EA003786B1

EA003786B1 - N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид - необратимый ингибитор тирозинкиназ

Info

Publication number: EA003786B1
Application number: EA200100546A
Authority: EA
Inventors: Александер Джеймс Бриджес; Денис Дрисколь; Вейн Дэниель Клос
Original assignee: Варнер Ламберт Компани
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2003-10-30
Also published as: BG105608A; HUP0104211A2; AU6261299A; NO20012465D0; PE20001242A1; NZ527718A; EP1131304B1; JP2002530386A; DE69904358D1; ZA200103535B; HK1041695A1; CA2349721A1; CZ20011759A3; BR9915487A; PT1131304E; DE69904358T2; EE200100271A; EA200100546A1; PL347717A1; NZ512189A

Abstract

Настоящее изобретение предлагает соединение N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид, которое является необратимым ингибитором тирозинкиназ. Также предложены способы лечения рака, рестеноза, атеросклероза, эндометриоза и псориаза с использованием соединения N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида, и фармацевтическая композиция, содержащая соединение N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к соединению Н-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил] акриламиду, которое является необратимым ингибитором тирозинкиназ. Изобретение также относится к способу лечения рака, атеросклероза, рестеноза, эндометриоза и псориаза с использованием соединения И-[4-(3-хлор-4фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида и к фармацевтической композиции, содержащей соединение Ν[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид.

Предпосылки создания изобретения

Рак рассматривают как поражение внутриклеточной сигнальной системы или механизма передачи сигнала. Клетки получают приказы от многих внеклеточных источников, указывающие им либо пролиферировать, либо не пролиферировать. Целью системы передачи сигнала является прием этих и других сигналов на поверхности клетки, перевод их внутрь клетки и затем передача сигналов на ядро, цитоскелет, а также транспорт и обеспечение синтеза белка.

В самом общем случае причиной рака являются либо серьезные дефекты в этих белках, когда они мутированы, либо нарушения в регуляции количества белка в клетке, приводящие к тому, что он образуется в избыточных или недостаточных количествах. Наиболее часто встречаются ключевые повреждения в клетке, которые ведут к такому состоянию, при котором ядро клетки получает сигнал к пролиферации, когда этот сигнал в действительности отсутствует. Это может осуществляться через множество различных механизмов. Иногда клетка может начать продуцировать аутентичный фактор роста для своих собственных рецепторов, когда этого не следует делать, это так называемый механизм аутокринной петли. Мутации клеточных поверхностных рецепторов, которые обычно передают сигнал внутрь клетки через тирозинкиназы, могут приводить к активации киназы в отсутствии лиганда и прохождению сигнала, которого нет в действительности. Альтернативно, многие поверхностные киназы могут быть сильно экспрессированы на поверхности клетки, что приводит к несоответственно сильному отклику на слабый сигнал. Внутри клетки имеется много уровней, на которых мутация или сильная экспрессия могут привести к такому же ложному сигналу, возникающему в клетке, а также имеется много других видов сигнальных дефектов, вызывающих рак. Настоящее изобретение относится к раковым заболеваниям, которые запускаются тремя уже описанными механизмами и которые вовлекают клеточные поверхностные рецепторы эпидермального фактора роста рецептора семейства тирозинкиназы (ЕСЕВ). Это семейство состоит из ЕСЕ рецептора (также известного как егЬВ 1), егЬВ2 рецеп тора и составляющего его активного онкопротеинового мутанта №и, егЬВ3 рецептора и егЬВ4 рецептора. Кроме того, другие биологические процессы, возбуждаемые членами семейства ЕСЕ рецепторов, также могут лечиться соединениями по изобретению, описанными ниже.

ЕСЕВ имеет два важнейших лиганда - эпидермальный фактор роста (ЕСЕ) и трансформирующий фактор роста α (ТСЕа). Кажется, что рецепторы имеют только второстепенные функции у взрослых людей, но они, несомненно, вовлечены в протекание большей части всех раковых заболеваний, в особенности рака ободочной кишки и рака молочной железы. Близкородственные рецепторы егЬВ2 (НЕВ2), егЬВ3 (НЕВ3) и егЬВ4 (НЕВ4) в качестве главных лигандов имеют семейство НегедиЬпе. причем недвусмысленно доказано, что сильная экспрессия и мутация рецептора является главным фактором риска при плохом прогнозе рака молочной железы. Кроме того, было показано, что все четыре члена этого семейства рецепторов могут образовывать гетеродимерные сигнальные комплексы с другими членами семейства и что это может привести к синергетической трансформирующей способности, если более одного члена семейства сильно экспрессировано на злокачественное развитие. Было показано, что сильная экспрессия более чем одного члена семейства является относительно общим признаком при злокачественных заболеваниях человека.

Кроме рака, рестеноз также является болезнью, при которой протекает нежелательная клеточная пролиферация. Рестеноз включает пролиферацию васкулярных гладких мускульных клеток. Рестеноз является главной клинической проблемой, связанной с коронарной ангиопластикой и другими медицинскими процедурами. Рестеноз проявляется, в основном, в течение 0-6 месяцев примерно у 30-60% пациентов, которые подверглись катеторной ангиопластике для очистки закупоренных коронарных артерий при попытке вылечить болезнь сердца, обусловленную закупоркой артерий. Появляющийся в результате рестеноз является причиной значительной заболеваемости пациентов и роста расходов на здравоохранение.

Развитие рестеноза инициируется повреждением кровеносного сосуда, включая артерии и вены, с последующим высвобождением тромбогенных, вазоактивных и митогенных факторов. Повреждение эндотелиальных и глубоких сосудов ведет к агрегации тромбоцитов, формированию тромба, воспалению и активации макрофагов и гладких мускульных клеток. Эти события вызывают выработку и высвобождение факторов роста и цитокинез, которые, в свою очередь, могут способствовать их собственному синтезу и высвобождать клетки-мишени. Таким образом, инициируется самовозобновляющийся процесс, вовлекающий факторы роста, такие как

ЕСЕ, тромбоцитарный фактор роста (РИСЕ) или фактор роста фибробластов (ЕСЕз). Следовательно, было бы полезно иметь необратимые ингибиторы путей передачи сигнала, особенно таких тирозинкиназ, как ЕСЕ, РОСЕ, ЕСЕ или згс тирозинкиназы.

В настоящее время нет хорошего способа лечения пролиферативного кожного заболевания псориаза. Его часто лечат с помощью противоопухолевых агентов, таких как метотрексат, который дает очень серьезные побочные эффекты, и не очень эффективен в предельно допустимых по токсичности дозах, которые могут использоваться. С тех пор как у 50% трансгенных мышей, которым ввели ТСЕа, развился псориаз, существует уверенность, что ТСЕа является главным фактором роста, вызывающим псориаз. Это предполагает, что подходящий ингибитор передачи сигналов ЕСЕК может быть использован в качестве противопсориазного агента, предпочтительно, но не обязательно, путем местного применения.

Выгода от необратимых ингибиторов тирозинкиназы особенно очевидна при сравнении с обратимыми ингибиторами, поскольку необратимые ингибиторы могут быть использованы в пролонгированном подавлении тирозинкиназы, ограниченном только обычным темпом ресинтеза рецептора, также называемым оборачиваемостью.

Информация о роли згс тирозинкиназ в биологических процессах, связанных с раком и рестенозом, может быть найдена в следующих документах, которые включены здесь в виде ссылки.

Бенжамин К. У. и Джон Д.А. Тромбоцитарный фактор роста, стимулирующий фактор роста рецептора, связывающего ассоциацию протеина-2 с зге в васкулярных гладких мышечных клетках (Вещают С.XV. апб 1опсз Ό.Α, Р1а1с1с1Эспусб Сго\\П1 Еас!ог 8!1ти1а!сз Сго\\П1 Еас!ог КсссрЮг Вшбтд Рго!ст-2 Аззос1а!юп Χνίΐΐι 8гс 1п Уазси1аг 8тоо111 Мизс1с Сс11з, 1ВС, 1994; 269:30911-30916).

Коваленко М. и др. Селективный тромбоцитарный фактор роста рецептора киназы - блокатор обратной цис-трансформации (Коуа1спко М., с! а1., 8с1ссбус Р1а1с1с1-Осг1усб СгомШ Еас1ог КсссрЮг Кшазс В1осксгз Ксусгзс С1з1гапзГогша!юп, Сапссг Ксз, 1994; 54:6106-6114).

Шварц Р.С. и др. Пересмотр хода рестеноза: Альтернативное предложение для клеточных механизмов (8сймаг1х К.8., с! а1., Тйс Ксз1споз1з Рагабщт Ксу1з1сб: Ап АИстаНус Ргороза1 Гог Сс11и1аг Мссйашзтз, 1 Ат Со11 Сагбю1 1992; 20:1284-1293).

Либби П. и др. Каскадная модель рестеноза - особый случай протекания атеросклероза (ЫЬЬу Р., с! а1., Сазсабс Мобс1 Гог Ксз1споз1з - А 8рсс1а1 Сазс оГ А1йсгозс1сгоз1з Ргодгсззюп, С1гси1абоп, 1992; 86:47-52).

Дополнительная информация о роли ЕСЕ тирозинкиназ в биологических процессах, связанных с раком и рестенозом, может быть найдена в следующем документе, который здесь приведен в виде ссылки.

Джонатан Блэй и Морли Д. Холленберг. Гетерологичная регуляция функции ЕСЕ рецептора в культивированных артериальных гладких мышечных клетках (1опа!йап В1ау апб Мог1су Ό. Но11спЬсгд, Нс!сго1одоиз КсдикЮоп ОГ ЕСЕ Кссср!ог Еипсбоп 1п СиЙигсб Аогбс 8тоо111 Мизс1с Сс11з, Еиг 1 Ркагтасок Мо1 Р11агтасо1 8сс!, 1989; 172(1): 1-7).

Информация о том, что антитела ЕСЕ или ЕСЕК проявляют ίπ у1уо противоопухолевую активность, может быть найдена в следующих документах, которые здесь включены в виде ссылки.

Моджтахеди X., Экклс С., Бокс Г., Стайлс Дж., Дин К. Иммунотерапия человеческих опухолевых ксенотрансплантатов, сильно экспрессирующих ЕСЕ рецептор, крысиными антителами, которые блокируют взаимодействие фактор роста-рецептор (Мобрайсб! Н., Есс1сз 8., Вох С., 8!у1сз 1., Эсап С. 1ттипо1йсгару ОГ Нитап Титоиг Хсподгайз Оусгсхргсззтд Тйс ЕСЕ Ксссркг νίΐΗ Ка! АпРЬобкз Тйа! В1оск Сго\\П1 Еас!ог-Кссср!ог 1п!сгас!юп, Вг 1 Сапссг, 1993; 67:254-261).

Курачи X., Моришиге К.И., Амемия К., Адачи X., Хирота К., Мияке А., Танизава О. Важность преобразования фактор роста α/эпидермальный фактор роста рецептора аутокринного механизма роста ш у1уо на линии раковых клеток яичников (КигасЫ Н., МопзЫдс К.1., Ашст1уа К., АбасЫ Н., Нпо!а К., М1уакс А., Ташха\\'а О. 1тройапсс ОГ ТгапзГогттд Сго\\П1 Еас!ог а/Ер1бсгта1 Сго\\П1 Еас!ог Кссср!ог Аи!осгтс Сго\\111 Мссйашзт 1п Ап Оуапап Сапссг Сс11 Ьшс 1п У1уо, Сапссг Ксз, 1991; 51:5956-5959).

Масуи Х., Морояма Т., Мендельсон Дж. Механизм противоопухолевой активности у мышей для антиэпидермального фактора роста рецептора моноклональных антител различных изотипов (Мазш Н., Могоуата Т., Мспбс1зойп 1. Мссйашзт ОГ АпШитог Асбуйу 1п Мкс Еог Ап!1-Ер1бсгта1 Сго\\111 Еас!ог Ксссркг Мопос1опа1 АпбЬобкз νίΐΗ ИгЕГсгсп! 1зо!урсз, Сапссг Ксз, 1986; 46:5592-5598).

Родек Ю., Херлин М., Херлин Д., Молтофф К., Аткинсон Б., Варелло М., Степлевски З., Копровски X. Модуляция роста опухоли моноклональным антителом рецептора эпидермального фактора роста: иммунологически опосредованные и эффекторные клеточнонезависимые эффекты (Кобсск и., Нсг1уп М., Нсг1уп Ό., МоИйоГГ С., А1ктзоп В., Уагс11о М., 8!ср1смзк1 Ζ., Коргомзк) Н. Титог Сго\\П1 МобикЮоп Ву А Мопос1опа1 АпбЬобу То Тйс Ер1бсгта1 Сго\\П1 Еас!ог Ксссркг: 1ттипо1ощ са11у Меб1а1еб Апб Ейес1ог Се11-1пдерепдеп1 Е££ес!з, Сапсег Кез, 1987; 47:3692-3696).

Гуан Е., Зоу Т., Ванг Дж., Хуанг П., Танг

B. , Зао М., Чен Й., Сун Й. Торможение роста человеческого носоглоточного рака у атимических мышей с помощью моноклональных антител рецептора антиэпидермального фактора роста (Сиап Е., Ζήση Т., Аапд I., Ниапд Р., Тапд А., ΖΙίβο М., СЬеп Υ., 8ип Υ. СгоАЬ ЫЫЫЛоп О£ Нитап Ка8орЬагуп§еа1 Сагстоша 1п А1Ьут1с М1се Ву АпЛ-Ер1бегта1 Сгоа1Ь Гас1ог Кесер1ог Мопос1опа1 АпЛЪоб1ез, 1п1егпа1 I Се11 С1оп, 1989; 7:242-256).

Масуи X., Кавамото Т., Сато Дж. Д., Волф Б., Сато Г., Мендельсон Дж. Торможение роста человеческих опухолевых клеток у атимических мышей с помощью моноклональных антител рецептора антиэпидермального фактора роста (Мазш Н., 1<а\\шпо1о Т., 8а1о Ι.Ό., Ао!1’ В., 8а1о

C. , Мепбе1зоЬп I. Сгоа1Ь ЫЫЫЛоп О£ Нишап Титог Се11з 1п А1Ьут1с М1се Ву АпЛ-Ер1бегта1 СгоАЬ Гас1ог Кесер1ог Мопос1опа1 АпЛЪоб1ез, Сапсег Кез, 1984; 44:1002-1007).

Кроме того, в следующих документах описана противоопухолевая активность ингибиторов белка тирозинкиназы. Документы включены здесь в виде ссылки.

Бачданджер Е., Тринкс Ю., Метт X., Риджинасс Ю., Мюллер М., Майер Т., МакГлинн Е., Пинна Л.А., Трекслер П., Лидон Н.Б. 4,5Дианилинфталимид: ингибитор белка тирозинкиназы, селективный для эпидермального фактора роста рецептора пути передачи сигнала и обладающий т νίνο сильной противоопухолевой активностью (ВисЬбипдег Е., Тппкз и., МеЛ Н., Кедепазз и., Ми11ег М., Меуег Т., МсС1упп Е., Ртпа Б.А., Тгах1ег Р., Бубоп Ν.Β. 4,5В1аш1торЬ1Ьа11т1бе: А Рго1ет Тугозте Ктазе 1пЫЫ1ог А11Ь 8е1ес1^г1у Гог ТЬе Ер1бегта1 Сгоа1Ь Гас1ог Кесер1ог 81дпа1 ТгапзбисЛоп Ра1ЬАау Апб Ро1еп1 1п νίνο АпШитог Ас11 νι'1γ, Ргос ΝΗ11 Асаб 8с1 И8А, 1994; 91:2334-2338).

Бачданджер Е., Метт X., Тринкс Ю., Риджинасс Ю., Мюллер М., Майер Т., Бейлштейн П., Вирц Б., Шнейдер П., Трекслер П., Лидон Н.Б. 4,5-Бис(4-фторанилин)фталимид: селективный ингибитор эпидермального фактора роста рецептора пути трансдукции сигнала с высокой ίπ νίνο противоопухолевой активностью (ВисЬбипдег Е., МеЛ Н., Тппкз и., Кедепазз и., Ми11ег М., Меуег Т., Вейз1ет Р., Αιγζ В., 8сЬпе1бег Р., Тгах1ег Р., Бубоп Ν. 4,5-В1з(4Б1иогоапШпо)РЬ1Ьайт1бе: А 8е!ес11\^;е 1пЬ1ЪЛог О£ ТЬе Ер1бегта1 Сгоа1Ь Гас1ог Кесер1ог 81дпа1 ТгапзбисЛоп Ра1ЬАау АЛЬ Ро1еп1 1п νίνο Мбб АпЛ1итог А^гсЛу, СНтса1 Сапсег КезеагсЬ, 1995; 1:813-821).

Соединения, являющиеся обратимыми ингибиторами тирозинкиназ, описаны в патентах и8 5457105, 5475001 и 5409930 и публикациях РСТ АО 95/19774 и АО 95/19970. В них описано соединение, которое имеет структуру, отли чающуюся от ингибиторов тирозинкиназы, описанных в вышеуказанных документах, и является необратимым ингибитором тирозинкиназ.

В заявке РСТ/И8 97/05778 (публикационный номер АО 97/38983), которая включена здесь в виде ссылки, описаны соединения, которые являются необратимыми ингибиторами тирозинкиназ.

Общая формула I, заявленная в заявке РСТ, охватывает соединение №[4-(3-хлор-4фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид (здесь «соединение I»), но соединение I специально не описано в заявке РСТ.

В заявке РСТ в примере 21 описывается соединение Ν- [4- [(3-бромфенил)амино]-7-[3-(4морфолино)пропокси]хинозолин-6-ил]акриламид, которое имеет следующую химическую структуру

Соединение I отличается от примера 21 заместителями фенильного кольца, которое присоединено к группе хинолина через атом азота. Фенильное кольцо соединения I замещено в положении 3 хлором и в положении 4 фтором. В отличие от него фенильное кольцо соединения в примере 21 по заявке РСТ (здесь пример 21) замещено в положении 3 бромом. Несмотря на то, что эти два соединения имеют похожую структуру, соединение I проявляет удивительные и неожиданные свойства т νίνο, по сравнению с примером 21 заявки РСТ.

Еще более удивительно и неожиданно, что соединение I и пример 21 показывают в определенных тестах похожую активность т νΐΐΓΟ, но проявляют значительное различие активности т νίνο.

Краткое изложение изобретения

Настоящее изобретение предлагает соединение №[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид или его фармацевтически приемлемые соли.

Также предложена фармацевтически приемлемая композиция, содержащая №[4-(3-хлор

4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид.

Также предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, имеющему рак, терапевтически эффективного количества Ы-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.

В предпочтительном варианте осуществления способа лечения рака рак является раком молочной железы.

В другом предпочтительном варианте осуществления способа лечения рака рак является раком ободочной кишки.

Также предложен способ лечения или предупреждения рестеноза, включающий введение пациенту, имеющему рестеноз или риск возникновения рестеноза, терапевтически эффективного количества Ы-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил] акриламида.

Также предложен способ необратимого ингибирования тирозинкиназ, включающий введение пациенту, нуждающемуся в ингибировании тирозинкиназы, ингибирующего количества Ы-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.

В предпочтительном варианте осуществления способа необратимого ингибирования тирозинкиназ тирозинкиназа представляет собой ЕСЕК.

В другом предпочтительном варианте осуществления способа необратимого ингибирования тирозинкиназ тирозинкиназа представляет собой егЬВ2.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления способа необратимого ингибирования тирозинкиназ тирозинкиназа представляет собой егЬВ4.

Также предложен способ лечения псориаза, включающий введение пациенту, имеющему псориаз, терапевтически эффективного количества Ы-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.

Также предложен способ лечения или предупреждения атеросклероза, включающий введение пациенту, имеющему атеросклероз или риск возникновения атеросклероза, терапевтически эффективного количества Ы-[4-(3-хлор-4фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.

Также предложен способ лечения эндометриоза, включающий введение пациенту, имеющему эндометриоз, терапевтически эффективного количества Ы-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.

Также предложен способ ингибирования секреции УЕСЕ, включающий введение пациенту, нуждающемуся в ингибировании секреции УЕСЕ, терапевтически эффективного количест ва Ы-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.

Также предложен способ ингибирования фосфорилирования тирозина егЬВ3, включающий введение пациенту, нуждающемуся в ингибировании фосфорилирования тирозина егЬВ3, терапевтически эффективного количества N-[4(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.

Подробное описание изобретения

Соединение I является необратимым ингибитором тирозинкиназ, особенно ЕСЕК тирозинкиназы. Другие тирозинкиназы, которые могут ингибироваться соединением I, включают ЕСЕК, ΡΌ6ΕΒ, С-8ТС, егЬВ2 и егЬВ4. Терапевтически эффективное количество соединения I может быть введено пациенту, имеющему рак, или пациенту, имеющему рестеноз или риск возникновения рестеноза, или пациенту, имеющему псориаз, атеросклероз или риск возникновения атеросклероза, или эндометриоз. Специалисты в данной области могут легко определить больных раком, рестенозом, псориазом, атеросклерозом или эндометриозом, и пациентов, у которых есть риск возникновения рестеноза или атеросклероза. Например, пациентами с риском возникновения рестеноза являются пациенты, подвергнувшиеся ангиопластике, шунтированию или трансплантации. Аналогично, пациенты с риском развития атеросклероза включают пациентов, которые страдают ожирением, едят очень жирную пищу, имеют высокий уровень холестерина или имеют гипертензию. Термин пациент означает животных, таких как собаки, коты, коровы, овцы, а также включает людей.

Термин рак включает, но не ограничивается этим, следующие виды рака: рак молочной железы; рак яичников; рак шейки матки; рак предстательной железы; рак яичка; рак пищевода; глиобластома; нейробластома; рак желудка; рак кожи, кератоакантома; рак легкого, плоскоклеточный рак, крупноклеточный рак, аденокарцинома; рак костей; рак ободочной кишки, аденокарцинома, аденома; рак поджелудочной железы, аденокарцинома; рак щитовидной железы, фолликулярная карцинома, недифференцированная карцинома, папиллярная карцинома; семинома; меланома; саркома; карцинома мочевого пузыря; карцинома печени и желчных протоков; карцинома почки; миелоидные нарушения; лимфатические нарушения, лимфогранулематоз, волосатые клетки; рак полости рта и глотки (оральный), губ, языка, рта, глотки; рак тонкой кишки; рак ободочной и прямой кишки, толстой кишки, прямой кишки; рак мозга и центральной нервной системы; и лейкемия.

Предпочтительными видами рака, для лечения которых может быть использовано соединение I, являются рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак ободочной и прямой кишки и рак яичников.

Кроме того, соединение I может быть использовано для лечения пациентов, нуждающихся в ингибировании секреции васкулярного эндотелиального фактора роста (УЕСЕ). В число пациентов, нуждающихся в ингибировании секреции УЕСЕ, включены те пациенты, у которых обнаружены рак, диабетическая ретинопатия, ревматоидный артрит, псориаз, рестеноз, атеросклероз, остеопороз, эндометриоз, люди, подвергнувшиеся эмбриональной имплантации, или люди, имеющие другие заболевания, в которых важную роль играют ангиогенез или неоваскуляризация.

Соединение по настоящему изобретению может быть использовано для ингибирования фосфорилирования тирозина етЬВ. Пациенты, нуждающиеся в ингибировании фосфорилирования тирозина егЬВ - это пациенты, имеющие или рискующие получить заболевания, упомянутые здесь в связи с ингибированием ЕСЕК, и ингибированием секреции УЕСЕ.

Соединение I может быть введено людям или животным орально, ректально, парентерально (внутривенно, внутримышечно или подкожно), внутриполостно, внутривагинально, внутрибрюшинно, внутрипузырно, локально (порошки, мази или капли) или распылением в нос или рот. Соединение I может быть введено само по себе или как часть фармацевтически приемлемой композиции, содержащей фармацевтически приемлемые наполнители.

Композиции, пригодные для парентеральных инъекций, могут включать физиологически приемлемые стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для получения стерильных инъецируемых растворов и дисперсий. Примеры подходящих водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или связующих включают воду, этанол, полиолы (пропиленгликоль, полиэтиленглиголь, глицерин и т.п.), их приемлемые смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и пригодные для инъекций органические эфиры, такие как этилолеат. Надлежащее жидкое состояние может быть поддержано, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий, и путем использования поверхностно-активных веществ.

Эти композиции могут также содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, увлажнители, эмульгаторы и диспергаторы. Предупредить воздействие микроорганизмов можно с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, таких как, например, парабены, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота и т.п. Также может быть желательно включение изотонических агентов, например, сахара, хлорида натрия и т.п. Пролонгированная абсорбция инъецируемой фармацевтической формы может быть обеспечена путем использования веществ, предотвращающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия или желатина.

Твердые лекарственные формы для орального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное соединение смешано, по крайней мере, с одним обычным инертным наполнителем (или носителем), таким как цитрат натрия или двухзамещенный фосфат кальция, или с (а) заполнителями или наполнителями, такими как, например, крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннитол и кремниевая кислота; (Ь) связующими, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, алигнаты, желатин, поливинилпироллидон, сахароза и гуммиарабик; (с) увлажнителями, такими как, например, глицерин; (б) дезинтегрирующими агентами, такими как, например, агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, определенный комплекс силикатов и карбонат натрия; (е) замедлителями растворения, такими как, например, парафин; (1) ускорителями абсорбции, такими как, например, четвертичные аммониевые соединения; (д) смачивающими веществами, такими как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (11) адсорбентами, такими как, например, каолин и бентонит; и (1) скользящими веществами, такими как, например, тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия или их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы могут также включать буферные агенты.

Твердые композиции подобного типа могут также применяться в качестве заполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах, с использованием таких наполнителей, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т. п.

Твердые лекарственные формы, такие как таблетки, драже, капсулы, пилюли и гранулы могут быть изготовлены с покрытием или оболочкой, такими как кишечно-растворимое покрытие и другие, хорошо известные в данной области техники. Они могут содержать контрастные вещества, а также могут включать такие композиции, что они высвобождают активное вещество в определенной части кишечного тракта в замедленном действии. Примерами герметизирующих композиций, которые могут использоваться, являются полимерные вещества и воски. Активное вещество может быть также в микроинкапсулированной форме, в том числе, если подходят, с одним или более из вышеперечисленных наполнителей.

Жидкие лекарственные формы для орального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Кроме активного соединения жидкие дозированные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как вода или другие растворители, солюбизирующие вещества и эмульгаторы, такие как, например, этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, припиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, в частности хлопковое масло, масло земляного ореха, масло из зародышей кукурузы, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбита или смеси этих веществ и т.п.

Кроме таких инертных разбавителей, композиция может также включать вспомогательные вещества, такие как увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие вещества, подсластители, вкусовые добавки и отдушки.

Суспензии, кроме активного соединения, могут содержать суспендирующие вещества, такие как, например, этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбитол и сложные эфиры сорбита, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант или их смеси и т.п.

Композиции для ректального введения предпочтительно представляют собой суппозитории, которые могут быть изготовлены путем смешения соединений по настоящему изобретению с подходящими не раздражающими наполнителями или носителями, такими как масло какао, полиэтиленгликоль или воск для суппозиториев, которые находятся в твердом состоянии при обычных температурах, но становятся жидкими при температуре тела и, следовательно, плавятся в прямой кишке или вагинальной полости и высвобождают активный компонент.

Лекарственные формы для местного введения включают мази, порошки, аэрозоли и средства для ингаляции. Активный компонент смешивают в стерильных условиях с физиологически приемлемым носителем и, если требуется, с любыми консервантами, буферными веществами или пропеллентами. Офтальмические составы, глазные мази, порошки и растворы также входят в объем настоящего изобретения.

Термины «фармацевтически приемлемые соли, эфиры, амиды и пролекарства», используемые здесь, относятся к тем солям по карбоксильной группе, солям амнокислотного присоединия, эфирам, амидам и пролекарствам соединения по настоящему изобретению, которые являются в объеме известных медицинских заключений пригодными для использования в контакте с тканями пациентов, не имеют чрезмерной токсичности, не вызывают раздражений, аллергических реакций и т. п. и соответственно обладают приемлемым соотношением выгода/риск и эффективностью при намеченном использовании, а также к цвиттерионным формам, где это возможно, соединений по изобретению. Термин «соли» относится к относительно нетоксичным, неорганическим и органическим кислотно-аддитивным солям соединений по настоящему изобретению. Эти соли могут быть получены ίη 8Йи в ходе конечного выделения и очистки соединения или путем отдельной реакции очищенного соединения в его свободной основной форме с подходящей органической или неорганической кислотой и выделения образовавшейся соли. Указанные соли включают гидробромиды, гидрохлориды, сульфаты, бисульфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валераты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, фосфаты, тозилаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, нафтилаты, мезилаты, глюкогептаноаты, лактобионаты, лаурилсульфонаты и т. п. Они могут включать катионы щелочных и щелочноземельных металлов, таких как натрий, литий, калий, кальций, магний и т.п., а также нетоксичные аммониевые, четвертичные аммониевые катионы и катионы аминов, включая, но не ограничиваясь ими, аммоний, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, триэтиламин, этиламин и т.п. (см., например 8.М. Вегде, е1 а1., Рйагшасеийса1 8а1к, 1. Рйагш. 8ск, 1977; 66:1-9, который включен здесь в качестве ссылки).

Примеры фармацевтически приемлемых нетоксичных эфиров соединений по настоящему изобретению включают сложные С₁-С₆алкиловые эфиры, в которых алкильная группа представляет собой прямую или разветвленную цепь. Приемлемые эфиры также включают сложные С5-С₇циклоалкиловые эфиры, а также сложные арилалкиловые эфиры, такие как, но не только, бензиловый эфир. Предпочтительны сложные С₁-С₄алкиловые эфиры. Сложные эфиры соединения по настоящему изобретению могут быть получены обычными методами.

Примеры фармацевтически приемлемых нетоксичных амидов соединения по настоящему изобретению включают амиды, полученные из аммиака, первичных С₁-С₆алкиламинов и вторичных С₁-С₆диалкиламинов, в которых алкильные группы представляют собой прямую или разветвленную цепь. В случае вторичных аминов, амины могут быть также в форме 5- или 6-членных гетероциклов, содержащих один атом азота. Предпочтительны амиды, полученные из аммиака, первичных С1-С3алкиламинов и вторичных С₁-С₂диалкиламинов. Амиды соединения по изобретению могут быть получены обычными методами.

Термин «пролекарство» относится к соединениям, которые быстро трансформируются ίη νίνο, давая исходное соединение вышеука занных формул, например, путем гидролиза в крови. Всестороннее обсуждение этого приведено в Т. Н1диеЫ аиб V. 81е11а Рго-бгадк ак Ыоуе1 ОеБуегу 8ук1етк, νοί. 14 οί Не Л.С.8. 8утрокшт 8епек и в ВюгеуегщЫе Сатегк ίη Огцд Эебдп. Еб Еб\гагб В. КосНе, Атепсап Р1агтасеи11са1 Аккошабоп апб Регдатоп Ргекк, 1987, оба источника включены здесь в качестве ссылки.

Соединение по настоящему изобретению может быть введено пациенту при уровнях доз в интервале от примерно 0,1 до примерно 1000 мг в день. Для среднего взрослого человека, имеющего вес тела около 70 кг, достаточной является доза в интервале от около 0,01 до 100 мг на килограмм веса тела в день. Однако используемая индивидуальная доза может варьироваться. Например, доза может зависеть от ряда факторов, включая потребности пациента, условия лечения и фармацевтическую активность используемого соединения. Определение оптимальных доз для конкретного пациента хорошо известно специалистам в данной области.

Соединение по настоящему изобретению может существовать в несольватированных, а также в сольватированных формах с фармацевтически приемлемыми растворителями, такими как вода, этанол и т.п. В общем, сольватированные формы считаются эквивалентными несольватированным формам для целей настоящего изобретения.

Подразумевается, что соединение I получают либо синтетически, либо биологически, например, путем метаболизма.

Следующие примеры иллюстрируют частные варианты осуществления изобретения и никоим образом не ограничивают описание, включая формулу изобретения.

Примеры

Соединение I может быть синтезировано следующим образом.

Ы-[4-(3-Хлор-4-фторфениламино)-7-(3морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид.

Стадия А. 4-[(3-Хлор-4-фторфенил)амино]-7-фтор-6-нитрохиназолин.

Порошкообразный 4-хлор-7-фтор-6-нитрохиназолин (1. Мебт. СНет., 1996; 39:918) (82,77 г, 363,7 ммоль) добавляли порциями в течение 10 мин к механически перемешиваемому раствору 3-хлор-4-фторанилина (53,183 г, 365,3 ммоль) и Ν,Ν-диметиланилина (88,5 г, 730 ммоль) в изопропаноле (1,09 л) в токе азота на ледяной бане. В конце добавления ледяную баню убирали и смесь перемешивали при 25°С в течение 6 ч. Затем смесь снова охлаждали на ледяной бане и при перемешивании добавляли по каплям воду (200 мл), а затем водный раствор №_;СО₃ (10% мас./об., 200 мл). Через 10 мин смесь фильтровали на воронке Бюхнера и твердый остаток промывали разбавленным раствором NаНСΟз (насыщенный/5, 2x100 мл), во дой (2x100 мл) и изопропанолом (2x100 мл). Смесь сушили на воздухе, а затем в вакууме над Р₂О₅ при 75°С в течение 12 ч, получили 4-[(3хлор-4-фторфенил)амино]-7-фтор-6-нитрохиназолин (110,71 г, 90,4%) в виде твердого горчично-желтого вещества.

'Н ЯМР (ДМСО-б₆): δ 10,44 (с, 1Н, ΝΗ),

9,51 (д, 1=8,0 Гц, 1Н, Н-5), 8,67 (с, 1Н, Н-2), 8,07 (дд, 1=2,7, 6,8 Гц, 1Н, Н-2'), 7,79 (д, 1=12,4 Гц, 1Н, Н-8), 7,74 (ддд, 1=2,7, 4,2, 9,0 Гц, 1-Н, Н-6'),

7,43 (т, 1=9,2 Гц, 1Н, Н-5').

Стадия Б. 4-[(3-Хлор-4-фторфенил)амино]7-[3-(4-морфолино)пропокси]-6-нитрохиназолин.

Раствор триметилсиланолата калия (57,73 г, 0,43 моль) в диметилсульфоксиде (ДМСО) (150 мл) добавляли по каплям в течение 50 мин к ярко-желтой кашице 4-[(3-хлор-4-фторфенил) амино]-7-фтор-6-нитрохиназолина (50,503 г, 150 ммоль) и 3-(4-морфолино)пропан-1-ола (32,67 г, 225 ммоль) в ДМСО (250 мл), энергично перемешивали в токе Ν₂ при температуре водяной бани 25°С. Немедленно появлялся насыщенный красный цвет, и в конце добавления реакционная смесь была вязкой смесью насыщенного красно-черного цвета. Через 6 ч реакционную смесь медленно выливали на перемешиваемую смесь лед-вода (4 л), содержащую насыщенный раствор №₂СО₃ (150 мл). После отстаивания в течение 13 ч оранжево-красную кашицу собирали фильтрованием на воронке Бюхнера. Осадок промывали разбавленным раствором №1ОН (0,05М, 500 мл; 0,02М, 500 мл), разбавленным раствором №НСО₃ (насыщенный/5, 500 мл) и водой (2x500 мл), сушили на воздухе в течение 4 ч, а затем в течение ночи в вакуумном сушильном шкафу при 50°С над Р2О5, получили 4[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7-[3 -(4-морфолино)пропокси]-6-нитрохиназолина (62,47 г, 89% уточненный) в виде твердого яркого оранжевожелтого вещества.

'Н ЯМР (ДМСО-б₆): δ 10,11 (с, 1Н, ΝΗ),

9,18 (с, 1Н, Н-5), 8,65 (с, 1Н, Н-2), 8,15 (дд, 1= 2,4, 6,8 Гц, 1Н, Н-2'), 7,79 (ддд, 1=2,7, 4,3, 9,0 Гц, 1Н, Н-6'), 7,45 (т, 1=9,0 Гц, 1Н, Н-5'), 7,44 (с, 1Н, Н-8), 4,32 (т, 1=6,1 Гц, АгОСН₂), 3,57 (т, 1=4,5 Гц, 4Н, Н-2 морфолино), 2,45 (т, 1=6,5 Гц, 2Н, Ν№₂), 2,34 (ушир. с. 4Н, Н-3 морфолино), 1,93 (пентет, 1=6,5 Гц, 2Н, Н-2 пропокси).

Стадия С. 6-Амино-4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7-[3-(4-морфолино)пропокси]хиназолин.

Раствор 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7[3-(4-морфолино)пропокси]-6-нитрохиназолина (62,9 г, 136,2 ммоль) в тетрагидрофуране (ТГФ) (1200 мл) гидрировали над никелем Ренея (20 г) при давлении 50 ρκί (фунтов на кв.дюйм) и температуре 23°С в течение 17,67 ч. Затем добавили никель Ренея (20 г) и смесь гидрировали еще 4,33 ч в тех же самых условиях. Реакционную смесь фильтровали через целит, растворитель отгоняли при пониженном давлении, получили 6-амино-4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7-[3-(4морфолино)пропокси]хиназолин (57,81 г, 97,6% уточненный) в виде твердого вещества бледнозеленоватого цвета.

¹Н ЯМР (ДМСО-б₆): δ 9,40 (с, 1Н, ΝΗ),

8,38 (с, 1Н, Н-2), 8,20 (дд, 1=2,5, 7,0 Гц, 1Н, Н2'), 7,79 (ддд, 1=2,5, 4,5, 9,0 Гц, 1Н, Н-6'), 7,40 (с, 1Н, Н-5), 7,40 (т, 1=9,1 Гц, 1Н, Н-5'), 7,08 (с, 1Н, Н-8), 5,38 (ушир.с, ΝΗ₂), 4,19 (т, 1=6,1 Гц, АгОСН₂), 3,58 (т, 1=4,4 Гц, 4Н, Н-2 морфолино),

2,49 (т, 1=7,0 Гц, 2Н, ΝΟΗ₂), 2,36 (ушир.с, 4Н, Н-3 морфолино), 1,97 (пентет, 1=6,5 Гц, 2Н, Н-2 пропокси).

Стадия Ό. №[4-(3-Хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6ил]акриламид.

Изобутилхлорформиат (27,2 г, 0,20 моль) добавляли по каплям в течение 10 мин к раствору акриловой кислоты (14,4 г, 0,20 моль) и триэтиламина (40,48 г, 0,40 моль) в ТГФ (800 мл) при перемешивании в токе азота при 0°С. Через 10 мин белую кашицу доводили на охлаждающей бане до температуры -25°С и перемешивали в токе азота в течение 20 мин. По каплям в течение 1,33 ч добавляли 6-амино-4-[(3-хлор-4фторфенил)амино]-7-[3-(4-морфолино)пропокси]хиназолин (43,19 г, 0,100 моль) в ТГФ (500 мл). Охлаждающая баня была отрегулирована на температуру -20°С, и через 2,33 ч реакционную смесь гасили добавлением воды (100 мл) за один прием. Через 20 мин реакционную смесь выливали на раздробленный лед (2 кг) и постепенно разбавляли водой (5 л). Смесь отстаивали 16 ч и фильтровали на воронке Бюхнера. Осадок промывали водой (2x1 л), сушили на воздухе в течение 18 ч, затем в вакуумном сушильном шкафу над Р₂О₅ при 60°С в течение 16 ч, получили сырой №[4-(3-хлор-4-фторфенил) амино]-7-[3-(4-морфолино)пропокси]хиназолин6-ил]акриламид (35,76 г, 73% не уточненный) в виде твердого зеленовато-желтого вещества. Из маточника затем выпадал осадок, который отфильтровывали на воронке Бюхнера, промывали водой (1 л) и сушили на воздухе в течение 14 ч, получили сырой продукт (4,73 г, 10% не уточненный) в виде твердого зеленовато-желтого вещества. Перекристаллизацией этого вещества из ДМСО извлекли 55% его в виде неполного гидрата цвета бледно-желтого и хаки, т. пл. 186,5-188,5°С.

Вычислено для С₂₄Н₂5Н₅ОзС1Г · 0,85 Н₂О: С, 57,61; Н, 5,37; Ν, 13,97%.

Найдено: С, 57,51; Н, 5,26; Ν, 13,88%.

Ή ЯМР (ДМСО-б₆): δ 9,81 (с, 1Н, ΝΗ), 9,63 (с, 1Н, ΝΗ), 8,87 (с, 1Н. Н-5), 8,54 (с, 1Н, Н2), 8,15 (дд, 1=2,5, 7,0 Гц, 1Н, Н-2'), 7,81 (ддд, 1=2,7, 4,4, 9,0 Гц, 1Н, Н-6'), 7,43 (т, 1=9,1 Гц, 1Н, Н-5'), 7,30 (с, 1Н, Н-8), 6,72 (дд, 1=10,1, 17,0 Гц, 1Н, Н-2 акрилоил), 6,32 (дд, 1=9,0, 17,0 Гц, 1Н, Н-3 акрилоил), 5,83 (дд, 1=1,9, 10,1 Гц, 1Н, Н-3 акрилоил), 4,27 (т, 1=6,2 Гц, АгОСН₂), 3,58 (т, 1=4,4 Гц, 4Н, Н-2 морфолино), 2,48 (т, 1=7,1 Гц, 2Н, ΝΟΠ₂), 2,36 (ушир.с, 4Н, Н-3 морфолино), 2,00 (пентет, 1=6,5 Гц, 2Н, Н-2 пропокси).

Масс-спектр АРС1 489,2 (9), 488,2 (35), 487,2 (26), 486,2 (100).

Соединение примера 21 заявки РСТ номер РСТ/ϋδ 97/05778 может быть синтезировано следующим образом.

Пример 21. №[4-[(3-Бромфенил)амино]-7[3-(4-морфолино)пропокси]хиназолин-6-ил] акриламид.

Металлический натрий (27,6 ммоль, 0,63 г) добавили к раствору 3-морфолинопропан-1-ола (22,0 ммоль, 3,20 г) в ТГФ (60 мл) в токе Ν₂. Полученную суспензию перемешивали при 20°С в течение 2 ч и затем с помощью катетера вводили в раствор 4-[(3-бромфенил)амино]-7фтор-6-нитрохиназолина (1. Меб. Сйст..

1996(36):918) (2,0 г, 5,51 ммоль) в ТГФ (50 мл) в токе азота. Раствор затем кипятили с обратным холодильником в течение 24 ч, затем разбавляли водой и экстрагировали ЕЮАс. Объединенные органические экстракты сушили над безводным №₂8О₄, концентрировали при пониженном давлении и хроматографировали на оксиде алюминия, меняя элюент с ЕЮ Ас/гексан (1:1) на МеОН/СН₂С1₂/ЕЮАс (2:3:5), получили 4-[(3бромфенил)амино]-7-[(3-морфолино)пропилокси]-6-нитрохиназолин (1,75 г, 65%) в виде желтого порошка, т.пл. (МеОН) 216-220°С.

'Н ЯМР [(СП₃)₂8О]: δ 10,12 (с, 1Н, ΝΗ), 9,24 (с, 1Н, ароматический) 8,69 (с, 1Н, ароматический), 8,19 (т, 1=1,8 Гц, 1Н, Н-2'), 7,88 (дт, 1_Д=7,8 Гц, 1_Т=1,4 Гц, 1Н, Н-6'), 7,49 (с, 1Н, ароматический), 7,38 (т, 1=8,0 Гц, 1Н, Н-5'), 7,34 (дт, 1_Д=8,1 Гц, Д_Т=1,4 Гц, 1Н, Н-4'), 4,35 (т, 1= 6,2 Гц, 2Н, СН₂СН₂СН₂О), 3,58 (т, 1=4,6 Гц, 4Н, метилен морфолина), 2,45 (т, 1=7,0 Гц, 2Н, №Η^Η^Η₂), 2,37 (ушир. с, 4Н, метилен морфолина), 1,94 (квинтет, 1=6,6 Гц, 2Н,

СН2СН2СН2).

¹³С ЯМР: δ 157,76, 157,26, 153,76, 153,21, 140,32, 138,86, 130,37, 126,38, 124,26, 121,70, 121,13, 120,72, 110,11, 107,88, 67,87, 66,13 (х2), 54,42, 53,28 (х2), 25,30.

Вычислено для ^Η₂₂ΒγΝ₅Ο₄ · 0,75 Н₂О: С, 50,3; Н, 4,7; Ν, 14,0%.

Найдено: С, 50,3; Н, 4,4; Ν, 13,8%.

Свежепромытый (1Н ИСТ затем дистиллированной водой) порошок железа (12 ммоль, 0,686 г) добавили порциями в кипящий раствор вышеописанного нитрохиназолина (1,50 г, 3,07 ммоль) в ЕЮН/Н₂О (2:1, 80 мл), содержащий ледяную уксусную кислоту (2,0 мл). Полученную суспензию нагревали до кипения при энергичном перемешивании в течение 20 мин, затем охлаждали, подщелачивали добавлением концентрированного ΝΗ3 и фильтровали через слой целита. Слой целита промывали ΕΐΟΗ, фильтрат концентрировали при пониженном давлении, разбавляли водой и экстрагировали ЕЮ Ас. Объединенные органические экстракты сушили над безводным Να_;8Ο.·|. концентрировали при пониженном давлении и хроматографировали на оксиде алюминия класса III, меняя элюент с СН₂С1₂/Е!ОАс (1:1) на МеОН/ЕЮАс (2:98), получили 6-амино-4-[(3 -бромфенил)амино] -7-[(3морфолино)пропилокси]хиназолин (1,08 г, 77%) в виде бледно-коричневого порошка, т. пл. (ЕЮАс/гексан) 158-160°С.

¹Н ЯМР [(СИ₃)₂8О], (400 МГц): δ 9,37 (с, 1Н, ΝΗ), 8,40 (с, 1Н, ароматический), 8,24 (т, 1=

1,9 Гц, 1Н, Н-2'), 7,86 (ддд, 1=8,2, 0,8, 1,8 Гц, 1Н, Н-6'), 7,42 (с, 1Н, ароматический), 7,30 (т, 1=8,1 Гц, 1Η, Н-5'), 7,21 (ддд, 1=8,2, 1,0, 1,9 Гц, 1Н, Н4'), 7,09 (с, 1Н, ароматический), 5.36 (с, 2Н, ΝΗ₂), 4,20 (т, 1=6.2 Гц, 2Н, СН₂СН₂СН₂О), 3,59 (т, 1=4,6 Гц, 4Н, метилен морфолина), 2,50 (т, 1= 7,3 Гц, 2Н, ΝΟΗ₂ΟΗ₂ΟΗ₂), 2,39 (ушир. с, 4Н, метилен морфолина), 1,99 (квинтет, 1=6,7 Гц, 2Н, СН2СН2СН2).

¹³С ЯМР: δ 154,88, 151,94, 150,19, 144,84, 141,94, 138,50, 130,16. 124,66, 123,02, 121,09, 119,65, 110,42, 106,37, 100,81, 66,45, 66,14 (х2), 54,77, 53,29 (х2), 25,50.

Вычислено для 0₂ιΗ₂₄ΒτΝ₅Ο₂ · 0,25 Н₂О: С, 54,5; Н, 5,3; Ν, 15,1%.

Найдено: С, 54,6; Н, 5,5; Ν, 15,0%.

К перемешиваемому раствору вышеописанного 6-аминохиназолина (0,5 г, 1,09 ммоль), акриловой кислоты (6 моль, 6,54 ммоль, 449 мкл) и Εΐ₃Ν (избыток, 2,0 мл) в ДМФ (20 мл) в токе азота добавили гидрохлорид 1-(3диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (ЕИС1 · НС1) (3 моль, 3,27 ммоль, 627 мг). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 15 мин, затем доводили до комнатной температуры и перемешивали еще 2 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученный остаток разбавляли насыщенным №НСО₃ и неоднократно экстрагировали ЕЮ Ас. Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором, сушили над безводным №ь8О₄ и концентрировали при пониженном давлении. Хроматографировали на оксиде алюминия класса III, меняя элюент с ЕЮАс/гексан (9:1) на МеОН/ЕЮАс (2:98), получили Ν- [4-[(3 -бромфенил)амино] -7-[(3 -морфолино)пропилокси)хиназолин-6-ил]акриламид (329 мг, 59%) в виде порошка кремового цвета, т.пл. (ЕЮАс/Е1₂О/гексан) 170-172°С.

Ή ЯМР [(СИ₃)₂8О]: δ 9,78 (с, 1Н, СОМН), 9,62 (с, 1Н, ΝΗ), 8,89 (с, 1Н, ароматический), 8,56 (с, 1Н, ароматический), 8,18 (т, 1=1,9 Гц, 1Н, Н-2'), 7,88 (ушир.д, 1=8,2, Гц, 1Н, Н-6'), 7,34 (т, 1=8,1 Гц, 1Н, Н-5'), 7,30 (с, 1Н, ароматический), 7,27 (ддд, 1=7,9, 1,4, 0,8 Гц, 1Н, Н-4'), 6,72 (дд, 1=17,0, 10,2 Гц, 1Н, СН₂СНСО), 6,33 (дд, 1= 17,0, 1,9 Гц, 1Н, СН₂СНСО), 5,83 (дд, 1=10,2, 1,9 Гц, 1Н, СН₂СНСО), 4,27 (т, 1=6,3 Гц, 2Н, СН₂СН₂СН₂О), 3,58 (т, 1=4,6 Гц, 4Н, метилен морфолина), 2,48 (т, 1=7,1 Гц, 2Н,

МСН₂СН₂СН₂), 2,38 (ушир. с, 4Н, метилен морфолина), 1,99 (квинтет, 1=6,7 Гц, 2Н,

СН2СН2СН2).

¹³С ЯМР: δ 163,49, 156,68, 154,96, 153,92,

149,19, 141,20, 131,58, 130,19, 127,16, 126,95,

125,52, 123,97, 121,03, 120,52, 116,78, 108,80, 107,28, 66,96, 66,14 (х2), 54,54, 53,28 (х2), 25,31.

Вычислено для С₂₄Н₂₆ВгМ₅О₃ · 0,5 Н₂О: С, 55,3; Н, 5,2; Ν, 13,4%.

Найдено: С, 55,3; Н, 4,9; Ν, 13,3%.

Сравнительные исследования

Культура ткани.

Клетки человеческого плоскоклеточного рака А431 и клетки ΜΌΑ-ΜΒ-453 были получены из Американской Коллекции Типовых Культур (Атепсап Туре СиЙите Со11есйоп, ВоскуШ, ΜΌ) и хранились в виде монослоев в 6ΜΕΜ (модифицированная питательная среда

Ии1Ьессо)/Е12, 50:50 (О1Ьсо/ВВ1, ВеШекба, ΜΌ), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки выращивали при температуре 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей в воздухе 5% СО₂.

Очистка эпидермального фактора роста рецептора тирозинкиназы.

Человеческий ЕОЕ рецептора тирозинкиназы (ЕОЕВ) выделяли из клеток человеческого плоскоклеточного рака А431 следующим способом. Клетки выращивали в среде άΜΕΜ/Ρ12 (С|Ьсо/ВРЕ Ве1ек6а, ΜΌ), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Примерно 10⁹ клеток лизировали в 2 объемах буфера, содержащего 20 мМ Нерек, рН 7,4, 5 мМ ЕОТА, 1% Ттйоп Х-100, 10% глицерина, 0,1 мМ ортованадата натрия, 5 мМ фторида натрия, 4 мМ пирофосфата, 4 мМ бензамида, 1 мМ ИТТ, 80 мкг/мл апротинина, 40 мкг/мл леупептина и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ΡΜ8Ε). После центрифугирования при 25000 х д в течение 10 мин, надосадочную жидкость перенесли в колонку с «быстрой» О сефарозой (Рйатташа Вю1есй., Шс., Р1кса1а^ау, N1) и элюировали с линейным градиентом от 0,1 до 0,4 М МаС1 в 50 мМ Нерек, 10% глицерина, рН 7,4. Активные фракции энзимов объединяли, разделяли на аликвоты и хранили при температуре -100°С. Фибробластный фактор роста рецептора (РОЕВ), тромбоцитарный фактор роста (ΡΌΟΓ), инсулин и с-кгс тирозинкиназы были получены методами, хорошо известными для специалистов в данной области. Например, см. Егу, е! а1., «81та1ед1ек Рог Тйе И1ксоуету ОГ Моуе1 Тутокте Шпаке [пЫЬйогк \νί11ι Апйсапсет Асйуйу, Апйсапсег Итид Иеыдп, 1994; 9:331-351, которая включена здесь в виде ссылки.

Исследования тирозинкиназы.

Исследования энзима для определений Κ.’₅₀проводили в 96-луночных фильтровальных планшетах ^(Шроте ΜΑ^VN6550, Μ^II^ро^е. ВебГотб, ΜΑ). Общий объем был 0,1 мл и со держал 20 мМ Нсрс5. рН 7,4, 50 мкМ ванадата натрия, 40 мМ хлорида магния, 10 мкМ АТР, содержащей 0,5 мкКи [³²Р]АТР, 20 мкг полиглутаминовой кислоты/тирозина (81дта Сйет1еа1 Со., 81.Бош5, МО), 10 нг БОР рецептора тирозинкиназы и подходящий разбавитель для ингибитора. Все компоненты, за исключением АТР, добавляли в лунки и планшет инкубировали при встряхивании в течение 10 мин при 25°С. Реакцию начинали путем добавления [³²Р]АТР, и планшет инкубировали при 25°С в течение 10 мин. Реакцию завершали добавлением 0,1 мл 20% трихлоруксусной кислоты (ТСА). Планшет выдерживали при 4°С, по меньшей мере, в течение 15 мин, до выпадения субстрата в осадок. Лунки затем 5 раз промывали 0,2 мл 10% ТСА и введение ³²Р определяли бета-счетчиком \Уа11ае. Исследования с использованием доменов внутриклеточных киназ ΡΌΟΡ, РОР, инсулиновых рецепторов, а также и с-8гс, проводили так же, как описано для БОР рецептора, за исключением того, что в реакцию вводили 10 мМ хлорида магния.

Исследования ЕОР- и Негедийп-зависимого фосфорилирования тирозина.

Клетки человеческого плоскоклеточного рака А431 или клетки ΜΌΑ-ΜΒ-453 выращивали в 6-луночных планшетах примерно до 80% слияния и затем инкубировали в среде без сыворотки в течение 18 ч. Клетки подвергали воздействию различных концентраций либо соединения I, либо соединения примера 21 в течение 2 ч, а затем стимулировали либо 100 нг/мл ЕОР (А431), либо 10 нг/мл герегулина (ΜΌΑ-ΜΒ453) в течение 5 мин. Получали экстракты клеток и снижение фосфотирозина определяли методом вестерн-блоттинга.

Метод вестерн-блоттинга.

Экстракты получали лизированием монослоев в 0,2 мл кипящего буфера Лаемли (2% додецилсульфата натрия, 5% бетамеркаптоэтанола, 10% глицерина и 50 мМ Трис, рН 6,8) и затем лизаты нагревали до 100°С в течение 5 мин. Белки из лизата отделяли электрофорезом в полиакриламидном геле и электрофоретически переносили на нитроцеллюлозу. Мембрану промывали один раз [10 мМ Трис, рН 7,2, 150 мл ИаС1, 0,01% азида натрия] (ΤΝΑ) и оставляли на ночь в ΤΝΑ, содержащем 5% бычьего сывороточного альбумина и 1% яичного альбумина. Мембрану блотировали в течение 2 ч с антителом антифосфотирозина (ИВ1, Баке Р1ас1б, ΝΥ, 1 мкг/мл в блокирующем буфере) и затем дважды промывали ΤΝΑ, один раз ΤΝΑ, содержащим 0,05 Твин-20 и 0,05% погибе! Р-40, и дважды ΤΝΑ. Мембраны затем инкубировали в течение 2 ч в блокирующем буфере, содержащем 0,1 мкКи/мл [¹²⁵1] протеина А, и затем вновь промывали, как описано выше. После чего блоттинги высушивали, загружали в пленочную кассету и подвергали пленки воздействию Х-АК рентгеновских лучей в течение 1-7 дней. Диапа зон интенсивности определяли лазерным денситометром.

Данные табл. 1 показывают, что пример 21 и соединение I имели примерно одинаковую активность по отношению к очищенному ЕОР рецептору тирозинкиназы, ЕОР-опосредованному рецептору аутофосфорилирования и Негедийп-опосредованному фосфорилированию тирозина ίη νίΐτο.

Таблица 1

Соединение	ЕОР рецептор тирозинкиназы ГС50, нМ	ЕОР-опосредованный рецептор аутофосфорилирования ГС50, нЫ	НегедиНпопосредованное фосфорилирование тирозина ГС50, нМ
Пример 21	3,6	5,3	6,4
Соединение I	2,0	2,9	9,0

Исследование ингибирования опухоли ΐη νίνο

Человеческий плоскоклеточный рак А431 был размножен ίη νίνο серийной трансплантацией. Такая модель опухоли была выбрана для этих исследований из-за известной зависимости ее роста от ЕОР рецептора и ее чувствительности на ранней стадии к терапии моноклональным антителом ίη νίνο. В этом эксперименте голым мышам, весящим 18-22 г, имплантировали подкожно 30 мг фрагмента опухоли А431 в область правой подмышечной впадины в день 0. Опухолям позволяли вырасти до массы 100-150 мг, в это время животных - носителей опухоли рандомизировали и распределяли по обработанным клеткам. Животных обрабатывали перорально в течение 15 последовательных дней изотионатными солями примера 21 и соединения I в воде. Изотионатные соли могут быть получены титрованием соединений в растворе 2 экв. изотионовой кислоты. Обработка была основана на усредненном весе группы. Контрольные животные получали воду. Оценка по эксперименту основана на задержке роста опухоли, Т-С, определенной как разница, в днях, за которые леченная и контрольная опухоли достигали оценочного размера 750 мг. Данные могут быть также представлены в виде процента ингибирования роста опухоли, определенного как задержка роста опухоли, разделенная на время лечения, принятое за 100%. Более значительные задержка роста опухоли и значение ингибирования роста опухоли указывают на более высокую активность соединений. Статистические исследования были проведены с использованием 1ΜΡ £ог Μηοίηίοδίι (8А8 1п81йи1е, 1пс., Сагу, ΝΟ.

Испытуемое соединение	Доза, мг/кг	Задержка роста опухоли, дни	Ингибирование роста опухоли, %
Пример 21	18	18,4	123
Пример 21	5	25,7	171
Соединение I	18	41,3	275
Соединение I	5	53,2	355

Значения для соединения I существенно отличаются от значений для примера 21 и основаны на времени, требуемом для того, чтобы каждая опухоль достигла 750 мг, р<0,05, 1-тест Стьюдента.

Исследования секреции УЕСЕ

Васкулярный эндотелиальный фактор роста (УЕСЕ), который также известен как фактор васкулярной проницаемости (УРЕ), считают главным стимулятором ангиогенеза для большинства видов рака. Существует много индукторов секреции УЕСЕ опухоли и два наиболее мощных - это эпидермальный фактор роста (ЕСЕ) и трансформирующий фактор роста альфа, при этом оба являются лигандами для ЕСЕ рецептора (ЕСЕК).

Ингибирование секреции УЕСЕ приводит к антиангиогенному эффекту и может привести к уменьшению опухоли, так как даже частичное ингибирование секреции УЕСЕ может привести к деструкции вновь сформированных незрелых кровеносных сосудов в опухолях (Вещатш Ь.Е. апб Кекбе1 Е., Сопбйюпа1 кмйеЫид оГ УЕСЕ ехргекЦоп ΐη 1итога: ίάυοίίοη οί епбо1беба1 се11 кбеббшд апб геще^юп оГ бетапдюЫайота-бке уе55е15 Ьу УЕСЕ мбйббгама1. Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 1997; 94:8761-8766).

Мы сравнили два ингибитора ЕСЕК тирозинкиназы, соединение I и пример 21, по их эффективности в отношении опухолевых клеток А431. По отношению к опухолям А431 ш у|уо соединение I неожиданно вызвало более значительную противоопухолевую реакцию (Т-С = 53 дня), чем пример 21 (Т-С = 26 дней). Смотрите результаты, изложенные выше. Далее мы проверяли влияние обоих соединений на секрецию УЕСЕ на А431. Неожиданно соединение I превзошло пример 21 в ингибировании секреции УЕСЕ из клеток А431 ш уйто. 0,5 мкМ соединения I блокировали секрецию УЕСЕ, стимулированную ЕСЕ или ТСЕ-α. В отличие от него, 0,5 мкМ примера 21 ингибировали секрецию УЕСЕ почти на том же самом уровне, какой наблюдали для 0,1 мкМ соединения I. 0,1 мкМ соединения I ингибировали ЕСЕ-стимулированную секрецию УЕСЕ на 63% и 0,5 мкМ ингибировали на 86%. В отличие от него, 0,1 мкМ примера 21 ингибировали ЕСЕ-стимулированную секрецию УЕСЕ на 48% и 0,5 мкМ примера 21 ингибировали ЕСЕ-стимулированную секрецию УЕСЕ на 57%. Похожие результаты были получены при использовании для стимуляции секреции УЕСЕ ТСЕ-α вместо ЕСЕ. 0,5 мкМ соединения I ингибировали стимулированную ТСЕ -α секрецию УЕСЕ более чем на 80%, в то время как та же концентрация примера 21 ингибировала секрецию УЕСЕ на 57%. Соединение I также проявило способность ингибировать основной уровень секреции УЕСЕ из клеток А431, в то время как пример 21 был неэффективным.

Методики.

Клетки человеческого плоскоклеточного рака А431, полученные из Американской Коллекции Типовых Культур (КоскуШе, МО), культивировали в среде Ои1Ьессо'§ МЕМ/Е12 (ОМЕМ/Е12), пополненной 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Перед обработкой лекарством и фактором роста клетки промывали три раза ОМЕМ/Е12 без сыворотки. Клетки в течение 2 ч подвергали воздействию соединения I или примера 21 с указанной концентрацией, после чего добавляли 10 нг/мл либо ЕСЕ, либо ТСЕ -α. После 48 ч инкубации при 37°С, среду удаляли и хранили замороженный продукт при 70°С. Исследования УЕСЕ ЕМ8А Цйетдеп, Со., Ригсбаке, ΝΥ) проводили на образцах сред, следуя заводским инструкциям. Результаты этого исследования приведены ниже в табличной форме.

Обработка	Секреция УЕСЕ (пг/10⁵ клеток ± 8Е)	Процент ингибирования
Среда без сыворотки (8Е)	490±32
8Е+0,1 мкМ соединения I	280±41	43
8Е+0,5 мкМ соединения I	250±46	49
8Е+0,1 мкМ пример 21	600±37	0
8Е+0,5 мкМ пример 21	440±110	10
8Е+10 нг/мл ЕОЕ	3980±85
8Е+ЕОЕ+0,1 мкМ соединения I	1490±170	63
8Е+ЕСЕ+0,5 мкМ соединения I	560±29	86
8Е+ЕСЕ+0,1 мкМ пример 21	2070±160	48
8Е+ЕСЕ+0,5 мкМ пример 21	1710±65	57
8Е+ТОЕ-а	4034±190
8Е+ТСЕ+0,1 мкМ соединения I	1976±37	51
8Е+ТСЕ+0,5 мкМ соединения I	766±75	81
8Е+ТСЕ+0,1 мкМ пример 21	3065±161	24
8Е+ТСЕ+0,5 мкМ пример 21	1734±21	57

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение №[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил] акриламид или его фармацевтически приемлемые соли.
2. Фармацевтически приемлемая композиция, включающая соединение по п.1.
3. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, имеющему рак, терапевтически эффективного количества соединения по п.1.
4. Способ по п.3, где рак является раком ободочной кишки.
5. Способ лечения или предупреждения рестеноза или атеросклероза, включающий введение пациенту, имеющему рестеноз или атеро23 склероз или риск возникновения рестеноза или атеросклероза, терапевтически эффективного количества соединения по п.1.
6. Способ необратимого ингибирования тирозинкиназ, включающий введение пациенту, нуждающемуся в ингибировании тирозинкиназ, ингибирующего количества соединения по п.1.
7. Способ по п.6, где тирозинкиназа представляет собой ЕСЕК, егЬВ2, етЬВ4.
8. Способ ингибирования фосфорилирования тирозина егЬВЗ или секреции УЕСЕ, вклю чающий введение пациенту, нуждающемуся в ингибировании фосфорилирования тирозина егЬВЗ или секреции УЕСЕ, терапевтически эффективного количества соединения по п.1.
9. Способ лечения псориаза или эндометриоза, включающий введение пациенту, имеющему псориаз или эндометриоз, терапевтически эффективного количества соединения по п.1.