SK283688B6

SK283688B6 - N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolín-4-yl-propoxy)- chinazolín-6-yl]-akrylamid jeho použitie a farmaceutický prípravok na jeho báze

Info

Publication number: SK283688B6
Application number: SK657-2001A
Authority: SK
Inventors: Alexander James Bridges; Denise Driscoll; Wayne Daniel Klohs
Original assignee: Warner-Lambert Company
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2003-12-02
Also published as: NO20012465L; GEP20032997B; SK6572001A3; WO2000031048A1; EE200100271A; AR023706A1; HK1041695A1; JP2002530386A; EP1131304A1; ZA200103535B; CN1330642A; PT1131304E; ATE229008T1; NO319357B1; IL143089A0; HUP0104211A2; BG105608A; DE69904358T2; DK1131304T3; AU6261299A

Abstract

Opísaná je zlúčenina N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3- morfolín-4-yl-propoxy)-chinazolín-6-yl]-alkylamidu, ktorá je ireverzibilným inhibítorom tyrozín-kináz a jej použitie na výrobu liečiva na liečbu nádorov, aterosklerózy, restenózy, endometriózy a psoriázy a farmaceutické prostriedky obsahujúce uvedenú zlúčeninu. ŕ

Description

Predkladaný vynález sa týka zlúčeniny N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]-akrylamidu, ktorá je ireverzibilným inhibítorom tyrozín-kináz. Predkladaný vynález sa tiež týka použitia tejto zlúčeniny na výrobu liečiva na liečbu nádorov, aterosklerózy, restenózy, endometriózy a psoriázy a farmaceutických prostriedkov obsahujúcich túto zlúčeninu.

Doterajší stav techniky

Nádory sa považujú za ochorenia vznikajúce v dôsledku intracelulárnej signalizácie alebo mechanizmu prenosu signálu. Bunky dostávajú príkazy z veľa extracelulámych zdrojov, a tieto príkazy určujú to, či budú alebo nebudú bunky proliferovať. Účelom systémov prenosu signálu je získať tieto a iné signály na povrchu buniek, preniesť ich do buniek a potom do jadra, cytoskeletu, transportných systémov a systémov na syntézu proteínov.

Najčastejšou príčinou nádorov je séria defektov, buď v týchto proteínoch, ak sú mutované, alebo v regulácii množstva proteínu v bunkách tak, že je nadmerne alebo nedostatočne produkovaný. Najčastejšie existujú kľúčové lézie v bunkách, ktoré vedú k trvalému stavu, pri ktorom dostávajú bunkové jadrá signál k proliferácii, aj keď nie je v skutočnosti tento signál prítomný. Toto môže prebehnúť mnohými mechanizmy. Niekedy môže bunka začať produkovať skutočný rastový faktor pre svoje vlastné receptory, keď by v skutočnosti nemala, čo sa označuje ako mechanizmus autokrínnej slučky. Mutácie receptorov bunkového povrchu, ktoré používajú zvyčajne k signalizácii do buniek tyrozín-kináz, môžu viesť k aktivácii kinázy za neprítomnosti ligandu a k prenosu signálu, ktorý v skutočnosti neexistuje. Alternatívne môže byť veľa povrchových kináz nadmerne exprimované na povrchu buniek, čo vedie k neprimerane silnej odpovedi na slabý signál. V bunke existuje veľa úrovní, na ktorých môžu mutácie alebo nadmerná expresia viesť k rovnakému chybnému signálu v bunke, a na nádoroch sa zúčastní veľa druhov defektov signalizácie. Predkladaný vynález sa týka nádorov, na ktorých sa zúčastnia tri práve opísané mechanizmy a ktoré nesú povrchové receptory pre tyrozín-kinázovou rodinu receptorov pre epidermálny rastový faktor (EGFR). Táto rodina sa skladá z EGF receptora (tiež označovaného ako erbBl), erbB2 receptora a ich konštitutívne aktivovaných mutantných onkoproteínov Neu, erbB3 receptora a erbB4 receptora. Ďalej, iné biologické procesy riadené prostredníctvom členov EGF rodiny receptorov môžu byť tiež liečené zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu opísanými ďalej.

Najdôležitejšími ligandmi pre EGFR sú epidermálny rastový faktor (EGF) a transformujúci rastový faktor a (TGTa). Zdá sa, že tieto receptory majú iba minimálny význam u dospelých ľudí, ale jednoznačne sa zúčastnia chorobných procesov, ako je veľké množstvo nádorov, najmä nádorov hrubého čreva a prsníka. Hlavnými ligandmi pre blízke príbuzné erbB2 (HER2), erbB3 (HER3) a erbB4 (HER4) receptory je rodina Heregulínov, a nadmerné expresie a mutácie receptora boli preukázané ako hlavný rizikový faktor pre zlú prognózu karcinómu prsníka. Ďalej bolo preukázané, že všetky štyri členovia tejto rodiny receptorov môžu tvoriť heterodimerické signalizačné komplexy s inými členmi rodiny, a že toto môže viesť pri nadmernej expresii viacej ako jedného člena rodiny pri malignite k synergnej transformačnej kapacite. Bolo preukázané, že nadmerná expresia viacej ako jedného člena rodiny je u ľudských malignit relatívne bežná.

Okrem nádorov je restenóza tiež ochorením, pri ktorom dochádza k nežiaducej proliferácii buniek. Restenóza vzniká v dôsledku proliferácie buniek hladkého svalu ciev. Restenóza je hlavným klinickým problémom spojeným s koronárnou angioplastikou a inými lekárskymi zákrokmi. Restenóza sa zvyčajne vyskytuje počas približne 0 až 6 mesiacov u približne 30 % až 50 % pacientov, ktorí prekonali balónkovú angioplastiku pre spriechodnenie upchatých koronárnych artérií na liečbe ochorenia srdca spôsobeného zúženými artériami. Vzniknutá restenóza spôsobuje značnú morbiditu pacienta a zvyšuje náklady na zdravotnú starostlivosť

Proces restenózy je iniciovaný poranením ciev vrátane tepien a žíl, s následným uvoľnením trombogenných, vazoaktívných a mitogenných faktorov. Poranenie endotelu a hlbších vrstiev cievy vedie k agregácii trombocytov, tvorbe trombu, zápalu a aktivácii makrofágov a buniek hladkého svalu. Tieto deje indukujú produkciu a uvoľňovanie rastových faktorov a cytokínov. ktoré potom môžu podporovať svoju vlastnú syntézu a uvoľňovanie z cieľových buniek. Tak jc začatý proces, ktorý sa sám udržuje a ktorý zahrnuje rastové faktory ako je EGF, trombocytámy rastový faktor (PDGF) alebo fibroblastový rastový faktor (FGF). Preto je výhodné mať ireverzibilné inhibítory dráh prenosu signálu, najmä tyrozín-kináz, ako je EGF, PDGF, FGF alebo src tyrozín-kináza.

Pre proliferatívne ochorenie kože - psoriázu - nie je v súčasnosti žiadna dobrá liečba. Toto ochorenie sa často lieči protinádorovými činidlami, ako je methothrexat, ktoré majú výrazné vedľajšie účinky a ktoré nemajú - pri dávkach limitovaných toxicitou - prílišnú účinnosť. Predpokladá sa, že TGFa je hlavným rastovým faktorom nadprodukovaným u psoriázy, pretože u 50 % transgenných myší, ktoré nadmerne exprimujú TGFa, vznikne psoriáza. Toto naznačuje, že dobrý' inhibítor EGFR signalizácie môže byť použitý ako antipsoriatické činidlo, výhodne, ale nie nevyhnutne, za lokálnej aplikácie.

V porovnaní s reverzibilnými inhibítormi tyrozín-kináz sú ireversibilné inhibítory najmä výhodné, pretože môžu byť použité na predĺženú inhibíciu tyrozín-kináz, ktorá je obmedzená iba normálnou rýchlosťou resyntézy receptorov, ktorá sa označuje tiež ako obrat.

Informácie o úlohe src tyrozín-kináz v biologických procesoch, ktoré súvisia s nádormi a restenózou sú uvedené v nasledujúcich dokumentoch, ktoré sú tu všetky inkorporované ako odkazy.

Benjamín, C. W. and Jones, D. A., Plaetled-Derived Growth Factor Stimulates Growth Factor Receptor Binding Protein-2 Association with Src In Vascular Smooth Muscle Cells, JBC, 1994, 269: 30911 - 30916;

Kovalenko, M. et al., Selective Plateled-Derived Growth Factor Receptor Kinase Blockers Reverse Cistransformation, Cancer Res., 1994, 54: 6106 - 6114;

Schwartz R. S., et al., The Restenosis Paradigm Revisted: An Alternatíve Proposal for Cellular Mechanisms, J. Am. Coli. Cardiol, 1992: 20: 1284 - 1293;

Libby P. et al., Cascade Model for Restenosis - A Special Čase of Atherosclerosis Progression, Circulation, 1992; 86: 47 - 52.

Ďalšie informácie o úlohe EGF tyrozín-kináz v biologických procesoch, ktoré súvisia s nádormi a restenózou sú uvedené v nasledujúcich dokumentoch, ktoré sú tu všetky inkorporované ako odkazy.

Jonathan Blay and Morley D. Hollenberg, Heterologous Regulation Of EGF Receptor Function In Cultured Aor tie Smooth Muscle Cells, Eur. J. Pharmacol., Mol. Pharmacol. Sect., 1989; 172(1): 17.

Informácie o tom, že protilátky k EGF alebo EGFR majú protinádorovú aktivitu, sú uvedené v nasledujúcich dokumentoch, ktoré sú tu všetky inkorporované ako odkazy.

Modjahedi H., Eccles S., Box G., Styles J., Dean C., Immunotherapy Of Human Tumour Xenografts Overexpressing The EGF Receptor With Rat Antibodies That Block Growth Factor-Receptor Interaction, Br. J. Cancer, 1993; 67: 254-261.

Kurachi H., Morishige K. I., Amemiya K., Adachi H., Hirota K., Miyake A., Tanizawa O., Importance Of Transfonning Growth Factor Alpha/Epidermal Growth Factor Receptor Autocrine Growth Mechanism In An Ovarian Cancer Celí Line In Vivo, Cancer Res., 1991; 51: 5956 - 5959.

Masui H., Moroyama T., Mendelsohn J., Mechanism Of Antitumor Activity In Mice For Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies With Different Isotypes, Cancer Res., 1986; 46: 5592 - 5598.

Rodeck U., Herlyn M., Herlyn D., Molthoff C., Atkinson B., Varello M., Steplewski Z., Koprowski H., Tumor Growth Modulation By A Monoclonal Antibody To The Epidermal Growth Factor Receptor: Immunologically Mediated And Effector Cell-Independent Effects, Cancer Res., 1987; 47: 3692-3696.

Guán E., Zhou T., Wang J., Huang P., Táng W., Zhao M., Chen Y., Sun Y., Growth Inhibition Of Human Nasopharyngeal Carcinoma In Athymic Mice By Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies, Internát. J. Celí Clôn., 1989; 7:242 - 256.

Masui H., Kawamoto T., Sato J. D., Wolf B., Sato G., Mendelsohn J., Growth Inhibition Of Human Tumor Cells In Athymic Mice By Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies, Cancer Res. 1984: 44: 10021007.

Ďalej, nasledujúce dokumenty uvádzajú protinádorovú aktivitu inhibítorov proteín tyrozín-kináz. Tieto dokumenty sú tu uvedené ako odkazy.

Buchdunger E., Trinks U., Mett H., Regenass U., Muller M., Meyer T., McGlynn E., Pinna L. A., Traxler P., Lydon N. B. 4,5-Dianilinophthalimide: A Protein Tyrosine Kinase Inhibítor With Selectivity For The Epidermal Growth Factor Receptor Signál Transduction Pathway And Potent In Vivo Antitumor Activity „Proc. Natl. Acad. Sci. USA“ 1994;91:2334-2338.

Buchdunger E., Mett H., Trinks U., Regenass U., Muller M., Meyer T., Beilstein P., Wirz B., Schneider P., Traxler P., Lydon N., 4,5-Bis(4-Fluoroanilino)Phthalimide: A Selective Inhibítor Of The Epidermal Growth Factor Receptor Signál Transduction Pathway. With Potent In Vivo Mdd Antitumor Activity, Clinical Cancer Research, 1995; 1: 813-821.

Zlúčeniny, ktoré sú ireverzibilnými inhibítormi tyrozínkináz, boli opísané v US patentoch č. 5 457 105, 5 475 001, a 5 409 930 a v PCT prihláškach č. WO 9519774 a WO 9519970. Zlúčenina podľa predkladaného vynálezu, ktorá je štrukturálne odlišná od inhibítorov tyrozín-kináz opísaných v uvedených dokumentoch, je ireverzibilným inhibítorom tyrozín-kináz.

PCT prihláška č. PCT/US97/05778 (prihláška č. WO 97/38983), ktorá je tu uvedená ako odkaz, opisuje zlúčeniny, ktoré sú ireverzibilnými inhibítormi tyrozín-kináz.

Generický vzorec uvedený v PCT prihláške zahrnuje zlúčeninu N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-chinazo lin-6-yl]-akrylamid (tu „zlúčeninu 1“), ale zlúčenina 1 nie je v PCT prihláške špecificky uvedená.

Zlúčenina 1 má nasledujúcu chemickú štruktúru:

Zlúčenina 1

PCT prihláška opisuje v príklade 21 zlúčeninu N-[4-(3-brómfenyljamino] -7-[3 -(4-morfolin)-propoxy] chinazolin-6-yl]-akrylamid, ktorá má nasledujúci chemický vzorec:

Príklad 21

Zlúčenina 1 sa líši od zlúčeniny príkladu 21 v substitúcii fenylového kruhu, ktorý je naviazaný na chinolínovú skupinu prostredníctvom atómu dusíka. Fenylový kruh zlúčeniny 1 je substituovaný v 3-pozícii chlórom a v 4-pozícii fluórom. Naopak, fenylový kruh zlúčeniny príkladu 21 PCT prihlášky (tu „príklad 21“) je substituovaný iba v 3-pozícii brómom. Aj keď majú tieto dve zlúčeniny podobnú štruktúru, má zlúčenina 1 prekvapivé a neočakávané vlastnosti in vivo v porovnaní so zlúčeninou príkladu 21 PCT prihlášky.

Ešte prekvapivejšie a neočakávanejšie je to, že zlúčenina 1 a zlúčenina príkladu 21 majú podobnú aktivitu in vitro v niektorých testoch, ale majú výrazne odlišnú aktivitu in vivo.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje zlúčeninu N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)chinazolin-6-yl]-akrylamid, alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ.

Vynález tiež poskytuje farmaceutický prijateľný prostriedok, ktorý obsahuje N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]-akrylamid.

Vynález tiež zahrnuje použitie tejto zlúčeniny na výrobu liečiva na liečbu nádorov.

Vo výhodnom uskutočnení použitia podľa vynálezu je nádorom karcinóm prsníka alebo karcinóm hrubého čreva.

Vynález tiež zahrnuje použitie tejto zlúčeniny na výrobu liečiva na liečbu alebo prevenciu restenózy alebo ireverzibilnú inhibíciu tyrozín-kináz. Vo výhodnom uskutočnení použitia podľa vynálezu je tyrozin-kinázou je EGFR, erbB2 alebo erbB.

Vynález tiež zahrnuje použitie N-[4-(3-chlór-4-fluórfenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl] akrylamidu na výrobu liečiva na inhibiciu fosforylácie tyrozínu erbB3.

Vynález tiež zahrnuje použitie N-[4-(3-chlór-4-fluórfenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]akrylamidu na výrobu liečiva na liečbu psoriázy, liečbu alebo prevenciu aterosklerózy, liečbu endometriózy alebo inhibiciu sekrecie VEGF.

Podrobný opis vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje zlúčeninu N- [4-(3 -chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]-akrylamid (zlúčeninu 1), alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ.

Zlúčenina 1 je ireverzibilný inhibítor tyrozín-kináz, konkrétne EGFR tyrozín-kinázy. Medzi ďalšie tyrozínkinázy, ktoré môžu byť inhibované zlúčeninou 1, patria FGFR, PDGFR, c-src, erbB2 a erbB4. Terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny 1 môže byť podané pacientovi s nádorom, pacientovi s restenózou alebo s rizikom restenózy, pacientovi s psoriázou, aterosklerózou alebo rizikom aterosklerózy, alebo s endometriózou. Odborníci v odbore ľahko identifikujú pacientov s nádorom, restenózou, psoriázou, aterosklerózou alebo endometriózou, alebo pacientov s rizikom restenózy alebo aterosklerózy. Napríklad pacienti s rizikom restenózy sú pacienti po angioplastike, bypassu alebo transplantácii. Obdobne, medzi pacientov s rizikom vzniku aterosklerózy patria pacienti, ktorí sú obézni, jedia veľa tukov, majú vysoké hladiny cholesterolu alebo majú hypertenziu. Termín „pacient“ označuje zvieratá, ako sú psy, mačky, kravy, ovce, a tiež zahrnuje ľudí.

Termín „nádorové ochorenie“ zahrnuje, napríklad, nasledujúce nádory: prsníka, vaječníkov, čapíku maternice, prostaty, varlat, jícnu, glioblastóm, neuroblastóm, žalúdka, kože (keratoakantóm), pľúc (epidermoidný karcinóm, veľkobunkový karcinóm, adenokarcinóm), kosti, hrubého čreva (adenokarcinóm, adenóm), štítnej žľazy (folikulámy karcinóm, nediferencovaný karcinóm, papilámy karcinóm), seminóm, melanóm, sarkóm, karcinóm močového mechúra, karcinóm pečene a žlčových ciest, karcinóm ľadvín, nádorové ochorenia myeloídneho radu, nádorové ochorenia lymfoídneho radu (Hodgkinova choroba, vlasatobunková leukémia), nádory dutiny ústnej, pery, jazyka, úst, hltanu, tenkého čreva, hrubého čreva - rekta, mozgu a centrálneho nervového systému a leukémie.

Medzi výhodné nádory, ktoré môžu byť liečené zlúčeninou 1, patrí karcinóm prsníka, hrubého čreva, rekta a vaječníkov.

Ďalej, zlúčenina 1 môže byť použitá na liečbu pacientov, ktorí potrebujú inhibiciu sekrécie vaskulámeho endotelového rastového faktora (VEGF). Medzi pacientov, ktorí potrebujú inhibiciu sekrecie VEGF patria pacienti s nádormi, diabetickou retinopatiou, reumatoídnou artritídou, psoriázou, restenózou, aterosklerózou, osteoporózou, endometriózou, pacienti pri implantácii embrya alebo pacienti s iným ochorením, pri ktorom hrá úlohu angiogenézia alebo neovaskularizácia.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu byť použité na inhibiciu fosforylácie tyrozínu erbB3. Pacienti, ktorí potrebujú inhibiciu fosforylácie tyrozínu erbB3 sú pacienti, ktorí majú alebo sú rizikoví z hľadiska ochorení uvedených v súvislosti s inhibíciou EGFR a inhibíciou sekrecie VEGF.

Zlúčenina 1 môže byť podaná ľuďom alebo zvieraťom orálne, rektálne, parenterálne (intravenózne, intramuskulárnc alebo podkožné), intracistemálne, intrarvaginálne, intraperitoneálne, intravezikálne, lokálne (prášky, masti a/alebo kvapky) alebo vo forme bukálnych alebo nazálnych sprejov. Zlúčenina môže byť podaná samostatne alebo ako súčasť farmaceutický prijateľného prostriedku, ktorý obsahuje farmaceutický prijateľné prísady.

Prostriedky vhodné na parenterálne injekcie môžu obsahovať fyziologicky prijateľné sterilné vodné alebo nevodné roztoky, disperzie, suspenzie alebo emulzie, a sterilné prášky na rekonštitúciu do sterilných injekčných roztokov alebo disperzií. Príklady vhodných vodných a nevodných nosičov, riedidel, rozpúšťadiel alebo vehikúl zahrnujú vodu, etanol, polyoly (propylénglykol, polyetylénglykol, glycerol a podobne), ich zmesi, rastlinné oleje (ako je olivový olej) a injekčné organické estery, ako je etyloleát. Správna tekutosť môže byť udržovaná, napríklad, použitím poťahov, ako je lecitín, udržovanie vhodnej veľkosti častíc v prípade disperzie a použitím surfaktantov.

Tieto prostriedky môžu tiež obsahovať pomocné činidlá, ako sú konzervačné činidlá, zmáčavé činidlá, emulgačné činidlá a dávkovacie činidlá. Prevencia pôsobenia mikroorganizmov môže byť zaistená rôznymi antibakteriálnymi a antimykotickými činidlami, ako sú napríklad parabény, chlórbutanol, fenol, kyselina sorbová a podobne. Môže byť žiaduce použitie činidiel upravujúcich izotonicitu, ako sú napríklad cukry, chlorid sodný a podobne. Predĺžené absorpcie injekčných farmaceutických foriem môže byť dosiahnuté s použitím činidiel odďaľujúcich absorpciu, ako je napríklad monostearan hlinitý a želatína.

Medzi pevné dávkové formy na orálne podanie patria kapsuly, tablety, pilulky, prášky a granuly. V takých pevných dávkových formách je aktívna zlúčenina zmiešaná s aspoň jednou bežnou prísadou (alebo nosičom), ako je citrát sodný alebo fosforečnan vápenatý alebo (a) plnivami alebo činidlami zvyšujúcimi objem, ako sú napríklad škroby, laktóza, sacharóza, glukóza, manitol a kyselina kremičitá; (b) spojivami, ako je napríklad karboxymetylcelulóza, algináty, želatína, polyvinylpyrrolidón, sacharóza a arabská guma; (c) zvľhčovacími činidlami, ako je napríklad glycerol: (d) činidlami podporujúcimi rozpadavosť, ako je napríklad agar-agar, uhličitan vápenatý, zemiakový alebo tapiokový škrob, kyselina alginová, niektoré komplexné kremičitany a uhličitan sodný; (e) činidlami spomaľujúcimi rozpúšťanie, ako je napríklad parafín; (f) činidlami zrýchľujúcimi absorpciu, ako sú napríklad kvartéme amóniové zlúčeniny; (g) zmáčavými činidlami, ako je napríklad cetyl alkohol a glycetrolmonostearát; (h) adsorbenty, ako je napríklad kaolín alebo bentonit; a (i) klznými činidlami, ako je napríklad talk, stearan horečnatý, pevné polyetylénglykoly, lauryl síran sodný alebo ich zmesi. V prípade kapsúl, tabliet a piluliek môžu tieto dávkové formy obsahovať tiež puffovacie činidlá.

Pevné prostriedky podobného typu môžu byť použité tiež ako náplne kapsúl z tuhej alebo mäkkej želatíny, s použitím prísad, ako je laktóza alebo mliečny cukor, rovnako ako polyetylénglykoly s vysokou molekulovou hmotnosťou a podobne.

Pevné dávkové formy, ako sú tablety, dražé, kapsuly, pilulky a granuly môžu byť pripravené s poťahmi alebo obalmi, ako sú enterálne poťahy a iné poťahy známe v odbore. Tieto poťahy môžu obsahovať činidlá neprepúšťajúce svetlo a môžu mať také zloženie, že uvoľňujú aktívnu zlúčeninu v niektorej časti črevného traktu. Príklady prostriedkov na inkorporáciu aktívnej zložky sú polymerické substancie a vosky. Aktívna zlúčenina môže byť tiež v mikroenkapsulovanej forme, pokiaľ je to vhodné, tak s jednou alebo viacej z uvedených prísad.

Kvapalné dávkové formy na orálne podanie zahrnujú farmaceutický prijateľné emulzie, roztoky, suspenzie, siru py a elixíry. Kvapalné dávkové formy môžu okrem aktívnej zlúčeniny obsahovať inertné riedidlá bežne používané v odbore, ako je voda a iné rozpúšťadlá, solubilizačné činidlá a emulgačné činidla, ako je napríklad etylalkohol, izopropylalkohol, etylkarbonát, etylacetát, benzylalkohol, benzylbenzoát, propylénglykol, 1,3-butylénglykol, dimetylformamid, oleje, konkrétne olej z bavlníkových semien, podzemnicový olej, kukuričný olej, olivový olej, ricínový olej a sezamový olej, glycerol, tetrahydrofúrfurylalkohol, polyetylénglykoly a sorbitanové estery mastných kyselín alebo zmesi týchto substancií, a podobne.

Okrem inertných riedidiel môže prostriedok tiež obsahovať pomocné činidlá, ako sú zmáčavé činidlá, emulgačné alebo suspendačné činidlá, sladidlá, chuťové korigens a činidlá upravujúca vôňu prostriedku.

Suspenzia môže okrem aktívnej zlúčeniny obsahovať suspendačné činidlá, ako sú napríklad etoxylované izostearylalkoholy, polyoxyetylénsorbitan a sorbitanové estery, mikrokryštalická celulóza, metahydroxid hlinitý, bentonit, agar-agar a tragant, alebo zmesi týchto substancií a podobne.

Prostriedky na rektálne podanie sú výhodne čapíky, ktoré môžu byť pripravené zmiešaním zlúčenín podľa predkladaného vynálezu s vhodnými nedráždivými prísadami alebo nosičmi, ako je kakaové maslo, polyetylénglykol alebo čapíkový vosk, ktoré sú pevné pri teplote miestnosti, ale kvapalné pri telesnej teplote a preto sa topia v rekte alebo vagíne a uvoľňujú aktívnu zložku.

Medzi dávkové formy na lokálne podanie patria masti, prášky, spreje a inhalačné prostriedky. Aktívna zložka sa zmieša za sterilných podmienok s fyziologicky prijateľným nosičom a akýmkoľvek konzervačným činidlom, pufrom alebo hnacím plynom, ktoré sú potrebné. Oftalmologické prostriedky, očné masti, prášky a roztoky tiež patria do rozsahu predkladaného vynálezu.

Termín „farmaceutický prijateľné soli, estery, amidy a proliečivá“, ako je tu použitý, označuje tie karboxylátové soli, adičné soli s aminokyselinami, estery, amidy a proliečivá, zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu, ktoré sú podľa lekárskych znalostí vhodné na použitie v kontakte s tkanivami pacienta bez nežiaducej toxicity, dráždenia, alergické reakcie a podobne, s prijateľným pomerom prínos/riziko, a účinné na požadované použitie, rovnako ako formy zlúčenín podľa predkladaného vynálezu tvorené obojakými iónmi. Termín „soli“ označuje relatívne netoxické adičné soli zlúčenín podľa predkladaného vynálezu s organickými a anorganickými kyselinami. Tieto soli môžu byť pripravené in situ počas konečnej izolácie a prečistenie zlúčeniny alebo samostatne reakciou prečistené zlúčeniny vo forme voľnej bázy s vhodnou organickou alebo anorganickou kyselinou a izoláciou takto vzniknutej soli. Príklady solí sú hydrochlorid, hydrobromid, síran, kyselý síran, dusičnan, octan, šťavelan, valerát, oleát, palmitát, stearát, laurát, boritan, benzoát, laktát, fosforečnan, tosylát, citrát, maleinan, fumarát, jantaran, vínan, naffylát, mesylát, glukoheptanoát, laktobionát a laurysíran a podobne. Tieto soli môžu obsahovať katióny alkalických kovov a kovov alkalických zemín, ako je sodík, lítium, draslík, vápnik, horčík a podobne, rovnako ako netoxické amóniové, kvartérne amóniové a amínové katióny vrátane napríklad amónia, tetrametylamónia, tetraetylamónia, metylamínu, dimetylamínu, trimetylamínu, trietylamínu, etylamínu a podobne (pozri napríklad S. M. Berge et al., „Pharmaceutical Salts“, J. Pharm. Sci. 1977; 66: 1 - 19, ktorá je tu uvedená ako odkaz).

Príklady farmaceutický prijateľných, netoxických esterov zlúčenín podľa predkladaného vynálezu zahrnujú

C_rC₆alkyl estery, kde alkylová skupina má priamy alebo rozvetvený reťazec. Prijateľnými estermi sú tiež C₆-C₇cykloalkyl estery, rovnako ako arylalkyl estery, ako napríklad benzyl estery. Výhodné sú C_rC₄alkyl estery. Estery zlúčenín podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené bežnými technikami.

Príklady farmaceutický prijateľných, netoxických anódových zlúčenín podľa predkladaného vynálezu zahrnujú amidy odvodené od amoniaku, primárnych C_rC₆alkylaminov a sekundárnych C|-C₆dialkylamínov, kde alkylová skupina má priamy alebo rozvetvený reťazec. V prípade sekundárnych amínov môže byť amín tiež vo forme 5- alebo 6-článkového heterocyklu obsahujúceho jeden atóm dusíka. Výhodné sú amidy odvodené od amoniaku, primárnych C|-C₃alkylamínov a sekundárnych C|-C₂-dialkylamínov. Amidy zlúčenín podľa predkladaného vynálezu môžu byť pripravené bežnými metódami.

Termín „proliečivo“ označuje zlúčeniny, ktoré sú rýchlo transformované in vivo za vzniku pôvodnej zlúčeniny uvedeného vzorca, napríklad hydrolýzou v krvi. Podrobnosti týkajúce sa proliečiv sú uvedené v T. Higuchi and V. Stella, „Prodrugs as Novel Delivery Systems“, zväzok 14 A. C. S. Symposium Šerieš, a v Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward, B. Roche, Američan Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, ktoré sú tu uvedené ako odkazy.

Zlúčenina podľa predkladaného vynálezu môže byť podaná pacientovi v dávke v rozmedzí od približne 0, 1 do približne 1000 mg na deň. Pre normálneho ľudského dospelého jedinca s telesnou hmotnosťou približné 70 kg je dostatočná dávka v rozmedzí od približne 0,01 do približne 100 mg na kg telesnej hmotnosti na deň. Presná použitá dávka môže byť, ale rôzna. Dávka závisí od rôznych faktorov, ako sú požiadavky pacienta, závažnosť liečeného ochorenia a farmakologická aktivita použitej zlúčeniny. Stanovenie optimálnych dávok pre jednotlivých pacientov je dobre známe odborníkom v odbore.

Zlúčeniny podľa predkladaného vynálezu môžu existovať ako nerozpustené formy, rovnako ako formy rozpustené vo farmaceutický prijateľných rozpúšťadlách, ako je voda, etanol a podobne. Všeobecne, rozpustené formy sú na účely predkladaného vynálezu považované za rovnocenne nerozpusteným formám.

Predpokladá sa, že zlúčenina 1 môže byť produkovaná synteticky rovnako ako biologicky, napríklad metabolický.

Nasledujúce príklady ilustrujú jednotlivé uskutočnenia vynálezu a nijako neobmedzujú predkladaný vynález vrátane patentových nárokov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Zlúčenina 1 môže byť syntetizovaná nasledujúcim spôsobom:

N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]-akrylamid

Stupeň A: N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenyl)amino]-7-fluór-6-nitrochinazolín

Práškový 4-chlór-7-fluór-6-nitrochinazolín (J. Med. Chem. 1996; 39: 918) (82,77 g, 363,7 mmol) sa pridá po dávkach počas 10 minút k mechanicky miešanému roztoku 3-chlór-4-fluóranilínu (53,183 g, 365,3 mmol) a N,N-dimetylanilínu (88,5 g, 730 mmol) v izopropanolu (1,09 1) pod atmosférou dusíka v ľadovom kúpeli. Ľadový kúpeľ sa odstráni na konci pridávania a zmes sa mieša pri teplote 25 °C počas 6 hodín. Zmes sa potom znovu ochladí v ľadovom kúpeli a po kvapkách sa za miešania pridá voda (200 ml) a potom vodný roztok Na₂CO₃ (10 % hmotn./obj., 200 ml). Po ďalších 10 minútach sa zmes prefiltruje cez Buchnerovov lievik a reziduálna pevná látka sa vypláchne riedeným roztokom NaHCO₃ (nasýteným/5, 2 x 100 ml), vodou (2 x x 100 ml) a izopropanolom (2 x 100 ml) . Zmes sa suší vzduchom a potom sa suší vo vákuovej piecke cez P₂O₅, pri 75 °C počas 12 hodín za zisku 4-[(3-chlór-4-fluorofenyl)amino]-7-fluór-6-nitrochinazolínu (110,71 g, 90,4 %) vo forme horčicovo žltej pevnej substancie. ’H NMR (DMSO-d₆): δ 10,44 (s, 1H, NH), 9,51 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-5), 8,67 (s, 1H, H-2), 8,07 (dd, J = 2,7, 6,8 Hz, 1H, H-2'), 7,79 (d, J = 12,4 Hz, 1H, H-8), 7,74 (ddd, J = 2,7, 4,2, 9,0 Hz, 1H, H-6), 7,43 (t, J = 9,2 Hz, 1H, H-5’).

Stupeň B: 4-[(3-chlór-4-fluórfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolín)propoxy]-6-nitrochinazolín

Roztok trimetylsilanolátu draselného (57,73 g, 0,45 mol) v dimetylsulfoxidu (DMSO) (150 ml) sa po kvapkách pridá počas 50 minút do svetložltej kaše 4-[(3-chlór-4-fluorofenyl)amino]-7-fluór-6-nitrochinazolínu (50,503 g, 150 mmol) a3-(4-morfolín)propan-l-olu (32,67 g, 225 mmol) v DMSO (250 ml), miešanej dôkladne pod N pri 25 °C vo vodnom kúpeli. Ihneď vznikne tmavočervené sfarbenie a na konci adície vznikne tmavočervenočierna viskózna zmes. Po 6 hodinách sa reakčná zmes pomalú naleje na miešaný ľad-vodu (4 1) obsahujúci nasýtený roztok Na₂CO₃ (150 ml). Po státí počas 13 hodín sa oranžovo-červená kaša získa Buchnerovou filtráciou. Zrazenina sa vypláchne riedeným roztokom NaOH (0,05 M, 500 ml; 0,02 M, 500 ml), riedeným roztokom NaHCO₃ (nasýteným/5, 500 ml) a vodou (2 x 500 ml) a suší sa vzduchom a potom sa suší vo vákuovej piecke cez P₂O₅ pri 50 °C počas 12 hodín za zisku 4-[(3-chlór-4-fluórfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolín)propoxy]-6-nitrochinazolínu (62,47 g, 89 % korigovaný) vo forme svetiel oranžovo-žltej pevnej látky. Ή NMR (DMSO-d₆): δ 10,11 (s, 1H, NH), 9,18 (s, 1H, H-5), 8,65 (s, 1H, H-2), 8,15 ( dd, J = 2,4, 6,8 Hz, 1H, H-2'), 7,79 (ddd, J = 2,7, 4,3, 9,0 Hz, 1H, H-6'),

7.45 (t, J = 9,0 Hz, 1H, H-5), 7,44 (s, 1H, H-8), 4,32 (t, J = = 6,1 Hz, ArOCH₂), 3,57 (J = 4,5 Hz, 4H, H-2 morfolín),

2.45 (t, J = 6,5 Hz, 2H, NCH₂), 2,34 (brs, 4H, H-3 morfolín), 1,93 (pentet, J = 6,5 Hz, 2H, H-2 propoxy).

Stupeň C: 6-amino-4-[(3-chlór-4-fluórfenyl)amino]-7-[3-(4-morfo 1 ín)propoxy] chinazo lín

Roztok 4-[(3-chlór-4-fluórfenyl)amino]-7-[3(4-morfolín)-propoxy]-6-nitrochinazolínu (62,9 g, 136,2 mmol) v tetrahydrofuráne (THF) (1200 ml) sa hydrogenuje cez Raneyho nikel (20 g) pri 50 psi a 23 °C počas 17,67 hodín. Pridá sa ďalší Raneyho nikel (20 g) a zmes sa hydrogenuje počas ďalších 4,33 hodín za rovnakých podmienok. Reakčná zmes sa prefiltruje cez celit a rozpúšťadlo sa odparí za redukovaného tlaku za zisku 6-amino-4-[(3-chlór-4-fluórfenyl)-amino]-7-[3-(4-morfolín)propoxy]chinazolínu (57,81 g, 97,6 % korigovaný) vo forme svetlozeleného pevného materiálu. ’H NMR (DMSO-d₆): δ 9,40 (s, 1H, NH), 8,38 (s, 1H, H-2), 8,20 (dd, J = 2,5, 7,0 Hz, 1H, H-2'), 7,79 (ddd, J = 2,5, 4,5, 9,0 Hz, 1H, H-6'), 7,40 (s, 1H, H-5), 7,40 (t, J = 9,1 Hz, 1H, H-5’), 7,08 (s, 1H, H-8), 5,38 (brs, NH₂), 4,19 (t, J = 6,1 Hz, ArOCH₂), 3,58 (t, J = 4,4 Hz, 4H, H-2 morfolín), 2,49 (t, J = 7,0 Hz, 2H, NCH₂), 2,36 (brs, 4H, H-3 morfolín), 1,97 (pentet, J = 6,5 Hz, 2H, H-2 propoxy).

Stupeň D: N-[4-(3-chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]-akrylamid

Izobutylchlorformiát (27,2 g, 0,20 mol) sa po kvapkách pridá počas 10 minút do roztoku kyseliny akrylovej (14,40 g, 0,20 mol) a trietylamínu (40,48 g, 0,40 mol) v THF (800 ml) miešaného pod dusíkom pri 0 °C. Po ďalších 10 minútach sa biela kaša prenesie do chladiaceho kúpeľa s teplotou -25 °C a mieša sa pod dusíkom počas 20 minút. Po kvapkách sa počas 1,33 hodiny pridá 6-amino-[(3-chlór-4-fluórfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolín)propoxy]chinazolín (43,19 g, 0,100 mol) v THF (500 ml). Teplota chladiaceho kúpeľa sa upraví na -20 °C, a po ďalších 2,33 hodinách sa reakcia utlmí pridaním vody (100 ml) v jednom podiele. Po 20 minútach sa reakčná zmes vnesie na drvený ľad (2 kg), vieri sa a postupne sa riedi vodou (5 1). Zmes sa nechá odstáť počas 16 hodín a potom sa filtruje cez Buchnerov lievik. Zrazenina sa vypláchne vodou (2 x 1 1), suší sa vzduchom počas 18 hodín a potom sa suší vo vákuovej piecke cez P₂O₅ pri 60 °C počas 16 hodín za zisku surového N-[4-[(3-chlór-4-fluórfenyl)-amino]-7-[3-(4-morfolín)propoxy]-chinazolin-6-yl]-akrylamidu (35,76 g, 73 % nekorigovaný) vo forme zeleno-žltého pevného materiálu. Z pôvodnej kvapaliny sa vyzráža ďalší pevný materiál, ktorý sa filtruje cez Buchnerov lievik, premyje sa vodou (1 1) a suší sa vzduchom počas 14 hodín za zisku ďalšieho surového materiálu (4,73 g, 10 % nekorigovaný) vo forme zeleno-žltého pevného materiálu. Rekryštalizáciou tohto materiálu z DMSO sa získa naspäť 55 % tohto materiálu vo forme svetložltého - khaki čiastočného hydrátu, t. t. 186,5 - 188,5 °C. Vypočítané pre C₂4H₂5N₅0₃C1F.O,85 H₂O: C, 57,61; H, 5,37; N, 13,97 %. Zistené: C, 57,51; H, 5,26: N, 13,88%. 'H NMR (DMSO-d₆): δ 9,81 (s, 1H, NH), 9,63 (s, 1H, NH), 8,87 (s, 1H, H-S), 8,54 (s, 1H, H-2), 8,15 (dd, J = = 2,5, 7,0, 1H, H-2'), 7,81 (ddd, J = 2,7, 4,4, 9,0 Hz, 1H, H-6’), 7,43 (t, J = 9,1 Hz, 1H, H-5'), 7,30 (s. 1H, H-8), 6.72 (dd, J = 10,1, 17,0 Hz, 1H, H-2 akryloyl), 6,32 (d, J = 9, 17,0 Hz, 1H, H-3 akryloyl), 5,83 (dd, J = 1,9, 10,1, Hz, 1H, H-3 akryloyl), 4,27 (t, J = 6,2 Hz, ArOCH₂), 3,58 (t, J = = 4,4 Hz, 4H, H-2 morfolín), 2,48 (t, J = 7,1 Hz, 2H, NCH-), 2,36 (brs, 4H, H-3 morfolín), 2,00 (pentet, I = 6, 5 Hz, 2H, H-2 propoxy). Hmotnostné spektrum APCI 489,2 (9), 488,2 (35), 487,2 (26), 486,2 (100).

Zlúčenina príkladu 21 PCT prihlášky č. PCT/US97/05778 môže byť syntetizovaná nasledujúcim spôsobom:

Zlúčenina príkladu 21: N-[4-(3-brómfenyl)amino]-7-[3-(4-morfolín)propoxy]chinazolin-6-yl]akrylamid

Sodík (27,6 mmol, 0,63 g) sa pridá do roztoku 3-morfolínpropan-l-olu (22,0 mmol, 3,20 g) v THF (60 ml) pod atmosférou N₂. Vzniknutá suspenzia sa mieša pri 20 °C a potom sa kanylou pridá do roztoku 4-[(3-brómfenyl)amino]-7-fluór-6-nitro-chinazolinu (J. Med. Chem. 1996 (39): 918) (2,0 g, 5,51 mmol) v THF (50 ml) pod atmosférou N₂. Roztok sa potom zohrieva pri teplote spätného toku počas 24 hodín a potom sa nariedi vodou a extrahuje sa EtOAc. Kombinované organické extrakty sa sušia cez bezvodný N'a₂SO₄, zahustia sa za redukovaného tlaku a spracujú sa chromatografíou na oxide hlinitom za elúcie EtO-Ac/hexánom (1 : 1) až MeOH/CH₂Cl₂/EtOAc (2 : 3 : 5) za zisku 4-[(3-brómfenyl)-amino]-7-[(3-morfolín)propoxy]-6-nitrochinazolínu 1,75 g, 65 %) vo forme svetložltého prášku, t. t. (MeOH) 216 - 220 °C. ’H NMR [(CD₃)₂SOj: δ 10,12 (s, 1H, NH), 9,24 (s, 1H, aromatický), 8,69 (s, 1H, aromatický), 8,19 (t, J = 1,8 Hz, 1H, H-2'), 7,88 (dt, ld = = 7,8 Hz, J = 1,4 Hz, 1H, H-6'), 7,49 (s, 1H, aromatický), 7,38 (t, J = 8,0 Hz, 1H, H-5'), 7,34 (dt, J_d = 8,1 Hz, J = 1,4 Hz, 1H, H-4'), 4,35 (t, J = 6,2 Hz, 2H, CH₂CH₂CH₂O), 3,58 (t, J = 4,6 Hz, 4H, morfolínmetylén), 2,45 (t, J = 7,0 Hz, 2H, NCH₂CH₂CH₂), 2,37 (br s, 4H, morfolínmetylén), 1,94 (kvintet, J = 6, 6 Hz, 2H, CH₂CH₂CH₂). ^I2C NMR: δ 157,76, 157,26, 153,76, 153,21, 140,32, 138,86, 130,37, 126,38, 124,26, 121,70, 121,13, 120,72, 110,11, 107,88, 67,87, 66,13 (x2), 54,42, 53,28 (x2), 25,30.

Analýza vypočítaná pre C2iH₂₂BrN₅O4.0,75 H₂O vyžaduje: C, 50,3; H, 4,7; N, 14,0 %.

Zistené: C, 50,3; H, 4,4; N, 13,8 %.

Čerstvo premytý (IN HC1 a potom destilovaná H₂O) železný prášok (12 mmol, 0,686 g) sa po častiach pridá do refluxujúceho roztoku uvedeného nitrochinazolínu (1,50 g, 3,07 mmol) v EtOH/H₂O (2 : 1, 80 ml), ktorý obsahuje ľadovú kyselinu octovú. Vzniknutá suspenzia sa zohrieva pri teplote spätného toku za dôkladného miešania počas 20 minút a potom sa ochladí, alkalizuje sa pridaním koncentrovaného NH₃ a prefiltruje sa cez vrstvu celitu. Celitová vrstva sa premyje EtOH a potom sa filtrát zahustí za redukovaného tlaku, riedi sa vodou a extrahuje sa EtOAc. Kombinované organické extrakty sa sušia cez bezvodný Na₂SO₄, zahustia sa za redukovaného tlaku a spracujú sa chromatografíou na oxide hlinitom gráde III za elúcie CH₂Cl₂/EtOAc (1 : 1) až MeOH/EtOAc (2 : 98) za zisku 6-amino-4-[(3-brómfenyl)-amino]-7-[(3-morfolín)propyloxyjchinazolínu (1,08 g, 77 %) vo forme svetlohnedého prášku, 1.1. (EtOAc/hexán) 158 - 160 °C.

’H NMR [(CD₃)₂SO), (400 MHZ): δ 9,37 (s, IH, NH), 8,40 (s, IH, aromatický), 8,24 (t, J = 1,9 Hz, IH, H-2'), 7,86 (ddd, J = 8,2, 0,8, 1,8 Hz, IH, H-6'), 7,42 (s, IH, aromatický), 7,30 (t, J = 8,1 Hz, IH, H-5'), 7,21 (ddd, J = 8,2, 1,0, 1,9 Hz, IH, H-4¹), 7,09 (s, IH, aromatický), 5,36 (s, 2H, NH₂), 4,20 (t, J = 6,2 Hz, 2H, CH₂CH₂CH₂O), 3,59 (t, J = = 4, 6 Hz, 4Π, morfolín-metylén), 2,50 (t, J = 7,3 Hz, 2H, NCH₂CH₂CH₂), 2,39 (br s, 4H, morfolínmetylén), 1,99 (kvintet, J = 6,7 Hz, 2H, CH₂CH₂CH₂). ¹³C NMR: δ 154,88, 151,94, 150,19, 144,84, 141,94, 138,50, 130,16, 124,66, 123,02, 121,09, 119,65, 110,42, 106,37, 100,81, 66,45, 66,14 (x2), 54,77, 53,29 (x2), 25,50.

Analýza vypočítaná pre C₂|H₂₄BrN₅O₂.0,25 H₂O vyžaduje:

C, 54,5; H, 5,3; N, 15,1 %. Zistené: C, 54,6; H, 5,5; N, 15,0 %.

Do miešaného roztoku uvedeného 6-amino-chinazolínu (0,50 g, 1,09 mmol), kyseliny akrylovej (6 mol, 6,54 mmol, 449 Hl) a Et₃N (nadbytku, 2,0 ml) v DMF (20 ml) pod atmosférou N₂ sa pridá l-(3-dimetyl-aminopropyl)-3-etylkarbodiimid, hydrochlorid (EDC1.HC1) (3 mol, 3,27 mmol, 627 mg). Reakčná zmes sa mieša pri 0 °C počas 15 minút a potom sa nechá zohriať na teplotu miestnosti a mieša sa počas ďalších 2 hodín. Rozpúšťadlo sa odstráni za redukovaného tlaku a získaný zvyšok sa nariedi nasýteným roztokom NaHCO₃ a opakovane sa extrahuje EtOAc. Kombinované organické extrakty sa premyjú soľankou, sušia sa cez bezvodný Na₂SO₄ a zahustia sa za redukovaného tlaku. Po chromatografii na oxide hlinitom gráde III za elúcie EtOAc/hexán (9 : 1) až MeOH/EtOAc (2 : 98) sa získa N-[4-[(3-brómfenyl)amino]-7-[(3-morfolín)propyloxy]-chinazolin-6-yl]akrylamid (329 mg, 59 %) vo forme krémovo sfarbeného prášku, 1.1. (EtOAc/Et₂O/hexán) 170 -172 °C. ’H NMR [(CD₃)₂SO]: δ 9,78 (s, IH, CONH), 9,62 (s, IH, NH), 8,89 (s, IH, aromatický), 8,56 (s, IH, aromatický), 8,18 (t, J = 1,9 Hz, IH, H-2'), 7,88 (br d, J = 8,2 Hz, IH, H-6'), 7,34 (t, J = 8,1 Hz, IH, H-5'), 7,30 (s, IH, aromatický), 7,27 (ddd, J = 7,9, 1,4, 0,8 Hz, IH, H-4’), 6,72 (dd. J = = 17,0, 10,2 Hz, IH, CH₂CHCO), 6,33 (dd, J = 17,0, 1,9 Hz, IH, CH₂CHCO), 5,83 (dd, J = 10,2, 1,9 Hz, IH, CH₂CHCO), 4,27 (t, J = 6,3 Hz; 2H, CH₂CH₂CH₂O), 3,58 (t, J = 4,6 Hz, 4H, morfolínmetylén), 2,48 (t, J = 7,1 Hz, 2H, NCH₂CH₂CH₂), 2,38 (br s, 4H, morfolínmetylén), 1,99 (kvintet, J = 6, 7 Hz, 2H, CH₂CH₂CH₂). ’³C NMR: δ 163,49, 156,68, 154,96, 153,92, 149,19, 141,20, 131,58, 130,19, 127,16, 126,95, 125,52, 123,97, 121,03, 120,52, 116,78, 108,80, 107,28, 66,96, 66,14 (x2), 54,54, 53,28 (x2), 25,31.

Analýza vypočítaná pre C₂₄H_2ňBrN₅O . 0,5 H₂O vyžaduje: C, 55,3; H, 5,2; N, 13,4 %.

Zistené: C, 55,3; H, 4,9; N, 13,3 %.

Porovnávacie testy

Tkanivová kultúra

A431 ľudské bunky epidermoidného karcinómu a MDA-MB-453 bunky boli získané z Američan Type Culture Collection, Rockville, MD a boli uchovávané ako monovrstvy v DMEM (Dulbeccove modifikovanom Eaglove médiu)/FI2, 50 : 50 (Gibco/BRL, Bethesda, MD) obsahujúcom 10 % fetálne hovädzie sérum. Bunky boli kultivované pri 37 °C vo zvlhčenej atmosfére obsahujúcej 5 % CO₂ vo vzduchu.

Prečistenie tyrozín-kinázy receptoru pre epidermálny rastový faktor

Ľudská tyrozín-kináza receptora pre EGF (EGFR) bola izolovaná z A431 buniek ľudského epidermoidného karcinómu nasledujúcim spôsobom. Bunky boli kultivované vo valcovitých skúmavkách v DMEM/F12 médiu (Gibco/BRL, Bethesda, MD) obsahujúcom 10 % fetálne teľacie sérum. Približné 10⁹ buniek bolo lyzované v 2 objemoch pufra obsahujúceho 20 mM Hepes, pH 7,4, 5 mM EGTA, 1 % Tritónu X-100, 10 % glycerolu, 0,1 mM ortovanadatanu sodného, 5 mM fluoridu sodného, 4 mM pyrofosforečnanu, 4 mM benzamidu, 1 mM DTT, 80 pg/ml aprotinínu, 40 pg/ml leupeptidu a 1 mM fenylmetylsulfonylfluoridu (PMSF). Po odstredení pri 25 000 x g počas 10 minút sa supematant aplikoval do fast Q sepharózovej kolóny (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) a eluoval sa lineárnym gradientom od 0,1 M NaCl do 0,4 M NaCl v 50 mM Hepes, 10 % glycerolu, pH 7,4. Enzymaticky aktívne frakcie sa zhromaždili, rozdelili sa do podielov a uskladnili sa pri -100 °C. Tyrozín-kinázy receptoru pre fibroblastový rastový faktor (FGFR), trombocytárny rastový faktor (PDGF), inzulín a c-src sa získali spôsobmi dobre známymi odborníkom v odbore. Pozri napríklad Fry et al., „Strategies For The Discovery Of Novel Tyrosine Kinase Inhibitors With Anticancer Activity, Anticancer Drug Design“, 1994; 9: 331 - 351, ktorá j e tu uvedená ako odkaz.

yrozín-kinázové testy

Enzýmové testy na stanovenie IC₅₀ boli uskutočnené v 96-jamkových filtračných platniach (Millipore MADVN6550, Millipore, Bedford, MA). Celkový objem bol 0,1 ml a obsahoval 20 mM Hepes, pH 7,4, 50 pM vanadatu sodného, 40 mM chloridu horečnatého, 10 μΜ ATP obsahujúci 0,5 pCi [³²P]ATP, 20 pg kyseliny polyglutamovej/tyrozinu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 10 ng tyrozín kinázy receptoru pre EGF, a vhodné riedenie inhibítora. Všetky zložky okrem ATP sa pridali do jamky a platňa sa inkubovala za trasenia počas 10 minút pri 25 °C. Reakcia sa začala pridaním [³²P]ATP a platňa sa inkubovala pri 25 °C počas 10 minút. Reakcia sa ukončila pridaním 0,1 ml 20 % kyseliny trichlóroctovej (TCA). Platňa sa ponechala pri teplote 4 °C počas aspoň 15 minút, aby sa umožnilo vyzrážanie substrátu. Jamky sa potom premyli 5-krát 0,2 ml 10 % TCA a inkorporácia ³²P sa určila β-čítačkou plátien (Wallac). Testy využívajúce intracelulárnych kinázových domén PDGF, FGF a inzulínových receptorov, rovnako ako c-src, boli uskutočnené rovnako ako pre EGF receptor s tou výnimkou, že reakcie sa účastnil chlorid manganatý.

Testy fosforylácie tyrozínu závislé od Heregulínu a EGF

A431 bunky ľudského epidermoídneho karcinómu alebo MDA-MB-453 bunky sa kultivovali v 6-jamkových platniach do približne 80 % konfluencie a potom sa inkubovali v bezsérovom médiu počas 18 hodín. Bunky sa vystavili pôsobeniu rôznych koncentrácií buď zlúčeniny 1 alebo zlúčeniny príkladu 21 počas 2 hodín a potom sa stimulovali buď 100 ng/ml EGF (A431) alebo 10 ng/ml heregulínu (MDA-MB-453) počas 5 minút. Pripravili sa bunkové extrakty a westernovým prenosom sa určila redukcia fosfotyrozínu.

Wcstcmový prenos

Extrakty sa pripravili lýzou monovrstiev vo 0,2 ml variaceho Laemliho pufra (2 % dodecylsíran sodný, 5 % β-merkaptoetanol, 10 % glycerol a 50 mM Tris, pH 6,8) a lyzáty sa zohrievali počas 5 minút pri teplote 100 °C. Proteíny v lyzátu sa separovali elektroforézou na polyakrylamidovom géli a elektroforeticky sa preniesli na nitrocelulózu. Membrána sa premyla jednou v (10 mM Tris, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,01 % azid sodný) (TNA) a blokovala sa cez noc v TNA obsahujúcom 5 % hovädzí sérový albumín a 1 % ovalbumín. Membrána sa spracovávala počas 2 hodín antifosfotyrozínovou protilátkou (UBI, Lake Placid, NY, 1 μg/ml v blokovacom pufre) a potom sa dvakrát premyla v TNA, jednou v TNA obsahujúcom 0,05 % Tween-20 a 0,05 % nonidet P-40 a dvakrát v TNA. Membrány sa potom inkubovali počas 2 hodín v blokovacom pufri obsahujúcom 0,1 pCi/ml [¹²⁵I]proteínu A a potom sa znovu premyli rovnakým spôsobom ako skoršie. Potom, čo škvrny uschli, sa vložili do filmovej kazety a exponovali sa na X-AR-rôntgenovom filme počas 1 až 7 dní. Intenzity pásikov sa určili lazerovým denzitometrom.

Dáta v tabuľke 1 ukazujú, že zlúčenina príkladu 21 a zlúčenina 1 sú približne rovnako aktívne oproti prečistenej tyrozín-kináze EGF receptora, autofosforylácii receptora sprostredkovanej EGF a fosforylácii tyrozínu sprostredkovanej heregulínom in vitro.

Zlúčenina	IC_;;. (TtN)	TC:_: (nMJ auto-	IC:·
	Tyrozín-kinázy	fosforvlácía	fosforyláceia
	receptora pre	receptora	tyrozínu

	EGF	sprostredkovaná EGF	sprostredkovaná heregulínom
Príklad 21	3₍ 6	5,3	6,4
Zlúčenina 1	2, 0	2,9	9, 0

Test inhibície nádorov in vivo

Ľudský epidermoídny karcinóm A431 bol propagovaný in vivo sériovou transplantáciou. Tento nádorový model bol vybraný pre tieto štúdie pre známu závislosť rastu od EGF receptore a pre svoju reaktivitu v časnom štádiu od terapie monoklonálnymi protilátkami in vivo. V tomto pokuse boli holým myšiam s hmotnosťou 18 - 22 g implantované pod kožné 30 mg fragmenty A431 nádoru do oblasti pravej axily v deň 0. Nádory sa nechali narásť do hmotnosti 100 - 150 mg a v tento čas sa zvieratá s nádormi náhodne rozdelili a umiestnili sa do liečebných boxov. Zvieratá sa liečili perorálne počas 15 nasledujúcich dní izetionátovou soľou zlúčeniny príkladu 21 a zlúčeniny 1 vo vode. Izetionátové soli môžu byť pripravené titráciou zlúčeniny do roztoku sa 2 ekvivalentmi kyseliny izetiónovej. Liečba bola založená na priemernej hmotnosti skupiny. Kontrolným zvieratám bola podaná voda. Pokus sa hodnotil podľa spomalenia rastu nádoru, T-C, ktorý' je definovaný ako rozdiel, v dňoch, v dosiahnutiu hmotnosti 750 mg pre liečené a kontrolné nádory. Dáta môžu byť tiež uvedené ako percento inhibície rastu nádorov, ktoré je definované ako spomalenie rastu nádorov delené počtom liečebných dávok x 100 %. Väčšie spomalenie rastu nádorov a vyššia inhibícia rastu nádoru ukazujú na aktívnejšie zlúčeniny. Štatistická analýza bola vykonaná s použitím JMP pre Macintosh (SAS Inštitúte, lnc., Čary, NC).

Testovárá žlúčenina	Dávka (mg/kg)	Spomalenie rastu nádoru (dni)	Inhibícia rastu nádoru (%)
Príklad 21	18	18,4	123
Príklad 21	5	25,7	171
Zlúčenina 1	18	41,3	275
Zlúčenina 1	5	53,2	355

Hodnoty pre zlúčeninu 1 sú štatisticky významne odlišné od hodnôt pre zlúčeninu príkladu 21 v čase nutnom na to, aby jednotlivé nádory dosiahli hmotnosti 750 mg. P < 0,05, študent t-test.

Test na sekreciu VEGF

Predpokladá sa, že vaskulámy endotelový rastový faktor (VEGF), ktorý je tiež známy ako faktor cievnej permeability (VPF), je hlavným stimulátorom angiogenézie pri väčšine typov nádorov. Existuje veľa induktorov sekrécie VEGF a dvomi najúčinnejšími sú epidermálny rastový faktor (EGF) a transformujúci rastový faktor a, ktoré sú obaja ligandmi pre EGF receptor (EGFR).

Inhibícia sekrecie VEGF vedie k antiangiogénnemu účinku a môže viesť k regresii nádoru, pretože aj čiastočná inhibícia sekrecie VEGF môže viesť k deštrukcii novovytvorených nezrelých ciev v nádoroch (Benjamín, L. E. and Keshel, E., Conditional switching of VEGF expression in tumors: induction of endotelial celí shedding and regresion of hemangioma-like vessels by VEGF withdrawal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997; 94: 8761 - 8766).

Porovnávali sme dva inhibítory EGFR tyrozín-kinázy, zlúčeninu 1 a zlúčeninu príkladu 21, z hľadiska ich účinku na A431 nádorovej bunky. Proti A431 nádorom in vivo má zlúčenina 1 neočekávane vyššiu protinádorovú účinnosť (T-C = 53 dni) ako zlúčenina príkladu 21 (T-C = 26 dní). Pozri test opísaný skôr. Potom sme hodnotili efekty oboch zlúčenín na sekréciu VEGF v A431. K nášmu prekvapeniu bola zlúčenina 1 lepšia v inhibícii sekrécie VEGF v A431 bunkách in vitro. Pri 0,5 μΜ blokovala zlúčenina 1 sekréciu VEGF stimulovanú EGF alebo TGF-α. Naopak, 0,5 μΜ zlúčeniny príkladu 21 inhibovalo sekreciu VEGF takmer rovnako, ako 0,1 μΜ zlúčeniny 1. 0,1 μΜ zlúčeniny 1 inhibovalo sekreciu VEGF stimulovanú EGF o 63 % a 0,5 μΜ inhibovalo túto sekréciu VEGF stimulovanú EGF o 86 %. Naopak, 0,1 μΜ zlúčeniny príkladu 21 inhibovalo sekréciu VEGF stimulovanú EGF o 48 % a 0,5 μΜ zlúčeniny príkladu 21 inhibovalo túto sekreciu VEGF stimulovanú EGF o 57 %. Podobné výsledky boli získané s použitím TGFa miesto EGF na stimuláciu sekrecie VEGF. 0,5 μΜ zlúčeniny 1 inhibovalo sekréciu VEGF stimulovanú TGFa o viacej ako 80 %, zatiaľ čo rovnaká koncentrácia zlúčeniny príkladu 21 inhibovala sekréciu VEGF o 57 %. Tiež sa zdá, že zlúčenina 1 inhibuje bazálnu sekréciu VEGF v A431 bunkách, zatiaľ čo zlúčenina príkladu 21 vôbec nie.

Metódy

A431 ľudské bunky epidermoidného karcinómu, získané z Američan Type Culture Collection, Rockville, MD, boli kultivované DMEM/F12 médiom doplnenom 10 % fetálnym hovädzím sérom. Pred pridaním lieku a rastového faktora sa bunky premyli trikrát v bezsérovom DMEM/F12. Bunky sa ošetrovali počas 2 hodín uvedenou koncentráciou zlúčeniny 1 alebo zlúčeniny príkladu 1 a potom sa pridalo 10 ng/ml buď EGF, alebo TGFa. Po 48 hodinovej inkubácii pri 37 °C sa médium odstránilo a skladovalo sa zmrazené pri -70 °C. VEGF ELISA testy (Intergen, Co., Purchase, NY) sa previedli na vzorkách média podľa návodu výrobcu. Výsledky tohto testu sú uvedené nasledujúcej tabuľke.

10. Použitie podľa nároku 7, kde tyrozín-kinázou je erbB4.

11. Použitie N-[4-(3-chlór-4-fluórfenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]akrylamidu na výrobu liečiva na inhibíciu fosforylácie tyrozínu erbB3.

12. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1 na výrobu liečiva na liečbu psoriázy.

13. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1 na výrobu liečiva na liečbu alebo prevenciu aterosklerózy.

14. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1 na výrobu liečiva na liečbu endometriózy.

15. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1 na výrobu liečiva na inhibíciu sekrecie VEGF.

Koniec dokumentu

OSetrenie	Sekrecia VEGF (pg/10* buniek ± SE)	% ínhibicia
Bezsérové médium (SF)	490 ± 32
SF + 0,1 μΜ zlúčeniny 1	280 ± 41	43
SF + 0,5 μΜ zlúčeniny 1	250 ± 46	49
SF + 0,1 μΜ zlúčeniny príkladu 21	600 ± 37	0
SF + 0,5 μΜ zlúčeniny príkladu 21	440 ± 110	10
SF + 10 ng/ml EGF	3980 ± 85
SF + EGF +0,1 μΜ zlúčeniny 1	1490 ± 1Θ0	63
SF + EGF + 0,5 μΜ zlúčeniny 1	560 ± 29	86
SF + EGF + 0,1 μΜ sl. príkladu 21	2070 ± 160	48
SF + EGF + 0,5 μΜ sl. príkladu 21	1710 ± 65	57
SF + TGFa	4034 ± 190
SF + TGF + 0,1 μΜ zlúčeniny 1	1976 ± 37	51
SF + TGF + C,5 μΜ zlúčeniny 1	766 ± 7S	81
SF + TGF + 0,1 μΜ sl. príkladu 21	3065 ± 161	24
SF + TGF + 0,5 μΜ sl. príkladu 21	1734 ± 21	57

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. N-[4-(3-Chlór-4-fluór-fenylamino)-7-(3-morfolin-4-yl-propoxy)-chinazolin-6-yl]-akrylamid alebo jeho farmaceutický prijateľné soli.

2. Farmaceutický prijateľný prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu podľa nároku 1.

3. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1 na výrobu liečiva na liečbu nádorov.

4. Použitie podľa nároku 3, kde nádorom je nádor prsníka.

5. Použitie podľa nároku 3, kde nádorom je nádor hrubého čreva.

6. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1 na výrobu liečiva na liečbu alebo prevenciu restenózy.

7. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1 na výrobu liečiva na ireverzibilnú inhibíciu tyrozín-kináz.

8. Použitie podľa nároku 7, kde tyrozín-kinázou je EGFR.

9. Použitie podľa nároku 7, kde tyrozín-kinázou je crbB2.