanci při 540 nm oproti zvyšujícím se koncentracím mAb DC-101. Vazba sekundární * 0 <·>

• ····

0

protilátky k buňkám samotným byla od každého stanoveni odečtena pro korekci nespecifické vazby. Výsledky uvádějí průměr ze tří nezávislých pokusů.

[18] Obrázek 8 :Imunoprecipitace fosforylovaného flk-1 (VEGFR-2)/fms z buněk 3T3 transfekovaných flk-1 (VEGFR2)/fms a stimulovaných s VEGF. Buňky byly stimulovány s VEGF tak, jak je popsáno v Postupech příkladů, a lyzáty byly imunoprecipitovány s irelevantními nebo relevantními protilátkami následovně: 1. krysí anti-FLK2 IgG2a (mAb 2A13); 2. krysí anti-flk-1 (VEGFR-2) IgGl (mAb DC-101); 3. krysí anti-FLK2 IgGl (mAb 23H7); 4. králičí anti-fms polyklonální protilátka; Imunoprecipitovaný protein byl podroben SDS PAGE s následným Western blottingem. Imunoprecipitace receptorů aktivovaného VEGF byla detekována testováním blotů s anti-fosfotyrosinovou protilátkou.

[19] Obrázek 9: Citlivost fosforylace indukované VEGF na inhibici receptorů flk-1 (VEGFR 2)/fms pomocí mAb DC101. Předběžné vazebné a kompetitivní zkoušky byly provedeny se 40 ng/ml VEGF při uvedených koncentracích protilátky. Buněčné lyzáty byly připraveny pro detekci receptorů s anti-fosfotyrosinovou protilátkou tak, jak je popsáno v Příkladech níže.

[20] Obrázek 10: Účinek mAb DC-101 na fosforylaci receptorů fms indukovanou CSF-1. V provedení (B) byla buněčná linie 3T3 transfekovaná fms/FLK 2, linie 10A2, stimulována s optimálními stimulačními hladinami CSF-1 v nepřítomnosti (čáry 3 a 4) a v přítomnosti (čáry 5 a 6) 5 μρ/πιΐ mAb DC-101. Nestimulované buňky testované v nepřítomnosti (čára 1) nebo v přítomnosti (čára 2) • · · • · • · protilátky slouží jako kontroly. Buněčné lyzáty byly připraveny pro detekci s anti-fosfotyrosinovou protilátkou tak, jak je popsáno v Příkladech níže.

[21] Obrázek 11: Specifičnost neutralizace aktivovaného receptorů flk-1 (VEGFR-2)/fms s monoklonální protilátkou DC-101 (mAb DC-101). Buňky C441 bylystimulovány s 20 nebo 40 ng/ml VEGF v přítomnosti DC-101 (IgGl), nebo irelevantních krysích anti-FLK-2 protilátek 2A13 (IgG2a) či 23H7 (IgGl). Zkoušky byly prováděny s každou z protilátek v nepřítomnosti VEGF (čáry 1 až 3) a v přítomnosti VEGF za kompetitivních podmínek (čáry 4 až 8), nebo za podmínek s předvázáním (čáry 9 až 11). Buněčné lyzáty byly připraveny pro detekci s anti-fosfotyrosinovou protilátkou tak, jak je popsáno v Příkladech níže. Bloty byly vyříznuty a znovu testovány na detekci receptorů flk-1 (VEGFR-2)/fms s použitím králičí polyklonální protilátky k C-koncové oblasti receptorů fms.

[22] Obrázek 12: Imunoprecipitace proužků fosforylovaného receptorů z buněk HUVEC stimulovaných VEGF. Buňky HUVEC byly pěstovány ke subkonfluenci v růstovém médiu pro endotelové buňky (endothelial growth medium (EGM)) po dobu tří dnů bez výměny média. Receptorové formy byly imunoprecipitovány s mAb DC-101 z lyzátů nestimulovaných buněk (čára 1), buněk stimulovaných VEGF (čára 2), a buněk stimulovaných s VEGF v přítomnosti 1 μg/ml heparinu (čára 3). Fosforylační zkoušky, imunoprecipitace a detekce fosforylovaných forem receptorů byly prováděny tak, jak je popsáno v Postupech příkladů.

[23] Obrázek 13: Účinek mAb DC-101 na proliferaci buněk HUVEC, jako odpovědi na VEGF. Buňky byly pěstovány po • · • » ··· · · · ··· ···· · ··· · ··· • · · · · ······· ···· ₁₀ ·..· : ·..· :

dobu 48 hodin tak, jak je popsáno v legendě k Obrázku 6.

Poté byly buňky podrobeny následujícím alternativním podmínkám testu: žádný přídavek do média (neošetřené); výměna média za čerstvé růstové médium pro endotelové buňky (fresh endothelial growth medium)(kompletní médium); přídavek 10 ng/ml VEGF v nepřítomnosti nebo v přítomnosti heparinu v množství 1 pg/ml; a buňky ošetřené VEGF a VEGFheparinem testované v přítomnosti 1 gg/ml DC-101. Byla testována proliferace buněk kolorimetrickou detekcí při 550 nm s použitím testovacího kitu ke stanovení buněčné proliferace (Promega).

[24] Obrázky 14a a 14b. Obrázek 14a: Redukce nádorového růstu u jednotlivých zvířat s DC-101 (krysí anti-flk-1 monoklonální protilátka). Obrázek 14b: Redukce nádorového růstu u jednotlivých zvířat v kontrolní skupině s 2A13 (krysí anti-flk-2 monoklonální protilátka).

[25] Obrázek 15: Athymické holé myši byly subkutánně injikovany s lidskou glioblastomovou buněčnou linií GBM-18 a myši byly rozděleny do tří skupin: PBS kontrola, irelevantní krysí IgGl kontrola 23H7, a DC-101. Ošetření bylo prováděno simultánně s nádorovými xenotransplantáty a pokračovalo po dobu čtyř týdnů.

[26] Obrázek 16: Graf znázorňující přímou vazbu různých protilátek scFv (plCll, plFl2, p2A6 a p2A7) k imobilizovanému KDR (VEGFR-2).

[27] Obrázek 17: Graf znázorňující inhibici vazby KDR (VEGFR-2) k imobilizovanému VEGFi₆₅ s různými protilátkami scFv (plCll, plFl2, p2A6 a p2A7).

• · •· · ·· · • · · ··· · · · • · · · · ··· · ··· • · · · · · ···· · · · ··· [28] Obrázek 18: Graf znázorňující inhibici proliferace buněk HUVEC, vyvolané VEGF, pomocí protilátek scFv (p2A6 a plCll).

[29] Obrázek 19: Nukleotidová a odvozená aminokyselinová sekvence V_H a V_L řetězců c-plCll.

[30] Obrázek 20: Graf znázorňující přímou vazbu protilátek (c-plCll, plCll, p2A6) k imobilizovanému KDR (VEGFR-2).

[31] Obrázek 21: Graf znázorňující FACS analýzu vazby c-plCll k buňkám HUVEC, exprimujícím KDR (VEGFR-2).

[32] Obrázek 22: Graf znázorňující inhibici vazby receptoru KDR (VEGFR-2) k imobilizovanému VEGFigs s různými protilátkami scFv(c-plCll, plCll a p2A6).

[33] Obrázek 23: Graf znázorňující inhibici vazby radioaktivně značeného VEGF165 k imobilizovanému receptoru KDR (VEGFR-2) s c-plCll a cold VEGFi₆₅.

[34] Obrázek 24: Graf znázorňující inhibici proliferace buněk HUVEC, vyvolané VEGF, pomocí anti-KDR (VEGFR-2) protilátek (c-plCll, plCll).

PODROBNÝ POPIS VYNÁLEZU [35] Předkládaný vynález poskytuje způsoby redukce nebo inhibice růstu nádorů u savců ozařováním·, chemoterapií

4

4 ·

4 4·· • · · a/nebo dalšího antagonistý receptorů v kombinaci s antagonistý receptorů VEGF.

[36] Ve výhodném provedení existuje synergie, jestliže jsou nádory, včetně nádorů lidských, ošetřeny antagonistý receptorů VEGF ve spojení s chemoterapeutickými agens, zářením, nebo dalším antagonistou receptorů, nebo jejich kombinací. Jinak řečeno, je inhibice růstu nádorů antagonistou receptorů VEGF více zvýšena, než je očekáváno od kombinace s chemoterapeutickými agens, zářením, dalším antagonistou receptorů, nebo jejich kombinace. Synergie může být například prokázána vyšší inhibici nádorového růstu pomocí kombinovaného ošetření, než by byl očekávaný aditivní účinek ošetření kombinace antagonistý receptorů VEGF s chemoterapeutickým agens, zářením, nebo dalším antagonistou receptorů. Synergie je výhodně prokázána remisí nádoru tam, kde remise není očekávána na základě léčby kombinací antagonistý receptorů VEGF a chemoterapeutického agens, záření, nebo jiného antagonistý (Viz Příklad VIII.).

[37] Antagonista receptorů VEGF je podáván před, během, nebo po zahájení chemoterapie nebo radioterapie, stejně jako při jakékoliv kombinaci těchto terapií, například před a během, před a po, během a po, nebo před, během a po zahájení chemoterapie a/nebo radioterapie. Tak například, jestliže antagonistou VEGF receptorů je protilátka, je tato protilátka typicky podávána 1 až 30 dnů, výhodně 3 až 20 dnů, nejvýhodněji pak 5 až 12 dnů před zahájením radioterapie a/nebo chemoterapie.

[38] Ozařování

9 9 · ·

9·· «9 * · • · · • · · 9 9 9 [39] Zdroj záření, použitým v kombinaci s antagonistou receptoru VEGF, může vzhledem k ošetřovanému pacientovi být buďto externí nebo interní. Jestliže je zdroj vzhledem k pacientovi externí, je terapie známá jako radiační terapie externím paprskem (external beam radiation therapy, EBRT)). Jestliže je zdroj vzhledem k pacientovi interní, je léčba nazývána brachyradioterapií (brachytherapy, BT).

[40] Ozařování je prováděno podle dobře známých standardních technik s použitím standardního zařízení vyrobeného pro tento účel, jako je například AECL Theratron a Varian Clinac. Dávka záření závisí na řadě faktorů tak, jak je v oboru dobře známo. Takové faktory zahrnují orgán, který je ošetřován, zdraví orgánů, které jsou v cestě ozařování a mohou být nepříznivě zasaženy v důsledku nepozornosti, toleranci pacienta k radiační terapii a oblast těla, která léčbu vyžaduje. Dávka bude typicky mezi až 100 Gy, konkrétněji mezi 2 až 80 Gy, Některé dávky, které se v oboru uvádějí, zahrnují 35 Gy pro míchu, 15 Gy pro ledviny, 20 Gy pro játra a 65 až 80 Gy pro prostatu. Nicméně, je třeba zdůraznit, že vynález není omezen na jakoukoliv konkrétní dávku záření. Dávka bude stanovena ošetřujícím lékařem podle specifických faktorů v dané situaci, včetně faktorů uvedených výše.

[41] Vzdálenost mezi zdrojem externího záření a místem vstupu do pacienta může být jakoukoliv vzdáleností, která představuje přijatelnou rovnováhu mezi zabíjením cílových buněk a minimalizací vedlejších účinků. Konkrétně, zdroj externího záření bývá mezi 70 a 100 cm od místa vstupu záření do pacienta.

• · · [42] Brachyradioterapie je obecně prováděna umístěním zdroje záření uvnitř těla pacienta. Konkrétně, zdroj záření je umístěn přibližně 0 až 3 cm od ošetřované tkáně. Známé techniky zahrnují intersticiální, interkavitární a povrchovou brachyradioterapii. Zdroje radioaktivity mohou být implantovány jako permanentní nebo dočasné. Některé z běžných radioaktivních atomů, které jsou používány v dočasných implantátech, zahrnují radium, cesium-137 a iridium-192. Některé z dalších radioaktivních atomů, které jsou používány v brachyradioterapii, zahrnují americium-241 a zlato-198.

[43] Dávka záření v brachyradioterapii může být shodná s dávkou uvedenou pro externí radioterapii. Kromě faktorů výše uvedených pro stanovení dávky externí radiační terapie, je při stanovování dávky brachyradioterapie též vzata v úvahu povaha použitého radioaktivního atomu.

[44] Chemoterapie [45] Chemoterapeutické agens zahrnují všechny chemické sloučeniny, které jsou účinné v inhibici růstu nádorů.

[46] Podání chemoterapeutických agens může být prováděno řadou cest, včetně systémového, parenterálního a enterálního způsobu. V jednom z provedení vynálezu jsou antagonista receptorů VEGF a chemoterapeutické agens podávány jako oddělené molekuly. V jiném provedení je antagonista receptorů VEGF připojen, například konjugací, k chemoterapeutickému agens.

[47] Příklady chemoterapeutických agens zahrnují alkylační činidla, jako například nitrogen mustards,

ethyleniminové sloučeniny a alkyl sulfonáty;

antimetabolity, jako například kyselinu listovou, purinové nebo pyrimidinové antagonisty; mitotické inhibitory, jako například břečťanové alkaloidy a deriváty podophylotoxinu; cytotoxická antibiotika; sloučeniny, které poškozují nebo interferují s expresí DNA.

[48] Kromě toho, chemoterapeutická agens zahrnují protilátky, biologické molekuly a malé molekuly, jak je zde popsáno.

[49] Konkrétní příklady chemoterapeutických agens nebo chemoterapie zahrnují cisplatinu, dicarbazin (DTIC), dactinomycin, mechlorethamin (nitrogen mustard), streptozocin, cyclofosfamid, carmustin (BCNU), lomustin (CCNU), doxorubicin (adriamycin), daunorubicin, procarbazin, mitomycin, cytarabin, etoposid, methotrexat, 5 fluorouracil, vinblastin, vincristin, bleomycin, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxoter), aldesleukin, asparaginázu, busulfan, karboplatinu, cladribin, dacarbazin, floxuridin, fludarabin, hydroxymočovinu, ifosfamid, interferon alfa, leuprolid, megestrol, melphalan, merkaptopUrin, plicamycin, mitotan, pegaspargázu, pentostatin, pipobroman, plicamycin, streptozocin, tamoxifen, teniposid, testolakton, thioguanin, thiotepa, uráčil mustard, vinorelbin, chlorambucil, taxol a jejich kombinace.

[50] Antagonisté receptorů růstových faktorů [51] Antagonisté receptorů růstových faktorů (jiné než antagonisté receptorů VEGF), které mohou být použity v kontextu s předkládaným vynálezem, zahrnují všechny látky, které inhibují stimulaci receptorů růstového ·· · · 4 · 4 4 · I *·· »44 4 « 4 • 4 44 4 444 « « <

• · · 4 · 44444*4 4 • * · 444 44 g 444444 «· » ·» faktoru ligandem receptoru růstového faktoru. Taková inhibice stimulace inhibuje růst buněk, které exprimují receptor růstového faktoru.

[52] Některými příklady receptorů růstových faktorů zúčastněných v tumorogenezi jsou epidermální růstový faktor (epidermal growth factor, EGFR), růstový faktor odvozený od destiček (platelet-derived growth factor PDGFR), inzulinlike růstový faktor (insulin-like growth factor, IGFR), nervový růstový faktor (nerve growth factor, NGFR) a fibroblastový růstový faktor (fibroblast growth factor,

FGF) .

[53] Výhodně je antagonistou receptoru růstového faktoru, který má být použit podle předkládaného vynálezu, antagonista EGFR. Antagonistou EGFR v kontextu s předkládaným vynálezem, je biologická molekula, malá molekula, nebo jakákoliv jiná látka, která inhibuje aktivaci EGFR, a tím inhibuje tyrosinkinázovou aktivitu EGFR a zabraňuje autofosforylaci receptoru a fosforylaci jiných proteinů zúčastněných v různých signalizačních dráhách EGFR. Inhibicí aktivace EGFR je míněno snížení aktivace EGFR, která nemusí kompletně bránit nebo zastavit aktivaci EGFR.

[54] Kromě toho, inhibice aktivace EGFR, tak jak je definována v předkládaném vynálezu, znamená inhibici EGFR, která rezultuje z interakce antagonisty EGFR a receptoru. Interakci je míněna dostatečná fyzikální nebo chemická interakce mezi antagonistou EGFR a receptorem, tak, že je inhibována tyrosinkinázová aktivita. Pro odborníka v oboru jsou příklady takových chemických interakcí, které zahrnují asociace nebo vazby, v oboru známé a zahrnují kovalentní

• · ·· · ♦ · · 9 9 * · · ··· · ·· vazbu, iontovou vazbu, vodíkovou vazbu, atd. mezi antagonistou EGFR a receptorem. Toto kontrastuje s antagonistou EGF, který interaguje s ligandem a tím inhibuje aktivaci.

[55] Jako v případě jiných růstových faktorů, může zvýšená aktivace EGFR rezultovat z vyšších hladin ligandu, amplifikace genu pro EGFR, zvýšené transkripce receptoru nebo z mutací, které způsobují regulaci nahoru signalizace receptoru. Amplifikace genu kódujícího EGFR vede ke zvýšenému počtu vazeb ligandů ke EGFR, jež může dále stimulovat buněčnou proliferaci. EGFR může být rovněž nadměrně exprimován (overexpressed) za absence genové amplifikace, pravděpodobně díky mutacím, které zvyšují transkripci EGFR, translaci mRNA, nebo stabilitu proteinu. Mutanty EGFR byly identifikovány v gliomech, nemalobuněčných plicních karcinomech, karcinomech vaječníků a karcinomech prostaty, které mají konstitutivně aktivní tyrosinkinázu, což svědčí o úloze aktivity vysoké hladiny EGFR spíše než nadměrné exprese EGFR v nádorech. Viz, například, Pedersen et al., Ann. Oncol.,12 (6): 745-60 (2001). (Mutace EGFR typu III - různě nazývané EGFRvIII, de2-7 EGFR nebo AEGFR - postrádá část extracelulární domény vázající ligand, kódované exony 2-7.); viz také Wikstrand et al., Cancer Res., 55: 3140-3148 (1995).

[56] V jednom provedení předkládaného vynálezu inhibuje antagonista vazbu EGFR ke svému ligandu. Vazba ligandu k externí, extracelární doméně EGFR stimuluje dimerizaci receptoru, autofosforylaci EGFR, aktivaci interní cytoplasmatické tyrosinkinázové domény receptoru a iniciaci mnohočetných transdukčních drah, zúčastněných

v. regulaci syntézy DNA a buněčného dělení. Ligandy EGFR • · ·

• · · · ♦ * · · ···· • · · · zahrnují, například EGF, TGF-α, amphiregulin, heparinvázající EGF (heparin-binding EGF, ΗΒ-EGF) a betarecullulin. Předpokládá se, že EGF a TGF-ct jsou hlavními endogenními ligandy, které rezultují ze stimulace zprostředkované EGFR, ačkoliv bylo prokázáno, že TGF-ct je účinnější v podpoře angiogeneze.

[57] V jiném provedení podle předkládaného vynálezu se antagonista EGFR váže s EGFR. Je třeba uvést, že antagonista EGFR se může vázat externě k extracelulární části EGFR, což může nebo nemusí inhibovat vazbu ligandu, nebo interně k tyrosinkinázové doméně. Příklady antagonistů EGFR, které vážou EGFR, zahrnují, bez omezení, biologické molekuly, jako jsou protilátky (a jejich funkční ekvivalenty) specifické proti EGFR a syntetické kinázové inhibitory, které působí přímo na cytoplasmatickou doménu EGFR, jako jsou malé molekuly.

[58] Antagonistou EGFR podle předkládaného vynálezu je výhodně biologická molekula, výhodněji protilátka nebo její funkční ekvivalent, specifická proti EGFR. Popis protilátek použitelných podle předkládaného vynálezu může být nalezen v části nazvané „Protilátky. Kromě toho, po vazbě protilátky je komplex EGFR-protilátka výhodné internalizován a degradován, čímž je zabráněno opětnému využití receptoru buňkou.

[59] Známou biologickou molekulou, jako antagonista EGFR, je ERBITUX™, (IMC-C225), která je chimérickou (člověk/myš) monoklonální protilátkou specifickou proti EGFR. Viz například US Patent č. 4 943 533 (Mendelsohn et al.); US Patent č. 6 217 866 (Schlessinger et al.); US přihlášky č. 08/973 065 (Goldstein et al.) a 09/635 974 • 0 · • ··

0 0 0

0 00 0 •00 ·· 0« · ·

0 0 ·

000 · * 0 0 0 0 ••000 0000 00 ·0 • ·

0 0 • ···· (Teufel); WO 99/60023 (Waksal et al.) a WO 00/69459 (Waksal). Monoklonální protilátka ERBITUX™ specificky váže EGFR a blokuje vazbu ligandu, například EGF. Tato blokáda vede k inhibici růstu nádoru, která zahrnuje inhibici invaze nádoru, metastáz, buněčné opravy a angiogeneze, a to interferencí ,s účinky aktivace EGFR. Kromě toho, nebo jinak, může monoklonální protilátka ERBITUX™ podpořit internalizaci komplexu receptor-protilátka, čímž je zabráněno další stimulaci receptoru ligandem nebo jakýmkoliv jiným mechanismem.

. [60] Jiným příkladem biologické molekuly, jako antagonisty EGFR, je ABX-EGF, která je úplnou lidskou IgG2 monoklonální protilátkou specifickou proti EGFR. ABX-EGF se váže s EGFR s vysokou specifičností, čímž blokuje vazbu EGFR k oběma svým ligandům, tj. EGF a TGF-α. Viz, například, Figlin et al., Abstract 1102, presented at the 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001. Sekvence a charakteristika ABX-EGF, která byla dříve známa jako klon E7.6.3, je popsána v US Patentu č. 6 235 883 (Abgenix, lne.) ve sloupci 28, od řádku 62 až do sloupce 29, řádku 36 a na Obrázcích 29 až 34. Viz Yang et al., Critical Rev.Oncol./Hematol., 38 (1): 17-23 (2001).

[61] V alternativním, avšak rovněž upřednostňovaném provedení, je antagonistou podle předkládaného vynálezu malá molekula tyrosinkinázového inhibitoru. Popis malých molekul může být nalezen v části „Malé molekuly. Byla popsána řada malých molekul vhodných pro inhibici EGFR.

[62] Tak například, Spada et al., US Patent č. 5 656 655, popisuje styrylem substituované heteroarylová sloučeniny, které inhibují EGFR. Heteroarylovou skupinou je ·· * · * φφφ φ 9 9

ΦΦΦΦ Φ φφφ φ 99φ ♦ * 9 · 9 · 9999 · 9 9 ·»· • Φ * 9φφ 9 9 9 ···· Φ · *· Φ ·· 9 monocyklických kruh s jedním nebo dvěma heteroatomy, nebo bicyklický kruh s 1 až přibližně 4 heteroatomy, přičemž sloučenina může být případně substituována nebo polysubstituována. Sloučeniny popsané v US patentu č. 5 656

655 jsou zde zahrnuty formou odkazu.

[63] Spada et al., US Patent č. 5 646 153 popisuje bis mono a/nebo bicyklický aryl heteroarylové, karbocyklické a heterokarbocyklické sloučeniny, které inhibují EGFR. Sloučeniny popsané v US Patentu č. 5 646 153 jsou zde zahrnuty formou odkazu.

[64] Bridges et al., US Patent č. 5 679 683 popisuje tricyklické pyrimidinové sloučeniny, které inhibují EGFR. Sloučeninami jsou fúzované heterocylické pyrimidinové deriváty, popsané v sloupci 3, od řádku 35 do sloupce 5, řádku 6. Popis těchto sloučenin ve sloupci 3, od řádku 35 do sloupce 5, řádku 6 je zde zahrnut formou odkazu.

[65] Barker, US Patent č. 5 616 582 popisuje chinazolinové deriváty, které mají tyrosinkinázovou inhibiční aktivitu. Sloučeniny popsané v US Patentu č. 5 616 582 jsou zde zahrnuty formou odkazu.

[66] Fry et al., Science, 265: 1093-1095 (1994) popisují sloučeninu mající strukturu, která inhibuje EGFR. Struktura je znázorněna na Obrázku 1. Sloučenina znázorněná na Obrázku 1 podle článku Fry et al. je zde zahrnuta formou odkazu.

[67] Osherov et al., J. Biol. Chem., 268 (15): 11,

134-42 (1993) popisují tyrphostiny, které inhibují EGFR/HER1 a HER2. Sloučeniny popsané v článku Osherov et •9 9· • 9 9

999 ♦ 9 9

9 9 ·· ♦ 99 · • 9 9 9 9 9 • 999 9 999

9 9 9999 9 9 9 999 • 9 9 9 9 9 ·· · 99 9 al., a zejména ty sloučeniny, které uvádějí Tabulky I, II,

III a IV, jsou zde zahrnuty formou odkazu.

[68] Levitzki et al., US Patent č. 5 196 446, popisují heteroarylethendiylové nebo heteroarylethendiylarylové sloučeniny, které inhibují EGFR. Sloučeniny popsané v ÚS Patentu č. 5 196 446 od sloupce 2, řádku 42 do sloupce 3, řádku 40 jsou zde zahrnuty formou odkazu.

[69] Pánek et al., J. Pharma. Exp. Thera., 283: 14331444 (1997) popisují sloučeninu označenou jako PD166285, která inhibuje receptory z rodin EGFR, PDGFR a FGFR.

PD166285 byla identifikována jako 6-(2,6-dichlorfenyl)-2-(4-(2-diethylaminoethoxy)fenylamino)-8-methyl-8H-pyrido(2,3-d)pyrimidin-7-on, mající strukturu znázorněnou v článku Pánek et al na Obrázku 1 na straně 1436, je zde zahrnuta formou odkazu.

[70] Jedním z příkladů malé molekuly, jako antagonisty EGFR, je IRESSA™ (ZD1939) , která je chinazolinovým derivátem, jež působí v inhibici EGFR jako mimetikum ATP.

Viz US Patent č. 5 616 582 (Zeneca Limited); WO 96/33980 (Zeneca Limited) na straně 4; viz rovněž Rowinsky et al., Abstract 5, presented at the 37th Annual Meeting of ASCO,

San Francisco, CA, 12-15 May 2001; Anido et al., Abstract 1712, presented at the 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001.

[71] TARCEVA™ je dalším příkladem malé molekuly, jako antagonisty EGFR. TARCEVA™ (OSI-774) je 4-substituovaný fenylamino chinazolinový derivát[6,7-Bis(2-methoxy-ethoxy)-chinazolin-4-yl]-(3-ethynyl-fenyl)amin hydrochlorid] inhibitoru EGFR, který je popsán ve WO 96/30347 (Pfizer • ΦΦΦ ·· · · ··· φφφ ··♦ • ··· · · · φ · · · · ♦ · ♦ · · · ···· · · · φφφφ φφφ φ φ · φφφ φφφφ ·· φφ · ·· >

lne.), například, na straně 2, od řádku 12 do strany 4, řádku 34 a na straně 19, řádcích 14-17. Viz také Moyer et al., Cancer Res., 57: 4838-48 (1997); Pollack et al.,J. Pharmacol., 291: 739-48 (1999). TARCEVA™ může působit inhibici fosforylace EGFR a svojí kinázovou signální transdukční drahou po směru Pl3/Akt a MAP (mitogen activated protein), vedoucí k zastavení buněčného cyklu zprostředkovaném p27. Viz Hidalgo et al., Abstract 281, presented at the 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001.

[72] Je známo mnoho jiných malých molekul, které inhibují EGFR. Některé z příkladů malých molekul jako antagonistů EGFR jsou popsány ve WO91/116051, WO96/30347, WO96/33980, WO 97/27199 (Zeneca Limited), WO 97/30034 (Zeneca Limited), WO97/42187 (Zeneca Limited), WO 97/49688 (Pfizer lne.), WO 98/33798 (Warner Lambert Company),

WOOO/18761 (American Cyanamid Company) a WO 00/31048 (Warner Lambert Company). Příklady specifických malých molekul, jako antagonistů EGFR, zahrnují Cl-1033, tj. chinazolin(N-[4-(3-chlor-4-fluor-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]-akrylamid), který je inhibitorem tyrosinkináz, zejména EGFR, a je popsán ve WO00/31048 (Warner Lambert Company) na straně 8, řádcích 22-6; PKI166, který je pyrrolopyrimidinovým inhibitorem EGFR, a je popsán ve WO97/27199 (Novartis AG) na stranách 10-12; GW2016, který je inhibitorem EGFR a HER2; a EkB569.

[73] Další antagonisté EGFR mohou být snadno určeni s použitím dobře známých metod. Antagonisté EGFR podle předkládaného vynálezu inhibují tyrosinkinázovou aktivitu EGFR, jež obecně zahrnuje fosforylační reakce. Proto jsou zkoušky fosforylace vhodné pro určení antagonistů vhodných • 4 4«

4 4

444 ♦ · 4

4 4

4444 44 • · 4 4 4 4

4 4 4 4 444

4 4444 4 4 4 444

4 4 4 4 4 ·· · 44 4 k použití v kontextu s předkládaným vynálezem. Některé zkoušky tyrosinkinázové aktivity jsou popsány v Pánek et al. (1997) a Batley et al., Life Sci., 62: 143-50 (1998). Kromě toho mohou být použity metody specifické pro detekci exprese EGFR. Tyto metody zahrnují imunohistochemii, (immunohistochemistry, IHC) pro detekci exprese proteinu, fluorescenční hybridizaci in šitu (fluorescence in šitu hybridization, FISH) pro detekci genové amplifikace, kompetitivní radioligandové vazebné zkoušky (competitive radioligand binding assays), techniky blotování na pevných nosičích (solid matrix blotting techniques), jako je Northern a Southern blotting, reverzní transkriptázová polymerázová řetězcová reakce (reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT PCR) a ELISA. Viz, například, Grandis et al., Cancer, 78: 1284-1292. (1996); Shimizu et al., Japan J. Cancer Res., 85: 567-571 (1994); Sauter et al., Am. J. Path., 148: 1047-1053 (1996); Collins, Glia,

15: 289-296 (1995); Radinsky et al., Clin. Cancer Res., 1: 19-31 (1995); Petrides et al., Cancer Res., 50: 3934-3939 (1990); Hoffmann et al., Anticancer Res., 17: 4419-4426 (1997); Wikstrand et al., Cancer Res., 55: 3140-3148 (1995).

[74] Antagonisté receptorů VEGF [75] V jiném provedení se antagonista receptorů VEGF specificky váže k epitopu na extracelulámí doméně receptorů VEGF. Extracelulámí doména receptorů VEGF je doména pro vazbu ligandů. Doména pro vazbu ligandů může být nalezena na každém konci receptorů, avšak normálně se nalézá na aminoterminálním konci.

φφφ • ΦΦΦΦ 9 9

9 φ

ΦΦΦ Φ

Φ ΦΦΦΦ Φ Φ ΦΦ Φ [76] Některé příklady receptorů VEGF zahrnují receptory proteinu tyrosinkinázy, označované v literatuře jako flt-1 (VEGFR-1), KDR a flk-1 (VEGFR-2). Pokud není uvedeno jinak, nebo jasně není jinak naznačeno z kontextu, používá tento popis běžnou nomenklaturu receptorů VEGF, známou z literatury. KDR (VEGFR-2) je označován jako lidská forma receptoru VEGF, mající molekulovou hmotnost (MW) 180 kD (Terman et al., výše). Flk-1 (VEGFR-2) je označován jako myší homolog KDR (Matthews et al., výše). Flt-1 (VEGFR-1) je označován jako forma receptoru VEGF odlišná, avšak příbuzná s receptorem KDR/flk-1 (VEGFR-2). Viz Shibuya et al., výše.

[77] Jiné receptory VEGF zahrnují ty, které mohou být křížově značeny s VEGF, nebo ty, které mohou být koimunoprecipitovány s KDR (VEGFR-2). Některé známé formy těchto receptorů VEGF mají molekulové hmotnosti přibližně 170 kD, 150 kD, 130-135 kD, 120-125 kD a 85 kD. Viz, například, Quinn et al. Proč. Nati Acad. Sci USA, 90: 75337537 (1993); Scher et al., J. Biol. Chem., 271: 5761-5767 (1996).

[78] Receptor VEGF je obvykle vázán na buňku, jakou je například endotelová buňka. Receptor VEGF může být rovněž vázán na buňku, která není endotelovou buňkou, tj.na takovou, jako je nádorová buňka. Nebo může být receptor VEGF volný, výhodně v rozpustné formě.

[79] Antagonisté neutralizují podle předkládaného vynálezu receptory VEGF. V tomto popise výraz neutralizující receptory VEGF znamená inaktivaci vlastní kinázové aktivity receptoru pro přenos signálu. Spolehlivou φ φ • · · φφφφ • φφφ φφφ φ φ φφφφ φ • * φ φφ

• φ φ φφ φ zkouškou neutralizace receptorů VEGF je inhibice fosforylace receptorů.

[80] Předkládaný vynález není omezen jakýmkoliv zvláštním mechanismem neutralizace receptorů VEGF. V době podání této přihlášky vynálezu nebyl mechanismus neutralizace receptorů VEGF dobře pochopen a mechanismus působení jednoho antagonisty není nezbytně shodný s mechanismem působení jiného antagonisty. Některé z možných mechanismů zahrnují zabránění vazby ligandu VEGF k extracelulární vazebné doméně receptorů VEGF a zabránění dimerizace nebo oligomerizace receptorů. Nicméně, ani jiný mechanismus nemůže být vyloučen.

[81] Antagonistou receptorů VEGF (nebo VEGFR) v kontextu s předkládaným vynálezem je biologická molekula, malá molekula, nebo jakákoliv jiná látka, která inhibuje receptory podrodiny VEGF. Inhibici aktivace receptorů podrodiny VEGFR je míněno snížení aktivace VEGFR. To znamená, že zabránění aktivace nemusí kompletně zastavit aktivaci VEGFR. Kromě toho inhibice aktivace VEGFR tak, jak je definována podle předkládaného vynálezu, znamená inhibici antagonisty VEGFR způsobenou interakcí antagonisty VEGFR a VEGFR. Asociací je míněna dostatečná fyzikální nebo chemická interakce mezí antagonistou VEGFR a VEGFR tak, že tyrosinkinázová aktivita receptorů je inhibována. Odborník v oboru snadno určí příklady takových chemických interakcí známých v oboru, které zahrnují asociaci nebo vazbu, včetně kovalentní vazby, iontové vazby, vodíkové vazby a podobně. Obdobně antagonisté VEGFR podle předkládaného vynálezu inhibují tyrosinkinázovou aktivitu receptorů, což brání autofosforylaci receptorů a fosforylaci různých jiných proteinů, zúčastněných ve VEGFR signalizačních drahách.

99 • · · • ··· ♦ 9 9 9

9 9

9999 9«

9 9 9 • »99999 • · 9 ·

• 9 9 «9

9 9 «

9 9999 •99

9

Takové dráhy, které jsou zúčastněny v regulaci vaskulogeneze a angiogeneze, zahrnují jakoukoliv z následujících: fosfolipázovou Cy dráhu (phospholipase Cy pathway, PLCy) nebo dráhu fosfatidylinositol 3'kináza (PI3K)/Akt a mitogenem aktivovanou protein kinázovou dráhu (mitogen activated protein kinase (MAPK) pathway). Viz, například, Larrivée et al.,Intl. J. Mol. Med., 5: 447-56 (2000).

[82] Podrodina receptorů VEGFR je charakterizována přítomností sedmi imunoglobulin-like smyček v extracelulární doméně, jednou transmembránovou oblastí a rozdělenou tyrosinkinázovou doménou v intracelulární oblasti (třída III receptorových tyrosinkináz). Je známa řada členů receptorů z podrodiny VEGFR, jejichž příklady zahrnují VEGFR-1, VEGFR-2 a VEGFR-3. Obecně se předpokládá, že KDR (VEGFR-2) je hlavním přenašečem signálu VEGF, který rezultuje v proliferaci endotelových buněk, migraci, diferenciaci, tvorbu kanálků, zvýšení vaskulární permeability a zachování vaskulární integrity. VEGFR-1 má mnohem slabší kinázovou aktivitu a není schopen vyvolat mitogenní odpověď, jestliže je stimulován pomocí VEGF, ačkoliv se váže k VEGF s afinitou, která je přibližně 10 x vyšší než má KDR (VEGFR-2). VEGFR-1 je rovněž zúčastněn v migraci monocytů a makrofágů a v produkci tkáňového faktoru, indukovaných VEGF a placentárním růstovým faktorem (P1GF).

[83] Tak, jako v případě EGFR popsaném výše, může zvýšená aktivace VEGFR rezultovat z vyšších hladin ligandu, z amplifikace genu VEGFR, ze zvýšené amplifikace receptoru nebo z mutací, které způsobují zvýšené receptorové signalizování.

• ··· · 0 • · 0

000 · ·» «« 0 • · · • 0 · · • · · 0000 • 0 · ·

0

0 0 • 0 0 0

0·00 •00 • 0 0 [84] V jednom z provedení podle předkládaného vynálezu inhibuje antagonista VEGFR vazbu VEGFR ke svému ligandu. Vazba ligandu k externí, extracelulární doméně VEGFR stimuluje dimerizaci receptorů, autofosforylaci VEGFR, aktivaci receptorové interní cytoplasmatické tyrosinkinázové domény a iniciaci mnohočetných signálních transdukčních drah zúčastněných v regulací vaskulogeneze a angiogeneze.

[85] Ligandy VEGFR zahrnují VEGF a jeho homology P1GF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D a VEGF-E. Tak například, P1GF, který je dimerním sekretovaným faktorem, jenž se váže pouze s VEGFR-1, je produkován ve velkých množstvích vilosním cytotrofoblastem, syncytiotrofoblastem a extravilosním trofoblastem a má velice blízkou aminokyselinovou homologii s VEGF. U lidí existují tři izoformy P1GF-1, P1GF-2 a PlGF3. Studie s PIGF-deficientní myší prokazují, že tento růstový faktor není zúčastněn v angiogenezi per se, ale spíše specificky moduluje angiogenní a permeabilní účinky VEGF během patologických situací. Rovněž VEGF-D je blízce příbuzný s VEGF-C prostřednictvím přítomnosti N- a Ckoncových prodloužení, která nejsou u jiných členů rodiny VEGF nalézána. V dospělých lidských tkáních se mRNA pro VEGF nejvíce vyskytuje v srdci, plicích, kosterních svalech, tlustém střevě a v tenkém střevě. Analýzy specifičnosti receptorů odhalily, že VEGF-D je ligandem jak pro VEGFR-2 (Fikl), tak pro VEGFR-3 (Flt4), a může tyto receptory aktivovat; nicméně, VEGF-D se neváže k VEGFR-1. Kromě toho VEGF-D je mitogenem pro endotelové buňky.

[86] V jiném provedení předkládaného vynálezu se antagonista VEGFR váže s VEGFR. Je třeba uvést, že • 4 · • · · • · · · • · ···· • · · ··> * ·· ·· ·» · • · · · · * • ··· · · · · • · · · · · ···· • · · · · · ···· ·· ·· · antagonista VEGFR se může vázat externě k extracelulární části VEGFR, což může, ale nemusí inhibovat vazbu ligandu, nebo se váže interně k tyrosinkinázové doméně. Příklady antagonistů VEGFR, které se vážou s VEGFR zahrnují, bez omezení, biologické molekuly, jako jsou receptorové ribozymy a protilátky (nebo jejich funkční ekvivalenty) specifické pro VEGFR, a syntetické inhibitory kináz, které působí přímo na cytoplasmatickou doménu VEGFR, tak jako malé molekuly. Výhodně je antagonistou VEGFR podle předkládaného vynálezu biologická molekula a ještě výhodněji protilátka, nebo její funkční ekvivalent, specifická pro VEGFR, jejichž podrobný popis je uveden níže. Alternativně je antagonistou VEGFR podle předkládaného vynálezu malá molekula kinázového inhibitoru, jejíž podrobný popis je uveden níže.

[87] V jednom z výhodných provedení se antagonista receptoru VEGF specificky váže k VEGFR-1. Konkrétně, výhodnými jsou proteiny vázající se na antigen, které se vážou na extracelulární doménu VEGFR-1 a blokují vazbu jednoho nebo obou svých ligandů, VEGF a P1GF, a/nebo neutralizují aktivaci VEGFR-1, indukovanou VEGF nebo PIGF. Tak například, mAb 6.12 je scFv, který se váže k rozpustnému VEGFR-1, exprimovanému buňkami na povrchu. ScFv 6.12 obsahuje domény V_L a V_H myší monoklonální protilátky mAb 6.12. Buněčná linie hybridomů, produkujícího mAb 6.12, byla uložena v ATCC pod depozitním číslem PTA-3344. Uložení bylo provedeno podle podmínek Budapešťské úmluva o mezinárodním uznávání uložení mikroorganismů pro účely patentové řízení (Budapešť Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Proceduře) a v souladu s jejími pravidly (Budapešťská úmluva, Budapešť Treaty). Tento způsob • · 0 ·00 000

0000 0 000 · 000

000 0 0000 00 0 000 • 00 000 000

0000 00 00 0 00 0 z y zajišťuje udržení životaschopné kultury po dobu 30 let od data uložení. Organismy mohou být v ATCC dostupné v souladu s pravidly Budapešťské úmluvy a jsou předmětem dohody mezi přihlašovatelem a sbírkou ATCC, která zajišťuje neomezený přístup po vydání relevantního US patentu. Dostupnost uložených kmenů není míněna jako licence k praktickému využití vynálezu v rozporu s právy, udělenými jakoukoliv oprávněnou vládní institucí v souladu s patentovými právy.

[88] Jiná výhodná provedení protilátek jsou popsána v Příkladech, konkrétně v Příkladech XII, XIII, a XIV, a v SEQ ID NO: 1 až 83. Kromě toho, někteří z těchto výhodných protilátkových antagonistů VEGFR jsou rovněž popsáni v Lu et al., Inťl J. Cancer, 97: 393-399 (2002).

[89] Existují rovněž různé hybridomy, které produkují protilátky proti VEGFR-2'. Tak například, myší hybridomová buněčná linie, produkující krysí monoklonální protilátku proti myšímu VEGFR-2 (DC101) , byla uložena jako ATCC HB 11534; a hybridomová buněčná linie (M25.18A1), produkující myší monoklonální protilátku mAb 25 proti myšímu VEGFR-2, byla uložena jako ATCC HB 12152; hybridomová buněčná linie (M73.24), produkující myší monoklonální protilátku mAb 73 proti myšímu VEGFR-2, byla uložena jako ATCC HB 12153.

[90] Kromě toho, existují různé hybridomy, které produkují protilátky proti VEGFR-1 (anti-VEGFR-1), jejichž výčet zahrnuje, bez omezení, hybridomy KM1730 (uložený jako FERM BP-5697), KM1731 (uložený jako FERM BP-5718), KM1732 (uložený jako FERM BP-5698), KM1748 (uložený jako FERM BP5699) a KM1750 (uložený jako FERM BP-5700), popsané ve WO98/22616, WO 99/59636, v australské přijaté přihlášce č. AU1998 50666 B2 a v kanadské přihlášce č. CA 2328893.

•· 0 0 »· 0 • · · · · · • 0 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0

0000 00 00 [91] V oboru jsou známí mnozí další antagonisté VEGFR. Někteří z příkladných antagonistů VEGFR jsou popsáni v US přihláškách č. 07/813 593; 07/906 397; 07/946 507; 07/977 451; 08/055 269; 08/252 517; 08/601 891; 09/021 324; 09/208,786; a 09/919 408 (všechny od původců Lemischka et al.); v US patentu č. 5 840 301 (Rockwell et al.); v US přihláškách č. 08/706 804; 08/866 969; 08/967 113; 09/047 807; 09/401 163; a 09/798 689 (všechny od původců Rockwell et al.); v US přihlášce č. 09/540 770 (Witte et al.); a v PCT/US01/06966 (Liao et al.). US patent č. 5 861 301 (Terman et al.), Terman et al., Oncogene 6: 1677-1683 (September 1991), WO 94/10202 (Ferrara et al.), a WO95/21865 (Ludwig) popisují antagonisty VEGFR a konkrétně protilátky proti VEGFR-2 (anti-VEGFR-2 antibodies). Protilátky proti VEGFR-2 kromě toho popisuje PCT/US95/01678 (Kyowa Hakko) .Protilátky proti VEGFR jsou rovněž popsány v US přihlášce č. 09/976 787 (Zhu et al.). US patenty č. 6 177 401(Ullrich et al.), 5 712 395 (App et al.) a 5 981 569 (App et al.) popisují antagonisty VEGFR, kterými jsou organické molekuly. Kromě toho, jsou známy bispecifické protilátky (bi-specific antibodies, BsAbs), které jsou protilátkami, jež mají dvě odlišné specifičnosti nebo místa pro vazbu s antigenem, namířené proti KDR (VEGFR-2) a VEGFR-1. Viz, například US přihlášku č. 09/865 198 (Zhu); 60/301 299 (Zhu).

[92] Hennequin et al. v J. Med. Chem. 42, 5369-5389 (1999) popisují určité chinazoliny, chinoliny a cinnoliny, jako vhodné antagonisty receptoru VEGF. Viz rovněž Annie et al., Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 17, A41 (1998). Antagonisté receptoru

VEGF, popsaní v článku Hennequin et al., jsou zde zahrnuti formou odkazu.

·· · · · · · · ·44· · ··· · ··· • · · · · · ···· * · · ··· 4·· · · · · · · • · · · · · · · · « » [93] Kromě toho, App et al. (US patent č. 5 849 742) popisuje malé molekuly derivátů chinazolinu, chinoxilinu, sustituovaného anilinu, isoxazolů, akrylonitrilu a fenylakrylonitrilových sloučenin, .které působí jako tyrosinkinázové inhibitory. Malé molekuly, popsané v Hennequin et al., Annie et al., a App et al. jsou v předkládaném vynálezu zahrnuty jako antagonisté receptoru VEGF.

[94] Kromě toho, v oboru jsou dobře známé zkoušky pro stanovení antagonistů VEGFR, a proto mohou snadno být identifikováni další antagonisté pro použití podle předkládaného vynálezu. Antagonisté VEGFR podle předkládaného vynálezu inhibují tyrosinkinázovou aktivitu VEGFR, což obecně zahrnuje fosforylační procesy. Proto jsou zkoušky fosforylace vhodné k určení antagonistů VEGFR v kontextu s předkládaným vynálezem. Některé ze zkoušek stanovení tyrosinkinázové aktivity jsou popsané v Pánek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera., 283: 1433-44 (1997) a Batley et al., Life Sci.,62: 143-50 (1998). Kromě toho mohou být využity specifické metody pro detekci exprese VEGFR.

[95] Protilátky [96] Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány v oboru známými postupy. Tyto metody zahrnují imunologické metody, popsané v Kohler and Milstein, Nátuře, 256: 495-497 (1975) a Campbell, Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent • · c« · · · ·· · • · · · · * · · · t ttt · · · · · · · · • · · « · · ···« · · · ··· ······ · · ·

...... ·· · .· · and Human Hybridomas, Burdon et al., Eds., Laboratory

Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985); stejně jako metody s využitím rekombinantní DNA, popsané v Huse et al., Science, 246, 1275-1281 (1989).

[97] Protilátkami podle předkládaného vynálezu mohou být monoklonální nebo polyklonální protilátky, nebo jakékoliv jiné vhodné typy protilátek, jako jsou protilátkové fragmenty nebo protilátkové deriváty, jednořetězcové protilátky (single chain antibody, scFv), nebo syntetické homology protilátky, za předpokladu, že taková protilátka má stejné vazebné charakteristiky, jako protilátka úplná, nebo má vazebné charakteristiky srovnatelné s úplnou protilátkou. Pokud není jiným způsobem definováno, nebo nevyplývá jasně z kontextu, odpovídají protilátkové domény, oblastí a fragmenty standardním definicím tak, jak jsou tyto dobře známé v oboru. Viz, například Abbas et al., Cellular and Molecular Immuno.logy,

W. B. Saunders Company, Philadelphia, PA (1991). Výhodnými protilátkami podle předkládaného vynálezu jsou monoklonální protilátky.

[98] Protilátkové fragmenty mohou být připraveny štěpením úplné protilátky, nebo expresí DNA, která kóduje fragment. Fragmenty protilátek mohou být připraveny metodami popsanými v Lamoyi et al., J. Immunol. Methods,

56: 235-243(1983) a v Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983) . Takové fragmenty mohou zahrnovat jeden nebo oba fragmenty Fab nebo fragment F(ab')₂. Rovněž mohou takové fragmenty obsahovat jednořetězcové fragmenty variabilních oblastí protilátek, tj.scFv, dibodies, nebo jiné protilátkové fragmenty. Způsoby přípravy takových funkčních

»· ·· · ·· · • · « · · · · ··· · · · · · ··· • · · · · ···· * · · ···· • · · · · · · · • · · · · · · 9 ekvivalentů jsou popsány v PCT přihlášce WO93/21319;

evropské patentové přihlášce č. EP 239 400; PCT přihlášce WO89/09622; evropské patentové přihlášce č. EP 338 745; a evropské patentové přihlášce č. EP 332 424.

[99] Jednořetězcovými protilátkami (single chain antibodies, scFv) jsou polypeptidy, které sestávají z variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky spojené s variabilní oblastí lehkého řetězce, a to s nebo bez vzájemného propojení spojovníkem (linkerem). Proto obsahuje scFv úplné protilátkové kombinované místo. Tyto řetězce mohou být připraveny v bakteriích, nebo v eukaryontních buňkách. Příkladem jednořetězcové protilátky je plCll. (Viz Příklad IX níže). Bylo prokázáno, že plCll blokuje interakci VEGF-KDR (VEGF-VEGFR-2) a inhibuje fosforylaci receptoru stimulovanou VEGF a mitogenezi HUVEC. Tento scFv se váže jak k rozpustnému KDR (VEGFR-2), tak ke KDR (VEGFR2) exprimovanému na buněčném povrchu HUVEC. Sekvence plCll je uvedena v SEQ ID No: 21. Výše popsané jednořetězcové protilátky mohou být vestavěny do chimérizovaných nebo humanizovaných protilátek způsoby, které jsou v oboru dobře známy, viz příklad IX-3 níže. Jedním z příkladů chimérického scFv je chimérický plCll, tj. c-plCll.

[100] Protilátkové fragmenty výhodně obsahují všech šest oblastí určujících komplementaritu (complementaritydetermining regions, CDRs) úplné protilátky, ačkoliv i fragmenty obsahující méně než všechny tyto oblasti, jako například tři, čtyři nebo pět CDRs, mohou být také funkční. Jestliže protilátkový fragment je příliš krátký, aby byl imunogenní, může být konjugován s molekulou nosiče. Některé z vhodných molekul nosičů zahrnují přílipkový hemocyanin • · · · • · ·» · · · · v ··· • · · · · · «··· 0 0 0····

Konjugace může vynálezu rovněž (keyhole limpet) a hovězí sérový albumin, být provedena metodami známými v oboru.

[101] Protilátky podle předkládaného zahrnují ty, u nichž byly vazebné charakteristiky zlepšeny řízenými mutacemi, metodami zrání afinity (methods of affinity maturation), fágového displeje (phage display), nebo řetězcového přeskupení (chain shuffling). Afinita a specifičnost mohou být modifikovány nebo zlepšeny mutacemi CDRs a screeningem vazebných míst pro antigen, která mají požadované charakteristiky (viz, například Yang et al·., J. Mol. Bio., 254: 392-403 (1995)). CDRs jsou mutovány řadou způsobů. Jedním ze způsobů je náhodný výběr jednotlivých zbytků nebo kombinací zbytků tak, aby v populaci jinak identických vazebných míst pro antigen bylo všech dvacet aminokyselinových zbytků nalézáno v určitých pozicích.

Jinak řečeno, mutace jsou indukovány v rozsahu zbytků CDRs, metodami PCR náchylnými k chybovosti (viz, například Hawkins et al., J. Mol.Bio., 226: 889-896 (1992)). Vektory pro fágový displej obsahující geny pro variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce jsou propagovány v mutátorových kmenech E. coli (viz, například Low et al., J. Mol. Bio., 250: 359-368 (1996)). Tyto metody jsou ilustrativní z řady metod, známých odborníkovi v oboru.

[102] Protilátkami podle předkládaného vynálezu mohou být rovněž chimérické protilátky mající variabilní oblast protilátky jednoho druhu, například myši, a konstantní oblast z odlišných druhů, například člověka. Jinak řečeno, protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být humanizované protilátky mající hypervariabilní nebo komplementaritu určující oblasti (CDRs) protilátky z jednoho druhu, například z myši, úseky struktury základní « · · ··♦ · · · # ·«· · · · · · · · *

9 * · · · ···· · · · ···

9 4 9 9 9 9 9 9 ~_Γ 9949 99 99 4 99 * a konstantní oblast z protilátky lidské. Protilátkami podle předkládaného vynálezu mohou rovněž být lidské protilátky mající jak konstantní oblast, tak variabilní oblast z lidské protilátky.

[103] Protilátky, zejména monoklonální protilátky, mohou být produkovány způsoby známými v oboru. Příklady produkce protilátek zahrnují, bez omezení, přípravu v buňkách hybridomů a transformaci savčích buněk pomocí DNA, kódující antagonistů receptoru. Tyto metody jsou popsány v řadě publikací, zahrnujících imunologické metody popsané v Kohler and Milstein, Nátuře, 256: 495-497 (1975) a Campbellem v Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas, v Burdon et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam(1985); stejně jako metody s využitím rekombinantní DNA, popsané v Huse et al.,

Science, 246: 1275-1281 (1989).

[104] Ekvivalenty protilátek jsou rovněž připravovány metodami známými v oboru. Tak například, fragmenty protilátek mohou být připravovány enzymatickým štěpením úplných protilátek. Výhodně jsou ekvivalenty protilátek připravovány z DNA kódující takové ekvivalenty. DNA, kódující fragmenty protilátek, může být připravena delecí všech částí kódujících úplnou protilátku, kromě požadovaných podílů DNA. DNA kódující chimérické protilátky může být připravena pomocí rekombinace DNA kódující lidské konstantní oblasti, získané v podstatě nebo výlučně z odpovídajících oblastí lidských protilátek, a z DNA kódující variabilní oblasti, získané v podstatě nebo výlučně ze sekvence variabilní oblasti savců odlišných od • » ·· φ

ΦΦΦ • φφφφ člověka. DNA kódující humanizované protilátky může být připravena rekombinaci DNA kódující konstantní oblasti a variabilní oblasti odlišné, než jsou komplementaritu určující oblasti(CDRs), v podstatě nebo výlučně odvozené z odpovídajících lidských oblastí protilátek, z DNA kódující CDRs, získané v podstatě nebo výlučně ze savců odlišných od člověka.

[105] Vhodné zdroje molekul DNA, které kódují fragmenty protilátek, zahrnují buňky, jako jsou hybridomy, které exprimuji úplnou protilátku. Fragmenty mohou být použity samy o sobě jako ekvivalenty protilátek, nebo mohou být rekombinovány do ekvivalentů, jak je popsáno výše. Delece DNA a rekombinace popsané v této části mohou být prováděny známými metodami, jako jsou ty, které jsou popsané ve zveřejněných patentových přihláškách uvedených výše v části nazvané „Funkční ekvivalenty protilátek, a/nebo standardními metodami rekombinace DNA, jako jsou ty, jež jsou popsané níže.

[106] Výhodnými hostitelskými buňkami pro transformaci vektory a expresi antagonistů receptorů podle předkládaného vynálezu jsou savčí buňky, buňky COS-7, buňky vaječníku čínského křečka (chinese hamster ovary, CHO) a buněčné linie lymfoidního původu, jako jsou buňky lymfomu, myelomu nebo hybridomů. Případně mohou být použity jiné eukaryontní hostitelské buňky, jako jsou buňky kvasinek. Tak například, myší stromální fetální jaterní buněčná linie 2018 váže fúzní proteiny APtag-flk 1 a APtag flk-2, tj. obsahuje ligandy pro VEGFR-2 a flk-2 (ATCC, Manassas, VA, CRL 10907), a lidská buněčná linie z fetální lidské sleziny Fsp 62891 obsahuje flk-2 ligand (ATCC CRL 10935), a lidská

0» 00 · 00 0 000 000 000

0··· 0 0 0 0 0 000

000 0 0000 00 0 000 stromální buněčná linie z fetálního thymu F. thy62891 obsahuje VEGFR-2 ligand (ATCC CRL 10936).

[107] Transformované hostitelské buňky jsou kultivovány metodami známými v oboru v tekutém médiu obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku (cukry, jako jsou glukóza a laktóza), dusíku (aminokyseliny, peptid, proteiny nebo jejich degradační produkty, jako jsou peptony, amoniové soli a podobně) a anorganické soli, (sulfáty, fosfáty a/nebo uhličitany sodné, draselné, horečnaté a vápenaté). Médium dále obsahuje například látky podporující růst, jako jsou stopové prvky, například železo, zinek, hořčík a podobně.

[108] Jestliže je požadována exprese genového konstruktu v kvasinkách, je vhodným selekčním genem u kvasinek gen trpí přítomný v kvasinkovém plasmidu YRp7. Stinchcomb et al. Nátuře, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979). Gen trpí poskytuje selekční markér pro mutantní kmen kvasinek postrádající schopnost růstu v přítomnosti tryptofanu, jakým jsou například kmeny ATCC č. 44076 nebo PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977) . Přítomnost léze genu trpí v genomu hostitelských buněk kvasinek poskytuje účinné prostředí pro detekci transformace pomocí růstu v nepřítomnosti tryptofanu.

Podobně Leu2-deficientní kmeny kvasinek (ATCC 20622 nebo 38626) jsou komplementovány známými plasmidy nesoucími gen Leu2.

[109] V jiném provedení může DNA kódující antagonistů receptoru rovněž být klonována do vektorů, odvozených z virů, jako je například adenovirus, adeno-asociovaný virus, herpesvirus, retrovirus nebo lentivirus. Exprese ·· ·· «·· ·· · * · · ··· · · · • · · · · · · · · ··» * · · · · · ··· « φ •♦♦Μ ······ · · ·

......... ·» ♦ genu je řízena indukovatelnými nebo neindukovatelnými regulačními sekvencemi.

[110] Stručně řečeno, je vybrán vhodný zdroj buněk, obsahující molekuly nukleových kyselin, které exprimuji požadovanou DNA pro produkt, jako je protilátka, ekvivalent protilátky nebo receptor VEGF. Je použita celková RNA připravená standardními postupy z vhodného zdroje. Celková RNA je použita pro přímou syntézu cDNA. Standardní metody pro izolaci RNA a syntézu cDNA jsou poskytnuty v standardních manuálech molekulární biologie, jako jsou například ty, které jsou popsány výše.

[111.] Amplifikace cDNA může být provedena známými postupy. Tak například, cDNA může být použita jako templát pro amplifikaci pomocí polymerázové řetězcové reakce (polymerase Chain reactíon, PCR); viz Saiki et al.,

Science, 239,487 (1988) nebo Mullis et al., US patent č. 4 683 195. Sekvence oligonukleotidových primerů pro PCR amplifikaci jsou odvozeny ze známých sekvencí pro amplifikaci. Oligonukleotidy jsou syntetizovány metodami známými v oboru. Vhodné metody zahrnují ty, které popisuje Caruthers v Science 230, 281-285 (1985).

[112] Při PCR amplifikaci je používána směs protisměrných oligonukleotidů (upstream) a oligonukleotidů po směru (downstream). Podmínky jsou optimalizovány pro každý konkrétní primerový pár v souladu se standardními postupy. Je analyzován produkt PCR, například elektroforézou cDNA, mající správnou velikost, odpovídající sekvenci mezi primery. V jiném provedení může kódující oblast být amplifikována ve dvou nebo více překrývajících se fragmentech (overlapping fragments). Překrývající se ·

* · 9 9 9 9 9 9 9 • 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9999 9 9 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9

......... .. · fragmenty jsou navrženy tak, aby obsahovaly restrikční místa umožňující kompletaci intaktní cDNA z fragmentů.

[113] Pro izolaci úplných oblastí kódujících protein receptorů VEGF je například protisměrný oligonukleotidový PCR primer komplementární k sekvenci na 5'konci, výhodně zahrnující start kodón ATG a alespoň 5-10 nukleotidů proti směru od kodónu start. PCR oligonukleotidový primer po směru je komplementární k sekvenci na 3'konci požadované sekvence DNA. Požadovaná sekvence DNA kóduje úplnou extracelulární část receptorů VEGF a případně kóduje celou nebo část transmembránové oblasti a/nebo celou nebo část intracelulární oblasti včetně kodónu stop.

[114] DNA, která má být amplifikována, tj. taková, která kóduje protilátky, ekvivalenty protilátek nebo receptory VEGF, může být rovněž replikována v rozsáhlém výběru klonovacích vektorů v široké řadě hostitelských buněk. Hostitelské buňky mohou být prokaryontní nebo eukaryontní.

[115] Vektor, do kterého je DNA včleněna, může obsahovat segmenty chromosomálních, nechromosomálních a syntetických sekvencí DNA. Některé z vhodných prokaryontních klonovacích vektorů zahrnují plasmidy z E. coli, jako jsou colEl, pCRl, pBR322, pMB9, pUC, pKSM a RRP4. Prokaryontní vektory rovněž zahrnují deriváty DNA fágů, jako jsou M13 a jiné vláknité jednořetězcové DNA fágy. Výhodným vektorem pro klonování nukleové kyseliny kódující receptor VEGF je baculovirový vektor.

[116] Vektor obsahující DNA, která má být exprimována, je transfekován do vhodné hostitelské buňky. Hostitelská »· «· · ♦ · Φ • · · 9 9 9 9 9

9 99 · Φ Φ · Φ · · *

999 9 9999 99 9 999· buňka je udržována ve vhodném kultivačním médiu a je podrobena podmínkám, za kterých se buňky a vektor replikují. Vektor může být z buněk získán zpět. DNA, která má být exprimována, může být znovu získána zpět z vektoru.

[117] DNA, která má být exprimována, tj. taková, která kóduje protilátky, ekvivalenty protilátek nebo receptory VEGF, může být inzerována do vhodného expresivního vektoru a může tak být exprimována ve vhodné prokaryontní nebo eukaryontní hostitelské buňce.

118] Tak například, DNA inzerovaná do hostitelské buňky může kódovat celou extracelulární část receptoru VEGF, nebo rozpustný fragment extracelulární části receptoru VEGF. Extracelulární část receptoru kódovaná DNA je případně připojena na jednom, nebo obou koncích 5' a 3' k přídavným aminokyselinovým sekvencím. Přídavné sekvence mohou být připojeny k extracelulární části receptoru VEGF přirozeným způsobem, například se jedná o vedoucí sekvence, transmembránovou oblast a/nebo intracelulární oblast receptoru VEGF. Přídavnými sekvencemi mohou být rovněž sekvence, které nejsou k receptoru připojeny přirozeným způsobem. Výhodně takovéto přídavné aminokyselinové sekvence slouží ke zvláštnímu účelu, jako je zlepšení úrovně exprese, sekrece, rozpustnosti, nebo imunogenních vlastností.

[119] Vektory pro expresi proteinů v bakteriích, zejména v E. coli, jsou známé. Takové vektory zahrnují vektory PATH popsané v Dieckmann and Tzagoloff, J. Biol. Chem.260, 1513-1520 (1985). Tyto vektory obsahují sekvence DNA, které kódují anthranilát syntetázu (TrpE) následované polylinkerem na karboxy konci. Jiné systémy expresivních »9 ·· ·· 4 ·· 4 •44 4 4 4 444

4444 4 444 4 444 · · 4 4 4444 · 4 4 444

444 *44 444

4444 «4 44 4 44 · [119] Vektory pro expresi proteinů v bakteriích, zejména v E. coli, jsou známé. Takové vektory zahrnují vektory PATH popsané v Dieckmann and Tzagoloff, J. Biol.

Chem.260, 1513-1520 (1985). Tyto vektory obsahují sekvence DNA, které kódují anthranilát syntetázu (TrpE) následované polylinkerem na karboxy konci. Jiné systémy expresivních vektorů jsou založeny na beta-galaktozidáze (pEX); lambda P_L; proteinu vázajícím maltózu (pMAL); a glutathion Stransferáze (pGST) - viz Gene 67, 31 (1988) a Peptide Research 3, 167 (1990).

[120] Rovněž jsou dostupné vektory vhodné pro kvasinky. Vhodným příkladem je plasmid 2μ .

[121] Rovněž jsou známy vhodné vektory pro expresi v savčích buňkách. Takové vektory zahrnují dobře známé deriváty SV-40, adenoviru, sekvencí DNA odvozených od retroviru a kyvadlové vektory, odvozené kombinacemi funkčních savčích vektorů, jako jsou ty, které jsou popsány výše, a funkční plasmidy a fágovou DNA.

[122] V oboru jsou známé další eukaryotické expresivní vektory (například P.J.Southern and P.Berg, J. Mol. Appl.

Genet., 1, 327-341 (1982); Subramani et al., Mol. Cell.

Biol., 1: 854-864 (1981); Kaufmann and Sharp,

Amplification and Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene, J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982); Kaufmann and Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601-664 (1982); Scahill et al., Expression and Characterization of the Product of a Human Immune Interferon DNA Gene ín Chinese Hamster Ovary Cells, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 4654-4659 (1983);

• 4 4 • « 4 · «««· · 4 «44

4 4

4

Urlaub and Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 42164220, (1980).

[123] Expresivní vektory vhodné podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň jednu řídící sekvenci pro expresi, která je operativně připojena k sekvenci DNA nebo k fragmentu, které mají být exprimovány. Řídící sekvence je inzerována do vektoru tak, aby řídila a regulovala expresi klonované sekvence DNA. Příklady vhodných expresivních řídících sekvencí jsou systém lac, systém trp, systém tac, systém trč, hlavní operátorové a promotorové oblasti fága lambda, řídící oblast obalového proteinu fd, glykolytické promotory kvasinek, například promotor pro 3-fosfoglycerát kinázu, promotory kvasinkové kyselé fosfatázy, například Pho5, promotory alfa-párovacích faktorů (alpha-mating factors), a promotory odvozené z polyomu, adenoviru, retroviru a opičího viru, jako jsou například časné a pozdní promotory, nebo SV40 a jiné sekvence, které jsou známy, že řídí expresi genů v prokaryontních nebo eukaryontních buňkách a jejich virech, nebo jejich kombinace.

[124] Vektory obsahující řídící signály a DNA, která má být exprimována, jako je ta, která kóduje protilátky, ekvivalenty protilátek nebo receptory VEGF, jsou pro expresi inzerovány do hostitelské buňky. Některé z vhodných hostitelských buněk pro expresi zahrnují dobře známé prokaryontní a eukaryontní buňky. Někteří z vhodných prokaryontních hostitelů zahrnují například E. coli, jako je E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E.coli X1776, E.coli X2282, E. coli DHI a E. coli MRC1,

Pseudomonas, Bacillus, jako je Bacillus subtilis, a Streptomyces. Vhodné eukaryontní buňky zahrnují kvasinky a jiné houby, hmyzí buňky, živočišné buňky, jako jsou buňky

COS a CHO, lidské buňky a rostlinné buňky ve tkáňových kulturách.

• 9 99

9 9 • 999 9 9 • 9 •999 «9

9 99 · • 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9999 99 9 9999

9 9 9 9

9 · 9 9 9 [125] Po expresi v hostitelské buňce, udržované ve vhodném médiu, mohou být exprimovaný polypeptid nebo peptid, odpovídající kódovaným protilátkám, ekvivalentům protilátek nebo receptorům VEGF, izolovány z média a purifikovány metodami známými v oboru. Jestliže polypeptid nebo peptid není sekretován do kultivačního média, jsou hostitelské buňky před izolací a purifikací lyžovány.

[126] Kromě toho, protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny imunizací savce rozpustným receptorem. Rozpustné receptory mohou být použity jako imunogeny samy o sobě, nebo mohou být navázány na proteinový nosič nebo na jiné objekty, jako jsou kuličky, například sepharosové kuličky. Poté, co savec vyprodukuje protilátky, je izolována směs buněk, jako jsou splenocyty, produkujících protilátky. Monoklonální protilátky mohou být získány izolací jednotlivých buněk produkujících protilátku a upravením těchto buněk k nesmrtelnosti, například fúzí s nádorovými buňkami, jako jsou buňky myelomu. Výsledné hybridomy jsou udržovány v kultuře a exprimují monoklonální protilátky, které jsou sklízeny z kultivačního média.

[127] Protilátky mohou rovněž být připraveny z receptorů vázaných k povrchu buněk, které exprimují předmětný specifický receptor. Buňkou , ke které jsou receptory vázány, může buňka, která přirozeně exprimuje receptor, jako je například vaskulární endotelová buňka pro VEGFR. Alternativně buňkou, ke které je receptor vázán, může být buňka, do která byla DNA kódující receptor

00 • 0 0

0 0 0 • 0

0 ··0 0 «· transfekována, jako například jsou buňky 3T3 cells, které byly transfekovány s VEGFR.

•00 0· 0

0 0 0 0

0 · 0 0 0 0

00000 0 0 00000

0 0 0 0

0 00 · [128] Receptor může být použit jako imunogen pro získání protilátky podle vynálezu. Peptid receptorů může být získán z přirozených zdrojů, jako například z buněk, které receptor exprimují. Tak například, peptid receptorů VEGF může být získán z vaskulárních endotelových buněk.

V jiném provedení mohou být syntetické receptorové proteiny připraveny s použitím komerčně dostupných zařízení.

V takovém provedení může být aminokyselinová sekvence receptorů VEGF poskytnuta podle například Shibuya et al., Oncogene 5, 519-524 (1990) pro flt-1 (VEGFR-1);

PCT/US92/01300 a Terman et al., Oncogene 6: 1677-1683 (1991) pro KDR (VEGFR-2); a Matthews et al. Proč. Naťl Acad. Sci. USA, 88: 9026-9030 (1991) pro flk-1.

[129] V další alternativě může být DNA kódující receptor, jako je cDNA nebo její fragment, klonována a exprimována a výsledný získaný polypeptid je použit jako imunogen pro vyvolání protilátky podle vynálezu. Tak například, aby byly připraveny receptory VEGF proti nimž jsou připravovány protilátky, molekuly nukleových kyselin, které kódují receptory podle vynálezu, nebo jejich části, zejména extracelulární části, mohou být inzerovány do známých vektorů pro expresi v hostitelských buňkách s použitím standardních technik rekombinace DNA, jako jsou ty, které jsou popsány níže. Vhodné zdroje takových molekul nukleových kyselin zahrnují buňky, které exprimují receptory VEGF, tj. vaskulární endotelové buňky.

[130] Protilátka může být připravena v jakémkoliv savci, výčet vhodných savců odlišných od člověka zahrnuje

4 «« 44 · 4

4 4

444

4

• 44*4 4 4

4 4 například králíka, krysu, myš, koně, kozu nebo primáta.

Myši jsou preferovány. Protilátka může být členem jedné z následujících imunoglobulinových tříd: IgG, IgM, IgA,

IgD, nebo IgE, a jejich podtříd, výhodně je pak protilátkou IgGl. Protilátky podle vynálezu a jejich funkční ekvivalenty mohou být nebo mohou kombinovat členy z jakýchkoliv imunoglobulinových tříd.

[131] Ne-protilátkoví antagonisté VEGFR (Non-Antibody VEGFR Antagonists) [132] Vedle protilátek nebo funkčních ekvivalentů protilátek výše diskutovaných mohou být vhodnými antagonisty receptorů podle předkládaného vynálezu také jiné biologické a malé molekuly, zejména v souvislosti s léčbou popsanou výše.

[133] Biologické molekuly zahrnují všechny lipidy a polymery monosacharidů, aminokyselin a nukleotidů, které mají molekulovu hmotnost větší než 450. Biologické molekuly tak například zahrnují oligosacharidy a polysacharidy; oligopeptidy, polypeptidy, peptidy a proteiny; a oligonukleotidy a polynukleotidy. Oligonukleotidy a polynukleotidy zahrnují například DNA a RNA.

[134] Biologické molekuly dále zahrnují deriváty jakýchkoliv molekul popsaných výše. Tak například, deriváty biologických molekul zahrnují lipidové a glykosylační deriváty oligopeptidů, polypeptidů, peptidů a proteinů. Deriváty biologických molekul dále zahrnují lipidové deriváty oligosacharidů a polysacharidů, jako například lipopolysacharidy.

·· ·· ► 4 ·

4·· • 4··

4« 4 44 • 4 · · · • 4 · 4 · ·

4 ···· · 4 · · · · 4 · ·· [135] Jakákoliv molekula, která není biologickou molekulou, je v tomto popise považována za malou molekulu. Malými molekulami jsou entity, které mají uhlíkové a vodíkové atomy, stejně jako heteroatomy, jež zahrnují, bez omezení, dusík, síru, kyslík a fosfor. Atomy jsou v malých molekulách spojeny prostřednictvím kovalentních a iontových vazeb; kovalentní vazby jsou typické pro malé organické sloučeniny, jakými jsou například inhibitory tyrosinkinázy Iressa™ a Tarceva™ , a iontové vazby jsou typické pro malé anorganické sloučeniny. Uspořádání atomů v malé organické molekule může být představováno řetězcem, například řetězcem typu uhlík-uhlík nebo uhlík-heteroatom, nebo kruhem obsahujícím uhlíkové atomy, jakým je například benzenový kruh, nebo kombinací uhlíku a heteroatomů, tj . heterocykly, jakými jsou například pyrimidin nebo chinazolin. Kombinace jednoho nebo více řetězců v malé organické molekule, připojených ke kruhovému systému vytváří substituovaný kruhový systém a fúzí dvou kruhů se vytváří fúzovaný polycyklický systém, který může být označen jako jednoduchý nebo polycyklický systém, jehož příkladem může být základní skelet Iressa™ . Malé molekuly zahrnují jak sloučeniny nalézané v přírodě, jako jsou hormony, neurotransmitery, nukleotidy, aminokyseliny, cukry, lipidy a jejich deriváty, tak sloučeniny připravené synteticky buďto běžnou organickou syntézou, biologicky zprostředkovanou syntézou, nebo jejich kombinací. Viz například Ganesan, Drug Discov. Today, 7(1): 47-55 (Jan. 2002); Lou, Drug Discov. Today, 6 (24): 1288-1294 (Dec.

2001).

[136] Některé z příkladů malých molekul zahrnují organické sloučeniny, organokovové sloučeniny, soli organických a organokovových sloučenin, sacharidy, ·· · ·· ··

• 9 ···· ···· • · · · • · · · · »·····« · • · 9 · aminokyseliny, nukleosidy a nukleotidy. Je třeba zdůraznit, že takovéto malé molekuly mohou být jakoukoliv molekulovou hmotnost. Malými molekulami jsou nazývány pouze proto, že zpravidla mají molekulovou hmotnost menší než 450. Malé molekuly zahrnují sloučeniny, které jsou nalézány v přírodě stejně, jako syntetické sloučeniny.

[137] Podání malé molekuly a biologických léčiv lidským pacientům je prováděno metodami známými v oboru. Příklady takových metod pro podání malých molekul uvádí Spada, US Patent č. 5 646 153 ve sloupci 57, od řádku 47 do sloupce 59, řádku 67. Tento popis podání malých molekul je zde zahrnut formou odkazu.

[138] Neutralizace aktivace VEGF u receptorů VEGF [139] Neutralizace aktivace VEGF u receptorů VEGF ve vzorku endotelových a ne-endotelových buněk, jako jsou nádorové buňky, může být prováděna in vitro nebo in vivo. Neutralizace aktivace VEGF u receptorů VEGF ve vzorku buněk exprimujících receptor VEGF zahrnuje kontaktování buněk s antagonistou, jako například s protilátkou podle vynálezu. Buňky jsou s antagonistou, jako například s protilátkou, uvedeny do kontaktu in vitro před, simultánně s , nebo po přidání VEGF ke vzorku buněk.

[140] In vivo je antagonista, například protilátka podle vynálezu, kontaktována s receptorem VEGF jejím podáním savci. Způsoby podání savci zahrnují například orální, intravenózní, intraperitoneální, subkutánní nebo intramusku.lární aplikaci.

0

0 0

0 0 0 • 0 0 0 0

0 0

0

00 0 0 0

000 0 0 0 ·

0 0

0000 00 [141] Tato in vivo neutralizační metoda je vhodná pro inhibici ángiogeneze u savců. Inhibice ángiogeneze je vhodná terapeutická metoda, například pro zabránění nebo inhibici ángiogeneze spojené s patologickými stavy, jakými je například růst nádorů. Proto jsou antagonisté podle vynálezu, například protilátky, anti-angiogenními a antitumorogenními imunoterapeutickými agens.

[142] Výraz savec znamená jakéhokoliv savce. Některé z příkladů savců zahrnují domácí zvířata, jako jsou psi a kočky; hospodářská zvířata, jako jsou vepři, hovězí dobytek, ovce a kozy; laboratorní zvířata, jako jsou myši a krysy; primáty, jako jsou opice, lidoopi a šimpanzi; a člověka.

[143] Receptory VEGF jsou nalézány na některých neendotelových buňkách, jako jsou nádorové buňky, což naznačuje neočekávanou přítomnost autokrinní a/nebo parakrinní smyčky v těchto buňkách.

[144] Metody inhibice ángiogeneze a inhibice patologických stavů, jakými jsou růst nádorů u savců, zahrnují systémové podání savci účinného množství jakéhokoliv z antagonistů podle vynálezu, například protilátek včetně jejich jakýchkoliv funkčních ekvivalentů, nebo přímé podání do nádoru uvnitř savce. Savcem je výhodně člověk. Tato metoda je účinná pro léčbu subjektů jak s pevnými nádory, přednostně vysoce vaskularizovanými nádory, tak pro léčbu nepevných nádorů.

[145] Inhibice nebo redukce nádorového růstu zahrnuje prevenci nebo inhibici progrese nádorů, zahrnujících rakovinné a nerakovinné nádory. Progrese nádorů zahrnuje • · invaze, metastázy, opětovný výskyt a zvýšení velikosti nádorů. Inhibice nebo redukce růstu nádorů rovněž zahrnuje destrukci nádoru.

0 00 « »0 · 0 0 • 0 0 0 0 0 0

0000 00 0 0000

0 0 0 0 0

0 00 · [146] Všechny typy nádorů mohou být léčeny způsoby podle předkládaného vynálezu. Nádory mohou být pevné a nepevné (non-solid tumor).

[147] Některé z příkladů pevných nádorů, které mohou být ošetřeny antagonisty podle předkládaného vynálezu, zahrnují karcinomy, sarkomy, blastomy nebo gliomy. Některé z příkladů takových nádorů zahrnují epidermoidní nádory, skvamózní nádory, jako jsou nádory hlavy a krku, kolorektální nádory, nádory prostaty, nádory prsů, nádory plic, včetně malobuněčných a nemalobuněčných plicních nádorů, nádory pankreatu, nádory štítné žlázy, nádory vaječníků a nádory jater. Jiné příklady zahrnují Kaposiho sarkom, neoplasmata CNS, neuroblastomy, kapilární hemangioblastomy, meningiomy a cerebrální metastázy, melanomy, gastrointestinální a renální karcinomy a sarkomy, rhabdomyosarkom, glioblastomy, přednostně glioblastomovou multiformu, a leiomyosarkom. Příklady vaskularizovaných kožních nádorů, vůči kterým jsou antagonisté podle tohoto vynálezu účinné, zahrnují karcinom skvamózních buněk, karcinom bazálních buněk a kožní nádory, které mohou být ošetřeny potlačením růstu maligních keratinocytů, jako jsou lidské maligní keratinocyty.

[148] Některé z příkladů nepevných nádorů zahrnují leukemie, mnohočetné myelomy a lymfomy. Některé příklady leukémií zahrnují akutní myeloidní leukémii (acute myelocytic leukemia, AML), chronickou myeloidní leukémii (chronic myelocytic leukemia, CML), akutní lymfoidní • ··· • · • · • · ···· ··

leukémii (acute lymphocytic leukemia, ALL), chronickou lymfoidní leukémii (chronic lymphocytic leukemia, CLL), erythroídní leukémii (erythrocytic leukemia) nebo leukémii monocytů. Některé příklady lymfomů zahrnují lymfomy spojené s Hodgkinovou nemocí (Hodgkin's disease) a s NonHodgkinovou nemocí (Non-Hodgkin's disease).

[149] Experimentální výsledky uvedené dále demonstrují, že protilátky podle vynálezu specificky blokují fosforylací, indukovanou VEGF, chimérického receptoru myší extracelulární flk-1 (VEGFR-2)(VEGFR2/intracelulární fms, který je exprimován v transfekovaných buňkách 3T3. Protilátky nemají žádný účinek na chimérický receptor extracelulární fms/intracelulární FLK-2, který je zcela stimulovaný s CSF-1. Studie in vivo rovněž popsané níže prokazují, že protilátky byly schopny signifikantně inhibovat růst nádorů u nahých myší.

[150] Směs antagonistů receptoru VEGF, jako například monoklonálních protilátek, poskytuje zvlášť účinné ošetření pro inhibici růstu nádorových buněk. Směs může obsahovat pouze 2, 3 nebo 4 protilátky, stejné jako 6, 8 nebo 10 protilátek.

[151] Zabránění nebo inhibice angiogeneze je rovněž vhodné pro léčbu non-neoplastických patologických stavů, charakterizovaných mimořádnou angiogenezí, jako je neovaskulární glaukom, proliferativní retinopatie včetně proliferativní diabetické retinopatie, artritida, makulární degenerace, hemangiomy, angiofibromy a psoriáza.

[152] Použití antagonistů podle vynálezu pro izolaci a purifikaci receptoru VRGF • · 0 · • · 0 • 0 0 0 0 • · 0 0 0 • · 0 0

0 ·

0 [153] Antagonisté podle vynálezu mohou být použiti pro izolaci a purifikaci receptoru VEGF s použitím konvenčních metod, jako je například afinitní chromatografie (Dean et al., Affinity Chromatography: A Practical Approach, IRL Press, Arlington, VA(1985)). Jiné, v oboru dobře známé metody zahrnují magnetickou separaci s magnetickými perličkami potaženými protilátkou, panning („rýžování, specifické vychytávání) s protilátkou uchycenou k pevné matrix a průtokovou cytometrii.

[154] Zdrojem receptoru VEGF jsou typicky vaskulární buňky, zejména vaskulární endotelové buňky, které exprimují receptor VEGF. Vhodnými zdroji vaskulárních endotelových buněk jsou krevní cévy, jako jsou krevní buňky pupeční šňůry, zejména lidské vaskulární endotelové buňky z pupeční šňůry (human umbilical cord vascular endothelial cells, HUVEC).

[155] Receptory VEGF mohou být použity jako výchozí materiál pro přípravu jiných materiálů, jako jsou antigeny pro přípravu dalších monoklonálních a polyklonálních protilátek, které rozpoznávají a vážou se k receptoru VEGF, nebo k jiným antigenům na povrchu buněk exprimujících VEGF.

[156] Použití antagonistů podle vynálezu k izolaci a purifikaci nádorových buněk pozitivních na flk-1 (VEGFR-2) [157] Antagonisté podle předkládaného vynálezu mohou být použiti k izolaci a purifikaci nádorových buněk pozitivních na flk-1 (VEGFR-2) (VEGFR-2) , tj. nádorových buněk exprimujících receptor flk-1 (VEGFR-2), a to s použitím konvenčních metod, jako je afinitní

• · ·· ·· · • · · · · · • ··· · · · · • · ··· ·····<

chromatografie (Dean, P.D.G. et al., Affinity

Chromatography: A Practical Approach, IRL Press, Arlington VA (1985)). Jiné, v oboru dobře známé metody zahrnují magnetickou separaci s magnetickými perličkami potaženými protilátkou, cytotoxickými agens, jako je komplement konjugovaný s protilátkou, panning s protilátkou uchycenou k pevné matrix a průtokovou cytometrii.

[158] Monitorování hladin VEGF a receptorů VEGF in vitro nebo in vivo [159] K monitorování hladin VEGF a receptorů VEGF v biologických vzorcích in vitro nebo in vivo mohou být použiti antagonisté, například protilátky podle vynálezu, s použitím standardních zkoušek a metod známých v oboru. Některé z příkladů biologických vzorků zahrnují tělní tekutiny, jako je krev. Standardní zkoušky zahrnují například značení protilátek a provádění standardních imunozkoušek, jako jsou radioimunozkoušky tak, jak jsou v oboru dobře známy.

[160] Standardní techniky rekombinace DNA vhodné pro provedení vynálezu jsou popsány v Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) a v Ausubel et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York (1990).

[161] Podávání [162] Antagonisté receptoru podle vynálezu mohou být podáváni pro terapeutické ošetření pacientovi trpícímu nádorovým onemocněním v množství dostatečném pro prevencí, • · • · · • ·· · · • · » · · • · • ··· ···· inhibici nebo snížení progrese nádoru, například růstu, invaze, metastázy a/nebo opětovného výskytu nádoru. Odpovídající množství k dosažení tohoto účinku je definováno jako terapeuticky účinná dávka. Účinná množství pro tento účel budou záviset na závažnosti onemocnění a na celkovém stavu pacientova imunitního systému. Dávkovači režim bude proměnlivý rovněž v závislosti na stavu nemoci a stavu pacienta a bude zpravidla v rozmezí od jednorázové dávky nebo kontinuální infúze k opakovanému podávání během dne (například každých 4-6 hodin), nebo tak, jak doporučí ošetřující lékař na základě stavu pacienta. Nicméně, je třeba uvést, že předkládaný vynález není limitován žádnou konkrétní dávkou.

[163] Předkládaný vynález může být využit k léčbě jakéhokoliv vhodného nádoru, včetně například nádorů prsů, srdce, plic, tenkého střeva, tlustého střeva, sleziny, ledvin, močového měchýře, hlavy a krku, vaječníků, prostaty, mozku, pankreatu, kůže, kostí, kostní dřeně, brzlíku, dělohy, varlat, děložního hrdla nebo jater. Výhodně jsou způsoby podle předkládaného vynálezu použity, jestliže nádorem je nádor tlustého střeva, nebo jestliže nádorem je nádor plicního karcinomu typu nemalobuněčného plicního karcinomu (non-small cell lung carcinoma, NSCLC).

[164] Kromě toho nádory podle překládaného vynálezu výhodně nadměrně exprimují EGFR. Zvýšená exprese EGFR byla detekována v signifikantním procentuálním zastoupení u mnoha lidských nádorů; tak například u nádorů hlavy a krku (80-100 %), kolorektálních nádorů (25-77 %), nádorů pankresu (30-50 %), nádorů plic (40-80 %), esofageálních nádorů (43-89 %), renálních buněk (50-90 %), prostaty(65 %) , močového měchýře (31-48 %)', děložního hrdla/dělohy (90 • · • · ·· · · • ·

%), vaječníků (35-70 %) a prsů (14-91 %) . Exprese EGFR byla rovněž prokázána jako indikátor špatné prognózy, sníženého přežití a zvýšených metastáz u určitých typů nádorů.

[165] Kromě toho mají nádory podle předkládaného vynálezu výhodně aberantní expresi nebo signalizaci VEGFR. Zvýšená signalizace VEGFR byla pozorována v mnoha odlišných lidských nádorech. Vysoké hladiny VEGFR-2 jsou exprimovány endotelovými buňkami, které infiltrují gliomy (Plate et al., (1992), Nátuře 359: 845-848). Hladiny VEGFR-2 jsou specificky regulovány nahoru pomocí VEGF produkovaným lidskými glioblastomy (Plate et al. (1993), Cancer Res. 53: 5822-5827). Nález vysokých hladin exprese VEGFR-2 v endotelových buňkách asociovaných s glioblastomem (glioblastoma associated endothelial cells, GAEC) indikuje, že aktivita receptoru je pravděpodobné indukována během tvorby nádoru, vzhledem k tomu, že transkripty VEGFR-2 jsou stěží detekovatelné v normálních endotelových buňkách mozku. Tato nadměrná exprese je omezena na vaskulární endotelové buňky v těsné blízkosti nádoru.

[166] Předkládaný vynález je vhodný pro inhibici nebo redukci růstu nádorů. Inhibici nebo redukcí nádorového růstu je míněna prevence, inhibice, nebo redukce progrese nádoru, například růstu, invaze matastáz a/nebo opětovný výskyt nádoru. Kromě toho může být předkládaný vynález vhodný k léčbě anangiogenních stavů, jako je ateroskleróza, artritida, makulární degenerace a psoriáza. Identifikace pacientů se stavy, jež jsou vhodné k léčbě podle předkládaného vynálezu, plně spadá do rozsahu schopností a znalostí odborníka v daném oboru.

• · • · ···· ·<

[167] Podle předkládaného vynálezu jakákoliv vhodná metoda nebo postup mohou být použity k podání antagonisty EGFR a/nebo antagonisty VEGFR, například se jedná o orální, intravenózní, intraperitoneální, subkutánní, nebo intramuskulární podání. Dávka podávaného antagonisty závisí na řadě faktorů, včetně například typu antagonisty, typu a závažnosti nádoru, který má být ošetřen, a na způsobu podání antagonistů. Nicméně, je třeba uvést, že předkládaný vynález není limitován na žádnou zvláštní metodu nebo způsob podávání.

[168] V jednom alternativním provedení mohou být antagonista EGFR a VEGFR podáváni v kombinaci s jedním nebo více antineoplastickými agens. Viz například US Patent č. 6 217 866 (Schlessinger et al.)(Anti-EGFR antibodies in combination with antineoplastic agents); US přihlášku č. 09/312,286 (Waksal et al.) (Anti-EGFR antibodies in combination with radiation). Může být použito jakékoliv vhodné antineoplastické agens, jako je chemoterapeutické agens, nebo ozařování. Příklady chemoterapeutických agens zahrnují bez omezení cisplatinu, doxorubicin, paclitaxel, irinotecan (CPT-11), topotecan nebo jejich kombinaci. Jestliže antineoplástickým agens je ozařování, může být zdroj záření buďto externí (externí radiační terapie, external beam radiation therapy, EBRT), nebo interní (brachyradioterapie, brachytherapy, BT)vzhledem k pacientovi, který je ošetřován. Podávaná dávka antineoplastického agens závisí na řadě faktorů včetně například typu agens, typu a závažnosti nádoru, který má být léčen, a na způsobu podání agens. Nicméně, je třeba uvést, že předkládaný vynález není limitován na žádnou konkrétní dávku.

♦ · · • · » · • ···· · · ·· «· * · · • · ·· [169] V dalším dodatečném alternativním provedení mohou být antagonista EGFR a VEGFR podáváni v kombinaci s jedním nebo více adjuvans, jako jsou například cytokiny (např. IL-10 a IL-13), nebo jiné imunitní stimulátory. Viz, například Larrivée et al., výše. Nicméně, je třeba zdůraznit, že v terapeuticky účinném způsobu je podání pouze antagonisty EGFR a antagonisty VEGFR postačující pro prevenci, inhibici, nebo redukci progrese nádoru.

[170] Kromě toho, mohou být antagonista EGFR a/nebo antagonista VEGFR podány jako ligandový konjugát, který se specificky váže k receptoru a doručuje toxickou, letální dávku po internalizaci konjugátu ligand-toxin. Konjugáty toxinů s receptory byly navrženy za účelem vývoje toxických agens specifických pro tumorové buňky nadměrně exprimující EGFR nebo VEGFR, při současném minimalizování nespecifické toxicity. Tak například, bylo prokázáno, že konjugát složený z EGF a endotoxinu Pseudomonas (Pseudomonas endotoxin, PE) je in vitro toxický pro HeLa buňky exprimující EGFR. Různé agens, včetně thioridazinu a adenoviru, mohou zvyšovat buněčný příjem konjugátu, stejně jako zvyšovat cytotoxicitu konjugátu.

[171] Je zřejmé, že antagonisté EGFR a/nebo VEGFR podle vynálezu, jestliže jsou použiti u savce pro účely profylaxe nebo léčby, budou podáváni ve formě kompozice , která dále obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič. Vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují například jeden nebo více z následujících nosičů, kterými jsou voda, fyziologický roztok, fyziologický roztok s fosfátovým pufrem, dextróza, glycerol, ethanol a podobně, stejně jako jejich kombinace. Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou dále zahrnovat minoritní množství pomocných látek, jako

·· · • · • · · • · · · · • · jsou zvlhčující nebo emulgační činidla, konzervační látky nebo pufry, které zvyšují životnost nebo účinnost vázání proteinů. Kompozice pro injekční podání může být připravena pro poskytnutí rychlého, udržovaného nebo odloženého uvolňování aktivní ingredience po podávání savci, jak je v oboru dobře známo.

[172] Antagonisté EGFR a/nebo antagonisté VEGFR podle předkládaného vynálezu mohou být v řadě různých forem. Tyto formy zahrnují, například pevné, polopevné a kapalné dávkovači formy, jako jsou tablety, pilulky, prášky a tekuté roztoky, disperze nebo suspenze, liposomy, čípky, roztoky pro injekce a pro infúze. Preferovaná forma závisí na zamýšleném způsobu podání a terapeutické aplikace.

[173] Antagonisté mohou být připraveni způsobem dobře známým v oboru přípravy farmaceutik. Při přípravě kompozice je aktivní ingredience obvykle smíchána s nosičem, nebo je nosičem naředěna a/nebo je uzavřena v nosiči, který může být ve formě například kapsule, tobolky, papíru nebo jiného obalu. Jestliže nosič slouží jako ředidlo, může se jednat o pevný, polopevný nebo tekutý materiál, který působí jako vehikulum, excipient nebo médium pro aktivní ingredienci.

V tom případě může kompozice být ve formě tablet, pastilek, tobolek, elixírů, suspenzí, aerosolů (jako pevná látka nebo v kapalném médiu, mastí obsahujících například až 10 % hmotnostních aktivní sloučeniny, měkkých a tvrdých želatinových tobolek, čípků, injekčních roztoků, suspenzí, sterilně zabalených prášků a jako topická náplast.

[174] Soupravy pro inhibici růstu nádorů ·· * • · • ··β· « • · • 9 9

99 9 t [175] Předkládaný vynález rovněž zahrnuje soupravy pro inhibici růstu nádorů, které obsahují terapeuticky účinné množství antagonisty EGFR a terapeuticky účinné množství antagonisty VEGFR. Antagonistou EGFR nebo VEGFR v uvedených soupravách může být jakýkoliv vhodný antagonista, jehož příklady byly shora popsány. Výhodně zahrnuje antagonista EGFR v soupravě protilátku, nebo její funkční ekvivalent, specifický pro EGFR. V jiném, rovněž výhodném, provedení, zahrnuje antagonista EGFR malou molekulu specifickou pro EGFR. Výhodně zahrnuje antagonista VEGFR v soupravě protilátku, nebo její funkční ekvivalent, specifický pro VEGFR. V jiném, rovněž výhodném, provedení, zahrnuje antagonista VEGFR malou molekulu specifickou pro VEGFR.

Mimo to mohou soupravy podle předkládaného vynálezu dále obsahovat antineoplastické agens. Příklady vhodných antineoplastických agens v kontextu s předkládaným vynálezem jsou zde popsány. Soupravy podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat adjuvans, jehož příklady byly rovněž popsány výše.

[176] V souladu s tím mohou uvedení antagonisté receptorů být použiti in vivo a in vitro k vyšetřovacím, diagnostickým, profylaktickým a léčebným postupům, které jsou v oboru dobře známy. Je zřejmé, že odborník v oboru je schopen provést obměny principů zde popsaného vynálezu, a proto jsou takovéto modifikace zahrnuty do rozsahu předkládaného vynálezu.

[177] Všechny odkazy zde zmíněné jsou zamýšleny tak, jako by byly uvedeny v celém rozsahu.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ

·· 4

4 •44 ·

44444 4 4 •4 ·

4 4 [178] Příklady provedení, které následují, jsou uvedeny pro pochopení vynálezu, nejsou však zamýšleny a neměly by být chápány jako jakýmkoliv způsobem limitující pro rozsah vynálezu. Příklady nezahrnují detailní popis běžných metod, jako jsou metody použité při konstrukci vektorů a plasmidů, inzerce genů kódujících polypeptidy do vektorů a plasmidů, nebo zavedení plasmidů do hostitelských buněk. Tyto metody jsou pro odborníka v oboru velmi dobře známé a jsou popsány v řadě publikací, včetně manuálu Sambrook, J., Frisch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[179] PŘÍKLAD I. BUNĚČNÉ LINIE A MÉDIA [180] Buňky NIH 3T3 byly získány z American Type Culture Collection (Rockville MD). Buněčná linie C441 byla zkonstruována transfekcí buněk 3T3 s chimérickým receptorem myší flk-1 (VEGFR-2)/lidský fms. Linie 10A2 je transfekovaná linie 3T3, obsahující chimérický receptor lidský fms/myší FLK-2, jehož izolace a charakterizace byla popsána (Došil et al., Mol. Cell. Biol. 13: 6572-6585 (1993)). Buňky byly rutinně udržovány v Dulbecco's modified Eagle's médiu (DME), doplněném 10% telecím sérem (calf sérum, CS), 1 mM L-glutaminu, antibiotiky a 600 μg/ml G418 (Geneticin; Sigma, St Louis MO).

[181] Buněčná linie glioblastomu GBM-18 byla udržována v DME doplněném 5% telecím sérem, 1 mM L-glutaminu a antibiotiky.

[182] Stabilní linie 3T3 vylučující rozpustný chimérický protein myší flk-1 (VEGFR-2):SEAPs (sekreční • · · · • · · · · • ·

9 • ···· • · alkalická fosfatáza, secretory alkaline phosphastaše), byla připravena a udržována v DMEM s 10% telecím sérem. Byla odebrána kondiciovaná média. Rozpustný flk-1 (VEGFR-2):SEAP byl izolován z kondicionovaného média.

[183] .PŘÍKLAD II. IZOLACE MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK [184] Příklad II-l. Krysí protilátka DC-101 (IgGl) proti myšímu flk-1 (VEGFR-2) [185] Krysy Lewis (Charles River Labs) byly hyperimunizovány s imunogenním komplexem sestávajícím z rozpustného receptoru myší flk-1:SEAPs, králičí polyklonální protilátky proti alkalické fosfatáze (rabbit anti-alkaline phosphatase polyclonal antibody), a ze sepharosových kuliček potažených Proteinem-G. Zvířata dostala 7 intraperitoneálních injekcí tohoto komplexu rozloženě v průběhu tří měsíců (ve dnech 0, 14, 21, 28, 49, 63, 77). V různých časech byla zvířatům odebírána krev z ocasní žíly a séra z imunizace byla podrobena screeningu pomocí metody ELISA k nalezení vysokých titrů vazby k mflk1 (VEGFR-2):SEAPs. Pět dnů po poslední injekci byly krysy usmrceny a asepticky byly odstraněny sleziny. Splenocyty byly promyty, spočítány a fúzovány v poměru 2: 1 s myší myelomovou buněčnou linií NS1. Hybridomy byly selektovány v médiu HAT a kolonie byly screenovány metodou ELISA na specifickou vazbu k mflk-1 (VEGFR-2):SEAPs, nikoliv však na vazbu k proteinu SEAPs. Počet pozitivních hybridomů byl zvětšen a třikrát klonován limitujícím ředěním. Jeden subklon, označený jako DC-101, byl dále charakterizován.

[186] Příklad II-2. Myší monoklonální protilátky Mab 25 a Mab 73 proti myšímu flk-1 (VEGFR-2) • 9999 9 • 9 »9 • 9 9 • 999 • 9 [187] Myší monoklonální protilátky (monoclonal antibodies, Mabs) proti flk-1 (VEGFR-2) byly produkovány s použitím podobného protokolu, jako v případě DC-101. Stručně shrnuto, myším byl injikován komplex rozpustného receptoru flk-1 (VEGFR-2)/SEAP navázaný buďto na anti-SEAP Protein/A Sepharosový komplex, nebo na Sepharosu s pšeničným zárodečným aglutininem, který byl získán z kondicionovaného média transfekovaných buněk NIH 3T3. Myši byly hyperimunizovány v periodických intervalech v průběhu období 6 měsíců. Imunitní splenocyty byly shromážděny a fúzovány s myší myelomovou buněčnou linií NSI. Hybridomy byly selektovány v médiu HAT, po inkubaci byly kolonie podrobeny screeningu na produkci myších Mab. Na rozdíl od protokolu použitém pro DC-101 byly pozitivní supernatanty screenovány na vazbu k receptoru flk-1(VEGFR2)/fms, zachyceném z lyzátů buněk C441 na plotnách ELISA potažených protilátkou proti C-koncové oblasti fms, generovanou s pomocí odpovídajícího peptidu. Reaktivní Mab byly poté zkoušeny metodou ELISA na vazbu k intaktním buňkám C441 a k purifikovanému flk-1 (VEGFR-2)/SEAP versus SEAP samotný. Supernatanty z hybridomů, vykazujících vazbu k C441 a reaktivitu s flk-1 (VEGFR-2)/SEAP, avšak nikoliv se samotným SEAP, byly expandovány, pěstovány v ascitech a purifikovány (EZ-PREP,Pharmacia). Purifikované Mabs byly podrobeny zkouškám na buňkách C441 ke stanovení vazebností jejich buněčného povrchu metodou FACS a jejich schopnosti inhibovat aktivaci flk-1 (VEGFR-2)/fms, indukovanou VEGF, ve fosforylačních zkouškách. Výsledky těchto studií vedly ke klonování Mabs 25 a 73 (izotyp IgGl) pro další charakterizaci, a to na základě jejich schopnosti specificky se vázat k flk-1 (VEGFR-2) a blokovat aktivaci

0

• 0 0 0 · * 00000·· • · 0 0

receptoru na úrovni, která je srovnatelná s úrovní zjištěnou pro DC-101.

[18 8] PŘÍKLAD III. ZKOUŠKY [189] Příklad III-l. Metody ELISA [190] Protilátky byly screenovány metodou ELISA na pevné fázi, ve které byly porovnávány vazebné charakteristiky různých mAbs s proteinem flk-1 (VEGFR2):SEAP a SEAP. Mikrotitrační destičky byly potaženy 50-100 ng/jamku buďto flk-1:SEAP nebo AP v uhličitanovém pufru o pH 9,6 přes noc při 4 °C. Destičky byly blokovány fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem, doplněným 10% sérem právě narozených telat (NB 10), po dobu jedné hodiny při 37° C. Supernatanty hybridomů nebo purifikované protilátky byly přidány k destičkám po dobu dvou hodin při 37° C s následujícím přidáním kozího anti-krysího IgG konjugovaného s křenovou peroxidázou (Tágo) po dobu další jedné hodiny při 37° C. Po důkladném promytí byly přidány TMB (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg MD) a peroxid vodíku, jako chromogen, a destičky byly odečítány při 450 nm v čtečce ELISA.

[191] Příklad III-2. Izotypizace [192] Izotypizace různých monoklonálních protilátek byla prováděna tak, jak bylo dříve popsáno (Songsakphisarn, R. and Goldstein, Ν. I., Hybridoma 12: 343-348, 1993) s použitím reagens specifických pro krysí izotypy (Zymed Labs, South San Francisco CA).

• ·

0 0 •·00· ♦ 0 [193] Příklad III-3.Fosforylace, imunoprecipitace a imunoblotové zkoušky

194] Fosforylační zkoušky a analýza Western blot s buňkami C441 a 10A2 byly s určitými modifikacemi prováděny tak, jak bylo dříve popsáno (Tessler et al.,

1994). Stručně uvedeno, buňky byly pěstovány k 90% konfluenci v DME-10% CS a poté byly před vlastními pokusy ponechány bez séra (vyhladověny) v DME-0,5% CS po dobu 24 hodin. Buňky HUVEC byly pěstovány ke subkonfluenci v základním médiu EGM. Pro neutralizační zkoušky byly buňky stimulovány různými koncentracemi vhodného ligandu za bezsérových podmínek (DME-0,1 % BSA) v přítomnosti a v nepřítomnosti mAb DC-101 po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Ligandy, VEGF a CSF-1, byly testovány v koncentracích 10-80 ng/ml a 20-40 ng/ml, v uvedeném pořadí. Monoklonální protilátky byly testovány v koncentracích pohybujících se v rozmezí od 0,5 μg/ml do 10 μg/ml. Pro vyhodnocení účinků mAb DC-101 na aktivaci receptorů flk-1 (VEGFR-2)-fms, indukovanou VEGF, byla protilátka přidána buďto simultánně (kompetitivní inhibice), nebo byla převázána k buňkám po dobu 15 minut při teplotě místnosti před vlastním přidáním ligandu. Buňky inkubované v bezsérovém médiu za nepřítomnosti a v přítomnosti DC-101 sloužily jako kontroly receptorové autofosforylace v nepřítomnosti ligandu a v přítomnosti protilátky, v uvedeném pořadí. Kontrolní buněčná linie exprimující fms/FLK-2 chimérický receptor(10A2) byla vyhladověna a stimulována s 20 a 40 ng/ml CSF-1 a testována v přítomnosti a v nepřítomnosti 5 μg/ml DC-101.

[195] Po stimulaci byly monovrstvy promyty ledově chladným PBS obsahujícím 1 mM orthovanadičnanu sodného.

·« ·· ·· ·

• · · • » * ···· ·« ·· • · » €

a • « • 99 • 9999 • · ··

Buňky byly lyžovány v lyzačním pufru (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% Triton X-100, 137 mM NaCl, 10 % glycerol, 10 mM EDTA, 2 mM orthovanadičnan sodný, 100 mM NaF, 100 mM difosforečnan sodný, 5 mM Pefabloc (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis IN), 100 μg aprotininu a 100 μς/πιΐ leupeptinu) a centrifugovány při 14 000 x g po dobu 10 minut. Protein byl imunoprecipitován z vyčištěných lyzátů transfekovaných buněk s použitím polyklonálních protilátek připravených proti peptidům odpovídajícím Ckoncové oblasti lidského receptoru fms (Tessler et al., J. Biol. Chem. 269, 12456-12461, 1994), nebo proti myší FLK-2 interkinázové doméně (Smáli et al., Proč.Naťl Acad. Sci. USA, 91, 459-463, 1994), navázaných na sepharosové kuličky potažené Proteinem A. Tam, kde je to vyznačeno, byly prováděny imunoprecipitace s DC-101 nebo irelevantním krysím IgG s 10 μg protilátky navázané na kuličky potažené Proteinem G. Poté byly kuličky promyty jednou s 0,2% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA (Pufr A) , dvakrát Pufrem A, obsahujícím 500 mM NaCl a dvakrát Tris-HCl, pH 8,0. Vysušené kuličky byly smíchány se 30 μΐ 2xSDS nanášecího pufru) a byly podrobeny SDS PAGE v 4-12% gradientových gelech (Novex, San Diego CA). Po elektroforéze byly proteiny pro analýzu přeneseny na nitrocelulózové filtry. Filtry byly přes noc blokovány v blokujícím pufru (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl (TBS) obsahujícím 5 % hovězího sérového albuminu a 10% odtučněného sušeného mléka (Biorad, CA). Pro detekci fosforylace receptoru byly bloty zkoušeny s monoklonální protilátkou namířenou proti fosfotyrosinu (UBI, Lake Placid, NY) v blokujícímm pufru po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Poté byly bloty důkladně promyty s 0,5 x TBS obsahujícím 0,1% Tween-20 (TBS-T) a inkubovány s kozím anti-myším IgG konjugovaným s křenovou peroxidázou • · • · · · · · · · · • · ·· · ··· · ··· • · · · · · ···· · · · ··· • · · · · · · · ·

...........

(Amersham). Bloty byly promyty s TBS a inkubovány po dobu 1 minuty s chemiluminiscenčním reagens (ECL, Amersham). Antifosfotyrosinová protilátka reagující s fosforylovanými proteiny, byla detekována expozicí na luminiscenční detekční film o vysoké citlivosti (Hyperfilm-ECL, Amersham) po dobu 0,5 až 10 minut.

[196] Pro detekci hladin receptorů flk-1 (VEGFR-2)/fms v buňkách C441 byly bloty rozděleny na proužky podle protokolu výrobce (Amersham) a opětovně zkoušeny s králičí polyklonální protilátkou anti-fms.

[197] Příklad III-4. Vazebná zkouška průtokovou cytometrií (Flow Cytometer Binding Assays) [198] Buňky C441 byly pěstovány téměř ke konfluenci v miskách o průměru 10 cm. Buňky byly odstraněny neenzymatických disociačním pufrem (Sigma), promyty v ledovém bezsérovém médiu a resuspendovány v Hanksovš roztoku (Hanks balanced salt solution) doplněném 1% BSA (HBSS-BSA) na koncentraci 1 milionu buněk na zkumavku. Monoklonální protilátka DC-101 nebo izotypově vhodná irelevantní protilátka anti-FLK-2 23H7 v množství 10 μς na zkumavku byly přidány po dobu 60 minut na ledu. Po promytí bylo přidáno 5 μρ kozího anti-myšího IgG konjugovaného s FITC (TÁGO) po dalších 30 minut na ledu. Buňky byly třikrát promyty, resuspendovány v 1 ml HBSS-BSA a analyzovány na cytometru „Coulter Epics Elitě Cytometer. Nespecifická vazba fluorescenční sekundární protilátky byla stanovena ze vzorků postrádajících primární protilátku.

[199] Příklad III-5. Vazebné zkoušky k intaktním buňkám • · • · • · · [200] Zkoušky s buňkami C441 byly prováděny s buňkami pěstovanými ke konfluenci na 24 jamkových destičkách. Buňky HUVEC byly pěstovány ke konfluenci na destičkách o 6 jamkách. Monovrstvy byly inkubovány při 4° C po dobu 2 hodin s různými množstvími mAb DC-101 ve vazebném pufru (DMEM, 50 Mm HEPES pH 7,0, 0,5% hovězí sérový albumin).

Poté byly buňky promyty ledovým fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (phosphate buffered šalině, PBS) a inkubovány se sekundární anti-krysí IgG protilátkou konjugovanou s biotinem v konečné koncentraci 2,5 pg/ml. Po 1 hodině při 4° C byly buňky promyty a inkubovány se streptavidin-křenovou peroxidázou po dobu 30 minut při 4°

C. Po promytí byla protilátka navázaná na buňky stanovena měřením absorbance při 540 nm na kolorimetrickém detekčním systému (TMB, Kirkegaard and Perry). Hodnota OD při 540 nm pro sekundární protilátku samotnou sloužila jako kontrola pro nespecifickou vazbu.

[201] Příklad III-6. Zkoušky buněčné proliferace [202] Mitogenní zkoušky byly prováděny s použitím „Cell Titer 96 Non Radioactive Cell Proliferation Assay Kit (Promega Corp., Madison, WI). V této zkoušce je proliferace kolorimetricky měřena jako hodnota získaná z redukce tetrazoliové soli životaschopnými buňkami na formazanový produkt. Stručně řečeno, byly buňky HUVEC pěstovány ve 24 jamkových, želatinou potažených destičkách v základním médiu EGM v množství 1000 buněk/jamka. Po inkubaci 48 hodin byly do jamek přidány různé složky. VEGF byl do média přidán v množství 10 ng/ml v přítomnosti nebo v nepřítomnosti 1 gg/ml mAb DC-101. Tam, kde je to uvedeno, byl přidán heparin (Sigma) na konečnou koncentraci 1 μς/ιηΐ.

• · · · · · • · · · · · · • · ··· ······· ····

Poté byly buňky inkubovány po další 3 dny. Pro stanovení buněčného růstu byl přidán 20μ1 alikvot tetrazolového barviva do každé jamky. Buňky byly dále inkubovány po 3 hodiny při 37° C. Buňky byly solubilizovány a byla měřena absorbance (OD 570) formazanového produktu, jako kvantifikace proliferace.

[203] Příklad IV. ZKOUŠKY AKTIVITY IN VITRO [204] Příklad IV-1. Myší Mabs 25 a 73 anti-flk1(VEGFR-2) vyvolávají specifickou neutralizaci receptoru flk-1(VEGFR-2)/fms, jehož aktivace je indukována VEGF [205] Byly prováděny zkoušky s imunoprepicitovanými receptory FLK/fms a PDGF ze shodných koncentrací buněčné linie C441, tj. buněčné linie 3T3 transfekované flk-1 (VEGFR-2)/fms, zatímco lidský EGFR byl imunoprecipitován z nádorové buněčné linie, KB. Buňky byly stimulovány s RPMI-0,5% BSA obsahujícím 20 ng/ml VEGF(flk-l/fms), DMEM10% telecí sérum (PDGFR) , nebo 10 ng/ml EGF (EGFR) v přítomnosti nebo v nepřítomnosti 10 μg/ml myších antiflk-1 Mabs, označených Mab 25 a Mab 73. Po stimulaci byly buňky promyty s PBS-lmM orthovanadičnanem sodným a lyžovány. Flk-1/fms a PDGFR byly z lyzátů imunoprecipitovány s protilátkami generovanými peptidem proti C-koncové oblasti c-fms (IM 133) a receptorům PDGF (UBI), v uvedeném pořadí. EGFR byl imunoprecipitován s Mab (C225) vyvolané proti N-koncové oblasti lidského receptoru. Imunoprecipitované lyzáty byly podrobeny SDS polyakrylamidové elektroforéze s následným Western blottingem. Bloty byly testovány s anti-PTyr Mab (UBI) pro detekci aktivace receptoru. Neutralizace receptoru • · *· ·· · ··· • · · · · · ··· ···· · ··· · ··· • · · · · · ···· · · · ···· stimulovaných buněk byla vyhodnocována v porovnání s irelevantní Mab a s nestimulovanou kontrolou.

[206] Příklad IV-2. Detekce receptoru flk-1 (VEGFR2)/fms Western blottingem s použitím Mab 25 a Mab 73 jako sond [207] Receptor byl detekován pomocí myších anti-flk-1 (VEGFR-2) Mabs na Western blotech s flk-1 (VEGFR-2)/fms receptorem, imunoprecipitovaným polyklonální protilátkou indukovanou peptidem, namířenou proti C-koncové oblasti receptoru c-fms, získaného z lyzátů připravených ze shodných koncentrací transfekované buněčné linie C441, tj. transfekované buněčné linie 3T3. Po analýze SDS gelovou elektroforézou a Western blottingu, byl blot rozdělen na čtyři části a každá ze sekcí byla testována se sondou 50 μς/ιηΐ anti-flk-1 (VEGFR-2) Mabs 25 a 73. Bloty byly pak naproužkovány a opětovně zkoušeny s anti-fms polyklonální protilátkou k verifikaci toho, že pruhy detekované s každou Mab reprezentují receptor flk-1 (VEGFR-2)/fms.

[208] Příklad IV 3. Detekce aktivovaného KDR (VEGFR-2) z buněk HUVEC a OVCAR-3, stimulovaných VEGF, pomocí imunoprecipitace s anti-flk-1 (VEGFR-2) Mabs [209] Proteiny byly imunoprecipitovány s odlišnými protilátkami z lyzátů čerstvě izolovaných buněk HUVEC. Před lyží byly buňky stimulovány 20 ng/ml VEGF po dobu 10 minut při teplotě místnosti v RPMI-0,5% BSA a promyty s PBS obsahujícím 1 mM orthovanadičnanu sodného. Jednotlivé imunoprecipitace byly prováděny se stejnými objemy lyzátů a poté byly podrobeny polyakrylamidové elektroforéze SDS s následným Western blottingem. Blot byl nejprve testován s φ φ · « · φ φ φ φ · • •Φ φ φ φ φφφ φφφφ φ φφφ φ φφφ φ φ φφφ φφφφφφφ φφφφ • ΦΦ φφφ φφφ φφφφφφ φφ φ φφ · anti-PTyr Mab (UBI) a pak byl postupně rozdělen podle jednotlivých pruhů a opětovně testován s peptidem indukovanou polyklonální protilátkou proti interkináze z flk-1/KDR (VEGFR-l/VEGFR-2, IM 142), a následovně s polyklonální protilátkou proti C-koncové oblasti flk-1 (VEGFR-1) (Santa Cruz Biotechnology, lne). Imunoprocipitace byly prováděny s irelevantní krysí Mab, 23H7, s irelevantní myší Mab, DAB8, oproti anti-flk-1 (VEGFR-2) Mabs, DC-101,

73, 25 a polyklonální protilátce anti flk-1/KDR (VEGFRl/VEGFR-2) , IM 142. V některých případech byly bloty naproužkovány a opětovně testovány s anti-flk-1 Mabs 73 a 25 pro detekci křížově reagujících pruhů.

[210] Podobný protokol byl použit pro detekci formy (forem) receptoru KDR (VEGFR-2) v buněčné linii karcinomu vaječníků OVCAR-3.

[211] PŘÍKLAD V. AKTIVITA PROTILÁTEK [212] Příklad V-l. ELISA a imunoprecipitace s DC-101 [213] Bylo zjištěno, že krysí IgGl monoklonální protilátka DC-101 je specifická pro myší tyrosinkinázový receptor flk-1 (VEGFR-2). Výsledky zkoušky ELISA prokázaly, že tato protilátka se vázala s purifikovaným flk-1 (VEGFR2):SEAP, nikoliv však s alkalickou fosfatázou nebo s jinými receptorovými tyrosinkinázami, jako je FLK-2. Jak ze zřejmé z Obrázku 1, DC-101 imunoprecipituje myší flk-1 (VEGFR2):SEAPS, nikoliv však SEAPS samotný.

[214] Příklad V-2. Inhibice fosforylace receptoru Flk-1 (VEGFR-2) s DC-101 • 4 • · * 44 4 * · · 4 · 4

4 4 4 4 4 4 4 · 4 4 4 • * · 4 4 4444444 4444

“.....^. * ”* * [215] Byly prováděny pokusy pro stanovení, zda může DC-101 v buňkách C441 neutralizovat fosforylaci flk-1 (VEGFR-2), vyvolanou ligandem příbuzným VEGF165. V těchto pokusech byly monoklonální protilátka a VEGF přidány simultánně k monovrstvám buněk po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Uvedené podmínky byly navrženy pro stanovení kompetitivních účinků (kompetitivní inhibice) protilátky na vazbu receptor/ligand. Výsledky zkoušek, uvedené na Obrázku 2a, naznačují, že fosforylace receptoru flk-1(VEGFR-2)/fms, indukovaná VEGF165, byla významně snížena, jestliže buňky byly testovány v přítomnosti DC-101. Kromě toho tyto výsledky naznačují, že Mab soutěží s VEGFiss o zabránění úplné aktivace receptoru ligandem. Ke stanovení citlivosti interakce VEGF-flk-1 (VEGFR-2) k inhibici pomocí DC-101 byly buňky C441 testovány při maximálních stimulačních koncentracích VEGF165 (40 ng/ml) v kombinaci s různými hladinami protilátky. Výsledky titrací Mab jsou uvedeny na Obrázku 2b. Významný pokles fosforylace flk-1 (VEGFR-2) působením VEGF165 byl pozorován, jestliže bylo použito DC101 v koncentracích vyšších než 0,5 μς/ιηΐ. Výsledky naznačují, že relativně nízké koncentrace protilátky (< 1 μς/ιηΐ) jsou dostatečné pro inhibici aktivace receptoru ligandem. Protilátka v koncentraci 5 pg/ml je schopna neutralizovat stimulaci flk-1 (VEGFR-2) pomocí VEGF165 v přítomnosti přebytku ligandů o koncentraci 80 ng/ml (Obrázek 3a a 3b). V kontrolním provedení byl testován účinek DC-101 na plně stimulovaný receptor fms/FLK-2 receptor (buněčné linie 10A2) s použitím CSF-1. Za těchto podmínek nevykazovala DC-101 žádný účinek na aktivaci receptoru.

[216] Příklad V-3. Inhibiční testy s DC-101 ··· ♦·· ··· • · ·· · · · · · ··· • · 9 · 9 9 9999 99 9 999

9 9 9 9 9 9 9 9

73_ ......... ·· · [217] Rozsah a specifičnost inhibice.s Mab byla dále zkoušena v testech, ve kterých byla DC-101 předem inkubována s buňkami před přidáním ligandu tak, aby byla umožněna maximální interakce protilátky s receptorem.

V těchto pokusech byly monovrstvy buněk inkubovány s 5 μς/πιΐ DC-101, krysí anti-FLK-2 Mab (2A13, připravenou konvenčními technikami (ImClone, NY), a s kontrolním krysím IgGl (Zymed Labs) po dobu 15 minut při teplotě místnosti, před přidáním 40 ng/ml VEGFi₆s po dalších 15 minut. Pro srovnání byly prováděny zkoušky, ve kterých DC-101 a VEGF_i65 byly přidány simultánně (kompetitivní inhibice). Výsledky těchto testů (Obrázek 4) ukazují, že preinkubace monoklonální protilátky anti-flk-1 (VEGFR-2) s buňkami transfekovanými flk-1 (VEGFR-2)/fms úplně ruší aktivaci receptorů pomocí VEGF165. Podobné výsledky byly pozorovány s použitím stimulace s VEGF121. Zatímco fosforylace flk-1 (VEGFR-2) s VEGF není ovlivněna přidáním irelevantních izotypově příbuzných krysích protilátek, reaktivita téhož blotu testovaného s polyklonální protilátkou anti-fms vykazuje shodnou hladinu receptorového proteinu v pruhu. Uvedené údaje naznačují, že inhibice fosforylace pozorovaná s DC-101 byla spíše způsobena blokací aktivace receptorů, než nedostatkem receptorového proteinu v testovaných vzorcích.

[218] Příklad V-4. FACS analýza - vazba DC-101 k buňkám C441 [219] Monoklonální protilátka (mAb) byla testována analýzou FACS na vazbu k buňkám 3T3 transfekovaným receptorem flk-1 (VEGFR-2)/fms (buňky C441). Výsledky uvedené na Obrázku 6 demonstrují, že chimérický flk-1 (VEGFR-2)/fms exprimovaný na povrchu buněk C441 je • · • ··· · · · * · ··· * · · * · · ···· » · · ··· ······ · · ·

...... ... .. .

specificky rozpoznáván mAb DC-101 a nikoliv protilátkou téhož izotypu, která byla vyvolána proti příbuznému receptoru tyrosinkinázy, FLK-2. Účinnost interakce mAbreceptor na buněčném povrchu byla stanovena na základě zkoušek, ve kterých byly měřeny hladiny vazby mAb na intaktních buňkách C441. Výsledky uvedené na Obrázku 7 naznačují, že mAb se váže k receptoru flk-1 (VEGFR-2)/fms s relativní zjevnou afinitou přibližně 500 ng/ml. Výsledky prokazují, že mAb má silnou afinitu k flk-1 (VEGFR-2), exprimovanému na buněčném povrchu.

[220] Příklad V-5. Stanovení reaktivity DC-101 imunoprecipitaci [221] Míra reaktivity DC-101 s receptorem flk-1 (VEGFR-2)/fms byla dále testována stanovením kapacity protilátky pro imunoprecipitaci receptoru po aktivaci s VEGF. Obrázek 8 znázorňuje imunoprecipitaci fosforylovaného receptoru flk-1 (VEGFR-2)/fms s mAb DC-101 z buněk C441, stimulovaných VEGF. Výsledky dokládají, že monoklonální protilátka DC-101 a polyklonální protilátky anti-fms vykazují podobnou úroveň interakce s receptorem, zatímco krysí anti-FLK-2 protilátky 2H37(IgGl) a 2A13 (IgG2a) nevykazují žádnou reaktivitu. Byly prováděny pokusy ke stanovení, zda mAb DC-101 může neutralizovat fosforylaci flk-1 (VEGFR-2)/fms indukovanou s VEGF při maximálních stimulačních koncentracích ligandu (40 ng/ml). V těchto pokusech byla monoklonální protilátka přidána k monovrstvám buďto současně s ligandem, nebo před stimulací ligandem, a bylo a zkoušeno její působení po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Uvedené podmínky byly testovány ke stanovení jak kompetitivních účinků (kompetitivní inhibice) protilátky na vazbu receptor/ligand, tak ke stanovení účinnosti • ·» ♦ • · · · · · · · 9 9 9

99999 9 9 99999 • 999 předvázání protilátky k zabránění aktivace receptoru. Výsledky těchto zkoušek, uvedené na Obrázku 4, naznačují, že fosforylace flk-1 (VEGFR-2)/fms je redukována simultánním přidáním mAb s VEGF a je významně inhibována, jestliže je protilátka předem vázána na receptor. Denzitometrická zobrazení těchto výsledků prokázala, že mAb DC-101 interaguje s flk-1 (VEGFR-2)/fms tak, že inhibuje fosforylaci na úrovni, která je 6% (čára 5, P) a 40% (čára 6, C) vzhledem ke kontrole, kterou je plně stimulovaný receptor (čára 4). Z těchto výsledků lze usuzovat, že Ab DC-101 intenzitvně soutěží s interakci ligand-receptor ve smyslu neutralizace aktivace receptoru flk-1. Ke stanovení citlivosti interakce VEGF-flk-1 (VEGFR-2) k inhibici s mAb DC-101, byly buňky C441 testovány s maximálními hladinami VEGF v přítomnosti zvyšujících se koncentrací protilátky. Byly prováděny testy s mAb za kompetitivních podmínek a za podmínek předvázání. Výsledky těchto mAb titrací jsou uvedeny na Obrázku 9. Významné snížení fosforylace flk-1 (VEGFR-2) je pozorováno tehdy, když Ab DC-101 soutěží s protilátkou VEGF v koncentracích vyšších než 0,5 μg/ml. Tyto údaje rovněž prokazují, že relativně nízké koncentrace předem vázané protilátky (< 1 gg/ml) jsou postačující pro kompletní inhibici aktivace receptoru ligandem.

[222] Příklad V-6. Aktivita DC-101 ve fosforylační zkoušce [223] Pro další stanovení antagonistického působení mAb DC-101 na aktivaci receptoru byly prováděny zkoušky fosforylace, ve kterých bylo pevně stanovené množství protilátky (5 pg/ml) přidáváno k buňkám C441 stimulovaným zvyšujícím se množstvím ligandu (Obrázek 3a). Úroveň fosforylace, indukovaná každou z koncentrací ligandu • · • 9

0 0 0t ••••0 00····· • ·· · 0 0 0 0 099 9 0 ··9

4 ·ί·» *··* ’«.· i ;

v přítomnosti a v nepřítomnosti mAb DC-101, byla rovněž kvantifikována denzitometrickým odečtem. Graf těchto výsledků, uvedený na Obrázku 3b, naznačuje, že protilátka byla schopna částečně neutralizovat fosforylaci receptorů, a to dokonce i v přítomnosti nadbytku VEGF. Ke stanovení specifičnosti mAb DC-101 pro aktivaci receptorů byla protilátka testována na svoji schopnost kompetitivně inhibovat aktivaci receptorů fms/FLK-2, indukovanou CSF-1, v transfekované buněčné linii 3T3, označené 10A2. V těchto pokusech bylo 5 pg/ml mAb DC-101 testováno společně s koncentracemi CSF-1 (20-40 ng/ml), o kterých je známo, že vedou k úplné aktivaci receptorů. Výsledky, které jsou znázorněny na Obrázku 10, naznačují, že mAb DC-101 neměla žádný účinek na fosforylaci receptorů fms/FLK-2, zprostředkovanou CSF-1.

[224] Příklad V-7. Inhibice s DC-101 v preinkubačních testech.

[225] Rozsah a specifičnost protilátkové inhibice byly dále testovány v pokusech, ve kterých DC-101 nebo irelevantní protilátky byly předem inkubovány s buňkami před přidáním ligandu tak, aby byla zajištěna maximální interakce protilátky s receptorem. V těchto pokusech byly monovrstvy předem inkubovány s buďto 5 pg/ml DC-101, krysí :anti-FLK-2 mAb (2A13), nebo s kontrolním krysím IgGl (Zymed Labs), a to před přidáním 40 ng/ml VEGF. Pro srovnání byly provedeny kompetitivní zkoušky, ve kterých byly protilátky a VEGF přidány simultánně. Výsledky těchto studií ukazují, že pouze předchozí inkubace monoklonální protilátky antiiflk-1 (VEGFR-2) s buňkami transfekovanými flk-1 (VEGFR2)/fms kompletně ruší aktivaci receptorů indukovanou VEGF, zatímco fosforylace flk-1 (VEGFR-2) s VEGF není přidáním • · · · «φφφφ φ · irelevantních izotypově příbuzných krysích protilátek dotčena. Reaktivita téhož blotu zkoušeného s polyklonální anti-fms (Obrázek 11) vykazuje shodné úrovně receptorového proteinu v pruhu. Výsledky naznačují, že nedostatečná fosforylace, pozorovaná u buněk ošetřených s mAb DC-101, byla způsobena díky blokaci fosforylace indukované VEGF shodných množství exprimovaného receptoru [226] Příklad V-8. Interakce protilátek s homologními formami receptorů [227] Dále byly prováděny pokusy ke stanovení toho, zda monoklonální protilátky anti-flk-1 (VEGFR-2) interagují s homologními formami receptorů na lidských endotelových buňkách. Titrace zvyšujících se koncentrací DC-101 na klonovaných buňkách HUVEC (ATCC) ukázaly, že protilátka vykazovala komplexní vazebné působení. Výsledky představují odlišné interakce protilátek s receptory VEGF, jejichž výskyt na endotelových buňkách byl popsán (Vaisman et al., J. Biol. Chem. 265, 19461-19466, 1990). Specifičnost interakcí DC-101 s buňkami HUVEC, stimulovanými VEGF, byla poté určena s použitím fosforylačních zkoušek za podmínek podobných těm, které jsou uvedeny pro Obrázek 8. V těchto studiích mají proteinové pruhy, získané imunoprecipitací s DC-101 z buněk HUVEC, molekulové hmotnosti podobné těm, které byly popsány pro křížově vázané VEGF-receptorové pruhy, jestliže je odečtena komponenta ligandů (Obrázek 12). Tyto pruhy vykazují zvýšenou fosforylací, jestliže jsou buňky stimulovány s VEGF (srovnej čáry 1 a 2 na Obrázku 12). Kromě toho fosforylace receptorových pruhů indukovaná VEGF je v testu umocněna zařazením působení 1 μρ/πιΐ heparinu (čára 3 na Obrázku 12). Tato zjištění jsou ve shodě s předchozími nálezy o zvyšující se vazbě VEGF • * • ·

9

9 » 9 9

999 s endotelovými buňkami v přítomnosti nízkých koncentrací heparinu (Gitay-Goren et al., J. Biol. Chem. 267, 60936098, 1992).

• ♦ 9 9

9 99999

9 9 «

[228] Je obtížné zjistit, který imunoprecipitovaný protein interaguje s DC-101 k vytvoření komplexu fosforylovaných pruhů pozorovaných na Obrázku 12 vzhledem ke zjištění, že se různé receptorové formy vážou s VEGF na buňkách HUVEC a vzhledem k možnosti jejich asociace po stimulaci. Bylo popsáno, že se receptorové formy exprimované na buněčném povrchu s molekulovými hmotnostmi přibližně 180 (KDR (VEGFR-2)), 155, 130-135, 120-125 a 85 vážou s VEGF na buňkách HUVEC. Takováto zjištění naznačují možnost, že řada odlišných receptorových forem může po stimulaci ligandem vytvářet heterodimery způsobem podobným tomu, jaký byl popsán pro KDR-flk-1(VEGFR-2/VEFGR1). Nicméně, s výjimkou KDR (VEGFR-2), konkrétní povaha a role těchto receptorových forem musí být teprve definována. Proto reaktivita protilátky může rezultovat z interakce (interakcí) s jedním nebo několika receptory VEGF nezávislými na KDR (VEGFR-2).

[229] V provedení ELISA nereaguje DC-101 s lidským KDR (VEGFR-2), ani se neváže k čerstvě izolovaným buňkám HUVEC v analýze FACS. Tyto výsledky vedou k závěru, že přímá interakce DC-101 s lidským (VEGFR-2) je vysoce nepravděpodobná.

[230] Na rozdíl od DC-101, obě protilátky Mab 25 a Mab 73 reagují s lidským KDR (VEGFR-2) v provedení ELISA a vážou se k čerstvě izolovaným buňkám HUVEC v analýze FACS.

[231] .Příklad V-9. Mitogenní zkoušky u buněk HUVEC.

44

4 4

4

4 4

4

4

4

4 4

4444 4 4

4· 4 [232] Byl pozorován inhibiční účinek DC-101 na endotelové buňky, jestliže byla protilátka testována v mitogenních zkouškách u buněk HUVEC (ATCC), stimulovaných s VEGF, v přítomnosti a v nepřítomnosti protilátky (Obrázek 12). Výsledky ukazují, že výrazné zvýšení buněčné proliferace pomocí VEGF je protilátkou DC-101 sníženo přibližně na 35%. Heparin nevykazuje žádný odlišný účinek na buněčný růst za podmínek růstu, použitých v těchto zkouškách.

[233] Vzhledem k tomu, že DC-101 může mít účinky na proliferaci, indukovanou VEGF, a na fosforylaci receptorů buněk HUVEC, je možné, že tyto výsledky jsou dané interakcí Mab s nedefinovanou formou receptorů, která je špatně přístupná na buněčném povrchu, avšak hraje určitou roli, i když malou, v růstu buněk HUVEC. Rovněž výsledky imunoprecipitace fosforylovaných pruhů o odpovídající molekulové hmotnosti s DC-101 z buněk HUVEC, stimulovaných VEGF, podporují teorii, že DC-101 může interagovat s nedefinovaným proteinem podobným flk-1 (VEGFR-2), který asociuje s aktivovaným receptorovým komplexem.

[234] Příklad V-10. Vazba Mab 25 a Mab 73 k buňkám C441 a buňkám HUVEC [235] Mabs 25 a 73 se vážou k C441 a HUVEC ve FACS analýze a vykazují internalízaci v obou buněčných liniích. Výsledky z Western blottingu naznačují, že obě anti-flk-1 Mabs mohou detekovat pruh(y) pro receptor FLK/fms v imunoprecipitátech s polyklonální protilátkou anti-fms z buněk C441. (Pro postup viz Příklad IV-2 uvedený výše).

Tyto protilátky vyvolávají specifickou neutralizaci • > · ♦ · ♦ · · · • ··· · · * · · ··· ♦ * · · · · ···· ♦« * ···· ···· ♦ · ···· ·· ·· · ·· · aktivace receptorů flk-1 (VEGFR-2)/fmsindukované VEGF a nemáji žádný účinek na fosforylaci myšího receptorů PDGF, nebo lidského receptorů EGF s EGF. (Pro postup viz Příklad IV-1 uvedený výše). Mají kapacitu inhibovat buňky HUVEC, stimulované s VEGF, v proliferačních zkouškách na 50 %, zatímco DC-101 působí na růst v mnohem menším rozsahu.

[236] Příklad V-ll, Imunoprecipitace KDR (VEGFR-2) s Mab 25 a Mab 73 [237] KDR (VEGFR-2) představuje jeden z fosfoproteinů imunoprecipitovaných s Mab25 a Mab 73 z aktivovaných buněk HUVEC. KDR (VEGFR-2) byl detekován ve Western blottingu a v imunoprecipitačních zkouškách s použitím polyklonální protilátky (IM142) anti-flk-l/KDR (VEGFR 1/VEGFR2) z časných pasáží buněk HUVEC, stimulovaných VEGF. Naopak, pruhy imunoprecipitované s těmito protilátkami z VEGFstimulovaných buněk HUVEC jsou křížově reaktivní s IM142, avšak nikoliv s polyklonální protilátkou anti-flt-1 (antiVEGFR-1). Z těchto zjištění lze odvodit, že Mabs mohou mít účinek na aktivitu KDR (VEGFR-2) v buňkách HUVEC, a to na základě experimentálních důkazů o účasti KDR (VEGFR-2), jako receptorů VEGF, který je zodpovědný za proliferativní odpověď v aktivovaných endotelových buňkách (Pro postup viz Příklad IV-3 uvedený výše).

[238] PŘÍKLAD VI. PŘÍTOMNOST FOREM RECEPTORŮ VEGF NA NEENDOTELOVÝCH (NÁDOROVÝCH) BUŇKÁCH [239] Několik nádorových linií bylo screenováno na reaktivitu proteinu s DC-101 immnoprecipítací a detekcí s antifosfotyrosinem. Imunobloty z buněčných linií 8161 (melanom) a A431(epidermální karcinom) poskytly

0« 0 •0 00 00 9

000 000 000

000 0 000 0 000

000 0 0000 00 0 »·0

000 000 000

0000 ·0 00 0 00 0 79 fosforylované pruhy s molekulovými hmotnostmi přibližně 170 a 120 kD. Tyto výsledky naznačují, že lidská forma receptoru VEGF je exprimována v neendotelových buňkách, jako jsou nádorové buňky.

[240] Podobné pokusy prokázaly, že receptor podobný KDR (VEGFR-2) je exprimován na buněčné linii z karcinomu vaječníku OVCAR-3. Tyto buňky rovněž vykazují sekreci VEGF. Fosforylované pruhy jsou imunoprecipitovány s polyklonální protilátkou anti-KDR (VEGFR-2) z buněk OVCAR-3, stimulovaných VEGF, které jsou ve Western blottingu reaktivní s anti-flk-1 (VEGFR-2) Mabs. Rovněž pruhy imunoprecipitované s myšími Mabs z těchto buněk vykazují křížovou reaktivitu se stejnou polyklonální protilátkou.

Kromě toho určité myší anti-flk-1 (VEGFR-2) Mabs vyvolávají v proliferačních zkouškách inhibiční účinek na tyto buňky. Výsledky demonstrují neendotelovou expresi (tj. na nádorových buňkách) forem lidského receptoru VEGF. Výsledky z fosforylačních a proliferačních zkoušek rovněž naznačují, že VEGF může modifikovat aktivitu receptoru autokrinním a parakrinním způsobem během tumorogeneze. (Pro postup viz Příklad IV-3 uvedený výše) [241] PŘÍKLAD VII. IN VIVO STUDIE S POUŽITÍM DC-101 [242] Příklad VII-1. Inhibice ángiogeneze in vivo s DC-101 [243] Byly navrženy testy k in vivo stanovení zda monoklonální protilátka anti-flk-1 (VEGFR-2) může blokovat růst nádorových buněk exprimujících VEGF. V těchto pokusech byla použita lidská multiformní buněčná linie glioblastomu, která má vysoké hladiny VEGF signálů a sekretuje přibližně

• · • · • *

9 9 9

99999 9 9

9 9 • · ····

9

9

9999 99 ng/ml růstového faktoru VEGF po kondicionování 24 hodin v bezsérovém médiu (Obrázek 5) .

[244] V nultém dni bylo athymickým nahým myším (nu/nu; Charles River Labs) injikováno do boku 1-2 miliónů glioblastomových buněk. Počínaje tímtéž dnem dostávala zvířata intraperitoneální injekce buďto DC-101, nebo kontrolních protilátek (100 μρ/ζνίίθ). Myši byly následně ošetřeny protilátkami ve dnech 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 a 21. Zvířata dostala injekce 100 μg buďto DC-101, nebo kontrolní krysí protilátky proti myšímu receptoru FLK-2 (2A13) ve dnech 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 a 21 v celkovém množství 1 mg/zvíře. Výskyt nádorů se začal objevovat v 5. dnu a pokračoval po dobu 50 dnů. Denně byla měřena velikost nádorů kaliperem a objem nádorů byl vypočítán podle následujícího vzorce: p/6 x větší průměr x (menší průměr)² (Baselga J.Naťl Cancer Inst. 85:. 13271333). Měření byla prováděna alespoň třikrát do týdne a objem nádoru byla počítán tak, jak je uvedeno výše. Jedno ze zvířat nesoucích nádor ve skupině ošetřené DC-101 předčasně v pokuse uhynulo a nebylo použito při stanovení statistické významnosti mezi skupinami.

[245] Obrázky 14a a 14b uvádějí porovnání mezi skupinou ošetřenou DC-101 a kontrolní skupinou 2A13 ve snížení nádorového růstu po 38 dnech u jednotlivých zvířat. Ačkoliv u všech zvířat se v průběhu pokusu vyvíjely nádory o různých velikostech a v různém počtu, myši ošetřené DC101 vykazovaly celkové zpoždění v progresi nádorů. Jedna myš ve skupině DC-101 zůstávala bez nádoru až do 49. dne, kdy byl pozorován malý růst nádoru. I tak byl růst nádoru významně potlačen. Byla provedena statistická analýza výsledků ke stanovení rozdílů ve velikosti nádorů mezi

99 ·· · 99 9 • · · · » · · · · • ··· · · · · · ··· • · · · · · ♦··· 9 9 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 9 99 9 uvedenými dvěmi skupinami. Výsledky byly vyhodnoceny standardní analýzou kovariance, ve které velikost nádoru byla snižována v čase s léčbou jako kovariantou. Výsledky prokázaly, že snížení velikosti nádoru v závislosti na čase bylo u skupiny ošetřené DC-101 signifikantně odlišné(p <

0,0001) od skupiny myší, kterým byla injikována 2A13.

[246] ,Obrázek 15 znázorňuje terapeutickou účinnost DC101 u athymické nahé myši, které byla transplantována lidská glioblastomová nádorová buněčná linie GBM-18, jež sekretuje VEGF. Nahým myším byly subkutánně injikovány buňky GBM-18 a myši byly rozděleny do tří léčebných skupin: kontrola - PBS, irelevatni kontrola - krysí IgGl a DC-101. Ošetření bylo prováděno simultánně s nádorovými xenotransplantáty a pokračovalo po dobu čtyř týdnů.

Výsledky ukázaly, že růst nádoru GBM-18 u nahých myší ošetřených s DC-101 byl signifikantně snížen ve srovnání s kontrolami. Uvedený pokus dokazuje, že DC-101 potlačuje nádorový růst blokací aktivace flk-1 (VEGFR-2) VEGF na s nádorem asociovaných endotelových buňkách, a že DC-101 má terapeutickou hodnotu jako anti-angiogenní reagens proti vaskularizovaným nádorům sekretujícím VEGF.

[247] Monoklonální protilátky k receptoru flk-1 (VEGFR-2) tyrosinkinázy inhibují invazi nádoru zrušením angiogeneze. Invazivní růst a angiogeneze jsou základními charakteristikami maligních nádorů. Bylo prokázáno, že oba fenomény jsou vhodné pro rozlišení benigních keratinocytů od maligních keratinocytů v povrchové transplantační zkoušce. Po transplantaci buněčné monovrstvy uchycené v kolagenním gelu na zádový sval nahé myši, všechny nádorové buňky zpočátku vytvářely skvamózní epitelie, avšak pouze maligní keratinocyty invazivně rostly během

00 • 0 0

000 • 0 ·»0 00 0 • 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0

00000 0 0 00000

000000 00 0 00 0 následujících 2-3 týdnů. Jak benigní, tak maligní buňky indukovaly angiogenezí. Nicméně, angiogenní odpověď na maligní buňky se objevila časněji, je mnohem silnější a kapilární růst směřoval k maligním epiteliím. Kromě toho v transplantátech benigních nádorových buněk došlo po 2-3 týdnech k regresi kapilár, zatímco maligní keratinocyty si udržují úroveň pokračující angiogeneze. Vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF) a jeho analogický receptor hrají ústřední roli v nádorové angiogenezí. Podání DC-101 narušilo pokračující angiogenezí, což vedlo k inhibici nádorové invaze. Protilátka zabránila zrání a další expanzi nově vytvářené sítě, avšak významně neinterferovala s počáteční angiogenezí. Tyto výsledky poskytují důkaz, že invaze nádoru vyžaduje precedentní angiogenezí, a že v tomto modelovém systému jsou receptory VEGF kritické pro udržení angiogeneze.

[248] Příklad VII-2. Účinek různých koncentrací DC-101 na typické glioblastomové nádory (gbm-18) [249] Athymické myši (nu/nu) byly inokulovány s GBM-18 (multimoforma lidského glioblastomu). Terapie s protilátkou byla započata, když nádory dosáhly v průměru objemu 100-200 mm³. Léčba spočívala v šesti následujících injekcích (dvakrát týdně po dobu 3 týdnů): (i) DC-101 v množství 200, 400 nebo 800 μg/injekce; (ii) irelevantní izotypově příbuzný krysí IgG (400 μg/injekce); nebo (iii) PBS. Objemy nádorů byly měřeny kaliperem. Bylo zjištěno, že inhibice nádoru ve skupinách ošetřených DC-101 je signifikantní (*) ve srovnání s PBS a s irelevantní monoklonální protilátkou.

[250] Další pokus prokazuje účinky krysí anti-flk-1 (VEGFR-2) monoklonální protilátky DC-101 na růst nádorů •i ·· 44 · 44 4 •44 ··· 444

444 4 444 4 444 • 4 444 4 4444 44 4···

444 444 ···

4444 ·· 44 4 44 4

GBM-18 u nahých myší. Zvířata (nu/nu; Charles River Labs; deset zvířat na skupinu) byla v nultém dnu subkutánně injikována buňkami GBM-18 (lidský glioblastom [100]; 1 milión na zvíře). Léčba s PBS nebo s DC-101 (200 μg/injekce) byla zahájena 7. den a pokračovala dvakrát týdně po dobu 3 týdnů (6x). Grafy znázorňují zanesení do grafu průměrných objemů nádorů a regresní hodnoty pro každou skupinu v závislosti na čase s jejich příslušnými rychlostmi nádorového růstu (sklony jsou uvedeny jako plné čáry) a 99% konfideční limity (tečkované čáry). Sklon čáry pro zvířata ošetřená s DC-101 byl signifikantně odlišný od skupiny ošetřené s PBS (p < 0,01). Je důležité uvést, že irelevantní krysí monoklonální protilátka IgGl (anti-myší IgA; Pharmigen) neměla žádný účinek na růst xenotransplantátů GBM-18 a poskytovala výsledky podobné těm, které byly nalezeny při ošetření s PBS (výsledky nejsou uvedeny).

[251] PŘÍKLAD VIII. PROTILÁTKA ΑΝΤΙ-flk-1 (VEGFR-2) SELEKTIVNĚ ZVYŠUJE RYCHLOST LÉČBY INDUKOVANÉ OZAŘOVÁNÍM U

LIDSKÝCH NÁDOROVÝCH XENOTRANSPLANTÁTŮ V NAHÉ MYŠI

252] Tento příklad vyhodnocuje, zda monoklonální protilátka DC-101, blokující klíčový VEGF receptor-2, flk-1 (VEGFR-2) na myších endotelových buňkách cév nádorů, zvyšuje léčitelnost nádorových transplantátů frakcionovanou radioterapií (RT), a zda protilátka současně moduluje radiační reakci normální tkáně (myší kůže).

[253] Materiály & Metody: Lidský malobuněčný plicní karcinom 54A a multiforma glioblastomu U87 byly implantovány subkutánně do zadní packy nahé myši. Léčba byla zahájena, jestliže nádor dosáhl v průměru 8 mm (den

0 · ·

0 0 0 0 • 0 0 0 0000 0 0

0 0 0 0

0*

0 0 0 000 0 0

0

0000 00 ·

• · 0 0

0 000

0 0

0

0). DC-101 byla injikována intraperitoneálně každé 3 dny v dávce 20 nebo 40 mg/kg tělesné hmotnosti v celkovém počtu 6 injekcí. Odstupňované celkové dávky záření byly aplikovány ve shodných denních dávkách po dobu 5 následujících dnů. V den 0, dostaly myši první injekci protilátky, nebo byla zahájena radioterapie (RT). Pro kombinovanou léčbu bylo podání DC-101 zahájeno v den 0 a RT započala v den 1. Velikost nádorů byla měřena 2-3krát za týden po léčbě. Myši s lokálně řízenými nádory byly dále sledovány pod dobu 90 dnů po posledním pozorovaném opětovném výskytu nádoru v kterékoliv skupině. Akutní reakce kůže v oblasti ozařování nádoru byla hodnocena s použitím bodovací stupnice měření během prvních 30 dnů po zahájení RT.

[254] Výsledky: Použití samotné protilátky indukovalo inhibici růstu (nikoliv však regresi) obou typů nádoru způsobem závislým na dávce. Účinek byl zřetelnější u xenotransplantátů 54A, než u U87. V kombinaci s nejnižšími dávkami záření (25-30 Gy celkem), poskytla DC 101 u obou modelů další zpoždění nádorového růstu ve srovnání se samotnou RT. Protilátka, rovněž způsobem závislým na dávce, zvýšila léčebný účinek RT. Tak například, ve své vyšší dávce snížila DC-101 radiační dávku nezbytnou k lokálnímu potlačení 50 % nádorů: l,7krát u xenotransplantátů 54A (z 67,6 Gy pro samotnou RT na 39,1 Gy pro kombinovanou terapii), a l,3krát u U87 (z 97,8 na 74,8 Gy). Obzvláště významné je, že tyto účinky DC-101 byly selektivní vůči nádorům. To znamená, že s protilátkou nebyly detekovány žádné paralelní změny radiační reakce kůže. Jak bylo stanoveno dalšími pokusy, zvýšení radiační odpovědi nádorů indukované DC-101 nebylo spojeno s jejich s citlivostí k ozařování nebo se změnami v oxygenaci, ale korelovalo se • ·

.....

signifikantním snížením tlaku intersticiální kapaliny v nádorech protilátkou.

[255] Závěr: Výsledky společně prokazují, že blokace VEGF-signálních drah pomocí protilátky proti hlavnímu receptoru těchto molekul růstového faktoru může selektivně zesílit odpověď nádoru na léčbu frakcionovanou RT, a tak poskytovat terapeutické zvýšení účinku.

[256] PŘÍKLAD IX. PŘÍPRAVA JEDNOŘETĚZCOVÝCH PROTILÁTEK [257] Příklad IX-1. Materiály [258] Příklad IX-1(a). Buněčné linie a proteiny [259] Primárně kultivované buňky HUVEC byly udržovány v médiu EBM-2 při 37° C, 5% CO2. Ve všech zkouškách byly používány buňky mezi pasáží 2 až 5. Protein VEGFi₆5 byl exprimován v baculoviru a purifikován. Komplementární DNA kódující extracelulární doménu KDR (VEGFR-2) byla izolována pomocí RT-PCR z mRNA lidské fetální ledviny a subklonována do míst Bgl II a BspE I vektoru AP-Tag. V tomto plasmidu je cDNA pro extracelulární doménu KDR (VEGFR-2) fúzována ve čtecím rámci s cDNA pro lidskou placentální AP. Plasmid byl elektroporován do buněk NIH 3T3 společně s neomycinovým expresivním vektorem pSV-Neo a stabilní buněčné klony byly selektovány s G418. Rozpustný fúzní protein KDR-ΑΡ byl ze supernatantu buněčné kultury purifikován afinitní chromatografií s použitím imobilizovaných monoklonálních protilátek proti AP.

·· · • · • ··· · *·· · ··· _t · · · · · ···· · · · ···· • · · · · · · · j ······ ·· · ·· * [260] Příklad IX-1 (b). Imunizace myší a konstrukce fágové displejové (expoziční) knihovny pro jednořetězcové protilátky [261] Samičkám myší BALB/C byly dány dvě intraperitoneální (i.p.) injekce 10 pg KDR-ΑΡ ve 200 pl adjuvantního systému RIBI a následně po dvou měsících jedna i.p. injekce bez adjuvantu RIBI. Myším byla rovněž dána subkutánní (s.c.) injekce 10 pg KDR-ΑΡ ve 200 pl RIBI v okamžiku první imunizace. Myši byly i.p. imunizovány s 20 pg KDR-ΑΡ tři dny před utracením. Sleziny z dárcovských myší byly odstraněny a buňky byly izolovány. Byla extrahována RNA a mRNA byla purifikována z celkové RNA splenocytů. Fágová displejová knihovna pro scFv s expozicí na povrchu vláknitého fága M13 byla zkonstruována s použitím mRNA.

[262] V scFv exponovaných na povrchu vláknitého fága jsou protilátkové domény V_H a V_L vzájemně spojeny pomocí linkeru o délce 15 aminokyselin (GGGGS)³a jsou fúzovány k N-konci proteinu III fága. Pro detekci a jiné analytické účely byla inzertována mezi C-konec V_L a protein III identifikátorová značka (tag) E tag o délce 15 aminokyselin, která byla následována kodónem amber (TAG). Amber kodón umístěný mezi E tag a protein III umožňuje, aby konstrukt byl exprimován ve formátu scFv exponovaném na povrchu fága, jestliže je tento konstrukt transformován do supresorového hostitele (jako jsou například buňky TGI), a ve formě rozpustného scFv, jestliže je konstrukt transformován do nesupresorového hostitele (jako jsou například buňky HB2151).

[263] Získaná scFv DNA byla ligována do vektoru pCANTAB 5E. Transformované buňky TG1 byly vysety na plotny 2YTAG a inkubovány. Kolonie byly seškrábnuty do 10 ml média 2YT, smíseny s 5 ml 50% glycerolu a uchovávány při -70° C jako zásobní kmen knihovny.

[264] Příklad IX-1(c). Biopanning [265] Zásobní kmen knihovny byl pěstován k .logaritmické fázi, znovu získán s pomocným fágem M13K07 a amplifikován přes noc v médiu 2YTAK (2YT obsahující 100 μg/ml ampicilinu a 50 μg/ml kanamycinu) při 30° C. Fágový preparát byl precipitován ve 4% PEG/0,5M NaCl, resuspendován ve 3% odtučněném mléku/PBS obsahujícím 500 μρ/πιΐ proteinu AP a inkubován při 37° C po dobu 1 hodiny pro navázání fágem exprimovaných anti-AP scFv a k blokaci jiných nespecifických vazeb.

[266] Zkumavky Maxisorp Star potažené KDR-AP(10 μρ/πιΐ) (Nunc, Denmark) byly nejprve blokovány s 3% mlékem/PBS při 37° C po dobu 1 hodiny, poté byly inkubovány s fágovém preparátem při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Zkumavky byly promyty lOkrát s PBST, následně lOkrát s PBS (PBS obsahující 0,1% Tween 20). Navázané fágy byly eluovány při teplotě místnosti po dobu 10 min s 1 ml čerstvě připraveného roztoku lOOmM triethylaminu. Eluované fágy byly inkubovány s 10 ml buněk TG1 ve střední logaritmické fázi při 37° C po dobu 30 min stacionárně a 30 min za třepání. Infikované buňky TG1 byly poté vysety na plotny 2YTAG a inkubovány přes noc při 30°C.

[267] Bylo zjištěno, že devadesátdevět procent klonů (185/186), které byly screenovány po třetím cyklu panningu, • · • · ··· ······· · · • · · · · · · ·

...........

se specificky váže ke KDR (VEGFR-2). Nicméně, pouze 15 (8 %) z těchto vazebných klonů mohlo blokovat vazbu KDR (VEGFR-2) k imobilizovanému VEGF. Fingerprint DNA těchto. 15 klonů s BstN I prokázal přítomnost 2 odlišných vzorků štěpení, zatímco 21 náhodně odebraných klonů neblokujících VEGF poskytovalo 4 odlišné vzorky. Všechny vzorky štěpení byly rovněž pozorovány u klonů identifikovaných po druhém opakování cyklu. Reprezentativní klony z každého vzorku štěpení byly odebrány z klonů znovu získaných po 2 cyklech panningu a podrobeny sekvenován! DNA. Z 15 sekvenovaných klonů byly 2 jedinečnými blokátory VEGF a 3 neblokujícími klony. Jeden scFv, p2A7, který se neváže ke KDR (VEGFR-2) ani neblokuje vazbu VEGF ke KDR (VEGFR-2), byl vybrán jako negativní kontrola pro všechny studie.

[268] Příklad IX-1 (d). Fágová zkouška ELISA [269] Jednotlivé klony TGl byly pěstovány při 37° C v 96jamkových plotnách a znovu získány s pomocným fágem M13K07 tak, jak bylo popsáno výše. Amplifikovaný fágový preparát byl blokován s 1/6 objemu 18% mléka/PBS při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a nanesen na mikrotitrační destičky o 96 jamkách Maxi-sorp (Nunc) potažené s KDR-ΑΡ nebo AP (1 gg/ml x 100 μΐ) . Po inkubaci při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny byly destičky promyty 3krát s PBST a inkubovány s konjugátem králičí anti-M13 fágová Ab-HRP. Destičky byly 5krát promyty, byl přidán substrát pro TMB peroxidázu, OD při 450 nm byla odečítána s použitím čtečky (microplate reader) a protilátkové scFv byly sekvenovány.

[270] Příklad IX-1 (e). Příprava rozpustného scFv • · · · • · · · · · ·

9999 [271] Pro infekci nesupresorového hostitele E. coli HB2151 byl použity fágy z jednotlivých klonů a infektanty byly selektovány na plotnách 2YTAG-N. Exprese scFv v buňkách HB2 151 byla indukována kultivací buněk v médiu 2YTA obsahujícím 1 mM isopropyl-l-thio-B-D-galaktopyranosid při 30° C. Periplasmatický extrakt z buněk byl připraven resuspendováním peletu buněk ve 25 mM Tris (pH 7,5) obsahujícím 20 % (hmotn./objem, w/v) sacharózy, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA a 0,1 mM PMSF, s následnou inkubací při 4°

C za jemného protřepáváním po dobu 1 hodiny. Po centrifugaci při 15 000 rpm po dobu 15 minut byl rozpustný scFv purifikován ze supernatantu afinitní chromatografií s použitím RPAS Purification Module (Pharmacia Biotech).

[272] Příklad IX-2. Zkoušky [273] Příklad IX-2 (a). Kvantitativní vazebná zkouška s KDR (VEGF-2) [274] Byly provedeny dvě zkoušky pro kvantitativní stanovení vazby purifikovaného rozpustného scFv ke.KDR (VEGFR-2).

[275] Čtyři odlišné klony zahrnující dva blokátory VEGF, plCll a plF12, jeden neblokující klon, dominantní klon p2A6, a nevazebný p2A7 byly exprimovány ve třepaných lahvích s použitím nesupresorových hostitelských buněk E. coli HB2151. Rozpustný scFv byl purifikován z periplasmatických extraktů z E. coli pomocí anti-E-tag afinitní chromatografie. Výtěžek purifikovaného scFv z těchto klonů se pohyboval v rozmezí od 100 do 400 μρ/1ίύΓ kultury.

• · • ·· · · ♦ ♦ · • · · · • 9 9999 [276] Ve zkoušce přímé vazby byla různá množství rozpustného scFv přidána do 96 jamkových mikrotitračních destiček Maxi-sorp potažených KDR (VEGFR-2), které pak byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, poté byly destičky promyty 3krát s PBST. Dále byly destičky inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny s 100 μΐ myší anti-E tag protilátky s následnou inkubací se 100 pl konjugátu králičí anti-myší protilátka-HRP. Destičky byly promyty a vyhodnoceny postupem, který je popsán výše pro fágovou zkoušku ELISA.

[277] V jiné zkoušce, tj. v kompetitivní zkoušce blokování VEGF, byla různá množství rozpustného scFv smíchána s pevně stanoveným množstvím KDR-AP (50 ng) a inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Pak byly směsi přeneseny na 96jamkové mikrotitrační destičky potažené s VEGF165 (200 ng/jamka) a inkubovány při teplotě místnosti po dobu dalších 2 hodin a pak byly destičky 5krát promyty a byl přidán substrát pro AP ke kvantifikaci vázaných KDR-AP molekul. Pak byla vypočtena hodnota IC50 , tj. koncentrace scFv, která je požadována pro 50% inhibici vazby KDR (VEGFR-2) k VEGF.

[278] Obrázek 16 znázorňuje vazbu scFv k imobilizovanému KDR (VEGFR-2) v závislosti na dávce tak, jak bylo zjištěno ve zkoušce ELISA s přímou vazbou. Klony plCll a plF12, avšak nikoliv klon p2A6, rovněž blokují vazbu KDR (VEGFR-2) k imobilizovanému VEGF, jak je uvedeno na Obrázku 17. Hodnoty uvedené na Obrázku 17 uvádějí průměr ± SD ze tří stanovení. Klon p2A7 jako negativní kontrola se nevázal s KDR (VEGFR-2) ani neblokoval vazbu KDR (VEGFR-2) s VEGF (Obrázek 16 a 17). Dominantní klon plCll po každém cyklu panningu vykazoval nejvyšší vazebnou kapacitu ke KDR • · · · • · · · · · · • · ♦ · · · · ···· · · · · · • · · · · · ···· · · • « « 9 9 9 9 9

9i .........

(VEGFR-2) a nejvyšší schopnost blokovat vazbu VEGF ke KDR (VEGFR-2) (Tabulka 1). Koncentrace protilátek z klonu plCll, které byly vyžadovány pro dosažení 50% maxima vazby ke KDR (VEGFR-2) a pro 50% inhibici vazby KDR (VEGFR-2) k VEGF (Obrázek 17) byly 0,3 nM a 3 nM, v uvedeném pořadí. (Viz Tabulka 1). Analýza FACS prokázala, že plCll, plF12 a p2A6 byly rovněž schopny se vázat k receptoru exprimovanému na povrchu buněk HUVEC.

[279] Příklad IX-2 (b). „BIAcore analýza rozpustného scFv [280] Kinetika vazby rozpustného scFv ke KDR (VEGFR-2) byla měřena s použitím BIAcore biosensoru(Pharmacia Biosensor). Fúzní protein KDR-ΑΡ byl imobilizován na sensorový čip a rozpustný scFv byl vstříknut koncentracích v rozmezí od 62,5 nM do 1000 nM. Pro každou z koncentrací byly získány sensorogramy, které byly vyhodnoceny s použitím programu BIA Evaluation 2.0 ke stanovení rychlostní konstanty kon a koff. Hodnota Kd byla vypočtena jako podíl rychlostních konstant koff/kon.

[281] Tabulka 1 uvádí výsledky povrchové plasmonové resonance na zařízení BIAcore. Klony plCll a P1F12, scFv, které blokují VEGF, se vázaly k ímobílizovanému KDR (VEGFR2) s Kd 2,1 a 5,9 nM, v uvedeném pořadí. Neblokující scFv, klon p2A6, se vázal ke KDR (VEGFR-2) s přibližně 6krát slabší afinitou (Kd 11,2 nM), než nejlepší vazebný klon plCll, a to zejména díky mnohem vyšší disociační rychlosti. Jak bylo očekáváno, p2A7 se v BIAcore analýze nevázal k imobilizovanému KDR (VEGFR-2) [282] Příklad IX-2 (c) Fosforylační zkouška • 4 · 4 •444« 4 · • 4

4 4 • 4444 [283] Fosforylační zkoušky byly prováděny s buňkami HUVEC z časných pasáží podle dříve popsaného protokolu. Stručně shrnuto, buňky HUVEC byly inkubovány v bezsérovém základním médiu EBM-2 doplněném 0,5% hovězím sérovým albuminem při teplotě místnosti po dobu 10 minut v přítomnosti nebo v nepřítomnosti protilátek scFv v množství 5 gg/ml, s následující stimulací s 20 ng/ml VEGFi₆₅ při teplotě místnosti po dalších 15 minut. Buňky byly zlyzovány a receptor KDR (VEGFR-2) byl z buněčných lyzátů ímunoprecipitován s Protein A-sepharosovými, kuličkami s navázanou králičí anti-KDR (antí-VEGFR-2) polyklonální protilátkou (ImClone Systems Incorporated). Kuličky byly promyty, smíchány s nanášecím pufrem pro SDS a supernatant byl podroben analýze Western blotting. Pro detekci fosforylace KDR (VEGFR-2) byly bloty zkoušeny s anti-fosfotyrosinovou Mab, 4G10. Pro zkoušku MAP kinázové aktivity byly buněčné lyzáty podrobeny SDS-PAGE s následující analýzou Western blotting, a to s použitím fosfo-specifické MAP kinázové protilátky. Všechny signály byly detekovány s použitím ECL.

[284] Výsledky ukázaly, že plCll, scFv blokující VEGF, avšak nikoliv p2A6, neblokující scFv, byl schopen inhibovat fosforylaci receptorů KDR (VEGFR-2), stimulovanou s VEGF. Kromě toho plCll také účinně inhiboval VEGF-stimulovanou aktivaci MAP kináz p44/p42. Naopak ani plCll, ani p2A6 nelnhiboval FGF-stimulovanou aktivaci MAP kináz p44/p42.

[285] Příklad IX-2 (d). Anti-mitogenní zkouška [286] Buňky HUVEC (5 χ 10³ buněk/jamka) byly vysety do 96 jamkových tkáňových kultivačních ploten (Wallach, lne., • · · • ··· • · ·

9 • 9 • ···

Gaithersburg, MD) ve 200 μΐ média EBM-2 bez VEGF, bFGF nebo EGF a inkubovány při 37° C po dobu 72 hodin. Různá množství protilátek byla duplicitně přidána do jamek a plotny byly preinkubovány při 37° C po dobu 1 hodiny, kdy byl přidán VEGF165 na konečnou koncentraci 16 ng/ml. Po inkubaci 18 hodin byl do každé jamky přidán [3H]-TdR (Amersham)v množství 0,25 μϋί a inkubace pokračovala po další 4 hodiny. Buňky byly umístěny na ledu, dvakrát promyty médiem obsahujícím sérum a následovala inkubace 10 minut při 4° C s 10% TCA. Poté byly buňky jednou promyty vodou a solubilizovány ve 25 μΐ 2% SDS. Byla přidána scintilační kapalina (150 μΐ/jamka) a radioaktivita inkorporovaná do DNA byla měřena scintilačním přístrojem (Wallach, Model 1450 Microbeta Scintillation Counter).

[287] Schopnost protilátek scFv blokovat mitogenní aktivitu stimulovanou VEGF v buňkách HUVEC je znázorněna na Obrázku 18. Protilátka scFv, plCll, blokující VEGF silně inhibovala syntézu DNA indukovanou VEGF v buňkách HUVEC s hodnotou EC50, tj. koncentrací protilátky, která inhibuje 50 % VEGF-stímulované mitogeneze buněk HUVEC, přibližně 5 nM. Neblokující scFv, p2A6, nevykazoval žádný inhibiční účinek na mitogenní aktivitu VEGF. Ani plCll , ani p2A6 neinhibovaly DNA syntézu indukovanou bFGF v buňkách HUVEC (neznázorněno). Údaje uvedené na Obrázku 18 představují výsledky z alespoň tří samostatných pokusů (!) pouze VEGF;(V) žádný VEGF.

[288] Příklad IX-3. Příprava chimérických protilátek z plCll [289] Příklad IX-3(a). Buněčné linie a proteiny • φ ·· φφ · φφ · φφφ φφφ φφφ φφφφ φ φφφ φ φφφ φ φ φφφ φ φφφφ φ φ φ φφφφ φφφ φφφ φφφ _{Λ Λ} φφφφφφ φφ φ Φ· · [290] Primárně kultivované endotelové buňky z lidské pupečníkové žíly (HUVEC) byly udržovány v médiu EBM-2 při 37° C, 5% CO₂. Pro všechny zkoušky byly používány buňky mezi 2 až 5 pasáží. VEGFi₆₅ a fúzní protein KDR (VEGFR-2)alkalická fosfatáza (KDR-ΑΡ) byly exprímovány v baculoviru a buňkách NIH 3T3, v uvedeném pořadí, a purifikovány výše popsanými postupy. Anti-KDR (antí-VEGFR-2) scFv plCll a scFv p2A6, tj. protilátka, která se váže ke KDR (VEGFR-2) ale neblokuje interakci KDR (VEGFR-2)-VEGF, byly izolovány z fágové displejové knihovny zkonstruované z myší imunizovaných s KDR (VEGFR-2) tak, jak bylo popsáno výše.

C225 je chimérická protilátka IgGl namířená proti receptoru epidermálního růstového faktoru (EGF). Viz výše.

[291] Příklad IX-3 (b). Klonování variabilních domén scFv PlCll [292] Variabilní domény lehkých (V_L) (SEQ ID NO: 8 a SEQ ID NO: 16) a těžkých (V_H) (SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO:

15) řetězců plCll byly klonovány z expresívního vektoru pro scFv s použitím PCR primerů 1 a 2 a primerů 3 a 4, v uvedeném pořadí. Pak byla přidána vedoucí peptidová sekvence pro sekreci proteinu v savčích buňkách k 5'konci V_L a V_H metodou PCR s použitím primerů 5 a 2 a primerů 5 a 4, v uvedeném pořadí.

[293] Primer 1: 5'CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATC GAG CTC3' [SEQ ID No: 37] [294] Primer 2: 5'TCG ATC TAG AAG GAT CCA CTC ACG TTT TAT TTC CAG3'SamHI [SEQ ID NO: 38]

	95	• 4 • · • • • 44 4 4	• · • 44« 4 4 4 · 4 4	44 4 4 4 4 • 4 4 4	44 4 4 4 4 4 4 4 4 · 4·
4 4 4 4 4 • 4	4444 4 4
[295] Primer 3: 5'CTA	GTA GCA	ACT GCA	ACT	GGA	GTA	CAT
TCA CAG GTC AAG CTG3' [SEQ	ID No:	39]
[296] Primer 4: 5'TCG	AAG GAT	CCA CTC	ACC	TGA	GGA	GAC
GGT3'BamHI [SEQ ID No: 40]
[297] Primer 5: 5'GGT	CAA AAG	CTT ATG	GGA	TGG	TCA	TGT
ATC ATC CTT TTT Hind HIII CTA GTA	GCA ACT3'	[SEQ ID No	: 4Γ

[298] Příklad IX-3(c). Konstrukce expresívního vektoru pro chimérický plCll IgG [299] Byly zkonstruovány oddělené vektory pro expresí lehkého řetězce a těžkých řetězců chimérického IgG. Klonovaný gen pro V_L byl rozštěpen s Hind III a BamH I a ligován do vektoru pKNIOO obsahujícím konstantní oblast (C_L) lidského lehkého řetězce κ za vzniku expresívního vektoru pro chimérický lehký řetězec plCll, označený cplCll-L. Klonovaný gen pro V_H byl štěpen s Hind. III a BamH 1 a ligován do vektoru pGID105 obsahujícím konstantní oblast (C_H) lidského těžkého řetězce IgGl (γ) za vzniku expresívního vektoru pro chimérický těžký řetězec plCll, označený c-plCll-H. Oba konstrukty byly zkontrolovány štěpením restrikčními enzymy a verifikovány dideoxynukleotidovým sekvenováním.

[300] Jak je zřejmé z Obrázku 19 V_H a V_L domény jsou přesně fúzovány na svých 5'koncích ke genovému segmentu kódujícímu vedoucí peptidovou sekvenci (SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 24) tak, jak je vyznačeno. V_H a V_L domény jsou ligovány via Hind IIl/BamH I místa do expresívního vektoru pGlD105, který obsahuje cDNA verzi lidského genu pro konstantní oblast γΐ, a do pKNIOO, který obsahuje cDNA ·· ·· 99 · ·· 9

9 9 · · · 9 9 9

999 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9999 9 9 · ···· • « · ♦ · · · · 9

............

verzi lidského genu pro konstantní oblast κ řetězce, v uvedeném pořadí. V každém případě je exprese řízena promotorem HCMVi a zakončována s umělou terminační sekvencí. Zbytky oblastí určujících komplementaritu (CDR) lehkého a těžkého řetězce, definovaných podle Kabata et al. definicí hypervariabilních sekvencí, jsou podtrženy a označeny jako CDR-H1 až H3 a CDR-L1 až 3, v uvedeném pořadí. CDR-Hl (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9); CDR H2 (SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 10); CDR-H3 (SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 11); CDR-L1 (SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 12); CDR-L2 (SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 13);. CDR-L3 (SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 14).

[301] Příklad IX-3(d). Exprese a purifikace IgG [302] Buňky COS byly kotransfekovány se shodnými množstvími plasmidů c-plCll-L a c-plCll-H pro transientní expresi IgG. Subkonfluentní buňky COS pěstované v DMEM/10%

FCS ve 150mm kultivačních nádobách byly jednou opláchnuty s 20 ml DMEM obsahujícím 40 mM Tris (pH 7,4), a dále následovala inkubace při 37° C po dobu 4,5 hodin se 4 ml směsi DMEM/DEAE-Dextran/DNA (DMEM obsahující 40 mM Tris,

0,4 mg/ml DEAE-Dextranu (Sigma) a 20 pg každého z plasmidů c-plCll-L a c-plCll-H). Buňky byly inkubovány při 37° C po dobu 1 hodiny se 4 ml DMEM/2% FCS obsahujícím 100 nM chlorochinu (Sigma), následovala inkubace s 1,5 ml 20% glycerol/PBS při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny.' Buňky byly dvakrát promyty s DMEM/5% FCS a inkubovány přes noc ve 20 ml téhož média při 37° C. Buněčné kultivační médium bylo zaměněno za bezsérový DMEM/HEPES, poté byly buňky dvakrát promyty obyčejným DMEM. Supernatant z buněčné kultury byl shromážděn ve 48. hodině a ve 120. hodině po transfekci. Chimérický IgG byl purifikovány z celkového supernatantu

9

9

99 • 9 9 9

999 9 999 9 999

999 9 9999 99 9 9999

999 999 999 ₉₇ ............

afinitní chromatografií s použitím sloupce s Proteinem G podle protokolu popsaného výrobcem (Pharmacia Biotech).

Frakce obsahující IgG byly spojeny, pufr byl zaměněn za PBS a bylo provedeno zakoncentrování s použitím koncentrátorů Centricon 10 (Amicon Corp., Beverly, MA). Čistota IgG byla analyzována pomocí SDS-PAGE. Koncentrace purifikované protilátky byla stanovena zkouškou ELISA s použitím kozí protilátky specifické proti lidskému γ řetězci, jako záchytného (capture) činidla, a s HRP-konjugovanou protilátkou proti lidskému κ řetězci, jako detekčního činidla. Standardní křivka byla kalibrována s protilátkou pro klinické použití, C225.

[303] Po afinitní purifikaci s proteinem G byl metodou SDS-PAGE detekován jeden proteinový pruh o ~ 150 kD.

Analýza Western blotting s použitím s HRP konjugované specifické protilátky proti lidskému IgGl Fc potvrdila přítomnost lidského podílu IgG Fc v purifikovaném proteinu, (nezobrazeno).

[304] Výsledky ELISA naznačují, že c-plCll se účinněji váže k imobilizovanému KDR (VEGFR-2) než rodičovský scFv (Obrázek 20).

[305] Příklad IX-4. Zkoušky a analýzy [306] Příklad IX-4 (a). Analýza FACS [307] Buňky HUVEC z časných pasáží byly pěstovány přes noc v médiu EBM-2 neobsahujícím růstový faktor pro indukci exprese KDR (VEGFR-2). Buňky byly sklizeny a třikrát promyty s PBS, inkubovány s c-plCll IgG (5 μg/ml) po dobu 1 hodiny při 4° C, následovala inkubace s králičí protilátkou «

• 00 • ··(·

0 • · 0 • 0 00 0 0 proti lidskému Fc značenou FITC (Capper, Organon Teknika

Corp., West Chester, PA) po dalších 60 minut. Buňky byly ' promyty a analyzovány průtokovým cytometrem (Model EPICS®,

Coulter Corp., Edison, NJ).

00 ·· • · · 0 0

000 0 0 • 0 0 0 0 ·

0 0 0 ·

0000 00 00 [308] Obrázek 21 je grafem, který znázorňuje analýzu FACS vazby c-plCll k buňkám HUVEC exprimujícím KDR (VEGFR2). Jak bylo zjištěno u rodičovského scFv plCll, c-plCll se specificky váže ke KDR (VEGFR-2) exprimovanému na časných pasážích buněk HUVEC.

[309] Příklad IX-4 (b). Kvantitativní vazebná zkouška KDR (VEGFR-2) [310] Různá množství protilátek byla přidána k mikrotitračním 96 jamkovým destičkám Maxi-sorp potaženým KDR (VEGFR-2) (Nunc.Danmark) a inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, poté byly destičky promyty 3krát s PBS obsahujícím 0,1% Tween-20. Pak byly destičky inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny se 100 μΐ konjugátu myší anti-tag E protilátka-HRP (Phannacia Biotech) pro scFv, nebo s konjugátem králičí specifická protilátka proti lidskému IgG Fc-HRP (Cappel, Organon Teknika Corp.) pro chimérický IgG. Destičky byly 5krát promyty, byl přidán TMB peroxidázový substrát (KPL, Gaithersburg, MD) a byla odečítána OD při 450mn s použitím čtečky destiček (Microplate reader Molecular Device, Sunnyvale, CA).

[311] Obrázek 20 je graf znázorňující přímou vazbu protilátek k imobilizovanému KDR (VEGFR-2). Bylo prokázáno, že se c-plCll váže účinněji k imobilizovanému KDR (VEGFR-2) receptorů než rodičovský scFv.

* 0

0 0 0

0000 00

0

0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

[312] Příklad IX-4 (c). Analýza BIAcore.

[313] Kinetika vazby protilátek ke KDR (VEGFR-2) byla měřena s použitím BIAcore biosensoru (Pharmacia Biosensor). Fúzní protein KDR-AP byl imobilizován na sensorový čip a protilátky nebo VEGF byly vstříknuty v koncentracích v rozmezí od 25 nM do 200 nM. Pro každou z koncentrací byly získány sensorogramy, které byly vyhodnoceny s použitím programu BIA Evaluation 2.0 ke stanovení rychlostní konstanty kon a koff. Hodnota Kd byla vypočtena jako podíl rychlostních konstant koff/kon.

[314] Analýza BIAcore odhalila, že c-plCll se váže ke KDR (VEGFR-2) s vyšší afinitou než rodičovský scFv (Tabulka 2). Kd pro c-plCll je 0,82 nM ve srovnání s hodnotou 2,1 nM pro scFv. Zvýšená afinita c-plCll je hlavně dána nižší disociační rychlostí (koff) bivalentního chimérického IgG. Je důležité poznamenat, že afinita (Kd) c-plCll vazby ke KDR (VEGFR-2) je podobná afinitě vazby přirozeného ligandu VEGF ke KDR (VEGFR-2), která je 0,93 nM, jak bylo stanoveno v naší BIAcore analýze.(Tabulka 2).

[315] Příklad IX-4 (d). Kompetitivní VEGF vazebná zkouška [316] V prvním testu byla různá množství protilátek smíchána s pevně stanoveným množstvím KDR (VEGFR-2)-AP (50 ng) a inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Směsi byly pak přeneseny na 96 jamkové mikrotitrační destičky potažené s VEGFi₆₅ ( 2 0 0 ng/jamka) a inkubovány při teplotě místnosti po další 2 hodiny, poté byly destičky 5krát promyty a byl přidán substrát pro AP (p-nitrofenyl ·

100

0· 00 0 0 0

0 0 •000 00

000 0 0 0

fosfát, Sigma) ke kvantifikaci navázaných molekul KDR (VEGFR-2)-AP.Pak byla vypočtena hodnota EC₅₀, tj .

požadovaná koncentrace protilátky pro 50% inhibici vazby

KDR (VEGFR-2) k VEGF.

[317] Obrázek 22 znázorňuje, že c-plCll blokuje receptor KDR (VEGFR-2) ve vazbě k imobilizovanému VEGF způsobem závislým na dávce. Chimérická protilátka je účinnější v blokování interakce VEGF-KDR (VEGFR-2) s IC₅₀ (tj. koncentrací protilátky požadovanou pro 50% inhibici vazby KDR (VEGFR-2) k VEGF) 0,8 nM ve srovnání s hodnotou IC₅o 2,0 nM pro scFv. Kontrolní scFv p2A6 se rovněž váže s KDR (VEGFR-2) (Obrázek 20), avšak neblokuje interakci VEGFKDR (VEGFR-2) (Obrázek 22) .

[318] Ve druhém testu byla různá množství protilátky c-plCll nebo neznačeného proteinu VEGF₁₆₅ smíchána s pevně stanoveným množstvím VEGF₁₆5 značeného ¹²⁵I a byla přidána do 96 jamkových mikrotitračních destiček potažených s receptorem KDR (VEGFR-2). Destičky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 2 hodin, 5krát promyty a bylo odečteno množství radioaktivně značeného VEGFi₆5, který se navázal na imobilizovaný receptor KDR (VEGFR-2). Byly stanoveny koncentrace c-plCll a neznačeného VEGFi₆₅, které byly požadovány pro 50% blokaci vazby radioaktivně značeného VEGFi₆5 k imobilizovanému rěceptoru KDR (VEGFR-2) .

[319] Výsledky inhibice vazby radioaktivně značeného VEGF165 jsou znázorněny na Obrázku 23. Uvedené výsledky jsou průměry ze tří stanovení. Bylo prokázáno, že c-plCll účinně soutěží s VEGF značeným ¹²⁵I o vazbu k imobilizovanému receptorů KDR (VEGFR-2) způsobem závislým na dávce. Jak bylo očekáváno, chimérická protilátka namířená proti • · ··· · · · ··· ···· · ··· · ··· • · · · φ · ···· φ φ · ···· • φ · ··· ··· ······ Φ· · ·· ·

101 receptoru EGF se neváže k receptoru KDR (VEGFR-2) ani neblokuje interakce VEGF-KDR (VEGFR-2) (neuvedeno).

[320] Příklad IX-4 (e). Fosforylační zkouška [321] Před vlastním pokusem byly subkonfluentní buňky HUVEC pěstovány v médiu EBM-2 bez růstového faktoru po dobu 24 až 48 hodin. Po předchozím působení 50nM orthovanadičnanu sodného po dobu 30 minut byly buňky inkubovány v přítomnosti nebo v nepřítomnosti protilátek po dobu 15 minut, následovala stimulace s 20 ng/ml VEGFi₆₅ nebo s 10 ng/ml FGF při teplotě místnosti po dalších 15 minut. Buňky byly poté zlyzovány v lyzačním pufru (50 nM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 0,25% deoxycholát sodný, 1 mM PMSF, 1 gg/ml leupeptin, 1 gg/ml pepstatin, 10 gg/ml aprotinin, pH 7,5) a buněčný lyzát byl použit pro obě fosforylační zkoušky pro KDR (VEGFR-2) a pro MAP kinázu. Receptor KDR (VEGFR-2) byl imunoprecipitován z buněčných lyzátů se sepharosovými kuličkami s navázaným Proteinem A (Santa Cruz Biotechnology, lne., CA) spojeným s anti-KDR (VEGFR-2) protilátkou, Mab 4.13 (ImClone Systems). Proteiny byly analyzovány s SDS-PAGE a dále podrobeny analýze Western blotting. Pro detekci fosforylace KDR (VEGFR-2) byly bloty zkoušeny s antifosfotyrosinovou Mab, PY20 (ICN Biomedicals, lne. Aurora, OH). Ve zkoušce MAP kinázové aktivity byly buněčné lyzáty analyzovány s SDS-PAGE a s následnou analýzou Western blotting s použitím fosfospecifické MAP kinázové protilátky (New England BioLabs, Beverly, MA). Všechny signály byly detekovány s použitím ECL (Amersham, Arlington Heights, IL). V obou testech byly bloty opakovaně zkoušeny s polyklonální anti-KDR (VEGFR-2) protilátkou (ImClone Systems), aby bylo zaručeno, že • · • · ······ ·· · ·· ·

102 v každém pruhu gelu v SDS-PAGE bylo naneseno stejné množství proteinu.

[322] C-plCll účinně inhibuje fosforylací receptoru KDR (VEGFR-2)stimulovanou VEGF a aktivaci MAP kináz p44/p42. Naopak, C225 nevykazuje žádnou inhibici receptoru KDR (VEGFR-2)stimulovanou VEGF a MAP kináz. Ani c-plCll, ani C225 samotná nemají jakékoliv účinky na aktivitu receptoru KDR (VEGFR-2) a MAP kináz p44/p42. Jak bylo dříve pozorováno, scFv plCll, c-plCll neinhibuje aktivaci MAP kináz p44/p42 stimulovanou FGF (neuvedeno). Kromě toho ani scFv p2A6, ani chimérická forma IgG p2A6 (c-p2A6) neinhibuje aktivaci receptoru KDR (VEGFR-2)stimulovanou VEGF a MAP kináz (neuvedeno).

[323] Příklad IX-4 (f). Anti-mitogenní zkouška [324] Účinek anti-KDR (VEGFR-2) protilátek na mitogenezi lidských endotelových buněk stimulovanou VEGF byl stanovován inkorporační zkouškou s [³H]-TdR DNA s použitím buněk HUVEC. Buňky HUVEC(5 χ 10³ buněk/jamka) byly vysety do 96 jamkových tkáňových kultivačních ploten ve 200 μΐ média EBM-2 bez VEGF, bFGF nebo EGF, a byly inkubovány při 37° C po dobu 72 hodin. Různá množství protilátek byla přidána duplicitně do jamek a byla předem inkubována při 37° C po dobu 1 hodiny, poté byl přidán VEGF₁₆₅ na konečnou koncentraci 16 ng/ml. Po inkubaci 18 hodin bylo do každé jamky přidáno 0,25 μθί [³H]-TdR a inkubace probíhala po další 4 hodiny. Radioaktivita inkorporovaná do DNA byla stanovena scintilačním přístrojem. Získané hodnoty jsou uvedeny na Obrázku 24 a představují výsledky z alespoň tří pokusů.

·· ·· · · · ·· · ··· ··· ··· ···· · ··· · · · · • · · · · · ···· · · · ···* ··· · · · ··· ······ ·· · ·· ·

103 [325] Jak c-plCll, tak scFv plCll účinně inhibují mitogenezi buněk HUVEC stimulovanou VEGF (Obrázek 24).CplCll je silnějším inhibitorem mitogeneze indukované VEGF u buněk HUVEC, než rodičovský scFv. Koncentrace protilátek požadovaná pro 50% inhibici mitogeneze indukované VEGF u buněk HUVEC jsou 0,8 nM pro c-plCll a 6 nM pro scFv, v uvedeném pořadí. Jak bylo očekáváno, nevykazuje scFv p2A6 jakýkoliv inhibiční účinek na proliferací endotelových buněk stimulovanou VEGF.

[326] Tak, jak je vynález nárokován, je proveditelný v souladu s výše uvedeným popisem a se snadno dostupnými odkazy a výchozími materiály. Nicméně, přihlašovatelé uložili v American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md., 20852 USA (ATCC) buněčné linie hybridomů, které produkují dále uvedené monoklonální protilátky:

[327] Hybridomová buněčná linie DC-101 produkující krysí anti-myší flk-1 (VEGFR-2) monoklonální protilátku, která byla uložena 26.ledna 1994 (pod ATCC depozitním číslem HB 11534).

[328] Hybridomová buněčná linie M25.18A1 produkující myší anti-myší flk-1 (VEGFR-2) monoklonální protilátku Mab 25, která byla uložena 19.července 1996 (pod ATCC depozitním číslem HB 12152).

[329] Hybridomová buněčná linie M73.24 produkující myší anti-myší flk-1 (VEGFR-2) monoklonální protilátku Mab 73, která byla uložena 19.července 1996 (pod ATCC depozitním číslem HB 12153).

• ·

104 • ··· 4 4 · 4

4 ······· 4 4 4 4 4

4 4 · · ·

4 · · · · [330] Tato uložení byla provedena v souladu s podmínkami Budapešťské dohody o Mezinárodním uznávání uložení mikroorganismů pro účely patentování a jejími pravidly (Budapešťská dohoda). Uložení zajišťuje udržení životaschopné kultury po 30 let od data uložení. Organismus bude dostupný u ATCC v souladu s podmínkami Budapešťské dohody a je předmětem dohody mezi přihlašovateli a ATCC, což zajišťuje neomezenou dostupnost po vydání relevantního US patentu. Dostupnost uložených kmenů není míněna jako licence k využívání vynálezu v rozporu s právy udělenými oprávněnou vládní institucí v souladu s jejími patentovými zákony.

TABULKA 1

KDR (VEGFR-2)-VAZEBNÁ ANALÝZA SCFV ΑΝΤΙ-KDR (VEGFR-2) PROTILÁTEK

Klon scFv	Vazba KDR1	Vazba VEGF2	Vazebné kinetiky3
ScFv	(EDS0 nM)	(IC50 nM)	kon	koff	Kd
			(105 M^s'1)	(ícrV1)	(10-9 M)
PlCll	Ano (0,3)	Ano (3,0)	1,1	2,3	2,1
P1F12	Ano (1,0)	Ano (15)	0,24	1,4	5,9
P2A6	Ano (5,0)	Ne (>300)	4,1	46, 1	11,2
P2A7	Ne (N/A)	Ne (>300)	N/A	N/A	N/A

1. Stanoveno zkouškou ELISA s přímou vazbou, počty v závorkách představují koncentrace scFv, které poskytují 50 % maxima vazby;

2.Stanoveno kompetitivní VEGF blokující zkouškou ELISA, počty v závorkách představují koncentrace scFv požadované pro 50% inhibici vazby KDR k imobilizovanému VEGF;

3. Stanoveno analýzou BIAcore, N/A = nepoužitelný.

105

TABULKA 2. VAZEBNÉ KINETIKY PlCll SCFV A C-P1C11 K RECEPTORU KDR (VEGFR-2)*

Protilátka	Kozí	koff	Kd
	(105 M‘1s’1)	(10 4s 1)	(ΙΟ-9 M)
plCll scFv	1, 11	2,27	2,1
c-plCll	0, 63	0,52	0,82
VEGF	1, 87	1,81	0,93

*Všechny rychlosti byly stanoveny povrchovou plasmonovou resonancí s použitím systému BIAcore a jsou průměrem alespoň ze tří samostatných stanovení.

[331] PŘÍKLAD X [332] Uvedený příklad demonstruje přípravu antagonisty VEGFR, zejména monoklonální protilátky anti-flt-1 (antiVEGFR-1), MF-1.

[333] Krysí monoklonální protilátka anti-VEGFR-1 byla připravena standardní technikou přípravy hybridomů. Krysy staré osm týdnů byly intraperitoneálně (i.p.) primárně imunizovány se 100 μg rekombinantního proteinu VEGFR-1 Fc (konstantní oblast)(R & D Systems, Minneapolis, MN) smíšeném s kompletním Freundovým adjuvans. Poté byly krysy před fúzí třikrát imunizovány se shodným proteinem smíšeným s nekompletním Freundovým adjuvans.

[334] Buňky hybridomů byly připraveny fúzí myelomových buněk P3x63Ag8.653 s buňkami sleziny a buňkami kostní dřeně z imunizovaných krys. Specifické klony anti-VEGFR-1 byly selektovány s použitím rekombinantního proteinu VEGFR-1φ φ · · φφφ ··· • · · ··· · · · • ··· · φ φ · φ φφφ φ φ φφφ φ ···· φ φ φ ··♦· φφφ φφφ φφφ

ΦΦΦΦΦΦ φφ φ φφ φ

106 alkalická fosfatáza (AP) na základě vazby ve zkoušce ELISA a blokovacích zkoušek. Pozitivní klony byly subklonovány limitujícím ředěním.

[335] Monoklonální protilátky anti-VEGFR-1 (mAbs) byly z hybridomů získány via kontinuální fermentaci v bezsérovém médiu. Monoklonální Abs byly purifikovány z bezsérového kondicionovaného média afinitní chromatografií s použitím Gamma-vazebné protein G-Sepharosy. Monoklonální Abs použité v in vivo studií byly testovány na endotoxin s použitím soupravy Pyrogent plus® Limulus Amebocyte Lysáte (Bio Whittaker, Walkersville, MD). Všechny protilátkové preparáty použité v testech na zvířatech obsahovaly < 1,25 EU/ml endotoxinu. Anti-VEGFR-1 polyklonální protilátky byly získány z králíka imunizovaného rekombinantním proteinem VEGFR-1 AP a purifikovány se sloupcem s navázaným Gammavazebným proteinem G (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).

[336] Imunochemické vlastnosti anti-VEGFR-1 mAbs byly charakterizovány ve vazebných zkouškách ELISA a v blokačních zkouškách, stejně jako v analýze BIAcore pro stanovení afinity. Vazebné zkoušky byly prováděny potažením 96 jamkových mikrotitračních destiček (Falcon Flexible plate, Becton Dickinson, Bedford, MA) 50 ng/jamka VEGFR-1 AP nebo VEGFR-2 AP proteinu přes noc při 4°C. Jamky byly blokovány přidáním 200 μΐ fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku obsahujícího 5 % hovězího séra, 0,05 % Tweenu 20 (blokující pufr) a inkubací po dobu 2 hodin při teplotě místnosti (room temperature, RT). Pak byly jamky promyty 5x) a inkubovány po dobu 1 hodiny při RT s různými koncentracemi mAbs v 50 μΐ ředěného blokujícího pufru.

Jamky byly opět promyty (5x) a inkubovány s 50 μΐ kozího • · • ·

·· · ·

107 • · · • · · · • ···· · · • · · anti-krysí IgG-HRP (BioSource International, Camarillo, CA) po dobu 1 hodiny při RT. V závěru byly jamky promyty (5x) a pak inkubovány s 50 μΐ 3,3', 5, 5'-tetra-methylbenzidínovým (TMB) substrátem (Kirkegaard and Perry Lab lne.,

Gaithersburg, MD) po dobu 15 minut při RT. Reakce byla zastavena přidáním 50 μΐ 1M kyseliny fosforečné (H3PO4) a jamky byly odečítány při 450 nm na čtečce mikrotitračních destiček.

[337] Pro blokační zkoušky VEGFR-l/VEGF nebo P1GF byly jamky potaženy se 100 ng VEGF nebo P1GF (R & D Systems, Minneapolis, MN) přes noc při 4° C. Jamky byly blokovány tak, jak je popsáno výše, a pak byly inkubovány po dobu 1 hodiny při RT se 100 ng VEGFR-1 AP, který byl předem inkubován 1 hodinu s různými koncentracemi mAb. Jamky byly promyty a inkubovány s p-nitrofenyl fosfátem (PNPP, Sigma, St. Louis, MO). Zbarvení bylo vyvíjeno po dobu 30 minut při RT a bylo pak odečítáno při 405 nm na čtečce mikrotitračních destiček.

[338] Vazebná kinetika anti-VEGFR-1 mAbs k VEGFR-1 byla stanovena s použitím biosensoru BIAcore (Pharmacia Biosensor). Fúzní protein VEGFR-1 Fc byl imobilizován na sensorový čip a Abs byly nastříknuty v koncentracích v rozmezí od 3,125 nM do 50 nM. Pro každou koncentraci byly získány sensorogramy, které byly vyhodnoceny s použitím programu BIA Evaluation 2.0 ke stanovení poměru rychlostních konstant kon/koff pro hodnotu Kd.

[339] PŘÍKLAD XI [340] Uvedený příklad demonstruje inhibici růstu nádoru po podání antagonisty receptoru epidermálního φ · φφ φ · · φφφ « · · · · · · · · φφφφ · ··» · φ · · • · · · · · ···· · · · φφφφ φφφ φφφ φφφ φφφφφφ φφ φ φφ ·

108 růstového faktoru (EGFR), monoklonální protilátky

ERBITUXM™ (rovněž známé jako IMC-C225 nebo C225)a terapeuticky účinného množství antagonisty receptorů vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGFR), tj. monoklonální anti-VEGFR-1 protilátky DC101.

[341] Protilátky pro imunohistochemickou analýzu a antiangiogenní léčbu byly získány následovně: krysí protilátka anti-myší CD31/PECAM-1 od Pharmingen (San Diego, CA); myší klon PC10 DAKO A/S proti proliferujícímu buněčnému jadernému antigenu (PCNA) od DAKO Corp. (Carpinteria, CA); s peroxidázou konjugovaný kozí antikrysí imunoglobulin (IgG) (H+L) a s Texaskou červení (Texas Red) konjugovaný kozí anti-krysí IgG od Jackson Research Laboratories (West Grove, PA); s peroxidázou konjugovaný krysí anti-myší IgG2a od Serotec Harlan Bioproducts for Science, lne. Indianapolis, IN); a krysí monoklonální protilátka anti-myší receptor VEGF-2 (Prewett et al., 1999; Witte.et al., 1998) a chimérická monoklonální protilátka anti-lidský receptor EGF (Goldstein et al., 1995) od ImClone Systems, lne. (New York, NY) (Prewett et al., 1999; Witte et al., 1998).

[342] Osm týdnů starým samečkům athymických nahých myší (National Cancer Institute, Animal Production Area, Frederick, MD), byla dána intraperitoneální injekce 1,0 x 10⁶ rakovinných buněk z tlustého střeva KM12L4 v 500 μΐ HBSS jehlou o velikosti 30 upevněnou na lml injekční stříkačku. Myši pak byly náhodně rozděleny do jedné ze čtyř léčebných skupin (10 myší na skupinu): kontrolní, DC101, C225, nebo DC101 a C225. Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s pravidly schválenými Animal Care and

99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9999 99 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 9 99 9

109

Use Committee of MD Anderson Cancer Center

9 and UKCCCR,

1998 .

[343] Počínaje 3 dny po injekci rakovinných buněk byly myším každý třetí den dány intraperitoneální injekce (i.p.) kontrolního vehikula (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, [PBS]), nebo DC101 (0,8 mg), nebo C225 (1,0 mg), nebo DC101 (0,8 mg) a C225 (1,0 mg) (každá injekce o celkovém objemu 700 μΐ) jehlou o velikosti 27 upevněnou na lml injekční stříkačku. Jednou týdně byly myši váženy. Myši byly usmrceny, když byla kontrolní skupina zvířat na vymření (přibližně 30 dnů od zahájení léčby) a byla provedena úplná nekropsie, byla kvantifikována zátěž nádorů a nádory byly odebrány a analyzovány tak, jak je popsáno níže.

[344] U každé z myší byla provedena nekropsie, velikost peritoneálních nádorů byla změřena kaliperem, byl stanoven průměr velikosti nádorů a reprezentativní léze byly vyříznuty. Rozsah ascites byl hodnocen výzkumným· pracovníkem, jenž netušil, o kterou z léčebných skupin se jedná, takto: stupeň 0, žádné ascites; stupeň 1, malé ascites; stupeň 2, nevelké ascites; stupeň 3, rozsáhlé ascites; stupeň 4, masivní ascites s napnutým břichem (Aparicio et al., 1999). Tkáňové řezy z nádorů byly buďto uloženy do sloučeniny OCT a zmraženy při -70° C, nebo byly fixovány ve formalínu a pak zality do parafinu.

[345] Z tkáňových řezů byl standardním postupem odstraněn parafín (v případě tkání, které byly fixovány formalínem a zality parafinem) nebo byly tkáňové řezy fixovány v acetonu a chloroformu (v případě tkání, které byly zmraženy v OCT) a byly provedeny imunohistochemické

9 9

9 9

9

9 9 • 9 9 ·

110

9· ·· • 9 9

999 9 9

9

9999 99 • ···· · 9 • 9 9

9 9 9 ··· • 9 · ·

9 9 9 ·····

9 9

9 analýzy tak, jak bylo dříve popsáno (Shaheen et al., 1999). Stručně řečeno, endogenní peroxidázy byly blokovány s 3%

H2O2 v methanolu a sklíčka byla promyta s PBS, inkubována po dobu 20 minut v roztoku blokujícím proteiny (PBS doplněný 1% normálním kozím sérem a 5% normálním koňským sérem), a inkubována přes noc při 4° C s primárními protilátkami proti CD31 nebo PCNA. Poté byla sklíčka promyta, inkubována s roztokem blokujícím proteiny, inkubována po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti se sekundárními protilátkami konjugovanými s peroxidázou, promyta a inkubována s DAB, promyta, obarvena hematoxylinem jako kontrastním barvivém, promyta a zamontována montovacím médiem Universal Mount a usušena na horké plotně při teplotě 56° C. Zmrazené řezy, které byly barveny na CD31, byly inkubovány se sekundární protilátkou konjugovanou s Texaskou červení (červená fluorescence) místo s protilátkou konjugovanou s peroxidázou. Vynechání primární protilátky sloužilo jako negativní kontrola.

[346] Bylo provedeno barvení technikou „Terminál deoxynucleotidyltransferase-(TdT)-mediated dUTP nick-end labelling (TUNEL) podle doporučení výrobce. Stručně řečeno, řezy byly fixovány se 4% paraformaldehydem neobsahujícím methanol, promyty, permeabilizovány s 0,2% Tritonem X-100, promyty, inkubovány s ekvilibračním pufrem soupravy, inkubovány s reakční směsí obsahující ekvilibrační pufr, směs nukleotidů a enzym TdT při 37° C po dobu 1 hodiny, inkubovány po dobu 15 minut při teplotě místnosti s 2x standardním fyziologickým roztokem s obsahem citrátu pro zastavení reakce TdT, promyty, obarveny s „DAPI Mount (k vizualizaci buněčných jader) a přikryty skleněnými sklíčky.

• ·

111 [347] Řada nádorových cév a PCNA-pozitivních buněk byly hodnoceny světelným mikroskopem (počítáno v 5 náhodně • · • 9 ···· ·

vybraných polích o velikosti 0,159 mm² při zvětšení 100 x) , digitálně zobrazeny a výsledky byly zpracovány s Optima Image Analysis softwarem (Biscan, Edmond, WA). Apoptické buňky byly vizualizovány fluorescencí následovně. Řezy byly digitálně zobrazeny a vyhodnoceny s Adobe Photoshop softwarem (Adobe Systems, Mountain View, CA).CD311pozitivní endotelové buňky (ECs) byly detekovány lokalizovanou červenou fluorescencí s použitím rhodamidového filtru. Apoptóza byla stanovena lokalizovanou zelenou fluorescencí u nádorových buněk (TCs), nebo zelenou s červenou fluorescencí pro ECs s použitím fluorescenčního filtru. Buněčná jádra byla detekována modrou fluorescencí DAPI s odpovídajícím filtrem. Buňky byly spočítány v pěti za sebou jdoucích, nepřekrývajících se polích o velikosti 0,011 mm² na sklíčko při zvětšení 400 x tak, že první pole bylo vybráno náhodně v části nádoru , která není nekrotická. Procento apoptotických ECs a TCs na pole bylo pak vypočteno jako [% apoptotických buněk = (počet apoptotických buněk/celkový počet buněk)' x 100] .

[348] Ke stanovení nádorové zátěže bylo použito měření průměru peritoneálních lézí po 30 dnech od zahájení léčby. Průměrná velikost peritoneálních nádorů byla menší ve skupině ošetřené DC101 (u 50,3 % menší) a u skupiny s kombinací DC101+C225 (u 66,7 % menší), než v kontrolní skupině. Ačkoliv 100 % myší z kontrolní skupiny a ze skupiny ošetřené C225 mělo onemocnění peritonea na konci pokusu, pouze 10 % myší ošetřených DC101 a 30 % myší ošetřených kombinovanou terapií nevykazovalo žádný důkaz o onemocnění. Konečně, průměrný stupeň ascites byl nižší jak u skupiny DC101 (u 66,7 % nižší), tak u skupiny

112 s kombinovanou terapií (u 100 % nižší), než u kontrolních myší. Kromě toho skupina ošetřená DC101+C225 měla signifikantně méně ascites, než měla skupina DC101; ve skutečnosti ve skupině s kombinovanou terapií nebyly nalezeny žádné ascites.

[349] Nádorové buňky byly barveny pro PCNA s imunohistochemickou analýzou ke stanovení proliferace nádorových buněk. Peritoneální nádory byly menší ve skupině DC101 (u 50,3 % menší) a ve skupině DC101+C225 (u 66,7 % menší), než v kontrolní skupině.

[350] Řezy z peritoneálních lézí myší byly rovněž barveny pro stanovení CD31 imunofluorescencí k detekci počtu ECs jako míry angiogeneze. Byl pozorován signifikantně menší počet ECs ve skupinách DC101 a DC101+C225, než u kontrolní skupiny.

[351] Imunofluorescenční barvení „TUNEL staining s a bez souběžného barvení CD31 bylo prováděno na řezech z peritoneálních metastáz ke kvantifikaci apoptózy TC a EC. Bylo zjištěno více apoptotických TCs a ECs ve skupině DC101 (14,3krát více TCs a 226krát více ECs) a ve skupině DC101+C225 (23,6krát více TCs a 331krát více ECs), než v kontrolní skupině, a vícé apoptotických TCs a ECs bylo zjištěno ve skupině DC101+C225, než ve skupině se samotnou DC101 (l,7krát více TCs a l,46krát více ECs).

[352] PŘÍKLAD XII. PRODUKCE LIDSKÉHO FAB [353] Příklad XII (a). Proteiny a buněčné linie.

• · ·

113 ·· · · • · · [354] Primární kultury buněk HUVEC byly získány od Dr.S.Rafii at Cornell Medical Center, New York, a byly udržovány v médiu EBM-2 (Clonetics, Walkersville, MD) při 37° C, 5% CO2. Rozpustné fúzní proteiny, KDR (VEGFR-2)-AP, jeho varianty s delecí imunoglobulinové (Ig) domény a Flk1-AP byly exprimovány ve stabilně transfekované NIH 3T3 a purifikovány ze supernatantů buněčné kultury afinitní chromatografií s použitím imobilizované monoklonální protilátky proti AP tak, jak popisuje Lu et al., J. Biol. Chem. 275: 14321-30 (2000). Protein VEGFi₆5 byl exprimován v baculoviru a purifikován podle postupů popsaných v Zhu et al., Cancer Res. 58: 3209-14 (1998). Leukemické buněčné linie, HL60 a HEL, byly udržovány v RPMI obsahujícím 10% fetální telecí sérum.

[355] Příklad XII (b). Fágová ELISA [356] Jednotlivé klony TG1 byly odebrány a pěstovány při 37° C v 96 jamkových destičkách a znovu získány s pomocným fágem M13K07 tak, jak je popsáno výše.

Amplifikovaný fágový preparát byl blokován s 1/6 objemu 18% mléka/PBS při RT po dobu 1 hodiny a byl přidán do 96 jamkových mikrotitračních destiček Maxi-sorp (Nunc) potažených s KDR(VEGFR-2)-AP nebo AP(1 μg/ml x 100 μΐ). Po inkubaci při RT po dobu 1 hodiny byly destičky promyty 3krát s PBST a inkubovány s konjugátem králičí protilátka anti-M13 fág-HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Destičky byly promyty 5krát, byl přidán TMB peroxidázový substrát (KPL, Gaithersburg, MD) a byla odečítána absorbance při 450 nm s použitím čtečky mikrodestiček (microplate reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

• · • · 0 • ····

0 ·

0 0 0 0

0 0

114 [357] Příklad XII (c) . Analýza vzorků DNA štěpených BstN I a sekvenování nukleotidů.

[358] Diversita Fab klonů anti-KDR (VEGFR-2) po každém cyklu selekce byla analyzována pomocí vzorků restrikčního enzymatického štěpení (tj. DNA fingerprinty). Genový inzert Fab jednotlivých klonů byl amplifikován PCR s použitím primerů: PUC 19 reverzní,

5'AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3'; a fdtet seq,

5'GTCGTCTTTCCAGACGTTAGT 3'. Amplifikovaný produkt byl štěpen s hojně štěpícím enzymem BstN 1, a byl analyzován na 3% agarózovém gelu. Dideoxynukleotidovým sekvenováním byly stanoveny sekvence DNA z reprezentativních klonů z každého vzorku štěpení.

[359] Příklad XII (d). Exprese a purifikace rozpustných fragmentů Fab.

[360] Plasmidy z jednotlivých klonů byly použity k transformaci nesupresorového hostitelského kmene E. coli HB2151. Exprese fragmentů Fab v HB2151 byla indukována kultivací buněk v médiu 2YTA obsahujícím 1 mM isopropyl-1thio-p-D-galaktopyranosidu (IPTG, Sigma) při 30° C. Extrakt z periplasmy buněk byl připraven resuspendováním buněčného peletu v 25 mM Tris (pH 7,5) obsahujícím 20 % (hmotn./objem, w/v) sacharózy, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA a 0,1 mM PMSF, s následnou inkubací při 4° C za jemného třepání po dobu 1 hodiny. Po centrifugaci při 15 000 rpm po dobu 15 minut byl rozpustný protein Fab purifikován ze supernatantu afinitní chromatografií s použitím sloupce s navázaným Proteinem G podle protokolu výrobce (Amersham Pharmacia Biotech).

• · · • ···· • · · a

115 • · · · · · ♦ · · · t ttt · • · · · · • · · · « ·· · · · · ·« [361] Příklad XII (e). Selekce lidského anti-KDR (VEGFR-2) Fab z fágové displejové knihovny.

[362] Pro selekci byla použita velká lidská Fab fágová displejová knihovna obsahující 3,7 x IO¹⁰ klonů (DeHaard et al.,J. Biol. Chem. 274: 18218-30 (1999)). Knihovna sestává z PCR-amplifikovaných genů pro protilátkové variabilní lehké řetězce a z genů pro variabilní těžké řetězce protilátek fúzovaných s geny pro lidské konstantní lehké řetězce (κ a λ) as DNA kódující CH1 doménu těžkého řetězce IgGl, v uvedeném pořadí. Jak těžké, tak lehké řetězcové konstrukty jsou předcházeny signální sekvencí-pelB pro lehký řetězec a signální sekvencí genu III pro těžký řetězec. Konstrukty těžkého řetězce dále kódují část genu pro protein III pro fágový displej, hexahistidinový tag, a 11 aminokyselin dlouhý c-myc tag, následovaný amber kodónem (TAG). Hexahistidin a identifikátorové značky c-myc tag mohou být použity pro purifikaci nebo pro detekci. Amber kodón umožňuje fágový displej s použitím supresorového hostitele (jako jsou buňky TG1), nebo produkci fragmentů Fab v rozpustné formě, jestliže je transformován nesupresorový hostitel (jako jsou buňky HB2151).

[363] Zásobní kmen knihovny byl pěstován k logaritmické fázi, znovu získán pomocí pomocného fága M13-K07 a amplifikován přes noc v médiu 2YTAK (médium 2YT obsahující 100 pg/ml ampicillinu a 50 pg/ml kanamycinu) při 30° C. Fágový preparát byl precipitován ve 4% PEG/0,5 M NaCl, resuspendován ve 3% odtučněném mléce/PBS obsahujícím 500 μg/ml proteinu AP a inkubován při 37° C po dobu 1 hodiny pro zachycení fágů exponujících (displaying) fragmenty anti-AP Fab a k blokaci jiných nespecifických vazeb.

116 » 9 ·

C · • · ·· [364] Zkumavky Maxisorp Star Nunc, Rosklide, Denmark) potažené s KDR (VEGFR-2)-AP (10 μς/ιηΐ v PBS) byly nejprve blokovány se 3% mlékem/PBS při 37° C po dobu 1 hodiny, poté byly inkubovány s fágovým preparátem při RT po dobu 1 hodiny. Zkumavky byly lOkrát promyty s PBST (PBS obsahující 0,1 % Tweenu-20) a následně lOkrát s PBS. Navázané fágy byly eluovány při RT po dobu 10 minut s 1 ml čerstvě připraveného roztoku lOOmM triethylaminu (Sigma, St. Louis, MO) . Eluované fágy byly inkubovány s 10 ml buněk TG1 ve střední logaritmické fázi při 37° C stacionárně po dobu 30 minut a za třepání dalších 30 minut. Infikované buňky byly převedeny do peletu a vysety na několik velkých ploten obsahujících 2YTAG a inkubovány přes noc při 30° C. Všechny kolonie, které na plotnách narostly, byly seškrabány do 3 až 5 ml média 2YTA, smíchány s glycerolem (na 10% konečnou koncentraci), rozděleny na shodná množství a uchovávány při -70° C. Pro další cyklus selekce bylo 100 μΐ fágového zásobního kmene přidáno do 25 ml média 2YTAG a fágy byly pěstovány do střední logaritmické fáze. Kultura byla znovu získána s pomocným fágem M13K07, amplifikována, precipitována a použita pro selekci postupem popsaným výše se sníženými koncentracemi KDR (VEGFR-2)-AP imobilizovaném na imunozkumavkách a se zvýšeným počtem odmytí po procesu vytváření vazeb.

[365] Na imobilizovaném KDR (VEGFR-2) byly provedeny celkem tři cykly selekce s proměnlivými koncentracemi proteinu a počtem promytí po počátečním procesu navazování. Po každém cyklu selekce bylo náhodně odpíchnuto 93 klonů, které byly testovány fágovou ELISA na vazbu ke KDR (VEGFR2). Sedmdesát z 93 klonů (75%) odebraných po druhé selekci a více než 90% klonů získaných po třetí selekci bylo • φ · · * · φ • · ·· • φ φ φ • φφφ φ φ

117 pozitivních ve vazbě ke KDR (VEGFR-2), což dokazuje vysokou účinnost selekčního postupu. Segmenty DNA kódující Fab ze všech 70 vázajících se klonů identifikovaných ve druhém cyklu selekce byly amplifikovány, štěpeny s BstN I a porovnány s fingerpríntovými vzorky. Bylo zjištěno celkem 42 odlišných vzorků, což naznačuje vynikající diversitu izolovaných anti-KDR (VEGFR-2) Fab. Zkouška křížové reaktivity prokázala, že 19 ze 42 protilátek bylo specifickými vazebnými partnery k FLT-1(VEGFR-1), zatímco zbývajících 23 protilátek se vázalo jak ke KDR (VEGFR-2), tak k jeho myšímu homologu, Flk-1. Další selekce bylo dosaženo s kompetitivní VEGF-vazebnou zkouškou, ve které byla stanovována vazba rozpustného KDR (VEGFR-2) k imobilizovanému VEGF v přítomnosti nebo za absence Fab fragmentů anti-KDR (VEGFR-2). Zkouškou byly identifikovány čtyři klony Fab, které byly schopny blokovat vazbu mezi VEGF a KDR (VEGFR-2). Tři byly specifickými vazebnými partnery ke KDR (VEGFR-2) a jeden křížově reagoval s Flk-1. Analýzy DNA fingerprinting a sekvenování potvrdily, že všechny čtyři protilátky blokující vazbu (VEGFR-2)/VEGF byly odlišné s jedinečnými DNA a aminokyselinovými sekvencemi.

[366] Aminokyselinové sekvence pro CDRl, CDR2 a CDR3 řetězce V_H a V_L pro tyto čtyři klony jsou uvedeny v Tabulce

3.

TABULKA 3 - SEKVENCE CDR VYBRANÝCH KDR (VEGFR-2)-VAZEBNÝCH LIDSKÝCH FABS φ Φ φφφ

ΦΦΦ··

	Klon	CDRl	CDR2	CDR3
Lehký řetězec
	D2C6	RASQSVSSYLA	DSSNRAT	LQHNTFPPT

9 9 ·· · ·

118 • ···· · ·

------ - t teti * · · · 9 9

		(SEQ ID NO: 1)	(SEQ ID NO: 2)	(SEQ ID NO: 3)
	D2H2	RASQGISSRLA	AASSLQT	QQANRFPPT
		(SEQ ID NO: 4)	(SEQ ID NO: 5)	(SEQ ID NO: 6)
	D1H4	AGTTTDLTYYDLVS	DGNKRPS	NSYVSSRFYV
		(SEQ ID NO: 7)	(SEQ ID NO: 8)	(SEQ ID NO: 9)
	D1F7	SGSTSNIGTNTAN	NNNQRPS	AAWDDSLNGHWV
		(SEQ ID NO: 10)	(SEQ ID NO: 11)	(SEQ ID NO: 12)
Těžký řetězec
	D2C6	GFTFSSYSMN	SISSSSSYIYYADSVKG	VTDAFDI
		(SEQ ID NO: 13)	(SEQ ID NO:14)	(SEQ ID NO: 15)
	D2H2	GFTFSSYSMN	SISSSSSYIYYADSVKG	VTDAFDI
	D1H4	GFTFSSYSMN	SISSSSSYIYYADSVKG	VTDAFDI
	D1F7	GGTFSSYAIS	GGIIPIFGTANYAQKFQG	GYDYYDSSGVASPFDY
		(SEQ ID NO: 16)	(SE ID NO: 17)	(SEQ ID NO: 18)

[367] Úplné sekvence pro řetězce V_H a V_L jsou uvedeny v sekvenčním protokolu. Pro D1F7 jsou nukleotidové a aminokyselinové sekvence pro V_H představovány sekvencemi SEQ ID NO: 19 a 20 v uvedeném pořadí, a nukleotidové a aminokyselinové sekvence pro V_L jsou představovány sekvencemi SEQ ID NO: 21 a 22.

[368] Pro D2C6 jsou nukleotidové a aminokyselinové sekvence pro V_H představovány sekvencemi SEQ ID NO: 23 a 24 v uvedeném pořadí, a nukleotidové a aminokyselinové sekvence pro V_Ljsou představovány sekvencemi SEQ ID NO: 25 a 26.

[369] Pro D2H2 jsou nukleotidové a aminokyselinové sekvence pro V_H představovány sekvencemi SEQ ID NO: 30 a 31 v uvedeném pořadí, a nukleotidové a aminokyselinové sekvence pro V_L jsou představovány sekvencemi SEQ ID NO: 32 a 33.

119 [370] Pro D1H4 jsou nukleotidové a aminokyselinové sekvence pro V_H představovány sekvencemi SEQ ID NO: 27 a 24 v uvedeném pořadí, a nukleotidové a aminokyselinové sekvence pro V_L jsou představovány sekvencemi SEQ ID NO: 28 a 29.

[371] Druhá knihovna byly vytvořena kombinováním jednoho těžkého řetězce z D2C6 s odlišnou populací lehkých řetězců odvozených z původní knihovny. Byly identifikovány další Fabs, které byly označeny jako SA1, SA3, SB10, SB5, SC7, SD2, SD5, SF2, SF7 a 1121. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence těchto deseti Fabs pro V_L jsou následující. Pro SA1 představují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 34 a 35. Pro SA3 představují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 36 a 37. Pro SB10 představují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 38 a 39. Pro SB5 představují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 40 a 41. Pro SC7 představují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 42 a 43. Pro SD2 představují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 44 a 45. Pro SD5 představují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 46 a 47. Pro SF2 představují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 48 a 49. Pro SF7 představují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 50 a 51. Pro 1121 představují nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 52 a 53.

[372] V_L CDR sekvence jsou uvedeny v Tabulce 4 • · » · · • ···· • · ·

120

TABULKA 4- SEKVENCE CDR LEHKÝCH ŘETĚZCŮ KDR (VEGFR-2)-VAZEBNÝCH LIDSKÝCH FABS

Klon	CDR1	CDR2	CDR3
SA1	TGSHSNFGAGTDV	GDSNRPS	QSYDYGLRGWV
	(SEQ ID NO: 54)	(SEQ ID NO: 55)	(SEQ ID NO: 56)
SA3	RASQNINNYLN	AASTLQS	QQYSRYPPT
	(SEQ ID NO: 57)	(SEQ ID NO: 58)	(SEQ ID NO: 59)
SB10	TGSSTDVGNYNYIS	DVTSRPS	NSYSATDTLV
	(SEQ ID NO: 60)	(SEQ ID NO: 61)	(SEQ ID NO: 62)
SB5	TGQSSNIGADYDVH	GHNNRPS	QSYDSSLSGLV
	(SEQ ID NO: 63)	(SEQ ID NO: 64)	(SEQ ID NO: 65)
SC7	RASQDISWLA	AASLLQS	QQADSFPPT
	(SEQ ID NO: 66)	(SEQ ID NO: 67)	(SEQ ID NO: 68)
SD2	RASQSIKRWLA	AASTLQS	QQANSFPPT
	(SEQ ID NO: 69)	(SEQ ID NO: 70)	(SEQ ID NO: 71)
SD5	SGSRSNIGAHYEVQ	GDTNRPS	QSYDTSLRGPV
	(SEQ ID NO: 72)	(SEQ ID NO: 73)	(SEQ ID NO: 74)
SF2	TGSSSNIGTGYDVH	AYTNRPS	QSFDDSLNGLV
	(SEQ ID NO: 75)	(SEQ ID NO: 76)	(SEQ ID NO: 77)
SF7	TGSHSNFGAGTDVH	GDTHRPS	QSYDYGLRGWV
	(SEQ ID NO: 78)	(SEQ ID NO: 79)	(SEQ ID NO: 80)
1121	RASQGIDNWLG	DASNLDT	QQAKAFPPT
	(SEQ ID NO: 81)	(SEQ ID NO: 822)	(SEQ ID NO: 83)

[373] PŘIKLAD XIII- ZKOUŠKY [374] Přiklad XIII (a). Kvantitativní zkouška vazby KDR (VEGFR-2) a blokování interakce KDR (VEGFR-2)/VEGF [375] V přímé vazebné zkoušce byla různá množství rozpustných proteinů Fab přidána do mikrotitračních 96

121 jamkových destiček Maxi-sorp potažených KDR (VEGFR-2) a inkubována při RT po dobu 1 hodiny, kdy byly destičky třikrát promyty s PBST. Poté byly destičky inkubovány při RT po dobu 1 hodiny se 100 μΐ konjugátu králičí anti-lidská Fab protilátka-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratory lne., West Grove, PA). Destičky byly promyty a dále bylo postupováno podle postupu dříve popsaného jako fágová ELISA. V kompetitivní zkoušce blokace KDR (VEGFR-2)/VEGF byla různá množství proteinů Fab smíchána s pevně stanoveným množstvím KDR (VEGFR-2)-AP (100 ng) a inkubována při RT po dobu 1 hodiny. Směsi byly pak přeneseny na 96 jamkové mikrotitrační destičky předem potažené s VEGF165 (200 ng/jamka) a inkubovány při RT po další 2 hodiny, kdy byly destičky 5krát promyty a byl přidán substrát pro AP (p-nitrofenyl fosfát, Sigma). Ke kvantifikaci vázaných KDR (VEGFR-2)-AP molekul (8) byla měřena absorbance při 405 nm. Pak byla vypočtena hodnota IC50 , tj. koncentrace proteinu Fab požadovaná pro 50% inhibici vazby KDR (VEGFR-2) k VEGF.

[376] Čtyři VEGF-blokující kolony (D2C6, D2H2,D1H4, D1F7) byly exprimovány jako rozpustný Fab, který byl purifikován z periplasmatíckých extraktů E.coli afinitní chromatografií s proteinem G. Výtěžek čištěných proteinů Fab z těchto klonů se pohyboval v rozmezí od 60 do 400 μς/ΐίίτ kultury. Analýza SDS-PAGE každého z purifikovaných preparátů Fab poskytla jeden proteinový pruh s očekávanou molekulovou hmotností.

[377] Klon D2C6 a D2H2 jsou účinnějšími vazebnými partnery, následované klonem D1H4 a D1F7. Všechny čtyři Fabs rovněž blokují vazbu KDR (VEGFR-2) k imobilizovanému VEGF. Koncentrace protilátek požadované pro 50% inhibici vazby KDR (VEGFR-2) k VEGF jsou přibližně 2 nM pro klony · · • · • ··· • ·

0 0 • ···· · • · 0

000

122

D2C6, D2H2 a D1H4, a 20 nM pro klon D1F7. Pouze klon D1F7 blokuje vazbu VEGF k Flk-1, s IC₅₀ přibližně 15 nM.

0·· « 0 [378]

Příklad XIII (b). Analýza BIAcore rozpustného scFv [379] Vazebné kinetiky rozpustných proteinů Fab ke KDR (VEGFR-2) byly měřeny povrchovou plasmonovou resonancí s použitím biosensoru BIAcore (Pharmacia Biosen.sor) . Fúzní protein KDR (VEGFR-2)-AP byl imobilizován na senzorovém čipu a rozpustné proteiny Fab byly vstříknuty v koncentracích v rozmezí od 1,5 nM do 100 nM. Pro každou z koncentrací byly získány sensorogramy, které byly vyhodnoceny s použitím programu BIA Evaluation 2.0 ke stanovení rychlostních konstant kon a koff. Hodnota Kd byla vypočtena jako poměr rychlostních konstant koff/kon.

[380] Všechny tři KDR (VEGFR-2)-specifické Fab fragmenty se vážou k imobilizovanému receptoru s Kd 2 až 4 nM (Tabulka 5). Křížově reaktivní klon D1F7 má Kd 45 nM, která je přibližně 10 až 15krát slabší, než je hodnota Kd pro KDR (VEGFR-2)-specifické klony.'Je třeba poznamenat, že ačkoliv jsou celkově hodnoty Kd pro tři KDR (VEGFR-2)specifické Fab fragmenty podobné, jednotlivé vazebné kinetiky, tj. kon a koff pro tyto protilátky, jsou zcela odlišné, tj. D2C6 má nejvyšší Kon (on-rate), zatímco D1H4 má nejnižší koff (off-rate) (Tabulka 5).

TABULKA 5 - VAZEBNÉ KINETIKY ČTYŘ NEUTRALIZAČNÍCH LIDSKÝCH FAB FRAGMENTU ANTI-KDR (VEGFR-2

Klon	kon	koff	Kd
	(104 M'1 S 1)	(10’4 S1)	(nM)

> φ φ * » * φφφφ φ φφφφ

123

Hu-2C6 Fab	27,3 ± 8.6*	5,38 ± 0,54	1, 97
Hu-2H2 Fab	12,4 ± 2,9	4,87 ± 0,18	3, 93
HU-1H4 Fab	5,55 ± 0,59	1,53 ± 0,22	2,76
Hu-1F7 Fab	4,14 ± 1,21	18,7 ± 2,12	45,2

[381] Všechny hodnoty byly získány analýzou BIAcore a představují průměr ± SE z alespoň tří jednotlivých stanovení.

[382] Příklad XIII (c). Mapování vazby epitopů (Binding epitope mapping) [383] Příprava extracelulárních KDR (VEGFR-2) variant s Ig-like doménovou delecí byla již dříve popsána (Lu et al. (2000)). Ve zkoušce mapování epitopů byly nejprve na 96 jamkové destičky (Nunc) imobilizovány úplný KDR (VEGFR-2)AP; fúzní proteiny KDR (VEGFR-2) s Ig-doménovou delecí a AP ve dvou variantách; a Flk-1-AP s použitím králičí anti-AP protilátky (DAKO-immunoglobulins, Glostrup, Denmark) jako záchytného agens. Destičky byly pak inkubovány s různými anti-KDR (VEGFR-2) Fab proteiny při RT po dobu 1 hodiny, následovala inkubace s konjugátem králičí anti-lidská Fab protilátka-HRP. Destičky byly promyty a vyvíjeny tak, jak bylo shora popsáno.

[384] Vazba anti-KDR (VEGFR-2) Fab fragmentů k epitopům byla mapována s použitím úplného KDR (VEGFR-2) a dvou variant KDR (VEGFR-2) s delecí v Ig-doméně. KDR (VEGFR-2)(1-3) je varianta KDR (VEGFR-2), která obsahuje první tři N-koncové Ig domény. KDR (VEGFR-2)(3) je varianta, která obsahuje pouze třetí Ig doménu. Klony D2C6 a D1H4 se vážou stejně dobře ke KDR(VEGFR-2), KDR (VEGFR2)(1-3) a KDR (VEGFR-2)(3), což naznačuje lokalizaci vazby ·· ·

124 epitopu(ů) uvnitř Ig domény 3. Klony D2H2 a D1F7 se vážou mnohem účinněji k úplnému KDR (VEGFR-2) a ke KDR (VEGFR-2) (1-3), což naznačuje rozsáhlé vázání epitopu(ů) uvnitř KDR (VEGFR-2) Ig domén 1 až 3. Pouze klon DIF7 křížově reaguje s Flk-1.

• ··· I Φ

• φ • φφφ φ

• φ φ • · · · • · φφ φφ • · φ • · φ [385] Příklad XIII (d). Anti-mitogenní zkouška [386] Buňky HUVEC (5 χ 10³ buněk/jamka) byly vysety na 96 jamkové tkáňové kultivační destičky (Wallach, lne., Gaithersburg, MD) ve 200 μΐ média EBM-2, neobsahujícího VEGF, bazický faktor růstu fibroblastů (bFGF) nebo epidermální růstový faktor (EGF), a byly inkubovány při 37° C po dobu 72 hodin. Duplicitně byla do jamek přidáná různá množství Fab proteinů a byla provedena preinkubace při 37°

C po dobu 1 hodiny, po které byl přidán VEGFRi₆5 na konečnou koncentraci 16 ng/ml. Po inkubaci 18 hodin bylo do každé jamky přidáno 0,25 μΰί [³H]-TdR (Amersham) a inkubace pokračovala další 4 hodiny. Buňky byly promyty jednou s PBS, trypsinizovány a sklizeny na skleněném filtru (Printed Filtermat A, Walach) buněčným harvestorem (Harvester 96, MACH III, TOMTEC, Orange, CT). Membrána byla třikrát promyta s H2O a usušena na vzduchu. Byla přidána scintilační kapalina a radioaktivita inkorporovaná do DNA byla stanovena na scintilačním detektoru (Wallach, Model 1450 Microbeta Scintillation Counter).

[387] Schopnost lidských anti-KDR (VEGFR-2) Fab blokovat mitogenní aktivitu buněk HUVEC stimulovanou VEGF. Všechny čtyři lidské fragmenty Fab inhibovaly VEGFindukovanou DNA syntézu v buňkách HUVEC způsobem závislým na dávce. Koncentrace Fab, která inhibovala 50 % (EC₅o) VEGE-stimulované inkorporace [³H]-TdR do HUVEC, je

0 • · · • 0000 • 9

9

125

• ·*· · Β · · φ • · ·»0 00·0··· • * · 9 9 9 9

Λ * * . _ * přibližně 0,5 ηΜ pro klony D2C6 a D1H4, 0,8 ηΜ pro klon

D2H2 a 15 nM pro klon D1F7. Kontroly obsahovaly pouze VEGF (1500 cpm) a prosté médium (60 cpm). Jamky byly testovány duplicitně. Uvedené údaje představují alespoň tři samostatné pokusy.

[388] Příklad XIII (e). Leukemická migrační zkouška [389] Buňky HL60 a HEL byly třikrát promyty bezsérovým médiem RPMI 1640 a suspendovány v médiu v množství 1 x 10⁶/ml. 100μ1 alikvoty buněčné suspenze byly přidány buďto do inzertů napříč jamek o velikosti pórů 3 μπι pro buňky HL60, nebo do inzertů napříč jamek o velikosti pórů 8 μιη pro buňky HEL (Costard, Corning Incorporated, Corning, NY) a byla provedena inkubace s anti-KDR (VEGFR-2) Fab proteiny (5 μg/ml) po dobu 30 minut při 37° C. Inzerty byly pak umístěny do jamek destiček o 24 jamkách, které obsahovaly 0,5 ml bezsérového RPMI 1640 s nebo bez VEGF165. Migrace byla prováděna při 37° C, 5% CO₂ po dobu 16 až 18 hodin v případě buněk HL60, nebo po dobu 4 hodin v případě buněk HEL. Migrující buňky byiy sebrány z dolních kompartmentů a spočítány pomocí Coulter counter (Model Zl, Coulter Electronics Ltd., Luton, England).

[390] VEGF indukoval migraci buněk HL60 a HEL způsobem závislým na dávce s maximální dosaženou stimulací při 200 ng/. Všechny anti-KDR (VEGFR-2) Fab fragmenty signifikantně inhibovaly VEGF-stimulovanou migraci buněk HL60 a HEL. Kontrolní Fab fragment C225, tj. protilátka namířená proti receptoru EGF, nevykazoval v této zkoušce signifikantní inhibiční účinek.

[39!] PŘÍKLAD XIV. PRODUKCE IgG ·· · ♦ · « • · · · • * ···« • · ♦

126 [392] Příklad XIV (a). Konstrukce vektorů pro expresi

IgG [393] Byly zkonstruovány samostatné vektory pro expresi lehkých a těžkých řetězců IgG. Klony genů pro V_L byly štěpeny a ligovány do vektoru pKNIOO. Klonované geny pro V_H byly štěpeny a ligovány do vektoru pGID 105, který obsahuje konstantní doménu lidského těžkého řetězce IgG I (γ). Konstrukty byly testovány s použitím štěpení restrikčními enzymy a verifikovány s dideoxynukleotidovým sekvenováním. V obou případech je exprese řízena promotorem HCMV a ukončena umělou terminační sekvencí.

[394] Geny sestavené pro těžké a lehké řetězce byly pak klonovány do expresivních vektorů Lonza GS pEE6.1 a pEEl2.1. Vektory pro těžké a lehké řetězce byly pak zkombinovány do jednoho vektoru pro stabilní transfekci buněk CHO nebo buněk NSO. Transfekované buňky jsou kultivovány v médiu bez glutaminu a exprimují protilátky na úrovních odpovídajících výši 1 g/1.

Claims (39)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob inhibice růstu nádorů zahrnující podávání člověku terapeuticky účinného množství antagonisty receptoru vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF) a terapeuticky účinného, množství antagonisty receptoru epidermálního růstového faktoru (EGFR).
2. 2. Způsob inhibice růstu nádorů zahrnující podávání člověku terapeuticky účinného množství antagonisty receptoru vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF) a ozařování.
3. 3. Způsob inhibice růstu nádorů zahrnující podávání člověku terapeuticky účinného množství antagonisty receptoru vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF) a chemoterapeutického agens.
4. 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde nádor nadměrně exprimuje VEGFR.
5. 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde nádorem je nádor prsů, srdce, plic, tenkého střeva, tlustého střeva, sleziny, ledvin, močového měchýře, hlavy a krku, vaječníků, prostaty, mozku, pankreatu, kůže, kostí, kostní dřeně, brzlíku, dělohy, varlat, děložního hrdla nebo jater.
6. 6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde nádorem je nádor tlustého střeva.

   128 ···· Β·
7. 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde nádorem je nádor nemalobuněčného plícního karcinomu.

   (NSCLC).
8. 8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde antagonista receptorů VEGF je podáván intravenózně.
9. 9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kde antagonista receptorů VEGF je podáván orálně.
10. 10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, kde antagonista receptorů VEGF inhibuje vazbu VEGFR ke svému ligandu.
11. 11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kde antagonista receptorů VEGF se váže s VEGFR.
12. 12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kde antagonista receptorů VEGF zahrnuje protilátku, nebo její funkční ekvivalent, specifickou pro VEGFR.
13. 13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kde antagonista receptorů VEGF zahrnuje malou molekulu specifickou pro VEGFR.
14. 14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, kde antagonistou receptorů VEGF je antagonista íms-like tyrosinkinázového receptorů (flt-1) VEGFR-1.
15. 15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, který dále zahrnuje podávání antineoplastického agens.

    • 9 9«

    9 9 9

    9 9 99 • 99

    9 9 9

    9999 99

    129

    99 9 99 9 • · · 9 9 9

    9 999 9 999 • · *··· · · · »·«» • · · · · · ·· 9 99 9
16. 16. Způsob podle nároku 15, kde antineoplastickým agens je chemoterapeutické agens nebo záření.
17. 17. Způsob podle nároku 15, který dále zahrnuje podávání adjuvans.
18. 18. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17, kde nádor nadměrně exprimuje EGFR.
19. 19. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1, 4 až 18, kde antagonista EGFR je podáván intravenózně.
20. 20. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1, 4 až 19, kde antagonista EGFR je podáván orálně.
21. 21. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1, 4 až 20, kde antagonista EGFR inhibuje vazbu EGFR ke svému ligandu.
22. 22. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1, 4 až 21, kde antagonista EGFR se váže s EGFR.
23. 23. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1, 4 až 24, kde antagonista EGFR inhibuje vazbu EGFR k ATP.
24. 24. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1, 4 až 22, kde antagonista EGFR zahrnuje protilátku, nebo její funkční ekvivalent, specifickou pro EGFR.
25. 25. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1, 4 až 23, kde antagonista EGFR zahrnuje malou molekulu specifickou pro

    EGFR.

    ·· φ * 9 9

    9 9 9 9

    130 • · • ΦΦ φφ Φ Φ
26. 26. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1, 4 až 25, kde protilátka zahrnuje konstantní oblast lidské protilátky.
27. 27. Způsob podle nároku 26, kde protilátkou je chimérická protilátka obsahující variabilní oblast z myší protilátky.
28. 28. Způsob podle nároku 26, kde protilátkou je lidská protilátka obsahující variabilní oblast z lidské protilátky, která má komplementaritu určující oblasti (CDRs) z myší protilátky a úseky struktury základní (framework regions) z lidské protilátky.
29. 29. Způsob podle nároku 26, kde protilátkou je lidská protilátka obsahující variabilní oblast z lidské protilátky.
30. 30. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 3 až 29, kde chemoterapeutické agens není konjugováno s antagonistou receptorů
31. 31. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 3 až 29, kde chemoterapeutické agens je vybráno ze skupiny sestávající z cisplatiny, dicarbazinu (DTIC), dactinomycinu, mechlorethaminu, streptozocinu, cyclofosfamidu, carmustinu lomustinu, doxorubicinu, daunorubicinu, procarbazinu, mitomycinu, cytarabinu, etoposidu, methotrexatu, 5t fluorouracilu, vinblastinu, vincristinu, bleomycinu, paclitaxelu, docetaxelu, aldesleukinu, asparaginázy, busulfanu, karboplatiny, cladribinu, dacarbazinu, floxuridinu, fludarabinu, hydroxymočoviny, ifosfamidu, interferonu alfa, leuprolidu, megestrolu, melphalanu, merkaptopurinu, plicamycinu, mitotanu, pegaspargázy, ·· ···« ··

    131 • · · · · • · · · pentostatinu, pipobromanu, plicamycinu, streptozocinu, tamoxifenu, teniposidu, testolaktonu, thioguaninu, thiotepa, uráčil mustard, vinorelbinu, chlorambucilu, taxolu a jejich kombinace.
32. 32. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 3 až 31, kde chemoterapeutické agens je vybráno ze skupiny sestávající z cisplatiny, doxorubicinu, taxolu a jejich kombinace.
33. 33. Souprava pro inhibici růstu nádorů, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství antagonisty receptoru epidermálního růstového faktoru (EGFR) a terapeuticky účinné množství antagonisty receptoru vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF).
34. 34. Souprava podle nároku 33, vyznačující se tím, že antagonista EGFR zahrnuje protilátku, nebo její funkční ekvivalent, specifickou pro EGFR.
35. 35. Souprava podle nároku 33, vyznačující se tím, že antagonista EGFR zahrnuje malou molekulu specifickou pro EGFR.
36. 36. Souprava podle kteréhokoli z nároků 33 až 35, vyznačující se tím, že antagonista VEGFR zahrnuje protilátku, nebo její funkční ekvivalent, specifickou pro VEGFR.
37. 37. Souprava podle kteréhokoli z nároků 33 až 35, vyznačující se tím, že antagonista VEGFR zahrnuje malou molekulu specifickou pro VEGFR.

    • .·« · ··· * ·»» ·* ί Σ ‘ 1 · ·**· · · · ··»·

    ·..· : ·..· ;

    132
38. 38. Souprava podle kteréhokoli z nároků 33 až 37, vyznačující se tím, že dále obsahuje antineoplastické agens.
39. 39. Souprava podle kteréhokoli z nároků 33 až 38, vyznačující se tím, že dále obsahuje adjuvans.