ES2837428T3

ES2837428T3 - Procedimientos de tratamiento de cánceres positivos para CEA usando antagonistas de unión al eje PD-1 y anticuerpos biespecíficos anti-CEA/anti-CD3

Info

Publication number: ES2837428T3
Application number: ES17700491T
Authority: ES
Inventors: Marina Bacac; Sara Colombetti; Christian Klein; Johannes Sam; Jose Saro; Pablo Umana
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2016-01-08
Filing date: 2017-01-05
Publication date: 2021-06-30
Anticipated expiration: 2037-01-05
Also published as: US20180000931A1; JP2021193096A; US20200376119A1; AR107303A1; WO2017118675A1; AU2017205089B2; IL259588B2; BR112018011029A2; EP3862365A1; JP2019502712A; CA3006529A1; IL259588B1; PL3400246T3; IL259588A; MX2018008347A; CN108368179A; HK1259020A1; US10596257B2; AU2017205089A1; CN108368179B

Abstract

Una composición que comprende un anticuerpo biespecífico anti-antígeno carcinoembrionario (CEA)/anti-CD3 para su uso en el tratamiento o retraso de la progresión de un cáncer positivo para CEA en un individuo, en el que el tratamiento comprende la administración de dicha composición en combinación con una segunda composición, en el que la segunda composición comprende un antagonista de unión al ligando de muerte programada 1 (PD-L1) humano; en el que (a) el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende (i) un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3, en el que el primer dominio de unión a antígeno es una molécula Fab que comprende una región variable de la cadena pesada (VHCD3) que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:44, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:45, y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:46, y una región variable de la cadena ligera (VLCD3) que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:47, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:48, y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:49; (ii) un segundo y un tercer dominio de unión a antígeno que se une a CEA, en el que el segundo y tercer dominio de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab que comprende una región variable de la cadena pesada (VHCEA) que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:38, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:39, y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:40, y una región variable de la cadena ligera (VLCEA) que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:41, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:42, y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:43; y (iii) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable; en el que el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y el tercer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc; y en el que (b) el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo, que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO: 19, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:20 y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:21; y una cadena ligera que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:22, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:23 y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:24.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos de tratamiento de cánceres positivos para CEA usando antagonistas de unión al eje PD-1 y anticuerpos biespecíficos anti-CEA/anti-CD3

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un antagonista de unión a PD-L1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 para su uso en el tratamiento de cánceres positivos para CEA.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. A pesar de los avances en las opciones de tratamiento, el pronóstico de los pacientes con cáncer avanzado sigue siendo malo. En consecuencia, existe una necesidad médica persistente y urgente de tratamientos óptimos para incrementar la supervivencia de los pacientes con cáncer sin provocar una toxicidad inaceptable.

Los resultados recientes de ensayos clínicos han demostrado que los tratamientos inmunitarios, en particular los inhibidores de puntos de control inmunitarios, pueden prolongar la supervivencia global de los pacientes con cáncer y dar lugar a respuestas duraderas. A pesar de estos resultados prometedores, los tratamientos inmunitarios actuales solo son eficaces en una proporción de pacientes y se necesitan estrategias de combinación para mejorar el beneficio terapéutico.

El ligando de muerte programada 1 (PD-L1) se encuentra en la superficie de células inmunitarias y tumorales y su expresión se induce por interferón gamma (IFNy). Evita que el sistema inmunitario destruya las células cancerosas interactuando con los receptores inhibidores de muerte programada 1 (PD-1) y B7.1 en linfocitos T activados, lo que da como resultado una señal inhibidora de linfocitos T.

Como resultado, la selección terapéutica de PD-1 y otras moléculas que envían señales a través de interacciones con PD-1, tales como el ligando de muerte programada 1 (PD-L1) y el ligando de muerte programada 2 (PD-L2), son un área de gran interés. El PD-L1 se sobreexpresa en muchos cánceres y a menudo se asocia con un mal pronóstico (Okazaki T et al., Intern. Immun. 2007 19(7):813) (Thompson RH et al., Cancer Res 2006, 66(7):3381). De forma interesante, la mayoría de los linfocitos T infiltrantes de tumor expresan predominantemente PD-1, al contrario que los linfocitos T en tejidos normales y los linfocitos T de sangre periférica, lo que indica que la regulación por incremento de PD-1 en linfocitos T reactivos al tumor puede contribuir a respuestas inmunitarias antitumorales alteradas (Blood 2009 114(8): 1537). Esto se puede deber al aprovechamiento de la señalización de PD-L1 mediada por células tumorales que expresan PD-L1 que interactúan con los linfocitos T que expresan PD-1 para dar como resultado la atenuación de la activación de linfocitos T y la evasión de la vigilancia inmunológica (Sharpe et al., Nat Rev 2002) (Keir ME et al., 2008 Annu. Rev. Immunol. 26:677). Por lo tanto, la inhibición de la interacción PD-L1/PD-1 puede potenciar la destrucción de tumores mediada por linfocitos T CD8+.

La inhibición de la señalización de PD-L1 se ha propuesto como un medio para potenciar la inmunidad de linfocitos T para el tratamiento de cáncer (por ejemplo, inmunidad tumoral) e infección, incluyendo infección tanto aguda como crónica (por ejemplo, persistente). Un tratamiento terapéutico óptimo puede combinar el bloqueo de la interacción ligando/receptor de PD-1 con un agente que activa los linfocitos T, en particular linfocitos T CD8+.

Se ha informado de que el bloqueo doble de PD-1 y PD-L1 mejora la destrucción de linfocitos T del tumor dirigido por BiTE frente a CEA en un modelo in vitro (Osada et al., Cancer Immunol Immunother (2015) 64(6):677-88); documento WO 2015/112534).

Sigue existiendo la necesidad de obtener tratamientos óptimos para tratar, estabilizar, prevenir y/o retrasar el desarrollo de diversos cánceres en pacientes.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una composición que comprende un antagonista de unión a PD-L1 humano y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional para su uso en el tratamiento o retraso de la progresión de un cáncer positivo para CEA en un individuo, en el que el tratamiento comprende la administración de dicha composición en combinación con una segunda composición, en el que la segunda composición comprende un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional; en el que (a) el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende (i) un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3, en el que el primer dominio de unión a antígeno es una molécula Fab que comprende una región variable de la cadena pesada (V^hCD3) que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:44, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:45, y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:46, y una región variable de la cadena ligera (V^lCD3) que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:47, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:48, y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:49; (ii) un segundo y un tercer dominio de unión a antígeno que se une a CEA, en el que el segundo y tercer dominio de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab que comprende una región variable de la cadena pesada (V^hCEA) que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:38, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:39, y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:40, y una región variable de la cadena ligera (V^lCEA) que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:41, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:42, y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:43; y (iii) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable; en el que el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y el tercer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc; y en el que (b) el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo, que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO: 19, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:20 y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:21; y una cadena ligera que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:22, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:23 y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:24.

La invención proporciona además una composición que comprende un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional para su uso en el tratamiento o retraso de la progresión de un cáncer positivo para CEA en un individuo, en el que el tratamiento comprende la administración de dicha composición en combinación con una segunda composición, en el que la segunda composición comprende un antagonista de unión a PD-L1 humano y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional; en el que (a) el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende (i) un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3, en el que el primer dominio de unión a antígeno es una molécula Fab que comprende una región variable de la cadena pesada (V^hCD3) que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:44, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:45, y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:46, y una región variable de la cadena ligera (V^lCD3) que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:47, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:48, y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:49; (ii) un segundo y un tercer dominio de unión a antígeno que se une a CEA, en el que el segundo y tercer dominio de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab que comprende una región variable de la cadena pesada (V^hCEA) que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:38, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:39, y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:40, y una región variable de la cadena ligera (V^lCEA) que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:41, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:42, y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:43; y (iii) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable; en el que el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y el tercer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc; y en el que (b) el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo, que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO: 19, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:20 y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:21; y una cadena ligera que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:22, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:23 y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:24.

En algunos aspectos de las composiciones descritas anteriormente y en el presente documento, el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humano. En algunos aspectos, el anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno. En algunos aspectos, el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2 y Fv.

En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1. En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a B7-1. En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 tanto a PD-1 como a B7-1. En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 es MPDL3280A (atezolizumab). En algunos aspectos, MPDL3280A se administra a una dosis de aproximadamente 800 mg a aproximadamente 1500 mg cada tres semanas (por ejemplo, de aproximadamente 1000 mg a aproximadamente 1300 mg cada tres semanas, por ejemplo, de aproximadamente 1100 mg a aproximadamente 1200 mg cada tres semanas). En algunos aspectos, MPDL3280A se administra a una dosis de aproximadamente 1200 mg cada tres semanas. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y/o la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:25 y la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-L1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1) comprende una mutación del sitio de aglucosilación. En algunos aspectos, la mutación del sitio de aglucosilación es una mutación de sustitución. En algunos aspectos, la mutación de sustitución está en el residuo aminoacídico N297, L234, L235 y/o D265 (numeración EU). En algunos aspectos, la mutación de sustitución se selecciona del grupo que consiste en N297G, N297A, L234A, L235A y D265A. En algunos aspectos, la mutación de sustitución es una mutación D265A y una mutación N297G. En algunos aspectos, la mutación del sitio de aglucosilación reduce la función efectora del anticuerpo. En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-L1 es una IgGi humana que tiene sustitución de Asn a Ala en la posición 297 de acuerdo con la numeración EU.

En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se une a un polipéptido CD3 humano. En algunos aspectos, el polipéptido CD3 es un polipéptido CD3s humano o un polipéptido CD3y humano. En algunos aspectos, el polipéptido CD3 es un polipéptido c D3s humano. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno se une a un polipéptido CD3s humano o un polipéptido CD3y humano en un complejo de receptor de linfocitos T (TCR) natural en asociación con otras subunidades de TCR. En algunos aspectos, el primer dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada (V^hCD3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y/o una región variable de la cadena ligera (V^lCD3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51. En algunos aspectos, el segundo y tercer dominio de unión a antígeno comprenden cada uno una región variable de la cadena pesada (V^hCEA) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34 y/o una región variable de la cadena ligera (V^lCEA) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35.

En aspectos particulares, el anticuerpo biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3 y un segundo y un tercer dominio de unión a antígeno que se une a CEA, en el que el primer dominio de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que los dominios variables o los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian (es decir, se reemplazan entre sí) y el segundo y tercer dominio de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab convencional. En un aspecto, el primer dominio de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que se intercambian los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de Fab. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende no más de un dominio de unión a antígeno que se une a CD3.

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende

(i) un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3, que comprende una región variable de la cadena pesada (V^hc D3) que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:44, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:45 y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:46; y una región variable de la cadena ligera (V^lCD3) que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:47, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:48, y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:49, en el que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que se intercambian cualquiera de las regiones variable o constante, en particular las regiones constantes, de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab;

(ii) un segundo y un tercer dominio de unión a antígeno que se une a CEA, que comprende una región variable de la cadena pesada (V^hCEA) que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:38, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:39, y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:40; y una región variable de la cadena ligera (V^lCEA) que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:41, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:42, y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:43, en el que el segundo y tercer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab, en particular una molécula Fab convencional;

(iii) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable, en el que el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, y el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y en el que el tercer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc.

En algunos aspectos, el dominio Fc comprendido en el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 es un dominio Fc de IgG, específicamente una IgG1. En algunos aspectos, el dominio Fc es un dominio Fc humano. En un aspecto, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1 humana.

En algunos aspectos, el dominio Fc comprendido en el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. En algunos de dichos aspectos, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que es posicionable en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad de la que la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad es posicionable. En un aspecto específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza con un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza con un residuo de valina (Y407V). En un aspecto, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza con un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza con un residuo de alanina (L368A) (numeración EU). Aún en otro aspecto, en la primera subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza con un residuo de cisteína (S354C) 0 el residuo de ácido glutámico en la posición 356 se reemplaza con un residuo de cisteína (E356C), y en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteína (Y349C) (numeración EU). En un aspecto particular, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W, y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A y Y407V (numeración EU).

En algunos aspectos, el dominio Fc comprendido en el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 presenta una afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. En algunos aspectos, el receptor de Fc es un receptor de Fcy y/o la función efectora es la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En algunos de dichos aspectos, el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora. En un aspecto, dicha una o más sustituciones aminoacídicas están en una o más posiciones seleccionadas del grupo de L234, L235 y P329 (numeración EU). En un aspecto, cada subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración EU).

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ iD NO: 52, una polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 53, un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ iD NO: 54, y un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 55. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 52, un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 53, un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 54 y un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 55. (CEA-TCB)

En aspectos particulares, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 es CEA-TCB. En algunos aspectos, CEA-TCB se administra en una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg cada semana.

En algunos aspectos de las composiciones descritas anteriormente y en el presente documento, el cáncer es cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de esófago o cáncer de próstata. En algunos aspectos, el individuo tiene cáncer o se le ha diagnosticado cáncer. En algunos aspectos, el individuo tiene cáncer localmente avanzado o metastásico o se le ha diagnosticado cáncer localmente avanzado o metastásico. En algunos aspectos, las células cancerosas en el individuo expresan PD-L1. En algunos aspectos, la expresión de PD-L1 se puede determinar por un ensayo de inmunohistoquímica (IHQ).

En algunos aspectos de las composiciones descritas anteriormente y en el presente documento, el tratamiento o la administración del antagonista de unión a PD-L1 humano y el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 puede dar como resultado una respuesta en el individuo. En algunos aspectos, la respuesta es una respuesta completa. En algunos aspectos, la respuesta es una respuesta mantenida después del cese del tratamiento. En algunos aspectos, la respuesta es una respuesta completa que se mantiene después del cese del tratamiento. En otros aspectos, la respuesta es una respuesta parcial. En algunos aspectos, la respuesta es una respuesta parcial que se mantiene después del cese del tratamiento.

En algunos aspectos de las composiciones descritas anteriormente y en el presente documento, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se administra antes del antagonista de unión a PD-L1, simultáneamente con el antagonista de unión a PD-L1 o después del antagonista de unión a PD-L1. En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se administra después del antagonista de unión a PD-L1, en particular al menos una hora después del antagonista de unión a PD-L1 cuando ambos se administran el mismo día. En algunos aspectos, el tratamiento o administración del antagonista de unión a PD-L1 humano y el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende una pauta posológica que comprende ciclos de tratamiento, en el que al individuo se le administra, el día 1 de cada ciclo, un antagonista de unión a PD-L1 a una dosis de aproximadamente 1200 mg, y los días 1, 8 y 15 de cada ciclo, un anticuerpo anti-CEA/anti-CD3 a una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg, repitiéndose cada ciclo cada 21 días. En algunos aspectos, el ciclo se repite hasta que existe pérdida de beneficio clínico y/o toxicidad inaceptable. En algunos aspectos, se repiten ciclos en los que se administra solo el antagonista de unión a PD-L1 o solo el anticuerpo anti-CEA/anti-CD3.

En algunos aspectos de las composiciones descritas anteriormente y en el presente documento, el antagonista de unión a PD-L1 y/o el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se administra por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantación, por inhalación, por vía intratecal, intraventricular o intranasal. En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-L1 y/o el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se administra por vía intravenosa. En algunos aspectos de las composiciones descritas anteriormente y en el presente documento, el tratamiento comprende además administrar un agente quimioterápico para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo. En algunos aspectos, el individuo se ha tratado con un agente quimioterápico antes del tratamiento de combinación con el antagonista de unión a PD-L1 y el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3. En algunos aspectos, el individuo tratado con la combinación del antagonista de unión a PD-L1 y/o el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 es resistente a un tratamiento con agente quimioterápico. En algunos aspectos, el individuo tratado con la combinación del antagonista de unión a PD-L1 y/o el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 es intolerante a un tratamiento con agente quimioterápico. Algunos aspectos de las composiciones descritas a lo largo de la solicitud comprenden además administrar un agente quimioterápico para tratar o retrasar la progresión del cáncer.

En algunos aspectos de las composiciones descritas anteriormente y en el presente documento, los linfocitos T CD8 en el individuo tienen una potenciación en el cebado, activación, proliferación y/o actividad citolítica en relación con antes de la administración de la combinación. En algunos aspectos, el número de linfocitos T CD8 es elevado en relación con antes de la administración del antagonista de unión a PD-L1 y el anticuerpo anti-CEA/anti-CD3. En algunos aspectos, el linfocito T CD8 es un linfocito T CD8 específico de antígeno. En algunos aspectos, la función de Treg se suprime en relación con antes de la administración del antagonista de unión a PD-L1 y el anticuerpo anti-CEA/anti-CD3. En algunos aspectos, el agotamiento de linfocitos T disminuye en relación con antes de la administración del antagonista de unión a PD-L1 y el anticuerpo anti-CEA/anti-CD3.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Lisis mediada por CEA-TCB de células MKN45. Gráficos representativos de lisis mediada por CEA-TCB de células tumorales MKN-45 evaluada (A) 24 horas y (B) 48 horas después de la incubación de células tumorales con PBMC humanas (E:T 10:1). Los valores de CE50 de destrucción de células tumorales son: 615 pM (24 h), 362 pM (48 h). La destrucción de células diana se evaluó por cuantificación de LDH liberada en sobrenadantes celulares.

Figura 2. Regulación por incremento mediada por CEA-TCB de PD-1 en linfocitos T y de PD-L1 en células tumorales supervivientes después de lisis de células tumorales. Gráficos representativos de regulación por incremento mediada por CEA-TCB de la expresión del receptor PD-1 en linfocitos T CD8+ (A), linfocitos T CD4+ (B) y de la expresión del ligando PD-L1 en células tumorales que resistieron la destrucción (C) analizada 48 h después de la incubación de células tumorales MKN-45 con PBMC humanas (E:T 10:1). La expresión de PD-1 y PD-L1 se analizó por citometría de flujo.

Figura 3. Crecimiento tumoral después del tratamiento con CEA-TCB (coinjerto, E:T 5:1). Masa tumoral promedio y error estándar de la media (EEM, n = 12); la masa tumoral se midió por bioluminiscencia (flujo total). Se administró CEA-TCB i.v. en dosis de 0,5 y 2,5 mg/kg, iniciando un día (tratamiento temprano, panel A) o siete días (tratamiento tardío, panel B) después del coinjerto de tumor/PBMC e inyección s.c. Los grupos de control recibieron solución salina tamponada con fosfato (PBS, vehículo), MCSP TCB o DP47 TCB (como controles no dirigidos, respectivamente). En todos los estudios, se administraron TCB dos veces por semana (2q7d). Las flechas indican el día de inicio del tratamiento. Las curvas se compararon usando análisis de regresión no lineal. (A) Inicio del tratamiento un día después del coinjerto con PBMC humanas. Comparación de curvas: vehículo frente a TCB no dirigido valor de p = 0,65, vehículo frente a CEA-TCB (0,5 mg/kg) valor de p <0,0001, vehículo frente a CEA-TCB (2,5 mg/kg) valor de p < 0,0001, CEA-TCB (2,5 mg/kg) frente a CEA-TCB (0,5 mg/kg) valor de p = 0,91. (B) Inicio del tratamiento siete días después del coinjerto con PBMC humanas. Comparación de curvas: vehículo frente a TCB no dirigido valor de p = 0,65, vehículo frente a CEA-TCB (0,5 mg/kg) valor de p <0,0001, vehículo frente a CEA-TCB (2,5 mg/kg) valor de p < 0,0001, CEA-TCB (2,5 mg/kg) frente a CEA-TCB (0,5 mg/kg) valor de p = 0,0008.

Figura 4. Análisis histológico de tumores después del tratamiento con CEA-TCB (coinjerto, E:T 5:1). Tinción con hematoxilina y eosina (HyE, paneles A y D) y anti-PD-L1 (paneles B, C, E y F) de tumores tratados con vehículo (paneles A-C) y CEA-TCB (paneles D-F) (2,5 mg/kg, tratamiento administrado el día 7) obtenidos al final en el experimento de coinjerto de células LS174T-fluc2 con hPBMC (E:T 5:1) que muestra una fuerte inducción de expresión de PD-L1 intratumoral tras el tratamiento con CEA-TCB. Los paneles B y E corresponden al área marcada del panel A y D, respectivamente. Los paneles C y F corresponden al área marcada del panel B y E, respectivamente.

Figura 5. Peso tumoral después del tratamiento con CEA-TCB. Células LS174T-fluc2 inyectadas s.c. y cultivadas hasta que se alcanzó un volumen de 100 mm3 en ratones NOG, seguido de transferencia i.p. de PBMC humanas (10 x 106 células). Tres días después de la transferencia de PBMC, los ratones recibieron inyecciones i.v. bisemanales de CEA-TCB (2,5 mg/kg), PBS (vehículo) o MCSP TCB (control no dirigido, 2,5 mg/kg). La masa tumoral se determinó al final del estudio pesando los tumores explantados. Los gráficos muestran el peso tumoral promedio y el error estándar de la media (EEM, 3 < n < 6 ratones). ** p < 0,005 usando la prueba de la t bilateral para datos independientes.

Figura 6. Análisis de citometría de flujo de leucocitos infiltrantes de tumor después del tratamiento con CEA-TCB. Análisis de citometría de flujo de tejidos tumorales obtenidos al final en el modelo de xenoinjerto de carcinoma de colon humano con transferencia i.p. de células efectoras humanas. El gráfico de barras muestra el número de linfocitos T CD45+/CD3+ humanos intratumorales como se evalúa por citometría de flujo en todos los grupos tratados. * p < 0,05 usando la prueba t bilateral para datos independientes.

Figura 7. Inmunoanálisis de PD después del tratamiento con CEA-TCB (transferencia i.p. de PBMC humanas). Análisis por citometría de flujo de sangre (A-F) y tejidos tumorales (G-L) obtenidos el día 18 (correspondiente a tres días después de la tercera administración de CEA-TCB) después de la inoculación de células tumorales en el modelo de xenoinjerto de carcinoma de colon humano (transferencia i.p. de células efectoras humanas). Los gráficos de puntos muestran la expresión de CD69 (B, E, H, K) y PD-1 (C, F, I, L) en linfocitos T CD3 en ambos compartimentos. Se muestran los ratones representativos para cada grupo. A-C, G-I: vehículo. D-F, J-L: CEA-TCB

Figura 8. Inhibición del crecimiento tumoral inducida por CEA-TCB en ratones completamente humanizados. Inhibición del crecimiento tumoral de MKN45 en ratones humanizados. Se muestran volúmenes tumorales al final del estudio (el día 32 después de la inyección de células tumorales). Cada punto representa un animal individual. Se inyectó CEA-TCB i.v. (2,5 mg/kg dos veces por semana) y se midió el crecimiento tumoral con un compás calibrador.* p <0,05 (prueba de la T para datos independientes).

Figura 9. Incremento de frecuencias de linfocitos T humanos intratumorales y activación de linfocitos T por CEA-TCB. Análisis citométrico de flujo de muestras tumorales obtenidas al final del estudio (día 32). Las células se tiñeron para determinar antígenos humanos (huCD45, huCD3, huPD-1, huCD69, huKi-67 y huGZB). (A, B) Frecuencias de linfocitos T humanos totales (A) y la proporción de linfocitos T CD8+ con respecto a CD4+ (B) en el tejido tumoral. (C, D) La expresión de marcadores de activación en el tumor se muestra como el porcentaje de linfocitos T CD8+ (C) o CD4+ (D) humanos. Cada punto representa un animal individual. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 (prueba de la T para datos independientes).

Figura 10. Análisis histológicos de tejidos tumorales al final del estudio. Tinción con hematoxilina y eosina (HyE, panel A y D) y anti-PD-L1 (panel B, C, E y F) (Mab SP142) de tumores tratados con vehículo (panel A-C) y CEA-t Cb (panel D-F) que presentan una fuerte inducción de la expresión de PD-L1 intratumoral tras el tratamiento con CEA-TCB. Todos los cortes se tiñeron por contraste con hematoxilina (núcleos azules). Los paneles B y E corresponden al área marcada del panel A y D, respectivamente. Los paneles C y F corresponden al área marcada del panel B y E, respectivamente.

Figura 11. Actividad antitumoral in vivo tras la combinación de CEA-TCB con anticuerpo de bloqueo anti-PD-L1 humano en el modelo tumoral MKN45 en ratones completamente humanizados. (A) Masa tumoral promedio y error estándar de la media (EEM). La masa tumoral se midió por un compás calibrador digital 3 veces por semana. La flecha indica el día de inicio del tratamiento. El día 60: n=7 (vehículo), n=8 (CEA-TCB); n=4 (a-PD-L1); n=5 (combinación CEA-TCB con anti-PD-L1). (B) Análisis estadístico del tiempo hasta el acontecimiento. El acontecimiento se definió como alcanzar un volumen tumoral de 500 mm3. La prueba de rango logarítmico por pares se usó para comparar los siguientes grupos de tratamiento, ya que puede tener en cuenta los diferentes abandonos: vehículo frente a CEA-TCB: p= 0,005; CEA-TCB frente a anti-PD-L1: p= 0,001; CEA-TCB frente a combinación de CEA-TCB con anti-PD-L1: p= 0,03.

Figura 12. Actividad antitumoral de CEA-TCB en el modelo MKN45 en ratones NOG completamente humanizados. Para el tratamiento de primera línea, a los ratones se les administró vehículo, como control, o CEA-TCB (2,5 mg/kg, administrado dos veces por semana durante 4 semanas, 7 administraciones en total). El día 34 del estudio, los ratones del grupo tratado con CEA-TCB se aleatorizaron en dos subgrupos: a uno se le continuó administrando CEA-TCB (2,5 mg/kg dos veces por semana) y al otro se le administró CEA-TCB (2,5 mg/kg dos veces por semana) en combinación con anticuerpo anti-PD-L1 de ratón (10 mg/kg, administrado una vez por semana) durante 5 semanas (11 administraciones en total para CEA-TCB y 6 administraciones en total para anti-PD-L1). ***p<0,0002 ANOVA bidireccional.

Figura 13. Actividad antitumoral de CEA-TCB en el modelo MC38-huCEA en ratones huCEA Tg completamente inmunocompetentes. (A) Para el tratamiento de primera línea, a los ratones se les administró vehículo, como control, con CEA-TCB (2,5 mg/kg, administrado dos veces por semana durante 4 semanas, 7 administraciones en total), con anticuerpo anti-PD-L1 de ratón (10 mg/kg, administrado una vez por semana durante 4 semanas, 4 administraciones en total), y con una combinación de CEA-TCB y anti-PD-L1 de ratón, administrados simultáneamente con la dosis y programas respectivos usados en los grupos terapéuticos únicos. El tratamiento se administró durante 4 semanas. (B) Los tumores subcutáneos se extirparon quirúrgicamente y, después de 5 semanas, los ratones se reexpusieron a células tumorales MC38-huCEA recién obtenidas inyectadas por vía subcutánea en el flanco opuesto. Como control, a los grupos de ratones huCEA Tg sin tratamiento previo, sin manipular o bien sometidos a un corte quirúrgico en el flanco, se les inyectó por vía subcutánea MC38-huCEA en el flanco opuesto.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Los inventores de la presente solicitud demostraron que un anticuerpo biespecífico de linfocitos T frente a CEA e inmunoterapia anti-PD-L1 actúan de forma sinérgica en sus propiedades antineoplásicas y su combinación podría proporcionar un beneficio clínico significativo en pacientes con cáncer. Los datos en la solicitud muestran que la combinación de un anticuerpo biespecífico de linfocitos T frente a CEA (CEA-TCB) con inmunoterapia anti-PD-L1 dio como resultado una potenciación en la inhibición del crecimiento tumoral.

En un aspecto, en el presente documento se describen procedimientos, composiciones y usos para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo que comprenden administrar una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-1 humano y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3.

En otro aspecto, en el presente documento se describen procedimientos, composiciones y usos para potenciar la función inmunitaria en un individuo que tiene cáncer que comprenden administrar una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-1 humano y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3.

I. Definiciones

Se debe entender que la terminología usada en el presente documento es con el propósito solo de describir aspectos particulares y no pretende ser limitante.

Como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias plurales a menos que el contenido lo indique claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una molécula" incluye opcionalmente una combinación de dos o más de dichas moléculas, y similares.

Como se usa en el presente documento, los términos "primero", "segundo", "tercero", etc. con respecto a los dominios de unión a antígeno, etc., se usan por conveniencia para distinguir cuando existe más de uno de cada tipo de dominio. El uso de estos términos no está destinado a conferir un orden u orientación específica a menos que se establezca explícitamente.

El término "aproximadamente" como se usa en el presente documento se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido por el experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) aspectos que se refieren a ese valor o parámetro, per se.

Se entiende que los aspectos descritos en el presente documento incluyen los aspectos "que comprende", "que consiste" y "que consiste esencialmente en".

El término "antagonista de unión al eje PD-1" se refiere a una molécula que inhibe la interacción de un compañero de unión al eje PD-1 con uno o bien más de sus compañeros de unión, para retirar la disfunción de linfocitos T que resulta de la señalización en el eje de señalización de PD-1, siendo un resultado el restablecimiento o potenciación de la función de linfocitos T (por ejemplo, proliferación, producción de citocinas, destrucción de células diana). Como se usa en el presente documento, un antagonista de unión al eje PD-1 incluye un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2. Un antagonista de unión al eje PD-1 "humano" se refiere a un antagonista de unión al eje PD-1 que tiene los efectos descritos anteriormente sobre el eje de señalización de PD-1 humano.

El término "antagonista de unión a PD -1 se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales que resulta de la interacción de PD-L1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-L1, PD-L2. En algunos aspectos, el antagonista de la unión a PD-1 es una molécula que inhibe la unión de PD-1 a uno o más de sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-1 inhibe la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2. Por ejemplo, los antagonistas de unión a PD-1 incluyen anticuerpos anti-PD-1, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren con la transducción de señales resultante de la interacción de PD1 con PD-L1 y/o PD-L2. En un aspecto, un antagonista de unión a PD-1 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de superficie celular expresadas en la señalización mediada por linfocitos T a través de PD-1 para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1. En un aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es MDX-1106 (nivolumab), descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es MK-3475 (pembrolizumab), descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es CT-011 (pidilizumab), descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es MEDI-0680 (AMP-514), descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es PDR001 descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es REGN2810 descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un antagonista de unión a PD-1 es BGB-108 descrito en el presente documento.

El término "antagonista de unión a PD-L1" se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L1 con uno cualquiera o más de sus compañeros de unión, tales como PD-1, B7-1. En algunos aspectos, un antagonista de unión a PD-L1 es una molécula que inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-L1 inhibe la unión de PD-L1 a PD-1 y/o B7-1. En algunos aspectos, los antagonistas de unión a PD-L1 incluyen anticuerpos anti-PD-L1, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-1, B7-1. En un aspecto, un antagonista de unión a PD-L1 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de superficie celular expresadas en la señalización mediada por linfocitos T a través de PD-L1 para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). En algunos aspectos, un antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1. En un aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es YW243.55.S70, descrito en el presente documento. En otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MDX-1105, descrito en el presente documento. Todavía en otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MPDL3280A (atezolizumab) descrito en el presente documento. Todavía en otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MDX-1105 descrito en el presente documento. Todavía en otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es YW243.55.S70 descrito en el presente documento. Todavía en otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MEDI4736 (druvalumab), descrito en el presente documento. Todavía en otro aspecto específico, un anticuerpo anti-PD-L1 es MSB0010718C (avelumab), descrito en el presente documento.

El término "antagonista de unión a PD-L2' se refiere a una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L2 con uno cualquiera o más de sus compañeros de unión, tales como PD-1. En algunos aspectos, un antagonista de unión a PD-L2 es una molécula que inhibe la unión de PD-L2 a uno o más de sus compañeros de unión. En un aspecto específico, el antagonista de unión a PD-L2 inhibe la unión de PD-L2 a PD-1. En algunos aspectos, los antagonistas de PD-L2 incluyen anticuerpos anti-PD-L2, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inmunoadhesinas, proteínas de fusión, oligopéptidos y otras moléculas que disminuyen, bloquean, inhiben, anulan o interfieren en la transducción de señales resultante de la interacción de PD-L2 con uno o bien más de sus compañeros de unión, tal como PD-1. En un aspecto, un antagonista de unión a PD-L2 reduce la señal coestimuladora negativa mediada por o a través de proteínas de superficie celular expresadas en la señalización mediada por linfocitos T a través de PD-L2 para hacer que un linfocito T disfuncional sea menos disfuncional (por ejemplo, potenciando las respuestas efectoras al reconocimiento de antígenos). En algunos aspectos, un antagonista de unión a PD-L2 es una inmunoadhesina.

El término "disfunción", en el contexto de disfunción inmunológica, se refiere a un estado de reactividad inmunitaria reducida a la estimulación antigénica. El término incluye los elementos comunes de agotamiento y/o anergia en los que se puede producir el reconocimiento de antígenos, pero la respuesta inmunitaria resultante es ineficaz para controlar la infección o el crecimiento tumoral.

El término "disfuncional', como se usa en el presente documento, también incluye resistente o que no responde al reconocimiento de antígenos, específicamente, capacidad alterada para traducir el reconocimiento de antígenos a funciones efectoras de linfocitos T posteriores, tales como proliferación, producción de citocinas (por ejemplo, IL-2) y/o destrucción de células diana.

El término "anergia" se refiere al estado de resistencia a la estimulación antigénica resultante de señales incompletas o insuficientes emitidas a través del receptor de linfocitos T (por ejemplo, incremento en el Ca2+ intracelular en ausencia de activación de ras). La anergia de linfocitos T también puede resultar de la estimulación con antígeno en ausencia de coestimulación, dando como resultado que la célula se vuelva resistente a la posterior activación por el antígeno incluso en el contexto de coestimulación. El estado de resistencia se puede anular a menudo por la presencia de interleucina-2. Los linfocitos T anérgicos no experimentan expansión clónica y/o adquieren funciones efectoras.

El término "agotamiento" se refiere al agotamiento de linfocitos T como un estado de disfunción de linfocitos T que surge de la señalización de TCR mantenida que se produce durante muchas infecciones crónicas y cáncer. Se distingue de la anergia por que surge no a través de señalización incompleta o insuficiente, sino de señalización mantenida. Se define por una mala función efectora, expresión mantenida de receptores inhibidores y un estado transcripcional distinto del de los linfocitos T de memoria o efectores funcionales. El agotamiento evita el control óptimo de infecciones y tumores. El agotamiento puede resultar tanto de las vías reguladoras negativas extrínsecas (por ejemplo, citocinas inmunorreguladoras) así como de las vías reguladoras (coestimuladoras) negativas intrínsecas celulares (PD-1, B7-H3, B7-H4, etc.).

"Potenciar la función de los linfocitos T" quiere decir inducir, provocar o estimular que un linfocito T tenga una función biológica mantenida o amplificada, o renovar o reactivar linfocitos T agotados o inactivos. Los ejemplos de potenciación de la función de linfocitos T incluyen: incremento en la secreción de Y-interferón desde los linfocitos T CD8+, incremento en la proliferación, incremento en la reactividad a antígenos (por ejemplo, aclaramiento vírico, patógeno o tumoral) en relación con dichos niveles antes de la intervención. En un aspecto, el nivel de potenciación es al menos un 50 %, de forma alternativa un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 120 %, 150 %, 200 %. La manera de medir esta potenciación es conocida por un experto en la técnica.

Un "trastorno disfuncional de linfocitos T ' es un trastorno o afección de los linfocitos T caracterizado por una disminución en la reactividad a la estimulación antigénica. En un aspecto particular, un trastorno disfuncional de linfocitos T es un trastorno que se asocia específicamente con un incremento inapropiado en la señalización a través de PD-1. En otro aspecto, un trastorno disfuncional de linfocitos T es uno en que los linfocitos T son anérgicos o tienen una disminución en la capacidad de secretar citocinas, proliferar o ejecutar la actividad citolítica. En un aspecto específico, la disminución en la reactividad da como resultado un control ineficaz de un patógeno o tumor que expresa un inmunógeno. Los ejemplos de trastornos disfuncionales de linfocitos T caracterizados por la disfunción de linfocitos T incluyen infección aguda, infección crónica e inmunidad tumoral sin resolver.

"Inmunidad tumoral' se refiere al proceso en que los tumores evaden el reconocimiento y aclaramiento inmunitarios. Por tanto, como concepto terapéutico, la inmunidad tumoral se "trata" cuando dicha evasión se atenúa y los tumores son reconocidos y atacados por el sistema inmunitario. Los ejemplos de reconocimiento tumoral incluyen unión tumoral, reducción del volumen tumoral y aclaramiento tumoral.

"Inmunogenicidad' se refiere a la capacidad de una sustancia particular de provocar una respuesta inmunitaria. Los tumores son inmunógenos y la potenciación de la inmunogenicidad tumoral ayuda en el aclaramiento de las células tumorales por la respuesta inmunitaria. Los ejemplos de potenciación de la inmunogenicidad tumoral incluyen el tratamiento con un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3.

"Respuesta mantenida" se refiere al efecto mantenido sobre la reducción del crecimiento tumoral después del cese de un tratamiento. Por ejemplo, el tamaño tumoral puede permanecer igual o más pequeño en comparación con el tamaño al comienzo de la fase de administración. En algunos aspectos, la respuesta mantenida tiene una duración al menos igual a la duración del tratamiento, al menos 1,5, 2,0, 2,5 o 3,0 veces la duración del tratamiento.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación. Dichas formulaciones son estériles. Los excipientes (vehículos, aditivos) "farmacéuticamente aceptables" son los que se pueden administrar razonablemente a un sujeto mamífero para proporcionar una dosis eficaz del ingrediente activo empleado.

Como se usa en el presente documento, el término " tratamiento" se refiere a la intervención clínica diseñada para alterar la evolución natural del individuo o la célula que se está tratando durante la evolución de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen disminuir la tasa de progresión de enfermedad, mejorar o paliar el estado de enfermedad, y la remisión o mejora del pronóstico. Por ejemplo, un individuo se "trata" con éxito si uno o más síntomas asociados con el cáncer se mitigan o eliminan, que incluyen, pero no se limitan a, reducir la proliferación de (o destruir) células cancerosas, disminuir los síntomas resultantes de la enfermedad, incrementar la calidad de vida de quienes padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad y/o prolongar la supervivencia de los individuos.

Como se usa en el presente documento, "retrasar la progresión de una enfermedad' quiere decir diferir, impedir, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (tal como cáncer). Este retraso puede tener duraciones de tiempo variables dependiendo de los antecedentes de la enfermedad y/o del individuo que se está tratando. Como es evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede englobar, en efecto, la prevención, ya que el individuo no desarrolla la enfermedad. Por ejemplo, se puede retrasar un cáncer en fase tardía, tal como el desarrollo de metástasis.

Una "cantidad eficaz ' es al menos la cantidad mínima requerida para lograr una mejora o prevención medibles de un trastorno particular. Una cantidad eficaz en el presente documento puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del paciente, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del tratamiento se compensa con los efectos terapéuticamente beneficiosos. Para su uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados tales como eliminar o reducir el riesgo, reducir la gravedad o retrasar la aparición de la enfermedad, incluyendo síntomas bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para su uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como disminuir uno o más síntomas que resultan de la enfermedad, incrementar la calidad de vida de los que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, potenciar el efecto de otro medicamento tal como por medio de selección, retrasar la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia. En el caso de cáncer o tumor, una cantidad eficaz del fármaco puede tener el efecto de reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño tumoral; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida o deseablemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y deseablemente detener) la metástasis tumoral; inhibir en cierta medida el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más administraciones. Para los propósitos de la presente divulgación, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr un tratamiento profiláctico o terapéutico, directa o bien indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica se puede lograr o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por tanto, una "cantidad eficaz" se puede considerar en el contexto de administrar uno o más agentes terapéuticos, y un único agente se puede considerar que se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más de otros agentes, se puede lograr o se logra un resultado deseable.

Como se usa en el presente documento, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento. Como tal, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de la otra modalidad de tratamiento al individuo.

Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento incluyendo, pero sin limitarse a, trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.

Los términos "trastorno proliferativo celular' y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que se asocian con algún grado de proliferación celular anómala. En un aspecto, el trastorno proliferativo celular es cáncer. En un aspecto, el trastorno proliferativo celular es un tumor.

"Tumor", como se usa en el presente documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásicos, ya sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "trastorno proliferativo celular", "trastorno proliferativo" y "tumor" no son mutuamente excluyentes como se hace referencia en el presente documento.

Los términos "cáncer' y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en los mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o neoplasias malignas linfocíticas. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón incluyendo carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma pulmonar de células escamosas, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer estromal gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de las vías urinarias, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, melanoma, melanoma de extensión superficial, lentigo maligno melanoma, melanomas lentiginosos acros, melanomas nodulares, mieloma múltiple y linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no hodgkiniano (LNH) folicular/de grado bajo; LNH linfocítico pequeño (LP); LNH folicular/de grado intermedio; LNH difuso de grado intermedio; LNH inmunoblástico de grado alto; LNH linfoblástico de grado alto; LNH de células pequeñas no escindidas de grado alto; LNH voluminoso; linfoma de células de manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (LLC); leucemia linfocítica aguda (LLA); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo postrasplante (TLPT), así como proliferación vascular anómala asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), síndrome de Meigs, cáncer cerebral, así como de cabeza y cuello, y metástasis asociadas. En determinados aspectos, los cánceres que son susceptibles de tratamiento por los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer rectal, carcinoma de pulmón no microcítico, glioblastoma, linfoma no hodgkiniano (LNH), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, sarcoma de partes blandas, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, mesotelioma y mieloma múltiple. En algunos aspectos, el cáncer se selecciona de: carcinoma de pulmón microcítico, glioblastoma, neuroblastomas, melanoma, carcinoma de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CCR) y carcinoma hepatocelular. Aún, en algunos aspectos, el cáncer se selecciona de: carcinoma de pulmón no microcítico, cáncer colorrectal, glioblastoma y carcinoma de mama, incluyendo las formas metastásicas de esos cánceres. En algunos aspectos, el cáncer es un cáncer positivo para CEA.

El término "agente citotóxico", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente que es perjudicial para las células (por ejemplo, provoca la muerte celular, inhibe la proliferación o dificulta de otro modo una función celular). Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu); agentes quimioterápicos; agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas; y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos. Los agentes citotóxicos ejemplares se pueden seleccionar de agentes antimicrotúbulos, complejos de coordinación de platino, agentes alquilantes, agentes antibióticos, inhibidores de la topoisomerasa II, antimetabolitos, inhibidores de la topoisomerasa I, hormonas y análogos hormonales, inhibidores de la vía de transducción de señales, inhibidores de angiogénesis de tirosina cinasas no receptoras, agentes inmunoterápicos, agentes proapoptóticos, inhibidores de LDH-A, inhibidores de la biosíntesis de ácidos grasos, inhibidores de señalización del ciclo celular, inhibidores de HDAC, inhibidores del complejo endopeptidásico multicatalítico e inhibidores del metabolismo del cáncer. En un aspecto, el agente citotóxico es un taxano. En un aspecto, el taxano es paclitaxel o docetaxel. En un aspecto, el agente citotóxico es un agente de platino. En un aspecto, el agente citotóxico es un antagonista de EGFR. En un aspecto, el antagonista de EGFR es N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina (por ejemplo, erlotinib). En un aspecto, el agente citotóxico es un inhibidor de RAF. En un aspecto, el inhibidor de RAF es un inhibidor de BRAF y/o CRAF. En un aspecto, el inhibidor de RAF es vemurafenib. En un aspecto, el agente citotóxico es un inhibidor de PI3K.

"Agente quimioterápico" incluye compuestos útiles en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen erlotinib (TAr CeVA®, Genentech/OSI Pharm.), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), disulfiram, galato de epigalocatequina, salinosporamida A, carfilzomib, 17-AAG (geldanamicina), radicicol, lactato deshidrogenasa A (LDH-A), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), sunitib (SUTENT®, Pfizer/Sugen), letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatinib (GLEEVEC®, Novartis), finasunato (VATALANIB®, Novartis), oxaliplatino (ELOXATIN®, Sanofi), 5-FU (5-fluorouracilo), ácido folínico, rapamicina (sirólimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafamib (SCH66336), sorafenib (NEXAVAR® Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN®; alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (en especial bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo topotecán e irinotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8); corticoesteroides (incluyendo prednisona y prednisolona); acetato de ciproterona; 5a-reductasas incluyendo finasterida y dutasterida); vorinostat, romidepsina, panobinostat, ácido valproico, mocetinostat dolastatina; aldesleucina, talco duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, cloromafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uramustina; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, en especial calicheamicina y1I y calicheamicina w1I (Angew Chem. Inti. Ed. Engl. 199433:183-186); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como el cromóforo neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos enodiinos de cromoproteínas relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® (doxorrubicina), morfolinodoxorrubicina, cianomorfolinodoxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina y desoxidoxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; phenamet, pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbacina; complejo de polisacárido p Sk® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (en especial toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano, vindesina; dacarbacina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOL (paclitaxel; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE® (sin Cremophor), formulaciones de nanopartículas genomanipuladas con albúmina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, III.) y TAXOTERE® (docetaxel, doxetaxel; Sanofi-Aventis); clorambucilo; GEMZAR® (gemcitabina); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE® (vinorelbina); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®); ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (Dm FO); retinoides, tales como ácido retinoico; y sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

El agente quimioterápico también incluye (i) agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores, tales como antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor estrogénico (MSRE), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, yodoxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona y FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano; Pfizer), formestano, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis) y ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprorrelina y goserelina; buserelina, tripterelina, acetato de medroxiprogesterona, dietilestilbestrol, premarina, fluoximesterona, todo el ácido transretinoico, fenretinida, así como troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolano nucleósido de citosina); (iv) inhibidores de proteína cinasa; (v) inhibidores de lípido cinasa; (vi) oligonucleótidos antisentido, en particular, los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación de células anómalas, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Ralf y H-Ras; (vii) ribocimas, tales como inhibidores de la expresión de VEGF (por ejemplo, ANGIOZYME®) e inhibidores de la expresión de HER2; (viii) vacunas, tales como vacunas de tratamiento génico, por ejemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® y VAXID®; PROLEUKIN®, rIL-2; un inhibidor de topoisomerasa 1, tal como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; y (ix) sales, ácidos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

El agente quimioterápico también incluye anticuerpos tales como alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuximab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen), rituximab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), pertuzumab (OMNETARG®, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia), y el conjugado anticuerpo-fármaco, gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®, Wyeth). Los anticuerpos monoclonales humanizados adicionales con potencial terapéutico como agentes en combinación con los compuestos descritos en el presente documento incluyen: apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bivatuzumab mertansina, cantuzumab mertansina, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicina, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, pascolizumab, pecfusituzumab, pectuzumab, pexelizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resyvizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, tacatuzumab tetraxetano, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, tucotuzumab celmoleucina, tucusituzumab, umavizumab, urtoxazumab, ustekinumab, visilizumab, y el anti-interleucina 12 (ABT-874/J695, Wyeth Research and Abbott Laboratories), que es un anticuerpo IgG1 A de longitud completa de secuencia exclusivamente humana recombinante genéticamente modificado para reconocer la proteína p40 de interleucina 12.

El agente quimioterápico también incluye "inhibidores de EGFR", que se refieren a compuestos que se unen a o de otro modo interactúan directamente con EGFR y previenen o reducen su actividad de señalización, y se denominan de forma alternativa "antagonista de EGFR". Los ejemplos de dichos agentes incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se unen a EGFR. Los ejemplos de anticuerpos que se unen a EGFR incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (véase la patente de EE. UU. n.° 4.943.533, Mendelsohn et al.) y variantes de los mismos, tales como 225 quimerizado (C225 o Cetuximab; ERBUTIX®) y 225 humano (H225) remodelado (véase, el documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, un anticuerpo dirigido a EGFR completamente humano (Imclone); anticuerpos que se unen a EGFR mutante de tipo II (patente de EE. UU. n.° 5.212.290); anticuerpos humanizados y quiméricos que se unen a EGFR como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.891.996; y anticuerpos humanos que se unen a EGFR, tales como ABX-EGF o Panitumumab (véase el documento WO98/50433, Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cáncer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 (matuzumab), un anticuerpo frente a EGFR humanizado dirigido frente a EGFR que compite tanto con EGF como con TGF-alfa por la unión a EGFR (EMD/Merck); anticuerpo frente a EGFR humano, HuMax-EGFR (GenMab); anticuerpos completamente humanos conocidos como E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3.3 y E7.6.3 y descritos en el documento US 6.235.883; MDX-447 (Medarex Inc); y mAb 806 o mAb humanizado 806 (Johns et al, J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)). El anticuerpo anti-EGFR se puede conjugar con un agente citotóxico, generando por tanto un inmunoconjugado (véase, por ejemplo, el documento EP659439A2, Merck Patent GmbH). Los antagonistas de EGFR incluyen moléculas pequeñas tales como los compuestos descritos en las patentes de EE. UU. n.os 5.616.582, 5.457.105, 5.475.001, 5.654.307, 5.679.683, 6.084.095, 6.265.410, 6.455.534, 6.521.620, 6.596.726, 6.713.484, 5.770.599, 6.140.332, 5.866.572, 6.399.602, 6.344.459, 6.602.863, 6.391.874, 6.344.455, 5.760.041,6.002.008 y 5.747.498, así como las siguientes publicaciones PCT: WO98/14451, WO98/50038, WO99/09016 y WO99/24037. Los antagonistas de EGFR de molécula pequeña particulares incluyen OSI-774 (CP-358774, erlotinib, TARCEVA® Genentech/OSI Pharmaceuticals); PD183805 (Cl 1033, 2-propenamida, diclorhidrato de N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[3-(4-morfolinil)propoxi]-6-quinazolinilo], Pfizer Inc.); ZD1839, gefitinib (IRESSA®) (4-(3'-cloro-4'-fluoroanilino)-7-metoxi-6-(3-morfolinopropoxi)quinazolina, AstraZeneca); ZM105180 ((6-amino-4-(3-metilfenil-amino)-quinazolina, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-cloro-4-fluoro-fenil)-N2-(1 -metil-piperidin-4-il)-pirimido[5,4-d]pirimidin-2,8-diamina, Boehringer Ingelheim); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-feniletil)amino]-1H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-il]-fenol); (R)-6-(4-hidroxifenil)-4-[(1-feniletil)amino]-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina); CL-387785 (N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-butinamida); EKB-569 (N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-3-ciano-7-etoxi-6-quinolinil]-4-(dimetilamino)-2-butenamida)(Wyeth); AG1478 (Pfizer); AG1571 (SU5271; Pfizer); e inhibidores de tirosina cinasas EGFR/HER2 dobles tales como lapatinib (TYKERB®, GSK572016 o N-[3-cloro-4-[(3-fluorofenil)metoxi]fenil]-6[5[[[(2-metilsulfonil)etil]amino]metil]-2-furanil]-4-quinazolinamina).

Los agentes quimioterápicos también incluyen "inhibidores de tirosina cinasa", incluyendo los fármacos dirigidos a EGFR indicados en el párrafo precedente; inhibidor de tirosina cinasa para HER2 de moléculas pequeñas, tal como TAK165, disponible de Takeda; CP-724,714, un inhibidor selectivo oral del receptor tirosina cinasa ErbB2 (Pfizer y OSI); inhibidores de HER dobles, tales como EKB-569 (disponible de Wyeth), que se une preferentemente a EGER, pero inhibe tanto las células que sobreexpresan HER2 como EGFR; lapatinib (GSK572016; disponible de Glaxo-SmithKline), un inhibidor de tirosina cinasa oral para HER2 y EGFR; PKI-166 (disponible de Novartis); inhibidores de pan-HER, tales como canertinib (CI-1033; Pharmacia); inhibidores de Raf-1, tales como el agente antisentido ISIS-5132, disponible de ISIS Pharmaceuticals, que inhiben la señalización de Raf-1; inhibidores de TK no dirigidos a HER, tales como mesilato de imatinib (GLEEVEC®, disponible de Glaxo SmithKline); inhibidores de tirosina cinasa con múltiples dianas, tales como sunitinib (SUTENT®, disponible de Pfizer); inhibidores de tirosina cinasa para los receptores de VEGF, tales como vatalanib (PTK787/ZK222584, disponible de Novartis/Schering AG); inhibidor de cinasas reguladas extracelularmente I de MAPK CI-1040 (disponible de Pharmacia); quinazolinas, tales como PD 153035, 4-(3-cloroanilino)quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas; curcumina (diferuloilmetano, 4,5-bis(4-fluoroanilino)ftalimida); tirfostinas que contienen restos nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber); moléculas antisentido (por ejemplo, las que se unen a ácido nucleico que codifica HER); quinoxalinas (patente de EE. UU. n.° 5.804.396); trifostinas (patente de EE. UU. n.° 5.804.396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inhibidores de pan-HER, tales como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de imatinib (GLEEVEC®); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); semaxinib (Pfizer); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering Ag ); INC-1C11 (Imclone), rapamicina (sirólimus, RAPAMUNE®); o como se describe en cualquiera de las siguientes publicaciones de patente: patente de EE. UU. n.° 5.804.396; documentos WO1999/09016 (American Cyanamid); WO1998/43960 (American Cyanamid); WO1997/38983 (Warner Lambert); WO1999/06378 (Warner Lambert); WO1999/06396 (Warner Lambert); WO1996/30347 (Pfizer, Inc); WO1996/33978 (Zeneca); WO1996/3397 (Zeneca) y WO1996/33980 (Zeneca).

Los agentes quimioterápicos también incluyen dexametasona, interferones, colquicina, metoprina, ciclosporina, anfotericina, metronidazol, alemtuzumab, alitretinoína, alopurinol, amifostina, trióxido de arsénico, asparaginasa, BCG viva, bevacuzimab, bexaroteno, cladribina, clofarabina, darbepoetina alfa, denileucina, dexrazoxano, epoetina alfa, elotinib, filgrastim, acetato de histrelina, ibritumomab, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, lenalidomida, levamisol, mesna, metoxaleno, nandrolona, nelarabina, nofetumomab, oprelvecina, palifermina, pamidronato, pegademasa, pegaspargasa, pegfilgrastim, pemetrexed disódico, plicamicina, porfímero sódico, mepacrina, rasburicasa, sargramostim, temozolomida, VM-26, 6-TG, toremifeno, tretinoína, ATRA, valrrubicina, zoledronato y ácido zoledrónico y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Los agentes quimioterápicos también incluyen hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, acetato de cortisona, pivalato de tixocortol, acetónido de triamcinolona, alcohol de triamcinolona, mometasona, amcinonida, budesonida, desonida, fluocinonida, acetónido de fluocinolona, betametasona, fosfato sódico de betametasona, dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, fluocortolona, 17-butirato de hidrocortisona, 17-valerato de hidrocortisona, dipropionato de aclometasona, valerato de betametasona, dipropionato de betametasona, prednicarbato, 17-butirato de clobetasona, 17-propionato de clobetasol, caproato de fluocortolona, pivalato de fluocortolona y acetato de fluprednideno; péptidos antiinflamatorios selectivos inmunitarios (ASIM) tales como fenilalanina-glutamina-glicina (FEG) y su forma isomérica D (feG) (IMULAN BioTherapeutics, LLC); fármacos antirreumáticos tales como azatioprina, ciclosporina (ciclosporina A), D-penicilamina, sales de oro, hidroxicloroquina, leflunomida minociclina, sulfasalazina, bloqueantes del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) tales como etanercept (Enbrel), infliximab (Remicade), adalimumab (Humira), certolizumab pegol (Cimzia), golimumab (Simponi), bloqueantes de interleucina 1 (IL-1) tales como anakinra (Kineret), bloqueantes de la coestimulación de linfocitos T tales como abatacept (Orencia), bloqueantes de la interleucina 6 (IL-6) tales como tocilizumab (ACTEMERA®); bloqueantes de la interleucina 13 (IL-13) tales como lebrikizumab; bloqueantes del interferón alfa (IFN) tales como rontalizumab; bloqueantes de la integrina beta 7 tales como rhuMAb Beta7; bloqueantes de la vía de la IgE tales como anti-M1 prima; LTa3 homotrimérico secretado y LTa1 heterotrímero unido a membrana/bloqueantes de p2 tales como antilinfotoxina alfa (LTa); isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu); diversos agentes en investigación tales como tioplatino, PS-341, fenilbutirato, ET-18- OCH3 o inhibidores de la farnesil transferasa (L-739749, L-744832); polifenoles tales como quercetina, resveratrol, piceatanol, galato de epigalocatequina, teaflavinas, flavanoles, procianidinas, ácido betulínico y derivados de los mismos; inhibidores de la autofagia tales como cloroquina; delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colquicinas; ácido betulínico; acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); podofilotoxina; tegafur (UFTORAL®); bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®); y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas tales como la vacuna THERATOPE®; perifosina, inhibidor de la COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib), inhibidor de proteasoma (por ejemplo, PS341); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersen de sodio (GENASENSE®); pixantrona; inhibidores de la farnesiltransferasa tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una politerapia de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para una pauta de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y ácido folínico.

Los agentes quimioterápicos también incluyen antinflamatorios no esteroideos con efectos analgésicos, antipiréticos y antinflamatorios. Los AINE incluyen inhibidores no selectivos de la enzima cicloxigenasa. Los ejemplos específicos de AINE incluyen aspirina, derivados de ácido propiónico, tales como ibuprofeno, fenoprofeno, cetoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina y naproxeno, derivados de ácido acético, tales como indometacina, sulindac, etodolaco, diclofenaco, derivados de ácido enólico, tales como piroxicam, meloxicam, tenoxicam, droxicam, lornoxicam e isoxicam, derivados de ácido fenámico, tales como ácido mefenámico, ácido meclofenámico, ácido flufenámico, ácido tolfenámico e inhibidores de COX-2, tales como celecoxib, etoricoxib, lumiracoxib, parecoxib, rofecoxib, rofecoxib y valdecoxib. Los AINE pueden estar indicados para el alivio sintomático de afecciones tales como artritis reumatoide, artrosis, artropatías inflamatorias, espondiloartritis anquilosante, artritis psoriásica, síndrome de Reiter, gota aguda, dismenorrea, dolor óseo metastásico, cefalea y migraña, dolor posoperatorio, dolor de leve a moderado debido a inflamación y lesión tisular, fiebre, íleo y cólico renal.

Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, ya sea in vitro o in vivo. En un aspecto, el agente inhibidor del crecimiento es un anticuerpo inhibidor del crecimiento que previene o reduce la proliferación de una célula que expresa un antígeno al que se une el anticuerpo. En otro aspecto, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la interrupción de G1 y la interrupción de la fase M. Los bloqueantes de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de la topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Estos agentes que interrumpen la G1 también actúan extendiéndose a la interrupción de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes del ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluoruracilo y Ara-C. Otra información se puede encontrar en Mendelsohn e Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", por Murakami et al. (W.B. Saunders, Filadelfia, 1995), por ejemplo, p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos antineoplásicos derivados ambos del árbol del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos previniendo la despolimerización, lo que da como resultado la inhibición de mitosis en células.

Por "radioterapia" se quiere decir el uso de rayos beta o rayos gamma dirigidos para inducir suficiente daño a una célula para limitar su capacidad de funcionar normalmente o destruir la célula por completo. Se apreciará que existen muchas formas conocidas en la técnica para determinar la dosificación y duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se dan como una administración en una sola dosis y las dosificaciones típicas varían de 10 a 200 unidades (Gy) por día.

Un "sujeto" o un "individuo" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, para la práctica de deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, ganado bovino, etc. Preferentemente, el mamífero es un ser humano. Un individuo o sujeto puede ser un paciente.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad biológica deseada.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos de investigación, diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En algunos aspectos, un anticuerpo se purifica (1) hasta más de un 95 % en peso de anticuerpo como se determina, por ejemplo, por el procedimiento de Lowry, y en algunos aspectos, hasta más de un 99 % en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna por el uso, por ejemplo, de un secuenciador de vaso giratorio o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando, por ejemplo, tinción con azul de Coomassie o plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

Los "anticuerpos naturales" son normalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulina diferentes. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V^h) seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V^l) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos aminoacídicos particulares forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada.

El término "dominio constante" se refiere a la porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos más conservada con relación a la otra porción de la inmunoglobulina, el dominio variable, que contiene el sitio de unión a antígeno. El dominio constante contiene los dominios C^h1, C^h2 y C^h3 (conjuntamente, CH) de la cadena pesada y el dominio CHL (o CL) de la cadena ligera.

La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios aminoterminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada se puede denominar "V^h". El dominio variable de la cadena ligera se puede denominar "V^l". Estos dominios son en general las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antígeno.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas partes de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente por todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables (HVR), en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones estructurales (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina beta, conectadas por tres HVR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las HVR en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las HVR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de mamífero se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa ("k") y lambda ("A"), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

El término "isotipo" o "subclase" de IgG como se usa en el presente documento quiere decir cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes.

Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden asignar a clases diferentes. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1 , IgG2 , IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, y , £, Y y M, respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de las clases diferentes de inmunoglobulinas son bien conocidas y se describen en general en, por ejemplo, Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4.a ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos.

Los términos "anticuerpo de longitud completa', "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Los términos se refieren en particular a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fc.

Un "anticuerpo no marcado" para los propósitos en el presente documento es un anticuerpo que no está conjugado con un resto citotóxico o radiomarcador.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión a antígeno del mismo. En algunos aspectos, el fragmento de anticuerpo descrito en el presente documento es un fragmento de unión a antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, con un nombre que refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con antígeno y todavía se puede reticular con el antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión a antígeno completo. En un aspecto, una especie de Fv bicatenario consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera en asociación estrecha no covalente. En una especie de Fv monocatenario (scFv) un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera se pueden enlazar de forma covalente por un conector peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada se puedan asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv bicatenario. Es en esta configuración en la que las tres HVR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Conjuntamente, las seis HVR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab contiene los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para un Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenarios" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica única. En general, el polipéptido scFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios Vh y Vl lo que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de scFv, véase, por ejemplo, Pliickthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Usando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

El término "anticuerpo monoclonal', como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de distintos anticuerpos. En determinados aspectos, un anticuerpo monoclonal de este tipo incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en el que la secuencia polipeptídica de unión a diana se obtuvo por un procedimiento que incluye la selección de una secuencia polipeptídica de unión a diana única de una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el procedimiento de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones de fago o clones de ADN recombinante. Se debe entender que una secuencia de unión a diana seleccionada se puede alterar adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a diana, para mejorar su producción en el cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a diana alterada también es un anticuerpo monoclonal como se describe en el presente documento. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas ya que típicamente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas.

El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente divulgación se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el procedimiento del hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU n.° 4.816.567), tecnologías de presentación en fagos (véanse, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a humanos en animales que tienen partes o todos los locus de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, los documentos WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); patentes de EE. UU n.os 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos PRIMATIZED® en los que la región de unión a antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido, por ejemplo, inmunizando macacos con el antígeno de interés.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En un aspecto, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de una HVR del receptor se reemplazan por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos FR de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden realizar para refinar además el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprenderá también al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véanse también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Alergia, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y las patentes de EE. UU. n.os 6.982.321 y 7.087.409.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos como se divulga en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo colecciones de presentación en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los procedimientos descritos en Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Véase también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a la exposición antigénica, pero con locus endógenos que se han inactivado, por ejemplo, xenorratones inmunizados (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584 con respecto a la tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) con respecto a anticuerpos humanos generados por medio de una tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos.

Un "anticuerpo dependiente de la especie" es uno que tiene una afinidad de unión más fuerte por un antígeno de una primera especie de mamífero que la que tiene por un homólogo de ese antígeno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de la especie se "une específicamente" a un antígeno humano (por ejemplo, tiene un valor de afinidad de unión (K^d) de no más de aproximadamente 1x10'7 M, preferentemente de no más de aproximadamente 1x10'8 M y preferentemente no más de aproximadamente 1x10'9 M) pero tiene una afinidad de unión por un homólogo del antígeno de una segunda especie de mamífero no humano que es al menos aproximadamente 50 veces, o al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión por el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de la especie puede ser cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos como se define anteriormente, pero preferentemente es un anticuerpo humanizado o humano.

El término "región hipervariable", "HVR' o "HV, cuando se usa en el presente documento, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). En anticuerpos naturales, H3 y L3 presentan la mayor diversidad de las seis HVR, y se cree que H3 en particular desempeña un papel exclusivo al conferir una especificidad precisa a los anticuerpos. Véanse, por ejemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu, en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003). De hecho, los anticuerpos de camélido naturales que consisten en una cadena pesada solo son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera. Véanse, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

Varias delimitaciones de HVR están en uso y se engloban en el presente documento. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las usadas más comúnmente (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia se refiere en cambio a la localización de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las HVR de AbM representan un término medio entre las HVR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan por el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVR de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVR se indican a continuación.

Bucle Kabat AbM Chothia Contacto

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeración de Kabat)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeración de Chothia)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

Las HVR pueden comprender "HVR extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en el VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en el VH. Los residuos del dominio variable se enumeran de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones.

Los residuos "estructurales" o "FR" son los residuos del dominio variable distintos de los residuos de HVR como se define en el presente documento.

El término "numeración de residuos de dominio variable según Kabat" o "numeración de posiciones aminoacídicas según Kabat', y variaciones de la misma, se refiere al sistema de numeración usado para dominios variables de la cadena pesada o dominios variables de la cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de o inserción en una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una única inserción aminoacídica (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de la FR de la cadena pesada. La numeración de residuos de Kabat se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada según Kabat "estándar".

El sistema de numeración de Kabat se usa en general cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). El "sistema de numeración EU" o "índice EU" se usa en general cuando se hace referencia a un residuo en una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU informado en Kabat et al., supra). El "índice EU según Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo humano IgG1 EU.

La expresión "anticuerpos lineales" se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, conjuntamente con polipéptidos de la cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Como se usa en el presente documento, el término "se une", "se une específicamente a" o es "específico para " se refiere a interacciones medibles y reproducibles tales como la unión entre una diana y un anticuerpo, que es determinante de la presencia de la diana en presencia de una población heterogénea de moléculas incluyendo moléculas biológicas. Por ejemplo, un anticuerpo que se une a o se une específicamente a una diana (que puede ser un epítopo) es un anticuerpo que se une a esta diana con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que con la que se une a otras dianas. En un aspecto, el grado de unión de un anticuerpo a una diana no relacionada es menor de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a la diana como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados aspectos, un anticuerpo que se une específicamente a una diana tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM o < 0,1 nM. En determinados aspectos, un anticuerpo se une específicamente a un epítopo en una proteína que se conserva entre la proteína de diferentes especies. En otro aspecto, la unión específica puede incluir, pero no requiere, una unión exclusiva.

El término "biespecífica" quiere decir que la molécula de unión a antígeno se puede unir específicamente a al menos dos determinantes antigénicos distintos. Típicamente, una molécula de unión a antígeno biespecífica comprende dos sitios de unión a antígeno, de los que cada uno es específico para un determinante antigénico diferente. En determinados aspectos, la molécula de unión a antígeno biespecífica se puede unir simultáneamente a dos determinantes antigénicos, en particular dos determinantes antigénicos expresados en dos células distintas.

El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria a parte o la totalidad de un antígeno. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamados regiones variables de anticuerpo). Preferentemente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH).

Una "molécula Fab" se refiere a una proteína que consiste en el dominio VH y CH1 de la cadena pesada (la "cadena pesada de Fab") y el dominio VL y c L de la cadena ligera (la "cadena ligera de Fab") de una inmunoglobulina.

Por molécula Fab de "entrecruzamiento" (también denominada "Crossfab") se quiere decir una molécula Fab en la que los dominios variables o los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian (es decir, se reemplazan entre sí), es decir, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta del dominio variable de la cadena ligera VL y el dominio constante de la cadena pesada 1 CH1 (VL-CH1, en sentido N a C terminal), y una cadena peptídica compuesta de la dominio variable de la cadena pesada VH y el dominio constante de la cadena ligera CL (VH-CL, en sentido N a C terminal). Por claridad, en una molécula Fab de entrecruzamiento en la que los dominios variables de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian, la cadena peptídica que comprende el dominio constante de la cadena pesada 1 CH1 se denomina en el presente documento "cadena pesada" de la molécula Fab (de entrecruzamiento). Por el contrario, en una molécula Fab de entrecruzamiento en la que los dominios constantes de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian, la cadena peptídica que comprende el dominio variable de la cadena pesada VH se denomina en el presente documento "cadena pesada" de la molécula Fab (de entrecruzamiento).

Al contrario que esto, por una molécula Fab "convencional' se quiere decir una molécula Fab en su formato natural, es decir, que comprende una cadena pesada compuesta de los dominios variable y constante de la cadena pesada (VH-CH1, en sentido N a C terminal), y una cadena ligera compuesta de los dominios variable y constante de la cadena ligera (VL-CL, en sentido N a C terminal).

El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente por extenderse de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxiterminal de la cadena pesada. Sin embargo, los anticuerpos producidos por células huésped pueden experimentar escisión postraduccional de uno o más, en particular uno o dos, aminoácidos del extremo C de la cadena pesada. Por lo tanto, un anticuerpo producido por una célula huésped por expresión de una molécula de ácido nucleico específica que codifica una cadena pesada de longitud completa puede incluir la cadena pesada de longitud completa, o puede incluir una variante escindida de la cadena pesada de longitud completa (también denominada en el presente documento una "cadena pesada variante escindida"). Este puede ser el caso cuando los dos aminoácidos C terminales finales de la cadena pesada son glicina (G446) y lisina (K447, numeración EU). Por lo tanto, la lisina C terminal (Lys447), o la glicina (Gly446) y lisina (K447) C terminales, de la región Fc pueden estar presentes o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991 (véase también anteriormente). Una "subunidad' de un dominio Fc como se usa en el presente documento se refiere a uno de los dos polipéptidos que forman el dominio Fc dimérico, es decir, un polipéptido que comprende regiones constantes C terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, que pueden tener autoasociación estable. Por ejemplo, una subunidad de un dominio Fc de IgG comprende un dominio constante CH2 de IgG y uno CH3 de IgG.

Por "fusionado" se quiere decir que los componentes (por ejemplo, una molécula Fab y una subunidad de dominio Fc) se unen por enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más conectores peptídicos.

Una "modificación que promueve la heterodimerización" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido, por ejemplo, una cadena pesada de inmunoglobulina, que reduce o evita la asociación del polipéptido con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la heterodimerización como se usa en el presente documento incluye en particular las modificaciones separadas hechas a cada uno de dos polipéptidos deseados para formar un dímero, en el que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de los dos polipéptidos. Por ejemplo, una modificación que promueve la heterodimerización puede alterar la estructura o carga de uno o ambos de los polipéptidos deseados para formar un dímero para hacer su asociación estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. La heterodimerización se produce entre dos polipéptidos no idénticos, por ejemplo, dos cadenas pesadas de inmunoglobulina en las que las regiones variables no son iguales. En algunos aspectos, la modificación que promueve la heterodimerización comprende una mutación aminoacídica, específicamente una sustitución aminoacídica. En un aspecto particular, la modificación que promueve la heterodimerización comprende una mutación aminoacídica separada, específicamente una sustitución aminoacídica, en cada uno de los dos polipéptidos deseados para formar un dímero.

Un "receptor de Fc activadot" es un receptor de Fc que después del acoplamiento por una región Fc de un anticuerpo provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula que porta el receptor para realizar funciones efectoras. Los receptores de Fc activadores incluyen FcYRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).

El término "funciones efectoras" cuando se usa en referencia a anticuerpos se refiere las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión a receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por complejo inmunitario por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

II. Antagonistas de la unión al eje PD-1

En el presente documento se describe un procedimiento para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3. También se describe en el presente documento un procedimiento de potenciación de la función inmunitaria en un individuo que tiene cáncer que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3. Por ejemplo, un antagonista de unión al eje PD-1 incluye un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2. PD-1 (muerte programada 1) también se denomina en la técnica "muerte celular programada 1", PDCD1, CD279 y SLEB2. PD-L1 (ligando de muerte programada 1) también se denomina en la técnica "ligando 1 de muerte celular programada 1", PDCD1LG1, CD274, B7-H y PDL1. Un PD-L1 humano ejemplar se muestra en UniProtKB/Swiss-Prot con n.° de acceso Q9NZQ7.1. PD-L2 (ligando de muerte programada 2) también se denomina en la técnica "ligando 2 de muerte celular programada 1", PDCD1LG2, CD273, B7-DC, Btdc y p Dl2. Un PD-L2 humano ejemplar se muestra en UniProtKB/Swiss-Prot con n.° de acceso Q9BQ51. En algunos aspectos, PD-1, PD-L1 y PD-L2 son PD-1, PD-L1 y PD-L2 humanos.

En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-1 es una molécula que inhibe la unión de PD-1 a sus compañeros de unión ligandos. En un aspecto específico, los compañeros de unión ligandos de PD-1 son PD-L1 y/o PD-L2. En otro aspecto, un antagonista de unión a PD-L1 es una molécula que inhibe la unión de PD-L1 a sus compañeros de unión. En un aspecto específico, los compañeros de unión a PD-L1 son PD-1 y/o B7-1. En otro aspecto, el antagonista de unión a PD-L2 es una molécula que inhibe la unión de PD-L2 a sus compañeros de unión. En un aspecto específico, un compañero de unión a PD-L2 es PD-1. El antagonista puede ser un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno del mismo, una inmunoadhesina, una proteína de fusión u oligopéptido.

En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico). En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-1 se selecciona del grupo que consiste en MDX 1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab), CT-011 (pidilizumab), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810 y BGB-108. En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-1 es una inmunoadhesina (por ejemplo, una inmunoadhesina que comprende una porción extracelular o de unión a PD-1 de PD-L1 o PD-L2 fusionada a una región constante (por ejemplo, una región Fc de una secuencia de inmunoglobulina)). En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-1 es AMP-224. En algunos aspectos, el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo anti-PD-L1. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en YW243.55.S70, MPDL3280A (atezolizumab), MDX-1105, MEDI4736 (durvalumab) y MSB0010718C (avelumab). El anticuerpo YW243.55.S70 es un anti-PD-L1 descrito en el documento WO2010/077634. MDX-1105, también conocido como BMS-936559, es un anticuerpo anti-PD-L1 descrito en el documento WO2007/005874. MEDI4736 es un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 descrito en los documentos WO2011/066389 y US2013/034559. Nivolumab, también conocido como MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, y OPDIVO®, es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el documento WO2006/121168. Pembrolizumab, también conocido como MK-3475, Merck 3475, lambrolizumab, KEYTRUDA® y SCH-900475, es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el documento WO2009/114335. CT-011, también conocido como hBAT, hBAT-1 o pidilizumab, es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el documento WO2009/101611. AMP-224, también conocido como B7-DCIg, es un receptor soluble de fusión PD-L2-Fc descrito en los documentos WO2010/027827 y WO2011/066342.

En algunos aspectos, el antagonista de la unión al eje PD-1 es un anticuerpo anti-PD-L1. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 puede inhibir la unión entre PD-L1 y PD-1 y/o entre PD-L1 y B7-1. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y (Fab')2. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo humanizado. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo humano.

Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-L1 útiles para los procedimientos, usos, composiciones y kits descritos en el presente documento, y los procedimientos para prepararlos, se describen en las publicaciones PCT n.os WO 2010/077634, WO2007/005874, WO2011/066389 y US2013/034559. Los anticuerpos anti-PD-L1 útiles en la presente divulgación, incluyendo composiciones que contienen dichos anticuerpos, se pueden usar en combinación con un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 para tratar el cáncer.

Anticuerpos anti-PD1

En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-1 es MDX-1106. Los nombres alternativos para "MDX-1106" incluyen MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 o nivolumab. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-1 es nivolumab (número de registro de CAS: 946414-94-4). Todavía en otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PD-1 aislado que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:1 y/o una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:2. Todavía en otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PD-1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y/o cadena ligera, en el que:

(a) la secuencia de la cadena pesada tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena pesada:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDG

SKRYYADSVKGRFTLSRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVT

VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA

VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE

FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS1EKTISKAKGQPREP

QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS

FFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK _{(SEQ ID NO:1), y}

(b) la secuencia de la cadena ligera tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena ligera:

E1VLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLL1YDASNRATG1

PARFSGSGSGTDFTLTTSSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFT

FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY

SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ^{(s e q ID NO:2).}

Anticuerpos anti-PD-L1

Los anticuerpos anti-PD-L1 descritos en los documentos WO 2010/077634 A1 y US 8.217.149 se pueden usar en los procedimientos, usos, composiciones y kits descritos en el presente documento. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:3 y/o una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:4. Todavía en otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y/o cadena ligera, en el que:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW1HWVRQAPGKGLEWVAWISPYGG

STYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQG

TLVTVSA ^{(SEQ ID NO:3),} _y

D1QMTQSPSSLSASVGDRVT1TCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLL1YSASFLYSG

(SEQ ID

En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-LI comprende un polipéptido de región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en la que:

^{(a) la secuencia de HVR-H1 es} GFTFSXiSW1H ^{(SEQ ID NO:5);}

^{(b) la secuencia de HVR-H2 es} AWIX ² PYGGSX ³ YYADSVKG ^{(SEQ ID NO:6 );}

^{(c) la secuencia de HVR-H3 es} RHWPGGFDY ^{(SEQ ID NO:7);}

en la que además: X1 es D o G; X2 es S o L; X3 es T o S. En un aspecto específico, X 1 es D; X2 es S y X3 es T.

En otro aspecto, el polipéptido comprende además secuencias estructurales de la cadena pesada de la región variable yuxtapuestas entre las HVR de acuerdo con la fórmula: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4). Aún en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. En otro aspecto, las secuencias estructurales son la secuencia estructural consenso de subgrupo III de VH. Todavía en otro aspecto, al menos una de las secuencias estructurales es la siguiente:

^{HC-FR1 es} EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS ^{(SEQ ID NO:8 )}

^{HC-FR2 es} WVRQAPGKGLEWV ^{(SEQ ID NO:9)}

^{HC-FR3 es} RFT1SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ^{ID NO: 10)}

^{HC-FR4 es} WGQGTLVTVSA ^{(SEQ ID NO: 11).}

Todavía en otro aspecto, el polipéptido de la cadena pesada se combina además con una cadena ligera de región variable que comprende una HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en la que:

(a) la secuencia de HVR-L1 es R A S Q X 4 X 5 X 6 T X 7 XSA (SEQ ID NO: 12);

^{(b) la secuencia de HVR-L2 es} SASX^LXioS, ^{(SEQ ID NO: 13);}

^{(c) la secuencia de HVR-L3 es} QQXiiX iiX iíXmPXisT ^{(SEQ ID NO: 14);}

en la que: X4 es D o V; X5 es V o I; X6 es S o N; X7 es A o F; X8 es V o L; X9 es F o T; X10 es Y o A; X11 es Y, G, F, o S; X12 es L, Y, F o W; X13 es Y, N, A, T, G, F o I; X 14 es H, V, P, T o I; X15 es A, W, R, P o T. Todavía en otro aspecto, X4 es D; X5 es V; X6 es S; X7 es A; X8 es V; X9 es F; X10 es Y; X11 es Y; X12 es L; X13 es Y; X14 es H; X15 es A.

Todavía en otro aspecto, la cadena ligera comprende además secuencias estructurales de la cadena ligera de la región variable yuxtapuestas entre las HVR de acuerdo con la fórmula: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales son una estructura consenso de kappa I de VL. Todavía en otro aspecto, al menos una de las secuencias estructurales es la siguiente:

^{LC-FR1 es} DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC ^{(SEQ ID NO: 15)}

^{LC-FR2 es} WYQQKPGKAPKLLIY ^{(SEQ ID NO: 16)}

^{LC-FR3 es} GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC ^{(SEQ ID NO: 17)}

^{LC-FR4 es} FGQGTKVEIKR ^{(SEQ ID NO: 18).}

En otro aspecto se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado o fragmento de unión a antígeno que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que:

(a) la cadena pesada comprende una HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en el que además:

^{(i) la secuencia de HVR-H1 es} GFTFSXiSW1H; ^{(SEQ ID NO:5)}

^{(¡i) la secuencia de HVR-H2 es} AWIX ² PYGGSX ³ YYADSVKG ^{(SEQ ID NO:6)}

^{(i¡¡) la secuencia de HVR-H3 es} RHWPGGFDY, ^{y (SEQ ID NO:7)}

(b) la cadena ligera comprende una HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en el que además:

(i) la secuencia de HVR-L1 es R A S Q X 4 X Í X 6 T X 7 X 8A (SEQ ID NO: 12)

^{(¡i) la secuencia de HVR-L2 es}SASX⁹LX ¹⁰S; ^{y (SEQ ID NO:13)}

(i¡¡) la secuencia de HVR-L3 es Q Q X u X ^ X b X wP X ijT; (SEQ ID NO: 14)

en la que: X 1 es D o G; X2 es S o L; X3 es T o S; X4 es D o V; X5 es V o I; X6 es S o N; X7 es A o F; X8 es V o L; X9 es F o T; X10 es Y o A; X 11 es Y, G, F o S; X 12 es L, Y, F o W; X 13 es Y, N, A, T, G, F o I; X14 es H, V, P, T o I; X15 es A, W, R, P o T. En un aspecto específico, X 1 es D; X2 es S y X3 es T. En otro aspecto, X4 es D; X5 es V; X6 es S; X7 es A; X8 es V; X9 es F; X10 es Y; X11 es Y; X12 es L; X13 es Y; X14 es H; X15 es A. Aún en otro aspecto, X1 es D; X2 es S y X3 es T, X4 es D; X5 es V; X6 es S; X7 es A; X8 es V; X9 es F; X10 es Y; X11 es Y; X12 es L; X13 es Y; X14 es H y X15 es A.

En otro aspecto, la región variable de la cadena pesada comprende una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena pesada se derivan de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. Todavía en otro aspecto, la secuencia estructural de la cadena pesada es una secuencia estructural consenso del subgrupo III de VH. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena pesada se exponen como SEQ ID NO:8, 9, 10 y 11. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera se derivan de una secuencia del subgrupo kappa I, II, II o IV de Kabat. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera son una secuencia estructural consenso de kappa I de VL. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena ligera se exponen como SEQ ID NO:15, 16, 17 y 18.

Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo comprende además una región constante humana o murina. Todavía en otro aspecto, la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. Todavía en otro aspecto específico, la región constante humana es IgG1. Todavía en otro aspecto, la región constante murina se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. Todavía en otro aspecto, la región constante murina es IgG2A. Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo tiene una función efectora reducida o mínima. Todavía en otro aspecto específico, la función efectora mínima resulta de una "mutación de Fc menos efectora" o aglucosilación. Todavía en otro aspecto, la mutación de Fc menos efectora es una sustitución N297A o D265A/N297A en la región constante.

Aún en otro aspecto se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que:

(a) la cadena pesada comprende además una secuencia de HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 que tiene al menos un 85 % ^{de identidad de secuencia con} GFTFSDSW1H ^{(SEQ ID NO:19),} AWISPYGGSTYYADSVKG ^{(SEQIDNO:20) y} RHWPGGFDY ^{(SEQ ID NO:21), respectivamente, o}

(b) la cadena ligera comprende además una secuencia de HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 que tiene al menos un 85 % de ^{identidad de secuencia con}RASQDVSTAVA ^{(SEQ ID NO:22),}SASFLYS ^{(SEQ ID NO:23) y}QQYLYIIPAT ^{(SEQ ID NO:24), respectivamente.}

En un aspecto específico, la identidad de secuencia es un 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.

En otro aspecto, la región variable de la cadena pesada comprende una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Aún en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena pesada se derivan de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. Todavía en otro aspecto, la secuencia estructural de la cadena pesada es una secuencia estructural consenso del subgrupo III de VH. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena pesada se exponen como SEQ ID NO:8, 9, 10 y 11. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera se derivan de una secuencia del subgrupo kappa I, II, II o IV de Kabat. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera son una secuencia estructural consenso de kappa I de VL. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena ligera se exponen como SEQ ID NO:15, 16, 17 y 18.

En otro aspecto además, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que:

(a) la secuencia de la cadena pesada tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena pesada:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW1HWVRQAPGKGLEWVAW1SPYGG

STYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQG

TLVTVSS ^{(SEQ |D N o : 2 5 ) , y/o}

(b) la secuencia de la cadena ligera tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de la cadena ligera:

DIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVE1KR (SEQ |D N O : 4 ) .

En un aspecto específico, la identidad de secuencia es un 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. En otro aspecto, la región variable de la cadena pesada comprende una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Aún en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. En otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena pesada se derivan de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. Todavía en otro aspecto, la secuencia estructural de la cadena pesada es una secuencia estructural consenso del subgrupo III de VH. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena

^{pesada se exponen como SEQ ID N O : 8 , 9 , 10 y}WGQG7LV J VSS ^{(SEQ |D N O : 2 7 ) .}

Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera se derivan de una secuencia del subgrupo kappa I, II, II o IV de Kabat. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera son una secuencia estructural consenso de kappa I de VL. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena ligera se exponen como SEQ ID NO:15, 16, 17 y 18.

Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo comprende además una región constante humana o murina. Todavía en otro aspecto, la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. Todavía en otro aspecto específico, la región constante humana es IgG1. Todavía en otro aspecto, la región constante murina se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. Todavía en otro aspecto, la región constante murina es IgG2A. Todavía en otro aspecto específico, el anticuerpo tiene una función efectora reducida o mínima. Todavía en otro aspecto específico, la función efectora mínima resulta de la producción en células procariotas. Todavía en otro aspecto específico, la función efectora mínima resulta de una "mutación de Fc menos efectora" o aglucosilación. Todavía en otro aspecto, la mutación de Fc menos efectora es una sustitución N297A o D265A/N297A en la región constante.

En otro aspecto, la región variable de la cadena pesada comprende una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1 )-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena pesada se derivan de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. Todavía en otro aspecto, la secuencia estructural de la cadena pesada es una secuencia estructural consenso del subgrupo III de VH. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena pesada es la siguiente:

^HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS ^{(SEQ ID NO:29)}

^HC-FR2 WVRQAPGKGLEWVA ^{(SEQ ID NO:30)}

^HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR ^{(SEQ ID NO: 10)}

HC-FR4 W G Q G T L V T V S S (SEQ ID NO:27).

Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera se derivan de una secuencia del subgrupo kappa I, II, II o IV de Kabat. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena ligera son una secuencia estructural consenso de kappa I de VL. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena ligera es la siguiente:

^LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC ^{(SEQ ID NO :15)}

^LC-FR2 WY ^{Q Q K P G K} APKLLIY ^{(SEQ ID NO: 16)}

^LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC ^{(SEQ ID NO: 17)}

^LC-FR4 FGQGTKVEIK ^{(SEQ ID NO:28).}

(c) la cadena pesada comprende además una secuencia de HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 que tiene al menos un 85 % ^{de identidad de secuencia con} GFTFSDSWIH ^{(SEQ ID NO: 19),} AWISPYGGSTYYADSVKG ^{(SEQIDNO:20) y} RHWPGGFDY ^{(SEQ ID NO:21), respectivamente, y/o}

(d) la cadena ligera comprende además una secuencia de HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 que tiene al menos un 85 % de ^{identidad de secuencia con} RASQDVSTAVA ^{(SEQ ID NO:22),} SASFLYS ^{(SEQ ID NO:23) y} QQYLYHPAT (SEQ ID NO:24), respectivamente.

En otro aspecto, la región variable de la cadena pesada comprende una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y las regiones variables de la cadena ligera comprenden una o más secuencias estructurales yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1 )-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4). Aún en otro aspecto, las secuencias estructurales se derivan de secuencias estructurales consenso humanas. Todavía en otro aspecto, las secuencias estructurales de la cadena pesada se derivan de una secuencia del subgrupo I, II o III de Kabat. Todavía en otro aspecto, la secuencia estructural de la cadena pesada es una secuencia estructural consenso del subgrupo III de VH. Todavía en otro aspecto, una o más de las secuencias estructurales de la cadena pesada se exponen como SEQ ID NO:8, 9, 10 y WGQGTLVTVSS ASTK (SEQ ID NO:31).

Todavía en otro aspecto se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW1HWVRQAPGKGLEWVAWISPYGG

STYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQG

TLVTVSS ^{(SEQ ID NO:25), o}

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR ^{(SEQ ID}NO:4).

En algunos aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que la secuencia de la región variable de la cadena ligera tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. En algunos aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que la secuencia de la región variable de la cadena pesada tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25. En algunos aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que la secuencia de la región variable de la cadena ligera tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25. En algunos aspectos, uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos aminoacídicos en el extremo N de la cadena pesada y/o ligera se pueden delecionar, sustituir o modificar.

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW1HWVRQAPGKGLEWVAWISPYGG

STYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQG T LVTVSSASTK ^{(SEQ ID NO:26) o}

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR ^{(SEQ ID}NO:4).

En algunos aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que la secuencia de la región variable de la cadena ligera tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. En algunos aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que la secuencia de la región variable de la cadena pesada tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26. En algunos aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que la secuencia de la región variable de la cadena ligera tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26. En algunos aspectos, uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos aminoacídicos en el extremo N de la cadena pesada y/o ligera se pueden delecionar, sustituir o modificar.

Todavía en otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW1HWVRQAPGKGLEWVAWISPYGG

STYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQG

TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV

HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ^{(SEQ ID}NO:32), y/o

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSV

F1FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST

YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ^{(SEQ ID NO:33)}

Todavía en otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-PD-LI aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSW1HWVRQAPGKGLEWVAW1SPYGG

STYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQG

TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV

HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTP

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQCiNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(SEQ ID}NO:56), y/o

DIQMTQSPSSLSASVGDRVT1TCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLL1YSASFLYSG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSV

F1FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST

YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ |D NQ 33)

En algunos aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que la secuencia de la cadena ligera tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33. En algunos aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que la secuencia de la cadena pesada tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 o 56. En algunos aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que la secuencia de la cadena ligera tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y la secuencia de la cadena pesada tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 o 56. En algunos aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado que comprende una secuencia de la cadena pesada y una de la cadena ligera, en el que la secuencia de la cadena ligera tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33 y la secuencia de la cadena pesada tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32.

En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 aislado está aglucosilado. La glucosilación de anticuerpos es típicamente unida a N o bien unida a O. Unida a N se refiere al acoplamiento del resto glucídico a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para el acoplamiento enzimático del resto glucídico a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación unida a O se refiere al acoplamiento de uno de los glúcidos N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La retirada de sitios de glucosilación de un anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se retira una de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glucosilación unida a N). La alteración se puede realizar por sustitución de un residuo asparagina, serina o treonina dentro del sitio de glucosilación con otro residuo aminoacídico (por ejemplo, glicina, alanina o una sustitución conservadora).

En cualquiera de los aspectos en el presente documento, el anticuerpo anti-PD-L1 aislado se puede unir a un PD-L1 humano, por ejemplo, un PD-L1 humano como se muestra en UniProtKB/Swiss-Prot, n.° de acceso Q9NZQ7.1, o una variante del mismo.

Todavía en otro aspecto, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. En algunos aspectos, el ácido nucleico comprende además un vector adecuado para la expresión del ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-PDL1 descritos previamente. Todavía en otro aspecto específico, el vector es una célula huésped adecuada para la expresión del ácido nucleico. Todavía en otro aspecto específico, la célula huésped es una célula eucariota o una célula procariota. Todavía en otro aspecto específico, la célula eucariota es una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede preparar usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, por un procedimiento que comprende cultivar una célula huésped que contiene ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-PDL1 o fragmento de unión a antígeno descritos previamente en una forma adecuada para la expresión, en condiciones adecuadas para producir dicho anticuerpo o fragmento, y recuperar el anticuerpo o fragmento.

III. Anticuerpos biespecíficos anti-CEA/anti-CD3

En el presente documento se describe un procedimiento para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3. También se describe en el presente documento un procedimiento de potenciación de la función inmunitaria en un individuo que tiene cáncer que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3.

En el presente documento se proporcionan anticuerpos biespecíficos que se unen a un antígeno carcinoembrionario humano (CEA). Los nombres alternativos para "CEA" incluyen CEACAM5. El término "CEA", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier CEA natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba CEA de "longitud completa" y sin procesar, así como cualquier forma de CEA que resulte del procesamiento en la célula (por ejemplo, proteína madura). El término también engloba variantes e isoformas naturales de CEA, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. En un aspecto, CEA es CEA humano. La secuencia de aminoácidos de CEA humano se muestra en UniProt (www.uniprot.org), n.° de acceso P06731, o NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004354.2.

En algunos aspectos, el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico que se une a CEA comprende una región variable de la cadena pesada (V^hCEA) que comprende la secuencia de aminoácidos:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWTNTK

TGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTST A YMELRSLRSDDT A VYYCARW DFAYYVEAM D

YW G Q GTTVTVSS ^{(SEQ ID NO:34), y/o}

una región variable de la cadena ligera (V^lCEA) que comprende la secuencia de aminoácidos: D1QMTQSPSSLSASVGDRVT1TCKASAAVGTYVAWYQQKPÜKAPKLL1YSASYRKRG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIK ^{(Se q ID}NO:35).

En algunos aspectos, el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico que se une a CEA comprende una ^{región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de HVR-H1 de} EFGMN ^{(SEQ ID NO: 38), una secuencia de HVR-H2 de} WINTKTGEATYVEEFKG ^{(SEQ ID NO: 39) y una secuencia de HVR-H3 de} WDFAYYVEAMDY ^{(SEQ ID NO: 40) y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de HVR-L1 de} KASAAVGTYVA ^{(SEQ ID NO: 41), una secuencia de HVR-L2 de} SASYRKR ^{(SEQ ID NO: 42) y una secuencia de HVR-L3 de} HQYYTYPLFT ^{(SEQ ID NO: 43).}

En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une a un polipéptido CD3 humano y un segundo dominio de unión a antígeno que se une a CEA. En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende además un tercer dominio de unión a antígeno que se une a CEA. En algunos aspectos, el segundo y el tercer dominio de unión a antígeno son idénticos (es decir, tienen las mismas secuencias de aminoácidos).

El correceptor de linfocitos T CD3 (grupo de diferenciación 3) es un complejo proteico y se compone de cuatro cadenas distintas. En mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3y, una cadena CD3ó y dos cadenas CD3s. Estas cadenas se asocian con el receptor de linfocitos T (TCR) y la cadena Z para generar una señal de activación en los linfocitos T. Las moléculas de TCR, cadena Z y CD3 juntas forman el complejo TCR. El término "CD3", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier CD3 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba proteína de "longitud completa" y sin procesar, así como cualquier forma de la proteína o una o más de las cadenas CD3 (polipéptidos) que resultan del procesamiento en la célula (por ejemplo, polipéptidos maduros). El término también engloba variantes e isoformas naturales de CD3, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. Por ejemplo, las descripciones de las cadenas y secuencias de CD3y, CD3ó y CD3s se proporcionan en www.uniprot.org/uniprot/P04234,www.uniprot.org/uniprot/P07766 y www.uniprot.org/uniprot/P09693. En un aspecto, CD3 es CD3 humano, en particular la subunidad épsilon de CD3 humano (CD3s). La secuencia de aminoácidos de CD3s humano se muestra en UniProt (www.uniprot.org), n.° de acceso P07766 (versión 144) o NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1. La secuencia de aminoácidos de CD3s de macaco cangrejero [Macaca fascicularis]se muestra en el GenBank de NCBI, n.° BAB71849.1.

En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico se une a un polipéptido CD3 épsilon (CD3s) humano. En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico se une a un polipéptido Cd 3 épsilon humano en un complejo de receptor de linfocitos T (TCR) natural en asociación con otras subunidades de TCR. En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico se une a un polipéptido CD3 gamma (CD3y) humano. En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico se une a un polipéptido CD3 gamma humano en un complejo de receptor de linfocitos T (TCR) natural en asociación con otras subunidades de TCR.

En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-CD3 de los mismos que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la unión a un polipéptido CD3 (por ejemplo, CD3 en la superficie de un linfocito T), o un fragmento peptídico del mismo, in vivo, in vitro o bien ex vivo. En el caso de un anticuerpo anti-CD3 multiespecífico (por ejemplo, biespecífico) como se describe en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo TCB que tiene un dominio de unión anti-CEA y un dominio de unión que reconoce un polipéptido CD3), la actividad biológica también puede incluir, por ejemplo, activación de células efectoras (por ejemplo, activación de linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T CD8+ y/o CD4 )), expansión de la población de células efectoras (es decir, un incremento en el recuento de linfocitos T), reducción de la población de células diana (es decir, una disminución en la población de células que expresan CEA en sus superficies celulares) y/o destrucción de células dianas. Se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro. En determinados aspectos, se somete a prueba un anticuerpo como se describe en el presente documento para determinar dicha actividad biológica.

En algunos aspectos, el/los dominio(s) de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico que se une a un CEA comprende(n) una región variable de la cadena pesada (V^hCEA) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, y una región variable de la cadena ligera (V^lCEA) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35. En algunos aspectos, el/los dominio(s) de unión a antígeno que se une(n) a CEA comprende(n) una ^{región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de HVR-H1 de} EFGMN ^{(SEQ ID NO: 38), una secuencia de HVR-H2 de} WINTKTGEATYVEEFKG ^{(SEQ ID NO: 39) y una secuencia de HVR-H3 de} WDFAYYVEAMDY ^{(SEQ ID NO: 40) y comprende(n) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de HVR-L1 de} KASAAVGTYVA ^{(SEQ ID NO: 41), una secuencia de HVR-L2 de} SASYRKR ^{(SEQ ID NO: 42)}y una secuencia de ^HVR-L3de HQYYTYPLFT ^{(SEQ ID NO: 43).}

En algunos aspectos, el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico que se une a un CD3 comprende una región variable de la cadena pesada (V^hCD3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, y una región variable de la cadena ligera (V^lCD3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51. En algunos aspectos, el dominio de unión a antígeno que se une a un CD3 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de HVR-H1 de T Y A M N (SEQ ID NO:44), una secuencia de HVR-H2 de RIRSKYNNYATYYADSVKG ^{(SEQ ID NO:45) y una secuencia de HVR-H3 de}HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:46) y comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de HVR-L1 de GSSTGAVTTSNYAN ^{(SEQ ID NO:47), una secuencia de HVR-L2 de}GTNKRAP ^{(SEQ ID NO:48) y una secuencia de HVR-L3 de}ALWYSNLWV ^{(SEQ ID NO:49).}

En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3 y un segundo y opcionalmente un tercer dominio de unión a antígeno que se une a CEA, en el que los dominios de unión a antígeno son moléculas Fab (por ejemplo, moléculas Fab convencionales o de entrecruzamiento). En dichos aspectos particulares, el anticuerpo biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3 y un segundo y opcionalmente un tercer dominio de unión a antígeno que se une a CEA, en el que el primer dominio de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que los dominios variables o los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian (es decir, se reemplazan entre sí) y el segundo (y tercero, si está presente) dominio de unión a antígeno es una molécula Fab convencional. En un aspecto, el primer dominio de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que se intercambian los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de Fab. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende no más de un dominio de unión a antígeno que se une a CD3, es decir, proporciona unión monovalente a CD3. En un aspecto, el primer y el segundo dominio de unión a antígeno se fusionan entre sí, opcionalmente a través de un conector peptídico. En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3 y un segundo y opcionalmente un tercer dominio de unión a antígeno que se une a CEA, en el que los dominios de unión a antígeno son moléculas Fab y (i) el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, o (ii) el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo dominio de unión a antígeno. En un aspecto particular, el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab del primer dominio de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo dominio de unión a antígeno se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende además un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable. En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3, un segundo dominio de unión a antígeno que se une a CEA y un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable, en el que los dominios de unión a antígeno son moléculas Fab y en el que (i) el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, y el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc, o (ii) el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo dominio de unión a antígeno, y el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En un aspecto particular, el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, y el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 consiste esencialmente en un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3, un segundo dominio de unión a antígeno que se une a CEA, un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en el que los dominios de unión a antígeno son moléculas Fab y en el que (i) el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, y el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc, o (ii) el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo dominio de unión a antígeno, y el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3, un segundo y un tercer dominio de unión a antígeno que se une a CEA y un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable, en el que los dominios de unión a antígeno son moléculas Fab y en el que (i) el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y el tercer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc, o (ii) el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo dominio de unión a antígeno, el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y el tercer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc. En un aspecto particular, el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y el tercer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc. En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 consiste esencialmente en un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3, un segundo y un tercer dominio de unión a antígeno que se une a CEA, un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en el que los dominios de unión a antígeno son moléculas Fab y en el que (i) el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y el tercer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc, o (ii) el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo dominio de unión a antígeno, el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y el tercer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc.

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende

Las moléculas Fab se pueden fusionar al dominio Fc o entre sí directamente o a través de un conector peptídico, que comprende uno o más aminoácidos, típicamente, aproximadamente 2-20 aminoácidos. Los conectores peptídicos son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. Los conectores peptídicos no inmunógenos adecuados incluyen, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n, "n" en general es un número entero de 1 a 10, típicamente de 2 a 4. En un aspecto, dicho conector peptídico tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos, en un aspecto una longitud de 5 a 100, en otro aspecto de 10 a 50 aminoácidos. En un aspecto, dicho conector peptídico es (GxS)n o (GxS)nGm con G=glicina, S=serina, y (x=3, n= 3, 4, 5 o 6, y m=0, 1, 2 o 3) o (x=4, n=2, 3, 4 o 5 y m= 0, 1, 2 o 3), en un aspecto x=4 y n=2 o 3, en otro aspecto x=4 y n=2. En un aspecto, dicho conector peptídico es (G4S)2. Un conector peptídico en particular adecuado para fusionar las cadenas ligeras de Fab del primer y el segundo dominio de unión a antígeno entre sí es (G4S)2. Un conector peptídico ejemplar adecuado para conectar las cadenas pesadas de Fab del primer y el segundo dominio de unión a antígeno comprende la secuencia (D)-(G4S)2. Otro conector adecuado de este tipo comprende la secuencia (G4S)4. Adicionalmente, los conectores pueden comprender (una porción de) una región bisagra de inmunoglobulina. En particular cuando una molécula Fab se fusiona al extremo N de una subunidad del dominio Fc, se puede fusionar por medio de una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de la misma, con o sin un conector peptídico adicional.

En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende (i) un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de una primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de una segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera subunidad del dominio Fc (VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4)), (ii) un polipéptido de cadena ligera de Fab de entrecruzamiento de la segunda molécula Fab, en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-c H1(2)), (iii) el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)), (iv) un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda subunidad del dominio Fc (VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) y (v) el polipéptido de la cadena ligera de Fab de la tercera molécula Fab (VL(3)-CL(3)). En determinados aspectos, el polipéptido de la cadena ligera de Fab de la primera y la tercera molécula Fab son idénticos. En determinados aspectos, los polipéptidos se unen covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro. En determinados aspectos, la primera y la tercera molécula Fab se unen a CEA y la segunda molécula Fab se une a CD3.

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 52, un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 53, un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 54, y un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 55. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 52, un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 53, un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 54 y un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 55.

Dominio Fc

El anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 usado en la presente invención comprende un dominio Fc que consiste en un par de cadenas polipeptídicas que comprenden dominios de cadena pesada de una molécula de anticuerpo. Por ejemplo, el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) es un dímero, del que cada unidad comprende los dominios constantes de la cadena pesada de IgG CH2 y CH3. Las dos subunidades del dominio Fc se pueden asociar de manera estable entre sí.

En un aspecto, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG. En un aspecto particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En otro aspecto, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un aspecto más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución aminoacídica en la posición S228 (numeración EU), en particular la sustitución aminoacídica S228P. Esta sustitución aminoacídica reduce el intercambio en el brazo Fab in vivo de los anticuerpos IgG4 (véase Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). En otro aspecto particular, el dominio Fc es humano. Una secuencia ejemplar de una región Fc de IgG1 humana se da en SEQ ID NO: 57.

Modificaciones en el dominio Fc que promueven la heterodimerización

El anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 usado en la presente invención comprende diferentes componentes (por ejemplo, dominios de unión a antígeno) fusionados a una o a la otra de las dos subunidades del dominio Fc, por tanto las dos subunidades del dominio Fc están comprendidas típicamente en dos cadenas polipeptídicas no idénticas. La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de dichos anticuerpos en la producción recombinante, será ventajoso por tanto introducir en el dominio Fc del anticuerpo una modificación que promueva la asociación de los polipéptidos deseados.

En consecuencia, en aspectos particulares el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana es en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, en un aspecto, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.

Existen varios enfoques para las modificaciones en el dominio CH3 del dominio Fc para garantizar la heterodimerización, que se describen bien por ejemplo, en los documentos WO96/27011, WO98/050431, EP1870459, WO2007/110205, WO2007/147901, WO2009/089004, WO2010/129304, WO2011/90754, WO2011/143545, WO2012058768, WO2013157954, WO2013096291. Típicamente, en todos de dichos enfoques, el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se genomanipulan ambos de manera complementaria de modo que cada dominio CH3 (o la cadena pesada que lo comprende) ya no se puede homodimerizar consigo mismo sino que se fuerza a heterodimerizarse con el otro dominio CH3 genomanipulado de complementariedad (de modo que el primer y segundo dominio CH3 se heterodimerizan y no se forman homodímeros entre los dos primeros o los dos segundos dominios CH3).

En un aspecto específico, dicha modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc es una modificación denominada "botón en ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc.

La tecnología de botón en ojal se describe, por ejemplo, en los documentos US5.731.168; US7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).

En consecuencia, en un aspecto particular, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que es posicionable en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad de la que la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad es posicionable.

Preferentemente, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande se selecciona del grupo que consiste en arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W).

Preferentemente dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona del grupo que consiste en alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V).

La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica.

En un aspecto específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc (la subunidad "botones") el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza con un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc (la subunidad "ojal") el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza con un residuo de valina (Y407V). En un aspecto, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza con un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza con un residuo de alanina (L368A) (numeración EU).

Aún en otro aspecto, en la primera subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza con un residuo de cisteína (S354C) o el residuo de ácido glutámico en la posición 356 se reemplaza con un residuo de cisteína (E356C), y en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteína (Y349C) (numeración EU). La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, estabilizando adicionalmente el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

En un aspecto particular, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W, y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A y Y407V (numeración EU).

En un aspecto particular, el dominio de unión a antígeno que se une a CD3 en el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 descrito en el presente documento se fusiona a la primera subunidad del dominio Fc (que comprende la modificación del "botón"). Sin quedar vinculado a ninguna teoría, la fusión del dominio de unión de CD3 a la subunidad que contiene el botón del dominio Fc minimizará (además) la generación de anticuerpos biespecíficos que comprenden dos dominios de unión a CD3 (impedimento estérico de dos polipéptidos que contienen el botón).

Otras técnicas de modificación de CH3 para garantizar la heterodimerización se contemplan como alternativas y se describen por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

En un aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento EP 1870459 A1, se usa de forma alternativa. Este enfoque se basa en la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase CH3/dominio CH3 entre las dos subunidades del dominio Fc. Un aspecto preferente son las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en uno de los dos dominios CH3 (del dominio Fc) y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el otro de los dominios CH3 del dominio Fc (numeración EU).

En otro aspecto, el anticuerpo comprende la mutación aminoacídica T366W en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, y adicionalmente las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc (numeración EU).

En otro aspecto, el anticuerpo comprende las mutaciones aminoacídicas S354C, T366W en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, o el anticuerpo comprende las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366W en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas S354C, T366S, L368A, Y407V en los dominios CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc y adicionalmente las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc (numeración EU).

En un aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2013/157953 se usa de forma alternativa. En un aspecto, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366K y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica L351D (numeración EU). En otro aspecto, el primer dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica L351K. En otro aspecto, el segundo dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica seleccionada de Y349E, Y349D y L368E (preferentemente L368E) (numeración EU).

En un aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2012/058768 se usa de forma alternativa. En un aspecto, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366A, K409F. En otro aspecto, el segundo dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica en la posición T411, D399, S400, F405, N390, o K392, por ejemplo, seleccionada de a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W, b) D399R, D399W, D399Y o D399K, c) S400E, S400D, S400R, o S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W, e) N390R, N390K o N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392f o K392E (numeración EU). En otro aspecto, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366V, K409F. En otro aspecto, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366a , K409F. En otro aspecto, el segundo dominio CH3 comprende además las mutaciones aminoacídicas K392E, T411E, D399R y S400R (numeración EU).

En un aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2011/143545 se usa de forma alternativa, por ejemplo, con la modificación aminoacídica en una posición seleccionada del grupo que consiste en 368 y 409 (numeración EU).

En un aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2011/090762, que también usa la tecnología de botones en ojales descrita anteriormente, se usa de forma alternativa. En un aspecto, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366W y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407A. En un aspecto, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366Y y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407T (numeración EU).

En un aspecto, el anticuerpo o su dominio Fc es de la subclase IgG2 y de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2010/129304.

En un aspecto alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable pero la heterodimerización electrostáticamente favorable. En un aspecto de este tipo, un primer dominio CH3 comprende la sustitución aminoacídica de K392 o N392 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D), preferentemente K392D o N392D) y un segundo dominio CH3 comprende la sustitución aminoacídica de D399, E356, D356 o E357 con un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, lisina (K) o arginina (R), preferentemente D399K, E356K, D356K o E357K, y más preferentemente D399K y E356 K). En otro aspecto, el primer dominio CH3 comprende además la sustitución aminoacídica de K409 o R409 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D), preferentemente K409D o R409D). En otro aspecto, el primer dominio CH3 comprende además o de forma alternativa la sustitución aminoacídica de K439 y/o K370 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D)) (numeración EU).

Aún en otro aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2007/147901 se usa de forma alternativa. En un aspecto, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas K253E, D282K y K322D y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas D239K, E240K y K292D (numeración EU).

Todavía en otro aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2007/110205 se puede usar de forma alternativa.

En un aspecto, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas K392D y K409D, y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas D356K y D399K (numeración EU).

Modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión al receptor de Fc y/o la función efectora

El dominio Fc confiere a un anticuerpo, tal como un anticuerpo biespecífico, propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una semivida en suero prolongada lo que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y una proporción de distribución tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a dirigir de forma indeseable el anticuerpo a células que expresan receptores de Fc en lugar de a las células que portan antígenos preferentes. Además, la coactivación de las vías de señalización del receptor de Fc puede dar lugar a la liberación de citocinas que, en combinación con otras propiedades inmunoestimuladoras que puede tener el anticuerpo y la semivida prolongada del anticuerpo, da como resultado una activación excesiva de los receptores de citocina y efectos secundarios graves tras la administración sistémica.

En consecuencia, en aspectos particulares, el dominio Fc del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 presenta una afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. En un aspecto de este tipo, el dominio Fc (o la molécula, por ejemplo, anticuerpo, que comprende dicho dominio Fc) presenta menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o una molécula correspondiente que comprende un dominio Fc de IgG1 natural), y/o menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o una molécula correspondiente que comprende un dominio Fc de IgG1 natural). En un aspecto, el dominio Fc (o la molécula, por ejemplo, el anticuerpo, que comprende dicho dominio Fc) no se une sustancialmente a un receptor de Fc y/o induce la función efectora. En un aspecto particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. En un aspecto, la función efectora es una o más seleccionada del grupo de CDC, ADCC, ADCP y secreción de citocinas. En un aspecto particular, la función efectora es ADCC. En un aspecto, el dominio Fc presenta una afinidad de unión sustancialmente similar por el receptor de Fc neonatal (FcRn), en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn cuando el dominio Fc (o la molécula, por ejemplo, el anticuerpo, que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 %, en particular más de aproximadamente un 80 %, más en particular más de aproximadamente un 90 % de la afinidad de unión de un dominio Fc de IgG1 natural (o la molécula correspondiente que comprende un dominio Fc de IgG1 natural) por FcRn.

En determinados aspectos, el dominio Fc se genomanipula para tener afinidad de unión reducida por Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En aspectos particulares, el dominio Fc comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora. Típicamente, la misma o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En un aspecto, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc. En un aspecto, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces, o al menos 10 veces. En aspectos donde existe más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por el receptor de Fc, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad de unión del dominio Fc por el receptor de Fc en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un aspecto, la molécula, por ejemplo, el anticuerpo, que comprende un dominio Fc manipulado presenta menos de un 20 %, en particular menos de un 10 %, más en particular menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc en comparación con una molécula correspondiente que comprende un dominio Fc no genomanipulado. En un aspecto particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En algunos aspectos, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En algunos aspectos, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos aspectos, también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un aspecto, no se reduce la afinidad de unión por el receptor de Fc neonatal (FcRn). La unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión del dominio Fc por dicho receptor, se logra cuando el dominio Fc (o la molécula, por ejemplo, el anticuerpo, que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o una molécula correspondiente que comprende dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) por FcRn. El dominio Fc, o molécula (por ejemplo, anticuerpo) que comprende dicho dominio Fc, puede presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En determinados aspectos, el dominio Fc se genomanipula para tener una función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La función efectora reducida puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) reducida, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) reducida, secreción de citocinas reducida, captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos reducida, unión a células NK reducida, unión a macrófagos reducida, unión a monocitos reducida, unión a células polimorfonucleares reducida, señalización directa que induce apoptosis reducida, reticulación de anticuerpos unidos a diana reducida, maduración de células dendríticas reducida o activación de linfocitos T reducida. En un aspecto, la función efectora reducida es una o más seleccionadas del grupo de CDC reducida, ADCC reducida, ADCP reducida y secreción de citocinas reducida. En un aspecto particular, la función efectora reducida es ADCC reducida. En un aspecto, la ADCC reducida es menos de un 20 % de la ADCC inducida por un dominio Fc no genomanipulado (o una molécula correspondiente que comprende un dominio Fc no genomanipulado).

En un aspecto, la mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora es una sustitución aminoacídica. En un aspecto, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de E233, L234, L235, N297, P331 y P329 (numeración EU). En un aspecto más específico, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de L234, L235 y P329 (numeración EU). En algunos aspectos, el dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A y L235A (numeración EU). En un aspecto de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. En un aspecto, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329. En un aspecto más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular P329G (numeración EU). En un aspecto, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 y otra sustitución aminoacídica en una posición seleccionada entre E233, L234, L235, N297 y P331 (numeración EU). En un aspecto más específico, la otra sustitución aminoacídica es E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En aspectos particulares, el dominio Fc comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones P329, L234 y L235 (numeración EU). En aspectos más particulares, el dominio Fc comprende las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G ("P329G LALA"). En un aspecto de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. La combinación "P329G LALA" de sustituciones aminoacídicas anula casi por completo la unión al receptor de Fcy (así como al complemento) de un dominio Fc de IgG1 humana, como se describe en la publicación PCT n.° WO 2012/130831. El documento WO 2012/130831 también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como unión al receptor de Fc o funciones efectoras.

Los anticuerpos IgG4 presentan una afinidad de unión reducida por receptores de Fc y funciones efectoras reducidas en comparación con anticuerpos IgG1. Por tanto, en algunos aspectos, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4, en particular un dominio Fc de IgG4 humano. En un aspecto, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en la posición S228, específicamente la sustitución aminoacídica S228P (numeración EU). Para reducir además su afinidad de unión por un receptor de Fc y/o su función efectora, en un aspecto el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición L235, específicamente la sustitución aminoacídica L235E (numeración EU). En otro aspecto, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329, específicamente la sustitución aminoacídica P329G (numeración EU). En un aspecto particular, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones S228, L235 y P329, específicamente las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y P329G (numeración EU). Dichos mutantes de dominios Fc de IgG4 y sus propiedades de unión al receptor Fcy se describen en la publicación PCT n.° WO 2012/130831.

En un aspecto particular, el dominio Fc que presenta afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural, es un dominio Fc de IgG1 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y opcionalmente P329G, o un dominio Fc de IgG4 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y opcionalmente P329G (numeración EU).

En determinados aspectos, se ha eliminado la N-glucosilación del dominio Fc. En un aspecto de este tipo, el dominio Fc comprende una mutación aminoacídica en la posición N297, en particular una sustitución aminoacídica que reemplaza asparagina por alanina (N297A) o ácido aspártico (N297D) (numeración EU).

Además de los dominios Fc descritos anteriormente en el presente documento y en la publicación PCT n.° WO 2012/130831, los dominios Fc con unión al receptor de Fc y/o función efectora reducidas también incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de dominio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056) (numeración EU). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se pueden preparar dominios Fc mutantes por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios nucleotídicos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.

La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (RPS) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de dominios Fc o moléculas que comprenden un dominio Fc para los receptores de Fc usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK humanos que expresan el receptor FcYllla.

La función efectora de un dominio Fc, o una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que comprende un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CelITechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

En algunos aspectos, se reduce la unión del dominio Fc a un componente de complemento, específicamente a C1q. En consecuencia, en algunos aspectos en los que se genomanipula el dominio Fc para que tenga una función efectora reducida, dicha función efectora reducida incluye CDC reducida. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si el dominio Fc, o molécula (por ejemplo, anticuerpo) que comprende el dominio Fc, se puede unir a C1q y por tanto tiene actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo biespecífico monocatenario que comprende el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno. En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico monocatenario comprende regiones variables, dispuestas del extremo N al extremo C, seleccionadas del grupo que consiste en (1) V^hCEA-V^lCEA-V^hCD3-V^lCD3, (2) V^hCD3-V^lCD3-V^hCEA-V^lCEA, (3) V^hCD3-V^lCD3-V^lCEA-V^hCEA, (4) V^hCEA-V^lCEA-V^lCD3-V^hCD3, (5) V^lCEA-V^hCEA-V^hCD3-V^lCD3 y (6) V^lCD3-V^hCD3-V^hCEA-V^lCEA.

IV. Preparación de anticuerpos

Los anticuerpos descritos en el presente documento se preparan usando técnicas disponibles en la técnica para generar anticuerpos, de las que sus procedimientos ejemplares se describen con más detalle en las siguientes secciones.

El anticuerpo se dirige frente a un antígeno de interés (es decir, PD-L1 (tal como un PD-L1 humano), CEA o CD3 (tal como un CD3 humano)). Preferentemente, el antígeno es un polipéptido biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece un trastorno puede dar como resultado un beneficio terapéutico en dicho mamífero.

En determinados aspectos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (K^d) de < 1 pM, < 150 nM, < 100 nM, < 50 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10 8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M).

En un aspecto, K^dse mide por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente ensayo. La afinidad de unión en solución de Fabs por el antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoración de antígeno no marcado, a continuación capturando el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), se mezcla [125l]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés. El Fab de interés se incuba a continuación durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN-20®) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 pl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.

De acuerdo con otro aspecto, K^dse mide usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con micromatrices CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan micromatrices de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc) con clorhidrato de W-etil-W-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el antígeno con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de su inyección a un caudal de 5 pl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWe En -20™)(PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión uno a uno de Langmuir sencillo (programa informático de evaluación de BIACORE®, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción ratio kdis/kas, véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol.

293:865-881 (1999). Si la tasa de asociación excede 106 M 'V por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces, se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación=295 nm; emisión=340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno medida en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

(i) Preparación de antígenos

Se pueden usar antígenos o fragmentos de los mismos solubles, opcionalmente conjugados con otras moléculas, como inmunógenos para generar anticuerpos. Para moléculas transmembranarias, tales como receptores, se pueden usar fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como inmunógeno. De forma alternativa, se pueden usar células que expresan la molécula transmembranaria como inmunógeno. Dichas células se pueden derivar de una fuente natural (por ejemplo, líneas celulares cancerosas) o pueden ser células que se han transformado por técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembranaria. Otros antígenos y formas de los mismos útiles para preparar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica.

(ii) Determinados procedimientos basados en anticuerpos

Los anticuerpos policlonales se producen preferentemente en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente con una proteína que es inmunógena en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación a través de residuos cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCh o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan frente al antígeno, conjugados inmunógenos o derivados combinando, por ejemplo, 100 pg o 5 pg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, se administra a los animales una dosis de refuerzo con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días más tarde, se extrae sangre de los animales y el suero se somete a ensayo para determinar el valor de anticuerpos. Se administra a los animales una dosis de refuerzo hasta la meseta del valor. Preferentemente, se refuerza al animal con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. También se pueden preparar conjugados en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. También se usan adecuadamente agentes de agregación, tales como alumbre, para potenciar la respuesta inmunitaria.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), y descrito además, por ejemplo, en Hongo el ala., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) con respecto a hibridomas humanos-humanos. Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 con respecto a la producción de anticuerpos IgM naturales humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma. La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

Para diversas otras técnicas de hibridoma, véanse, por ejemplo, los documentos US 2006/258841; US 2006/183887 (anticuerpos completamente humanos), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; y las patentes de EE. Uu . n.° 7.078.492 y 7.153.507. Un protocolo ejemplar para producir anticuerpos monoclonales usando el procedimiento de hibridoma se describe como sigue. En un aspecto, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza para provocar linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unen específicamente a la proteína usada para inmunización. Los anticuerpos se producen en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) de un polipéptido como se describe en el presente documento o un fragmento del mismo, y un adyuvante, tal como monofosforil lípido A (MPL)/trehalosa dicrinomicolato (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.). Un polipéptido como se describe en el presente documento (por ejemplo, antígeno) o un fragmento del mismo se puede preparar usando procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como procedimientos recombinantes, de los que algunos se describen además en el presente documento. Se somete a ensayo el suero de animales inmunizados para determinar anticuerpos anti-antígeno, y se administran opcionalmente inmunizaciones de refuerzo. Se aíslan linfocitos de animales que producen anticuerpos anti-antígeno. De forma alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

A continuación, se fusionan los linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Véase, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986). Se pueden usar células de mieloma que se fusionan eficazmente, soportan una producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las células de mieloma ejemplares incluyen, pero no se limitan a, líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE. UU., y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE. UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Se siembran las células de hibridoma así preparadas y se cultivan en un medio de cultivo adecuado, por ejemplo, un medio que contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que impiden el crecimiento de células carentes de HGPRT. Preferentemente, se usan procedimientos de cultivo celular de hibridoma sin suero para reducir el uso de suero derivado de animal tal como suero fetal bovino, como se describe, por ejemplo, en Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006).

Los oligopéptidos como herramientas para mejorar la productividad de cultivos celulares de hibridoma se describen en Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005). Específicamente, se enriquecen los medios de cultivo estándar con determinados aminoácidos (alanina, serina, asparagina, prolina) o con fracciones de hidrolizado de proteínas, y se puede suprimir significativamente la apoptosis por oligopéptidos sintéticos, constituidos de tres a seis residuos aminoacídicos. Los péptidos están presentes en concentraciones milimolares o mayores.

El medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se puede someter a ensayo para determinar la producción de anticuerpos monoclonales que se unen a un anticuerpo como se describe en el presente documento. La especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se puede determinar por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por análisis de Scatchard. Véase, por ejemplo, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y cultivar por procedimientos estándar. Véase, por ejemplo, Goding, supra. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, se pueden cultivar in vivo células de hibridoma como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Un procedimiento para el aislamiento de proteínas de células de hibridoma se describe en el documento US2005/176122 y la patente de EE. UU. n.° 6.919.436. El procedimiento incluye el uso de sales mínimas, tales como sales liotrópicas, en el procedimiento de unión y preferentemente también el uso de pequeñas cantidades de disolventes orgánicos en el procedimiento de elución.

(iii) Anticuerpos derivados de colecciones

Los anticuerpos útiles en la invención se pueden aislar cribando colecciones combinatorias para determinar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Los procedimientos adicionales se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen además, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que, a continuación, se pueden cribar para determinar el fago de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos propios y también no propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos génicos V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y conseguir el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos-anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente de EE. UU. n.° 5.750.373 y las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.

(iv) Anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos

En determinados aspectos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con cambio de clase" en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En determinados aspectos, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en humanos, mientras conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o partes de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o partes de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunos aspectos, se sustituyen algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injerto SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describen el "rebarnizado"); Dall' Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de la "selección guiada" al reordenamiento de FR).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci., 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de f R (véase, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

En determinados aspectos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Dichos animales contienen típicamente todo o una parte de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena en general se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584, que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429, que describe la tecnología HUMAB®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870, que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.

También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano-murino para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur etal., MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boemer et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Los anticuerpos humanos generados por medio de tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.

(v) Fragmentos de anticuerpo

Se pueden generar fragmentos de anticuerpo por medios tradicionales, tales como digestión enzimática, o por técnicas recombinantes. En determinadas circunstancias, existen ventajas del uso de fragmentos de anticuerpo, en lugar de anticuerpos completos. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite un aclaramiento rápido y puede dar lugar a una mejora en el acceso a tumores sólidos. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron por medio de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al. Journal o f Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir ahora directamente por células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv se pueden expresar todos en y secretar de E. coli, permitiendo por tanto una fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Se pueden aislar fragmentos de anticuerpo de las colecciones de fagos de anticuerpos analizadas anteriormente. Como alternativa, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, se pueden aislar fragmentos F(ab')2 directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')2 con incremento en la semivida in vivo que comprenden residuos de epítopo de unión a receptor de rescate se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el profesional experto. En determinados aspectos, un anticuerpo es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véanse el documento WO 93/16185 y las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Fv y scFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes; por tanto, pueden ser adecuados para una unión inespecífica reducida durante su uso in vivo . Se pueden construir proteínas de fusión de scFv para proporcionar la fusión de una proteína efectora en el extremo amínico o bien carboxílico de un scFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.641.870, por ejemplo. Dichos anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

(vi) Anticuerpos multiespecíficos

Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes, donde los epítopos son normalmente de antígenos diferentes. Aunque dichas moléculas normalmente solo se unirán a dos epítopos diferentes (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAb), los anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos se engloban por esta expresión cuando se usan en el presente documento. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2).

Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las que solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que normalmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se divulgan en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Un enfoque conocido en la técnica para preparar anticuerpos biespecíficos es el enfoque de "botones en ojales" o "protuberancia en cavidad" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). En este enfoque, dos polipéptidos de inmunoglobulina (por ejemplo, polipéptidos de cadena pesada) comprenden cada uno una interfase. Una interfase de un polipéptido de inmunoglobulina interactúa con una correspondiente interfase en el otro polipéptido de inmunoglobulina, permitiendo de este modo que los dos polipéptidos de inmunoglobulina se asocien. Estas interfases se pueden genomanipular de modo que un "botón" o "protuberancia" (estos términos se pueden usar de manera intercambiable en el presente documento) localizado en la interfase de un polipéptido de inmunoglobulina se corresponda con un "ojal" o "cavidad" (estos términos se pueden usar de manera intercambiable en el presente documento) localizado en la interfase del otro polipéptido de inmunoglobulina. En algunos aspectos, el ojal tiene un tamaño idéntico o similar al botón y está situado adecuadamente de modo que, cuando las dos interfases interactúan, el botón de una interfase se puede situar en el correspondiente ojal de la otra interfase. Sin desear quedar vinculado a teoría alguna, se cree que esto estabiliza el heteromultímero y favorece la formación del heteromultímero sobre otras especies, por ejemplo, homomultímeros. En algunos aspectos, este enfoque se puede usar para promover la heteromultimerización de dos polipéptidos de inmunoglobulina diferentes, creando un anticuerpo biespecífico que comprende dos polipéptidos de inmunoglobulina con especificidades de unión para diferentes epítopos.

En algunos aspectos, se puede construir un botón reemplazando una cadena lateral de aminoácidos pequeña con una cadena lateral más grande. En algunos aspectos, se puede construir un ojal reemplazando una cadena lateral de aminoácidos grande con una cadena lateral más pequeña. Pueden existir botones u ojales en la interfase original, o se pueden introducir sintéticamente. Por ejemplo, se pueden introducir botones u ojales sintéticamente alterando la secuencia de ácido nucleico que codifica la interfase para reemplazar al menos un residuo aminoacídico "original" con al menos un residuo aminoacídico "importado". Los procedimientos para alterar las secuencias de ácido nucleico pueden incluir técnicas de biología molecular estándar bien conocidas en la técnica. Los volúmenes de cadena lateral de diversos residuos aminoacídicos se muestran en la siguiente tabla. En algunos aspectos, los residuos originales tienen un volumen de cadena lateral pequeño (por ejemplo, alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina o valina), y los residuos importados para formar un botón son aminoácidos naturales y pueden incluir arginina, fenilalanina, tirosina y triptófano. En algunos aspectos, los residuos originales tienen un volumen de cadena lateral grande (por ejemplo, arginina, fenilalanina, tirosina y triptófano), y los residuos importados para formar un ojal son aminoácidos naturales y pueden incluir alanina, serina, treonina y valina.

Tabla 1. Propiedades de residuos aminoacídicos

aPeso molecular del aminoácido menos el del agua. Valores de Handbook of Chemistry and Physics, 43.a ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961.

bValores de A.A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107-123, 1972.

cValores de C. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1-14, 1975. El área de superficie accesible se define en las figuras 6-20 de esta referencia.

En algunos aspectos, los residuos originales para formar un botón o un ojal se identifican en base a la estructura tridimensional del heteromultímero. Las técnicas conocidas en la técnica para obtener una estructura tridimensional pueden incluir cristalografía de rayos X y RMN. En algunos aspectos, la interfaz es el dominio CH3 de un dominio constante de inmunoglobulina. En estos aspectos, la interfase CH3/CH3 de IgG1 humana implica dieciséis residuos en cada dominio localizados en cuatro hebras p antiparalelas. Sin desear quedar vinculado a teoría alguna, los residuos mutados se localizan preferentemente en las dos hebras p antiparalelas centrales para minimizar el riesgo de que los botones se puedan acomodar por el disolvente circundante, en lugar de los ojales compensatorios en el dominio CH3 compañero. En algunos aspectos, las mutaciones que forman los correspondientes botones y ojales en dos polipéptidos de inmunoglobulina corresponden a uno o más pares proporcionados en la siguiente tabla.

Tabla 2. Conjuntos ejemplares de mutaciones que forman botones y ojales correspondientes

Las mutaciones se indican por el residuo original, seguido de la posición usando el sistema de numeración EU, y a continuación el residuo importado (todos los residuos se dan en código aminoacídico de una letra). Las mutaciones múltiples están se separadas por dos puntos.

En algunos aspectos, un polipéptido de inmunoglobulina comprende un dominio CH3 que comprende una o más sustituciones aminoacídicas enumeradas en la tabla 2 anterior. En algunos aspectos, un anticuerpo biespecífico comprende un primer polipéptido de inmunoglobulina que comprende un dominio CH3 que comprende una o más sustituciones aminoacídicas enumeradas en la columna izquierda de la tabla 2, y un segundo polipéptido de inmunoglobulina que comprende un dominio CH3 que comprende una o más sustituciones aminoacídicas correspondientes enumeradas en la columna derecha de la tabla 2.

Después de la mutación del ADN como se analiza anteriormente, los polinucleótidos que codifican polipéptidos de inmunoglobulina modificada con una o más mutaciones que forman los botones u ojales correspondientes se pueden expresar y purificar usando técnicas recombinantes estándar y sistemas celulares conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.731.168; 5.807.706; 5.821.333; 7.642.228; 7.695.936; 8.216.805; la publicación de EE. UU. n°. 2013/0089553; y Spiess et al., Nature Biotechnology 31:753-758, 2013. Se pueden producir polipéptidos de inmunoglobulina modificada usando células huésped procariotas, tales como E. coli, o células huésped eucariotas, tales como células CHO. Los polipéptidos de inmunoglobulina que portan los botones y ojales correspondientes se pueden expresar en células huésped en cocultivo y purificar conjuntamente como un heteromultímero, o se pueden expresar en cultivos individuales, purificar por separado y ensamblar in vitro. En algunos aspectos, dos cepas de células huésped bacterianas (expresando una un polipéptido de inmunoglobulina con un botón y expresando la otra un polipéptido de inmunoglobulina con un ojal) se cocultivan usando técnicas de cultivo bacteriano estándar conocidas en la técnica. En algunos aspectos, las dos cepas se pueden mezclar en una proporción específica, por ejemplo, para lograr niveles de expresión iguales en cultivo. En algunos aspectos, las dos cepas se pueden mezclar en una proporción de 50:50, 60:40 o 70:30. Después de la expresión polipeptídica, las células se pueden lisar conjuntamente y se puede extraer la proteína. Las técnicas estándar conocidas en la técnica que permiten medir la abundancia de especies homomultiméricas frente a heteromultiméricas pueden incluir cromatografía de exclusión por tamaño. En algunos aspectos, cada polipéptido de inmunoglobulina modificado se expresa por separado usando técnicas recombinantes estándar, y se pueden ensamblar conjuntamente in vitro. El ensamblaje se puede lograr, por ejemplo, purificando cada polipéptido de inmunoglobulina modificado, mezclándolos e incubándolos conjuntamente en igual masa, reduciendo los disulfuros (por ejemplo, tratando con ditiotreitol), concentrando y reoxidizando los polipéptidos. Los anticuerpos biespecíficos formados se pueden purificar usando técnicas estándar incluyendo cromatografía de intercambio catiónico y medir usando técnicas estándar incluyendo cromatografía de exclusión por tamaño. Para una descripción más detallada de estos procedimientos, véase Spiess et al., Nat. Biotechnol 31:753-8, 2013. En algunos aspectos, los polipéptidos de inmunoglobulina modificados se pueden expresar por separado en células CHO y ensamblarse in vitro usando los procedimientos descritos anteriormente.

De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es típico que la primera región constante de la cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en los aspectos cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o para las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales dé como resultado rendimientos altos o cuando las proporciones no sean de particular importancia.

En un aspecto de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones indeseadas de cadenas de inmunoglobulina, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera fácil de separación. Este enfoque se divulga en el documento WO 94/04690. Para otros detalles de generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210(1986).

De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento WO96/27011, se puede genomanipular la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. Una interfase comprende al menos una parte del dominio C^h3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Por ejemplo, se han propuesto dichos anticuerpos para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (patente de EE. UU. n.° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por el VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Se pueden preparar anticuerpos heteroconjugados usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y se divulgan en la patente de EE. UU. n.° 4.676.980, junto con varias técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando un enlace químico. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente de complejación con ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuro intermolecular. A continuación, los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los recientes progresos han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar directamente fragmentos de anticuerpo biespecífico del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de las cremalleras de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y a continuación se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) por un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios V^hy V^lde un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios V^ly V^hcomplementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico por el uso de dímeros de Fv monocatenario (sFv). Véase Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994).

Otra técnica para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico es el enfoque con "acoplador de linfocitos T biespecífico" o BítE® (véanse, por ejemplo, los documentos WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261 y WO2008/119567). Este enfoque utiliza dos dominios variables de anticuerpo dispuestos en un único polipéptido. Por ejemplo, una cadena polipeptídica única incluye dos fragmentos Fv monocatenarios (scFv), teniendo cada uno un dominio de la cadena pesada variable (V^h) y uno de la cadena ligera variable (V^l) separados por un conector polipeptídico de una longitud suficiente para permitir la asociación intramolecular entre los dos dominios. Este polipéptido único incluye además una secuencia espaciadora polipeptídica entre los dos fragmentos scFv. Cada scFv reconoce un epítopo diferente, y estos epítopos pueden ser específicos para diferentes tipos celulares, de modo que las células de dos tipos celulares diferentes se acercan en estrecha proximidad o se anclan cuando cada scFv se conecta con su epítopo afín. Un aspecto particular de este enfoque incluye un scFv que reconoce un antígeno de la superficie celular expresado por una célula inmunitaria, por ejemplo, un polipéptido c D3 en un linfocito T, enlazado a otro scFv que reconoce un antígeno de la superficie celular expresado por una célula diana, tal como una célula cancerosa o tumoral.

Como es un polipéptido único, el acoplador de linfocitos T biespecífico se puede expresar usando cualquier sistema de expresión celular procariota o eucariota conocido en la técnica, por ejemplo, una línea celular CHO. Sin embargo, pueden ser necesarias técnicas de purificación específicas (véase, por ejemplo, el documento EP1691833) para separar los acopladores de linfocitos T biespecíficos monoméricos de otras especies multiméricas, que pueden tener actividades biológicas distintas de la actividad destinada del monómero. En un esquema de purificación ejemplar, una solución que contiene polipéptidos secretados se somete en primer lugar a una cromatografía de afinidad por metales, y los polipéptidos se eluyen con un gradiente de concentraciones de imidazol. Este eluido se purifica además usando cromatografía de intercambio aniónico, y los polipéptidos se eluyen usando un gradiente de concentraciones de cloruro de sodio. Finalmente, este eluido se somete a cromatografía de exclusión por tamaño para separar monómeros de especies multiméricas.

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tuft et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

(vii) Anticuerpos de dominio único

Un anticuerpo de dominio único es una cadena polipeptídica única que comprende todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados aspectos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). En un aspecto, un anticuerpo de dominio único consiste en todo o una parte del dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo.

(viii) Variantes de anticuerpo

En algunos aspectos, se contemplan modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo introduciendo cambios apropiados en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede preparar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos se pueden introducir en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del sujeto en el momento en que se realiza esa secuencia.

(ix) Variantes de sustitución, inserción y deleción

En determinados aspectos, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Se muestran sustituciones conservadoras en la tabla 3 bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 3 bajo el encabezado de "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadena lateral aminoacídica. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, conservación/mejora de unión a antígeno, disminución en inmunogenicidad, o mejora en ADCC o CDC.

Tabla 3. Sustituciones ejemplares.

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

a. hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

b. hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

c. ácidos: Asp, Glu;

d. básicos: His, Lys, Arg;

e. residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

f. aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, incremento en afinidad, reducción en inmunogenicidad) en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).

Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de HVR, es decir, residuos codificados por codones que se someten a mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o SDR (a-CDR), sometiéndose a prueba la variante resultante VH o VL para determinar la afinidad de unión. La maduración de afinidad por construcción y reselección de colecciones secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) En algunos aspectos de maduración de afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una segunda colección. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando modelado o mutagénesis por barrido de alanina. A menudo se seleccionan en particular CDR-H3 y CDR-L3.

En determinados aspectos, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones en una o más HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en HVR. Dichas alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" de HVR o SDR. En determinados aspectos de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden seleccionar para mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) se identifican y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígenoanticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incremente la semivida en suero del anticuerpo.

(x) Variantes de glucosilación

En determinados aspectos, se altera un anticuerpo proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o se retiran uno o más sitios de glucosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se une en general por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a un GlcNAc en el "tallo" de la estructura oligosacárida biantenaria. En algunos aspectos, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo descrito en el presente documento para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

En un aspecto, se proporcionan variantes de anticuerpo que comprenden una región Fc en la que una estructura glucídica unida a la región Fc tiene fucosa reducida o carece de fucosa, lo que puede mejorar la función de ADCC. Específicamente, se contemplan anticuerpos en el presente documento que tienen fusosa reducida en relación con la cantidad de fucosa en el mismo anticuerpo producido en una célula CHO natural. Es decir, se caracterizan por tener una cantidad menor de fucosa de la que de otro modo tendrían si se produjeran por células CHO naturales (por ejemplo, una célula CHO que produce un patrón de glucosilación natural, tal como una célula CHO que contiene un gen FUT8 natural). En determinados aspectos, el anticuerpo es uno en el que menos de aproximadamente un 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % o un 5 % de los glucanos unidos a N en el mismo comprenden fucosa. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en un anticuerpo de este tipo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. En determinados aspectos, el anticuerpo es uno en el que ninguno de los glucanos unidos a N en el mismo comprende fucosa, es decir, en el que el anticuerpo está completamente sin fucosa, o no tiene fucosa o está afucosilado. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración Eu de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia insignificantes en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una mejora en la función ADCC. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU. n.os US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosilado" o "carente de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol.

336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec13 CHO carentes de fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., en especial el ejemplo 11), y líneas celulares con genes inactivados, tales como células CHO con el gen FUT8, de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, inactivado (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y documento W02003/085107).

Se proporcionan además variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una reducción en la fucosilación y/o una mejora en la función ADCC. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (Umana et al.); documento US 2005/0123546 (Umana et al.) y Ferrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5): 851-861 (2006). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una mejora en la función CDC. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

En determinados aspectos, las variantes de anticuerpo que comprenden una región Fc descritas en el presente documento se pueden unir a un FcyRIII. En determinados aspectos, las variantes de anticuerpo que comprenden una región Fc descritas en el presente documento tienen actividad ADCC en presencia de células efectoras humanas o tienen un incremento en la actividad ADCC en presencia de células efectoras humanas en comparación con el anticuerpo de otro modo igual que comprende una región Fc de IgG1 natural humana.

(xi) Variantes de la región Fc

En determinados aspectos, se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.

En determinados aspectos, la divulgación contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que le convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por tanto probablemente carece de actividad ADCC), pero mantiene su capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, solo expresan Fc(RIII, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RlI y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 (véanse, por ejemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’lAcad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat’lAcad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); documento 5.821.337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). De forma alternativa se pueden emplear procedimientos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y por tanto carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). La unión a FcRn y determinaciones del aclaramiento/semivida in vivo también se pueden realizar usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., In t’l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se describen determinadas variantes de anticuerpo con una mejora o reducción en la unión a FcR. (Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; documento WO 2004/056312 y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591 6604 (2001).)

En determinados aspectos, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de residuos). En un aspecto ejemplar, el anticuerpo comprende las siguientes sustituciones aminoacídicas en su región Fc: S298A, E333A y K334A.

En algunos aspectos, se realizan las alteraciones en la región Fc, que dan como resultado una unión a C1q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, mejoradas o reducidas), por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178 4184 (2000).

Los anticuerpos con un incremento en las semividas y una mejora en la unión al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del residuo de la región Fc 434 (patente de EE. UU. n.° 7.371.826). Véanse también Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); patente de EE. UU. n.° 5.648.260; patente de EE. UU. n.° 5.624.821; y documento WO94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de la región Fc.

(xii) Derivados de anticuerpos

Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden modificar además para contener restos no proteicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. En determinados aspectos, los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se une más de un polímero, pueden ser las mismas moléculas o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones incluyendo, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, ya sea si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

(xiii) Vectores, células huésped y procedimientos recombinantes

Los anticuerpos también se pueden producir usando procedimientos recombinantes. Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-antígeno, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se aísla y se inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes del vector en general incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia finalizadora de la transcripción.

(a) Componente de secuencia señal

Un anticuerpo se puede producir de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que se reconoce y se procesa (por ejemplo, se escinde por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen y procesan una secuencia señal de anticuerpo natural, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II termoestable. Para la secreción en levadura, la secuencia señal natural se puede sustituir, por ejemplo, por la secuencia líder de invertasa de levadura, secuencia líder de factor a (incluyendo las secuencias líder de factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces) o secuencia líder de fosfatasa ácida, secuencia líder de glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresión de células de mamífero, están disponibles secuencias señal de mamífero así como secuencias líder secretoras víricas, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.

(b) Origen de replicación

Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gramnegativas, el origen del plásmido 2p es adecuado para la levadura, y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. En general, el componente de origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamífero (el origen de SV40 se puede usar típicamente solo porque contiene el promotor temprano).

(c) Componente del gen de selección

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias autotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa de bacilos.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para interrumpir el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármaco y, por tanto, sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son los que permiten la identificación de células competentes para aceptar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo, tales como DHFR, glutamina sintetasa (GS), timidina cinasa, metalotioneína-I y -II, preferentemente genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, se identifican células transformadas con el gen DHFR cultivando los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Bajo estas condiciones, el gen DHFR se amplifica junto con cualquier otro ácido nucleico cotransformado. Se puede usar una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) carente de actividad de DHFR endógena (por ejemplo, ATCC CRF-9096).

De forma alternativa, las células transformadas con el gen GS se identifican cultivando los transformantes en un medio de cultivo que contiene L-metionina sulfoximina (Msx), un inhibidor de GS. Bajo estas condiciones, el gen GS se amplifica junto con cualquier otro ácido nucleico cotransformado. El sistema de selección/amplificación de GS se puede usar en combinación con el sistema de selección/amplificación de DHFR descrito anteriormente.

De forma alternativa, se pueden seleccionar células huésped (en particular huéspedes naturales que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de interés, gen DHFR natural y otro marcador seleccionable tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH) por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Véase la patente de EE. UU. n.° 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para su uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC n.° 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión de trp1 en el genoma de célula huésped de levadura proporciona a continuación un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura carentes de Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan con plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.

Además, se pueden usar vectores derivados del plásmido circular de 1,6 pm pKD1 para la transformación de levaduras Kluyveromyces. De forma alternativa, se ha informado de un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina bovina recombinante para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). También se han divulgado vectores de expresión de múltiples

madura por cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

(d) Componente de promotor

Los vectores de expresión y clonación contienen en general un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se enlaza de forma funcional al ácido nucleico que codifica un anticuerpo. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor de phoA, sistemas promotores de p-lactamasa y lactosa, promotor de fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (SD) enlazada de forma funcional al ADN que codifica un anticuerpo.

Las secuencias de promotor son conocidas para eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases en dirección 5' del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases en dirección 5' del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT, donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas está la secuencia A A T A A A 9ue Puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en vectores de expresión eucariotas.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras se describen además en el documento EP 73.657. Los potenciadores de levadura también se usan de forma ventajosa con promotores de levadura.

La transcripción del anticuerpo a partir de vectores en células huésped de mamíferos se puede controlar, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B, virus de simio 40 (SV40), o de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E. Un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos usando el virus del papiloma bovino como vector se divulga en la patente de EE. UU. n.° 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.601.978. Véase también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión del ADNc de p-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. De forma alternativa, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous se puede usar como promotor.

(e) Componente de elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica un anticuerpo como se describe en el presente documento por eucariotas superiores a menudo se incrementa insertando una secuencia potenciadora en el vector. Muchas secuencias potenciadoras son conocidas ahora a partir de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el promotor/potenciador temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' para la secuencia codificante de anticuerpo, pero se localiza preferentemente en un sitio 5' del promotor.

(f) Componente finalizador de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levadura, hongo, insecto, vegetal, animal, humana o nucleadas de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles de regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de ADN o ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente finalizador de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión divulgado en el mismo.

(g) Selección y transformación de células huésped

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en el presente documento son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Las células procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, enterobacteriáceas tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P divulgado en el documento DD266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli preferente es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. co liX1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325) son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

Los anticuerpos de longitud completa, proteínas de fusión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se pueden producir en bacterias, en particular cuando no se necesitan la glucosilación y la función efectora de Fc, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) que por sí mismo muestra eficacia en la destrucción de células tumorales. Los anticuerpos de longitud completa tienen mayor semivida en circulación. La producción en E. coli es más rápida y más rentable. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.648.237 (Carter et al.), patente de EE. UU. n.° 5.789.199 (Joly et al.), patente de EE. Uu . n.° 5.840.523 (Simmons et al.), que describen la región de iniciación de la traducción (TIR) y las secuencias señal para optimizar la expresión y la secreción. Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli. Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta celular de E. coli en una fracción soluble y se puede purificar a través de, por ejemplo, una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al procedimiento para purificar el anticuerpo expresado, por ejemplo, en células de CHO.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores codificantes de anticuerpos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es la más usada entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores. Sin embargo, una serie de otros numerosos géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K.fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Para una revisión que analiza el uso de levaduras y hongos filamentosos para la producción de proteínas terapéuticas, véase, por ejemplo, Gemgross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004).

Se pueden seleccionar determinadas cepas de hongos y levaduras en las que las vías de glucosilación se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véase, por ejemplo, Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) (que describe la humanización de la vía de glucosilación en Pichia pastoris); y Gerngross et al., supra.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovíricas y las correspondientes células huésped de insecto permisivas de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Una variedad de cepas víricas para la transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 del VPN de Autographa californica y la cepa Bm-5 del VPN de Bombyx mori, y dichos virus se pueden usar como virus en el presente documento, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, lenteja de agua (Leninaceae), alfalfa (M. truncatula) y tabaco también se pueden utilizar como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

Las células de vertebrado se pueden usar como huéspedes, y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL70); células de riñón de mono verde africano (v Er O-76, ATCC c Rl-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL34); células de hígado de rata búfalo (BRL3A, ATCC CRL1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL75); células de hígado humano (Hep G2, HB8065); tumor mamario de ratón (MMTO60562, ATCC CCL51); linfocitos TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR-(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma, tales como NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268.

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o de clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

(h) Cultivo de las células huésped

Las células huésped usadas para producir un anticuerpo como se describe en el presente documento se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como F10 de Ham (Sigma), medio esencial mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al, Meth. Enz.

58:44 (1979), Bames et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), patentes de EE. UU. n.os 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o patente de EE. UU. Re. 30.985 se pueden usar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede complementar de acuerdo con sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario también se puede incluir en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica.

(xiv) Purificación de anticuerpo

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o se puede secretar directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los restos de partículas, células huésped o bien fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. En resumen, se descongela la pasta de células en presencia de acetato de sodio (pH3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares se pueden retirar por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión en general se concentran en primer lugar usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes accidentales.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad una de las etapas de purificación típicamente preferentes. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Se puede usar proteína A para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es muy a menudo agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C^h3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina-SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna con poli(ácido aspártico)), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.

En general, diversas metodologías para preparar anticuerpos para su uso en investigación, pruebas y clínica están bien establecidas en la técnica, consecuente con las metodologías descritas anteriormente y/o de acuerdo con lo considere apropiado un experto en la técnica para un anticuerpo particular de interés.

C. Selección de anticuerpos biológicamente activos

Los anticuerpos producidos como se describe anteriormente se pueden someter a uno o más ensayos de "actividad biológica" para seleccionar un anticuerpo con propiedades beneficiosas desde una perspectiva terapéutica o seleccionar formulaciones y condiciones que retienen la actividad biológica del anticuerpo. El anticuerpo se puede someter a prueba para determinar su capacidad para unirse al antígeno frente al que se originó. Por ejemplo, se pueden usar procedimientos conocidos en la técnica (tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia, etc.).

Por ejemplo, para un anticuerpo anti-PD-L1, las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo se pueden evaluar en un ensayo que detecta la capacidad de unirse a PD-L1. En algunos aspectos, la unión del anticuerpo se puede determinar por ensayos de unión por saturación; ELISA; y/o competencia (por ejemplo, RIA), por ejemplo. Además, el anticuerpo se puede someter a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, para evaluar su eficacia como agente terapéutico. Dichos ensayos son conocidos en la técnica y dependen del antígeno diana y del uso previsto del anticuerpo. Por ejemplo, los efectos biológicos del bloqueo de PD-L1 por el anticuerpo se pueden evaluar en linfocitos T CD8+, un modelo murino de virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) y/o un modelo de tumor singénico, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 8.217.149.

Para detectar anticuerpos que se unen a un epítopo particular en el antígeno de interés (por ejemplo, los que bloquean la unión del anticuerpo anti-PD-L1 del ejemplo a PD-L1), se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). De forma alternativa, se puede realizar una cartografía de epítopos, por ejemplo, como se describe en Champe et al., J. Biol. Chem 270:1388-1394 (1995), para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.

D. Composiciones farmacéuticas y formulaciones

También se proporcionan en el presente documento composiciones y formulaciones farmacéuticas que comprenden un antagonista de unión al eje PD-1 y/o un anticuerpo descrito en el presente documento (tal como un anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo biespecífico que se une a CEA y CD3) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas como se describen en el presente documento se pueden preparar mezclando los ingredientes activos (por ejemplo, un antagonista de unión al eje PD-1 y/o un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3) que tienen el grado deseado de pureza con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Znproteína) y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas a pH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.

Se describen formulaciones de anticuerpos liofilizadas ejemplares en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y documento WO2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón acetato-histidina.

La composición y la formulación en el presente documento también pueden contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

IV. Procedimientos de tratamiento

En el presente documento se describen procedimientos para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3. En algunos aspectos, el tratamiento da como resultado una respuesta en el individuo después del tratamiento. En algunos aspectos, la respuesta es una respuesta parcial. En algunos aspectos, la respuesta es una respuesta completa. En algunos aspectos, el tratamiento da como resultado una respuesta mantenida (por ejemplo, una respuesta parcial o respuesta completa mantenida) en el individuo después del cese del tratamiento. Los procedimientos descritos en el presente documento pueden encontrar uso en el tratamiento de afecciones donde se desea una potenciación en la inmunogenicidad, tal como un incremento en la inmunogenicidad tumoral para el tratamiento del cáncer. También se describen en el presente documento procedimientos para potenciar la función inmunitaria en un individuo que tiene cáncer que comprenden administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, MPDL3280A) y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 (por ejemplo, CEA-TCB).

En algunos casos, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen la administración de una cantidad eficaz de un antagonista de unión al eje PD-1 seleccionado del grupo que consiste en un antagonista de unión a PD-1, un antagonista de unión a PD-L1 y un antagonista de unión a PD-L2. En algunos casos, el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo, tal como un anticuerpo que puede inhibir la unión de PD-L1 a PD-1 y B7.1, pero no interrumpe la unión de PD-1 a PD-L2. En algunos casos, el anticuerpo antagonista de unión a PD-L1 es MPDL3280A, que se puede administrar en una dosis de aproximadamente 800 mg a aproximadamente 1500 mg cada tres semanas (por ejemplo, de aproximadamente 1000 mg a aproximadamente 1300 mg cada tres semanas, por ejemplo, de aproximadamente 1100 mg. mg a aproximadamente 1200 mg cada tres semanas). En algunos aspectos, MPDL3280A se administra a una dosis de aproximadamente 1200 mg cada tres semanas.

Como propuesta general, la cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1, por ejemplo, MPDL3280A) que se puede administrar a un humano estará en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del paciente ya sea por una o más administraciones. En algunos aspectos, por ejemplo, el antagonista (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1, por ejemplo, MPDL3280A) se administra en una dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 15 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 mg/kg administrados diariamente, por ejemplo. En algunos aspectos, el antagonista (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1, por ejemplo, MPDL3280A) se administra a 15 mg/kg. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. En un aspecto, un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1, por ejemplo, MPDL3280A) se administra a un humano a una dosis de aproximadamente 100 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 400 mg, aproximadamente 500 mg, aproximadamente 600 mg, aproximadamente 700 mg, aproximadamente 800 mg, aproximadamente 900 mg, aproximadamente 1000 mg, aproximadamente 1100 mg, aproximadamente 1200 mg, aproximadamente 1300 mg, aproximadamente 1400 mg o aproximadamente 1500 mg. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1, por ejemplo, MPDL3280A) se administra a una dosis de aproximadamente 1150 mg a aproximadamente 1250 mg cada tres semanas. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1, por ejemplo, MPDL3280A) se administra a una dosis de aproximadamente 1200 mg cada tres semanas. La dosis se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples (por ejemplo, 2 o 3 dosis), tal como infusiones. La dosis del anticuerpo administrado en un tratamiento de combinación se puede reducir en comparación con un tratamiento único. En algunos aspectos, por ejemplo, el procedimiento para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo comprende una pauta posológica que comprende ciclos de tratamiento, en el que al individuo se le administra, los días 1 de cada ciclo, un antagonista de unión al eje PD-1 humano (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1, por ejemplo, MPDL3280A) a una dosis de aproximadamente 1200 mg, en el que cada ciclo es de 21 días (es decir, cada ciclo se repite cada 21 días). La evolución de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas convencionales.

En algunos casos, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 (por ejemplo, CEA-TCB). En algunos casos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 (por ejemplo, CEA-TCB) se administra al individuo a una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 400 mg cada semana (por ejemplo, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 60 mg cada semana, por ejemplo, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 40 mg cada semana, por ejemplo de aproximadamente 80 mg a aproximadamente 200 mg cada semana, por ejemplo de aproximadamente 80 mg a aproximadamente 400 mg cada semana, o por ejemplo de aproximadamente 160 mg a 400 mg cada semana). En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 (por ejemplo, CEA-TCB) se administra a una dosis de aproximadamente 5 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 80 mg o aproximadamente 160 mg, cada semana. Como propuesta general, la cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 (por ejemplo, CEA-TCB) administrada a un humano estará en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 400 mg (por ejemplo, de aproximadamente 5 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 25 mg, aproximadamente 30 mg aproximadamente 35 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 45 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 55 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 65 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 80 mg aproximadamente 85 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 95 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 150 mg, aproximadamente 160 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 250 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 350 mg o aproximadamente 400 mg), ya sea por una o más administraciones. Por ejemplo, en algunos aspectos, se administra aproximadamente 5 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 80 mg o aproximadamente 160 mg de CEA-TCB. En algunos aspectos, CEA-TCB se administra a 5 mg, 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg o 160 mg, una vez por semana. En aspectos particulares, se administran al menos aproximadamente 80 mg de CEA-TCB. En algunos aspectos, CEA-TCb se administra a 80 mg una vez por semana. En algunos aspectos, CEA-TCB se administra a 80-200 mg, 80-400 mg o 160-400 mg una vez por semana. En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 (por ejemplo, CEA-TCB) se puede administrar semanalmente, cada 2 semanas, cada 3 semanas, cada 4 semanas, los días 1,8 y 15 de cada ciclo de 21 días, o los días 1, 8 y 15 de cada ciclo de 28 días.

En algunos casos, el antagonista de unión al eje PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1, por ejemplo, MPDL3280A) y el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 (por ejemplo, CEA-TCB) se administran en una pauta posológica única. La administración de estos agentes puede ser simultánea o separada dentro del contexto de la pauta posológica. Por ejemplo, en algunos casos, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen una pauta posológica que comprende ciclos de tratamiento, en los que al individuo se le administra, los días 1 de cada ciclo, un antagonista de unión al eje PD-1 humano a una dosis de aproximadamente 1200 mg, y los días 1, 8 y 15 de cada ciclo, un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 a una dosis de aproximadamente 5 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 80 mg o aproximadamente 160 mg, repitiéndose cada ciclo cada 21 días. En un aspecto, al individuo se le administra, los días 1 de cada ciclo, un antagonista de unión al eje PD-1 humano a una dosis de aproximadamente 1200 mg, y los días 1, 8 y 15 de cada ciclo, un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 a una dosis de aproximadamente 80 mg, repitiéndose cada ciclo cada 21 días. En un aspecto particular, al individuo se le administra, los días 1 de cada ciclo, un antagonista de unión al eje PD-1 humano a una dosis de aproximadamente 1200 mg, y los días 1, 8 y 15 de cada ciclo, un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 a una dosis de al menos aproximadamente 80 mg, repitiéndose cada ciclo cada 21 días. Todavía en otro aspecto, al individuo se le administra, los días 1 de cada ciclo, un antagonista de unión al eje PD-1 humano a una dosis de aproximadamente 1200 mg, y los días 1,8 y 15 de cada ciclo, un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 a una dosis de aproximadamente 80 mg a aproximadamente 200 mg, de aproximadamente 80 mg a aproximadamente 400 mg, o de aproximadamente 160 mg a aproximadamente 400 mg, repitiéndose cada ciclo cada 21 días.

En algunos aspectos, el individuo es un ser humano. En algunos aspectos, el individuo padece cáncer de mama localmente avanzado o metastásico. En algunos aspectos, el individuo tiene cáncer positivo para CEA. En algunos aspectos, el cáncer positivo para CEA es cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de esófago o cáncer de próstata. En un aspecto particular, el cáncer es carcinoma colorrectal. En algunos aspectos, el cáncer de mama es un carcinoma de mama o un adenocarcinoma de mama. En algunos aspectos, el carcinoma de mama es un carcinoma ductal invasivo. En algunos aspectos, el cáncer de pulmón es un adenocarcinoma de pulmón. En algunos aspectos, el cáncer de colon es un adenocarcinoma colorrectal. En algunos aspectos, las células cancerosas en el individuo expresan PD-L1. En algunos aspectos, las células cancerosas en el individuo expresan la proteína CEA a un nivel que es detectable (por ejemplo, detectable usando procedimientos conocidos en la técnica).

En algunos aspectos, el individuo se ha tratado con un tratamiento del cáncer antes del tratamiento de combinación con un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3. En algunos aspectos, el individuo tiene un cáncer que es resistente a uno o más tratamientos del cáncer. En algunos aspectos, la resistencia al tratamiento del cáncer incluye recidiva de cáncer o cáncer resistente al tratamiento. La recidiva se puede referir a la reaparición del cáncer, en el sitio original o en un sitio nuevo, después del tratamiento. En algunos aspectos, la resistencia a un tratamiento del cáncer incluye la progresión del cáncer durante el tratamiento con el tratamiento antineoplásico. En algunos aspectos, la resistencia a un tratamiento del cáncer incluye el cáncer que no responde al tratamiento. El cáncer puede ser resistente al comienzo del tratamiento o se puede volver resistente durante el tratamiento. En algunos aspectos, el cáncer está en una fase precoz o en una fase tardía.

En algunos aspectos, el tratamiento de combinación descrito en el presente documento comprende la administración de un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3. El antagonista de unión al eje PD-1 y el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar de cualquier manera adecuada conocida en la técnica. Por ejemplo, el antagonista de unión al eje PD-1 y el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar de forma secuencial (en diferentes momentos) o simultánea (al mismo tiempo). En algunos aspectos, el antagonista de unión al eje PD-1 está en una composición separada como el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3. En algunos aspectos, el antagonista de unión al eje PD-1 está en la misma composición que el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3.

El antagonista de unión al eje PD-1 y el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar por la misma vía de administración o por diferentes vías de administración. En algunos aspectos, el antagonista de la unión al eje PD-1 se administra por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantación, por inhalación, por vía intratecal, intraventricular o intranasal. En algunos aspectos, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se administra por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantación, por inhalación, intratecal, intraventricular o intranasal. Se puede administrar una cantidad eficaz del antagonista de unión al eje PD-1 y del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 para la prevención o tratamiento de la enfermedad. La dosificación apropiada del antagonista de unión al eje PD-1 y/o del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se puede determinar en base al tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de antagonista de unión al eje PD-1 y el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3, la gravedad y el curso de la enfermedad, el estado clínico del individuo, la anamnesis del individuo y la respuesta al tratamiento, y el juicio del médico especialista.

En algunos aspectos, los procedimientos pueden comprender además un tratamiento adicional. El tratamiento adicional puede ser radioterapia, cirugía (por ejemplo, tumorectomía y una mastectomía), quimioterapia, genoterapia, tratamiento de ADN, tratamiento antivírico, tratamiento de ARN, inmunoterapia, trasplante de médula ósea, nanoterapia, tratamiento con anticuerpos monoclonales o una combinación de los anteriores. El tratamiento adicional puede ser en forma de tratamiento posquirúrgico o prequirúrgico. En algunos aspectos, el tratamiento adicional es la administración de inhibidor enzimático de molécula pequeña o agente antimetastásico. En algunos aspectos, el tratamiento adicional es la administración de agentes limitantes de efectos secundarios (por ejemplo, agentes destinados a reducir la aparición y/o gravedad de los efectos secundarios del tratamiento, tales como agentes antieméticos, etc.). En algunos aspectos, el tratamiento adicional es radioterapia. En algunos aspectos, el tratamiento adicional es cirugía. En algunos aspectos, el tratamiento adicional es una combinación de radioterapia y cirugía. En algunos aspectos, el tratamiento adicional es irradiación gamma. En algunos aspectos, el tratamiento adicional es un tratamiento dirigido a la vía PI3K/AKT/mTOR, inhibidor de HSP90, inhibidor de tubulina, inhibidor de apoptosis y/o agente quimioprofiláctico. El tratamiento adicional puede ser uno o más de los agentes quimioterápicos descritos en el presente documento.

Otras politerapias

En el presente documento también se describen procedimientos para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo un antagonista de unión al eje PD-1 humano (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-L1, por ejemplo, MPDL3280A) y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 (por ejemplo, CEA-TCB) junto con otro agente antineoplásico o tratamiento del cáncer.

En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con una quimioterapia o agente quimioterápico. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con una radioterapia o agente radioterápico. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un tratamiento dirigido o agente terapéutico dirigido. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con una inmunoterapia o agente inmunoterápico, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal.

Sin desear quedar vinculado a teoría alguna, se cree que potenciar la estimulación de linfocitos T, promoviendo una molécula coestimuladora activadora o inhibiendo una molécula coestimuladora negativa, puede promover la muerte de las células tumorales, tratando o retrasando de este modo la progresión del cáncer. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un agonista dirigido frente a una molécula coestimuladora activadora. En algunos aspectos, una molécula coestimuladora activadora puede incluir CD40, CD226, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM o CD127. En algunos aspectos, el agonista dirigido frente a una molécula coestimuladora activadora es un anticuerpo agonista que se une a CD40, CD226, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM o CD127. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un antagonista dirigido frente a una molécula coestimuladora inhibidora. En algunos aspectos, una molécula coestimuladora inhibidora puede incluir CTLA-4 (también conocido como CD152), PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7-H3, B7-H4, IDO, TIGIT, MICA/B o arginasa. En algunos aspectos, el antagonista dirigido frente a una molécula coestimuladora inhibidora es un anticuerpo antagonista que se une a CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7-H3, B7-H4, IDO, TIGIT, MICA/B 0 arginasa.

En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un antagonista dirigido frente a CTLA-4 (también conocido como CD152), por ejemplo, un anticuerpo de bloqueo. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 se puede administrar junto con ipilimumab (también conocido como MDX-010, MDX-101 o YERVOY®). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con tremelimumab (también conocido como ticilimumab o CP-675.206). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un antagonista dirigido frente a B7-H3 (también conocido como CD276), por ejemplo, un anticuerpo de bloqueo. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con MGA271. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un antagonista dirigido frente a un TGF beta, por ejemplo, metelimumab (también conocido como CAT-192), fresolimumab (también conocido como GC1008) o LY2157299.

En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un tratamiento que comprende la transferencia adoptiva de un linfocito T (por ejemplo, un linfocito T citotóxico o CTL) que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un tratamiento que comprende la transferencia adoptiva de un linfocito T que comprende un receptor de t Gf beta dominante negativo, por ejemplo, un receptor de TGF beta tipo II dominante negativo. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un tratamiento que comprende un protocolo HERCREEM (véase, por ejemplo, ClinicalTrials.gov, identificador NCT00889954).

En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un agonista dirigido frente a CD137 (también conocido como TNFRSF9, 4-1BB o ILA), por ejemplo, un anticuerpo activador. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con urelumab (también conocido como BMS-663513). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un agonista dirigido frente a CD40, por ejemplo, un anticuerpo activador. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con CP-870893. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un agonista dirigido frente a OX40 (también conocido como CD134), por ejemplo, un anticuerpo activador. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un anticuerpo anti-OX40 (por ejemplo, AgonOX). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un agonista dirigido frente a CD27, por ejemplo, un anticuerpo activador. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 se puede administrar junto con CDX-1127. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un antagonista dirigido frente a la indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO). En algunos aspectos, el antagonista de IDO es 1-metil-D-triptófano (también conocido como 1-D-MT).

En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un conjugado anticuerpo-fármaco. En algunos aspectos, el conjugado anticuerpo-fármaco comprende mertansina o monometilauristatina E (MMAE). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un conjugado anticuerpo anti-NaPi2b-MMAE (también conocido como DNIB0600A o RG7599). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con trastuzumab emtansina (también conocido como T-DM1, ado-trastuzumab emtansina o KADCYLA®, Genentech). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con DMUC5754A. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un conjugado anticuerpo-fármaco dirigido al receptor de endotelina B (EDNBR), por ejemplo, un anticuerpo dirigido frente a EDNBR conjugado con MMAE.

En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un inhibidor de la angiogénesis. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 se puede administrar junto con un anticuerpo dirigido frente a un VEGF, por ejemplo, VEGF-A. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con bevacizumab (también conocido como AVASTIN®, Genentech). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un anticuerpo dirigido frente a la angiopoyetina 2 (también conocida como Ang2). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con MEDI3617.

En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un agente antineoplásico. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un agente dirigido a CSF-1R (también conocido como M-CSFR o CD115). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con anti-CSF-1R (también conocido como IMC-CS4). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un interferón, por ejemplo, interferón alfa o interferón gamma. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con Roferon-A (también conocido como interferón recombinante alfa-2a). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con GM-CSF (también conocido como factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos humanos recombinantes, rhu GM-CSF, sargramostim, o Leukine®). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con IL-2 (también conocida como aldesleucina o Proleukin®). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con IL-12. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un anticuerpo dirigido a CD20. En algunos aspectos, el anticuerpo dirigido a CD20 es obinutuzumab (también conocido como GA101 o Gazyva®) o rituximab. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un anticuerpo dirigido a GITR. En algunos aspectos, el anticuerpo dirigido a GITR es TRX518.

En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con una vacuna contra el cáncer. En algunos aspectos, la vacuna contra el cáncer es una vacuna contra el cáncer peptídica que, en algunos aspectos, es una vacuna peptídica personalizada. En algunos aspectos, la vacuna contra el cáncer peptídica es un péptido largo multivalente, un péptido múltiple, una mezcla de péptidos, un péptido híbrido o una vacuna de células dendríticas pulsadas con péptidos (véase, por ejemplo, Yamada et al., Cancer Sci, 104:14-21, 2013). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un adyuvante. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un tratamiento que comprende un agonista de TLR, por ejemplo, poli-ICLC (también conocido como Hiltonol®), LPS, MPL o CpG ODN. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con el factor de necrosis tumoral (TNF) alfa. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con IL-1. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con HMGB1. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un antagonista de IL-10. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un antagonista de IL-4. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un antagonista de IL-13. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un antagonista de HVEM. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un agonista de ICOS, por ejemplo, por administración de ICOS-L, o un anticuerpo agonista dirigido frente a ICOS. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un tratamiento dirigido a CX3CL1. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un tratamiento dirigido a CXCL9. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un tratamiento dirigido a CXCL10. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un tratamiento dirigido a CCL5. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 se puede administrar junto con un agonista de LFA-1 o ICAM1. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un agonista de selectina.

En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un tratamiento dirigido. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un inhibidor de B-Raf. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con vemurafenib (también conocido como Zelboraf®). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con dabrafenib (también conocido como Tafinlar®). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con erlotinib (también conocido como Tarceva®). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un inhibidor de una MEK, tal como MEK1 (también conocida como MAP2K1) o MEK2 (también conocida como MAP2K2). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con cobimetinib (también conocido como GDC-0973 o XL-518). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con trametinib (también conocido como Mekinist®). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un inhibidor de K-Ras. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un inhibidor de c-Met. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con onartuzumab (también conocido como MetMAb). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un inhibidor de Alk. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con AF802 (también conocido como CH5424802 o alectinib). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un inhibidor de una fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con BKM120. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con idelalisib (también conocido como GS-1101 o c AL-101). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con perifosina (también conocida como KRX-0401). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un inhibidor de una Akt. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con MK2206. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con GSK690693. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con GDC-0941. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un inhibidor de mTOR. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con sirolimus (también conocido como rapamicina). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con temsirolimus (también conocido como CCI-779 o Torisel®). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con everolimus (también conocido como RAD001). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con ridaforolimus (también conocido como AP-23573, MK-8669 o deforolimus). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con OSI-027. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con AZD8055. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con INK128. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con un inhibidor de PI3K/mTOR doble. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con XL765. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con GDC-0980. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con BEZ235 (también conocido como NVP-BEZ235). En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con BGT226. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con GSK2126458. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con PF-04691502. En algunos aspectos, un antagonista de unión al eje PD-1 y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se pueden administrar junto con PF-05212384 (también conocido como PKI-587).

V. Artículos de fabricación o kits

En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un artículo de fabricación o un kit que comprende un antagonista de unión al eje PD-1 y/o un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3. En algunos aspectos, el artículo de fabricación o kit comprende además un prospecto del envase que comprende instrucciones para usar el antagonista de unión al eje PD-1 junto con un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 para tratar o retrasar la progresión del cáncer en un individuo o para potenciar la función inmunitaria de un individuo que tiene cáncer. Cualquiera del antagonista de unión al eje PD-1 y/o un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 descritos en el presente documento se pueden incluir en el artículo de fabricación o kits.

En algunos aspectos, el antagonista de unión al eje PD-1 y el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 están en el mismo recipiente o en recipientes separados. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, bolsas y jeringuillas. El recipiente se puede formar de una variedad de materiales tales como vidrio, plástico (tal como poli(cloruro de vinilo) o poliolefina) o aleación metálica (tal como acero inoxidable o Hastelloy). En algunos aspectos, el recipiente contiene la formulación y la etiqueta en, o asociada con, el recipiente puede indicar instrucciones de uso. El artículo de fabricación o kit puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos del envase con instrucciones para su uso. En algunos aspectos, el artículo de fabricación incluye además uno o más de otro agente (por ejemplo, un agente quimioterápico y un agente antineoplásico). Los recipientes adecuados para uno o más agentes incluyen, por ejemplo, frascos, viales, bolsas y jeringuillas.

EJEMPLOS

La invención se entenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: la lisis tumoral mediada por CEA-TCB da lugar a una regulación por incremento de PD-1 en linfocitos T humanos y de PD-L1 en células tumorales supervivientes in vitro

CEA-TCB es un anticuerpo biespecífico de linfocitos T novedoso dirigido al antígeno carcinoembrionario (CEA) en las células tumorales y CD3 en los linfocitos T. Actualmente se está investigando como agente único en un estudio en fase I en pacientes con tumores que expresan CEA avanzados y/o metastásicos.

La lisis de células diana MKN-45 que expresan CEA mediada por CEA-TCB se evaluó después de 24 h y 48 h de incubación con PBMC humanas (E:T 10:1, liberación de LDH) (figura 1, A 24 h, B 48 h).

Las PBMC se aislaron de una capa leucocitaria obtenida del "Blutspende Zürich". La sangre se diluyó 3:1 con PBS. Aproximadamente 30 ml de la mezcla de sangre/PBS se colocaron en capas sobre 15 ml de Histopaque y se centrifugaron durante 30 min a 450 g sin freno a temperatura ambiente (t.a.). Los linfocitos se recogieron con una pipeta de 10 ml en tubos de 50 ml que contenían PBS y se llenaron hasta 50 ml con PBS y se centrifugaron durante 10 min a 350 g. El sobrenadante se desechó, el sedimento se resuspendió en 50 ml de p Bs y se centrifugó durante 10 min a 300 g. La etapa de lavado se repitió una vez. Las células se resuspendieron en RPMi que contenía FCS al 10 % y GlutaMax al 1 % y se almacenaron a 37 °C, CO2 al 5 % en la incubadora hasta el inicio del ensayo.

Se obtuvieron células diana MKN-45 adherentes con tripsina/EDTA un día antes del ensayo, se lavaron y se prepararon en placas a una densidad de 1,4 millones de células/pocillo usando placas de 24 pocillos de fondo plano. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche en una incubadora humidificada. El día del ensayo, se centrifugaron las placas a 350 g durante 5 min y se aspiró el medio. Se añadieron 550 pl por pocillo de medio de ensayo (RPMI1640, FCS al 2 %, GlutaMax al 1 %).

Se añadieron CEA-TCB o TCB no dirigido a las concentraciones indicadas (intervalo de 6,4 pM-100 nM, por triplicado). Se añadieron PBMC a las células diana en la proporción efector:diana final E:T 10:1, el volumen final por pocillo fue de 1,1 ml.

Se evaluó la destrucción de células diana después de 24 h y 48 h de incubación por cuantificación de LDH (lactato deshidrogenasa) liberada en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001). Se logró la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin anticuerpo biespecífico. Se calcularon los valores de CE50 usando GraphPadPrism5.

Después de la destrucción, se evaluó la expresión superficial del receptor PD-1 (en linfocitos T CD4+ o CD8 ) y de PD-L1 (en células tumorales que sobrevivieron a la destrucción) por citometría de flujo.

Tras la retirada de 50 pl del sobrenadante para la segunda lectura de LDH (punto temporal de 48 h), las placas de ensayo se centrifugaron durante 5 min a 350 g y los sobrenadantes se desecharon. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 pl de PBS y se transfirieron a pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Los pocillos se lavaron con 80 pl de PBS y esta etapa de lavado se agrupó con los sobrenadantes ya transferidos de las etapas anteriores. Las células MKN45 adherentes se separaron con 80 pl de tampón de disociación celular (Gibco) y también se transfirieron a la placa FACS. Las placas se centrifugaron durante 4 min a 400 g. Los sedimentos celulares se lavaron una vez más con 150 pl de tampón FACS. Después de la centrifugación (400 g durante 4 min), se retiró el sobrenadante y se resuspendieron las células por agitación en vórtex con cuidado. La suspensión celular por pocillo se dividió en dos y las placas de ensayo se centrifugaron de nuevo. Se añadieron por pocillo 25 pl de la mezcla de anticuerpos (anticuerpos dirigidos frente a CD4, CD8 , PD-1 (Biolegend, n.° 329920) y PD-L1 (Biolegend, n.° 329708)). Para retirar el anticuerpo no unido, se lavaron las células dos veces con 150 pl de tampón FACS por pocillo. Después de la centrifugación (400 g durante 4 min), se retiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en 120 pl de tampón FACS.

La figura 2 muestra una regulación por incremento dependiente de la dosis del receptor PD-1 en linfocitos T CD8 (A) y CD4+ (B), así como de PD-L1 en células tumorales que resistieron la destrucción (C) y se obtuvieron después de 48 h de incubación.

Ejemplo 2: la lisis tumoral mediada por CEA-TCB da lugar a una regulación por incremento de PD-1 en linfocitos T humanos y de PD-L1 en células tumorales supervivientes in vivo

Se llevaron a cabo estudios de farmacología in vivo no clínicos usando un modelo tumoral de xenoinjerto de carcinoma de colon humano (LS174T-fluc2) en ratones NOG inmunodeficientes. Se usaron dos ajustes experimentales diferentes: 1) se coinjertaron células tumorales con PBMC humanas (subcutáneas [s.c.]) a diferentes proporciones E:T, y 2) se inyectaron células tumorales s.c. seguido de transferencia intraperitoneal (i.p.) de PBMC una vez que se determinaron los tumores (alcanzaron una masa palpable).

Experimento de xenoinjerto con coinjerto de células efectoras

Los resultados de la eficacia in vivo de CEA-TCB obtenidos tras el coinjerto de células LS174T-fluc2 con PBMC humanas a una proporción efector:diana (E:T) 5:1 se muestran en la figura 3.

Cuando se administra un día después del coinjerto de tumor/PBMC, ambas dosis de CEA-TCB (0,5 y 2,5 mg/kg) indujeron regresión tumoral (figura 3A). Cuando se administró siete días después del coinjerto, solo la dosis mayor (2,5 mg/kg) indujo regresión tumoral, mientras que la dosis menor (0,5 mg/kg) no pudo inducir regresión tumoral, pero dio lugar al control del crecimiento tumoral y estasis tumoral (figura 3B).

El análisis histológico de tumores obtenidos al final del mismo experimento confirmó que tanto el tratamiento temprano (día 1) con 0,5 mg/kg de CEA-TCB como el tratamiento retardado (día 7) con 2,5 mg/kg de CEA-TCB dieron lugar a la eliminación completa células tumorales que expresan CEA y dieron como resultado una infiltración de linfocitos T notable en tumores (no mostrado). Mientras que se detectó una alta expresión de CEA en células tumorales junto con infiltración de linfocitos T variable en tumores de control (vehículo y MCSP TCB no dirigido), el tratamiento con CEA-TCB (0,5 y 2,5 mg/kg) dio lugar a una eliminación completa de células tumorales que expresan CEA junto con la formación de áreas necróticas/fibróticas llenas de linfocitos T infiltrantes (no mostrado). La tinción de los mismos tumores con anticuerpo anti-PD-L1 demostró una fuerte inducción de la expresión de PD-L1 intratumoral tras el tratamiento con CEA-TCB en comparación con el control de vehículo (figura 4).

Experimento de xenoinjerto con transferencia i.p. de células efectoras

La eficacia in vivo de CEA-TCB también se evaluó en modelos de xenoinjerto, en los que se inyectaron células tumorales s.c. seguido de transferencia i.p. de PBMC una vez que los tumores alcanzaron una masa palpable. CEA-TCB (2,5 mg/kg i.v. bisemanal) dio lugar a una regresión tumoral significativa (reducción de peso tumoral, figura 5) y a un incremento en la infiltración de linfocitos T en los tumores (análisis de citometría de flujo (figura 6) e histología (no mostrado)), teniendo los linfocitos T un fenotipo activado (como se muestra por el análisis de citometría de flujo que indica una regulación por incremento de los marcadores de activación de CD25 y CD69, no mostrado). Esto contrastó con el vehículo (PBS) y MCSP TCB (control no dirigido), donde solo un número bajo de linfocitos T infiltraron tumores y mostraron un fenotipo en reposo.

Experimentos adicionales que estudiaron los biomarcadores PD-1 y CD69 mostraron que, en comparación con el vehículo, CEA-TCB indujo una regulación por incremento del marcador de activación temprana CD69 y de PD-1 (figura 7L, flecha) en linfocitos T infiltrantes de tumor. Por el contrario, los linfocitos T de sangre periférica mostraron un fenotipo de reposo en ambos grupos (figura 7 A-F).

La tinción de los mismos tumores con anticuerpo anti-PD-L1 mostró una fuerte inducción de la expresión de PD-L1 intratumoral tras el tratamiento con CEA-TCB en comparación con el control de vehículo.

Experimento de xenoinjerto en ratones completamente humanizados

La actividad antitumoral de CEA-TCB se evaluó in vivo en un modelo de ratón humanizado que porta la línea celular cancerosa MKN45 que expresa CEA por vía subcutánea.

Se inyectó CEA-TCB i.v. (2,5 mg/kg, dos veces/semana) el día 11 después de la inyección de células tumorales, y se midió el crecimiento tumoral dos veces por semana por compás calibrador. La figura 8 muestra los volúmenes tumorales individuales al final del estudio; se descubrió una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) en el volumen tumoral.

Además de las mediciones de volumen tumoral, se obtuvieron tumores, sangre, bazo y ganglios linfáticos al final del estudio (correspondiente a 32 días después de la inyección de células tumorales) y se analizaron por citometría de flujo. El tratamiento con CEA-TCB dio como resultado un incremento significativo de frecuencias de linfocitos T humanos en el tumor y cambió la proporción de linfocitos T CD8+/CD4+ a favor de los linfocitos T CD8+ (figura 9 A y B). Al mismo tiempo, los linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ presentaron un fenotipo activado en los tumores tratados con CEA-TCB mostrado por regulación por incremento de la expresión de CD69 y PD-1 en linfocitos T CD4+ y CD8+ intratumorales (figura 9 C y D). Los linfocitos T CD8+ revelaron una regulación por incremento de la expresión de Granzima B (GZB) intracelular así como una mayor tasa de proliferación (marcador Ki-67). Los análisis de muestras de bazo y sangre de animales tratados con CEA-TCB no mostraron ninguna diferencia en términos de frecuencias de linfocitos T, proporción de linfocitos T o estado de activación en comparación con el vehículo.

Por tanto, los cambios inmunológicos desencadenados por el tratamiento con CEA-TCB fueron específicos de tumor, lo que indica que la reticulación y activación de los linfocitos T humanos se produce exclusivamente en tumores que expresan CEA y no en otras áreas que son negativas para CEA como la sangre y el bazo.

El análisis histológico de tumores obtenidos al final del estudio confirmó los resultados de la citometría de flujo (no mostrado). Mientras que el CEA humano se expresó en tumores de grupos tratados tanto con vehículo como CEA-TCB, el tamaño del tumor se redujo significativamente por tratamiento con CEA-TCB. Además, los tumores de vehículo mostraron baja infiltración de células inmunitarias humanas que estaban principalmente confinadas en áreas del estroma y el borde del tumor, mientras que los grupos tratados con CEA-TCB mostraron una fuerte infiltración de células inmunitarias a través de toda el área tumoral y no solo en la periferia. Además, los linfocitos T humanos mostraron un incremento en la expresión de GZB dentro de los tumores. La tinción de los mismos tumores con anticuerpo anti-PD-L1 demostró una fuerte inducción de la expresión de PD-L1 intratumoral tras el tratamiento con CEA-TCB en comparación con el control de vehículo (figura 10).

Ejemplo 3: evaluación de la actividad antitumoral in vivo tras la combinación de CEA-TCB con anticuerpo de bloqueo anti-PD-L1 en modelo de ratón con carcinoma gástrico

La eficacia antitumoral de CEA-TCB en combinación con el anticuerpo de bloqueo anti-PD-L1 humano se evaluó en ratones completamente humanizados que portaban la línea celular tumoral de carcinoma gástrico (MKN45).

Se generó un anticuerpo sustituto anti-PD-L1 de ratón basado en el anticuerpo frente a PD-L1 YW243.55.S70 descrito en el documento WO 2010/077634 (secuencia mostrada en la figura 11) para su uso en modelos tumorales in vivo. Este anticuerpo contenía una mutación DAPG para anular la interacción con FcyR. La región variable de YW243.55.S70 se unió a un dominio constante de IgG1 murina con mutaciones de Fc DAPG.

Las secuencias polipeptídicas de muIgG1 frente a PD-L1 YW243.55.S70 son las siguientes:

HC con DAPG de muIgG1 frente a PD-L1 YW243.55.S70 (SEQ ID NO:36):

E V QLVES GGGLV QPGGS LRLS C A AS GFTFS D S W1HW VRQ APGKGLE W V AWIS P YGG S TYY ADS VKGRFTIS ADTS KNT A YLQMNSLRAEDT A VY YC ARRHWPGGFD YW GQG TLVT V S A AKTTPPS V YPLAPGS A AQTN S M VTLGCLVKG YFPEP VT VTWN S GS LS S G V HTFP A VLQS DLYTLS S S VT VPS S TWPS ET VT CN V AHP AS S TKVDKKIVPRDCGC KPCI CT VPEV S S VFIFPPKPKD VLTITLTPKVTC VVVDIS KD APEV QFS WFVDD VE VHT AQT QPREEQFN S TFRS V S ELPIMHQD WLN GKEFKCRVN S A AF G APIEKTIS KTKGRPKAPQ VYTIPPPKEQMAKDKV S LTCMITDFFPEDIT VEW QWN GQP AENYKNTQPIMDTDGS Y FV Y S KLNV QKS NWE AGNTFTCS VLHEGLHNHHTEKS LS HS PGK

LC de muIgG1 frente a PD-L1 YW243.55.S70 (SEQ ID NO:37):

DIQMTQS PS S LS AS VGDR VTITCRAS QD VS T A V A W YQQKPGKAPKLLIYS ASFL YS G VPSRFS GS GS GTDFTLTIS S LQPEDFAT YYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRAD A APTV SIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDST YS MS S TLTLTKDE YERHN S YT CE ATHKT S TS PIVKS FNRNEC

En resumen, se inyectaron 1 x 106 células tumorales MKN45 por vía subcutánea en ratones NOG completamente humanizado. 7 días después de la inyección de células tumorales, los ratones se aleatorizaron en cuatro grupos: el primer grupo recibió solución salina tamponada con fosfato (PBS, vehículo) como control, el segundo grupo recibió CEA-TCB (a la dosis de 2,5 mg/kg, administrada dos veces por semana durante 7 semanas, 15 administraciones en total), el tercer grupo recibió anticuerpo anti-PD-L1 (a la dosis de 10 mg/kg, administrada una vez por semana durante 7 semanas, 8 administraciones en total) y el cuarto grupo recibió un combinación de CEA-TCB y anticuerpo anti-PD-L1, administrado simultáneamente con la dosis y programas respectivos usados en los grupos terapéuticos únicos durante 7 semanas (8 administraciones de anticuerpo anti-PD-L1, 10 mg/kg administrados una vez por semana y 15 administraciones de CEA-TCB, 2,5 mg/kg administrados dos veces por semana).

Los resultados de este estudio muestran un incremento significativo en la actividad antitumoral tras la combinación de CEA-TCB con anticuerpo de bloqueo anti-PD-L1 en comparación con el agente único CEA-TCB (figura 11). El tratamiento con anticuerpo anti-PD-L1 como agente único no mostró ninguna actividad antitumoral. No se observaron toxicidades sintomáticas relacionadas con el producto de prueba después del tratamiento con la combinación.

Se diseñó un segundo estudio para evaluar si, después de un tratamiento de primera línea con monoterapia de CEA-TCB, la combinación de CEA-TCB con a-PD-L1 podría ejercer una actividad antitumoral superior al tratamiento de continuación con CEA-TCB como monoterapia.

Para este estudio, se inyectaron 1 x 106 células tumorales MKN45 por vía subcutánea en ratones NOG completamente humanizados. 10 días después de la inyección de células tumorales, los ratones recibieron solución salina tamponada con fosfato (PBS, vehículo) como control o CEA-TCB (a la dosis de 2,5 mg/kg, administrada dos veces por semana durante 4 semanas, 7 administraciones en total). El día 34 del estudio, los ratones tratados con CEA-TCB se aleatorizaron en dos subgrupos: uno continuó recibiendo la administración de CEA-TCB (2,5 mg/kg, dos veces por semana), el otro recibió CEA-TCB (2,5 mg/kg, dos veces por semana) en combinación con anticuerpo anti-PD-L1 (10 mg/kg, una vez por semana) durante 5 semanas (11 administraciones en total para CEA-TCB y 6 administraciones en total para anticuerpo anti-PD-L1).

Los resultados muestran claramente que la politerapia CEA-TCB anti-PD-L1 como tratamiento de segunda línea media una actividad antitumoral superior significativa a la monoterapia CEA-TCB (figura 12).

Ejemplo 4: evaluación de la actividad antitumoral in vivo tras la combinación de CEA-TCB con anticuerpo de bloqueo anti-PD-L1 en modelo de ratón con carcinoma colorrectal

La eficacia antitumoral de CEA-TCB en combinación con el anticuerpo de bloqueo anti-PD-L1 también se evaluó en ratones completamente inmunocompetentes que portaban la línea celular tumoral de carcinoma colorrectal MC38 diseñada internamente para expresar CEA humano en la superficie celular (MC38-huCEA).

En resumen, se inyectaron 0,5 x 106 células tumorales MC38-huCEA por vía subcutánea en C57BL/6 completamente inmunocompetentes transgénicos para CEA humano (ratones huCEA Tg). 17 días después de la inyección de células tumorales, los ratones se aleatorizaron en cuatro grupos para el tratamiento de primera línea: el primer grupo recibió solución salina tamponada con fosfato (PBS, vehículo) como control, el segundo grupo recibió CEA-TCB (a la dosis de 2,5 mg/kg, administrada dos veces por semana durante 4 semanas, 7 administraciones en total), el tercer grupo recibió un anticuerpo anti-PD-L1 de ratón (a la dosis de 10 mg/kg, administrada una vez por semana durante 4 semanas, 4 administraciones en total) y el cuarto grupo recibió un combinación de CEA-TCB y anticuerpo anti-PD-L1, administrado simultáneamente con la dosis y programas respectivos usados en los grupos terapéuticos únicos durante 4 semanas (4 administraciones de anti-PD-L1, 10 mg/kg administrados una vez por semana y 7 administraciones de CEA-TCB, 2,5 mg/kg administrados dos veces por semana).

Los resultados muestran un incremento significativo en la actividad antitumoral tras la combinación de CEA-TCB con anticuerpo de bloqueo anti-PD-L1 en comparación con CEA-TCB y agentes únicos anti-PD-L1 (figura 13). Además, el día 42 del estudio, 4 de 9 ratones del grupo tratado con combinación estaban libres de tumores, mientras que no se observaron ratones libres de tumores tras el tratamiento con CEA-TCB, y solo se observó 1 de 8 ratones libres de tumores tras el tratamiento anti-PD-L1.

No se observaron toxicidades sintomáticas relacionadas con el producto de prueba después del tratamiento con la combinación.

El día 42 del estudio, los tumores subcutáneos se extirparon quirúrgicamente de todos los grupos y los ratones se dejaron sin tratar durante 5 semanas. Después de este período de reposo, a ratones tratados con primera línea más dos grupos de ratones huCEA Tg sin tratamiento previo (uno sin tocar y el otro sometido previamente a un corte quirúrgico en el flan

celulares tumorales MC38-huCEA en el flanco opuesto. No se aplicó ninguna inyección de tratamiento a ninguno de los grupos, mientras que se controló el crecimiento tumoral. Los resultados muestran que en todos los ratones tratados en primera línea, se observó protección tumoral tras reexposición tumoral, con un control tumoral significativo en comparación con los ratones sin tratamiento previo. El grupo que había recibido la combinación de CEA-TCB con anti-PD-L1 como tratamiento de primera línea, mostró 3 de 8 ratones sin tumor el día 37 del estudio tras reexposición tumoral. Estos datos indican que en el modelo MC38-huCEA, la combinación de CEA-TCB con anticuerpo anti-PD-L1 no solo mejoró la respuesta al tratamiento de primera línea, sino que también mejoró la protección antitumoral tras posterior exposición tumoral.

Ejemplo 5: un estudio en fase IB sin enmascaramiento, m ulticéntrico, de escalada de dosis y expansión para evaluar la seguridad, farmacocinética y actividad terapéutica de CEA-TCB en combinación con atezolizumab en pacientes con tumores sólidos localmente avanzados y/o metastásicos positivos para CEA

Los datos analizados anteriormente demuestran que CEA-TCB y atezolizumab actúan de forma sinérgica en sus propiedades antineoplásicas y conjuntamente su combinación podría proporcionar un beneficio clínico significativo en pacientes con cáncer.

Se lleva a cabo un estudio clínico en fase Ib sin enmascaramiento, multicéntrico, de escalada de dosis y expansión de CEA-TCB en combinación con atezolizumab. Cada ciclo de tratamiento tiene una duración de 21 días y consiste en infusiones i.v. de CEA-TCB administradas semanalmente (QW) (± 1 día) en combinación con atezolizumab administrado cada 3 semanas (Q3W) (± 2 días). Los pacientes reciben atezolizumab (dosis fija de 1200 mg) i.v. el día 1 de cada ciclo, seguido de CEA-TCB al menos una hora después, administrado i.v. el día 1, día 8 y día 15 de cada ciclo.

Para CEA-TCB, la dosis inicial es de 5 mg administrados en un programa QW, que se administrará al menos una hora después de la administración de 1200 mg de atezolizumab cuando ambos se administren el mismo día (día 1 de cada ciclo).

Los pacientes se tratan hasta la pérdida del beneficio clínico, toxicidades inaceptables o la retirada del consentimiento. En caso de que uno de los tratamientos se suspenda permanentemente, se puede continuar el tratamiento con el otro fármaco solo.

Los criterios clave de elegibilidad incluyen tumor sólido localmente avanzado y/o metastásico confirmado en pacientes que han progresado con un tratamiento estándar, son intolerantes al tratamiento estándar y/o no son susceptibles de tratamiento estándar; estado funcional (PS) del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) 0-1; y expresión de CEA confirmada localmente en tejido tumoral (> 50 % de las células tumorales que se tiñen con al menos moderada a alta intensidad de expresión de CEA para todos los tumores sólidos con excepción de NSCLC > 20 % de las células tumorales que se tiñen con al menos moderada a alta intensidad de CEA expresión) o expresión de CEA confirmada centralmente.

Los objetivos principales de este estudio son la seguridad y la tolerabilidad, con objetivos secundarios de FC y actividad clínica (datos de tasa de respuesta global objetiva (TRG), tasa de control de la enfermedad (TCE; definida como tasa de respuesta [TR]+ tasa de enfermedad estable [TEE]), supervivencia sin progresión (SSP) y supervivencia global (SG) de acuerdo con los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST), criterios de la versión 1.1 y criterios RECIST modificados).

La respuesta tumoral se evalúa de acuerdo con RECIST v1.1 y los criterios RECIST modificados usando una medición unidimensional tal como la tomografía computarizada (TC) o resonancia magnética nuclear.

Resultados

Hasta el 15 de noviembre de 2016, se había tratado a 30 pacientes con los siguientes niveles de cohorte de dosis: 5 mg de CEA-TCB QW 1200 atezolizumab Q3W: 4 pacientes

10 mg de CEA-TCB QW 1200 atezolizumab Q3W: 4 pacientes

20 mg de CEA-TCB QW 1200 atezolizumab Q3W: 4 pacientes

40 mg de CEA-TCB QW 1200 atezolizumab Q3W: 6 pacientes

80 mg de CEA-TCB QW 1200 atezolizumab Q3W: 5 pacientes

160 mg de CEA-TCB QW 1200 atezolizumab Q3W: 7 pacientes

El tratamiento de combinación fue a los niveles de dosis actuales (hasta 160 mg de CEA-TCB QW 1200 mg de atezolizumab Q3W) seguro y bien tolerado. En ningún paciente se suspendió debido a un acontecimiento de seguridad relacionado con el tratamiento.

Todos los pacientes en este estudio realizaron una evaluación tumoral por PET-FDG la semana 4 y una evaluación tumoral por TAC la semana 8 y a continuación cada 8 semanas.

Con 20 mg de CEA-TCB, 2/4 pacientes han experimentado una enfermedad estable prolongada de acuerdo con los criterios RECIST. Un paciente con adenocarcinoma de páncreas ha estado en el estudio durante 32 semanas, el paciente experimentó una respuesta metabólica estable evaluada por PET-FDG la semana 4. El segundo paciente, un adenocarcinoma de la unión gastroesofágica con inestabilidad de MSI, ha estado en el estudio durante 30 semanas. Este paciente experimentó una respuesta metabólica parcial en la evaluación por PET-FDG la semana 4.

Con 40 mg de CEA-TCB, 1/6 pacientes experimentó enfermedad estable prolongada de acuerdo con los criterios RECIST y ha estado en estudio durante 20 semanas. Este paciente, un paciente con carcinoma colorrectal, se trató previamente en el ensayo de monoterapia (BP29541) y recibió 31 ciclos de tratamiento.

Con 80 mg de CEA-TCB, 5/5 pacientes experimentaron reducción del volumen tumoral en la TAC de la semana 8 y una respuesta parcial metabólica en la PET-FDG de la semana 4. En esta cohorte, 4/5 pacientes fueron pacientes con carcinoma colorrectal y 1 paciente con carcinoma de ampolla de Vater.

En resumen, los datos clínicos generados hasta ahora en este ensayo mostraron una actividad antitumoral clínica pertinente y prometedora en 2/4 pacientes tratados con 20 mg de CEA-TCB 1200 mg de atezolizumab, 1/6 pacientes tratados con 40 mg de CEA-TCB 1200 mg de atezolizumab, y 5/5 pacientes tratados con 80 mg de c EA-TCB 1200 mg de atezolizumab.

Los datos analizados anteriormente con respecto a la cohorte de 80 mg de CEA-TCB en una población que no responde al tratamiento anti PD-1 o anti PD-L1, apoyan que CEA-TCB y atezolizumab actúan de forma sinérgica en sus propiedades antineoplásicas y conjuntamente su combinación podría proporcionar un beneficio clínico significativo en pacientes con cáncer.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un anticuerpo biespecífico anti-antígeno carcinoembrionario (CEA)/anti-CD3 para su uso en el tratamiento o retraso de la progresión de un cáncer positivo para CEA en un individuo, en el que el tratamiento comprende la administración de dicha composición en combinación con una segunda composición, en el que la segunda composición comprende un antagonista de unión al ligando de muerte programada 1 (PD-L1) humano; en el que

(a) el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende (i) un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3, en el que el primer dominio de unión a antígeno es una molécula Fab que comprende una región variable de la cadena pesada (V^hCD3) que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:44, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:45, y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:46, y una región variable de la cadena ligera (V^lCD3) que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:47, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:48, y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:49; (ii) un segundo y un tercer dominio de unión a antígeno que se une a CEA, en el que el segundo y tercer dominio de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab que comprende una región variable de la cadena pesada (V^hCEA) que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:38, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:39, y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:40, y una región variable de la cadena ligera (V^lCEA) que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:41, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:42, y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:43; y (iii) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de forma estable;

en el que el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y el tercer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc; y en el que

(b) el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo, que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO: 19, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:20 y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:21; y una cadena ligera que comprende una secuencia de HVR-L1 de s Eq ID NO:22, una secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:23 y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:24.

2. Una composición que comprende un antagonista de unión a PD-L1 humano para su uso en el tratamiento o retraso de la progresión de un cáncer positivo para CEA en un individuo, en el que el tratamiento comprende la administración de dicha composición en combinación con una segunda composición, en el que la segunda composición comprende un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3; en el que

en el que el segundo dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer dominio de unión a antígeno, el primer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y el tercer dominio de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc; y en el que (b) el antagonista de unión a PD-L1 es un anticuerpo, que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:19, una secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:20 y una secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:21; y una cadena ligera que comprende una secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:22, una secuencia de HVR-L2 de Se Q ID NO:23 y una secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:24.

3. La composición para su uso de la reivindicación 1 o 2, en la que el antagonista de unión a PD-L1 es atezolizumab.

4. La composición para su uso de la reivindicación 1 o 2, en la que el antagonista de unión a PD-L1 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

5. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el antagonista de unión a PD L1 comprende una mutación del sitio de aglucosilación, en la que opcionalmente la mutación del sitio de aglucosilación es una mutación de sustitución y en la que además opcionalmente

(i) la mutación de sustitución está en el residuo aminoacídico N297, L234, L235 y/o D265 (numeración EU);

(ii) la mutación de sustitución se selecciona del grupo que consiste en N297G, N297A, L234A, L235A y D265A; o

(iii) la mutación de sustitución es una mutación D265A y una mutación N297G.

6. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el primer dominio de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende una región variable de la cadena pesada (V^hCD3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:50 y/o una región variable de la cadena ligera (V^lCD3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51.

7. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en la que el segundo y el tercer dominio de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende cada uno una región variable de la cadena pesada (V^hCEA) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34 y/o una región variable de la cadena ligera (VLCEA) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35.

8. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el primer dominio de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que los dominios variables o los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian, y el segundo y tercer dominio de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 son cada uno una molécula Fab convencional.

9. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el dominio Fc del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 es un dominio Fc de IgG, específicamente una IgG1, y/o un dominio Fc humano.

10. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que el dominio Fc del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc, en la que opcionalmente

(i) en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que es posicionable en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad es posicionable;

(ii) en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza con un residuo de triptófano (T366W) y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza con un residuo de valina (Y407V), y opcionalmente

(a) en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza con un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza con un residuo de alanina (L368A), y/o

(b) en la primera subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza con un residuo de cisteína (S354C) o el residuo de ácido glutámico en la posición 356 se reemplaza con un residuo de cisteína (E356C), y en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteína (Y349C) (numeración EU).

11. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la primera subunidad del dominio Fc del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W, y la segunda subunidad del dominio Fc del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeración EU).

12. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que el dominio Fc del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 presenta afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural, en la que opcionalmente el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc y/o función efectora, y en la que además opcionalmente dichas una o más sustituciones aminoacídicas están en una o más posiciones seleccionadas del grupo de L234, L235 y P329 (numeración EU).

13. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que cada subunidad del dominio Fc del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G

(numeración EU).

14. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que el anticuerpo biespecífico

anti-CEA/anti-CD3 comprende un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 52, un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 53, un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 95 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 54, y un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 95 % idéntica a la

secuencia de SEQ ID NO: 55.

15. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que el cáncer es cáncer de colon,

cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de endometrio,

cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de esófago o cáncer de próstata.

16. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en la que el antagonista de unión a

PD-L1 humano se administra a una dosis de aproximadamente 1200 mg cada tres semanas, y/o el anticuerpo

biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se administra a una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg cada

semana.

17. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en la que el individuo es resistente a

un tratamiento con agente quimioterápico o es intolerante a un tratamiento con agente quimioterápico.

18. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en la que el tratamiento da como

resultado una respuesta en el individuo.

19. La composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en la que el tratamiento comprende

además administrar un agente quimioterápico para tratar o retrasar la progresión del cáncer.