ES2901794T3

ES2901794T3 - Anticuerpo anti-CD20 de tipo II para reducir la formación de anticuerpos antifármaco

Info

Publication number: ES2901794T3
Application number: ES16810283T
Authority: ES
Inventors: Marina Bacac; Stefan Evers; Christian Klein; Pavel Pisa; Eva Rossmann; Jose Saro; Pablo Umana
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2016-12-06
Publication date: 2022-03-23
Anticipated expiration: 2036-12-06
Also published as: US20230372479A1; JP2019502676A; JP2021165271A; BR112018003984A2; CA2997406C; IL313608A; EP3387015B1; US20230052521A1; CN115920030A; CA2997406A1; US20170209573A1; MX2023010900A; AU2016368469A1; US20210252144A1; KR20180085740A; EP3387015A2; US20220054635A1; JP7325186B2; WO2017097723A2; CN108290954B

Abstract

Un anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso en un procedimiento para reducir la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto, que comprende la administración del anticuerpo anti- CD20 de tipo II al sujeto antes de la administración del agente terapéutico, en el que el anticuerpo anti-CD20 de tipo II comprende una región Fc de IgG1, y en el que el agente terapéutico comprende un polipéptido seleccionado del grupo de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que comprende una porción de unión a antígeno de un anticuerpo intacto, un anticuerpo de dominio único, un receptor de antígeno o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un ligando de receptor o un fragmento de unión a receptor del mismo, un dominio Fc, un inmunoconjugado y una citocina.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-CD20 de tipo II para reducir la formación de anticuerpos antifármaco

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso en un procedimiento para la reducción de la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) en respuesta a la administración de un agente terapéutico.

Antecedentes

El número de agentes terapéuticos derivados de biotecnología disponibles para su uso en entornos clínicos se ha incrementado drásticamente en los últimos años e incluye citocinas humanas recombinantes (por ejemplo, interferón a y p, interleucina-2), factores de crecimiento celular (por ejemplo, GM-CSF), hormonas (por ejemplo, glucagón), antagonistas neuromusculares (por ejemplo, toxina botulínica), hemoderivados (por ejemplo, factor de coagulación VIII), receptores recombinantes (por ejemplo, etanercept) y anticuerpos monoclonales. Aunque las proteínas terapéuticas se consideran en general seguras y no tóxicas, durante el tratamiento se pueden desarrollar anticuerpos contra estos agentes terapéuticos, conocidos como anticuerpos antifármaco (ADA).

Se han observado ADA en relación con diversos agentes terapéuticos, tales como eritropoyetina, factor VIII, insulina, inmunotoxinas y anticuerpos monoclonales (Schellekens y Casadevall, J Neurol (2004), 251 [Supl 2]:II/4-II/9; Mossoba et al., Clin Cancer Res (2011) 17(11): 3697-3705; Hsu et al., British Journal of Dermatology (2014) 170, 261-273). La formación de ADA es frecuente, por ejemplo, en pacientes autoinmunes tratados con bloqueantes de TNF y afecta al resultado clínico (Schaeverbecke et al., Rheumatology (2015) doi: 10.1093/rheumatology/kev277).

El desarrollo de ADA puede influir en las concentraciones séricas y la función de los agentes terapéuticos. La presencia de ADA puede incrementar el aclaramiento del agente terapéutico a través de la formación de complejos inmunitarios entre el agente terapéutico y el anticuerpo (neutralizante, no neutralizante o ambos), reduciendo por tanto la semivida del agente terapéutico. Además, la actividad y eficacia del agente terapéutico se pueden disminuir a través de la unión del anticuerpo al agente terapéutico. Los ADA también se pueden asociar con reacciones alérgicas o de hipersensibilidad y otros acontecimientos adversos.

Puesto que estos acontecimientos adversos asociados con las respuestas inmunitarias pueden influir en el perfil de seguridad y eficacia de los tratamientos, la identificación y desarrollo de estrategias para superar o inhibir los ADA es de gran interés.

Se han investigado varios enfoques de genomanipulación de proteínas para reducir la inmunogenicidad de los tratamientos de proteínas, incluyendo, por ejemplo, el enmascaramiento o alteración de epítopos de linfocitos B de proteínas o la modificación epítopos de linfocitos T de proteínas. Sin embargo, la seguridad clínica y el éxito de estos enfoques no se han sometido a prueba y requerirán una cantidad significativa de tiempo para evaluarse. Por lo tanto, existe una necesidad inmediata de desarrollar nuevas intervenciones usando reactivos aprobados por la FDA para prevenir las respuestas de ADA.

Se ha informado de enfoques basados en quimioterapia dirigidos a la supresión inmunitaria del huésped (Mossoba et al., Clin Cancer Res (2011) 17(11): 3697-3705). Se ha informado de que otros agentes, tales como el inhibidor de JAK tofacitinib o el agente inmunosupresor CTLA4Ig, suprimen las respuestas de anticuerpos a proteínas terapéuticas en roedores y perros (Onda et al., J Immunol (2014) 193: 48-55; Siegall et al., J Immunol (1997) 159; 5168-5173).

El anticuerpo anti-CD20 rituximab se ha usado en combinación con metotrexato e inmunoglobulina intravenosa para lograr tolerancia al tratamiento de restitución de enzimas en un paciente con Morbus Pompe (Mendelsohn et al., NEJM (2009) 360:2, 194-195). Sin embargo, en un ensayo clínico, el pretratamiento del huésped con rituximab no inhibió la respuesta inmunitaria humana contra la inmunotoxina LMB-1 (Hassan et al., Clin Cancer Res (2004) 10, 16-18).

El anticuerpo anti-CD20 obinutuzumab se ha usado en combinación con otros agentes para el tratamiento del cáncer (véase, por ejemplo, el documento WO 2015/095410).

Los trastornos proliferativos de linfocitos B describen un grupo heterogéneo de neoplasias malignas que incluye tanto leucemias como linfomas. Los linfomas se desarrollan a partir de células linfáticas e incluyen dos categorías principales: linfomas de Hodgkin (LH) y linfomas no hodgkinianos (LNH). En los Estados Unidos, los linfomas de origen en linfocitos B constituyen aproximadamente un 80-85 % de todos los casos de linfomas no hodgkinianos, y existe una heterogeneidad considerable dentro del subconjunto de linfocitos B, basada en patrones de expresión genotípica y fenotípica en el linfocito B de origen. Por ejemplo, los subconjuntos de linfomas de linfocitos B incluyen las enfermedades de escasa malignidad e incurables de crecimiento lento, tales como linfoma folicular (LF) o leucemia linfocítica crónica (LLC), así como los subtipos más agresivos, linfoma de células del manto (LCM) y linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG).

A pesar de la disponibilidad de diversos agentes para el tratamiento de trastornos proliferativos de linfocitos B, existe una necesidad continua de desarrollo de tratamientos seguros y eficaces para prolongar la remisión y mejorar las tasas de curación en los pacientes.

Una estrategia que se está investigando actualmente es el acoplamiento de linfocitos T contra linfocitos B malignos. Para acoplar eficazmente los linfocitos T contra linfocitos T malignos, se han desarrollado dos enfoques recientes. Estos dos enfoques son: 1) la administración de linfocitos T genomanipulados ex vivo para reconocer células tumorales (también conocido como tratamiento con linfocitos T modificados con receptor de antígeno quimérico [linfocitos T-CAR]) (Maude et al., N Engl J Med (2014) 371,1507-1517); y, 2) la administración de agentes que activan linfocitos T endógenos, tales como anticuerpos biespecíficos (Oak y Bartlett, Expert Opin Investig Drugs (2015) 24, 715-724).

Se informa de un ejemplo del primer enfoque en el estudio por Maude et al., en el que se trataron 30 pacientes adultos y pediátricos con linfocitos T autólogos transducidos con un vector lentivírico con receptor de antígeno quimérico dirigido a CD19 (linfocitos T-CAR CTL019). El resultado fue una remisión mantenida basada en una tasa de supervivencia sin sucesos en 6 meses de un 67 % y una tasa de supervivencia global de un 78 %. Sin embargo, todos los pacientes tuvieron el síndrome de liberación de citocinas (SLC) (asociado con la carga tumoral), y teniendo un 27 % de los pacientes SLC grave. También se observaron toxicidades del sistema nervioso central de causa desconocida a frecuencias altas.

Por el contrario, el segundo enfoque, que implica activar linfocitos T endógenos para reconocer dianas tumorales, evita este obstáculo de escalabilidad y también puede proporcionar eficacia competitiva, datos de seguridad y duraciones de respuesta potencialmente a largo plazo. En diferentes neoplasias malignas hemáticas con CD20+, este enfoque se ejemplifica mejor por blinatumomab, una molécula biespecífica de linfocitos T dirigida a CD19 CD3 (Bargou et al., Science (2008) 321, 974-977) que se aprobó recientemente para pacientes con leucemia linfocítica aguda (LLA) positiva para leucemia residual mínima. Este compuesto, que está compuesto de dos fragmentos Fv monocatenarios (el llamado formato BiTE®), dirige la lisis de células CD19+ por linfocitos T citolíticos. La principal limitación de blinatumomab es su semivida corta (de aproximadamente 2 horas), lo que necesita una infusión continua por medio de una bomba durante 4-8 semanas. No obstante, tiene una eficacia potente en pacientes tanto con linfoma no hodgkiniano (LNH r/r) como LLA recidivante/resistente al tratamiento, y requiriéndose dosificación escalonada (DE) para mitigar el síndrome de liberación de citocinas grave y toxicidades del SNC (Nagorsen y Baeuerle, Exp Cell Res (2011) 317, 1255-1260).

La molécula biespecífica de linfocitos T dirigida a CD20 CD3, CD20XCD3 bsAB, es otro ejemplo de una próxima generación de anticuerpos dirigidos a linfocitos B. CD20XCD3 bsAB es un anticuerpo biespecífico de linfocitos T (TCB) dirigido a CD20 expresado en linfocitos B y cadena épsilon de CD3 (CD3e) presente en linfocitos T.

El mecanismo de acción de CD20XCD3 bsAB comprende la unión simultánea a linfocitos B CD20+ y linfocitos T CD3+, dando lugar a la activación de linfocitos T y destrucción de linfocitos B mediada por linfocitos T. En presencia de linfocitos B CD20+, ya sean circulantes o residentes en tejido, las dosis farmacológicamente activas desencadenarán la activación de linfocitos T y la liberación de citocinas asociada. CD20XCD3 bsAB ha mostrado una potenciación en la potencia en modelos no clínicos sobre los agentes de activación de linfocitos T competitivos y, al tener un formato basado en IgG, tiene una vida media muy mejorada en comparación con blinatumomab.

La liberación de citocinas es el resultado de la activación de linfocitos T. En un estudio de fase 1 realizado por TeGenero (Suntharalingam et al., N Engl J Med (2006) 355, 1018-1028), los 6 voluntarios sanos experimentaron un síndrome de liberación de citocinas (SLC) grave casi mortal rápidamente después de la infusión de una anticuerpo monoclonal anti-CD28 superagonista estimulador de linfocitos T de dosis inapropiada. Más recientemente, en el estudio mencionado anteriormente por Maude et al. del tratamiento con linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (linfocitos T-CAR) dirigido a CD19 de pacientes con LLA recidivante, los 30 pacientes tuvieron liberación de citocinas, lo que se catalogó como grave en un 27 % de los pacientes. El SLC es una complicación común pero grave del tratamiento con linfocitos T-CAR (revisado en Xu y Tang, Cancer Letters (2014) 343, 172-178).

También se ha observado con frecuencia toxicidad del SNC y SLC grave con el agente biespecífico de linfocitos T CD19-CD3, blinatumomab (Klinger et al., Blood. 2012;119(26):6226-6233). En pacientes que recibieron blinatumomab en todos los ensayos clínicos, se han producido toxicidades neurológicas aproximadamente en un el 50 % de los pacientes y los tipos de toxicidades observados están bien definidos en el prospecto del envase.

No se comprende bien si la toxicidad del SNC está relacionada o cómo se relaciona con la activación de linfocitos T o la liberación de citocinas temprana. Similar a blinatumomab, se informó de AA en el SNC (que variaron de delirio a encefalopatía global) para un 43 % (13/30) de los pacientes con LLA r/r tratados con linfocitos T-CAR dirigidos a CD19 (Maude et al., N Engl J Med (2014) 371,1507-1517; Ghorashian et al., Br J Haematol (2015) 169, 463-478). Los efectos tóxicos neurológicos se produjeron típicamente después de que los síntomas del SLC alcanzaran el punto máximo y comenzaran a resolverse; sin embargo no se encontró una asociación directa inequívoca con el SLC grave. Los autores propusieron que el mecanismo de neurotoxicidad podría implicar toxicidad mediada por linfocitos T-CAR directa o podría estar mediado por citocinas. Por el contrario, se ha sugerido una asociación entre el SLC grave y neurotoxicidad (por ejemplo, encefalopatía) en otro estudio de tratamiento con linfocitos T-CAR dirigidos a CD19 (Davila et al., Sci Transl Med (2014) 6, 224ra25) y se especuló que se podría deber a la activación de linfocitos T general, frente al daño inducido por T-CAR directo.

La liberación de citocinas y/o las toxicidades relacionadas con el SNC son en particular pronunciadas en anticuerpos biespecíficos de linfocitos T que unen células CD3+ a linfocitos B, en comparación con otros anticuerpos biespecíficos de linfocitos T que unen células CD3+ a células diana restringidas a tejido (es decir, no circulantes).

Por tanto, existe la necesidad de obtener procedimientos para reducir o prevenir dichos efectos adversos de estos agentes prometedores que tienen el potencial de contribuir significativamente al tratamiento de pacientes con trastornos proliferativos de linfocitos B tales como LNH y LLC.

Sumario de la invención y otros aspectos de la divulgación

La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que (i) la formación de ADA en respuesta a la administración de un agente terapéutico inmunógeno a un sujeto se puede prevenir de forma eficaz y sostenible, y (ii) la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico, en particular un agente terapéutico activador de linfocitos T tal como CD20XCD3 bsAB, a un sujeto se puede reducir significativamente, por el pretratamiento de dicho sujeto con un anticuerpo anti-CD20 de tipo II, tal como obinutuzumab.

Obinutuzumab es un mAb anti-CD20 de tipo II glucomanipulado humanizado que se une con alta afinidad al antígeno CD20, induciendo actividad citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), citotoxicidad dependiente de complemento baja (CDC) y alta inducción de muerte celular directa. Hasta la fecha, el perfil de seguridad de obinutuzumab (incluyendo la liberación de citocinas) se ha evaluado y gestionado en cientos de pacientes en ensayos clínicos de obinutuzumab en curso.

Sin quedar vinculado a ninguna teoría, el uso de pretratamiento con obinutuzumab (GAZYVA®) (GPT) debería ayudar en la rápida disminución de linfocitos B, tanto en sangre periférica como en órganos linfoides secundarios, de modo que se reduce el riesgo de acontecimientos adversos (Aa ) altamente pertinentes de una fuerte activación de linfocitos T sistémica por agentes terapéuticos (activadores de linfocitos T) (por ejemplo, SLC), mientras que se mantienen los niveles de exposición de agentes terapéuticos que son lo suficientemente altos desde el inicio de la dosificación como para mediar en la eliminación de células tumorales. Además de mantener el perfil de seguridad de agentes terapéuticos (activadores de linfocitos T) tales como CD20XCD3 bsAB, el GPT también debería ayudar a prevenir la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra moléculas terapéuticas.

Para los pacientes, el GPT se debería traducir en una mejor exposición al fármaco con una potenciación en el perfil de seguridad.

El GPT debería ser más eficaz para lograr los objetivos anteriores en comparación con otros procedimientos usados, tales como la dosificación escalonada (DE). Por ejemplo, una única dosis de obinutuzumab debería permitir que los pacientes recidivantes/resistentes al tratamiento reciban la dosis terapéutica completa del agente terapéutico activador de linfocitos T tal como CD20XCD3 bsAB, una vez determinada, sin un retardo de tiempo desde la dosificación escalonada. En contraste con esto, se informó recientemente de que la pauta posológica de blinatumomab para pacientes con LDLBG r/r en un ensayo de fase 2 en curso incorpora un enfoque escalonado doble (es decir, 9 —^ 28—^ 112 |jg/m2/día), requiriendo por tanto 14 días para alcanzar la dosis máxima de 112 jg /m 2/día (Viardot et al., Hematol Oncol (2015) 33, 242(Abstract 285)). Como se muestra en los ejemplos, después del pretratamiento con obinutuzumab, se toleró la administración de CD20XCD3 bsAB a macacos cangrejeros hasta un nivel que fue diez veces mayor que el tolerado sin GPT. Se observó una disminución en linfocitos B de sangre periférica eficiente y actividad antitumoral junto con una fuerte reducción en la liberación de citocinas en la sangre periférica asociada con la primera inyección de CD20XCD3 bsAB tras GPT.

En consecuencia, la invención proporciona un anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso en un procedimiento para reducir la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto, que comprende la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto antes de la administración del agente terapéutico, en el que el anticuerpo anti-CD20 de tipo II comprende una región Fc de IgG1, y en el que el agente terapéutico comprende un polipéptido seleccionado del grupo de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que comprende una porción de unión a antígeno de un anticuerpo intacto, un anticuerpo de dominio único, un receptor de antígeno o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un ligando de receptor o un fragmento de unión a receptor del mismo, un dominio Fc, un inmunoconjugado y una citocina.

En un aspecto, el período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la administración del agente terapéutico es suficiente para la reducción del número de linfocitos B en el sujeto en respuesta a la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En un aspecto más específico, el período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 tipo II y la administración del agente terapéutico es de 3 días a 21 días, de 5 días a 20 días, de 7 días a 21 días, de 7 días a 14 días, de 5 días a 15 días, de 7 días a 15 días, de 8 días a 15 días, de 10 días a 20 días, de 10 días a 15 días, de 11 días a 14 días o de 12 días a 13 días.

En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, la HCDR2 de SEQ ID NO: 5, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 6; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, la LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 9. En otro aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 11. En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II es un anticuerpo IgG, en particular un anticuerpo IgG1. En un aspecto, al menos aproximadamente un 40 % de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc del anticuerpo anti-CD20 de tipo II son no fucosilados. En un aspecto específico, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II es obinutuzumab.

En un aspecto, la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II es (i) una única administración, o (ii) dos o más administraciones separadas, en particular dos o más administraciones separadas en dos o más días consecutivos. En un aspecto, la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II es una dosis de aproximadamente 2 g de anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

En un aspecto, el agente terapéutico se administra por vía parenteral, en particular por vía intravenosa.

En algunos aspectos, el agente terapéutico comprende un anticuerpo.

En un aspecto de este tipo, el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico se une específicamente al antígeno carcinoembrionario (CEA). En un aspecto específico, el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico se une específicamente a CEA y comprende (i) una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 14, la HCDR2 de SEQ ID NO: 15, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 16; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 17, la LCDR2 de SEQ ID NO: 18 y la LCd R3 de s Eq ID NO: 19; o (ii) una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 21.

En otro aspecto específico, el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico se une específicamente a CEA y comprende (i) una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 136, la HCDR2 de SEQ ID NO: 137, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 138; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 139, la LCDR2 de SEQ ID NO: 140 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 141; o (ii) una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 143.

En otro aspecto, el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico se une específicamente a CD3, en particular CD3e. En un aspecto específico, el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico se une específicamente a CD3, en particular CD3e, y comprende (i) una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 32, la HCDR2 de SEQ ID NO: 33, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 35, la LCDR2 de SEQ ID NO: 36 y la LCd R3 de s Eq ID NO: 37; o (ii) una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39.

Todavía en otro aspecto, el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico se une específicamente a la proteína de activación de fibroblastos (FAP). En un aspecto específico, el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico se une específicamente a FAP y comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 25 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 26.

En un aspecto, el agente terapéutico comprende un inmunoconjugado que comprende

(a) un anticuerpo que (i) se une específicamente a CEA y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 14, la HCDR2 de SEQ ID NO: 15, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 16, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 17, la LCDR2 de SEQ ID NO: 18 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 19; o una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 21.; o (ii) se une específicamente a FAP y comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 25 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 26; y

(b) una citocina, en el que la citocina es un polipéptido de IL-2 humana mutante que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G (numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana SEQ ID NO: 12).

En un aspecto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CD3 en un linfocito T y a un antígeno de célula diana.

En un aspecto específico, el agente terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico que comprende

(a) un anticuerpo que se une específicamente a CEA y comprende (i) una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 14, la HCDR2 de SEQ ID NO: 15, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 16, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) I de SEQ ID NO: 17, la LCDR2 de SEQ ID NO: 18 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 19; o una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 21; o (ii) una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 136, la HCDR2 de SEQ ID NO: 137, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 138, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 139, la LCDR2 de SEQ ID NO: 140 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 141; o una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 143; y

(b) un anticuerpo se une específicamente a CD3, en particular CD3e, y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la Cd R de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ iD NO: 32, la HCDR2 de SEQ ID NO: 33, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 34, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 35, la LCDR2 de SEQ ID NO: 36 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 37; o una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39.

La divulgación también proporciona un procedimiento para (i) reducir la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto y/o (ii) reducir la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico, en particular un agente terapéutico activador de linfocitos T, en un sujeto, que comprende la administración de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto antes de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, el período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la administración del agente terapéutico es suficiente para la reducción del número de linfocitos B en el sujeto en respuesta a la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

La divulgación proporciona además un procedimiento de tratamiento de una enfermedad en un sujeto, comprendiendo el procedimiento un régimen de tratamiento que comprende

(i) administración al sujeto de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II,

y consecutivamente después de un período de tiempo

(ii) administración al sujeto de un agente terapéutico,

en el que el período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la administración del agente terapéutico es suficiente para la reducción del número de linfocitos B en el sujeto en respuesta a la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

En un aspecto, el régimen de tratamiento reduce eficazmente la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) en el sujeto en respuesta a la administración del agente terapéutico en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

En otro aspecto, el régimen de tratamiento reduce eficazmente la liberación de citocinas asociada con la administración del agente terapéutico en el sujeto en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En dicho aspecto, el agente terapéutico preferentemente es un agente terapéutico activador de linfocitos T.

La divulgación proporciona además un anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso en un procedimiento para (i) reducir la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto y/o (ii) reducir la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico, en particular un agente terapéutico activador de linfocitos T, en un sujeto, que comprende la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto antes de la administración del agente terapéutico.

En un aspecto, el período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la administración del agente terapéutico es suficiente para la reducción del número de linfocitos B en el sujeto en respuesta a la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

La divulgación proporciona además un anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad en un sujeto, comprendiendo el procedimiento un régimen de tratamiento que comprende

(i) administración al sujeto del anticuerpo anti-CD20 de tipo II,

y consecutivamente después de un período de tiempo

(ii) administración al sujeto de un agente terapéutico,

En un aspecto, el régimen de tratamiento reduce eficazmente la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra el agente terapéutico en el sujeto (en respuesta a la administración del agente terapéutico) en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20.

La divulgación proporciona además el uso de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II en la fabricación de un medicamento para (i) la reducción de la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto y/o (ii) la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico, en particular un agente terapéutico activador de linfocitos T, en un sujeto,

en el que el medicamento se va a usar en un régimen de tratamiento que comprende

(i) administración al sujeto del anticuerpo anti-CD20 de tipo II,

y consecutivamente después de un período de tiempo

(ii) administración al sujeto de un agente terapéutico,

En un aspecto, el régimen de tratamiento reduce eficazmente la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra el agente terapéutico en el sujeto en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20.

La divulgación proporciona además un kit para (i) la reducción de la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto y/o (ii) la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico, en particular un agente terapéutico activador de linfocitos T, en un sujeto, que comprende un envase que comprende una composición de anticuerpo anti-CD20 de tipo II e instrucciones para el uso de la composición de anticuerpo anti-CD20 de tipo II en un régimen de tratamiento que comprende (i) administración al sujeto de la composición de anticuerpo anti-CD20 de tipo II,

y consecutivamente después de un período de tiempo

(ii) administración al sujeto de un agente terapéutico,

en el que el período de tiempo entre la administración de la composición de anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la administración del agente terapéutico es suficiente para la reducción del número de linfocitos B en el sujeto en respuesta a la administración del anticuerpo contra CD20 de tipo II.

En un aspecto, el régimen de tratamiento reduce eficazmente la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra el agente terapéutico en el sujeto en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración de la composición de anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

En otro aspecto, el régimen de tratamiento reduce eficazmente la liberación de citocinas asociada con la administración del agente terapéutico en el sujeto en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración de la composición de anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En dicho aspecto, el agente terapéutico preferentemente es un agente terapéutico activador de linfocitos T.

En un aspecto, el kit comprende además una composición de agente terapéutico.

La divulgación proporciona además un agente terapéutico para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad en un sujeto, comprendiendo el procedimiento un régimen de tratamiento que comprende

(i) administración al sujeto de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II,

y consecutivamente después de un período de tiempo

(ii) administración al sujeto del agente terapéutico,

en el que el período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la administración del agente terapéutico es suficiente para la reducción del número de linfocitos B en el sujeto en respuesta a la administración del anticuerpo contra CD20.

La divulgación proporciona además el uso de un agente terapéutico en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un sujeto, en el que el tratamiento comprende un régimen de tratamiento que comprende

(i) administración al sujeto de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II,

y consecutivamente después de un período de tiempo

(ii) administración al sujeto del agente terapéutico,

La divulgación proporciona además un kit para el tratamiento de una enfermedad en un sujeto, que comprende un envase que comprende una composición de agente terapéutico e instrucciones para el uso de la composición de agente terapéutico en un régimen de tratamiento que comprende

(i) administración al sujeto de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II,

y consecutivamente después de un período de tiempo

(ii) administración al sujeto de la composición de agente terapéutico,

en el que el período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la administración de la composición de agente terapéutico es suficiente para la reducción del número de linfocitos B en el sujeto en respuesta a la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

En un aspecto, el kit comprende además una composición de anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

Los procedimientos, usos, anticuerpos anti-CD20 de tipo II, agentes terapéuticos y kits de la divulgación pueden incorporar, individualmente o en combinación, cualquiera de los rasgos característicos descritos a continuación.

En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, la HCDR2 de SEQ ID NO: 5, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 6; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, la LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 9.

En un aspecto más específico, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 11.

En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II es un anticuerpo IgG, en particular un anticuerpo IgG1.

En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II se genomanipula para tener un incremento en la proporción de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. En un aspecto, al menos aproximadamente un 40 % de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc del anticuerpo antic D20 de tipo II son no fucosilados.

En un aspecto particular, el anticuerpo anti-CD20 es obinutuzumab.

En algunos aspectos, en particular en aspectos en relación con la divulgación relacionados con la reducción de la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto, el agente terapéutico comprende un polipéptido.

En algunos aspectos, en particular en aspectos en relación con la divulgación relacionados con la reducción de la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo.

En un aspecto de este tipo, el anticuerpo se une específicamente al antígeno carcinoembrionario (CEA). En un aspecto, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 14, la HCDR2 de SEQ ID NO: 15, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 16; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 17, la LCDR2 de SEQ ID NO: 18 y la LCDR3 de s Eq ID NO: 19. En otro aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 21.

En otro aspecto de este tipo, el anticuerpo se une específicamente a CD3, en particular CD3 épsilon. En un aspecto, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 32, la HCDR2 de SEQ ID NO: 33, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 35, la LCDR2 de SEQ ID NO: 36 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 37. En otro aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39.

En algunos aspectos, en particular en aspectos en relación con la divulgación relacionados con la reducción de la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto, el agente terapéutico comprende una citocina.

En un aspecto de este tipo, la citocina es interleucina-2 (IL-2).

En otro aspecto de este tipo, la citocina es un polipéptido de IL-2 humana mutante que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45a y L72G (numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana SEQ ID NO: 12).

En algunos aspectos, en particular en aspectos en relación con la divulgación relacionados con la reducción de la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto, el agente terapéutico comprende un inmunoconjugado.

En un aspecto de este tipo, el inmunoconjugado comprende (a) un anticuerpo que se une específicamente a CEA y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 14, la HCDR2 de SEQ ID NO: 15, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 16; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 17, la LCDR2 de SEQ ID NO: 18 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 19, y (b) un polipéptido de IL-2 humana mutante que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G (numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana SEQ ID NO: 12).

En un aspecto particular de este tipo, el agente terapéutico comprende cergutuzumab amunaleucina (CEA-IL2v). En algunos aspectos, en particular en aspectos en relación con la divulgación relacionados con la reducción de la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CEA y CD3.

En un aspecto de este tipo, el agente terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico que comprende

(i) un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 32, la HCDR2 de SEQ ID NO: 33, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 35, la LCDR2 de SEQ ID NO: 36 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 37; y

(ii) un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CEA y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de Se Q iD NO: 14, la HCDR2 de SEQ ID NO: 15, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 16; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 17, la LCDR2 de SEQ ID NO: 18 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 19.

En un aspecto particular, el agente terapéutico comprende CEA TCB.

En algunos aspectos, en particular en aspectos en relación con la divulgación relacionados con la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico en un sujeto, el agente terapéutico es un agente terapéutico activador de linfocitos T.

En un aspecto, el agente terapéutico activador de linfocitos T comprende un anticuerpo, en particular un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, biespecífico).

En un aspecto, el anticuerpo se une específicamente a un antígeno activador de linfocitos T.

En un aspecto, el anticuerpo se une específicamente a un antígeno seleccionado del grupo de CD3, CD28, CD137 (también conocido como 4-1BB), CD40, CD226, OX40, GITR, CD27, HVEM y CD127.

En un aspecto, el anticuerpo se une específicamente a CD3, en particular CD3e.

En un aspecto, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 32, la HCDR2 de SEQ ID NO: 33, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 35, la LCDR2 de SEQ ID NO: 36 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 37.

En un aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39.

En un aspecto, el anticuerpo se une específicamente a un antígeno de linfocito B, en particular a un antígeno de linfocito B maligno.

En un aspecto, el anticuerpo se une específicamente a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD20, CD19, CD22, ROR-1, CD37 y CD5, en particular a CD20 o CD19.

En un aspecto, el anticuerpo se une específicamente a CD20.

En un aspecto, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, la HCDR2 de SEQ ID NO: 5, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 6; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, la LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 9.

En un aspecto, el anticuerpo comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 11.

En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico, en particular un anticuerpo biespecífico.

En un aspecto, el anticuerpo multiespecífico se une específicamente a (i) un antígeno activador de linfocitos T y (ii) un antígeno de linfocito B.

En un aspecto, el anticuerpo multiespecífico se une específicamente a (i) CD3 y (ii) un antígeno seleccionado de CD20 y CD19.

En un aspecto, el anticuerpo multiespecífico se une específicamente a CD3 y CD20.

En algunos aspectos, en particular en aspectos en relación con la divulgación relacionados con la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico en un sujeto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico que comprende

(i) un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de Se Q iD NO: 32, la HCDR2 de SEQ ID NO: 33, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 35, la LCDR2 de SEQ ID NO: 36 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 37; y

(ii) un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, la HCDR2 de SEQ ID NO: 5, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 6; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, la LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 9.

En un aspecto particular, el agente terapéutico comprende CD20XCD3 bsAB.

En algunos aspectos, en particular en aspectos en relación con la divulgación relacionados con la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico en un sujeto, el agente terapéutico comprende un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un linfocito T que expresa un CAR, en particular un CAR que se une específicamente a un antígeno de linfocito B, más en particular un CAR que se une específicamente a un antígeno seleccionado del grupo de CD20, CD19, CD22, ROR-1, CD37 y CD5.

En algunos aspectos, en particular en aspectos en relación con la divulgación relacionados con la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico en un sujeto, la enfermedad es un trastorno proliferativo de linfocitos B, en particular un trastorno de linfocitos B positivos para CD20. En un aspecto, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en linfoma no hodgkiniano (LNH), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LlC), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular (LF), linfoma de células del manto (LCM), linfoma de la zona marginal (LZM), mieloma múltiple (MM) y linfoma de Hodgkin (LH).

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. El tratamiento previo con obinutuzumab pero no rituximab o vehículo da como resultado la atenuación de respuestas de anticuerpos IgG de novo específicos del toxoide tetánico en macacos cangrejeros. Rituxan indica rituximab y GA101 obinutuzumab, respectivamente.

Figura 2. Las respuestas de recuerdo por producción de anticuerpos IgG específicos contra el sarampión en respuesta a la reexposición inmunitaria con una vacuna de refuerzo contra el sarampión/rubéola en animales con valores de referencia para sarampión no se ven afectados por obinutuzumab o bien rituximab en macacos cangrejeros. Rituxan indica rituximab y GA101 obinutuzumab, respectivamente.

Figura 3. Recuentos de linfocitos B (CD45+CD19+) en muestras de sangre periférica antes del inicio del pretratamiento con obinutuzumab (VR = valor de referencia), antes del inicio del tratamiento con RO6895882 (C1D1 = ciclo 1 día 1) y durante el tratamiento con RO6895882. Las líneas/símbolos representan pacientes individuales. Desde los puntos temporales de C1D1 en adelante, no se detectaron linfocitos B en las muestras de sangre periférica.

Figura 4. Reducción de células CD19+ (linfocitos B) detectada por citometría de flujo en biopsias tumorales obtenidas al inicio (VR) y después del tratamiento con obinutuzumab (tratados). Se obtuvieron muestras en el tratamiento antes o bien durante el tratamiento con RO6895882. El porcentaje de células CD45+ (linfocitos) con tinción positiva para CD19 (linfocitos B) se redujo fuertemente (B). No se observó un cambio claro para el porcentaje de células CD16+ (linfocitos citolíticos naturales) (A) o células CD3+ (linfocitos T) (C). Las líneas representan pacientes individuales.

Figura 5. Reducción de linfocitos B en biopsias tumorales obtenidas al inicio (VR) y después del tratamiento (tratados) con obinutuzumab medido por inmunohistoquímica. Se obtuvieron muestras en el tratamiento antes o bien durante el tratamiento con RO6895882. Se midió la densidad de linfocitos B por tinción con CD20 (A, B) y PAX5 (C, D). Ambos procedimientos detectaron una disminución de linfocitos B en tumor y tejido normal circundante. Las líneas representan pacientes individuales.

Figura 6. Configuraciones ejemplares de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T (TCB) útiles en el presente documento. (A, D) Ilustración de la molécula "1 1 CrossMab". (B, E) Ilustración de la molécula "2+1 IgG Crossfab" con orden alternativo de los componentes Crossfab y Fab ("invertida"). (C, F) Ilustración de la molécula "2+1 IgG Crossfab". (G, K) Ilustración de la molécula "1 1 IgG Crossfab" con orden alternativo de los componentes Crossfab y Fab ("invertida"). (H, L) Ilustración de la molécula "1 1 IgG Crossfab". (I, M) Ilustración de la molécula "2+1 IgG Crossfab" con dos CrossFab. (J, N) Ilustración de la molécula "2+1 IgG Crossfab" con dos CrossFab y orden alternativo de los componentes Crossfab y Fab ("invertida"). (O, S) Ilustración de la molécula "Fab-Crossfab". (P, T) Ilustración de la molécula "Crossfab-Fab". (Q, U) Ilustración de la molécula "(Fab)2-Crossfab". (R, V) Ilustración de la molécula "Crossfab-(Fab)²". (W, Y) Ilustración de la molécula "Fab-(Crossfab)²". (X, Z) Ilustración de la molécula "(Crossfab)²-Fab". Punto negro: modificación opcional en el dominio Fc que promueve la heterodimerización. +, --: aminoácidos de cargas opuestas introducidos opcionalmente en los dominios CH1 y CL. Las moléculas Crossfab se representan como que comprenden un intercambio de regiones VH y VL, pero, en aspectos en los que no se introducen modificaciones de carga en los dominios CH1 y CL, pueden comprender de forma alternativa un intercambio de los dominios CH1 y CL.

Figura 7. Recuentos de linfocitos B y linfocitos T en la sangre periférica en los diferentes grupos de tratamiento. Análisis de citometría de flujo de linfocitos B CD19⁺(A) y linfocitos T CD3⁺(B) en la sangre periférica de ratones NOG completamente humanizados tratados con vehículo y CD20XCD3 bsAB, 24 horas y 72 horas después de la primera y segunda administración de CD20XCD3 bsAB. Las flechas negras indican los días de administración de CD20XCD3 bsAB.

Figura 8. Citocinas liberadas en sangre periférica entre los diferentes grupos de tratamiento. Análisis múltiple de citocinas en sangre de ratones tratados con vehículo y ratones tratados, 24 horas y 72 horas después de la primera y segunda administración de CD20XCD3 bsAB. Las barras de histograma representan la media de 5 animales indicando las barras de error la desviación estándar. Se muestran gráficos representativos para IFNy (A), TNFa (B) e IL-6 (C). Compara la liberación de citocinas de la primera inyección de CD20XCD3 bsAB con y sin pretratamiento con obinutuzumab (las barras a comparar se indican por líneas de conexión).

Figura 9. Actividad antitumoral de CD20XCD3 bsAB, obinutuzumab y pretratamiento con obinutuzumab (Gpt) CD20XCD3 bsAB. Actividad antitumoral de CD20XCD3 bsAB y obinutuzumab como monoterapia o Gpt CD20XCD3 bsAB en ratones NOG completamente humanizados. La flecha negra indica el inicio de tratamiento. (8<n<10). Modelo tumoral: WSU-DLCL2.

Figura 10. Citocinas liberadas en sangre periférica de macacos cangrejeros después de dosificación con tratamientos con CD20XCD3 bsAB y Gpt CD20XCD3 bsAB. (A) IFNy, (B) IL-8, (C) TNFa, (D) IL-2, (E) IL-6.

Figura 11. Actividad antitumoral tras la dosificación escalonada de CD20XCD3 bsAB y pretratamiento con obinutuzumab (Gpt) en ratones NOG completamente humanizados que portan tumores WSU-DLCL2. Los ratones recibieron un primer tratamiento (flecha) como una dosis fraccionada de CD20XCD3 bsAB (0,15, 0,05, 0,015 mg/kg i.v.) o bien Gpt (obinutuzumab 10 mg/kg), seguido de inyecciones intravenosas semanales de CD20XCD3 bsAB a 0,5 mg/kg (dosis completa) durante 9 ciclos de tratamiento (es decir, 9 semanas). En el grupo de vehículo, se muestra un único ratón desde el día 18. Para los otros grupos, n = 9 o 10. Modelo tumoral: WSU-DLCL2 inyectado por vía subcutánea. [CD20XCD3 bsAB 0,05 mg/kg CD20XCD3 bsAB 0,05 mg/kg] frente a [obinutuzumab 10 mg/kg CD20XCD3 bsAB 0,5 mg/kg] *p = 0,018 (análisis ANOVA unidireccional de Ab C con procedimiento de Dunnet).

Figura 12. Tinción de linfocitos T en pulmones de ratones NOG completamente humanizados que portan tumores WSU-DLCL2, (A-D) 7 días después del primer tratamiento y (E-H) 24 horas después del segundo tratamiento. Los grupos de tratamiento son como sigue (único tratamiento o primer segundo tratamiento): (A) vehículo, (B) obinutuzumab 10 mg/kg, (C) CD20XCD3 bsAB 0,15 mg/kg, (D) CD20XCD3 bsAB 0,5 mg/kg, (e ) vehículo vehículo, (F) obinutuzumab 10 mg/kg CD20XCD3 bsAB 0,5 mg/kg, (G) CD20XCD3 bsAB 0,15 mg/kg CD20XCD3 bsAB 0,5 mg/kg, (H) vehículo CD20XCD3 bsAB 0,5 mg/kg. Se tiñen inmunohistoquímicamente cortes pulmonares con anticuerpo anti-CD3 (oscuro); se tiñeron los núcleos por contraste con hematoxilina. Aumento 20x. Las flechas apuntan al incremento de células positivas para CD3 perivasculares.

Figura 13. Pulmón de ratón NOG humanizado sacrificado 24 horas después del único tratamiento con 0,5 mg/kg de CD20XCD3 bsAB. Marginación y adhesión de linfocitos T (flechas) al endotelio en vasos. Pocos linfocitos T han transmigrado al espacio perivascular (asteriscos). (A) aumento 20x, (B) aumento 40x.

Figura 14. Curvas de concentración sérica-tiempo de CD20XCD3 bsAB después de una única administración intravenosa con o sin pretratamiento con obinutuzumab en macacos cangrejeros. A macacos cangrejeros se les administró una única dosis i.v. de 100-1000 |jg/kg de CD20XCD3 bsAB con o sin pretratamiento con obinutuzumab (Gpt) (50 mg/kg, 4 días antes de la administración de CD20XCD3 bsAB). Se representan seis animales en cada grupo de dosis y los datos se presentan como media ± DE.

Descripción detallada de la invención y otros aspectos de la divulgación

Definiciones

Los términos se usan en el presente documento como se usan en general en la técnica, a menos que se defina de otro modo a continuación.

CD20 (también conocido como antígeno CD20 de linfocitos B, antígeno de superficie de linfocitos B B1, Leu-16, Bp35, BM5 y LF5; la proteína humana se caracteriza en la entrada de la base de datos UniProt PI 1836) es una proteína transmembranaria hidrófoba con un peso molecular de aproximadamente 35 kD expresada en linfocitos pre-B y B maduros (Valentine, M.A. et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 11282-11287; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980; Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-717; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568). El correspondiente gen humano es el de 4 dominios que atraviesan la membrana, subfamilia A, miembro 1, también conocido como MS4A1. Este gen codifica un miembro de la familia de genes 4A que atraviesan la membrana. Los miembros de esta familia de proteínas nacientes se caracterizan por rasgos característicos estructurales comunes y límites de empalme entre intrones/exones similares y presentan patrones de expresión únicos entre células hematopoyéticas y tejidos no linfáticos. Este gen codifica la molécula de superficie de linfocitos B que desempeña un papel en el desarrollo y diferenciación de linfocitos B en células plasmáticas. Este miembro de la familia se localiza en 11q12, entre un grupo de miembros de la familia. El empalme alternativo de este gen da como resultado dos variantes de transcripción que codifican la misma proteína.

El término "CD20" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier CD20 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) a menos que se indique de otro modo. El término engloba CD20 sin procesar "de longitud completa" así como cualquier forma de CD20 que resulte del procesado en la célula. El término también engloba variantes naturales de CD20, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. En un aspecto, CD20 es CD20 humano. La secuencia de aminoácidos de una CD20 humano ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 1.

Los términos "anticuerpo anti-CD20" y "un anticuerpo que se une a CD20" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a CD20 con una afinidad suficiente de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a CD20. En un aspecto, el grado de unión de un anticuerpo anti-CD20 a una proteína distinta de CD20 no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a CD20 como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados aspectos, un anticuerpo que se une a CD20 tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 jM , < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0.001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M). En determinados aspectos, un anticuerpo anti-CD20 se une a un epítopo de CD20 que se conserva entre CD20 de diferentes especies.

Por "anticuerpo anti-CD20 de tipo II" se quiere decir un anticuerpo anti-CD20 que tiene propiedades de unión y actividades biológicas de anticuerpos anti-CD20 de tipo II como se describe en Cragg et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; Cragg et al., Blood 101 (2003) 1045-1052, Klein et al., mAbs 5 (2013), 22-33, y se resumen en la tabla 1 a continuación.

Tabla 1. Propiedades de anticuerpos anti-CD20 de tipo I y tipo II

en el caso de isotipo IgG1

Los ejemplos de anticuerpos anti-CD20 de tipo II incluyen, por ejemplo, obinutuzumab (GA101), tositumumab (B1), IgG1 de anticuerpo B-Ly1 humanizado (un anticuerpo IgG1 humanizado quimérico como se divulga en el documento WO 2005/044859), IgG1 11B8 (como se divulga en el documento WO 2004/035607) e IgG1 AT80.

Los ejemplos de anticuerpos anti-CD20 de tipo I incluyen, por ejemplo, rituximab, ofatumumab, veltuzumab, ocaratuzumab, ocrelizumab, PRO131921, ublituximab, IgG3 Hi47 (e Ca CC, hibridoma), IgG12C6 (como se divulga en el documento WO 2005/103081), IgG1 2F2 (como se divulga en los documentos WO 2004/035607 y WO 2005/103081) e IgG1 2H7 (como se divulga en el documento WO 2004/056312).

El término "anticuerpo B-Ly1 humanizado" se refiere a un anticuerpo B-Ly1 humanizado, como se divulga en los documentos WO 2005/044859 y WO 2007/031875, que se obtuvo a partir del anticuerpo anti-CD20 monoclonal murino B-Ly1 (región variable de la cadena pesada (VH) murina: SEQ ID NO: 2; región variable de la cadena ligera murina (VL): SEQ ID NO: 3 (véase Poppema, S. y Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139) por quimerización con un dominio constante humano de IgG1 y seguido de humanización (véanse los documentos WO 2005/044859 y WO 2007/031875). Estos "anticuerpos B-Ly1 humanizados" se divulgan en detalle en los documentos WO 2005/044859 y WO 2007/031875.

Como se usa en el presente documento, el término "citocina" se refiere a una molécula que media y/o regula una función o proceso biológico o celular (por ejemplo, inmunidad, inflamación y hematopoyesis). El término "citocina" como se usa en el presente documento incluye "linfocinas", "quimiocinas", "monocinas" e "interleucinas". Los ejemplos de citocinas útiles incluyen, pero no se limitan a, GM-CSF, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-a, IFN-p, IFN-y, MIP-1a, MIP-1 p, TGF-p, TNF-a y TNF-p. Una citocina particular es IL-2. El término "citocina" como se usa en el presente documento también incluye variantes de citocina que comprenden una o más mutaciones aminoacídicas en las secuencias de aminoácidos de la correspondiente citocina natural, tales como, por ejemplo, las variantes de IL-2 descritas en Sauve et al., Proc Natl Acad Sci USA 88, 4636-40 (1991); Hu et al., Blood 101,4853-4861 (2003) y publicación de patente de EE. UU. n.° 2003/0124678; Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000); Heaton et al., Cancer Res 53, 2597-602 (1993) y patente de EE. UU. n.° 5.229.109; publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/0036752; WO 2008/0034473; WO 2009/061853; o en el documento WO 2012/107417.

El término "interleucina-2" o "IL-2" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier IL-2 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) a menos que se indique de otro modo. El término engloba IL-2 sin procesar así como cualquier forma de iL-2 que resulte del procesado en la célula. El término también engloba variantes naturales de IL-2, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una IL-2 humana ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 12. La IL-2 humana sin procesar comprende adicionalmente un péptido señal de 20 aminoácidos N terminales que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 31, que está ausente en la molécula de IL-2 madura. El término "interleucina-2" como se usa en el presente documento también incluye variantes de IL-2 que comprenden una o más mutaciones aminoacídicas en las secuencias de aminoácidos de la correspondiente citocina natural, tales como, por ejemplo, las variantes de IL-2 descritas en Sauve et al., Proc Natl Acad Sci USA 88, 4636-40 (1991); Hu et al., Blood 101,4853-4861 (2003) y publicación de patente de EE. UU. n.° 2003/0124678; Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000); Heaton et al., Cancer Res 53, 2597-602 (1993) y patente de EE. UU. n.° 5.229.109; publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/0036752; WO 2008/0034473; WO 2009/061853; o en el documento WO 2012/107417.

El término "mutante de IL-2" o "polipéptido de IL-2 mutante" como se usa en el presente documento pretende englobar cualquier forma mutante de las diversas formas de la molécula de IL-2 incluyendo IL-2 de longitud completa, formas truncadas de IL-2 y formas donde IL-2 se une a otra molécula tal como por fusión o conjugación química. "Longitud completa" cuando se usa en referencia a IL-2 pretende querer decir la molécula de IL-2 de longitud natural madura. Por ejemplo, IL-2 humana de longitud completa se refiere a una molécula que tiene 133 aminoácidos (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 12). Las diversas formas de mutantes de IL-2 se caracterizan por tener al menos una mutación aminoacídica que afecta a la interacción de IL-2 con CD25. Esta mutación puede implicar la sustitución, deleción, truncamiento o modificación del residuo aminoacídico natural situado normalmente en esa posición. Son preferentes los mutantes obtenidos por sustitución aminoacídica. A menos que se indique de otro modo, un mutante de IL-2 se puede denominar en el presente documento secuencia peptídica mutante de IL-2, polipéptido mutante de IL-2, proteína mutante de IL-2 o análogo mutante de IL-2. La designación de las diversas formas de IL-2 se realiza en el presente documento con respecto a la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 12. Se pueden usar diversas designaciones en el presente documento para indicar la misma mutación. Por ejemplo, se puede indicar una mutación de fenilalanina en la posición 42 a alanina como 42A, A42, A⁴², F42A o Phe42Ala.

Como se usa en el presente documento, el término "liberación de citocinas" es sinónimo de "hipercitocinemia" o "síndrome de liberación de citocinas" (abreviado como "SLC"), y se refiere a un incremento en los niveles de citocinas, en particular factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interferón gamma (IFN-y), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10), interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina-8 (IL-8), en la sangre de un sujeto durante o poco después de (por ejemplo, dentro de 1 día de) la administración de un agente terapéutico, dando como resultado síntomas adversos. La liberación de citocinas es un tipo de reacción relacionada con infusión (RRI), que son reacciones medicamentosas adversas comunes al agente terapéutico y relacionadas oportunamente con la administración del agente terapéutico. Las RRI se producen típicamente durante o poco después de la administración del agente terapéutico, es decir, típicamente dentro de las 24 horas después de la infusión, predominantemente en la primera infusión. En algunos casos, por ejemplo, después de la administración de linfocitos T-CAR, también se puede producir SLC sólo después, por ejemplo, varios días después de la administración tras la expansión de los linfocitos T-CAR. La incidencia y gravedad típicamente disminuyen con las infusiones posteriores. Los síntomas pueden variar desde malestar sintomático hasta acontecimientos mortales, y pueden incluir fiebre, escalofríos, mareo, hipertensión, hipotensión, disnea, inquietud, sudoración, rubor, erupción cutánea, taquicardia, taquipnea, cefalea, dolor tumoral, náuseas, vómitos y/u fallo orgánico.

El término "mutación aminoacídica", como se usa en el presente documento, pretende englobar sustituciones, deleciones, inserciones y modificaciones aminoacídicas. Se puede realizar cualquier combinación de sustitución, deleción, inserción y modificación para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, una reducción en la unión a CD25 o a un receptor de Fc. Las deleciones e inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen deleciones e inserciones de aminoácidos amino y/o carboxiterminales. Las mutaciones aminoacídicas particulares son sustituciones aminoacídicas. Con el propósito de alterar, por ejemplo, las características de unión de un polipéptido de IL-2 o una región Fc, son en particular preferentes las sustituciones aminoacídicas no conservadoras, es decir, el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas diferentes. Las sustituciones aminoacídicas incluyen el reemplazo por aminoácidos no naturales o por derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar (por ejemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Se pueden generar mutaciones aminoacídicas usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis dirigida a sitio, PCR, síntesis génica y similares. Se contempla que también pueden ser útiles procedimientos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido por procedimientos distintos de genomanipulación, tales como modificación química. Se pueden usar diversas designaciones en el presente documento para indicar la misma mutación aminoacídica. Por ejemplo, se puede indicar una sustitución de prolina en la posición 329 de la región Fc a glicina como 329G, G329, G³²⁹, P329G o Pro329Gly.

El término "CD25" o "subunidad a del receptor de IL-2" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier CD25 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) a menos que se indique de otro modo. El término engloba CD25 sin procesar "de longitud completa" así como cualquier forma de CD25 que resulta del procesado en la célula. El término también engloba variantes naturales de CD25, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. En determinados aspectos, CD25 es CD25 humano. La secuencia de aminoácidos de CD25 humano se muestra en UniProt (www.uniprot.org) con n.° de acceso P01589 o NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000408.

El término "receptor de IL-2 de alta afinidad" como se usa en el presente documento, se refiere a la forma heterotrimérica del receptor IL-2, que consiste en la subunidad y del receptor (también conocida como subunidad Y del receptor de citocina común, Y^c, o CD132), la subunidad p del receptor (también conocida como CD122 o p70) y la subunidad a del receptor (también conocida como CD25 o p55). El término "receptor de IL-2 de afinidad intermedia" por contraste se refiere al receptor de IL-2 que incluye solo la subunidad Y y la subunidad p, sin la subunidad a (para una revisión véase, por ejemplo, Olejniczak y Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)).

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un receptor) y su compañero de unión (por ejemplo, un ligando). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, receptor y un ligando). La afinidad de una molécula X por su compañera Y se puede representar en general por la constante de disociación (K^d), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (k^dy k^a, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos bien establecidos conocidos en la técnica. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (RPS).

"Reducción" (y variaciones gramaticales de la misma tales como "reducir" o "reduciendo"), por ejemplo, la reducción del número de linfocitos B o la formación de ADA o liberación de citocinas, se refiere a una disminución en la cantidad respectiva, como se mide por procedimientos apropiados conocidos en la técnica. Por claridad, el término incluye también la reducción hasta cero (o por debajo del límite de detección del procedimiento analítico), es decir, la supresión o eliminación completa. Por el contrario, "incrementado" se refiere a un incremento en la cantidad respectiva.

Por "linfocito T regulador" o "linfocito T^reg" se quiere decir un tipo especializado de linfocito T CD4⁺que puede suprimir las respuestas de otros linfocitos T. Los linfocitos T^regse caracterizan por la expresión de la subunidad a del receptor de IL-2 (CD25) y el factor de transcripción forkhead box P3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)) y desempeñan un papel crítico en la inducción y mantenimiento de la autotolerancia periférica a antígenos, incluyendo los expresados por tumores. Los linfocitos T^regrequieren de IL-2 para su función y desarrollo e inducción de sus características supresoras.

Como se usa en el presente documento, el término "resto de unión a antígeno" se refiere a una molécula polipeptídica que se une específicamente a un determinante antigénico. En un antígeno, un resto de unión a antígeno puede dirigir la entidad a la que se une (por ejemplo, una citocina o un segundo resto de unión a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que lleva el determinante antigénico. Los restos de unión a antígeno incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos como se define además en el presente documento. Los restos de unión a antígeno preferentes incluyen un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo. En determinados aspectos, los restos de unión a antígeno pueden incluir regiones constantes de anticuerpo, como se define además en el presente documento y es conocido en la técnica. Las regiones constantes de la cadena pesada útiles incluyen cualquiera de los cinco isotipos: a, p, £, y o |j. Las regiones constantes de la cadena ligera útiles incluyen cualquiera de los dos isotipos: k y A.

Por "se une específicamente" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de un resto de unión a antígeno para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un instrumento BlAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (20o2)).

Como se usa en el presente documento, el término "determinante antigénico" es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional compuesta por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un resto de unión a antígeno, formando un complejo de resto de unión a antígeno-antígeno. Se pueden encontrar determinantes antigénicos útiles, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células enfermas, libres en suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC).

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de, o de manera intercambiable con, cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, incluyendo sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos no naturales. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o producir por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar de cualquier manera, incluyendo por síntesis química. Un polipéptido en el presente documento puede ser de un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, o 2000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tienen necesariamente dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, se denominan desplegados.

Por un polipéptido "aislado" o una variante o derivado del mismo se entiende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado se puede retirar de su entorno natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de manera recombinante expresados en células huésped se consideran aislados en el presente documento, ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han separado, fraccionado o parcial o sustancialmente purificado por cualquier técnica adecuada.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, b La s T-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa de ordenador ALIGN-2.

Como se usa en el presente documento, el término "resto efector" se refiere a un polipéptido, por ejemplo, una proteína o glucoproteína, que influye en la actividad celular, por ejemplo, a través de la transducción de señales u otras vías celulares. En consecuencia, el resto efector se puede asociar con la señalización mediada por receptor que transmite una señal desde el exterior de la membrana celular para modular una respuesta en una célula que porta uno o más receptores para el resto efector. En un aspecto, un resto efector puede provocar una respuesta citotóxica en células que portan uno o más receptores para el resto efector. En otro aspecto, un resto efector puede provocar una respuesta proliferativa en células que portan uno o más receptores para el resto efector. En otro aspecto, un resto efector puede provocar la diferenciación en células que portan receptores para el resto efector. En otro aspecto, un resto efector puede alterar la expresión (es decir, regular por incremento o regular por disminución) de una proteína celular endógena en células que portan receptores para el resto efector. Los ejemplos no limitantes de restos efectores incluyen citocinas, factores de crecimiento, hormonas, enzimas, sustratos y cofactores. El resto efector se puede asociar con un resto de unión a antígeno tal como un anticuerpo en una variedad de configuraciones para formar un inmunoconjugado.

El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211,I131,I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de micromoléculas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados a continuación.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. El término "fragmento de anticuerpo" como se usa en el presente documento también engloba anticuerpos de dominio único.

El término "molécula de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo natural.

Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados región constante de la cadena pesada. De forma similar, del extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina se puede asignar a una de cinco clases, llamadas a (IgA), p (IgD), £ (IgE), y (IgG) o |j (IgM), de las que algunas se pueden dividir además en subclases, por ejemplo, yi (IgGi), Y2 (IgG2), Y3 (IgG3), Y4 (IgG4), ai (IgAi) y a2 (IgA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente en dos moléculas Fab y un dominio Fc, unidos por medio de la región bisagra de inmunoglobulina.

El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria a parte o la totalidad de un antígeno. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamados regiones variables de anticuerpo). Preferentemente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural en general tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde con la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos.

Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados aspectos, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos de contacto con antígeno ("contactos con antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR ejemplares en el presente documento incluyen:

(a) bucles hipervariables que se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), and 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

(b) CDR que se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(c) contactos con antígeno que se producen en los residuos aminoacídicos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); and

(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), incluyendo los residuos aminoacídicos de HVR46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).

A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.

"Región estructural" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y f R4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, y y |J, respectivamente.

El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente por extenderse de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, los anticuerpos producidos por células huésped pueden experimentar escisión postraduccional de uno o más, en particular uno o dos, aminoácidos del extremo C de la cadena pesada. Por lo tanto, un anticuerpo producido por una célula huésped por expresión de una molécula de ácido nucleico específica que codifica una cadena pesada de longitud completa puede incluir la cadena pesada de longitud completa, o puede incluir una variante escindida de la cadena pesada de longitud completa (también denominada en el presente documento una "cadena pesada variante escindida"). Este puede ser el caso cuando los dos aminoácidos C terminales finales de la cadena pesada son glicina (G446) y lisina (K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Por lo tanto, la lisina C terminal (Lys447), o la glicina (Gly446) y lisina (K447) C terminales, de la región Fc pueden estar presentes o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991 (véase también anteriormente). Una "subunidad" de un dominio Fc como se usa en el presente documento se refiere a uno de los dos polipéptidos que forman el dominio Fc dimérico, es decir, un polipéptido que comprende regiones constantes C terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, que pueden tener autoasociación estable. Por ejemplo, una subunidad de un dominio Fc de IgG comprende un dominio constante CH2 de IgG y uno CH3 de IgG.

Una "modificación que promueve la heterodimerización" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido, por ejemplo, una cadena pesada de inmunoglobulina, que reduce o previene la asociación del polipéptido con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la heterodimerización como se usa en el presente documento incluye en particular modificaciones separadas hechas a cada uno de dos polipéptidos deseados para formar un dímero, en el que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de los dos polipéptidos. Por ejemplo, una modificación que promueve la heterodimerización puede alterar la estructura o carga de uno o ambos de los polipéptidos deseados para formar un dímero para hacer su asociación estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. La heterodimerización se produce entre dos polipéptidos no idénticos, tales como dos cadenas pesadas de inmunoglobulina en las que otros componentes inmunoconjugados fusionados a cada una de las cadenas pesadas (por ejemplo, el polipéptido de IL-2) no son los mismos. En los inmunoconjugados útiles en el presente documento, la modificación que promueve la heterodimerización está en la(s) cadena(s) pesada(s), específicamente en el dominio Fc, de una molécula de inmunoglobulina. En algunos aspectos, la modificación que promueve la heterodimerización comprende una mutación aminoacídica, específicamente una sustitución aminoacídica. En un aspecto particular, la modificación que promueve la heterodimerización comprende una mutación aminoacídica separada, específicamente una sustitución aminoacídica, en cada una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina.

De forma similar, una "modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de una subunidad del dominio Fc que reduce o previene la asociación de un polipéptido que comprende la subunidad del dominio Fc con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la asociación como se usa en el presente documento en particular incluye modificaciones separadas realizadas en cada una de las dos subunidades del dominio Fc que se desean asociar (es decir, la primera y la segunda subunidad del dominio Fc), en la que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de las dos subunidades del dominio Fc. Por ejemplo, una modificación que promueve la asociación puede alterar la estructura o carga de una o ambas de las subunidades del dominio Fc para hacer que su asociación sea estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. Por tanto, se produce (hetero)dimerización entre un polipéptido que comprende la primera subunidad del dominio Fc y un polipéptido que comprende la segunda subunidad del dominio Fc, que podría ser no idéntico en el sentido de que otros componentes fusionados a cada una de las subunidades (por ejemplo, restos de unión a antígeno) no son los mismos. En algunos aspectos, la modificación que promueve asociación comprende una mutación aminoacídica en el dominio Fc, específicamente una sustitución aminoacídica. En un aspecto particular, la modificación que promueve asociación comprende una mutación aminoacídica separada, específicamente una sustitución aminoacídica, en cada una de las dos subunidades del dominio Fc.

Un "receptor de Fc activador" es un receptor de Fc que después del acoplamiento por una región Fc de un anticuerpo provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula que porta el receptor para realizar funciones efectoras. Los receptores de Fc activadores incluyen FcYRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).

El término "funciones efectoras" cuando se usa en referencia a anticuerpos se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C lq y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión a receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por complejo inmunitario por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

Como se usa en el presente documento, el término "células efectoras" se refiere a una población de linfocitos que muestran receptores de restos efectores, por ejemplo, receptores de citocinas, y/o receptores de Fc en su superficie a través de los que se unen a un resto efector, por ejemplo, una citocina, y/o una región Fc de un anticuerpo y contribuyen a la destrucción de células diana, por ejemplo, células tumorales. Las células efectoras pueden mediar, por ejemplo, efectos citotóxicos o fagocíticos. Las células efectoras incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T efectores tales como linfocitos T citotóxicos CD8+, linfocitos T auxiliares CD4+, linfocitos T y5, linfocitos NK, linfocitos citolíticos activados por linfocina (LAK) y macrófagos/monocitos.

Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "genomanipular, genomanipulado, genomanipulación" incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La genomanipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación, o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de estos enfoques. La "genomanipulación", en particular con el prefijo "gluco", así como el término "genomanipulación de la glucosilación" incluye la genomanipulación metabólica de la maquinaria de glucosilación de una célula, incluyendo las manipulaciones genéticas de las vías de síntesis de los oligosacáridos para lograr una alteración de la glucosilación de las glucoproteínas expresadas en las células. Además, la genomanipulación de glucosilación incluye los efectos de mutaciones y del entorno celular sobre la glucosilación. En un aspecto, la genomanipulación de glucosilación es una alteración en la actividad glucosiltransferasa. En un aspecto particular, la genomanipulación da como resultado una alteración en la actividad glucosaminiltransferasa y/o actividad fucosiltransferasa. La genomanipulación de la glucosilación se puede usar para obtener una "célula huésped que tenga un incremento en la actividad GnTIII" (por ejemplo, una célula huésped que se ha manipulado para expresar un incremento en los niveles de uno o más polipéptidos que tienen actividad p-(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), una "célula huésped que tiene un incremento en la actividad ManII" (por ejemplo, una célula huésped que se ha manipulado para expresar un incremento en los niveles de uno o más polipéptidos que tienen actividad a-manosidasa II (ManII)) o una "célula huésped que tiene una disminución en la actividad a-(1,6)-fucosiltransferasa" (por ejemplo, una célula huésped que se ha manipulado para expresar una disminución en los niveles de a-(1,6)-fucosiltransferasa).

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar las proteínas usadas en el presente documento. En un aspecto, la célula huésped se genomanipula para permitir la producción de un anticuerpo con oligosacáridos modificados. En determinados aspectos, las células huésped se han manipulado para expresar un incremento en los niveles de uno o más polipéptidos que tienen actividad p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). En determinados aspectos, las células huésped se han manipulado además para expresar un incremento en los niveles de uno o más polipéptidos que tienen actividad a-manosidasa II (ManII). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombras algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido que tiene actividad GnTIII" se refiere a polipéptidos que pueden catalizar la adición de un residuo de N-acetilglucosamina (GlcNAc) en un enlace p-1,4 al manósido unido a p del núcleo de trimanosilo de oligosacáridos unidos a N. Esto incluye polipéptidos de fusión que presentan actividad enzimática similar a, pero no necesariamente idéntica a, una actividad de la p(1,4)-Nacetilglucosaminiltransferasa III, también conocida como p-1,4-manosil-glucoproteína 4-beta-N-acetilglucosaminiltransferasa (EC 2.4.1.144), de acuerdo con el Nomenclatura Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), como se mide en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso donde existe dependencia de la dosis, no necesita ser idéntica a la de GnTIII, sino más bien sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada en comparación con la GnTIII (es decir, el polipéptido candidato presentará mayor actividad o no más de aproximadamente 25 veces menos y, preferentemente, no más de aproximadamente diez veces menos actividad, y lo más preferentemente, no más de aproximadamente tres veces menos actividad en relación con la GnTIII). En determinados aspectos, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización de Golgi de un polipéptido residente en Golgi heterólogo. En particular, el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de manosidasa II o GnTI, lo más en particular el dominio de localización de manosidasa II. De forma alternativa, el dominio de localización de Golgi se selecciona del grupo que consiste en: el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de GnTII y el dominio de localización de a-1,6-fucosiltransferasa del núcleo. Los procedimientos para generar dichos polipéptidos de fusión y usarlos para producir anticuerpos con un incremento en las funciones efectoras se divulgan en el documento WO 2004/065540 y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0241817.

Como se usa en el presente documento, el término "dominio de localización de Golgi" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido residente en Golgi que es responsable de anclar el polipéptido a una localización dentro del aparato de Golgi. En general, los dominios de localización comprenden "colas" aminoterminales de una enzima.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido que tiene actividad ManII" se refiere a polipéptidos que pueden catalizar la hidrólisis de los residuos de a-D-manosa unidos a 1,3 y 1,6 terminales en el intermedio de manosa GlcNAcMan^sGlcNAc²ramificado de oligosacáridos unidos a N. Esto incluye polipéptidos que presentan actividad enzimática similar, pero no necesariamente idéntica a, una actividad de la a-manosidasa II de Golgi, también conocida como manosil-oligosacárido 1,3-1,6-a-manosidasa II (EC 3.2.1.114), de acuerdo con el Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB).

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo inmunitario que da lugar a la lisis de células diana recubiertas de anticuerpo por células efectoras inmunitarias. Las células diana son células a las que se unen específicamente anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprenden una región Fc, en general por medio de la parte proteica que es N terminal a la región Fc. Como se usa en el presente documento, el término "incremento/reducción en la ADCC" se define como un incremento/reducción en el número de células diana que se lisan en un tiempo dado, a una concentración dada de anticuerpo en el medio circundante a las células diana, por el mecanismo de ADCC definido anteriormente, y/o bien un incremento/reducción en la concentración de anticuerpo en el medio circundante a las células diana, requerido para lograr la lisis de un número dado de células diana en un tiempo dado, por el mecanismo de ADCC. El incremento/reducción en la ADCC es relativo a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped, usando los mismos procedimientos de producción, purificación, formulación y almacenamiento estándar (que son conocidos para los expertos en la técnica), pero que no se ha genomanipulado. Por ejemplo, el incremento en la ADCC mediada por un anticuerpo producido por células huésped genomanipuladas para tener una alteración en el patrón de glucosilación (por ejemplo, para expresar la glucosiltransferasa, GnTIII, u otras glucosiltransferasas) por los procedimientos descritos en el presente documento, es en relación con la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped no genomanipuladas.

Por "anticuerpo que tiene un incremento/reducción en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)" se entiende un anticuerpo que tiene un incremento/reducción en la ADCC como se determina por cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos en la técnica. Un ensayo de ADCC in vitro aceptado es como sigue:

1) el ensayo usa células diana que son conocidas por expresar el antígeno diana reconocido por la región de unión a antígeno del anticuerpo;

2) el ensayo usa células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas, aisladas de sangre de un donante sano elegido al azar, como células efectoras;

3) se lleva a cabo el ensayo de acuerdo con el siguiente protocolo:

i) se aíslan las PBMC usando procedimientos de centrifugación por densidad estándar y se suspenden a 5 x 10⁶células/ml en medio de cultivo celular RPMI;

ii) se cultivan las células diana por procedimientos de cultivo tisular estándar, se recogen de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad mayor de un 90 %, se lavan en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 microcurios de ⁵¹Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo celular y se resuspenden en medio de cultivo celular a una densidad de 10⁵células/ml;

iii) se transfieren 100 microlitros de la suspensión de células diana final anterior a cada pocilio de una placa de microvaloración de 96 pocillos;

iv) se diluye el anticuerpo en serie de 4000 ng/ml a 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se añaden 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las células diana en la placa de microvaloración de 96 pocillos, sometiendo a prueba por triplicado diversas concentraciones de anticuerpo que abarcan todo el intervalo de concentraciones anterior;

v) para los controles de liberación máxima (MR), 3 pocillos adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2 % (V/V) de un detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis), en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv anterior);

vi) para los controles de liberación espontánea (SR), 3 pocillos adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular RPMI en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv anterior);

vii) a continuación, se centrifuga la placa de microvaloración de 96 pocillos a 50 x g durante 1 minuto y se incuba durante 1 hora a 4 °C;

viii) se añaden 50 microlitros de la suspensión de PBMC (punto i anterior) a cada pocillo para proporcionar una proporción de células efectoras:diana de 25:1 y se disponen las placas en una estufa de incubación en una atmósfera con CO2 al 5 % a 37 °C durante 4 horas;

ix) se recoge el sobrenadante sin células de cada pocillo y se cuantifica la radioactividad liberada experimentalmente (ER) usando un contador gamma;

x) se calcula el porcentaje de lisis específica para cada concentración de anticuerpo de acuerdo con la fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, donde ER es la radioactividad promedio cuantificada (véase el punto ix anterior) para esa concentración de anticuerpo, MR es la radioactividad promedio cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles de MR (véase el punto v anterior) y SR es la radioactividad promedio cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles de SR (véase el punto vi anterior);

4) "incremento/reducción en la ADCC" se define como un incremento/reducción en el porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a prueba anterior y/o bien un incremento/reducción en la concentración de anticuerpo requerida para lograr la mitad del porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a prueba anterior. El incremento/reducción en la ADCC es relativo a la ADCC medida con el ensayo anterior, mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped, usando los mismos procedimientos de producción, purificación, formulación y almacenamiento estándar (que son conocidos para los expertos en la técnica), pero que no se ha genomanipulado.

Como se usa en el presente documento, el término "inmunoconjugado" se refiere a una molécula polipeptídica que incluye al menos un resto efector, tal como una citocina, y un resto de unión a antígeno, tal como un anticuerpo. En determinados aspectos, el inmunoconjugado comprende no más de un resto efector. Los inmunoconjugados particulares útiles en el presente documento consisten esencialmente en un resto efector y un anticuerpo unido por uno o más conectores peptídicos. Los inmunoconjugados particulares en el presente documento son proteínas de fusión, es decir, los componentes del inmunoconjugado se unen por enlaces peptídicos.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades insignificantes. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar en el presente documento se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

Como se usa en el presente documento, los términos "primero", "segundo", "tercero", etc., con respecto a restos de unión a antígeno, etc., se usan por conveniencia para distinguir cuando hay más de uno de cada tipo de resto. El uso de estos términos no está destinado a conferir un orden u orientación específica a menos que se establezca explícitamente.

Los términos "multiespecífica" y "biespecífica" quieren decir que la molécula de unión a antígeno se puede unir específicamente a al menos dos determinantes antigénicos distintos. Típicamente, una molécula de unión a antígeno biespecífica comprende dos sitios de unión a antígeno, de los que cada uno es específico para un determinante antigénico diferente. En determinados aspectos, una molécula de unión a antígeno biespecífica se puede unir simultáneamente a dos determinantes antigénicos, en particular dos determinantes antigénicos expresados en dos células distintas.

El término "valente" como se usa en el presente documento indica la presencia de un número especificado de sitios de unión a antígeno en una molécula de unión a antígeno. Como tal, el término "unión monovalente a un antígeno" indica la presencia de un (y no más de un) sitio de unión a antígeno específico para el antígeno en la molécula de unión a antígeno.

Un "sitio de unión a antígeno" se refiere al sitio, es decir, uno o más residuos aminoacídicos, de una molécula de unión a antígeno que proporciona interacción con el antígeno. Por ejemplo, el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo comprende residuos aminoacídicos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Una molécula de inmunoglobulina natural típicamente tiene dos sitios de unión a antígeno, una molécula Fab típicamente tiene un único sitio de unión a antígeno.

Un "agente terapéutico activador de linfocitos T" como se usa en el presente documento se refiere a un agente terapéutico que puede inducir la activación de linfocitos T en un sujeto, en particular un agente terapéutico diseñado para inducir la activación de linfocitos T en un sujeto. Los ejemplos de agentes terapéuticos activadores de linfocitos T incluyen anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a un antígeno activador de linfocitos T, tal como CD3, y un antígeno de célula diana, tal como CD20 o CD19. Otros ejemplos incluyen receptores de antígenos quiméricos (CAR) que comprenden un dominio activador de linfocitos T y un resto de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno de célula diana, tal como CD20 o CD19.

Un "antígeno activador de linfocitos T" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico expresado por un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, que puede inducir o potenciar la activación de linfocitos T tras la interacción con una molécula de unión a antígeno. Específicamente, la interacción de una molécula de unión a antígeno con un antígeno activador de linfocitos T puede inducir la activación de linfocitos T desencadenando la cascada de señalización del complejo receptor de linfocitos T. Un antígeno activador de linfocitos T ejemplar es CD3.

"Activación de linfocitos T" como se usa en el presente documento se refiere a una o más respuestas celulares de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, seleccionadas de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T y los agentes terapéuticos activadores de linfocitos T usados en el presente documento pueden inducir la activación de linfocitos T. Los ensayos adecuados para medir la activación de linfocitos T son conocidos en la técnica descrita en el presente documento.

Un "antígeno de célula diana" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico presentado en la superficie de una célula diana, por ejemplo, una célula en un tumor tal como una célula cancerosa o una célula del estroma tumoral.

Un "antígeno de linfocito B" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico presentado en la superficie de un linfocito B, en particular un linfocito B maligno (en ese caso, el antígeno también se denomina "antígeno de linfocito B maligno").

Un "antígeno de linfocito T" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico presentado en la superficie de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico.

Una "molécula Fab" se refiere a una proteína que consiste en el dominio VH y CH1 de la cadena pesada (la "cadena pesada de Fab") y el dominio VL y CL de la cadena ligera (la "cadena ligera de Fab") de una inmunoglobulina.

Por "receptor de antígeno quimérico" o "CAR" se quiere decir una proteína receptora genomanipulada que comprende un resto de unión a antígeno, por ejemplo, un fragmento variable monocatenario (scFv) de un anticuerpo dirigido, un dominio transmembranario, un dominio de señalización de activación de linfocitos T intracelular (por ejemplo, la cadena zeta de CD3 del receptor de linfocitos T) y opcionalmente uno o más dominios coestimuladores intracelulares (por ejemplo, de CD28, CD27, CD137 (4-1BB), Ox40). Los CAR median en el reconocimiento de antígenos, la activación de linfocitos T y, en el caso de CAR de segunda generación, la coestimulación para aumentar la funcionalidad y persistencia de linfocitos T. Para una revisión, véase, por ejemplo, Jackson et al., Nat Rev Clin Oncol (2016) 13, 370-383.

Por "trastorno proliferativo de linfocitos B" se quiere decir una enfermedad en la que el número de linfocitos B en un paciente se incrementa en comparación con el número de linfocitos B en un sujeto sano, y en particular en la que el incremento en el número de linfocitos B es la causa o rasgo característico de la enfermedad. Un "trastorno proliferativo de linfocitos B positivos para CD20" es un trastorno proliferativo de linfocitos B en el que los linfocitos B, en particular linfocitos B malignos (además de linfocitos B normales), expresan CD20.

Los trastornos de proliferación de linfocitos B ejemplares incluyen linfoma no hodgkiniano (LNH), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular (LF), linfoma de células del manto (LCM), linfoma de la zona marginal (LZM), así como algunos tipos de mieloma múltiple (MM) y linfoma de Hodgkin (LH).

Por "fusionado" se quiere decir que los componentes (por ejemplo, una molécula Fab y una subunidad del dominio Fc) se unen por enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más conectores peptídicos.

Un "anticuerpo antifármaco" o "ADA" se refiere a un anticuerpo que se une a un agente terapéutico y puede influir en las concentraciones séricas y la función del agente terapéutico en un sujeto. La presencia de ADA puede incrementar el aclaramiento del agente terapéutico a través de la formación de complejos inmunitarios entre el agente terapéutico y el anticuerpo (neutralizante, no neutralizante o ambos), reduciendo por tanto la semivida del agente terapéutico. Además, la actividad y eficacia del agente terapéutico se pueden disminuir a través de la unión del anticuerpo al agente terapéutico (en particular en el caso de a Da neutralizantes). Los ADA también se pueden asociar con reacciones alérgicas o de hipersensibilidad y otros acontecimientos adversos.

Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad.

Por "agente terapéutico" se quiere decir un ingrediente activo, por ejemplo, de una composición farmacéutica, que se administra a un sujeto en un intento de alterar el curso natural de una enfermedad en el sujeto que se está tratando, y se puede realizar para profilaxis o bien durante el transcurso de análisis clínicos. Un "agente inmunoterápico" se refiere a un agente terapéutico que se administra a un sujeto en un intento de restablecer o potenciar la respuesta inmunitaria del sujeto, por ejemplo, a un tumor.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). Preferentemente, el individuo o sujeto es un ser humano.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la composición.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural de una enfermedad en el individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante el transcurso de análisis clínicos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos aspectos, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

"CD3" se refiere a cualquier CD3 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba CD3 sin procesar "de longitud completa" así como cualquier forma de CD3 que resulte del procesado en la célula. El término también engloba variantes naturales de CD3, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. En un aspecto, CD3 es CD3 humano, en particular la subunidad épsilon de CD3 humano (CD3e). La secuencia de aminoácidos de CD3e humano se muestra en UniProt (www.uniprot.org) con n.° de acceso

P07766 (versión 144) o NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1. Véase también SEQ ID NO: 115. La secuencia de aminoácidos de CD3e de macaco cangrejero [Macaca fascicularis] se muestra en NCBI GenBank, n.° BAB71849.1. Véase también SEQ ID NO: 116.

"CD19" se refiere al antígeno de linfocitos B CD19, también conocido como antígeno de superficie de linfocitos B B4 o antígeno de superficie de linfocitos T Leu-12 e incluye cualquier CD19 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba CD19 sin procesar "de longitud completa" así como cualquier forma de CD19 que resulte del procesado en la célula. El término también engloba variantes naturales de CD19, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. En un aspecto, CD19 es CD19 humano. La secuencia de aminoácidos de un CD19 humano ejemplar se muestra en UniProt (www.uniprot.org) con n.° de acceso P15391 (versión 174) o NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_001770.5, y SEQ ID NO: 117.

"Antígeno carcinoembrionario" o "CEA" (también conocido como molécula de adherencia celular relacionada con antígeno carcinoembrionario 5 (CEACAM5)), se refiere a cualquier CEA natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba CEA sin procesar "de longitud completa" así como cualquier forma de CEA que resulta del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de CEA, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. En un aspecto, CEA es CEA humano. La secuencia de aminoácidos de CEA humano se muestra en UniProt (www.uniprot.org) con n.° de acceso P06731 o NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004354.2.

El término "proteína de activación de fibroblastos" o "FAP" (también conocido como seprasa) se refiere a cualquier FAP natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba FAP sin procesar "de longitud completa" así como cualquier forma de FAP que resulta del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de FAP, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. En un aspecto, FAP es FAP humana. La secuencia de aminoácidos de FAP humana se muestra en UniProt (www.uniprot.org) con n.° de acceso Q12884 o NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2.

Por molécula Fab de "entrecruzamiento" (también denominada "Crossfab") se quiere decir una molécula Fab en la que los dominios variables o los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian (es decir, se reemplazan entre sí), es decir, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta del dominio variable de la cadena ligera VL y el dominio constante de la cadena pesada 1 CH1 (VL-CH1, en sentido N a C terminal), y una cadena peptídica compuesta de la dominio variable de la cadena pesada VH y el dominio constante de la cadena ligera CL (VH-CL, en sentido N a C terminal). Por claridad, en una molécula Fab de entrecruzamiento en la que los dominios variables de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian, la cadena peptídica que comprende el dominio constante de la cadena pesada 1 CH1 se denomina en el presente documento "cadena pesada" de la molécula Fab (de entrecruzamiento). Por el contrario, en una molécula Fab de entrecruzamiento en la que los dominios constantes de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian, la cadena peptídica que comprende el dominio variable de la cadena pesada VH se denomina en el presente documento "cadena pesada" de la molécula Fab (de entrecruzamiento).

Al contrario que esto, por una molécula Fab "convencional" se quiere decir una molécula Fab en su formato natural, es decir, que comprende una cadena pesada compuesta de los dominios variable y constante de la cadena pesada (VH-CH1, en sentido N a C terminal), y una cadena ligera compuesta de los dominios variable y constante de la cadena ligera (VL-CL, en sentido N a C terminal).

Anticuerpos anti-CD20 de tipo II

La molécula CD20 (también llamada antígeno de diferenciación restringido a linfocitos B humanos o Bp35) es una proteína transmembranaria hidrófoba expresada en la superficie de linfocitos pre-B y B maduros malignos y no malignos que se ha descrito extensamente (Valentine, M.A., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 11282-11287; y Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-717; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208 212; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560 CD20 se expresa altamente en más de un 90 % de los linfomas no hodgkinianos (LNH) de linfocitos B (Anderson, K.C., et al., Blood 63 (1984) 1424-1433) pero no se encuentra en las células madre hematopoyéticas, linfocitos pro-B, células plasmáticas normales u otros tejidos normales (Tedder, T.F., et al., J, Immunol. 135 (1985) 973 979).

Existen dos tipos diferentes de anticuerpos anti-CD20 que difieren significativamente en su modo de unión a CD20 y actividades biológicas (Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; y Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052). Los anticuerpos anti-CD20 de tipo I utilizan principalmente el complemento para destruir células diana, mientras que los anticuerpos de tipo II funcionan principalmente a través de la inducción directa de muerte celular.

Los anticuerpos anti-CD20 de tipo I y de tipo II y sus características se revisan, por ejemplo, en Klein et al., mAbs 5 (2013), 22-33. Los anticuerpos anti-CD20 de tipo II no localizan CD20 en balsas lipídicas, muestran baja actividad de CDC, muestran solo aproximadamente la mitad de la capacidad de unión a linfocitos B en comparación con anticuerpos anti-CD20 de tipo I e inducen la agregación homotípica y muerte celular directa. En contraste a esto, los anticuerpos de tipo I localizan CD20 en balsas lipídicas, muestran alta actividad de CDC, capacidad de unión total a linfocitos B y solo inducción débil de agregación homotípica y muerte celular directa.

Obinutuzumab y tositumumab (número CAS 192391-48) son ejemplos de anticuerpos anti-CD20 de tipo II, mientras que rituximab, ofatumumab, veltuzumab, ocaratuzumab, ocrelizumab, PRO131921 y ublituximab son ejemplos de anticuerpos anti-CD20 de tipo I.

De acuerdo con la invención y otros aspectos de la divulgación, el anticuerpo anti-CD20 es un anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II puede reducir el número de linfocitos B en un sujeto. En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II es un anticuerpo IgG, en particular un anticuerpo IgG1. En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II es un anticuerpo de longitud completa. En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II comprende una región Fc, en particular una región Fc de IgG o, más en particular, una región Fc de IgG1. En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II es un anticuerpo B-Ly1 humanizado. En particular, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II es un anticuerpo anti-CD20 de tipo II de clase IgG humanizado, que tiene la especificidad de unión del anticuerpo B-Ly1 murino (Poppema y Visser, Biotest Bulletin 3, 131-139 (1987); SEQ ID NO 2 y 3).

En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, la HCDR2 de SEQ ID NO: 5, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 6; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, la LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 9. En particular, las regiones estructurales (FR) de la región variable de la cadena pesada FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo anti-CD20 de tipo II son secuencias de FR humanas codificadas por la secuencia de la línea germinal humana VHl_10, la FR4 de la región variable de la cadena pesada de dicho anticuerpo anti-CD20 es una secuencia de FR humana codificada por la secuencia de la línea germinal humana JH4, las FR de la región variable de la cadena ligera FR1, FR2 y f R3 de dicho anticuerpo anti-CD20 de tipo II son secuencias de FR humanas codificadas por la secuencia de la línea germinal humana VK_2_40, y la FR4 de la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo anti-CD20 es una secuencia de FR humana codificada por la secuencia de la línea germinal humana JK4. En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 11.

En un aspecto particular, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II es obinutuzumab (DCI recomendada, WHO Drug Information, vol. 26, n.° 4, 2012, p. 453). Como se usa en el presente documento, obinutuzumab es sinónimo de GA101. El nombre comercial es GAZYVA® o GAZYVARO®. Esto reemplaza todas las versiones previas (por ejemplo, vol. 25, n.° 1, 2011, p. 75-76) y es conocido anteriormente como afutuzumab (DCI recomendada, WHO Drug Information, vol. 23, n.° 2, 2009, p. 176; vol. 22, n.° 2, 2008, p. 124). En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II es tositumomab.

El anticuerpo anti-CD20 de tipo II útil en el presente documento se puede genomanipular para tener un incremento en la función efectora, en comparación con un correspondiente anticuerpo no modificado. En un aspecto, el anticuerpo genomanipulado para tener un incremento en la función efectora tiene un incremento de al menos 2 veces, al menos 10 veces o incluso al menos 100 veces en la función efectora, en comparación con un correspondiente anticuerpo no genomanipulado. El incremento en la función efectora puede incluir, pero no se limita a, uno o más de los siguientes: incremento en la unión a receptor de Fc, incremento en la unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), incremento en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), incremento en la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), incremento en la secreción de citocinas, incremento en la captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos, incremento en la unión a linfocitos NK, incremento en la unión a macrófagos, incremento en la unión a monocitos, incremento en la unión a células polimorfonucleares, incremento en la señalización directa que induce apoptosis, incremento en la reticulación de anticuerpos unidos a la diana, incremento en la maduración de células dendríticas o incremento en la activación de linfocitos T.

En un aspecto, el incremento en la función efectora es uno o más seleccionados del grupo de incremento en la unión a receptor de Fc, incremento en CDC, incremento en ADCC, incremento en ADCP e incremento en la secreción de citocinas. En un aspecto, el incremento en la función efectora es incremento en la unión a un receptor de Fc activador. En un aspecto de este tipo, la afinidad de unión al receptor de Fc activador se incrementa al menos 2 veces, en particular al menos 10 veces, en comparación con la afinidad de unión de un correspondiente anticuerpo no genomanipulado. En un aspecto específico, el receptor de Fc activador se selecciona del grupo de FcYRIIIa, FcyRI y FcYRIIa. En un aspecto, el receptor de Fc activador es FcYRIIIa, en particular FcYRIIIa humano. En otro aspecto, el incremento en la función efectora es incremento en ADCC. En un aspecto de este tipo, la ADCC se incrementa al menos 10 veces, en particular al menos 100 veces, en comparación con la ADCC mediada por un correspondiente anticuerpo no genomanipulado. Aún en otro aspecto, el incremento en la función efectora es incremento en la unión a un receptor de Fc activador e incremento en ADCC.

Se puede medir el incremento en la función efectora por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. u U. n.° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA82, 1499 1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véanse, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar la actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA95, 652-656 (1998). La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. De acuerdo con un aspecto particular, la afinidad de unión a un receptor de Fc activador se mide por resonancia de plasmón superficial usando un aparato BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C. De forma alternativa, la afinidad de unión de anticuerpos por receptores de Fc se puede evaluar usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK que expresan el receptor FcYIIIa. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si el anticuerpo se puede unir a C1q y, por tanto tiene actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

En incremento en la función efectora puede resultar, por ejemplo, de la glucomanipulación de la región Fc o de la introducción de mutaciones aminoacídicas en la región Fc del anticuerpo. En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 se genomanipula por introducción de una o más mutaciones aminoacídicas en la región Fc. En un aspecto específico, las mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas. En un aspecto incluso más específico, las sustituciones aminoacídicas están en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de residuos). Se describen otras mutaciones aminoacídicas adecuadas, por ejemplo, en Shields et al., J Biol Chem 9(2), 6591-6604 (2001); la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; el documento WO 2004/063351 y el documento WO 2004/099249. Las regiones Fc mutantes se pueden preparar por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios nucleotídicos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.

En otro aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II se genomanipula por modificación de la glucosilación en la región Fc. En un aspecto específico, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II se genomanipula para tener un incremento en la proporción de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado. Un incremento en la proporción de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc de un anticuerpo da como resultado que el anticuerpo tiene un incremento en la función efectora, en particular un incremento en la ADCC.

En un aspecto más específico, al menos aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 100 %, preferentemente al menos aproximadamente un 40 %, de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc del anticuerpo anti-CD20 de tipo II son no fucosilados. En un aspecto, entre aproximadamente un 40 % y aproximadamente un 80 % de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc del anticuerpo anti-CD20 de tipo II son no fucosilados. En un aspecto, entre aproximadamente un 40 % y aproximadamente un 60 % de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc del anticuerpo anti-CD20 de tipo II son no fucosilados. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser del tipo híbrido o complejo.

En otro aspecto específico, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II se genomanipula para tener un incremento en la

proporción de oligosacáridos bisecados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no genomanipulado.

En un aspecto más específico, al menos aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente

un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, apro un 40 %, aproximadamente

45 %, aproximadamente un

nte un 55 %, apro un 60 %, aproximadamente

65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, apro un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadame un 100 %, preferentemente al menos aproximadamente un 40 %, de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc

del anticuerpo anti-CD20 de tipo II son bisecados. En un aspecto, entre aproximadamente un 40 % y

aproximadamente un 80 % de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc del anticuerpo anti-CD20 se bisecan.

En un aspecto, entre aproximadamente un 40 % y aproximadamente un 60 % de los oligosacáridos unidos a N en

la región Fc del anticuerpo anti-CD20 de tipo II se bisecan. Los oligosacáridos bisecados pueden ser del tipo híbrido

o complejo.

Aún en otro aspecto específico, el anticuerpo anti-CD20 se genomanipula para tener un incremento en la

proporción de oligosacáridos no fucosilados bisecados en la región Fc en comparación con un anticuerpo no

genomanipulado. En un aspecto más específico, al menos aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 15 %,

aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %,

aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %,

aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %,

aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o

aproximadamente un 100 %, preferentemente al menos aproximadamente un 15 %, más preferentemente al

menos aproximadamente un 25 %, de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc del anticuerpo anti-CD20 son

no fucosilados bisecados. Los oligosacáridos bisecados no fucosilados pueden ser del tipo híbrido o complejo.

Las estructuras de oligosacáridos en la región Fc de anticuerpo se pueden analizar por procedimientos bien

conocidos en la técnica, por ejemplo, por espectrometría de masas mA l DI TOF como se describe en Umana et

al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999) o Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006). El porcentaje de

oligosacáridos no fucosilados es la cantidad de oligosacáridos que carecen de residuos de fucosa, en relación con

todos los oligosacáridos unidos a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y con alto contenido en

manosa) e identificados en una muestra tratada con N-glucosidasa F por EM MALDI TOF. Asn 297 se refiere al

residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los

residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos

hacia 5' o hacia 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia

insignificantes en los anticuerpos. El porcentaje de oligosacáridos bisecados o bisecados no fucosilados se

determina de forma análoga.

En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II se genomanipula para tener una glucosilación modificada en la

región Fc, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, produciendo el anticuerpo en una célula

huésped que tiene una alteración en la actividad de una o más glucosiltransferasas. Las glucosiltransferasas

incluyen p-(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), p-(1,4)-galactosiltransferasa (GalT), p-(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnTI), p-(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II (GnTII) y a-(1,6)-fucosiltransferasa. En un aspecto específico, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II se genomanipula para tener un

incremento en la proporción de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc, en comparación con un anticuerpo

no genomanipulado, produciendo el anticuerpo en una célula huésped que tiene un incremento en la actividad p-(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). En un aspecto incluso más específico, la célula huésped tiene

adicionalmente un incremento en la actividad a-manosidasa II (ManII). La metodología de glucomanipulación que

se puede usar para glucomanipular anticuerpos útiles en el presente documento se ha descrito con mayor detalle

en Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999), Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006), documento

WO 99/54342 (patente de EE. UU. n.° 6.602.684, documento EP 1071700), documento WO 2004/065540

(publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0241817, documento EP 1587921), documento WO

03/011878 (publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2003/0175884). Los anticuerpos glucomanipulados

usando esta metodología se denominan GlycoMab en el presente documento.

En general, se puede usar cualquier tipo de línea celular cultivada, incluyendo las líneas celulares analizadas en

el presente documento, para generar líneas celulares para la producción de anticuerpos anti-TNC A2 con una

alteración en el patrón de glucosilación. Las líneas celulares particulares incluyen células CHO, células BHK,

células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células

PER.C6 o células de hibridoma, y otras células de mamífero. En determinados aspectos, las células huésped se

han manipulado para expresar un incremento en los niveles de uno o más polipéptidos que tienen actividad p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). En determinados aspectos, las células huésped se han manipulado

además para expresar un incremento en los niveles de uno o más polipéptidos que tienen actividad a-manosidasa

II (ManII). En un aspecto específico, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que

comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización de Golgi de un polipéptido residente en Golgi heterólogo. En particular, dicho dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de Golgi de manosidasa II. Los procedimientos para generar dichos polipéptidos de fusión y usarlos para producir anticuerpos con un incremento en las funciones efectoras se divulgan en Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006) y el documento WO2004/065540.

Las células huésped que contienen la secuencia codificante de un anticuerpo útil en el presente documento invención y/o la secuencia codificante de polipéptidos que tienen actividad glucosiltransferasa, y que expresan los productos génicos biológicamente activos, se pueden identificar, por ejemplo, por hibridación de ADN-ADn o ADN-ARN; la presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras"; evaluando el nivel de transcripción como se mide por la expresión de los respectivos transcritos de ARNm en la célula huésped; o la detección del producto génico como se mide por inmunoanálisis o por su actividad biológica; procedimientos que son bien conocidos en la técnica. La actividad GnTIII o ManII se puede detectar, por ejemplo, empleando una lectina que se une a productos de biosíntesis de GnTIII o ManII, respectivamente. Un ejemplo de dicha lectina es la lectina E4-PHA que se une preferentemente a oligosacáridos que contienen GlcNAc bisecante. Los productos de biosíntesis (es decir, estructuras de oligosacáridos específicas) de polipéptidos que tienen actividad GnTIII o ManII también se pueden detectar por análisis espectrométrico de masas de los oligosacáridos liberados de glucoproteínas producidas por células que expresan dichos polipéptidos. De forma alternativa, se puede usar un ensayo funcional que mide el incremento en la función efectora, por ejemplo, el incremento en la unión al receptor de Fc, mediada por anticuerpos producidos por las células genomanipuladas con el polipéptido que tiene actividad GnTIII o ManII.

En otro aspecto, el anticuerpo anti-CD20 se genomanipula para tener un incremento en la proporción de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc, en comparación con un anticuerpo no genomanipulado, produciendo el anticuerpo en una célula huésped que tiene una disminución en la actividad a(1,6)-fucosiltransferasa. Una célula huésped que tiene una disminución en la actividad a-(1,6)-fucosiltransferasa puede ser una célula en la que el gen de la a(1,6)-fucosiltransferasa se ha inactivado o desactivado de otro modo, por ejemplo, se ha suprimido (véanse Yamane-Ohnuki et al., Biotech Bioeng 87, 614 (2004); Kanda et al., Biotechnol Bioeng 94(4), 680-688 (2006); Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151-160 (2006)).

Otros ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lec13 carentes de fucosilación de proteínas (Ripka et al., Arch Biochem Biophys 249, 533-545 (1986); solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2003/0157108 y documento WO 2004/056312, en especial en el ejemplo 11). Los anticuerpos útiles en el presente documento se pueden glucomanipular de forma alternativa para tener una reducción en los residuos de fucosa en la región Fc de acuerdo con las técnicas divulgadas en los documentos EP1 176 195 A1, WO 03/084570, WO 03/085119 y publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.os 2003/0115614, 2004/093621,2004/110282, 2004/110704, 2004/132140, patente de EE. UU. n.° 6.946.292 (Kyowa), por ejemplo, reduciendo o suprimiendo la actividad de una proteína transportadora de GDP-fucosa en las células huésped usadas para la producción de anticuerpos.

Los anticuerpos glucomanipulados útiles en el presente documento también se pueden producir en sistemas de expresión que producen glucoproteínas modificadas, tales como las enseñadas en el documento WO 03/056914 (GlycoFi, Inc.) o en los documentos WO 2004/057002 y WO 2004/024927 (Greenovation).

Agentes terapéuticos

La presente invención y otros aspectos de la divulgación son útiles en relación con diversos agentes terapéuticos, en particular con agentes terapéuticos que son inmunógenos en el sujeto (es decir, tienen la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria en el sujeto) y/o que activan linfocitos T en el sujeto. Dichos agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, proteínas recombinantes.

En un aspecto, el agente terapéutico induce la formación de ADA en un sujeto cuando se administra al sujeto en un régimen de tratamiento sin la administración de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En un aspecto, el agente terapéutico induce la liberación de citocinas en un sujeto cuando se administra al sujeto en un régimen de tratamiento sin la administración de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En un aspecto, el agente terapéutico induce la formación de ADA y liberación de citocinas en un sujeto cuando se administra al sujeto en un régimen de tratamiento sin la administración de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

En un aspecto, el agente terapéutico es un agente biológico. En un aspecto, el agente terapéutico comprende un polipéptido, en particular un polipéptido recombinante. En un aspecto, el agente terapéutico comprende un polipéptido que no se encuentra naturalmente en el sujeto y/o es inmunógeno en el sujeto. En un aspecto, el agente terapéutico se debe administrar sistémicamente. En un aspecto, el agente terapéutico se debe administrar por infusión, en particular infusión intravenosa.

En un aspecto, el agente terapéutico comprende un polipéptido de unión a antígeno. En un aspecto, el agente terapéutico comprende un polipéptido seleccionado del grupo de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un dominio Fc y un inmunoconjugado. En un aspecto, el agente terapéutico comprende un polipéptido seleccionado del grupo de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un receptor de antígeno o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y un ligando de receptor o un fragmento de unión a receptor del mismo. En un aspecto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo de clase IgG, en particular un anticuerpo de subclase IgG1. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante.

En determinados aspectos, el agente terapéutico comprende un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véanse, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), p.

269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.os 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos del epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen un incremento en la semivida in vivo, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. En un aspecto, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab o un fragmento scFv.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados aspectos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1).

Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo inalterado, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

En determinados aspectos, el agente terapéutico comprende un anticuerpo quimérico. Determinados anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con cambio de clase" en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En determinados aspectos, el agente terapéutico comprende un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en seres humanos, mientras mantiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o porciones de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunos aspectos, se sustituyen algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado con los correspondientes residuos de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y procedimientos de prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describe el injerto de región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" para el reordenamiento de FR).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci., 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véanse, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

En determinados aspectos, el agente terapéutico comprende un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Se describen anticuerpos humanos en general en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol.

20:450-459 (2008).

Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que reemplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena en general se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech.

23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584, que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429, que describe la tecnología HUMAB®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870, que describe la tecnología K-M m Ou SE® y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.

También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma murino-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véanse, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boemer et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Los anticuerpos humanos generados por medio de tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.

Los anticuerpos comprendidos en el agente terapéutico se pueden aislar cribando colecciones combinatorias para determinar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen además, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299 310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467 12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que, a continuación, se pueden cribar para determinar el fago de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad por el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos propios y también no propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos génicos V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y conseguir el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos-anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente de EE. UU. n.° 5.750.373 y las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.

En determinados aspectos, el agente terapéutico comprende un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinados aspectos, las especificidades de unión son para diferentes antígenos. En determinados aspectos, las especificidades de unión son para diferentes epítopos en el mismo antígeno. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos para células que expresan un antígeno. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véanse Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), documento WO 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), y genomanipulación por "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden preparar genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodímeras de Fc de anticuerpos (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980, y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véanse, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); usando tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenarios (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

En el presente documento también se incluyen anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo" (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).

El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un "Fab de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a dos antígenos diferentes (véase el documento US 2008/0069820, por ejemplo).

Los anticuerpos "Crossmab" también se incluyen en el presente documento (véanse, por ejemplo, los documentos WO2009080251, WO2009080252, WO2009080253, WO2009080254).

Otra técnica para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico es el enfoque con "acoplador de linfocitos T biespecífico" o Bít E® (véanse, por ejemplo, los documentos WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261 y WO2008/119567). Este enfoque utiliza dos dominios variables de anticuerpo dispuestos en un único polipéptido. Por ejemplo, una cadena polipeptídica única incluye dos fragmentos Fv monocatenarios (scFv), teniendo cada uno un dominio de la cadena pesada variable (VH) y uno de la cadena ligera variable (VL) separados por un conector polipeptídico de una longitud suficiente para permitir la asociación intramolecular entre los dos dominios. Este polipéptido único incluye además una secuencia espaciadora polipeptídica entre los dos fragmentos scFv. Cada scFv reconoce un epítopo diferente, y estos epítopos pueden ser específicos para diferentes tipos celulares, de modo que las células de dos tipos celulares diferentes se acercan en estrecha proximidad o se anclan cuando cada scFv se conecta con su epítopo afín. Un aspecto particular de este enfoque incluye un scFv que reconoce un antígeno de la superficie celular expresado por una célula inmunitaria, por ejemplo, un polipéptido CD3 en un linfocito T, enlazado a otro scFv que reconoce un antígeno de la superficie celular expresado por una célula diana, tal como una célula cancerosa o tumoral.

Como es un polipéptido único, el acoplador de linfocitos T biespecífico se puede expresar usando cualquier sistema de expresión celular procariota o eucariota conocido en la técnica, por ejemplo, una línea celular CHO. Sin embargo, pueden ser necesarias técnicas de purificación específicas (véase, por ejemplo, el documento EP1691833) para separar acopladores de linfocitos T biespecíficos monoméricos de otras especies multiméricas, que pueden tener actividades biológicas distintas de la actividad prevista del monómero. En un esquema de purificación ejemplar, una solución que contiene polipéptidos secretados se somete en primer lugar a una cromatografía de afinidad por metales, y los polipéptidos se eluyen con un gradiente de concentraciones de imidazol. Este eluido se purifica además usando cromatografía de intercambio aniónico, y los polipéptidos se eluyen usando un gradiente de concentraciones de cloruro de sodio. Finalmente, este eluido se somete a cromatografía de exclusión por tamaño para separar monómeros de especies multiméricas.

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tuft et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

En determinados aspectos, un anticuerpo comprendido en el agente terapéutico se puede modificar además para contener restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se une más de un polímero, pueden ser las mismas moléculas o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones incluyendo, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, ya sea si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

El agente terapéutico también puede comprender un anticuerpo conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas), o isótopos radiactivos.

En un aspecto, el agente terapéutico comprende un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) en el que un anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, incluyendo pero sin limitarse a un maitansinoide (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.208.020, 5.416.064, y la patente europea EP 0425 235 B1); una auristatina tal como restos de fármaco monometilauristatina DE and DF (MMAE y MMAF) (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.298); una dolastatina; una caliqueamicina o derivado de la misma (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, y 5.877.296; Hinman et al., Cáncer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cáncer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina (véanse Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y la patente de EE. UU. n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En otro aspecto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado con una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo pero sin limitarse a cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.

En otro aspecto, un agente terapéutico comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, Tc99m o I123, o un marcador de espín para tomografía por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succi nimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis-(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); patente de EE. UU. n.° 5.208.020).

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo monoclonal tal como, pero sin limitarse a, alemtuzumab (LEMTRADA®), bevacizumab (AVASTIN®), cetuximab (ERBITUX®), panitumumab (VECTIBIX®), pertuzumab (OMNITARG®, 2C4), trastuzumab (HERCEPTIN®), tositumomab (Bexxar®), abciximab (REOPRO®), adalimumab (HUMIRA®), apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, basiliximab (SIMULECT®), bavituximab, belimumab (BENLYSTA®) briankinumab, canakinumab (ILARIS®), cedelizumab, certolizumab pegol (CIMZIA®), cidfusituzumab, cidtuzumab, cixutumumab, clazakizumab, crenezumab, daclizumab (z EnAPAX®), dalotuzumab, denosumab (PROLIA®, XGEVA®), eculizumab (SOLIRIS®), efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, golimumab (SIMPONI®), ipilimumab, imgatuzumab, infliximab (REMICADE®), labetuzumab, lebrikizumab, lexatumumab, lintuzumab, lucatumumab, lulizumab pegol, lumretuzumab, mapatumumab, matuzumab, mepolizumab, mogamulizumab, motavizumab, motovizumab, muronomab, natalizumab (TYSABRI®), necitumumab (PORTRAZZA®), nimotuzumab (THERACIM®), nolovizumab, numavizumab, olokizumab, omalizumab (XOLAIR®), onartuzumab (also known as MetMAb), palivizumab (SYNAGIS®), pascolizumab, pecfusituzumab, pectuzumab, pembrolizumab (KEYTRUDA®), pexelizumab, priliximab, ralivizumab, ranibizumab (LUCENTIS®), reslivizumab, reslizumab, resyvizumab, robatumumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, sarilumab, secukinumab, seribantumab, sifalimumab, sibrotuzumab, siltuximab (SYLVANT®) siplizumab, sontuzumab, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab (ACTEMRA®), toralizumab, tucusituzumab, umavizumab, urtoxazumab, ustekinumab (STELARA®), vedolizumab (ENTYVIO®), visilizumab, zanolimumab, zalutumumab.

En un aspecto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo indicado para el tratamiento del cáncer. En un aspecto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo indicado para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria. En un aspecto, el agente terapéutico es un agente inmunoterápico. En un aspecto, el agente terapéutico está indicado para el tratamiento del cáncer. En algunos aspectos, en particular en relación con los aspectos descritos en el presente documento relacionados con la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico en un sujeto, el cáncer es un trastorno proliferativo de linfocitos B. En un aspecto, el cáncer es un trastorno proliferativo de linfocitos B positivos para CD20. En un aspecto, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfoma no hodgkiniano (LNH), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular (LF), linfoma de células del manto (LCM), linfoma de la zona marginal (LZM), mieloma múltiple (MM) y linfoma de Hodgkin (LH). En un aspecto, el agente terapéutico es un agente inmunoterápico.

En un aspecto, el agente terapéutico es un agente inmunosupresor. En un aspecto, el agente terapéutico está indicado para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.

Sin quedar vinculado a ninguna teoría, se cree que potenciar la estimulación de linfocitos T, promoviendo una molécula coestimuladora activadora o inhibiendo una molécula coestimuladora negativa, puede promover la muerte de las células tumorales, tratando o retrasando de este modo la progresión del cáncer. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un agonista dirigido contra una molécula coestimuladora activadora. En algunos aspectos, una molécula coestimuladora activadora puede incluir CD40, CD226, CD28, OX40, GITR, CD137, Cd 27, HVEM o CD127. En algunos aspectos, el agonista dirigido contra una molécula coestimuladora activadora es un anticuerpo agonista que se une a CD40, CD226, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM o CD127. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo dirigido a GITR. En algunos aspectos, el anticuerpo dirigido a GITR es TRX518. En algunos, el agente terapéutico puede comprender un antagonista dirigido contra una molécula coestimuladora inhibidora. En algunos aspectos, una molécula coestimuladora inhibidora puede incluir CTLA-4 (también conocido como CD152), PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7-H3, B7-H4, IDO, T iGIT, MICA/B o arginasa. En algunos aspectos, el antagonista dirigido contra una molécula coestimuladora inhibidora es un anticuerpo antagonista que se une a CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7-H3, B7-H4, IDO, TIGIT, MICA/B o arginasa.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo anti-PD-1. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 se selecciona del grupo que consiste en MDX-1106 (nivolumab), MK-3475 (pembrolizumab, conocido anteriormente como lambrolizumab), CT-011 (pidilizumab). MDX-1106, también conocido como MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558, o nivolumab, es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el documento WO2006/121168. MK-3475, también conocido como pembrolizumab o (anteriormente) lambrolizumab, es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el documento WO2009/114335. CT-011, también conocido como hBAT, hBAT-1 o pidilizumab, es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el documento WO2009/101 611.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender una inmunoadhesina (por ejemplo, una inmunoadhesina que comprende una porción extracelular o de unión a PD-1 de PD-L1 o PD-L2 fusionada a una región constante (por ejemplo, una región Fc de una secuencia de inmunoglobulina)). En un aspecto, el agente terapéutico puede comprender AMP-224, también conocido como B7-DClg (un receptor soluble de fusión PD-L2-Fc descrito en los documentos WO2010/027827 y WO2011/066342).

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo anti-PD-L1. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en YW243.55.S70, MPDL3280A, MdX-1105 y MEDI4736. El anticuerpo YW243.55.S70 es un anticuerpo anti-PD-L1 descrito en el documento WO 2010/077634. MDX-1105, también conocido como BMS-936559, es un anticuerpo anti-PD-L1 descrito en el documento WO2007/005874. MEDI4736 es un anticuerpo monoclonal anti-PD-LI descrito en los documentos WO2011/066389 y US2013/034559. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-LI es atezolizumab.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un antagonista dirigido contra CTLA-4 (también conocido como CD152), por ejemplo, un anticuerpo bloqueante. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender ipilimumab (también conocido como MDX-010, MDX-101 o YERVOY®). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender tremelimumab (también conocido como ticilimumab o CP-675.206). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un antagonista dirigido contra B7-H3 (también conocido como CD276), por ejemplo, un anticuerpo bloqueante. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender MGA271. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un antagonista dirigido contra un TGF beta, por ejemplo, metelimumab (también conocido como CAT-192), fresolimumab (también conocido como GC1008) o LY2157299.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un agonista dirigido contra CD137 (también conocido como TNFRSF9, 4-IBB o ILA), por ejemplo, un anticuerpo activador. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender urelumab (también conocido como BMS-663513). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender ligando de CD137 (también conocido como TNFRSF9, 4-1BB o ILA), tal como 4-1BBL. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un agonista dirigido contra CD40, por ejemplo, un anticuerpo activador. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender CP-870893. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un agonista dirigido contra OX40 (también conocido como CD134), por ejemplo, un anticuerpo activador. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo anti-OX40 (por ejemplo, AgonOX). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un ligando de OX40, tal como OX40L. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un agonista dirigido contra CD27, por ejemplo, un anticuerpo activador. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender CDX-1127.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un linfocito T (por ejemplo, un linfocito T citotóxico o CTL) que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un linfocito T que comprende un receptor de TGF beta dominante negativo, por ejemplo, un receptor de TGF beta de tipo II dominante negativo.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un conjugado anticuerpo-fármaco. En algunos aspectos, el conjugado anticuerpo-fármaco comprende mertansina o monometilauristatina E (MMAE). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un conjugado anticuerpo anti-NaPi2b-MMAE (también conocido como DNIB0600A o RG7599). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender trastuzumab emtansina (también conocido como T-DM1, ado-trastuzumab emtansina o KADCYLA®). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender DMUC5754A. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un conjugado anticuerpo-fármaco dirigido al receptor de endotelina B (EDNBR), por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra EDNBR conjugado con MMAE (también conocido como DEDN6526A). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender inotuzumab ozogamicina. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender bivatuzumab mertansina. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender cantuzumab mertansina. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender cantuzumab ravtansina. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender brentuximab vedotina (ADECTRIS®). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender pinatuzumab vedotina. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender polatuzumab vedotina. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender glembatumumab vedotina. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender lorvotuzumab mertansina. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender tacatuzumab tetraxetan. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender vandortuzumab vedotina (DSTP3086S). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN®)

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo dirigido contra angiopoyetina 2 (también conocida como Ang2). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender MEDI3617.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo dirigido a CSF-1R (también conocido como M-CSFR o GD115). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender IMC-CS4 (LY3022855)). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender emactuzumab.

En algún aspecto, el agente terapéutico puede comprender una citocina. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un interferón, por ejemplo, interferón alfa o interferón gamma. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender Roferon-A (también conocido como interferón alfa-2a recombinante). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender GM-CSF (también conocido como factor estimulador de colonias de macrófagos de granulocitos humano recombinante, rhu GM-CSF, sargramostim o Leukine®). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender aldesleucina (PROLEUKIN®). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender IL-12. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender IL-10.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender una proteína de fusión de IL-2. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender tucotuzumab celmoleucina. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender darleucina. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender teleucina.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender una proteína de fusión de IL-10. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender dekavil. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender una proteína de fusión de TNF. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender fibromun.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico, tal como, pero sin limitarse a, duligotuzumab, MM-111, MM141, TF2, ABT-981, ABT-122, LY3164530, SAR156597, GSK2434735, ozoralizumab, ALX-0761, ALX-0061, ALX-0141, ACE910.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico que se puede unir a un linfocito T y una célula diana, por ejemplo, una célula tumoral. En algún aspecto, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CD3 en un linfocito T y a un antígeno de célula diana. En algún aspecto, el agente terapéutico puede comprender un acoplador de linfocitos T biespecífico (BiTE®). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y CD19. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es blinatumomab (BLINCYTO®). En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es AFM11. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y EpCAM. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es catumaxomab (REVOMAB®). En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es solitomab (AMG110, MT110). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y Her2. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es ertumaxomab. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CDS y PSMA. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es BAY2010112 (AMG212, MT112). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra Cd 3 y CEA. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es MEDI565 (AMG211, MT111). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y CD33. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es AMG330. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y CD123. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es MGD006. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es XmAb®14045. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y CD38. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y gpA33. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es MGD007. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y CD20. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es XmAb®13676. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es REGN1979. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es FBTA05 (Lymphomun).

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD30 y CD16A. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es AFM13. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra DR5 y FAP. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra Ang2 y VEGF. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es vanucizumab.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un dominio Fc. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender una proteína de fusión que comprende un dominio Fc.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un receptor recombinante o un fragmento del mismo. En algunos aspectos, el receptor es un receptor de linfocitos T. En algunos aspectos, el receptor es un receptor de TNF. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender etanercept (ENBREL®). En algunos aspectos, el receptor es un receptor de VEGF. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender ziv-aflibercept (ZALTRAP®). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender aflibercept (EYLEA®). En algunos aspectos, el receptor es un receptor de IL-1. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender rilonacept (ARCALYST®). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender IMCgp100. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender una proteína de fusión factor IX-Fc. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender una proteína de fusión factor VIII-Fc. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender una proteína de fusión CTLA-4-Fc, tal como, por ejemplo, belatacept, abatacept (ORENCIA®). En un aspecto, el agente terapéutico puede comprender romiplostim.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un ligando de receptor recombinante, tal como un ligando de receptor de TNF.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender una versión biológica genérica, biosimilar o no comparable de un agente, por ejemplo, un anticuerpo, mencionado en el presente documento.

En un aspecto, el agente terapéutico no comprende obinutuzumab.

Agentes terapéuticos activadores de linfocitos T

Lo siguiente describe con más detalle agentes terapéuticos activadores de linfocitos T para los que la invención y otros aspectos de la divulgación pueden ser útiles, en particular aspectos descritos en el presente documento relacionados con la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico en un sujeto.

En algunos aspectos, el agente terapéutico comprende un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno activador de linfocitos T. En un aspecto, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno seleccionado del grupo de CD3, CD28, CD137 (también conocido como 4-1BB), CD40, CD226, OX40, GITR, CD27, HVEM y CD127.

En un aspecto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo que se une específicamente a CD3, en particular CD3e.

En un aspecto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo que es o puede competir por la unión con el anticuerpo H2C (publicación pCt n.° WO2008/119567), anticuerpo V9 (Rodrigues et al., Int J Cancer Supl 7, 45 50 (1992) y patente de EE. UU. n.° 6.054.297), anticuerpo FN18 (Nooij et al., Eur J Immunol 19, 981-984 (1986)), anticuerpo Sp 34 (Pessano et al., EMBO J 4, 337-340 (1985)), anticuerpo OKT3 (Kung et al., Science 206, 347 349 (1979)), anticuerpo WT31 (Spits et al., J Immunol 135, 1922 (1985)), anticuerpo UCHT1 (Bums et al., J Immunol 129, 1451-1457 (1982)), anticuerpo 7D6 (Coulie et al., Eur J Immunol 21, 1703-1709 (1991)) o anticuerpo Leu-4. En algunos aspectos, el agente terapéutico también puede comprender un anticuerpo que se une específicamente a CD3 como se describe en los documentos WO 2005/040220, WO 2005/118635, WO 2007/042261, WO 2008/119567, WO 2008/119565, WO 2012/162067, WO 2013/158856, WO 2013/188693, WO 2013/186613, WO 2014/110601, WO 2014/145806, WO 2014/191113, WO 2014/047231, WO 2015/095392, WO 2015/181098, WO 2015/001085, WO 2015/104346, WO 2015/172800, WO 2016/020444 o WO 2016/014974.

En un aspecto, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de linfocito B, en particular un antígeno de linfocito B maligno. En un aspecto, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD20, CD19, CD22, ROR-1, CD37 y CD5, en particular a CD20 o CD19.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo seleccionado de rituximab, ocrelizumab, ofatumumab, ocaratuzumab, veltuzumab y ublituximab.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo multiespecífico, en particular un anticuerpo biespecífico. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico que se puede unir a un linfocito T y una célula diana, por ejemplo, una célula tumoral. En algunos aspectos, la célula diana es un linfocito B, en particular un linfocito B maligno. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a (i) un antígeno activador de linfocitos T y (ii) un antígeno de linfocito B. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CD3 en un linfocito T y a un antígeno de célula diana. En algunos aspectos, el antígeno de célula diana es un antígeno de linfocito B, en particular un antígeno de linfocito B maligno. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un acoplador de linfocitos T biespecífico (BiTE®).

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y CD20. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es XmAb®13676. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es REGN1979. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es FBTA05 (Lymphomun).

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y CD19. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es blinatumomab (BLINCYTO®). En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es AFM11. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es MGD011 (JNJ-64052781).

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y CD38. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es XmAb®13551, XmAb®15426 o XmAb®14702.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y BCMA. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es BI836909.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y CD33. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es AMG330.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y CD123. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es MGD006. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es XmAb®14045. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es JNJ-63709178.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un receptor recombinante o un fragmento del mismo. En algunos aspectos, el receptor es un receptor de linfocitos T (TCR). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un receptor de antígeno quimérico (CAR).

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un linfocito T (por ejemplo, un linfocito T citotóxico o CTL) que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un linfocito T que expresa un receptor de linfocitos T recombinante (TCR).

En un aspecto, el agente terapéutico puede comprender un CAR que se une específicamente a un antígeno de linfocito B, en particular un antígeno de linfocito B maligno. En un aspecto, el agente terapéutico puede comprender un CAR que se une específicamente a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD20, CD19, CD22, ROR-1, CD37 y CD5, en particular a CD20 o CD19.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un CAR dirigido a CD19, o un linfocito T que expresa un c A r dirigido a CD19. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender KTE-C19, CTL019, JCAR-014, JCAR-015, JCAR-017, BPX-401, UCART19,

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un CAR dirigido a CD22, o un linfocito T que expresa un CAR dirigido a CD22. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender JCAR-018 o UCART22.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un agonista dirigido contra una molécula coestimuladora activadora de linfocitos T. En algunos aspectos, una molécula coestimuladora activadora de linfocitos T puede incluir CD40, CD226, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM o CD127. En algunos aspectos, el agonista dirigido contra una molécula coestimuladora activadora de linfocitos T es un anticuerpo agonista que se une a CD40, CD226, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM o CD127. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo dirigido a GITR. En algunos aspectos, el anticuerpo dirigido a GITR es TRX518.

En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un agonista dirigido contra CD137 (también conocido como TNFRSF9, 4-1BB o ILA), por ejemplo, un anticuerpo activador. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender urelumab (también conocido como BMS-663513). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender ligando de CD137 (también conocido como TNFRSF9, 4-1BB o ILA), tal como 4-1BBL. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un agonista dirigido contra CD40, por ejemplo, un anticuerpo activador. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender CP-870893. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un agonista dirigido contra OX40 (también conocido como CD134), por ejemplo, un anticuerpo activador. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un anticuerpo anti-OX40 (por ejemplo, AgonOX). En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un ligando de OX40, tal como OX40L. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender un agonista dirigido contra CD27, por ejemplo, un anticuerpo activador. En algunos aspectos, el agente terapéutico puede comprender CDX-1127.

Agentes terapéuticos particulares

(i) Reducción de la formación de anticuerpos antifármaco (ADA)

Los agentes terapéuticos descritos a continuación son en particular útiles en la invención y otros aspectos de la divulgación, en particular en relación con los aspectos descritos en el presente documento relacionados con la reducción de la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto.

En algunos aspectos, el agente terapéutico comprende un anticuerpo que se une específicamente al antígeno carcinoembrionario (CEA).

En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CEA comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la Cd R de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 14, la HCDR2 de SEQ ID NO: 15, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 16; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 17, la LCDR2 de SEQ ID NO: 18 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 19. En otro aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CEA comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la de SEQ ID NO: 20 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 21. En otro aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CEA comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 21.

En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CEA comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la Cd R de la cadena pesada (HCDR) 1 de Se Q ID NO: 136, la HCDR2 de SEQ ID NO: 137, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 138; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 139, la LCDR2 de SEQ ID NO: 140 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 141. En otro aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CEA comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la de SEQ ID NO: 142 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 143. En otro aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CEA comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 143.

En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CEA es un anticuerpo de longitud completa. En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CEA es un anticuerpo de la clase IgG humana, en particular un anticuerpo de la clase IgG1 humana. En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CEA es un fragmento de anticuerpo, en particular una molécula Fab o una molécula scFv, más en particular una molécula Fab. En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CEA es un anticuerpo humanizado.

En algunos aspectos, el agente terapéutico comprende un anticuerpo que se une específicamente a la proteína de activación de fibroblastos (FAP). En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a FAP comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la de SEQ ID NO: 25 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 26. En otro aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a FAP comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 25 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 26.

En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a FAP es un anticuerpo de longitud completa. En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a FAP es un anticuerpo de la clase IgG humana, en particular un anticuerpo de la clase IgG1 humana. En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a fA p es un fragmento de anticuerpo, en particular una molécula Fab o una molécula scFv, más en particular una molécula Fab. En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a FAP es un anticuerpo humano.

En algunos aspectos, el agente terapéutico comprende un anticuerpo que se une específicamente a CD3, en particular CD3 épsilon. En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a c D3 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 32, la HCDR2 de SEQ ID NO: 33, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 35, la LCDR2 de SEQ ID NO: 36 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 37. En otro aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la de SEQ ID NO: 38 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 39. En otro aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39.

En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 es un anticuerpo de longitud completa. En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 es un anticuerpo de la clase IgG humana, en particular un anticuerpo de la clase IgG1 humana. En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 es un fragmento de anticuerpo, en particular una molécula Fab o una molécula scFv, más en particular una molécula Fab. En un aspecto particular, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que los dominios variables o los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian (es decir, se reemplazan entre sí). En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 es un anticuerpo humanizado.

En algunos aspectos, el agente terapéutico comprende una citocina. En un aspecto, la citocina se selecciona del grupo que consiste en GM-CSF, IL-1a, IL-1 p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-a, IFN-p, IFN-y, MIP-1a, MIP-1p, TGF-p, TNF-a y TNF-p. En un aspecto, la citocina es IL-2, en particular IL-2 humana. La secuencia de la IL-2 humano natural se muestra en SEQ ID NO: 12.

En un aspecto, el agente terapéutico comprende un polipéptido de IL-2 mutante que tiene una reducción en la afinidad de unión por la subunidad a del receptor de IL-2 en comparación con IL-2 natural. Conjuntamente con las subunidades p y y (también conocidas como CD122 y CD132, respectivamente), la subunidad a (también conocida como CD25) forma el receptor de IL-2 de alta afinidad heterotrimérico, mientras que el receptor dimérico que consiste solo en las subunidades p y y se llama receptor de IL-2 de afinidad intermedia. Un polipéptido de iL-2 mutante con una reducción en la unión a la subunidad a del receptor de IL-2 tiene una reducción en la capacidad para inducir la señalización de IL-2 en linfocitos T reguladores (Treg), induce menos muerte celular inducida por activación (AICD) en linfocitos T, y tiene una reducción en el perfil de toxicidad in vivo, en comparación con un polipéptido de IL-2 natural (véase el documento WO 2012/107417).

En un aspecto más específico, el polipéptido de IL-2 mutante comprende tres sustituciones aminoacídicas en las posiciones correspondientes al residuo 42, 45 y 72 de IL-2 humana. En un aspecto incluso más específico, el polipéptido de IL-2 mutante es un polipéptido de IL-2 humano que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G (numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana SEQ ID NO: 12). En un aspecto, el polipéptido de IL-2 mutante comprende adicionalmente una mutación aminoacídica en una posición correspondiente a la posición 3 de IL-2 humana, que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2. En un aspecto, dicha mutación aminoacídica que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana es una sustitución aminoacídica seleccionada del grupo de T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K y T3P. En particular, dicha mutación aminoacídica adicional es una sustitución aminoacídica que reemplaza un residuo de treonina por un residuo de alanina. Un polipéptido de IL-2 mutante particular útil en el presente documento comprende cuatro sustituciones aminoacídicas en las posiciones correspondientes a los residuos 3, 42, 45 y 72 de IL-2 humana. Las sustituciones aminoacídicas específicas son T3A, F42a , Y45A y L72G. Este polipéptido de IL-2 mutante cuádruple no presenta unión detectable a CD25, reducción en la capacidad para inducir apoptosis en linfocitos T, reducción en la capacidad para inducir la señalización de IL-2 en linfocitos Treg y una reducción en el perfil de toxicidad in vivo (véase, por ejemplo, el documento WO 2012/107417). Sin embargo, mantiene la capacidad de activar la señalización de IL-2 en células efectoras, para inducir la proliferación de células efectoras, y para generar IFN-y como una citocina secundaria por linfocitos NK.

El polipéptido de IL-2 mutante o IL-2 de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores puede comprender mutaciones adicionales que proporcionan otras ventajas tales como un incremento en la expresión o estabilidad. Por ejemplo, la cisteína en la posición 125 se puede reemplazar con un aminoácido neutro tal como serina, alanina, treonina o valina, proporcionando C125S IL-2, C125A IL-2, C125T IL-2 o C125V IL-2, respectivamente, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.518.584. Como se describe en el mismo, también se puede delecionar el residuo de alanina N terminal de IL-2 proporcionando mutantes tales como des-A1 C125S o des-A1 C125A. De forma alternativa o conjunta, el mutante de IL-2 puede incluir una mutación por la que la metionina que se produce normalmente en la posición 104 de IL-2 humana natural se reemplaza por un aminoácido neutro tal como alanina (véase la patente de EE. UU. n.° 5.206.344). Los mutantes resultantes, por ejemplo, des-A1 M104A IL-2, des-A1 M104A C125S IL-2, M104A IL-2, M104A C125A IL-2, des-A1 M104A C125A IL-2 o M104A C125S IL-2 (estos y otros mutantes se pueden encontrar en la patente de EE. UU. n.° 5.116.943 y en Weiger etal., Eur J Biochem 180, 295-300 (1989)) se pueden usar conjuntamente con las mutaciones de IL-2 particulares descritas en el presente documento.

Por tanto, en determinados aspectos, el polipéptido de IL-2 mutante o IL-2 comprende una mutación aminoacídica adicional en una posición correspondiente al residuo 125 de IL-2 humana. En un aspecto, dicha mutación aminoacídica adicional es la sustitución aminoacídica C125A.

En determinados aspectos, el polipéptido de IL-2 mutante es esencialmente una molécula de IL-2 de longitud completa, en particular una molécula de IL-2 de longitud completa humana. En un aspecto, el polipéptido de IL-2 mutante comprende una secuencia polipeptídica que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, o al menos un 90 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 12.

En un aspecto específico el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 13.

En algunos aspectos, el agente terapéutico comprende un inmunoconjugado. Los inmunoconjugados particulares se describen en los documentos w O 2012/107417 y WO 2012/146628.

En un aspecto, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que se une específicamente a CEA como se describe en el presente documento, y un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

(i) un anticuerpo de la subclase IgG1 humana que se une específicamente a CEA y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 14, la HCDR2 de SEQ ID NO: 15, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 16; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 17, la LCDR2 de SEQ ID NO: 18 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 19; y

(ii) un polipéptido de IL-2 humana mutante que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G (numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana s Eq ID NO: 12).

En un aspecto, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que se une específicamente a FAP como se describe en el presente documento, y un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

(i) un anticuerpo de la subclase IgG1 humana que se une específicamente a FAP y comprende la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 25; y la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 26; y

En un aspecto, el inmunoconjugado comprende no más de un polipéptido de IL-2 mutante. En un aspecto, el polipéptido de IL-2 mutante se fusiona al aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de anticuerpo, opcionalmente a través de un péptido conector. De forma adecuada, los péptidos conectores no inmunógenos incluyen, por ejemplo, los péptidos conectores (G4S)n, (SG4)n o G4(SG4)n, en los que n es en general un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4. En un aspecto, el péptido conector es (G4S)3.

En un aspecto, el inmunoconjugado comprende un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 22, un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 23, y un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 24.

En un aspecto, el inmunoconjugado comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 22, un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 23, y un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 24.

En un aspecto, el inmunoconjugado es cergutuzumab amunaleucina (véase WHO Drug Information (International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances), DCI recomendada: List 75, 2016, copia previa a la publicación).

En un aspecto, el inmunoconjugado comprende un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 27, un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 28, y un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 29.

En un aspecto, el inmunoconjugado comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 27, un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 28, y un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 29.

En un aspecto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos particulares se describen en las publicaciones PCT n.os WO 2013/026833 y WO 2014/131712 and y en la publicación PCT n.° WO 2017/055389.

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un anticuerpo que se une específicamente a CEA como se describe en el presente documento, y un anticuerpo que se une específicamente a CD3 como se describe en el presente documento. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un primer anticuerpo que se une específicamente a CD3 como se describe en el presente documento, y un segundo y un tercer anticuerpo que se unen específicamente a CEA como se describe en el presente documento. En un aspecto, el primer anticuerpo es una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, y el segundo y el primer anticuerpo son cada uno una molécula Fab convencional. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende además un dominio Fc como se describe en el presente documento. El anticuerpo biespecífico puede tener los formatos de anticuerpo descritos en el presente documento y puede comprender los restos de unión a antígeno descritos en el presente documento. El anticuerpo biespecífico puede comprender modificaciones en la región Fc y/o los restos de unión a antígeno como se describe en el presente documento.

En un aspecto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico que comprende

(i) un primer resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la c Dr de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 32, la HCDR2 de SEQ ID NO: 33, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 35, la LCDR2 de SEQ ID NO: 36 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 37, en el que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que se intercambian las regiones variable o bien las constantes, en particular las regiones constantes, de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab;

(ii) un segundo y un tercer resto de unión a antígeno que se unen específicamente a CEA, que comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 14, la HCDR2 de SEQ ID NO: 15, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 16; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 17, la LCDR2 de SEQ ID NO: 18 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 19, en el que el segundo y tercer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab, en particular una molécula Fab convencional;

(iii) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se puede asociar de forma estable, en el que el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y en el que el tercer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc.

En un aspecto, el primer resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, comprende la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38, y la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39. En un aspecto, el segundo y tercer restos de unión a antígeno que se unen específicamente a CEA comprenden la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20, y la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 21.

En un aspecto, los restos de unión a antígeno y la región Fc se fusionan entre sí por conectores peptídicos, en particular por conectores peptídicos como en SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 40, un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 41, un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 42, y un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 43.

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 40, un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 41, un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ iD n O: 42 y un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID No : 43. (CEA-TCB)

En un aspecto, el anticuerpo terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico que comprende

(i) un primer resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 32, la HCDR2 de SEQ ID NO: 33, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 35, la LCDR2 de SEQ ID NO: 36 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 37, en el que el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que se intercambian cualquiera de las regiones variables o las constantes, en particular las regiones variables, de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab;

(ii) un segundo y un tercer resto de unión a antígeno que se unen específicamente a CEA, que comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 136, la HCDR2 de SEQ ID NO: 137, y la Hc DR3 de SEQ ID NO: 138; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 139, la LCDR2 de SEQ ID NO: 140 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 141, en el que el segundo y tercer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab, en particular una molécula Fab convencional;

En un aspecto, el primer resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, comprende la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38, y la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39. En un aspecto, el segundo y tercer restos de unión a antígeno que se unen específicamente a CEA comprenden la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142, y la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 143.

En un aspecto, los restos de unión a antígeno y la región Fc se fusionan entre sí por conectores peptídicos, en particular por conectores peptídicos como en SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146.

En un aspecto, en el dominio constante CL de la segunda y la tercera molécula Fab en (ii) el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por lisina (K) o arginina (R), en particular arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat), y en el dominio constante CH1 de la segunda y la tercera molécula Fab en (ii) el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 144, un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 145, un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 146, y un polipéptido que comprende una secuencia que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 147.

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 144, un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 145, un polipéptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 146 y un polipéptido que comprende la secuencia de Se Q ID NO: 147.

(ii) Reducción de la liberación de citocinas

Los agentes terapéuticos descritos a continuación son en particular útiles en la invención y otros aspectos de la divulgación, en particular en relación con los aspectos descritos en el presente documento relacionados con la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico en un sujeto.

Los aspectos descritos en el presente documento relacionados con la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico en un sujeto son en particular útiles en relación con agentes terapéuticos que activan linfocitos T en el sujeto (agentes terapéuticos activadores de linfocitos T), es decir, tienen la capacidad de inducir la activación de linfocitos T en el sujeto. Dichos agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, anticuerpos dirigidos a antígenos de linfocitos T (en particular antígenos activadores de linfocitos T) o linfocitos T modificados con receptores de antígenos quiméricos (CAR) o receptores de linfocitos T recombinantes (TCR). Los aspectos descritos en el presente documento relacionados con la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico en un sujeto son en particular útiles en conexión con agentes terapéuticos activadores de linfocitos T dirigidos a linfocitos B.

En algunos aspectos, el agente terapéutico comprende un anticuerpo que se une específicamente a CD3, en particular CD3 épsilon.

En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 32, la HCDR2 de SEQ ID NO: 33, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 35, la LCDR2 de SEQ ID NO: 36 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 37. En otro aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la de SEQ ID NO: 38 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 39. En otro aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39.

En un aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la Hv R de la cadena pesada 1 (H1-HVR) de SEQ ID NO: 120, la H2-HVR de SEQ ID NO: 121, y la H3-HVR de SEQ ID NO: 122; y una región variable de la cadena ligera que comprende la HVR de la cadena ligera 1 (L1-HVR) de SEQ ID NO: 123, la L2-HVR de SEQ ID NO: 124 y la L3-HVR de SEQ ID NO: 125. En otro aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la de SEQ ID NO: 126 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 127. En otro aspecto, el anticuerpo que se une específicamente a CD3 comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 126 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 127.

En un aspecto, el agente terapéutico comprende un anticuerpo multiespecífico, en particular un anticuerpo biespecífico. En un aspecto, el anticuerpo multiespecífico se une específicamente a (i) un antígeno activador de linfocitos T y (ii) un antígeno de linfocito B. Los anticuerpos biespecíficos particulares se describen en la publicación PCT n.° WO 2016/020309 y la publicación PCT n.° W o 2017/055314, así como en la publicación PCT n.° WO 2015/095392).

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se une específicamente a CD3 y CD20. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD20, y un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD3. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un primer resto de unión a antígeno que se une específicamente a c D3, y un segundo y un tercer resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD20. En un aspecto, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento, y el segundo y el primer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab convencional. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende además un dominio Fc. El anticuerpo biespecífico puede tener los formatos de anticuerpo descritos en el presente documento y puede comprender los restos de unión a antígeno descritos en el presente documento. El anticuerpo biespecífico puede comprender modificaciones en la región Fc y/o los restos de unión a antígeno como se describe en el presente documento.

(i) un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y comprende una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38; y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39; y

(ii) un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 y comprende una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 10; y una región variable de la cadena ligera de s Eq ID NO: 11.

En un aspecto particular, el agente terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico que comprende

a) una primera molécula Fab que se une específicamente a un primer antígeno;

b) una segunda molécula Fab que se une específicamente a un segundo antígeno, y en la que los dominios variables VL y VH de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se reemplazan entre sí;

c) una tercera molécula Fab que se une específicamente al primer antígeno; y

d) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable; en el que

(i) el primer antígeno es CD20 y el segundo antígeno es CD3, en particular CD3 épsilon;

(ii) la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) comprenden cada una la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 4, la CDR 2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 5, la CDR 3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 6, la CDR 1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 7, la CDR 2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 8 y la CDR 3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 9, y la segunda molécula Fab en b) comprende la cadena pesada CDR 1 de SEQ ID NO: 32, la CDR 2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 33, la CDR 3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 34, la CDR 1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 35, la CDR 2 de la cadena ligera de Se Q ID NO: 36 y la CDR 3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 37;

(iii) en el dominio constante CL de la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por lisina (K) o arginina (R), en particular por arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat), y en la que en el dominio constante CH1 de la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de

Kabat); y

(iv) la primera molécula Fab en a) se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab en b), y la segunda molécula Fab en b) y la tercera molécula

Fab en c) se fusionan cada una en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc en d).

En un aspecto, la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) comprenden cada una una región

variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ

ID NO: 10, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica

a la secuencia de SEQ ID NO: 11.

En un aspecto, la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) comprenden cada una la secuencia

de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 10, y la secuencia de la región variable de la cadena

ligera de SEQ ID NO: 11.

En un aspecto, la segunda molécula Fab en b) comprende una región variable de la cadena pesada que es al

menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 38, y una región variable de la

cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 39.

Todavía en otro aspecto, la segunda molécula Fab en b) comprende la secuencia de la región variable de la cadena

pesada de SEQ ID NO: 38, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39.

En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico comprende un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %,

97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID No : 44, un polipéptido que es al menos un 95 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 45, un polipéptido que es al menos un 95 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 46, y un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 47. En otro aspecto particular, el anticuerpo biespecífico comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 44, una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 45, una secuencia polipeptídica de SeQ ID NO: 46 y una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 47. (CD20XCD3 bsAB)

(i) un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y comprende una región variable de la cadena

pesada que comprende la HVR de la cadena pesada 1 (Hl-HVR) de SEQ ID NO: 120, la H2-HVR de SEQ ID NO:

121, y la H3-HVR de SEQ ID NO: 122; y una región variable de la cadena ligera que comprende la HVR de la

cadena ligera 1 (Ll-HVR) de SEQ ID NO: 123, la L2-HVR de SEQ ID NO: 124 y la L3-HVR de SEQ ID NO: 125; y

(ii) un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 y comprende una región variable de la cadena

pesada que comprende la HVR de la cadena pesada 1 (Hl-HVR) de SEQ ID NO: 128, la H2-HVR de SEQ ID NO:

129, y la H3-HVR de SEQ ID NO: 130; y una región variable de la cadena ligera que comprende la HVR de la

cadena ligera 1 (Ll-HVR) de SEQ ID NO: 131, la L2-HVR de SEQ ID NO: 132 y la L3-HVR de SEQ ID NO: 133.

pesada de SEQ ID NO: 126; y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 127; y

pesada de SEQ ID NO: 134; y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 135.

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un resto de unión a antígeno que se une específicamente a

CD19, y un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD3. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un primer resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, y un segundo y un tercer resto

de unión a antígeno que se une específicamente a CD19. En un aspecto, el primer resto de unión a antígeno es

una molécula Fab de entrecruzamiento, y el segundo y el primer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab convencional. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende además un dominio Fc. El anticuerpo biespecífico puede comprender modificaciones en la región Fc y/o los restos de unión a antígeno como

se describe en el presente documento.

pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 32, la HCDR2 de SEQ ID NO: 33,

y la HCDR3 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 35, la LCDR2 de SEQ ID NO: 36 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 37; y

(ii) un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD19 y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ iD NO: 48, la HCDR2 de SEQ ID NO: 49, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 50; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 51, la LCDR2 de SEQ ID NO: 52 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 53.

(ii) un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD19 y comprende una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 54; y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 55.

a) una primera molécula Fab que se une específicamente a un primer antígeno;

c) una tercera molécula Fab que se une específicamente al primer antígeno; y

(i) el primer antígeno es CD19 y el segundo antígeno es CD3, en particular CD3 épsilon;

(ii) la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) comprenden cada una la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 48, la CDR 2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 49, la CDR 3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 50, la CDR 1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 51, la CDR 2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 52 y la CDR 3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 53, y la segunda molécula Fab en b) comprende la cadena pesada CDR 1 de SEQ ID NO: 32, la CDR 2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 33, la CDR 3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 34, la CDR 1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 35, la CDR 2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 36 y la CDR 3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 37;

(iii) en el dominio constante CL de la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por lisina (K) o arginina (R), en particular por arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat), y en la que en el dominio constante CH1 de la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); y

(iv) la primera molécula Fab en a) se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab en b), y la segunda molécula Fab en b) y la tercera molécula Fab en c) se fusionan cada una en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc en d).

En un aspecto, la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) comprenden cada una una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 54, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 55.

En un aspecto, la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) comprenden cada una la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 54, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 55.

En un aspecto, la segunda molécula Fab en b) comprende una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 38, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 39.

Todavía en otro aspecto, la segunda molécula Fab en b) comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39.

En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico comprende un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 47, un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 56, un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 57, y un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 58. En otro aspecto particular, el anticuerpo biespecífico comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 47, una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 56, una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 57 y una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 58.

(ii) un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD19 y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ iD NO: 59, la HCDR2 de SEQ ID NO: 60, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 61; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 62, la LCDR2 de SEQ ID NO: 63 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 64.

(ii) un resto de unión a antígeno que se une específicamente a CD19 y comprende una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 65; y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 66.

a) una primera molécula Fab que se une específicamente a un primer antígeno;

c) una tercera molécula Fab que se une específicamente al primer antígeno; y

(ii) la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) comprenden cada una la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 59, la CDR 2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 60, la CDR 3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 61, la CDR 1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 62, la CDR 2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 63 y la CDR 3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 64, y la segunda molécula Fab en b) comprende la cadena pesada CDR 1 de SEQ ID NO: 32, la CDR 2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 33, la CDR 3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 34, la CDR 1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 35, la CDR 2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 36 y la CDR 3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 37;

En un aspecto, la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) comprenden cada una una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 65, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 66.

En un aspecto, la primera molécula Fab en a) y la tercera molécula Fab en c) comprenden cada una la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 65, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 66.

En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico comprende un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID No : 47, un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 148, un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 149, y un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 150. En otro aspecto particular, el anticuerpo biespecífico comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 47, una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 148, una secuencia polipeptídica de s Eq ID NO: 149 y una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 150.

Formatos de anticuerpo

Los componentes de un anticuerpo comprendidos en el agente terapéutico, en particular un anticuerpo multiespecífico, se pueden fusionar entre sí en una variedad de configuraciones. Las configuraciones ejemplares se representan en la figura 6.

En aspectos particulares, los restos de unión a antígeno comprendidos en el anticuerpo son moléculas Fab. En dichos aspectos, el primer, segundo, tercer, etc., resto de unión a antígeno se pueden denominar en el presente documento primera, segunda, tercera, etc., molécula Fab, respectivamente. Además, en aspectos particulares, el anticuerpo comprende un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.

En algunos aspectos, la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc.

En un aspecto de este tipo, la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab. En un aspecto específico de este tipo, el anticuerpo consiste esencialmente en la primera y la segunda molécula Fab, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, y la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. Una configuración de este tipo se representa esquemáticamente en las figuras 6G y 6K. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab y la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En otro aspecto de este tipo, la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En un aspecto específico de este tipo, el anticuerpo consiste esencialmente en la primera y la segunda molécula Fab, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la primera y la segunda molécula Fab se fusionan cada una en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc. Una configuración de este tipo se representa esquemáticamente en las figuras 6A y 6D. La primera y la segunda molécula Fab se pueden fusionar al dominio Fc directamente o a través de un conector peptídico. En un aspecto particular, la primera y la segunda molécula Fab se fusionan cada una al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un aspecto específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG1 humana, en particular donde el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1.

En otros aspectos, la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En un aspecto de este tipo, la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab. En un aspecto específico de este tipo, el anticuerpo consiste esencialmente en la primera y la segunda molécula Fab, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, y la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. Una configuración de este tipo se representa esquemáticamente en las figuras 6H y 6L. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab y la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

Las moléculas Fab se pueden fusionar al dominio Fc o entre sí directamente o a través de un conector peptídico, que comprende uno o más aminoácidos, típicamente, aproximadamente 2-20 aminoácidos.

Los conectores peptídicos son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. Los conectores peptídicos no inmunógenos adecuados incluyen, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n. "n" es en general un número entero de 1 a 10, típicamente de 2 a 4. En un aspecto, dicho conector peptídico tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos, en un aspecto una longitud de 5 a 100, en otro aspecto de 10 a 50 aminoácidos. En un aspecto, dicho conector peptídico es (GxS)n o (GxS)nGm con G=glicina, S=serina, y (x=3, n= 3, 4, 5 o 6, y m=0, 1, 2 o 3) o (x=4, n=2, 3, 4 o 5 y m= 0, 1, 2 o 3), en un aspecto x=4 y n=2 o 3, en otro aspecto x=4 y n=2. En un aspecto, dicho conector peptídico es (G4S)2. Un conector peptídico en particular adecuado para fusionar las cadenas ligeras de Fab de la primera y la segunda molécula Fab entre sí es (G4S)2. Un conector peptídico ejemplar adecuado para conectar las cadenas pesadas de Fab del primer y el segundo fragmentos Fab comprende la secuencia (D)-(G4S)2 (SEQ ID NO 118 y 119). Otro conector adecuado de este tipo comprende la secuencia (G4S)4. Adicionalmente, los conectores pueden comprender (una porción de) una región bisagra de inmunoglobulina. En particular cuando una molécula Fab se fusiona al extremo N de una subunidad del dominio Fc, se puede fusionar por medio de una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de la misma, con o sin un conector peptídico adicional.

Un anticuerpo con un único resto de unión a antígeno (tal como una molécula Fab) que se pude unir específicamente a un antígeno de célula diana (por ejemplo, como se muestra en la figura 6A, D, G, H, K, L) es útil, en particular en casos donde se espera internalización del antígeno de célula diana después de la unión de un resto de unión a antígeno de alta afinidad. En dichos casos, la presencia de más de un resto de unión a antígeno específico para el antígeno de célula diana puede potenciar la internalización del antígeno de célula diana, reduciendo de este modo su disponibilidad.

En muchos otros casos, sin embargo, será ventajoso tener un anticuerpo que comprende dos o más restos de unión a antígeno (tal como moléculas Fab) específicos para un antígeno de célula diana (véanse los ejemplos mostrados en la figura 6B, 6C, 6E, 6F, 6I, 6J. 6M o 6N), por ejemplo, para optimizar la dirección hacia el sitio diana o para permitir la reticulación de los antígenos de células diana.

En consecuencia, en aspectos particulares, el anticuerpo comprende además una tercera molécula Fab que se une específicamente al primer antígeno. Preferentemente el primer antígeno es el antígeno de célula diana. En un aspecto, la tercera molécula Fab es una molécula Fab convencional. En un aspecto, la tercera molécula Fab es idéntica a la primera molécula Fab (es decir, la primera y la tercera molécula Fab comprenden las mismas secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera y tienen la misma disposición de dominios (es decir, convencional o entrecruzado)). En un aspecto particular, la segunda molécula Fab se une específicamente a un antígeno activador de linfocitos T, en particular CD3, y la primera y tercera molécula Fab se une específicamente a un antígeno de célula diana.

En aspectos alternativos, el anticuerpo comprende además una tercera molécula Fab que se une específicamente al segundo antígeno. En estos aspectos, el segundo antígeno preferentemente es el antígeno de célula diana. En un aspecto de este tipo, la tercera molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento (una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CL y CH1 de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí). En un aspecto de este tipo, la tercera molécula Fab es idéntica a la segunda molécula Fab (es decir, la segunda y la tercera molécula Fab comprenden las mismas secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera y tienen la misma disposición de dominios (es decir, convencional o entrecruzado)). En un aspecto de este tipo, la primera molécula Fab se une específicamente a un antígeno activador de linfocitos T, en particular CD3, y la segunda y tercera molécula Fab se une específicamente a un antígeno de célula diana.

En un aspecto, la tercera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc.

En un aspecto particular, la segunda y la tercera molécula Fab se fusionan cada una en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab. En un aspecto específico de este tipo, el anticuerpo consiste esencialmente en la primera, la segunda y la tercera molécula Fab, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, y la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y en la que la tercera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc. Una configuración de este tipo se representa esquemáticamente en la figura 6B y 6E (aspectos particulares, en los que la tercera molécula Fab es una molécula Fab convencional y preferentemente idéntica a la primera molécula Fab), y la figura 6I y 6M (aspectos alternativos, en los que la tercera molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento y preferentemente idéntica a la segunda molécula Fab). La segunda y la tercera molécula Fab se pueden fusionar al dominio Fc directamente o a través de un conector peptídico. En un aspecto particular, la segunda y la tercera molécula Fab se fusionan cada una al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un aspecto específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG1 humana, en particular donde el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab y la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En otro aspecto, la primera y la tercera molécula Fab se fusionan cada una en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab. En un aspecto específico de este tipo, el anticuerpo consiste esencialmente en la primera, la segunda y la tercera molécula Fab, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, y la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y en la que la tercera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc. Una configuración de este tipo se representa esquemáticamente en la figura 6C y 6F (aspectos particulares, en los que la tercera molécula Fab es una molécula Fab convencional y preferentemente idéntica a la primera molécula Fab), y la figura 6J y 6N (aspectos alternativos, en los que la tercera molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento y preferentemente idéntica a la segunda molécula Fab). La primera y la tercera molécula Fab se pueden fusionar al dominio Fc directamente o a través de un conector peptídico. En un aspecto particular, la primera y la tercera molécula Fab se fusionan cada una al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un aspecto específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG1 humana, en particular donde el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab y la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En configuraciones del anticuerpo en las que una molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de cada una de las subunidades del dominio Fc a través de regiones bisagra de inmunoglobulina, las dos moléculas Fab, las regiones bisagra y el dominio Fc forman esencialmente una molécula de inmunoglobulina. En un aspecto particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un aspecto incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG1. En otro aspecto, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la subclase IgG4. En otro aspecto particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros aspectos, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada.

En algunos de los anticuerpos, la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab y la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico. Dependiendo de la configuración de la primera y la segunda molécula Fab, la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab se puede fusionar en su extremo C al extremo N de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab, o la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab se puede fusionar en su extremo C al extremo N de la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab. La fusión de las cadenas ligeras de Fab de la primera y la segunda molécula Fab reduce además el emparejamiento incorrecto de cadenas pesada y ligera de Fab no coincidentes, y además reduce el número de plásmidos necesarios para la expresión de algunos de los anticuerpos.

En determinados aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)), y un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)). En determinados aspectos, los polipéptidos se unen covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En determinados aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4)), y un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)). En determinados aspectos, los polipéptidos se unen covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En algunos aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). En otros aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)).

En algunos de estos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido de cadena ligera de Fab de entrecruzamiento de la segunda molécula Fab, en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)), y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)). En otros de estos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1)), o un polipéptido en el que el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2)), según sea apropiado.

El anticuerpo de acuerdo con estos aspectos puede comprender además (i) un polipéptido de subunidad del dominio Fc (CH2-CH3(-CH4)), o (ii) un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (VL(3)-CL(3)). En determinados aspectos, los polipéptidos se unen covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En algunos aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). En otros aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4)).

En algunos de estos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido de cadena ligera de Fab de entrecruzamiento de la segunda molécula Fab, en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)), y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)). En otros de estos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(2)-CH1(2)-VL(1)CL(i)), o un polipéptido en el que el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2)), según sea apropiado.

En algunos aspectos, la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab. En determinados aspectos de este tipo, el anticuerpo no comprende un dominio Fc. En determinados aspectos, el anticuerpo consiste esencialmente en la primera y la segunda molécula Fab, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab. Una configuración de este tipo se representa esquemáticamente en las figuras 6O y 6S.

En otros aspectos, la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab. En determinados aspectos de este tipo, el anticuerpo no comprende un dominio Fc. En determinados aspectos, el anticuerpo consiste esencialmente en la primera y la segunda molécula Fab, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab. Una configuración de este tipo se representa esquemáticamente en las figuras 6P y 6T.

En algunos aspectos, la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, y el anticuerpo comprende además una tercera molécula Fab, en la que dicha tercera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab. En dichos aspectos particulares, dicha tercera molécula Fab es una molécula Fab convencional. En otros aspectos de este tipo, dicha tercera molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CL y CH1 de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En determinados aspectos de este tipo, el anticuerpo consiste esencialmente en la primera, la segunda y la tercera molécula Fab, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, y la tercera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab. Una configuración de este tipo se representa esquemáticamente en la figura 6Q y 6U (aspectos particulares, en los que la tercera molécula Fab es una molécula Fab convencional y preferentemente idéntica a la primera molécula Fab).

En algunos aspectos, la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, y el anticuerpo comprende además una tercera molécula Fab, en la que dicha tercera molécula Fab se fusiona en el extremo N de la cadena pesada de Fab al extremo C de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab. En dichos aspectos particulares, dicha tercera molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En otros aspectos de este tipo, dicha tercera molécula Fab es una molécula Fab convencional. En determinados aspectos de este tipo, el anticuerpo consiste esencialmente en la primera, la segunda y la tercera molécula Fab, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, y la tercera molécula Fab se fusiona en el extremo N de la cadena pesada de Fab al extremo C de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab. Una configuración de este tipo se representa esquemáticamente en la figura 6W y 6Y (aspectos particulares, en los que la tercera molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento y preferentemente idéntica a la segunda molécula Fab).

En algunos aspectos, la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, y el anticuerpo comprende además una tercera molécula Fab, en la que dicha tercera molécula Fab se fusiona en el extremo N de la cadena pesada de Fab al extremo C de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab. En dichos aspectos particulares, dicha tercera molécula Fab es una molécula Fab convencional. En otros aspectos de este tipo, dicha tercera molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En determinados aspectos de este tipo, el anticuerpo consiste esencialmente en la primera, la segunda y la tercera molécula Fab, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, y la tercera molécula Fab se fusiona en el extremo N de la cadena pesada de Fab al extremo C de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab. Una configuración de este tipo se representa esquemáticamente en la figura 6R y 6V (aspectos particulares, en los que la tercera molécula Fab es una molécula Fab convencional y preferentemente idéntica a la primera molécula Fab).

En algunos aspectos, la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, y el anticuerpo comprende además una tercera molécula Fab, en la que dicha tercera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab. En dichos aspectos particulares, dicha tercera molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En otros aspectos de este tipo, dicha tercera molécula Fab es una molécula Fab convencional. En determinados aspectos de este tipo, el anticuerpo consiste esencialmente en la primera, la segunda y la tercera molécula Fab, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, y la tercera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab. Una configuración de este tipo se representa esquemáticamente en la figura 6X y 6Z (aspectos particulares, en los que la tercera molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento y preferentemente idéntica a la primera molécula Fab).

En determinados aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera) (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)).

En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)).

En determinados aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab (VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)).

En determinados aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera) (VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además el polipéptido de cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (v L(3)-CL(3)).

En determinados aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera) (VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además el polipéptido de cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (VL(3)-CL(3)).

En determinados aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además el polipéptido de cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (VL(3)-CL(3)).

En determinados aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab (VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además el polipéptido de cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (v L(3)-CL(3)).

En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab (es decir, la tercera molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera) (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CL(1)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (VH(3)-CL(3)).

En determinados aspectos de la divulgación, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (es decir, la tercera molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera) (VH(1)CH1(i)-VH(2)-CL(2)-VH(3)-CL(3)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(i)-CL(i)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab (VL(3)-CH1(3)).

En determinados aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab (es decir, la tercera molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab (VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(i)-CH1(i)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(2)-CL(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(i)-CL(i)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (VH(3)-CL(3)).

En determinados aspectos, el anticuerpo comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (es decir, la tercera molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab (VH(3)-CL(3)-VH(2)-CL(2)-VH(i)-CH1(i)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(i)-CL(i)). En algunos aspectos, el anticuerpo comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab (VL(3)-CH1(3)).

De acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores, los componentes del anticuerpo (por ejemplo, moléculas Fab, dominio Fc) se pueden fusionar directamente o a través de diversos conectores, en particular conectores peptídicos que comprenden uno o más aminoácidos, típicamente, aproximadamente 2-20 aminoácidos, que se describen en el presente documento o son conocidos en la técnica. De forma adecuada, los conectores peptídicos no inmunógenos incluyen, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n, en los que n en general es un número entero de 1 a 10, típicamente de 2 a 4.

Dominio Fc

Un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un inmunoconjugado, comprendido en el agente terapéutico puede comprender un dominio Fc que consiste en un par de cadenas polipeptídicas que comprenden dominios de cadena pesada de una molécula de anticuerpo. Por ejemplo, el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) es un dímero, del que cada unidad comprende los dominios constantes de la cadena pesada de IgG CH2 y CH3. Las dos subunidades del dominio Fc pueden tener asociación estable entre sí.

En un aspecto, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG. En un aspecto particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgGi. En otro aspecto, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un aspecto más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución aminoacídica en la posición S228 (numeración de Kabat), en particular la sustitución aminoacídica S228P. Esta sustitución aminoacídica reduce el intercambio en el brazo Fab in vivo de los anticuerpos IgG4 (véase Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). En otro aspecto particular, el dominio Fc es humano. Una secuencia ejemplar de una región Fc de IgGi humana se da en SEQ ID NO: 30.

(i) Modificaciones en el dominio Fc que promueven la heterodimerización

Los anticuerpos, en particular anticuerpos biespecíficos o inmunoconjugados, comprendidos en el agente terapéutico pueden comprender diferentes componentes (por ejemplo, dominios de unión a antígeno, citocinas) fusionados a una o a la otra de las dos subunidades del dominio Fc, por tanto las dos subunidades del dominio Fc están comprendidas típicamente en dos cadenas polipeptídicas no idénticas. La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de dichos anticuerpos en la producción recombinante, será ventajoso por tanto introducir en el dominio Fc del anticuerpo una modificación que promueva la asociación de los polipéptidos deseados.

En consecuencia, en aspectos particulares el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana es en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, en un aspecto, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.

Existen varios enfoques para las modificaciones en el dominio CH3 del dominio Fc para garantizar la heterodimerización, que se describen bien por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, Wo 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Típicamente, en todos de dichos enfoques, el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se genomanipulan ambos de manera complementaria de modo que cada dominio CH3 (o la cadena pesada que lo comprende) ya no se puede homodimerizar consigo mismo sino que se fuerza a heterodimerizarse con el otro dominio CH3 genomanipulado de complementariedad (de modo que el primer y segundo dominio CH3 se heterodimerizan y no se forman homodímeros entre los dos primeros o los dos segundos dominios CH3). Estos diferentes enfoques para una mejora en la heterodimerización de la cadena pesada se contemplan como diferentes alternativas en combinación con las modificaciones de la cadena pesada-ligera (por ejemplo, intercambio/reemplazo de la región variable o constante en brazos Fab, o introducción de sustituciones de aminoácidos cargados con cargas opuestas en la interfase CH1/CL) lo que reduce el emparejamiento incorrecto de la cadena ligera y los productos secundarios de tipo Bence Jones.

En un aspecto específico, dicha modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc es una modificación denominada "botón en ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc.

La tecnología de botón en ojal se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).

En consecuencia, en un aspecto particular, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que es posicionable en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza con un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad es posicionable.

Preferentemente, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande se selecciona del grupo que consiste en arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W).

Preferentemente dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona del grupo que consiste en alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V).

La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica.

En un aspecto específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc (la subunidad "botones") el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza con un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc (la subunidad "ojal") el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza con un residuo de valina (Y407V). En un aspecto, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza con un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza con un residuo de alanina (L368A) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Aún en otro aspecto, en la primera subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza con un residuo de cisteína (S354C) o el residuo de ácido glutámico en la posición 356 se reemplaza con un residuo de cisteína (E356C), y en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteína (Y349C) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, estabilizando adicionalmente el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

En un aspecto particular, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W, y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A y Y407V (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto particular, el polipéptido de IL-2 mutante en el inmunoconjugado descrito en el presente documento, o el resto de unión a antígeno CD3 en el anticuerpo biespecífico descrito en el presente documento, se fusiona a la primera subunidad del dominio Fc (que comprende la modificación de "botón"). Sin quedar vinculado a ninguna teoría, la fusión del polipéptido de IL-2 o resto de unión a antígeno CD3 a la subunidad que contiene el botón del dominio Fc minimizará (además) la generación de inmunoconjugados que comprenden dos polipéptidos de IL-2 o anticuerpos biespecíficos que comprenden dos dominios de unión a c D3, respectivamente (impedimento estérico de dos polipéptidos que contienen botón).

Otras técnicas de modificación de CH3 para garantizar la heterodimerización se contemplan como alternativas en el presente documento y se describen por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

En un aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento EP 1870459 A1, se usa de forma alternativa. Este enfoque se basa en la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase CH3/dominio CH3 entre las dos subunidades del dominio Fc. Un aspecto preferente son las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en uno de los dos dominios CH3 (del dominio Fc) y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el otro de los dominios CH3 del dominio Fc (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro aspecto, el anticuerpo comprende la mutación aminoacídica T366W en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, y adicionalmente las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro aspecto, el anticuerpo comprende las mutaciones aminoacídicas S354C, T366W en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, o el anticuerpo comprende las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366W en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas S354C, T366S, L368A, Y407V en los dominios CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc y adicionalmente las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc (todas las numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2013/157953 se usa de forma alternativa. En un aspecto, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366K y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica L351D (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro aspecto, el primer dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica L351K. En otro aspecto, el segundo dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica seleccionada de Y349E, Y349D y L368E (preferentemente L368E) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2012/058768 se usa de forma alternativa. En un aspecto, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y un segundo dominio c H3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366A, K409F. En otro aspecto, el segundo dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica en la posición T411, D399, S400, F405, N390 o K392, por ejemplo, seleccionada de a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W, b) D399R, D399W, D399Y o D399K, c) S400E, S400D, S400R o S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W, e) N390R, N390K o N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro aspecto, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366V, K409F. En otro aspecto, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366a , K409F. En otro aspecto, el segundo dominio CH3 comprende además las mutaciones aminoacídicas K392E, T411E, D399R y S400R (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2011/143545 se usa de forma alternativa, por ejemplo, con la modificación aminoacídica en una posición seleccionada del grupo que consiste en 368 y 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2011/090762, que también usa la tecnología de botones en ojales descrita anteriormente, se usa de forma alternativa. En un aspecto, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366W y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407a . En un aspecto, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366Y y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407T (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el anticuerpo o su dominio Fc es de la subclase IgG2 y de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2010/129304.

En un aspecto alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable pero la heterodimerización electrostáticamente favorable. En un aspecto de este tipo, un primer dominio CH3 comprende la sustitución aminoacídica de K392 o N392 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D), preferentemente K392D o N392D) y un segundo dominio CH3 comprende la sustitución aminoacídica de D399, E356, D356 o E357 con un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, lisina (K) o arginina (R), preferentemente D399K, E356K, D356K o E357K, y más preferentemente D399K y E356K). En otro aspecto, el primer dominio CH3 comprende además la sustitución aminoacídica de K409 o R409 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D), preferentemente K409D o R409D). En otro aspecto, el primer dominio CH3 comprende además o de forma alternativa la sustitución aminoacídica de K439 y/o K370 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D)) (todas las numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Aún en otro aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2007/147901 se usa de forma alternativa. En un aspecto, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas K253E, D282K y K322D y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas D239K, E240K y K292D (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Todavía en otro aspecto, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2007/110205 se puede usar de forma alternativa.

En un aspecto, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas K392D y K409D, y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas D356K y D399K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

(ii) Modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión al receptor de Fc y/o la función efectora

El dominio Fc confiere a un anticuerpo, tal como un anticuerpo biespecífico o inmunoconjugado, propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una semivida en suero prolongada lo que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y una proporción de distribución tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a dirigir de forma indeseable el anticuerpo a células que expresan receptores de Fc en lugar de a las células que portan antígenos preferentes. Además, la coactivación de las vías de señalización del receptor de Fc puede dar lugar a la liberación de citocinas que, en combinación con otras propiedades inmunoestimuladoras que puede tener el anticuerpo y la semivida prolongada del anticuerpo, da como resultado una activación excesiva de los receptores de citocina y efectos secundarios graves tras la administración sistémica.

En consecuencia, en aspectos particulares, el dominio Fc del anticuerpo, en particular anticuerpo biespecífico o inmunoconjugado, comprendido en el agente terapéutico presenta una reducción en la afinidad de unión por un receptor de Fc y/o una reducción en la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. En un aspecto de este tipo, el dominio Fc (o la molécula, por ejemplo, anticuerpo, que comprende dicho dominio Fc) presenta menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o una molécula correspondiente que comprende un dominio Fc de IgG1 natural), y/o menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgGi natural (o una molécula correspondiente que comprende un dominio Fc de IgG1 natural). En un aspecto, el dominio Fc (o la molécula, por ejemplo, el anticuerpo, que comprende dicho dominio Fc) no se une sustancialmente a un receptor de Fc y/o induce la función efectora. En un aspecto particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRi o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. En un aspecto, la función efectora es una o más seleccionada del grupo de CDC, ADCC, ADCP y secreción de citocinas. En un aspecto particular, la función efectora es ADCC. En un aspecto, el dominio Fc presenta una afinidad de unión sustancialmente similar por el receptor de Fc neonatal (FcRn), en comparación con un dominio Fc de IgGi natural. Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn cuando el dominio Fc (o la molécula, por ejemplo, el anticuerpo, que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 %, en particular más de aproximadamente un 80 %, más en particular más de aproximadamente un 90 % de la afinidad de unión de un dominio Fc de IgGi natural (o la molécula correspondiente que comprende un dominio Fc de IgGi natural) por FcRn.

En determinados aspectos, el dominio Fc se genomanipula para tener una reducción en la afinidad de unión por Fc y/o reducción en la función efectora, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En aspectos particulares, el dominio Fc comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora. Típicamente, la misma una o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En un aspecto, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc. En un aspecto, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces, o al menos 10 veces. En aspectos donde existe más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por el receptor de Fc, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad de unión del dominio Fc por el receptor de Fc en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un aspecto, la molécula, por ejemplo, el anticuerpo, que comprende un dominio Fc manipulado presenta menos de un 20 %, en particular menos de un 10 %, más en particular menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc en comparación con una molécula correspondiente que comprende un dominio Fc no genomanipulado. En un aspecto particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En algunos aspectos, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En algunos aspectos, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos aspectos, también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un aspecto, no se reduce la afinidad de unión por el receptor de Fc neonatal (FcRn). La unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión del dominio Fc por dicho receptor, se logra cuando el dominio Fc (o la molécula, por ejemplo, el anticuerpo, que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o una molécula correspondiente que comprende dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) por FcRn. El dominio Fc, o molécula (por ejemplo, anticuerpo) que comprende dicho dominio Fc, puede presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En determinados aspectos, el dominio Fc se genomanipula para tener una reducción en la función efectora, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La reducción en la función efectora puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes: reducción en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), reducción en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), reducción en la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), reducción en la secreción de citocinas, reducción en la captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos, reducción en la unión a linfocitos NK, reducción en la unión a macrófagos, reducción en la unión a monocitos, reducción en la unión a células polimorfonucleares, reducción en la señalización directa que induce apoptosis, reducción en la reticulación de anticuerpos unidos a diana, reducción en la maduración de células dendríticas o reducción en la activación de linfocitos T. En un aspecto, la reducción en la función efectora es una o más seleccionadas del grupo de reducción en la CDC, reducción en la ADCC, reducción en la ADCP y reducción en la secreción de citocinas. En un aspecto particular, la reducción en la función efectora es una reducción en la ADCC. En un aspecto, la reducción en la ADCC es menos de un 20 % de la ADCC inducida por un dominio Fc no genomanipulado (o una molécula correspondiente que comprende un dominio Fc no genomanipulado).

En un aspecto, la mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora es una sustitución aminoacídica. En un aspecto, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de E233, L234, L235, N297, P331 y P329 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un aspecto más específico, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de L234, L235 y P329 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En algunos aspectos, el dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A y L235A (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un aspecto de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. En un aspecto, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329. En un aspecto más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular P329G (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un aspecto, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 y otra sustitución aminoacídica en una posición seleccionada de E233, L234, L235, N297 y P331 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un aspecto más específico, la otra sustitución aminoacídica es E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En aspectos particulares, el dominio Fc comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones P329, L234 y L235 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En aspectos más particulares, el dominio Fc comprende las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G ("P329G LALA"). En un aspecto de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. La combinación "P329G LALA" de sustituciones aminoacídicas anula casi por completo la unión al receptor de Fcy (así como al complemento) de un dominio Fc de IgGi humana, como se describe en la publicación PCT n.° WO 2012/130831. El documento WO 2012/130831 también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como unión al receptor de Fc o funciones efectoras.

Los anticuerpos IgG4 presentan una reducción en la afinidad de unión por receptores de Fc y reducción en las funciones efectoras en comparación con anticuerpos IgG1. Por tanto, en algunos aspectos, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4, en particular un dominio Fc de IgG4 humano. En un aspecto, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en la posición S228, específicamente la sustitución aminoacídica S228P (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). Para reducir además su afinidad de unión por un receptor de Fc y/o su función efectora, en un aspecto, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición L235, específicamente la sustitución aminoacídica L235E (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro aspecto, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329, específicamente la sustitución aminoacídica P329G (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un aspecto particular, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones S228, L235 y P329, específicamente las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y P329G (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). Dichos mutantes de dominio Fc de IgG4 y sus propiedades de unión al receptor de Fcy se describen en la publicación PCT n.° WO 2012/130831.

En un aspecto particular, el dominio Fc que presenta una reducción en la afinidad de unión por un receptor de Fc y/o reducción en la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural, es un dominio Fc de IgG1 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y opcionalmente P329G, o un dominio Fc de IgG4 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y opcionalmente P329G (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En determinados aspectos, se ha eliminado la N-glucosilación del dominio Fc. En un aspecto de este tipo, el dominio Fc comprende una mutación aminoacídica en la posición N297, en particular una sustitución aminoacídica que reemplaza asparagina por alanina (N297A) o ácido aspártico (N297D) o glicina (N297G) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Además de los dominios Fc descritos anteriormente en el presente documento y en la publicación PCT n.° WO 2012/130831, los dominios Fc con una reducción en la unión al receptor de Fc y/o función efectora también incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de dominio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se pueden preparar dominios Fc mutantes por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios nucleotídicos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.

La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de dominios Fc o moléculas que comprenden un dominio Fc para los receptores de Fc usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK humanos que expresan el receptor Fcyllla.

La función efectora de un dominio Fc, o una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que comprende un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA83, 7059 7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA82, 1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véanse, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo a Ct I™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar la actividad de ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA95, 652-656 (1998).

En algunos aspectos, se reduce la unión del dominio Fc a un componente de complemento, específicamente a C1q. En consecuencia, en algunos aspectos en los que se genomanipula el dominio Fc para que tenga una reducción en la función efectora, dicha reducción en la función efectora incluye reducción en la CDC. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si el dominio Fc, o molécula (por ejemplo, anticuerpo) que comprende el dominio Fc, se puede unir a C1q y por tanto tiene actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

Restos de unión a antígeno

El anticuerpo comprendido en el agente terapéutico puede ser específico, es decir, comprende al menos dos restos de unión a antígeno que se pueden unir específicamente a dos determinantes antigénicos distintos. De acuerdo con aspectos particulares, los restos de unión a antígeno son moléculas Fab (es decir, dominio de unión a antígeno compuestos de una cadena pesada y una ligera, comprendiendo cada una un dominio variable y uno constante). En un aspecto, dichas moléculas Fab son humanas. En otro aspecto, dichas moléculas Fab son humanizadas. Aún en otro aspecto, dichas moléculas Fab comprenden dominios constantes de la cadena pesada y ligera.

En algunos aspectos, al menos uno de los restos de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento. Dicha modificación reduce el emparejamiento incorrecto de las cadenas pesada y ligera a partir de diferentes moléculas Fab, mejorando de este modo el rendimiento y la pureza del anticuerpo en la producción recombinante. En una molécula Fab de entrecruzamiento particular útil para el anticuerpo, se intercambian los dominios variables de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab (Vl y VH, respectivamente). Sin embargo, incluso con este intercambio de dominios, la preparación del anticuerpo puede comprender determinados productos secundarios debido a la llamada interacción de tipo Bence Jones entre las cadenas pesada y ligera con emparejamiento incorrecto (véase Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191). Para reducir además el emparejamiento incorrecto de las cadenas pesada y ligera de diferentes moléculas Fab y por tanto incrementar la pureza y el rendimiento del anticuerpo deseado, se pueden introducir aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en los dominios CH1 y CL de la(s) molécula(s) Fab que se une(n) específicamente a un antígeno de célula diana, o bien la molécula Fab que se une específicamente a un antígeno activador de linfocitos T. Las modificaciones de carga se realizan en la(s) molécula(s) Fab convencional(es) comprendida(s) en el anticuerpo (tal como se muestra, por ejemplo, en las figuras 6 A-C, G-J), o bien en la(s) molécula(s) Fab de entrecruzamiento comprendida(s) en el anticuerpo (tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 6 D-F, K-N) (pero no en ambas). En aspectos particulares, las modificaciones de carga se realizan en la(s) molécula(s) Fab convencional(es) comprendida(s) en el anticuerpo (que en aspectos particulares se une(n) específicamente al antígeno de célula diana).

En un aspecto particular en el presente documento, el anticuerpo se puede unir simultáneamente a un antígeno de célula diana, en particular un antígeno de célula tumoral, y un antígeno activador de linfocitos T, en particular CD3. En un aspecto, el anticuerpo puede reticular un linfocito T y una célula diana por unión simultánea a un antígeno de célula diana y un antígeno activador de linfocitos T. En un aspecto incluso más particular, dicha unión simultánea da como resultado la lisis de la célula diana, en particular una célula tumoral. En un aspecto, dicha unión simultánea da como resultado la activación del linfocito T. En otros aspectos, dicha unión simultánea da como resultado una respuesta celular de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, seleccionada del grupo de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. En un aspecto, la unión del anticuerpo al antígeno activador de linfocitos T, en particular CD3, sin unión simultánea al antígeno de célula diana no dan como resultado activación de linfocitos T.

En un aspecto, el anticuerpo puede redirigir la actividad citotóxica de un linfocito T hacia una célula diana. En un aspecto particular, dicho redireccionamiento es independiente de la presentación de antígenos peptídicos mediada por MHC por la célula diana y/o la especificidad del linfocito T.

En particular, un linfocito T de acuerdo con cualquiera de los aspectos descritos en el presente documento es un linfocito T citotóxico. En algunos aspectos, el linfocito T es un linfocito T CD4+ o CD8+, en particular un linfocito T CD8+.

(i) Resto de unión a antígeno activador de linfocitos T

En algunos aspectos, un anticuerpo comprendido en el agente terapéutico, en particular un anticuerpo biespecífico, comprende al menos un resto de unión a antígeno, en particular una molécula Fab, que se une específicamente a un antígeno activador de linfocitos T (también denominado en el presente documento "resto de unión a antígeno activador de linfocitos T o molécula Fab de unión a antígeno activador de linfocitos T"). En un aspecto particular, el anticuerpo comprende no más de un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T. En un aspecto, el anticuerpo proporciona unión monovalente al antígeno activador de linfocitos T.

En aspectos particulares, el resto de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno activador de linfocitos T es una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En dichos aspectos, el/los resto(s) de unión a antígeno que se une(n) específicamente a un antígeno de célula diana es/son preferentemente una molécula Fab convencional. En aspectos donde existe más de un resto de unión a antígeno, en particular una molécula Fab, que se une específicamente a un antígeno de célula diana comprendido en el anticuerpo, el resto de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno activador de linfocitos T preferentemente es una molécula Fab de entrecruzamiento y los restos de unión a antígeno que se unen específicamente a un antígeno de célula diana son moléculas Fab convencionales.

En aspectos alternativos, el resto de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno activador de linfocitos T es una molécula Fab convencional. En dichos aspectos, el/los resto(s) de unión a antígeno que se une(n) específicamente a un antígeno de célula diana es/son una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí.

En un aspecto, el antígeno activador de linfocitos T se selecciona del grupo que consiste en CD3, CD28, CD137 (también conocido como 4-1BB), CD40, CD226, OX40, GITR, CD27, HVEM y CD127.

En un aspecto particular, el antígeno activador de linfocitos T es CD3, en particular CD3 humano (SEQ ID NO: 115) o c D3 de macaco cangrejero (SEQ ID NO: 116), lo más en particular CD3 humano. En un aspecto particular, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T es reactivo de forma cruzada para (es decir, se une específicamente a) CD3 humano y de macaco cangrejero. En algunos aspectos, el antígeno activador de linfocitos T es la subunidad épsilon de CD3 (CD3 épsilon).

En algunos aspectos, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T se une específicamente a CD3, en particular CD3 épsilon, y comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 y al menos una CDR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37.

En un aspecto el resto de unión a antígeno de unión a CD3, en particular molécula Fab, comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR1 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 32, la CDR2 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 33, la CDR3 de la cadena pesada de SEQ ID NO: 34, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR1 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 35, la CDR2 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 36, y la c Dr 3 de la cadena ligera de SEQ ID NO: 37.

En un aspecto, el resto de unión a antígeno de unión a CD3, en particular la molécula Fab, comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 38 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 39.

En un aspecto el resto de unión a antígeno de unión a CD3, en particular molécula Fab, comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.

En un aspecto el resto de unión a antígeno de unión a CD3, en particular molécula Fab, comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39.

En algunos aspectos, el resto de unión a antígeno activador de linfocitos T se une específicamente a CD3, en particular CD3 épsilon, y comprende al menos una HVR de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 120, s Eq ID NO: 121 y SEQ ID NO: 122 y al menos una HVR de la cadena ligera seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125.

En un aspecto el resto de unión a antígeno de unión a CD3, en particular molécula Fab, comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la HVR de la cadena pesada 1 (H1-HVR) de SEQ ID NO: 120, la H2-HVR de SEQ ID NO: 121, y la H3-HVR de SEQ ID NO: 122; y una región variable de la cadena ligera que comprende la HVR de la cadena ligera 1 (L1-HVR) de SEQ ID NO: 123, la L2-HVR de SEQ ID NO: 124 y la L3HVR de SEQ ID NO: 125.

En un aspecto, el resto de unión a antígeno de unión a CD3, en particular la molécula Fab, comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 126 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 127.

En un aspecto el resto de unión a antígeno de unión a CD3, en particular molécula Fab, comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127.

En un aspecto el resto de unión a antígeno de unión a CD3, en particular molécula Fab, comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 126 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 127.

(ii) Resto de unión a antígeno de célula diana

En algunos aspectos, un anticuerpo comprendido en el agente terapéutico, en particular un anticuerpo biespecífico, comprende al menos un resto de unión a antígeno, en particular una molécula Fab, que se une específicamente a un antígeno de célula diana. En determinados aspectos, el anticuerpo comprende dos restos de unión a antígeno, en particular moléculas Fab, que se unen específicamente a un antígeno de célula diana. En un aspecto particular de este tipo, cada uno de estos restos de unión a antígeno se une específicamente al mismo determinante antigénico. En un aspecto incluso más particular, todos estos restos de unión a antígeno son idénticos, es decir, comprenden las mismas secuencias de aminoácidos incluyendo las mismas sustituciones aminoacídicas en el dominio CH1 y CL como se describe en el presente documento (si hay). En un aspecto, el anticuerpo comprende una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno de célula diana. En un aspecto, el anticuerpo comprende no más de dos restos de unión a antígeno, en particular moléculas Fab, que se unen específicamente a un antígeno de célula diana.

En aspectos particulares, el/los resto(s) de unión a antígeno que se une(n) específicamente a un antígeno de célula diana es/son una molécula Fab convencional. En dichos aspectos, el/los resto(s) de unión a antígeno que se une(n) específicamente a un antígeno activador de linfocitos T es/son una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí.

En aspectos alternativos, el/los resto(s) de unión a antígeno que se une(n) específicamente a un antígeno de célula diana es/son una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En dichos aspectos, el/los resto(s) de unión a antígeno que se une(n) específicamente a un antígeno activador de linfocitos T es/son una molécula Fab convencional.

El resto de unión a antígeno de célula diana puede dirigir el anticuerpo a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral que expresa el antígeno de célula diana.

En un aspecto, el antígeno de célula diana es CEA, en particular CEA humano.

En un aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CEA comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1 de SEQ ID NO: 14, la CDR de la cadena pesada 2 de SEQ ID NO: 15, y la CDR de la cadena pesada 3 de SEQ ID NO: 16, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera 1 de SEQ ID NO: 17, la c Dr de la cadena ligera 2 de SEQ ID NO: 18 y la CDR de la cadena ligera 3 de SEQ ID NO: 19. En otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CEA comprende una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 20, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 21. Todavía en otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CEA comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 21.

En un aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CEA comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1 de SEQ ID NO: 136, la CDR de la cadena pesada 2 de SEQ ID NO: 137, y la CDR de la cadena pesada 3 de SEQ ID NO: 138, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera 1 de SEQ ID NO: 139, la c Dr de la cadena ligera 2 de SEQ ID NO: 140 y la CDR de la cadena ligera 3 de SEQ ID NO: 141. En otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CEA comprende una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 142, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 143. Todavía en otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CEA comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 143.

En un aspecto, el antígeno de célula diana es un antígeno de linfocito B, en particular un antígeno de linfocito B maligno. En un aspecto, el antígeno de célula diana es un antígeno de superficie celular. En un aspecto, el antígeno de célula diana se selecciona del grupo que consiste en CD20, CD19, CD22, ROR-1, CD37 y c D5.

En un aspecto, el antígeno de célula diana es CD20, en particular CD20 humano.

En un aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CD20 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1 de SEQ ID NO: 4, la CDR de la cadena pesada 2 de SEQ ID NO: 5, y la CDR de la cadena pesada 3 de SEQ ID NO: 6, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera 1 de SEQ ID NO: 7, la CDR de la cadena ligera 2 de SEQ ID NO: 8 y la CDR de la cadena ligera 3 de SEQ ID NO: 9. En otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CD20 comprende una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 10, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 11. Todavía en otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CD20 comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 10, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 11.

En un aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CD20 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la HVR de la cadena pesada 1 (H1-HVR) de SEQ ID NO: 128, la H2-HVR de SEQ ID NO: 129, y la H3-HVR de SEQ ID NO: 130; y una región variable de la cadena ligera que comprende la HVR de la cadena ligera 1 (L1-HVR) de SEQ ID NO: 131, la L2-HVR de SEQ ID NO: 132 y la L3-HVR de SEQ ID NO: 133. En otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CD20 comprende una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 134, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 135. Todavía en otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CD20 comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 135.

En un aspecto, el antígeno de célula diana es CD19, en particular CD19 humano.

En un aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CD19 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1 de SEQ ID NO: 48, la CDR de la cadena pesada 2 de SEQ ID NO: 49, y la CDR de la cadena pesada 3 de SEQ ID NO: 50, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera 1 de SEQ ID NO: 51, la c Dr de la cadena ligera 2 de SEQ ID NO: 52 y la CDR de la cadena ligera 3 de SEQ ID NO: 53. En otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CD19 comprende una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 54, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 55. Todavía en otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CD19 comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 54, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 55.

En otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CD19 comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1 de SEQ ID NO: 59, la CDR de la cadena pesada 2 de SEQ ID NO: 60, y la CDR de la cadena pesada 3 de SEQ ID NO: 61, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera 1 de SEQ ID NO: 62, la CDR de la cadena ligera 2 de SEQ ID NO: 63 y la CDR de la cadena ligera 3 de SEQ ID NO: 64. En otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CD19 comprende una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 65, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 66. Todavía en otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une específicamente a CD19 comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 65, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 66.

En otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular la molécula Fab, que se une específicamente a CD19 comprende

(i) una región variable de la cadena pesada que comprende la región determinante de la complementariedad (Cd R) de la cadena pesada 1 de SEQ ID NO: 67, la CDR de la cadena pesada 2 de SEQ ID NO: 68, y la CDR de la cadena pesada 3 de SEQ ID NO: 69, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera 1 de SEQ ID NO: 70, la CDR de la cadena ligera 2 de SEQ ID NO: 71 y la CDR de la cadena ligera 3 de SEQ ID NO: 72;

(ii) una región variable de la cadena pesada que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1 de SEQ ID NO: 75, la CDR de la cadena pesada 2 de SEQ ID NO: 76, y la CDR de la cadena pesada 3 de SEQ ID NO: 77, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera 1 de SEQ ID NO: 78, la CDR de la cadena ligera 2 de SEQ ID NO: 79 y la CDR de la cadena ligera 3 de SEQ ID NO: 80;

(iii) una región variable de la cadena pesada que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1 de SEQ ID NO: 83, la CDR de la cadena pesada 2 de SEQ ID NO: 84, y la CDR de la cadena pesada 3 de SEQ ID NO: 85, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera 1 de SEQ ID NO: 86, la CDR de la cadena ligera 2 de SEQ ID NO: 87 y la CDR de la cadena ligera 3 de SEQ ID NO: 88;

(iv) una región variable de la cadena pesada que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1 de SEQ ID NO: 91, la CDR de la cadena pesada 2 de SEQ ID NO: 92, y la CDR de la cadena pesada 3 de SEQ ID NO: 93, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera 1 de SEQ ID NO: 94, la CDR de la cadena ligera 2 de SEQ ID NO: 95 y la CDR de la cadena ligera 3 de SEQ ID NO: 96;

(v) una región variable de la cadena pesada que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1 de SEQ iD NO: 99, la Cd R de la cadena pesada 2 de SEQ ID NO: 100, y la CDR de la cadena pesada 3 de SEQ ID NO: 101, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera 1 de SEQ ID NO: 102, la CDR de la cadena ligera 2 de SEQ ID NO: 103 y la Cd R de la cadena ligera 3 de SEQ ID NO: 104;

o

(vi) una región variable de la cadena pesada que comprende la región determinante de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada 1 de SEQ iD NO: 107, la CDR de la cadena pesada 2 de SEQ ID NO: 108, y la CDR de la cadena pesada 3 de SEQ ID NO: 109, y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera 1 de SEQ ID NO: 110, la CDR de la cadena ligera 2 de SEQ ID NO: 111 y la Cd R de la cadena ligera 3 de SEQ ID NO: 112.

(i) una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 73, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 74;

(ii) una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 81, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 82;

(iii) una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 89, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 90;

(iv) una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 97, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 98;

(v) una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 105, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 106; o

(vi) una región variable de la cadena pesada que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 113, y una región variable de la cadena ligera que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 114.

Todavía en otro aspecto, el resto de unión a antígeno, en particular la molécula Fab, que se une específicamente a CD19 comprende

(i) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 73, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 74;

(ii) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 81, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 82;

(iii) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 89, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 90;

(iv) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 97, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 98;

(v) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 105, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 106; o

(vi) la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 113, y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 114.

Modificaciones de carga

Un anticuerpo, en particular un anticuerpo multiespecífico, comprendido en el agente terapéutico puede comprender sustituciones aminoacídicas en las moléculas Fab comprendidas en el mismo que son en particular eficaces para reducir el emparejamiento incorrecto de las cadenas ligeras con las cadenas pesadas no coincidentes (productos secundarios de tipo Bence-Jones), que se pueden producir en la producción de moléculas de unión a antígeno bi/multiespecíficas basadas en Fab con un intercambio VH/VL en uno (o más, en caso de moléculas que comprendan más de dos moléculas Fab de unión a antígeno) de sus brazos de unión (véase también la publicación PCT n.° WO 2015/150447, en particular los ejemplos en la misma).

En consecuencia, en aspectos particulares, un anticuerpo comprendido en el agente terapéutico comprende

(a) una primera molécula Fab que se une específicamente a un primer antígeno

(b) una segunda molécula Fab que se une específicamente a un segundo antígeno, y en la que los dominios variables VL y VH de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se reemplazan entre sí,

en la que el primer antígeno es un antígeno activador de linfocitos T y el segundo antígeno es un antígeno de célula diana, o el primer antígeno es un antígeno de célula diana y el segundo antígeno es un antígeno activador de linfocitos T; y

en el que

i) en el dominio constante CL de la primera molécula Fab en a) el aminoácido en la posición 124 se sustituye por un aminoácido cargado positivamente (numeración de acuerdo con Kabat), y en la que en el dominio constante CH1 de la primera molécula Fab en a) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye por un aminoácido cargado negativamente (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); o

ii) en el dominio constante CL de la segunda molécula Fab en b) el aminoácido en la posición 124 se sustituye por un aminoácido cargado positivamente (numeración de acuerdo con Kabat), y en la que en el dominio constante CH1 de la segunda molécula Fab en b) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye por un aminoácido cargado negativamente (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

El anticuerpo no comprende ambas modificaciones mencionadas en i) y ii). Los dominios constantes CL y CH1 de la segunda molécula Fab no se reemplazan entre sí (es decir, permanecen sin intercambio).

En un aspecto del anticuerpo, en el dominio constante CL de la primera molécula Fab en a) el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un aspecto preferente, independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el dominio constante CH1 de la primera molécula Fab en a) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro aspecto, en el dominio constante CL de la primera molécula Fab en a) el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat), y en el dominio constante CH1 de la primera molécula Fab en a) el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto particular, en el dominio constante CL de la primera molécula Fab en a) el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un aspecto preferente, independientemente por lisina (K) o arginina (R)) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un aspecto preferente, independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el dominio constante CH1 de la primera molécula Fab en a) el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto más particular, en el dominio constante CL de la primera molécula Fab en a) el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por lisina (K) o arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat), y en el dominio constante CH1 de la primera molécula Fab en a) el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice Eu de Kabat).

En un aspecto incluso más particular, en el dominio constante CL de la primera molécula Fab en a) el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat), y en el dominio constante CH1 de la primera molécula Fab en a) el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En aspectos particulares, el dominio constante CL de la primera molécula Fab en a) es de isotipo kappa.

De forma alternativa, las sustituciones aminoacídicas de acuerdo con los aspectos anteriores se pueden realizar en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de la segunda molécula Fab en b) en lugar de en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de la primera molécula Fab en a). En dichos aspectos particulares, el dominio constante CL de la segunda molécula Fab en b) es de isotipo kappa.

El anticuerpo puede comprender además una tercera molécula Fab que se une específicamente al primer antígeno. En aspectos particulares, dicha tercera molécula Fab es idéntica a la primera molécula Fab en a). En estos aspectos, las sustituciones aminoacídicas de acuerdo con los aspectos anteriores se realizarán en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de cada una de la primera molécula Fab y la tercera molécula Fab. De forma alternativa, las sustituciones aminoacídicas de acuerdo con los aspectos anteriores se pueden realizar en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de la segunda molécula Fab en b), pero no en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de la primera molécula Fab y la tercera molécula Fab.

En aspectos particulares, el anticuerpo comprende además un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad que se pueden asociar de manera estable.

Régimen de tratamiento

De acuerdo con la invención y otros aspectos de la divulgación, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II y el agente terapéutico se pueden administrar de diversas formas (por ejemplo, con respecto a la vía de administración, dosis y/o momento), siempre que el anticuerpo anti-CD20 de tipo II se administre antes del agente terapéutico y que la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II haya inducido eficazmente una reducción del número de linfocitos B en el sujeto tratado en el momento en que se administra el agente terapéutico.

Sin quedar vinculado a ninguna teoría, la reducción del número de linfocitos B en el sujeto antes de la administración del agente terapéutico reducirá o prevendrá la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra el agente terapéutico y reducirá o prevendrá por tanto una pérdida de eficacia del agente terapéutico y/o acontecimientos adversos en el sujeto asociados con ADA, y/o reducirá o prevendrá la liberación de citocinas asociada con la administración del agente terapéutico y reducirá o prevendrá por tanto acontecimientos adversos (tales como RRI) en el sujeto asociados con la administración del agente terapéutico.

En un aspecto, el régimen de tratamiento reduce eficazmente la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) en el sujeto en respuesta a la administración del agente terapéutico en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En un aspecto, la formación de ADA se reduce al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, o al menos 100 veces en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En un aspecto, se previene esencialmente la formación de ADA. En un aspecto, la reducción o prevención de la formación de ADA es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 días, o 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 12 meses o más, después de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, la reducción o prevención de ADA es aproximadamente 2 meses después de la administración del agente terapéutico.

En un aspecto, el valor de ADA en el sujeto después de la administración del agente terapéutico no excede el valor de ADA en el sujeto antes de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, el valor de ADA en el sujeto después de la administración del agente terapéutico no excede el valor de ADA en el sujeto antes de la administración del agente terapéutico en más de 1,1 veces, más de 1,2 veces, más de 1,5 veces., más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces o más de 10 veces. En un aspecto, el valor de ADA en el sujeto después de la administración del agente terapéutico se incrementa menos de 1,1 veces, menos de 1,2 veces, menos de 1,5 veces, menos de 2 veces, menos de 3 veces, menos de 4 veces, menos de 5 veces o menos de 10 veces, en comparación con el valor de ADA en el sujeto antes de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, el valor de ADA en el sujeto después de la administración del agente terapéutico es el valor de ADA 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 días, o 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 12 meses o más, después de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, el valor de ADA en el sujeto después de la administración del agente terapéutico es el valor de ADA aproximadamente 2 meses después de la administración del agente terapéutico.

En un aspecto, no se detecta esencialmente ningún ADA en el sujeto después de la administración del agente terapéutico, en particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 días, o 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 12 meses o más, después de la administración del agente terapéutico.

Se pueden detectar ADA por procedimientos conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Mire-Sluis et al., J Immunol Methods (2004) 289, 1-16; Nencini et al., Drug Dev Res (2014), 75 Supl 1, S4-6; Schouwenburg et al., Nat Rev Rheumatol (2015) 9, 164-172). Un procedimiento ejemplar para detectar ADA es un ELISA de tipo sandwich, en el que el agente terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo) se recubre en la placa de ensayo, se expone al suero del sujeto tratado y se detecta la presencia de ADA por el agente terapéutico marcado. Otro procedimiento ejemplar para detectar ADA es una prueba de unión a antígeno en la que se agregan inmunoglobulinas del suero del sujeto tratado a una proteína (por ejemplo, proteína A Sepharose) y se detecta la presencia de ADA por un agente terapéutico marcado.

Se pueden detectar ADA, por ejemplo, en una muestra de sangre obtenida del sujeto. En un aspecto, el valor de ADA en el sujeto (como se mide, por ejemplo, en una muestra de sangre obtenida del sujeto) no excede un valor (es decir, la dilución más alta posible de la muestra que da una señal de ensayo por encima del punto de corte de ensayo) de aproximadamente 10, de aproximadamente 20, de aproximadamente 30, de aproximadamente 40, de aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 200, o aproximadamente 500, o de aproximadamente 1000 después de la administración del agente terapéutico, en particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 días, o 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 12 meses o más después de la administración del agente terapéutico.

En algunos aspectos, el régimen de tratamiento incrementa la eficacia del agente terapéutico, en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En algunos aspectos, el régimen de tratamiento incrementa la supervivencia global del sujeto, en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En algunos aspectos, el régimen de tratamiento incrementa la supervivencia sin progresión del sujeto, en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

En un aspecto, el régimen de tratamiento reduce eficazmente la liberación de citocinas en el sujeto asociada con la administración del agente terapéutico en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En un aspecto, la liberación de citocinas se reduce al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, o al menos 100 veces en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En un aspecto, se previene esencialmente la liberación de citocinas. En un aspecto, la reducción o prevención de la liberación de citocinas es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas después de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, la reducción o prevención de la liberación de citocinas es dentro de las primeras 24 horas después de la administración del agente terapéutico.

En un aspecto, la concentración de citocinas en el sujeto (como se mide, por ejemplo, en una muestra de sangre obtenida del sujeto) después de la administración del agente terapéutico no excede la concentración de citocinas en el sujeto antes de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, la concentración de citocinas en el sujeto después de la administración del agente terapéutico no excede la concentración de citocinas en el sujeto antes de la administración del agente terapéutico en más de 1,1 veces, más de 1,2 veces, más de 1,5 veces., más de 2 veces, más de 3 veces, más de 4 veces, más de 5 veces, más de 10 veces, más de 20 veces, más de 50 veces o más de 100 veces. En un aspecto, la concentración de citocinas en el sujeto después de la administración del agente terapéutico se incrementa menos de 1,1 veces, menos de 1,2 veces, menos de 1,5 veces, menos de 2 veces, menos de 3 veces, menos de 4 veces, menos de 5 veces, menos de 10 veces, menos de 20 veces, menos de 50 veces o menos de 100 veces, en comparación con la concentración de citocinas en el sujeto antes de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, la concentración de citocinas en el sujeto después de la administración del agente terapéutico es la concentración de citocinas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas después de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, la concentración de citocinas en el sujeto después de la administración del agente terapéutico es la concentración de citocinas dentro de las primeras 24 horas después de la administración del agente terapéutico.

En un aspecto, no es detectable esencialmente ningún incremento en la concentración de citocinas en el sujeto después de la administración del agente terapéutico, en particular 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 horas después de la administración del agente terapéutico.

Las citocinas se pueden detectar por procedimientos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, ELISA, FACS o ensayo Luminex®.

Se pueden detectar citocinas, por ejemplo, en una muestra de sangre obtenida del sujeto. En un aspecto, la concentración de citocinas es en la sangre del sujeto.

En algunos aspectos, la citocina es una o más citocinas seleccionadas del grupo que consiste en factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interferón gamma (IFN-y), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10), interleucina-2 (IL-2) e interleucina-8 (IL-8), en particular el grupo que consiste en TNF-a, IFN-y e IL-6. En algunos aspectos, la citocina es TNF-a. En algunos aspectos, la citocina es IFN-y. En algunos aspectos, la citocina es IL-6. En algunos aspectos, la citocina es IL-10. En algunos aspectos, la citocina es IL-2. En algunos aspectos, la citocina es IL-8.

En algunos aspectos, el régimen de tratamiento incrementa la seguridad del agente terapéutico, en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En algunos aspectos, el régimen de tratamiento reduce los acontecimientos adversos en el sujeto, en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En algunos aspectos, el régimen de tratamiento incrementa la semivida en suero del agente terapéutico, en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En algunos aspectos, el régimen de tratamiento reduce la toxicidad del agente terapéutico, en comparación con un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

De acuerdo con la invención y otros aspectos de la divulgación, el período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la administración del agente terapéutico es suficiente para la reducción del número de linfocitos B en el sujeto en respuesta a la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

En un aspecto, el período de tiempo es de 3 días a 21 días, de 5 días a 20 días, de 7 días a 21 días, de 7 días a 14 días, de 5 días a 15 días, de 7 días a 15 días, de 8 días a 15 días, de 10 días a 20 días, de 10 días a 15 días, de 11 días a 14 días o de 12 días a 13 días. En un aspecto, el período de tiempo es de 7 a 14 días. En un aspecto particular, el período de tiempo es de 10 a 15 días. En un aspecto, el período de tiempo es de 8 a 15 días. En un aspecto, el período de tiempo es de 5 a 10 días. En un aspecto particular, el período de tiempo es de 7 días.

En un aspecto, el período de tiempo es de aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 15 días, aproximadamente 16 días, aproximadamente 17 días, aproximadamente 18 días, aproximadamente 19 días, aproximadamente 20 días, aproximadamente 21 días, aproximadamente 22 días, aproximadamente 23 días, aproximadamente 24 días, aproximadamente 25 días, aproximadamente 26 días, aproximadamente 27 días, aproximadamente 28 días, aproximadamente 29 días o aproximadamente 30 días.

En un aspecto, el período de tiempo es de al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días o al menos 15 días. En un aspecto particular, el período de tiempo es de al menos 5 días. En otro aspecto particular, el período de tiempo es de al menos 7 días.

En un aspecto, el período de tiempo es entre la última administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la (primera, si varias) administración del agente terapéutico. En un aspecto, no se realiza ninguna administración del agente terapéutico durante el período de tiempo.

En un aspecto particular, la reducción del número de linfocitos B es en la sangre del sujeto. En un aspecto, los linfocitos B son linfocitos B de sangre periférica. En un aspecto, los linfocitos B son linfocitos B normales. En un

aspecto, los linfocitos B son linfocitos B malignos y normales. En un aspecto, los linfocitos B son linfocitos B

malignos.

En algunos aspectos, la reducción de linfocitos B es en un tejido del sujeto. En un aspecto, el tejido es de un tumor.

En un aspecto, el tejido es un ganglio linfático. En un aspecto, el tejido es de bazo. En un aspecto, el tejido es la

zona marginal del bazo. En un aspecto, los linfocitos B son linfocitos B de ganglios linfáticos. En un aspecto, los

linfocitos B son linfocitos B esplénicos. En un aspecto, los linfocitos B son linfocitos B esplénicos de la zona

marginal. En un aspecto, los linfocitos B son linfocitos B positivos para CD20, es decir, linfocitos B que expresan

CD20 en su superficie.

ente un 25 ente un 40 ente un 55 ente un 70

ente un 85

número de linfocitos B es una eliminación completa de linfocitos B. En un aspecto particular, la reducción del

número de linfocitos B es una reducción de al menos un 90 %, en particular al menos un 95 %, del número de

linfocitos B en la sangre (periférica) del sujeto. En un aspecto, la reducción del número de linfocitos B es una

reducción en comparación con el número de linfocitos B en el sujeto antes de la (primera, si varias) administración

del anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto.

El número de linfocitos B en el sujeto se puede determinar por cualquier procedimiento conocido en la técnica

adecuado para cuantificar linfocitos B en sangre o tejido del paciente, tal como citometría de flujo, procedimientos

inmunohistoquímicos o inmunofluorescentes, usando anticuerpos contra marcadores de linfocitos B tales como

CD20, CD19 y/o PAX5.

El número de linfocitos B también se puede determinar indirectamente, por cuantificación de los niveles de proteína

o ARNm de marcadores de linfocitos B en sangre o tejidos del paciente. Los procedimientos adecuados conocidos

en la técnica para la determinación de niveles de proteína específicos incluyen procedimientos de inmunoanálisis

tales como ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o inmunoelectrotransferencia, los procedimientos para

la determinación de niveles de ARNm incluyen, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa o tecnologías de micromatrices.

Todos los procedimientos y tecnologías mencionados anteriormente son bien conocidos en la técnica y se pueden

deducir de libros de texto estándar tales como Lottspeich (Bioanalytik, Spektrum Akademisher Verlag, 1998) o

Sambrook y Russell (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, U.S.A., 2001).

En determinados aspectos, la reducción del número de linfocitos B se determina por cuantificación de linfocitos B

en la sangre del sujeto (por ejemplo, en una muestra de sangre obtenida del sujeto). En un aspecto de este tipo,

los linfocitos B se cuantifican por análisis de citometría de flujo. Los procedimientos de citometría de flujo (FACS)

son bien conocidos en la técnica para la cuantificación de células en muestras de sangre o tejido. En particular,

permiten determinar el número de células que expresan un antígeno específico (por ejemplo, CD20 y/o CD19)

entre un número total definido de células en una muestra de sangre o tejido (por ejemplo, una muestra de sangre

o (parte de) una biopsia tisular). En un aspecto, se cuantifican linfocitos B por análisis de citometría de flujo usando

un anticuerpo anti-CD19 y/o un anticuerpo anti-CD20.

En otros aspectos, la reducción del número de linfocitos B se determina por cuantificación de linfocitos B en un

tejido, por ejemplo, un tumor, de dicho individuo (por ejemplo, en una biopsia tisular obtenida del sujeto). En un

aspecto de este tipo, los linfocitos B se cuantifican por análisis inmunohistoquímico o inmunofluorescente. En un

aspecto, los linfocitos B se cuantifican por análisis inmunohistoquímico usando un anticuerpo anti-CD19, un

anticuerpo anti-CD20 y/o un anticuerpo anti-PAX5.

Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden aplicar en el tratamiento de una variedad de

enfermedades, dependiendo del/de los agente(s) terapéutico(s) usado(s).

En determinados aspectos, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo, en particular cáncer. Los

ejemplos no limitantes de cánceres incluyen cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer

pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer

endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de

próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de huesos y cáncer de

riñón. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando un procedimiento descrito en el

presente documento incluyen, pero no se limitan a, neoplasias localizadas en: abdomen, hueso, mama, aparato

digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos,

ovario, timo, tiroidea), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, aparato genital femenino, piel, tejidos blandos, bazo, región torácica y aparato genitourinario. También se incluyen afecciones o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En determinados aspectos, el cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de células renales, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello. En algunos aspectos, el cáncer es un tumor sólido. En algunos aspectos, el cáncer expresa la diana del agente terapéutico, por ejemplo, un anticuerpo. En un aspecto, el cáncer expresa CEA. En otro aspecto, el cáncer expresa FAP.

En algunos aspectos, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno inflamatorio. En algunos aspectos, la enfermedad que se va a tratar es una enfermedad autoinmunitaria (es decir, una enfermedad o trastorno no maligno que surge de y se dirige contra los propios tejidos de un individuo). Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunitarios incluyen, pero no se limitan a, respuestas inflamatorias, tales como dermatosis inflamatorias, incluyendo psoriasis y dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica); respuestas asociadas con una enfermedad inflamatoria intestinal (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa); dermatitis; afecciones alérgicas, tales como eccema y asma; artritis reumatoide; lupus eritematoso diseminado (LED) (incluyendo, pero sin limitarse a, nefritis lúpica, lupus cutáneo); diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus de tipo 1 o diabetes mellitus insulinodependiente); esclerosis múltiple y diabetes juvenil. En un aspecto, la enfermedad es rechazo de trasplante o enfermedad injerto contra huésped.

En algunos aspectos, la enfermedad que se va a tratar es una enfermedad infecciosa, tal como una infección vírica o una infección bacteriana. En otros aspectos, la enfermedad que se va a tratar es trastorno neurológico. Todavía en otros aspectos, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno metabólico.

En relación con aspectos descritos en el presente documento relacionados con la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico en un sujeto, los procedimientos son en particular útiles, en el tratamiento de trastornos proliferativos de linfocitos B, en particular trastornos de linfocitos B positivos para CD20, donde los linfocitos B (positivos para CD20) están presentes en grandes cantidades (es decir, un incremento en el número de linfocitos B está presente un en el sujeto que padece el trastorno, en comparación con un sujeto sano).

Por tanto, en un aspecto, la enfermedad es un trastorno proliferativo de linfocitos B, en particular un trastorno de linfocitos B positivos para CD20.

En un aspecto, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en linfoma no hodgkiniano (LNH), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular (LF), linfoma de células del manto (LCM), linfoma de la zona marginal (LZM), mieloma múltiple (MM) o linfoma de Hodgkin (LH). En un aspecto, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en linfoma no hodgkiniano (LNH), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular (LF), linfoma de células del manto (LCM) y linfoma de la zona marginal (LZM).

En un aspecto particular, la enfermedad es LNH, en particular LNH recidivante/resistente al tratamiento (r/r). En un aspecto, la enfermedad es DLBCL. En un aspecto, la enfermedad es FL. En un aspecto, la enfermedad es MCL. En un aspecto, la enfermedad es MZL.

Un experto en la técnica reconoce fácilmente que en muchos casos el agente terapéutico puede no proporcionar una cura, sino que solo puede proporcionar un beneficio parcial. En algunos aspectos, un cambio fisiológico que tiene algo de beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos aspectos, una cantidad del agente terapéutico que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz".

El sujeto, paciente o individuo que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un ser humano. En determinados aspectos, el sujeto es un ser humano.

En algunos aspectos, en particular en relación con aspectos descritos en el presente documento relacionados con la reducción de la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto, el sujeto padece un tumor sólido localmente avanzado y/o metastásico y ha progresado o es intolerante al tratamiento de referencia. En un aspecto, el tumor es un tumor que expresa CEA. En otro aspecto, el tumor es un tumor que expresa FAP. La expresión de CEA y/o FAP en un tumor se puede determinar, por ejemplo, por análisis inmunohistoquímico de una biopsia tumoral obtenida del sujeto.

En otros aspectos, en particular en relación con aspectos descritos en el presente documento relativos a la reducción de la liberación de citocinas asociada con la administración de un agente terapéutico en un sujeto, el sujeto padece un trastorno proliferativo de linfocitos B, en particular linfoma no hodgkiniano (LNH), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular (LF), linfoma de células del manto (LCM), linfoma de la zona marginal (LZM), mieloma múltiple (MM) o linfoma de Hodgkin (LH). En un aspecto, el sujeto padece NHL recidivante/resistente al tratamiento (r/r).

Administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II

De acuerdo con la invención y otros aspectos de la divulgación, el período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la administración del agente terapéutico y la dosis del anticuerpo anti-CD20 de tipo II se eligen de modo que se reduzca eficazmente el número de linfocitos B en el sujeto antes de la administración del agente terapéutico.

El anticuerpo anti-CD20 de tipo II se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada. En un aspecto, el anticuerpo anti-CD20 de tipo II se administra por vía parenteral, en particular por vía intravenosa, por ejemplo, por infusión intravenosa.

El anticuerpo anti-CD20 de tipo II se formulará, dosificará y administrará de forma consecuente con la buena práctica médica. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos.

En un aspecto, la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II es una única administración. En otro aspecto, la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II es dos o más administraciones separadas. En un aspecto, las dos o más administraciones separadas son en dos o más días consecutivos. En un aspecto, no se realiza ninguna otra administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto antes o después de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II es una única administración, o dos administraciones en dos días consecutivos, y no se realiza ninguna otra administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En un aspecto, el período de tiempo es entre la última administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la (primera, si varias) administración del agente terapéutico.

En un aspecto, la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II es una dosis de anticuerpo anti-CD20 de tipo II eficaz para la reducción de linfocitos B en el sujeto. En un aspecto, la dosis de anticuerpo anti-CD20 de tipo II es eficaz para reducir el número de linfocitos B en el sujeto dentro del período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la administración del agente terapéutico. En un aspecto, el período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la administración del agente terapéutico y la dosis administrada de anticuerpo anti-CD20 de tipo II es suficiente para la reducción del número de linfocitos B en el sujeto en respuesta a la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

En un aspecto, la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II es una dosis de aproximadamente 2 g de anticuerpo anti-CD20 de tipo II. La dosis de aproximadamente 2 g de anticuerpo anti-CD20 de tipo II se puede administrar al sujeto como una única administración de aproximadamente 2 g, o como varias administraciones, por ejemplo, dos administraciones de aproximadamente 1 g cada una o tres administraciones de, por ejemplo, 100 mg, 900 mg y 1000 mg. En un aspecto, se realiza una administración de aproximadamente 2 g de anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto. En otro aspecto, se realizan dos administraciones de aproximadamente 1 g de anticuerpo anti-CD20 tipo II cada una al sujeto en dos días consecutivos. Todavía en otro aspecto, se realizan tres administraciones ((i) a (iii)) de (i) aproximadamente 100 mg de anticuerpo anti-CD20 de tipo II, (ii) aproximadamente 900 mg de anticuerpo anti-CD20 de tipo II y (iii) aproximadamente 1000 mg de anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto en tres días consecutivos. En un aspecto, se realizan dos administraciones de aproximadamente 1 g de anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto en dos días consecutivos, de 10 días a 15 días antes de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, se realiza una administración de aproximadamente 2 g de anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto de 10 días a 15 días antes de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, no se realiza ninguna otra administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto. En un aspecto, no se realiza ninguna administración del agente terapéutico al sujeto antes de la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II (al menos no dentro de la misma tanda de tratamiento).

En un aspecto, la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II es una dosis de aproximadamente 1000 mg de anticuerpo anti-CD20 de tipo II. La dosis de aproximadamente 1000 mg de anticuerpo anti-CD20 de tipo II se puede administrar al sujeto como una única administración de aproximadamente 1000 mg, o como varias administraciones, por ejemplo, dos administraciones de aproximadamente 500 mg cada una. En un aspecto particular, se realiza una administración de aproximadamente 1000 mg de anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto. En otro aspecto, se realizan dos administraciones de aproximadamente 500 mg de anticuerpo anti-CD20 de tipo II cada una al sujeto en dos días consecutivos. En un aspecto, se realiza una administración de aproximadamente 1000 mg de anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto, 7 días antes de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, no se realiza ninguna otra administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto. En un aspecto, no se realiza ninguna administración del agente terapéutico al sujeto antes de la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II (al menos no dentro de la misma tanda de tratamiento).

En un aspecto, el régimen de tratamiento comprende además la administración de premedicación antes de la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En un aspecto, la premedicación comprende un corticoesteroide (tal como, por ejemplo, prednisolona, dexametasona o metilprednisolona), paracetamol/acetaminofeno y/o un antihistamínico (como, por ejemplo, difenilhidramina). En un aspecto, la premedicación se administra al menos 60 minutos antes de la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

En un aspecto, el régimen de tratamiento no comprende la administración de un agente inmunosupresor distinto del anticuerpo anti-CD20 de tipo II (y opcionalmente la premedicación descrita anteriormente) antes de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, el régimen de tratamiento no comprende la administración de un agente seleccionado del grupo de metotrexato, azatioprina, 6-mercaptopurina, leflunomida, ciclosporina, tacrolimus/FK506, micofenolato de mofetilo y micofenolato de sodio antes de la administración del agente terapéutico. En un aspecto, el régimen de tratamiento no comprende la administración de otro anticuerpo además del anticuerpo anti-CD20 de tipo II antes de la administración del agente terapéutico.

Administración del agente terapéutico

El agente terapéutico se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Sin embargo, los procedimientos descritos en el presente documento son en particular útiles en relación con agentes terapéuticos administrados por infusión parenteral, en particular intravenosa. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada. En un aspecto, el agente terapéutico se administra por vía parenteral, en particular por vía intravenosa. En un aspecto particular, el agente terapéutico se administra por infusión intravenosa.

El agente terapéutico se formulará, dosificará y administrará de forma consecuente con la buena práctica médica. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. El agente terapéutico no lo necesita, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de agente terapéutico presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan en general en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada del agente terapéutico (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de agente terapéutico, la gravedad y evolución de la enfermedad, si se administra el agente terapéutico con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, anamnesis del paciente y respuesta al agente terapéutico y el criterio del médico especialista. El agente terapéutico se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1mg/kg - 10 mg/kg) de agente terapéutico puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al sujeto, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del agente terapéutico estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al sujeto una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana, cada dos semanas o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el sujeto recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del agente terapéutico). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguida de una o más dosis menores, o una dosis menor inicial, seguida de una o más dosis mayores. Una pauta posológica ejemplar comprende administrar una dosis inicial de aproximadamente 10 mg, seguido de una dosis bisemanal de aproximadamente 20 mg del agente terapéutico. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

En un aspecto, la administración del agente terapéutico es una única administración. En determinados aspectos, la administración del agente terapéutico es de dos o más administraciones. En un aspecto de este tipo, el agente terapéutico se administra cada semana, cada dos semanas o cada tres semanas, en particular cada dos semanas. En un aspecto, el agente terapéutico se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz. En un aspecto, el agente terapéutico se administra a una dosis de 10 mg - 20 mg. En un aspecto, la administración del agente terapéutico comprende una administración inicial de una dosis de aproximadamente 10 mg de agente terapéutico y una o más administraciones posteriores de una dosis de aproximadamente 20 mg de agente terapéutico. En un aspecto, el agente terapéutico se administra a una dosis de aproximadamente 50 |jg/kg, aproximadamente 100 jg/kg, aproximadamente 200 jg/kg, aproximadamente 300 jg/kg, aproximadamente 400 jg/kg, aproximadamente 500 jg/kg, aproximadamente 600 jg/kg, aproximadamente 700 jg/kg, aproximadamente 800 jg/kg, aproximadamente 900 jg/kg o aproximadamente 1000 jg/kg. En un aspecto, el agente terapéutico se administra a una dosis que es mayor que la dosis del agente terapéutico en un correspondiente régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. En un aspecto, la administración del agente terapéutico comprende una administración inicial de una primera dosis del agente terapéutico y una o más administraciones posteriores de una segunda dosis del agente terapéutico, en la que la segunda dosis es mayor que la primera dosis. En un aspecto, la administración del agente terapéutico comprende una administración inicial de una primera dosis del agente terapéutico y una o más administraciones posteriores de una segunda dosis del agente terapéutico, en la que la primera dosis no es menor que la segunda dosis.

En un aspecto, la administración del agente terapéutico en el régimen de tratamiento descrito en el presente documento es la primera administración de ese agente terapéutico al sujeto (al menos dentro de la misma tanda de tratamiento). En un aspecto, no se realiza ninguna administración del agente terapéutico al sujeto antes de la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

En la presente invención y otros aspectos de la divulgación, el agente terapéutico se puede usar solo o en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, se puede coadministrar el agente terapéutico con al menos un agente terapéutico adicional. En determinados aspectos, un agente terapéutico adicional es un agente inmunoterápico. En algún aspecto, el agente terapéutico adicional comprende un agente como se describe en el presente documento en relación con el agente terapéutico. La invención y otros aspectos de la divulgación son en particular útiles en relación con combinaciones de varios agentes terapéuticos que pueden inducir la formación de ADA o liberación de citocinas en un sujeto cuando se usan en un régimen de tratamiento sin la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II. Dichas combinaciones pueden incluir diversos agentes terapéuticos como se describe en el presente documento, y pueden incluir en particular uno o más agentes inmunoterápicos, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer (inmunoterapia del cáncer).

Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o formulaciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración del agente terapéutico se puede producir antes de, simultáneamente y/o después de la administración de un agente o agentes terapéuticos adicionales. En un aspecto, la administración del agente terapéutico y la administración de un agente terapéutico adicional se produce en aproximadamente un mes, o en aproximadamente una, dos o tres semanas, o en aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, entre sí.

Artículos de fabricación

En otro aspecto descrito en el presente documento, se proporciona un artículo de fabricación, por ejemplo, un kit, que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de una enfermedad, o para la reducción de la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) y/o la reducción de la liberación de citocinas como se describe en el presente documento. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección, contiene una composición que es eficaz para reducir la formación de ADA y/o liberación de citocinas, y que puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-CD20 de tipo II o un agente terapéutico como se describe en el presente documento. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección y/o para reducir la formación de ADA y/o liberación de citocinas. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo anti-CD20 de tipo II como se describe en el presente documento; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente terapéutico como se describe en el presente documento. El artículo de fabricación en este aspecto puede comprender además un prospecto del envase que indica que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular y/o para reducir la formación de ADA y/o liberación de citocinas. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Ejemplos

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención y otros aspectos de la divulgación. Se entiende que se pueden practicar diversos otros aspectos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Ejemplo 1: el tratamiento previo con obinutuzumab pero no rituximab o vehículo da como resultado la atenuación de respuestas de anticuerpos IgG de novo específicos del toxoide tetánico en macacos cangrejeros

Para evaluar el impacto funcional que tiene la disminución de linfocitos B con obinutuzumab o rituximab sobre la respuesta inmunitaria humoral a xenoantígenos, se sometió a macacos cangrejeros a exposición inmunitaria después del tratamiento con un antígeno novedoso que los animales nunca habían experimentado antes (respuesta de novo a toxoide tetánico) o bien con una reexposición inmunitaria de refuerzo con un inmunógeno que los animales ya habían experimentado antes de la administración del anticuerpo CD20 (respuesta de recuerdo a sarampión/rubéola).

A los animales se les administró el día -14 y el día -7 rituximab u obinutuzumab a una dosis de 30 mg/kg o vehículo por infusión i.v. La inmunización con toxoide tetánico se realizó el día 0. Los animales sin exposición previa de todos los grupos tuvieron una medición de IgG anti-toxoide tetánico de referencia de alrededor de 0,1 UI/ml el día 0. El día 7, los animales tratados con vehículo y los animales tratados con rituximab mostraron fuertes respuestas IgG anti-toxoide tetánico humoral, con un incremento de alrededor de 1,0 UI/ml, mientras que los animales tratados con obinutuzumab mostraron respuestas atenuadas, dando como resultado una señal igual al fondo de 0,1 UI/ml. El día 21, los valores serológicos en animales tratados con vehículo y tratados con rituximab continuaron aumentando hasta niveles máximos de 2,5 UI/ml (figura 1). Los animales tratados con obinutuzumab comenzaron a presentar un ligero incremento en los valores hasta 0,5 UI/ml, lo que fue significativamente inferior al de los grupos tratados con vehículo y rituximab. La respuesta IgG sérica decayó el día 51 y 68 en todos los grupos alcanzando alrededor de 1,5 UI/ml en animales tratados con vehículo, 1,3 UI/ml con rituximab y volviendo a 0,2 UI/ml con obinutuzumab.

Estos resultados indican que el tratamiento previo con obinutuzumab pero no rituximab da como resultado la atenuación de respuestas de anticuerpos IgG de novo específicos del toxoide tetánico en macacos cangrejeros.

Para investigar las respuestas de recuerdo por la producción de anticuerpos IgG específicos contra el sarampión en respuesta a una reexposición inmunitaria con una vacuna de refuerzo contra el sarampión/rubéola, se seleccionaron animales que tuvieron valores anti-sarampión positivos de referencia medibles. A los animales se les administró rituximab u obinutuzumab a una dosis de 30 mg/kg o vehículo por infusión i.v. el día -14 y el día -7. Se realizó una reexposición inmunitaria con una vacuna contra el sarampión/rubéola el día 0.

La medición del cambio en veces en la lectura de densidad óptica DO450 nm sobre la lectura de referencia del día -14, dio como resultado un incremento medible en los valores anti-sarampión en los tres grupos el día 21, día 51 y día 68, sin encontrar diferencias significativas en las respuestas de IgG al sarampión entre los tres diferentes grupos de tratamiento (figura 2). La conclusión es que las respuestas de recuerdo se dejaron intactas independientemente del tratamiento de disminución anti-CD20. La administración de obinutuzumab o bien rituximab no tuvo un impacto medible sobre las respuestas de recuerdo a una inmunización de refuerzo contra la vacunación contra el sarampión/rubéola con valores basales establecidos como resultado de una vacunación previa.

En general, estos resultados mostraron que el tratamiento previo con obinutuzumab dio lugar a una fuerte supresión de las respuestas de anticuerpos de novo, pero dejó las respuestas de memoria humoral protectoras intactas. Sin quedar vinculado a ninguna teoría, la capacidad para bloquear las respuestas de anticuerpos humorales de novo se puede atribuir posiblemente al incremento en el grado de disminución de linfocitos B endógenos observado con obinutuzumab y/o bien a la potenciación en la capacidad de obinutuzumab para disminuir los linfocitos B que expresan CD20 activado.

Ejemplo 2 : un estudio de fase 1 multicéntrico, aleatorizado y abierto para evaluar la viabilidad, la seguridad y el efecto farmacodinámico del pretratamiento con obinutuzumab antes del tratamiento con RO6895882 (cergutuzumab amunaleucina, CEA-IL2v), en pacientes con tumores sólidos localmente avanzados y/o metastásicos

Procedimientos

Se realiza un subestudio clínico de fase 1b, abierto, multicéntrico, aleatorizado de RO6895882 administrado con o sin obinutuzumab como pretratamiento.

El objetivo principal de este subestudio es determinar si el pretratamiento con obinutuzumab previene la formación de ADA en pacientes tratados posteriormente con RO6895882.

El ensayo incluye pacientes con tumores sólidos positivos para CEA localmente avanzados y/o metastásicos que han progresado o son intolerantes al tratamiento de referencia. Se administran por vía intravenosa (i.v.) obinutuzumab y RO6895882.

Se aleatorizaron catorce pacientes en el grupo de pretratamiento con obinutuzumab y cinco pacientes en el grupo de control sin pretratamiento con obinutuzumab. Los pacientes en el grupo de pretratamiento con obinutuzumab recibieron 2 g de obinutuzumab, administrados en dos días consecutivos (2 x 1000 mg), día -13 y día -12 (+/- 2 días) antes de la administración de RO6895882 del ciclo 1 día 1 (C1D1). Se administró premedicación antes de cada dosificación de obinutuzumab. El C1D1, todos los pacientes recibieron una dosis fija y constante de 10 mg de RO6895882. En ciclos posteriores, todos los pacientes recibieron 20 mg de RO6895882, administrados durante un mínimo de 2 horas de infusión i.v. bisemanal (q2W). Los pacientes en el grupo de control (sin pretratamiento con obinutuzumab) recibieron administraciones de RO6895882 comenzando el C1D1 de forma idéntica a los pacientes del grupo de pretratamiento con obinutuzumab.

Se obtuvieron muestras de sangre antes y durante el período de tratamiento para el seguimiento de recuentos de linfocitos B. Se obtuvieron recuentos de linfocitos B usando citometría de flujo y tinción para CD19. Se obtuvieron muestras de sangre para la determinación de ADA al inicio y después de esto cada dos semanas después de la administración de RO6895882.

Todos los pacientes se sometieron a biopsias tumorales de referencia y en el tratamiento. Para los pacientes pretratados con obinutuzumab, se obtuvieron biopsias de referencia después de la aleatorización, antes de la administración de obinutuzumab. Los pacientes de control tienen biopsias tumorales obtenidas antes de la administración de RO6895882 del ciclo 1 día 1. Se obtuvieron biopsias tumorales en el tratamiento de los primeros cinco pacientes pretratados con obinutuzumab en el ciclo 1 día 1 (+ 0/-1 días) antes de la administración de RO6895882 para confirmar la disminución de linfocitos B tisulares antes del inicio del tratamiento con RO6895882. De los pacientes pretratados con obinutuzumab restantes, se obtuvieron las biopsias tumorales repetidas en el ciclo 3 día 14 (+/- 2 días), antes de la cuarta administración de RO6895882 en el ciclo 4 día 1. Se analizó una porción del tejido de biopsia por citometría de flujo y tinción con CD19 para la detección de linfocitos B. La segunda porción se fijó en formol y se incluyó en parafina y se analizó para determinar los linfocitos B usando tinción con CD20 y PAX5.

Los objetivos principales de este estudio fueron evaluar el efecto del pretratamiento con obinutuzumab en la disminución de la proporción de pacientes con valor de ADA en el ciclo 4 y evaluar la seguridad y tolerabilidad de la administración de obinutuzumab antes del tratamiento con RO6895882.

Los objetivos secundarios de este estudio incluyeron la caracterización de los ADA RO6895882 (en el ciclo 4) y la investigación y caracterización de la disminución de linfocitos B en tejido (tumor y piel) y sangre periférica resultante del pretratamiento con obinutuzumab.

Resultados

Se ha sometido a prueba RO6895882 (cergutuzumab amunaleucina, CEA-IL2v) en el estudio BP28920 EIH Study (identificador de ClinicalTrials.gov: NCT02004106). A partir de noviembre de 2016, los resultados preliminares del estudio BP28920 muestran que en 59 de 74 pacientes (80 %) se detectaron anticuerpos anti-CEA-IL2v. Entre los 59 pacientes positivos para ADA, 58 (98 %) mostraron una respuesta inmunitaria persistente mientras que 1 (1,6 %) mostró una respuesta inmunitaria transitoria. La intensidad de respuestas de ADA varía de valores bajos a altos (10-196.830), 32 de 59 casos positivos para ADA persistentes (54 %) muestran valores de ADA altos (>100). La primera aparición de una respuesta inmunitaria se observó después de una dosis de RO6895882 (cergutuzumab amunaleucina, CEA-IL2v) ya el día 5, es decir, 96 h después de la primera dosis. No se identificó ningún paciente con ADA preexistentes y todos los ADA se indujeron por tratamiento. En cinco de 59 pacientes (8 %), además de valores de ADA altos (> 100), se observó pérdida de exposición. No se informó de reacciones de hipersensibilidad o signos y síntomas indicativos de hipersensibilidad, ni pruebas de acontecimientos adversos mediados por ADA en los 108 pacientes que recibieron RO6895882.

Se inició el subestudio clínico descrito anteriormente para explorar el potencial de obinutuzumab (Gazyva®) administrado como pretratamiento para la administración de RO6895882 (cergutuzumab amunaleucina, CEA-IL2v) para atenuar el desarrollo de anticuerpos antifármaco (ADA). El estudio ha concluido.

Catorce de los 14 pacientes tratados con obinutuzumab permanecieron libres de ADA contra RO6895882 en el ciclo 2 día 1 (dos semanas después de la primera administración de RO6895882) y durante todo el período de estudio. El período de seguimiento en tratamiento más largo fue de hasta 10 ciclos de tratamiento, es decir, 20 semanas. Cuatro de los cinco pacientes de control que no se pretrataron con obinutuzumab desarrollaron ADA con valores de 10 a 270 después de 1 dosis de RO6895882.

El perfil de seguridad del pretratamiento con obinutuzumab fue aceptable en pacientes con tumores sólidos localmente avanzados y/o metastásicos. Los pacientes que recibieron tratamiento con obinutuzumab/CEA-IL2v no experimentaron AA inesperados en comparación con la monoterapia con CEA-IL2v. No se informó de ningún desenlace mortal debido a un acontecimiento adverso.

El análisis de citometría de flujo de sangre periférica indicó una disminución completa de linfocitos B después del tratamiento con obinutuzumab. Antes del inicio del tratamiento con RO6895882 (C1D1), no se detectaron linfocitos B en las muestras de sangre obtenidas (figura 3).

Se analizaron las muestras de biopsia tumoral de pacientes con pretratamiento con obinutuzumab tanto por citometría de flujo como inmunohistoquímica (IHQ) para determinar la frecuencia de linfocitos B. El análisis de citometría de flujo (figura 4) mostró una fuerte reducción en el número y porcentaje de células que se tiñen positivamente para CD19, una proteína de superficie expresada en linfocitos B. El análisis IHQ de una porción diferente de las muestras de biopsia tumoral emparejadas detectó una disminución en células con tinción positiva para CD20, un segundo antígeno expresado en linfocitos B (figura 5 A y B). Para excluir que la reducción en la tinción de CD20 se provocara por obinutuzumab que puede competir con la tinción anti-CD20, se confirmaron los resultados por tinción con PAX5, un factor de transcripción específico de linfocitos B, que también se redujo fuertemente (figura 5 C y D). Tomados conjuntamente, estos resultados indican una reducción eficaz de linfocitos B en el tumor y tejido normal adyacente.

En conclusión, los datos anteriores de este subestudio sugieren fuertemente que obinutuzumab es eficaz para mitigar los ADA.

Ejemplo 3 : evaluación clínica de la viabilidad, seguridad y efecto farmacodinámico del pretratamiento con obinutuzumab antes del tratamiento con CEA TCB

Un ensayo clínico de fase I en curso con CEA TCB (identificador de ClinicalTrials.gov: NCT02324257) incluye pacientes con tumores sólidos positivos para CEA localmente avanzados y/o metastásicos que han progresado con el tratamiento estándar, son intolerantes al tratamiento de referencia (TR) y/o no son susceptibles de TR.

Se abren cohortes paralelas de pacientes para incluir pacientes que se pretratarán con obinutuzumab. El objetivo principal de estas cohortes es determinar si el pretratamiento con obinutuzumab previene la formación de a Da en pacientes tratados posteriormente con CEA TCB. Se administran obinutuzumab y CEA TCB por vía intravenosa (i.v.). Los pacientes de las cohortes de pretratamiento con obinutuzumab reciben 2000 mg de obinutuzumab, 2000 mg de obinutuzumab i.v. el día 13 o bien 1000 mg de obinutuzumab i.v. en dos días consecutivos, día-13 y día-12 (± 2 días) antes del ciclo 1 día 1 (C1D1) de administración de CEA TCB. Se administra premedicación, incluyendo analgésicos, antihistamínicos y corticoesteroides antes de cada dosificación de obinutuzumab. El C1D1, todos los pacientes reciben una dosis fija (dependiendo de la cohorte de dosis a la que estén asignados, como se define en el ensayo clínico en curso) de CEA TCB durante un mínimo de 120 minutos de infusión i.v. En ciclos posteriores, todos los pacientes reciben la misma dosis de CEA TCB, administrada durante un mínimo de 90 minutos de infusión i.v. en C2D1 y durante un mínimo de 60 minutos de infusión i.v. de C3D1 en adelante semanalmente (QW). Los pacientes que no reciben pretratamiento con obinutuzumab reciben administraciones de CEA TCB comenzando el C1D1 de forma idéntica a los pacientes de las cohortes de pretratamiento con obinutuzumab. Se obtienen muestras de sangre antes y durante el período de tratamiento para el seguimiento de recuentos de linfocitos B. Se obtienen recuentos de linfocitos B usando citometría de flujo y tinción para CD19. Se obtienen muestras de sangre para FC para evaluar los niveles séricos de CEA TCB y para la determinación de ADA al inicio y después de esto en cada ciclo de administración de CEA TCB. Los objetivos principales para estas cohortes de pacientes que reciben pretratamiento con obinutuzumab es el efecto del pretratamiento con obinutuzumab en la disminución de la tasa de pacientes con valor de anticuerpos antifármaco (ADA) positivo contra CEA TCB en la semana 8 y/o el retraso del momento de aparición de ADA contra CEA TCB, y para evaluar la seguridad y tolerabilidad de la administración de obinutuzumab antes del tratamiento con CEA TCB. El estudio también analizará la caracterización de ADA dirigido contra CEA TCB; incluye también la investigación y caracterización de la disminución de linfocitos B en tejido (se realizan biopsias tumorales al inicio y en la semana 7 después de C1D1 con CEA TCB) y sangre periférica resultante del pretratamiento con obinutuzumab.

Resultados preliminares

CEA TCB se está sometiendo a prueba en un estudio EIH (identificador de ClinicalTrials.gov: NCT02324257). A partir del 27 de octubre de 2016 (fecha tope para la inclusión de datos de ADA), los resultados preliminares del estudio BP29541 muestran que en 40 de 77 pacientes (52 %) se detectaron anticuerpos anti-CEA TCB, ninguno de estos pacientes recibió pretratamiento con obinutuzumab, excepto dos pacientes con valores positivos transitorios (uno tuvo un valor de 30 en el ciclo 2 día 1 pero después se volvió negativo hasta el ciclo 24 y otro tuvo un valor de 270 en el ciclo 3 día 1 y de 90 en el ciclo 4 día 1 pero después se volvió negativo hasta el ciclo 8). A excepción de estos dos pacientes, los otros 38 pacientes positivos para ADA mostraron una respuesta inmunitaria persistente. La intensidad de las respuestas de ADA varió de valores bajos a altos (10 - 21870). 17 de 38 casos positivos para ADA persistentes (45 %) mostraron valores de ADA moderados (< 810), mientras que 21 de 28 casos positivos para ADA persistentes (55 %) mostraron valores de ADA altos (> 810). La primera aparición de una respuesta inmunitaria se observó después de una dosis de CEA TCB el día 8 (predosis de C2D1), sin embargo, 3 pacientes tuvieron valores positivos en el ciclo 1 día 1 predosis. Se identificaron tres pacientes con ADA preexistentes y todos los demás ADA de pacientes se indujeron por tratamiento. En 24 de 38 pacientes (63 %) con una respuesta inmunitaria persistente, la presencia de ADA mantenida se correlacionó con la pérdida total de exposición (varía del ciclo 3 día 1 y ciclo 13 día 1 (fecha tope para la inclusión de datos farmacocinéticos: 7 de noviembre de 2016)). Hasta ahora, no se ha informado de reacciones de hipersensibilidad o signos y síntomas indicativos de hipersensibilidad, ni pruebas de acontecimientos adversos mediados por ADA en los 77 pacientes que recibieron CEA TCB. Se inició el estudio clínico descrito anteriormente con cohortes paralelas de pacientes que recibieron pretratamiento con obinutuzumab para explorar el potencial de obinutuzumab (Gazyva®/Gazyvaro®) administrado como un pretratamiento para la administración de CEA TCB para atenuar el desarrollo de anticuerpos antifármaco (ADA). El estudio está en curso. De acuerdo con los datos preliminares, a partir de la fecha tope para la inclusión de datos clínicos del 27 de octubre de 2016 (fecha tope para la inclusión de datos de ADA), los 12 pacientes pretratados con obinutuzumab para los que están disponibles datos de ADA hasta el momento (2 de los pacientes solo recibieron obinutuzumab debido a su deterioro clínico entretanto y no recibieron ninguna infusión de CEA TCB) permanecieron sin ADA contra CEA TCB en los siguientes puntos temporales: 1 paciente hasta C1, 1 paciente hasta C3, 1 paciente hasta C4, 1 paciente hasta C6, 1 paciente hasta C8, 1 paciente hasta C10, 2 pacientes hasta C12, 1 paciente hasta C16 y 1 paciente hasta C25.

Ocho de los sesenta y cinco pacientes que no se pretrataron con obinutuzumab desarrollaron ADA con valores de 10 a 810 después de 1 dosis de CEA TCB. En base a un análisis de seguridad preliminar, el perfil de seguridad del pretratamiento con obinutuzumab fue aceptable en pacientes con tumores sólidos localmente avanzados y/o metastásicos. Los pacientes que recibieron pretratamiento con obinutuzumab antes de recibir dosis semanales de CEA TCB no experimentaron acontecimientos adversos (AA) inesperados en comparación con los que no recibieron pretratamiento con obinutuzumab. El análisis de citometría de flujo de sangre periférica indicó una disminución completa de linfocitos B después del tratamiento con obinutuzumab. Antes del inicio del tratamiento con CEA TCB (C1D1), no se detectaron linfocitos B en las muestras de sangre obtenidas. Las muestras de biopsia tumoral de pacientes con pretratamiento con obinutuzumab se tomaron al inicio antes de recibir el pretratamiento con obinutuzumab y en tratamiento en el ciclo 7 día 1. Los análisis todavía están en curso.

Ejemplo 4: evaluación de la actividad antitumoral y liberación de citocinas mediada por pretratamiento de CD20XCD3 bsAB ± obinutuzumab (Gpt) en ratones completamente humanizados

Se investigó si el Gpt podría prevenir la liberación de citocinas asociada con la primera administración de CD20XCD3 bsAB en ratones n Og completamente humanizados.

Todas las opciones de tratamiento (obinutuzumab, CD20XCD3 bsAB y Gpt CD20XCD3 bsAB) dieron lugar a una disminución de linfocitos B de sangre periférica detectada ya 24 horas después de la primera administración de tratamiento (figura 7A). Los recuentos de linfocitos T revelaron una disminución transitoria en la sangre periférica 24 horas después de la primera administración de CD20XCD3 bsAB pero no después de obinutuzumab o Gpt CD20XCD3 bsAB (figura 7B). Por lo tanto, cuando se administra antes de CD20XCD3 bsAB, una única administración de obinutuzumab anula la disminución de linfocitos T mediada por CD20XCD3 bsAB en la sangre periférica.

El análisis de citocinas liberadas en la sangre de ratones tratados en los diferentes grupos experimentales reveló que el tratamiento con CD20XCD3 bsAB induce una elevación transitoria de varias citocinas en la sangre, con un pico a las 24 horas después de la primera administración y un retorno a los niveles casi de referencia en 72 horas. horas (figura 8). MIP-1b, IL-5, IL-10, MCP-1 muestran una tendencia similar a IFNy, TNFa e IL-6 (no mostrado). Gpt redujo fuertemente la liberación de citocinas en la sangre periférica asociada con la primera inyección de CD20XCD3 bsAB (tabla 2).

Tabla 2. Citocinas liberadas en la sangre periférica de ratones NOG completamente humanizados tras tratamientos con CD20XCD3 bsAB y Gpt CD20XCD3 bsAB

Notas: Los datos se presentan como media aritmética (DE). N = 5 en ambos tratamientos.

La actividad antitumoral de CD20XCD3 bsAB no se vio afectada por el pretratamiento con obinutuzumab (figura 9). El tratamiento con obinutuzumab, como monoterapia, mostró una fuerte actividad antitumoral, aunque con una cinética más lenta en comparación con CD20XCD3 bsAB en este modelo tumoral y de ratón.

Por lo tanto, los datos indican que el Gpt reduce la liberación de citocinas asociada con la primera inyección de CD20XCD3 bsAB, sin embargo, a pesar de dirigirse al mismo antígeno en las células tumorales, la actividad antitumoral de CD20XCD3 bsAB no se ve afectada por el Gpt.

Ejemplo 5: estudio de pretratamiento con obinutuzumab en macacos cangrejeros

Se realizó un estudio farmacodinámico (sin GLP) en macacos cangrejeros machos para investigar los efectos del pretratamiento con obinutuzumab sobre la respuesta a CD20XCD3 bsAB a dosis de 0,1, 0,3 y 1 mg/kg) (tabla 3). En este estudio, 6 macacos cangrejeros machos sin exposición previa/grupo (4 para el grupo 1), recibieron una dosis i.v. del artículo de control 1 (grupos 1 y 2) o bien obinutuzumab (50 mg/kg, grupos 3, 4, 5), seguidos 4 días después por tratamiento con el artículo de control 2 (grupo 1), CD20XCD3 bsAB, 0,1 mg/kg (grupo 2, grupo 3), CD20XCD3 bsAB, 0,3 mg/kg (grupo 4) o CD20XCD3 bsAB, 1 mg/kg (grupo 5). Cuatro días entre la dosificación de obinutuzumab y CD20XCD3 bsAB se consideró suficiente para permitir la disminución de linfocitos B en sangre periférica, ganglios linfáticos y bazo por obinutuzumab. El día 12, se realizó la necropsia de 2 animales del grupo 1 y 4 de los grupos 2 a 5 (necropsia terminal). Se conservaron dos animales de cada grupo durante un período de recuperación de 8 semanas.

Tabla 3. Diseño del estudio: Pretratamiento con obinutuzumab en macacos cangrejeros.

Nota: Artículo de control 1 = Control para obinutuzumab: Artículo de control 2 = Control para CD20XCD3 bsAB

a Animales del grupo principal, necropsia terminal, día 12.

b Animales de recuperación, necropsia, semana 8 (día 61).

Los siguientes datos están disponibles a partir de este estudio:

• Después del pretratamiento con obinutuzumab (50 mg/kg, Gpt), se toleró la administración i.v. de CD20XCD3 bsAB hasta 1 mg/kg, la mayor dosis sometida a prueba. Se redujeron notablemente los signos clínicos, observados con CD20XCD3 bsAB solo (vómito, postura encorvada e hipoactividad) por Gpt en todas las dosis de CD20XCD3 bsAB.

• La administración de CD20XCD3 bsAB sola dio como resultado la reducción de linfocitos B y la activación y expansión de subconjuntos de linfocitos T (CD4+ y CD8+) y linfocitos NK. Por el contrario, la administración de obinutuzumab antes de la administración de CD20XCD3 bsAB dio como resultado una disminución de linfocitos B, así como la posterior atenuación de la activación de linfocitos T, como se demuestra por reducciones en las reducciones transitorias de poblaciones de linfocitos y monocitos después de la administración de CD20XCD3 bsAB, así como reducciones en la expansión y regulación por incremento del marcador de activación de linfocitos T, en relación con los cambios presentes para los animales que se trataron con CD20XCD3 bsAB solo.

• La liberación de IFNy, IL-8, TNFa, IL-2 e IL-6, 4 horas después del tratamiento con 0,1 mg/kg de CD20XCD3 bsAB, se redujo notablemente en los grupos Gpt. De forma similar, se observaron niveles bajos de liberación de citocinas a dosis mayores de CD20XCD3 bsAB en los grupos Gpt (figura 10).

Los hallazgos histopatológicos relacionados con CD20XCD3 bsAB se restringieron a los órganos linfáticos (por ejemplo, una disminución en la celularidad que afecta específicamente a las células positivas para CD20 estuvo presente en los folículos linfáticos del bazo). Las disminuciones de células positivas para CD20 se invirtieron casi por completo después del período sin tratamiento de 8 semanas. No se presentaron otros cambios histopatológicos, incluyendo en cerebro, médula espinal y nervio ciático en monos tratados con CD20XCD3 bsAB a 0,1 mg/kg y en animales administrados con CD20XCD3 bsAB a 0,1, 0,3 o 1 mg/kg después de Gpt.

Ejemplo 6 : evaluación clínica de seguridad, tolerabilidad y farmacocinética de CD20XCD3 bsAB con pretratamiento con obinutuzumab en pacientes con LNH r/r

Se llevará a cabo un estudio de aumento escalonado de dosis en fase I, incluyendo los objetivos principales la evaluación de la seguridad, tolerabilidad y farmacocinética de CD20XCD3 bsAB con pretratamiento con obinutuzumab en pacientes con LNH recidivante/resistente al tratamiento (r/r).

El estudio incluirá pacientes con LNH r/r, con tumores que se espera que expresen CD20 en linfocitos B. No se incluirán pacientes con LLC. Se espera que los pacientes hayan recaído después de o no hayan respondido a al menos un régimen de tratamiento previo.

Se administrarán por vía intravenosa (i.v.) obinutuzumab y CD20XCD3 bsAB.

Antes de la administración de obinutuzumab y CD20XCD3 bsAB, se administrará premedicación con corticoesteroides (por ejemplo, 20 mg i.v. de dexametasona, 80 mg i.v. de metilprednisona o equivalente), junto con antihistamínicos y paracetamol. También se recomendarán medidas profilácticas para otros acontecimientos, tales como síndrome de lisis tumoral, según sea necesario u obligatorio.

CD20XCD3 bsAB se iniciará en el ciclo 1 /día 1 (C1/D1) como un único agente por infusión intravenosa (i.v.), después del pretratamiento con una única dosis de obinutuzumab (1000 mg; i.v.) siete días con antelación (ciclo 1/día -7) de la primera dosis de CD20XCD3 bsAB (ciclo 1 /día 1). La dosis inicial prevista de CD20XCD3 bsAB será de 5 microgramos (dosis fija). Todos los ciclos de dosificación son de 14 días (Q2W) de duración, administrándose una dosis adicional solo en el ciclo 1. Por tanto, el esquema de dosificación es para la administración de CD20XCD3 bsAB los días 1 y 8 en el ciclo 1 (C1/D1; C1/D8), seguido de la dosificación en todos los ciclos posteriores solo el día 1 (Q2W) durante un total de 12 ciclos (24 semanas) de tratamiento o hasta que se produzca una toxicidad o progresión inaceptables.

Se obtendrán muestras de sangre en puntos temporales apropiados para determinar las propiedades FC pertinentes de CD20XCD3 bsAB, así como una gama de marcadores FD en sangre, para evaluar, por ejemplo, la magnitud y la cinética de la disminución de linfocitos B después del inicio de la dosis de Gpt y CD20XCD3 bsAB, fenotipos de linfocitos T y para evaluar la liberación de mediadores solubles (citocinas y quimiocinas), después de la administración de Gpt y CD20XCD3 bsAB en puntos temporales seleccionados.

Ejemplo 7: comparación de la actividad antitumoral de la dosificación escalonada (DE) y el pretratamiento con obinutuzumab (Gpt)

Como se muestra en este ejemplo, Gpt es un enfoque superior para la dosificación escalonada (DE) en términos de actividad antitumoral y redistribución de linfocitos T en tejidos periféricos.

Se generaron internamente ratones hembra NOG completamente humanizados (Taconic). La edad era de 20 semanas al comienzo del experimento. A todos los ratones se les inyectó s.c. el día de estudio 01,5x106 células WSU-DLCL2 (linfoma difuso de linfocitos B grandes humano). Siete días después de la administración de células tumorales (día 7), a los ratones se les administró i.v. el primer tratamiento como se indica en la tabla 4. El segundo tratamiento como se indica en la tabla 4 se administró el día 14.

Después de 9 semanas de tratamiento con CD20XCD3 bsAB, el número de ratones sin tumor al finalizar el estudio (día 69) fue mayor cuando el tratamiento se precedió por obinutuzumab (Gpt) que cuando se precedió por cualquiera de las tres dosis fraccionadas únicas de CD20XCD3 bsAB (DE) (figura 11, tabla 4).

Tabla 4. Actividad antitumoral tras la dosificación escalonada de CD20XCD3 BSAB y pretratamiento con obinutuzumab (Gpt) en ratones NOG completamente humanizados que portan tumores WSU-DLCL2.

Además de una eficacia antitumoral superior, siete días después del primer (pre)tratamiento (correspondiente al día 14 del estudio), se observó un incremento en linfocitos T CD3 positivos perivasculares en los pulmones de ratones tratados con CD20XCD3 bsAB (dosis completa o fracción de la dosis completa) pero no en ratones tratados con obinutuzumab (10 mg/kg) (figura 12 A-D). Lo mismo sucedió para el análisis en un punto temporal posterior correspondiente a 24 horas después del segundo tratamiento (día de estudio 15) (figura 12 E-H).

Para este experimento, se generaron ratones y se les inyectaron células tumorales como se describe anteriormente. Siete días después de la administración de células tumorales, a los ratones se les administraron i.v. los tratamientos como se indica en la tabla 5A.

Se sacrificaron cuatro animales/grupo 7 días después de recibir una única dosis de CD20XCD3 bsAB, obinutuzumab o vehículo. Los cuatro animales/grupo restantes se sacrificaron 24 horas después de recibir el segundo tratamiento el día 14, como se indica en la tabla 5B. Los controles recibieron el tampón de vehículo.

Se obtuvieron los pulmones, el hígado y los riñones en la necropsia y se tiñeron cortes seriados con inmunohistoquímica (IHQ) para CD3 humano de acuerdo con los protocolos establecidos. Se evaluaron cortes teñidos inmunohistoquímicamente para CD3 desconociendo el tratamiento por un anatomopatólogo veterinario especialista usando una puntuación de 0 (ninguna o pocas células positivas para CD3 en el corte) a 3 (muchas células positivas para CD3 rodeando los vasos/conductos).

Los resultados representativos de cortes pulmonares se muestran en la figura 12, tabla 5.

Se observó un incremento dependiente de la dosis en linfocitos T CD3 positivos perivasculares en el pulmón de ratones siete días después de una única dosis de > 0,05 mg/kg de CD20XCD3 bsAB (dosis completa o fracción de la dosis completa), pero no en ratones tratados con obinutuzumab (figura 12 A-D, tabla 5A).

Tabla 5A. IHQ pulmonar para CD3: animales sacrificados 7 días después del primer tratamiento. La tabla muestra la puntuación promedio de linfocitos T CD3 positivos perivasculares en el pulmón (realizado por análisis con anatomopatólogo desconocedor del tratamiento).

También se observó un incremento en linfocitos T perivasculares en ratones 24 horas después de una dosis única o repetida de CD20XCD3 bsAB, pero no en ratones pretratados con obinutuzumab (figura 12 E-H, tabla 5B).

Tabla 5B. IHQ pulmonar para CD3: animales sacrificados 24 horas después del 2.° tratamiento. La tabla muestra la puntuación promedio de linfocitos T CD3 positivos perivasculares en el pulmón (realizado por análisis con anatomopatólogo desconocedor del tratamiento).

En animales que recibieron una única dosis de 0,5 mg/kg de CD20XCD3 bsAB sacrificados 24 horas después del tratamiento, se presentó marginación y adhesión de linfocitos T CD3 positivos en vasos pulmonares (figura 13), lo que sugiere una activación temprana de linfocitos T con transmigración al espacio perivascular.

En conclusión, el tratamiento único o repetido con dosis completa o fracción de la dosis completa de CD20XCD3 bsAB dio como resultado un incremento en linfocitos T CD3 positivos en comparación con controles con distribución perivascular en el pulmón, perivascular/periductal en el hígado y en los glomérulos en los riñones (datos de hígado y riñón no mostrados). Estos cambios no se produjeron en animales pretratados con obinutuzumab.

Ejemplo 8 : comparación de la exposición a CD20XCD3 bsAB en macacos cangrejeros con o sin Gpt

En este ejemplo, se muestra que Gpt incrementa la exposición a CD20XCD3 bsAB. A macacos cangrejeros se les administró una única dosis i.v. de 100-1000 |jg/kg de CD20XCD3 bsAB con o sin pretratamiento con obinutuzumab (Gpt) (50 mg/kg, 4 días antes de la administración de CD20XCD3 bsAB).

El incremento en la exposición que resulta de la disminución de linfocitos B CD20+ por obinutuzumab (50 mg/kg) se muestra por los niveles séricos de CD20XCD3 bsAB después de una única dosis de 100 jg/kg de CD20XCD3 bsAB con o sin Gpt (figura 14). El aclaramiento de CD20XCD3 bsAB después del Gpt se redujo notablemente a aproximadamente un cuarto del aclaramiento observado en el grupo sin Gpt (tabla 6). En el momento de la dosificación de CD20XCD3 bsAB, se redujeron los linfocitos B por Gpt a aproximadamente un 1-5 % de los niveles de referencia. La reducción del aclaramiento es consecuente con la disminución de linfocitos B inducida por Gpt y la reducción resultante del aclaramiento mediado por diana de la unión de linfocitos B. Después del Gpt, el aclaramiento y el volumen central de distribución (Vc) fueron independientes de la dosis en el intervalo de dosis estudiado, con valores de aclaramiento alrededor de 90 ml/día/kg y valores de Vc alrededor de 40 ml/kg, lo que es similar al volumen sérico.

Tabla 6. Media de parámetros farmacocinéticos medios de CD20XCD3 bsAB después de una única administración intravenosa con o sin pretratamiento con obinutuzumab en macacos cangrejeros.

28,7

(9,8)

ABCinf = área bajo la curva de concentración-tiempo de tiempo 0 a infinito; CL = aclaramiento:

Cmáx = concentración máxima; T1/2 = semivida; Vc = volumen central de distribución.

Notas: A macacos cangrejeros se les administró una única dosis i.v. de 100-1000 |jg/kg de CD20XCD3 bsAB con o sin pretratamiento con obinutuzumab (Gpt) (50 mg/kg, 5 días antes de la administración de CD20XCD3 bsAB) en un estudio de seguridad farmacodinámico. Los valores son promedios de seis animales por grupo (± %CV).

a T1/2 aparente (debido a farmacocinética no lineal)

Ejemplo 9: pretratamiento con obinutuzumab para evitar la liberación de citocinas después del tratamiento con linfocitos T adoptivo con linfocitos T-CAR

El síndrome de liberación de citocinas (SLC) es un fenómeno muy frecuente después del tratamiento con linfocitos T-CAR para CD19 y así como con linfocitos T-CAR dirigidos contra CD20 o CD22 que puede dar como resultado efectos secundarios letales. Las estrategias para evitar o reducir el SLC se centran en diversos aspectos del tratamiento con T-CAR (revisado en Xu y Tang, Cancer Letters (2014) 343, 172-178).

Se sugiere un enfoque novedoso para evitar SLC después del tratamiento con linfocitos T-CAR en trastornos proliferativos de linfocitos B, por disminución de linfocitos B periféricos y malignos usando pretratamiento con obinutuzumab.

Para este propósito, se aleatorizaron pacientes con un trastorno proliferativo de linfocitos B (por ejemplo, LNH) en un grupo de pretratamiento con obinutuzumab y un grupo de control sin pretratamiento con obinutuzumab. Los pacientes en el grupo de pretratamiento con obinutuzumab reciben 1 g de obinutuzumab, administrado el día -7 (+/- 2 días) antes de la administración de linfocitos T-CAR para CD19, CD20 o CD22.

A los pacientes se les infunden linfocitos T autólogos transducidos con un vector lentivírico con CAR a una dosis apropiada para el linfocito T-CAR específico usado, el paciente y la enfermedad que se va a tratar (por ejemplo, de 0,76x106 a 20,6x106 linfocitos T-CAR por kilogramo de peso corporal como se describe en Maude et al., N Engl J Med (2014) 371,1507-1517; de 1,4x 106 a 1,2x107 linfocitos T-Ca R por kilogramo de peso corporal como se describe en Grupp et al., New Engl J Med (2013) 368, 1509-1518; o de 0,14 x 108 a 11 x 108 linfocitos T-CAR como se describe en Porter et al., Sci Transl Med (2015) 7, 303ra139). Los pacientes se siguen para obtener una respuesta, efectos tóxicos y la expansión y persistencia de linfocitos T-CAR circulantes.

Se administra premedicación antes de cada dosificación de obinutuzumab. Se obtienen muestras de sangre antes y durante el período de tratamiento para el seguimiento de recuentos de linfocitos B. Se obtienen recuentos de linfocitos B usando citometría de flujo y tinción para CD19. Además, se criba la incidencia de SLC midiendo las citocinas incluyendo IL-6.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso en un procedimiento para reducir la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) contra un agente terapéutico en un sujeto, que comprende la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II al sujeto antes de la administración del agente terapéutico, en el que el anticuerpo anti-CD20 de tipo II comprende una región Fc de IgG1, y

en el que el agente terapéutico comprende un polipéptido seleccionado del grupo de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que comprende una porción de unión a antígeno de un anticuerpo intacto, un anticuerpo de dominio único, un receptor de antígeno o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un ligando de receptor o un fragmento de unión a receptor del mismo, un dominio Fc, un inmunoconjugado y una citocina.

2. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II y la administración del agente terapéutico es suficiente para la reducción del número de linfocitos B en el sujeto en respuesta a la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

3. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el período de tiempo entre la administración del anticuerpo anti-CD20 tipo II y la administración del agente terapéutico es de 3 días a 21 días, de 5 días a 20 días, de 7 días a 21 días, de 7 días a 14 días, de 5 días a 15 días, de 7 días a 15 días, de 8 días a 15 días, de 10 días a 20 días, de 10 días a 15 días, de 11 días a 14 días o de 12 días a 13 días.

4. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo anti-CD20 de tipo II comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 4, la HCDR2 de SEQ ID NO: 5, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 6; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, la LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 9.

5. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo anti-CD20 de tipo II comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 11.

6. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo anti-CD20 de tipo II es un anticuerpo IgG, en particular un anticuerpo IgG1.

7. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos aproximadamente un 40 % de los oligosacáridos unidos a N en la región Fc del anticuerpo anti-CD20 de tipo II son no fucosilados.

8. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo anti-CD20 de tipo II es obinutuzumab.

9. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II es (i) una única administración, o (ii) dos o más administraciones separadas, en particular dos o más administraciones separadas en dos o más días consecutivos.

10. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la administración del anticuerpo anti-CD20 de tipo II es una dosis de aproximadamente 2 g de anticuerpo anti-CD20 de tipo II.

11. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente terapéutico se administra por vía parenteral, en particular por vía intravenosa.

12. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente terapéutico comprende un anticuerpo.

13. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico se une específicamente al antígeno carcinoembrionario (CEA).

14. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico comprende

(i) una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 14, la HCDR2 de SEQ ID NO: 15, y la Hc Dr 3 de SEQ ID NO: 16; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 17, la LCDR2 de SEQ ID NO: 18 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 19; o

(ii) una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 20 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 21.

15. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico comprende

(i) una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 136, la HCDR2 de SEQ ID NO: 137, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 138; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 139, la LCDR2 de SEQ ID NO: 140 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 141; o

(ii) una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 142 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 143.

16. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico se une específicamente a CD3, en particular CD3e.

17. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico comprende

(i) una región variable de la cadena pesada que comprende la CDR de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 32, la HCDR2 de SEQ ID NO: 33, y la HCDR3 de SEQ ID NO: 34; y una región variable de la cadena ligera que comprende la CDR de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 35, la LCDR2 de SEQ ID NO: 36 y la LCDR3 de SEQ ID NO: 37; o

(ii) una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39.

18. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico se une específicamente a la proteína de activación de fibroblastos (FAP).

19. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el anticuerpo comprendido en el agente terapéutico comprende una secuencia de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 25 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 26.

20. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, 18 y 19, en el que el agente terapéutico comprende un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo como se define en la reivindicación 14 o 19, y una citocina,

en el que la citocina es un polipéptido de IL-2 humana mutante que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G (numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana Se Q ID NO: 12).

21. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el agente terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CD3 en un linfocito T y a un antígeno de célula diana.

22. El anticuerpo anti-CD20 de tipo II para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el agente terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo como se define en la reivindicación 14 o 15 y un anticuerpo como se define en la reivindicación 17.