CN108368179B - 使用pd-1轴结合拮抗剂和抗cea/抗cd3双特异性抗体治疗cea阳性癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于治疗CEA阳性癌症的组合物和方法。该方法包括施用PD‑1轴结合拮抗剂和靶向CEA和CD3的双特异性抗体。

Description

使用PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体治疗CEA 阳性癌症的方法
发明领域
本发明涉及通过施用PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体来治疗CEA阳性癌症的方法。
发明背景
癌症是全世界首要死因之一。尽管有治疗选项的进步，具有晚期癌症的患者的预后仍然较差。因此，对在不引起不可接受的毒性的情况下延长癌症患者的存活的最佳疗法存在持久且迫切的医学需要。
最近来自临床试验的结果已经显示免疫疗法，特别是免疫检查点抑制剂能延长癌症患者的总体存活及引起持久的响应。尽管有这些有希望的结果，当前基于免疫的疗法仅仅在一部分患者中有效，而且需要组合策略来改善治疗益处。
编程性死亡配体1(PD-L1)是在免疫和肿瘤细胞的表面上找到的，而且它的表达受到干扰素伽马(IFNγ)诱导。通过与活化的T细胞上的抑制性编程性死亡-1(PD-1)和B7.1受体相互作用，产生T细胞抑制性信号，它阻止免疫系统破坏癌细胞。
因此，靶向PD-1和经由与PD-1的相互作用发信号的其它分子，诸如编程性死亡配体1(PD-L1)和编程性死亡配体2(PD-L2)的治疗剂是一个强烈感兴趣的领域。PD-L1在许多癌症中过表达，而且常常与不良预后有关 (Okazaki T et al.,Intern.Immun.2007,19(7):813)(Thompson RH et al.,Cancer Res 2006,66(7):3381)。有趣的是，与正常组织中的T淋巴细胞和外周血T淋巴细胞形成对比，大多数肿瘤浸润性T淋巴细胞主要表达PD-1，这指示肿瘤反应性T细胞上PD-1的上调能促成受损的抗肿瘤免疫应答(Blood 2009, 114(8):1537)。这可以是由于利用由与PD-1表达性T细胞相互作用的PD-L1表达性肿瘤细胞介导的PD-L1信号传导以导致削弱T细胞活化及逃避免疫监视 (Sharpe et al.,Nat Rev 2002)(Keir ME et al.,2008Annu.Rev.Immunol. 26:677)。因此，抑制PD-L1/PD-1相互作用可增强CD8+ T细胞介导的肿瘤杀伤。
已经提出抑制PD-L1信号传导作为一种增强T细胞免疫以治疗癌症(例如肿瘤免疫)和感染(包括急性和慢性(例如持久的)感染二者)的手段。一种最佳的治疗性处理可组合PD-1受体/配体相互作用的阻断与活化T细胞，特别是CD8+ T细胞的药剂。
已经报告PD-1和PD-L1的双重阻断在体外模型中改善由CEA BiTE引导的对肿瘤的T细胞杀伤(Osada et al.,Cancer Immunol Immunother(2015)64(6): 677-88)。
仍然需要用于在患者中治疗各种癌症，稳定各种癌症，预防各种癌症，和/或延迟各种癌症发生的最佳疗法。
通过援引将本文中引用的所有参考文献(包括专利申请，专利公开文本，和UniProtKB/Swiss-Prot登录号)完整收入本文，就像明确且单独指出通过援引来收录每一篇个别参考文献。
发明概述
一方面，本文中提供的是一种用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用有效量的人PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗 CD3双特异性抗体。
另一方面，本文中提供的是一种在具有癌症的个体中增强免疫功能的方法，其包括施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体。
另一方面，本文中提供的是人PD-1轴结合拮抗剂在制造用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的药物中的用途，其中该药物包含该人PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂，且其中该治疗包括与包含抗CEA/抗 CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物。
另一方面，本文中提供的是抗CEA/抗CD3双特异性抗体在制造用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的药物中的用途，其中该药物包含该抗 CEA/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂，且其中该治疗包括与包含人PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物。
另一方面，本文中提供的是包含人PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物，其用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展，其中该治疗包括与第二组合物组合施用所述组合物，其中该第二组合物包含抗CEA/ 抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂。
另一方面，本文中提供的是包含抗CEA/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的组合物，其用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展，其中该治疗包括与第二组合物组合施用所述组合物，其中该第二组合物包含人PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂。
另一方面，本文中提供的是一种试剂盒，其包含包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的药物和包含说明书的包装插页，该说明书关于与包含抗CEA/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物，用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展。
另一方面，本文中提供的是一种试剂盒，其包含包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的第一药物和包含抗CEA/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的第二药物。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含包含说明书的包装插页，该说明书关于施用该第一药物和该第二药物，用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展。
另一方面，本文中提供的是一种试剂盒，其包含包含抗CEA/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的药物和包含说明书的包装插页，该说明书关于与包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物，用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展。
在上文和本文中描述的方法，用途，组合物，和试剂盒的一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂选自由PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和 PD-L2结合拮抗剂组成的组。在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，该抗体是人源化抗体，嵌合抗体或人抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中，该抗原结合片段选自由Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv组成的组。
在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。在一些实施方案中，该PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对其配体结合配偶的结合。在一些实施方案中，该PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对PD-L1的结合。在一些实施方案中，该PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对PD-L2的结合。在一些实施方案中，该PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对PD-L1和PD-L2二者的结合。在一些实施方案中，该PD-1结合拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，该PD-1结合拮抗剂选自由MDX1106(nivolumab)，MK-3475(pembrolizumab)，CT-011 (pidilizumab)，MEDI-0680(AMP-514)，PDR001，REGN2810，和BGB-108 组成的组。
在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。在一些实施方案中，该PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对PD-1的结合。在一些实施方案中，该PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对B7-1的结合。在一些实施方案中，该PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对PD-1和B7-1二者的结合。在一些实施方案中，该PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，该 PD-L1结合拮抗剂选自由MPDL3280A(atezolizumab)，YW243.55.S70， MDX-1105，MEDI4736(durvalumab)，和MSB0010718C(avelumab)组成的组。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体是MPDL3280A(atezolizumab)。在一些实施方案中，以约800mg至约1500mg每三周(例如约1000mg至约1300 mg每三周，例如约1100mg至约1200mg每三周)的剂量施用MPDL3280A。在一些实施方案中，以约1200mg每三周的剂量施用MPDL3280A。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体包含重链和/或轻链，该重链包含SEQ ID NO:19的HVR-H1序列，SEQ ID NO:20的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:21的 HVR-H3序列，该轻链包含SEQ ID NO:22的HVR-L1序列，SEQ IDNO:23的 HVR-L2序列，和SEQ ID NO:24的HVR-L3序列。在一些实施方案中，该抗 PD-L1抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:4 的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体包含WO 2010/077634 和美国专利No.8,217,149(其通过援引收入本文)中描述的抗体 YW243.55.S70的三种重链HVR序列和/或抗体YW24355.S70的三种轻链HVR 序列。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体包含抗体YW243.55.S70的重链可变区序列和/或抗体YW24355.S70的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂是PD-L2结合拮抗剂。在一些实施方案中，该PD-L2结合拮抗剂是抗体。在一些实施方案中，该PD-L2 结合拮抗剂是免疫粘附素。
在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂是抗体(例如抗PD-1抗体，抗 PD-L1抗体，或抗PD-L2抗体)且包含无糖基化位点突变。在一些实施方案中，该无糖基化位点突变是替代突变。在一些实施方案中，该替代突变在氨基酸残基N297，L234，L235，和/或D265(EU编号方式)处。在一些实施方案中，该替代突变选自由N297G，N297A，L234A，L235A，和D265A组成的组。在一些实施方案中，该替代突变是D265A突变和N297G突变。在一些实施方案中，该无糖基化位点突变降低抗体的效应器功能。在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体，抗PD-L1抗体，或抗 PD-L2抗体)是具有依照EU编号方式的第297位处的Asn至Ala替代的人 IgG1。
在上文和本文中描述的方法，用途，组合物，和试剂盒的一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合域和结合CEA的第二抗原结合域。在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体进一步包含结合CEA的第三抗原结合域。在一些实施方案中，该第一抗原结合域结合人CD3多肽。在一些实施方案中，该CD3多肽是人CD3ε多肽或人CD3γ多肽。在一些实施方案中，该CD3多肽是人CD3ε多肽。在一些实施方案中，该第一抗原结合域结合天然T细胞受体(TCR)复合物中与其它 TCR亚基联合的人CD3ε多肽或人CD3γ多肽。在一些实施方案中，该第一抗原结合域包含重链可变区(VHCD3)和轻链可变区(VLCD3)，且该第二(和第三，如果存在的话)抗原结合域包含重链可变区(VHCEA)和轻链可变区 (VLCEA)。在一些实施方案中，该第一抗原结合域包含重链可变区(VHCD3) 和/或轻链可变区(VLCD3)，该重链可变区(VHCD3)包含SEQ ID NO:44的 HVR-H1序列，SEQ ID NO:45的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:46的HVR-H3 序列，该轻链可变区(VLCD3)包含SEQ ID NO:47的HVR-L1序列，SEQ ID NO:48的HVR-L2序列，和SEQ ID NO:49的HVR-L3序列。在一些实施方案中，该第一抗原结合域包含重链可变区(VHCD3)和/或轻链可变区(VLCD3)，该重链可变区(VHCD3)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，该轻链可变区 (VLCD3)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，该第二(和第三，如果存在的话)抗原结合域包含重链可变区(VHCEA)和/或轻链可变区 (VLCEA)，该重链可变区(VHCEA)包含SEQ ID NO:38的HVR-H1序列，SEQ ID NO:39的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:40的HVR-H3序列，该轻链可变区 (VLCEA)包含SEQ ID NO:41的HVR-L1序列，SEQ ID NO:42的HVR-L2序列，和SEQ ID NO:43的HVR-L3序列。在一些实施方案中，该第二(和第三，如果存在的话)抗原结合域包含重链可变区(VHCEA)和/或轻链可变区 (VLCEA)，该重链可变区(VHCEA)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，该轻链可变区(VLCEA)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合域和结合CEA的第二和任选的第三抗原结合域，其中该抗原结合域是Fab分子。在特定的此类实施方案中，该双特异性抗体包含结合CD3 的第一抗原结合域和结合CEA的第二和任选的第三抗原结合域，其中该第一抗原结合域是交换Fab分子，其中Fab重和轻链的可变域或恒定域是交换的(即彼此替换)且该第二(和第三，如果存在的话)抗原结合域是常规Fab分子。在一个实施方案中，该第一抗原结合域是交换Fab分子，其中Fab重和轻链的恒定域是交换的。在一个实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含不超过一个结合CD3的抗原结合域。在一个实施方案中，该第一和该第二抗原结合域彼此融合，任选经由肽接头。在一些实施方案中，该抗 CEA/抗CD3双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合域和结合CEA的第二和任选的第三抗原结合域，其中该抗原结合域是Fab分子且(i)该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，或(ii)该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合域的Fab重链的N 端。在一个特定的实施方案中，该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端。
在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。在一些实施方案中，该抗CEA/抗 CD3双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合域和结合CEA的第二和任选的第三抗原结合域，其中该抗原结合域是Fab分子且(i)该第二抗原结合域在 Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，且该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端，或(ii)该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合域的Fab重链的N端，且该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N 端。在一个特定的实施方案中，该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，且该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端。
在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合域和结合CEA的第二和第三抗原结合域，其中该抗原结合域是 Fab分子且(i)该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的 Fab重链的N端，该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，且该第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端，或(ii)该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合域的Fab重链的N端，该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，且该第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。在一个特定的实施方案中，该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，该第一抗原结合域在Fab重链的 C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，且该第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。
在一个实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含 (i)结合CD3的第一抗原结合域，其包含重链可变区(VHCD3)和轻链可变区 (VLCD3)，该重链可变区(VHCD3)包含SEQ IDNO:44的HVR-H1序列，SEQ ID NO:45的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:46的HVR-H3序列，该轻链可变区 (VLCD3)包含SEQ ID NO:47的HVR-L1序列，SEQ ID NO:48的HVR-L2序列，和SEQ IDNO:49的HVR-L3序列，其中该第一抗原结合模块是交换Fab 分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定区，特别是恒定区任一是交换的；
(ii)结合CEA的第二和第三抗原结合域，其包含重链可变区(VHCEA)和轻链可变区(VLCEA)，该重链可变区(VHCEA)包含SEQ ID NO:38的HVR-H1序列，SEQ ID NO:39的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:40的HVR-H3序列，该轻链可变区(VLCEA)包含SEQ ID NO:41的HVR-L1序列，SEQ ID NO:42的 HVR-L2序列，和SEQ ID NO:43的HVR-L3序列，其中该第二和第三抗原结合模块每一个是Fab分子，特别是常规Fab分子；
(iii)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，
其中该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，且该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N 端，且其中该第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的 N端。
在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体中包含的Fc域是 IgG，具体是IgG1或IgG4Fc域。在一些实施方案中，该Fc域是人Fc域。在一个实施方案中，该Fc域是人IgG1Fc域。
在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体中包含的Fc域包含促进Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰。在一些此类实施方案中，在该Fc域的第一亚基的CH3域中一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成隆起，该隆起可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中，且在该Fc域的第二亚基的CH3域中一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成空腔，该空腔内可安置第一亚基的CH3域内的隆起。
在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体中包含的Fc域展现与天然IgG1Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一些实施方案中，该Fc受体是Fcγ受体和/或该效应器功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些此类实施方案中，该Fc域包含降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的一处或多处氨基酸替代。在一个实施方案中，所述一处或多处氨基酸替代在选自L234，L235，和P329(EU编号方式) 的组的一个或多个位置处。在一个实施方案中，该Fc域的每个亚基包含三处降低对激活性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代是L234A，L235A和P329G(EU编号方式)。
在一个实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含包含与SEQ ID NO: 52的序列至少80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%同一的序列的多肽，包含与SEQ ID NO: 53的序列至少80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%同一的序列的多肽，包含与SEQ ID NO: 54的序列至少80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%同一的序列的多肽，和包含与SEQ IDNO: 55的序列至少80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%同一的序列的多肽。在一个实施方案中，该双特异性抗体包含包含SEQ ID NO: 52的序列的多肽，包含SEQ ID NO: 53的序列的多肽，包含SEQ ID NO: 54的序列的多肽，和包含SEQ ID NO: 55的序列的多肽(CEATCB)。
在特定的实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体是CEA TCB。在一些实施方案中，以约5mg至约400mg每周(例如约10mg至约60mg每周，例如约10mg至约40mg每周，例如约80mg至约200mg每周，例如约80mg 至约400mg每周，或例如约160mg至400mg每周)的剂量施用CEA TCB。在一些实施方案中，以约5mg，约10mg，约20mg，约40mg，约80mg，约 160mg，特别是至少约80mg每周的剂量施用CEA TCB。
在上文和本文中描述的方法，用途，组合物，和试剂盒的一些实施方案中，该癌症是CEA阳性癌症。在一些实施方案中，该癌症是结肠癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，乳腺癌，肾癌，食管癌，前列腺癌，或本文中描述的其它癌症。在一些实施方案中，该个体具有癌症或已经诊断有癌症。在一些实施方案中，该个体具有局部晚期或转移性癌症或已经诊断有局部晚期或转移性癌症。在一些实施方案中，该个体中的癌细胞表达PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1的表达可以通过免疫组织化学(IHC)测定法来测定。
在上文和本文中描述的方法，用途，组合物，和试剂盒的一些实施方案中，该人PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的治疗或施用可以在该个体中导致响应。在一些实施方案中，该响应是完全响应。在一些实施方案中，该响应是该治疗停止后的持久响应。在一些实施方案中，该响应是该治疗停止后持久的完全响应。在其它实施方案中，该响应是部分响应。在一些实施方案中，该响应是该治疗停止后持久的部分响应。
在上文和本文中描述的方法，用途，组合物，和试剂盒的一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体在该PD-1轴结合拮抗剂之前，与该 PD-1轴结合拮抗剂同时，或在该PD-1轴结合拮抗剂之后施用。在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体在该PD-1轴结合拮抗剂之后，特别是当它们二者在同一天施用时在该PD-1轴结合拮抗剂之后至少1小时施用。在一些实施方案中，该人PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的治疗或施用包含包含如下的治疗周期的剂量给药方案，其中对该个体在每个周期的第1天以约1200mg的剂量施用人PD-1轴结合拮抗剂，并在每个周期的第1，8，和15天以约5mg，约10mg，约20mg，约40mg，约80 mg，约160mg，特别是至少约80mg的剂量施用抗CEA/抗CD3抗体，每21天重复每个周期。在一些实施方案中，重复该周期直至有临床益处的损失和/ 或不可接受的毒性。在一些实施方案中，重复只施用该PD-1轴结合拮抗剂或只施用该抗CEA/抗CD3抗体的周期。
在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗CD3双特异性抗体在同一组合物中。在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂和该抗 CEA/抗CD3双特异性抗体在分开的组合物中。
在上文和本文中描述的方法，用途，组合物，和试剂盒的一些实施方案中，静脉内，肌肉内，皮下，表面，口服，经皮，腹膜内，眼窝内，通过植入，通过吸入，鞘内，室内，或鼻内施用该PD-1轴结合拮抗剂和/或该抗CEA/抗CD3双特异性抗体。在一些实施方案中，静脉内施用该PD-1轴结合拮抗剂和/或该抗CEA/抗CD3双特异性抗体。在上文和本文中描述的方法，用途，组合物，和试剂盒的一些实施方案中，该治疗进一步包括施用化疗剂，用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展。在一些实施方案中，该个体在该PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的组合治疗之前已经用化疗剂治疗。在一些实施方案中，用该PD-1轴结合拮抗剂和/或该抗 CEA/抗CD3双特异性抗体的组合治疗的个体对化疗剂治疗不应。在一些实施方案中，用该PD-1轴结合拮抗剂和/或该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的组合治疗的个体对化疗剂治疗不耐受。贯穿本申请描述的方法，用途，组合物，和试剂盒的一些实施方案进一步包括施用化疗剂，用于治疗癌症或延迟癌症进展。
在上文和本文中描述的方法，用途，组合物和试剂盒的一些实施方案中，该个体中的CD8 T细胞具有相对于施用该组合之前增强的引发，活化，增殖和/或溶胞活性。在一些实施方案中，CD8 T细胞的数目相对于施用该 PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗CD3抗体之前升高。在一些实施方案中，该CD8 T细胞是抗原特异性CD8 T细胞。在一些实施方案中，Treg功能相对于施用该PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗CD3抗体之前受到遏制。在一些实施方案中，T细胞耗竭相对于施用该PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗 CD3抗体之前降低。
要理解的是，可以组合本文中描述的各个实施方案的一个，一些，或所有特性以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对本领域技术人员会变得显而易见。通过下面的详述进一步描述本发明的这些和其它实施方案。
附图简述
图1。CEA TCB介导的MKN45细胞的裂解。肿瘤细胞与人PBMC(E:T 10:1)温育后(A)24小时和(B)48小时评估的CEA TCB介导的MKN-45肿瘤细胞的裂解的代表性图。肿瘤细胞杀伤的EC50值是：615pM(24小时)，362 pM(48小时)。通过量化释放入细胞上清液中的LDH来评估靶细胞杀伤。
图2。CEA TCB介导的T细胞上的PD-1和肿瘤细胞裂解后存活的肿瘤细胞上的PD-L1的上调。MKN-45肿瘤细胞与人PBMC(E:T 10:1)温育后48小时分析的CEA TCB介导的CD8+ T细胞(A)，CD4+ T细胞(B)上的PD-1受体表达和抵抗杀伤的肿瘤细胞上的PD-L1配体表达(C)的上调的代表性图。通过流式细胞术来分析PD-1和PD-L1表达。
图3。用CEA TCB处理后的肿瘤生长(共移植，E:T 5:1)。平均肿瘤负担和均值的标准误差(SEM，n＝12)；通过生物发光(总通量)测量肿瘤负担。以 0.5和2.5mg/kg的剂量IV施用CEA TCB，肿瘤/PBMC共移植和SC注射后1天 (早期治疗，小图A)或7天(晚期治疗，小图B)开始。对照组分别接受磷酸盐缓冲盐水(PBS，媒介)，MCSP TCB，或DP47TCB(作为非靶向对照)。在所有研究中，一周两次(2q7d)施用TCB。箭指示疗法开始的日子。使用非线性回归分析来比较曲线。(A)共移植人PBMC后1天开始疗法。曲线比较：媒介对非靶向TCB p值＝0.65，媒介对CEA TCB(0.5mg/kg)p值<0.0001，媒介对 CEA TCB(2.5mg/kg)p值<0.0001，CEA TCB(2.5mg/kg)对CEA TCB(0.5 mg/kg)p值＝0.91。(B)共移植人PBMC后7天开始疗法。曲线比较：媒介对非靶向TCB p值＝0.65，媒介对CEA TCB(0.5mg/kg)p值<0.0001，媒介对CEA TCB(2.5mg/kg)p值<0.0001，CEA TCB(2.5mg/kg)对CEA TCB(0.5mg/kg) p值＝0.0008。
图4。用CEA TCB处理后肿瘤的组织学分析(共移植，E:T 5:1)。 LS174T-fluc2细胞与hPBMC(E:T 5:1)的共移植实验中结束时收集的媒介(小图A-C)和CEA TCB(小图D-F)处理的肿瘤(2.5mg/kg，疗法在第7天给予)的苏木精和曙红(H&E，小图A和D)和抗PD-L1(小图B，C，E和F)染色，显示 CEA TCB处理后肿瘤内PD-L1表达的强诱导。小图B和E分别对应于小图A和D的标记区域。小图C和F分别对应于小图B和E的标记区域。
图5。用CEA TCB处理后的肿瘤重量。在NOG小鼠中SC注射 LS174T-fluc2细胞并生长直至实现100mm3的体积，接着IP转移人PBMC(10 x 106个细胞)。PBMC转移后3天，小鼠接受两周一次IV注射CEA TCB(2.5 mg/kg)，PBS(媒介)，或MCSP TCB(非靶向对照，2.5mg/kg)。在研究结束时通过对外植的肿瘤称重来测定肿瘤块。图显示平均肿瘤重量和均值的标准误差(SEM，3≤n≤6只小鼠)。**p＜0.005，使用非配对，双尾t检验。
图6。用CEA TCB处理后肿瘤浸润性白细胞的流式细胞术分析。IP转移人效应细胞的人结肠癌异种移植物模型中结束时收集的肿瘤组织的流式细胞术分析。条形图显示所有处理组中通过流式细胞术评估的肿瘤内人 CD45+/CD3+ T细胞的数目。*p＜0.05，使用非配对，双尾t检验。
图7。用CEA TCB处理后的免疫PD分析(IP转移人PBMC)。人结肠癌异种移植物模型(IP转移人效应细胞)中肿瘤细胞接种后第18天(对应于第三次 CEA TCB施用后3天)收集的血液(A-F)和肿瘤组织(G-L)的流式细胞术分析。点图显示两个隔室中CD3T细胞上CD69(B，E，H，K)和PD-1(C，F，I，L) 的表达。显示了每个组的代表性小鼠。A-C，G-I：媒介。D-F，J-L：CEA TCB。
图8。完全人源化小鼠中CEA TCB诱导的肿瘤生长抑制。人源化小鼠中 MKN45的肿瘤生长抑制。显示了研究结束时(肿瘤细胞注射后第32天时)的肿瘤体积。每个点代表一个动物个体。IV注射CEA TCB(2.5mg/kg，一周两次)，并通过测径器测量肿瘤生长。*p＜0.05(非配对t检验)。
图9。CEA TCB所致肿瘤内人T细胞频率和T细胞活化的升高。研究结束时(第32天)收集的肿瘤样品的流式细胞术分析。针对人抗原(huCD45， huCD3，huPD-1，huCD69，huKi-67，和huGZB)染色细胞。(A，B)肿瘤组织中的总人T细胞频率(A)和CD8+对CD4+ T细胞比(B)。(C，D)作为人CD8+ (C)或CD4+(D)T细胞的百分比显示肿瘤中活化标志物的表达。每个点代表一个动物个体。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001(非配对t 检验)。
图10。研究结束时肿瘤组织的组织学分析。媒介(小图A-C)和CEA TCB (小图D-F)处理的肿瘤的苏木精和曙红(H&E，小图A和D)和抗PD-L1(小图 B，C，E和F)染色(MabSP142)，展现CEA TCB处理后肿瘤内PD-L1表达的强诱导。所有切片用苏木精复染色(蓝色核)。小图B和E分别对应于小图A和 D的标记区域。小图C和F分别对应于小图B和E的标记区域。
图11。在完全人源化小鼠中的MKN45肿瘤模型中组合CEA TCB与抗人 PD-L1阻断性抗体后的体内抗肿瘤活性。(A)平均肿瘤负担和均值的标准误差(SEM)。一周三次通过数字测径器测量肿瘤负担。箭指示疗法开始的日子。在第60天：n＝7(媒介)，n＝8(CEA TCB)；n＝4(a-PD-L1)；n＝5(CEA TCB与抗PD-L1的组合)。(B)时间对事件统计分析。事件定义为达到500 mm3肿瘤体积。使用成对时序检验来比较下面的处理组，因为它能将不同漏失纳入考虑：媒介对CEA TCB：p＝0.005；CEA TCB对抗PD-L1： p＝0.001；CEA TCB对CEA TCB与抗PD-L1的组合：p＝0.03。
图12。完全人源化NOG小鼠中的MKN45模型中CEA TCB的抗肿瘤活性。对于一线治疗，对小鼠施用作为对照的媒介或CEA TCB(2.5mg/kg，一周两次，施用4周，总共7次施用)任一。在研究第34天时，将CEA TCB处理组中的小鼠随机化入两个亚组中：一个继续施用CEATCB(2.5mg/kg，一周两次)而另一个施用CEA TCB(2.5mg/kg，一周两次)与抗小鼠PD-L1抗体(10 mg/kg，一周一次施用)的组合达5周(总共11次施用CEA TCB和总共6次施用抗PD-L1)。***p<0.0002，双向ANOVA。
图13。完全免疫胜任huCEA Tg小鼠中的MC38-huCEA模型中CEA TCB 的抗肿瘤活性。(A)对于一线治疗，对小鼠施用作为对照的媒介，CEA TCB (2.5mg/kg，一周两次，施用4周，总共7次施用)，抗小鼠PD-L1抗体(10 mg/kg，一周一次，施用4周，总共4次施用)，和CEATCB和抗小鼠PD-L1的组合(以单一治疗剂组中使用的相应剂量和进度表伴随施用)任一。处理施用 4周。(B)手术取出皮下肿瘤，并在5周后用新鲜MC38-huCEA肿瘤细胞再攻击小鼠，在相对体侧皮下注射。作为对照，对或是留置不操作或是提交体侧手术切口的多组未实验
Figure BDA0001686871200000131
huCEA Tg小鼠在相对体侧皮下注射 MC38-huCEA。
发明详述
本申请的发明人证明，CEA T细胞双特异性抗体和抗PD-L1免疫疗法在它们的抗癌特性中协同作用且它们的组合能在具有癌症的患者中提供有意义的临床益处。本申请中的数据显示，CEA T细胞双特异性抗体(CEA TCB) 与抗PD-L1免疫疗法的组合导致增强的肿瘤生长抑制。
一方面，本文中提供的是用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，组合物和用途，其包括施用有效量的人PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗 CD3双特异性抗体。
另一方面，本文中提供的是用于在具有癌症的个体中增强免疫功能的方法，组合物和用途，其包括施用有效量的人PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/ 抗CD3双特异性抗体。
I.定义
在详细描述本发明之前，要理解的是，本发明不限于特定的组合物或生物学系统，它们当然可以有所变化。还要理解的是，本文中使用的术语仅仅出于描述特定实施方案的目的，并非意图是限制性的。
如本文中使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数所指物，除非内容另外清楚指明。如此，例如，提及“一个/种分子”任选包括两个/种或更多个/种此类分子的组合，诸如此类。
如本文中使用的，术语“第一”，“第二”，“第三”等就抗原结合域等而言用于在有超过一个每类域时方便区分。除非明确如此陈述，这些术语的使用并非意图赋予具体的次序或取向。
如本文中使用的，术语“约”指本技术领域的技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。本文中提到“约”数值或参数包括(且描述)涉及该数值或参数本身的实施方案。
理解的是，本文中描述的发明的各个方面和实施方案包括“包含”，“由……组成”，和“基本上由……组成”的方面和实施方案。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”指如下的分子，其抑制PD-1轴结合配偶与一种或多种它的结合配偶相互作用，从而去除源自PD-1信号传导轴上的信号传导的T细胞功能障碍–一项结果是恢复或增强T细胞功能(例如增殖，细胞因子生成，靶细胞杀伤)。如本文中使用的，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1 结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。“人”PD-1轴结合拮抗剂指对人PD-1信号传导轴具有上述效果的PD-1轴结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”指如下的分子，其降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-L1，PD-L2)相互作用的信号转导。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1对一种或多种它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面，PD-1结合拮抗剂抑制 PD-1对PD-L1和/或PD-L2的结合。例如，PD-1结合拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用的信号转导的抗PD-1抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-1介导信号传导)，从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。在一个具体的方面， PD-1结合拮抗剂是本文所述MDX-1106(nivolumab)。在另一个具体的方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述MK-3475(pembrolizumab)。在另一个具体的方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述CT-011(pidilizumab)。在另一个具体的方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述MEDI-0680(AMP-514)。在另一个具体的方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述PDR001。在另一个具体的方面，PD-1 结合拮抗剂是本文所述REGN2810。在另一个具体的方面，PD-1结合拮抗剂是本文所述BGB-108。
术语“PD-L1结合拮抗剂”指如下的分子，其降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1，B7-1)相互作用的信号转导。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1对它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对 PD-1和/或B7-1的结合。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L1与一种或多种它的结合配偶(诸如 PD-1，B7-1)相互作用的信号转导的抗PD-L1抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号 (经由PD-L1介导信号传导)，从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性 (例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一个具体的方面，抗PD-L1抗体是本文所述 YW243.55.S70。在另一个具体的方面，抗PD-L1抗体是本文所述 MDX-1105。在仍有另一个具体的方面，抗PD-L1抗体是本文所述 MPDL3280A(atezolizumab)。在仍有另一个具体的方面，抗PD-L1抗体是本文所述MDX-1105。在仍有另一个具体的方面，抗PD-L1抗体是本文所述 YW243.55.S70。在仍有另一个具体的方面，抗PD-L1抗体是本文所述 MEDI4736(durvalumab)。在仍有另一个具体的方面，抗PD-L1抗体是本文所述MSB0010718C(avelumab)。
术语“PD-L2结合拮抗剂”指如下的分子，其降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L2与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1)相互作用的信号转导。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2对一种或多种它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2 对PD-1的结合。在一些实施方案中，PD-L2拮抗剂包括降低，阻断，抑制，消除或干扰源自PD-L2与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1)相互作用的信号转导的抗PD-L2抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-L2介导信号传导)，从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
术语“功能障碍”在免疫功能障碍的背景中指降低的对抗原性刺激的免疫响应性的状态。该术语包括可以发生抗原识别，但是随后的免疫应答对于控制感染或肿瘤生长无效的耗竭和/或无反应性二者的共同要件。
如本文中使用的，术语“功能障碍性”还包括对抗原识别的不感受或不响应，具体地，将抗原识别转化成下游T细胞效应器功能，诸如增殖，细胞因子生成(例如IL-2)和/或靶细胞杀伤的能力受损。
术语“无反应性”指源自经由T细胞受体投递的不完全或不充分信号(例如ras激活缺失下细胞内Ca+2的升高)的对抗原刺激的无响应性状态。T细胞无反应性也可以在共刺激缺失下在用抗原刺激后发生，导致细胞变成即使在共刺激的背景中也对随后抗原所致激活变得不感受。无响应性状态常常可以被白介素-2的存在制服。无反应性T细胞不经历克隆扩充和/或获得效应器功能。
术语“耗竭”指作为源自在许多慢性感染和癌症期间发生的持续TCR信号传导的T细胞功能障碍状态的T细胞耗竭。它与无反应性的区别在于它并非经由不完全或有缺陷的信号传导，而是由于持续信号传导而发生。它以较差的效应器功能，持续的抑制性受体表达和与功能性效应或记忆T细胞的转录状态不同的转录状态限定。耗竭阻止对感染和肿瘤的最佳控制。耗竭可以源自外在负调节途径(例如免疫调节性细胞因子)及细胞内在负调节(共刺激)途径(PD-1，B7-H3，B7-H4，等)二者。
“增强T细胞功能”意味着诱导，引起或刺激T细胞具有持续或放大的生物学功能，或者更新或再激活耗竭的或无活性的T细胞。增强T细胞功能的例子包括：相对于干预前的此类水平，升高的来自CD8+ T细胞的γ-干扰素分泌，升高的增殖，升高的抗原响应性(例如病毒，病原体，或肿瘤清除)。在一个实施方案中，增强的水平是至少50％，或者60％，70％，80％，90％，100％，120％，150％，200％。本领域普通技术人员知道测量此增强的方式。
“T细胞功能障碍性病症”是以降低的对抗原性刺激的响应性为特征的T 细胞病症或状况。在一个特定的实施方案中，T细胞功能障碍性病症是明确与不适当的升高的经由PD-1的信号传导有关的病症。在另一个实施方案中，T细胞功能障碍性病症是如下的病症，其中T细胞是无反应性的或具有降低的分泌细胞因子，增殖，或执行溶胞活性的能力。在一个具体的方面，降低的响应性导致对表达免疫原的病原体或肿瘤的无效控制。以T细胞功能障碍为特征的T细胞功能障碍性病症的例子包括未分辨的急性感染，慢性感染和肿瘤免疫。
“肿瘤免疫”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为一种治疗概念，当此类逃避削弱，而且肿瘤受到免疫系统识别和攻击时，肿瘤免疫得到“治疗”。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。
“免疫原性”指特定物质引发免疫应答的能力。肿瘤是免疫原性的，而且增强肿瘤免疫原性有助于通过免疫应答来清除肿瘤细胞。增强肿瘤免疫原性的例子包括用PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体处理。
“持续应答”指在停止治疗后对降低肿瘤生长的持续影响。例如，与施用阶段开始时的大小相比，肿瘤大小可以保持为相同或更小。在一些实施方案中，持续应答具有与治疗持续时间至少相同的持续时间，治疗持续时间的至少1.5倍，2.0倍，2.5倍，或3.0倍长度。
术语“药物配制剂”指如下的制备物，其处于允许活性组分的生物学活性有效的形式，且不含另外的对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的成分。此类配制剂是无菌的。“药学可接受”赋形剂(媒介，添加剂) 是那些可合理施用于受试者哺乳动物以提供有效剂量的所采用的活性组分的。
如本文中使用的，术语“治疗/处理”指设计用于改变临床病理学过程期间所治疗/处理个体或细胞的自然进程的临床干预。治疗/处理的期望效果包括降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。例如，若一种或多种与癌症有关的症状得到减轻或消除，包括但不限于降低癌性细胞的增殖(或破坏癌性细胞)，减少/减轻源自疾病的症状，提高罹患疾病的那些的生活质量，降低治疗疾病需要的其它药物的剂量，和/或延长个体的存活，则个体得到成功“治疗”。
如本文中使用的，“延迟疾病进展”意味着推迟，阻碍，减缓，延迟，稳定，和/或延缓疾病(诸如癌症)的发生。根据疾病的历史和/或所治疗的个体，此延迟可以是不同时间长度的。如对于本领域技术人员明显的是，充分或显著的延迟实质上可以涵盖预防，因为个体不发生疾病。例如，可以延迟晚期阶段癌症，诸如转移的发生。
“有效量”至少是实现特定病症的可测量改善或预防需要的最小量。本文中的有效量可以随诸如患者的疾病状态，年龄，性别，和重量，及抗体在个体中引发期望的应答的能力等因素而变化。有效量也是治疗有益效果超过治疗的任何有毒或有害效果的量。为了预防性使用，有益或期望的结果包括如下的结果，诸如消除或降低风险，减轻严重性，或延迟疾病发作，包括疾病的生物化学，组织学和/或行为症状，其并发症和疾病发生期间呈现的中间病理学表型。为了治疗性使用，有益或期望的结果包括如下的临床结果，诸如减少/减轻源自疾病的一种或多种症状，提高罹患疾病的那些的生活质量，降低治疗疾病需要的其它药物的剂量，增强另一种药物的效果(诸如经由靶向)，延迟疾病进展，和/或延长存活。在癌症或肿瘤的情况中，有效量的药物在减少癌细胞的数目；降低肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减缓或期望停止)癌细胞浸润入外周器官中；抑制(即在一定程度上减缓且期望停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病症有关的症状中可以具有效果。可以在一次或多次施用中施用有效量。出于本发明的目的，药物，化合物，或药物组合物的有效量是足以直接或间接实现预防性或治疗性处理的量。如在临床背景中理解的，药物，化合物，或药物组合物的有效量可以与或不与另一种药物，化合物，或药物组合物一起实现。如此，可以在施用一种或多种治疗剂的背景中考虑“有效量”，并且若与一种或多种其它药剂一起，可以实现期望的结果或者实现了期望的结果，则可以认为单一药剂是以有效量给予的。
如本文中使用的，“与……联合/组合/一起”指在一种治疗形态以外还施用另一种治疗形态。因而，“与……联合/组合/一起”指在对个体施用一种治疗形态之前，期间，或之后施用另一种治疗形态。
“病症”是会受益于治疗的任何状况，包括但不限于慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物易患所讨论病症的病理状况。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症是癌症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症是肿瘤。
如本文中使用的，“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”，“癌性”，“细胞增殖性病症”，“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理学状况。癌症的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤，和白血病或淋巴样恶性。此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌 (例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃的癌或胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，尿道癌，肝瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌或肾的癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝的癌，肛门癌，阴茎癌，黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤，恶性雀斑样痣黑素瘤，肢端黑素瘤，结节性黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)，小淋巴细胞性(SL)NHL，中级/滤泡性 NHL，中级弥漫性NHL，高级成免疫细胞性NHL，高级成淋巴细胞性 NHL，高级小无核裂细胞性NHL，贮积病(bulkydisease)NHL，套细胞淋巴瘤，AIDS相关淋巴瘤，和瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)，梅格斯(Meigs)氏综合征有关的异常血管增殖，脑，以及头和颈癌，及相关转移。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括乳腺癌，结肠直肠癌，直肠癌，非小细胞肺癌，成胶质细胞瘤，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，肾细胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，软组织肉瘤，卡波西(Kaposi)氏肉瘤，类癌癌(carcinoid carcinoma)，头和颈癌，卵巢癌，间皮瘤，和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自：小细胞肺癌，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，黑素瘤，乳腺癌，胃癌，结肠直肠癌(CRC)，和肝细胞癌。还有，在一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌，结肠直肠癌，成胶质细胞瘤和乳腺癌，包括那些癌症的转移性形式。在一些实施方案中，癌症是CEA阳性癌症。
如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指任何对细胞有害(例如引起细胞死亡，抑制增殖，或以其它方式阻碍细胞功能)的药剂。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212， P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；和毒素，诸如小分子毒素或细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。例示性的细胞毒剂可选自抗微管剂，铂配位复合物，烷化剂，抗生剂，拓扑异构酶II抑制剂，抗代谢物，拓扑异构酶 I抑制剂，激素和激素类似物，信号转导途径抑制剂，非受体酪氨酸激酶血管发生抑制剂，免疫治疗剂，促凋亡剂，LDH-A的抑制剂，脂肪酸生物合成的抑制剂，细胞周期信号传导抑制剂，HDAC抑制剂，蛋白酶体抑制剂，和癌代谢的抑制剂。在一个实施方案中，细胞毒剂是紫杉烷。在一个实施方案中，紫杉烷是帕利他赛(paclitaxel)或多西他赛(docetaxel)。在一个实施方案中，细胞毒剂是铂剂。在一个实施方案中，细胞毒剂是EGFR的拮抗剂。在一个实施方案中，EGFR的拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(例如厄洛替尼(erlotinib))。在一个实施方案中，细胞毒剂是RAF抑制剂。在一个实施方案中，RAF抑制剂是BRAF和/或 CRAF抑制剂。在一个实施方案中，RAF抑制剂是维罗非尼(vemurafenib)。在一个实施方案中，细胞毒剂是PI3K抑制剂。
“化疗剂”包括在治疗癌症中有用的化合物。化疗剂的例子包括厄洛替尼(erlotinib)(
Figure BDA0001686871200000201
Genentech/OSI Pharm.)，硼替佐米(bortezomib) (
Figure BDA0001686871200000202
Millennium Pharm.)，双硫仑(disulfiram)，没食子酸表没食子儿茶精(epigallocatechin gallate)，salinosporamide A，carfilzomib，17-AAG (格尔德霉素(geldanamycin))，根赤壳菌素(radicicol)，乳酸脱氢酶A (LDH-A)，氟维司群(fulvestrant)(
Figure BDA0001686871200000211
AstraZeneca)，舒尼替尼 (sunitib)(
Figure BDA00016868712000002110
Pfizer/Sugen)，来曲唑(letrozole)(
Figure BDA00016868712000002111
Novartis)，甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(
Figure BDA0001686871200000212
Novartis)， finasunate(
Figure BDA0001686871200000213
Novartis)，奥沙利铂(oxaliplatin) (
Figure BDA0001686871200000214
Sanofi)，5-FU(5-氟尿嘧啶)，甲酰四氢叶酸(leucovorin)，雷帕霉素(Rapamycin)(西罗莫司(Sirolimus)，
Figure BDA0001686871200000215
Wyeth)，拉帕替尼(Lapatinib)(
Figure BDA0001686871200000216
GSK572016，Glaxo Smith Kline)，Lonafamib (SCH 66336)，索拉非尼(sorafenib)(
Figure BDA0001686871200000217
Bayer Labs)，吉非替尼(gefitinib)(
Figure BDA0001686871200000218
AstraZeneca)，AG1478，烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和
Figure BDA0001686871200000219
环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkylsulfonates)，诸如白消安(busulfan)，英丙舒凡 (improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派 (benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedopa)，和乌瑞替派 (uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撑磷酰胺 (triethylenephosphoramide)，三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括托泊替康(topotecan)和伊立替康(irinotecan))；苔藓抑素(bryostatin)； callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1 和隐藻素8)；肾上腺皮质类固醇类(adrenocorticosteroids)，包括泼尼松(prednisone)和泼尼松龙(prednisolone)；醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate)； 5α-还原酶，包括非那雄胺(finasteride)和度他雄胺(dutasteride)；vorinostat， romidepsin，panobinostat，丙戊酸(valproic acid)，mocetinostat多拉司他汀 (dolastatin)；阿地白介素(aldesleukin)，滑石(talc)duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin； sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlomaphazine)，胆磷酰胺 (chlorophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)，美法仑(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥胆甾醇 (phenesterine)，泼尼莫司汀(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ω1I(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.1994,33:183-186)；蒽环类抗生素 (dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomysins)，放线菌素(actinomycin)，氨茴霉素(authramycin)，偶氮丝氨酸(azaserine)，博来霉素(bleomycin)，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素 (caminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，放线菌素D(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸，
Figure BDA0001686871200000221
(多柔比星(doxorubicin))，吗啉代多柔比星，氰基吗啉代多柔比星，2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，麻西罗霉素 (marcellomycin)，丝裂霉素(mitomycin)诸如丝裂霉素C，霉酚酸(mycophenolic acid)，诺拉霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，泊非霉素(porfiromycin)，嘌呤霉素(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)，链佐星(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤(methotrexate) 和5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸 (denopterin)，甲氨蝶呤，蝶酰三谷氨酸(pteropterin)，三甲曲沙 (trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤 (mercaptopurine)，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟 (carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦 (trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯 (aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸 (aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)； bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamnol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星 (pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0001686871200000231
多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类 (trichothecenes)(尤其是T-2毒素，疣孢菌素(verracurin)A，杆孢菌素(roridin) A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷 (arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如泰素(TAXOL)(帕利他塞(paclitaxel)；Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)，
Figure BDA0001686871200000232
(无克列莫佛(Cremophor) 的)，帕利他塞的清蛋白改造的纳米颗粒剂型(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和泰索帝
Figure BDA0001686871200000233
(多西他塞(docetaxel， doxetaxel)；Sanofi-Aventis)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；
Figure BDA0001686871200000234
(吉西他滨(gemcitabine))；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；
Figure BDA0001686871200000241
(长春瑞滨(vinorelbine))；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷 (teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤 (aminopterin)；卡培他滨(capecitabine)
Figure BDA0001686871200000242
伊本膦酸盐 (ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸 (DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；及上述任一的药学可接受盐，酸和衍生物。
化疗剂还包括(i)起调节或抑制激素对肿瘤作用的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬 (tamoxifen)(包括
Figure BDA0001686871200000243
柠檬酸他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，iodoxyfene，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬 (trioxifene)，那洛昔芬(keoxifene)，LY117018，奥那司酮(onapristone)，和
Figure BDA0001686871200000244
(柠檬酸托瑞米芬(toremifine citrate))；(ii)抑制在肾上腺中调节雌激素生成的酶芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑，氨鲁米特 (aminoglutethimide)，
Figure BDA0001686871200000245
(醋酸甲地孕酮(megestrol acetate))，
Figure BDA0001686871200000246
(依西美坦(exemestane)；Pfizer)，福美坦(formestanie)，法倔唑(fadrozole)，
Figure BDA0001686871200000247
(伏罗唑(vorozole))，
Figure BDA0001686871200000248
(来曲唑 (letrozole)；Novartis)，和
Figure BDA0001686871200000249
(阿那曲唑(anastrozole)； AstraZeneca)；(iii)抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)，尼鲁米特 (nilutamide)，比卡米特(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林 (goserelin)；布舍瑞林(buserelin)，曲普瑞林(tripterelin)，醋酸甲羟孕酮 (medroxyprogesterone acetate)，己烯雌酚(diethylstilbestrol)，倍美力 (premarin)，氟甲睾酮(fluoxymesterone)，全反式视黄酸，芬维A胺 (fenretinide)，以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白质激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的那些，诸如例如 PKC-α，Ralf和H-Ras；(vii)核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如
Figure BDA00016868712000002410
)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如
Figure BDA00016868712000002411
和
Figure BDA00016868712000002412
Figure BDA00016868712000002413
rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，诸如
Figure BDA00016868712000002414
Figure BDA00016868712000002415
rmRH；和(ix)及上述任一的药学可接受盐，酸和衍生物。
化疗剂还包括抗体，诸如阿仑珠单抗(alemtuzumab)(Campath)，贝伐珠单抗(bevacizumab)(
Figure BDA0001686871200000257
Genentech)；西妥昔单抗(cetuximab) (
Figure BDA0001686871200000251
mclone)；帕尼单抗(panitumumab)(
Figure BDA0001686871200000252
Amgen)，利妥昔单抗(rituximab)(
Figure BDA0001686871200000253
Genentech/Biogen Idec)，帕妥珠单抗 (pertuzumab)(
Figure BDA0001686871200000254
2C4，Genentech)，曲妥珠单抗(trastuzumab) (
Figure BDA0001686871200000255
Genentech)，托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar， Corixia)，和抗体药物缀合物，吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin) (
Figure BDA0001686871200000256
Wyeth)。具有作为与本发明化合物组合的药剂的治疗潜力的另外的人源化单克隆抗体包括：阿泊珠单抗(apolizumab)，阿塞珠单抗(aselizumab)，atlizumab，巴匹珠单抗(bapineuzumab)，bivatuzumab mertansine，莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)，西利珠单抗 (cedelizumab)，培舍珠单抗(certolizumab pegol)，cidfusituzumab， cidtuzumab，达克珠单抗(daclizumab)，依库珠单抗(eculizumab)，依法珠单抗(efalizumab)，依帕珠单抗(epratuzumab)，厄利珠单抗(erlizumab)，非维珠单抗(felvizumab)，芳妥珠单抗(fontolizumab)，吉妥珠单抗奥佐米星 (gemtuzumab ozogamicin)，英妥珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)，伊匹木单抗(ipilimumab)，拉贝珠单抗(labetuzumab)，林妥珠单抗 (lintuzumab)，马妥珠单抗(matuzumab)，美泊利单抗(mepolizumab)，莫维珠单抗(motavizumab)，motovizumab，那他珠单抗(natalizumab)，尼妥珠单抗 (nimotuzumab)，nolovizumab，numavizumab，ocrelizumab，奥马珠单抗 (omalizumab)，帕利珠单抗(palivizumab)，帕考珠单抗(pascolizumab)， pecfusituzumab，pectuzumab，培克珠单抗(pexelizumab)，ralivizumab，雷珠单抗(ranibizumab)，reslivizumab，瑞利珠单抗(reslizumab)，resyvizumab，罗维珠单抗(rovelizumab)，卢利珠单抗(ruplizumab)，西罗珠单抗(sibrotuzumab)，西利珠单抗(siplizumab)，索土珠单抗(sontuzumab)， tacatuzumabtetraxetan，tadocizumab，他利珠单抗(talizumab)，特非珠单抗 (tefibazumab)，托珠单抗(tocilizumab)，托利珠单抗(toralizumab)，tucotuzumab西莫白介素(celmoleukin)，tucusituzumab，umavizumab，乌珠单抗(urtoxazumab)，优特克单抗(ustekinumab)，维西珠单抗(visilizumab)，和抗白介素-12(ABT-874/J695，Wyeth Research and AbbottLaboratories)，其为经遗传修饰以识别白介素-12p40蛋白的重组唯独人序列，全长IgG1λ抗体。
化疗剂还包括“EGFR抑制剂”，其指结合EGFR或以其它方式直接与 EGFR相互作用并阻止或降低其信号传导活性的化合物，而且还称作“EGFR 拮抗剂”。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)，MAb455(ATCC CRL HB 8507)，MAb 225(ATCC CRL 8508)，MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利No.4,943,533，Mendelsohn等人)及其变体，诸如嵌合化225(C225或西妥昔单抗；
Figure BDA0001686871200000261
)和重构人225(H225)(参见WO96/40210，Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，一种完全人的EGFR靶向性抗体(Imclone)；结合 II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利No.5,891,996中描述的；和结合EGFR的人抗体，诸如 ABX-EGF或帕尼单抗(Panitumumab)(参见WO98/50433，Abgenix/Amgen)；EMD 55900(Stragliotto et al.,Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996))；EMD7200(matuzumab)，一种与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合的针对EGFR的人源化EGFR抗体(EMD/Merck)；人EGFR抗体，HuMax-EGFR(GenMab)；称作 E1.1，E2.4，E2.5，E6.2，E6.4，E2.11，E6.3和E7.6.3且在US 6,235,883中描述的完全人抗体；MDX-447(Medarex Inc)；和mAb 806或人源化mAb 806 (Johns et al.,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可与细胞毒剂缀合，如此生成免疫缀合物(参见例如EP 659,439A2，Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子，诸如美国专利No.5,616,582， 5,457,105，5,475,001，5,654,307，5,679,683，6,084,095，6,265,410， 6,455,534，6,521,620，6,596,726，6,713,484，5,770,599，6,140,332， 5,866,572，6,399,602，6,344,459，6,602,863，6,391,874，6,344,455，5,760,041，6,002,008，和5,747,498，以及PCT公开文本WO98/14451， WO98/50038，WO99/09016，和WO99/24037中描述的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774，厄洛替尼(erlotinib)，
Figure BDA0001686871200000263
Genentech/OSI Pharmaceuticals)；PD 183805(CI1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二氢氯化物，Pfizer Inc.)；ZD1839，吉非替尼(gefitinib)
Figure BDA0001686871200000262
4-(3’-氯 -4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3- 氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺， Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth)；AG1478(Pfizer)；AG1571(SU 5271；Pfizer)；双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼(lapatinib) (
Figure BDA0001686871200000271
GSK572016或N-[3-氯4-[(3氟苯基)甲氧基]苯基]-6[5[[[2甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺)。
化疗剂还包括“酪氨酸激酶抑制剂”，包括前一段中提到的EGFR靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如可从Takeda获得的TAK165； CP-724,714，一种口服ErbB2受体酪氨酸激酶选择性抑制剂(Pfizer和OSI)；双重HER抑制剂，诸如优先结合EGFR但抑制HER2和EGFR过表达性细胞二者的EKB-569(可从Wyeth获得)；拉帕替尼(lapatinib)(GSK572016；可从 Glaxo-SmithKline获得)，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂； PKI-166(可从Novartis获得)；泛HER抑制剂，诸如卡奈替尼(canertinib) (CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，诸如可从ISIS Pharmaceutica1s获得的，抑制Raf-1信号传导的反义药剂ISIS-5132；非HER靶向性TK抑制剂，诸如甲磺酸伊马替尼(
Figure BDA0001686871200000272
可从Glaxo SmithKline获得)；多靶向性酪氨酸激酶抑制剂，诸如舒尼替尼(sunitinib)(
Figure BDA0001686871200000273
可从Pfizer获得)； VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，诸如瓦他拉尼(vatalanib) (PTK787/ZK222584，可从Novartis/Schering AG获得)；MAPK细胞外调节激酶I抑制剂CI-1040(可从Pharmacia获得)；喹唑啉类，诸如PD 153035，4-(3- 氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，诸如 CGP 59326，CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶类，4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶类；姜黄素(二阿魏酰甲烷，4,5-双(4-氟苯胺基)-酞酰亚胺)；含有硝基噻吩模块的tyrphostine类；PD-0183805(Warner-Lamber)；反义分子(例如与编码HER的核酸结合的那些)；喹喔啉类(美国专利No. 5,804,396)；tryphostin类(美国专利No.5,804,396)；ZD6474(AstraZeneca)； PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛HER抑制剂，诸如CI-1033(Pfizer)； Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊马替尼
Figure BDA0001686871200000281
PKI 166 (Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569 (Wyeth)；Semaxinib(Pfizer)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787 (Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)，雷帕霉素(西罗莫司，
Figure BDA0001686871200000282
)；或如任何下述专利公开文本中描述的：美国专利No. 5,804,396；WO1999/09016(American Cyanamid)；WO1998/43960(American Cyanamid)；WO1997/38983(Warner Lambert)；WO1999/06378(WarnerLambert)；WO1999/06396(Warner Lambert)；WO1996/30347(Pfizer,Inc)； WO1996/33978(Zeneca)；WO1996/3397(Zeneca)和WO1996/33980 (Zeneca)。
化疗剂还包括地塞米松(dexamethasone)，干扰素，秋水仙素 (colchicine)，氯苯氨啶(metoprine)，环孢霉素(cyclosporine)，两性霉素 (amphotericin)，甲硝唑(metronidazole)，阿仑单抗(alemtuzumab)，阿利维A 酸(alitretinoin)，别嘌醇(allopurinol)，氨磷汀(amifostine)，三氧化二砷 (arsenic trioxide)，天冬酰胺酶(asparaginase)，活的BCG，贝伐珠单抗 (bevacuzimab)，贝沙罗汀(bexarotene)，克拉屈滨(cladribine)，里本灵(clofarabine)，darbepoetin alfa，地尼白介素(denileukin)，右雷佐生 (dexrazoxane)，阿法依伯汀(epoetin alfa)，厄洛替尼(elotinib)，非格司亭(filgrastim)，醋酸组氨瑞林(histrelin acetate)，ibritumomab，干扰素α-2a，干扰素α-2b，来那度胺(lenalidomide)，左旋咪唑(levamisole)，美司钠 (mesna)，甲氧沙林(methoxsalen)，诺龙(nandrolone)，奈拉滨(nelarabine)，诺非单抗(nofetumomab)，奥普瑞白介素(oprelvekin)，palifermin，帕米膦酸盐(pamidronate)，培加酶(pegademase)，培门冬酶(pegaspargase)，PEG非格司亭(pegfilgrastim)，培美曲塞二钠(pemetrexeddisodium)，普卡霉素 (plicamycin)，卟吩姆钠(porfimer sodium)，喹纳克林(quinacrine)，拉布立酶 (rasburicase)，沙格司亭(sargramostim)，替莫唑胺(temozolomide)，VM-26， 6-TG，托瑞米芬(toremifene)，tretinoin，ATRA，戊柔比星(valrubicin)，唑来膦酸盐(zoledronate)，和唑来膦酸(zoledronic acid)，及其药学可接受盐。
化疗剂还包括氢化可的松(hydrocortisone)，醋酸氢化可的松 (hydrocortisoneacetate)，醋酸可的松(cortisone acetate)，替可的松匹伐酯 (tixocortol pivalate)，曲安奈德(triamcinolone acetonide)，曲安西龙醇 (triamcinolone alcohol)，莫米松(mometasone)，安西奈德(amcinonide)，布地奈德(budesonide)，地奈德(desonide)，fluocinonide，fluocinolone acetonide，倍他米松(betamethasone)，倍他米松磷酸钠(betamethasone sodium phosphate)，地塞米松(dexamethasone)，地塞米松磷酸钠(dexamethasone sodium phosphate)，氟可龙(fluocortolone)，氢化可的松-17-丁酸盐(hydrocortisone-17-butyrate)，氢化可的松-17-戊酸盐 (hydrocortisone-17-valerate)，二丙酸阿氯米松(aclometasone dipropionate)，戊酸倍他米松(betamethasone valerate)，二丙酸倍他米松(betamethasone dipropionate)，泼尼卡酯(prednicarbate)，氯倍他松-17-丁酸盐 (clobetasone-17-butyrate)，氯倍他松-17-丙酸盐(clobetasol-17-propionate)，己酸氟考龙(fluocortolone caproate)，特戊酸氟考龙(fluocortolone pivalate)和醋酸氟甲叉龙(fluprednidene acetate)；免疫选择性抗炎肽(ImSAID)，诸如苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)及其D-异构体形式(feG)(IMULANBioTherapeutics,LLC)；抗风湿药物，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)，环孢素(ciclosporin)(环孢霉素(cyclosporine)A)，D-青霉胺，金盐，羟氯喹，来氟米特(leflunomide)米诺环素(minocycline)，柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，肿瘤坏死因子α(TNFα)阻断剂，诸如依那西普(etanercept)(Enbrel)，英夫利昔单抗(infliximab)(Remicade)，阿达木单抗(adalimumab)(Humira)，certolizumab pegol(Cimzia)，golimumab(Simponi)，白介素1(IL-1)阻断剂，诸如阿那白滞素(anakinra)(Kineret)，T细胞共刺激阻断剂，诸如abatacept(Orencia)，白介素6(IL-6)阻断剂，诸如tocilizumab
Figure BDA0001686871200000291
白介素13(IL-13)阻断剂，诸如lebrikizumab；干扰素α(IFN)阻断剂，诸如Rontalizumab；β7整联蛋白阻断剂，诸如rhuMAb Beta7；IgE途径阻断剂，诸如抗M1prime；分泌型同三聚LTa3和膜结合型异三聚LTa1/β2阻断剂，诸如抗淋巴毒素α(LTa)；放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212， P32，Pb212和Lu放射性同位素)；混杂调查性药剂，诸如thioplatin，PS-341，丁酸苯酯，ET-18-OCH3，或法尼基转移酶抑制剂(L-739749，L-744832)；多酚，诸如槲皮素(quercetin)，白藜芦醇(resveratrol)，piceatannol，没食子酸表没食子儿茶精(epigallocatechine gallate)，茶黄素(theaflavin)，黄烷醇 (flavanol)，原花青素(procyanidin)，白桦脂酸(betulinic acid)及其衍生物；自噬抑制剂，诸如氯喹；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，
Figure BDA0001686871200000301
)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicine)；白桦脂酸(betulinic acid)；乙酰喜树碱，东莨菪亭 (scopolectin)，和9-氨基喜树碱)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；替加氟 (tegafur)
Figure BDA0001686871200000302
贝沙罗汀(bexarotene)
Figure BDA0001686871200000303
二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如
Figure BDA0001686871200000304
或
Figure BDA0001686871200000305
)，依替膦酸盐(etidronate)
Figure BDA0001686871200000306
NE-58095，唑来膦酸/ 唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)
Figure BDA0001686871200000307
阿伦膦酸盐 (alendronate)
Figure BDA00016868712000003012
帕米膦酸盐(pamidronate)
Figure BDA0001686871200000308
替鲁膦酸盐(tiludronate)
Figure BDA0001686871200000309
或利塞膦酸盐(risedronate)
Figure BDA00016868712000003010
和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如
Figure BDA00016868712000003011
疫苗；哌立福辛 (perifosine)，COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔 (etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如PS341)；CCI-779；tipifarnib(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersen sodium
Figure BDA00016868712000003013
pixantrone；法尼基转移酶抑制剂，诸如lonafarnib(SCH 6636,SARASARTM)；及上述任一的药学可接受盐，酸或衍生物；以及上述两项或更多项的组合，诸如CHOP(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱，和泼尼松龙的组合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU 和亚叶酸组合的治疗方案的缩写)。
化疗剂还包括具有止痛，退热和消炎效果的非类固醇消炎药。NSAID 包括酶环氧合酶的非选择性抑制剂。NSAID的具体例子包括阿司匹林 (aspirin)，丙酸衍生物诸如布洛芬(ibuprofen)，非诺洛芬(fenoprofen)，酮洛芬(ketoprofen)，氟比洛芬(flurbiprofen)，奥沙普秦(oxaprozin)和荼普生 (naproxen)，乙酸衍生物诸如吲哚美辛(indomethacin)，舒林酸(sulindac)，依托度酸(etodolac)，双氯芬酸(diclofenac)，烯醇酸衍生物诸如吡罗昔康 (piroxicam)，美洛昔康(meloxicam)，替诺昔康(tenoxicam)，屈恶昔康 (droxicam)，氯诺昔康(lornoxicam)和伊索昔康(isoxicam)，灭酸衍生物诸如甲灭酸(mefenamicacid)，甲氯芬那酸(meclofenamic acid)，氟芬那酸 (flufenamic acid)，托芬那酸(tolfenamic acid)，和COX-2抑制剂诸如塞来考昔 (celecoxib)，依托考昔(etoricoxib)，罗美考昔(lumiracoxib)，帕瑞考昔 (parecoxib)，罗非考昔(rofecoxib)，罗非昔布(rofecoxib)，和伐地考昔 (valdecoxib)。NSAID可指示用于诸如类风湿性关节炎，骨关节炎，炎性关节病，强直性脊柱炎，银屑病关节炎，莱特尔(Reiter)氏综合征，急性痛风，痛经，骨转移疼痛，头痛和偏头痛，手术后疼痛，炎症和组织损伤所致轻度至中度疼痛，发热，肠梗阻，和肾绞痛等状况的症状缓解。
在用于本文时，“生长抑制剂”指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。在一个实施方案中，生长抑制剂是阻止或降低表达抗体所结合的抗原的细胞增殖的生长抑制性抗体。在另一个实施方案中，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))，紫杉烷类(taxanes)，和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，依托泊苷(etoposide)，和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)，泼尼松(prednisone)，达卡巴嗪(dacarbazine)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，顺铂(cisplatin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，和ara-C。别的信息可参见 Mendelsohn和Israel编，《The MolecularBasis of Cancer》，第1章，题为“Cell cycle regulation,oncogenes,andantineoplastic drugs”，Murakami等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，例如第13页。紫杉烷类(帕利他赛(paclitaxel) 和多西他赛(docetaxel))是自紫杉树衍生的抗癌药。自欧洲紫杉衍生的多西他赛(
Figure BDA0001686871200000312
Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他赛(
Figure BDA0001686871200000311
Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。帕利他赛和多西他赛促进自微管蛋白二聚体装配微管并通过防止解聚使微管稳定，这导致对细胞中有丝分裂的抑制。
“放射疗法”或“放疗”意指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱导对细胞的足够损伤，以限制其正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。会领会的是，会有本领域知道的许多方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予，而典型的剂量范围为每天10至200个单位(戈瑞 (Gray))。
出于治疗的目的，“受试者”或“个体”指归为哺乳动物的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园，运动，或宠物动物，诸如犬，马，猫，牛，等。优选地，哺乳动物为人。个体或受试者可以是患者。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，而且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现期望的生物学活性。
“分离的”抗体是已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰抗体的研究，诊断或治疗用途的物质，而且可包括酶，激素，和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如Lowry法的测定，抗体重量超过95％，而在一些实施方案中，重量超过99％，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体。然而，分离的抗体通常会通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”通常是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约 150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而二硫化物连接的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是一些恒定域。每条轻链具有一端的一个可变域(VL)及其另一端的一个恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，而轻链可变域与重链的可变域对齐。认为特定的氨基酸残基形成轻链和重链可变域之间的界面。
术语“恒定域”指免疫球蛋白分子中的如下部分，其相对于免疫球蛋白的其它部分(含有抗原结合位点的可变域)具有更加保守的氨基酸序列。恒定域含有重链的CH1，CH2和CH3域(合称CH)及轻链的CHL(或CL)域。
抗体的“可变区”或“可变域”指抗体的重或轻链的氨基端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。
术语“可变”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域二者中称作高变区 (HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重和轻链的可变域每个包含四个FR区，大多采取β-片层构象，通过三个HVR (它们形成连接β-片层结构且在一些情况中形成β-片层结构的一部分的环)。每条链中的HVR通过FR区非常接近地保持在一起，并与来自另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,National Institute of Health, Bethesda,Md.(1991))。恒定域并不直接参与抗体对抗原的结合，但是展现多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。
基于它们的恒定域的氨基酸序列，来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归至两种明显不同的型之一，称作卡帕(“κ”)和拉姆达 (“λ”)。
如本文中使用的，术语IgG“同种型”或“亚类”意指由它们的恒定区的化学和抗原特征定义的任何免疫球蛋白亚类。
根据它们的重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可指派至不同的类。有五大类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，而且这些中的数项可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，γ，ε，γ，和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是公知的且一般性描述于例如Abbas et al.,Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可以是通过抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价联合而形成的更大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”，“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体，而非下文定义的抗体片段。该术语特别指重链包含Fc 区的抗体。
为了本文中的目的，“裸抗体”指未缀合至细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。在一些实施方案中，本文所述抗体片段是抗原结合片段。抗体片段的例子包括 Fab，Fab'，F(ab')2，和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和自抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，每个具有一个抗原结合位点，和一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点且仍然能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密，非共价联合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻和重链能以在与双链Fv种类中的类似的“二聚体”结构联合。正是在这种构造中，每个可变域的三个HVR相互作用，在 VH-VL二聚体的表面上限定一个抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个 HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力比完整结合位点要低。
Fab片段包含重和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1域的羧基端添加少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为具有Fab'片段之间的铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL域，其中这些域存在于一条多肽链中。一般地，scFv多肽进一步包含VH和VL域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成抗原结合期望的结构。关于scFv的综述参见例如 Plückthun，于《The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》，第113卷， Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，1994，第269-315页。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段包含同一条多肽链(VH-VL)中连接的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个域之间不能配对，迫使这些域与另一条链的互补域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更加完整地描述于例如EP 404,097；WO1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson etal.,Nat.Med.9: 129-134(2003)。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，例如构成群体的抗体个体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然发生突变。如此，修饰语“单克隆”指示抗体并非分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型地包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆，诸如杂交瘤克隆，噬菌体克隆，或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了改善对靶物的亲和力，将靶物结合序列人源化，改善其在细胞培养物中的生成，降低其在体内的免疫原性，创建多特异性抗体，等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体制备物的优势还在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群体获得的特征，而且不要解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，要依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein,Nature 256:495-97(1975)；Hongo et al.,Hybridoma 14(3):253-260 (1995)；Harlow et al.,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling et al.,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))，重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)，噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu et al., J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；及 Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))，和用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann et al., Year in Immuno.7:33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825； 5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368: 812-813(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)； Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；及Lonberg and Huszar,Intern. Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现期望的生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567；及Morrison etal.,Proc.Natl.Acad. Sci.USA81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括
Figure BDA0001686871200000361
抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。
“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指如下的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体HVR的残基用来自具有期望特异性，亲和力，和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔，或非人灵长动物)HVR的残基替换。在一些情况中，人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。而且，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，而且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选还会包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的。别的细节参见例如Jones etal.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329 (1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如 Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)； Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr. Op.Biotech.5:428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和7,087,409。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/ 或使用本文中公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter,J. Mol.Biol.227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。Cole et al.,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,p.77(1985)； Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991)中描述的方法也可用于制备人单克隆抗体。还可参见van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5: 368-74(2001)。人抗体可通过对经过修饰以响应抗原性刺激而生成此类抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物，例如经过免疫的异种小鼠(xenomice) 施用抗原来制备(参见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103: 3557-3562(2006)，关于经人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
“物种依赖性抗体”指如下的抗体，其具有的对来自第一哺乳动物物种的抗原的结合亲和力比它具有的对来自第二哺乳动物物种的该抗原的同系物的结合亲和力要强。正常情况下，物种依赖性抗体“特异性结合”人抗原(例如具有不超过约1x 10-7M，优选不超过约1x 10-8M，且优选不超过约1x 10-9M的结合亲和力(KD)值)，但是对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原的同系物的结合亲和力比它对人抗原的结合亲和力弱至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍。物种依赖性抗体可以是上文定义的各种类型的抗体中的任一种，但是优选人源化或人抗体。
在本文中使用时，术语“高变区”，“HVR”，或“HV”指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1，H2，H3)，三个在VL中(L1，L2，L3)。在天然抗体中，H3和L3展示六个HVR的最大多样性，而且特别认为H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson and Wu,in:Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)。确实，仅仅由重链组成的天然发生骆驼(camelid) 抗体在轻链缺失下是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448(1993)；Sheriff et al.,Nature Struct.Biol.3:733-736 (1996)。
本文中使用且涵盖许多HVR叙述。Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性且最常用(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。 Chothia改为指结构环的定位(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917 (1987))。AbM HVR代表Kabat HVR和Chothia结构环之间的折衷，而且得到 Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR基于可获得的复合物晶体结构的分析。下文记录了来自这些HVR中每一个的残基。
Figure BDA0001686871200000381
HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)，46-56或 50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)，50-65或49-65(H2)和 93-102，94-102，或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。
“框架”或“FR”残基指除本文中定义的HVR残基以外的那些可变域残基。
术语“如Kabat中的可变域残基编号方式”或“如Kabat中的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat et al.,见上文中用于抗体编辑的重链可变域或轻链可变域编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat的残基52a)和重链FR 残基82后的插入残基(例如依照Kabat的残基82a，82b，和82c，等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过在同源区比对抗体的序列与“标准”Kabat 编号序列来确定。
Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat et al.,Sequences ofImmunological Interest.5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat et al.，见上文中报告的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号方式。
表述“线性抗体”指Zapata et al.(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062中描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
如本文中使用的，术语“结合”，“特异性结合”或“对……特异性的”指可测量且可再现的相互作用，诸如靶物和抗体之间的结合，其确定在分子(包括生物学分子)的异质群体存在下靶物的存在。例如，结合或特异性结合靶物(其可以是表位)的抗体是以比它结合其它靶物要大的亲和力，亲合力，更容易，和/或以更大的持续时间结合此靶物的抗体。在一个实施方案中，抗体结合无关靶物的程度小于抗体对靶物的结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，特异性结合靶物的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上在来自不同物种的蛋白质间保守的表位。在另一个实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性结合。
术语“双特异性”意味着抗原结合分子能够特异性结合至少两种截然不同的抗原性决定簇。典型地，双特异性抗原结合分子包含两种抗原结合位点，其中每种是对不同抗原性决定簇特异性的。在某些实施方案中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇，特别是两种截然不同细胞上表达的两种抗原性决定簇。
术语“抗原结合域”指抗体中包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的部分。抗原结合域可以由例如一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变域(VL)和抗体重链可变域(VH)。
“Fab分子”指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1域及轻链 (“Fab轻链”)的VL和CL域组成的蛋白质。
“交换”Fab分子(也称作“Crossfab”)意指如下的Fab分子，其中Fab重和轻链的可变域或恒定域是交换的(即彼此替换)，即交换Fab分子包含由轻链可变域VL和重链恒定域1CH1构成的肽链(VL-CH1，N至C端方向)，和由重链可变域VH和轻链恒定域CL构成的肽链(VH-CL，N至C端方向)。为了清楚起见，在其中Fab轻链和Fab重链的可变域交换的交换Fab分子中，包含重链恒定域1CH1的肽链在本文中称作(交换)Fab分子的“重链”。相反，在其中Fab轻链和Fab重链的恒定域交换的交换Fab分子中，包含重链可变域VH的肽链在本文中称作(交换)Fab分子的“重链”。
与之形成对比，“常规”Fab分子意指处于它的天然型式的Fab分子，即包含由重链可变和恒定域构成的重链(VH-CH1，N至C端方向)，和由轻链可变和恒定域构成的轻链(VL-CL，N至C端方向)。
本文中的术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中含有至少部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的 Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或自 Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞生成的抗体可经历翻译后切割，自重链的C端切除一个或多个，特别是一个或两个氨基酸。因此，通过表达编码全长重链的特定核酸分子由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链，或者它可包括全长重链的切割变体(在本文中也称为“切割变体重链”)。在重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，EU编号方式)的情况中可能就是这种情况。因此，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)，或 C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称作EU索引，如记载于Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991(也可见上文)。如本文中使用的，Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两条多肽之一，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如，IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。
“融合”意味着各成分(例如Fab分子和Fc域亚基)通过肽键连接，或是直接地或是经由一个或多个肽接头。
“促进异二聚化的修饰”是如下的肽主链操作或多肽(例如免疫球蛋白重链)的翻译后修饰，其降低或防止多肽与相同多肽联合以形成同二聚体。如本文中使用的，促进异二聚化的修饰特别包括对期望形成二聚体的两条多肽中的每一个进行的分开的修饰，其中该修饰彼此互补，从而促进两条多肽联合。例如，促进异二聚化的修饰可改变期望形成二聚体的两条多肽之一或二者的结构或电荷，从而分别使得它们的联合在立体上或在静电上有利。异二聚化在两条不相同的多肽，例如可变区不相同的两条免疫球蛋白重链之间发生。在一些实施方案中，促进异二聚化的修饰包含氨基酸突变，具体是氨基酸替代。在一个特定的实施方案中，促进异二聚化的修饰包含期望形成二聚体的两条多肽的每一个中的分开的氨基酸突变，具体是氨基酸替代。
“激活性Fc受体”是在通过抗体的Fc区啮合后引发刺激携带受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。激活性Fc受体包括FcγRIIIa (CD16a)，FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)，和FcαRI(CD89)。
术语“效应器功能”在提及抗体使用时指那些可归于抗体Fc区的生物学活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)，Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)，细胞因子分泌，免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调，和B 细胞激活。
II.PD-1轴结合拮抗剂
本文中提供的是一种用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体。本文中还提供的是一种在具有癌症的个体中增强免疫功能的方法，其包括对该个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体。例如，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。PD-1(编程性死亡1)在本领域中也称为“编程性细胞死亡1”，PDCD1，CD279和SLEB2。PD-L1(编程性死亡配体1)在本领域中也称为“编程性细胞死亡1配体1”，PDCD1LG1，CD274，B7-H，和PDL1。一种例示性人PD-L1显示于UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1。PD-L2(编程性死亡配体2)在本领域中也称为“编程性细胞死亡1配体2”，PDCD1LG2， CD273，B7-DC，Btdc，和PDL2。一种例示性人PD-L2显示于 UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9BQ51。在一些实施方案中，PD-1，PD-L1，和PD-L2是人PD-1，PD-L1和PD-L2。
在一些实施方案中，该PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1对它的配体结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面，该PD-1配体结合配偶是PD-L1和/或 PD-L2。在另一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1对它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面，PD-L1结合配偶是PD-1和/或 B7-1。在另一个实施方案中，该PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2对它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面，PD-L2结合配偶是PD-1。该拮抗剂可以是抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，或寡肽。
在一些实施方案中，该PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如人抗体，人源化抗体，或嵌合抗体)。在一些实施方案中，该抗PD-1抗体选自由MDX 1106(nivolumab)，MK-3475(pembrolizumab)，CT-011(pidilizumab)， MEDI-0680(AMP-514)，PDR001，REGN2810，和BGB-108组成的组。在一些实施方案中，该PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如包含融合至恒定区 (例如免疫球蛋白序列的Fc区)的PD-L1或PD-L2胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，该PD-1结合拮抗剂是AMP-224。在一些实施方案中，该PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，该抗 PD-L1抗体选自由YW243.55.S70，MPDL3280A(atezolizumab)， MDX-1105，MEDI4736(durvalumab)，和MSB0010718C(avelumab)组成的组。抗体YW243.55.S70是WO 2010/077634中描述的一种抗PD-L1。 MDX-1105，也称为BMS-936559，是WO2007/005874中描述的一种抗PD-L1 抗体。MEDI4736是WO2011/066389和US2013/034559中描述的一种抗PD-L1 单克隆抗体。Nivolumab，也称为MDX-1106-04，MDX-1106，ONO-4538， BMS-936558，和
Figure BDA0001686871200000421
是WO2006/121168中描述的一种抗PD-1抗体。Pembrolizumab，也称为MK-3475，Merck 3475，lambrolizumab，
Figure BDA0001686871200000422
和SCH-900475，是WO2009/114335中描述的一种抗PD-1抗体。CT-011，也称为hBAT，hBAT-1或pidilizumab，是WO2009/101611中描述的一种抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是WO2010/027827和 WO2011/066342中描述的一种PD-L2-Fc融合可溶性受体。
在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1和PD-1之间和/或PD-L1和B7-1之间的结合。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体是选自由Fab，Fab’-SH，Fv，scFv，和(Fab’)2片段组成的组的抗体片段。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体是人抗体。
对本发明的方法，用途，组合物和试剂盒有用的抗PD-L1抗体的例子，及其生成方法描述于PCT专利申请WO2010/077634，WO2007/005874， WO2011/066389，和US2013/034559，其通过援引收入本文。在本发明中有用的抗PD-L1抗体，包括含有此类抗体的组合物，可以与抗CEA/抗CD3双特异性抗体组合使用来治疗癌症。
抗PD1抗体
在一些实施方案中，该抗PD-1抗体是MDX-1106。“MDX-1106”的备选名称包括MDX-1106-04，ONO-4538，BMS-936558或nivolumab。在一些实施方案中，该抗PD-1抗体是nivolumab(CAS登记号：946414-94-4)。在仍有又一个实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-1抗体，其包含重链可变区和/或轻链可变区，该重链可变区包含来自SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列，该轻链可变区包含来自SEQ ID NO:2的轻链可变区氨基酸序列。在仍有又一个实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-1抗体，其包含重链和/ 或轻链序列，其中：
(a)该重链序列与下述重链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少 92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWV AVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT NDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:1)，且
(b)该轻链序列与下述轻链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少 92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC(SEQ ID NO:2)。
抗PD-L1抗体
WO 2010/077634A1和US 8,217,149中描述的抗PD-L1抗体可用于本文所述方法，用途，组合物和试剂盒。在一些实施方案中，该抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:3的重链可变区序列和/或SEQ ID NO:4的轻链可变区序列。在仍有又一个实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和 /或轻链序列，其中：
(a)该重链序列与下述重链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少 92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVA WISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARR HWPGGFDYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:3)，且
(b)该轻链序列与下述轻链序列具有至少85％，至少90％，至少91％，至少 92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA SFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTK VEIKR(SEQ ID NO:4)。
在一个实施方案中，该抗PD-L1抗体包含重链可变区多肽，其包含 HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3序列，其中：
(a)HVR-H1序列是GFTFSX1SWIH(SEQ ID NO:5)；
(b)HVR-H2序列是AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(SEQ ID NO:6)；
(c)HVR-H3序列是RHWPGGFDY(SEQ ID NO:7)；
进一步地其中：X1是D或G；X2是S或L；X3是T或S。在一个具体的方面， X1是D；X2是S且X3是T。
在另一个方面，该多肽进一步包含依照下式的在HVR间并置的可变区重链框架序列：
(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)。在还有另一个方面，该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在又一个方面，该框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，至少一个框架序列如下：
HC-FR1是EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:8)
HC-FR2是WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:9)
HC-FR3是RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:10)
HC-FR4是WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:11)。
在仍有又一个方面，该重链多肽进一步与可变区轻链组合，该可变区轻链包含HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3，其中：
(a)HVR-L1序列是RASQX4X5X6TX7X8A(SEQ ID NO:12)；
(b)HVR-L2序列是SASX9LX10S(SEQ ID NO:13)；
(c)HVR-L3序列是QQX11X12X13X14PX15T(SEQ ID NO:14)；
其中：X4是D或V；X5是V或I；X6是S或N；X7是A或F；X8是V或L；X9是F 或T；X10是Y或A；X11是Y，G，F，或S；X12是L，Y，F或W；X13是Y， N，A，T，G，F或I；X14是H，V，P，T或I；X15是A，W，R，P或T。在仍有又一个方面，X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是 Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H；X15是A。
在仍有又一个方面，该轻链进一步包含依照下式的在HVR间并置的可变区轻链框架序列：
(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在仍有又一个方面，该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在仍有又一个方面，该框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面，至少一个框架序列如下：
LC-FR1是DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:15)
LC-FR2是WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:16)
LC-FR3是GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:17)
LC-FR4是FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:18)。
在另一个实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
(a)重链包含HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3，其中进一步地：
(i)HVR-H1序列是GFTFSX1SWIH(SEQ ID NO:5)，
(ii)HVR-H2序列是AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(SEQ ID NO:6)
(iii)HVR-H3序列是RHWPGGFDY(SEQ ID NO:7)，且
(b)轻链包含HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3，其中进一步地：
(i)HVR-L1序列是RASQX4X5X6TX7X8A(SEQ ID NO:12)
(ii)HVR-L2序列是SASX9LX10S(SEQ ID NO:13)；且
(iii)HVR-L3序列是QQX11X12X13X14PX15T(SEQ ID NO:14)；
其中：X1是D或G；X2是S或L；X3是T或S；X4是D或V；X5是V或I；X6是S 或N；X7是A或F；X8是V或L；X9是F或T；X10是Y或A；X11是Y，G，F，或 S；X12是L，Y，F或W；X13是Y，N，A，T，G，F或I；X14是H，V，P，T 或I；X15是A，W，R，P或T。在一个具体的方面，X1是D；X2是S且X3是 T。在另一个方面，X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H；X15是A。在还有另一个方面， X1是D；X2是S且X3是T，X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是 F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H且X15是A。
在又一个方面，该重链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列：
(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，且该轻链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列：
(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在仍有又一个方面，该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在仍有又一个方面，该重链框架序列是自Kabat亚组I，II，或III序列衍生的。在仍有又一个方面，该重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如SEQ ID NO:8，9，10和11所列。在仍有又一个方面，该轻链框架序列是自KabatκI，II，II或IV亚组序列衍生的。在仍有又一个方面，该轻链框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO:15，16，17和18所列。
在仍有又一个具体的方面，该抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面，该人恒定区选自由IgG1，IgG2，IgG2，IgG3，IgG4组成的组。在仍有又一个具体的方面，该人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面，该鼠恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3组成的组。在仍有又一个方面，该鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面，该抗体具有降低的或最小限度的效应器功能。在仍有又一个具体的方面，该最小限度的效应器功能源自“效应器较小(effector-less)的Fc突变”或无糖基化(aglycosylation)。在仍有又一个实施方案中，该效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或 D265A/N297A替代。
在还有另一个实施方案中，提供的是一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
(a)重链进一步包含分别与GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:19)， AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:20)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO:21)具有至少85％序列同一性的HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3序列，或 (b)轻链进一步包含分别与RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:22)，SASFLYS (SEQID NO:23)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO:24)具有至少85％序列同一性的 HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3序列。
在一个具体的方面，该序列同一性是86％，87％，88％，89％，90％， 91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。
在另一个方面，该重链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列：
(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，且该轻链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列：
(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面，该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在仍有又一个方面，该重链框架序列是自Kabat亚组I，II，或III序列衍生的。在仍有又一个方面，该重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如SEQ ID NO:8，9，10和11所列。在仍有又一个方面，该轻链框架序列是自KabatκI，II，II或IV亚组序列衍生的。在仍有又一个方面，该轻链框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO:15，16，17和18所列。
在仍有又一个具体的方面，该抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面，该人恒定区选自由IgG1，IgG2，IgG2，IgG3，IgG4组成的组。在仍有又一个具体的方面，该人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面，该鼠恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3组成的组。在仍有又一个方面，该鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面，该抗体具有降低的或最小限度的效应器功能。在仍有又一个具体的方面，该最小限度的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有又一个实施方案中，该效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
在另一个又一个实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
(a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVA WISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARR HWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:25)，和/或
(b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA SFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTK VEIKR(SEQ ID NO:4)。
在一个具体的方面，该序列同一性是86％，87％，88％，89％，90％， 91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在另一个方面，该重链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列：
(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，且该轻链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列：
(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面，该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在又一个方面，该重链框架序列是自Kabat亚组I，II，或III序列衍生的。在仍有又一个方面，该重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如SEQ ID NO:8，9，10和WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)所列。
在仍有又一个方面，该轻链框架序列是自KabatκI，II，II或IV亚组序列衍生的。在仍有又一个方面，该轻链框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO:15，16，17和18所列。
在仍有又一个具体的方面，该抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面，该人恒定区选自由IgG1，IgG2，IgG2，IgG3，IgG4组成的组。在仍有又一个具体的方面，该人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面，该鼠恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3组成的组。在仍有又一个方面，该鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面，该抗体具有降低的或最小限度的效应器功能。在仍有又一个具体的方面，该最小限度的效应器功能源自原核细胞中的生成。在仍有又一个具体的方面，该最小限度的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有又一个实施方案中，该效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
在又一个方面，该重链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列：
(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，且该轻链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列：
(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在仍有又一个方面，该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在仍有又一个方面，该重链框架序列是自Kabat亚组I，II，或III序列衍生的。在仍有又一个方面，该重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：
HC-FR1EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:29)
HC-FR2WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:30)
HC-FR3RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:10)
HC-FR4WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。
在仍有又一个方面，该轻链框架序列是自KabatκI，II，II或IV亚组序列衍生的。在仍有又一个方面，该轻链框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个轻链框架序列如下：
LC-FR1DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:15)
LC-FR2WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:16)
LC-FR3GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:17)
LC-FR4FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:28)。
在仍有又一个具体的方面，该抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面，该人恒定区选自由IgG1，IgG2，IgG2，IgG3，IgG4组成的组。在仍有又一个具体的方面，该人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面，该鼠恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3组成的组。在仍有又一个方面，该鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面，该抗体具有降低的或最小限度的效应器功能。在仍有又一个具体的方面，该最小限度的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有又一个实施方案中，该效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
在还有另一个实施方案中，提供的是一种抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
(c)重链进一步包含分别与GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:19)， AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:20)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO:21)具有至少85％序列同一性的HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3序列，和/ 或
(d)轻链进一步包含分别与RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:22)，SASFLYS (SEQ ID NO:23)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO:24)具有至少85％序列同一性的 HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3序列。
在一个具体的方面，该序列同一性是86％，87％，88％，89％，90％， 91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。
在另一个方面，该重链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列：
(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，且该轻链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列：
(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面，该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在仍有又一个方面，该重链框架序列是自Kabat亚组I，II，或III序列衍生。在仍有又一个方面，该重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如SEQ ID NO:8，9，10和WGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO:31)所列。
在仍有又一个方面，该轻链框架序列是自KabatκI，II，II或IV亚组序列衍生的。在仍有又一个方面，该轻链框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO:15，16，17和18所列。在仍有又一个具体的方面，该抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面，该人恒定区选自由IgG1，IgG2，IgG2，IgG3，IgG4组成的组。在仍有又一个具体的方面，该人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面，该鼠恒定区选自由IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3组成的组。在仍有又一个方面，该鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面，该抗体具有降低的或最小限度的效应器功能。在仍有又一个具体的方面，该最小限度的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有又一个实施方案中，该效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
在仍有又一个实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
(a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVA WISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARR HWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:25)，或
(b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA SFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTK VEIKR(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中该轻链可变区序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少 91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中该重链可变区序列与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少 94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中该轻链可变区序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少 91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性且该重链可变区序列与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少 89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，可以在重和/或轻链的N端删除，替代或修饰一个，两个，三个，四个或五个氨基酸残基。
在仍有又一个实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
(a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVA WISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARR HWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO:26)，或
(b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA SFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTK VEIKR(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中该轻链可变区序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少 91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中该重链可变区序列与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少 94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中该轻链可变区序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少 91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性且该重链可变区序列与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少 89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，可以在重和/或轻链的N端删除，替代或修饰一个，两个，三个，四个或五个氨基酸残基。
在仍有又一个实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链序列，其中：
(a)该重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVA WISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARR HWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYAS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:32)，和/或
(b)该轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA SFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:33)。
在仍有又一个实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链序列，其中：
(a)该重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVA WISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARR HWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYAS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K(SEQ ID NO:56)，和/或
(b)该轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA SFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:33)。
在一些实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链序列，其中该轻链序列与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少 92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1 抗体，其包含重链和轻链序列，其中该重链序列与SEQ ID NO:32或56的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少 90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链序列，其中该轻链序列与 SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少 88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性且该重链序列与SEQ ID NO:32或56的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少 87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，提供的是一种分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链序列，其中该轻链序列与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少 85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少 98％，或至少99％序列同一性且该重链序列与SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少 97％，至少98％，或至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，该分离的抗PD-L1抗体是无糖基化的。抗体的糖基化典型地是N连接的或O连接的。N连接的指碳水化合物模块附着至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X 是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是碳水化合物模块酶促附着至天冬酰胺侧链的识别序列。如此，这些三肽序列任一在多肽中的存在创建潜在的糖基化位点。O连接的糖基化指糖N-乙酰基半乳糖胺，半乳糖，或木糖附着至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列，使得去除上文所述三肽序列(用于N连接的糖基化位点)之一，方便地实现自抗体去除糖基化位点。可以通过将糖基化位点内的天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸残基用另一种氨基酸残基(例如甘氨酸，丙氨酸或保守氨基酸替代)替代来进行该改变。
在本文中的任何实施方案中，该分离的抗PD-L1抗体能结合人PD-L1 (例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1中所示人PD-L1)或其变体。
在仍有又一个实施方案中，提供的是一种分离的核酸，其编码本文中描述的任何抗体。在一些实施方案中，该核酸进一步包含适合于编码先前描述的任何抗PDL1抗体的核酸表达的载体。在仍有又一个具体的方面，该载体在适合于该核酸表达的宿主细胞中。在仍有又一个具体的方面，该宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在仍有又一个具体的方面，该真核细胞是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
可以使用本领域知道的方法，例如通过如下的方法来生成该抗体或其抗原结合片段，该方法包括在适合于生成此类抗体或片段的条件下培养含有处于适合于表达的形式的编码先前描述的任何抗PDL1抗体或抗原结合片段的核酸的宿主细胞，并回收该抗体或片段。
III.抗CEA/抗CD3双特异性抗体
本文中提供的是一种用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体。本文中还提供的是一种在具有癌症的个体中增强免疫功能的方法，其包括对该个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体。
本文中提供的是结合人癌胚抗原(CEA)的双特异性抗体。“CEA”的备选名称包括CEACAM5。如本文中使用的，术语“CEA”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CEA，包括哺乳动物，诸如灵长动物(例如人)，非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。该术语涵盖“全长”和未加工的CEA以及源自细胞中的加工的任何形式的CEA(例如成熟蛋白)。该术语还涵盖CEA的天然发生变体和同等型，例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中，CEA是人CEA。人CEA的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号P06731，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004354.2。
在一些实施方案中，双特异性抗体中结合CEA的抗原结合域包含重链可变区(VHCEA)和/或轻链可变区(VLCEA)，该重链可变区(VHCEA)包含下述氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEW MGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCA RWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:34)，
该轻链可变区(VLCEA)包含下述氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYS ASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQ GTKLEIK(SEQ ID NO:35)。
在一些实施方案中，双特异性抗体中结合CEA的抗原结合域包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含EFGMN(SEQ ID NO:38)的 HVR-H1序列，WINTKTGEATYVEEFKG(SEQ ID NO:39)的HVR-H2序列，和WDFAYYVEAMDY(SEQ ID NO:40)的HVR-H3序列，该轻链可变区包含 KASAAVGTYVA(SEQ ID NO:41)的HVR-L1序列，SASYRKR(SEQ ID NO:42)的HVR-L2序列，和HQYYTYPLFT(SEQ ID NO:43)的HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含结合人CD3多肽的第一抗原结合域和结合CEA的第二抗原结合域。在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体进一步包含结合CEA的第三抗原结合域。在一些实施方案中，该第二和该第三抗原结合域是相同的(即具有相同的氨基酸序列)。
CD3(分化簇3)T细胞共同受体是一种蛋白质复合物且由四条独特链构成。在哺乳动物中，该复合物含有一条CD3γ链，一条CD3δ链，和两条 CD3ε链。在T淋巴细胞中这些链与T细胞受体(TCR)和ζ链联合以生成激活信号。TCR，ζ链，和CD3分子一些形成TCR复合物。如本文中使用的，术语“CD3”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，包括哺乳动物，诸如灵长动物(例如人)，非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。该术语涵盖“全长”和未加工的蛋白质以及源自细胞中的加工的任何形式的蛋白质或一种或多种CD3链(多肽)(例如成熟多肽)。该术语还涵盖CD3的天然发生变体和同等型，例如剪接变体或等位变体。例如，CD3γ，CD3δ，和CD3ε链的描述和序列提供于 www.uniprot.org/uniprot/P04234，www.uniprot.org/uniprot/P07766，和 www.uniprot.org/uniprot/P09693。在一些实施方案中，CD3是人CD3，特别是人CD3的厄普西隆亚基(CD3ε)。人CD3ε的氨基酸序列显示于UniProt (www.uniprot.org)登录号P07766(版本144)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1。食蟹猴[Macaca fascicularis]CD3ε的氨基酸序列显示于NCBI GenBank no.BAB71849.1。
在一些实施方案中，该双特异性抗体结合人CD3厄普西隆(CD3ε)多肽。在一些实施方案中，该双特异性抗体结合天然T细胞受体(TCR)复合物中与其它TCR亚基联合的人CD3厄普西隆多肽。在一些实施方案中，该双特异性抗体结合人CD3伽马(CD3γ)多肽。在一些实施方案中，该双特异性抗体结合天然T细胞受体(TCR)复合物中与其它TCR亚基联合的人CD3伽马多肽。
在一个方面，提供用于鉴定具有生物学活性的抗CD3抗体的测定法。生物学活性可以包括例如结合CD3多肽(例如T细胞表面上的CD3)或其肽片段，或是在体内，或是在体外，或是离体。在本发明的多特异性(例如双特异性)抗CD3抗体(例如具有抗CEA结合域和识别CD3多肽的结合域的TCB抗体)的情况中，生物学活性还可以包括例如效应细胞激活(例如T细胞(例如 CD8+和/或CD4+ T细胞)激活)，效应细胞群扩充(即T细胞计数升高)，靶细胞群减少(即在它们的细胞表面上表达CEA的细胞群减少)，和/或靶细胞杀伤。提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。
在一些实施方案中，双特异性抗体中结合CEA的抗原结合域包含重链可变区(VHCEA)和轻链可变区(VLCEA)，该重链可变区(VHCEA)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，该轻链可变区(VLCEA)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CEA的抗原结合域包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含EFGMN(SEQ ID NO:38)的HVR-H1序列， WINTKTGEATYVEEFKG(SEQ ID NO:39)的HVR-H2序列，和 WDFAYYVEAMDY(SEQ ID NO:40)的HVR-H3序列，该轻链可变区包含 KASAAVGTYVA(SEQ ID NO:41)的HVR-L1序列，SASYRKR(SEQ ID NO:42)的HVR-L2序列，和HQYYTYPLFT(SEQ ID NO:43)的HVR-L3序列。
在一些实施方案中，双特异性抗体中结合CD3的抗原结合域包含重链可变区(VHCD3)和轻链可变区(VLCD3)，该重链可变区(VHCD3)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，该轻链可变区(VLCD3)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD3的抗原结合域包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含TYAMN(SEQ ID NO:44)的HVR-H1序列， RIRSKYNNYATYYADSVKG(SEQ ID NO:45)的HVR-H2序列，和 HGNFGNSYVSWFAY(SEQ IDNO:46)的HVR-H3序列，该轻链可变区包含 GSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:47)的HVR-L1序列，GTNKRAP(SEQ ID NO:48)的HVR-L2序列，和ALWYSNLWV(SEQ ID NO:49)的HVR-L3序列。
在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合域和结合CEA的第二和任选的第三抗原结合域，其中该抗原结合域是Fab分子(例如常规或交换Fab分子)。在特定的此类实施方案中，该双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合域和结合CEA的第二和任选的第三抗原结合域，其中该第一抗原结合域是交换Fab分子，其中Fab重和轻链的可变域或恒定域是交换的(即彼此替换)且该第二(和第三，如果存在的话) 抗原结合域是常规Fab分子。在一个实施方案中，该第一抗原结合域是交换 Fab分子，其中Fab重和轻链的恒定域是交换的。在一个实施方案中，该抗 CEA/抗CD3双特异性抗体包含不超过一个结合CD3的抗原结合域，即提供对CD3的单价结合。在一个实施方案中，该第一和该第二抗原结合域彼此融合，任选经由肽接头。在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合域和结合CEA的第二和任选的第三抗原结合域，其中该抗原结合域是Fab分子且(i)该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，或(ii)该第一抗原结合域在Fab 重链的C端融合至该第二抗原结合域的Fab重链的N端。在一个特定的实施方案中，该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab 重链的N端。任选地，该第一抗原结合域的Fab轻链和该第二抗原结合域的Fab轻链可另外彼此融合。
在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。在一些实施方案中，该抗CEA/抗 CD3双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合域，结合CEA的第二抗原结合域，和由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，其中该抗原结合域是Fab分子且其中(i)该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，且该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端，或(ii)该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合域的Fab重链的N端，且该第二抗原结合域在Fab重链的C 端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个特定的实施方案中，该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，且该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N 端。在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体本质上由结合CD3 的第一抗原结合域，结合CEA的第二抗原结合域，由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中该抗原结合域是Fab分子且其中(i)该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，且该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该 Fc域的第一或第二亚基的N端，或(ii)该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合域的Fab重链的N端，且该第二抗原结合域在Fab重链的 C端融合至该Fc域的第一或第二亚基的N端。
在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含结合CD3的第一抗原结合域，结合CEA的第二和第三抗原结合域，和由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，其中该抗原结合域是Fab分子且其中(i)该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，且该第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端，或(ii)该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合域的Fab重链的N端，该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，且该第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。在一个特定的实施方案中，该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，且该第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体本质上由结合CD3的第一抗原结合域，结合CEA的第二和第三抗原结合域，由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，和任选的一个或多个肽接头组成，其中该抗原结合域是Fab分子且其中(i)该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，该第一抗原结合域在Fab 重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，且该第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端，或(ii)该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第二抗原结合域的Fab重链的N端，该第二抗原结合域在 Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，且该第三抗原结合域在Fab 重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端。
在一个实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含 (i)结合CD3的第一抗原结合域，其包含重链可变区(VHCD3)和轻链可变区 (VLCD3)，该重链可变区(VHCD3)包含SEQ IDNO:44的HVR-H1序列，SEQ ID NO:45的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:46的HVR-H3序列，该轻链可变区 (VLCD3)包含SEQ ID NO:47的HVR-L1序列，SEQ ID NO:48的HVR-L2序列，和SEQ IDNO:49的HVR-L3序列，其中该第一抗原结合模块是交换Fab 分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定区任一，特别是恒定区是交换的；
(ii)结合CEA的第二和第三抗原结合域，其包含重链可变区(VHCEA)和轻链可变区(VLCEA)，该重链可变区(VHCEA)包含SEQ ID NO:38的HVR-H1序列，SEQ ID NO:39的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:40的HVR-H3序列，该轻链可变区(VLCEA)包含SEQ ID NO:41的HVR-L1序列，SEQ ID NO:42的 HVR-L2序列，和SEQ ID NO:43的HVR-L3序列，其中该第二和第三抗原结合模块每一个是Fab分子，特别是常规Fab分子；
(iii)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，
其中该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，且该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N 端，且其中该第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的 N端。
该Fab分子可以直接或经由肽接头融合至该Fc域或彼此融合，该肽接头包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸。本领域知道且本文中描述了肽接头。合适的，非免疫原性的肽接头包括例如(G4S)n，(SG4)n，(G4S)n或 G4(SG4)n肽接头。“n”一般是1至10，通常是2至4的整数。在一个实施方案中，所述肽接头具有至少5个氨基酸，在一个实施方案中，5至100个氨基酸，在又一个实施方案中，10至50个氨基酸的长度。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，且(x＝3，n＝3， 4，5或6，且m＝0，1，2或3)或(x＝4，n＝2，3，4或5且m＝0，1，2或3)，在一个实施方案中，x＝4且n＝2或3，在又一个实施方案中，x＝4且n＝2。在一个实施方案中，所述肽接头是(G4S)2。一种特别适合于将该第一和该第二抗原结合域的Fab轻链彼此融合的肽接头是(G4S)2。一种适合于连接该第一和该第二抗原结合域的Fab重链的例示性肽接头包含序列(D)-(G4S)2。另一种合适的此类接头包含序列(G4S)4。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，当Fab分子融合至Fc域亚基的N端时，它可以在有或无另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其部分融合。
在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含(i)如下的多肽，其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab重链可变区继而与该第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即该第二Fab分子包含交换Fab重链，其中重链恒定区用轻链恒定区替换)，第二Fab分子的Fab轻链恒定区继而与第一Fc域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))，(ii)该第二 Fab分子的交换Fab轻链多肽，其中该第二Fab分子的Fab轻链可变区与该第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2))，(iii)该第一Fab 分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))，(iv)如下的多肽，其中第三Fab分子的Fab 重链与第二Fc域亚基共享羧基末端肽键(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))和(v) 该第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施方案中，该第一和该第三Fab分子的Fab轻链多肽是相同的。在某些实施方案中，该多肽是共价连接的，例如通过二硫键。在某些实施方案中，该第一和该第三Fab分子结合CEA，且该第二Fab分子结合CD3。
在一个实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含包含与SEQ ID NO:52的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一的序列的多肽，包含与SEQ IDNO:53的序列至少80％，85％，90％，95％， 96％，97％，98％，或99％同一的序列的多肽，包含与SEQ ID NO:54的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一的序列的多肽，和包含与SEQ ID NO:55的序列至少80％，85％，90％，95％，96％， 97％，98％，或99％同一的序列的多肽。在一个实施方案中，该双特异性抗体包含包含SEQ ID NO:52的序列的多肽，包含SEQ ID NO:53的序列的多肽，包含SEQ ID NO:54的序列的多肽，和包含SEQID NO:55的序列的多肽。
Fc域
本发明中使用的抗CEA/抗CD3双特异性抗体可包含Fc域，其由一对包含抗体分子的重链域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体，其每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定域。该Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。
在一个实施方案中，该Fc域是IgG Fc域。在一个特定的实施方案中，该Fc域是IgG1Fc域。在另一个实施方案中，该Fc域是IgG4Fc域。在一个更加具体的实施方案中，该Fc域是包含位置S228(EU编号方式)处的氨基酸替代，特别是氨基酸替代S228P的IgG4Fc域。此氨基酸替代降低IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch et al.,Drug Metabolismand Disposition 38: 84-91(2010))。在又一个特定的实施方案中，该Fc域是人的。人IgG1Fc区的一种例示性序列在SEQ ID NO:57中给出。
促进异二聚化的Fc域修饰
本发明中使用的抗CEA/抗CD3双特异性抗体可包含不同构件(例如抗原结合域)，其融合至该Fc域的两个亚基之一或另一，如此该Fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致该两种多肽的数种可能组合。为了改善重组生成中此类抗体的产量和纯度，因而在该抗体的Fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。
因而，在特定的实施方案中，该Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在该Fc域的CH3域中。
存在数种办法来修饰该Fc域的CH3域以加强异二聚化，其详细记载于例如WO 96/27011，WO 98/050431，EP 1870459，WO 2007/110205，WO 2007/147901，WO 2009/089004，WO2010/129304，WO 2011/90754，WO 2011/143545，WO 2012058768，WO 2013157954，WO2013096291。典型地，在所有此类办法中，该Fc域的第一亚基的CH3域和该Fc域的第二亚基的CH3 域二者以互补方式进行工程化改造使得每个CH3域(或包含它的重链)不再能与其自身同二聚化但被迫与互补工程化改造的其它CH3域异二聚化(使得该第一和第二CH3域异二聚化且两个该第一或两个该第二CH3域之间不形成同二聚体)。
在一个具体的实施方案中，所述促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰是所谓的“节-入-穴”修饰，其包含Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和Fc 域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。
节-入-穴技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,ProtEng 9:617-621(1996)及Carter,J Immunol Meth 248:7-15(2001)。一般地，该方法牵涉引入第一多肽的界面处d隆起(“节”)并第二多肽的界面中的相应空腔(“穴”)，使得隆起能安置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。
因而，在一个特定的实施方案中，在该Fc域的第一亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成隆起，其可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中，并在该Fc 域的第二亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成空腔，其中可安置第一亚基的 CH3域内的隆起。
优选地，所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，和色氨酸(W)组成的组。
优选地，所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，和缬氨酸(V)组成的组。
可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变，或通过肽合成来生成隆起和空腔。
在一个具体的实施方案中，在该Fc域的第一亚基(“节”亚基)的CH3域中，位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W)，而在该Fc域的第二亚基(“穴”亚基)的CH3域中，位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换 (Y407V)。在一个实施方案中，在该Fc域的第二亚基中，另外，位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(EU编号方式)。
在还有又一个实施方案中，在该Fc域的第一亚基中，另外，位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(E356C)，且在该Fc域的第二亚基中，另外，位置349处的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(EU编号方式)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在该Fc域的两个亚基之间形成二硫桥，进一步稳定该二聚体(Carter,J Immunol Methods 248:7-15(2001))。
在一个特定的实施方案中，该Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和 T366W，且该Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C，T366S，L368A和 Y407V(EU编号方式)。
在一个特定的实施方案中，将本文所述抗CEA/抗CD3双特异性抗体中结合CD3的抗原结合域融合至该Fc域的第一亚基(其包含“节”修饰)。不希望受理论束缚，CD3结合域与Fc域的含节亚基的融合会(进一步)使包含两个 CD3结合域的双特异性抗体的生成最小化(两条含节多肽的空间碰撞)。
涵盖修饰CH3以增强异二聚化的其它技术作为依照本发明的备选，它们描述于例如WO 96/27011，WO 98/050431，EP 1870459，WO 2007/110205， WO 2007/147901，WO 2009/089004，WO 2010/129304，WO 2011/90754， WO 2011/143545，WO 2012/058768，WO 2013/157954，WO 2013/096291。
在一个实施方案中，备选地使用EP 1870459A1中描述的异二聚化办法。此办法基于在Fc域的两个亚基之间的CH3/CH3域界面中的特定氨基酸位置处引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸。一个优选的实施方案是(该Fc域的) 两个CH3域之一中的氨基酸突变R409D；K370E和该Fc域的CH3域之另一中的氨基酸突变D399K；E357K(EU编号方式)。
在另一个实施方案中，该抗体包含该Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变T366W和该Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变T366S，L368A， Y407V，和另外地该Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变R409D；K370E 和该Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变D399K；E357K(EU编号方式)。
在另一个实施方案中，该抗体包含该Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变S354C，T366W和该Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变Y349C， T366S，L368A，Y407V，或该抗体包含该Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变Y349C，T366W和该Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变 S354C，T366S，L368A，Y407V和另外地该Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变R409D；K370E和该Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变 D399K；E357K(所有编号依照EU编号方式)。
在一个实施方案中，备选地使用WO 2013/157953中描述的异二聚化办法。在一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变T366K且第二CH3域包含氨基酸突变L351D(EU编号方式)。在又一个实施方案中，该第一CH3域进一步包含氨基酸突变L351K。在又一个实施方案中，该第二CH3域进一步包含选自Y349E，Y349D和L368E的氨基酸突变(优选L368E)(EU编号方式)。
在一个实施方案中，备选地使用WO 2012/058768中描述的异二聚化办法。在一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变L351Y，Y407A且第二 CH3域包含氨基酸突变T366A，K409F。在又一个实施方案中，该第二CH3 域进一步包含位置T411，D399，S400，F405，N390，或K392处的氨基酸突变，例如选自a)T411N，T411R，T411Q，T411K，T411D，T411E或T411W， b)D399R，D399W，D399Y或D399K，c)S400E，S400D，S400R，或S400K， d)F405I，F405M，F405T，F405S，F405V或F405W，e)N390R，N390K或 N390D，f)K392V，K392M，K392R，K392L，K392F或K392E(EU编号方式)。在又一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变L351Y，Y407A且第二CH3 域包含氨基酸突变T366V，K409F。在又一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366A，K409F。在又一个实施方案中，该第二CH3域进一步包含氨基酸突变K392E，T411E，D399R 和S400R(EU编号方式)。
在一个实施方案中，备选地使用WO 2011/143545中描述的异二聚化办法，例如凭借选自由368和409组成的组的位置处的氨基酸修饰(EU编号方式)。
在一个实施方案中，备选地使用WO2011/090762中描述的异二聚化办法，其也使用上文描述的节-入-穴技术。在一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变T366W且第二CH3域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变T366Y且第二CH3域包含氨基酸突变Y407T (EU编号方式)。
在一个实施方案中，该抗体或它的Fc域是IgG2亚类的且备选地使用WO 2010/129304中描述的异二聚化办法。
在一个备选的实施方案中，促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostatic steering effect)的修饰，例如如PCT公开文本 WO 2009/089004中描述的。一般地，此方法牵涉将在两个Fc域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而同二聚体形成变成在静电上不利于的但异二聚化变成在静电上有利的。在一个此类实施方案中，第一CH3域包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D))对 K392或N392的氨基酸替代(优选K392D或N392D)且第二CH3域包含带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R))对D399，E356，D356，或E357的氨基酸替代(优选D399K，E356K，D356K，或E357K，更优选D399K和E356K)。在又一个实施方案中，该第一CH3域进一步包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D))对K409或R409的氨基酸替代(优选K409D或R409D)。在又一个实施方案中，该第一CH3域进一步或备选地包含带负电荷的氨基酸 (例如谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D))对K439和/或K370的氨基酸替代(所有编号依照EU编号方式)。
在还有又一个实施方案中，备选地使用WO 2007/147901中描述的异二聚化办法。在一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变K253E，D282K，和K322D且第二CH3域包含氨基酸突变D239K，E240K，和K292D(EU编号方式)。
在仍有另一个实施方案中，可以备选地使用WO 2007/110205中描述的异二聚化办法。
在一个实施方案中，该Fc域的第一亚基包含氨基酸替代K392D和 K409D，且该Fc域的第二亚基包含氨基酸替代D356K和D399K(EU编号方式)。
降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰
该Fc域赋予抗体，诸如双特异性抗体以有利的药动学特性，包括长血清半衰期，其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分布比。然而，同时它可能导致不想要的抗体对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。此外，Fc受体信号传导途径的共激活可导致细胞因子释放，其与抗体可具有的其它免疫刺激性特性和抗体的长半衰期组合，在系统性施用后导致细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。
因而，在特定的实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的Fc域展现与天然IgG1Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个此类实施方案中，该Fc域(或包含所述Fc域的分子，例如抗体)展现与天然IgG1Fc域(或包含天然IgG1Fc域的相应分子)相比小于50％，优选小于20％，更优选小于10％且最优选小于5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG1Fc域(或包含天然IgG1Fc域的相应分子)相比小于50％，优选小于 20％，更优选小于10％且最优选小于5％的效应器功能。在一个实施方案中，该Fc域(或包含所述Fc域的分子，例如抗体)并不实质性结合Fc受体和/ 或诱导效应器功能。在一个特定的实施方案中，该Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，该Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，该Fc受体是激活性Fc受体。在一个具体的实施方案中，该Fc受体是激活性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa，FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，该效应器功能是选自CDC，ADCC，ADCP，和细胞因子分泌的组的一项或多项。在一个特定的实施方案中，该效应器功能是ADCC。在一个实施方案中，该Fc域展现与天然IgG1Fc域相比实质性相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当该Fc域(或包含所述Fc域的分子，例如抗体)展现大于约70％，特别是大于约80％，更特别是大于约90％的天然IgG1Fc域(或包含天然IgG1Fc域的相应分子)对FcRn的结合亲和力时，实现实质性相似的对FcRn的结合。
在某些实施方案中，该Fc域工程化改造为具有与非工程化改造的Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在特定的实施方案中，该Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。典型地，相同的该一处或多处氨基酸突变存在于该 Fc域的两个亚基的每一个中。在一个实施方案中，该氨基酸突变降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，该氨基酸突变将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍，至少5倍，或至少10倍。在有超过一处降低 Fc域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍，至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施方案中，包含工程化改造的Fc域的分子，例如抗体展现与包含非工程化改造的Fc域的相应分子相比小于20％，特别是小于 10％，更特别是小于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个特定的实施方案中，该Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中，该Fc受体是人Fc受体。在一些实施方案中，该Fc受体是激活性Fc受体。在一个具体的实施方案中，该 Fc受体是激活性人Fcγ受体，更特别是人FcγRIIIa，FcγRI或FcγRIIa，最特别是人FcγRIIIa。优选地，对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些实施方案中，对补体成分的结合亲和力，具体是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当该Fc域(或包含所述Fc域的分子，例如抗体)展现非工程化改造形式的Fc域 (或包含所述非工程化改造形式的Fc域的相应分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现实质性相似的对FcRn的结合，即保留该Fc域对所述受体的结合亲和力。该Fc域或包含所述Fc域的分子，例如抗体可展现大于约 80％和甚至大于约90％的此类亲和力。在某些实施方案中，该Fc域工程化改造成具有与非工程化改造的Fc域相比降低的效应器功能。该降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)，降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)，降低的细胞因子分泌，降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞进行的抗原摄取，降低的对NK细胞的结合，降低的对巨噬细胞的结合，降低的对单核细胞的结合，降低的对多形核细胞的结合，降低的诱导凋亡的直接信号传导，降低的靶物结合的抗体的交联，降低的树突细胞成熟，或降低的T细胞引发。在一个实施方案中，该降低的效应器功能是选自降低的 CDC，降低的ADCC，降低的ADCP，和降低的细胞因子分泌的组的一项或多项。在一个特定的实施方案中，该降低的效应器功能是降低的ADCC。在一个实施方案中，该降低的ADCC是小于20％的由非工程化改造的Fc域(或包含非工程化改造的Fc域的相应分子)诱导的ADCC。
在一个实施方案中，该降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中，该Fc域包含在选自 E233，L234，L235，N297，P331和P329的组的位置处的氨基酸替代(EU编号方式)。在一个更加具体的实施方案中，该Fc域包含在选自L234，L235和 P329的组的位置处的氨基酸替代(EU编号方式)。在一些实施方案中，该Fc 域包含氨基酸替代L234A和L235A(EU编号方式)。在一个此类实施方案中，该Fc域是IgG1Fc域，特别是人IgG1Fc域。在一个实施方案中，该Fc域包含位置P329处的氨基酸替代。在一个更加具体的实施方案中，该氨基酸替代是P329A或P329G，特别是P329G(EU编号方式)。在一个实施方案中，该Fc域包含位置P329处的氨基酸替代和选自E233，L234，L235，N297和 P331的位置处的又一处氨基酸替代(EU编号方式)。在一个更加具体的实施方案中，该又一处氨基酸替代是E233P，L234A，L235A，L235E， N297A，N297D或P331S。在特定的实施方案中，该Fc域包含位置P329， L234和L235处的氨基酸替代(EU编号方式)。在更加特定的实施方案中，该 Fc域包含氨基酸突变L234A，L235A和P329G(“P329G LALA”)。在一个此类实施方案中，该Fc域是IgG1Fc域，特别是人IgG1Fc域。“P329G LALA”氨基酸替代组合几乎完全消除人IgG1Fc域的Fcγ受体(以及补体)结合，如 PCT公开文本no.WO 2012/130831中描述的，通过援引完整并入本文。WO 2012/130831还描述了制备此类突变体Fc域的方法和用于测定它的特性诸如 Fc受体结合或效应器功能的方法。
IgG4抗体展现与IgG1抗体相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此，在一些实施方案中，该Fc域是IgG4Fc域，特别是人IgG4 Fc域。在一个实施方案中，该IgG4Fc域包含位置S228处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P(EU编号方式)。为了进一步降低它对Fc受体的结合亲和力和/或它的效应器功能，在一个实施方案中，该IgG4Fc域包含位置 L235处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代L235E(EU编号方式)。在另一个实施方案中，该IgG4Fc域包含位置P329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代P329G(EU编号方式)。在一个特定的实施方案中，该IgG4Fc域包含位置 S228，L235和P329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P，L235E和 P329G(EU编号方式)。此类IgG4Fc域突变体及其Fcγ受体结合特性描述于 PCT公开文本no.WO 2012/130831，通过援引完整并入本文。
在一个特定的实施方案中，该展现与天然IgG1Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的Fc域是包含氨基酸替代L234A， L235A和任选的P329G的人IgG1Fc域，或包含氨基酸替代S228P，L235E和任选的P329G的人IgG4Fc域(EU编号方式)。
在某些实施方案中，该Fc域的N-糖基化已经消除。在一个此类实施方案中，该Fc域包含位置N297处的氨基酸突变，特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)或甘氨酸(N297G)替换天冬酰胺的氨基酸替代(EU编号方式)。
在上文和PCT公开文本no.WO 2012/130831中描述的Fc域以外，具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238， 265，269，270，297，327和329中一个或多个的替代的(美国专利No. 6,737,056)(EU编号方式)。此类Fc突变体包括具有氨基酸位置265，269， 270，297和327的两个或更多个处的替代的Fc突变体，包括所谓的“DANA” Fc突变体，其具有残基265和297变成丙氨酸的替代(美国专利No. 7,332,581)。
可以使用本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除，替代，插入或修饰来制备突变体Fc域。遗传方法可包括编码DNA序列的位点特异性诱变，PCR，基因合成，等等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。
可以容易地测定对Fc受体的结合，例如通过ELISA或通过使用标准仪器诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR)和诸如可通过重组表达获得的Fc受体进行。或者，可使用已知表达特定Fc受体的细胞系，诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来评估Fc域或包含Fc域的分子对Fc受体的结合亲和力。
可通过本领域已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的分子(例如抗体)的效应器功能。本文中描述了用于测量ADCC的一种合适的测定法。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它例子描述于美国专利No.5,500,362； Hellstrom et al.，Proc Natl AcadSci USA 83:7059-7063(1986)及Hellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA 82:1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337； Bruggemann et al.,J Exp Med 166:1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法 (CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox
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非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如公开于Clynes et al.,Proc Natl Acad Sci USA 95:652-656(1998)的。
在一些实施方案中，该Fc域对补体成分，具体是对C1q的结合是降低的。因而，在该Fc域工程化改造成具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可进行C1q结合测定法来测定该Fc域或包含该Fc域的分子(例如抗体)是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合 ELISA。为了评估补体活化，可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,JImmunol Methods 202:163(1996)；Cragg et al.,Blood 101:1045-1052 (2003)；及Craggand Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。
在一些实施方案中，该双特异性抗体是单链双特异性抗体，其包含第一抗原结合域和第二抗原结合域。在一些实施方案中，该单链双特异性抗体包含选自由(1)VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3，(2) VHCD3-VLCD3-VHCEA-VLCEA，(3)VHCD3-VLCD3-VLCEA-VHCEA，(4)VHCEA-VLCEA-VLCD3-VHCD3，(5)VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3，和(6) VLCD3-VHCD3-VHCEA-VLCEA组成的组的自N端至C端排列的可变区。
IV.抗体制备
使用本领域用来生成抗体的可用技术来制备本文所述抗体，下面各节中更为详细地描述了其例示性方法。
该抗体针对感兴趣抗原(即PD-L1(诸如人PD-L1)，CEA，或CD3(诸如人CD3))。优选地，该抗原是生物学上重要的多肽，而且对罹患病症的哺乳动物施用该抗体能在该哺乳动物中导致治疗益处。
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM，≤150nM，≤100 nM，≤50nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数 (KD)。
在一个实施方案中，KD是通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力 (参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将
Figure BDA0001686871200000711
多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(大约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板 (Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab 混合。然后将感兴趣Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时段(例如约65 个小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20(TWEEN-
Figure BDA0001686871200000721
)洗板8次。板干燥后，添加150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽马计数仪(Packard)上对板计数10分钟。选择各Fab 给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，KD是使用表面等离振子共振测定法使用
Figure BDA0001686871200000722
-2000或
Figure BDA0001686871200000723
-3000(BIAcore,Inc.，Piscataway，NJ)于 25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺 (EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约 0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了动力学测量，于25℃以大约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20 (TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(
Figure BDA0001686871200000724
Evaluation软件版本3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon) 和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)以比率koff/kon计算。参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么可使用荧光淬灭技术来测定结合速率，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯进行的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm， 16nm带通)的升高或降低。
(i)抗原制备
可溶性抗原或其片段(任选缀合有其它分子的)可作为免疫原用于生成抗体。对于跨膜分子，诸如受体，它们的片段(例如受体的胞外结构域)可用作免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可衍生自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是经重组技术转化而表达跨膜分子的细胞。对于制备抗体有用的其它抗原及其形式对于本领域技术人员会是显而易见的。
(ii)某些基于抗体的方法
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烃基，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质缀合可能是有用的，例如匙孔虫戚血蓝蛋白，血清清蛋白，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原，免疫原性缀合物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或缀合物对动物进行加强免疫。7-14 天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/ 或通过不同交联剂缀合得到的缀合物进行加强免疫。缀合物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
单克隆抗体可使用杂交瘤方法来生成，其首先记载于Kohler et al., Nature,256:495(1975)，并进一步记载于例如Hongo et al.,Hybridoma,14(3): 253-260(1995),Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2nd ed.1988)；Hammerling et al.,in:Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981),和Ni, Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)，关于人-人杂交瘤。别的方法包括那些记载于例如U.S.Pat.No.7,189,826的，其关于自杂交瘤细胞系生成单克隆人天然IgM抗体。人杂交瘤技术(三元杂交瘤(Trioma)技术)记载于 Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和 Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
关于各种其它杂交瘤技术，参见例如US 2006/258841；US 2006/183887 (完全人的抗体)；US 2006/059575；US 2005/287149；US 2005/100546； US 2005/026229；和U.S.Pat.Nos.7,078,492和7,153,507。一种使用杂交瘤方法来生成单克隆抗体的例示性方案记载如下。在一个实施方案中，免疫小鼠或其它适宜宿主动物(诸如仓鼠)以引发生成或能够生成会特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射本发明的多肽或其片段和佐剂诸如单磷脂酰脂质A(MPL)/海藻糖二棒分枝菌酸酯(TDM)(Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,Mont.)，在动物中生成抗体。本发明的多肽(例如抗原)或其片段可使用本领域公知方法来制备，诸如重组方法，其中一些在本文中有进一步描述。对来自经免疫动物的血清测定抗抗原抗体，并任选施用加强免疫。自生成抗抗原抗体的动物分离淋巴细胞。或者，在体外免疫淋巴细胞。
然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。参见例如Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986)。可使用高效融合，支持选定的抗体生成细胞稳定地高水平生成抗体，且对培养基诸如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。例示性的骨髓瘤细胞包括但不限于鼠骨髓瘤系，诸如那些衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可得自索尔克(Salk)研究所细胞分发中心, San Diego,Calif.USA)的，及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可得自美国典型培养物保藏中心,Rockville,Md.USA)的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)； Brodeur et al.,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp. 51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，例如含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的培养基。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或 HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的会含有次黄嘌呤，氨基喋呤和胸苷 (HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选地，使用无血清杂交瘤细胞培养方法来降低动物衍生血清的使用，诸如胎牛血清，如记载于例如Evenet al.,Trends in Biotechnology,24(3),105-108(2006)。
作为提高杂交瘤细胞培养物生产力的工具的寡肽记载于Franek,Trends inMonoclonal Antibody Research,111-122(2005)。具体地，标准培养基富含某些氨基酸(丙氨酸，丝氨酸，天冬酰胺，脯氨酸)或蛋白质水解产物级分，而且可通过由3-6个氨基酸残基构成的合成寡肽来显著遏制凋亡。所述肽以毫摩尔或更高浓度存在。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定结合本发明抗原的单克隆抗体的生成。可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Scatchard分析来测定。参见例如Munson et al.,Anal.Biochem.107:220(1980)。
在鉴定得到生成具有期望特异性，亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(参见例如Goding,见上文)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或 RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液，腹水或血清适当分开。一种用于自杂交瘤细胞分离蛋白质的规程记载于US 2005/176122和U.S.Pat.No.6,919,436。该方法包括在结合过程中最低限度地使用盐，诸如易溶盐，而且优选还在洗脱过程中使用少量的有机溶剂。
(iii)文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离在本发明中有用的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库及对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。别的方法综述于例如Hoogenboom et al.,in Methods inMolecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554；Clackson et al.,Nature352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks andBradbury,in Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)； Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol. 340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter et al.,Ann.Rev.Immunol. 12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由 Griffiths et al.,EMBOJ,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373及美国专利公开文本No.2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126， 2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
(iv)嵌合抗体，人源化抗体和人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81:6851-6855(1984)。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如自小鼠，大鼠，仓鼠，家兔，或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如为了恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033 (1989)；美国专利No.5,821,337，No.7,527,791，No.6,982,321，和No. 7,087,409；Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)(记载SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(记载“重修表面”)； Dall’Acqua et al.,Methods 36:43-60(2005)(记载“FR改组”)；及Osbourn et al., Methods 36:61-68(2005)及Klimka et al.,Br.J.Cancer 83:252-260(2000)(记载 FR改组的“引导选择”办法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(参见例如Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(参见例如Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；及Presta et al.,J. Immunol.151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro andFransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(参见例如Baca et al.,J.Biol.Chem. 272:10678-10684(1997)及Rosok et al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618 (1996))。
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin. Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有整个或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利No.6,075,181和No.6,150,584，其描述了 XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了
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技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M
Figure BDA0001686871200000781
技术，和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900，其描述了
Figure BDA0001686871200000782
技术。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor,J. Immunol.133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York, 1987)；及Boerner et al.,J.Immunol.147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-3562 (2006)。其它方法包括那些记载于例如美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)及Ni,XiandaiMianyixue 26(4):265-268 (2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于 Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology 20(3):927-937(2005)及 Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology 27(3):185-91(2005)。
也可以如下生成人抗体，即分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv 克隆可变域序列。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
(v)抗体片段
抗体片段可以通过传统手段来生成，诸如酶促消化，或者通过重组技术来生成。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于到达实体瘤。某些抗体片段的综述参见Hudson et al.(2003)Nat.Med.9:129-134。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)；及Brennan et al.,Science 229:81 (1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab，Fv和scFv 抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。包含补救受体结合表位残基，具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及 5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点，缺少恒定区的唯一类型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering,Borrebaeck编,见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)多特异性抗体
多特异性抗体具有对至少两种不同表位的结合特异性，其中所述表位通常来自不同抗原。尽管此类分子通常只结合两种不同表位(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。
用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein etal.,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO 93/08829及Traunecker et al.,EMBO J.,10:3655-3659(1991)。
本领域已知的用于生成双特异性抗体的一种办法是“节-入-穴”或“隆起- 入-空腔”办法(参见例如美国专利No.5,731,168)。在这种办法中，两条免疫球蛋白多肽(例如重链多肽)各自包含一个界面。一条免疫球蛋白多肽的界面与另一免疫球蛋白多肽上的对应界面相互作用，由此容许两条免疫球蛋白多肽联合。可以改造这些界面，使得位于一条免疫球蛋白多肽的界面中的“节”或“隆起”(这些术语在本文中可互换使用)对应于位于另一免疫球蛋白多肽的界面中的“穴”或“空腔”(这些术语在本文中可互换使用)。在一些实施方案中，穴具有与节相同或相似的尺寸，而且位置恰当，使得当两个界面相互作用时，一个界面的节可位于另一界面的对应穴中。不希望受理论束缚，认为这稳定异二聚体且有利于异多聚体形成胜过其它种类，例如同多聚体。在一些实施方案中，这种办法可用于促进两种不同免疫球蛋白多肽的异多聚化，创建包含具有针对不同表位的结合特异性的两条免疫球蛋白多肽的双特异性抗体。
在一些实施方案中，节可以通过将小氨基酸侧链用更大侧链替换来构建。在一些实施方案中，穴可以通过将大氨基酸侧链用更小侧链替换来构建。节或穴可以存在于原始界面中，或者可以合成引入。例如，可以通过改变编码界面的核酸序列，将至少一个“原始”氨基酸残基用至少一个“输入”氨基酸残基替换来合成引入节或穴。用于改变核酸序列的方法可包括本领域公知的标准分子生物学技术。下文表中显示了各种氨基酸残基的侧链体积。在一些实施方案中，原始残基具有较小侧链体积(例如丙氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，或缬氨酸)，而用于形成节的输入残基是天然发生氨基酸，而且可以包括精氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸。在一些实施方案中，原始残基具有较大侧链体积(例如精氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸)，而用于形成穴的输入残基是天然发生氨基酸，而且可以包括丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，和缬氨酸。
表1：氨基酸残基的特性
Figure BDA0001686871200000801
Figure BDA0001686871200000811
a氨基酸的分子量减去水的分子量。数值来自Handbook of Chemistry andPhysics,43rd ed.,Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961。
b数值来自A.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972。
c数值来自C.Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975。可及表面积在此参考文献的图6-20定义。
在一些实施方案中，基于异多聚体的三维结构鉴定用于形成节或穴的原始残基。本领域已知的用于获得三维结构的技术可以包括X射线结晶学和 NMR。在一些实施方案中，界面是免疫球蛋白恒定域的CH3域。在这些实施方案中，人IgG1的CH3/CH3界面涉及每个域上位于四条反平行β链上的16 个残基。不希望受理论束缚，突变的残基优选位于两条中央反平行β链上以最小化节会被周围溶剂，而非配偶CH3域中的补充穴容纳的风险。在一些实施方案中，两条免疫球蛋白多肽中形成对应节和穴的突变对应于下文表中提供的一对或多对。
表2：对应节和穴形成突变的例示性套组
Figure BDA0001686871200000812
Figure BDA0001686871200000821
通过原始残基，接着是使用EU编号系统的位置，然后是输入残基来表示突变(所有残基以单字母氨基酸代码给出)。多重突变以冒号分开。
在一些实施方案中，免疫球蛋白多肽包含包含一处或多处上文表2中列出的氨基酸替代的CH3域。在一些实施方案中，双特异性抗体包含第一免疫球蛋白多肽，其包含包含一处或多处表2左栏中列出的氨基酸替代的CH3 域，和第二免疫球蛋白多肽，其包含包含一处或多处表2右栏中列出的对应氨基酸替代的CH3域。
如上所述突变DNA后，可以使用标准重组技术和本领域已知的细胞系统，表达编码具有一处或多处对应节或穴形成突变的经修饰免疫球蛋白多肽的多核苷酸，并纯化。参见例如美国专利No.5,731,168；5,807,706； 5,821,333；7,642,228；7,695,936；8,216,805；美国公开文本No. 2013/0089553；和Spiess et al.,Nature Biotechnology 31:753-758,2013。可以使用原核宿主细胞，诸如大肠杆菌，或真核宿主细胞，诸如CHO细胞生成经修饰免疫球蛋白多肽。可以作为异多聚体一起在共培养物中在宿主细胞中表达携带对应节和穴的免疫球蛋白多肽，并纯化，或者可以在多个单培养物中表达，分开纯化，并在体外组装。在一些实施方案中，使用本领域已知的标准细菌培养技术共培养两株细菌宿主细胞(一株表达具有节的免疫球蛋白多肽，另一株表达具有穴的免疫球蛋白多肽)。在一些实施方案中，可以以特定比例混合两种株，例如为了在培养物中实现相等的表达水平。在一些实施方案中，可以以50:50，60:40，或70:30比例混合两种株。在多肽表达后，可以一起裂解细胞，并可以提取蛋白质。本领域已知的容许测量同多聚体对异多聚体种类丰度的标准技术可以包括大小排阻层析。在一些实施方案中，使用标准重组技术分开表达每一种经修饰免疫球蛋白多肽，并可以在体外将它们组装到一起。可以例如通过纯化每一种经修饰免疫球蛋白多肽，以相等的质量将它们一起混合并温育，还原二硫化物(例如通过用二硫苏糖醇处理)，浓缩，并重氧化多肽来实现组装。可以使用标准技术(包括阳离子交换层析)来纯化形成的双特异性抗体，并使用标准技术 (包括大小排阻层析)来测量。对于这些方法更加详细的描述，参见Spiess et al.,Nat Biotechnol 31:753-8,2013。在一些实施方案中，可以在CHO细胞中分开表达经修饰免疫球蛋白多肽，并使用上文所述方法在体外组装。
依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点) 的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链，CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。通常在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO 94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.,Methods in Enzymology,121:210(1986)。
依照WO96/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。一种界面包含抗体恒定域的至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源缀合的”抗体。例如，可以将异源缀合物中的一种抗体与亲合素偶联，而将另一种抗体与生物素偶联。此类抗体已经建议用于例如将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No. 4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO 91/00360,WO 92/200373,和EP 03089)。异源缀合抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的，而且披露于美国专利No.4,676,980。
文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.,Science,229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab'片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种 Fab'片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。
还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.,J. Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993) 记载的“双抗体”技术提供了生成双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体生成双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994)。
用于生成双特异性抗体片段的另一种技术是“双特异性T细胞衔接器”(engager)或
Figure BDA0001686871200000841
办法(参见例如WO2004/106381，WO2005/061547， WO2007/042261，和WO2008/119567)。这种办法利用在单一多肽上排列的两种抗体可变域。例如，单一多肽链包括两个单链Fv(scFv)片段，每个具有由多肽接头分开的一个可变重链(VH)域和一个可变轻链(VL)域，多肽接头的长度足以容许两个域之间的分子内联合。此单一多肽进一步包括两个 scFv片段之间的多肽间隔物序列。每个scFv识别不同的表位，而且这些表位可以是不同细胞类型特异性的，使得当每种scFv啮合其关联表位时两种不同细胞类型的细胞变成紧密接近或系留。这种办法的一个具体实施方案包括识别由免疫细胞表达的细胞表面抗原(例如T细胞上的CD3多肽)的scFv 连接识别由靶细胞(诸如恶性或肿瘤细胞)表达的细胞表面抗原的另一 scFv。
因为它是单一多肽，所以双特异性T细胞衔接器可以使用本领域已知的任何原核或真核细胞表达系统(例如CHO细胞系)来表达。然而，特定纯化技术(参见例如EP1691833)对于分开单体双特异性T细胞衔接器与其它多聚体种类(其可能具有与单体的预定活性不同的生物学活性)可能是必需的。在一种例示性纯化方案中，首先对含有分泌多肽的溶液进行金属亲和层析，并用咪唑浓度的梯度洗脱多肽。使用阴离子交换层析进一步纯化此洗出液，并使用氯化钠浓度的梯度洗脱多肽。最后，对此洗出液进行大小排阻层析以分开单体与多聚体种类。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tuft et al.,J.Immunol.,147:60(1991)。
(vii)单域抗体
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或者整个或部分轻链可变域的单一多肽链。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis, Inc.,Waltham,Mass.；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。
(viii)抗体变体
在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以是通过将适宜的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除，插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序列。
(ix)替代，插入，和删除变体
在某些实施方案中，提供具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表3：例示性替代
初始残基 例示性替代 优选的替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
a.疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
b.中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
c.酸性的：Asp，Glu；
d.碱性的：His，Lys，Arg；
e.影响链取向的残基：Gly，Pro；
f.芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种例示性替代变体是亲和力成熟抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中做出变化(例如替代)，例如为了改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或 SDR(a-CDR)中做出此类变化，对所得变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom et al.,in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)任一将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的办法，其中将数个HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代，插入，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR 中做出保守变化(例如保守替代，如本文中提供的)，其没有实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR以外。在上文提供的变体VH 和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或是未改变的，或是含有不多于 1，2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如记载于Cunningham and Wells,Science,244:1081-1085 (1989)。在这种方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg，asp，his，lys，和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原之间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
(x)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变附着于Fc区的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright et al.,TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖，N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的 GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改良特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供包含如下Fc区的抗体变体，其中附着于Fc区的碳水化合物结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，这可改善ADCC功能。具体而言，本文中涵盖如下的抗体，其具有相对于在野生型CHO细胞中生成的相同抗体上岩藻糖的量减少的岩藻糖。就是说，它们特征在于具有比如果由天然CHO细胞(例如生成天然糖基化样式的CHO细胞，诸如含有天然 FUT8基因的CHO细胞)生成的话它们会具有的量降低的量的岩藻糖。在某些实施方案中，该抗体是如下的抗体，其上少于约50％，40％，30％， 20％，10％，或5％的N连接的聚糖包含岩藻糖。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。在某些实施方案中，该抗体是如下的抗体，其上无一N连接的聚糖包含岩藻糖，即其中该抗体完全没有岩藻糖，或者没有岩藻糖或是无岩藻糖基化的。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过 MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而， Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的 ADCC功能。参见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta,L.)； US 2004/0093621(Kyowa HakkoKogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282； US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO 2002/031140； Okazaki et al.,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al., Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka et al.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No US 2003/0157108A1,Presta, L；及WO2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见例如 Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.et al., Biotechnol.Bioeng.94(4):680-688(2006)；及WO 2003/085107)。
进一步提供具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc来两分的。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；US 2005/0123546(Umana等)；及Ferrara et al.,Biotechnology andBioengineering, 93(5):851-861(2006)。还提供在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)。
在某些实施方案中，包含本文所述Fc区的抗体变体能够结合FcγRIII。在某些实施方案中，包含本文所述Fc区的抗体变体在人效应细胞存在下具有ADCC活性或在人效应细胞存在下具有与包含人野生型IgG1Fc区的其它方面相同的抗体相比升高的ADCC活性。
(xi)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1，IgG2，IgG3 或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏 FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导 ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和 FcγRIII。在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464 页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(参见例如 Hellstrom,I.et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及 Hellstrom,I.et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337 (参见Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.，Mountain View，CA；和CytoTox
Figure BDA0001686871200000901
非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合 ELISA。为了评估补体活化，可以实施CDC测定法(参见例如 Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.et al., Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol. 18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238，265，269， 270，297，327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(参见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312；及Shields et al.,J.Biol.Chem. 9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代(例如Fc区位置298，333，和/或334(EU残基编号方式)的替代)的Fc 区。在一个例示性实施方案中，抗体在它的Fc区中包含下述氨基酸替代： S298A，E333A，和K334A。
在一些实施方案中，在Fc区中做出改变，其导致改变的(即改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551；WO 99/51642；及Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184 (2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG 转移至胎儿(Guyer etal.,J.Immunol.117:587(1976)及Kim et al.,J.Immunol. 24:249(1994))。那些抗体包含具有改善Fc区对FcRn的结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238，256，265，272，286， 303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的一处或多处具有替代(例如Fc区残基434的替代) 的(美国专利No.7,371,826)。还可参见Duncan and Winter,Nature 322:738-40 (1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
(xii)抗体衍生物
可进一步修饰在本发明中使用的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。在某些实施方案中，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇 (PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三口恶烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能，抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
(xiii)载体，宿主细胞，和重组方法
也可以使用重组方法来生成抗体。为了重组生产抗抗原抗体，分离编码抗体的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规规程容易的分离编码抗体的DNA并测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列，复制起点，一种或多种标志基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列。
(a)信号序列构件
抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽重组生产，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(例如受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列，α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)，或酸性磷酸酶前导序列，白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列，或WO90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
(b)复制起点
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌，酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40，多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。
(c)选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素，新霉素，甲氨蝶呤，或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素，霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取抗体编码核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR，谷氨酰胺合酶(GS)，胸苷激酶，金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。
例如，通过将转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR基因转化的细胞。在这些条件下， DHFR基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可使用内源DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
或者，通过将转化子在含有L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Msx)(L-methioninesulfoximine)(GS的一种抑制剂)的培养基中进行培养来鉴定经GS基因转化的细胞。在这些条件下，GS基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可以与上文描述的DHFR选择/扩增系统组合地使用GS选择/扩增系统。
或者，可以通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素，新霉素，或G418的培养基中的细胞生长来选择经编码感兴趣抗体，野生型DHFR基因，和另一种选择标志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶 (APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利4,965,199。
适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因 (Stinchcomb etal.,Nature 282:39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones, Genetics 85:12(1977).酵母宿主细胞基因组中存在trp1损害随之提供了用于通过在不存在色氨酸下生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2 基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van denBerg,Bio/Technology 8:135(1990)。还披露了适用于通过克鲁维氏酵母属的工业菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer et al.,Bio/Technology 9:968-975(1991)。
(d)启动子构件
表达和克隆载体一般包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码抗体的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子，β- 内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶启动子，色氨酸(trp)启动子系统，和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗体的DNA可操作连接的 Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT 区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适地插入真核表达载体。
适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，与氮代谢有关的降解酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。
抗体在哺乳动物宿主细胞中自载体的转录可通过例如从病毒诸如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(诸如腺病毒2)，牛乳头瘤病毒，禽类肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙肝病毒，猿猴病毒40(SV40)基因组，或从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及从热休克启动子获得的启动子来控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No. 4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes etal., Nature 297:598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(e)增强子元件构件
常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白，弹性蛋白酶，清蛋白，甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子，和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，位于抗体编码序列的5'或3' 位置，但是优选位于启动子的5'位点。
(f)转录终止构件
用于真核宿主细胞(酵母，真菌，昆虫，植物，动物，人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中披露的表达载体。
(g)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物，酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia) 例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形菌属(Proteus)，沙门氏菌属 (Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属 (Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
可以在细菌中生产全长抗体，抗体融合蛋白，和抗体片段，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如在将治疗性抗体缀合至自身在肿瘤细胞破坏方面显示出效力的细胞毒剂(例如毒素)时。全长抗体在循环中具有较长的半衰期。大肠杆菌中的生成是较快的且较合算的。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利No.5,648,237(Carteret.al.),美国专利No..5,789,199(Joly et al.),美国专利No.5,840,523(Simmons etal.),其描述了使表达和分泌优化的翻译起始区(TIR)和信号序列。还可参见Charlton,Methods in Molecular Biology,卷248(B.K.C.Lo,编,Humana Press,Totowa, NJ,2003),pp.245-254,其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段。表达后，可以在可溶性级分中自大肠杆菌细胞浆液分离抗体，并可以通过例如蛋白A或 G柱(取决于同种型)来纯化抗体。可以实施最终的纯化，其类似于用于纯化在例如CHO细胞中表达的抗体的工艺。
在原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。啤酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可获得许多其它属，种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)，保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)，威克克鲁维酵母(K. wickeramii)(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，果蝇克鲁维酵母(K. drosophilarum)(ATCC 36,906)，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉 (Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，弯颈霉属 (Tolypocladium)，和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。关于讨论酵母和丝状真菌用于生产治疗性蛋白质的用途的综述参见例如Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)。
可选择如下的某些真菌和酵母株，其中糖基化途径已经“人源化”，导致具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的生成。参见例如Li et al.,Nat. Biotech.24:210-215(2006)(记载了巴斯德毕赤氏酵母中糖基化途径的人源化)；及Gerngross et al.,见上文。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5 株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
还可利用棉，玉米，马铃薯，大豆，矮牵牛，番茄，浮萍 (Leninaceae)，苜蓿(M.truncatula)，和烟草的植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；6,040,498；6,420,548；7,125,978；和 6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
可使用脊椎动物细胞作为宿主，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCCCRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4,Mather,Biol. Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1,ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCCCCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562,ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad. Sci.383:44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，诸如NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参阅例如Yazakiand Wu,Methods in Molecular Biology,卷248 (B.K.C.Lo,编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.255-268。
用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子，选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
(h)培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)，极限必需培养基(MEM,Sigma)，RPMI-1640 (Sigma)，和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM,Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255 (1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或 5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素，运铁蛋白或表皮生长因子)，盐(诸如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲剂(诸如 HEPES)，核苷酸(诸如腺苷和胸苷)，抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)，痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件(诸如温度，pH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
(xiv)抗体的纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内，在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter et al., Bio/Technology 10:163-167(1992)记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)，EDTA和苯甲基磺酰氟 (PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么一般首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon 或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析，疏水相互作用层析，凝胶电泳，透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中亲和层析是通常优选的纯化步骤之一。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体 (Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.,EMBO J.5:1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker, Phillipsburg,NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级，乙醇沉淀，反相HPLC，硅土上的层析，肝素SEPHAROSETM上的层析，阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析，层析聚焦，SDS-PAGE，和硫酸铵沉淀。
一般而言，用于制备供研究，测试，和临床中使用的抗体的各种方法学是本领域完善建立的，与上文所述方法学一致，和/或是本领域技术人员认为适合于特定的感兴趣抗体的。
C.选择生物学活性抗体
可以将如上文所述生成的抗体提交一项或多项“生物学活性”测定法以选择从治疗前景看具有有益特性的抗体或选择保留抗体的生物学活性的配制剂和条件。可以对抗体测试它结合抗原(该抗体就是针对该抗原生成的)的能力。例如，可以使用本领域已知的方法(诸如ELISA，Western印迹，等)。
例如，对于抗PD-L1抗体，可以在检测结合PD-L1的能力的测定法中评估抗体的抗原结合特性。在一些实施方案中，例如，可以通过饱和结合； ELISA；和/或竞争测定法(例如RIA)来测定抗体的结合。还有，可以将抗体提交其它生物学活性测定法，例如为了评估它作为治疗剂的有效性。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于靶抗原和抗体的预定用途。例如，可以在CD8+ T细胞，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)小鼠模型和/或同基因肿瘤模型中评估通过抗体阻断PD-L1的生物学效果，例如如美国专利 8,217,149中描述的。
为了筛选结合感兴趣抗原上的特定表位的抗体(例如那些阻断实施例的抗PD-L1抗体结合PD-L1的)，可以实施常规交叉阻断测定法，诸如 Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的。或者，可以实施表位作图来测定抗体是否结合感兴趣表位，例如如Champe et al.,J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995) 中描述的。
D.药物组合物和配制剂
本文中还提供的是包含本文所述抗体(诸如抗PD-L1抗体，或结合CEA 和CD3的双特异性抗体)和/或PD-1轴结合拮抗剂和药学可接受载剂的药物组合物和配制剂。
可以通过混合具有期望纯度的活性组分(例如PD-1轴结合拮抗剂和/或抗 CEA/抗CD3双特异性抗体)与一种或多种任选的药学可接受载剂 (Remington’s PharmaceuticalSciences，第16版，Osol,A.编(1980))以冻干配制剂或水溶液的形式制备如本文中描述的药物组合物和配制剂。一般地，药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA0001686871200001011
Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20描述于美国专利公开文本No. 2005/0260186和2006/0104968。在一个方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性冻干抗体配制剂描述于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些描述于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的组合物和配制剂还可含有超过一种所治疗特定适应症所必需的活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。合适地是，此类活性组分以对于预定目的有效的量组合存在。
活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中 (例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质处于成形物品的形式，例如膜，或微胶囊。要用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
IV.治疗方法
本文中提供的是用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体。在一些实施方案中，该治疗在治疗后在该个体中导致响应。在一些实施方案中，该响应是部分响应。在一些实施方案中，该响应是完全响应。在一些实施方案中，该治疗在该治疗停止后在该个体中导致持久响应(例如持久部分响应或完全响应)。本文所述方法可用于治疗期望增强免疫原性的状况，诸如为了治疗癌症提高肿瘤免疫原性。本文中还提供的是在具有癌症的个体中增强免疫功能的方法，其包括对该个体施用有效量的PD-1轴结合拮抗剂(例如MPDL3280A)和抗CEA/抗CD3双特异性抗体(例如CEA TCB)。
在一些情况中，本文中提供的方法包括施用有效量的选自由PD-1结合拮抗剂，PD-L1结合拮抗剂，和PD-L2结合拮抗剂组成的组的PD-1轴结合拮抗剂。在一些情况中，该PD-L1结合拮抗剂是抗体，诸如能够抑制PD-L1结合PD-1和B7.1，但是不破坏PD-1结合PD-L2的抗体。在一些情况中，该 PD-L1结合拮抗性抗体是MPDL3280A，其可以以约800mg至约1500mg每三周(例如约1000mg至约1300mg每三周，例如约1100mg至约1200mg每三周) 的剂量施用。在一些实施方案中，MPDL3280A以约1200mg每三周的剂量施用。
作为一般性建议，可施用于人的PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体，例如MPDL3280A)的治疗有效量会在约0.01至约50mg/kg患者体重的范围中，无论是通过一次或多次施用。在一些实施方案中，例如，该拮抗剂 (例如抗PD-L1抗体，例如MPDL3280A)以例如每天施用约0.01至约45 mg/kg，约0.01至约40mg/kg，约0.01至约35mg/kg，约0.01至约30mg/kg，约0.01至约25mg/kg，约0.01至约20mg/kg，约0.01至约15mg/kg，约0.01至约10mg/kg，约0.01至约5mg/kg，或约0.01至约1mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，该拮抗剂(例如抗PD-L1抗体，例如MPDL3280A)以15mg/kg 施用。然而，其它剂量方案可能是有用的。在一个实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体，例如MPDL3280A)以约100mg，约200mg，约300mg，约400mg，约500mg，约600mg，约700mg，约800mg，约900 mg，约1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg，约1400mg，或约 1500mg的剂量施用于人。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂(例如抗 PD-L1抗体，例如MPDL3280A)以约1150mg至约1250mg每三周的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体，例如 MPDL3280A)以约1200mg每三周的剂量施用。该剂量可以作为单剂或作为多剂(例如2或3剂)施用，诸如输注。该抗体在组合治疗中施用的剂量可以与单一治疗相比降低。在一些实施方案中，例如，该用于在个体中治疗癌症或延迟其进展的方法包括包含如下治疗周期的剂量给药方案，其中对该个体在每个周期的第1天以约1200mg的剂量施用人PD-1轴结合拮抗剂(例如抗 PD-L1抗体，例如MPDL3280A)，其中每个周期是21天(即每21天重复每个周期)。此疗法的进展易于通过常规技术来监测。
在一些情况中，本文中提供的方法包括施用有效量的抗CEA/抗CD3双特异性抗体(例如CEA TCB)。在一些情况中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体(例如CEA TCB)以约5mg至约400mg每周(例如约10mg至约60mg每周，例如约10mg至约40mg每周，例如约80mg至约200mg每周，例如约80mg 至约400mg每周，或例如约160mg至400mg每周)的剂量施用于该个体。在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体(例如CEA TCB)以约5 mg，约10mg，约20mg，约40mg，约80mg或约160mg每周的剂量施用。作为一般性建议，抗CEA/抗CD3双特异性抗体(例如CEA TCB)施用于人的治疗有效量会在约5至约400mg的范围中(例如约5mg，约10mg，约15mg，约20mg，约25mg，约30mg，约35mg，约40mg，约45mg，约50 mg，约55mg，约60mg，约65mg，约70mg，约75mg，约80mg，约85 mg，约90mg，约95mg，约100mg，约150mg，约160mg，约200mg，约250mg，约300mg，约350mg，或约400mg)，无论是通过一次或多次施用。例如，在一些实施方案中，施用约5mg，约10mg，约20mg，约40 mg，约80mg或约160mg的CEA TCB。在一些实施方案中，CEA TCB以5 mg，10mg，20mg，40mg，80mg或160mg一周一次施用。在特定的实施方案中，施用至少约80mg的CEA TCB。在一些实施方案中，CEA TCB以 80mg一周一次施用。在一些实施方案中，CEA TCB以80-200mg，80-400 mg或160-400mg一周一次施用。在一些实施方案中，该抗CEA/抗CD3双特异性抗体(例如CEA TCB)可以每周，每2周，每3周，每4周，在每个21天周期的第1，8和15天，或在每个28天周期的第1，8，和15天施用。
在一些情况中，该PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体，例如 MPDL3280A)和该抗CEA/抗CD3双特异性抗体(例如CEA TCB)在一个剂量给药方案中施用。在该剂量给药方案的背景中这些药剂的施用可以是并行的或分开的。例如，在一些情况中，本文中提供的方法包括包含如下治疗周期的剂量给药方案，其中对该个体在每个周期的第1天以约1200mg的剂量施用人PD-1轴结合拮抗剂，并在每个周期的第1，8，和15天以约5mg，约 10mg，约20mg，约40mg，约80mg或约160mg的剂量施用抗CEA/抗CD3 双特异性抗体，每21天重复每个周期。在一个实施方案中，对该个体在每个周期的第1天以约1200mg的剂量施用人PD-1轴结合拮抗剂，并在每个周期的第1，8，和15天以约80mg的剂量施用抗CEA/抗CD3双特异性抗体，每 21天重复每个周期。在一个特定的实施方案中，对该个体在每个周期的第1 天以约1200mg的剂量施用人PD-1轴结合拮抗剂，并在每个周期的第1，8，和15天以至少约80mg的剂量施用抗CEA/抗CD3双特异性抗体，每21天重复每个周期。在仍有又一个实施方案中，对该个体在每个周期的第1天以约 1200mg的剂量施用人PD-1轴结合拮抗剂，并在每个周期的第1，8，和15天以约80mg至约200mg，约80mg至约400mg，或约160mg至约400mg的剂量施用抗CEA/抗CD3双特异性抗体，每21天重复每个周期。
在一些实施方案中，该个体是人。在一些实施方案中，该个体罹患局部晚期或转移性乳腺癌。在一些实施方案中，该个体具有CEA阳性癌症。在一些实施方案中，CEA阳性癌症是结肠癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，乳腺癌，肾癌，食管癌，或前列腺癌。在一个特定的实施方案中，该癌症是结肠直肠癌。在一些实施方案中，该乳腺癌是乳腺癌瘤或乳腺腺癌。在一些实施方案中，该乳腺癌瘤是侵入性导管癌。在一些实施方案中，该肺癌是肺腺癌。在一些实施方案中，该结肠癌是结肠直肠腺癌。在一些实施方案中，该个体中的癌细胞表达PD-L1。在一些实施方案中，该个体中的癌细胞以可检测的(例如使用本领域已知方法可检测的)水平表达CEA蛋白质。
在一些实施方案中，该个体在PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体的组合治疗之前已经用癌症疗法治疗过。在一些实施方案中，该个体具有对一种或多种癌症疗法有抗性的癌症。在一些实施方案中，对癌症疗法的抗性包括癌症的复发或顽固性癌症。复发可以指治疗后在原始部位或新部位癌症的再出现。在一些实施方案中，对癌症疗法的抗性包括用抗癌疗法治疗期间癌症的进展。在一些实施方案中，对癌症疗法的抗性包括不响应治疗的癌症。该癌症可以是在治疗开始时有抗性的，或者它可以在治疗期间变成有抗性的。在一些实施方案中，该癌症处于早期阶段或处于晚期阶段。
在一些实施方案中，本发明的组合疗法包括施用PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体。该PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以以本领域已知的任何合适方式施用。例如，该PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以序贯(在不同时间)或并行(在相同时间)施用。在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂与该抗CEA/抗CD3双特异性抗体在分开的组合物中。在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂与该抗CEA/抗CD3双特异性抗体在同一组合物中。
该PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以通过相同施用路径或通过不同施用路径来施用。在一些实施方案中，静脉内，肌肉内，皮下，表面，口服，经皮，腹膜内，眼窝内，通过植入，通过吸入，鞘内，室内，或鼻内施用该PD-1轴结合拮抗剂。在一些实施方案中，静脉内，肌肉内，皮下，表面，口服，经皮，腹膜内，眼窝内，通过植入，通过吸入，鞘内，室内，或鼻内施用该抗CEA/抗CD3双特异性抗体。可以施用有效量的该PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗CD3双特异性抗体来预防或治疗疾病。该PD-1轴结合拮抗剂和/或该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的适宜剂量可以基于要治疗的疾病的类型，该PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗 CD3双特异性抗体的类型，该疾病的严重程度和过程，该个体的临床状况，该个体的临床史和对该治疗的响应，和主治医师的斟酌来确定。
在一些实施方案中，该方法可进一步包括另外的疗法。该另外的疗法可以是放射疗法，手术(例如乳房肿瘤切除术和乳房切除术)，化学疗法，基因疗法，DNA疗法，病毒疗法，RNA疗法，免疫疗法，骨髓移植，纳米疗法，单克隆抗体疗法，或前述的组合。该另外的疗法可以是辅助或新辅助疗法的形式。在一些实施方案中，该另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗代谢剂。在一些实施方案中，该另外的疗法是施用副作用限制剂(例如旨在减少治疗的副作用的发生和/或减轻治疗的副作用的严重程度的药剂，诸如治恶心药，等)。在一些实施方案中，该另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，该另外的疗法是手术。在一些实施方案中，该另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，该另外的疗法是γ照射。在一些实施方案中，该另外的疗法是靶向PI3K/AKT/mTOR途径的疗法，HSP90 抑制剂，微管蛋白抑制剂，凋亡抑制剂，和/或化学预防剂。该另外的疗法可以是本文所述化疗剂中的一种或多种。
其它组合疗法
本文中还提供的是用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括对该个体施用与另一种抗癌剂或癌症疗法联合的人PD-1轴结合拮抗剂 (例如抗PD-L1抗体，例如MPDL3280A)和抗CEA/抗CD3双特异性抗体(例如 CEA TCB)。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与化疗或化疗剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与放射疗法或放疗剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与靶向疗法或靶向治疗剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与免疫疗法或免疫治疗剂，例如单克隆抗体联合施用。
不希望受理论束缚，认为通过促进激活性共刺激性分子或通过抑制负面共刺激性分子，增强T细胞刺激可促进肿瘤细胞死亡，由此治疗癌症或延迟癌症进展。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与针对激活性共刺激性分子的激动剂联合施用。在一些实施方案中，激活性共刺激性分子可包括CD40，CD226，CD28，OX40，GITR，CD137，CD27，HVEM，或CD127。在一些实施方案中，该针对激活性共刺激性分子的激动剂是结合CD40，CD226，CD28，OX40，GITR， CD137，CD27，HVEM，或CD127的激动性抗体。在一些实施方案中， PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与针对抑制性共刺激性分子的拮抗剂联合施用。在一些实施方案中，抑制性共刺激性分子可包括CTLA-4(也称为CD152)，PD-1，TIM-3，BTLA，VISTA，LAG-3， B7-H3，B7-H4，IDO，TIGIT，MICA/B，或精氨酸酶。在一些实施方案中，该针对抑制性共刺激性分子的拮抗剂是结合CTLA-4，PD-1，TIM-3，BTLA，VISTA，LAG-3，B7-H3，B7-H4，IDO，TIGIT，MICA/B，或精氨酸酶的拮抗性抗体。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与针对CTLA-4(也称为CD152)的拮抗剂，例如阻断性抗体联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂可以与ipilimumab(也称为MDX-010， MDX-101，或
Figure BDA0001686871200001071
)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与tremelimumab(也称为ticilimumab或 CP-675,206)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与针对B7-H3(也称为CD276)的拮抗剂，例如阻断性抗体联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与MGA271联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与针对TGFβ的拮抗剂，例如 metelimumab(也称为CAT-192)，fresolimumab(也称为GC1008)，或 LY2157299联合施用。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与包含过继转移表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(例如细胞毒性T细胞或CTL)的治疗联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/ 抗CD3双特异性抗体可以与包含过继转移包含显性阴性TGFβ受体，例如显性阴性TGFβII型受体的T细胞的治疗联合施用。在一些实施方案中，PD-1 轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与包含HERCREEM方案的治疗(参见例如ClinicalTrials.gov标识符NCT00889954)联合施用。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与针对CD137(也称为TNFRSF9，4-1BB，或ILA)的激动剂，例如活化性抗体联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3 双特异性抗体可以与urelumab(也称为BMS-663513)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与针对CD40 的激动剂，例如活化性抗体联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与CP-870893联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与针对OX40 (也称为CD134)的激动剂，例如活化性抗体联合施用。在一些实施方案中， PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与抗OX40抗体(例如 AgonOX)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗 CD3双特异性抗体可以与针对CD27的激动剂，例如活化性抗体联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂可以与CDX-1127联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与针对吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的拮抗剂联合施用。在一些实施方案中，该IDO拮抗剂是1-甲基-D-色氨酸(也称为1-D-MT)。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与抗体-药物缀合物联合施用。在一些实施方案中，该抗体-药物缀合物包含米他齐(mertansine)或单甲基奥瑞司他汀(auristatin)E(MMAE)。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与抗 NaPi2b抗体-MMAE缀合物(也称为DNIB0600A或RG7599)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与trastuzumab emtansine(也称为T-DM1，ado-trastuzumab emtansine，或
Figure BDA0001686871200001081
Genentech)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与DMUC5754A联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与靶向内皮缩血管肽B受体(EDNBR)的抗体-药物缀合物，例如与MMAE缀合的针对 EDNBR的抗体联合施用。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与血管发生抑制剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂可以与针对VEGF，例如VEGF-A的抗体联合施用。在一些实施方案中， PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与贝伐珠单抗(也称为
Figure BDA0001686871200001082
Genentech)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与针对血管生成素2(也称为Ang2)的抗体联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与MEDI3617联合施用。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与抗肿瘤剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与靶向CSF-1R(也称为M-CSFR或CD115)的药剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与抗CSF-1R(也称为IMC-CS4)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与干扰素，例如干扰素α或干扰素γ联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与Roferon-A(也称为重组干扰素α-2a)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与GM-CSF(也称为重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，rhu GM-CSF，沙格司亭(sargramostim)，或
Figure BDA0001686871200001091
)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与IL-2(也称为阿地白介素(aldesleukin)或
Figure BDA0001686871200001092
)联合施用。在一些实施方案中，PD-1 轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与IL-12联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与靶向 CD20的抗体联合施用。在一些实施方案中，该靶向CD20的抗体是奥努珠单抗(obinutuzumab)(也称为GA101或
Figure BDA0001686871200001093
)或利妥昔单抗(rituximab)。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与靶向GITR的抗体联合施用。在一些实施方案中，该靶向GITR的抗体是 TRX518。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与癌症疫苗联合施用。在一些实施方案中，该癌症疫苗是肽癌症疫苗，其在一些实施方案中是个人化肽疫苗。在一些实施方案中，该肽癌症疫苗是多价长肽，多重肽，肽混合物，杂合肽，或经肽脉冲的树突细胞疫苗 (参见例如Yamada et al.,Cancer Sci.104:14-21,2013)。在一些实施方案中， PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与辅助剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与包含TLR激动剂，例如Poly-ICLC(也称为
Figure BDA0001686871200001094
)，LPS，MPL，或 CpG ODN的治疗联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与肿瘤坏死因子(TNF)α联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与IL-1联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与HMGB1联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与IL-10拮抗剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与IL-4拮抗剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与IL-13拮抗剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与HVEM拮抗剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与ICOS激动剂，例如通过施用ICOS-L，或针对ICOS的激动性抗体联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与靶向CX3CL1的治疗联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与靶向CXCL9的治疗联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与靶向 CXCL10的治疗联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与靶向CCL5的治疗联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂可以与LFA-1或ICAM1激动剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与选择蛋白激动剂联合施用。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与靶向疗法联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与B-Raf的抑制剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与vemurafenib (也称为
Figure BDA0001686871200001101
)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与dabrafenib(也称为
Figure BDA0001686871200001102
)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与厄洛替尼(erlotinib)(也称作
Figure BDA0001686871200001103
)联合施用。在一些实施方案中，PD-1 轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与MEK，诸如MEK1(也称为MAP2K1)或MEK2(也称为MAP2K2)的抑制剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与cobimetinib(也称为GDC-0973或XL-518)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与trametinib(也称为
Figure BDA0001686871200001104
)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与K-Ras的抑制剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与c-Met的抑制剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与onartuzumab (也称为MetMAb)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与Alk的抑制剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与AF802(也称为 CH5424802或alectinib)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与BKM120联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与idelalisib(也称为GS-1101或CAL-101)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与哌立福辛(perifosine)(也称为KRX-0401)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与Akt的抑制剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与MK2206联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与GSK690693联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与GDC-0941联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与mTOR的抑制剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与西罗莫司(sirolimus)(也称为雷帕霉素(rapamycin))联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/ 抗CD3双特异性抗体可以与坦西莫司(temsirolimus)(也称为CCI-779或
Figure BDA0001686871200001111
)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗 CD3双特异性抗体可以与依维莫司(everolimus)(也称为RAD001)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与地磷莫司(ridaforolimus)(也称为AP-23573，MK-8669，或deforolimus)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与OSI-027联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与AZD8055联合施用。在一些实施方案中， PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与INK128联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与双重PI3K/mTOR抑制剂联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与XL765联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与GDC-0980联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与BEZ235(也称为NVP-BEZ235)联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与BGT226联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与GSK2126458联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗 CEA/抗CD3双特异性抗体可以与PF-04691502联合施用。在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体可以与PF-05212384(也称为PKI-587)联合施用。
V.制品或试剂盒
在本发明的另一个实施方案中，提供包含PD-1轴结合拮抗剂和/或抗 CEA/抗CD3双特异性抗体的制品或试剂盒。在一些实施方案中，该制品或试剂盒进一步包含包含说明书的包装插页，该说明书关于与抗CEA/抗CD3 双特异性抗体联合使用该PD-1轴结合拮抗剂来在个体中治疗癌症或延迟癌症进展或增强具有癌症的个体的免疫功能。该制品或试剂盒中可以包括本文所述任何PD-1轴结合拮抗剂和/或抗CEA/抗CD3双特异性抗体。
在一些实施方案中，该PD-1轴结合拮抗剂和该抗CEA/抗CD3双特异性抗体在同一容器或分开的容器中。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，袋和注射器。该容器可以自各种材料形成，诸如玻璃，塑料(诸如聚氯乙烯或聚烯烃)，或金属合金(诸如不锈钢或哈氏合金)。在一些实施方案中，该容器装有该配制剂，而且该容器上或与该容器关联的标签可指示使用说明。该制品或试剂盒可进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料，包括其它缓冲剂，稀释剂，滤器，针头，注射器，和印有使用说明的包装插页。在一些实施方案中，该制品进一步包括一种或多种另一种药剂(例如化疗剂和抗肿瘤剂)。适合于该一种或多种药剂的容器包括例如瓶，管形瓶，袋和注射器。
认为本说明书足以使得本领域技术人员能够实施本发明。根据上述描述，在本文所示和所述之外对本发明的各种修改对本领域技术人员会变得明显且落在所附权利要求的范围内。通过援引将本文中引用的所有出版物，专利，和专利申请完整收入本文用于所有目的。
实施例
通过参考下述实施例，会更加全面地理解本发明。然而，它们不应解释为限制本发明的范围。理解的是，本文中描述的实施例和实施方案只是出于例示目的，而且根据它们，本领域技术人员会想到各种变更和变化，而且它们被包括在本申请的精神和范围及所附权利要求的范围内。
实施例1：在体外CEA TCB介导的肿瘤裂解导致人T细胞上的PD-1和存活的肿瘤细胞上的PD-L1上调
CEA TCB是一种靶向肿瘤细胞上的癌胚抗原(CEA)和T细胞上的CD3的新颖T细胞双特异性抗体。它当前正在作为单一药剂在一项I期研究中在具有晚期和/或转移性CEA表达性肿瘤的患者中进行调查。
与人PBMC一起温育24小时和48小时后评估由CEA TCB介导的CEA表达性MKN-45靶细胞的裂解(E:T 10:1，LDH释放)(图1，A 24小时，B 48小时)。
自得自“Blutspende Zürich”的血沉棕黄层分离PBMC。用PBS 3:1稀释血液。将约30ml血液/PBS混合物在15ml Histopaque上铺层并于室温(RT)以 450g无中断离心30分钟。用10ml移液器将淋巴细胞收集入装有PBS的50ml 管中，用PBS填补至50ml并以350g离心10分钟。丢弃上清液，在50ml PBS 中重悬浮团粒并以300g离心10分钟。清洗步骤重复一次。在含有10％FCS 和1％GlutaMax的RPMI中重悬浮细胞并在温箱中保存于37℃，5％CO2直至测定法启动。
在测定法前1天用胰蛋白酶/EDTA收获贴壁MKN-45靶细胞，清洗并使用平底24孔板以1.4x 106个细胞/孔的密度分配。细胞在增湿温箱中留置贴壁过夜。在测定法那天，将板以350g离心5分钟并吸出培养基。添加550μl 每孔测定培养基(RPMI1640，2％FCS，1％GlutaMax)。
以标示浓度(6.4pM–100nM的范围，一式三份)添加CEA TCB或非靶向TCB。将PBMC添加至靶细胞，最终效应:靶比E:T 10:1，最终体积每孔是 1.1ml。
温育24小时和48小时后通过量化由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液中的LDH(乳酸脱氢酶)(LDH检测试剂盒，Roche Applied Science，#11 644 793 001)来评估靶细胞杀伤。靶细胞的最大裂解(＝100％)通过将靶细胞与1％ Triton X-100一起温育来实现。最小裂解(＝0％)指在没有双特异性抗体的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。使用GraphPadPrism5计算EC50值。
杀伤后，通过流式细胞术评估PD-1受体(CD4+或CD8+ T细胞上的)和 PD-L1(在杀伤中存活的肿瘤细胞上的)的表面表达。
在为了第二个LDH读出取出50μl上清液(48小时时间点)后，将测定板以350g离心5分钟并丢弃上清液。在100μl PBS中重悬浮细胞团粒并转移入圆底96孔板的孔中。用80μlPBS清洗孔并合并此清洗步骤与来自之前步骤的早就转移的上清液。用80μl细胞解离缓冲液(Gibco)使贴壁MKN45细胞脱离并同样转移至FACS板。将板以400g离心4分钟。再次用150μl FACS缓冲液清洗细胞团粒一次。离心(400g，4分钟)后，取出上清液并通过小心漩涡震荡来重悬浮细胞。将每个孔的细胞悬浮液拆分为二并再次离心测定板。每个孔添加25μl抗体混合物(针对CD4，CD8，PD-1(Biolegend，#329920) 和PD-L1(Biolegend#329708)的抗体)。为了去除未结合的抗体，用每个孔 150μl FACS缓冲液清洗细胞两次。离心(400g，4分钟)后，取出上清液并在 120μl FACS缓冲液中重悬浮细胞。
图2展示CD8+(A)和CD4+(B)T细胞上的PD-1受体以及抵抗杀伤的肿瘤细胞上的PD-L1(C)的剂量依赖性上调，在温育48小时后收获。
实施例2：在体内CEA TCB介导的肿瘤裂解导致人T细胞上的PD-1和存活的肿瘤细胞上的PD-L1上调
使用免疫缺陷NOG小鼠中的人结肠癌异种移植物肿瘤模型 (LS174T-fluc2)进行非临床体内药理学研究。使用两种不同实验设置：1)以不同E:T比将肿瘤细胞与人PBMC(皮下[SC])共移植，和2)SC注射肿瘤细胞，接着一旦肿瘤建立(达到可触知块)就腹膜内(IP)转移PBMC。
带有效应细胞共移植的异种移植物实验
以效应:靶比(E:T)5:1共移植LS174T-fluc2细胞与人PBMC后获得的CEA TCB体内功效的结果展示于图3。
当肿瘤/PBMC共移植后1天施用时，两种剂量的CEA TCB(0.5和2.5 mg/kg)均诱导肿瘤消退(图3A)。当共移植后7天施用时，只有较高剂量(2.5 mg/kg)诱导肿瘤消退，而较低剂量(0.5mg/kg)不能诱导肿瘤消退但引起肿瘤生长控制和肿瘤停滞(图3B)。
同一实验结束时收集的肿瘤的组织学分析确认了0.5mg/kg CEA TCB的早期(第1天)处理和2.5mg/kg CEA TCB的延迟(第7天)处理均引起CEA表达性肿瘤细胞的完全消除并导致显著的T细胞浸润入肿瘤中(未显示)。虽然在对照肿瘤(媒介和非靶向MCSP TCB)中检测到肿瘤细胞上的高CEA表达连同可变的T细胞浸润，但是CEA TCB处理(0.5和2.5mg/kg)引起CEA表达性肿瘤细胞的完全消除连同浸润性T细胞填充的坏死/纤维化区域的形成(未显示)。同一肿瘤用抗PD-L1抗体的染色展现与媒介对照相比CEA TCB处理后肿瘤内 PD-L1表达的强诱导(图4)。
带有效应细胞IP转移的异种移植物实验
还在异种移植物模型中评估CEA TCB的体内功效，其中SC注射肿瘤细胞，接着一旦肿瘤达到可触知块就IP转移PBMC。CEA TCB(2.5mg/kg， IV，两周一次)引起显著的肿瘤消退(肿瘤重量减轻，图5)和T细胞浸润入肿瘤中增加(流式细胞术分析(图6)和组织学(未显示))，T细胞具有激活表型(如通过流式细胞术分析显示的，指示CD25和CD69激活标志物上调，未显示)。这与媒介(PBS)和MCSP TCB(非靶向对照)形成对比，其中只有少量的 T细胞浸润肿瘤且显示休眠表型。
另外的研究PD-1和CD69生物标志物的实验显示与媒介相比CEA TCB诱导肿瘤浸润性T细胞上的早期激活标志物CD69和PD-1上调(图7L，箭)。与之对比，两个组中的外周血T细胞均显示休眠表型(图7A-F)。
同一肿瘤用抗PD-L1抗体的染色显示与媒介对照相比CEA TCB处理后肿瘤内PD-L1表达的强诱导。
完全人源化小鼠中的异种移植物实验
在皮下携带CEA表达性MKN45癌细胞系的人源化小鼠模型中体内评估 CEA TCB的抗肿瘤活性。
肿瘤细胞注射后在第11天IV注射CEA TCB(2.5mg/kg，一周两次)，并一周两次通过测径器测量肿瘤生长。图8显示研究结束时的个体肿瘤体积；发现了肿瘤体积的统计学上显著的(p＜0.05)差异。
在肿瘤体积测量以外，在研究结束时(对应于肿瘤细胞注射后32天)收集肿瘤，血液，脾，和淋巴结并通过流式细胞术进行分析。CEA TCB处理导致肿瘤中的人T细胞频率显著升高且改变CD8+/CD4+ T细胞比，有利于 CD8+ T细胞(图9A和B)。在同一时间，CEA TCB处理的肿瘤中的CD4+和 CD8+ T细胞均展现激活表型，通过肿瘤内CD4+和CD8+ T细胞上的CD69和 PD-1表达上调来显示(图9C和D)。CD8+ T细胞揭示细胞内粒酶B(GZB)表达上调以及更高的增殖速率(Ki-67标志物)。CEA TCB处理的动物的脾和血液样品的分析没有显示与媒介相比就T细胞频率，T细胞比，或激活状态而言的任何差异。
如此，由CEA TCB处理触发的免疫学变化是肿瘤特异性的，指示人T细胞的交联和激活唯独在CEA表达性肿瘤中发生且在CEA阴性的其它区域像血液和脾中不发生。
研究结束时收集的肿瘤的组织学分析确认了流式细胞术的结果(未显示)。虽然媒介和CEA TCB处理的组的肿瘤中均表达人CEA，但是CEA TCB 处理显著缩小肿瘤的尺寸。而且，媒介肿瘤显示人免疫细胞的低浸润，大多限于基质区域和肿瘤边界，而CEA TCB处理的组展示强免疫细胞浸润遍及整个肿瘤区域且不仅在外周。另外，人T细胞展示肿瘤内升高的GZB表达。同一肿瘤用抗PD-L1抗体的染色展现与媒介对照相比CEA TCB处理后肿瘤内PD-L1表达的强诱导(图10)。
实施例3：胃癌小鼠模型中CEA TCB与抗PD-L1阻断性抗体组合后体内抗肿瘤活性的评估
在携带胃癌肿瘤细胞系(MKN45)的完全人源化小鼠中评估CEA TCB与抗人PD-L1阻断性抗体组合的抗肿瘤功效。
生成基于WO 2010/077634中描述的YW243.55.S70 PD-L1抗体(序列显示于WO2010/077634图11)的抗小鼠PD-L1替代抗体用于体内肿瘤模型。此抗体含有DAPG突变以消除FcγR相互作用。将YW243.55.S70的可变区附着至具有DAPG Fc突变的鼠IgG1恒定域。
YW243.55.S70PD-L1muIgG1的多肽序列如下：
YW243.55.S70PD-L1muIgG1DAPG HC(SEQ ID NO:36)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVA WISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARR HWPGGFDYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLV KGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETV TCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITL TPKVTCVVVDISKDAPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSE LPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKE QMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYF VYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK。
YW243.55.S70PD-L1muIgG1LC(SEQ ID NO:37)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA SFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTK VEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSE RQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSP IVKSFNRNEC。
总之，在完全人源化NOG小鼠中皮下注射1x106个MKN45肿瘤细胞。肿瘤细胞注射后7天，将小鼠随机化入四个组：第一组接受作为对照的磷酸盐缓冲盐水(PBS，媒介)，第二组接受CEA TCB(以2.5mg/kg的剂量，一周两次，施用7周，总共15次施用)，第三组接受抗PD-L1抗体(以10mg/kg的剂量，一周一次，施用7周，总共8次施用)，而第四组接受CEA TCB和抗PD-L1抗体的组合，以单一治疗剂组中使用的相应剂量和进度表伴随施用达 7周(8次施用10mg/kg抗PD-L1抗体，一周一次给予和15次施用2.5mg/kg CEA TCB，一周两次给予)。
此研究的结果显示与CEA TCB单一药剂相比CEA TCB与抗PD-L1阻断性抗体组合后抗肿瘤活性的显著升高(图11)。作为单一药剂的抗PD-L1抗体处理没有显示任何抗肿瘤活性。用组合处理后没有观察到明显的测试项目相关毒性。
第二项研究设计成评估用CEA TCB单一疗法一线处理后CEA TCB与抗 PD-L1组合是否能施加与作为单一疗法的CEA TCB的持续处理相比卓越的抗肿瘤活性。
对于这项研究，在完全人源化NOG小鼠中皮下注射1x106个MKN45肿瘤细胞。肿瘤细胞注射后10天，小鼠接受作为对照的磷酸盐缓冲盐水 (PBS，媒介)，或CEA TCB(以2.5mg/kg的剂量，一周两次，施用4周，总共 7次施用)任一。研究第34天时，将CEA TCB处理的小鼠随机化入两个亚组：一个继续接受CEA TCB施用(2.5mg/kg，一周两次)，另一个接受CEA TCB(2.5mg/kg，一周两次)与抗PD-L1抗体(10mg/kg，一周一次)的组合达5 周(总共11次施用CEA TCB，和总共6次施用抗PD-L1抗体)。
结果清楚显示作为二线处理的CEA TCB+抗PD-L1组合疗法介导与 CEA TCB单一疗法相比显著卓越的抗肿瘤活性(图12)。
实施例4：结肠直肠癌小鼠模型中CEA TCB与抗PD-L1阻断性抗体组合后体内抗肿瘤活性的评估
还在携带内部改造成在细胞表面上表达人CEA的结肠直肠癌肿瘤细胞系MC38(MC38-huCEA)的完全免疫胜任小鼠中评估CEA TCB与抗PD-L1阻断性抗体组合的抗肿瘤功效。
总之，在人CEA转基因的完全免疫胜任C57BL/6(huCEA Tg小鼠)中皮下注射0.5x106个MC38-huCEA肿瘤细胞。肿瘤细胞注射后17天，将小鼠随机化入四个组进行一线处理：第一组接受作为对照的磷酸盐缓冲盐水 (PBS，媒介)，第二组接受CEA TCB(以2.5mg/kg的剂量，一周两次，施用4 周，总共7次施用)，第三组接受抗小鼠PD-L1抗体(以10mg/kg的剂量，一周一次，施用4周，总共4次施用)，而第四组接受CEA TCB和抗PD-L1抗体的组合，以单一治疗剂组中使用的相应剂量和进度表伴随施用达4周(4次施用 10mg/kg抗PD-L1，一周一次给予和7次施用2.5mg/kg CEA TCB，一周两次给予)。
结果显示与CEA TCB和抗PD-L1单一药剂相比CEA TCB与抗PD-L1阻断性抗体组合后抗肿瘤活性的显著升高(图13)。而且，在研究第42天，来自组合处理组的9只小鼠中的4只没有肿瘤，而在CEA TCB处理后没有观察到无肿瘤小鼠，在抗PD-L1疗法后只观察到8只小鼠中1只没有肿瘤。
用组合处理后没有观察到明显的测试项目相关毒性。
在研究第42天，自所有组手术取出皮下肿瘤并将小鼠留置5周不处理。此休息期后，对一线处理小鼠加两组未实验huCEA Tg小鼠(一个留置不触及，另一个先前提交体侧手术切口以模拟手术干预)在相对体侧皮下注射 0.5x106个MC38-huCEA肿瘤细胞系。不对任何组应用疗法注射，同时监测肿瘤生长。结果显示在所有一线处理小鼠中观察到肿瘤再攻击后的肿瘤保护，有与未实验小鼠相比显著的肿瘤控制。接受作为一线处理的CEA TCB 与抗PD-L1的组合的组显示肿瘤再攻击后研究第37天时8只小鼠中的3只没有肿瘤。这些数据指示在MC38-huCEA模型中，CEA TCB与抗PD-L1抗体的组合不仅改善一线处理响应，而且改善随后肿瘤攻击后的抗肿瘤保护。
实施例5：在具有局部晚期和/或转移性CEA阳性实体瘤的患者中评估CEA TCB与阿特珠单抗(atezolizumab)组合的安全性，药动学和治疗活性的一项开放标签，多中心，剂量扩大和扩充IB期研究
上文讨论的数据证明CEA TCB和阿特珠单抗在它们的抗癌特性中协同作用且它们的组合共同地能在具有癌症的患者中提供有意义的临床益处。
进行了CEA TCB与阿特珠单抗组合的一项开放标签，多中心，剂量扩大和扩充Ib期临床研究。每个治疗周期持续21天且由一周一次(QW)(±1天) 给予的IV输注CEA TCB与每3周(Q3W)(±2天)给予的阿特珠单抗组合组成。患者接受在每个周期第1天IV给予的阿特珠单抗(1200mg固定剂量)，接着是至少1小时后在每个周期的第1天，第8天和第15天IV给予的CEA TCB。
对于CEA TCB，起始剂量是以QW进度表施用的5mg，当同一天(每个周期的第1天)施用二者时，在施用1200mg阿特珠单抗后至少1小时施用。
治疗患者直至临床益处损失，不可接受的毒性，或撤回同意。在治疗之一永久中止的情况中，另一药物单独治疗可以继续。
关键适格标准包括在标准疗法时已经进展，不耐受标准疗法，和/或不适合标准疗法的患者中经过确认的局部晚期和/或转移性实体瘤；东部肿瘤学协作组(ECOG)性能状态(PS)0-1；和经过当地确认的肿瘤组织中的CEA 表达(对于所有实体瘤，≥50％的肿瘤细胞染色有至少中等至高强度的CEA 表达，NSCLC例外，≥20％的肿瘤细胞染色有至少中等至高强度的CEA表达)或经过中心确认的CEA表达。
这项研究的主要目标是安全性和耐受性，次要目标是PK和临床活性(依照实体瘤响应评估标准(RECIST)，1.1版标准和改良RECIST标准的客观总体响应率(ORR)，疾病控制率(DCR；定义为响应率[RR]+稳定疾病率 [SDR])，无进展存活(PFS)和总体存活(OS)数据)。
使用单维测量诸如计算机断层照相(CT)扫描或磁共振成像依照RECIST v1.1和改良RECIST标准评估肿瘤响应。
结果
到2016年11月15日，以下面的剂量分队水平治疗了30名患者：
5mg CEA TCB QW+1200阿特珠单抗Q3W：4名患者
10mg CEA TCB QW+1200阿特珠单抗Q3W：4名患者
20mg CEA TCB QW+1200阿特珠单抗Q3W：4名患者
40mg CEA TCB QW+1200阿特珠单抗Q3W：6名患者
80mg CEA TCB QW+1200阿特珠单抗Q3W：5名患者
160mg CEA TCB QW+1200阿特珠单抗Q3W：7名患者
组合治疗在当前剂量水平(高至160mg CEA TCB QW+1200mg阿特珠单抗Q3W)是安全且较好耐受的。没有患者因治疗相关安全性事件而中止。
此研究中的所有患者具有第4周时的FDG PET扫描肿瘤评估和第8周和然后每8周的CT扫描肿瘤评估。
在20mg CEA TCB，2/4名患者经历依照RECIST标准的延长的稳定疾病。1名具有胰腺腺癌的患者研究了32周，该患者经历第4周时通过FDG PET评估的稳定代谢响应。第二名患者(具有MSI不稳定性的胃-食管连接腺癌)研究了30周。此患者经历第4周FDG PET评估时的部分代谢响应。
在40mg CEA TCB，1/6名患者经历依照RECIST标准的延长的稳定疾病且它研究了20周。此患者(一名结肠直肠癌患者)先前在单一疗法试验 (BP29541)中治疗且接受31个周期的治疗。
在80mg CEA TCB，5/5名患者经历第8周CT扫描时的肿瘤体积缩小和第4周FDG PET扫描时的代谢部分响应。在这个分队中，4/5名患者是结肠直肠癌患者且1名患者具有ampulla Vater癌。
总之，这项试验中至今生成的临床数据显示2/4名以20mg CEA TCB+ 1200mg阿特珠单抗治疗的患者，1/6名以40mg CEA TCB+1200mg阿特珠单抗治疗的患者，和5/5名以80mgCEA TCB+1200mg阿特珠单抗治疗的患者中有希望的相关临床抗肿瘤活性。
上文关于不响应抗PD-1或抗PD-L1治疗的群体中80mg CEA TCB分队讨论的数据支持CEA TCB和阿特珠单抗在它们的抗癌特性中协同作用，而且它们的组合共同地能在具有癌症的患者中提供有意义的临床益处。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 使用PD-1轴结合拮抗剂和抗CEA/抗CD3双特异性抗体治疗CEA阳性癌症的方法
<130> P33335
<150> EP16150506.0
<151> 2016-01-08
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> Asp 或 Gly
<400> 5
Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> Ser 或 Leu
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> Thr 或 Ser
<400> 6
Ala Trp Ile Xaa Pro Tyr Gly Gly Ser Xaa Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 7
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 9
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
1 5 10
<210> 10
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 10
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 11
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> Asp 或 Val
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> Val 或 Ile
<220>
<221> 变体
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<223> Ser 或 Asn
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
<223> Ala 或 Phe
<220>
<221> 变体
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<223> Val 或 Leu
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> Phe 或 Thr
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> Tyr 或 Ala
<400> 13
Ser Ala Ser Xaa Leu Xaa Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> Tyr, Gly, Phe 或 Ser
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> Leu, Tyr, Phe 或 Trp
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> Tyr, Asn, Ala, Thr, Gly, Phe 或 Ile
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> His, Val, Pro, Thr 或 Ile
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> Ala, Trp, Arg, Pro 或 Thr
<400> 14
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 16
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 17
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 18
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 19
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 20
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 21
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 23
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 24
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 27
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 28
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 31
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
1 5 10 15
<210> 32
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 33
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
180 185 190
Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
210 215 220
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Ala Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
260 265 270
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
305 310 315 320
Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
340 345 350
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
355 360 365
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
370 375 380
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe
385 390 395 400
Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
405 410 415
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
420 425 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 37
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 38
Glu Phe Gly Met Asn
1 5
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 39
Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 40
Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 41
Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 42
Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg
1 5
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 43
His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr
1 5 10
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 44
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 45
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 46
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 47
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 48
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 49
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 50
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 50
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 51
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 51
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 52
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 52
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 53
<211> 694
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu
225 230 235 240
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val
260 265 270
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser
275 280 285
Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
290 295 300
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
305 310 315 320
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His
325 330 335
Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
340 345 350
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
355 360 365
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
370 375 380
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
385 390 395 400
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
405 410 415
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
420 425 430
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
435 440 445
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
450 455 460
Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
465 470 475 480
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
485 490 495
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
500 505 510
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
515 520 525
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
530 535 540
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
545 550 555 560
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
565 570 575
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
580 585 590
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
595 600 605
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
610 615 620
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
625 630 635 640
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
645 650 655
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
660 665 670
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
675 680 685
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690
<210> 54
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 55
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 56
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 57
<211> 225
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 57
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225

Claims (38)

1.抗CEA/抗CD3双特异性抗体在制造用于在个体中治疗CEA阳性癌症或延迟CEA阳性癌症进展的药物中的用途，其中该药物包含该抗CEA/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂，且其中该治疗包括与包含人PD-L1结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物；其中 (a)该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含(i)结合CD3的第一抗原结合域，其中该第一抗原结合域是包含重链可变区VHCD3和轻链可变区VLCD3的Fab分子，该重链可变区VHCD3包含SEQ ID NO:44的HVR-H1序列，SEQ ID NO:45的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:46的HVR-H3序列，该轻链可变区VLCD3包含SEQ ID NO:47的HVR-L1序列，SEQ ID NO:48的HVR-L2序列，和SEQ ID NO:49的HVR-L3序列；(ii)结合CEA的第二和第三抗原结合域，其中该第二和第三抗原结合域各自是包含重链可变区VHCEA和轻链可变区VLCEA的Fab分子，该重链可变区VHCEA包含SEQ ID NO:38的HVR-H1序列，SEQ ID NO:39的HVR-H2序列，和SEQ IDNO:40的HVR-H3序列，该轻链可变区VLCEA包含SEQ ID NO:41的HVR-L1序列，SEQ ID NO:42的HVR-L2序列，和SEQ ID NO:43的HVR-L3序列；和(iii)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域； 其中该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，且该第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端；且其中 (b)该PD-L1结合拮抗剂是抗体，包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO:19的HVR-H1序列，SEQ ID NO:20的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:21的HVR-H3序列，该轻链包含SEQ ID NO:22的HVR-L1序列，SEQ ID NO:23的HVR-L2序列，和SEQ ID NO:24的HVR-L3序列。
2.人PD-L1结合拮抗剂在制造用于在个体中治疗CEA阳性癌症或延迟CEA阳性癌症进展的药物中的用途，其中该药物包含该人PD-L1结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂，且其中该治疗包括与包含抗CEA/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物；其中 (a)该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含(i)结合CD3的第一抗原结合域，其中该第一抗原结合域是包含重链可变区VHCD3和轻链可变区VLCD3的Fab分子，该重链可变区VHCD3包含SEQ ID NO:44的HVR-H1序列，SEQ ID NO:45的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:46的HVR-H3序列，该轻链可变区VLCD3包含SEQ ID NO:47的HVR-L1序列，SEQ ID NO:48的HVR-L2序列，和SEQ ID NO:49的HVR-L3序列；(ii)结合CEA的第二和第三抗原结合域，其中该第二和第三抗原结合域各自是包含重链可变区VHCEA和轻链可变区VLCEA的Fab分子，该重链可变区VHCEA包含SEQ ID NO:38的HVR-H1序列，SEQ ID NO:39的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:40的HVR-H3序列，该轻链可变区VLCEA包含SEQ ID NO:41的HVR-L1序列，SEQ ID NO:42的HVR-L2序列，和SEQ ID NO:43的HVR-L3序列；和(iii)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域； 其中该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，且该第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端；且其中 (b)该PD-L1结合拮抗剂是抗体，包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO:19的HVR-H1序列，SEQ ID NO:20的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:21的HVR-H3序列，该轻链包含SEQ ID NO:22的HVR-L1序列，SEQ ID NO:23的HVR-L2序列，和SEQ ID NO:24的HVR-L3序列。
3. 抗CEA/抗CD3双特异性抗体和人PD-L1结合拮抗剂在制造用于在个体中治疗CEA阳性癌症或延迟CEA阳性癌症进展的药物中的用途，其中该治疗包括与包含该人PD-L1结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用包含该抗CEA/抗CD3双特异性抗体和任选的药学可接受载剂的组合物；其中 (a)该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含(i)结合CD3的第一抗原结合域，其中该第一抗原结合域是包含重链可变区VHCD3和轻链可变区VLCD3的Fab分子，该重链可变区VHCD3包含SEQ ID NO:44的HVR-H1序列，SEQ ID NO:45的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:46的HVR-H3序列，该轻链可变区VLCD3包含SEQ ID NO:47的HVR-L1序列，SEQ IDNO:48的HVR-L2序列，和SEQ ID NO:49的HVR-L3序列；(ii)结合CEA的第二和第三抗原结合域，其中该第二和第三抗原结合域各自是包含重链可变区VHCEA和轻链可变区VLCEA的Fab分子，该重链可变区VHCEA包含SEQ ID NO:38的HVR-H1序列，SEQ ID NO:39的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:40的HVR-H3序列，该轻链可变区VLCEA包含SEQ ID NO:41的HVR-L1序列，SEQ IDNO:42的HVR-L2序列，和SEQ ID NO:43的HVR-L3序列；和(iii)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域； 其中该第二抗原结合域在Fab重链的C端融合至该第一抗原结合域的Fab重链的N端，该第一抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第一亚基的N端，且该第三抗原结合域在Fab重链的C端融合至该Fc域的第二亚基的N端；且其中 (b)该PD-L1结合拮抗剂是抗体，包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO:19的HVR-H1序列，SEQ ID NO:20的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:21的HVR-H3序列，该轻链包含SEQ ID NO:22的HVR-L1序列，SEQID NO:23的HVR-L2序列，和SEQ ID NO:24的HVR-L3序列。
4.权利要求1-3任一项的用途，其中该PD-L1结合拮抗剂是阿特珠单抗(atezolizumab)。
5.权利要求1-3任一项的用途，其中该PD-L1结合拮抗剂包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
6.权利要求1-3任一项的用途，其中该PD-L1结合拮抗剂包含无糖基化位点突变。
7.权利要求6的用途，其中该无糖基化位点突变是替代突变。
8.权利要求7的用途，其中该替代突变在氨基酸残基N297，L234，L235，和/或D265处，依照EU编号方式。
9.权利要求7的用途，其中该替代突变选自由N297G，N297A，L234A，L235A，和D265A组成的组，依照EU编号方式。
10.权利要求7的用途，其中该替代突变是D265A突变和N297G突变，依照EU编号方式。
11.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域包含重链可变区VHCD3和/或轻链可变区VLCD3，该重链可变区VHCD3包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，该轻链可变区VLCD3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
12.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的第二和第三抗原结合域包含重链可变区VHCEA和/或轻链可变区VLCEA，该重链可变区VHCEA包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，该轻链可变区VLCEA包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
13.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的第一抗原结合域是交换Fab分子，其中Fab重和轻链的可变域或恒定域是交换的，且该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的第二和第三抗原结合域各自是常规Fab分子。
14.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的Fc域是IgG Fc域。
15.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的Fc域是IgG1 Fc域。
16.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的Fc域是人Fc域。
17.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。
18.权利要求17的用途，其中在该Fc域的第一亚基的CH3域中一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成隆起，该隆起可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中，且在该Fc域的第二亚基的CH3域中一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成空腔，该空腔内可安置第一亚基的CH3域内的隆起。
19.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的Fc域的第一亚基的CH3域包含氨基酸替代T366W，且该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的Fc域的第二亚基的CH3域包含氨基酸替代Y407V，依照EU编号方式。
20.权利要求19的用途，其中 (a)该Fc域的第二亚基另外包含氨基酸替代T366S和L368A，依照EU编号方式，和/或 (b)该Fc域的第一亚基另外包含氨基酸替代S354C或E356C，且该Fc域的第二亚基另外包含氨基酸替代Y349C，依照EU编号方式。
21.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W，且该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C，T366S，L368A和Y407V，依照EU编号方式。
22.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的Fc域展现与天然IgG1 Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。
23.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的Fc域包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。
24.权利要求23的用途，其中所述一处或多处氨基酸替代在选自L234，L235，和P329的组的一个或多个位置处，依照EU编号方式。
25.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体的Fc域的每个亚基包含氨基酸替代L234A，L235A和P329G，依照EU编号方式。
26.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含包含与SEQ IDNO: 52的序列至少95%同一的序列的多肽，包含与SEQ ID NO: 53的序列至少95%同一的序列的多肽，包含与SEQ ID NO: 54的序列至少95%同一的序列的多肽，和包含与SEQ ID NO:55的序列至少95%同一的序列的多肽。
27.权利要求1-3任一项的用途，其中该抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含包含SEQ IDNO: 52的序列的多肽，包含SEQ ID NO: 53的序列的多肽，包含SEQ ID NO: 54的序列的多肽，和包含SEQ ID NO: 55的序列的多肽。
28.权利要求1-3任一项的用途，其中该癌症是结肠癌，肺癌，卵巢癌，胃癌，膀胱癌，胰腺癌，子宫内膜癌，乳腺癌，肾癌，食管癌，或前列腺癌。
29.权利要求1-3任一项的用途，其中该个体具有癌症或已经诊断有癌症。
30.权利要求1-3任一项的用途，其中该个体中的癌细胞表达PD-L1。
31.权利要求1-3任一项的用途，其中以1200 mg每三周的剂量施用该人PD-L1结合拮抗剂。
32.权利要求1-3任一项的用途，其中以5 mg至100 mg每周的剂量施用该抗CEA/抗CD3双特异性抗体。
33.权利要求1-3任一项的用途，其包含如下的治疗周期，其中对该个体在每个周期的第1天以1200 mg的剂量施用人PD-L1结合拮抗剂，且在每个周期的第1，8，和15天以5 mg，10mg，20 mg，40 mg，80 mg或160 mg的剂量施用抗CEA/抗CD3抗体，每21天重复每个周期。
34.权利要求1-3任一项的用途，其中该个体对化疗剂治疗不应。
35.权利要求1-3任一项的用途，其中该个体对化疗剂治疗不耐受。
36.权利要求1-3任一项的用途，其中该治疗在该个体中导致响应。
37.权利要求1-3任一项的用途，其中该PD-L1结合拮抗剂和/或该抗CEA/抗CD3双特异性抗体静脉内，肌肉内，皮下，表面，口服，经皮，腹膜内，眼窝内，通过植入，通过吸入，鞘内，室内，或鼻内施用。
38.权利要求1-3任一项的用途，其进一步包括施用化疗剂来治疗癌症或延迟癌症进展。
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