KR20120103587A

KR20120103587A - 수상돌기 소극 밀도를 증진시키는 방법

Info

Publication number: KR20120103587A
Application number: KR1020127012195A
Authority: KR
Inventors: 다라 와이. 칼로프; 아나톨리 니콜라에브; 마크 테시어-라빈; 로비 웨이머
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2009-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2012-09-19
Also published as: US20110110942A1; JP2013510871A; RU2012124093A; BR112012009997A2; TW201121570A; WO2011060246A2; MX2012005464A; CN102612374A; WO2011060246A3; EP2498817A2; AR078986A1; CA2780319A1

Abstract

본 발명은 인지를 유지 또는 개선시키고, 감소된 수상돌기 소극 형태와 관련된 장애 및 정신 장애, 예컨대 중독 및 정신분열증, 또는 인지 손상과 관련된 장애, 예컨대 자폐증, 레트 증후군, 투렛 증후군, 및 취약성-X 증후군을 치료하기 위한 수단으로서 수상돌기 소극의 밀도를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

수상돌기 소극 밀도를 증진시키는 방법 {A METHOD OF PROMOTING DENDRITIC SPINE DENSITY}

<관련 출원에 대한 상호 참조>

본 출원은 2009년 11월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 61/260,815 및 2010년 1월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 61/294,020 (이들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 우선권 주장한다.

<발명의 분야>

본 발명은 뉴런에서 수상돌기 소극 밀도를 증진시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 DR6 및/또는 p75의 억제에 의한 시냅스의 증가 및 인지 장애의 치료 방법에 관한 것이다.

DR6 수용체 (또한, 문헌에서는 "TR9"라고 지칭되기도 함; 문헌에서는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 21 또는 TNFRSF21이라고도 공지되어 있음)라고 불리는 TNFR 패밀리 구성원은 4개의 세포외 시스테인-풍부 모티프 및 세포질 사멸 도메인 구조를 갖는 유형 I 막횡단 수용체로서 기재되었다 (문헌 [Pan et al., FEBS Lett., 431:351-356 (1998)], 또한, 미국 특허 6,358,508; 6,667,390; 6,919,078; 6,949,358 참조). 특정의 형질감염된 세포주에서 DR6이 과다발현되면 NF-kB 및 JNK 둘 다의 아폽토시스 및 활성화가 유도된다고 보고되었다 (문헌 [Pan et al., FEBS Letters, 431:351-356 (1998)]).

DR6-결여 마우스 모델에서, T 세포는 실질적으로 JNK 활성화에 손상이 있었고, DR6(^-/-) 마우스에게 단백질 항원을 시험투여한 경우에는 이것의 T 세포가 과다증식하고 Th2 반응에 대해 고도의 편향성을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (반면 Th1 분화는 동등하게 영향을 받지 않았음) (문헌 [Zhao et al., J. Exp. Med., 194:1441-1448 (2001)]). 추가로, DR6의 표적화된 파괴는 시험관내 T 헬퍼 2 (Th2) 분화를 증진시키는 것으로 보고되었다 (문헌 [Zhao et al., 상기 문헌]). B-세포 매개 상태의 조절에 있어서 DR6 효능제 또는 길항제의 다양한 용도가 2005년 3월 31일에 공개된 US 2005/0069540에 기재되었다. DR6 수용체는 천식의 OVA-유도 마우스 모델에서 기도 염증의 조절에 있어서 소정의 역할을 할 수 있다 (문헌 [Venkataraman et al., Immunol. Lett., 106:42-47 (2006)]). 실험적 자가면역 뇌척수염의 미엘린 핍지교세포 당단백질 (MOG(35-55))-유도 모델을 사용하여, DR6^-/- 마우스가 야생형 (WT)의 자손에 비해 CNS 질환의 발병 및 진행 둘 다에서 높은 내성이 있음이 밝혀졌다. 따라서, DR6은 백혈구 침윤의 조절에 관여할 수 있고, 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 진행에서 기능할 수 있다 (문헌 [Schmidt et al., J. Immunol., 175:2286-2292 (2005)]).

다양한 TNF 리간드 및 수용체 패밀리 구성원이 다양한 생물학적 활성 및 특성을 갖는 것으로 확인되었지만, 이러한 리간드 및 수용체 중에서 신경계-관련 기능에 관여하는 것으로 보고된 것은 거의 없다. 예를 들어, 2004년 8월 26일에 공개된 WO2004/071528에는 뮤린 모델에서 CD95 (Fas) 리간드/수용체 복합체를 억제하여 척수 손상을 치료하는 것이 기재되어 있다. 최근에, 니콜라에브(Nikolaev) 등은 APP의 N-말단 단편이 DR6에 대한 리간드라는 것을 보여주었다 (문헌 [Nilolaev et al. (2009) Nature 457:981-989)]).

신경 세포는 시냅스에서 서로 소통하고, 이는 수상돌기 상의 "수상돌기 소극"에서 일어난다. 수상돌기 소극은 수상돌기로부터 돌출되고, (일반적으로) 축삭의 단일 시냅스와 접촉하고 있는 수상돌기의 막 영역이다. 단일 수상돌기 상에 수천개의 소극이 존재할 수 있다. 소극은 축삭으로부터 흥분성 및 억제성 입력을 둘 다 수용하지만, 흥분성 입력이 보다 더 흔하다. 시냅스후 밀도 영역 (PSD)으로 지칭되는 전자 밀집 영역이 수상돌기 소극의 끝 부분 근처에 있다. 이 영역 내에는 PSD에 대한 마커인 PSD-95로 불리는 구조 단백질이 있다. 소극은 글루타메이트 수용체 (예를 들어, AMPA 및 NMDA 수용체)에 풍부하다. 다른 수용체, 예컨대 TrkB 수용체는 소극 생존에서 일부 역할을 수행할 것으로 여겨진다.

화학적 시냅스는 뉴런을 연결하여 정보를 처리 및 저장할 수 있는 기능 회로를 형성한다. 이러한 연결의 적절한 기능 또는 안정성의 손실은 수많은 정신 질환 및 신경변성 질환의 근본적 원인일 것으로 생각된다.

<발명의 개요>

본 발명은 인지 또는 정신 장애를 갖는 환자에게 유효량의 DR6 억제제 및/또는 p75 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 수상돌기 소극의 밀도를 증가시키는 방법을 제공한다. 억제제는 예를 들어 DR6의 에피토프에 결합하여 DR6의 기능을 억제하는 항체, 또는 p75의 에피토프에 결합하여 p75의 기능을 억제하는 항체일 수 있다. 억제성 항-DR6 항체의 예는 3F4.4.8, 4B6.9.7, 1E5.5.7, 및 그의 항원-결합 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이와 같이, 항체는 키메라 또는 인간화 항체, 예컨대 예를 들어 키메라 또는 인간화 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7, 또는 3F4.4.8, 4B6.9.7, 또는 1E5.5.7과 동일한 에피토프에 결합하는 항체일 수 있다. DR6의 억제제는 뉴런에서 DR6 신호전달을 감소시키거나 또는 방지한다.

본 발명은 또한 수상돌기 소극의 감소와 관련된 인지 또는 정신 장애를 갖는 환자를 확인하는 것 및 환자에게 치료 유효량의 DR6 길항제 및/또는 p75 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 인지 또는 정신 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 인지 또는 정신 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 정신 또는 인지 장애는 예를 들어 레트 증후군, 투렛 증후군, 자폐증, 정신분열증, 또는 취약성-X 정신 지체일 수 있다. 억제제는 예를 들어 DR6의 에피토프에 결합하여 DR6의 기능을 억제하는 항체, 및/또는 p75의 에피토프에 결합하여 p75의 기능을 억제하는 항체일 수 있다. 항체는 예를 들어 3F4.4.8, 4B6.9.7, 1E5.5.7, 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 항체는 키메라 또는 인간화 항체, 예컨대 예를 들어 키메라 또는 인간화 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7, 또는 3F4.4.8, 4B6.9.7, 또는 1E5.5.7과 동일한 에피토프에 결합하는 항체일 수 있다.

본 발명은 또한 대상체에서 수상돌기 소극의 밀도를 증진시키는데 효과적인 양의 DR6 및/또는 p75 억제제를 대상체에게 투여하여 상기 대상체에서 인지를 유지하는 것을 포함하는, 노화 과정 동안 대상체에서 인지를 유지하는 방법을 제공한다. 억제제는 예를 들어 DR6의 에피토프에 결합하여 DR6의 기능을 억제하는 항체, 및/또는 p75의 에피토프에 결합하여 p75의 기능을 억제하는 항체일 수 있다. 항체는 예를 들어 3F4.4.8, 4B6.9.7, 1E5.5.7, 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 항체는 키메라 또는 인간화 항체, 예컨대 예를 들어 키메라 또는 인간화 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7, 또는 3F4.4.8, 4B6.9.7, 또는 1E5.5.7과 동일한 에피토프에 결합하는 항체일 수 있다.

따라서, 본 발명은 수상돌기 소극 밀도를 증가시키고, 감소된 수상돌기 소극 밀도와 관련된 인지 또는 정신 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 DR6 길항제 및/또는 p75 길항제의 용도를 제공한다.

도 1은 자궁내 전기천공에 의한 피질 층 2/3 흥분성 뉴런의 표적화된 표지를 보여준다. 패널 A: 수태 중인 마우스로부터의 E16 배아를 노출시키고, 약 1 ㎕의 DNA를 우측 뇌실에 주사하고, 전위를 적용하였다; 패널 B: 층 2/3 흥분성 뉴런 세포체 및 이들의 과정은 조직학에 의해 보여질 수 있다. 뉴런을 디에스레드익스프레스(DsRedExpress) 및 PSD-95-paGFP와 공동-표지하였다; 패널 C: 이식된 두개창; 패널 D: 두개창을 통한 광자 현미경 영상 (제14일 및 제44일).
도 2는 대조군 동물과 비교하여 생후 60일된 DR6^-/- 동물에서 증가된 수상돌기 소극의 밀도 및 폭을 보여준다 (패널 A). 밀도는 동일한 군 내의 모든 동물에 걸쳐 세포당 소극의 전체 개수/수상돌기 길이의 평균을 구하여 계산하였다. DR6^+/-의 경우 26개 세포/7마리 동물 및 DR6^+/+의 경우 26개 세포/6마리 동물과 비교하여 DR6^-/-의 경우 총 28개 세포/8마리 동물에 대해 주석을 달았다 (패널 B). 소극 폭 및 길이를 유전자형당 분석된 소극의 전체 집단의 누적 플롯으로 플롯팅하였다 (패널 C).
도 3은 0 ㎍/ml N-APP (대조군) (패널 A 및 B); 1 ㎍/ml N-APP (패널 C); 3 ㎍/ml N-APP (패널 D); 10 ㎍/ml N-APP (패널 E); 및 30 ㎍/ml N-APP (패널 F)로의 처리 후 배양물에서의 E16 피질 뉴런을 보여준다.
도 4는 1, 3, 10, 및 30 ㎍/ml N-APP로의 처리의 결과 (대조군과 비교)로서 PSD95 반점의 감소를 보여준다.
도 5는 PSD95 반점 밀도의 N-APP-유도된 감소가 DR6 기능에 의존성이라는 것을 보여준다. 0.1, 0.3, 1.0, 또는 3.0 ㎍/ml N-APP (산성 테일 없음) 또는 전장 N-APP (N-APP FL)의 첨가시 처리되지 않은 뉴런에서의 대조군의 백분율 (반점/100 ㎛). 한 군을 30 ㎍/ml 항-DR6.1 항체로 추가로 처리하였다 (나타낸 바와 같음).

<발명의 상세한 설명>

본원에 기재되거나 언급된 기술 및 절차는 일반적으로 당업자에게 널리 이해되고 통상적인 방법, 예컨대 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기재된 널리 사용되는 분자 클로닝 방법을 이용하여 보편적으로 이용된다. 적절한 경우, 시판되는 키트 및 시약의 사용을 수반하는 절차는 일반적으로 달리 언급되지 않는 한 제조업체가 규정한 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 수행한다.

본 발명의 방법 및 검정을 기재하기 전에, 본 발명이 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구축물 및 시약으로 제한되지 않으며, 이들은 물론 변할 수 있음을 이해해야 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 본 발명의 범주를 제한하기 위함이 아니라, 특정 실시양태만을 기재하기 위한 목적이라고 이해해야 할 것이며, 본 발명의 범주는 하기하는 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이다.

본원 및 하기하는 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는다면 복수 형태를 포함한다는 것을 주목한다. 따라서, 예를 들어 "유전자 변경"의 언급은 복수개의 이러한 변경을 포함하고, "프로브"의 언급은 하나 이상의 프로브 및 당업자에게 공지된 그의 균등물에 대한 언급을 포함하는 식이다. 본 명세서 및 첨부되는 특허청구범위에서 언급된 모든 숫자 (예를 들어, 아미노산 22-81, 1-354 등)는 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서 언급된 모든 간행물들은 간행물에서 인용된 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 언급된 간행물은 본원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해 인용된다. 여기서, 그 어느 것도 본 발명자들이 본 발명의 최우선일 또는 우선일에 의해 간행물보다 선행하지 않는다고 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 실제 공개일은 제시된 것과 상이할 수 있고, 별도의 확인을 필요로 할 수 있다.

용어 "아밀로이드 전구체 단백질" 또는 "APP"는 APP 프리-mRNA에 의해 코딩되는 다양한 폴리펩티드 이소형, 예를 들어 각각 서열 3 내지 5에 나타낸 APP695, APP751 및 APP770 이소형 (APP 프리-mRNA의 대안적으로 스플라이싱된 전사체로부터 번역된 이소형) 뿐만 아니라, APP 이소형의 번역후 프로세싱된 부분을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, APP 유전자로부터 전사된 APP 프리-mRNA는 선택적인 엑손 스플라이싱을 거쳐 수많은 이소형을 생성시킨다 (예를 들어, 문헌 [Sandbrink et al., Ann NY Acad. Sci. 777: 281-287 (1996)] 및 PubMed NCBI 단백질 로커스 등록 번호 P05067과 관련한 정보 참조). 이러한 대안적인 엑손 스플라이싱은 695개 (서열 3), 751개 (서열 4) 및 770개 (서열 5) 아미노산의 3가지 주요 이소형을 생성시킨다 (예를 들어, 문헌 [Kang et al., Nature 325: 733-736 (1987)]; [Kitaguchi et al., Nature 331: 530-532 (1988)]; [Ponte et al., Nature 331: 525-527 (1988)]; 및 [Tanzi et al., Nature 331: 528-532 (1988)] 참조). 이러한 이소형 중 2가지 (APP₇₅₁ 및 APP₇₇₀)는 쿠니츠(Kunitz) 패밀리의 세린 프로테아제 억제제 (KPI)에 고도로 상동성인 56개 잔기 삽입물을 함유하고, 편재되어 발현된다. 이와 대조적으로, KPI 모티프가 결여된 보다 짧은 이소형인 APP₆₉₅는 신경계, 예를 들어 뉴런 및 아교 세포에서 우세하게 발현되고, 이 때문에 종종 "뉴런 APP"로 불린다 (예를 들어, 문헌 [Tanzi et al., Science 235: 880-884 (1988)]; [Neve et al., Neuron 1: 669-677 (1988)]; 및 [Haas et al., J. Neurosci. 11: 3783-3793 (1991)] 참조). 695, 751 및 770을 포함하는 APP 이소형에는 유의한 번역후 프로세싱 사건이 일어난다 (예를 들어, 문헌 [Esch et al. 1990 Science 248:1122-1124], [Sisodia et al. 1990 Science 248:492-495] 참조). 예를 들어, 이들 이소형 각각은 다양한 세크레타제 및/또는 세크레타제 복합체에 의해 절단되고, 이러한 사건에 의해 APP 엑토도메인을 함유하는 N-말단 분비된 폴리펩티드 (sAPPα 및 sAPPβ)를 포함하는 APP 단편이 생성된다. 알파-세크레타제에 의한 또는 대안적으로는 베타-세크레타제에 의한 절단을 통해 가용성 N-말단 APP 폴리펩티드인 sAPPα 및 sAPPβ 각각이 생성되어 세포외 방출되고, 상응하는 막-앵커링된 C-말단 단편인 C83 및 C99가 보유된다. 감마-세크레타제에 의한 C83의 이후 프로세싱에 의해 P3 폴리펩티드가 생성된다. 이는 주요 분비 경로이고, 아밀로이드 생성 성질을 갖지 않는다. 대안적으로, C99의 프레세닐린/니카스트린-매개된 감마-세크레타제 프로세싱은 아밀로이드 베타 폴리펩티드, 즉 아밀로이드-베타 40 (A베타40) 및 아밀로이드-베타 42 (A베타42), 아밀로이드 플라크의 주요 성분, 및 세포독성 C-말단 단편, 감마-CTF(50), 감마-CTF(57) 및 감마-CTF(59)를 방출한다. 증거는 각각의 절단 사건의 상대적인 중요성이 세포 유형에 따라 달라진다는 것을 시사한다. 예를 들어, 비-뉴런 세포는 A베타 서열 내의 APP를 절단하는 α-세크레타제 경로(들)에 의해 APP를 우선적으로 프로세싱하여 A베타의 형성을 방지한다 (예를 들어, 문헌 [Esch et al. 1990 Science 248:1122-1124]; [Sisodia et al. 1990 Science 248:492-495] 참조). 이와 대조적으로, 뉴런 세포는 β-세크레타제 경로(들)에 의해 APP₆₉₅의 훨씬 더 큰 부분을 프로세싱하고, 적어도 2종의 효소 클래스의 조합 활성에 의해 무손상 A베타를 생성시킨다. 뉴런 세포에서, β-세크레타제(들)는 A베타 도메인의 아미노 말단에서 APP₆₉₅를 절단하여 별개의 N-말단 단편 (sAPPβ)을 방출한다. 또한, γ-세크레타제(들)는 카르복시 말단의 대안적인 부위에서 APP를 절단하여 40개 (A베타₄₀) 또는 42개 (A베타₄₂) 아미노산 길이의 A베타 종을 생성시킨다 (예를 들어, 문헌 [Seubert et al. 1993 Nature 361:260-263]; [Suzuki et al. 1994 Science 264:1336-1340]; 및 [Turner et al. 1996 J. Biol. Chem. 271:8966-8970] 참조). 영양 고갈은 APP의 BACE 절단을 일으켜 약 100 kDa sAPPβ를 생성하고, 이는 추가의 절단(들)을 거쳐 약 55 kDa 카르복시-말단 단편 (항-sAPPβ 항체에 의해 검출됨) 및 아미노-말단 약 35 kDa 단편 (항-N-APP (폴리클로날 항체)에 의해 검출됨) (본 발명자들은 "N-APP"로 지칭함)을 생성하는 것으로 여겨진다. 추가의 절단(들)의 부위는 알려져 있지 않으나, 단편 크기에 기초하여 APP "산성" 및 "E2" 도메인 사이의 접합부 (아미노산 286) 주위일 것으로 예상되고; 실제로 재조합 APP[1-286]은 약 35 kDa에 있고, N-APP와 유사하게 항-N-APP(폴리)로 검출되었다.

용어 "APP", "APP 단백질" 및 "APP 폴리펩티드"가 본원에서 사용되는 경우, 이들 용어는 천연 APP 서열 및 APP 변이체 및 그의 프로세싱된 단편을 포함한다. 이들 용어는 인간을 포함하는 다양한 포유동물에서 발현된 APP를 포함한다. APP는 다양한 인간 조직 계통에서 자연적으로 발생하는 바와 같이 내인성 발현될 수도 있고, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 발현될 수도 있다. "천연 서열 APP"는 자연계에서 유래된 APP와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (예를 들어, 695, 751 및 770 이소형 또는 그의 프로세싱된 부분)를 포함한다. 따라서, 천연 서열 APP는 인간을 포함하는 임의의 포유동물로부터 자연적으로 발생하는 APP의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 천연 서열 APP는 자연계에서 단리될 수도 있고, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수도 있다. 용어 "천연 서열 APP"는 구체적으로 자연적으로 발생하는 프로세싱되고/되거나 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열 등을 함유하는 가용성 형태), 자연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 대안적으로 스플라이싱되고/되거나 단백질분해 방식으로 프로세싱된 형태) 및 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다. APP 변이체는 천연 서열 APP의 단편 또는 결실 돌연변이체를 포함할 수 있다.

본 발명의 실시양태에서 유용한 APP 폴리펩티드는 상기 기재 및 하기하는 비-제한적인 예에서 기재된 것을 포함한다. 이들 예시적인 형태는 본 발명의 다양한 실시양태에서 사용되도록 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, APP 폴리펩티드는 전장 APP 이소형, 예컨대 각각 서열 3-5에 나타낸 APP₆₉₅ 및/또는 APP₇₅₁ 및/또는 APP₇₇₀ 이소형을 포함한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, APP 폴리펩티드는 APP의 번역후 프로세싱된 이소형, 예를 들어 세크레타제, 예컨대 α-세크레타제, β-세크레타제 또는 γ-세크레타제에 의해 절단된 APP 폴리펩티드 (예를 들어, 가용성 N-말단 단편, 예컨대 sAPPα 또는 sAPPβ)를 포함한다. 본 발명의 관련 실시양태에서, 하나 이상의 특이적인 도메인, 예컨대 N-말단 엑토도메인 (예를 들어, 문헌 [Quast et al., FASEB J. 2003; 17(12):1739-41] 참조), 헤파린 결합 도메인 (예를 들어, 문헌 [Rossjohn et al., Nat. Struct. Biol. 1999 Apr;6(4):327-31] 참조), 구리 유형 II (예를 들어, 문헌 [Hesse et al., FEBS Letters 349(1): 109-116 (1994)] 참조) 또는 쿠니츠 프로테아제 억제제 도메인 (예를 들어, 문헌 [Ponte et al., Nature; 331(6156):525-7 (1988)] 참조)을 포함하는 APP 폴리펩티드가 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, APP 폴리펩티드는 본원에 개시된 DR6 길항제, 예컨대 항체 또는 DR6 이뮤노어드헤신에 의해 인식되는 에피토프, 예를 들어 APP₆₉₅의 아미노산 22-81을 포함하는 것으로 관찰되는 서열, 모노클로날 항체 22C11에 의해 결합되는 에피토프를 포함하는 서열을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Hilbich et al., J. Biol. Chem. 268(35): 26571-26577 (1993)] 참조).

본 발명의 특정 실시양태에서, APP 폴리펩티드, 예를 들어 쿠니츠 프로테아제 억제제 도메인을 포함하지 않는 APP 폴리펩티드 (예를 들어, APP₆₉₅), 또는 알츠하이머 베타 아밀로이드 단백질 (A베타) 서열을 포함하지 않는 APP 폴리펩티드 (예를 들어, Aβ₄₀ 및/또는 Aβ₄₂ 서열을 포함하지 않는 폴리펩티드인 sAPPβ)는 하나 이상의 특이적인 도메인 또는 서열을 포함하지 않는다 (예를 들어, 문헌 [Bond et al., J. Struct Biol. 2003 Feb;141(2):156-70] 참조). 본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 실시양태에서 사용되는 APP 폴리펩티드는 하나 이상의 도메인 또는 서열은 포함하지만 다른 도메인 또는 서열은 포함하지 않으며, 예를 들어 APP 폴리펩티드는 N-말단 엑토도메인 (또는 DR6 길항제, 예컨대 모노클로날 항체 22C11에 의해 결합되는 것으로 관찰되는 그의 적어도 일부)을 포함하지만, 하나 이상의 세크레타제 절단 부위에 대해 C-말단인 도메인 또는 서열, 예컨대 베타 아밀로이드 (A베타) 서열을 포함하지 않는다 (예를 들어, sAPPα 또는 sAPPβ).

용어 "세포외 도메인", "엑토도메인" 또는 "ECD"는 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인이 존재하지 않는 APP의 형태를 나타낸다. 통상적으로, 가용성 ECD는 이러한 막횡단 및 세포질 도메인을 1% 미만으로 가질 것이고, 바람직하게는 이러한 도메인을 0.5% 미만으로 가질 것이다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 확인된 임의의 막횡단 도메인(들)은 소수성 도메인 유형을 확인하기 위해 당업계에서 통상 사용되는 기준에 따라 확인됨이 이해될 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계는 달라질 수 있지만, 가장 가능하게는 처음 확인된 도메인의 어느 한쪽 말단에서 약 5개 이하의 아미노산만큼 달라질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, ECD는 막횡단 및 세포질 또는 세포내 도메인이 존재하지 않는 (또한, 막 결합되지 않은) 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인 서열로 이루어질 것이다.

용어 "APP 변이체"는 서열 3, 4 또는 5에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 APP와 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는, 하기 정의된 바와 같은 APP 폴리펩티드, 또는 그의 가용성 단편, 또는 그의 가용성 세포외 도메인을 의미한다. 이러한 변이체는 예를 들어 다른 종으로부터의 변이체를 포함하여, 하나 이상의 아미노산 잔기가 APP의 전장 또는 성숙 서열의 N- 또는 C-말단에 부가되거나 이로부터 결실된 APP 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 내부 서열 또는 도메인에 삽입되거나 이로부터 결실된 APP 폴리펩티드를 포함하지만, 천연-서열 APP 폴리펩티드는 포함하지 않는다.

"DR6" 또는 "DR6 수용체"는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열이 공지되어 있는, 당업계에서 언급되는 수용체를 포함한다. 판(Pan) 등의 문헌은 "DR6" 또는 "TR9"로 언급되는 TNF 수용체 패밀리 구성원에 대한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 기재한다 (문헌 [Pan et al., FEBS Lett., 431:351-356 (1998)], 또한, 미국 특허 6,358,508; 6,667,390; 6,919,078; 6,949,358 참조). 인간 DR6 수용체는 추정 신호 서열 (아미노산 1-41), 세포외 도메인 (아미노산 42-349), 막횡단 도메인 (아미노산 350-369), 이어서 세포질 도메인 (아미노산 370-655)을 갖는 655개 아미노산의 단백질 (서열 1)이다. DR6에 대한 cDNA 서열은 서열 2로서 제공된다. 용어 "DR6 수용체"가 본원에서 사용되는 경우, 이것은 천연 서열 수용체 및 수용체 변이체를 포함한다. 이러한 용어는 인간을 포함하는 다양한 포유동물에서 발현되는 DR6 수용체를 포함한다. DR6 수용체는 다양한 인간 조직 계통에서 자연적으로 발생하는 바와 같이 내인성 발현될 수도 있거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 발현될 수도 있다. "천연 서열 DR6 수용체"는 자연계에서 유래되는 DR6 수용체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 DR6 수용체는 인간을 포함하는 임의의 포유동물로부터의 자연 발생 DR6 수용체의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 천연 서열 DR6 수용체는 자연계에서 단리될 수도 있고, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수도 있다. 용어 "천연 서열 DR6 수용체"는 구체적으로 수용체의 자연 발생 말단절단 또는 분비 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열을 함유하는 가용성 형태), 자연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 대안적으로 스플라이싱된 형태) 및 자연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다. 수용체 변이체는 천연 서열 DR6 수용체의 단편 또는 결실 돌연변이체를 포함할 수 있다.

용어 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인이 존재하지 않는 DR6 수용체의 형태를 의미한다. 통상적으로, 가용성 ECD는 이러한 막횡단 및 세포질 도메인을 1% 미만으로 가질 것이고, 바람직하게는 이러한 도메인을 0.5% 미만으로 가질 것이다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 확인된 임의의 막횡단 도메인(들)은 소수성 도메인 유형을 확인하기 위해 당업계에서 통상 사용되는 기준에 따라 확인됨이 이해될 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계는 달라질 수 있지만, 가장 가능하게는 처음 확인된 도메인의 어느 한쪽 말단에서 약 5개 이하의 아미노산만큼 달라질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, ECD는 막횡단 및 세포질 또는 세포내 도메인이 존재하지 않는 (또한, 막 결합되지 않은) 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인 서열로 이루어질 것이다.

용어 "DR6 변이체"는 서열 1에 나타낸 추정 아미노산 서열을 갖는 인간 DR6과 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는, 하기 정의된 바와 같은 DR6 폴리펩티드, 또는 그의 가용성 단편, 또는 그의 가용성 세포외 도메인을 의미한다. 이러한 변이체는 예를 들어 다른 종으로부터의 변이체를 포함하여, 하나 이상의 아미노산 잔기가 서열 1의 전장 또는 성숙 서열의 N- 또는 C-말단에 부가되거나 이로부터 결실된 DR6 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 내부 서열 또는 도메인에 삽입되거나 이로부터 결실된 DR6 폴리펩티드를 포함하지만, 천연-서열 DR6 폴리펩티드는 포함하지 않는다. 임의로, DR6 변이체는 최대 10개의 보존적 아미노산 치환이 존재하는, 서열 1의 아미노산 1-349 또는 42-349를 포함하는 DR6 수용체의 가용성 형태를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 변이체는 하기 정의되는 바와 같은 DR6 길항제로서 작용한다.

용어 "DR6 길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 시험관내, 계내, 생체내 또는 생체외에서 DR6 수용체가 그의 동족 리간드, 바람직하게는 그의 동족 리간드 APP에 결합하거나 또는 뉴런 세포 또는 조직에서 하나 이상의 세포내 신호(들) 또는 세포내 신호전달 경로(들)를 활성화시키는 능력을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 임의의 분자를 포함한다. 예를 들어, DR6 길항제는 DR6 수용체가 뉴런 세포 또는 조직에서 하나 이상의 세포내 신호(들) 또는 세포내 신호전달 경로(들)를 활성화시키는 능력을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시켜서 뉴런 세포 또는 조직에서 아폽토시스 또는 세포 사멸을 야기할 수 있다. DR6 길항제는 동족 리간드의 DR6에 대한 결합, DR6과 그의 동족 리간드 (예를 들어, APP) 사이의 복합체 형성, DR6 수용체의 올리고머화, DR6 수용체와 이종 보조 수용체 사이의 복합체 형성, 동족 리간드의 DR6 수용체/이종 보조 수용체 복합체에 대한 결합, 또는 DR6 수용체, 이종 보조 수용체와 그의 동족 리간드 사이의 복합체의 형성의 차단, 억제 또는 중화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 메카니즘에 의해 DR6을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 작용을 할 수 있다. DR6 길항제는 직접 또는 간접 방식으로 기능할 수 있다. 본 발명에서 고려되는 DR6 길항제는 APP 항체, DR6 항체, 이뮤노어드헤신, DR6 이뮤노어드헤신, DR6 융합 단백질, DR6의 공유결합에 의해 변형된 형태, DR6 변이체 및 그의 융합 단백질, 또는 DR6의 보다 큰 올리고머 형태 (이량체, 응집체) 또는 DR6의 동종중합체 또는 이종중합체 형태, JNK 신호전달 케스케이드의 소분자 억제제, 예컨대 약리학적 억제제, 예를 들어 Jun N-말단 키나제 JNK 활성의 소분자 및 펩티드 억제제, 신호 도입 경로에서 JNK의 상류에서 기능하는 단백질 키나제 MLK 및 MKK 활성의 약리학적 억제제, JNK의 스캐폴드 단백질 JIP-1에 대한 결합의 약리학적 억제제, JNK의 그의 기질, 예를 들어 c-Jun 또는 AP-1 전사 인자 복합체에 대한 결합의 약리학적 억제제, JNK의 기질, 예컨대 JNK 결합 도메인 (JBD) 펩티드 및/또는 JNK의 기질 결합 도메인의 JNK-매개된 인산화의 약리학적 억제제 및/또는 JNK 기질 인산화 부위를 포함하는 펩티드 억제제, ATP의 JNK에 대한 결합을 차단하는 소분자, 및 JNK에 대한 기질 결합을 차단하는 소분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

DR6 길항제가 뉴런 세포 또는 조직에서 하나 이상의 세포내 신호(들) 또는 세포내 신호전달 경로(들)를 활성화시키는 DR6 수용체의 능력을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는지 결정하기 위해, 예를 들어 다양한 뉴런 세포 또는 조직에 대한 DR6 길항제의 효과(들) 뿐만 아니라 생체내 모델에서의 DR6 길항제의 효과(들)를 평가하기 위한 검정을 수행할 수 있다. 다양한 검정은 하기 기재되거나 또는 당업계에 공지되어 있고 문헌에 기재된 것과 같은 공지된 시험관내 또는 생체내 검정 포맷으로 수행할 수 있다. DR6 길항제가 뉴런 세포 또는 조직에서 하나 이상의 세포내 신호(들) 또는 세포내 신호전달 경로(들)를 활성화시키는 DR6 수용체의 능력을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는지 여부를 결정하기 위한 검정의 한 실시양태는, DR6 길항제 또는 잠재적인 DR6 길항제 (즉, 관심 분자)의 존재 또는 부재하에서 DR6 및 APP를 합한 후에 이러한 DR6 길항제 또는 잠재적인 DR6 길항제의 존재하에 APP에 대한 DR6의 결합의 억제를 검출하는 것을 포함한다.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA를 포함하는 의미이다. 예를 들어, 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 박테리아 핵산이 조직 샘플에 존재한다. 용어 "핵산"은 이중 가닥 핵산 분자의 한 가닥 또는 두 가닥 둘 다를 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질의 코딩을 담당하는 모든 핵산으로 이루어질 수도 있고, 또는 단백질의 코딩 또는 발현을 담당하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수도 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 독특한 영역 내에 유전자 이상을 함유할 수 있다.

용어 "아미노산(들)"은 모든 자연 발생 L-알파-아미노산을 나타낸다. 이러한 정의는 노르류신, 오르니틴 및 호모시스테인을 포함하는 의미이다. 아미노산은 1-문자 또는 3-문자 명명법으로 확인된다:

"단리된"이 본원에 개시된 다양한 펩티드 또는 단백질을 기재하는데 사용되는 경우, 이것은 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 이것의 천연 환경의 오염 성분은 전형적으로 펩티드 또는 단백질의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 펩티드 또는 단백질은 (1) 스피닝 컵 시쿼네이터를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도까지, 또는 (2) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 비-환원 또는 환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 나타날 때까지, 또는 (3) 질량 분광기 또는 펩티드 맵핑 기술에 의해 균질한 것으로 나타날 때까지 정제될 것이다. 단리된 물질은 재조합 세포 내의 계내 펩티드 또는 단백질을 포함하는데, 이는 그의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 펩티드 또는 단백질은 1회 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.

본원에서 확인된 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성(%)"은 서열을 정렬하고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성(%)을 달성하기 위한 갭을 도입한 후에 임의의 보존적인 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않으면서 참조 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율(%)로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성(%)을 결정하기 위한 정렬은 비교될 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 알고리즘의 배정을 포함하는, 정렬을 측정하는 적절한 파라미터를 결정할 수 있는 당업계 기술 범위 내의 다양한 방식으로 달성할 수 있다. 본원에서의 목적상, 아미노산 동일성(%) 값은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)에 권리가 있는 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 얻을 수 있고, 이것의 원시 코드는 미국 20559 워싱톤 디씨 소재의 미국 저작권청에 사용자 문서로 보관되어 있고, 미국 저작권 등록번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코에 소재하는 제넨테크, 인크.를 통해 공개적으로 입수가능하다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.

용어 "프라이머(들)"는 상보적 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 일어나는 것과 같이 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드가 단계별 합성되는 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 나타낸다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은 예를 들어 프로모터, 임의로는 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더의 DNA는 폴리펩티드에 대한 DNA가 상기 폴리펩티드의 분비에 수반되는 전단백질로서 발현되는 경우에 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미칠 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이며; 또는 리보솜 결합 부위는 코딩 서열의 번역을 용이하게 하도록 배치될 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치하고 리딩 페이스 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션을 통해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.

용어 "표지"가 본원에 사용된 경우, 이것은 시약, 예컨대 핵산 프로브 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되거나 융합된 화합물 또는 조성물을 나타내고, 그와 접합되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 한다. 표지는 그 자체가 검출가능할 수도 있고 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 기질 화합물 또는 조성물의 검출가능한 화학적 변경을 촉매할 수도 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "이뮤노어드헤신"은 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합한 항체-유사 분자를 나타낸다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외 (즉, "이종")의 바람직한 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 수용체 또는 리간드의 적어도 결합 부위를 포함하는 인접한 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 내의 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.

"DR6 수용체 항체", "DR6 항체" 또는 "항-DR6 항체"는 적어도 하나의 형태의 DR6 수용체, 바람직하게는 인간 DR6 수용체, 예컨대 서열 1에 나타낸 DR6 서열 또는 그의 세포외 도메인 서열에 결합하는 항체를 넓은 의미에서 나타내는데 사용된다. 임의로, DR6 항체는 이종 서열 또는 분자에 융합되거나 연결된다. 바람직하게는, 이종 서열은 항체가 보다 고차원의 또는 올리고머 형태의 복합체를 형성하는 것을 허용하거나 돕는다. 용어 "항-DR6 항체" 및 그의 문법적 균등물은 구체적으로 하기 기재된 DR6 모노클로날 항체를 포함한다. 임의로, DR6 항체는 DR6 수용체에 결합하지만, 종양 괴사 인자 패밀리의 임의의 추가의 수용체 (예를 들어, DR4, DR5, TNFR1, TNFR2, Fas)에는 결합하거나 교차반응하지 않는다. 임의로, 본 발명의 DR6 항체는 비아코어(BIAcore) 결합 검정으로 측정시에 약 0.067 nM 내지 약 0.033 μM의 농도 범위에서 DR6 수용체에 결합한다.

용어 "항-APP 항체", "APP 항체" 및 문법적 균등물은 넓은 의미로 사용되고, 적어도 하나의 형태의 APP, 바람직하게는 인간 APP, 예컨대 본원에서 구체적으로 기재된 APP 폴리펩티드 이소형에 결합하는 항체를 나타낸다. 바람직하게는, APP 항체는 DR6 길항제 항체이다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 DR6 길항제의 제조 및/또는 확인 방법에서, APP의 하나 이상의 이소형 및/또는 그의 일부가 동물 (예를 들어, 모노클로날 항체 생성 방법의 일부로서의 마우스)을 면역화시키기 위한 면역원 및/또는 화합물의 라이브러리 (예를 들어, 재조합 항체 라이브러리)를 스크리닝하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 본 발명의 실시양태에 유용한 전형적인 APP 폴리펩티드는 하기하는 비-제한적인 예를 포함한다. 이들 예시적인 형태는 본 발명의 다양한 실시양태에서 사용되도록 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, APP 폴리펩티드는 전장 APP 이소형, 예컨대 각각 서열 3, 4 및 5에 나타낸 APP₆₉₅ 및/또는 APP₇₅₁ 및/또는 APP₇₇₀ 이소형을 포함한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, APP 폴리펩티드는 APP의 번역후 프로세싱된 이소형, 예를 들어 세크레타제, 예컨대 α-세크레타제, β-세크레타제 또는 γ-세크레타제에 의해 절단된 APP 폴리펩티드 (예를 들어, 가용성 N-말단 단편, 예컨대 sAPPα 또는 sAPPβ)를 포함한다. 본 발명의 관련 실시양태에서, 하나 이상의 특이적인 도메인, 예컨대 N-말단 엑토도메인 (예를 들어, 문헌 [Quast et al., FASEB J. 2003; 17(12):1739-41] 참조), 헤파린 결합 도메인 (예를 들어, 문헌 [Rossjohn et al., Nat. Struct. Biol. 1999 Apr; 6(4):327-31] 참조), 구리 유형 II (예를 들어, 문헌 [Hesse et al., FEBS Letters 349(1): 109-116 (1994)] 참조) 또는 쿠니츠 프로테아제 억제제 도메인 (예를 들어, 문헌 [Ponte et al., Nature; 331(6156):525-7 (1988)] 참조)을 포함하는 APP 폴리펩티드가 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, APP 폴리펩티드는 본원에 개시된 DR6 길항제, 예컨대 항체 또는 DR6 이뮤노어드헤신에 의해 인식되는 에피토프, 예를 들어 APP₆₉₅의 아미노산 22-81을 포함하는 것으로 관찰되는 서열, 모노클로날 항체 22C11에 의해 결합되는 에피토프를 포함하는 서열을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Hilbich et al., J. Biol. Chem., 268(35): 26571-26577 (1993)] 참조). 본 발명의 특정 실시양태에서, APP 폴리펩티드, 예를 들어 특정 N-말단 또는 C-말단 아미노산을 포함하지 않는 APP 폴리펩티드, 쿠니츠 프로테아제 억제제 도메인을 포함하지 않는 APP 폴리펩티드 (예를 들어, APP₆₉₅), 또는 알츠하이머 베타 아밀로이드 단백질 (A베타) 서열을 포함하지 않는 APP 폴리펩티드 (예를 들어, Aβ₄₀ 및/또는 Aβ₄₂ 서열을 포함하지 않는 폴리펩티드인 sAPPβ)는 하나 이상의 특이적인 도메인 또는 서열을 포함하지 않는다 (예를 들어, 문헌 [Bond et al., J. Struct Biol. 2003 Feb;141(2):156-70] 참조). 본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 실시양태에서 사용되는 APP 폴리펩티드는 하나 이상의 도메인 또는 서열은 포함하지만 다른 도메인 또는 서열은 포함하지 않으며, 예를 들어 APP 폴리펩티드는 N-말단 엑토도메인 (또는 DR6 길항제, 예컨대 모노클로날 항체 22C11에 의해 결합되는 것으로 관찰되는 그의 적어도 일부)을 포함하지만, 하나 이상의 세크레타제 절단 부위에 대해 C-말단인 도메인 또는 서열, 예컨대 베타 아밀로이드 (A베타) 서열을 포함하지 않는다 (예를 들어, sAPPα 또는 sAPPβ). 임의로, 항-APP 항체는 DR6에 대한 N-APP 폴리펩티드의 결합을 억제할 것이고, 본원에 기재된 바와 같이 및/또는 정량적 세포-기반 결합 검정으로 측정시에 10 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml의 농도에서 N-APP 폴리펩티드에 결합할 것이다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 구체적으로 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2종의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함한다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 일부를 포함하고, 바람직하게는 무손상 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

"천연 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결부의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_H)을 갖고, 그 뒤에는 수많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_L) 및 다른쪽 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 인터페이스를 형성한다고 여겨진다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타낸다는 사실을 지칭하고, 각 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성이 항체 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역이라 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 이들 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데는 직접 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)에서의 항체 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.

항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편 (각각 단일 항원-결합 부위를 가짐) 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성시킨다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀하게 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 형태에서는 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체 표면상의 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 초가변 영역을 단지 3개만 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖고 있다.

Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (C_H1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 C_H1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 하나의 유리 티올기를 보유하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 가운데에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

임의의 척추동물 종의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)라고 불리는 2개의 분명하게 상이한 유형 중 하나로 배정될 수 있다.

이들 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 여러 클래스로 지정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 무손상 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이중 몇 가지는 서브클래스 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있다.

"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재하는, 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, V_H 및 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 동일 폴리펩티드 쇄 (V_H-V_L) 내에서 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 나타낸다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되며 고도로 특이적이다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단결정자에 대해 지시된다. 이러한 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 하이브리도마 배양에 의해 합성되고, 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재되었던 하이브리도마 방법으로 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567)으로 제조될 수 있다. 또한, "모노클로날 항체"는 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

구체적으로, 본원에서의 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린), 및 또한 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서의 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이(Old World Monkey), 예컨대 개코원숭이, 붉은털 원숭이 또는 시노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 5,693,780).

비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 치환된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되게 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

용어 "초가변 영역"이 본원에서 사용되는 경우, 이것은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 초가변 영역은 "상보적 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

관심 항원에 "결합하는" 항체는 이것이 항원을 발현하는 세포를 표적화하기 위한 치료체 또는 진단제로서 유용할 만큼 충분한 친화도 및/또는 결합력으로 항원에 결합할 수 있는 것이다.

본원에서의 목적상, "면역요법"은 비접합 또는 "네이키드" 항체일 수 있거나, 또는 이종 분자(들) 또는 작용제(들), 예컨대 하나 이상의 세포독성제(들)와 접합되거나 융합되어 "면역접합체"를 생성시킬 수 있는 항체를 사용하여 포유동물 (바람직하게는 인간 환자)을 치료하는 방법을 지칭할 것이다.

"단리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 확인되고, 분리 및/또는 회수된 항체이다. 항체의 천연 환경의 오염 성분은 상기 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정시에 항체의 95 중량%를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량%를 초과하는 정도로, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 나타날 정도로 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.

용어 "태그가 부착된"이 본원에서 사용되는 경우, 이것은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 나타낸다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하거나 일부 다른 기능, 예컨대 올리고머화하는 능력 (예를 들어, 류신 지퍼 도메인을 갖는 펩티드에서 발생)을 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 일반적으로 항체 또는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 또한, 태그 폴리펩티드는 태그-특이적 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 교차반응하지 않도록 아주 독특한 것이 바람직하다. 일반적으로, 적합한 태그 폴리펩티드는 적어도 6개의 아미노산 잔기, 통상적으로는 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는, 약 10 내지 약 20개의 잔기)를 갖는다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합하는 수용체를 기재하는데 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 추가로, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하며, 이들은 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함하는 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 이 용어는 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 또한 포함한다 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]). 본원에서의 FcR은 다형성, 예컨대 IgG1에 결합하는 수용체의 영역에 위치하는 아미노산 위치 158에 페닐알라닌 (F) 또는 발린 (V)을 생성시키는, FcγRIIIa를 코딩하는 유전자에서의 유전자 이형성을 포함한다. 동형접합성 발린 FcγRIIIa (FcγRIIIa-158V)는 동형접합성 페닐알라닌 FcγRIIIa (FcγRIIIa-158F) 또는 이형접합성 (FcγRIIIa-158F/V) 수용체에 비해 인간 IgG1에 대해 보다 높은 친화도를 갖고 시험관내에서 증가된 ADCC를 매개하는 것으로 나타난 바 있다.

용어 "폴리올"이 본원에서 사용되는 경우, 이것은 다가 알콜 화합물을 넓게 의미한다. 폴리올은 예를 들어 임의의 수용성 폴리(알킬렌 옥시드) 중합체일 수 있고, 직쇄 또는 분지쇄를 가질 수 있다. 바람직한 폴리올은 하나 이상의 히드록실 위치에서 화학기, 예를 들어 1 내지 4개의 탄소를 갖는 알킬기로 치환된 것을 포함한다. 전형적으로, 폴리올은 폴리(알킬렌 글리콜), 바람직하게는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)이다. 그러나, 당업자는 PEG 대신에 다른 폴리올, 예를 들어 폴리(프로필렌 글리콜) 및 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 공중합체를 본원에 기재된 접합 기술을 이용하여 사용할 수 있음을 알 것이다. 폴리올은 당업계에 잘 공지된 것 및 공개적으로 이용가능한 것, 예컨대 시판 공급원, 예컨대 넥타^® 코포레이션(Nektar^® Corporation)으로부터의 것을 포함한다.

용어 "접합체"는 함께 결합 또는 연결된 것을 의미하도록 가장 넓은 정의에 따라 본원에서 사용된다. 분자는 결합된 것처럼 작용 또는 기능하는 경우에 "접합"된 것이다.

표현 "유효량"은 해당 장애 또는 상태의 예방, 완화 또는 치료에 효과적인 작용제 (예를 들어, DR6 길항제 등)의 양을 나타낸다. 본 발명의 DR6 길항제는 수상돌기 소극의 밀도와 PSD-95의 유지를 증진시키는데 유용할 것임이 고려된다.

본원에 사용된, 용어 "치료하는", "치료" 및 "요법"은 치유적 요법, 예방적 요법 및 방지적 요법을 나타낸다. 연속 치료 또는 투여는 1일 이상 치료가 중단되지 않으면서 적어도 매일 치료하는 것을 나타낸다. 간헐적 치료 또는 투여, 또는 간헐 방식의 치료 또는 투여는 연속적이지는 않지만 성질상 주기적인 치료를 나타낸다.

본원에 사용된, 용어 "장애"는 일반적으로 본원에 기재된 DR6 길항제로의 치료에 의해 유익한 임의의 상태를 나타낸다. 이것은 만성 및 급성 장애 뿐만 아니라, 포유동물을 해당 장애에 걸리기 쉽게 만드는 병리 상태를 포함한다.

"뉴런 세포 또는 조직"은 일반적으로 운동 뉴런, 교련 뉴런을 포함하지만 이에 제한되지 않는 개재뉴런, 후근 신경절 뉴런을 포함하지만 이에 제한되지 않는 감각 뉴런, 흑색질의 도파민 (DA) 뉴런, 선조체 DA 뉴런, 피질 뉴런, 뇌간 뉴런, 척수 개재뉴런 및 운동 뉴런, 해마의 CA1 추체 뉴런을 포함하지만 이에 제한되지 않는 해마 뉴런, 및 전뇌 뉴런을 나타낸다. 본원에서, 용어 뉴런 세포 또는 조직은 세포체, 축색돌기(들) 및 수상돌기(들)로 이루어진 뉴런 세포 뿐만 아니라, 이러한 뉴런 세포의 일부를 형성할 수 있는 축색돌기(들) 또는 수상돌기(들)를 나타낸다.

"정신 장애"는 정신분열증 및 중독과 같은 장애를 포함하는 상태를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. "인지 장애"은 자폐증, 투렛 증후군, 레트 증후군 및 취약성-X 증후군 정신 지체와 같은 장애를 포함한다.

"대상체" 또는 "환자"는 요법을 실시하고자 하는 임의의 단일 대상체, 예를 들어 인간을 의미한다. 또한, 대상체에는 질환의 임의의 임상적 징후를 나타내지 않는 임상 연구 시험에 포함된 임의의 대상체, 역학 연구에 포함된 대상체, 또는 대조군으로 이용된 대상체가 포함된다.

본원에 사용된, 용어 "포유동물"은 인간, 소, 말, 개 및 고양이를 포함하는, 포유동물로서 분류되는 임의의 포유동물을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

화학적 시냅스는 뉴런을 연결하여 정보를 처리 및 저장할 수 있는 기능 회로를 형성한다. 이들 연결의 적절한 기능 또는 안정성의 손실은 수많은 정신 및 인지 장애의 근본적 원인인 것으로 생각된다. 수상돌기 소극의 손실 또는 수상돌기 소극의 불안정성 및 수상돌기 소극-관련 단백질, 예컨대 PSD-95의 변경은 레트 증후군, 투렛 증후군, 정신분열증, 자폐증, 중독 및 취약성-X 증후군과 같은 장애와 관련되는 것으로 여겨진다.

놀랍게도, 본 출원인들은 TNFR 패밀리의 구성원인 DR6이 대뇌 피질, 해마, 척수의 운동 뉴런 및 개재뉴런을 비롯한 배아 및 성체 중추 신경계 내에서 고도로 발현된다는 것을 발견하였다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 본 출원인들은 생체내 시냅스 안정성에서 DR6의 역할을 조사하기 위한 다양한 실험 검정을 실시하였다.

본 출원인은 또한 아밀로이드 전구체 단백질의 일부 (N-APP)가 DR6 수용체의 동족 리간드이고, 이에 따라 APP는 또한 시냅스 안정성에 소정의 역할을 갖는다고 가정하였다. 최근 비트너(Bittner) 등의 문헌에서 (문헌 [Bittner, T., et al. (2009) J. Neurosci. 29(33):10405-10409]), 저자는 APP^+/- 마우스에서의 수상돌기 소극 밀도가 야생형 마우스보다 더 높고, 심지어는 APP^-/- 마우스에서 더 높다는 것을 보여주었다. 아밀로이드 전구체 단백질은 이전에 완전하게 이해된 것은 아니지만 알츠하이머병에서 일부 역할을 수행한다고 가정된 바 있다 (문헌 [Selkoe, J. Biol. Chem. 271:18295 (1996)]; [Scheuner; et al., Nature Med. 2:864 (1996)]; [Goate, et al., Nature 349:704 (1991)]).

DR6 및/또는 APP 억제제는 다양한 정신 및 인지 장애를 치료하는데 특히 유용할 것으로 여겨진다. 이러한 억제제는 또한 노화 과정 동안 인지를 향상시키거나 또는 인지를 유지하는데 유용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 DR6 및/또는 APP 길항제 조성물, 및 유효량의 DR6 및/또는 APP 길항제를 투여하는 것을 포함하는 포유동물에서 DR6 및/또는 APP 활성을 억제, 차단 또는 중화시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 사용되는 DR6 및/또는 APP 길항제의 양은 수상돌기 소극의 밀도를 증진시키고, 건강한 시냅스를 유지하는데 효과적인 양일 것이다. 사용되는 길항제의 양은 또한 수상돌기 소극에서 PDS-95의 발현을 증가시키거나 또는 그의 유지를 향상시킬 수 있다. 일부 경우에, p75의 길항제를 DR6 및/또는 APP 길항제와 함께 또는 이들과 별개로 사용하는 것이 유익할 수 있다.

상기 방법에 사용될 수 있는 DR6 길항제는 DR6 및/또는 APP 이뮤노어드헤신, DR6 및/또는 APP를 포함하는 융합 단백질, DR6 및/또는 APP의 공유결합에 의해 변형된 형태, DR6 및/또는 APP 변이체, 그의 융합 단백질, 및 DR6 및/또는 APP 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 방법에 사용될 수 있는 p75 길항제는 p75 이뮤노어드헤신, p75를 포함하는 융합 단백질, p75의 공유결합에 의해 변형된 형태, p75 변이체, 그의 융합 단백질, 및 p75 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항-p75 항체는 당업계에 공지된 임의의 것일 수 있다. p75의 단백질 서열은 서열 6으로서 제공된다. 길항제 제조에 이용될 수 있는 다양한 기술이 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, DR6, p75 및 APP 폴리펩티드의 제조 방법 및 기술이 기재되어 있다. DR6, p75 및 APP 폴리펩티드의 추가의 변형, 및 DR6, p75 및 APP에 대한 항체도 기재되어 있다.

본원에 개시된 발명은 수많은 실시양태를 갖는다. 본 발명은 APP에 대한 DR6의 결합이 억제되는 조건하에 DR6 폴리펩티드 및/또는 APP 폴리펩티드를 하나 이상의 DR6 길항제에 노출시키는 것을 포함하는, APP에 대한 DR6의 결합을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 관련 실시양태는 DR6 폴리펩티드 및 APP 폴리펩티드를 DR6 또는 APP에 결합하는 단리된 길항제와 합하는 것을 포함하는, 서열 1의 아미노산 1-655을 포함하는 DR6 폴리펩티드 및 서열 3의 아미노산 66-81을 포함하는 APP 폴리펩티드 (예를 들어, sAPPβ)의 결합을 억제하는 방법을 제공하고, 여기서 단리된 길항제는 APP에 결합하는 항체, DR6에 결합하는 항체 및 서열 1의 아미노산 1-354를 포함하는 가용성 DR6 폴리펩티드 중 적어도 하나로부터 선택되고, 단리된 길항제는 DR6 및 APP의 결합을 억제하는 능력에 대해 선택되어, APP에 대한 DR6의 결합이 억제된다.

본 발명은 또한 APP에 대한 DR6 및 p75의 결합이 억제되는 조건하에 DR6 폴리펩티드, p75 폴리펩티드, 임의로는 APP 폴리펩티드를 하나 이상의 DR6 길항제 및 하나 이상의 p75 길항제에 노출시키는 것을 포함하는, APP에 대한 DR6의 결합을 억제하고, APP에 대한 p75의 결합을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 관련 실시양태는 서열 1의 아미노산 1-655를 포함하는 DR6 폴리펩티드 및 서열 3의 아미노산 66-81을 포함하는 APP 폴리펩티드 (예를 들어, sAPPβ)의 결합을 억제하는 방법을 제공하고, 이 방법은 DR6 폴리펩티드 및 APP 폴리펩티드를 DR6 또는 APP에 결합하는 단리된 길항제, 및 p75에 결합하는 길항제와 조합하는 것을 포함하며, 여기서 단리된 DR6 길항제는 APP에 결합하는 항체, DR6에 결합하는 항체 및 서열 1의 아미노산 1-354를 포함하는 가용성 DR6 폴리펩티드 중 적어도 하나로부터 선택되고, 단리된 DR6 길항제는 DR6 및 APP의 결합을 억제하는 그의 능력에 대해 선택되어, APP에 대한 DR6의 결합이 억제된다. 단리된 p75 길항제는 p75에 결합하는 항체, 및 p75의 세포외 도메인의 아미노산 (예를 들어, 서열 6의 아미노산 29-250)을 포함하는 가용성 p75 폴리펩티드 중 적어도 하나로부터 선택되고, 단리된 p75 길항제는 p75 및 APP의 결합을 억제하는 그의 능력에 대해 선택되어, APP에 대한 p75의 결합이 억제된다.

임의로는 이러한 방법에서, DR6 길항제 중 하나 이상이 DR6에 결합하는 항체 (예를 들어, DR6에 결합하는 항체가 각각 ATCC 기탁 번호 PTA-8095, PTA-8094 또는 PTA-8096으로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 3F4.4.8, 4B6.9.7, 또는 1E5.5.7 모노클로날 항체의 결합을 경쟁적으로 억제함), 서열 1의 아미노산 1-354를 포함하는 가용성 DR6 폴리펩티드 (예를 들어, DR6 이뮤노어드헤신), 또는 APP에 결합하는 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체 22C11)로부터 선택된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, DR6 길항제는 DR6에 결합하는 항체, APP에 결합하는 항체, 또는 가용성 DR6 폴리펩티드 (폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비-단백질성 중합체에 연결됨)이다. p75 길항제는 또한 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 비-단백질성 중합체에 연결될 수 있다.

상기 방법의 임의의 실시양태에서, DR6 폴리펩티드는 단독으로 또는 p75 폴리펩티드와 함께 하나 이상의 포유동물 세포 (예를 들어, 교련 뉴런 세포, 감각 뉴런 세포 또는 운동 뉴런 세포)의 세포 표면 상에서 발현되고, 상기 하나 이상의 DR6 길항제 및/또는 p75 길항제의 결합은 DR6 활성화 또는 신호전달 및/또는 p75 활성화 또는 신호전달을 억제한다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, DR6 및 임의로 p75의 APP에 대한 결합을 억제하는 방법은 정신과적 상태 또는 장애 또는 인지 장애를 갖는 포유동물에서 생체내에서 수행될 수 있다. 임의로, 정신과적 상태 또는 장애는 정신분열증 또는 중독이다. 대안적으로, 인지적 상태 또는 장애는 투렛 증후군, 레트 증후군, 취약성-X 증후군 또는 자폐증을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 상태 또는 장애를 갖는 포유동물에게 유효량의 하나 이상의 DR6 길항제를 단독으로 또는 하나 이상의 p75 길항제와 함께 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 전형적으로, 이러한 방법에서, 하나 이상의 DR6 길항제는 DR6에 결합하는 항체, 서열 1의 아미노산 1-354를 포함하는 가용성 DR6 폴리펩티드, DR6 이뮤노어드헤신 및 APP에 결합하는 항체로부터 선택된다. 하나 이상의 p75 길항제는 p75에 결합하는 항체, p75 이뮤노어드헤신 및 서열 6의 아미노산 29-250을 포함하는 가용성 p75 폴리펩티드로부터 선택된다. 본 발명의 임의의 실시양태에서, 상태 또는 장애는 자폐증, 취약성-X 증후군, 레트 증후군, 투렛 증후군, 중독 및 정신분열증이다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 치료제가 상기 포유동물에게 투여된다. 본 발명의 예시적인 특정 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 NGF, 아폽토시스 억제제, EGFR 억제제, β-세크레타제 억제제, γ-세크레타제 억제제, 콜린에스테라제 억제제, 항-A베타 항체 및 NMDA 수용체 길항제로부터 선택된다. 임의로, 하나 이상의 DR6 길항제, p75 길항제 및/또는 추가의 치료제는 주사, 주입 또는 관류를 통해 포유동물에게 투여된다.

본원에 기재된 전장 천연 서열 DR6, p75 및 APP 폴리펩티드에 추가하여, DR6, p75 및 APP 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있음이 고려된다. DR6, p75 및/또는 APP 변이체는 코딩 DNA에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하고/하거나 원하는 폴리펩티드를 합성하여 제조될 수 있다. 당업자는 아미노산 변화가 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드의 번역후 프로세싱의 변경, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화 또는 막 앵커링 특징의 변경을 야기할 수 있음을 이해할 것이다.

본원에 기재된 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 번호 5,364,934에 기재된 것과 같은 보존적 및 비-보존적 돌연변이에 대한 임의의 기술 및 지침 등을 사용하여 형성될 수 있다. 변이는 천연 서열 폴리펩티드에 비해 아미노산 서열에서의 변화를 야기하는, 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인에서 적어도 하나의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 어느 아미노산 잔기가 원하는 활성에 불리한 영향을 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 결정할 때의 지침은 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드의 서열을 공지의 상동성 단백질 분자와 비교하고 높은 상동성 영역에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 확인될 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 구조적 및/또는 화학적 특성이 유사한 또 다른 아미노산으로 대체한 결과일 수 있고, 예를 들어 류신을 세린으로 대체한, 즉, 보존적 아미노산 대체의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산 범위에 걸쳐 이루어질 수 있다. 허용되는 변이는 서열에서 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고, 생성되는 변이체를 DR6, p75 및/또는 APP 길항 활성에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다.

본원에서는 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드 단편이 제공된다. 이러한 단편은 예를 들어 전장 천연 단백질과 비교할 때 N-말단 또는 C-말단에서 말단절단된 것일 수도 있고, 또는 내부 잔기가 결실된 것일 수도 있다. 특정 단편에서는 DR6 폴리펩티드의 원하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결실되어 있다.

DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드 단편은 임의의 많은 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 원하는 펩티드 단편을 화학적으로 합성할 수 있다. 대안적인 접근법은 효소적 소화에 의해, 예를 들어 단백질을 이것을 특정 아미노산 잔기로 제한되는 부위에서 절단하는 것으로 공지된 효소로 처리하거나, 또는 DNA를 적합한 제한 효소로 소화시켜 폴리펩티드 단편을 생성하고, 원하는 단편을 단리하는 것을 포함한다. 또 다른 적합한 기술은 원하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시키는 것을 포함한다. DNA 단편의 원하는 말단을 제한하는 올리고뉴클레오티드를 PCR에서의 5' 및 3' 프라이머에서 사용한다.

특정한 실시양태에서, 관심 보존적 치환은 하기 표에서 바람직한 치환이라는 제목하에 제시되어 있다. 이러한 치환이 생물학적 활성을 변화시키는 경우에는 하기 표에 예시적인 치환이라 명명되거나 아미노산 부류에 대해 아래에서 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝한다.

DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 실체의 실질적인 변형은, (a) 치환 영역에서 폴리펩티드 주쇄의 구조가 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지되거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성이 유지되거나, 또는 (c) 측쇄의 크기가 유지되는데 미치는 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성을 기초로 하기 군으로 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 이러한 치환된 잔기를 또한 보존적 치환 부위에, 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비-보존된) 부위에 도입할 수 있다.

변이는 당업계 공지의 방법, 예컨대 올리고뉴클레오티드-매개 (부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이유발을 이용하여 이루어질 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발 (문헌 [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)]; [Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)]), 카세트 돌연변이유발 (문헌 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)]), 제한 선택 돌연변이유발 (문헌 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)]) 또는 다른 공지된 기술을 클로닝된 DNA 상에서 수행하여, DR6 폴리펩티드 변이체 DNA를 생성할 수 있다.

인접한 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인하기 위해 스캐닝 아미노산 분석을 이용할 수도 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 알라닌이 이러한 군에서 전형적으로 바람직한 스캐닝 아미노산이고, 이는 베타-탄소를 지나 존재하는 측쇄를 제거하고, 변이체의 주쇄 형태를 변경시킬 가능성이 적기 때문이다 (문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]). 알라닌은 또한 가장 흔한 아미노산이기 때문에 전형적으로 바람직하다. 추가로, 알라닌은 종종 매립된 위치 및 노출된 위치 둘 다에서 발견된다 (문헌 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.)]; [Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]). 알라닌 치환이 적당량의 변이체를 생성하지 않을 경우에는 이소테릭 아미노산을 사용할 수 있다.

DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드의 적당한 형태 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기도 상기 분자의 산화 안정성을 개선하고 이상 가교를 저해하기 위해서 일반적으로는 세린으로 치환시킬 수 있다. 반대로, DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드의 안정성을 개선시키기 위해서는 시스테인 결합(들)을 상기 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드에 부가할 수 있다.

본원에 개시된 본 발명의 실시양태는 매우 다양한 APP 폴리펩티드에 적용된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 예를 들어 APP는 서열 3-5에 나타낸 전장 695, 750 또는 770 APP 이소형이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, APP는 APP 엑토도메인을 갖고 번역후 프로세싱 사건으로부터 생성된 APP의 N-말단 부분을 포함한다 (예를 들어, sAPPα 또는 sAPPβ). 임의로, 예를 들어, APP는 세크레타제에 의한 절단으로부터 생성되는 695, 750 또는 770 APP 이소형 중 하나의 가용성 형태, 예를 들어 β-세크레타제에 의한 절단으로부터 생성되는 뉴런 APP₆₉₅의 가용성 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 특정 실시양태에서, APP는 APP₆₉₅의 아미노산 20-591을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Jin et al., J. Neurosci., 14(9): 5461-5470 (1994)] 참조). 본 발명의 또 다른 실시양태에서, APP는 모노클로날 항체 22C11 (예를 들어, 케미콘 인터내셔날 인크.(Chemicon International Inc.) (미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재)로부터 입수가능한 것)에 의해 인식되는 에피토프를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 임의로, APP는 22C11 에피토프를 함유하는 영역인 APP₆₉₅의 잔기 66-81을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Hilbrich, J. Biol.Chem. 268 (35):26571-26577 (1993)] 참조).

하기 기재는 주로 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드-코딩 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양하여 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드를 생성하는 것에 관한 것이다. 물론, DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드를 제조하기 위해 당업계에 공지된 대안적인 방법을 이용할 수도 있다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열 또는 그의 일부는 고체-상 기술을 이용한 직접적인 펩티드 합성 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)]; [Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)] 참조)에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 펩티드 합성기 (캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 달성될 수 있다. DR6 및/또는 APP 폴리펩티드의 다양한 부분들을 별도로 화학적으로 합성하고, 원하는 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드가 생성되도록 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 조합할 수 있다.

기재된 방법 및 기술은 DR6, p75 및/또는 APP 변이체, DR6, p75 및/또는 APP의 변형된 형태 및 DR6, p75 및/또는 APP 항체의 생성에 유사하게 적용될 수 있다.

DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 단리

DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드 mRNA를 보유하고 이를 검출가능한 수준으로 발현한다고 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 인간 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드 DNA는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득될 수 있다. DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드-코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지의 합성 절차 (예를 들어, 자동화 핵산 합성)으로 수득될 수도 있다.

라이브러리는 관심 유전자 또는 그에 의해 코딩되는 단백질을 확인하도록 설계된 프로브 (예를 들어 적어도 약 20 내지 80개 염기의 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 표준 절차를 이용하여 수행될 수 있다. DR6 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 단리하는 대안적인 수단은 PCR 방법을 이용하는 것이다 (문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]; [Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]).

cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성이 최소화되도록 충분한 길이이고 충분히 분명해야 한다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 스크리닝될 라이브러리 내의 DNA에 대한 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지된다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고, ³²P-표지된 ATP와 같은 방사능표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간 정도의 엄격도 및 고엄격도를 포함하는 혼성화 조건은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에서 제공된다.

이러한 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 공공 데이터베이스, 예를 들어 진뱅크(GenBank) 또는 다른 사설 서열 데이터베이스에 기탁되고 이로부터 이용가능한 다른 공지의 서열과 비교 및 정렬될 수 있다. 분자의 제한된 영역 내의 서열 동일성 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준)은 당업계에 공지되고 본원에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 결정될 수 있다.

단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 본원에서 최초로 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고, 필요한 경우에는 cDNA로 역전사될 수 없는 mRNA의 전구체 및 프로세싱 중간체를 검출하기 위해 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같은 통상적인 프라이머 연장 절차를 이용함으로써, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 얻을 수 있다.

숙주 세포의 선택 및 형질전환

숙주 세포를 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드 생성에 대해 본원에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 중에서 배양한다. 배양 조건, 예컨대 배지, 온도, pH 등은 당업자가 과도한 실험 없이 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생성성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 실제 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 [Sambrook et al., 상기 문헌]에서 찾을 수 있다.

진핵 세포 형질감염 및 원핵 세포 형질전환의 방법, 예를 들어 CaCl₂, CaPO₄, 리포솜-매개 및 전기천공은 당업자에게 공지되어 있다. 사용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리, 또는 전기천공은 일반적으로 원핵생물에 대해 사용된다. 문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315 (1983)] 및 WO 89/05859 (1989년 6월 29일 공개)에 기재된 바와 같이, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 이러한 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우에는, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전 방법을 이용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 측면은 미국 특허 번호 4,399,216에 기재되어 있다. 효모로의 형질전환은 전형적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, DNA를 세포에 도입하기 위한 다른 방법, 예를 들어 핵 미세주입, 전기천공, 무손상 세포와 박테리아 원형질체의 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴에 의한 방법이 이용될 수도 있다. 포유동물 세포를 형질전환하는 다양한 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.

본원에서 벡터 내 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물의 세포를 포함한다. 적합한 원핵생물은 유박테리움, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae), 예컨대 이. 콜라이(E. coli)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예컨대 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 공개적으로 입수가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 엔테로박테리아세아에, 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella) 뿐만 아니라 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실루스 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시된 바실루스 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적이다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주 중 하나이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비한다. 예를 들어 균주 W3110은 숙주에 내인성인 단백질을 코딩하는 유전자에 유전자 돌연변이가 발생하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4, 및 미국 특허 번호 4,946,783 (1990년 8월 7일 허여)에 개시된 돌연변이체 주변세포질 프로테아제를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 대안적으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.

원핵생물 뿐만이 아니라 진핵 미생물, 예를 들어 필라멘트형 진균 또는 효모 역시 DR6 폴리펩티드-코딩 벡터의 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 사용되는 보다 낮은 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (문헌 [Beach and Nurse (1981) Nature, 290:140]; EP 139,383 (1985년 5월 2일 공개)); 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 번호 4,943,529; 문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)]), 예컨대 예를 들어 클루이베로미세스 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; 문헌 [Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 (1983)]), 클루이베로미세스 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로미세스 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 클루이베로미세스 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로미세스 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 클루이베로미세스 드라소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906; 문헌 [Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)]), 클루이베로미세스 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 클루이베로미세스 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070; 문헌 [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1998)]); 칸디다(Candida); 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) (문헌 [Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)]); 슈와니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈와니오미세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) (EP 394,538 (1990년 10월 31일 공개)); 및 필라멘트형 진균, 예컨대 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) (WO 91/00357 (1991년 1월 10일 공개)), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans) (문헌 [Ballance et al. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289]; [Tilburn et al. (1983) Gene, 26:205-221]; [Yelton et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474]) 및 아스페르길루스 니거(A. niger) (문헌 [Kelly and Hynes (1985) EMBO J. 4:475-479])가 포함된다. 메틸영양요구성 효모가 본원에서 적합하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다, 클로에케라(Kloeckera), 피치아, 사카로미세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어진 속으로부터 선택된, 메탄올에서 성장할 수 있는 효모를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 클래스의 효모의 예시적인 특정 종의 목록은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에서 찾을 수 있다.

글리코실화 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 곤충 세포, 예컨대 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9 뿐만 아니라, 식물 세포, 예컨대 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 세포 배양물을 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (쐐기벌레), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용성 곤충 숙주 세포가 확인된 바 있다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하고, 이같은 바이러스들은, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로 사용될 수 있다.

그러나, 관심은 척추동물 세포에서 가장 컸으며, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식이 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (293 세포 또는 현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포 (문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al. (1982) Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 주 (Hep G2)를 포함한다.

숙주 세포를 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 생성에 대해 상기한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 중에서 배양한다.

복제가능한 벡터의 선택과 사용

DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)을 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 이용가능하다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열을 다양한 절차를 통해 벡터에 삽입할 수 있다. 일반적으로, 당업계 공지의 기술을 이용하여, DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 성분 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 이용한다.

DR6, p75 및/또는 APP는 재조합 방식으로 직접 생성될 수도 있고, 또한 신호 서열일 수도 있고 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드일 수도 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생성될 수도 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수도 있고, 또는 벡터로 삽입되는 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드-코딩 DNA의 일부일 수도 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, 알파 인자 리더 (사카로미세스 및 미국 특허 번호5,010,182에 기재된 클루이베로미세스 α-인자 리더 포함) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일에 공개된 EP 362,179) 또는 WO 90/13646 (1990년 11월 15일 공개)에 기재된 신호일 수 있다. 포유동물 세포 발현시에, 포유동물 신호 서열, 예컨대 동일 또는 관련 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더가 단백질의 분비를 지시하는데 사용될 수 있다.

발현 벡터 및 클로닝 벡터는 둘 다 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다.

발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 선택가능한 마커라고도 불리는 선택 유전자를 함유할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 얻을 수 없는 중요 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 바실루스의 경우에는 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.

포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드-코딩 핵산의 흡수에 감응성이 있는 세포를 확인할 수 있게 하는 것, 예컨대 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적절한 숙주 세포는 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조하여 증식시킨, DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이다. 효모에서 사용하기에 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]; [Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)]; [Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]). trp1 유전자는 트립토판 중에서의 성장 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 (문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]).

발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 mRNA 합성을 지시하는, DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드-코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 (문헌 [Chang et al. (1978) Nature, 275:615]; [Goeddel et al. (1979) Nature, 281:544]), 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel, Nucl. Acids Res., 8:4057 (1980)]; EP 36,776) 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터 (문헌 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]를 포함한다. 또한, 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) (S.D.) 서열을 함유할 것이다.

효모 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 (문헌 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]) 또는 다른 당분해 효소 (문헌 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)]; [Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)]), 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.

성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드 전사는 예를 들어 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일에 공개된 UK 2,211,504), 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈에서 얻은 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 및 열 충격 프로모터 (단, 이러한 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용가능한 경우)에 의해 제어된다.

고등 진핵생물에 의한 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 그의 전사를 증가시키도록 프로모터에 대해 작용하는, 보통 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스 작용 요소이다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 이것의 예는 복제 기점의 하류 쪽 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드 코딩 서열의 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터 역시 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 흔히 이용가능하다. 이들 영역은 DR6 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다.

여전히 재조합 척추동물 세포 배양물에서 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드의 합성에 이용하기에 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)]; [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)]; EP 117,060; 및 EP 117,058에 기재되어 있다.

숙주 세포의 배양

본 발명의 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드를 생성하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지 중에서 배양될 수 있다. 시판 배지, 예컨대 햄 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 ((MEM), 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ((DMEM), 시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기술된 배지들 중 임의의 배지를 숙주 세포용 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지에는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 겐타마이신(GENTAMYCIN)^TM 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원이 보충될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충물을 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함시킬 수도 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 이용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.

유전자 증폭/발현의 검출

유전자 증폭 및/또는 발현은 본원에서 제공되는 서열을 기초로 하여 예를 들어 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하는 노던 블롯팅 (문헌 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)]), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 적절하게 표지된 프로브를 사용한 계내 혼성화에 의해 샘플 중에서 직접 측정될 수 있다. 대안적으로, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함한 특정 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 다시, 항체를 표지할 수 있고, 듀플렉스가 표면에 결합하는 검정을 수행하여, 표면 상에 듀플렉스가 형성되었을 때 듀플렉스에 결합된 항체의 존재가 검출될 수 있도록 할 수 있다.

대안적으로 유전자 발현은 유전자 생성물의 발현을 직접적으로 정량화하기 위해, 면역학적 방법, 예컨대 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 검정에 의해 측정될 수 있다. 면역조직화학 염색 및/또는 샘플 유체의 검정에 유용한 항체는 모노클로날이거나 폴리클로날일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조될 수 있다. 편리하게는, 항체는 천연 서열 DR6 폴리펩티드 또는 본원에서 제공되는 DR6 서열을 기초로 하는 합성 펩티드 또는 DR6 DNA에 융합되고 특이적 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대해 제조될 수 있다.

DR6 폴리펩티드의 정제

DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드의 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우에는, 적합한 세제 용액 (예를 들어, 트리톤(Triton)-X 100)을 사용하거나 효소적 절단에 의해 이것을 막으로부터 방출시킬 수 있다. DR6 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예를 들어 동결-해동 주기, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제에 의해 파괴할 수 있다.

재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드를 정제하고자 할 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과; 오염물, 예컨대 IgG를 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 칼럼; 및 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드의 에피토프-태그 부착된 형태에 결합하기 위한 금속 킬레이팅 칼럼. 다양한 단백질 정제 방법을 이용할 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)]; [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)는 예를 들어 이용된 생성 공정의 성질, 및 생성된 특정 DR6 폴리펩티드에 따라 결정될 것이다.

DR6, p75 및/또는 APP의 가용성 형태는 본 발명의 방법에서 DR6 길항제 또는 p75 길항제로서 사용될 수 있다. 이러한 가용성 형태의 DR6, p75 및/또는 APP는 하기 기재한 바와 같은 변형 (예를 들어, 이뮤노글로불린, 에피토프 태그 또는 류신 지퍼에 대한 융합에 의한 변형)을 포함할 수 있다. 이뮤노어드헤신 분자가 본원의 방법에서의 사용에 대해 추가로 고려된다. DR6, p75 및/또는 APP 이뮤노어드헤신은 다양한 형태의 DR6, p75 및/또는 APP, 예컨대 전장 폴리펩티드 뿐만 아니라 DR6, p75 및/또는 APP의 가용성 세포외 도메인 형태 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 분자는 DR6 폴리펩티드와 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역의 융합체를 포함할 수 있다. 2가 형태의 이뮤노어드헤신의 경우, 이러한 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역을 포함할 수 있다. Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 영역 대신에 폴리펩티드의 가용성 형태 (막횡단 도메인이 결실되거나 불활성화된 형태)를 사용하는 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 융합체는 힌지, C_H2 및 C_H3, 또는 IgG1 분자의 힌지, C_H1, C_H2 및 C_H3 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 융합체의 생성에 대해서는, 또한 1995년 6월 27일에 허여된 미국 특허 번호 5,428,130 및 문헌 [Chamow et al., TIBTECH, 14:52-60 (1996)]을 참조한다.

임의의 이뮤노어드헤신 설계는 어드헤신의 결합 도메인(들) (예를 들어, DR6, p75 및/또는 APP 엑토도메인)을 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역과 조합한다. 통상적으로, 본 발명의 이뮤노어드헤신을 제조할 때, 어드헤신의 결합 도메인을 코딩하는 핵산이 C-말단에서 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 융합될 것이지만, N-말단 융합체 또한 가능하다.

전형적으로, 이러한 방식으로, 코딩된 키메라 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 중쇄의 불변 영역의 적어도 기능적으로 활성인 힌지, C_H2 및 C_H3 도메인을 보유할 것이다. 융합은, 불변 도메인의 Fc 부분의 C-말단에, 또는 중쇄의 C_H1 또는 경쇄의 상응하는 영역에 대한 N-말단 바로 근처에서도 이루어진다. 융합체가 제조되는 정확한 부위는 중요하지 않다; 특정 부위들이 잘 공지되어 있고, 이뮤노어드헤신의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특징을 최적화하기 위해 선택될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 어드헤신 서열은 이뮤노글로불린 G₁ (IgG₁)의 Fc 영역의 N-말단에 융합된다. 전체 중쇄 불변 영역을 어드헤신 서열에 융합시키는 것이 가능하다. 그러나, 보다 바람직하게는, IgG Fc를 화학적으로 제한하는 파파인 절단 부위 (즉, 중쇄 불변 영역의 첫번째 잔기를 114로 간주했을 때 잔기 216), 또는 다른 이뮤노글로불린의 유사 부위의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작되는 서열이 융합에 사용된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 어드헤신 아미노산 서열은 IgG 중쇄의 (a) 힌지 영역 및 C_H2 및 C_H3 또는 (b) C_H1, 힌지, C_H2 및 C_H3 도메인에 융합된다.

이중특이적 이뮤노어드헤신의 경우, 이뮤노어드헤신은 다량체로서, 특히 이종이량체 또는 이종사량체로서 어셈블리된다. 일반적으로, 이러한 어셈블리된 이뮤노글로불린은 공지된 단위 구조를 가질 것이다. 기본적인 4쇄 구조 단위는 IgG, IgD 및 IgE가 존재하는 형태이다. 더 높은 분자량의 이뮤노글로불린에서는 4쇄 단위가 반복되고, IgM은 일반적으로 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 4개의 기본 단위의 오량체로서 존재한다. IgA 글로불린, 및 때때로 IgG 글로불린은 혈청 내에서 다량체 형태로 존재할 수도 있다. 다량체의 경우, 각각의 4개 단위는 동일하거나 상이할 수 있다.

본원의 범위 내에 속하는 다양한 예시적인 어셈블리된 이뮤노어드헤신을 아래에서 요약적으로 나타낸다:

(a) AC_L-AC_L;

(b) AC_H-(AC_H, AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, 또는 V_LC_L-AC_H);

(c) AC_L-AC_H-(AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, V_LC_L-AC_H, 또는 V_LC_L-V_HC_H);

(d) AC_L-V_HC_H-(AC_H, 또는 AC_L-V_HC_H, 또는 V_LC_L-AC_H);

(e) V_LC_L-AC_H-(AC_L-V_HC_H, 또는 V_LC_L-AC_H); 및

(f) (A-Y)_n-(V_LC_L-V_HC_H)₂,

여기서, 각각의 A는 동일하거나 상이한 어드헤신 아미노산 서열을 나타내고,

V_L은 이뮤노글로불린 경쇄 가변 도메인이고;

V_H는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인이고;

C_L은 이뮤노글로불린 경쇄 불변 도메인이고;

C_H는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인이고;

n은 1 초과의 정수이고;

Y는 공유 가교제의 잔기를 나타낸다.

간결하게 나타내기 위해, 상기 구조는 주요 특징만을 제시하고, 이뮤노글로불린의 연결 (J) 또는 다른 도메인은 나타내지 않았으며, 디술피드 결합도 제시되지 않았다. 그러나, 이러한 도메인이 결합 활성에 필요한 경우, 이들은 이뮤노글로불린 분자 내에서 차지하는 통상적인 위치 내에 존재하도록 구축될 것이다.

대안적으로, 키메라 중쇄를 포함하는 이뮤노글로불린이 수득되도록 어드헤신 서열이 이뮤노글로불린 중쇄 서열과 경쇄 서열 사이에 삽입될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 힌지와 C_H2 도메인 사이 또는 C_H2 도메인과 C_H3 도메인 사이에서 이뮤노글로불린의 각 아암 내의 이뮤노글로불린 중쇄의 3' 말단에 어드헤신 서열이 융합된다. 유사한 구축물이 문헌 [Hoogenboom et al., Mol. Immunol., 28:1027-1037 (1991)]에서 보고되었다.

이뮤노글로불린 경쇄의 존재가 본 발명의 이뮤노어드헤신에 필요하지는 않지만, 이뮤노글로불린 경쇄가 어드헤신-이뮤노글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유 결합되거나 어드헤신에 직접 융합되어 존재할 수 있다. 전자의 경우, 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 어드헤신-이뮤노글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 전형적으로 동시-발현된다. 분비시, 하이브리드 중쇄 및 경쇄가 공유 결합되어 2개의 디술피드-연결 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 이뮤노글로불린-유사 구조가 제공될 것이다. 이러한 구조의 제조에 적합한 방법은 예를 들어 1989년 3월 28일에 허여된 미국 특허 번호 4,816,567에 개시되어 있다.

가장 편리하게는, 이뮤노어드헤신은 어드헤신 부분을 코딩하는 cDNA 서열을 이뮤노글로불린 cDNA 서열에 인-프레임으로 융합시켜 구축된다. 그러나, 게놈 이뮤노글로불린 단편에 대한 융합이 이용될 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990)]; 및 [Stamenkovic et al., Cell, 66:1133-1144 (1991)] 참조). 후자 유형의 융합에는 발현을 위한 Ig 조절 서열의 존재가 필요하다. 혼성화 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술에 의해 비장 또는 말초혈 림프구로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터의 공개된 서열을 기초로 하여 IgG 중쇄 불변 영역을 코딩하는 cDNA를 단리할 수 있다. 이뮤노어드헤신의 "어드헤신" 및 이뮤노글로불린 부분을 코딩하는 cDNA를 선택된 숙주 세포에서의 효율적인 발현을 지시하는 플리스미드 벡터 내에 일렬로 삽입한다.

또 다른 실시양태에서, DR6 길항제는 미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 기재된 방식으로 다양한 비-단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나 또는 다른 유사 분자, 예컨대 폴리글루타메이트에 수용체 폴리펩티드를 연결함으로써 공유결합에 의해 변형될 수 있다. 이러한 PEG화 형태는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

이들 분자의 류신 지퍼 형태도 본 발명에서 고려된다. "류신 지퍼"는 당업계에서 그의 융합 파트너 (예를 들어, 류신 지퍼가 융합되거나 연결되는 서열 또는 분자)의 이량체화 또는 삼량체화를 증진, 촉진 또는 구동하는 류신 풍부 서열을 지칭하는데 사용되는 용어이다. 다양한 류신 지퍼 폴리펩티드가 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Landschulz et al., Science, 240:1759 (1988)]; 미국 특허 5,716,805; WO 94/10308; [Hoppe et al., FEBS Letters, 344:1991 (1994)]; [Maniatis et al., Nature, 341:24 (1989)]을 참조한다. 당업자는 류신 지퍼 서열이 DR6 또는 p75 분자의 5' 또는 3' 말단에서 융합될 수 있음을 알 것이다.

또한, 본 발명의 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드를 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합시켜 키메라 분자를 형성시키는 방식으로 변형될 수도 있다. 바람직하게는, 이러한 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 키메라 분자를 올리고머화하는 작용을 하는 것이다. 한 실시양태에서, 이러한 키메라 분자는 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드와 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 이러한 에피토프-태그가 부착된 형태의 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공함으로써 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화도 매트릭스를 사용한 친화도 정제에 의해 폴리펩티드를 쉽게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 이것의 예는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그, 플루 HA 태그 폴리펩티드 및 이것의 항체 12CA5 (문헌 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]), c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (문헌 [Evan et al., Mol. Cell. Biol., 5:3610-3616 (1985)]), 및 단순 포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 이것의 항체 (문헌 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)])를 포함한다. 다른 태그 폴리펩티드는 플래그-펩티드 (문헌 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]), KT3 에피토프 펩티드 (문헌 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]), 알파-튜불린 에피토프 펩티드 (문헌 [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]) 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (문헌 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)])를 포함한다.

항-DR6, 항-p75 및 항-APP 항체

본 발명의 다른 실시양태에서, DR6, p75 및/또는 APP 항체가 제공된다. 예시적인 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 항-DR6, p75 및/또는 APP 항체는 바람직하게는 DR6 길항제 항체이다.

폴리클로날 항체

본 발명의 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는, 예를 들어 면역화제 및 원하는 경우 아주반트의 1회 이상의 주사에 의해 포유동물에서 생성될 수 있다. 전형적으로, 면역화제 및/또는 아주반트는 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물에 주사될 것이다. 면역화제는 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드 (예를 들어, DR6, p75 및/또는 APP ECD) 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화시킬 포유동물에서 면역원성인 것으로 공지된 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 면역원성 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 아주반트의 예는 프로인트(Freund) 완전 아주반트 및 MPL-TDM 아주반트 (모노포스포릴 리피드 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험 없이 당업자가 선택할 수 있다. 이후, 포유동물로부터 채혈하여 혈청을 DR6 및/또는 APP 항체 역가에 대해 검정할 수 있다. 원한다면, 포유동물을 항체 역가가 증가하거나 안정될 때까지 부스팅할 수 있다.

모노클로날 항체

대안적으로, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 전형적으로는 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 면역화제로 면역화하여, 항체를 생성하거나 생성할 수 있고 상기 면역화제에 특이적으로 결합할 림프구를 유발한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다.

면역화제는 전형적으로 DR6, p75 및/또는 APP 폴리펩티드 (예를 들어, DR6, p75 및/또는 APP ECD) 또는 그의 융합 단백질, 예컨대 DR6 ECD-IgG, p75 ECD-IgG 및/또는 APP sAPP-IgG 융합 단백질을 포함할 것이다.

일반적으로, 인간 기원의 세포가 필요하면 말초 혈액 림프구 ("PBL")를 사용하거나, 비-인간 포유동물 공급원이 필요하면 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 이후, 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 불멸화 세포주와 융합시켜서 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]). 불멸화 세포주는 일반적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결여된 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이다 ("HAT 배지").

바람직한 불멸화 세포주는, 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 발현을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것들이다. 보다 바람직한 불멸화 세포주는, 예를 들어 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) 및 버지니아주 매너시스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 수득할 수 있는 뮤린 골수종 세포주이다. 이러한 뮤린 골수종 세포주의 예는 P3X63Ag8U.1 (ATCC CRL 1580)이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 기재된 바 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]).

이후, 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지를 대상으로 하여 DR6, p75 및/또는 APP에 대해 지시된 모노클로날 항체의 존재에 대해 검정할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강법 또는 시험관내 결합 검정법, 예컨대 방사성면역검정법 (RIA) 또는 효소-연결된 면역 흡착 검정법 (ELISA)에 의해 결정된다. 이러한 기술 및 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드 분석 또는 비아코어 분석에 의해 결정할 수 있다.

원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 제한 희석 절차로 서브클로닝하고 표준 방법 (문헌 [Goding, 상기 문헌])으로 성장시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 둘베코 변형 이글 배지 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포를 포유동물에서 복수로서 생체내 성장시킬 수도 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 또는 정제될 수 있다.

또한, 모노클로날 항체는 재조합 DNA 방법, 예컨대 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 방법으로 제조될 수도 있다. 통상적인 절차 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함)을 이용하여 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 쉽게 단리하고 서열분석한다. 하이브리도마 세포는 이같은 DNA의 바람직한 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 후 이러한 벡터를 형질감염되지 않으면 이뮤노글로불린 단백질을 생성하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성물을 수득하였다. 또한, DNA는 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 사용하거나 (문헌 [Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)]), 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 연결시켜 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 본원의 항-DR6 모노클로날 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.

전형적으로, 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드가 본 발명의 항체의 불변 도메인을 대신하거나, 또는 이들이 본 발명의 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 대신하여 DR6에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.

또한, 키메라 또는 하이브리드 항체는 가교제의 사용을 포함하는 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내 제조될 수도 있다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 면역독소를 구축할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 들 수 있다.

단일 쇄 Fv 단편은 또한 문헌 [Iliades et al., FEBS Letters, 409:437-441 (1997)]에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. 다양한 링커를 사용하는 이러한 단일 쇄 단편의 커플링은 문헌 [Kortt et al., Protein Engineering, 10:423-433 (1997)]에 기재되어 있다. 항체의 재조합 생성 및 조작을 위한 다양한 기술이 당업계에 널리 공지되어 있다. 전형적으로 당업자에 의해 이용되는 이러한 기술의 설명적 예는 아래 보다 상세하게 기재된다.

인간화 항체

일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 내부에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "유입" 가변 도메인의 것이다. 인간화는 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열 대신 사용함으로써 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 수행될 수 있다.

따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인에 실질적으로 미치지 못하는 부분이 비-인간 종의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

항원에 대한 높은 결합 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특징을 보유하도록 항체를 인간화하는 것이 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 공지되어 있다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가가 달성되도록 FR 잔기를 컨센서스 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합할 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 CDR 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.

인간 항체

인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 예를 들어 문헌 [Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984)], 및 [Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]에 기재되어 있다.

면역화시에 내인성 이뮤노글로불린의 생성 없이 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생성이 완전히 억제된다고 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이같은 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 접종시 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993)]을 참조한다.

멘데즈(Mendez) 등의 문헌 [Nature Genetics 15: 146-156 (1997)]에서는 상기 기술이 추가로 개선되었고, 항원으로의 시험투여시에 고친화도의 완전 인간 항체를 생성하는 "크세노마우스(Xenomouse) II"라고 명명된 트랜스제닉 마우스 계통을 생성시켰다. 이것은 메가베이스의 인간 중쇄 및 경쇄 로커스를 상기한 바와 같이 내인성 J_H 절편이 결실된 마우스에게 배선 통합시켜서 달성되었다. 크세노마우스 II는 대략 66개의 V_H 유전자, 완전한 D_H 및 J_H 영역 및 3개의 상이한 불변 영역 (μ, δ 및 χ)을 함유하는 1,020 kb의 인간 중쇄 로커스를 보유하고, 또한 32개의 Vκ 유전자, Jκ 절편 및 Cκ 유전자를 함유하는 800 kb의 인간 κ 로커스를 보유한다. 이러한 마우스에서 생성된 항체는 유전자 재배열, 어셈블리 및 레퍼토리를 포함하는 모든 측면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하다. 인간 항체는 뮤린 로커스에서 유전자 재배열을 방지하는 내인성 J_H 절편의 결실에 의해 내인성 항체보다 우선적으로 발현된다.

대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348, 552-553 (1990)])을 이용하여, 면역화되지 않은 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 생성할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 코트 단백질 유전자로 인 프레임으로 클로닝하고, 파지 입자의 표면상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택에 의해 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자도 선택된다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 이에 대한 검토를 위해 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993)]을 참조한다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합형 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 단리되었다. 비면역화된 인간 공여자로부터 V 유전자 레퍼토리를 구축할 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자기-항원 포함)에 대한 항체는 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993)]에 기재되어 있는 기술에 따라서 본질적으로 단리될 수 있다. 천연 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 비율로 돌연변이를 축적한다 (체세포 과다돌연변이). 도입된 변화 중 일부는 더 높은 친화도를 부여할 것이고, 고친화도 표면 이뮤노글로불린을 디스플레이하는 B 세포가 후속 항원 접종 동안 우선적으로 복제 및 분화된다. 이러한 천연 과정은 "쇄 셔플링"으로 공지된 기술 (문헌 [Marks et al., Bio/Technol. 10, 779-783 [1992]])을 이용하여 모방할 수 있다. 이 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 얻은 "일차" 인간 항체의 친화도는 면역화되지 않은 공여자로부터 얻은 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체의 레퍼토리로 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 순차적으로 대체함으로써 개선시킬 수 있다. 이러한 기술은 nM 범위의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편의 생성을 가능하게 한다. 매우 큰 파지 항체 레퍼토리 ("머더-오브-올 라이브러리즈(mother-of-all libraries)"라고도 공지됨)를 제조하는 전략은 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)]에 기재되어 있다. 유전자 셔플링은 또한 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수도 있고, 이때 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅"이라고도 지칭되는 이러한 방법에 따라, 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자가 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 설치류-인간 키메라를 생성시킨다. 항원에 대한 선택을 통해, 기능적 항원-결합 부위를 회복할 수 있는 인간 가변 도메인을 단리하며, 즉, 에피토프가 파트너 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 나머지 설치류 V 도메인을 대체하기 위해 상기 과정을 반복할 때, 인간 항체가 수득되었다 (1993년 4월 1일에 공개된 PCT 특허 출원 WO 93/06213 참조). CDR 이식에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기술은 설치류 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기가 없는 완전 인간 항체를 제공한다.

아래에서 상세하게 논의되는 바와 같이, 본 발명의 항체는 임의로 단량체 항체, 이량체 항체 뿐만 아니라, 다가 형태의 항체를 포함할 수 있다. 당업자는 당업계에 공지된 기술에 의해 본원의 DR6 및/또는 APP 항체를 사용하여 이러한 이량체 또는 다가 형태를 구축할 수 있다. 1가 항체의 제조 방법도 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 이뮤노글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄는 중쇄 가교를 방지하도록 일반적으로 Fc 영역 내의 임의의 지점에서 절단된다. 대안적으로, 관련 시스테인 잔기는 가교를 방지하도록 또 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.

이중특이적 항체

이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체인 모노클로날 항체이다. 본 발명의 경우에서, 결합 특이성 중 하나는 DR6 수용체에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 또 다른 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다. 한 실시양태에서, 다른 항원은 p75이다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein and Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중에서 오직 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 PCT 출원 공개 번호 WO 93/08829 (1993년 5월 13일 공개) 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

상이하고 보다 바람직한 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 힌지, C_H2 및 C_H3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 융합체의 적어도 하나에는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (C_H1)을 갖는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합물 및 원한다면 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 별개의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동 형질감염된다. 이것은 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비율이 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 큰 가용성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우, 또는 비율이 특별한 유의성을 갖지 않는 경우, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 이러한 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 1994년 3월 3일에 공개된 PCT 공개 번호 WO 94/04690에 개시되어 있다.

이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 세부사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Meth. Enzymol. 121, 210 (1986)]을 참조한다.

이종접합체 항체

이종접합체 항체도 또한 본 발명의 범주에 속한다. 이종접합체 항체는 2개의 공유 결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포의 원치않는 세포로의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980) 및 HIV 감염의 치료 (PCT 출원 공개 번호 WO 91/00360 및 WO 92/200373, EP 03089)를 위해 제안된 바 있다. 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 이종접합체 항체가 제조될 수 있다. 적합한 가교제가 당업계에 잘 공지되어 있고, 수많은 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.

항체 단편

특정 실시양태에서, 항-DR6, 항-p75 및/또는 항-APP 항체 (뮤린, 인간 및 인간화 항체, 및 항체 변이체를 포함함)는 항체 단편이다. 항체 단편 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해 소화를 통해 유래된다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들이 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또 다른 실시양태에서, F(ab')₂ 분자의 어셈블리를 촉진하도록 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 F(ab')₂가 형성된다. 또 다른 접근법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')₂ 단편이 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다양한 기술이 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 파파인을 사용하여 소화를 수행할 수 있다. 파파인 소화의 예는 WO 94/29348 (1994년 12월 22일 공개) 및 미국 특허 번호 4,342,566에 기재되어 있다. 항체를 파파인으로 소화시키면, 전형적으로 Fab 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편 (각각 단일 항원 결합 부위를 가짐) 및 나머지 Fc 단편이 생성된다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성시킨다.

항체 소화로 생성된 Fab 단편 역시 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (C_H1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 C_H1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 나타낸다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 가운데에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

항체의 글리코실화 변이체

항체는 그의 불변 영역 내의 보존된 위치에서 글리코실화된다 (문헌 [Jefferis and Lund, Chem. Immunol. 65:111-128 (1997)]; [Wright and Morrison, TibTECH 15:26-32 [1997]]). 이뮤노글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질의 기능에 영향을 주고 (문헌 [Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318 (1996)]; [Wittwe and Howard, Biochem. 29:4175-4180 (1990)]), 당단백질의 일부 사이의 분자내 상호작용은 당단백질의 형태 및 제시된 3차원 표면에 영향을 줄 수 있다 (문헌 [Hefferis and Lund, 상기 문헌]; [Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416 (1996)]). 올리고사카라이드는 또한 특정 인식 구조를 기초로 하여 주어진 당단백질을 특정 분자로 표적화하는 기능을 할 수도 있다. 예를 들어, 비갈락토실화 IgG에서 내부-C_H2 공간 및 말단 N-아세틸글루코사민 잔기의 올리고사카라이드 모이어티 '플립(flip)' 아웃이 만노스 결합 단백질에 결합하는데 이용가능하게 되었다고 보고되어 있다 (문헌 [Malhotra et al., Nature Med. 1:237-243 (1995)]). 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 생성된 CAMPATH-1H (인간 림프구의 CDw52 항원을 인식하는 재조합 인간화 뮤린 모노클로날 IgG1 항체)로부터의 올리고사카라이드의 글리코펩티다제에 의한 제거는 보체 매개 용해 (CMCL)의 완전한 감소를 야기하지만 (문헌 [Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318 [1996]]), 뉴라미니다제를 사용한 시알산 잔기의 선택적인 제거는 DMCL의 손실을 전혀 야기하지 않았다. 항체의 글리코실화는 또한 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 특히, 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 테트라시클린-조절된 발현을 보이는 CHO 세포가 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다 (문헌 [Umana et al., Mature Biotech. 17:176-180 (1999)]).

항체의 글리코실화 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변경된 변이체이다. 변경은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 결실, 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 항체로의 부가, 글리코실화 조성 (글리코실화 패턴)에서의 변화, 글리코실화 정도에서의 변화 등을 의미한다. 글리코실화 변이체는 예를 들어 항체를 코딩하는 핵산 서열에 대한 하나 이상의 글리코실화 부위의 제거, 변화 및/또는 첨가를 통해 제조될 수 있다.

항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 나타낸다. 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄로 탄수화물 모이어티를 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 어느 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 또한 사용될 수 있다.

항체에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 항체가 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 또한 변경은 원래의 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 달성될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

또한, 항체의 글리코실화 (글리코실화 패턴을 포함함)은 근본적인 뉴클레오티드 서열을 변경시키지 않으면서 변경될 수 있다. 글리코실화는 항체의 발현에 사용된 숙주 세포에 주로 의존적이다. 잠재적인 치료제로서 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현에 사용되는 세포 유형은 천연 세포가 드물기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴의 유의한 변형을 예상할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hse et al., J. Biol. Chem. 272:9062-9070 (1997)] 참조). 숙주 세포의 선택에 추가하여, 항체의 재조합 생성 동안 글리코실화에 영향을 주는 인자는 성장 방식, 배지 제제, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 방식 등을 포함한다. 올리고사카라이드 생성에 관여하는 특정 효소를 도입하거나 과다발현시키는 것을 포함하여 특정 숙주 유기체에서 달성되는 글리코실화 패턴을 변경하기 위한 다양한 방법이 제안된 바 있다 (미국 특허 번호 5,047,335; 5,510,261 및 5.278,299). 글리코실화 또는 특정 유형의 글리코실화는 예를 들어 엔도글리코시다제 H (Endo H)를 사용하여 당단백질로부터 효소에 의해 제거될 수 있다. 추가로, 재조합 숙주 세포는 예를 들어 특정 유형의 폴리사카라이드의 프로세싱에 결함이 있도록 유전공학적으로 조작될 수 있다. 이러한 기술 및 유사 기술은 당업계에 공지되어 있다.

항체의 글리코실화 구조는 렉틴 크로마토그래피, NMR, 질량 분광측정법, HPLC, GPC, 모노사카라이드 조성 분석, 순차적 효소 소화, 및 전하를 기초로 하여 올리고사카라이드를 분리하기 위해 높은 pH의 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 HPAEC-PAD를 포함하는 통상적인 탄수화물 분석 기술에 의해 쉽게 분석될 수 있다. 또한, 분석 목적을 위해 올리고사카라이드를 방출시키는 방법도 공지되어 있고, 이것은 효소 처리 (통상적으로 펩티드-N-글리코시다제 F/엔도-β-갈락토시다제를 사용하여 수행됨), 주로 O-연결 구조를 방출시키기 위한 가혹한 알칼리성 환경을 사용한 제거, 및 N- 및 O-연결된 올리고사카라이드 둘 다를 방출시키기 위해 무수 히드라진을 사용하는 화학적 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 항체

하기 실시예에 기재된 바와 같이, 항-DR6 모노클로날 항체가 확인되었다. 임의의 실시양태에서, 본 발명의 DR6 항체는 본원에 구체적으로 개시된 임의의 항-DR6, 항-p75 및/또는 항-APP 항체와 동일한 생물학적 특징을 가질 것이다.

용어 "생물학적 특징"은 모노클로날 항체의 시험관내 및/또는 생체내 활성 또는 특성, 예컨대 DR6에 특이적으로 결합하거나 DR6 활성화를 차단, 억제 또는 중화시키는 능력을 지칭하는데 사용된다. DR6, p75 및/또는 APP 항체의 특성 및 활성은 하기 실시예에 추가로 기재되어 있다.

임의로, 본 발명의 모노클로날 항체는 하기 실시예에서 구체적으로 특성화된 임의의 항체와 동일한 생물학적 특징을 갖고/갖거나 이들 항체와 동일한 에피토프(들)에 결합할 것이다. 이것은 다양한 검정, 예컨대 본원 및 실시예에 기재된 검정을 수행하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체가 본원에서 구체적으로 언급된 DR6, p75 및/또는 APP 항체와 동일한 특이성을 갖는지 여부를 결정하기 위해서, 이것의 활성을 경쟁적 결합 검정으로 비교할 수 있다. 추가로, 특정 항-DR6, p75 및/또는 APP 항체가 결합하는 에피토프는 DR6, p75 및/또는 APP와 해당 항체 사이의 복합체에 대한 결정구조 연구에 의해 결정될 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이, DR6, p75 및/또는 APP 항체는 바람직하게는 원하는 DR6, p75 또는 APP 길항 활성을 보유할 것이다. 상기 항체는 키메라, 인간화, 인간, 및 친화도 성숙 항체를 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 상기한 바와 같이, DR6, p75 및/또는 APP 항체는 이러한 원하는 활성 또는 특성을 달성하기 위해서 다양한 기술을 이용하여 구축되거나 조작될 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 비-단백질성 중합체에 연결된, 본원에 개시된 항-DR6 수용체, 항-p75 및/또는 항-APP 리간드 항체를 포함한다. 임의로, 본원에 개시된 항-DR6 수용체, 항-p75 및/또는 항-APP 리간드 항체는 글리코실화되거나 또는 대안적으로는 글리코실화되지 않는다.

본 발명의 항체는 "가교된" DR6, p75 및/또는 APP 항체를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "가교된"은 적어도 2개의 IgG 분자가 함께 결합하여 1개의 (또는 단일) 분자를 형성하는 것을 나타낸다. DR6, p75 및/또는 APP 항체는 다양한 링커 분자를 사용하여 가교될 수 있고, 바람직하게는 DR6, p75 및/또는 APP 항체는 항-IgG 분자, 보체, 화학적 변형 또는 분자적 조작을 이용하여 가교된다. 당업자는 세포 표면 막에 항체가 결합하면 보체가 항체 분자에 대해 비교적 높은 친화도를 갖는다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어 보체를 세포 표면 막에 결합된 2개 이상의 항-DR6 항체를 연결시키는 가교 분자로서 사용할 수 있다고 여겨진다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 DR6, p75 및/또는 APP 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 이러한 항체 제조를 위한 재조합 기술을 제공한다.

항체의 재조합 생성을 위해, 이것을 코딩하는 핵산을 단리하여 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 절차 (예를 들어, 항체를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)를 이용하여 서열분석된다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

본원에서의 방법은 항-DR6, 항-p75 및/또는 항-APP 항체 경쇄 또는 중쇄 (또는 경쇄와 중쇄 둘 다)를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 단계, 숙주 세포를 상기 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키는 단계, 및 상기 숙주 세포(들)를 재조합 항-DR6 항체, 항-p75 항체 및/또는 항-APP 항체 생성물을 생성하는데 충분한 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는, 키메라 또는 재조합 항-DR6 및/또는 APP 항체의 생성 방법을 포함한다.

DR6 길항제의 제제

본원에서의 전형적인 제제의 제조시에, 사용되는 성분의 권장 품질 또는 "등급"은 제제의 궁극적인 용도에 따라 달라진다는 것에 주목한다. 치료 용도를 위해서는, 성분(들)이 제약 제품에 대한 첨가제로서 허용되는 등급 (예를 들어, "GRAS")인 것이 바람직하다.

특정 실시양태에서, DR6 및 임의로 p75 길항제(들) 및 DR6 길항제의 용해도 및/또는 안정성을 증진시키는데 충분한 이온 강도를 제공하는 하나 이상의 부형제를 포함하는 조성물이 제공하고, 상기 조성물의 pH는 6 (또는 약 6) 내지 9 (또는 약 9)이다. DR6 및 p75 길항제는 예를 들어 상기 방법에 따라 단백질의 원하는 순도 달성에 적합한 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 길항제는 숙주 세포에서 재조합 방식으로 발현되거나 또는 화학적 합성에 의해 제조된다. 제제 내의 DR6 또는 p75 길항제의 농도는 예를 들어 제제의 의도된 용도에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 DR6 또는 p75 길항제의 원하는 농도를 결정할 수 있다.

제제 중에서 DR6 또는 p75 길항제의 용해도 및/또는 안정성을 증진시키는데 충분한 이온 강도를 제공하는 하나 이상의 부형제는 임의로 다이온성 유기 또는 무기의 산, 아스파르테이트, 황산나트륨, 숙신산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 캅티솔(Captisol)^TM, 트리스, 아르기닌 염 또는 다른 아미노산, 당 및 폴리올, 예컨대 트레할로스 및 수크로스이다. 바람직하게는, 제제 중에서 충분한 이온 강도를 제공하는 하나 이상의 부형제는 염이다. 사용될 수 있는 염은 나트륨 염 및 아르기닌 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사용되는 염의 유형 및 염의 농도는, 제제가 제제 중의 DR6 길항제가 안정될 수 있는 비교적 높은 이온 강도를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 임의로, 염은 제제 중에 약 20 mM 내지 약 0.5 M의 농도로 존재한다.

조성물의 pH는 바람직하게는 6 (또는 약 6) 내지 9 (또는 약 9), 보다 바람직하게는 약 6.5 내지 약 8.5, 훨씬 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서, 상기 조성물은 이것의 pH를 적어도 약 6 내지 약 8로 유지하는 완충제를 추가로 포함할 것이다. 사용될 수 있는 완충제의 예는 트리스, 헤페스 및 히스티딘을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 트리스를 사용하는 경우, pH는 약 7 내지 8.5로 임의로 조정될 수 있다. 헤페스 또는 히스티딘을 사용하는 경우, pH는 약 6.5 내지 7로 임의로 조정될 수 있다. 임의로, 완충제는 제제 중에 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도로 사용된다.

특히, 액체 제제 (또는 재구성되는 동결건조된 제제)의 경우, 조성물에 하나 이상의 계면활성제를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 계면활성제는 예를 들어 비이온계 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)^TM 또는 플루로닉스(PLURONICS)^TM (예를 들어, 폴리소르베이트 또는 폴록사머)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 ("트윈 20")을 포함한다. 계면활성제는 임의로 약 0.005% 내지 약 0.2%의 농도로 사용될 것이다.

본 발명의 제제는 DR6 길항제(들) 및 상기 기재된 성분에 추가하여 추가의 다양한 다른 부형제 또는 성분을 포함할 수 있다. 임의로, 상기 제제는 비경구 투여를 위해 제약상 또는 비경구적으로 허용되는 담체, 즉 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고 제제의 다른 성분과 상용가능한 담체를 함유할 수 있다. 임의로, 담체는 비경구 담체, 예컨대 수용자의 혈액과 등장성인 용액이다. 이러한 담체 비히클의 예는 물, 염수 또는 완충 용액, 예를 들어 포스페이트-완충 염수 (PBS), 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 다양한 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)]에 추가로 기재되어 있다.

또한, 본원에서의 제제는 하나 이상의 보존제를 함유할 수 있다. 이것의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물) 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 유형의 보존제는 방향족 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤 및 m-크레졸을 포함한다. 항산화제는 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 부틸 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.

본 발명의 조성물은 액체 제제 (액체 용액제 또는 액체 현탁액제) 및 동결건조된 제제 뿐만 아니라, 현탁액 제제를 포함할 수 있다.

액체인 경우에, 최종 제제는 바람직하게는 ≤ 20℃에서 동결 저장된다. 대안적으로, 제제를 동결건조시켜 주사용수를 사용한 재구성을 위해 분말로서 제공할 수 있고, 임의로 2℃ 내지 30℃에서 저장할 수 있다.

치료 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 멸균 여과 막 (예를 들어, 0.2 ㎛ 막)을 통한 여과에 의해 멸균이 쉽게 달성된다. 치료 조성물은 일반적으로 멸균 입구를 갖는 용기, 예를 들어 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알에 공급된다.

조성물은 통상적으로 수용액 또는 재구성을 위한 동결건조된 제제로서 단일 단위 또는 다중 투여 용기, 예를 들어 밀봉 앰플 또는 바이알에 저장될 것이다. 용기는 당업계에서 사용가능한 임의의 용기이고 통상적인 방법을 사용하여 충전될 수 있다. 임의로, 상기 제제는 제제의 치료 목적의 전달에 적합한 주사 펜 장치 (또는 펜 장치 내에 설치되는 카트리지), 예컨대 당업계에서 사용가능한 장치 (예를 들어, 미국 특허 5,370,629 참조)에 포함될 수 있다. 주사 용액은 동결건조된 DR6 길항제 제제를 예를 들어 주사용수로 재구성하여 제조될 수 있다.

DR6 길항제(들)를 사용하는 요법

본 발명의 DR6 길항제는 다양한 유용성을 갖는다. DR6 길항제는 정신 장애의 진단 및 치료에 유용하다. 포유동물에서 본원에 기재된 다양한 병리 상태는 당업자에 의해 진단될 수 있다. 예를 들어 포유동물에서 다양한 정신 장애의 진단 또는 검출을 허용하는 진단 기술이 당업계에서 이용가능하다.

본 발명에 의한 치료에 대해 고려되는 정신 장애는 중독 및 정신분열증을 포함한다. 본 발명에 의한 치료에 대해 고려되는 인지 장애는 투렛 증후군, 레트 증후군, 취약성-X 증후군, 및 자폐증을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법이 노화 과정 동안 인지를 유지하고, 아마도 인지를 향상시키기 위해 정상적인 노화 환자를 치료하는데 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

본 발명의 방법에서, DR6 길항제는 담체, 바람직하게는 제약상 허용되는 담체 중에서 포유동물에 투여되는 것이 바람직하다. 적합한 담체 및 이것의 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., edited by Osol et al.]에 기재되어 있다. 전형적으로, 제제를 등장성으로 만들기 위해서 제제 중에 적절량의 제약상 허용되는 염을 사용한다. 담체의 예는 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가의 담체는 지속 방출 제제, 예컨대 성형품, 예컨대 필름, 리포솜 또는 마이크로입자의 형태이고 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 당업자에게는 예를 들어 투여 경로 및 투여되는 DR6 길항제의 농도에 따라 특정 담체가 보다 바람직할 수 있음이 명백할 것이다.

DR6 길항제는 주사 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 문맥내), 경구, 또는 다른 방법, 예컨대 혈류 내에 유효 형태로 전달되게 하는 주입에 의해 포유동물에게 투여될 수 있다. 또한, DR6 길항제는 국소 치료 효과를 발생시키기 위해 분리된 관류 기술, 예를 들어 분리된 조직 관류, 또는 경막내, 안구내 또는 요추 천자에 의해 투여될 수도 있다. 혈액-뇌 장벽을 쉽게 횡단하지 못하는 DR6 길항제는 직접, 예를 들어 뇌내 또는 척수 공간 내로 또는 제공될 수도 있고, 또는 이것이 상기 장벽을 횡단하여 수송되게 하는 다른 방법으로 제공될 수도 있다. DR6 길항제의 유효 투여량 및 투여 스케쥴은 경험적으로 결정할 수 있고, 이러한 결정은 당업자의 기술 범위 내이다. 당업자는 투여해야 하는 DR6 길항제의 투여량이 예를 들어 길항제를 투여받는 포유동물, 투여 경로, 사용되는 길항제의 특정 유형 및 포유동물에게 투여되는 다른 약물에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이다. 적절한 용량 선택에 대한 지침은 예를 들어 항체의 치료 용도에 대한 문헌, 예를 들어 문헌 [Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357]; [Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389]에서 찾을 수 있다. 단독으로 사용되는 DR6 항체의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 요인에 따라 약 1 ㎍/kg(체중)/일 내지 100 mg/kg(체중)/일의 범위이거나 이를 초과할 수 있다.

또한, DR6 길항제는 하나 이상의 다른 치료제와 조합되어 포유동물에게 투여될 수도 있다. APP는 또한 p75 (ELISA에 의한 EC₅₀ = 약 300 nM)에 보다 적은 정도로 결합하는 것으로 보인다. 따라서, DR6 길항제 뿐만 아니라 p75 길항제와 함께 정신 및 인지 장애를 치료하는 것이 유리할 수 있다. 다른 치료제는 임의로 p75 길항제와 함께, DR6 길항제와 추가로 조합될 수 있다. 상기 다른 치료제의 예는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제, 예를 들어 EGFR에 결합하거나 다르게는 직접 상호작용하여 그의 신호전달 활성을 방지하거나 감소시키는 화합물, 예컨대 타르세바(Tarceva), 세툭시맙 및 에르비툭스(Erbitux)^® (임클론 시스템즈 인크. (ImClone Systems Inc.))로도 언급되는 C225와 같은 항체, 완전 인간 ABX-EGF (파니투무맙, 아브게닉스 인크. (Abgenix Inc.)) 뿐만 아니라, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 및 E7.6.3으로 알려지고 US 6,235,883에 기재되어 있는 완전 인간 항체; MDX-447 (메다렉스 인크. (Medarex Inc.)) 뿐만 아니라, EGFR 소분자 억제제, 예컨대 US5616582, US5457105, US5475001, US5654307, US5679683, US6084095, US6265410, US6455534, US6521620, US6596726, US6713484, US5770599, US6140332, US5866572, US6399602, US6344459, US6602863, US6391874, WO9814451, WO9850038, WO9909016, WO9924037, US6344455, US5760041, US6002008, US5747498에 기재된 화합물; 특정 소분자 EGFR 억제제, 예를 들어 OSI-774 (CP-358774, 에를로티닙, 오에스아이 파마슈티칼스 (OSI Pharmaceuticals)); PD 183805 (CI 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-, 디히드로클로라이드, 화이자 인크. (Pfizer Inc.)); 이레사 (ZD1839, 게피티닙, 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린, 아스트라제네카 (AstraZeneca)); ZM 105180 ((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린, 제네카 (Zeneca)); BIBX-1382 (N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민, 베링거 인겔하임 (Boehringer Ingelheim)); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-히드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785 (N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); 및 EKB-569 (N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드)를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 치료제는 아폽토시스 억제제, 특히 세포내 아폽토시스 억제제, 예를 들어 카스파제 억제제, 예컨대 카스파제-3, 카스파제-6 또는 카스파제-8 억제제, Bid 억제제, Bax 억제제 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 적합한 억제제의 예는 일반적인 카스파제 억제제, 디펩티드 억제제, 카르바메이트 억제제, 치환된 아스파르트산 아세탈, 헤테로시클릴디카르브아미드, 퀴놀린-(디-, 트리-, 테트라펩티드) 유도체, 치환된 2-아미노벤즈아미드 카스파제 억제제, 치환된 a-히드록시산 카스파제 억제제, 니트로실화에 의한 억제, CASP-1, CASP-3: 단백질-억제제, 안티센스 분자, 니코티닐-아스파르틸-케톤, y-케토산 디펩티드 유도체, CASP-8: 안티센스 분자, 상호작용 단백질 CASP-9, CASP2: 안티센스 분자, CASP-6: 안티센스 분자, CASP-7: 안티센스 분자, 및 CASP-12 억제제이다. 추가의 예는 미토콘드리아 억제제, 예컨대 Bcl-2-조정 인자; Bad로부터 유래된 Bcl-2 돌연변이체 펩티드, Bad, BH3-상호작용 도메인 사멸 효능제, Bax 억제제 단백질 및 BLK 유전자 및 유전자 생성물이다. 아폽토시스의 추가의 적합한 세포내 조정자는 CASP9/Apaf-1 회합의 조정자, Apaf-1 발현의 안티센스 조정자, 아폽토시스의 억제를 위한 펩티드, 단순 포진 바이러스의 R1 서브유닛을 포함하는 항-아폽토시스 조성물, MEKK1 및 그의 단편, 수르비빈(Survivin)의 조정자, 아폽토시스 억제제의 조정자 및 HIAP2이다. 이러한 작용제의 추가의 예는 미토콘드리아로부터의 시토크롬 c 방출을 억제하고 카스파제-3 mRNA 상향조절을 차단하는 미노시클린(Minocycline) (뉴로아폽토시스 래보러토리(Neuroapoptosis Laboratory)), p53 억제제인 피피트린(Pifithrin) 알파 (UIC), JNK 경로 억제제인 CEP-1346 (세팔론 인크.(Cephalon Inc.)), 아폽토시스전 GAPDH 신호전달을 억제하는 TCH346 (노파르티스(Novartis)), pan-카스파제 억제제인 IDN6556 (이둔 파마슈티칼즈(Idun Pharmaceuticals)), 카스파제-3 억제제인 AZQ (아스트라제네카), 카스파제-1/-4 억제제인 HMR-3480 (아벤티스 파마(Aventis Pharma)), 및 혈병을 용해시키는 악티바제(Activase)/TPA (제넨테크) (혈전용해 약물)를 포함한다.

DR6 길항제에 추가하여 투여될 수 있는 추가의 적합한 작용제는 BACE 억제제, 콜린에스테라제 억제제 (예컨대, 도네페질(Donepezil), 갈란타민(Galantamine), 리바스티그민(Rivastigmine), 타크린(Tacrine)), NMDA 수용체 길항제 (예컨대, 메만틴(Memantine)), Aβ 응집 억제제, 항산화제, γ-세크레타제 조정자, NGF 모방체 또는 NGF 유전자 요법제, PPARγ 효능제, HMG-CoA 리덕타제 억제제 (스타틴), 암파킨, 칼슘 채널 차단제, GABA 수용체 길항제, 글리코겐 신타제 키나제 억제제, 정맥내 이뮤노글로불린, 무스카린성 수용체 효능제, 니코틴산 수용체 조정자, 능동 또는 수동 Aβ 면역화, 포스포디에스테라제 억제제, 세로토닌 수용체 길항제 및 항-Aβ 항체를 포함한다 (예를 들어, WO 2007/062852; WO 2007/064972; WO 2003/040183; WO 1999/06066; WO 2006/081171; WO 1993/21526; EP 0276723B1; WO 2005/028511; WO 2005/082939 참조).

DR6 길항제는 하나 이상의 다른 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. DR6 길항제 및 치료제의 양은 예를 들어 사용되는 약물의 유형, 치료할 병리 상태 및 투여 스케쥴 및 경로에 따라 달라지지만, 일반적으로 각각이 개별적으로 사용되는 경우보다는 적을 것이다.

DR6 길항제 및 임의로 p75 길항제를 포유동물에게 투여한 후, 상기 포유동물의 생리 상태를 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 모니터링할 수 있다.

본 발명의 DR6 길항제 및 임의로 p75 길항제의 치료 효과는 시험관내 검정 및 생체내 동물 모델을 사용하여 조사할 수 있다.

키트 및 제조품

본 발명의 추가의 실시양태에서, 정신 장애 및 인지 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조품 및 키트가 제공된다. 제조품은 라벨을 갖는 용기를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있고, 바람직하게는 멸균된다. 용기는 정신 및 인지 장애의 치료에 효과적인 활성제를 갖는 조성물을 보유한다. 조성물 중의 활성제는 DR6 길항제이고, 바람직하게는 항-DR6 모노클로날 항체 또는 항-APP 모노클로날 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 중의 또 다른 활성제는 p75 길항제이고, 바람직하게는 항-p75 모노클로날 항체 또는 항-APP 모노클로날 항체를 포함한다. 용기 상의 라벨은 상기 조성물이 정신 및 인지 장애의 치료에 사용됨을 나타내고, 또한 예컨대 상기 기재한 바와 같은 생체내 또는 시험관내 사용을 위한 지시사항을 나타낼 수도 있다. 제조품 또는 키트는 임의로 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 금기 사항, 포장 제품과 함께 조합될 다른 치료 제품 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고 등에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업적 포장물에 통상적으로 포함되는 지침서를 지칭하는 포장 삽입물을 추가로 포함한다.

본 발명의 키트는 상기 기재된 용기 및 완충제를 포함하는 제2 용기를 포함한다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.

실시예

본 발명의 다양한 측면은 하기하는 실시예에 의해 추가로 기재되고 예시되며, 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.

시냅스는 만성 두개창을 통해 2-광자 현미경검사를 이용하여 생체내에서 시각화될 수 있다 (도 1 참조). 이 접근법을 이용하여 본 발명자들은 (1) 흥분성 시냅스의 형태학적 상호관련물인 수상돌기 소극의 밀도를 평가하고, (2) 수상돌기 소극의 형태를 평가할 수 있다.

실시예 1: 생체내 PSD-95 체류의 모니터링

물질 및 방법

자궁내 전기천공. L2/3 전구 세포를 자궁내 전기천공을 통해 형질감염시켰다 (문헌 [Saito T. and N. Nakatsuji (2001) Dev. Biol. 240:237-246]; [Tabata, H. and K. Nakajima (2001) Neurosci. 103:865-872]). E16 지정-수태 C57BL/6J 마우스 (찰스 리버(Charles River), 미국 매사추세츠주 윌밍톤)를 이소플루란-산소 혼합물을 사용하여 깊이 마취시켰다. 자궁각을 노출시키고, 대략 1 ㎕의 DNA 용액 (플라스미드 발현 디에스레드-익스프레스, 1 ㎍/㎕ 함유), 및 패스트 그린(Fast Green) (시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스)을 당겨진 유리 모세관을 통해 각각의 배아의 우측 뇌실에 가압 주사하였다. 각각의 배아의 머리 부분을 주문 제작 트위저 전극 사이에 위치시키고, 양성 플레이트를 머리 부분의 우측에 접촉시켰다. 전기천공은 5 스퀘어 펄스 (지속기간 = 50 ms, 주파수 = 1 Hz, 40V)로 달성하였다. 공동-형질감염 효율은 60 내지 70%였다. 도 1을 참조한다.

수술. 영상화 창을 P8에서 또는 P60 후에 체성감각 피질 위에 설치하였다. 마우스를 이소플루란-산소 혼합물로 깊이 마취시켰다. 개두술 (직경; 4 내지 5 mm)은 경뇌막을 손상시키지 않으면서 우측 체성감각 피질 (각각 새끼/성체의 경우 브레그마로부터 0.5/1.5 mm 후방 및 중앙선으로부터 3.0/3.5 mm 측면)을 개방하였다. 경뇌막을 HEPES-완충된 인공 뇌척수액에 용해된 1% 아가로스 (유형-IIIA, 시그마)로 덮고, 덴탈 아크릴릭을 갖는 장소로 봉입된 5 mm 주문 제작 커버 글래스 (1호)로 덮었다. 또한 동물에게 4% 덱사메타손 (피닉스 사이언티픽(Phoenix Scientific), 미국 미주리주 세인트 조셉) 20 ㎕를 주사하였다. 1-h 회복 기간 후에, 성체를 다시 케이지에 넣고, 새끼를 자손 및 대리모와 함께 하우징하였다.

영상화. 고해상도 영상을 주문 제작 2-레이저 2 광자 레이저 주사 현미경 (2PLSM)을 통해 수집하였다. 영상화를 위한 광원은 고체-상태 Ti:사파이어(Sapphire) 레이저 (λ 약 1020; 약 100 mW; 대물렌즈 후초점면) (스펙트라 피직스(Spectra Physics), 미국 캘리포니아주 프레몬트)이고; 적색 형광 광자는 밴드패스 필터 (610/90; 크로마 테크놀로지(Chroma Technology))를 사용하여 분리하였다. 신호를 광전자 증배관 (3896; 일본 하마마쯔시 하마마쯔)을 사용하여 수집하였다. 대물 렌즈 (40, 0.8 NA) 및 3안 현미경을 올림푸스(Olympus) (일본 도쿄)로부터의 것이었다.

본 발명자들은 매일 관심 영역을 확인하기 위해 혈관계 및 수상돌기 분지화의 패턴을 이용하였다. 영상화 세션은 90분에 걸친 일련의 영상 스택으로 이루어진다. 영상 스택은 축방향으로 1 ㎛ 분리된 개별 섹션 (512 x 512 픽셀; 픽셀 크기, 0.08 ㎛)으로 이루어진다. 영상화 세션 후에, 마우스를 보온 담요 위에서 대략 30분 동안 회복시킨 후에 자손 및 대리모와 하우징하고, 성체 동물을 그들의 게이지로 돌려보냈다.

데이터 분석. 개별 소극을 확인하고, 주석을 달고, 매트랩(Matlab) (매쓰웍스(Mathworks))에서 주문 제작 분석 루틴을 사용하여 시점 상에서 추적하였다. 소극 수명, 밀도 및 길이를 주문형 소프트웨어를 이용하여 측정하였다 (문헌 [Holtmaat A.J. et al. (2005) Neuron 45:279-291]).

결과

본 발명자들은 DR6^+/- 및 DR6^+/+ 동물과 비교하여 DR6^-/- 동물에서 수상돌기 소극의 증가된 밀도 및 폭을 관찰하였다 (도 2). 밀도를 동일한 군 내에서 모든 동물에 걸쳐 세포당 소극의 전체 개수/수상돌기 길이의 평균을 구하여 계산하였다. DR6^+/-의 경우 26개 세포/7마리 동물 및 DR6^+/+의 경우 26개 세포/6마리 동물과 비교하여 DR6^-/-의 경우 총 28개 세포/8마리 동물에 대해 주석을 달았다. 소극 폭 및 길이를 유전자형당 분석된 소극의 전체 집단의 누적 플롯으로 플롯팅하였다.

문헌 [Bittner, et al., 상기 문헌]의 결과는 APP가 DR6에 대한 동족 리간드라는 본 발명자들의 이전 발견과 함께 APP가 또한 수상돌기 소극 밀도에서 역할을 수행한다는 것을 나타낸다.

실시예 2: 시험관내 수상돌기 소극에 대한 N-APP의 효과

물질 및 방법

세포 배양: PDL/라미닌 코팅된 8웰 슬라이드 (벡톤, 디킨슨 앤드 캄파니(Becton, Dickinson and Company))를 500 ㎕/웰의 뉴로베이잘(Neurobasal) 배지 (인비트로젠(Invitrogen)) + 50 ng/ml의 각각의 재조합 BDNF 및 NT-3 (케미콘(Chemicon)), + B-27 보충물 X50 (인비트로젠); + 펜 스트렙(Pen Strep) 글루타민 X100 (카달로그 번호 10378-016; 깁코) + 글루코스 X100으로 채웠다. E16 피질 뉴런 체외이식편을 각각의 웰에 넣고, 21일 동안 37℃ 인큐베이터에 넣었다. 제21일에, 배양물을 0, 1, 3, 10, 또는 30 ㎍/ml의 N-APP로 처리하였다. 배양물을 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 뉴런은 현미경검사를 위해 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)^® 488 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))에 접합된 2차 항체 (염소-항-마우스 IgG)와 마우스 항-PSD95 항체를 사용하는 고정 및 염색에 의해 처리하였다. 결과를 도 3에 나타내었다.

뉴런의 mm 당 반점을 정량하고, 처리되지 않은 피질 뉴런 (대조군)의 백분율 변화로서의 변화 (반점/mm)로 플롯팅하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.

별도의 실험에서, 배양물의 피질 세포를 30 ㎍/ml의 항-DR6 항체 aDR6.1을 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 0 ㎍/ml N-APP (대조군), 또는 0.1, 0.3, 1.0 또는 3.0 ㎍/ml의 농도의 산성 테일에 없는 N-APP (N-APP (-) 산성 테일) 또는 전장 N-APP (N-APP FL)에 노출시켰다. 결과를 도 5에 나타내었다.

결과

도 3은 N-APP가 PSD95 반점의 감소를 일으킨다는 것을 보여준다. PSD95 반점의 감소는 도 4에 나타난 바와 같이 농도 의존성이다. 결과는 DR6과의 N-APP 상호작용과 일치하며, 이는 신경변성 및/또는 신경돌기 (축삭 또는 수상돌기) 길이 및 분지화의 감소를 유발하고, 이에 따라 PSD95 반점의 감소에 의해 나타난 수상돌기 소극의 손실을 일으킨다. 도 5는 PSD95 반점의 N-APP-유도된 감소가 DR6에 의존성이라는 것을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> Genentech Inc. Kallop, Dara Y. Nikolaev, Anatoly Y. Tessier-Lavigne, Marc Weimer, Robby <120> A Method of Promoting Dendritic Spine Density <130> P4388R1 WO <150> 61/260815 <151> 2009-11-12 <150> 61/294020 <151> 2010-01-11 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 655 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Thr Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ile Ala Arg Arg Ala Thr Ala Thr Met Ile Ala Gly Ser Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Gly Phe Leu Ser Thr Thr Thr Ala Gln Pro Glu Gln Lys Ala Ser 35 40 45 Asn Leu Ile Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Ala Thr Gly Gln Val 50 55 60 Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys 65 70 75 80 Thr Asn Thr Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Val Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu Lys Cys His Asp Cys Ser Gln Pro 100 105 110 Cys Pro Trp Pro Met Ile Glu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp 115 120 125 Arg Glu Cys Thr Cys Pro Pro Gly Met Phe Gln Ser Asn Ala Thr Cys 130 135 140 Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly 145 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480 catcgcccgc cgagccacag ccacgatgat cgcgggctcc cttctcctgc ttggattcct 540 tagcaccacc acagctcagc cagaacagaa ggcctcgaat ctcattggca cataccgcca 600 tgttgaccgt gccaccggcc aggtgctaac ctgtgacaag tgtccagcag gaacctatgt 660 ctctgagcat tgtaccaaca caagcctgcg cgtctgcagc agttgccctg tggggacctt 720 taccaggcat gagaatggca tagagaaatg ccatgactgt agtcagccat gcccatggcc 780 aatgattgag aaattacctt gtgctgcctt gactgaccga gaatgcactt gcccacctgg 840 catgttccag tctaacgcta cctgtgcccc ccatacggtg tgtcctgtgg gttggggtgt 900 gcggaagaaa gggacagaga ctgaggatgt gcggtgtaag cagtgtgctc ggggtacctt 960 ctcagatgtg ccttctagtg tgatgaaatg caaagcatac acagactgtc tgagtcagaa 1020 cctggtggtg atcaagccgg ggaccaagga gacagacaac gtctgtggca cactcccgtc 1080 cttctccagc tccacctcac cttcccctgg cacagccatc tttccacgcc ctgagcacat 1140 ggaaacccat gaagtccctt cctccactta tgttcccaaa ggcatgaact caacagaatc 1200 caactcttct gcctctgtta gaccaaaggt actgagtagc atccaggaag ggacagtccc 1260 tgacaacaca agctcagcaa gggggaagga agacgtgaac aagaccctcc caaaccttca 1320 ggtagtcaac 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gaaaagaagg acacagtgtt gcggcaggta cgcctggacc cctgtgactt 2220 gcagcctatc tttgatgaca tgctccactt tctaaatcct gaggagctgc gggtgattga 2280 agagattccc caggctgagg acaaactaga ccggctattc gaaattattg gagtcaagag 2340 ccaggaagcc agccagaccc tcctggactc tgtttatagc catcttcctg acctgctgta 2400 gaacataggg atactgcatt ctggaaatta ctcaatttag tggcagggtg gttttttaat 2460 tttcttctgt ttctgatttt tgttgtttgg ggtgtgtgtg tgtgtttgtg tgtgtgtgtg 2520 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tttaacagag aatatggcca gtgcttgagt tctttctcct 2580 tctctctctc tctttttttt ttaaataact cttctgggaa gttggtttat aagcctttgc 2640 caggtgtaac tgttgtgaaa tacccaccac taaagttttt taagttccat attttctcca 2700 ttttgccttc ttatgtattt tcaagattat tctgtgcact ttaaatttac ttaacttacc 2760 ataaatgcag tgtgactttt cccacacact ggattgtgag gctcttaact tcttaaaagt 2820 ataatggcat cttgtgaatc ctataagcag tctttatgtc tcttaacatt cacacctact 2880 ttttaaaaac aaatattatt actattttta ttattgtttg tcctttataa attttcttaa 2940 agattaagaa aatttaagac cccattgagt tactgtaatg caattcaact ttgagttatc 3000 ttttaaatat 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Ala Lys His Arg 370 375 380 Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gln 385 390 395 400 Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile Gln His Phe 405 410 415 Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gln 420 425 430 Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp 435 440 445 Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu Gln Ala Val 450 455 460 Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg 465 470 475 480 Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe Glu His Val 485 490 495 Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser Gln Val Met 500 505 510 Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu 515 520 525 Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp Glu Val Asp 530 535 540 Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn 545 550 555 560 Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro 565 570 575 Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly 580 585 590 Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp 595 600 605 Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg 610 615 620 Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr 625 630 635 640 Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe 645 650 655 Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe 660 665 670 Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val 675 680 685 Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu 690 695 700 Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val Glu Val Asp 705 710 715 720 Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn 725 730 735 Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn 740 745 750 <210> 5 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe 610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 Gln Asn 770 <210> 6 <211> 427 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys 20 25 30 Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn 35 40 45 Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys 50 55 60 Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr 65 70 75 80 Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu 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Ser Asp 290 295 300 Ser Gly Ile Ser Val Asp Ser Gln Ser Leu His Asp Gln Gln Pro His 305 310 315 320 Thr Gln Thr Ala Ser Gly Gln Ala Leu Lys Gly Asp Gly Gly Leu Tyr 325 330 335 Ser Ser Leu Pro Pro Ala Lys Arg Glu Glu Val Glu Lys Leu Leu Asn 340 345 350 Gly Ser Ala Gly Asp Thr Trp Arg His Leu Ala Gly Glu Leu Gly Tyr 355 360 365 Gln Pro Glu His Ile Asp Ser Phe Thr His Glu Ala Cys Pro Val Arg 370 375 380 Ala Leu Leu Ala Ser Trp Ala Thr Gln Asp Ser Ala Thr Leu Asp Ala 385 390 395 400 Leu Leu Ala Ala Leu Arg Arg Ile Gln Arg Ala Asp Leu Val Glu Ser 405 410 415 Leu Cys Ser Glu Ser Thr Ala Thr Ser Pro Val 420 425

Claims

인지 또는 정신 장애를 갖는 환자에게 유효량의 DR6 억제제 또는 p75 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 인지 또는 정신 장애를 갖는 환자의 뉴런에서 수상돌기 소극의 밀도를 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 DR6 억제제가 DR6의 에피토프에 결합하여 DR6의 기능을 억제하는 항체인 방법.
제1항에 있어서, 상기 p75 억제제가 p75의 에피토프에 결합하여 p75의 기능을 억제하는 항체인 방법.
제2항에 있어서, 상기 항체가 3F4.4.8, 4B6.9.7, 1E5.5.7, 및 그의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 항체가 키메라 또는 인간화 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7, 또는 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7과 동일한 에피토프에 결합하는 항체인 방법.
제1항에 있어서, 상기 DR6 억제제가 상기 뉴런에서 DR6 신호전달을 감소시키거나 또는 방지하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 p75 억제제가 상기 뉴런에서 p75 신호전달을 감소시키거나 또는 방지하는 것인 방법.
수상돌기 소극의 감소와 관련된 인지 또는 정신 장애를 갖는 환자를 확인하는 것 및 상기 환자에게 치료 유효량의 DR6 길항제 또는 p75 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 인지 또는 정신 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 인지 또는 정신 장애를 치료하는 방법.
제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 정신 또는 인지 장애가 레트 증후군, 투렛 증후군, 자폐증, 정신분열증 및 취약성-X 정신 지체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 DR6 억제제가 DR6의 에피토프에 결합하여 DR6의 기능을 억제하는 항체인 방법.
제8항에 있어서, 상기 p75 억제제가 p75의 에피토프에 결합하여 p75의 기능을 억제하는 항체인 방법.
제10항에 있어서, 상기 항체가 3F4.4.8, 4B6.9.7, 1E5.5.7, 및 그의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 항체가 키메라 또는 인간화 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7, 또는 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7과 동일한 에피토프에 결합하는 항체인 방법.
대상체에서 수상돌기 소극의 밀도를 증진시키는데 효과적인 양의 DR6 억제제 또는 p75 억제제를 대상체에게 투여하여 상기 대상체에서 인지를 유지하는 것을 포함하는, 노화 과정 동안 대상체에서 인지를 유지하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 DR6 억제제가 DR6의 에피토프에 결합하여 DR6의 기능을 억제하는 항체인 방법.
제15항에 있어서, 상기 항체가 3F4.4.8, 4B6.9.7, 1E5.5.7, 및 그의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 항체가 키메라 또는 인간화 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7, 또는 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7과 동일한 에피토프에 결합하는 항체인 방법.
제14항에 있어서, 상기 p75 억제제가 p75의 에피토프에 결합하여 p75의 기능을 억제하는 항체인 방법.
인지 또는 정신 장애를 갖는 환자에서 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서, DR6 활성을 억제하는 DR6 길항제의 용도.
제15항에 있어서, 상기 DR6 길항제가 DR6의 에피토프에 결합하는 항체인 DR6 길항제의 용도.
제16항에 있어서, 상기 항체가 3F4.4.8, 4B6.9.7, 1E5.5.7, 및 그의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 DR6 길항제의 용도.
제16항에 있어서, 상기 항체가 키메라 또는 인간화 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7, 또는 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7과 동일한 에피토프에 결합하는 항체인 DR6 길항제의 용도.
인지 또는 정신 장애를 갖는 환자에서 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서, p75 활성을 억제하는 p75 길항제의 용도.