CN102612374A - 提升树突棘密度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及增加树突棘密度的方法，将其作为保持或改善认知以及治疗与减少的树突棘形态学相关的疾病以及精神疾病诸如成瘾和精神分裂症或与受损的认知相关的疾病诸如自闭症、雷特综合征、图雷特综合征和脆性X综合征的方法。

Description

提升树突棘密度的方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求与2009年11月12日提交的美国临时申请号No.61/260,815的和于2010年1月11日提交的美国临时申请号No.61/294,020的利益，所述申请中的每个的公开内容通过引用完整地结合于此。

发明领域

本发明涉及提升神经元中树突棘密度的方法。更具体地，本发明关注于通过抑制DR6和/或p75来增加突触以及治疗认知疾病的方法。

发明背景

被称为DR6受体的TNFR家族成员(在文献中也被称为“TR9”；在文献中也被称为TNF受体超家族成员21或TNFRSF21)已经被描述为具有四个胞外富含半胱氨酸基序和胞质死亡域结构的I类跨膜受体(Pan等，FEBS Lett.(FEBS通讯)，431：351-356(1998)；同样参见美国专利6,358,508；6,667,390；6,919,078；6,949,358)。据报道DR6在特定转染细胞系中的过表达导致凋亡以及NF-kB和JNK两者的激活(Pan等，FEBS Letters(FEBS通讯)，431：351-356(1998))。

在DR6缺陷型小鼠模型中，在JNK激活中T细胞基本被破坏，而当用蛋白抗原攻击DR6(-/-)小鼠时，发现它们的T细胞过量增殖并展示向Th2响应的深度极化(而Th1分化不受同样的影响)(Zhao等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，194：1441-1448(2001))。据进一步报道，DR6的定向破坏导致在体外的增强的T辅助细胞2(Th2)分化(Zhao等，见上)。DR6激动剂或拮抗剂在调节B细胞介导的病症方面的多种用途在公布于2005年3月31日的US 2005/0069540中得到描述。DR6受体可以在调节OVA诱导小鼠哮喘模型中的气道炎症中起作用(Venkataraman等，Immunol.Lett.(免疫学通讯)，106：42-47(2006))。使用实验性自身免疫脑脊髓炎的髓鞘少突胶质糖蛋白(MOG(35-55))诱导模型，发现与野生型(WT)同窝相比，DR6-/-小鼠对CNS疾病的发作和进展两者都具有高度的耐受。因此，DR6可能与调节白细胞浸润有关并且在实验性自身免疫脑脊髓炎的诱导和进展中起作用(Schmidt等，J.Immunol.(免疫学杂志)，175：2286-2292(2005))。

虽然不同的TNF配体和受体家族成员已经被鉴定为具有不同的生物学活性和性质，但是几乎没有这种配体和受体被报道为涉及神经学相关功能。例如，于2004年8月26日公布的WO2004/071528描述了在鼠模型中抑制CD95(Fas)配体/受体复合物以治疗脊髓损伤。目前，Nikolaev等显示APP的N端片段是DR6的配体(Nilolaev等(2009)Nature(自然)457：981-989)。

神经细胞在突触处彼此通讯，其在树突上发生于“树突棘”处。树突棘是从树突伸出并(通常)与轴突的单个突触接触的树突的膜区域。在单个树突上可能由数千个棘。棘从轴突接收兴奋性和抑制性输入两者，然而，更通常的是兴奋性输入。接近树突棘尖端的是被称为突触后密度区(PSD)的电子密度区。在此区域内的是被称为PSD-95的结构蛋白，PSD-95是PSD的标志物。棘富含谷氨酸受体(例如，AMPA和NMDA受体)。据信其他受体诸如TrkB受体在棘存活中起一定作用。

化学突触连接神经元以形成能够处理并储存信息的功能回路。据认为这些连接的合适功能或稳定性的丧失是许多精神疾病和神经退行性疾病的基础。

发明概述

本发明提供使患有认知或精神疾病的患者的树突棘密度增加的方法，所述方法包括将有效量的DR6抑制剂和/或p75抑制剂给药于患者。所述抑制剂可以是，例如，结合DR6的表位并抑制DR6的功能的抗体，或者结合p75的表位并抑制p75的功能的抗体。抑制性抗DR6抗体的实例包括但不限于3F4.4.8、4B6.9.7、1E5.5.7和它们的抗原结合片段。同样地，所述抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体，诸如，例如嵌合或人源化3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7或与3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7结合相同表位的抗体。DR6的抑制剂减少或防止神经元中的DR6信号传导。

本发明还提供在需要其的患者中治疗认知或精神疾病的方法，所述方法包括鉴别患有与树突棘减少相关的认知或精神疾病的患者并且将治疗有效量的DR6拮抗剂和/或p75拮抗剂给药于患者。精神或认知疾病可以是，例如，雷特综合征(Rett Syndrome)、图雷特综合征(Tourettesyndrome)、自闭症(autism)、精神分裂症(schizophrenia)或脆性X精神发育迟缓(fragile-X mental retardation)。抑制剂可以是，例如，结合DR6的表位并抑制DR6的功能的抗体，和/或结合p75的表位并抑制p75的功能的抗体。所述抗体可以是，例如，3F4.4.8、4B6.9.7、1E5.5.7或它们的抗原结合片段。所述抗体可以是嵌合或人源化抗体，诸如，例如，嵌合或人源化3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7，或与3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7结合相同表位的抗体。

本发明还提供在衰老过程中保持受试者认知的方法，所述方法包括将对于提升受试者的树突棘密度有效的量的DR6和/或p75抑制剂给药于受试者，从而保持所述受试者的认知。抑制剂可以是，例如，结合DR6的表位并抑制DR6的功能的抗体，和/或结合p75的表位并抑制p75的功能的抗体。所述抗体可以是，例如，3F4.4.8、4B6.9.7、1E5.5.7或它们的抗原结合片段。所述抗体可以是嵌合或人源化抗体，诸如，例如，嵌合或人源化3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7，或与3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7结合相同表位的抗体。

因此，本发明提供DR6拮抗剂和/或p75拮抗剂在制备用于增加树突棘密度以及治疗患有与下降的树突棘密度相关的认知或精神疾病的患者的药物的用途。

附图简述

图1显示通过子宫内电穿孔的皮层2/3兴奋性神经元的定向标记。图A：将来自怀孕小鼠的E16胚胎暴露，并用～1μl DNA注射到右侧脑室中并施加电势；图B：可以通过组织学观察到层2/3兴奋性神经元细胞体和它们的过程。用DsRedExpress和PSD-95-paGFP共标记神经元；图C：植入的颅窗；图D：通过颅窗的光子显微镜图像(第14天和第44天)。

图2显示与对照动物相比，出生后60天的DR6^-/-动物树突棘密度和宽度的增加(图A)。通过对同一组群内所有动物每个细胞的棘总数/树突长度进行平均来计算密度。总计28个细胞/8只动物被注释为DR6-/-，相比26个细胞/7只动物被注释为DR6+/-而26个细胞/6只动物被注释为DR6+/+(图B)。将棘宽度和长度绘制成按照每个基因型分析的棘的整个群体的累积图(图C)。

图3显示在用0μg/ml N-APP(对照)(图A和B)；1μg/ml N-APP(图C)；3μg/ml N-APP(图D)；10μg/ml N-APP(图E)；以及30μg/ml N-APP(图F)处理后培养中的E16皮层神经元。

图4显示作为用1、3、10和30μg/ml N-APP处理的结果(与对照相比)的PSD95点(puncta)的减少。

图5显示N-APP诱导的PSD95点密度的降低依赖于DR6功能。当加入0.1、0.3、1.0或3.0ug/ml N-APP(不带酸性尾部)或全长N-APP(N-APPFL)后在未处理的神经元中的对照的百分比(点/100um)。用30ug/ml抗DR6.1抗体对一个组进行额外处理(如图所示)。

发明详述

本文中描述或涉及的技术和方法通常能够被本领域技术人员很好的理解并且被本领域技术人员使用常规方法所采用，诸如，例如，在Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor，N.Y中所述的广泛使用的分子克隆方法。除非另外说明，当适当时，通常根据制造商规定的方案和/或参数来进行涉及使用市售试剂盒和试剂的步骤。

在描述本方法和测定前，要理解本发明不限于所述的特定方法、方案、细胞系、动物种或属、构建体和试剂，因为这些当然可以不同。还要理解本文中所用的术语仅意在描述特定的实施方案，而不意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。

必须注意，当在本文中和所附权利要求中使用时，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数所指，除非文中另有清楚说明。因此，例如，述及“遗传改变”包括多个这样的改变，而述及“探针”包括述及一个或多个探针及其为本领域技术人员所知的等同物，诸如此类。将在说明书和所附权利要求中例举的数字(例如氨基酸22-81、1-354等)理解为被术语“约”修饰。

本文中提及的所有出版物通过引用结合于此，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。本文中引用的出版物因其在本申请的提交日之前的公开内容而被引用。不将此处的任何内容看作是承认本发明人没有权利根据发明较早的优先权日或在先日而先于所述出版物。此外，实际公布日可以不同于显示的那些并且需要独立验证。

术语“淀粉状前体蛋白”或“APP”包括由APP前mRNA(pre-mRNA)编码的不同的多肽同种型，例如分别显示在SEQ ID NO：3-5中的APP695、APP751和App770同种型(翻译自APP前mRNA的可变剪接转录产物的同种型)，以及APP同种型的翻译后加工部分。如在本领域中已知的，转录自APP基因的APP前mRNA经历可变外显子剪接以产生若干同种型(参见，例如Sandbrink等，Ann NY Acad.Sci.(纽约科学院学报)777：281-287(1996)；以及与PubMed NCBI蛋白位点登录号P05067相关的信息)。此可变外显子剪接产生三种主要的同种型：695(SEQ ID NO：3)、751(SEQ ID NO：4)和770SEQ ID NO：5)氨基酸(参见，例如Kang等，Nature(自然)325：733-736(1987)；Kitaguchi等，Nature(自然)331：530-532(1988)；Ponte等，Nature(自然)331：525-527(1988)；和Tanzi等，Nature(自然)331：528-532(1988))。这些同种型中的两个(App₇₅₁和APP₇₇₀)包含与丝氨酸蛋白酶抑制剂的Kunitz家族(KPI)高度同源并且被普遍表达的56个残基的插入。相反，作为缺乏KPI基序的较短的同种型，APP₆₉₅在神经系统中(例如在神经元和胶质细胞中)的表达是占优势的，并且因此其通常被称为“神经元APP”(参见，例如Tanzi等，Science(科学)235：880-884(1988)；Neve等，Neuron(神经元)1：669-677(1988)；和Haas等，J.Neurosci.(神经科学杂志)11：3783-3793(1991))。包括695、751和770的APP同种型经历显著的翻译后加工事件(参见，例如Esch等1990 Science(科学)248：1122-1124；Sisodia等1990 Science(科学)248：492-495)。例如，这些同种型中的每个被多种分泌酶和/或分泌酶复合物切割，该事件产生包括N端分泌多肽的APP片段，所述N端分泌多肽包含APP胞外域(sAPPα和sAPPβ)。通过α分泌酶或备选地通过β分泌酶的切割分别导致可溶N端APP多肽(sAPPα和sAPPβ)的产生和胞外释放，以及对应的膜定位C端片段(C83和C99)的保留。随后的通过γ分泌酶的对C83的加工产生P3多肽。这是主要的分泌途径并且是不生成淀粉状蛋白的。备选地，早老蛋白/呆蛋白介导的γ-分泌酶对C99的加工释放淀粉状蛋白β多肽、淀粉状蛋白-β40(Aβ40)和淀粉状蛋白-β42(Aβ42)(淀粉状蛋白斑的主要成分)以及细胞毒C端片段，γ-CTF(50)、γ-CTF(57)和γ-CTF(59)。证据表明各种切割事件的相对重要性取决于细胞类型。例如，非神经元细胞优先通过在Aβ序列内切割APP的α-分泌酶途径来加工APP，由此排除了Aβ的形成(参见，例如Esch等1990 Science(科学)248：1122-1124；Sisodia等1990 Science(科学)248：492-495)。相反，神经元细胞通过β-分泌酶途径来加工大得多的部分的APP₆₉₅，并且通过至少两类酶的组合活性来产生完整的Aβ。在神经元细胞中，β-分泌酶在Aβ结构域的氨基端切割APP₆₉₅，释放不同的N端片段(sAPPβ)。此外，γ-分泌酶在羧基端的备选位点切割APP，产生40个(Aβ₄₀)或42个氨基酸长(Aβ₄₂)的Aβ种类(参见，例如Seubert等1993 Nature(自然)361：260-263；Suzuki等1994 Science(科学)264：1336-1340；以及Turner等1996 J.Biol.Chem.(生物化学杂志)271：8966-8970)。据信营养剥夺引发BACE切割APP从而产生～100kDa的sAPPβ，其经历额外的一次或多次切割以产生～55kDa的羧基端片段(通过抗sAPPβ抗体检测)以及氨基端～35kDa片段(通过抗N-APP(多克隆抗体)检测)，我们将其称为“N-APP”。额外切割的位点是未知的，但是基于片段大小，预期是在APP“酸性”和“E2”结构域之间的接合处(氨基酸286)附近；实际上，重组APP[1-286]位于～35kDa处，并且与N-APP类似可以用抗N-APP(多)检测。

当在本文中使用时，术语“APP”、“APP蛋白”和“APP多肽”包括天然APP序列和APP变体及其经加工的片段。这些术语包括表达在多种哺乳动物(包括人)中的APP。APP可以如在多种人体组织谱系中自然发生的那样被内源性表达，或者可以通过重组或合成方法表达。“天然序列APP”包括具有与来源于自然的APP相同的氨基酸序列的多肽(例如695、751和770同种型或它们经加工的部分)。因此，天然序列APP可以具有天然存在的来源于任何哺乳动物(包括人)的APP的氨基酸序列。这种天然序列APP可以分离自自然或者可以通过重组或合成方法制备。具体地，术语“天然序列APP”包括天然存在的经加工和/或分泌形式(例如，包含例如胞外结构域序列的可溶形式)，天然存在的变体形式(例如，可变剪接和/或经蛋白水解加工的形式)以及天然存在的等位变体。APP变体可以包括天然序列APP的片段或缺失突变体。

在本发明的实施方案中有用的APP多肽包括以上以及以下非限制性实施例所述的那些。可以选择示例性的形式以用于本发明的不同实施方案。在本发明的一些实施方案中，APP多肽包括全长APP同种型诸如分别显示在SEQ ID NO：3-5中的APP₆₉₅和/或APP₇₅₁和/或APP₇₇₀同种型。在本发明其他的实施方案中，APP多肽包括经翻译后加工的APP的同种型，例如经历分泌酶诸如α-分泌酶、β-分泌酶或γ-分泌酶切割的APP多肽(例如可溶N端片段，诸如sAPPα或sAPPβ)。在本发明的相关实施方案中，可以选择APP多肽以包括一个或多个特异性结构域诸如N端胞外域(参见，例如Quast等，FASEB J.2003；17(12)：1739-41)、肝素结合结构域(参见，例如Rossjohn等，Nat.Struct.Biol.(自然-结构生物学)1999Apr；6(4)：327-31)、铜II型(参见，例如Hesse等，FEBS Letters(FEBS通讯)349(1)：109-116(1994))或Kunitz蛋白酶抑制剂结构域(参见，例如Ponte等，Nature(自然)；331(6156)：525-7(1988))。在本发明的一些实施方案中，APP多肽包括被观察到包含由本文中公开的DR6拮抗剂(诸如抗体或DR6免疫粘附素)识别的表位的序列，例如APP₆₉₅的氨基酸22-81；包含被单克隆抗体22C11结合的表位的序列(参见，例如Hilbich等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)268(35)：26571-26577(1993))。

在本发明的某些实施方案中，APP多肽不包含一个或多个特异性结构域或序列，例如，不包含Kunitz蛋白酶抑制剂结构域的APP多肽(例如APP₆₉₅)，或不包含阿尔茨海默氏β淀粉状蛋白(Aβ)序列的APP多肽(例如sAPPβ，其是不包含Aβ₄₀和/或Aβ₄₂序列的多肽)(参见，例如Bond等，J.Struct Biol.(结构生物学杂志)2003 Feb；141(2)：156-70)。在本发明的其他实施方案中，用于本发明的实施方案的APP多肽包含一个或多个结构域或序列而不包含其他结构域或序列，例如这样的APP多肽，其包含N端胞外域(或者其一部分，观察到该部分被DR6拮抗剂诸如单克隆抗体22C11结合)但是不包含C端至一个或多个分泌酶切割位点的结构域或序列(诸如β淀粉状蛋白(Aβ)序列(例如sAPPα或sAPPβ))。

术语“胞外结构域”、“胞外域”或“ECD”是指APP的形式，其基本没有跨膜和胞质结构域。通常，可溶ECD将具有低于1％的这种跨膜和胞质结构域，并且优选地将具有低于0.5％的这种结构域。要理解本发明的多肽的任何经鉴别的跨膜结构域是根据本领域中通常采用的用于鉴别所述类型的疏水结构域的标准来鉴别的。跨膜结构域的精确边界可以变化，但是多半不超过在最初鉴别的结构域的任一端的大约5个氨基酸。在优选的实施方案中，ECD将由多肽的可溶、胞外结构域序列组成，其不含跨膜和胞质或胞内结构域(并且不与膜结合)。

术语“APP变体”是指如以下限定的APP多肽，其与具有显示在SEQID NO：3、4或5中的氨基酸序列的人APP或其可溶片段或其可溶胞外结构域具有至少大约80％，优选地至少大约85％、86％、87％、88％、89％，更优选地至少大约90％、91％、92％、93％、94％，最优选地至少大约95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。这种变体包括，例如，其中向APP的全长或成熟序列的N末端或C末端添加了一个或多个氨基酸残基或从APP的全长或成熟序列的N末端或C末端缺失了一个或多个氨基酸残基的APP多肽，或者其中向多肽的内部序列或结构域插入一个或多个氨基酸残基或从多肽的内部序列或结构域缺失了一个或多个氨基酸残基的APP多肽，包括来自其他物种的变体，但是排除天然-序列APP多肽。

“DR6”或“DR6受体”包括在本领域中已知其多核苷酸和多肽序列的受体。Pan等已经描述了被称为“DR6”或“TR9”的TNF受体家族成员的多核苷酸和多肽序列(Pan等，FEBS Lett.(FEBS通讯)，431：351-356(1998)；同样参见美国专利6,358,508；6,667,390；6,919,078；6,949,358)。人DR6受体是655个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：1)，其具有推定的信号序列(氨基酸1-41)、胞外结构域(氨基酸42-349)、跨膜结构域(氨基酸350-369)，之后是胞质结构域(氨基酸370-655)。DR6的cDNA序列被以SEQ ID NO：2提供。当在本文中使用时，术语“DR6受体”包括天然序列受体和受体变体。这些术语包括表达在多种哺乳动物(包括人)中的DR6受体。DR6受体可以如在多种人体组织谱系中自然发生的那样被内源性表达，或者可以通过重组或合成方法表达。“天然序列DR6受体”包括具有与来源于自然的DR6受体相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列DR6受体可以具有天然存在的来源于任何哺乳动物(包括人)的DR6受体的氨基酸序列。这种天然序列DR6受体可以分离自自然或者可以通过重组或合成方法制备。具体地，术语“天然序列DR6受体”包括受体的天然存在的截短或分泌形式(例如，包含例如胞外结构域序列的可溶形式)，天然存在的变体形式(例如，可变剪接形式)和天然存在的等位变体。受体变体可以包括天然序列DR6受体的片段或缺失突变体。

术语“胞外结构域”或“ECD”是指DR6受体的形式，其基本没有跨膜和胞质结构域。通常，可溶ECD将具有低于1％的这种跨膜和胞质结构域，并且优选地将具有低于0.5％的这种结构域。要理解本发明的多肽的任何经鉴别的跨膜结构域是根据本领域中通常采用的用于鉴别所述类型的疏水结构域的标准来鉴别的。跨膜结构域的精确边界可以变化，但是多半不超过在最初鉴别的结构域的任一端的大约5个氨基酸。在优选的实施方案中，ECD将由多肽的可溶、胞外结构域序列组成，其不含跨膜和胞质或胞内结构域(并且不与膜结合)。

术语“DR6变体”是指如以下限定的DR6多肽，其与具有显示在SEQID NO：1中的推断的氨基酸序列的人DR6或其可溶片段或其可溶胞外结构域具有至少大约80％，优选地至少大约85％、86％、87％、88％、89％，更优选地至少大约90％、91％、92％、93％、94％，最优选地至少大约95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。这种变体包括，例如，其中向SEQ ID NO：1的全长或成熟序列的N末端或C末端添加了一个或多个氨基酸残基或从SEQ ID NO：1的全长或成熟序列的N末端或C末端缺失了一个或多个氨基酸残基的DR6多肽，或者其中向多肽的内部序列或结构域插入一个或多个氨基酸残基或从多肽的内部序列或结构域缺失了一个或多个氨基酸残基的DR6多肽，包括来自其他物种的变体，但是排除天然-序列DR6多肽多肽。通常，DR6变体包括包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-349或42-349并具有达到10个保守氨基酸置换的可溶形式的DR6受体。优选地，这种变体充当如以下所限定的DR6拮抗剂。

术语“DR6拮抗剂”以最广义使用，并且包括在体外、原位、体内或先体外后体内(ex vivo)，部分或完全阻断、抑制或中和DR6受体与其同源配体(优选地，其同源配体APP)结合或在神经元细胞或组织中激活一种或多种胞内信号或胞内信号传导途径的能力的任何分子。例如，DR6拮抗剂可以部分或完全阻断、抑制或中和DR6受体在神经元细胞或组织中激活导致神经元细胞或组织中的凋亡或细胞死亡的一种或多种胞内信号或胞内信号传导途径的能力。DR6拮抗剂可以通过多种机制来起部分或完全阻断、抑制或中和DR6的作用，包括但不限于，通过阻断、抑制或中和同源配体与DR6的结合，DR6和其同源配体(例如APP)之间的复合物的形成，DR6受体的寡聚，DR6受体与异源共同受体之间的复合物的形成，同源配体与DR6受体/异源共同受体复合物的结合，或DR6受体、异源共同受体和其同源配体之间的复合物的形成。DR6拮抗剂可以以直接或间接方式发挥功能。本发明预期的DR6拮抗剂包括但不限于：APP抗体、DR6抗体、免疫粘附素、DR6免疫粘附素、DR6融合蛋白、共价修饰形式的DR6、DR6变体及其融合蛋白，或DR6的更高级的寡聚体形式(二体、聚集体)或DR6的同源或异源聚合物形式，小分子诸如JNK信号级联放大的药理学抑制剂(包括Jun N端激酶JNK活性的小分子和肽抑制剂)，在信号转导途径中在JNK的上游发挥功能的蛋白激酶MLK和MKK活性的药理学抑制剂，JNK与支架蛋白JIP-1结合的药理学抑制剂，JNK与其底物诸如c-Jun或AP-1转录因子复合物结合的药理学抑制剂，JNK介导的其底物(诸如JNK结合结构域(JBD)肽)的磷酸化的药理学抑制剂和/或JNK的底物结合结构域的磷酸化的药理学抑制剂和/或包括JNK底物磷酸化位点的肽抑制剂，阻断ATP与JNK结合的小分子，和阻断底物与JNK结合的小分子。

为确定DR6拮抗剂是否部分或完全阻断、抑制或中和DR6受体在神经元细胞或组织中激活一种或多种胞内信号或胞内信号传导途径的能力，可以进行测定以评估DR6拮抗剂对例如多种神经元细胞或组织以及在体内模型中的作用。可以以已知的体外或体内测定形式来进行多种测定，诸如以下描述的或本领域中已知的以及在文献中所述的。确定DR6拮抗剂是否部分或完全阻断、抑制或中和DR6受体在神经元细胞或组织中激活一种或多种胞内信号或胞内信号传导途径的能力的测定的一个实施方案包括：在存在或不存在DR6拮抗剂或潜在的DR6拮抗剂(即目的分子)的情况下使DR6与APP结合；然后检测在存在此DR6拮抗剂或潜在的DR6拮抗剂的情况下对DR6与APP结合的抑制。

通过“核酸”是意在包括任何DNA或RNA。例如，存在于组织样品中的染色体核酸、线粒体核酸、病毒核酸和/或细菌核酸。术语“核酸”包括双链核酸分子中的一条或两条链并且包括完整核酸分子的任何片段或部分。

“基因”是指在编码或转录蛋白或调节其他基因表达中具有功能作用的任何核酸序列或其部分。基因可以由负责编码功能蛋白的所有核酸或仅由负责编码或表达蛋白的核酸的一部分组成。核酸序列在外显子、内含子、起始或终止区、启动子序列、其他调节序列或基因的唯一相邻区内可以包含遗传异常。

术语“氨基酸(amino acid)”和“氨基酸(amino acids)”是指所有天然存在的L-α-氨基酸。此定义意在包括正亮氨酸、鸟氨酸和高半胱氨酸。氨基酸通过单个字母或三个字母的名称来得以识别：

Asp

D

天冬氨酸

Ile

I

异亮氨酸

Thr

T

苏氨酸

Leu

L

亮氨酸

Ser

S

丝氨酸

Tyr

Y

酪氨酸

Glu

E

谷氨酸

Phe

F

苯丙氨酸

Pro

P

脯氨酸

His

H

组氨酸

Gly

G

甘氨酸

Lys

K

赖氨酸

Ala

A

丙氨酸

Arg

R

精氨酸

Cys

C

半胱氨酸

Trp

W

色氨酸

Val

V

缬氨酸

Gln

Q

谷氨酰胺

Met

M

甲硫氨酸

Asn

N

天冬酰胺

当用于描述本文中公开的多种肽或蛋白时，“分离的”是指已经从其天然环境的组分中鉴别和分离和/或回收的肽或蛋白。它的天然环境的污染物组分是通常将妨碍肽或蛋白的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在优选的实施方案中，肽或蛋白将被纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪(spinning cup sequenator)获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)通过使用考马斯蓝或优选银染色，在非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质，或(3)通过质谱或肽定位(mapping)技术达到同质。既然肽或蛋白的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的物质包括重组细胞内的原位肽或蛋白。然而，分离的肽或蛋白通常通过至少一个纯化步骤来制备。

关于本文中鉴别的序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”，定义为在进行序列比对并在必要时导入空隙以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域技术内的能够确定测量比对的合适参数的各种方法进行比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，所述方法包括对所比较的全长序列获得最大比对所需的比对算法。然而，为此目的，百分比氨基酸同一性值可以使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得，所述序列比较计算机程序ALIGN-2的作者是Genentech，Inc.，并且其该源代码已经随用户文档提交至美国版权局，WashingtonD.C.，20559，并以美国版权注册登记号TXU510087注册。公众可通过Genentech，Inc.，South San Francisco，CA得到ALIGN-2程序。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。

术语“引物(primer)”或“引物(primers)”是指这样的寡核苷酸序列，其与互补RNA或DNA目标多核苷酸杂交并且充当如例如在聚合酶链反应中发生的从单核苷酸通过核苷酸转移酶的多核苷酸分步合成的起始点。

术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞能利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

若核酸与另一核酸序列处于功能性关系中，则该核酸是“可操作连接”的。例如，若前序列或分泌前导序列的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接″指相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导序列的情况中指相邻且处于相同阅读框中。然而，增强子不必相邻。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么可依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。

词语“标记物”当在本文中使用时是指直接或间接与试剂诸如核酸探针或抗体缀合或融合并促进与其缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。所述标记物可以本身是可检测的(例如，放射同位素标记物或荧光标记物)，或者，在酶标记物的情形中，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。

本文所用的术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合物，所述期望结合特异性不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”)。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。

“DR6受体抗体”、“DR6抗体”或“抗DR6抗体”以广义使用，并且是指这样的抗体，其结合至少一种形式的DR6受体，优选地人DR6受体，诸如显示在SEQ ID NO：1中的DR6序列或其胞外结构域序列。任选地，DR6抗体与异源序列或分子融合或连接。优选地异源序列允许或促进抗体形成更高阶或寡聚复合物。具体地，术语“抗DR6抗体”及其语法上的等价物包括以下所述的DR6单克隆抗体。任选地，DR6抗体结合DR6受体但是不结合肿瘤坏死因子家族(例如DR4、DR5、TNFR1、TNFR2、Fas)的任何另外的受体或与肿瘤坏死因子家族(例如DR4、DR5、TNFR1、TNFR2、Fas)的任何另外的受体交叉反应。任选地，本发明的DR6抗体以大约0.067nM至大约0.033μM的浓度结合DR6受体，如在BIAcore结合测定中测得的。

术语“抗APP抗体”、“APP抗体”和语法上的等价物以广义使用，并且是指这样的抗体，其结合至少一种形式的APP，优选地人APP诸如本文中具体描述的APP多肽同种型。优选地，APP抗体是DR6拮抗剂抗体。例如，在如本文中公开的用于制备和/或鉴别DR6拮抗剂的方法中，APP的一种或多种同种型和/或其部分可以被用作免疫原来免疫动物(例如小鼠，作为产生单克隆抗体的过程的部分)和/或作为探针来筛选化合物的库(例如重组抗体库)。在本发明的实施方案中有用的典型APP多肽包括以下非限制性实例。可以选择这些示例性形式以将其用于本发明的不同实施方案。在本发明的一些实施方案中，APP多肽包括全长APP同种型诸如分别显示在SEQ ID NO：3、4和5中的APP₆₉₅和/或APP₇₅₁和/或APP₇₇₀同种型。在本发明的其他实施方案中，APP多肽包括APP的经翻译后加工的同种型，例如经历了分泌酶诸如α-分泌酶、β-分泌酶或γ-分泌酶切割的APP多肽(例如可溶N端片段诸如sAPPα或sAPPβ)。在本发明相关的实施方案中，可以选择APP多肽以使其包含一个或多个特异性结构域诸如N端胞外域(参见，例如Quast等，FASEB J.2003；17(12)：1739-41)、肝素结合结构域(参见，例如Rossjohn等，Nat.Struct.Biol.(自然-结构生物学)1999 Apr；6(4)：327-31)、铜II型(参见，例如Hesse等，FEBS Letters(FEBS通讯)349(1)：109-116(1994))或Kunitz蛋白酶抑制剂结构域(参见，例如Ponte等，Nature(自然)；331(6156)：525-7(1988))。在本发明的一些实施方案中，APP多肽包括被观察到包含由本文中公开的DR6拮抗剂(诸如抗体或DR6免疫粘附素)识别的表位的序列，例如APP₆₉₅的氨基酸22-81；包含被单克隆抗体22C11结合的表位的序列(参见，例如Hilbich等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)268(35)：26571-26577(1993))。在本发明的某些实施方案中，APP多肽不包含一个或多个特异性结构域或序列，例如，不包含特定N端或C端氨基酸的APP多肽，不包含Kunitz蛋白酶抑制结构域的APP多肽(例如APP₆₉₅)，或不包含阿尔茨海默氏β淀粉状蛋白(Aβ)序列的APP多肽(例如sAPPβ，其是不包含Aβ₄₀和/或Aβ₄₂序列的多肽)(参见，例如Bond等，J.Struct Biol.(结构生物学杂志)2003 Feb；141(2)：156-70)。在本发明的其他实施方案中，用于本发明的实施方案的APP多肽包含一个或多个结构域或序列而不包含其他结构域或序列，例如这样的APP多肽，其包含N端胞外域(或者观察到至少它的部分被DR6拮抗剂诸如单克隆抗体22C11结合)但是不包含C端至一个或多个分泌酶切割位点的结构域或序列(诸如β淀粉状蛋白(Aβ)序列(例如sAPPα或sAPPβ))。任选地，抗APP抗体将抑制N-APP多肽与DR6的结合并且以10μg/ml至50μg/ml的浓度结合N-APP多肽，如本文中所述，和/或如在基于细胞的定量结合测定中测得的。

术语“抗体”在本文中以最广义使用并且具体地覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们显示所需的生物学活性。

“抗体片段”包括完整抗体的部分，优选地包含抗原结合或其可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，所述糖蛋白由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。将每条轻链通过一个共价二硫键连接于重链，而二硫键的数目在不同的免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(V_H)，其后是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(V_L)并且在其另一端具有恒定结构域；将轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，而将轻链可变结构域与重链可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基形成轻链和重链可变结构域之间的界面。

术语“可变的”指可变结构域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域。它集中于轻链和重链可变结构域中称作高变区或互补决定区的三个区段。可变结构域中更加高度保守的部分被称作构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个HVRs连接。每条链中的高变区通过FR区非常接近的保持在一起，并与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，国家健康研究所(National Institute of Health)，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中的参与。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，所述“Fab”片段每个具有单抗原结合位点，以及残余的“Fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)₂片段，所述片段具有两个抗原组合位点，并且仍旧能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区域由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的，非共价缔合的二聚体组成。在这种构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用从而限定在V_H-V_L二聚体的表面上的抗原结合位点。总之，六个高变区将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端加入几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文关于Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有至少一个游离巯基。F(ab’)₂抗体片段最初作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对产生。还已知抗体片段的其它化学偶联。

基于抗体(免疫球蛋白)的恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”分为两种清楚区分的类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。

取决于它们的重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体分为不同的种类。存在五种主要的完整抗体类别：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，和IgA2。对应于不同类别的抗体的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ，和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域以单多肽链存在。优选地，所述Fv多肽在V_H和V_L结构域之间还包含多肽接头，所述接头使scFv形成对于抗原结合需要的结构。关于scFv的综述参见例如Pluckthun于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies(单克隆抗体药理学)，卷113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)中。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在相同的多肽链(V_H-V_L)中包含与轻链可变结构域(V_L)连接的重链可变结构域(V_H)。通过使用太短所以不能在相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)中。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与传统(多克隆)抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，并且不应理解为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过由Kohler等，Nature(自然)，256：495(1975)首先描述的杂交瘤法来制备，或者可以通过重组DNA法来制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。还可以使用例如在Clackson等，Nature(自然)，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)中所述的技术来从噬菌体抗体库中分离“单克隆抗体”。

单克隆抗体在本文中具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与来源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)81：6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类源化(primatized)”抗体，所述抗体包含来源自非人灵长类动物(例如旧大陆猴(Old World Monkey)，诸如狒狒、恒河猴或食蟹猴(cynomolgus monkey))的可变结构域抗原结合序列以及人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的构架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等，自然(Nature)321：522-525(1986)；Riechmann等，自然(Nature)332：323-329(1988)；及Presta，现代结构生物学观点(Curr.Op.Struct.Biol.)2：593-596(1992)。

术语“高变区”当用于本文时是指负责结合抗原的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.Public Health Service，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)196：901-917(1987))。“框架”或“FR”残基是除如本文中所限定的高变区残基以外的那些可变结构域残基。

“结合”目的抗原的抗体是这样的抗体，其能够与抗原以足够的亲和力和/或亲合力结合，从而该抗体可用作靶向蛋白质或表达该抗原的细胞的诊断或治疗剂。

当用于本文中时，“免疫疗法”将指使用抗体治疗哺乳动物(优选地人类患者)的方法，其中所述抗体可以是非缀合或“裸”抗体，或者所述抗体可以与异源分子或试剂(诸如一个或多个细胞毒试剂)缀合或融合，由此产生“免疫缀合物”。

“分离的”抗体指已经鉴定且与其天然环境的成分分离和/或从其回收的抗体。抗体的天然环境的污染性成分是将会干扰其诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素、和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在优选实施方案中，将抗体纯化至(1)通过例如Lowry法确定，超过95重量％的抗体，并且最优选超过99重量％的抗体，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)通过使用例如考马斯蓝或优选银染色，在还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。

术语“带标签的”当在本文中使用时是指包含与“标签多肽”融合的抗体或多肽的嵌合分子。标签多肽具有足够的残基以提供针对其可制备抗体的表位，或提供一些其他功能，诸如寡聚的能力(例如当肽具有亮氨酸拉链结构域时所发生的)，但又足够短使得其通常不干扰抗体或多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得标签特异性抗体基本上不与其它表位交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基且通常在约8个到约50个氨基酸残基之间(优选在约10个到约20个残基之间)。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。优选FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见

，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年评)15：203-234(1997))。FcR的综述见于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol(免疫学年评)9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods(免疫方法)4：25-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.(实验室临床医学杂志)126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的那些。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.(免疫学杂志)117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.(免疫学杂志)24：249(1994))。在本文中FcR包括多态性诸如编码FcγRIIIa的基因的遗传二态性，其导致在位于受体的IgG1结合区中的氨基酸位置158处要么是苯丙氨酸(F)要么是缬氨酸(V)。相对纯合的苯丙氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158F)或杂合的(FcγRIIIa-158F/V)受体，纯合的缬氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158V)已经显示出具有更高的对人IgG1的亲和力并且在体外介导增加的ADCC。

术语“多元醇”当在本文中使用时宽泛地指多元醇化合物。多元醇可以是任何水溶性聚(氧化烯)聚合物，并且例如可以具有线形或分支的链。优选的多元醇包括在一个或多个羟基位置被化学基团诸如具有一至四个碳的烷基取代的那些。典型地，多元醇是聚(烷撑二醇)，优选地聚(乙二醇)(PEG)。然而，本领域技术人员认可其他多元醇，诸如，例如，聚(丙二醇)和聚乙烯-聚丙二醇共聚物，可以使用本文中所述的用于PEG的缀合技术来采用。所述多元醇包括本领域中众所周知的那些以及公众可获得的那些，诸如从市场上可获得的来源诸如

Corporation。

在本文中根据其最广的定义来使用术语“缀合”以指结合或连接在一起。当分子好像结合在一起那样表现或起作用时，它们是“缀合的”。

短语“有效量”指对于预防、改善或治疗所指的疾病或病症有效的药剂(例如DR6拮抗剂等)的量。预期本发明的DR6拮抗剂将在提升树突棘密度和保持PSD-95的方面有用。

术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”和“治疗(therapy)”当在本文中使用时指治疗性治疗、预防的治疗和预防性疗法。连续治疗或给药指至少以每日为基础的治疗，在治疗中不存在一日或多日的中断。间歇治疗或给药，或以间歇方式的治疗或给药，指非连续而本质是周期性的治疗。

当在本文中使用时，术语“疾病”通常指将从用本文中所述的DR6拮抗剂治疗中获益的任何病症。这包括慢性和急性疾病，以及使哺乳动物易患有所述疾病的病理学病症。

“神经元细胞或组织”通常指运动神经元、中间神经元(包括但不限于连合神经元)、感觉神经元(包括但不限于背根神经节神经元)、黑质的多巴胺(DA)神经元、纹状体DA神经元、皮层神经元、脑干神经元、脊髓中间神经元和运动神经元、海马神经元(包括但不限于海马的CA1锥形神经元)以及前脑神经元。术语神经元细胞或组织在本文中意欲指由细胞体、一个或多个轴突和一个或多个树突组成的神经元细胞，以及指可以形成这种神经元细胞的部分的一个或多个轴突或一个或多个树突。

“精神疾病(psychiatric disorder)”当在本文中使用时指包括诸如精神分裂症(schizophrenia)和成瘾(addiction)的疾病的病症。“认知疾病(cognitive disorders)”包括疾病如自闭症(autism)、图雷特综合征(Tourette Syndrome)、雷特综合征(Rett Syndrome)和脆性X综合征精神发育迟缓(Fragile-X Syndrome mental retardation)。”

“受试者”或“患者”指需要治疗的任何单个受试者，包括人。同样意欲作为受试者被包括的是参与临床研究试验而不显示疾病的任何临床体征的任何受试者，或者参与流行病学研究的受试者，或用作对照的受试者。

术语“哺乳动物”当在本文中使用时指被分类为哺乳动物的任何哺乳动物，包括人、牛、马、狗和猫。在本发明优选的实施方案中，哺乳动物是人。

化学突触连接神经元以形成能够加工并储存信息的功能回路。认为这些连接的合适功能或稳定性的丧失成为众多精神和认知疾病的原因。据信树突棘的损失或树突棘的不稳定性以及树突棘相关蛋白诸如PSD-95的改变与疾病如雷特综合征、图雷特综合征、精神分裂症、自闭症、成瘾和脆性X综合征相关。

申请人意外地发现TNFR家族成员DR6在胚胎和成熟的中枢神经系统中大量表达，所述神经系统包括大脑皮层、海马、脊髓的运动神经元和中间神经元。如在以下的实施例中所述，申请人进行了多种实验测定以检查DR6在体内突触稳定性中的作用。

申请人进一步推测部分的淀粉状蛋白前体蛋白(N-APP)是DR6受体的同源配体，并且因此APP在突触稳定性中也发挥作用。在最近的Bittner等(Bittner，T.等(2009)J.Neurosci.(神经科学杂志)29(33)：10405-10409)的文章中，作者表明树突棘密度在APP^+/-小鼠中比在野生型小鼠中更高，而在APP^-/-小鼠中甚至更高。之前已经推测淀粉状蛋白前体蛋白在阿尔茨海默病中起一定作用(尽管还未被完全了解)(Selkoe，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)271：18295(1996)；Scheuner；等，Nature Med.(自然-医学)2：864(1996)；Goate等，Nature(自然)349：704(1991))。

据信DR6和/或APP抑制剂在治疗多种精神和认知疾病中将尤其有用。这样的抑制剂也可以用于在衰老过程中增强认知或维持认知。

因此，本发明提供DR6和/或APP拮抗剂组合物和用于在哺乳动物中抑制、阻断或中和DR6和/或APP活性的方法，所述方法包括给药有效量的DR6和/或APP拮抗剂。优选地，采用的DR6和/或APP拮抗剂的量将是对提升树突棘密度和维持健康的突触有效的量。采用的拮抗剂的量还可以增加PDS-95在树突棘中的表达或加强PDS-95在树突棘中的保持。在一些情况中，可能有益的是连同DR6和/或APP拮抗剂一起或与其分离地采用p75的拮抗剂。

可以在所述方法中采用的DR6拮抗剂包括但不限于DR6和/或APP免疫粘附素、包含DR6和/或APP的融合蛋白、DR6和/或APP的共价修饰形式、DR6和/或APP变体、其融合蛋白以及DR6和/或APP抗体。可以在所述方法中采用的p75拮抗剂包括但不限于p75免疫粘附素、包含p75的融合蛋白、p75的共价修饰形式、p75变体、其融合蛋白和p75抗体。抗p75抗体可以是任何在本领域中已知的。将p75的蛋白序列提供为SEQ ID NO：6。本文中描述了可以用于制备拮抗剂的多种技术。例如，描述了用于制备DR6、p75和APP多肽的方法和技术。同样描述了对DR6、p75和APP多肽的此外的改变，和针对DR6、p75和APP的抗体。

本文中公开的本发明有许多实施方案。本发明提供抑制DR6与APP结合的方法，所述方法包括在其中DR6与APP的结合被抑制的条件下将DR6多肽和/或APP多肽暴露于一种或多种DR6拮抗剂。本发明的相关实施方案提供抑制包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-655的DR6多肽与包含SEQ ID NO：3的氨基酸66-81的APP多肽(例如sAPPβ)结合的方法，所述方法包括将DR6多肽和APP多肽与分离的结合DR6或APP的拮抗剂结合，其中所述分离的拮抗剂选自以下各项中的至少一个：结合APP的抗体、结合DR6的抗体以及包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-354的可溶DR6多肽；并且根据其抑制DR6与APP结合的能力来选择所述分离的拮抗剂；以致DR6与APP的结合得到抑制。

本发明还提供抑制DR6与APP结合以及抑制p75与APP结合的方法，所述方法包括在其中DR6和p75与APP的结合被抑制的条件下将DR6多肽、p75多肽和任选地APP多肽暴露于一种或多种DR6拮抗剂以及一种或多种p75拮抗剂。本发明的相关实施方案提供抑制包含SEQ IDNO：1的氨基酸1-655的DR6多肽与包含SEQ ID NO：3的氨基酸66-81的APP多肽(例如sAPPβ)结合的方法，所述方法包括将DR6多肽和APP多肽与分离的结合DR6或APP的拮抗剂以及结合p75的拮抗剂结合，其中所述分离的DR6拮抗剂选自以下各项中的至少一个：结合APP的抗体、结合DR6的抗体以及包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-354的可溶DR6多肽；并且根据其抑制DR6与APP结合的能力来选择所述分离的DR6拮抗剂；以致DR6与APP的结合得到抑制。分离的p75拮抗剂选自以下各项中的至少一个：结合p75的抗体以及包含p75的胞外结构域的氨基酸(例如，SEQ ID NO：6的氨基酸29-250)的可溶p75多肽；并且根据其抑制p75与APP结合的能力来选择所述分离的p75拮抗剂；以致p75与APP的结合得到抑制。

任选地在这样的方法中，一种或多种DR6拮抗剂选自结合DR6的抗体(例如结合DR6的抗体竞争性地抑制3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7单克隆抗体的结合，所述单克隆抗体分别由保藏为ATCC登录号PTA-8095、PTA-8094或PTA-8096的杂交瘤细胞系制备)、包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-354的可溶DR6多肽(例如DR6免疫粘附素)或结合APP的抗体(例如单克隆抗体22C11)。在本发明的某些实施方案中，DR6拮抗剂是结合DR6的抗体、结合APP的抗体或与一个或多个非蛋白性聚合物相连的可溶DR6多肽，所述一个或多个非蛋白性聚合物选自由以下各项组成的组：聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯。p75拮抗剂也可以与一个或多个非蛋白性聚合物相连，所述一个或多个非蛋白性聚合物选自由以下各项组成的组：聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯。

在这些方法的任选实施方案中，DR6多肽(单独地或联合p75多肽)被表达在一种或多种哺乳动物细胞(例如连合神经元细胞、感觉神经元细胞或运动神经元细胞)的细胞表面，而所述一种或多种DR6拮抗剂和/或p75拮抗剂的结合抑制DR6激活或信号传导和/或p75激活或信号传导。

在本发明进一步的实施方案中，可以在体内在患有精神疾病或病症或认知疾病的哺乳动物中进行抑制DR6(以及任选地p75)与APP结合的方法。任选地，所述精神疾病或病症是精神分裂症或成瘾。备选地，所述认知疾病或病症包括图雷特综合征、雷特综合征、脆性X综合征或自闭症。

本发明的进一步的实施方案提供用于治疗患有疾病或病症的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药有效量的一种或多种DR6拮抗剂(单独地或联合一种或多种p75拮抗剂)。典型地，在这样的方法中，所述一种或多种DR6拮抗剂选自结合DR6的抗体、包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-354的可溶DR6多肽、DR6免疫粘附素以及结合APP的抗体。所述一种或多种p75拮抗剂选自结合p75的抗体、p75免疫粘附素和包含SEQ ID NO：6的氨基酸29-250的可溶p75多肽。在本发明的任选实施方案中，所述病症或疾病是自闭症、脆性X综合征、雷特综合征、图雷特综合征、成瘾和精神分裂症。在本发明的不同实施方案中，将一种或多种此外的治疗剂给药于所述哺乳动物。在本发明某些示例性实施方案中，所述一种或多种此外的治疗剂选自NGF、凋亡抑制剂、EGFR抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、胆碱酯酶抑制剂、抗Aβ抗体和NMDA受体拮抗剂。任选地，将所述一种或多种DR6拮抗剂、p75拮抗剂和/或此外的治疗剂经由注射、输注或灌注给药于所述哺乳动物。

除了本文中所述的全长天然序列DR6、p75和APP多肽，还预期可以制备DR6、p75和APP多肽变体。可以通过向编码DNA中引入合适的核苷酸改变和/或通过合成所需的多肽来制备DR6、p75和/或APP变体。本领域技术人员将理解氨基酸变化可能改变DR6、p75和/或APP多肽的翻译后加工，诸如糖基化位点的数目或位置的改变或膜锚定性质的改变。

可以例如使用在例如美国专利号5,364,934中所述的保守或非保守突变的任何技术和指导来进行本文中所述的DR6、p75和/或APP多肽的变异。变异可以是编码多肽的一个或多个密码子的置换、缺失或插入，其导致与天然序列多肽相比的氨基酸序列的变化。任选地，所述变异是通过在DR6、p75和/或APP多肽的一个或多个结构域中使至少一个氨基酸被任何其他的氨基酸置换。可以通过将DR6、p75和/或APP多肽的序列与已知的同源蛋白分子进行比较并使在高同源性区域中作出的氨基酸序列变化的数目最小化来发现在确定可以插入、置换或缺失哪个氨基酸残基而不对所需的活性有不利影响方面的指导。氨基酸置换可以是用一个氨基酸置换另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸的结果，诸如用丝氨酸置换亮氨酸，即，保守氨基酸替换。插入或缺失可以任选地在大约1至5个氨基酸的范围内。可以通过在所述序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或置换并且测试所得变体的DR6、p75和/或APP拮抗剂活性来确定所允许的变异。

本文中提供DR6、p75和/或APP多肽片段。这样的片段可以在N端或C端截短，或者可以缺失中间残基，例如当与全长天然蛋白比较时。某些片段缺少对于所需的DR6多肽的生物学活性不是必需的氨基酸残基。

可以通过多种常规技术中的任何一种来制备DR6、p75和/或APP多肽片段。所需的肽片段可以通过化学方法合成。备选的方法涉及通过酶消化产生多肽片段，例如，通过用已知在由特定氨基酸残基限定的位点切割蛋白的酶来处理蛋白，或者通过用合适的限制性酶来消化DNA并且分离所需的片段。而另一种合适的技术涉及通过聚合酶链反应(PCR)来分离和扩增编码所需多肽片段的DNA片段。在PCR中在5′和3′引物中采用限定DNA片段的所需末端的寡核苷酸。

在特定的实施方案中，感兴趣的保守置换显示在以下的表中在优选的置换的标题下。如果这些置换导致生物学活性的变化，则引入在所述表中被命名为典型置换的或如以下根据氨基酸分类进一步描述的更多的改变，并对产物进行筛选。

DR6、p75和/或APP多肽的功能或免疫学同一性的基本变化通过选择在其对维持以下各项的影响方面差异显著的置换来实现：(a)置换区域中的多肽骨架的结构，例如，如片层或螺旋的构象，(b)在目标位点处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链性质，天然存在的残基被划分为以下各组：

(1)疏水：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性亲水：cys、ser、thr；

(3)酸性：asp、glu；

(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；

(5)影响链取向的残基：gly、pro；以及

(6)芳族：trp、tyr、phe。

非保守置换将需要将这些分类中的一种的成员换为另一种。也可以将这些被置换的残基引入到保守置换位点，更优选地引入到剩余的(非保守的)位点。

可以使用本领域中已知的方法诸如寡核苷酸介导的(定向)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来进行这些变异。可以在克隆的DNA上进行定向诱变(Carter等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，10：6487(1987))、盒诱变(Wells等，Gene(基因)，34：315(1985))、限制性选择诱变(Wells等，Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA(伦敦皇家学会自然科学期刊A系列)，317：415(1986))或其他已知技术以制备DR6多肽变体DNA。

也可以采用扫描氨基酸分析来沿相邻序列鉴别一个或多个氨基酸。在优选的扫描中，氨基酸是相对小的、中性氨基酸。这样的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。通常，在此组中，丙氨酸是优选的扫描氨基酸，原因在于它排除了β碳之后的侧链并且几乎不可能改变变体的主链构象(Cunningham和Wells，Science(科学)，244：1081-1085(1989))。丙氨酸通常优选的原因还在于它是最普通的氨基酸。此外，它在埋入和暴露的位置都经常被发现(Creighton，THE PROTEINS(蛋白质)，(W.H.Freeman& Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，150：1(1976))。如果丙氨酸置换未产生足够量的变体，则可以使用等排氨基酸(isotericamino acid)。

未参与维持DR6、p75和/或APP多肽的合适构象的任何半胱氨酸残基通常也可以被丝氨酸置换，以改善分子的氧化稳定性并防止异常的交联。相反地，可以将一个或多个半胱氨酸键加入到DR6、p75和/或APP多肽以改善其稳定性。

本文中公开的本发明的实施方案适用于多种APP多肽。例如，在本发明的某些实施方案中，APP是分别显示在SEQ ID NO：3-5中的全长695、750或770 APP同种型。在本发明的其他实施方案中，APP包含APP的n端部分，该部分具有APP胞外域并且产生自翻译后加工事件(例如sAPPα或sAPPβ)。任选地例如，APP可以包括由分泌酶切割而产生的695、750或770 APP同种型中一种的可溶形式，例如由β-分泌酶切割而产生的神经元APP₆₉₅的可溶形式。在特定的例示性实施方案中，APP包含APP₆₉₅的氨基酸20-591(参见，例如Jin等，J.Neurosci.(神经科学杂志)，14(9)：5461-5470(1994)。在本发明的另一个实施方案中，APP包括具有为单克隆抗体22C11(例如可从Chemicon International Inc.，Temecula，CA，U.S.A.获得的)所识别的表位的多肽。任选地，APP包含APP₆₉₅的残基66-81，其是包含22C11表位的区域(参见，例如Hilbrich，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)268(35)：26571-26577(1993))。

以下描述主要涉及通过培养用包含编码DR6、p75和/或APP多肽的核酸转化或转染的细胞来制备DR6、p75和/或APP多肽。当然，可以预期，可以采用本领域中众所周知的备选方法来制备DR6、p75和/或APP多肽。例如，可以通过使用固相技术直接肽合成来制备合适的氨基酸序列或其部分(参见，例如，Stewart等，SOLID-PHASE PEPTIDE SYNTHESIS(固相肽合成)，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.(美国化学学会杂志)，85：2149-2154(1963))。可以使用手动技术或通过自动化来进行体外蛋白合成。例如可以使用Applied BiosystemsPeptide Synthesizer(肽合成仪)(Foster City，CA)使用制造商的说明来完成自动合成。可以单独地以及组合地使用化学或酶方法来在化学上合成DR6和/或APP多肽的不同部分以制备所需的DR6、p75和/或APP多肽。

所述方法和技术类似地可用于制备DR6、p75和/或APP变体，DR6、p75和/或APP的经修饰的形式；以及DR6、p75和/或APP抗体。分离编码DR6和/或APP多肽的DNA

编码DR6、p75和/或APP多肽的DNA可以从cDNA文库获得，所述cDNA文库制备自据信具有DR6、p75和/或APP多肽mRNA并以可检测的水平表达它的组织。因此，可以方便地从制备自人组织的cDNA文库获得人DR6、p75和/或APP多肽DNA。也可以从基因组文库或通过已知的合成方法(例如，自动化核酸合成)获得编码DR6、p75和/或APP多肽的基因。

可以用被设计成识别目的基因或由目的基因编码的蛋白质的探针(诸如具有至少大约20-80碱基的寡核苷酸)来对文库进行筛选。可以使用标准方法诸如在Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的来进行使用所选探针的对cDNA或基因组文库的筛选。分离编码DR6多肽的基因的备选方法是使用PCR方法(Sambrook等，见上；Dieffenbach等，PCR Primer：A Laboratory Manual(PCR引物：实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995))。

用于筛选cDNA文库的技术在本领域中是众所周知的。被选作探针的寡核苷酸序列应当具有足够的长度和足够确定的以使假阳性最小化。优选地，这样标记寡核苷酸以致当杂交到被筛选的文库中的DNA时它可以被检测到。标记方法在本领域中是已知的，并且包括使用放射线标记物如³²P标记的ATP、生物素化或酶标记。在Sambrook等(见上)中提供了包括中等严格性和高度严格性的杂交条件。

可以将在这样的文库筛选方法中鉴别的序列与公共数据库诸如GenBank或其他私人序列数据库中存放并可获得的其他已知序列进行比较和比对。可以使用本领域中已知的以及如在本文中所述的方法来确定分子的规定区域内或整个全长序列的序列同一性(在氨基酸或核苷酸水平)。

可以通过以下方法来获得具有蛋白编码序列的核酸：筛选所选的cDNA或基因组文库，使用本文中首次公开的推断的氨基酸序列，并且如果必要使用如在Sambrook等(见上)中所述的常规引物延伸方法以检测可能不能被反转录到cDNA中的mRNA的前体或加工中间体。

宿主细胞的选择和转化

用本文中所述的用于DR6、p75和/或APP多肽生产的表达或克隆载体转染或转化宿主细胞，并将其培养在为诱导启动子、选择转化体或扩增编码目的序列的基因而适当改变的常规营养培养基中。培养条件诸如培养基、温度、pH等可以由本领域技术人员来选择而无需过度实验。通常可以在Mammalian Cell Biotechnology：a Practical Approach(哺乳动物细胞生物技术：实用方法)，M.Butler编辑(IRL Press，1991)和Sambrook等(见上)中找到用于使细胞培养物产率最大化的原理、方案和实用技术。

真核细胞转染和原核细胞转化的方法为本领域技术人员所知，例如，CaCl₂、CaPO₄、脂质体介导的和电穿孔。取决于所用的宿主细胞，使用对这种细胞适当的标准技术来进行转化。如在Sambrook等(见上)中所述的采用氯化钙的钙处理或电穿孔通常被用于原核。使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的感染用于转化某些植物细胞，如由Shaw等，Gene(基因)，23：315(1983)和于1989年6月29日公布的WO 89/05859所述的。对于没有这样的细胞壁的哺乳动物细胞，可以使用Graham和vander Eb，Virology(病毒学)，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染的大体方面已经在美国专利号4,399,216中得到描述。通常根据Van Solingen等，J.Bact.(细菌学杂志)，130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报)，76：3829(1979)的方法来进行向酵母的转化。然而，也可以使用用于将DNA引入细胞的其他方法，诸如通过核微注射、电穿孔、与完整细胞的细菌原生质体融合或聚阳离子例如polybrene、聚鸟氨酸。对于用于转化哺乳动物细胞的多种技术，参见Keown等，Methods in Enzymology(酶学方法)，185：527-537(1990)和Mansour等，Nature(自然)，336：348-352(1988)。

本文中，适用于克隆或表达载体中的DNA的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。合适的原核细胞包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)诸如大肠杆菌(E.coli)。多种大肠杆菌菌株是公众可获得的，诸如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5 772(ATCC 53,635)。其他合适的原核宿主细胞包括肠杆菌科诸如埃希氏菌(Escherichia)例如大肠杆菌、肠杆菌、欧文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、变形菌(Proteus)、沙门氏菌(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，以及志贺氏菌(Shigella)，以及芽孢杆菌(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，在于1989年4月12日公布的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，以及链霉菌(Streptomyces)。这些实例是例示性的而不是限制性的。菌株W3110是一种尤其优选的宿主或亲本宿主，原因在于它是用于重组DNA产物发酵的通常宿主菌株。优选地，所述宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，可以将菌株W3110改变成在编码宿主内源蛋白的基因中引入遗传突变，这种宿主的实例包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整的基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整的基因型tonA ptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整的基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kan^r；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整的基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169degP ompT rbs7 ilvG kan^r；大肠杆菌W3110菌株40B4，其是无卡那霉素抗性并带有degP缺失突变的菌株37D6；以及在于1990年8月7日颁发的美国专利号4,946,783中公开的具有突变周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。备选地，体外克隆方法例如PCR或其他核酸聚合酶反应是合适的。

除了原核细胞，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是DR6多肽编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)是通常适用的低等真核宿主微生物。其他包括栗酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)(Beach和Nurse(1981)Nature(自然)，290：140；公布于1985年5月2日的EP 139,383)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主(美国专利号4,943,529；Fleer等，Bio/Technology(生物技术)，9：968-975(1991))诸如，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C、CBS683、CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.(细菌学杂志)，154(2)：737-742(1983))、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、wickeramii克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、waltii克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg等，Bio/Technology(生物技术)，8：135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.(基础微生物学杂志)，28：265-278(1988))；假丝酵母(Candida)；reesia木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)，76：5259-5263(1979))；许旺酵母(Schwanniomyces)如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(公布于1990年10月31日的EP394,538)；以及丝状真菌如，例如，脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、雪状白僵菌(Tolypocladium)(1991年1月10日公布的WO91/00357)和曲霉菌(Aspergillus)宿主如构巢曲霉菌(A.nidulans)(Ballance等(1983)，Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化学与生物物理学研究通讯)，112：284-289；Tilburn等(1983)，Gene(基因)，26：205-221；Yelton等(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)，81：1470-1474)以及黑曲霉菌(A.niger)(Kelly和Hynes(1985)，EMBO J.(欧洲分子生物学学会杂志)，4：475-479)。甲醇酵母(Methylotropic yeast)在本文中是合适的并且包括但不限于选自由以下各项组成的类的能够依靠甲醇生长的酵母：汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母、克勒克酵母(Kloeckera)、毕赤酵母、酵母菌(Saccharomyces)、球拟酵母(Torulopsis)和深红酵母(Rhodotorula)。作为典型的此类酵母的具体物种的列表可以在C.Anthony，The Biochemistryof Methylotrophs(甲基营养菌的生物化学)，269(1982)中找到。

适用于表达经糖基化的DR6、p75和/或APP多肽的宿主细胞来源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞诸如果蝇S2和贪夜蛾Sf9，以及植物细胞，诸如棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛花、番茄和烟草的细胞培养物。已经鉴别出众多杆状病毒菌株和变体以及来自宿主诸如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕蛾(Bombyx mori)的相应的允许昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒毒株是公众可获得的，例如，苜蓿丫纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕蛾NPV的Bm-5毒株，并且可以根据本发明将这样的病毒用作本文中的病毒，尤其用于转染草地贪夜蛾细胞。

然而，最关注的是脊椎动物细胞，并且脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例有SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系(293细胞或被亚克隆以用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等，J.GenVirol.(普通病毒学杂志)36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)77：4216(1980))；小鼠塞托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人子宫颈瘤细胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等(1982)Annals N.Y.Acad.Sci.(纽约科学院年鉴)383：44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝细胞瘤系(Hep G2)。

用上述用于DR6和/或APP多肽制备的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将其培养在为诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因而适当改变的常规营养培养基中。

选择和使用可复制载体

可以将编码DR6、p75和/或APP多肽的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)插入到用于克隆(DNA的扩增)或表达的可复制载体中。多种载体是公众可获得的。所述载体可以例如以质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过度种方法将适当的核酸序列插入到载体中。通常，使用本领域中已知的技术将DNA插入到合适的限制性内切酶位点中。载体构件通常包括但不限于一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、一个增强子元件、启动子和转录终止序列。采用本领域技术人员已知的标准连接技术来进行对包含一个或多个这些构件的合适载体的构建。

DR6、p75和/或APP不仅可以直接地重组制备，而且还可以作为与异源多肽的融合多肽被重组制备，所述异源多肽可以是信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特异性切割位点的其他多肽。通常，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是被插入到载体中的DR6、p75和/或APP多肽编码DNA的部分。信号序列可以是例如选自以下组的原核信号序列：碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导区。对于酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导区、α因子前导区(包括酵母和克鲁维酵母α-因子前导区，后者描述于美国专利号5,010,182)或酸性磷酸酶前导区、白色念球菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导区(于1990年4月4日公布的EP 362,179)，或在公布于1990年11月15日的WO 90/13646中所述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以将哺乳动物信号序列用于蛋白的直接分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导区。

表达和克隆载体都包含使所述载体能够在一种或多种所选的宿主细胞中复制的核酸序列。对于多种细菌、酵母和病毒，这样的序列是已知的。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性菌，2μ质粒起点适合于酵母，而多种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可以用于哺乳动物细胞中的克隆载体。

表达和克隆载体通常将包含选择基因，其也被称为选择性标记。典型的选择基因编码这样的蛋白，所述蛋白(a)提供对抗生素或其他毒素(例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补足营养缺陷，或(c)提供不能从复合培养基中获得的重要营养物，例如，编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。

适用于哺乳动物细胞的选择性标记的实例有使对能够吸收DR6、p75和/或APP多肽编码核酸的细胞的鉴别成为可能的那些，诸如DHFR或胸腺激酶。当采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，其如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)，77：4216(1980)所述的那样制备和繁殖。适用于酵母中的选择基因是出现在酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature(自然)，282：39(1979)；Kingsman等，Gene(基因)，7：141(1979)；Tschemper等，Gene(基因)，10：157(1980))。trp1基因为不能在色氨酸中生长的酵母的突变菌株提供选择标记，所述酵母的突变菌株例如，ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics(遗传学)，85：12(1977))。

表达和克隆载体通常包含与编码DR6、p75和/或APP多肽的核酸序列可操作相连的启动子以指导mRNA合成。为多种潜在宿主细胞所识别的启动子是已知的。适于与原核宿主一起使用的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等(1978)Nature(自然)，275：615；Goeddel等(1979)Nature(自然)，281：544)、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，8：4057(1980)；EP 36,776)，以及杂合启动子诸如tac启动子(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)，80：21-25(1983))。用于细菌系统的启动子也将包括与编码DR6、p75和/或APP多肽的DNA可操作相连的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。

适于与酵母宿主一起使用的启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，255：2073(1980))或其他糖解酶的启动子(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.(酶调节进展杂志)，7：149(1968)；Holland，Biochemistry(生物化学)，17：4900(1978))，诸如以下酶的启动子：烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。

其他酵母启动子(具有通过生长条件来控制转录的额外优势的可诱导启动子)是以下各项的启动子区域：醇脱氢酶2、异细胞色素(isocytochrome)C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。适用于酵母表达中的载体和启动子在EP 73,657中得到进一步描述。

通过例如从病毒如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公布的UK2,211,504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猴病毒40(SV40)的基因组获得的启动子，从异源哺乳动物启动子获得的启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，以及从热休克启动子获得的启动子(只要这些启动子与宿主细胞系统相容)来控制哺乳动物宿主细胞中从载体的DR6、p75和/或APP多肽转录。

可以通过将增强子序列插入到载体中来增强高等真核生物对编码DR6、p75和/或APP多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常为约10至300bp，其作用于启动子以增强它的转录。目前已知很多来自哺乳动物基因的增强子序列(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白质和胰岛素)。然而，典型地，将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点晚期侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子。增强子可以被接合到载体中的DR6、p75和/或APP多肽编码序列的5’位置或3’位置处，但是优选地位于启动子的5’位点。

用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物的成核细胞)中的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所需的序列。这种序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’和(偶尔的)3’未翻译区获得。这些区域包含作为编码DR6多肽的mRNA的未翻译部分中的多腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。

适用于DR6、p75和/或APP多肽在重组脊椎动物细胞培养中的合成的其他方法、载体和宿主细胞在Gething等，Nature(自然)，293：620-625(1981)；Mantei等，Nature(自然)，281：40-46(1979)；EP117,060；和EP 117,058中得到描述。

培养宿主细胞

可以将用于生产本发明的DR6、p75和/或APP多肽的宿主细胞在多种培养基中培养。市售培养基诸如Ham’s F10(Sigma)、Minimal EssentialMedium(最小必需培养基)((MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改进Eagle培养基((DMEM)，Sigma)适合培养宿主细胞。此外，在Ham等，Meth.Enz.(酶学方法)58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.(分析生物化学)102：255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中所述的任何培养基都可以被用作宿主细胞的培养基。当必要时任何这些培养基都可以补充以激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸腺嘧啶)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药)、痕量元素(被定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)以及葡萄糖或等价能量源。也可以包含本领域技术人员已知的适当浓度的任何其他必要的添加物。培养条件诸如温度、pH等是之前被选择用于表达的宿主细胞所使用的那些，并且其对于本领域技术人员是显然的。

检测基因扩增/表达

可以基于本文中提供的序列，使用适当标记的探针，直接通过例如常规Southern印迹法、量化mRNA转录的Northern印迹法(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)，77：5201-5205(1980))、斑点印迹法(DNA分析)或原位杂交来测量样品中的基因扩增和/或表达。备选地，可以采用这样的抗体，所述抗体可以识别特异性双链体，包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。又可以使抗体被标记，并且可以在双链体结合到表面时进行测定，以致当双链体在表面形成时，可以检测到结合到双链体的抗体的存在。

备选地，可以通过以下方法来测量基因表达：免疫方法如对细胞或组织切片的免疫组化染色以及测定细胞培养物或体液以直接量化基因产物的表达。可用于免疫组化染色和/或测定样品液的抗体可以是单克隆或多克隆，并且可以在任何哺乳动物中制备。可以方便地制备针对天然序列DR6多肽、或针对基于本文中提供的DR6序列的合成肽、或针对与DR6DNA融合并编码特异性抗体表位的外源序列的抗体。

DR6多肽的纯化

可以从培养基或宿主细胞裂解液回收多种形式的DR6、p75和/或APP多肽。如果是膜结合的，则可以使用合适的去垢剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶切来使其从膜释放。可以通过多种物理或化学方法如冻融循环、超声、机械破碎或细胞裂解试剂来破裂用于表达DR6多肽的细胞。

可能需要的是从重组细胞蛋白或多肽纯化DR6、p75和/或APP多肽。以下方法是合适纯化方法的示例：通过在离子交换柱上的分部分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅或在阳离子交换树脂如DEAE上的层析；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；除去污染物如IgG的蛋白质A Sepharose柱；以及结合表位标签形式的DR6和/或APP多肽的金属螯合柱。可以使用多种蛋白纯化方法并且这些方法在本领域中是已知的并在例如Deutscher，Methods inEnzymology(酶学方法)，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principlesand Practice(蛋白纯化：原理和实践)，Springer-Verlag，纽约(1982)中得到描述。所选择的一个或多个纯化步骤将取决于例如所用的生产方法和所产生的特定DR6多肽的性质。

可以将可溶形式的DR6、p75和/或APP用作本发明方法中的DR6拮抗剂或p75拮抗剂。这样的可溶形式的DR6、p75和/或APP可以包含修饰，如下所述(诸如通过与免疫球蛋白、表位标签或亮氨酸拉链融合)。还预期将免疫粘附素分子用于本文中的方法。DR6、p75和/或APP免疫粘附素可以包括不同形式的DR6、p75和/或APP，诸如全长多肽以及可溶胞外结构域形式的DR6、p75和/或APP或其片段。在特定的实施方案中，所述分子可以包括DR6多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区域的融合物。对于二价形式的免疫粘附素，这种融合可以是与IgG分子的Fc区的。Ig融合优选地包括用可溶(跨膜结构域缺失或失活)形式的多肽置换Ig分子中的至少一个可变区。在尤其优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包括IgG1分子的铰链、CH2和CH3，或铰链、CH1、CH2和CH3区。对于免疫球蛋白融合物的制备，也参见于1995年6月27日发布的美国专利号5,428,130和Chamow等，TIBTECH，14：52-60(1996)。

任选的免疫粘附素设计将粘附素(例如DR6、p75和/或APP胞外域)的一个或多个结合结构域与免疫球蛋白重链的Fc区结合在一起。通常，当制备本发明的免疫粘附素时，编码粘附素的结合结构域的核酸将通过C端与编码免疫球蛋白恒定结构域序列的N末端的核酸融合，然而N端融合也是可能的。

通常，在这样的融合中，被编码的嵌合多肽将至少保留功能上有活性的免疫球蛋白重链的恒定区的铰链、C_H2和C_H3结构域。融合也发生在恒定结构域的Fc部分的C末端，或者使N端紧邻重链的C_H1或轻链的相应区域。融合发生的准确位点不是关键的；具体位点是已知的并且可以对其进行选择以优化免疫粘附素的生物学活性、分泌或结合性质。

在优选的实施方案中，将粘附素序列融合到免疫球蛋白G₁(IgG₁)的Fc区的N末端。可能将整个重链恒定区与粘附素序列融合。然而，更优选地，在融合中使用在紧接以下位点上游的铰链区起始的序列：在化学上限定IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位点(即残基216，重链恒定区的第一个残基是114)，或其他免疫球蛋白的类似位点。在尤其优选的实施方案中，将粘附素氨基酸序列融合到IgG重链的(a)铰链区和C_H2和C_H3，或(b)C_H1、铰链、C_H2和C_H3结构域。

对于双特异性免疫粘附素，免疫粘附素被装配成多聚体，并且尤其被装配成异源二聚体或异源四聚体。通常，这些经装配的免疫球蛋白将具有已知的单位结构。当IgG、IgD和IgE存在时形成基本的四链结构单元。四链单元在更高分子量免疫球蛋白中重复；IgM通常以通过二硫键保持在一起的四个基本单元的五聚体存在。IgA球蛋白以及偶尔的IgG球蛋白也可以以多聚形式存在于血清中。在多聚体的情况中，四个单元中的每个可以相同或不同。

在本文的范围内的多种例示性的经装配的免疫粘附素示意性地图示于下：

(a)AC_L-AC_L；

(b)AC_H-(AC_H、AC_L-AC_H、AC_L-V_HC_H或V_LC_L-AC_H)；

(c)AC_L-AC_H-(AC_L-AC_H、AC_L-V_HC_H、V_LC_L-AC_H或V_LC_L-V_HC_H)

(d)AC_L-V_HC_H-(AC_H或AC_L-V_HC_H或V_LC_L-AC_H)；

(e)V_LC_L-AC_H-(AC_L-V_HC_H或V_LC_L-AC_H)；以及

(f)(A-Y)_n-(V_LC_L-V_HC_H)₂，

其中每个A表示相同或不同的粘附素氨基酸序列；

V_L是免疫球蛋白轻链可变结构域；

V_H是免疫球蛋白重链可变结构域；

C_L是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

C_H是免疫球蛋白重链恒定结构域；

n是大于1的整数；

Y指示共价交联剂的残基。

为简洁起见，上述结构仅显示主要特性；它们不显示连接(J)或免疫球蛋白的其他结构域，也不显示二硫键。然而，当这样的结构域为结合活性所需时，应当将它们看作是存在于它们在免疫球蛋白分子中占据的通常位置。

备选地，可以将粘附素序列插入到免疫球蛋白重链和轻链序列之间，以致获得包含嵌合重链的免疫球蛋白。在此实施方案中，将粘附素序列融合到免疫球蛋白每个臂中的免疫球蛋白重链的3′端，在铰链和C_H2结构域之间，或在C_H2和C_H3结构域之间。Hoogenboom等，Mol.Immunol.(分子免疫学)，28：1027-1037(1991)报道了类似的构建体。

尽管不要求在本发明的免疫粘附素中存在免疫球蛋白轻链，但是免疫球蛋白轻链可以如下方式存在：与粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽共价结合，或直接融合到粘附素。在前一种情况中，通常将编码免疫球蛋白轻链的DNA与编码粘附素-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。当分泌时，杂合重链和轻链将共价结合从而提供包含两个经二硫键连接的免疫球蛋白重链-轻链对的免疫球蛋白样结构。适于产生这样的结构的方法在例如于1989年3月28日发布的美国专利号4,816,567中得到公开。

通过将编码粘附素部分的cDNA序列符合读框的融合到免疫球蛋白cDNA序列可以最方便地构建免疫粘附素。然而，以可以使用与基因组免疫球蛋白片段的融合(参见，例如Aruffo等，Cell(细胞)，61：1303-1313(1990)；和Stamenkovic等，Cell(细胞)，66：1133-1144(1991))。后一种类型的融合需要用于表达的Ig调节序列的存在。可以通过杂交或通过聚合酶链反应(PCR)技术，基于来自源于脾或周边血淋巴细胞的cDNA文库的公布的序列，来分离编码IgG重链恒定区的cDNA。将编码“粘附素”和免疫粘附素的免疫球蛋白部分的cDNA串联地插入到在所选宿主细胞中进行有效表达的质粒载体中。

在另一个实施方案中，可以通过以下方式来对DR6拮抗剂进行共价修饰：以在美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式将受体多肽与多种非蛋白聚合物中的一种(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)或其他相似分子(诸如聚谷氨酸)相连。可以使用本领域中已知的技术来制备这种PEG化的(pegylated)形式。

这些分子的亮氨酸拉链形式同样为本发明所预期。在本领域中，术语“亮氨酸拉链”用于表示富含亮氨酸的序列，其增强、促进或驱动其融合配偶体(例如，与亮氨酸拉链融合或连接的序列或分子)的二聚化或三聚化。多种亮氨酸拉链多肽已经在本领域中得到描述。参见，例如，Landschulz等，Science(科学)，240：1759(1988)；美国专利5,716,805；WO 94/10308；Hoppe等，FEBS Letters(FEBS通讯)，344：1991(1994)；Maniatis等，Nature(自然)，341：24(1989)。本领域技术人员将理解亮氨酸拉链序列可以在DR6或p75分子的5′或3′端融合。

也可以通过将本发明的DR6、p75和/或APP多肽与另一种、异源多肽或氨基酸序列融合来以形成嵌合分子的方式对所述多肽进行修饰。优选地，这样的异源多肽或氨基酸序列是使所述嵌合分子寡聚化的异源多肽或氨基酸序列。在一个实施方案中，这样的嵌合分子包括DR6、p75和/或APP多肽与标签多肽的融合物，所述标签多肽提供抗标签抗体可以选择性结合的表位。通常将表位标签放置在多肽的氨基或羧基末端。可以使用针对标签多肽的抗体来检测这种表位标签形式的多肽的存在。同样，表位标签的提供使得能够通过亲和纯化使用抗标签抗体或另一种类型的与表位标签结合的亲和性基质来容易地纯化多肽。多种标签多肽及其各自的抗体在本领域中是已知的。实例包括多-组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field等，Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)，8：2159-2165(1988))；c-myc标签及针对它的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan等，Mol.Cell.Biol.(分子细胞生物学)，5：3610-3616(1985))；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等，Protein Engineering(蛋白质工程)，3(6)：547-553(1990))。其他标签多肽包括Flag-肽(Hopp等，BioTechnology(生物技术)，6：1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin等，Science(科学)，255：192-194(1992))；α微管蛋白表位肽(Skinner等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，266：15163-15166(1991))；和T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)，87：6393-6397(1990))。

抗DR6、抗p75和抗APP抗体

在本发明的其他实施方案中，提供DR6、p75和/或APP抗体。例示性抗体包括多克隆、单克隆、人源化、双特异性和异源缀合抗体。在一些实施方案中，这些抗DR6、p75和/或APP抗体优选DR6拮抗剂抗体。

多克隆抗体

本发明的抗体可以包括多克隆抗体。用于制备多克隆抗体的方法为技术人员所熟知。可以例如通过一次或多次免疫剂和(如果需要)佐剂的注射，在哺乳动物中培育多克隆抗体。典型地，通过多次皮下或腹膜内注射将免疫剂和/或佐剂注射到哺乳动物中。免疫剂可以包括DR6、p75和/或APP多肽(例如DR6、p75和/或APP ECD)或其融合蛋白质。可能有用的是将免疫剂与已知在被免疫的哺乳动物中具有免疫原性的蛋白缀合。这种具有免疫原性的蛋白质的实例包括但不限于血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可用的佐剂的实例包括Freund氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂A、合成海藻糖dicorynomycolate)。本领域技术人员不需要过多实验就可以选择免疫方案。然后给所述哺乳动物放血，并且测定血清的DR6和/或APP抗体效价。如果需要，给哺乳动物加强注射(boosted)直到抗体效价增加或达到平台。

单克隆抗体

备选地，本发明的抗体可以是单克隆抗体。可以使用杂交瘤方法如由Kohler和Milstein，Nature(自然)，256：495(1975)描述的那些来制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，典型地用免疫剂来免疫小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物以诱导产生或能够产生将与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。备选地，可以在体外免疫淋巴细胞。

所述免疫剂通常将包括DR6、p75和/或APP多肽(例如DR6、p75和/或APP ECD)或其融合蛋白，诸如DR6ECD-IgG、p75ECD-IgG和/或APPsAPP-IgG融合蛋白。

通常，如果需要的是人类器官的细胞则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要的是非人哺乳动物来源则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与永生细胞系融合，从而形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理与实践)，Academic Press，(1986)pp.59-103)。永生细胞系通常是被转化的哺乳动物细胞，尤其是啮齿动物、牛和人起源的骨髓瘤细胞。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可以将杂交瘤细胞在合适的培养基中培养，所述培养基优选地包含一种或多种抑制未融合的永生细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基将典型地包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)，所述物质阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。

优选的永生细胞系是这样的细胞系，其有效地融合，支持所选抗体产生细胞稳定地高水平地表达抗体，并且对培养基如HAT培养基敏感。更优选的永生细胞系是鼠科骨髓瘤细胞系，其可以从例如Salk Institute CellDistribution Center(Salk研究所细胞分发中心)，San Diego，California和American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心)，Manassas，Virginia获得。这种鼠骨髓瘤细胞系的实例是P3X63Ag8U.1，(ATCC CRL1580)。对于将人骨髓瘤和鼠-人杂交骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体也已经有描述(Kozbor，J.Immunol.(免疫学杂志)，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体制备技术和应用)，Marcel Dekker，Inc.，纽约，(1987)pp.51-63)。

然后可以测定在其中培养有杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对DR6、p75和/或APP的单克隆抗体。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定来确定由杂交瘤细胞制备的单克隆抗体的结合特异性，所述测定如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。这些技术和测定在本领域中是已知的。可以例如通过Munson和Pollard，Anal.Biochem.(分析生物化学)，107：220(1980)的Scatchard分析或通过BiaCore分析来确定单克隆抗体的结合亲和力。

在所需的杂交瘤细胞得到鉴别后，可以通过有限稀释方式来亚克隆克隆以及通过标准方法使克隆生长(Goding，如上)。用于此目的的合适培养基包括例如，Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM培养基)和RPMI-1640培养基。备选地，杂交瘤细胞可以作为腹水在哺乳动物体内培育。

可以通过常规免疫球蛋白纯化方法如例如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析来从培养基或腹水流体分离或纯化由亚克隆分泌的单克隆抗体。

也可以通过重组DNA方法如在美国专利号4,816,567中所述的那些来制备单克隆抗体。可以使用常规方法容易地分离编码单克隆抗体的DNA并对其进行测序(例如，通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当这种DNA的优选的来源。一旦被分离，可以将DNA置于表达载体中，然后将所述表达载体转染到宿主细胞如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。也可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列置换同源的鼠的序列(Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)81，6851(1984))或通过与免疫球蛋白编码序列非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价相连来改变DNA。以所述方式制备“嵌合”或“杂合”抗体以使其具有对本文中的抗DR6单克隆抗体的结合特异性。

通常，用这种非免疫球蛋白多肽来置换本发明的抗体的恒定结构域，或者用它们来置换本发明的抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体，所述嵌合二价抗体包含一个对DR6具有特异性的抗原结合位点以及另一个对不同的抗原具有特异性的抗原结合位点。

也可以使用合成蛋白化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些)来制备嵌合或杂合抗体。例如，可以使用二硫键互换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁亚氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。

也可以制备单链Fv片段，诸如在Iliades等，FEBS Letters(FEBS通讯)，409：437-441(1997)中所述的。在Kortt等，Protein Engineering(蛋白质工程)，10：423-433(1997)中描述了使用多种接头来对这种单链片段进行偶联。用于重组制备和抗体操作的多种技术在本领域中是已知的。为技术人员所通常使用的这些技术的例示性实例在以下得到更详细的描述。

人源化抗体

通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。基本可以遵从Winter及同事(Jones等，Nature(自然)，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature(自然)，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science(科学)，239：1534-1536(1988))的方法，通过用啮齿动物的CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行人源化。

因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上不及完整人可变结构域的序列被来自非人物种的相应序列所置换。实际上，人源化抗体典型地是其中某些CDR残基以及可能的某些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基所取代的人抗体。

重要的是被人源化的抗体保留有对抗原的高亲和力和其他有利的生物学性质。为实现此目的，根据优选的方法，通过分析亲本序列和多种概念上的人源化产物的过程(使用亲本和人源化序列的三维模型)来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是本领域技术人员可获得并且熟悉的。图示并显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。对这些显示的观察允许对残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用进行分析，即对影响候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基进行分析。以此方式，可以从共有和输入序列选择并结合FR残基以获得所需的抗体特性，诸如增加的对一个或多个靶标抗原的亲和力。通常，CDR残基直接并且最充分地涉及对抗原结合的影响。

人抗体

可以通过杂交瘤方法制备人单克隆抗体。例如，Kozbor，J.Immunol.(免疫学杂志)133，3001(1984)，和Brodeur等，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体制备技术和应用)，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)已经描述了用于制备人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。

目前可能制备这样的转基因动物(例如小鼠)，当免疫时所述转基因动物能够在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下生产全套人抗体。例如，据描述，抗体重链连接区(JH)基因在嵌合和种系突变体小鼠中的纯合缺失导致对内源抗体制备的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系突变体小鼠中将导致抗原攻击时人抗体的产生。参见，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院报)90，2551-255(1993)；Jakobovits等，Nature(自然)362，255-258(1993)。

Mendez等(Nature Genetics(自然-遗传学)15：146-156(1997))进一步改进了该技术并且制备出了被称为“Xenomouse II”的转基因小鼠，该转基因小鼠当用抗原攻击时产生高亲和力完全人抗体。这通过将兆碱基人重链和轻链基因座种系整合到如上所述的内源J_H区段缺失的小鼠中实现。Xenomouse II具有1,020kb的人重链基因座，其包含大约66个V_H基因，完全D_H和J_H区以及三个不同的恒定区(μ、δ和χ)，并且还具有800kb的人κ基因座，其包含32个Vκ基因，Jκ区段和Cκ基因。在这些小鼠中产生的抗体与在人中所见的抗体在包括基因重排、装配和谱(repertoire)的所有方面都非常相似。由于内源J_H区段的缺失(其防止了在鼠基因座中的基因重排)人抗体得到相对内源抗体的优先表达。

备选地，可以将噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature(自然)348，552-553(1990))用于在体外从来自未经免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因组谱制备人抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体V结构域基因符合读框地克隆到丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并且将其作为功能抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能性质的选择也导致对编码展示那些性质的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟B细胞的某些性质。可以以多种形式进行噬菌体展示；对它们的综述参见，例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in StructuralBiology(结构生物学新见)3，564-571(1993)。可以将多种来源的V-基因区段用于噬菌体展示。Clackson等，Nature(自然)352，624-628(1991)从来源于经免疫的小鼠的脾的V基因的小的随机组合文库分离出多种抗

唑酮抗体。可以构建来自未经免疫的人供体的全套V基因，并且可以基本上遵从Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222，581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.(欧洲分子生物学学会杂志)12，725-734(1993)所述的技术来分离针对多种抗原(包括自体抗原)的抗体。在天然免疫反应中，抗体基因以高的速率累积突变(体细胞超突变)。引入的某些改变将提供更高的亲和力，并且在随后的抗原攻击过程中展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞得到优先复制和分化。可以通过采用已知为“链替换(chainshuffling)”的技术(Marks等，Bio/Technol.(生物技术)10，779-783[1992])来模拟此天然过程。在此方法中，可以通过以下方法来改善通过噬菌体展示获得的“初级”人抗体的亲和力：继续用获得自未经免疫的供体的V结构域基因的全套天然存在的变体(谱)替代重链和轻链V区基因。此技术允许制备具有nM范围内的亲和力的抗体和抗体片段。Waterhouse等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)21，2265-2266(1993)已经描述了用于制备非常大的抗体谱(也被称为“母库(mother-of-all libraries)”)的策略。也可以将基因替换用于从啮齿动物抗体衍生出人抗体，其中人抗体与起始啮齿动物抗体具有相似的亲和力和特异性。根据此方法(其也被称为“表位印记”)，用全套人V结构域基因来替代通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V结构域基因，产生啮齿动物-人嵌合体。对抗原的选择导致能够恢复功能抗原结合位点的人可变的分离，即表位控制(印记)对伙伴的选择。当重复该过程以替代剩余的啮齿动物V结构域时，获得人抗体(参见PCT专利申请WO 93/06213，于1993年4月1日公布)。与常规通过CDR嫁接的啮齿动物抗体的人源化不同，此技术提供完全的人抗体，其不具有啮齿动物源的框架或CDR残基。

如以下所详述的，本发明的抗体可以任选地包括单体抗体、双体抗体以及多价形式的抗体。本领域技术人员可以通过本领域中已知的技术并使用本文中的DR6和/或APP抗体来构建这些二体或多价形式。用于制备单价抗体的方法在本领域中也是已知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰的重链的重组表达。重链通常在Fc区中的任一点处被截短以防止重链交联。备选地，用另一个氨基酸残基置换相关的半胱氨酸残基或将其缺失以防止交联。

双特异性抗体

双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆(优选地)人或人源化抗体。在本例中，结合特异性之一针对DR6受体，另一个针对任何其他抗原，并且优选针对另一种受体或受体亚基。在一个实施方案中，另一个抗原是p75。制备双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。常规上，双特异性抗体的重组制备基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature(自然)，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))产生十种不同抗体分子的可能混合物，在所述十种不同抗体分子中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤完成的对正确分子的纯化是相当繁琐的，并且产物产量低。类似方法公开在PCT申请公布号WO 93/08829(公布于1993年5月13日)以及Traunecker等，EMBO J.(欧洲分子生物学学会杂志)，10：3655-3659(1991)中。

根据一个不同的并且更优选的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域融合到免疫球蛋白恒定结构域序列。该融合优选地是与免疫球蛋白重链恒定结构域(其包含至少部分的铰链、CH2和CH3区)融合。优选的是在至少一个所述融合中存在有第一重链恒定区(CH1)，其包含轻链结合所需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物以及(如果需要)免疫球蛋白轻链的的DNA插入到分别的表达载体中，并将其共转染到合适的宿主生物体中。当非等比的用于构建的三种多肽链提供最优产量时，这在调节实施方案中三种多肽片段的相互比例方面提供极大的灵活性。然而，可能的是，当至少两种多肽链的等比表达导致高产量时或当比率不是特别重要时，将两种或全部三种多肽链的编码序列插入到一个表达载体中。在此方法优选的实施方案中，双特异性抗体由在一个臂中的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。发现，此非对称结构促进所需的双特异性化合物从不需要的免疫球蛋白链组合中分离，因为免疫球蛋白轻链仅在双特异性分子的一半中存在提供了容易的分离方式。此方法公开在于1994年3月3日公布的PCT公布号WO 94/04690中。

对于制备双特异性抗体的进一步的细节，参见，例如，Suresh等，Meth.Enzymol.(酶学方法)121，210(1986)。

异源缀合抗体

异源缀合物抗体也在本发明的范围内。异源缀合物抗体由两个共价结合的抗体构成。已经提出例如这种抗体使不想要的细胞成为免疫系统细胞的靶标(美国专利号4,676,980)，并且用于治疗HIV感染(PCT申请公布号WO 91/00360和WO 92/200373；EP 03089)。可以使用任何方便的交联方法来制备异源缀合抗体。合适的交联剂在本领域中是已知的，并与众多交联技术一起公开在美国专利号4,676,980中。

抗体片段

在某些实施方案中，抗DR6、抗p75和/或抗APP抗体(包括鼠、人和人源化抗体，和抗体变体)是抗体片段。已经开发出多种用于制备抗体片段的技术。常规上，通过对完整抗体进行蛋白水解消化来获得这些片段(参见，例如，Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods(生物化学生物物理学方法杂志)24：107-117(1992)和Brennan等，Science(科学)229：81(1985))。然而，目前可以直接通过重组宿主细胞来制备这些片段。例如，可以直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并对其进行化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology(生物技术)10：163-167(1992))。在另一个实施方案中，使用亮氨酸拉链GCN4来形成F(ab′)₂以促进F(ab′)₂分子的装配。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离Fv、Fab或F(ab′)₂片段。对于本领域技术人员，用于制备抗体片段的多种技术将是显然的。例如，可以使用木瓜蛋白酶来进行消化。木瓜蛋白酶消化的实例公开在公布于12/22/94的WO 94/29348和美国专利号4,342,566中。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，其每个具有单抗原结合位点以及残余的Fc片段。胃蛋白酶处理产生F(ab′)₂片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。

在抗体消化中制备的Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH₁)。Fab′片段因在重链CH₁结构域的羧基末端增加了一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。Fab′-SH是本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为成对Fab′片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。抗体的糖基化变体

抗体在它们的恒定区中的保守位置处被糖基化(Jefferis和Lund，Chem.Immunol.(化学免疫学)65：111-128(1997)；Wright和Morrison，TibTECH 15：26-32[1997])。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白的功能(Boyd等，Mol.Immunol.(分子免疫学)32：1311-1318(1996)；Wittwe和Howard，Biochem.(生物化学)29：4175-4180(1990))，和能够影响糖蛋白的构象和呈现的三维表面的部分的糖蛋白的部分之间的分子内相互作用(Hefferis和Lund，见上；Wyss和Wagner，Current Opin.Biotech.(生物技术新见)7：409-416(1996))。寡糖也可以用于基于特异性的识别结构将给定的糖蛋白靶向到特定的分子。例如，据报道，在半乳糖基化的IgG中，寡糖部分从CH2空间之间“翻(flip)”出，而末端N-乙酰葡糖胺残基变得可以结合甘露糖结合蛋白(Malhotra等，Nature(自然)Med.1：237-243(1995))。通过糖肽酶从在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞细胞中制备的CAMPATH-1H(识别人淋巴细胞CDw52抗原的重组人源化鼠单克隆IgG1抗体)中除去寡糖导致补体介导的溶菌的完全下降(CMCL)(Boyd等，Mol.Immunol.(分子免疫学)32：1311-1318[1996])，而使用神经氨酸酶选择性地去除唾液酸残基不导致DMCL的损失。同样据报道，抗体的糖基化影响抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)。尤其地，据报道，四环素调节β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)表达、糖基转移酶催化等分GlcNAc形成的CHO细胞具有改善的ADCC活性(Umana等，Mature Biotech.17：176-180(1999))。

抗体的糖基化变体是其中抗体的糖基化形式被改变的变体。改变是指缺失一个或多个发现于抗体中的碳水化合物部分，向抗体中添加一个或多个碳水化合物部分，改变糖基化的组成(糖基化模式)、糖基化的程度等。可以例如通过在编码抗体的核酸序列中除去、改变和/或添加一个或多个糖基化位点来制备糖基化变体。

抗体的糖基化通常是N连接型的或O连接型的。N连接型的是指将碳水化合物部分连接到天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶连接的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一个在多肽中的出现产生潜在的糖基化位点。O连接型糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一个与羟基氨基酸连接，所述羟基氨基酸最通常的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

常规上通过改变氨基酸序列以使其包含一个或多个上述三肽序列来实现将糖基化位点添加到抗体(用于N连接型糖基化位点)。也可以通过向原有抗体的序列加入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基置换原有抗体的序列来进行改变(用于O连接型糖基化位点)。

也可以在不改变根本的核苷酸序列的情况下改变抗体的糖基化(包括糖基化形式)。糖基化很大程度上取决于用于表达抗体的宿主细胞。因为用于表达作为潜在治疗剂的重组糖蛋白(例如抗体)的细胞类型很少是天然细胞，所以可以预期抗体糖基化形式的显著变化(参见，例如Hse等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272：9062-9070(1997))。除了对宿主细胞的选择，在抗体的重组制备过程中影响糖基化的因素还包括生长模式、培养基配方、培养密度、充氧、pH、纯化方案等。已经提出了用于在特定宿主生物体中实现糖基化形式改变的多种方法，包括引入或过表达参与寡糖制备的某些酶(美国专利号5,047,335；5,510,261和5.278,299)。可以例如使用内切糖苷酶H(Endo H)来通过酶学方法从糖蛋白除去糖基化或某些类型的糖基化。此外，可以对重组宿主细胞进行遗传改造，例如在对某些类型的多糖的加工中产生缺陷。这些和相似的技术在本领域中是已知的。

可以通过碳水化合物分析的常规技术来容易地分析抗体的糖基化结构，所述碳水化合物分析的常规技术包括凝集素层析、NMR、质谱、HPLC、GPC、单糖组成分析、连续酶消化以及HPAEC-PAD，其使用高pH阴离子交换层析从而基于电荷分离寡糖。释放寡糖以用于分析的方法也是已知的，并且包括但不限于酶处理(通常使用肽-N-糖苷酶F/内切-β-半乳糖苷酶来进行)，使用极碱性环境以主要释放O连接型结构的去除，以及使用无水肼以释放N连接型和O连接型寡糖的化学方法。

典型抗体

如在以下实施例中所述，已经鉴别了抗DR6单克隆抗体。在备选的实施方案中，本发明的DR6抗体将具有与本文中具体公开的抗DR6，抗p75和/或抗APP抗体中的任一种相同的生物学特性。

术语“生物学特性”用于指单克隆抗体的体外和/或体内活性或性质，诸如特异性结合DR6或阻断、抑制或中和DR6活化的能力。DR6、p75和/或APP抗体的性质和活性在以下实施例中得到进一步描述。

任选地，本发明的单克隆抗体将具有与在以下实施例中被具体表征的抗体中的任一种相同的生物学特性，和/或结合与这些抗体结合的表位相同的一个或多个表位。这可以通过进行多种测定确定，所述多种测定诸如在本文中以及在实施例中所述的。例如，为确定单克隆抗体是否具有与本文中具体所指的DR6、p75和/或APP抗体相同的特异性，可以在竞争性结合测定中比较其活性。此外，可以通过对DR6、p75和/或APP与所述抗体之间的复合物的晶体学研究来确定特定的抗DR6、p75和/或APP抗体结合哪个表位。

如本文中所述，DR6、p75和/或APP抗体优选地将具有所需的DR6、p75或APP拮抗活性。这样的抗体可以包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和亲和力成熟抗体。如上所述，可以使用多种技术来构建或改造DR6、p75和/或APP抗体以获得这些所需的活性或性质。

本发明另外的实施方案包括本文中公开的与一个或多个非蛋白聚合物相连的抗DR6受体，抗p75和/或抗APP配体抗体，所述一个或多个非蛋白聚合物选自由聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯组成的组。任选地，本文中公开的抗DR6受体、抗p75和/或抗APP配体抗体是糖基化的或备选地是未经糖基化的。

本发明的抗体包括“交联的”DR6、p75和/或APP抗体。术语“交联的”当用于本文时指至少两个IgG分子结合在一起以形成一个(或单个)分子。可以使用多种接头分子来对DR6、p75和/或APP抗体进行交联，优选地使用抗IgG分子、补体、化学修饰或分子改造来交联DR6、p75和/或APP抗体。为本领域技术人员所理解的是，一旦抗体与细胞表面膜结合补体就具有相当高的对抗体分子的亲和力。因此，例如，据信补体可以被用作交联分子以连接两个或更多个与细胞表面膜结合的抗DR6抗体。

本发明还提供如本文中公开的编码DR6、p75和/或APP抗体的分离的核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞，以及用于制备所述抗体的重组技术。

为重组制备抗体，将编码所述抗体的核酸分离并插入到用于进一步克隆(DNA的扩增)或表达的可复制载体中。使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体的基因特异性结合的寡核苷酸探针)可以容易地分离编码抗体的DNA并对其测序。许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下各项中的一个或多个：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子以及转录终止序列。

本文中的方法包括用于制备嵌合或重组抗DR6和/或APP抗体的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含编码抗DR6、抗p75和/或抗APP抗体轻链或重链(或轻链和重链两者)的DNA序列的载体，用该载体转染或转化宿主细胞，以及在足以产生重组抗DR6抗体、抗p75抗体和/或抗APP抗体产物的条件下培养宿主细胞。

DR6拮抗剂的制剂

在本文中典型的制剂的制备中，要注意，所用组分的推荐的品质或“级别”将取决于制剂的最终用途。对于治疗性用途，优选的是所述一种或多种组分属于可允许作为药物产品添加剂的级别(诸如“GRAS”)。

在某些实施方案中，提供包含DR6和任选地一种或多种p75拮抗剂以及一种或多种赋形剂的组合物，所述一种或多种赋形剂的组合物提供足够的离子强度以增强DR6拮抗剂的可溶性和/或稳定性，其中所述组合物具有6(或大约6)至9(或大约9)的pH。可以通过任何合适的方法来制备DR6和p75拮抗剂以达到所需的蛋白纯度，例如，根据以上方法。在某些实施方案中，在宿主细胞中重组表达拮抗剂或通过化学合成来制备拮抗剂。DR6或p75拮抗剂在所述制剂中的浓度可以取决于例如该制剂的目的用途而不同。本领域技术人员无需过度实验就可以确定所需的DR6或p75拮抗剂的浓度。

所述制剂中的提供足够的离子强度以增强DR6或p75拮抗剂的可溶性和/或稳定性一种或多种赋形剂的组合物任选地是聚离子有机或无机酸、天冬氨酸盐、硫酸钠、琥珀酸钠、醋酸钠、氯化钠、Captisol^TM、Tris、精氨酸盐或其他氨基酸、糖和多元醇诸如海藻糖和蔗糖。优选地所述制剂中的提供足够离子强度的一种或多种赋形剂是盐。可以采用的盐包括但不限于钠盐和精氨酸盐。优选地，所用的盐的种类和盐的浓度使得该制剂具有相对高的离子强度，该离子强度允许制剂中的DR6拮抗剂稳定。任选地，盐以约20mM至约0.5M的浓度存在于制剂中。

所述组合物优选地具有6(或大约6)至9(或大约9)的pH，更优选地具有大约6.5至大约8.5的pH，并且甚至更优选地具有大约7至大约7.5的pH。在此实施方案的优选方面中，所述组合物还将包含缓冲剂以将所述组合物的pH维持在至少大约6至大约8。可用的缓冲剂的实例包括但不限于Tris、HEPES以及组氨酸。当使用Tris时，可以将pH任选地调节至大约7至8.5。当使用Hepes或组氨酸时，可以将pH任选地调节至大约6.5至7。任选地，将缓冲剂以大约5mM至大约50mM的浓度用于制剂中。

尤其对于液体制剂(或再生的冻干制剂)，可能需要在组合物中包含一种或多种表面活性剂。这样的表面活性剂可以例如包括非离子表面活性剂如TWEEN^TM或PLURONICS^TM(例如，聚山梨醇酯或泊洛沙姆)。优选地，所述表面活性剂包括聚山梨醇酯20(“Tween 20”)。将任选地以大约0.005％至大约0.2％的浓度来使用所述表面活性剂。

除了一种或多种DR6拮抗剂以及上述那些组分以外，本发明的制剂还可以包括多种其他赋形剂或组分。任选地，对于肠胃外给药，所述制剂可以包含药用或肠胃外用载体，即，在所用剂量和浓度对受体无毒性并且可与制剂的其他成分相容的载体。任选地，所述载体是肠胃外载体，诸如与受体的血液等渗的溶液。这样的载体的实例包括水、盐水或经缓冲的溶液诸如磷酸盐缓冲液(PBS)、Ringer溶液和葡萄糖溶液。多种任选的药用载体、赋形剂或稳定剂在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington药物科学)，16版，Osol，A.编辑(1980)中得到进一步描述。

本文中的制剂还可以包含一种或多种防腐剂。实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基是长链化合物)以及卞索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳香族醇、烷基对羟基苯甲酸酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯以及间甲酚。抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、卞索氯铵；丁醇；烷基对羟基苯甲酸酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于大约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖或其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；或聚乙二醇(PEG)。

本发明的组合物可以包含液体制剂(液体溶液或液体悬浮液)，和冻干制剂，以及悬浮液制剂。

如果最终制剂是液体，则优选地将其冻存在≤20℃。备选地，可以将制剂冻干并将其作为可以储存在2-30℃、用于与水再生以用于注射的粉末提供。

用于治疗性给药的制剂必须是无菌的。通过经由无菌滤膜(例如，0.2微米膜)的过滤可以容易地实现无菌。通常将治疗性组合物放入具有无菌接入端的容器中，例如，静脉溶液包或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶。

通常将所述组合物作为水溶液或作为用于再生的冻干制剂储存在单一单元或多剂容器中，例如，密封的安瓿或小瓶。容器可以是本领域中任何可用容器并且使用常规方法将其填充。任选地，制剂可以包含在适于治疗性递送所述制剂的注射笔设备(或适应笔设备的药筒)中，诸如本领域中可用的那些(参见，例如，美国专利5,370,629)。可以通过使用例如注射用水使冻干的DR6拮抗剂制剂再生来制备注射溶液。

使用DR6拮抗剂的治疗

本发明的DR6拮抗剂具有多种用途。DR6拮抗剂可用于精神病的诊断和治疗。可以由技术人员来进行对具有多种本文中所述的病理学病症的哺乳动物的诊断。诊断技术在本领域中是可用的，其允许例如诊断或检测哺乳动物的多种精神疾病。

预期由本发明治疗的精神疾病包括成瘾和精神分裂症。预期由本发明治疗的认知疾病包括图雷特综合征、雷特综合征、脆性X综合征以及自闭症。预期本发明的组合物和方法可以被用于正常的、年老的患者以保持以及可能改善衰老过程中的认知。

在本发明的方法中，优选地将DR6拮抗剂在载体中给药于哺乳动物；优选地是药用载体。合适的载体及它们的制剂在由Osol等编辑的Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington药物科学)，16版，1980，Mack Publishing Co.中得到描述。通常，将适当量的药用盐用于制剂中以使制剂等渗。载体的实例包括盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH优选地是大约5至大约8，并且更优选地大约7至大约7.5。其他载体包括缓释制剂诸如含有抗体的固体疏水聚合物的半透基质，所述基质是以成形物品例如膜、脂质体或微粒的形式存在。对于本领域技术人员明显的是取决于例如给药途径和被给药的DR6拮抗剂的浓度某些载体可以是更优选的。

可以通过注射(例如，静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、门静脉内)、口服或其他方法诸如保证其以有效形式递送到血流的输注来将DR6拮抗剂给药于哺乳动物。也可以通过隔离灌注技术诸如隔离组织灌注或通过鞘内注射、眼内注射或腰椎穿刺来给药DR6拮抗剂以发挥局部疗效。可以将不容易穿过血脑屏障的DR6拮抗剂直接给药，例如，脑内给药或给药到脊髓空间或其他，这将运输它们穿过屏障。给药DR6拮抗剂的有效剂量和时间表可以凭经验确定，并且作出这样的决定在本领域的技术范围内。本领域技术人员将理解，必须被给药的DR6拮抗剂的剂量将取决于例如将接受该拮抗剂的哺乳动物、给药途径、所用拮抗剂的具体类型以及给药于哺乳动物的其他药物而不同。可以在文献中找到在选择适当剂量方面的指导，例如，关于抗体的治疗用途，例如，Handbook of MonoclonalAntibodies(单克隆抗体手册)，Ferrone等编辑，Noges Publications，ParkRidge，N.J.，(1985)ch.22以及pp.303-357；Smith等，Antibodies in HumanDiagnosis and Therapy(人类诊断和治疗中的抗体)，Haber等编辑，RavenPress，New York(1977)pp.365-389。取决于上面提及的因素，单独使用的DR6抗体的每日典型剂量可以在每天大约1μg/kg体重至100mg/kg体重以上的范围内。

也可以将DR6拮抗剂与一种或多种其他治疗剂结合地给药于哺乳动物。据显示，APP也以较低的程度结合p75(EC₅₀＝～300nM，通过ELISA测定)。因此，可能有利的是，用DR6拮抗剂与p75拮抗剂的组合来治疗精神和认知疾病。可以进一步将其他治疗剂与DR6拮抗剂组合，任选地与p75拮抗剂组合。这样的其他治疗剂的实例包括表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，例如，结合或以其他方式与EGFR直接相互作用并防止或减弱其信号活性的化合物，诸如Tarceva、抗体如C225(也被称为cetuximab(西妥昔单抗)和

(爱必妥)(ImClone Systems Inc.))、完全人ABX-EGF(panitumumab(帕尼单抗)，Abgenix Inc.)以及被称为E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3和在US 6,235,883中所述的完全人抗体；MDX-447(Medarex Inc)以及EGFR小分子抑制剂诸如在US5616582、US5457105、US5475001、US5654307、US5679683、US6084095、US6265410、US6455534、US6521620、US6596726、US6713484、US5770599、US6140332、US5866572、US6399602、US6344459、US6602863、US6391874、WO9814451、WO9850038、WO9909016、WO9924037、US6344455、US5760041、US6002008、US5747498中所述的化合物；特别的小分子EGFR抑制剂包括OSI-774(CP-358774、厄洛替尼(erlotinib)，OSI Pharmaceuticals)；PD 183805(CI1033、2-丙烯酰胺、N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-二盐酸化物，Pfizer Inc.)；易瑞沙(Iressa)(ZD1839、吉非替尼(gefitinib)、4-(3’-氯-4’-氟苯胺)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5，4-d]嘧啶-2，8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯乙基)氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁酰胺)；以及EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)。可以采用的其他治疗剂包括凋亡抑制剂，尤其是细胞内凋亡抑制剂，例如半胱天冬酶抑制剂诸如半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6或半胱天冬酶-8抑制剂，Bid抑制剂，Bax抑制剂或它们的任何组合。合适的抑制剂的实例有半胱天冬酶抑制剂(通常)、二肽抑制剂、氨基甲酸酯抑制剂、经取代的天冬氨酸缩醛、杂环对尿嗪、喹啉-(二-，三-，四肽)衍生物、经取代的2-氨基苯甲酰胺半胱天冬酶抑制剂、经取代的a-羟基酸半胱天冬酶抑制剂、由硝基化作用产生的抑制；CASP-1；CASP-3：蛋白抑制剂，反义分子，烟酰-天冬氨酰-酮，y-酮酸二肽衍生物，CASP-8：反义分子，相互作用蛋白CASP-9，CASP2：反义分子；CASP-6：反义分子；CASP-7：反义分子；以及CASP-12抑制剂。其他实例有线粒体抑制剂诸如Bcl-2-调制因子；衍生自Bad的Bcl-2突变肽、Bad、BH3-相互作用结构域死亡激动剂、Bax抑制剂蛋白和BLK基因和基因产物。此外，合适的细胞内凋亡调质有CASP9/Apaf-1关联调质、Apaf-1表达的反义调质、凋亡抑制肽、含有单纯疱疹病毒R1亚基的抗凋亡组合物、MEKK1及其片段、存活蛋白的调质、凋亡抑制剂的调质以及HIAP2。这样的试剂的此外的实例包括抑制细胞色素c从线粒体释放并且阻断半胱天冬酶-3mRNA正调节的二甲胺四环素(Neuroapoptosis Laboratory)，作为p53抑制剂的皮斐松(Pifithrin)α(UIC)，作为JNK途径抑制剂的CEP-1346(Cephalon Inc.)，抑制凋亡前GAPDH信号传导的TCH346(Novartis)，作为泛-半胱天冬酶抑制剂的IDN6556(Idun Pharmaceuticals)；作为半胱天冬酶-3抑制剂的AZQs(AstraZeneca)，作为半胱天冬酶-1/-4抑制剂的HM-3480(Aventis Pharma)，和溶解血凝块的活化酶/TPA(Genentech)(溶血栓药)。

此外，除了DR6拮抗剂，可以被给药的合适试剂还包括BACE抑制剂、胆碱酯酶抑制剂(诸如多奈哌齐(Donepezil)、加兰他敏(Galantamine)、利凡斯的明(Rivastigmine)、他克林(Tacrine))、NMDA受体拮抗剂(诸如美金刚(Memantine))、Aβ聚集拮抗剂、抗氧化剂、γ-分泌酶调质、NGF拟似物或NGF基因治疗、PPARγ激动剂、HMG-CoA还原酶拮抗剂(他汀)、安帕金(ampakines)、钙通道阻断剂、GABA受体拮抗剂、糖原合成酶激酶拮抗剂、静脉内免疫球蛋白、毒蕈碱性受体激动剂、烟碱性受体调质、主动或被动Aβ免疫、磷酸二酯酶拮抗剂、5-羟色胺受体拮抗剂和抗Aβ抗体(参见例如，WO 2007/062852；WO 2007/064972；WO 2003/040183；WO 1999/06066；WO 2006/081171；WO 1993/21526；EP 0276723B1；WO 2005/028511；WO 2005/082939)。

DR6拮抗剂可以与一种或多种其他治疗剂相继地或同时地给药。DR6拮抗剂和治疗剂的量取决于例如使用的药物的种类，被治疗的病理学病症，以及给药的时序安排和途径，但是通常将少于如果各自单独使用时。

在向哺乳动物给药DR6拮抗剂以及任选地p75拮抗剂后，可以以为技术人员所熟知的多种方式监测哺乳动物的病理学状态。

可以在体外测定中以及使用体内动物模型来检查本发明的DR6拮抗剂以及任选地p75拮抗剂的疗效。

试剂盒与制品

在本发明进一步的实施方案中，提供包含可用于治疗精神疾病和认知疾病的物质的制品和试剂盒。制品包括具有标签的容器。合适的容器包括例如瓶、小瓶和试管。容器可由诸如玻璃或塑料的多种材料制成，并且优选地是无菌的。容器盛有具有活性试剂的组合物，所述活性试剂对于治疗精神和认知疾病有效。组合物中的活性试剂是DR6拮抗剂，并且优选地包括抗DR6单克隆抗体或抗APP单克隆抗体。在一些实施方案中，组合物中的另一种活性试剂是p75拮抗剂并且优选地包括抗p75单克隆抗体或抗APP单克隆抗体。容器上的标签指出该组合物被用于治疗精神和认知疾病，并且也可以指出用于体内或体外用途(如在以上所述的那些)的指示。制品或试剂盒任选地还包括药品说明书，其是指通常包含在治疗产品的商业包装中的使用说明，其包含关于以下各项的信息：适应证、用法、剂量、给药、禁忌、与所包装产品结合的其他治疗产品和/或关于使用这种治疗产品的警告，等。

本发明的试剂盒包括上述容器和包含缓冲剂的第二容器。它还可以包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

实施例

通过以下实施例本发明的不同方面得到进一步描述和示例，所述实施例都不意欲限制本发明的范围。

可以在体内使用双光子显微镜通过长期颅窗来使突触可视化(参见图1)。利用此方法，我们可以(1)评估作为兴奋性突触的形态学相关项的树突棘的密度，以及(2)评估树突棘的形态学。

实施例1：监测体内PSD-95保持

材料和方法

子宫内电穿孔。通过子宫内电穿孔转染L2/3祖先细胞(Saito T.和N.Nakatsuji(2001)Dev.Biol.(发育生物学)240：237-246；Tabata，H.和K.Nakajima(2001)Neurosci.(神经科学)103：865-872)。使用异氟烷-氧混合物将E16计时怀孕C57BL/6J小鼠(Charles River，Wilmington，Massachusetts，United States)深度麻醉。使子宫角暴露，并且将大约1μl DNA溶液(含表达DsRed-Express的质粒，1ug/ul)以及Fast Green[Sigma，St.Louis，Missouri，United States])通过拉出的玻璃毛细管压力注射到每个胚胎的右侧脑室。将每个胚胎的头部放置在定制的钳状电极之间，并且阳极板接触头部的右侧。用五个矩形脉冲(持续时间＝50ms，频率＝1Hz，40V)来实现电穿孔。共转染效率是60-70％。参见图1。

手术。将成像窗安装在P8处的或P60后的躯体感觉皮质的上方。使用异氟烷-氧混合物将小鼠深度麻醉。在右侧躯体感觉皮质(分别地，对于幼仔/成鼠，前卤点后0.5/1.5mm以及中线侧3.0/3.5mm)的上方进行开颅(直径：4-5mm)，保持硬脑膜完整。用溶解在HEPES缓冲的人工脑脊液中的1％琼脂糖(Type-IIIA，Sigma)覆盖硬脑膜并且用5mm定制的盖玻片覆盖硬脑膜(No.1)，用牙用丙烯酸类(dental acrylic)将所述盖玻片封接就位。动物也被给予20-μl 4％地塞米松(dexamethasone)(Phoenix Scientific，St.Joseph，Missouri，United States of America)的注射。在1-h恢复期后，将成鼠放入笼中，而使幼仔与同窝小鼠以及替代母亲住在一起。

成像。通过定制的双激光双光子激光扫描显微镜(2PLSM)收集高分辨率图像。用于成像的光源是固态Ti：蓝宝石激光器(λ～1020；在物镜背聚焦面中～100mW)(Spectra Physics，Fremont，California，United States)；使用带通滤波器(610/90；Chroma Technology)来分离红色荧光光子。使用光电倍增管(3896；Hamamatsu，Hamamatsu City，Japan)来收集信号。物镜(40，0.8NA)和三眼头(trinoc)来自Olympus(Tokyo，Japan)。

我们每天使用脉管系统和树突分支模式以鉴别目的区域。成像会话由90min内的一系列图像栈组成。图像栈由在轴向上间隔以1μm的单个区段(512x512像素；像素尺寸，0.08μm)组成。在成像会话后，允许小鼠在与同窝小鼠以及替代母亲住在一起之前在加热毯上恢复大约30min；使成年动物返回它们的笼子。

数据分析。使用Matlab(Mathworks)中的定制分析例行程序在多个时间点对个体脊柱进行鉴别、注释和追踪。使用定制软件(Holtmaat A.J.等(2005)Neuron(神经元)45：279-291)来测量棘寿命、密度和长度。

结果

我们观察到：与DR6^+/-和DR6+/+动物相比，在DR6^-/-动物中树突棘密度和宽度的增加(图2)。通过对同一种群内所有动物每个细胞的棘总数/树突长度进行平均来计算密度。相比26个细胞/7只动物被注释为DR6+/-而26个细胞/6只动物被注释为DR6+/+，总计28个细胞/8只动物被注释为DR6-/-。将棘宽度和长度绘制成按照每个基因型分析的棘的整个群体的累积图。

Bittner等(见上)的结果与我们较早的发现即APP是DR6的同源配体一起表明APP对树突棘密度也发挥作用。

实施例2：在体外N-APP对树突棘的效果

材料和方法

细胞培养：用以下各项填充被PDL/昆布氨酸涂布的8孔载玻片(Becton，Dickinson and Company)：500μl/孔Neurobasal Medium(神经基质培养基)(Invitrogen)加上50ng/ml的每种重组BDNF和NT-3(Chemicon)，加上B-27补剂X50(Invitrogen)；加上Pen Strep谷氨酰胺X100(Cat.No.10378-016；Gibco)加上葡萄糖X100。将E16皮质神经元外植体放入每个孔并且在37℃培养箱中放置21天。在第21天，用0、1、3、10或30μg/ml的N-APP处理培养物。将培养物培养24小时。然后通过固定和使用带有与Alexa488(Molecular Probes)缀合的第二抗体(羊抗鼠IgG)的小鼠抗PSD95抗体来处理神经元以用于显微镜检查。结果显示在图3中。

量化每mm神经元的点(puncta)并将其绘制成相对未经处理的皮质神经元(对照)的百分比变化的点/mm的变化。结果显示在图4中。

在分别的实验中，将培养中的皮质细胞暴露于0ug/ml N-APP(对照)或浓度为0.1、0.3、1.0或3.0ug/ml的不带酸性尾部的N-APP(N-APP(-)酸性尾部)或全长N-APP(N-APP FL)，其中添加或不添加30ug/ml的抗DR6抗体aDR6.1。结果显示在图5中。

结果

图3显示N-APP引发PSD95点的减少。如在图4中所示，PSD95点的减少是浓度依赖的。该结果与N-APP和DR6相互作用从而引起神经退行和/或神经突(轴突或树突)长度和分支的减少因而引起树突棘的损失(由PSD95点的减少指示)相符。图5显示N-APP诱导的PSD95点的减少依赖于DR6。

Claims (23)

1.一种增加患有认知或精神疾病的患者的神经元中树突棘密度的方法，所述方法包括向所述患者给药有效量的DR6抑制剂或p75抑制剂。

2.权利要求1所述的方法，其中所述DR6抑制剂是与DR6的表位结合并抑制DR6的功能的抗体。

3.权利要求1所述的方法，其中所述p75抑制剂是与p75的表位结合并抑制p75的功能的抗体。

4.权利要求2所述的方法，其中所述抗体选自由3F4.4.8、4B6.9.7、1E5.5.7以及其抗原结合片段组成的组。

5.权利要求4所述的方法，其中所述抗体是嵌合或人源化的3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7，或与3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7结合相同表位的抗体。

6.权利要求1所述的方法，其中所述DR6抑制剂减少或防止所述神经元中的DR6信号传导。

7.权利要求1所述的方法，其中所述p75抑制剂减少或防止所述神经元中的p75信号传导。

8.治疗需要所述治疗的患者的认知或精神疾病的方法，所述方法包括鉴别患有与树突棘的减少相关的认知或精神疾病的患者，以及向所述患者给药治疗有效量的DR6拮抗剂或p75拮抗剂。

9.权利要求1或8所述的方法，其中所述精神或认知疾病选自由以下各项组成的组：雷特综合征、图雷特综合征、自闭症、精神分裂症和脆性X精神发育迟缓。

10.权利要求8所述的方法，其中所述DR6抑制剂是与DR6的表位结合并抑制DR6的功能的抗体。

11.权利要求8所述的方法，其中所述p75抑制剂是与p75的表位结合并抑制p75的功能的抗体。

12.权利要求10所述的方法，其中所述抗体选自由3F4.4.8、4B6.9.7、1E5.5.7以及其抗原结合片段组成的组。

13.权利要求12所述的方法，其中所述抗体是嵌合或人源化的3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7，或与3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7结合相同表位的抗体。

14.在衰老过程中维持受试者的认知的方法，所述方法包括将有效提升所述受试者中树突棘密度的量的DR6抑制剂或p75抑制剂给药于所述受试者，由此维持所述受试者的认知。

15.权利要求14所述的方法，其中所述DR6抑制剂是与DR6的表位结合并抑制DR6的功能的抗体。

16.权利要求15所述的方法，其中所述抗体选自由3F4.4.8、4B6.9.7、1E5.5.7以及其抗原结合片段组成的组。

17.权利要求16所述的方法，其中所述抗体是嵌合或人源化的3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7，或与3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7结合相同表位的抗体。

18.权利要求14所述的方法，其中所述p75抑制剂是与p75的表位结合并抑制p75的功能的抗体。

19.DR6拮抗剂在制备用于患有认知或精神疾病的患者的药物中的用途，其中所述拮抗剂抑制DR6活性。

20.权利要求15所述的DR6拮抗剂的用途，其中所述DR6拮抗剂是结合DR6的表位的抗体。

21.权利要求16所述的DR6拮抗剂的用途，其中所述抗体选自由3F4.4.8、4B6.9.7、1E5.5.7以及其抗原结合片段组成的组。

22.权利要求16所述的DR6拮抗剂的用途，其中所述抗体是嵌合或人源化的3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7，或与3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7结合相同表位的抗体。

23.p75拮抗剂在制备用于患有认知或精神疾病的患者的药物中的用途，其中所述拮抗剂抑制p75活性。

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