UA119646C2 - Гуманізоване антитіло, що зв`язується з сd3 людини - Google Patents

Гуманізоване антитіло, що зв`язується з сd3 людини Download PDF

Info

Publication number
UA119646C2
UA119646C2 UAA201600940A UAA201600940A UA119646C2 UA 119646 C2 UA119646 C2 UA 119646C2 UA A201600940 A UAA201600940 A UA A201600940A UA A201600940 A UAA201600940 A UA A201600940A UA 119646 C2 UA119646 C2 UA 119646C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
heavy chain
zeo
human
sequence
Prior art date
Application number
UAA201600940A
Other languages
English (en)
Inventor
ден Брінк Едвард ван
Ден Бринк Эдвард Ван
Йост Й. Нейсен
Аран Франк Лабрейн
Аран Франк Лабрэйн
Йойсе Местерс
Яніне Схююрман
Янине Схююрман
Паул Парен
Паул Парэн
Original Assignee
Ґенмаб А/С
Генмаб А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2013/064330 external-priority patent/WO2014006217A1/en
Application filed by Ґенмаб А/С, Генмаб А/С filed Critical Ґенмаб А/С
Publication of UA119646C2 publication Critical patent/UA119646C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Винахід стосується гуманізованого антитіла, що зв’язується з CD3 людини. Також, винахід стосується біспецифічного антитіла, конструкції з нуклеїнової кислоти, експресуючого вектора, клітини хазяїна, фармацевтичної композиції, способу одержання антитіла, діагностичної композиції, способу виявлення наявності антигену CD3 та набору для виявлення наявності антигену CD3 або клітин, експресуючих CD3, у зразку.

Description

Винахід стосується гуманізованого антитіла, що зв'язується з СОЗ людини. Також, винахід стосується біспецифічного антитіла, конструкції з нуклеїнової кислоти, експресуючого вектора, клітини хазяїна, фармацевтичної композиції, способу одержання антитіла, діагностичної композиції, способу виявлення наявності антигену СОЗ та набору для виявлення наявності антигену СОЗ або клітин, експресуючих СОЗ, у зразку.
А
180003
Я вії воСьЬВ: ТЗ
Що яв НЕ що ло2о0о Ше ния Я юбтьвесюжні щ | ох в. о ; шк Ж вОінободнть а в Що з й щолмласюЗНІКЗ
Її обо А «й ей ЩЕ -НиС НС кю чеки. вена кв
В кити р ІДС СПВЬЕМЕрА б е-о- а е- а хе яд о0бнНоО ОЯ 0л 1 то 109
АБ (кими дДнійтало ЕС5О. , . іМллмтЬ ді нас НІк ШІ НДИИ тва нисоЗ- НВ ідсповосоВ-Ня
ПТК есе ТИВИ Ки ЗНИННЕ тасі-льсоа не їв 0000 006 шасо я ТЕО ЕЕ ве Сх тевелобзснек? по а в З зевві спа БбіаькиВмА но асо оч плани ЇЇ влас нубдлтазвіхний уро мА
КУ р у й Я засво есе оА спи - 4 їх що БсОЗтЕОА
ОО Я й
І ще Е я я А о заст т ооп З. їв: з та ува
Авімки ми) ящик | ГЕС ввідси СОЗ хоНЕНо у ов 5зівої СсОоЗ КБ ВЕВА і 1075 виб! порОоЗ-нЗБіхнЕЯо МЕРА Тов дді-восоЗ- З ЛЕВА соя
Гіві св ЕВА ШИ | ОХ
Даний винахід стосується гуманізованих або химерних антитіл, що зв'язуються з СОЗ людини, композицій, які містять такі гуманізовані або химерні антитіла, і застосування таких гуманізованих або химерних антитіл при лікуванні захворювань.
Попередній рівень техніки
Кластер диференціювання З (СОЗ) відомий уже багато років і тому він був предметом інтересу в багатьох відношеннях. Зокрема, відомі антитіла проти СОЗ або комплексу Т- клітинних рецепторів, до складу якого входить СЮОЗ. Були описані характеристики іп міго 5 гуманізованих варіантів антитіл з ефекторною функцією ОКТЗ |11.
Лікування моноклональним антитілом пПоОКТЗдатта! (Аіа-АіІа) проти СОЗ приводить до поліпшення відповідей на С-пептид і клінічних параметрів протягом щонайменше 2 років після виникнення цукрового діабету 1-го типу за відсутності безперервного застосування імунодепресивних препаратів (21.
Перспективний підхід до поліпшення прицільної терапії антитілами полягає в доставці цитотоксичних клітин спеціально до експресуючих антиген ракових клітин. Ця концепція застосування Т-клітин для ефективного знищення клітин пухлин уже була описана |З). Проте, первинні клінічні дослідження були досить невтішними в основному через низьку ефективність, важкі побічні ефекти (цитокіновий шторм) та імуногеність біспецифічних антитіл |4)|. Досягнення в області розробки й застосування біспецифічних антитіл змогли частково подолати первинний бар'єр цитокінового шторму й поліпшити клінічну ефективність без обмежуючої дозування токсичності І51.
Наприклад, деякі біспецифічні антитіла, у яких одне плече спрямоване на антиген на пухлинних клітинах, а інше плече, приміром, на СОЗ на Т-клітинах, забезпечують зв'язування
Ес-рецептора з Ес-фрагментом. Після зв'язування утворюється комплекс Т-клітин, пухлинних клітин і ефекторних клітин, який зв'язується з Ес-фрагментом антитіла, що призводить до загибелі пухлинних клітин |4). Катумаксомаб (саїштахотарб) складається з гетеродимера ІдсСга миші й ІдбсС2р пацюка й виявився успішним для лікування пов'язаного з раком асциту після внутрішньоочеревинного застосування |б). Проте, гібрид миша/пацюк є імуногенним 17) їі не може застосовуватися для тривалого внутрішньовенного введення людині. Пов'язані з лікуванням часті побічні ефекти, що відносяться до катумаксомабу, включають симптоми,
Зо пов'язані з вивільненням цитокинів (тобто гіпертермію, нудоту, блювоту, пропасницю, тахікардію й гіпотензію) І81-(9|, які пов'язані з ефекторною функцією Ес-фрагмента катумаксомаба. Інше антитіло - ертумаксомаб (егішпахотаб, НЕК2Хх СОЮЗ), який викликає цитотоксичність у клітинних лініях з низькою експресією НЕК2. Ертумаксомаб проходить ІІ фазу клінічної розробки для метастатичного раку молочної залози І|101-1111.
Були описані антитіла до СОЗ, що дають перехресну реакцію з СОЗ яванської макаки- крабоїда й/або макаки-резус |121-(13Ї), однак необхідне подальше вдосконалення таких антитіл, що дають перехресну реакцію.
Суть винаходу
Об'єктом даного винаходу є одержання гуманізованих або химерних антитіл до СОЮЗ. Так, в одному аспекті даний винахід стосується гуманізованих або химерних антитіл, що зв'язуються з
СОЗ людини, причому такі антитіла містять у собі єднальну область, що містить СОК1, СОК2 і
СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), послідовності яких наведені в ЗЕО ІЮ МО: 1, 2 і 3, відповідно, і СОКІ1, СОК2 ії СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ), послідовності яких наведені в БЕО ІЮ МО: 4, послідовність СТМ Її послідовність, наведену в ЗЕО ІЮО МО: 5, відповідно.
В іншому аспекті даний винахід стосується біспецифічних антитіл, що містять першу єднальну область антитіла за винаходом й другу єднальну область, яка зв'язується з іншою мішенню, ніж дана перша область, що зв'язує антиген.
В іншому аспекті даний винахід стосується конструкцій з нуклеїнової кислоти, що кодують одну або кілька амінокислотних послідовностей за винаходом.
В іншому аспекті даний винахід стосується експресуючого вектора, що містить (Її) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність важкого ланцюга гуманізованого або химерного антитіла за винаходом, (ії) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність легкого ланцюга гуманізованого або химерного антитіла за винаходом, або ж (ії) - і (1), і (ії).
В іншому аспекті даний винахід стосується клітин хазяїна, що містять експресуючий вектор за винаходом.
В іншому аспекті даний винахід стосується композицій, які містять антитіло або біспецифічне антитіло за винаходом.
В іншому аспекті даний винахід стосується фармацевтичних композицій, які містять антитіло бо або біспецифічне антитіло за винаходом й фармацевтично прийнятний носій.
В іншому аспекті даний винахід стосується антитіл або біспецифічних антитіл, композицій або фармацевтичних композицій за винаходом для застосування як лікарського засобу.
В іншому аспекті даний винахід стосується антитіл або біспецифічних антитіл, композицій або фармацевтичних композицій за винаходом для застосування при лікуванні захворювань.
В іншому аспекті даний винахід стосується способу лікування захворювань, який включає введення антитіла або біспецифічного антитіла, композиції або фармацевтичної композиції за винаходом пацієнтові, який цього потребує.
В одному аспекті даний винахід стосується способу діагностики захворювань, які характеризуються участю або нагромадженням експресуючих СОЮЗ клітин, який включає введення суб'єктові гуманізованого або химерного антитіла, композиції або фармацевтичної композиції за винаходом, при цьому необов'язково дане гуманізоване або химерне антитіло мітиться детектованою міткою.
В іншому аспекті даний винахід стосується способу одержання антитіл або біспецифічних антитіл за винаходом, який включає стадії а) культивування клітин хазяїна за винаходом й б) виділення антитіл з культурального середовища.
В іншому аспекті даний винахід стосується діагностичної композиції, яка містить антитіло або біспецифічне антитіло за винаходом.
В іншому аспекті даний винахід стосується способу виявлення наявності антигену СОЗ або клітин, експресуючих СОЮЗ, у зразку, який включає стадії а) контактування зразка з антитілом або біспецифічним антитілом за винаходом в умовах, що сприяють утворенню комплексу між антитілом або біспецифічним антитілом і СОЗ, і В) аналізу того, чи утворився комплекс.
В іншому аспекті даний винахід стосується набору для виявлення наявності антигену СОЗ або клітин, експресуючих СОЗ, у зразку, який включає Її) антитіло або біспецифічне антитіло за винаходом й ії) інструкції із застосування набору.
В іншому аспекті даний винахід стосується антиідіотипічних антитіл, які зв'язуються з антитілом за винаходом.
Короткий опис фігур
На Фіг. 1 представлені криві зв'язування (Фіг. 1А) варіантів моноспецифічних антитіл Їд(1- писСОЗ і (Фіг. 18) варіантів біспецифічних антитіл б51д1-пиСсОЗхХНЕКЗ з Т-клітинами лінії Уигкаї
Зо людини. Дані представлені у вигляді середньої інтенсивності флуоресценції (МЕЇ) з одного репрезентативного експерименту, як описано в прикладі 2. У таблицях наведені концентрації антитіл (мкг/мл), що дають напівмаксимальне зв'язування (ЕСво).
На Фіг. 2 представлені криві зв'язування (Фіг. 2А) варіантів моноспецифічних антитіл Ідс1- писСОЗ і (Фіг. 28) варіантів біспецифічних антитіл б5Іде1-пиСсОЗхХНЕКЗ з Т-клітинами лінії НС-Е макаки-крабоїда. Дані представлені у вигляді середньої інтенсивності флуоресценції (МЕ) з одного репрезентативного експерименту, як описано в прикладі 2.
На Фіг. З представлена активація Т-клітин варіантами антитіл І(де1-СО03. Експресію СО69 на
Т-клітинах людини (Фіг. ЗА) і макаки (3В) у культурі РВМС вимірювали методом ЕБАС5, як описано у прикладі 3. Ці експерименти повторювали двічі, а представлені репрезентативні результати з одного експерименту.
На Фіг. 4 представлена проліферація Т-клітин, індукована варіантами антитіл 951-203.
Клітини РВМС людини (Фіг. 4А) або макаки (Фіг. 48) інкубували з варіантами антитіл Іде1-С2О03 протягом З днів, після чого вимірювали проліферацію методом ЕГІЗА для проліферації клітин, як описано в прикладі 4. Представлені репрезентативні результати із двох незалежних експериментів.
На Фіг. 5 представлена опосередкована Т-клітинами людини (Фіг. 5А) й макаки (58) цитотоксичність, індукована варіантами антитіл пиСОЗ з неактивуючими мутаціями ГЕГЕВА, яку визначали, як описано в прикладі 5. Представлені репрезентативні результати із двох незалежних експериментів, виконаних у двох повторах.
На Фіг. 6 представлені криві зв'язування неактивуючих варіантів моноспецифічних антитіл
Ідса1-пиСОЗ (Фіг. 6А) і неактивуючих варіантів біспецифічних антитіл Б51д1-пиСсОЗхНЕКЗ (Фіг. 68) з Т-клітинами лінії ЧУигкаї людини. Дані представлені у вигляді середньої інтенсивності флуоресценції (МЕЇ) з одного репрезентативного експерименту, як описано в прикладі 2. У таблицях наведені концентрації антитіл (мкг/мл), що дають напівмаксимальне зв'язування (ЕСво).
На Фіг. 7 представлені криві зв'язування неактивуючих варіантів моноспецифічних антитіл
Ідса1-пиСОЗ (Фіг. 7А) і неактивуючих варіантів біспецифічних антитіл р5Іде1-пиСсОЗхХНЕНКЗ (Фіг. 78) з Т-клітинами лінії Н5С-Е макаки. Дані представлені у вигляді середньої інтенсивності флуоресценції (МЕЇ) з одного репрезентативного експерименту, як описано в прикладі 2. У бо таблицях наведені концентрації антитіл (мкг/мл), що дають напівмаксимальне зв'язування
(ЕСво).
На Фіг. 8 представлена активація Т-клітин неактивуючими моноспецифічними варіантами антитіл (дс1-йпиСОЗ ((Фіг. 8А й В) або неактивуючими біспецифічними варіантами антитіл р5Ідат-пиСсСОЗХНЕКЗ ((Фіг. 8С і Б). Експресію СО69 на Т-клітинах людини (Фіг. вА і С) і макаки (Фі. 8В ї 0) у культурі РВМС вимірювали методом БАС5, як описано у прикладі 3. Ці експерименти повторювали двічі, а представлені репрезентативні результати з одного експерименту.
На Фіг, 9 представлена проліферація Т-клітин, індукована неактивуючими моноспецифічними варіантами антитіл ІдсС1-пиСОЗ (Фі. 9А й В) або неактивуючими біспецифічними варіантами антитіл р5іде1-пиСсСОЗхХНЕКЗ (Фіг. 9С ії Б). Проліферацію Т-клітин вимірювали на клітинах РВМС людини (Фіг. 9А і С) або макаки (Фіг. 9В і 0), які інкубували з різними варіантами антитіл протягом З днів, після чого вимірювали проліферацію методом
ЕГІЗА для проліферації клітин, як описано в прикладі 4. Представлені репрезентативні результати із двох незалежних експериментів.
На Фіг. 10 представлена опосередкована Т-клітинами людини (Фіг. 10А) й макаки (Фіг. 108) цитотоксичність, індукована варіантами антитіл пиСОЗ з неактивуючими мутаціями ГЕГЕВА, яку визначали, як описано в прикладі 5. Представлені репрезентативні результати із двох незалежних експериментів, виконаних у двох повторах.
На Фіг. 11 представлена активація Т-клітин макаки резус варіантами антитіл ЇдДе1-пиСОЗ.
Експресію СОб9 на Т-клітинах макаки в культурі РВМС вимірювали методом ЕАС5Б, як описано у прикладі 6.
На Фіг. 12 представлена активація Т-клітин неактивуючими варіантами антитіл пис В-ТГ3/4.
Варіанти Ід01-пиСІ В-13/4 титрували на РВМС. Експресію СОб69 на Т-клітинах у культурі РВМС вимірювали методом ЕАС5, як описано у прикладі 7. Представлені репрезентативні результати з З експериментів.
На Фіг. 13 представлена проліферація Т-клітин неактивуючими варіантами антитіл пис В-
Т3/4. Клітини РВМС інкубували з антитілами протягом З днів, після чого вимірювали проліферацію методом ЕГІЗА для проліферації клітин, як описано в прикладі 8. Представлені репрезентативні результати із двох незалежних експериментів.
На Фіг. 14 представлена опосередкована Т-клітинами іп міго цитотоксичність, індукована неактивуючими варіантами антитіл до СОЗ. Індукування опосередкованої Т-клітинами цитотоксичності варіантами антитіл (М2970, ЕГЕ, ГЕГЕМО, ГЕГЕВБА, САМО), ГЕГЕОСАМОРЗ |Фіг. 14А-|) визначали, як викладено в прикладі 9. Представлені середні значення із двох експериментів, виконаних у двох повторах.
На Фіг. 15 представлена опосередкована Т-клітинами іп міго цитотоксичність, індукована неактивуючими варіантами антитіл пиСІ В-13/4. Індукування опосередкованої Т-клітинами цитотоксичності варіантами антитіл (І РЕВА, ГАГ І|Фіг. 15А-СІ) визначали, як описано в прикладі 9. Представлені середні значення з одного експерименту, виконаного у двох повторах.
На Фіг. 16 представлена оцінка зв'язування С14 з неактивуючими варіантами антитіл писСіІ В-
Т3/4. Зв'язування Сід з моноспецифічними антитілами Ідс1-пиСіВ-13/4 (Фіг. 16А-С) і біспецифічними антитілами Б5Ідое1-пиСіІ В-Т3/А4ХНЕКЗ (Фіг. В-О) і їх неактивуючими варіантами визначали методом ЕГІЗА, як описано в прикладі 10. Результати на графіках представлені для п-2 експериментів.
На Фіг. 17 представлений аналіз фармакокінетики (РК) неактивуючих варіантів антитіл пис В-13/4 у порівнянні з антитілом дикого типу І(Д1-пиСіІ В-13/4, як описано в прикладі 11.
Будували графіки концентрації Ідс1 у плазмі людини залежно від часу (Фіг. 17А). Швидкість кліренсу в плазмі розраховували, як описано в прикладі 11 (Фіг. 178). Горизонтальна пунктирна лінія представляє середню швидкість кліренсу антитіл (ДС1 людини в мишей СІЮ (10 мл/день/кг).
На Фіг. 18 представлена частота позитивних Т-клітинних відповідей серед здорових НІ А- типованих донорів. Індекси 5 2 1,9 при аналізі як проліферації, так і секреції І--2 уважалися позитивними відповідями. У якості клінічного еталона контрольного антитіла використовували гуманізоване антитіло АЗЗ, яке проявляє високий рівень імуногенності в клініці й зазвичай викликає 20-30 95 Т-клітинних відповідей при аналізі методом ЕріЗсгееп. Також включені відповіді КІ Н для перевірки якості РВМС (після відтавання).
На Фіг. 19 представлене сполучення послідовностей варіабельної області важкого ланцюга (МН) і легкого ланцюга (МІ) у гуманізованих антитіл до СОЗ за даним винаходом.
Докладний опис винаходу
В одному аспекті даний винахід стосується гуманізованих або химерних антитіл, що бо зв'язуються з СЮОЗ людини, причому такі антитіла містять у собі єднальну область, яка містить
СОКІ1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області важкого ланцюга (МН), послідовності яких наведені в
ЗЕО ІО МО: 1, 2 і 3, відповідно, і СОК1, СОК2 і СОКЗ варіабельної області легкого ланцюга (МІ, послідовності яких наведені в ЗЕО ІЮ МО: 4, послідовність СТМ і послідовність, наведену в 5ХЕО
ІО МО: 5, відповідно.
Термін "антитіло" у даному винаході служить для позначення молекул імуноглобуліну, фрагментів молекул імуноглобуліну або похідних будь-кого з них, які мають здатність до специфічного зв'язування з антигеном у звичайних фізіологічних умовах з періодом напіврозпаду, який становить значний період часу, як то: щонайменше 30 хвилин, щонайменше 45 хвилин, щонайменше 1 годину, щонайменше 2 години, щонайменше 4 години, щонайменше 8 годин, щонайменше 12 годин, 24 години або більше, 48 годин або більше, 3, 4, 5, 6, 7 днів або більше і т.д., або ж будь-який інший значимий, функціонально визначений період часу (приміром, достатній, щоб викликати, сприяти, підсилювати й/(або модулювати фізіологічну реакцію, пов'язану зі зв'язуванням антитіла з антигеном, і/або достатній для того, щоб антитіло задіяло ефекторну активність). Єднальна область (або єднальний домен, що також може застосовуватися в даному описі, причому обидва терміни мають те саме значення), яка взаємодіє з антигеном, включає варіабельні області важких і легких ланцюгів молекули імуноглобуліну. Константні області антитіл (АБ) можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну із тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (як, наприклад, ефекторні клітини й Т-клітини) і компонента системи комплементу типу С1а4, першого компонента в класичному шляху активації комплементу. Як зазначено вище, у даному винаході термін "антитіло", якщо не зазначене інакше або явно не суперечить контексту, включає фрагменти антитіл, які зберігають здатність до специфічної взаємодії, як, наприклад, зв'язування, з антигеном. Було показано, що антиген-єднальна функція антитіл може виконуватися фрагментами повнорозмірних антитіл. Приклади єєднальних фрагментів, охоплюваних терміном "антитіло", включають (ї) ЕРар'- або Рар-фрагменти - моновалентні фрагменти, які складаються із доменів Мі, Мн, Сі і Сні, або моновалентні антитіла, описані в УМО 2007059782 (Септаб А/5); (ії) Е(ар)2-фрагменти - бівалентні фрагменти, які містять два Еаб- фрагмента, з'єднаних дисульфідним містком у шарнірній області; (ії) ЕРа-фрагменти, які складаються в основному з доменів Мн і Сн1; ї (м) Ем-фрагменти, які складаються в основному з
Ко) доменів Мі і Мн одного плеча антитіла. Крім того, хоча два домени фрагмента Ем, Мі і Мн, кодуються окремими генами, але їх можна з'єднати рекомбінантними методами через синтетичний лінкер, який дозволить їм вироблятися у вигляді єдиного білкового ланцюга, у якому області М і Мн утворюють пари з утворенням моновалентних молекул (відомих як одноланцюгові антитіла або одноланцюгові Ем (зсЕм), наприклад, див. Віга еї аї., 5сіепсе 242, 423-426 (1988); ії Нивіоп еї аі., РМАБ О5БА 85, 5879-5883 (1988)). Такі одноланцюгові антитіла охоплюються терміном "антитіло", якщо не зазначене інакше або не очевидно з контексту. Хоча такі фрагменти зазвичай охоплюються значенням терміна "антитіло", однак усі вони разом і незалежно один від одного є унікальними особливостями даного винаходу, проявляючи різноманітні біологічні властивості й корисність. Ці й інші корисні фрагменти антитіл обговорюються в контексті даного винаходу далі. Слід також мати на увазі, що термін "антитіло", якщо не зазначене інакше, також охоплює й поліклональні антитіла, моноклональні антитіла (тАбБ5), химерні антитіла й гуманізовані антитіла, а також фрагменти антитіл, що зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном (антиген-єднальні фрагменти), отримані будь-яким відомим методом типу ферментативного розщеплення, пептидного синтезу й рекомбінантних методів. Отримані антитіла можуть мати будь-який ізотип.
Термін "імуноглобуліновий важкий ланцюг", "важкий ланцюг імуноглобуліну" або "важкий ланцюг" у даному винаході служить для позначення одного з ланцюгів імуноглобуліну. Важкий ланцюг зазвичай складається з варіабельної області важкого ланцюга (скорочено Ун) і константної області важкого ланцюга (скорочено Сн), які визначають ізотип імуноглобуліну.
БО Константна область важкого ланцюга зазвичай складається із трьох доменів, Сні, Сн2 і Снз.
Константна область важкого ланцюга також може включати шарнірну область. Термін "Імуноглобулін" у даному винаході служить для позначення цілого класу близьких за структурою глікопротеїнів поліпептидних ланцюгів, які складаються із двох пар: однієї пари легких (І) низькомолекулярних ланцюгів і однієї пари важких (Н) ланцюгів, причому всі чотири ланцюги потенційно з'єднуються між собою дисульфідними зв'язками. Структура імуноглобулінів добре вивчена (наприклад, див. (141). У структурі імуноглобуліну два важкі ланцюги з'єднуються між собою дисульфідними зв'язками в так званій "шарнірній області". Так само, як і важкі ланцюги, кожний легкий ланцюг зазвичай складається з декількох областей: варіабельної області легкого ланцюга (скорочено Мі) і константної області легкого ланцюга (скорочено Сі). Константна 60 область легкого ланцюга, як правило, складається з одного домена Сі. Крім того, області Мн і М.
можна додатково підрозділити на ділянки гіперваріабельності (або гіперваріабельні ділянки, які можуть бути гіперваріабельними за послідовністю й/або утворювати петлі з певною структурою), які також називають визначальними комплементарність ділянками (СОК), упереміж з більш консервативними ділянками, які іменуються каркасними ділянками (ЕК5). Як правило, кожний Мн і Мі складається із трьох СОК і чотирьох ЕК, що розташовуються від М-кінця до С-кінця в наступному порядку ЕК!, СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕК4 (див. (151).
Послідовності СОК можна визначити методом, який надається ІМОТ (|161-(171.
Термін "ізотип" у даному винаході відноситься до класу імуноглобулінів (наприклад, Ідс1,
Іс, за3, да, дО, ІА, ІДЕ, або ІдМ) або будь-якого їх алотипу, такого як ЇДС1т(7а) і Іст т()
ІЗЕО ІЮ МО: 151), який кодується генами константної області важкого ланцюга. Так, в одному втіленні антитіло містить важкий ланцюг імуноглобуліну класу ЇдДО1 або будь-якого його алотипу.
Крім того, кожний ізотип важкого ланцюга може сполучатися з легким ланцюгом типу каппа (к) або лямбда (Х).
Термін "химерне антитіло" у даному винаході відноситься до антитіл, у яких варіабельна область походить із іншого виду, ніж людей (приміром, із гризунів), а константна область походить із такого виду як людина. Химерні антитіла можуть бути отримані шляхом інженерії антитіл. Термін "Інженерія антитіл" застосовується як загальний термін для різного роду модифікацій антитіл і добре відомий фахівцям. Зокрема, химерні антитіла можна одержувати стандартними методами ДНК, як описано в |18)|. Так, химерними можуть бути отримані методами генетичної або ензиматичної інженерії рекомбінантні антитіла. Одержання химерних антитіл перебуває в компетенції фахівців, тому одержання химерних антитіл за даним винаходом може здійснюватися й іншими методами, ніж описані тут. Химерні моноклональні антитіла для терапевтичного застосування розробляються, щоб зменшити імуногенність антитіл. Як правило, вони містять варіабельні області не людини (наприклад, миші), які специфічні для потрібного антигену, і константні домени важкого й легкого ланцюга антитіл людини. Терміни "варіабельна область" або "варіабельні домени" у контексті химерних антитіл відносяться до тієї області, у якій містяться ділянки СОК і каркасні ділянки як важких, так і легких ланцюгів імуноглобуліну.
Термін "гуманізоване антитіло" у даному винаході відноситься до генетично сконструйованих антитіл не людини, які містять константні домени антитіл людини й варіабельні домени не людини, модифіковані для того, щоб вони мали високий рівень гомології послідовності з варіабельними доменами людини. Це може здійснюватися шляхом пересадження шести визначальних комплементарність ділянок (СОК) з антитіл не людини, спільно утворюючих антигензв'язуючий сайт, у гомологічну акцепторну каркасну область (ЕК) людини (див. (19|-І(201). Для повної реконструкції спорідненості зв'язування й специфічності вихідного антитіла може знадобитися вставка каркасних залишків вихідного антитіла (тобто не людини) у каркасні ділянки людини (БасК-мутації). Моделювання структурної гомології може допомогти встановити ті амінокислотні залишки в каркасних ділянках, які важливі для єднальних властивостей антитіла. Таким чином, гуманізоване антитіло може містити послідовності СОК не людини, переважно людські каркасні ділянки, що необов'язково містять одну або кілька зворотних мутацій амінокислот до амінокислотної послідовності не людини, і повністю людські константні області. Необов'язково можуть проводитися додаткові модифікації амінокислот, які не обов'язково є зворотними мутаціями, щоб одержати гуманізовані антитіла із кращими характеристиками типу спорідненості й біохімічних властивостей.
Гуманізовані або химерні антитіла за кожним з аспектів або втілень даного винаходу можуть іменуватися "гуманізованими або химерними антитілами до СО3", "гуманізованими або химерними антитілами за винаходом", "антитілами до СОЗ3" або "антитілами до СОЗ за винаходом", які всі мають те саме значення й зміст, якщо це не суперечить контексту.
Амінокислотна послідовність антитіл не людського походження відрізняється від антитіл людського походження, тому не людські антитіла потенційно імуногенні при введенні людям.
Проте, незважаючи на те, що антитіло походить не з людини, його СОК-сегменти відповідають за здатність антитіла до зв'язування з його антигеном-мішенню, а гуманізація призначається для збереження специфічності й спорідненості зв'язування даного антитіла. Таким чином, гуманізація нелюдських терапевтичних антитіл проводиться для того, щоб звести до мінімуму їх імуногенність для людини, хоча такі гуманізовані антитіла в той же час зберігають специфічність і спорідненість зв'язування антитіл нелюдського походження.
Термін "ділянка зв'язування" у даному винаході відноситься до тієї ділянки антитіла, яка здатна зв'язуватися з будь-якою молекулою типу поліпептиду, наприклад, що перебуває на клітині, бактерії або віріоні. 60 Термін "зв'язування" у даному винаході відноситься до зв'язування антитіла із заданим антигеном або мішенню, з якими воно зазвичай зв'язується зі спорідненістю, що відповідає Ко близько 10-96 М або менше, наприклад, 10-" М або менше, як от 10-8 М або менше, типу 10-93 М або менше, 10-19 М або менше або 10-"! М або навіть менше, при визначенні, наприклад, методом поверхневого плазменного резонансу (РЕ) на приладі ВіАсоге 3000 з використанням антигену в якості ліганда й антитіла як аналізованої речовини, і зв'язується із заданим антигеном зі спорідненістю, відповідною до значення Ко, яке щонайменше в 10 разів менше, як от щонайменше в 100 разів менше, приміром, щонайменше в 1000 разів менше, як от щонайменше 10 000 разів менше, приміром, щонайменше в 100 000 разів менше, ніж його спорідненість зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, ВЗА, казеїном), а не заданим антигеном або спорідненим антигеном. Ступінь, у якому спорідненість буде менше, залежить від Ко антитіла, так що коли Ко антитіла дуже низька (тобто антитіло має високу специфічність), то ступінь, у якому спорідненість до антигену буде менше, ніж спорідненість до неспецифічного антигену, може становити щонайменше 10 000 разів. Термін "Кос (М) у даному винаході відноситься до рівноважної константи дисоціації конкретної взаємодії антитіло-антиген.
Термін "СОЗ людини" у даному винаході відноситься до білка кластера диференціювання З людини, який входить до складу комплексу білка з Т-клітинним рецептором і складається із чотирьох окремих ланцюгів. СОЗ також виявлений в інших видів, тому термін "СОЗ3" може застосовуватися тут і не обмежується СОЗ людини, якщо це не суперечить контексту. У ссавців комплекс містить ланцюг СОЗу (гама) (ланцюг СОЗу людини: Зм/із5ргої РО9693, СОЗУу макаки- крабоїда: Зугіззргої 095117), ланцюг СОЗб (дельта) (СОЗб людини: Зуліззргої РО4234, СЮЗб макаки-крабоїда: Зм/із5ргої 20295118), два ланцюги СОЗє (епсилон) (СОЗєЄ людини: Зм/із5ргої
РО7766, СОЗє макаки-крабоїда: Зм/і55ргої 095115, СОЗєЄ макаки-резус: Зм/із5ргої 57МСВУ), і ланцюг СОЗСЄ (дзета) (СОЗЄ людини: Зм/іб55ргої Р20963, СОЗСЄ макаки-крабоїда: бм/із5ргої 009ТКО). Ці ланцюги асоційовані з молекулою, відомою як Т-клітинний рецептор (ТСК), і генерують сигнал активації Т-лімфоцитів. Молекули ТОК і СОЗ разом становлять комплекс ТОК.
Фахівцям повинно бути відомо, що амінокислотні послідовності, наведені у вигляді номерів
Зм/і55ргої, включають і сигнальний пептид, який видаляється після трансляції білка. Таким чином, білки типу СОЗ, присутні на поверхні клітин, не містять сигнальних пептидів. Зокрема, амінокислотні послідовності, перераховані в табл. 1, не містять таких сигнальних пептидів. Такі
Ко) білки, як наведені в табл. 1, можуть іменуватися "зрілими білками". Таким чином, 5ЕО ІЮО МО: 14 представляє амінокислотну послідовність зрілого СОЗб (дельтад людини, ЗЕО ІЮ МО: 13 представляє амінокислотну послідовність зрілого СОЗє (епсилон) людини, 5ЕО ІЮ МО: 21 представляє амінокислотну послідовність зрілого СОЗє макаки-крабоїда й 5ЕБО ІЮО МО: 23 представляє амінокислотну послідовність зрілого СОЗєЄ макаки-резусє. Таким чином, термін "зрілий" у даному винаході відноситься до білків, які не містять ніякої сигнальної або лідерної послідовності.
Добре відомо, що гомологічність, довжина й положення сайту розщеплення послідовностей сигнальних пептидів суттєво відрізняється між різними білками. Сигнальні пептиди можна визначати різними методами, наприклад, 5ЕО ІЮО МО: 13 за даним винаходом визначали за допомогою додатка 5ідпаІр (доступно на пер:/Лумлм.срз и. ак/зегмісез/Зідпа!р/).
У кращому втіленні гуманізоване або химерне антитіло за даним винаходом зв'язується з епсилон-ланцюгом СОЮЗ, як от із епсилон- ланцюгом СОЗ людини (ЗЕО ІЮ МО: 13). В іншому кращому втіленні гуманізоване або химерне антитіло зв'язується з епітопом у межах амінокислот 1-27 в М-кінцевій частині СЮОЗєЄ (епсилон) людини (5ЕО ІЮ МО: 13). У такому кращому втіленні антитіло навіть може ще перехресно реагувати й з іншими видами приматів, ніж людина, такими як макака-крабоїд (СО З-епсилон крабоїда: 560 ІЮ МО: 21) і/або макака- резус (СО З-епсилон резусу: ЗЕО ІЮ МО: 23).
Термін "перехресно реагувати" у даному винаході відноситься до здатності антитіла типу гуманізованого або химерного антитіла за винаходом до зв'язування своєї мішені у різних видів.
Зокрема, гуманізоване антитіло до СОЗ, наведене в описаних тут прикладах, має здатність до зв'язування й з СЮОЗ людини (приклад 2), і макаки-крабоїда (приклад 2), і макаки-резус.
Антитіла за даним винаходом, що містять послідовності СОК, як визначено тут, а також утримуючі каркасні області, можуть відрізнятися за послідовностями за межами послідовностей
СОК, але усе ще повністю зберігати здатність до зв'язування, як у вихідного антитіла. Так, даний винахід також стосується антитіл, що містять амінокислотну послідовність варіабельної області, що має певну ідентичність послідовності з будь-якою описаною тут послідовністю.
Термін "ідентичність послідовності" у контексті даного винаходу означає ступінь ідентичності між двома послідовностями залежно від числа ідентичних положень, спільних для цих послідовностей (тобто гомологія в 95 - число ідентичних положень/загальне число положень бо х100), з урахуванням кількості пробілів і довжини кожного пробілу, які необхідно ввести для оптимального сполучення двох послідовностей. Ступінь ідентичності між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями можна визначити, приміром, за алгоритмом Е. Меуег5 апа у. Ммійнег (211. Крім того, ступінь ідентичності між двома амінокислотними послідовностями можна визначити за алгоритмом Мееаієтап апа МУип5сп 1(122|Ї. Множинні співставлення переважно виконуються за допомогою алгоритму Сіизіа! УМ (23) (він використовується, наприклад, у програмному забезпеченні Месіог МТІ Адмапсеф версії 11.5; Іпмігодеп Іпос.).
Так, в одному втіленні область Мн за амінокислотною послідовністю щонайменше на 90 95, на 95 95, на 97 96 або на 99 95 ідентична щонайменше одній амінокислотній послідовності, наведеній в числі послідовностей Мн із групи, яка складається з: а) послідовності Мн, наведеної в 5ХЕО ІЮ МО:6; р) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮО МО:8; с) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:7; і а) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:9.
В одному кращому втіленні область Мн за амінокислотною послідовністю щонайменше на 9695 ідентична щонайменше одній амінокислотній послідовності, наведеній в числі послідовностей Мн із групи, яка складається з: а) послідовності Мн, наведеної в 5ХЕО ІЮ МО:6; р) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:8; с) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:7; і а) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:9.
В одному втіленні область Мі за амінокислотною послідовністю щонайменше на 90 95, на 9595, на 9795 або на 99595 ідентична щонайменше одній амінокислотній послідовності, наведеній в числі послідовностей Мі із групи, яка складається з: а) послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:10; р) послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:11; і с) послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:12.
В одному кращому втіленні область Мі за амінокислотною послідовністю щонайменше на 9595 ідентична щонайменше одній амінокислотній послідовності, наведеній в числі послідовностей М із групи, яка складається з:
Ко) а) послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:10; р) послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:11; і с) послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:12.
В одному втіленні область Мн обрана із групи, яка складається з: а) послідовності Мн, наведеної в 5ХЕО ІЮ МО:6; р) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮО МО:8; с) послідовності Мн, наведеної в хЕО ІЮ МО:7; і а) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:9.
В одному втіленні область Мі обрана із групи, яка складається з: а) послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:10; р) послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:11; і с) послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:12.
В одному втіленні тільки послідовність Мн або Мі на 100 95 ідентична одній з наведених тут послідовностей, тоді як інша за амінокислотною послідовністю може бути щонайменше на 90 95, на 95 95, на 97 95 або на 99 95 ідентична одній з наведених тут послідовностей.
В одному кращому втіленні амінокислотна послідовність Мн щонайменше на 97 95 ідентична щонайменше одній амінокислотній послідовності, наведеній в числі послідовностей Мн із групи, яка складається з: а) послідовності Мн, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:6; р) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮО МО:7;
БО с) послідовності Мн, наведеної в зЕО ІЮ МО:8; і а) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:9. а амінокислотна послідовність Мі щонайменше на 9595 ідентична щонайменше одній амінокислотній послідовності, наведеній в числі послідовностей М із групи, яка складається з: ї) послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:10; ії) послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІО МО:11; і ії) послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:12.
В одному втіленні послідовності Мн і Мі обрані із групи, яка складається з: а) послідовностей Мн і Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовностям, наведеним в
ЗЕО ІЮ МО:6 і 10, відповідно; 7 і 10, відповідно; 8 і 10, відповідно; 9 ії 10, відповідно; 6 і 11, 60 відповідно; 7 і 11, відповідно; 8 і 11, відповідно; 9 ії 11, відповідно; 6 і 12, відповідно; 7 і 12,
відповідно; 8 і 12, відповідно; і 9 і 12, відповідно;
Юр) послідовностей Мн і Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовностям, наведеним в
ЗЕО ІЮ МО:6 і 10, відповідно; 7 і 10, відповідно; 8 і 10, відповідно; 9 і 10, відповідно; 6 і 11, відповідно; 7 і 11, відповідно; 8 і 11, відповідно; 9 ї 11, відповідно; 6 і 12, відповідно; 7 і 12, відповідно; 8 і 12, відповідно; і 9 і 12, відповідно; с) послідовностей Мн і Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовностям, наведеним в
ЗЕО ІЮ МО:6 і 10, відповідно; 7 і 10, відповідно; 8 і 10, відповідно; 9 ії 10, відповідно; 6 і 11, відповідно; 7 і 11, відповідно; 8 і 11, відповідно; 9 ї 11, відповідно; 6 і 12, відповідно; 7 і 12, відповідно; 8 і 12, відповідно; і 9 і 12, відповідно; а) послідовностей Мн і Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовностям, наведеним в
ЗЕО ІЮ МО:6 і 10, відповідно; 7 і 10, відповідно; 8 і 10, відповідно; 9 ії 10, відповідно; 6 і 11, відповідно; 7 і 11, відповідно; 8 і 11, відповідно; 9 ї 11, відповідно; 6 і 12, відповідно; 7 і 12, відповідно; 8 і 12, відповідно; і 9 і 12, відповідно; е) послідовностей Мн і Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовностям, наведеним в
ЗЕО ІЮ МО:6 і 10, відповідно; 7 і 10, відповідно; 8 і 10, відповідно; 9 і 10, відповідно; 6 і 11, відповідно; 7 і 11, відповідно; 8 і 11, відповідно; 9 ї 11, відповідно; 6 і 12, відповідно; 7 і 12, відповідно; 8 і 12, відповідно; і 9 і 12, відповідно;
І) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; 9) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
І) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ї) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
Ко) |) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
К) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в хЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
І) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО 10
МО:10, 11 або 12; т) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; п) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; о) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; р) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
БО МО:10, 11 або 12; а) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; г) послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; 5) послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; 60 У послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; и) послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; м) послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; х) послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в хЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; у) послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; 7) послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; аа) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; аб) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ас) послідовностей Ун, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ад) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО;:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
Ко) ае) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; аї) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ад) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ап) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО;:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в 5ЕО 10
МО:10, 11 або 12; аї) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; а)) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ак) послідовностей Ун, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в хЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
БО МО:10, 11 або 12; а!) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО;:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ат) послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ап) послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; 60 ао) послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ар) послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО;:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ад) послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; аг) послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; аз) послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ау послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ
МО:7, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ра) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; рр) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; рс) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ра) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
Ко) ре) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
БО) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; род) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
БП) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в хЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; рі) послідовностей Ун, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
Бі) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
БК) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
БО МО:10, 11 або 12;
БІ) послідовностей Ун, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; рт) послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; рп) послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; 60 ро) послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; рр) послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ра) послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в 5ХЕО 10
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
Бг) послідовностей Ун, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ро) послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
БО послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:8, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; са) послідовностей Ун, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; с) послідовностей Ун, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; сс) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО 10
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; са) послідовностей Мн, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
Ко) се) послідовностей Ун, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; с) послідовностей Мн, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; сод) послідовностей Ун, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; сі) послідовностей Ун, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; сі) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; сі) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
СК) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО 10
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
БО МО:10, 11 або 12;
СІ) послідовностей Мн, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ст) послідовностей Мн, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; сп) послідовностей Ун, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; 60 со) послідовностей Ун, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; ср) послідовностей Ун, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в зЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; са) послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 90 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; сг) послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 95 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12; с5) послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 97 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
СО послідовностей Мн, щонайменше на 100 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:9, і послідовностей Мі, щонайменше на 99 95 ідентичних послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ
МО:10, 11 або 12;
В одному втіленні єднальна область містить Мн і Мі, обрані із групи, яка складається з: а) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:6, і послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІО МО:10; р) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовності Мі, наведеної в хЕО ІЮ МО:10; с) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:9, і послідовності Мі, наведеної в 5ХЕО ІЮ МО:10; а) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:6, і послідовності Мі, наведеної в 5ХЕО ІЮ МО:11; е) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:6, і послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:12;
У) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІО МО:7, і послідовності Мі, наведеної в ХЕО ІЮ МО:10; 9) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:7, і послідовності Мі, наведеної в 5ХЕО ІЮ МО:11;
Р) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮО МО:7, і послідовності Мі, наведеної в ЗХЕО ІЮ МО:12; ї) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:11; )) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:12;
К) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:9, і послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:11; і
І) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮО МО:9, і послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:12.
У кращому втіленні єднальна область містить послідовність Мн і послідовність Мі, обрані із групи, яка складається з: а) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:6, і послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІО МО:10; р) послідовності Мн, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:8, і послідовності Мі, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:10; і с) послідовності Мн, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:9, і послідовності Мі, наведеної в 5ХЕО ІЮ МО:10.
Гуманізовані антитіла за даним винаходом можуть бути отримані шляхом порівняння амінокислотних послідовностей варіабельної області важкого й легкого ланцюга за всією базою даних гаметних послідовностей варіабельних областей людини для того, щоб ідентифікувати послідовності важкого й легкого ланцюга людини з відповідним ступенем гомології для використання як каркаса варіабельних областей людини. Можна скласти цілий ряд гуманізованих варіабельних областей важкого й легкого ланцюга шляхом пересадження ділянок
СОК, наприклад, миші, у каркасні ділянки (ідентифіковані, як описано вище), і, якщо потрібно, за допомогою зворотних мутацій (мутацій одного або декількох амінокислотних залишків людини в каркасних ділянках назад в амінокислоти не людини в певних положеннях) на конкретну послідовність тих ідентифікованих залишків миші, які можуть мати вирішальне значення для відновлення ефективності зв'язування у антитіла. Потім можна відібрати варіанти послідовностей з найменшим рівнем потенційних Т-клітинних епітопів, визначених із застосуванням технологій іп 5іїїсо: Горе м ії ТСЕО тм ((24), (251 і (261).
Крім того, гуманізовані антитіла за даним винаходом також можна "деїімунізувати".
Деїімунізація може бути бажана, оскільки наявність Т-клітинних епітопів людини в послідовності такого білка, як гуманізоване антитіло за даним винаходом, може збільшити ступінь ризику імуногенності, тому що вони мають потенціал для активації хелперних Т-клітин. Такої активації хелперних Т-клітин можна уникнути шляхом деїімунізації. Деіїмунізація може здійснюватися шляхом уведення мутацій в амінокислотну послідовність гуманізованого антитіла для того, щоб вилучити Т-клітинні епітопи без істотного зниження спорідненості зв'язування у антитіла.
Так, в одному втіленні даного винаходу, гуманізоване антитіло може бути отримане способом, що має стадії: (і) порівняння повної послідовності варіабельної області важкого 60 ланцюга не людини й/або повної послідовності варіабельної області легкого ланцюга не людини за базою даних гаметних послідовностей людини, (ії) вибору гаметної послідовності людини з найбільшою гомологією до послідовності не людини, одержуючи гуманізовану послідовність, (її) оптимізації гуманізованої послідовності за допомогою зворотних мутацій, якщо потрібно, і (їм) експресії цієї послідовності в придатній системі експресії.
Таким чином, повнорозмірне антитіло за даним винаходом можна одержати способом, що має стадії: (ї) порівняння послідовності варіабельної області важкого ланцюга не людини й послідовності варіабельної області легкого ланцюга не людини за базою даних гаметних послідовностей людини, (ії) вибору гаметної послідовності людини з найбільшою гомологією до послідовності не людини, (ії) пересадження ділянок СОМ не людини в обрану гаметну послідовність людини, одержуючи гуманізовані послідовності, (ім) оптимізації гуманізованих послідовностей за допомогою зворотних мутацій, якщо потрібно, (м) визначення послідовностей константних областей важкого й легкого ланцюга, і (мі) експресування повної послідовності важкого ланцюга й повної послідовності легсого ланцюга в придатних системах експресії.
Повнорозмірне антитіло за даним винаходом може бути отримане так, як описано в прикладі 1.
Одержання повнорозмірного антитіла, виходячи з послідовностей СОМ або повних послідовностей варіабельних областей, перебуває в компетенції фахівців. Отже фахівцям повинно бути відомо, як одержати повнорозмірне антитіло за даним винаходом.
Термін "повна послідовність важкого ланцюга" у даному винаході відноситься до послідовності, яка складається з послідовностей варіабельної області важкого ланцюга й константної області важкого ланцюга.
Термін "повна послідовність легкого ланцюга" у даному винаході відноситься до послідовності, яка складається з послідовностей варіабельної області легкого ланцюга й константної області легкого ланцюга.
Зворотні мутації можна вводити стандартними методами мутагенезу ДНК. Такі стандартні методи мутагенезу ДНК описані в (18). З іншого боку, можна використовувати комерційно доступні набори типу Оціскспапде"м Зпйе-Оігесієй Мшіадепевзів Кії (Зігаїадепе) або ж уводити потрібні зворотні мутації методом синтезу ДНК де помо.
Отже, в одному втіленні антитіло є гуманізованим антитілом.
Химерні антитіла можуть бути отримані шляхом заміни всіх послідовностей константної області антитіла не людини (типу миші) на послідовності константної області з людини. Таким чином, у химерного антитіла зберігаються повні послідовності варіабельної області не людини.
Так, химерні антитіла за даним винаходом можуть бути отримані способом, що включають стадію експресування послідовностей варіабельної області важкого ланцюга не людини (ЗЕО
ІО МО: 27) і варіабельної області легкого ланцюга не людини (5ЕО ІЮ МО: 28), послідовностей константної області важкого ланцюга людини й константної області легкого ланцюга людини в придатних системах експресії, одержуючи при цьому повнорозмірне химерне антитіло. Можна використовувати й альтернативні способи. Такі способи одержання химерних антитіл перебувають у компетенції фахівців, тому фахівцям повинно бути відомо, як одержати химерне антитіло за даним винаходом.
Отже, в одному втіленні антитіло є химерним антитілом.
В одному втіленні антитіло є повнорозмірним антитілом. Термін "повнорозмірне антитіло" у даному винаході відноситься до таких антитіл (наприклад, вихідних або варіантів антитіл), у яких усі константні й варіабельні домени важкого й легкого ланцюга відповідають тим, що зазвичай зустрічаються в антитілах дикого типу цього ізотипа.
В одному втіленні антитіло містить область Ес, яка містить перший і другий важкий ланцюг імуноглобуліну.
Термін "Рс-область" у даному винаході відноситься до області, яка містить у напрямку від М- кінця до С-кінця, як мінімум шарнірну ділянку, область Сн2 і область Сн3. Ес-область також може містити область Сні на М-кінці шарнірної ділянки.
Термін "шарнірна ділянка" у даному винаході відноситься до шарнірної ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну. Так, наприклад, шарнірна ділянка антитіла типу ІДС! людини відповідає амінокислотам 216-230 за нумерацією Еи, наведеною в КаБбаї.
Якщо не зазначене інакше або не суперечить контексту, амінокислоти в послідовності константної області пронумеровані тут відповідно до індексу нумерації Еи (описаним в (271) |і можуть іменуватися " відповідно до нумерації Ем, наведеної в Кабаї", "нумерацією ЕЄи згідно
Кабваї" або "за системою нумерації Еи".
Термін "область Сні" або "домен Сні" у даному винаході відноситься до області Сні важкого ланцюга імуноглобуліну. Так, наприклад, область Сні антитіла типу (91 людини відповідає амінокислотам 118-215 за системою нумерації Еи. Проте, область Сні також може 60 бути будь-якого з інших підтипів, як описано тут.
Термін "область Сн2" або "домен Сн2" у даному винаході відноситься до області Сн2 важкого ланцюга імуноглобуліну. Так, наприклад, область Сн2 антитіла типу (ДС1 людини відповідає амінокислотам 231-340 за системою нумерації Еи. Проте, область Сн2 також може бути будь-якого з інших підтипів, як описано тут.
Термін "область Сн3" або "домен Сн3" у даному винаході відноситься до області СнЗ3 важкого ланцюга імуноглобуліну. Так, наприклад, область Сн3 антитіла типу (ДС1 людини відповідає амінокислотам 341-447 за системою нумерації Еи. Проте, область Сн3 також може бути будь-якого з інших підтипів, як описано тут.
В одному втіленні ізотип важкого ланцюга імуноглобуліну обраний із групи, яка складається з 91, Ід52, ІДОЗ і І(дс4. Важкий ланцюг імуноглобуліну може бути будь-якого алотипу в межах кожного із класів імуноглобулінів, таких як (91 т() (5ЕО ІЮ МО: 15). Так, в одному кращому втіленні ізотипом важких ланцюгів імуноглобуліну є ЇДС1 або будь-який його алотип, як от
ІЯСс1т( (ЗЕО ІЮ МО: 15).
При впливі на антиген СОЗ, який входить до складу Т-клітинного рецептора (ТСЕ), бажані специфічні до Т-клітин механізми знищення клітин. Інші ефекторні функції, наприклад, активація комплементу, можуть бути небажаними, тому бажане зниження ефекторних функцій.
Зв'язування Сід є першою стадією каскаду комплементу, тому воно служить індикатором залежної від комплементу цитотоксичності (СОС) антитіл. Якщо можна уникнути зв'язування
С14 з антитілом, то можна уникнути й активації каскаду комплементу.
Так, в одному втіленні антитіло включає Ес-область, яка була модифікована так, щоб зв'язування Сід з даним антитілом зменшилося у порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 70 95, на 80 95, на 90 95, на 95 95, на 97 9б, на 99 95 або на 100 95 при визначенні зв'язування з С14 методом ЕГІЗА.
Термін "модифікована" у даному винаході відноситься до такої амінокислотної послідовності
Ес-області, яка не ідентична амінокислотній послідовності Ес-області дикого типу. Тобто амінокислотні залишки в певних положеннях Ес-області дикого типу були замінені, вилучені або вставлені для того, щоб змінити, приміром, сайт зв'язування з С1д, сайти зв'язування для інших ефекторних молекул або зв'язування з Ес-рецепторами (ЕСЕ). Такі модифікації амінокислотної послідовності можуть бути отримані шляхом заміни однієї або декількох амінокислот на
Зо консервативну амінокислоту або ж шляхом заміни однієї або декількох амінокислот на альтернативну амінокислоту, яка фізично й/або функціонально аналогічна амінокислоті, присутній у дикого типу. Заміни також можуть бути отримані шляхом заміни на неконсервативну амінокислоту.
У контексті даного винаходу, амінокислоти можуть бути описані як консервативні або неконсервативні, тому їх можна класифікувати відповідним чином. Амінокислотні залишки також можна підрозділити на класи за альтернативними фізичними і функціональними властивостями.
Так, класи амінокислот можна представити у вигляді однієї або обох з нижченаведених таблиць.
Амінокислотні залишки з консервативних класів
Альтернативна фізична й функціональна класифікація амінокислотних залишків . . А, С, Б, б, Н.І, І, М, ЕЙ, Т, М, Мі . . А, С,0,Е,б,Н,К,М, ОО, КК, 5, Рі
У контексті даного винаходу, заміни в антитілах типу гуманізованих або химерних антитіл позначаються як: вихідна амінокислота - положення - амінокислота, що заміняє.
Відносно загальноприйнятої номенклатури для амінокислот, застосовується трибуквений код або однобуквений код, включаючи коди Хаа і Х для позначення будь-якого амінокислотного залишку. Відповідно, позначення "І 234Е" або "Гец234РПе" означає, що антитіло містить заміну лейцину на фенілаланін у положенні амінокислоти 234.
Заміна амінокислоти в заданому положенні на будь-яку іншу амінокислоту позначається як: вихідна амінокислота - положення; наприклад, "І 234".
Для таких модифікацій, при яких вихідна амінокислота й/або амінокислота, що заміняє, може містити більш ніж одну, але не всі амінокислоти, ці більш ніж одна амінокислоти можуть відділятися через "7" або "/". Наприклад, заміна лейцину на фенілаланін, аргінін, лізин або триптофан у положенні 234 позначається як: "Гец234Рпе, Аго, Гуз, Тгр"' або "Геш234Рпе/АгаЛуз/Лтр" або "1234, БК, МУ" або "/234Р/Б/КЛИ" або "1234 на Р, Е, К або МУ".
Такі позначення можуть застосовуватися взаємозамінно в контексті даного винаходу, але вони мають те саме значення й зміст.
Крім того, термін "заміна" охоплює заміни на будь-які з інших 19 природних амінокислот або ж на інші амінокислоти типу, що не зустрічаються в природі амінокислот. Наприклад, заміна амінокислоти Ї. у положенні 234 містить у собі кожну з наступних замін: 234А, 234С, 2340, 234Е, 234, 2340, 234Н, 2341, 234К, 234М, 234М, 2340, 234, 2345, 234, 234, 23А4МУ, 234Р і 234У. До речі, це еквівалентно позначенню 234Х, де Х означає будь-яку амінокислоту, крім вихідної. Ці заміни також можуть позначатися як 1 234А, 1 234 і т.д., або І 234А, С і т.д., або жі 234А/С/ і т.д.
Те ж саме за аналогією відноситься до кожного з наведених тут положень, так що вони конкретно включають будь-які наведені тут заміни.
Антитіло за винаходом також може містити делецію амінокислотного залишку. Такі делеції позначаються "де!" ї включають, приміром, написання у вигляді І 234деїЇ. Таким чином, у таких втіленнях лейцин у положенні 234 був вилучений з амінокислотної послідовності.
Зо Терміни "амінокислота" і "амінокислотний залишок" можуть застосовуватися тут взаємозамінним чином.
Термін "зв'язування С1д" у даному винаході відноситься до зв'язування С14 з антитілом, коли дане антитіло зв'язане зі своїм антигеном. Термін "зв'язане зі своїм антигеном" у даному винаході відноситься до зв'язування антитіла зі своїм антигеном як іп мімо, так і іп міго.
Термін "зменшувати" у даному винаході відносно зв'язування Сід означає здатність антитіла за винаходом зменшити, мінімізувати або навіть повністю інгібувати зв'язування С14 з антитілом у порівнянні зі зв'язуванням С14 з антитілом дикого типу.
Термін "антитіло дикого типу" у даному винаході відносно застосування при порівняльних аналізах антитіл за даним винаходом відноситься до таких антитіл, які ідентичні антитілу, що підлягає аналізу, але не є інертними. При цьому термін "інертні" означає те, що в модифікованої
Ес-області знижене або відсутнє зв'язування з С14 при визначенні його як у прикладі 10, тобто при визначенні зв'язування з С1д методом ЕГІ5ЗА; знижена або відсутня Ес-опосередкована проліферація Т-клітин при визначенні її як у прикладі 4, тобто при вимірюванні проліферації Т- клітин методом функціонального аналізу на основі мононуклеарів периферичної крові (РВМС); і або знижена або відсутня Ес-опосередкована експресія СОб69 при визначенні її як у прикладі 3, тобто при визначенні Ес-опосередкованої експресії СО69 методом функціонального аналізу на основі РВМО. Так, антитіло дикого типу містить амінокислоти, які зустрічаються в природі у важких ланцюгах імуноглобуліну, тобто таке антитіло не містить ніяких модифікацій амінокислот, які можуть змінити або зменшити здатність антитіла до взаємодії, наприклад, з
Ста, Ес-рецепторами й т.п. При цьому антитіло дикого типу повинне залишатися активуючим антитілом, яке здатне зв'язуватися, наприклад, з С1д. Антитіла дикого типу й антитіла за даним винаходом можуть містити інші модифікації амінокислот, ніж ті, які стосуються здатності антитіла індукувати ефекторні функції, наприклад, щоб одержати з них біспецифічні антитіла.
Термін "ЕГІБА" у даному винаході означає імуноферментний твердофазний аналіз, тобто тест, у якому для ідентифікації субстанції використовуються антитіла й зміна забарвлення. На поверхні планшета фіксується перше специфічне антитіло. Потім додають білок зі зразка, при цьому тестують зв'язування даного першого специфічного антитіла. Додають друге антитіло, що зв'язується з антитілом зі зразка. Друге антитіло пов'язане з ферментом, і на кінцевій стадії додається субстанція, що містить субстрат для ферменту. Наступна реакція дає детектований 60 сигнал, найчастіше зміну забарвлення субстрату. Концепція методу ЕГІЗА добре відома в даній області, і передбачені різні способи виконання ЕГІ5А у складі способу визначення антитіла за винаходом. Таким чином, дана інтерпретація не повинна сприйматися як обмежувальна, оскільки можуть застосовуватися різні форми ЕГІЗА типу описаних у прикладі 4.
Зокрема, здатність антитіл за даним винаходом зв'язуватися з С1д можна визначати методом ЕГІЗА, що включає стадії: (ії) покриття даним антитілом 96-коміркового планшета, (ії) додавання З 95 сироватки, (ії) додавання антитіла проти С14 людини, (ім) проявлення планшета й (м) вимірювання ОЮзлознм Так, в одному втіленні антитіло включає Ес-область, яка була модифікована таким чином, що зв'язування С14 з даним антитілом зменшилося у порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 70 95, на 80 95, на 90 95, на 95 95, на 97 95 або на 100 95, причому зв'язування з С14 визначається методом ЕГІЗА, що включає стадії: (і) покриття даним антитілом 96-коміркового планшета, (ії) додавання З 95 сироватки, (ії) додавання антитіла проти
Стд людини, (ім) проявлення планшета й (м) вимірювання ОЮхознм Так, у кращому втіленні зв'язування С14 визначається, як описано в прикладі 10.
Терміни "Рс-рецептор" або "ЕСЕ" у даному винаході відносяться до білка, що перебуває на поверхні деяких клітин. Ес-рецептор зв'язується з Ес-областю антитіл. Є кілька різних типів
Ес, які класифікують на основі типу антитіл, які вони розпізнають. Наприклад, Есу-рецептори (гама) зв'язуються з антитілами із класу дО.
Терміни "Есу-рецептор", "РГс-гамма-рецептор" або "Есук" у даному винаході відносяться до тієї групи Ес-рецепторів, які належать до надсімейства імуноглобулінів і є найбільш важливими
Ес-рецепторами для індукування фагоцитозу опсонізованих (покритих антитілами) мікробів. Це сімейство містить у собі декілька представників: Есукі (СО64), ЕсумПа (СО32а), ЕсукЬ (СО32Б),
ЕсУукШа (СО1ба), ЕсукІЬ (СО16Б), які відрізняються за спорідненістю до антитіл через відмінності в молекулярній структурі.
Ес-опосередковані ефекторні функції є частиною біологічної активності молекул імуноглобуліну з (40) людини. Приклади таких ефекторних функцій включають, наприклад, залежну від антитіл опосередковану клітинами цитотоксичність (АОСС) і залежну від комплементу цитотоксичність (СОС), які запускаються при зв'язуванні різних ефекторних молекул з Ео-областю. У контексті даного винаходу "Ро-зв'язування", "зв'язування з Ес- рецептором", "зв'язування з ЕСЕ" і "зв'язування Ес-області антитіла з ЕСЕ" відносяться до
Зо зв'язування Ес-області з Ес-рецептором (БСК) або ефекторною молекулою. Терміни "зв'язування з Есук" і "зв'язування Есукі" відносяться до зв'язування Ес-області з Ес-гамма- рецептором і Ес-гамма-рецептором І, відповідно. При зв'язуванні антитіл до СОЗ з Т-клітинами
Ес-область антитіла дикого типу до СОЗ зв'язується з ЕсК5, що перебувають на інших клітинах, наприклад, моноцитах, що веде до неспецифічної Ес-опосередкованої активації Т-клітин. Така неспецифічна Ес-опосередкована активація Т-клітин може бути небажаною. Т-клітини також можуть бути активовані шляхом прицільної або адресної активації Т-клітин. Така адресна активація Т-клітин може бути досить бажана при лікуванні цілого ряду показань, таких як рак.
Термін "адресна активація Т-клітин" у даному винаході означає спрямованість Т-клітин на певні клітини типу пухлинних клітин за допомогою біспецифічного антитіла, що містить першу ділянку зв'язування для зв'язування з конкретною мішенню типу ракової мішені на пухлинних клітинах і другу ділянка зв'язувань для зв'язування зі специфічною для Т-клітин мішенню типу СОЮЗ. Таким чином, таргетинг Т-клітин на певні клітини, наприклад, пухлинні клітини, може полегшуватися за допомогою біспецифічного антитіла, у якого одна з ділянок зв'язування зв'язується з СОЗ, присутнім на Т-клітинах, а інша ділянка зв'язування зв'язується зі специфічним антигеном мішені, наприклад, на пухлинній клітині. При цьому усе ще може бути можлива неспецифічна,
Ес-опосередкована активація Т-клітин, тому такої неспецифічної, Ес-опосередкованої активації
Т-клітин за допомогою Ес-опосередкованої зшивки слід уникати і її можна відключити, зробивши
Ес-область інертною для такої активності. Тим самим буде запобігатися взаємодії такої інертної
Ес-області із присутніми Ес-рецепторами. При тестуванні декількома різними методами було доведено, що гуманізоване антитіло за даним винаходом є інертним, наприклад, див. приклади 3-5. Інше досліджене антитіло до СОЗ, пиСІ В-13/4, що містить амінокислотні модифікації в Ес- області, також виявилося інертним при тестуванні різними методами, наприклад, див. приклади 7-10. Гуманізоване антитіло до СЮОЗ за даним винаходом, що містить амінокислотні заміни
І234РЕ, 1І235Е і 0265А, як описано в прикладах, проявляло низькі рівні експресії СО69 на Т- клітинах (приклад 3), усунення Ес-опосередкованої проліферації Т-клітин (приклад 4) і відсутність неспецифічного знищення мішені при використанні у вигляді біспецифічного антитіла (приклад 5). Таким чином, гуманізоване антитіло за даним винаходом проявляє чудові результати при аналізі декількома методами в порівнянні з антитілом дикого типу.
Антитіло за даним винаходом може містити модифікації в Ес-області. Коли антитіло містить бо такі модифікації, воно може стати інертним або неактивуючим антитілом. Термін "інертність",
"інертна" або "неактивуюча" у даному винаході відноситься до такої Ес-області, яка, щонайменше, не здатна зв'язуватися з Есу-рецепторами, індукувати Ес-опосередковану зшивку
ЕсК5 або викликати ЕсК-опосередковану зшивку антигенів мішені через дві Ес-області індивідуальних антитіл або не здатна зв'язуватися з С19. Інертність Ес-області гуманізованого або химерного антитіла до СОЗ переважно тестують за допомогою антитіла в моноспецифічному форматі, хоча ідентифікована при цьому інертна Ес-область може використовуватися в біспецифічних або інших гуманізованих або химерних поліспецифічних антитілах до СОЗ.
Для розробки терапевтичних антитіл можна сконструювати кілька варіантів, щоб зробити Ес- область антитіла неактивною для взаємодії з Ес-гамма-рецепторами й з С1д. Приклади таких варіантів описані тут.
Так, в одному втіленні антитіло містить Ес-область, яка була модифікована так, щоб дане антитіло викликало зниження Ес-опосередкованої проліферації Т-клітин у порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 50 95, на 60 95, на 70 95, на 80 95, на 90 95, на 99 95 або на 100 95 при вимірюванні такої проліферації Т-клітин методом функціонального аналізу на основі мононуклеарів периферичної крові (РВМО).
Термін "зниження" у даному винаході означає зниження активності або експресії в порівнянні з контрольним білком типу антитіла. Зокрема, термін "зниження" відносно проліферації Т-клітин означає здатність антитіла за винаходом зменшувати, мінімізувати або навіть повністю інгібувати проліферацію Т-клітин у порівнянні з антитілом дикого типу. Здатність антитіл знижувати проліферацію Т-клітин може бути оцінена методом функціонального аналізу на основі РВМС, як описано в прикладі 4 і прикладі 8. В одному втіленні аналіз проводиться на
РВМС людини. В іншому втіленні аналіз проводиться на РВМС макаки-крабоїда. У ще одному втіленні аналіз проводиться на РВМС макаки-резус. Оскільки антитіла за даним винаходом мають перехресну реактивність, то описаний тут аналіз на основі РВМС може виконуватися на
РВМС будь-якого виду, що проявляє зниження проліферації Т-клітин, якщо тільки РВМО використовуваного виду перебувають у межах спектра перехресної реактивності антитіл, наприклад, людини, макаки-крабоїда або макаки-резус.
Термін "функціональний аналіз на основі мононуклеарів периферичної крові (РВМО)" у даному винаході відноситься до методу, який застосовується для оцінки такої функціональної ознаки антитіл за даним винаходом, як здатність даного антитіла впливати на проліферацію Т- клітин або експресію СОб69, при якому присутні тільки клітини - мононуклеари периферичної крові. Так, в одному втіленні проліферація Т-клітин вимірюється способом, який включає стадії інкубації РВМС з антитілом у діапазоні 1-1000 нг/мл при 37 "С у зволожувальному інкубаторі з 5 95 (об/06) СО» протягом трьох днів, додавання хімічної сполуки типу Вга), яка вбудовується в
ДНК проліферуючих клітин, інкубування протягом 5 годин, осадження клітин, висушування клітин, необов'язкове зберігання клітин при 4 "С, нанесення клітин на планшет для ЕГІ5А, інкубування з антитілом проти Вгди з пероксидазою протягом 90 хв. за кімнатної температури, розвиток фарбування протягом 30 хв. із 1 мг/мл 2,2'-азіно-біс(З-етилбензотіазолін-б- сульфонової кислоти), додавання 100 мкл 2 90 щавелевої кислоти для зупинки реакції й вимірювання оптичної щільності при 405 нм на придатному зчитувальному обладнанні.
Термін "проліферація" у даному винаході позначає ріст клітин у контексті поділу клітин.
Термін "ВгаО" у даному винаході означає 5-бром-2-дезоксиуридин, який є гомологом тімідина. При додаванні ВгаШ у культуру клітин на обмежений період часу (наприклад, 4 години) він буде вбудовуватися в ДНК проліферуючих клітин. Детектування включеного Вг(дО може проводитися після фіксації клітин методом ЕГІЗА за допомогою антитіла проти ВгаО з пероксидазою. Таким чином, включення ВгаШ є заходом проліферації.
В одному втіленні антитіло містить Ес-область, яка була модифікована так, щоб дане антитіло знижувало Ес-опосередковану експресію СО69 щонайменше на 50 95, на 60 95, на 7095, на 8095, на 90 95, на 9995 або на 10095 у порівнянні з антитілом дикого типу при визначенні Ес-опосередкованої експресії СО6У методом функціонального аналізу на основі
РВМО.
Термін "зниження" у даному винаході означає зниження активності або експресії в порівнянні з контрольним білком типу антитіла. Зокрема, термін "зниження" відносно рівня експресії маркера активації Т-клітин СО69 означає зниження рівня експресії СО69 у порівнянні з рівнем експресії СО69 при зв'язуванні Т-клітин з антитілом дикого типу, за умови, що єднальні ділянки обох антитіл зв'язуються з СОЮЗ. Здатність антитіл знижувати експресію СО69 може бути оцінена методом функціонального аналізу на основі РВМС, як описано в прикладі З і прикладі 7.
Так, в одному втіленні експресія СО69 вимірюється способом, який включає стадії інкубації бо РВМС з антитілом у діапазоні 1-1000 нг/мл при 37 "С у зволожувальному інкубаторі з 5 95
(об/06) СО» протягом 16-24 годин, відмивання клітин, фарбування клітин при 4 "С за допомогою мишачого антитіла проти СО28 людини с РЕ і мишачого антитіла проти СО69 людини с АРС і визначення експресії СО69 на СО 28-позитивних клітинах методом проточної цитометрії.
Термін "СО69" у даному винаході відноситься до кластера диференціювання 69, який є трансмембранним білком людини типу лектина С, кодований геном СОб9. Активація Т- лімфоцитів і клітин нормальних кілерів (МК), як іп мімо, так і іп міго, індукує експресію СОб9.
СО69 функціонує в якості рецептора, який передає сигнал, бере участь у явищах активації клітин, включаючи проліферацію, функціонує в якості рецептора, який передає сигнал у лімфоцитах, включаючи клітини нормальних кілерів, і в тромбоцитах, і індукції певних генів.
Термін "функціональний аналіз на основі мононуклеарів периферичної крові (РВМО)" у даному винаході відноситься до методу, який застосовується для оцінки такої функціональної ознаки антитіл за даним винаходом, як здатність даного антитіла впливати на проліферацію Т- клітин або експресію СОб69, при якому присутні тільки клітини - мононуклеари периферичної крові. Функціональний аналіз на основі РВМС, який описано в прикладах 3, 4, 5 і 7, включає стадії: (ї) інкубації РВМС з антитілом при 37 "С в зволожувальному інкубаторі з 5 95 (0б/06) СО» протягом 16-24 годин, (ії) відмивання клітин, (ії) фарбування клітин при 4 "С за допомогою мишачого антитіла проти СО28 людини з РЕ і мишачого антитіла проти СО69 людини з АРС і (м) визначення експресії СО69 на СО 28-позитивних клітинах методом проточної цитометрії, коли визначається експресія СО69. Так, в одному втіленні експресія СО69 визначається, як описано в прикладі 3, 4, 5 або 7.
Отже, можна модифікувати ті амінокислоти в Ес-області, які відіграють головну роль у взаємодії з С1д і Ес-гамма-рецепторами. Приклади положень амінокислот, які можна модифікувати, включають положення 1 234, І 235 і Р331. Їхні комбінації типу І234Е/ 235Е/Р3315 можуть викликати сильне зниження зв'язування з СО64, СОЗ2А, СО16 і СТ14 людини.
Тому в одному втіленні, щонайменше в одному положенні, що відповідає І 234, І 235 і РЗЗ31, може бути амінокислота А, А і 5, відповідно (Г11, (281). Крім того, амінокислотні заміни І234БЕ і
Ї235Е можуть привести до усунення взаємодії Ес-області з Ес-гамма-рецепторами й Ста (291-
ЇЗОЇ). Тому в одному втіленні, у положеннях, що відповідають 1234 і 1235, можуть бути амінокислоти Е і Е, відповідно. Амінокислотна заміна 0265А може знижувати зв'язування з усіма
Зо Ес-гамма-рецепторами й запобігати АОСС (І31Ї). Тому в одному втіленні, у положенні, що відповідає 0265, може бути амінокислота А. Зв'язування з С1д може усуватися при мутаціях у положеннях 0270, К322, РЗ329 і РЗ31. Мутації в цих положеннях на 0270А, на КЗ322А або на
РЗ29А або на РЗЗ1А можуть зробити антитіло дефектним за активністю СОС (ІЗ321). Тому в одному втіленні, щонайменше в одному положенні, що відповідає 0270, КЗ322, РЗ329 їі РЗЗ1, можуть бути амінокислоти А, А, А і А, відповідно.
Альтернативний підхід до мінімізації взаємодії Ес-області з Рс-гамма-рецепторами й С14 полягає у видаленні сайту глікозилювання у антитіла. Мутації в положенні М297, наприклад, на
О, А або Е, усувають сайт глікозилювання, який відіграє вирішальну роль у взаємодіях Ідс-Есу- рецептор. Тому в одному втіленні, у положенні, що відповідає М297, може бути амінокислота б,
О, А або Е (ІЗ33Ї). В іншому альтернативному підході мінімізація взаємодії Ес-області з Ес-гамма- рецепторами досягається при наступних мутаціях: Р2З8А, АЗ27О0, РЗ29А або
Е2ЗЗР/Л 234М/ 235А/с236аве! (ІЗ11).
З іншого боку, підкласи Ідб2 і Ідсб4 людини вважаються природно дефектними за взаємодіями з С14 і Ес-гамма-рецепторами, хоча й були повідомлення про взаємодії з Есу- рецепторами (Ес-гамма-рецепторами) (І341-І351). В обох ізотипів можуть бути отримані мутації, що усувають ці залишкові взаємодії, що веде до зменшення небажаних побічних ефектів, пов'язаних зі зв'язуванням з ЕРсК. Для Ідс2 вони включають І 234А і С237А, а для Ідс4 - І 235Е.
Тому в одному втіленні, у положеннях, що відповідають І 234 і 5237 у важкому ланцюзі Ід52 людини, можуть бути амінокислоти А і А, відповідно. В одному втіленні, у положенні, що відповідає І 235 у важкому ланцюзі 954 людини, може бути амінокислота Е.
Інші підходи до подальшої мінімізації взаємодії з Ес-гамма-рецепторами й С14 в антитіл
І9052 включають ті, що описані в ІЗБбІ і (371.
Шарнірна область антитіл також може мати важливе значення відносно взаємодій з Ес- гамма-рецепторами й комплементом (ІЗ81-І391). Відповідно, мутації або делеції в шарнірній області можуть впливати на ефекторні функції антитіл.
Термін "перехресна зшивка" у даному винаході відноситься до непрямої перемички між Еар- плечима антитіла (моновалентно або бівалентно), пов'язаного із цільовим антигеном в Есг- несучої клітини за допомогою зв'язування з Ес-областю антитіла. Таким чином, антитіло, яке зв'язується зі своїм цільовим антигеном на цільових клітинах, що несуть антиген, може бо утворювати перехресну зшивку з іншою клітиною, яка експресує ГСК.
Термін "неспецифічна загибель" у даному винаході відноситься до загибелі клітин під дією цитотоксичної функції Т-клітин або інших ефекторних клітин, через незалежну від цільового пухлинного антигену активацію даних клітин. Таким чином, під неспецифічною загибеллю мають на увазі, що клітини, які несуть мішені пухлини, можуть бути знищені, наприклад, цитотоксичними Т-клітинами, а не антитілами, що зв'язують мішені пухлини, наприклад, при індукції СОС.
Автори даного винаходу показали (див. приклад 3-5, 7-10), що неактивуючу Ес-область можна отримати шляхом модификації однієї або декількох з, щонайменше, пяти визначених положень амінокислот в Ес-області.
Так, в одному втіленні антитіло містить перший і другий важкий ланцюг імуноглобуліну, причому щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів імуноглобуліну одна або кілька амінокислот у положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235, 0265, М297 і
РЗ31 у важкому ланцюзі Ід1 людини, представленіне Г., Г,, О, М і Р, відповідно.
В одному втіленні в обох із цих першого й другого важких ланцюгів одна або кілька амінокислот у положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235, 0265, М297 і РЗ331 у важкому ланцюзі Ід1 людини, представлені не Г., Г, 0, М і Р, відповідно.
В іншому втіленні щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів одна або декількох амінокислот у положеннях, які відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі ЇДО1 людини, представлені не Г, ГЇ ії О, відповідно, а амінокислоти в положеннях, що відповідають М297 і РЗ31 у важкому ланцюзі Ід51 людини, представлені М і Р, відповідно.
Термін "амінокислота, яка відповідає положенню" у даному винаході відноситься до номера положення амінокислоти у важкому ланцюзі ЇД1 людини. Якщо не зазначено інакше або не суперечить контексту, амінокислоти в послідовностях константної області пронумеровані тут відповідно до індексу нумерації Єи (описаним в |271). Так, амінокислоті або сегменту в одній послідовності "відповідає" така амінокислота або сегмент в іншій послідовності, яка сполучається з іншою амінокислотою або сегментом при використанні стандартної програми суміщення послідовностей типу АЇІОМ, СіІиестаму або аналогічної як правило, при настроюваннях за замовчуванням, і ідентична щонайменше на 50 95, на 80 95, на 90 95 або на 95 95 важкому ланцюгу ЇДО1 людини. Уважається, що в даній області добре відомо, як сумістити послідовність або сегмент у послідовності й тим самим визначити положення в послідовності, відповідно до положення амінокислоти за даним винаходом.
У контексті даного винаходу амінокислота може бути визначена так, як описано вище.
Термін "амінокислота представлена не" або аналогічні вирази відносно амінокислот у важкому ланцюзі слід розуміти як те, що амінокислота представлена будь-якою іншою амінокислотою, ніж дана зазначена амінокислота. Наприклад, те, що амінокислота в положенні, що відповідає 234 у важкому ланцюзі дС1 людини, представлена не Ї, означає, що амінокислота може бути представлена будь-якою іншою, що зустрічаються або не зустрічаються в природі амінокислотою, крім Ї.
В одному втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідс1 людини, представлена не 0.
В одному втіленні щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі ІдДс1 людини, представлена не 0, а амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням М297 і РЗ31 у важкому ланцюзі ІдД1 людини, представлені М і Р, відповідно.
В одному втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідс1 людини, представлена гідрофобною або полярною амінокислотою.
Термін "гідрофобні" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: А, С, Е, б, Н, І, Ї, М, КЕ, Т, М, МУ, У.
Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі 951 людини, обрана із групи амінокислот, яка складається з: А, С, ГЕ, 0, Н.І, І, М, К, Т.М, Мі ХМ.
Термін "полярні" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: С, ОО, Е, Н,К, М, О, КЕ, 5 і Т. Так, в одному втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідс1 людини, обрана із групи, яка складається з: С,Е, Н,К, М, 0, КК, 51 Т.
В іншому втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів 60 амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідс1 людини,
представлена аліфатичною незарядженою, ароматичною або кислою амінокислотою.
Термін "аліфатичні незаряджені" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: А, 0, І, Ї ї М. Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі ЇДО1 людини, обрана із групи, яка складається 3: А, б, І.Г їі М.
Термін "ароматичні" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: Е, Т і МУ. Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ід! людини, обрана із групи, яка складається з: Е, Т і МУ.
Термін "кислі" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: О і Е. Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі ІД51 людини, обрана із групи, яка складається 3: О і Е.
У кращому втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідс1 людини, обрана із групи, яка складається 3: А, Е, ГЕ, 0,1, 1, Т, М і МУ.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі ІД1 людини, представлена не р.
В одному втіленні в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі ІД1 людини, представлена не о, а амінокислоти в положеннях, що відповідають М297 і РЗЗ1 у важкому ланцюзі Їд1 людини, представлені М і Р, відповідно.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі (951 людини, представлена гідрофобною або полярною амінокислотою.
Термін "гідрофобні" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: А, С, Е, б, Н, І, Ї, М, КЕ, Т, М, МУ, У.
Так, в одному втіленні, в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідд! людини, обрана із групи амінокислот, яка складається 3: А, С, БЕ, б, Н.І, Ї, М, ЕК, Т, М, М і ХМ.
Термін "полярні" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: С, ОО, Е, Н,К, М, О, К, 5 і Т. Так, в одному втіленні, в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі 99! людини, обрана із групи, яка складається з С, Е,Н,К, М, 0, Б, 51 Т.
В іншому втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі 99! людини, представлена аліфатичною незарядженою, ароматичною або кислою амінокислотою.
Термін "аліфатичні незаряджені" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: А, 0, І, Ї ї М. Так, в одному втіленні, в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається з:
А, С, Г їм.
Термін "ароматичні" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: Е, Т і МУ. Так, в одному втіленні, в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається з: Е, Т і МУ.
Термін "кислі" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: О і Е. Так, в одному втіленні, в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається з: Ю і Е.
У кращому втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається 3: А, Е, БЕ, 0,1, 1, Т, М і МУ.
У наступному втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню М297 у важкому ланцюзі Ід91 людини, 60 представлена не М.
В одному втіленні щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню М297 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена не М, а амінокислота в положенні, яке відповідає положенню РЗЗ31 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Р.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню М297 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена не М.
В одному втіленні в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню М297 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена не М, а амінокислота в положенні, яке відповідає положенню РЗЗ31 у важкому ланцюзі 991 людини, представлена Р.
У наступному втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі Іда1 людини, представлені не І ії, відповідно.
В одному втіленні щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням І 234 і 1235 у важкому ланцюзі Іда1 людини, представлені не Ї і Ї, відповідно, а амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням М297 і РЗ31 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені М і Р, відповідно.
В одному втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі Ід91 людини, обрані із групи, яка складається 3: А, С.О, Е, ГЕ, б, Н.І, К, М, М, Р, О, Р, 5, Т, М, М.
В одному втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі Іда41 людини, представлені гідрофобними або полярними амінокислотами.
Термін "гідрофобні" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається 3: А, С,Е, б, Н.І, І, М, КК, Т, М, М і ХМ.
Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі Іда1 людини, обрана із групи, яка складається з: А, С, Б, б, Н.І, М, Б, Т, М, М і У.
Термін "полярні" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає
Ко) амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: С, ОО, Е, Н,К, М, О, КЕ, 5 і Т. Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі Іда1 людини, обрана із групи, яка складається з: С.О, Е, НК, М, О, КК, 5 іт.
У кращому втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням 1234 і І 235 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, обрана із групи, яка складається 3: А, С.О, Е, ГЕ, б, Н.І, К, М, М, ОО, К, 5, Т, М, Мі
У.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені не І. і Ї,, відповідно.
В одному втіленні в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають 1 234 і І 235 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представленіне Г ії, відповідно, а амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням М297 і РЗЗ1 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені М і Р, відповідно.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають /234 і 1235 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені гідрофобними або полярними амінокислотами.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням І 234 і І 235 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається 3: А, С, Е, б, Н.І, М, КК, Т, М, ММ і ХМ.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням І 234 і І 235 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається з: С.О, Е, НК, М, ОО, К, 5 і.
У кращому втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням І 234 і | 235 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається 3: А, С.О, Е, БЕ, с, Н.І, К, М, М, ОО, Б, 5, Т, М, М/ і М.
В іншому втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі Іда41 людини, представлені аліфатичними незарядженими, ароматичними або кислими бо амінокислотами.
Термін "аліфатичні незаряджені" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: А, 0, І, Ї ї М. Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням 1234 і | 235 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається з: А, б, ЇЇ М.
Термін "ароматичні" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: Е, Т і МУ. Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням І 234 і І 235 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається з: Е, Т і МУ.
Термін "кислі" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: О і Е. Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням І 234 і І 235 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається з: Ю і
Е.
У кращому втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, що відповідають 234 і 1235 у важкому ланцюзі Ідач1 людини, обрана із групи, яка складається з: А, О, Е, Б, б, І, Т, М і МУ.
В одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням І 234 і 1235 у важкому ланцюзі Іда1 людини, представлені Е і Е; або А і А, відповідно.
В одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі Іда41 людини, представлені Е і Е; або А і А, відповідно, а амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням М297 і РЗ31 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені М і Р, відповідно.
В одному втіленні, в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е і Е; або А і А, відповідно.
В одному втіленні, в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі Ідд!ї людини, представлені Е їі Е; або А ії А, відповідно, а амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням М297 і РЗ31 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені М і Р, відповідно.
У кращому втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі Іда41 людини, представлені Е і Е, відповідно.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е і Е, відповідно.
В одному втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням І 234 і 1235 у важкому ланцюзі Ідо1 людини, представлені А і А, відповідно.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів принаймні амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі Іда41 людини, представлені А і А, відповідно.
В іншому втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлені не ГГ. і О, відповідно.
В одному втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають 1 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід9!1 людини, представлені не Г, І. і О, відповідно, а амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням
М297 і РЗ31 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені М і Р, відповідно.
У одному втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти, які відповідають положенням 1234 й І 235 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрані з групи, яка складається з: А, С.О, Е, Е, б, Н.І, К, М, М, Р, О, К, 5, Т, У, М й МУ, а амінокислота, яка відповідає положенню 0265, обрана із групи, яка складається 3: А, С, Е, Е, б, Н.І, К, І, М, М,
Р.Ф, Кк, 5, Т, М, М і МУ.
В одному втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
Ід91 людини, представлені гідрофобними або полярними амінокислотами. бо Термін "гідрофобні" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається 3: А, С, БЕ, б, Н.І, Ї, М, К, Т, М, М/ і М.
Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі ІдДЧд1ї людини, обрана із групи амінокислот, яка складається 3: А, С, Е, б, Н.І, ЇЇ, М, К, Т, М, М/ і У, а кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі Ідо1 людини, обрана із групи, яка складається 3: А, С, БЕ, б, Н.І, М, БЕ, Т, М, М і м.
Термін "полярні" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: С, ОО, Е, Н,К, М, 0, Р, 5 і Т. Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням 1234 і 1235 у важкому ланцюзі Ідо1 людини, обрана із групи амінокислот, яка складається з: С, О,Е, НК, М, 0, Кк, Зіт, а амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідд1ї людини, обрана із групи, яка складається з: С,Е, Н,К, М, 0, КК, 51 Т.
У кращому втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням І 234 і 1235 у важкому ланцюзі
ІдД91 людини, обрана із групи, яка складається 3: А, С,0О,Е, Б, о, Н.І, К, М, М, О, ЕК, 5, Т, М, Мі
У, а амінокислота у положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, обрана із групи, яка складається з: А, С, Е, БЕ, б, Н.І, К.І, М, М, ОО, Б, 5, ГТ, М, ММ ХМ.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені гідрофобними або полярними амінокислотами.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи амінокислот, яка складається з: А, С, Е, б, Н.І, Ї, М, К, Т, М, М/ і У, а кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням І 234 і | 235 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається з: А, С, ГЕ, б, Н.І, М, К, Т, М, Мі У.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням І 234 і І 235 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи амінокислот, яка складається 3: С, О, Е, Н,К, М, 0, ЕК, 5 і Т, а амінокислота в положенні,
Зо яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі 991 людини, обрана із групи, яка складається з С, Е,Н,К, М, 0, Б, 51 Т.
У кращому втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням І 234 і І 235 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається з: А, С.О, Е, Е, б, Н,Ї, К, М, М, О, ЕК, 5, Т, М, М їі У, а амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, обрана із групи, яка складається з: А, С, Е, БЕ, С, Н.І, К.Г, М, М, ОО, БЕ, 5, Т, М, Мі ХМ.
В іншому втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 91 людини, представлені аліфатичними незарядженими, ароматичними або кислими амінокислотами.
Термін "аліфатичні незаряджені" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: А, 0, І, Ї ї М. Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається з: А, 0, І, Ї ї М, а кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням
І 234 і 1235 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається 3: А, С, | і М.
Термін "ароматичні" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: Е, Т і ММ. Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, обрана із групи, яка складається з: Е, Т і МУ.
Термін "кислі" у даному винаході відносно амінокислотних залишків означає амінокислотні залишки, обрані із групи, яка складається з: О і Е. Так, в одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається 3: ОБіЕ.
У кращому втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, обрана із групи, яка складається з: А, Е, Е, 0,1, І, Т, М ї МУ, а кожна з амінокислот у положеннях, 60 що відповідають 1 234 і І 235, обрана із групи, яка складається з: А, О, Е, Б, 0, І, Т, М і МУ.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені не Г., Г. і О, відповідно.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі ІдДд1 людини, представлені не, і О, відповідно, а амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням М297 і РЗ331 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлені М і Р, відповідно.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені аліфатичними незарядженими, ароматичними або кислими амінокислотами.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається з: А, 0, І, Ї ї М, а кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням
І 234 і 1235 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається 3: А, С, | і М.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів кожна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, обрана із групи, яка складається 3: О і Е.
У кращому втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, обрана із групи, яка складається з: А, Е, Е, 0, І, Г, Т, М ї МУ, а кожна з амінокислот у положеннях, що відповідають
І 234 і 1235, обрана із групи, яка складається 3: А, О, Е, БЕ, б, І, Т, М і МУ.
В одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
І491 людини, представлені Е,Е і А; або А, А і А, відповідно.
В одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
Ід91 людини, представлені РЕ, ЕЕ і А; або А, А і А, відповідно, а амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням М297 і РЗ31 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені М і Р, відповідно.
Зо В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені Е, ЕЕ і А; або А, А і А, відповідно.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені Е, Е і А; або А, А і А, відповідно, а амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням М297 і РЗ31 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені М і Р, відповідно.
У кращому втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлені Е, Е і А, відповідно.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені РЕ, Е і А, відповідно.
В одному втіленні, щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлені А, А і А, відповідно.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлені А, А і А, відповідно.
В іншому втіленні щонайменше в одному з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235, 0265, М297 і РЗ31 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлені РЕ, Е, А, 0 і 5, відповідно.
В одному втіленні в обох з даних першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235, 0265, М297 і РЗЗ1 у важкому ланцюзі
Ід91 людини, представлені РЕ, Е, А, 0 і 5, відповідно.
У кращому втіленні антитіло за винаходом містить послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ
МО:8, послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, і щонайменше в одному з важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлені Е, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні антитіло за винаходом містить послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:8, 60 послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮ МО:12, і щонайменше в одному з важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлені Е, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні антитіло за винаходом містить послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:6, послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, і щонайменше в одному з важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлені Е, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні антитіло за винаходом містить послідовність Ун, наведену в 5ЕО ІЮ МО:6, послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮ МО:12, і щонайменше в одному з важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлені Е, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні антитіло за винаходом містить послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:9, послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, і щонайменше в одному з важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлені Е, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні антитіло за винаходом містить послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:9, послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮ МО:12, і щонайменше в одному з важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлені Е, Е і А, відповідно.
В одному аспекті даний винахід стосується мультиспецифічних антитіл, що містять щонайменше першу єднальну область антитіла за будь-яким з описаних тут аспектів або втілень і одну або кілька єднальних областей, які зв'язують одну або декілька інших мішеней, ніж перша єднальна область. Такі мультиспецифічні антитіла можуть бути біспецифічними антитілами.
Так, в одному аспекті даний винахід стосується біспецифічних антитіл, що містять першу єднальну область антитіла за будь-яким з описаних тут аспектів або втілень і другу єднальну область, яка зв'язується з іншою мішенню, ніж перша єднальна область.
Термін "мультиспецифічне антитіло" відноситься до антитіл, що володіють специфічністю щонайменше до двох різних, як от щонайменше до трьох епітопів, які, як правило, не перекриваються. Такі епітопи можуть перебувати на одній і тій же або на різних мішенях. Якщо
Зо епітопи перебувають на різних мішенях, то такі мішені можуть перебувати на одній і тій же клітині або на різних клітинах або типах клітин.
Термін "біспецифічне антитіло" відноситься до антитіл, що володіють специфічністю щонайменше до двох різних епітопів, що як правило, не перекриваються. Такі епітопи можуть перебувати на одній і тій же або на різних мішенях. Якщо епітопи перебувають на різних мішенях, то такі мішені можуть перебувати на одній і тій же клітині або на різних клітинах або типах клітин.
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить перший і другий важкі ланцюги.
Втілення, пов'язані з модифікацією Ес-області, і втілення, пов'язані з певними амінокислотними замінами, розглядаються в складі будь-яких біспецифічних антитіл за винаходом. Так, в одному втіленні, щонайменше один із цих першого й другого важких ланцюгів містить одну або кілька амінокислот, модифікованих так, як визначено в будь-якому з описаних тут втілень, як ті, що описані у зв'язку з одержанням інертної Ес-області. В одному втіленні обидва з даних першого й другого важких ланцюгів містять одну або кілька амінокислот, модифікованих так, як визначено в кожному з описаних тут втілень, як ті, що описані у зв'язку з одержанням інертної Ес-області. Відповідно, біспецифічне антитіло містить Ес-область, модифіковану відповідно до кожного з описаних тут аспектів або втілень; або ж принаймні один з даних першого й другого важких ланцюгів містить одну або кілька амінокислот, модифікованих так, як визначено в будь-якому з описаних тут аспектів або втілень.
Так, в одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає
БО послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, причому Ес-область була модифікована так, щоб зв'язування Сід з даним антитілом зменшувалося в порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 70 95, на 80 9о, на 90 95, на 95 95, на 97 95 або на 100 95 при визначенні зв'язування з С1д4 методом ЕГ ІЗА.
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12, причому Ес-область була модифікована так, щоб зв'язування Сід з даним антитілом зменшувалося в порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 70 95, на 80 9о, на 90 95, на 95 95, на 97 95 або на 100 95 при визначенні зв'язування з С1д методом ЕЇГ ІЗА.
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає 60 послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10,
причому Ес-область була модифікована так, щоб зв'язування Сід з даним антитілом зменшувалося в порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 70 95, на 80 9о, на 90 95, на 95 95, на 97 95 або на 100 95 при визначенні зв'язування з С1д4 методом ЕГ ІЗА.
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12, причому Ес-область була модифікована так, щоб зв'язування Сід з даним антитілом зменшувалося в порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 70 95, на 80 9о, на 90 95, на 95 95, на 97 95 або на 100 95 при визначенні зв'язування з С1д4 методом ЕГ ІЗА.
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІО МО:9, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, причому Ес-область була модифікована так, щоб зв'язування Сід з даним антитілом зменшувалося в порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 70 95, на 80 9о, на 90 95, на 95 95, на 97 95 або на 100 95 при визначенні зв'язування з С1д4 методом ЕГ ІЗА.
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІО МО:9, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12, причому Ес-область була модифікована так, щоб зв'язування Сід з даним антитілом зменшувалося в порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 70 95, на 80 9о, на 90 95, на 95 95, на 97 95 або на 100 95 при визначенні зв'язування з С1д4 методом ЕГ ІЗА.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, причому Ес-область була модифікована так, щоб дане антитіло викликало зниження Ес- опосередкованої проліферації Т-клітин у порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 5096, на 60 95, на 7095, на 8095, на 9095, на 9995 або на 10095 при вимірюванні такої проліферації Т-клітин методом функціонального аналізу на основі мононуклеарів периферичної крові (РВМО).
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12, причому Ес-область була модифікована так, щоб дане антитіло викликало зниження Ес- опосередкованої проліферації Т-клітин у порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 5096, на 6095, на 7095, на 8095, на 9095, на 9995 або на 10095 при вимірюванні такої проліферації Т-клітин методом функціонального аналізу на основі мононуклеарів периферичної крові (РВМО).
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, причому Ес-область була модифікована так, щоб дане антитіло викликало зниження Ес- опосередкованої проліферації Т-клітин у порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 5096, на 60 95, на 7095, на 8095, на 9095, на 9995 або на 10095 при вимірюванні такої проліферації Т-клітин методом функціонального аналізу на основі мононуклеарів периферичної крові (РВМО).
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12, причому Ес-область була модифікована так, щоб дане антитіло викликало зниження Ес- опосередкованої проліферації Т-клітин у порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 5096, на 60 95, на 7095, на 8095, на 9095, на 9995 або на 10095 при вимірюванні такої проліферації Т-клітин методом функціонального аналізу на основі мононуклеарів периферичної крові (РВМО).
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІО МО:9, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, причому Ес-область була модифікована так, щоб дане антитіло викликало зниження Ес- опосередкованої проліферації Т-клітин у порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 5096, на 60 95, на 7095, на 8095, на 9095, на 9995 або на 10095 при вимірюванні такої проліферації Т-клітин методом функціонального аналізу на основі мононуклеарів периферичної крові (РВМО).
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІО МО:9, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12, причому Ес-область була модифікована так, щоб дане антитіло викликало зниження Ес- опосередкованої проліферації Т-клітин у порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 5096, на 60 95, на 7095, на 8095, на 9095, на 9995 або на 10095 при вимірюванні такої проліферації Т-клітин методом функціонального аналізу на основі мононуклеарів периферичної 60 крові (РВМО).
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, причому Ес-область була модифікована так, щоб дане антитіло знижувало Ес-опосередковану експресію СО6О щонайменше на 50 95, на 60 95, на 70 95, на 80 95, на 90 95, на 99 95 або на 100 95 у порівнянні з антитілом дикого типу при визначенні Ес-опосередкованої експресії СО69 методом функціонального аналізу на основі РВМС.
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12, причому Ес-область була модифікована так, щоб дане антитіло знижувало Ес-опосередковану експресію СО6О щонайменше на 50 95, на 60 95, на 70 95, на 80 95, на 90 95, на 99 95 або на 100 95 у порівнянні з антитілом дикого типу при визначенні Ес-опосередкованої експресії СО69 методом функціонального аналізу на основі РВМС.
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, причому Ес-область була модифікована так, щоб дане антитіло знижувало Ес-опосередковану експресію СО6О щонайменше на 50 95, на 60 95, на 70 95, на 80 95, на 90 95, на 99 95 або на 100 95 у порівнянні з антитілом дикого типу при визначенні Ес-опосередкованої експресії СО69 методом функціонального аналізу на основі РВМС.
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12, причому Ес-область була модифікована так, щоб дане антитіло знижувало Ес-опосередковану експресію СО6О щонайменше на 50 95, на 60 95, на 70 95, на 80 95, на 90 95, на 99 95 або на 100 95 у порівнянні з антитілом дикого типу при визначенні Ес-опосередкованої експресії СО69 методом функціонального аналізу на основі РВМС.
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в 5ЕО ІЮО МО:9, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, причому Ес-область була модифікована так, щоб дане антитіло знижувало Ес-опосередковану експресію СО6О щонайменше на 50 95, на 60 95, на 70 95, на 80 95, на 90 95, на 99 95 або на 100 95 у порівнянні з антитілом дикого типу при визначенні Ес-опосередкованої експресії СО69
Зо методом функціонального аналізу на основі РВМС.
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІО МО:9, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12, причому Ес-область була модифікована так, щоб дане антитіло знижувало Ес-опосередковану експресію СО6О щонайменше на 50 95, на 60 95, на 70 95, на 80 95, на 90 95, на 99 95 або на 100 95 у порівнянні з антитілом дикого типу при визначенні Ес-опосередкованої експресії СО69 методом функціонального аналізу на основі РВМС.
У кращому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені РЕ, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12, причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені РЕ, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені РЕ, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12, причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлені РЕ, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІО МО:9, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:10, причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в 60 положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини,
представлені РЕ, Е і А, відповідно.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІО МО:9, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12, причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлені РЕ, Е і А, відповідно.
Приклади молекул біспецифічних антитіл, які можна використовувати в даному винаході, включають: (ії) цільні антитіла, які мають два плеча, які містять різні антигензв'язуючі області, (ії) одноланцюгові антитіла, які мають специфічність до двох різних епітопів, наприклад, у вигляді двох 5сЕЕм5, з'єднаних між собою через додатковий пептидний лінкер; (ії) антитіла з подвійними варіабельними доменами (0МО-Ід М), у яких кожний легкий ланцюг і важкий ланцюг містить по два варіабельні домени, з'єднаних між собою через короткий пептидний лінкер (401); (ім) хімічно зв'язані біспецифічні (Гар)г2-фрагменти; (м) ТападбеУ, що представляють собою злиття двох одноланцюгових діатіл, при цьому утворюється тетравалентне біспецифічне антитіло, що має по два сайти зв'язування для кожного із цільових антигенів; (м) флекситіла, що представляють собою комбінацію 5сЕм5 з діатілом, у результаті чого виходить мультивалентна молекула; (мії) так звані молекули "док-і-лок" (Ооск-апа-І оскУ) на основі "домена димеризації й стикування" у протеїнкінази А, який у застосуванні до Гар5 може утворювати тривалентний біспецифічний єднальний білок, який складається із двох однакових Раб-фрагментів, з'єднаних з іншим Еар- фрагментом; (мії) так звані молекули-скорпіони, які містять, наприклад, два 5сЕм5, злитих з обома кінцями Рар-плеча людини; і (їх) діатіла.
В одному втіленні біспецифічними антитілами за даним винаходом є діатіла, зшиті антитіла або ж біспецифічні антитіла, отримані шляхом контрольованого обміну Рар-плеча, наприклад,
ОиоВодуф (як типи описані в І41)), як описано в даному винаході.
Приклади різних класів біспецифічних антитіл включають, без обмеження: (ії) Ідс-подібні молекули з комплементарними доменами Сн3, що викликає гетеродимеризацію; (ії) рекомбінантні Ідо-подібні молекули подвійного таргетинга, у яких кожна із двох сторін молекули містить Гар-фрагмент або частину Гар-фрагмента щонайменше із двох різних антитіл; (ії) злиті молекули Ідс, у яких повнорозмірні антитіла типу до злиті з додатковим Гар-фрагментом або
Зо частиною ЕРар-фрагмента; (ім) злиті з Ес молекули, у яких одноланцюгові молекули Ем або стабілізовані діатіла злиті з константними доменами важкого ланцюга, Ес-областями або їх частинами; (м) злиті молекули Раб, у яких злиті разом різні Рар-фрагменти, злиті з константними доменами важкого ланцюга, Ес-областями або їх частинами; і (мі) антитіла на основі 5сЕм або діатіл або важких ланцюгів (наприклад, доменних антитіл, Мапобродіе5?У), у яких різні одноланцюгові молекули Ем або різні діатіла або різні антитіла на основі важких ланцюгів (наприклад, доменні антитіла, Мапободіе5?) злито один з одним або з іншим білком або молекулою носія, злитою з константними доменами важкого ланцюга, Ес-областями або їх частинами.
Приклади ІдсС-подібних молекул з комплементарними доменами Сн3 включають, без обмеження: Тгіотаьф (Тгіоп Рпагта/Ргезепіци5 Віотесі, (421), Кпорз-іпіюо-Ноїез (Сепепіеси, (431),
Сто55табз (Коспе, 441) і електростатично спарені (Атдеп, І451-(46); Спидаї, (47); Опсотес,, (481), молекули І 072-У (Сепепіесн), Оід-роду і Рід-боду (Ріаптабсіпе), доменні антитіла із заміною ниток (Зігапа Ехспапде ЕподіпеегеЯа Юотаіїп Боду, Зеєароду) (ЕМО Зегопо, І49|), молекули
Вісіопіс5 (Меги5), Есладр (Кедепегоп, |50ОЇ), біспецифічні Ідо1 і де2 (Ріїгег/Кіпаї, (511), Агутейнс зсаноїа (7утемжоКв/Мегек, І521|), тАбр-Ем (Хепсог, (531Ї), бівалентні біспецифічні антитіла (Коспе) і молекули ОиоВоадауф (Септаб А/5, |411).
Приклади рекомбінантних Ідб-подібних молекул подвійного таргетинга включають, без обмеження: Юца! Тагдеїїпдо (0Т)-д (з5К/Оотапіїйв), антитіла два-в-одному (Тмо-іп-опе Апіїбоаду,
Сепепіесі), зшиті тАр5 (Кагптапо5 Сапсег Сепіег), тАбБ2 (Е-іаг, І541), 2уродіє5 м (2упдепіа), підходи із загальним легким ланцюгом (СтисеПМегив, (551), кАВодієз5 (Моміттипе) і СоухХ-Ббодую (Соух/Рііг2ег).
Приклади злитих молекул ДО включають, без обмеження: подвійні варіабельні домени (0М0О)-Ід "м (АБброїї, (56)), антитіла типу два домена, дві голівки (Опііемег; Запоїї Амепії5, 57),
Ідсі-подібні біспецифічні (Іпсіопе/Еїї І іШу), Т52АБ (Медіттипе/А7) і В5АБ (7утодепеїісв),
Негсшез "м (Віодеп Ідес, |58)), злиті 5сЕм (Момагії5), злиті з5СЕм (Спапд2пои Адат Віоїесі! Іпс, 591) і ТМАЬ (Коспе, І591, І6ОЇ).
Приклади злитих з Ес молекул включають, без обмеження: злиття типу 5СЕмМ/Ес (Асадетіс
Іпвійшіоп), Зсогріоп'м (ЕЄтегудепі ВіобБоішіоп5з/Тгиріоп, 2утодепеїіс5/ВМ5), технологію ретаргетинга з подвійною спорідненістю (Юа! Айіпйу Кеїагдейпуд Тесппоіоду, Ес-ВАКТ М) 60 (Масгосепісв, І621, ІЄЗ3І) ії Юца(5сЕм)2-таб (Маїйопа! Резеагсй Сепієї їог Апіроду Медісіпе -
Китай).
Приклади злитих з Бар біспецифічних антитіл включають, без обмеження: Е(ар)2 (Медагех/АМОЄЕМ), подвійної ді або Віс-Рар (Сепепієснт), ОосК-апа-їоскФ (ОМ) (ІттипоМеаіс5), бівалентні біспецифічні (Віоїеспої) і Рар-Ем (ОСВ-Сеїйеснп).
Приклади антитіл на основі 5СЕм, діатіл і доменних антитіл включають, без обмеження: біспецифічні Т-клітинні захвати (Візресійс Т СеїЇ Епдадег, Впеф) (Місготе), тандемні діатіла (Тапааб) (Айітеа), технологію ретаргетинга з подвійною спорідненістю (Оцаї Айіпку Неїагдеїіпу
Тесппоіоду, Ес-ВАКТ М) (МасгосСепісв5), одноланцюгові діатіла (Асадетіс), ТСК-подібні антитіла (АІТ, Кесеріогі одісв5), злиті із сироватковим альбуміном людини 5сЕм (Ме!гтітаск) і Сотроду м (Ерідеп Віоїесі), нанотіла подвійного таргетинга (АБріупх), доменні антитіла подвійного таргетинга на основі важких ланцюгів.
Крім того, передбачається, що будь-яке моноспецифічне антитіло, що відповідає описаним тут умовам аналізу, може скласти основу біспецифічного антитіла. Тобто біспецифічне антитіло, у якого одна з областей зв'язування зв'язує СОЮЗ, може походити з будь-якого моноспецифічного антитіла до СОЗ, перевіреного в методах функціонального аналізу, що й відповідає викладеним тут вимогам. Таке біспецифічне антитіло може бути отримане способами, описаними в І411, яка включена сюди шляхом посилання.
Отже, у кращому втіленні кожен з даних першого й другого важких ланцюгів містить принаймні шарнірну область і області Сн2 і Сн3, причому в даному першому важкому ланцюзі щонайменше одна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням, обраним із групи, яка складається з 7366, 1368, К370, 0399, 405, У407 і К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, була замінена, і в даного другого важкого ланцюга щонайменше одна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням, обраним із групи, яка складається з 7366, І 368,
К370, 0399, 405, 407 і К409 у важкому ланцюзі Ідді людини, була замінена, причому даний перший й даний другий важкі ланцюги замінені не в тих самих положеннях. При цьому термін "замінена" означає те, що амінокислота в певному положенні була замінена на іншу амінокислоту, яка зустрічається або не зустрічається в природі. Таким чином, "замінена" амінокислота в положенні, яке відповідає цьому положенню у важкому ланцюзі Ідд!ї людини, означає те, що амінокислота в даному положенні відрізняється від природної амінокислоти у
Зо важкому ланцюзі Ід91.
В одному втіленні в даному першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі ІдДді людини, представлена не К, І. або М, і необов'язково амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Е, а в даному другому важкому ланцюзі щонайменше одна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням, обраним із групи, яка складається з Т366, 1368, К370, 0399, Е405 і
Уу407 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, була замінена.
В одному втіленні в даному першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі (991! людини, представлена не К, Ї або М, а в даного другого важкого ланцюга амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі Іда1 людини, представлена не ЕК, і необов'язково амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
В одному втіленні в даному першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі (991! людини, представлена не Е, К або б, а в даному другому важкому ланцюзі амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням, обраним із групи, яка складається з 7366, І 368, К370, 0399, У407 ії К409 у важкому ланцюзі ІдДд91 людини, були замінені.
В одному втіленні в даному першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі Ідд91 людини, представлена не К, І. або М, а амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі ІдДд1 людини, представлена не Р.
В іншому втіленні в даному першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена Г, а в даному другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі Ідд!ї людини, представлена ЕК, або ж навпаки.
Так, в одному втіленні в першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає
К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена І.
У наступному втіленні гуманізоване або химерне антитіллио до СОЗ за винаходом щонайменше в одному із першого й другого важких ланцюгів містить одну або декілька інактивуючих замін, викладених у будь-якому з наведених вище втілень, типу І 234Е, І1235Е і 60 0265А; а амінокислота в положенні, що відповідає Е405, представлена не Р. В одному втіленні гуманізоване або химерне антитіло до СОЗ за винаходом щонайменше в одному із першого й другого важких ланцюгів містить одну або декілька інактивуючих замін, викладених у будь-якому з наведених вище втілень, типу І 234Е, І 235Е і 02654А; а також заміну в положенні К409 типу
К409К. Зокрема, в одному втіленні гуманізоване або химерне антитіло до СОЗ за винаходом в обох з першого й другого важких ланцюгів містить одну або декілька інактивуючих замін, викладених у будь-якому з наведених вище втілень, типу І 234, І 235Е і 02654А; а також заміну в положенні Е405 типу Е405І. В одному втіленні гуманізоване або химерне антитіло до СОЗ за винаходом в обох з першого й другого важких ланцюгів містить одну або декілька інактивуючих замін, викладених у будь-якому з наведених вище втілень, типу І 234Е, І 235Е і 0265А; а також заміну в положенні К.409 типу К409К. Такі антитіла застосовні для одержання біспецифічних антитіл.
Відповідно, в іншому втіленні щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е, Е і А, відповідно, у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Ї, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлена К.
В одному втіленні щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають 1 234, 1235, 0265, М297 і РЗ31 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлені Е, Е, А, М і Р, відповідно, у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Г, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі Іда1 людини, представлена К.
В альтернативному втіленні щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е, Е і А, відповідно, у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі
ІД9Д1 людини, представлена І.
Зо В одному втіленні щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають 1 234, 1235, 0265, М297 і РЗ31 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлені Е, Е, А, М і Р, відповідно, у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі ІдДд1ї людини, представлена К, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає 405 у важкому ланцюзі Іда1 людини, представлена І.
В іншому втіленні в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно, у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Г, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К.
В одному втіленні в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають 1234, 1235, 0265, М297 і РЗ331 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені РЕ, Е, А, М і Р, відповідно, у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі ІД91! людини, представлена І, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі Ідд!ї людини, представлена К.
В альтернативному втіленні в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно, у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена І.
В одному втіленні в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають 1234, 1235, 0265, М297 і РЗ331 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені РЕ, Е, А, М і Р, відповідно, у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі ІД91 людини, представлена К, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає Б405 у важкому ланцюзі 991 людини, представлена Ї.
Як описано тут, залучення Т-клітин на конкретні клітини мішені, як ракові або пухлинні клітини, забезпечує спосіб знищення клітин мішені. Автори даного винаходу показали, що бо біспецифічне антитіло СОЗХНЕК2, що містить конкретні амінокислотні заміни І234Е, 1235Е і
Зо р265А в обох важких ланцюгах, здатне індукувати знищення клітин АШ5Ьб5, як описано в прикладі 5. Опосередковане Т-клітинами знищення може здійснюватися біспецифічним антитілом, націленим на СОЗ3З першою єднальною областю й на іншу мішень - другою єднальною областю. Так, в одному втіленні перша єднальна область відповідає будь-якому з описаних тут втілень для гуманізованого або химерного антитіла до СОЗ, а друга єднальна область зв'язується з іншою мішенню, ніж перша єднальна область. Слід мати на увазі, що, коли антитілом є біспецифічне антитіло, то щонайменше одна половина антитіла, тобто один з пари важких і легких ланцюгів антитіла, є гуманізованим або химерним антитілом, як описано тут. Таким чином, одна половина біспецифічного антитіла є гуманізованим або химерним антитілом, що зв'язується з СОЗ відповідно до даного винаходу, а друга половина може бути гуманізованою, химерною, повністю не людською або повністю людською, що зв'язується із другою мішенню. Так, в одному втіленні антитіло містить перший і другий важкий ланцюг, перший і другий легкий ланцюг, причому даний перший важкий і даний перший легкий ланцюги є гуманізованими або химерними й з'єднуються через дисульфідні містки, утворюючи першу єднальну область; а дані другі важкий і легкий ланцюги є повністю людськими й з'єднуються через дисульфідні містки, утворюючи другу єднальну область, причому дана перша єднальна область відповідає будь-якому з описаних тут аспектів або втілень, а дана друга єднальна область зв'язується з іншою мішенню. В одному втіленні антитіло містить перший і другий важкий ланцюг, перший і другий легкий ланцюг, причому даний перший важкий і даний перший легкий ланцюги є гуманізованими або химерними й з'єднуються через дисульфідні містки, утворюючи першу єднальну область; а дані другі важкий і легкий ланцюги є гуманізованими або химерними й з'єднуються через дисульфідні містки, утворюючи другу єднальну область, причому дана перша єднальна область відповідає будь-якому з описаних тут аспектів або втілень, а дана друга єднальна область зв'язується з іншим епітопом СОЗ, ніж перша єднальна область.
Так, в одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:10; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:19, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20; причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е, Е і А, відповідно у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 405 у важкому ланцюзі Ї991 людини, представлена ЇЇ, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К.
В одному втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:10; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:29, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮ МО:30; причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991! людини, представлені Е, Е і А, відповідно у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена ЇЇ, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:10; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:19, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20; причому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІЧ91 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Її, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:10; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:29, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:30; причому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІЧ91 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Ї а в 60 другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:12; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:19, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20; причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е, Е і А, відповідно у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 405 у важкому ланцюзі ІдДд!ї людини, представлена ЇЇ, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд! людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:12; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:29, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:30; причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е, Е і А, відповідно у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 405 у важкому ланцюзі Ідд1ї людини, представлена ЇЇ, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:12; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:19, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20; причому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІЧ91 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена І, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає
Ко) послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:8, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІО МО:12; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:29, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:30; причому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІЧ91 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Ї , а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:10; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:19, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20; причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е, Е і А, відповідно у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 405 у важкому ланцюзі Ї991 людини, представлена ЇЇ, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:10; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:29, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:30; причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е, Е і А, відповідно у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 405 у важкому ланцюзі Ї991 людини, представлена ЇЇ, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд! людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:10; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:19, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20; причому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів 60 амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІЧ91 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Її, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:10; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:29, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:30; причому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІЧ91 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Її, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІО МО:12; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:19, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20; причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е, Е і А, відповідно у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 405 у важкому ланцюзі Ї991 людини, представлена ЇЇ, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІО МО:12; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:29, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:30; причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е, Е їі А, відповідно у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 405 у важкому ланцюзі Ї991 людини, представлена ЇЇ, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІО МО:12; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:19, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20; причому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
І991 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Її, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:6, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІО МО:12; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:29, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:30; причому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
І991 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Її, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:9, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:10; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:19, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20; причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991! людини, представлені Е, Е і А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 405 у важкому ланцюзі Ї991 людини, представлена ЇЇ, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає 60 послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:9, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:10; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:29, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:30; причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е, Е і А, відповідної у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню 405 у важкому ланцюзі Ї991 людини, представлена ЇЇ, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:9, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:10; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:19, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20; причому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
І991 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Її, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:9, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІЮО МО:10; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:29, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:30; причому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІЧ91 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Її, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:9, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІО МО:12; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:19, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20; причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991 людини, представлені Е, Е і А, відповідно у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена ЇЇ, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:9, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІО МО:12; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:29, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:30; причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, що відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 991! людини, представлені Е, Е і А, відповідно у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена ЇЇ, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:9, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІО МО:12; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:19, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20; причому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІЧ91 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Ї а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
В іншому втіленні біспецифічне антитіло містить першу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮО МО:9, і послідовність Мі, наведену в ЗЕО ІО МО:12; другу єднальну область, що включає послідовність Мн, наведену в ЗЕО ІЮ МО:29, і послідовність Мі, наведену в 5ЕО ІЮ МО:30; причому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІЧ91 людини, представлені Е, Е ї А, відповідно; у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню Е405 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена Ї, а в 60 другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, яке відповідає положенню К409 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлена К.
Термін "дисульфідний місток" у даному винаході відноситься до ковалентного зв'язку між двома залишками цистеїну, тобто дана взаємодія також може позначатися як взаємодію Сув-
Сув.
Термін "мішень" у даному винаході відноситься до молекули, з якою зв'язується єднальна область антитіла за винаходом. При використанні в контексті зв'язування антитіла цей термін включає будь-які антигени, на які спрямовано отримане антитіло.
В одному кращому втіленні перший важкий і перший легкий ланцюги є гуманізованими або химерними й з'єднуються через дисульфідні містки, утворюючи першу єднальну область; а другі важкий і легкий ланцюги є повністю людськими й з'єднуються через дисульфідні містки, утворюючи другу єднальну область, причому перша єднальна область відповідає будь-якому з описаних тут аспектів або втілень, а друга єднальна область зв'язується з іншою мішенню; при цьому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені РЕ, Е і А, відповідно.
В одному кращому втіленні перший важкий і перший легкий ланцюги є гуманізованими або химерними й з'єднуються через дисульфідні містки, утворюючи першу єднальну область; а другі важкий і легкий ланцюги є повністю людськими й з'єднуються через дисульфідні містки, утворюючи другу єднальну область, причому перша єднальна область відповідає будь-якому з описаних тут аспектів або втілень, а друга єднальна область зв'язується з іншим епітопом СОЗ, ніж перша єднальна область; при цьому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням І 234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі Ідд1 людини, представлені Е, Е і А, відповідно.
В одному кращому втіленні перший важкий і перший легкий ланцюги є гуманізованими або химерними й з'єднуються через дисульфідні містки, утворюючи першу єднальну область; а другі важкий і легкий ланцюги є повністю людськими й з'єднуються через дисульфідні містки, утворюючи другу єднальну область, причому перша єднальна область відповідає будь-якому з описаних тут аспектів або втілень, а друга єднальна область зв'язується з іншою мішенню; при цьому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі Ід91 людини, представлені Е,Е і
А, відповідно.
В одному кращому втіленні перший важкий і перший легкий ланцюги є гуманізованими або химерними й з'єднуються через дисульфідні містки, утворюючи першу єднальну область; а другі важкий і легкий ланцюги є повністю людськими й з'єднуються через дисульфідні містки, утворюючи другу єднальну область, причому перша єднальна область відповідає будь-якому з описаних тут аспектів або втілень, а друга єднальна область зв'язується з іншим епітопом СОЗ, ніж перша єднальна область; при цьому в обох із цих першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі
ІД91 людини, представлені Е, Е і А, відповідно.
Конструкції з нуклеїнових кислот, експресуючі вектори й клітини хазяїна
В одному аспекті даний винахід стосується конструкцій з нуклеїнових кислот, що кодують одну або кілька послідовностей, наведених у табл. 1. Так, даний винахід стосується конструкцій з нуклеїнових кислот, що кодують одну або кілька послідовностей, наведених в ЗЕО ІЮ МО: 1, 2,
З3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25126.
В іншому аспекті винахід стосується конструкцій з нуклеїнових кислот, що кодують послідовності гуманізованих або химерних антитіл до СОЗ за даним винаходом, експресуючих векторів, що містять конструкції з нуклеїнових кислот за даним винаходом, клітин хазяїна, що містять такі експресуючі вектори, і способів одержання таких антитіл шляхом культивування таких клітин хазяїна у відповідних умовах, при яких антитіла виробляються й необов'язково виділяються. Гуманізовані антитіла до СОЗ також можуть позначатися як "пиСОЗ3".
В одному втіленні, винаходом передбачений експресуючий вектор, що містить: (Її) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовність важкого ланцюга гуманізованого або химерного антитіла за винаходом, (ії) послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовність легкого ланцюга гуманізованого або химерного антитіла за винаходом, або (ії) і те (і), і інше (ії).
Таким чином, експресуючий вектор містить одну або кілька конструкцій з нуклеїнової кислоти або послідовностей нуклеїнової кислоти відповідно до будь-якого з описаних тут аспектів або втілень.
В одному втіленні експресуючий вектор за винаходом містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує одну або кілька послідовностей СОМ важкого ланцюга й легкого ланцюга, 60 обраних із групи, яка складається з: 5БЕО ІЮО МО: 1, 2, 3, 4 і 5; і послідовність СТМ.
В одному втіленні, винаходом передбачений експресуючий вектор, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує одну або кілька амінокислотних послідовностей, обраних із групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 20, 27, 28, 29 і 30, або будь-які їхні комбінації. В іншому втіленні експресуючий вектор містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує амінокислотну послідовність СОКЗ Мн, наведену в 5ЕО ІЮО МО: 3. В іншому втіленні експресуючий вектор містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує амінокислотну послідовність Мн, обрану з БЕО ІЮ МО: 6, 7, 8, 9, 19, 27 і 29. В іншому втіленні експресуючий вектор містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує амінокислотну послідовність Мі, обрану з ЗЕО ІЮ МО: 10, 11, 12, 20, 28 ї 30. В іншому втіленні експресуючий вектор містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує константну область легкого ланцюга антитіла людини, важкого ланцюга антитіла людини або те й інше. В іншому втіленні, винаходом передбачений експресуючий вектор, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує амінокислотну послідовність згідно ЗЕО ІЮО МО: 15, 16, 23, 24, 25 або 26.
У кращому втіленні експресуючий вектор містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіант однієї або декількох з вищенаведених амінокислотних послідовностей, причому даний варіант містить не більше 25 амінокислотних модифікацій, як от не більш 20, не більш 15, 14, 13, 12 або 11 амінокислотних модифікацій, як от 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотних модифікацій типу делецій або вставок, а переважно замін типу консервативних або не консервативних замін, або ж він щонайменше на 8095 ідентичний якій-небудь із даних послідовностей, як от щонайменше на 85 95 ідентичний або на 90 95 ідентичний або на 95 95 ідентичний, як от на 96 95 ідентичний або на 97 95 ідентичний або на 98 95 ідентичний або на 99 95 ідентичний кожній з вищенаведених амінокислотних послідовностей. Даний винахід також стосується послідовностей нуклеїнових кислот, що відрізняються від вищенаведених послідовностей нуклеїнових кислот, але внаслідок мінливості генетичного коду, що кодують таку ж амінокислотну послідовність, як у антитіла за даним винаходом. Наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти може варіюватися, але буде давати амінокислотні послідовності, ідентичні яким-небудь із описаних тут амінокислотних послідовностей. Фахівцям у даній області добре відомо, як визначити такі додаткові послідовності нуклеїнових кислот на підставі генетичного коду.
Зо В іншому втіленні експресуючий вектор додатково містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує константну область легкого ланцюга, важкого ланцюга або ж і легкого, і важкого ланцюга антитіла, наприклад, людського антитіла.
Такі експресуючі вектори, як описано вище, можуть застосовуватися для рекомбінантного одержання антитіл за винаходом.
Експресуючим вектором у контексті даного винаходу може бути будь-який придатний вектор, включаючи хромосомні, нехромосомні й вектори із синтетичної нуклеїнової кислоти (послідовності нуклеїнової кислоти, що містить придатний набір контролюючих експресію елементів). Приклади таких векторів включають похідні 540, бактеріальні плазміди, фагові
ДНК, бакуловіруси, дріжджові плазміди, вектори, отримані з комбінацій плазмід і фагових ДНК, і вектори з вірусної нуклеїнової кислоти (РНК або ДНК). В одному втіленні нуклеїнова кислота, яка кодує гуманізоване або химерне антитіло до СОЗ, уміщена у вектор з голої ДНК або РНК, включаючи, приміром, лінійні експресуючі елементи (описані, приміром, в І64)), вектори із щільно упакованої нуклеїнової кислоти (описані, приміром, в |65) і/або |6бЇ), плазмідні вектори типу рВК322, риС19/18 або рисС118/119, вектори-крихітки ("тідде") з нуклеїнової кислоти мінімального розміру (описані, приміром, в (67|), або у вигляді осадженої векторної конструкції з нуклеїнової кислоти типу СаРОз-осаджених конструкцій (описаних, приміром, в (681), 691, (79 і
Г711). Такі вектори з нуклеїнової кислоти і їх застосування гарно відомі в даній області (приміром, див. І721 і (731).
В одному втіленні вектор підходить для експресії гуманізованого або химерного антитіла до
СОЗ у бактеріальних клітинах. Приклади таких векторів включають такі експресуючі вектори, як
ВіІнезсгірі (Зігагадепе), вектори ріМ (1741), вектори рЕТ (Момадеп, Мадізоп УМ) і ін.
Експресуючим вектором також або альтернативно може бути вектор, що підходить для експресії в дріжджовій системі. Можна використовувати будь-який вектор, придатний для експресії в дріжджовій системі. Придатні вектори включають, приміром, вектори, що містять конститутивні або індуцибельні промотори типу альфа-фактора, алкоголь-оксидази й РОН (див. огляди (751 і (761).
Конструкція й/або вектор з нуклеїнової кислоти також може містити послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовність секреції/локалізації яка може направляти поліпептид типу зростаючого поліпептидного ланцюга в периплазматичний простір або в бо культуральне середовище. Такі послідовності відомі в даній області й включають лідери секреції або сигнальні пептиди, послідовності, націлені на органели (наприклад, послідовності ядерної локалізації сигнали утримання в ЕК, мітохондріальні транзитні послідовності, хлоропластні транзитні послідовності), послідовності мембранної локалізації/якірні (наприклад, послідовності зупинки транслокації, якірні послідовності ОРІ) і ін., які добре відомі в даній області.
В експресуючому векторі за винаходом нуклеїнові кислоти, що кодують гуманізовані або химерні антитіла до СОЗ, можуть містити або бути пов'язаними з будь-яким придатним промотором, енхансером і іншими сприятливими для експресії елементами. Приклади таких елементів включають сильні промотори експресії (наприклад, промотор/«енхансер, СММ 1Е людини, а також промотори К5М, 5М40, 513-3, ММТМ і НІМ ІТК), ефективні полі(А)- послідовності термінації, початок реплікації для плазмідних продуктів в Е. соїї, гени стійкості до антибіотиків у якості селективного маркера й/або зручні сайти для клонування (наприклад, полілінкери). Конструкції й/або вектори з нуклеїнових кислот також можуть містити індуцибельні промотори на відміну від конститутивних промоторів типу СММ ІЕ (фахівцям повинно бути відомо, що такі терміни насправді служать для опису ступеня експресії генів за певних умов).
В одному втіленні експресуючий вектор, що кодує гуманізоване або химерне антитіло до
СОЗ3, поставляється в і/або доставляється до клітин хазяїна або в організм тварини за допомогою вірусного вектора.
Такі експресуючі вектори можуть застосовуватися для рекомбінантного одержання гуманізованих або химерних антитіл до СОЗ.
В одному аспекті винаходом передбачені клітини хазяїна, які містять експресуючий вектор за винаходом.
В одному аспекті гуманізовані або химерні антитіла до СЮОЗ за будь-яким з описаних тут аспектів або втілень одержують за допомогою рекомбінантних еукаріотичних, рекомбінантних прокаріотичних або рекомбінантних мікробних клітин хазяїна, які виробляють антитіла.
Відповідно, винаходом передбачені рекомбінантні еукаріотичні, рекомбінантні прокаріотичні або рекомбінантні мікробні клітини хазяїна, які виробляють гуманізоване або химерне антитіло до
СОЗ або імуноглобулін, як визначено тут. Приклади клітин хазяїна включають дріжджові, бактеріальні й клітини ссавців типу клітин СНО або НЕК-294. Наприклад, в одному втіленні клітини хазяїна містять послідовність нуклеїнової кислоти, стабільно вбудовану в клітинний геном, яка включає послідовність, що кодує експресію описаного тут гуманізованого або химерного антитіла до СО3. В іншому втіленні клітини хазяїна містять не вбудовану послідовність нуклеїнової кислоти типу плазміди, косміди, фагеміди або лінійного експресуючого елемента, яка включає послідовність, що кодує експресію описаного тут гуманізованого або химерного антитіла до СОЗ.
Термін "рекомбінантна клітина хазяїна" (або просто "клітина хазяїна") у даному винаході служить для позначення клітин, у які був уведений експресуючий вектор або конструкція або послідовність нуклеїнової кислоти. Слід мати на увазі, що такі терміни служать не тільки для позначення даних конкретних клітин, але також і потомства таких клітин. Оскільки в наступних поколіннях можуть мати місце деякі модифікації внаслідок мутації або впливу навколишнього середовища, то таке потомство може насправді й не бути ідентичним батьківській клітині, але все таки вони входять у рамки використовуваного тут терміна "клітина-хазяїн". Рекомбінантні клітини хазяїна включають, приміром, еукаріотичні клітини хазяїна типу клітин СНО, клітин НЕК- 293, клітин РЕК.Сб, клітин М50О і клітин лімфоцитів, а також прокаріотичні клітини типу Е. соїї і інші еукаріотичні організми типу клітин рослин і грибів.
У наступному аспекті винахід стосується способу одержання гуманізованих або химерних антитіл до СОЮЗ за винаходом, який містить у собі стадії: а) культивування клітин хазяїна за винаходом, як описано вище, і р) виділення й/або очищення антитіл за винаходом з культурального середовища.
У наступному аспекті послідовність нуклеотидів, що кодує послідовність гуманізованого або химерного антитіла до СОЗ, додатково кодує другу молекулу типу терапевтичного поліпептиду.
Приклади терапевтичних поліпептидів описані тут в іншому місці. В одному втіленні винахід стосується способу одержання злитого з гуманізованим або химерним антитілом до СОЗ білка, який містить у собі стадії: а) культивування клітин хазяїна, що містять експресуючий вектор, який містить таку послідовність нуклеотидів, і р) виділення й/або очищення злитого з гуманізованим або химерним антитілом до СОЗ білка з культурального середовища.
Композиції бо В одному аспекті винаходом передбачені композиції, що містять антитіло або біспецифічне антитіло за будь-яким з описаних тут аспектів і втілень.
В одному аспекті винаходом передбачені фармацевтичні композиції, що містять антитіло або біспецифічне антитіло за будь-яким з описаних тут аспектів і втілень і фармацевтично прийнятний носій.
Фармацевтичні композиції можуть бути складені з фармацевтично прийнятними носіями або розріджувачами, а також з будь-якими іншими відомими ад'ювантами й наповнювачами відповідно до звичайних методів типу тих, що описані в І771|.
Фармацевтично прийнятні носії або розріджувачі, а також будь-які інші відомі ад'юванти й наповнювачі повинні бути придатними для гуманізованих або химерних антитіл даного винаходу й обраного способу введення. Придатність для носіїв і інших компонентів фармацевтичних композицій визначається на підставі відсутності істотного негативного впливу на бажані біологічні властивості обраної сполуки або фармацевтичної композиції даного винаходу (наприклад, менш ніж істотний вплив на зв'язування антигену, тобто відносне інгібування на 10 95 або менше, відносне інгібування на 5 95 або менше і т.д.).
Фармацевтичні композиції за даним винаходом також можуть містити в собі розріджувачі, заповнювачі, солі, буфери, детергенти (наприклад, неіонні детергенти типу Туееп-20 або
Тмееп-80), стабілізатори (наприклад, цукри або безбілкові амінокислоти), консерванти, тканеві фіксатори, солюбілізатори й/або інші матеріали, придатні для введення у фармацевтичні композиції.
Фактичний рівень дози активного інгредієнта у фармацевтичних композиціях даного винаходу може варіюватися для того, щоб одержати таку кількість активного інгредієнта, яка ефективна для досягнення необхідної терапевтичної відповіді для даного пацієнта, композиції й способу введення, без токсичності для пацієнта. Обраний рівень дозування буде залежати від різних фармакокінетичних факторів, у тому числі активності даної конкретної композиції даного винаходу, способу введення, часу введення, швидкості виведення даної конкретної сполуки, тривалості лікування, інших лікарських засобів, сполук і/або матеріалів, використовуваних у комбінації з даною композицією, віку, статі, ваги, захворювання, загального стану здоров'я й попередньої історії хвороби пацієнта, що підлягає лікуванню, і інших подібних факторів, добре відомих в області медицини.
Зо Фармацевтичні композиції можна вводити будь-яким придатним способом за будь-якою схемою. Придатні способи введення гуманізованих або химерних антитіл даного винаходу іп мімо і іп міго добре відомі в даній області й можуть бути обрані рядовими фахівцями.
В одному втіленні фармацевтичні композиції даного винаходу вводяться парентерально.
Вираження "парентеральне введення" і "уводиться парентерально" у даному винаході означають інші способи введення, ніж ентеральне й місцеве введення, зазвичай шляхом ін'єкції, і включають епідермальне, внутрішньовенне, внутрішньом'язове, внутрішньосуглобне, внутрішньоартеріальне, інтратекальне, інтраорбітальне, внутрішньосерцеве, внутрішньошкірне, внутрішньоочеревинне, внутрішньосухожильне, транстрахеальне, підшкірне, підепідермальне, субкапсулярне, субарахноїдальне, інтраспинальне, внутрічерепне, внутрішньогрудне, епідуральне й внутрішньогрудинне введення й уливання.
В одному втіленні дані фармацевтичні композиції вводяться шляхом внутрішньовенного або підшкірного введення або уливання.
Фармацевтично прийнятні носії включають усілякі придатні розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні й протигрибкові засоби, засоби для |ізотонічності, антиоксиданти й сповільнюючі усмоктування засоби та ін., які фізіологічно сумісні з гуманізованими або химерними антитілами даного винаходу.
Приклади придатних водних і неводних носіїв, які можна використовувати у фармацевтичних композиціях даного винаходу, включають воду, фізрозчин, фізрозчин з фосфатним буфером, етанол, декстрозу, поліоли (як от гліцерин, пропіленгліколь, полієтиленгліколь та ін.) і їхні придатні суміші, рослинні олії, такі як маслинова олія, кукурудзяна олія, арахісова олія, бавовняна олія й кунжутна олія, колоїдні розчини карбоксиметилцелюлози, трагакантову камедь і органічні складні ефіри для ін'єкцій типу етилолеату й/або різні буфери.
Інші носії добре відомі в області фармацевтики.
Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії й стерильні порошки для приготування стерильних розчинів або дисперсій для ін'єкцій ех Тетрого.
Застосування таких середовищ і засобів для фармацевтично активних субстанцій відоме в даній області. За винятком тих випадків, коли звичайний носій або речовина несумісна з активною сполукою, передбачається їхнє застосування у фармацевтичних композиціях даного винаходу. Передбачається, що вираз "активна сполука" також відноситься до гуманізованих або 60 химерних антитіл за даним винаходом.
Належна плинність може підтримуватися, приміром, за допомогою таких покриваючих матеріалів, як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру часток у випадку дисперсій і за допомогою поверхнево-активних речовин.
Фармацевтичні композиції даного винаходу також можуть містити фармацевтично прийнятні антиоксиданти, наприклад: (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, цистеїн гідрохлорид, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію й ін.; (2) жиророзчинні антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутильований гідроксианізол (ВНА), бутильований гідрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол і ін.; і (3) хелатуючі метали речовини, такі як лимонна кислота, етилендиамінтетраоцтова кислота (ЕОТА), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота й ін.
Фармацевтичні композиції даного винаходу також можуть містити засоби підтримки ізотонічності, як от цукри, багатоатомні спирти типу маніту, сорбіту, гліцерину або хлорид натрію в композиціях.
Фармацевтичні композиції даного винаходу також можуть містити одну або кілька допоміжних речовин, що придатні для обраного способу введення, як от консерванти, змочуючі засоби, емульгатори, диспергуючі речовини, консерванти або буфери, які можуть підвищити строки зберігання або ефективність фармацевтичної композиції. Гуманізовані або химерні антитіла даного винаходу можуть бути складені з носіями, які будуть захищати сполуку від швидкого вивільнення, типу складів з контрольованим вивільненням, включаючи імплантати, трансдермальні пластирі й мікрокапсульовані системи доставки. Такі носії можуть включати желатин, гліцерилмоностеарат, гліцерилдістеарат, біорозкладані й біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, поліортоефіри й полімолочна кислота, самі по собі або разом з воском або іншими матеріалами, добре відомими в даній області. Способи одержання таких складів загалом відомі фахівцям у даній області (наприклад, див. І781).
В одному втіленні гуманізовані або химерні антитіла даного винаходу складаються таким чином, щоб забезпечити належний розподіл іп мімо. Фармацевтично прийнятні носії для парентерального введення включають стерильні водні розчини або дисперсії й стерильні порошки для приготування стерильних розчинів або дисперсій для ін'єкцій ех іетрого.
Зо Застосування таких середовищ і речовин для фармацевтично активних субстанцій відоме в даній області. За винятком тих випадків, коли звичайний носій або речовина несумісна з активною сполукою, передбачається їхнє застосування у фармацевтичних композиціях даного винаходу. У композиції можуть входити й інші активні або лікувальні сполуки.
Фармацевтичні композиції для ін'єкцій, як правило, повинні бути стерильними й стабільними в умовах виробництва й зберігання. Композиції можуть бути складені у вигляді розчину, мікроемульсії, ліпосом або інших упорядкованих структур, що підходять для високої концентрації препарату. Носієм може бути водний або неводний розчинник або дисперсійне середовище, що містить, приміром, воду, етанол, поліоли (як от гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і ін.) ії їхні придатні суміші, рослинні олії типу маслинової олії й органічні складні ефіри для ін'єкцій типу етилолеата. Належна плинність може підтримуватися, приміром, за допомогою таких покриваючих матеріалів, як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру часток у випадку дисперсій і за допомогою поверхнево-активних речовин. У багатьох випадках переважно слід включати в композиції засоби підтримки ізотонічності, приміром, цукри, багатоатомні спирти типу гліцерину, маніту, сорбіту або хлорид натрію. Пролонговане усмоктування композицій для ін'єкцій може здійснюватися шляхом включення в композицію засобу, що сповільнює усмоктування, приміром, солей моностеарата й желатину. Стерильні розчини для ін'єкцій можуть бути приготовлені введенням активної сполуки в необхідній кількості у відповідному розчиннику з одним або комбінацією інгредієнтів, наприклад, із числа перерахованих вище, як буде потрібно, з наступною стерилізацією мікрофільтруванням.
Загалом, дисперсії одержують уведенням активної сполуки в стерильний носій, що містить основу дисперсійного середовища й інші необхідні інгредієнти, наприклад, із числа перерахованих вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних розчинів для ін'єкцій приклади способів одержання - вакуумне сушіння й заморожування-висушування (ліофілізація), які дають порошок активного інгредієнта плюс будь-яких додаткових потрібних інгредієнтів з попередньо стерилізованого фільтруванням розчину.
Стерильні розчини для ін'єкцій можуть бути приготовлені шляхом уведення активної сполуки в необхідній кількості у відповідному розчиннику з одним або комбінацією перерахованих вище інгредієнтів, як буде потрібно, з наступною стерилізацією мікрофільтруванням. Загалом, дисперсії одержують уведенням активної сполуки в стерильний носій, що містить основу бо дисперсійного середовища й інші необхідні інгредієнти із числа перерахованих вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних розчинів для ін'єкцій прикладами способів одержання служать вакуумне сушіння й заморожування-висушування (ліофілізація), які дають порошок активного інгредієнта плюс будь-яких додаткових потрібних інгредієнтів з попередньо стерилізованого фільтруванням розчину.
Терапевтичне застосування
В іншому аспекті даний винахід стосується гуманізованих або химерних антитіл або фармацевтичних композицій винаходу за будь-яким з описаних тут аспектів або втілень для застосування як лікарських засобів.
В іншому аспекті даний винахід стосується гуманізованих або химерних антитіл або фармацевтичних композицій винаходу за будь-яким з описаних тут аспектів або втілень для застосування у лікуванні захворювань.
Гуманізовані або химерні антитіла або фармацевтичні композиції за винаходом можуть застосовуватися у лікуванні будь-яких ракових захворювань, при яких бажані ефекторні механізми цитотоксичних Т-клітин. Наприклад, гуманізовані або химерні антитіла можна вводити в культури клітин, наприклад, іп міго або ех мімо, або ж людям, наприклад, іп мімо, для лікування або профілактики таких захворювань, як ракові, запальні або аутоімунні захворювання. У даному винаході термін "суб'єкт", як правило, означає людину, яка реагує на гуманізоване або химерне антитіло або фармацевтичну композицію. Суб'єктами, приміром, можуть бути хворі люди з такими захворюваннями, які можуть бути виправлені або полегшені шляхом модуляції функції мішені або шляхом знищення клітин, прямо або побічно.
В іншому аспекті даним винаходом передбачені способи лікування або профілактики захворювань типу раку, при яких рекрутування Т-клітин буде сприяти лікуванню або профілактиці, які включають уведення суб'єктові, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості гуманізованого або химерного антитіла або фармацевтичної композиції даного винаходу. Спосіб зазвичай включає введення суб'єктові гуманізованого або химерного антитіла у кількості, ефективній для лікування або профілактики захворювання.
В одному кращому аспекті даний винахід стосується способу лікування раку, що включає введення суб'єктові який цього потребує, гуманізованого або химерного антитіла або фармацевтичної композиції за винаходом, як це визначено в будь-якому з описаних тут аспектів
Зо і втілень.
В іншому аспекті даний винахід стосується застосування або способу за будь-яким з описаних тут аспектів або втілень, у якому гуманізоване або химерне антитіло є біспецифічним антитілом, що специфічно зв'язуються й з СОЮЗ, і зі специфічною для раку мішенню, або ж з мішенню, яка надлишково експресується при раку або асоційована з раком, як от НЕК2, СО19,
ЕрРСАМ, ЕСЕК, СОббе (або СЕА, СЕАСАМ5), СО33, ЕрпА? або МО5Р (або НММУ-МАА), причому захворювання представлене таким раком, як рак молочної залози, рак простати залози, недрібноклітинний рак легенів, рак сечового міхура, рак яєчників, рак шлунка, колоректальний рак, рак стравоходу й плоскоклітинна карцинома голови й шиї, рак шийки матки, рак підшлункової залози, рак яєчок, злоякісна меланома, рак м'яких тканин (наприклад, синовіальна саркома), в'ялотекуча або агресивна форма В-клітинної лімфоми, хронічна лімфоцитарна лейкемія або гострий лімфолейкоз.
Ефективні дози й схеми дозування для гуманізованих або химерних антитіл залежать від захворювання або стану, які підлягають лікуванню й можуть бути визначені фахівцями в даній області.
Рядовий лікар може легко визначити й призначити ефективну кількість потрібної фармацевтичної композиції.
Наприклад, лікар може почати з доз гуманізованого або химерного антитіла, використовуваного у фармацевтичній композиції, на меншому рівні, ніж це потрібно для досягнення необхідного терапевтичного ефекту, і поступово збільшувати дозу до досягнення необхідного ефекту. Загалом придатною дозою композиції даного винаходу буде така кількість гуманізованого або химерного антитіла, яка складе найменшу дозу для ефективного одержання терапевтичного ефекту за певною схемою дозування. Така ефективна доза зазвичай залежить від факторів, описаних вище.
Так, "ефективна кількість" для терапевтичного застосування може вимірюватися за її здатністю стабілізувати розвиток хвороби. Здатність сполуки інгібувати рак, приміром, можна оцінювати на тваринах з модельної системи, здатної прогнозувати ефективність на пухлинах людини. З іншого боку, цю властивість композиції можна оцінювати за здатністю гуманізованого або химерного антитіла інгібувати ріст клітин або індукувати цитотоксичність методами аналізу іп міго, відомими лікарям-фахівцям. Терапевтично ефективна кількість терапевтичної сполуки, бо тобто терапевтичного гуманізованого або химерного антитіла або фармацевтичної композиції за винаходом може зменшувати розміри пухлин або іншим способом полегшувати симптоми у суб'єкта. Рядові фахівці зможуть визначити такі кількості, виходячи з таких факторів, як розмір суб'єкта, тяжкість симптомів у суб'єкта й конкретна композиція або обраний спосіб уведення.
Типовий необмежувальний діапазон терапевтично ефективних кількостей гуманізованих або химерних антитіл за винаходом становить 0,001-30 мг/кг, як от 0,001-20 мг/кг, як от 0,001-10 мг/кг, як от 0,001-5 мг/кг, приміром, 0,001-2 мг/кг, як от 0,001-1 мг/кг, наприклад, близько 0,001, приблизно 0,01, приблизно 0,1, приблизно 1, приблизно 5, приблизно 8, приблизно 10, приблизно 12, приблизно 15, приблизно 18 мг/кг.
Уведення може проводитися, наприклад, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрібрюшинно або підшкірно, наприклад, проксимально до сайту мішені.
Схеми дозування у вищенаведених способах лікування й застосування підбираються так, щоб забезпечити оптимальну бажану відповідь (наприклад, терапевтичну відповідь).
Наприклад, можна вводити одним болюсом, можна вводити кілька дробових доз за часом або ж можна пропорційно зменшувати або збільшувати дозу, як того вимагатиме терапевтична ситуація.
В одному втіленні ефективність лікування відслідковується в процесі терапії, наприклад, у заданих точках за часом.
Якщо потрібно, ефективна добова доза фармацевтичної композиції може вводитися у вигляді двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести або більше менших доз, що вводяться окремо через відповідні проміжки протягом доби, необов'язково у вигляді стандартних дозових форм. В іншому втіленні гуманізоване або химерне антитіло або фармацевтична композиція вводиться шляхом повільного безперервного уливання протягом тривалого часу типу більше 24 годин, щоб звести до мінімуму будь-які небажані побічні ефекти.
Хоча гуманізовані або химерні антитіла даного винаходу можна вводити й самі по собі, але переважно гуманізовані або химерні антитіла вводяться у вигляді фармацевтичної композиції, як описано вище.
Ефективна доза гуманізованого або химерного антитіла за винаходом також може вводитися за щотижневою, двотижневою або тритижневою схемою дозування. Період дозування може бути обмежений, наприклад, до 8 тижнів, 12 тижнів або до припинення
Зо клінічного прогресування. З іншого боку, ефективна доза гуманізованого або химерного антитіла за винаходом може вводитися через кожні два, три або чотири тижні.
В одному втіленні гуманізоване або химерне антитіло може вводитися шляхом інфузії за щотижневою схемою в перерахуванні на мг/м-. Такі дозування можуть виходити, приміром, з наведених вище доз у мг/кг за наступною формулою: доза (мг/кг) х 70:1,8. Таке введення можна повторювати, наприклад, від 1 до 8 разів, як от від З до 5 разів. Уведення може проводитися шляхом безперервного уливання протягом від 2 до 24 годин, як от від 2 до 12 годин. В одному втіленні гуманізоване або химерне антитіло може вводитися шляхом повільного безперервного уливання протягом тривалого часу, як от більш 24 годин, щоб зменшити токсичні побічні ефекти.
В одному втіленні гуманізоване або химерне антитіло може вводитися за щотижневою схемою в перерахуванні на фіксовану дозу аж до 8 разів, як от від 4 до 6 разів при введенні раз на тиждень. Така схема може повторюватися один або кілька разів, як буде потрібно, наприклад, через 6 місяців або 12 місяців. Такі фіксовані дози, приміром, можуть грунтуватися на наведених вище дозах у мг/кг, враховуючи масу тіла в 70 кг. Дозування може визначатися або підбиратися шляхом вимірювання кількості гуманізованого або химерного антитіла даного винаходу в крові після введення, приміром, у біологічних зразках з використанням антиіїдіотипічних антитіл, націлених на область зв'язування в гуманізованих або химерних антитіл даного винаходу.
В одному втіленні гуманізовані або химерні антитіла можуть уводитися при підтримуючій терапії, як от, наприклад, один раз на тиждень протягом 6 місяців або більше.
Гуманізовані або химерні антитіла також можуть уводитися профілактично для того, щоб зменшити ризик виникнення раку, сповільнити настання подій при прогресуванні раку й/або зменшити ризик виникнення рецидиву при ремісії раку.
Парентеральні композиції можуть бути складені у вигляді стандартної дозової форми для простоти введення й однорідності дозування. Стандартна дозова форма в даному винаході означає фізично дискретні одиниці, придатні в якості одиничних доз для суб'єктів, що підлягають лікуванню; кожна одиниця містить заздалегідь визначену кількість активної сполуки, розраховану на одержання необхідного терапевтичного ефекту, у комбінації з потрібним фармацевтичним носієм. Специфікації для стандартних дозових форм за даним винаходом бо диктуються й безпосередньо залежать від (а) унікальних характеристик активної сполуки та конкретного терапевтичного ефекту, що досягається, і (Б) обмежень, властивих області складання таких активних сполук для лікування пацієнтів.
Гуманізовані або химерні антитіла також можуть уводитися профілактично для того, щоб зменшити ризик виникнення раку, сповільнити настання подій при прогресуванні раку й/або зменшити ризик виникнення рецидиву при ремісії раку. Це може бути особливо корисно для тих пацієнтів, у яких важко локалізувати пухлину, яка повинна в них бути, через інші біологічні фактори.
Діагностичне застосування
Гуманізовані або химерні антитіла за винаходом також можуть застосовуватися в діагностичних цілях з використанням композицій, що містять гуманізовані або химерні антитіла, як описано тут. Відповідно, винаходом передбачені способи діагностики й композиції, у яких застосовуються описані тут гуманізовані або химерні антитіла, . Такі способи й композиції можуть застосовуватися в чисто діагностичних цілях типу виявлення або ідентифікації захворювання, а також для моніторингу прогресу при терапевтичному лікуванні, відстеження прогресування захворювання, оцінки стану після лікування, моніторингу на предмет рецидиву захворювання, оцінки ризику виникнення хвороби й ін.
В одному аспекті даний винахід стосується способу діагностики захворювань, що характеризуються залученням або нагромадженням експресуючих СОЗ клітин, який включає введення суб'єктові гуманізованого або химерного антитіла за винаходом, композиції за винаходом або фармацевтичної композиції за винаходом, при цьому необов'язково дане гуманізоване або химерне антитіло мітиться детектованим агентом.
В одному аспекті гуманізоване або химерне антитіло даного винаходу застосовується ех мімо, як от у діагностиці захворювань, при яких клітини, експресуючі потрібну визначену мішень і з якими зв'язується гуманізоване або химерне антитіло, показові для захворювання або залучені в патогенез, шляхом виявлення рівня мішені або рівня клітин, експресуючих дану мішень, на поверхні цих клітин у зразку, узятому в пацієнта. Це здійснюється, приміром, шляхом контактування тестованого зразка, необов'язково разом з контрольним зразком, з гуманізованим або химерним антитілом за винаходом в умовах, що сприяють зв'язуванню антитіла з мішенню. Потім детектується утворення комплексу (наприклад, методом ЕГІЗА). При
Зо використанні контрольного зразка разом з тестованим зразком, в обох зразках аналізують рівень гуманізованого або химерного антитіла або комплексу антитіла з мішенню, і статистично значиме підвищення рівня гуманізованого або химерного антитіла або комплексу антитіла з мішенню в тестованому зразку означає, що рівень мішені в тестованому зразку підвищений у порівнянні з контрольним зразком.
Приклади стандартних методів імуноаналізу, у яких можна використовувати гуманізовані або химерні антитіла даного винаходу, включають, без обмеження, методи ЕГІЗА, КІА, ЕАС5, метод плазмонного резонансу, хроматографічні методи, імуногістохімію тканин, вестерн-блот і/або імунопреципітацію.
Відповідно, в одному втіленні даний винахід стосується способу діагностики захворювань, що характеризуються залученням або нагромадженням експресуючих СОЗ клітин, який включає введення суб'єктові антитіла, біспецифічного антитіла, композиції або фармацевтичної композиції за будь-яким з описаних тут аспектів або втілень, при цьому необов'язково антитіло позначене детектованим агентом.
В одному втіленні винахід стосується способу виявлення присутності мішені або клітин, експресуючих мішень, у зразку, що включає: - контактування зразка з гуманізованим або химерним антитілом за винаходом в умовах, що сприяють зв'язуванню гуманізованого або химерного антитіла з мішенню в зразку; і - аналіз того, чи утворився комплекс.
Як правило, зразок є біологічним зразком.
В одному втіленні зразком є зразок тканини, який відомо або імовірно містить конкретну мішень і/або клітини, експресуючі мішень. Наприклад, виявлення експресії мішені іп й може здійснюватися шляхом узяття гістологічного зразка в пацієнта й доставки гуманізованого або химерного антитіла даного винаходу в такий зразок. Гуманізоване або химерне антитіло може бути надане шляхом нанесення або накладення гуманізованого або химерного антитіла на зразок, а потім детектування його придатним способом. Після цього можна визначити не тільки наявність мішені або клітин, експресуючих мішень, але також і розподіл мішені або клітин, експресуючих мішень, у досліджуваній тканині (наприклад, у контексті оцінки поширення ракових клітин). При використанні даного винаходу, рядовим фахівцям повинно бути добре відомо, що для такого детектування іп 5йи можна модифікувати будь-які із цілого ряду бо гістологічних методів (як от процедури фарбування).
У вищенаведених методах гуманізоване або химерне антитіло може бути позначене детектованою речовиною, що дозволяє детектувати зв'язане антитіло. З іншого боку, зв'язане (первинне) специфічне гуманізоване або химерне антитіло можна детектувати за допомогою антитіла, позначеного детектованою речовиною, що зв'язується з первинним специфічним гуманізованим або химерним антитілом. Крім того, у наведені вище методах можна використовувати діагностичні композиції, що містять антитіло або біспецифічне антитіло за будь-яким з описаних тут аспектів або втілень. Так, в одному аспекті даний винахід стосується діагностичних композицій, що містять антитіло або біспецифічне антитіло за будь-яким з описаних тут аспектів або втілень.
Рівень мішені в зразку також можна визначити методом конкурентного імуноаналізу з використанням стандартів мішені, позначених детектованою речовиною, і неміченого специфічного до мішені гуманізованого або химерного антитіла. У методах цього типу змішують біологічний зразок, позначені стандарти мішені й специфічне до мішені гуманізоване або химерне антитіло й визначають кількість міченого стандарту мішені, що зв'язався з неміченим специфічним до мішені гуманізованим або химерним антитілом. Кількість мішені в біологічному зразку обернено пропорційна кількості міченого стандарту мішені, що зв'язався з неміченим специфічним до мішені гуманізованим або химерним антитілом.
Придатні мітки для специфічного до мішені гуманізованого або химерного антитіла, вторинного антитіла й/або стандарту мішені, використовуваних у методах діагностики іп міїго, включають, без обмеження, різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні речовини, люмінесцентні речовини й радіоактивні речовини. Приклади придатних ферментів (- пероксидаза хріну, лужна фосфатаза, бета-галактозидаза й ацетилхолінестераза; приклади придатних комплексів простетичних груп - стрептавідин/біотин і авідин/біотин; приклади придатних флуоресцентних речовин - умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїн ізотіоціанат, родамін, дихлортриазиніламін флуоресцеїн, дансилхлорид і фікоеритрин; приклад люмінесцентної речовини - люмінол; а приклади придатних радіоактивних речовин - "251, 191, 355 і ЗН.
В одному аспекті специфічні до мішені гуманізовані або химерні антитіла за винаходом застосовуються при візуалізації іп мімо експресуючих мішень тканин типу пухлин. Для методів іп
Зо мімо особливо кращі фрагменти антитіл, такі, приміром, як (Габ)»., Раб- і Гар'-фрагменти, через їхню швидку кінетику розподілу.
Візуалізація іп мімо може проводитися будь-яким придатним методом. Наприклад, для візуалізації нагромадження або розподілу специфічного до мішені антитіла в експресуючих мішень тканинах типу пухлин за допомогою гамма-сцинтиляційної камери (наприклад, установки ЕїІ5сіпі Арех 409 ЕСТ) можна використовувати специфічне до мішені гуманізоване або химерне антитіло (наприклад, антитіло або його фрагмент), позначене 99Тс, "71, 17Ід або іншим гамма-випромінюючим ізотопом, як правило, з використанням низькоенергетичного коліматора високого дозволу або низькоенергетичного універсального коліматора. З іншого боку, для візуалізації розподілу специфічного до мішені гуманізованого або химерного антитіла або фрагмента антитіла в пухлинах методом позитронно-емісійної томографії (РЕТ) можна використовувати мечені 8971, "Ві, "ЗЕ або іншим випромінюючим позитрони радіонуклідом.
Отримані із застосуванням таких методів зображення можна використовувати для оцінки біорозподілу мішені в пацієнтів, ссавців або в тканинах, приміром, при використанні мішені в якості біомаркера на присутність ракових/пухлинних клітин. Варіанти цього методу можуть включати застосування магнітно-резонансної томографії (МК!) для поліпшення візуалізації в порівнянні з методами з використанням гамма-камери. Стандартні методи й принципи імуносцинтиграфії описані, наприклад, в І791, І8ВОЇ і І81). Крім того, такі зображення можуть послужити і як основа для хірургічних методів при видаленні пухлин. Більше того, такі методи візуалізації іп мімо можуть застосовуватися для ідентифікації й локалізації пухлини в ситуації, коли в пацієнта встановлена наявність пухлини (за наявності інших біомаркерів, метастазів і т.д.), але пухлину неможливо ідентифікувати традиційними аналітичними методами. Усі ці способи входять у рамки даного винаходу.
Візуалізація іп мімо і інші способи діагностики, передбачені даним винаходом, особливо застосовні при виявленні мікрометастазів у хворих людей (наприклад, у пацієнтів, яким раніше не ставився діагноз раку, або у хворих у період видужання/ремісії від раку).
В одному втіленні даним винаходом передбачений спосіб візуалізації іп мімо, у якому специфічне до мішені гуманізоване або химерне антитіло даного винаходу зазнає кон'югування з детектуючою рентгеноконтрастною речовиною, кон'юговане гуманізоване або химерне антитіло вводиться хазяїнові, у вигляді ін'єкції в кровоток, і проводиться аналіз на наявність і бо локалізацію міченого гуманізованого або химерного антитіла в хазяїна. За допомогою цього способу й будь-яких інших представлених тут методів діагностики даний винахід забезпечує спосіб скринінгу на наявність пов'язаних із хворобою клітин у хворої людини або в біологічному зразку, узятому у хворої людини, і/або для оцінки розподілу специфічного до мішені гуманізованого або химерного антитіла перед початком специфічної до мішені АЮОС-терапії.
Для діагностичної візуалізації радіоїзотопи можна зв'язувати зі специфічним до мішені гуманізованим або химерним антитілом прямо або побічно за допомогою проміжної функціональної групи. Корисними проміжними функціональними групами є такі хелатори, як етилендиамінтетраоцтова кислота й диетилентриамінпентаоцтова кислота (приміром, див. І821).
Поряд з радіоїзотопами й рентгеноконтрастними речовинами, діагностичні методи можуть виконуватися з використанням специфічних до мішені антитіл, які кон'юговані з барвниками (типу комплексу біотин-стрептавідин), контрастними речовинами, флуоресцентними сполуками або молекулами й підсилювачами (наприклад, парамагнітними іонами) для магнітно- резонансної томографії (МК!) (наприклад, див. І83Ї, де описані методи МКІ і одержання антитіл, кон'югованих з підсилювачами для МКІ). Такі діагностичні/детектуючі речовини можуть бути обрані із призначених для МК речовин і флуоресцентних сполук. Для того, щоб навантажити специфічне до мішені гуманізоване або химерне антитіло радіоактивними металами або парамагнітними іонами, може знадобитися піддати їх реакції з реагентом, що мають довгий хвіст, до якого приєднано декілька хелатуючих груп для зв'язування іонів. Таким хвостом може бути полімер типу полілізину, полісахарид або інше похідне з функціоналізованим ланцюгом, що містить бічні групи, з якими можуть зв'язуватися хелатуючі групи, такі, наприклад, як порфірини, поліаміни, краун-ефіри, бістіосемікарбазони, поліоксими й подібні групи, які застосовні для цієї мети. Хелати можна кон'югувати зі специфічними до мішені гуманізованими або химерними антитілами за стандартними хімічними методиками.
Так, даним винаходом передбачені діагностичні специфічні до мішені гуманізовані або химерні антитіла, причому ці специфічні до мішені гуманізовані або химерні антитіла кон'юговані з контрастною речовиною (типу підсилювачів контрасту для магнітно-резонансної томографії, комп'ютерної томографії або УЗД) або радіонуклідом, яким може бути, приміром, гамма-, бета-, альфа-випромінюючий, випромінюючий електрони Оже або позитрони ізотоп.
В одному аспекті даний винахід стосується діагностичних композицій, які містять антитіло
Зо або біспецифічне антитіло за винаходом.
У наступному аспекті даний винахід стосується набору для детектування присутності антигену-мішені або клітин, експресуючих мішень, у зразку, який включає: - специфічне до мішені гуманізоване або химерне антитіло за винаходом; і - інструкції із застосування набору.
Так, в одному аспекті даним винаходом передбачений набір для детектування присутності антигену СОЗ або клітин, експресуючих СОЗ, у зразку, яке включає стадії: а) контактування зразка з антитілом або біспецифічним антитілом за винаходом в умовах, що сприяють утворенню комплексу між антитілом або біспецифічним антитілом і СОЗ; і р) аналіз того, чи утворився комплекс.
В одному втіленні даним винаходом передбачений набір для діагностики раку, що включає контейнер, який містить специфічне до мішені гуманізоване або химерне антитіло й один або кілька реагентів для детектування зв'язування специфічного до мішені гуманізованого або химерного антитіла з мішенню. Реагенти можуть включати, приміром, люмінесцентні мітки, ферментні мітки або інші детектовані мітки. Реагенти також можуть включати вторинні або третинні антитіла або реагенти для ферментативних реакцій, причому ферментативні реакції дають продукт, який можна візуалізувати. В одному втіленні даним винаходом передбачений діагностичний набір, що містить одне або декілька специфічних до мішені гуманізованих або химерних антитіл даного винаходу в міченому або неміченому виді в придатних контейнерах, реагенти для інкубації при непрямому методі й субстрати або функціоналізуючі реагенти для детектування в такому методі, залежно від характеру мітки. Також можуть бути включені контрольні реагенти й інструкції із застосування.
Діагностичні набори також можуть призначатися для застосування зі специфічним до мішені гуманізованим або химерним антитілом типу мічених специфічних до мішені антитіл для детектування присутності мішені в зразку тканини або в організмі У таких діагностичних наборах, а також у наборах для терапевтичного застосування, описаних тут в іншому місці, специфічне до мішені гуманізоване або химерне антитіло зазвичай презентоване в ліофілізованому вигляді в контейнері, або саме по собі, або в комбінації з додатковими антитілами, специфічними до клітин або пептидів мішені. Як правило, також включають (зазвичай в окремому контейнері для змішування) фармацевтично прийнятний носій бо (наприклад, інертний розріджувач) і/або його компоненти, такі як трис, фосфатний або карбонатний буфер, стабілізатори, консерванти, біоциди, інертні білки, наприклад, сироватковий альбумін або такого типу й додаткові реагенти (зазвичай також в окремому контейнері). У деякі набори також входить вторинне антитіло, здатне зв'язуватися зі специфічним до мішені гуманізованим або химерним антитілом, яке зазвичай перебуває в окремому контейнері. Друге антитіло зазвичай кон'юговане з міткою й складене в такий же спосіб, як і специфічне до мішені гуманізоване або химерне антитіла даного винаходу.
Використовуючи методи, описані тут вище й в інших місцях, специфічні до мішені гуманізовані або химерні антитіла можна використовувати для визначення підмножин ракових/пухлинних клітин і характеристики таких клітин і пов'язаних з ними тканин пухлин.
Антиідіотипічні антитіла
У наступному аспекті винахід стосується антиідіотипічних антитіл, які зв'язуються з гуманізованими або химерними антитілами за винаходом, як описано тут.
Антиіїдіотипічним (4) антитілом є таке антитіло, яке розпізнає унікальні детермінанти, у загальному пов'язані з антигензв'язуючим сайтом антитіла. Анти-ій антитіло може бути отримане шляхом імунізації тварини того ж виду й генетичного типу, що й джерело моноклонального антитіла до СОЮЗ, тим моноклональним антитілом, проти якого й одержують анти-Іа антитіло. Імунізована тварина, як правило, може розпізнавати й реагувати на ідіотипічні детермінанти імунізуючого антитіла, виробляючи антитіла до цих ідіотипічних детермінантів (антитіла проти Ід). Такі антитіла описані, приміром, в 05 4,699,880. Такі антитіла теж входять у рамки даного винаходу.
Анти-ій антитіла також можуть застосовуватися в якості "імуногена" для того, щоб викликати імунну реакцію в ще однієї тварини, яка буде виробляти так зване антитіло проти анти-1іа.
Антитіло проти анти-Їй за епітопом може бути ідентичне вихідному моноклональному антитілу, яке індукувало анти-ій антитіло. Таким чином, за допомогою антитіл до ідіотипічних детермінантів моноклонального антитіла можна ідентифікувати інші клони, експресуючі антитіла з ідентичною специфічністю. Анти-ІЯ антитіла можна модифікувати (одержуючи при цьому варіанти анти-Їй антитіла) і/або функціоналізувати будь-яким придатним методом типу тих, що описані тут у відношенні специфічних до СЮОЗ антитіл даного винаходу. Наприклад, моноклональне анти-ІЯ антитіло можна кон'югувати із носієм типу гемоцианіну молюска
Зо блюдечко (КІН) і використовувати для імунізації мишей ВАЇВ/с. Сироватка цих мишей, як правило, буде містити антитіла проти анти-ї4 з характеристиками зв'язування, близькими, якщо не ідентичними вихідному антитілу до СОЗ.
Послідовності
Таблиця 1
ЗЕОІЮ |пиСОоЗ УН
ЗЕОІЮ |пиСОоЗ УН
ЗЕОІЮ |пиСОоЗ УН
ЗЕОІЮ |пиСОЗ МІ пиСОоЗ МІ. ов т
ЗЕОІЮ |пиСОЗ МІ
ЕОЮ ЕМКІ МЕЗО МОРССБІ ВІ БСААЗИЕТЕМТУАММУУВОА РОКИ ЕМ
МО в пиСОЗ УНІ | МАВІВЗКУММУАТУМАВЗУКОВЕТІЗАВОБЗКООЇ М ОМММІ КТЕОТАМУУ
І суУвнамРгамМомМУЗУгАУМмаОоатІ МТУ
ФЕОЮ ЕМКІ МЕЗО МКРОВБІ ВІ БСААЗИЕТЕМТМАММУ/УАОАРаИкКаі ЕМ М
МО-7 пиСОоЗ УН2г | АВІВЗЕКУМММАТУМАОБУКОВЕТІЗНО ОКО МІ ОМММІ КТЕОТАМУ МОУ
І днамРгамМемМУЗУуУгАУМмсоатТІМТУ5о
ФЕОЮ ЕМКІ МЕЗО МКРОВБІ ВІ БСААЗИЕТЕМТМАММУ/УАОАРаИкКаі ЕМ М
МОВ пиСОоЗ УНЗ | АВІВЗЕКУМММАТУМАОЗУКОВЕТІЗАООЗКБІЇ М ОММ5І КТЕОТАМУМСМ
І вднамгеамМемМУЗУгАУМУсоатІМТУ5о
ФЕОЮ ЕУКІ МЕЗБОСІЇ МКРИаВ5БІ ВІ ЗСААБОЕТЕМ ГТ МАММУУАОАРОКаИагЕММ
МОЗ пиСОЗ УНА | АВІВБ3ЕАКУМММАТУМАрЗУКОВЕТІЗАВОЗКІИІ МОММ5І КТЕОТАМУУСМ
І АнНаТамМмеамеУУБУЕАУМмаОосастмМУТУ55
ФЕОІЮ ОАММТОЕРБЕБУБРОСТУМ ТІТОВА ОАМТТЗМУАМУМУМООТРООАЕНИї.
МО о пиСОЗ МІ ПасатТМкКААРЕИМРАВЕЗОаБИИОКААЇ ТІТаАОСАООЄЕБІМЕСАЇ М/УБМІ ММ
І саваткітмі.
ФЕОІЮ ОАМУМТОЕРБЕБУБРОСТУ ТІТОВА ОАМТТЗММАММУМООТРООСАЕНВИ І
МО пиСОЗ мМІ2 | ватУМкКААРЕИМРАВЕЗИОаБІ СМКААГТІТаАОАООЕБІМЕСАЇ Му/УЗМІММБаИ
І саткітмі.
ФЕОІЮ ОАММТОЕРБЕБУБРОСТУМ ТІТОВА ОАМТТЗМУАМУМУМООТРООАЕНИї.
МО 12 пиСОоЗ МІ З паст МкААРЕИМРАВЕЗОБІ СМКААГТІТаАОАВОЕБОММУСАЇ М УБМІ ММ
І ЕвааткітмІ. зрілий СОЗе ОорамЕгєємаасітОоТРУКУБІЗЕИТ ТМ ТОРОМРОаЗЕУОНМОКМИааоЕо
ЗЕ І (епсилон) ОКМазорЕОНІ 5І КЕРЗЕГЕОБОУУМСУРАИазКРЕОАМЕМІ МІ ВАВМСЕМ
МОЗ людини СМЕМОММ5МАТІМІМОІСТТЯСС УМ ММ 5КМАКАКАКРУТАНИАСАССИВ
ОВаомМмкКЕВРРРУРМРОМЕРІВКСОАОІ За МОВНІ
ЕОЮ созб ЕКІРІЕЕЄГЕОВМЕУМСМТ БІТИ МЕС ТМат ПІТ ОГаквВІОоРАСІМАС
МО-14 (дельта) МатрімкоКкЕЗТМОУнНУАМСОЗСМЕГОРАТМАСИМТОМІАТІ ГП АГИМЕС
І людини ЕАСНЕТОавІ заТдАОТОАІСАМрОУМОРСАВАОрАОУЗНІ саму АВМК
АЗТКаРЗМЕРІАРЗЗКЗТЗИастТАА асі МКОМЕРЕРУТУБУМЗИаА Та константна | МНТЕРАМІ О5БИЇ У5І ЗБУТ УРЗББІ ТО ТМІСМУМНКРЗУМТКМОКАМЕР
ЕОЮ область КЗСОКТНТСРРСОРАРЕ ССОРБЗМУЕГЕРРКРКОТІ МІЗАВТРЕУТСМУМОМ5
МО: 15 | Важкого НЕОРЕМКЕМУ УМИМЕУМНМАКТКРАЕЄОУМЗ ТУАУУЗМІТМІ НОВУ М
І ланцюга СКЕУКСКУЗМКАГ РАРІЕКТІЗКАКСООРАЕРОМУТІ РРЗВЕЕМТКМОМ5БІ.
І991 т(ї) ТСГУКагМмРБОІАМЕМЕЗМООРЕМММКТТРРМІ ОБООЗЕРІ МЗКІТМОК
ЗВО ММЕЗСЗММНЕА-НМНУТОКБІ І 5РИаК област ща Авікарзміріарз5Квіздаїааідсімкауїрермімзмпздайзампрамідззаїувівв
ФЕОЮ | важкого МмімрзззідідіуїспипиКропікмактуеркзсактїсррсраретеддрзмітрркрк
МО: 16 | ланцюга СІтівпремісуумахзпедреуКіпуухадмемппакіКкргеєдупвїугиувміїмінай
І | й ММІпоКкеуксКУзпКаІраріекіізКакддргердмуПррогеетікКпадмвіїсімКатурзаїа 991 т)
ІБ ЕВА межезпдареппукйррміазадзшузкімакзгидддпмї5с5мтпеаіпппуїкКііроак
ФЕО!Ю Мн пиСІВ- ЕМО МЕЗОСІСЇ МКРОСБІ ВІ БСААБагтЕ55УаМЕММНОАРИаКаї.
МОочяу ва ЕММАТІБАУЗАМІМУРОБУКОИаВЕТІЗАОМАКМБІ МГОММ5І ВАЕОТА
І МУХСАВАРІ МаЗЗРОУМУССОСТІ ТУ
ФЕО!Ю МІ пиСІВ- ЕІМГТО5РАТІ 5І ЗРЕЕВАТІ ЗСЗАЗЗЗМ ГУУНММООКРООАРВАГ
Мої в/м ІМОТЗКІГ Аа РАНЕЗИаЗИаЗОТОБТІТІЗЗГЕРЕОРАУУУСгОВСБИаУ
І РСТРаЗаткСЕМА
ФЕОІЮ ОМОЇ МОБЕАЕУККРИаАБУКУЗСКАБИМ ТЕТММИІ5УУУВОАРОСС
МО-19 Мн НЕН2 169 | ЕМ МОУ/Л ЗАУБаМТМАОКГОСАМТМТТОТТТТАММЕЇГ БІ НО
І ОТАМУУСАВОВІММАРОМЕО МУ СОСТІ МТУ55
ЕОЮ ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РЕЕВАТІ ЗСВАБОБЗУЗЗМ АММООКРИИОАРА
МО:2о МІ НЕН2 169 | ГІПМОАЗМААТОаІРАНЕЗОаЗОаЗаИтОвРТІ ТЗІ ЕРЕОБАУУМСООВ
І ЗМУ РАТРСОСТКМЕІК зрілий СОЗє | ОБО МЕЕМОаБІТОТРУОМВІЗОТТМІТОоБОНІ Я5ЕАОУМОНМИКМ
ЗЕОІЮО |(епсилон) КЕОБИарвгеЕгРЕЕБЕМЕОБИаУУУСуУРАЗМРЕВАЗННІ МІ КАНМ
МО:21 макаки- СЕМСМЕМОМУМАМАТІМІМОІСТТ С МУ ЗКМАКАКАКРУТНО крабоїда АСАСИавОопаомМкКЕВАРРРУМРМРОМЕРІВНКСОСОСОВІ УЗасмМОВАІ зрілий СОЗе ОорамЕгЕмМавіТтотРУНУВІЗИТТМІТОоОНІ азЗЕМОМОНМИК
ЗЕ І (епсилон) МКЕОБарАГЕСРЕЕЗБЕМЕОБИахуУУУСуУРАЗМРЕОВАЗННІ МІ КА
МО:22 макаки-резус АМСЕМСМЕМОММАМАТІМІМОІСТТС ОС С ММ ММ ЗКМАКАКАКРУ тТвпададаавВОвВаОМкЕВРРРУРМРОМЕРІВНКООСОЮІ УЗаСМОВ ВІ
АЗТКаРЗМЕРІ АРЗЗКЗТЗИасТААГ асі МКОМЕРЕРУТУБУУМБИаА
ГТ5амнНтТЕРАМГ ОБОЇ БІ 55УММТУРБЗБЗІЯТОГМІСМУМНКРБЗМ
ТКМОКАМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕЇ са РБМЕ ЕРРКРКОТІ МІ
ЗЕОЇІЮ | д91т()- АТРЕМТСУУМОУМЗНЕОРЕУКЕМИМ УМВИМЕМНМАКТКРАЕЄОУМ5
МО 23 |Р405І. ТУИАМУБМІТУМ НОРМІ МакЕМКСКМУЗМКАГРАРІЕКТІЗКАКСИа.ОРА
ЕРОМУТГ РРОВЕЕМТКМОМБІСТСІ МКЕЕМРЗОІАМЕМЕЗМООРЕМ
МУКТТРРМ ОоОСЯЗЕП ЗК МОКЗАУМООСММЕЗСЗУМНЕАСНМ
НУТОКБІ І РОК
АБТКОаРБОМЕРІ АРОБКОТЗОаСТААІ СІ МКОМЕРЕРУТУБМУ МБИА
ГТ5аМНТЕРАМІ О550І М5І 55 УРБББІ ЕТО МІСМММНКРОМ
ТКМОКАУМЕРКЗСОКТНТСРРСОРАРЕЇ ЇЇ СО РОМГБІ ЕРРКРКОТІ МІБ
ЗЕОІО | Ідатт()- ВТРЕМТСУМУМОМЗНЕОРЕУКЕМУ УМОСМЕМНМАКТКРАЕЕОММ5
МО:24 ка ТУВММУ5БМІ ТМ НОМ МЕОКЕМКСКУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРА
ЕРОММУТІ РРОВЕЕМТКМОМ5І ТС УКОЕМРЗОІАМЕМЕЗБМОО РЕМ
МУКТТРРМІО5ОО5ЕРІ ЗА ТМОКЗАМОСОММЕЗСОЗМУМНЕАЇ Н
МНУТОКОБІ БІ Рак
АБТКОаРОМЕРІ АРОБКОТЗИасТАА ас МКОМЕРЕРМТУБУ МЗИАЇ.
Т5ОаМНТЕРАМІ О5501І М5І 55 МРБББІ ЕТО МІСМУММНКРЗМТК дат т(в- МОКАМЕРКЗСОКТНТСОСРРСОРАРЕРЕСОРБМРІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТР
ЗЕО І ІЕГЕПА- ЕМТСУММАМ5НЕОРЕУКЕМУ УМВС МЕМНМАКТКРАЕЕОУМО ТА ММ
МО:25 Е4б5І. ЗМІ ТМ НОБУУІ МСОКЕМКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКаОРАВЕРОМУТІ.
РРОВЕЕМТКМОМ5І ТОЇ УКОЕУРБОІАМЕМ ЕЗБМСОРЕММУКТТРРМІ. рзравР кі ГМК ВУМОССММЕЗСВММНЕАЇ НМНУТОКОБІ 51.
Рак
АБТКОаРОМЕРІ АРОБКОТЗИасТАА ас МКОМЕРЕРМТУБУ МЗИАЇ.
Т5ОаМНТЕРАМІ 055021 М5І 55 МРБББІ аТОТМІСМУМНКРОМТКМ
ЕОЮ Ідаїт()- ОКАМЕРКЗСОКТНТСРРСОРАРЕРЕСОРБМУРІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМ
МО-26 ІГЕГЕВА- ТСМУММАМ5НЕОРЕМКЕМУУУраМЕУНМАКТКРАВЕЄОУМОТ МАМІ.
І ка ТМ НОМ МЕОКЕМКСКМУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСООРАЕРОММТІ РРО
ЕЕМТКМОМ5І ТС УКОЕМРБЗОІАМЕЖМЕЗМООРЕММУКТТРРМ ОСС
ЕРГМЗАСТМОКЗАВУмМОССММЕЗСОЗУМНЕАІНМНУТОКОБІ БІ Рак
ЗЕО ПО | вихідна Мн ЕМКІ ЕЗБОСОИЇ МОРКОаБІ КІ БСААЗОЕТЕМТМАММУМУУВОАРИКаїгї ЕМ
МО-27 миші МАВІВ5КУМММАТУМАОБУМКОВЕТІЗАВОБОБІІ МІ ОМММІ КТЕОТАМУ
І УСУВвВНОаМеаМОМУ5У ЕАММ ОСТІ МТ УА 5ЕОІЮ | вихідна Мі ОАММТОЕБАЇ ТТ5РОЕТМТІ ТСВ55ТОАМТТ5ММАМУМОЕКРОНІ ЕТО
МО28 миші ПаатТМкААРЕИМРАВЕЗОаБІ І2ОКААЇТІТИАОТЕОРЕАІМЕСАЇ МУБМІ. " МмУгаасткі тм.
ФЕОІЮ мнСОго- ЕМОЇ МЕЗОСОЇ МОРОВБІ ВІ БСААЗИЕТЕНОМАМНУУВОАРОКИІ Е
МО:29 708 М МУ5ТІБМУ МИТІ мМАрБУКОаВЕТІЗАОМАКМ5І МІ ОММ5І ВАЕОТАЇ У
Й УСАКОЮМУСОМУУМаМмоО мУсОосТтУТУ55
БОЮ Мі сого- ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РЕЕВАТІ БСВАБОБУББЗМУІ АММООКРОСАРНАЇ М
МО:30 708 рАБМААТИаІЇРАНЕЗОаБа5БаТОвТтІ ТІЗ5І ЕРЕОБЕАМУМСООНБММУ РІТ
Й ЕаОСТВІ БІК
ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Одержання гуманізованих антитіл до СОЗ і не активуючих варіантів антитіл
Гуманізація антитіл до СОЗ
Гуманізація антитіл до СОЗ миші (05 8,236,308, описані тут як ІЇ991-СО3) проводилася на фірмі Апійоре (Сатбгідде, ОК) з використанням поліпшеної версії їх технології гаметної гуманізації (пересадження СОК) (ЕР 0 629 240). За цією технологією було розроблено 4 різні Мн- ланцюги (ЗЕО ІЮ МО: 6, 7, 8 і 9) і З різні Мі-ланцюги (ЗЕО ІЮ МО: 10, 11 і 12). Комбінуючи ці 4 Мн- ланцюги з З Мі-ланцюгами, одержали 12 різних антитіл. Гуманізовані варіанти позначаються тут як пиСОЗ. Так, гуманізовані варіанти, що містять Мн і Мі за винаходом, позначаються, наприклад, як Ідд1-пиСО3-Н111, що означає, що даний конкретний варіант відноситься до ізотипу ІДо1, є гуманізованим антитілом до СОЗ і містить амінокислотну послідовність Мн, яка іменується "НІ" і відповідає 5ЕО ІЮ МО: 6, і амінокислотну послідовність Мі, яка іменується "1" і відповідає ЗЕО ІЮ МО: 10. Таким чином, НІ означає варіабельну область важкого ланцюга Уні,
Ї1 означає варіабельну область легкого ланцюга Мі і т.д.
Зокрема, були отримані й перевірені в описаних тут прикладах варіанти Ідд1-пиСОЗ3-НІІ 1 (гуманізоване до СОЗ, що включає послідовність Уні, наведену в зЕО ІЮ МО: 6, і послідовність
МИ1, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 10), Ід91-пиСО3-НІ112 (гуманізоване до СОЗ, що включає послідовність Мні, наведену в ЗЕО ІЮ МО:6, і послідовність Мі2, наведену в ЗЕО ІЮО МО:11),
Ід91-пиСО3-НІТІ З (гуманізоване до СОЮЗ, що включає послідовність Мні, наведену в ЗЕО ІЮ
МО:6, і послідовність МІЗ3, наведену в 5ЕО ІЮ МО:12), Ідд1-пиСО3-НЗІ З (гуманізоване до СОЗ, що включає послідовність Ун3, наведену в 5ЕО ІЮ МО:8, і послідовність Мі 3, наведену в ЗЕО ІЮ
МО:12), ІЧ91-пиСО3-НАЇ 1 (гуманізоване до СОЗ, що включає послідовність Уні, наведену в ЗЕО
ІО МО:9, і послідовність М/1, наведену в 5ЕО ІЮ МО':10), Ідд1-пиСО3-НЗІ 1 (гуманізоване до СОЗ, що включає послідовність Ун3, наведену в 5ЕО ІЮ МО:8, і послідовність М1, наведену в ЗЕО ІЮ
МО:10), ІЧ91-пиСО3-НЗІ З (гуманізоване до СОЗ, що включає послідовність Ун3, наведену в ЗЕО
ІО МО:8, і послідовність МІ3, наведену в ЗЕО ІЮ МО:12), і Ідд1-пиСО3-НАї З (гуманізоване до
СО3, що включає послідовність Ун4, наведену в ЗЕО ІЮО МО:9, і послідовність МІ 3, наведену в
ЗЕО ІЮ МО:12).
У деяких прикладах у якості контрольного антитіла (І абгі)п еї аіІ., РМАЗ 2013, 110: 5145-50) й для перевірки різних не активуючих комбінацій, мутацій в Ес-області (див. приклади 8-10) використовували антитіло, яке містить послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюга пис В-13/4 (5ЕО ІО МО: 17 ії 18, відповідно). НиСВІ--13/4 є гуманізованою версією мишачого антитіла СІ В-13/4 до СОЗ (Раїтеп еї аї., Ке5 Іттипої. 1991, 142(9):749-63). Обидві послідовності (ЗЕС ІО МО: 17 ї 18) клонували у відповідні експресуючі вектори рсрМАЗ.З (Іпмігодеп) і піддавали експресії після котрансфекції в клітини НЕК29ЗЕ. Отримане контрольне антитіло позначене як Ід91-пиСіІ В-Т3/4.
У деяких прикладах у якості позитивного контролю використовували антитіло, що включає послідовності варіабельних областей важкого й легкого ланцюга антитіла 708 до СО20 (ЗЕО ІЮ
МО: 29, відповідає послідовності Мн, ії 5ЕБЕО ІЮ МО: 30, відповідає послідовності Мі). При використанні в якості позитивного контролю воно іменується "ІЧ91-2020".
Ці антитіла І(901-СО3 (тобто химерне вихідне антитіло до СОЮЗ), Ід91-пиСОЗ ї Ідд1-пиСіІ В-
Т3/4 використовували в моноспецифічному і в біспецифічному форматі, причому біспецифічні антитіла одержували, як описано нижче.
Антитіло до НЕК2
У деяких прикладах використовували антитіло проти НЕК2. Послідовності Мн і Мі для цього специфічного до НЕКЗ2 антитіла (антитіло 169, 5ЕО ІО МО: 19 ї 20, відповідно) були описані раніше (МО 2012/143524 |Септабі|; Іабгіп еї а, РМАБ 2013, 110: 5145-50). Антитіло використовували й у моноспецифічному, і в біспецифічному форматі, воно іменується "Іда1-
НЕВН2г".
Антитіло 012
У деяких прикладах у якості негативного контролю використовували антитіло 012, специфічне до др120 (Вагра5 СЕ. 9. Мої. ВіоІ. 1993 Арг 5, 230(3):812-23), яке іменується "Ід91- р12г".
Зо Експресія
Антитіла експресували у вигляді 991, до або Ідд1,л з описаними нижче неактивуючими мутаціями або без них і з мутацією в домені Сн3, яка сприяє отриманню описаним нижче способом біспецифічних антитіл: Ідд1-НЕН2-К4098, Ідд1-612-К4098, Іда1-СО3-Е405І. Суміші плазмідних ДНК, які кодують важкі й легкі ланцюги антитіл, піддавали короткочасній трансфекції в клітини Егеезіуїе НЕК29ЗЕ (Іпмігодеп, США) за допомогою 293фектина (Іпмігодеп, США), в основному, як описано виробником.
Очищення антитіл
Супернатант культури фільтрували через заглушені фільтри на 0,2 мкм, наносили на стовпчики Марзеїесі ЗиКе в 5 мл (СЕ Неайй Саге) і елюювали 0,1 М цитратом натрію з Ммаон, рН 3. Елюат відразу ж нейтралізували 2М трис-НСЇ, рн 9 ії діалізували протягом ночі проти 12,6
ММ МанНгРО», 140 мм Масі, рН 7,4 (В.Вгашп). У якості альтернативи елюат після очищення наносили на знесолюючу колонку НіРгер і міняли буфер в антитіла на 12,6 мМ МанНегРо»х, 140 мМ масі, рН 7,4 (В.Вгашп). Після діалізу або заміни буфера зразки стерилізували фільтруванням через глухі фільтри на 0,2 мкм. Визначали чистоту методом 50О5-РАСЕ і вимірювали концентрацію за поглинанням при 280 нм. Очищені антитіла зберігали при 2-8 С.
Одержання біспецифічних антитіл
Біспецифічні антитіла одержували іп міго за технологією на платформі ЮОиоВоауФф, тобто індукованого 2-МЕА обміну Рар-плечима, як описано в УМО 2011/147986 і І абгізп еї аї. (Габгі)п еї а, РМАБ 2013, 110: 5145-50; Статег єї а. Маре 2013, 5: 962-973). Для одержання біспецифічних антитіл цим методом, створювали молекули Ідо1, які несуть одиночні мутації у домені СНЗ: в одного вихідного антитіла Ідд1 - мутацію Е4051І. (тобто це антитіло Ідо1 до СОЗ), в іншого вихідного антитіла Ідд1 - мутацію К409К (тобто це антитіло до НЕК2 або антитіло Б12).
Для одержання біспецифічних антитіл ці два вихідні антитіла, кожне в кінцевій концентрації 0,5 мг/мл, інкубували з 25 або 75 мМ 2-меркаптоетиламін-НСІ (2-МЕА) у загальному обсязі 500 мкл
ТО при 31"С протягом 5 год. Відновлювальну реакцію зупиняли шляхом видалення відновлювача 2-МЕА на колонці РО-10 (СЕ-Неаннсаге, виріб 217-0851-01), урівноваженій 25 мл
РВ5. Перед знесоленням у зразки додавали 2 мл РВ5 (В.Вгайп, виріб Ж 3623140) для доведення обсягу до 2,5 мл. Проводили елюювання в 3,5 мл РВ5. Зразки збирали в центрифужні гнізда Атісоп ШКга (межа відсікання 30 кД, Мійроге, виріб ЖОРС803096) і бо концентрували центрифугуванням 8 хв. при 3000х9д. Доводили об'єми до 500 мкл (за необхідності) за допомогою РВЗ5 і зразки стерилізували фільтруванням через фільтр на 0,2 мкм (Міех-СУ, виріб Ж5І 500451). Отримані біспецифічні продукти зберігали за температури 2- 8.
В альтернативному способі, що дає такі ж біспецифічні антитіла, для одержання біспецифічних антитіл змішували два вихідні антитіла по 100 мкг і інкубували з 75 мМ 2- меркаптоетиламін-НСІ (2-МЕА) у загальному об'ємі 400 мкл РВ5 (В.Вгацп, виріб 53623140) за 31 "С протягом 5 годин. Відновлювальну реакцію зупиняли шляхом видалення відновлювача 2-
МЕА за допомогою центрифужних гнізд Атісоп ОГга на 0,5 мл (межа відсікання 30 кД, МіПіроге, виріб ЖЮОРС803096) і промивали 4 рази по 400 мкл РВ5 центрифугуванням 10 хв. при 13000х9.
Зразки збирали в нові пробірки, перевертаючи фільтри й центрифугуючи 2 хв. при 1000х9.
Доводили об'єми до 200 мкл (за необхідності) за допомогою РВ5. Для визначення кінцевої концентрації вимірювали поглинання біспецифічних продуктів при 280 нм (А280). Для визначення кількості біспецифічного продукту проводили катіоно-обмінну хроматографію НРІС (НРІ О-СЕХ) (як описано в УМО 2013/060867). Зразки зберігали при 2-8 76.
Отримані біспецифічні антитіла надалі іменуються "остов К409Е Ідд1" і "остов Е405І Ідд1".
Неактивуючі мутації
Одержували кілька варіантів антитіл із заміною однієї або декількох амінокислот в Ес- області. Інактивація Ес-області запобігає взаємодії антитіл з Ес-рецепторами, які присутні на клітинах крові типу моноцитів, або з Сід при активації класичного шляху комплементу. У варіантів антитіл, що містять різні комбінації амінокислотних замін в Ес-області, перевіряли зниження активності Ес. Уводили максимум п'ять амінокислотних замін, які включають мутації
М2970, І 234А, І 235А, І 234Е, І 235Е, 0265А і РЗ3315. Заміни в одному або декількох із цих п'яти положень амінокислот уводили в остов К409К і/або Е405І. Ід91. Були отримані наступні варіанти
Ес-області антитіла пис В-Т3/4: М2970О (що означає заміну М2970), іменується Ід91-писСІ В-Т3/4-
М297О), ГРГЕ (що означає заміни І234Р// 235Е, іменується Ідо1-пиСІ В-13/4-ІЕГЕ), ГАГА (що означає заміни І234А/Л 235А, іменується Ідоа1-пиСІ В-13/4-Г АГА), ГРЕГЕМО (що означає заміни
ІЇ234Р//235Е/М2970, іменується Ідд1-пиСі В-13/4-ІРГ ЕМО), ГРГЕСА (що означає заміни 1/234ЕЛ1. 235Е/0265А, іменується Ідо1-пиСІВ-13/4-ІЕГЕБА), БА (що означає заміну 0265А, іменується Ідо1-пиСіІ В-13/4-БА), БАРЗ (що означає заміни 0265А/РЗ3315, іменується Ідд1-
Зо пиСІ В-Т3/4-ЮАРБ5), БАМО (що означає заміни 0265А/М2970, іменується Іда1-писСіІ В-Т3/4-
РАМО), ГРГЕРБ (що означає заміни І 234Е/ 235Е/РЗ3315, іменується Іда1-писСіІ В-13/4-І РІГ ЕР) і
ГРГЕВАМОР5 (що означає заміни І234Р/235Е/0265А/М2970/РЗ3315, іменується Ідо1-писСіІ В-
Т3/4-І ЕГЕОАМО РБ).
Зокрема, для одержання антитіл з неактивуючою Ес-областю варіантам антитіл Ідд1-пиСОЗ в остови К4А09К і Е405І. Ідд1 вводили комбінацію з трьох замін амінокислот, яка включає мутації
І 234Е, 1235Е і 0265А і іменується І ЕГЕВА. Отримані неактивуючі варіанти антитіл іменуються з суфіксом "-ГЕГЕВБА".
Приклад 2. Зв'язування гуманізованих антитіл до СОЗ й їх неактивуючих варіантів з Т- клітинними лініями людини і макаки, які експресують СОЗ
Аналізували зв'язування очищених варіантів гуманізованих антитіл до СОЗ (пиСОЗ) і біспецифічних молекул (65)1д91-пиСОЗх НЕК2 з мутаціями І РІ ЕВА в Ес-області (див. приклад 1) або без них з Т-клітинами лінії дигКаї людини (клон Еб-1, АТС? ТІВ-1527М, | (зС Зіапдага5 стрнН, Умезеї, Німеччина) або з Т-клітинами лінії Н5С-Е макаки-крабоїда (кат. Мо ОСРВ1164;
Неакй Зсіепсе Кезеагсп Кезоигсез5 Вапк, ОзакКа, дарап) методом ЕАС5. Поряд з неактивуючими мутаціями І ЕГЕБА, варіанти антитіл містили мутації Е405І або К4А09Е, як описано в прикладі 1.
Клітини (1х105 клітин на лунку) інкубували в полістиролових 9б-ямкових круглодонних планшетах (Сгеіпег Віо-опе 650101) із серійними розведеннями препаратів антитіл (у діапазоні від 5 до 10000 нг/мл у вигляді З-кратних розведень) в 100 мкл РВБЗ/О,1 95 В5А/0,02 95 азиду при 4 "С протягом 30 хв.
БО Після дворазового відмивання в РВБ/О,1 95 ВБА/0,02 95 азиду, клітини інкубували в об'ємі 100 мкл із вторинним антитілом при 4 "С протягом 30 хв. У якості вторинного антитіла у всіх експериментах використовували кон'юговане з К-фікоеритрином (РЕ) козяче Е(аб)2 проти ІДС людини (109-116-098, Часкзоп ІттипокКезеагсй І арогаогіе5, Іпс., УУМеб5і Сгоме, РА), розведене 1/100 в РВ5Б/0,1 95 ВБА/0,02 95 азиду. Потім клітини відмивали двічі в РВБ/0,1 95 В5А/0,02 95 азиді, ресуспендували в 150 мкл РВБ/О,1 95 ВБА/0,02 95 азиду й аналізували на приладі ЕАС5
Сапіо! (ВО Віозсіепсе5). Криві зв'язування аналізували методом нелінійної регресії (сигмоїдальна крива доза-відповідь зі змінним нахилом) за допомогою програмного забезпечення сСгарпРаай Р'гізт М5.04 (сгарпРаа боймаге, Зап Оіведо, СА, ОА).
З Фіг. 1А видно, що зв'язування із клітинами ДЧигкаї спостерігалося у всіх варіантів Іда1А- 60 пиСОЗ з Ес-областю дикого типу: Ідд1-пиСОЗ3-НІ111 (ЗЕО ІЮ МО: 6 і 10, відповідно), ІЧ91-пиСОЗ3-
НІТІ2 (ЗЕ ІЮ МО: 6 і 11, відповідно), Ідд1-пиСОЗ3-НІТІ З (5ЕО ІО МО: 6 і 12, відповідно), Ід91- пиСОЗ3-НЗІ З (5ЕО ІЮ МО: 8 й 12, відповідно) й Ід91-пиСО3-НА1 1 (ЗЕО ІЮО МО: 9 й 10, відповідно), а єднальна здатність у І(д91-С03-І РГЕВА (вихідне антитіло до СОЮЗ, описане у прикладі 1, з неактивуючими мутаціями ГРІ ЕБА) ї Ідд1-пиСбО3-НЗІ 1--РЕГЕСА з неактивуючими мутаціями
ІГРСЕБА була близька до варіантів пиСОЗ з Ес-областю дикого типу. В Іа491-писСІ В-Т3/4, включеного в якості позитивного контролю, зв'язування із клітинами УигКкаї було сильніше в порівнянні з варіантами Ідд91-пиСОЗ. Ніякого зв'язування не спостерігалося в антитіла негативного контролю -- Ід91-612.
З Фіг. бА видно, що зв'язування з клітинами Уигкаї у Ї991-2О03-І ЕГЕБВА (вихідне антитіло до
СО3, описане у прикладі 1, з неактивуючими мутаціями І РЕВА), Ідд1-пиСОЗ3-НЗІ 1-І ГГ ЕВА,
Ід91-пиСО3-НЗІ 3-І РГЕВА, Іда1-3пиСО3-НІ11 1-І РГЕВА, Іда1-пиСОЗ3-НТІ 1 3-І РІ ЕВА, Ідд1-пиСО3-
Н4АІ1-І РГЕВА ії Ідоа1-пиСО3-НА 3-І ЕЕГ ЕБА з неактивуючими мутаціями ГЕРГЕБА було близьке з єднальною здатністю варіантів пиИСОЗ з Ес-областю дикого типу. В Ід91-пиСІ В-13/4, включеного в якості позитивного контролю, зв'язування із клітинами ЧЩигКкаї було сильніше в порівнянні з варіантами Ід91-пиСОЗ при низьких концентраціях антитіла, але близьке при більш високих концентраціях антитіла. У цілому, гуманізовані СОЗ-варіанти зберігали таку ж здатність до зв'язування з СОЗ, як у антитіл Ід91-СО03. Ніякого зв'язування не спостерігалося в антитіла негативного контролю - 991-612.
З Фіг. 18 видно, що варіанти біспецифічних антитіл б5Ідд1-СОЗхНЕК2, Б5Ідд1-СО3хр12-
ГРГЕВА і Б51д4а1-пиСО3-НЗІ 1хНЕК2-Ї ЕГЕВА також зв'язуються із клітинами дигкаї. Максимальні значення зв'язування у цих біспецифічних антитіл були вищі, ніж максимальні значення зв'язування в моноспецифічних антитіл. Концентрації ЕСзо у біспецифічних антитіл були в 6-10 разів вищі. Знову ж, ніякого зв'язування не спостерігалося в антитіла негативного контролю --
Ід91-612.
З Фіг. 6В видно, що варіанти біспецифічних антитіл з неактивуючою Ес-областю: Б5Ід91- пиСОЗ3-НЗГ1ХНЕК2-ГРГЕБА, б5іда1-пиСО3-НЗІ ЗхНЕК2-І РГЕБА, / рзідд1-пиСОЗ3-НІТ 1 хНЕНК2-
ІГРГЕБА, рзідд1-пиСО3-НІІ ЗхНЕК2-І РЕВА, реІдд1-пиСОЗ3-НЯАЇ 1хНЕК2-І БГЕБСА її Б5Ідд1- пиСОЗ3-Н4Ї ЗхНЕК2-Г РЕА також зв'язуються з клітинами «игКаї. Максимальні значення зв'язування у цих біспецифічних антитіл були вищі, ніж максимальні значення зв'язування в
Зо моноспецифічних антитіл. Концентрації ЕСзо у біспецифічних антитіл були в 4-10 разів вищі.
Знову ж, ніякого зв'язування не спостерігалося в антитіла негативного контролю - Ід491-012.
З Фіг. 2А видно, що зв'язування з Т-клітинами лінії Н5С-Е макаки-крабоїда у варіантів Ідда1- писСОЗ з Ес-областю дикого типу: Ід91-пиСОЗ-НІ1 1, Ідд1-пиСОЗ3-НІ12, Ідд1-пиСОЗ3-НІ1 3, Іда1- пиСОЗ3-НІЗІЗ ї Ід91-пиСО3-НА11, а також у І991-2О03-І ЕГЕВА, Ідд1-пиСОЗ3-НЗІ 1-ЇРЕГЕБА було однаковим. Ніякого зв'язування не спостерігалося у контрольного антитіла пиСІ В-13/4, яке не дає перехресної реакції з СОЗ макаки, і антитіла негативного контролю - Ід491-012.
З Фіг. 7А видно, що зв'язування з Т-клітинами лінії макаки-крабоїда у варіантів ІЇд91-203-
ГРГЕВА, Іда1-пиСО3-НЗІ 1-І РЕВА, Ідд1-пиСО3-НЗІ 3-І ГГ ЕВА, Іда1-пиСО3-НТІ 1-І РІ ЕВА, Ідад1- пиСОЗ3-НІТІ 3-ГЕГЕВА, Ідд1-пиСОЗ3-НАІ 1-І РЕВА ії Ідд1-пиСО3-Н4І 3-ЇЕГЕБА було однаковим.
Ніякого зв'язування не спостерігалося у антитіла негативного контролю -1д491-012.
З Фіг. 28 видно, що варіанти біспецифічних антитіл р5ідд!-СОЗхХНЕК2 і р5Ідд1-пиСО3-
НЗІГТХНЕК2-Ї ГГ ЕВА також зв'язуються із клітинами НЗС-Е. Максимальні значення зв'язування у цих біспецифічних антитіл були вищі, ніж максимальні значення зв'язування у варіантів моноспецифічних антитіл до СОЗ3. Концентрації ЕСвзо у біспецифічних антитіл були в 10-12 разів вищі, ніж у варіантів моноспецифічних антитіл до СОЗ. Знову ж, ніякого зв'язування не спостерігалося у антитіла негативного контролю - Ід91-012.
З Фіг. 7В видно, що варіант біспецифічних антитіл з неактивуючою Ес-областю: р5Іда1- пиСОЗ3-НЗГ1ХНЕК2-ГРГЕБА, б5іда1-пиСО3-НЗІ ЗхНЕК2-І РГЕБА, / рзідд1-пиСОЗ3-НІТ 1 хНЕНК2-
ГРГЕБА, реІдда1-пиСОЗ3-НІТІ ЗхНЕК2-І РЕВА, р5Іда1-пиСО3-НАЇ 1хНЕК2-І РЕВА і Бзідд1-писаз-
Н4АІ ЗхНЕК2-І РЕВА також зв'язуються з клітинами НЗС-Р. Максимальні значення зв'язування цих біспецифічних антитіл були вищі, ніж максимальні значення зв'язування у варіантів моноспецифічних антитіл до СОЗ. Концентрації ЕСво у біспецифічних антитіл були в 3-6 разів вищі, ніж у моноспецифічних антитіл до пиСОЗ. Знову ж, ніякого зв'язування не спостерігалося в антитіла негативного контролю - Ід491-612.
Приклад 3. Активація Т-клітин гуманізованими варіантами антитіл до СОЗ
Експресія СО69 є раннім маркером активації Т-клітин. Антитіла до СОЗ можуть опосередковувати зшивання Т-клітин і імунних клітин за допомогою зв'язування СОЮЗ, експресованого Т-клітинами, і Ес-рецепторів, експресованих імунними клітинами, через Ес- область антитіла типу Ес-області Ідо1. Це могло б привести до активації Т-клітин і індукції СОб9. бо Варіанти антитіл, що містять неактивуючу Ес-область (мутації І РЕГЕБА), не зв'язуються з Ес- 5О0 рецепторами. Тому слід очікувати, що неактивуючі антитіла до СОЗ не будуть викликати активацію Т-клітин і експресію СОбОУ, так як неактивуюча Ес-область не зв'язується з експресуючими Ес-рецептори імунними клітинами і тому не може зшивати Т-клітини та імунні клітини.
Для вивчення ранньої активації Т-клітин визначали експресію СО69 на Т-клітинах методом
ЕАС5 після інкубації з гуманізованими варіантами антитіл до СОЗ (пиСОЗ) з мутаціями ГГ РЕГЕВБА в Ес-області й без них. Поряд з неактивуючими мутаціями, варіанти І РГЕБА містять мутації
Е405І. або К409ЕК, як описано в прикладі 1.
Виділяли клітини РВМС із цільної крові або лейкоцитарної плівки методом поділу в градієнті щільності, використовуючи пробірки Іеисозер (5227290; Сгеіпег Віо-опе, АІрпеп а/й Вііп,
Нідерланди), промивали в РВ5 і ресуспендували в культуральному середовищі.
Готовили серійні розведення варіантів антитіл до ПпиИСОЗ, негативного контролю (Ід91-012) і позитивного контролю (ІДЕ-пиСОЗ і вихідний І991-СО3) у культуральному середовищі (від 0,1 до 1000 нг/мл у вигляді 10-кратних розведень) і вносили в лунки 9б-ямкового круглодонного планшета, що містять РВМС людини або макаки. Після 24- годинної інкубації клітини осаджували центрифугуванням, а супернатант (який містить цитокіни) збирали й зберігали при - "С. Потім клітини промивали РВБ/0,1 95 ВБА/0,02 95 азиду й фарбували 30 хвилин при 4 "С мишачим антитілом проти СО28 людини з РЕ (854.222.010; Запдпціп, Ат5іегаат, Нідерланди; Т- клітинний маркер) і мишачим антитілом проти СО6О людини з АРС (340560; ВО Віоз5сієепсев, 20 ЕгапкКіїп ГакКкев, М), які дають перехресні реакції з СО28 ії СО69 макаки, відповідно. Антитіла, що не зв'язалися, видаляли шляхом двократного промивання в РВБЗ/0,1 96 ВБА/0,02 азиду. Клітини ресуспендували при 150 мкл на лунку й вимірювали експресію СО6У в СО 28-позитивних клітинах на приладі ЕАС5 Сапіо ІІ (ВО Віозсіепсебв).
З Фіг. З видно, що антитіло Ї4051-СО3 (описане в прикладі 1) і гуманізовані варіанти Ідд1- пиСОЗ з Ес-областю Ідд1 дикого типу індукували близькі рівні експресії СО6У в Т-клітинах людини (Фіг. ЗА) і макаки (Фіг. ЗВ). Неактивуючі (І ГГ ЕБА) варіанти Ідсе1-СО3-І ЕЕГ ЕВА і Іда1- пиСОЗ3-НЗІ 1 індукували низькі рівні експресії СО69 в Т-клітинах людини. Неактивуючі варіанти
Іда41-пиСОЗ не викликали ніякої експресії в Т-клітинах макаки. Контрольне антитіло Ід491-612 також не викликало експресії СОб69 в Т-клітинах людини або макаки.
Зо З Фіг. 8 видно, що неактивуючі (І РІГ ЕБА) варіанти Ідд1-пиСОЗ3-НЗІ 1-І РГЕВА, Ідд1-пиСОз3-
НЗІ3-ГРГЕБА, | Іад1-3пиСО3-НІІ1-ЇЕГЕВБА, | Ідд1-пиСО3-НІ13-ІРГЕБА, | Ідд1-пиСОЗ3-НАЇ 1-
ГРГЕВА і Іда1-пиСО3-НАЇ 3-І ГГ ЕВА індукували низькі рівні експресії СО69 в Т-клітинах людини.
На Фіг. 8А і 88 представлена індукція експресії СО69 в Т-клітинах макаки-крабоїда. Невелика активація, яка спостерігалася, неактивуючими варіантами може бути зумовлена зшиванням молекул СОЗ при бівалентному зв'язуванні антитіл до СЮОЗ. Таке пояснення підтверджується тим, що активація знижується при найвищій концентрації, якщо зв'язування антитіла є моновалентним. Контрольне антитіло Ід91-512 також не викликає експресії СО69 в Т-клітинах людини або макаки.
З Фіг. 8С й 80 видно, що неактивуючі варіанти біспецифічних антитіл Б5Ідд1-пиСОЗ3-
НЗІТХхНЕНК2-ГЕГЕВБА, рзідд1-пиСОЗ3-НЗІ ЗхНЕК2-І РЕВА, рвіда1-пиСО3-НІТІ 1ХхНЕК2-Ї ЕГЕВА, р5Іда1-пиСОЗ3-НІТІ ЗхНЕК2-І РГЕБА, рзідд!-пибО3-НЯ411 хНЕК2-ІЇРГЕСА ої 0 р5Іідд1-пиСОЗ3-
Н4АІЇ ЗхНЕК2-І ГГ ЕВА не викликають експресії СО69 в Т-клітинах людини (Фіг. 8С) або макаки- крабоїда (Фіг. 80). Проте, при більш високих концентраціях антитіл спостерігалася деяка індукція експресії СОб69.
Приклад 4. Проліферація Т-клітин, викликана гуманізованими варіантами антитіл до СОЗ
Вивчали вплив гуманізованих варіантів антитіл до СОЗ (пиСОЗ) (описаних у прикладі 1) на проліферацію Т-клітин людини й макаки за допомогою набору СеїЇ ргоїїегайоп ЕГІБА фірми
Восне Арріїєд 5сієпсе (Сеї! Ргоїїїегайоп ЕГІЗА, Віди КИ, ж11647229001; Воспе Арріїєд Зсієпсе,
Мапппеїт, Німеччина), яку визначали згідно з інструкціями виготовлювача.
Клітини РВМС, виділені із цільної крові або лейкоцитарної плівки, інкубували в 96-ямкових планшетах із серійними розведеннями (від 0,1 до 1000 нг/мл у вигляді 10-кратних розведень) варіантів антитіл (991 до пиСОЗ3. У якості позитивного контролю включали ІЗЕ-СОЗ і Ідд1-писСІ В-
Т3/4, а в якості негативного контролю - дд1-6012. Після З днів інкубації з антитілами в середовище додавали ВгаО (Коспе АрріФй Зсіепсе, Мапппеїт, Німеччина) і інкубували планшети протягом 5 годин. Потім клітини осаджували центрифугуванням, а супернатант збирали й зберігали при -20 "С. Планшети сушили й зберігали при 4 "С аж до проведення
ЕПЗА.
Включення ВІЯ4О у ДНК визначали методом ЕГІЗА згідно з інструкціями виготовлювача (Коспе Арріїей Зсіепсе). Клітини фіксували на планшетах, після чого планшети інкубували 90 бо хвилин за кімнатної температури з антитілами проти ВгаШ, кон'югованими з пероксидазою.
Планшети відмивали РВ5Т і визначали зв'язування за допомогою буфера АВТ5 (замість розчину ТМВ, що входить у набір). Через 30 хв. зупиняли розвиток фарбування додаванням у лунки 2 95 щавлевої кислоти. Потім вимірювали ОЮзо5 на зчитувальному обладнанні ЕІ 808 для
ЕПЗА.
З Фіг. 4 видно, що інкубація РМВСз з вихідним Ід491-СО3 і з гуманізованими варіантами Іда1- пиСОЗ з Ес-областю Ідд1 дикого типу викликала сильну проліферацію Т-клітин людини (Фіг. 4А) і макаки (Фіг. 48) навіть при дуже низьких концентраціях антитіл. Інкубація з неактивуючими варіантами І РГЕВА антитіл Ід91-пиСОЗ не визивала пролиферації Т-клітин людини (Фіг. 4А і
ОА) або Т-клітин макаки (Фіг. 4В і 98). Таким чином, хоча неактивуючі варіанти антитіл Іда1- писСОЗ індукували низькі рівні експресії СО69 в Т-клітинах людини (як показано в прикладі 3), ці неактивуючі варіанти Ідд1-пиСОЗ не викликали проліферації Т-клітин людини.
З Фіг. 9С й 90 видно, що неактивуючі варіанти біспецифічних антитіл Б5Ід91-нпиСО3-
НЗІТХхНЕНК2-ГЕГЕВБА, рзідд1-пиСОЗ3-НЗІ ЗхНЕК2-І РЕВА, рвіда1-пиСО3-НІТІ 1ХхНЕК2-Ї ЕГЕВА, р5Іда1-пиСОЗ3-НІТІ ЗхНЕК2-І РГЕБА, рзідд!-пибО3-НЯ411 хНЕК2-ІЇРГЕСА ої 0 р5Іідд1-пиСОЗ3-
НА! ЗхНЕК2-Г РЕВА не викликали проліферації Т-клітин, виділених з людини (Фіг. 9С) або макаки (Фіг. 90).
Приклад 5. Опосередкована Т-клітинами цитотоксичність іп міго, викликана гуманізованими варіантами антитіл до СОЗ
Пухлиноспецифічна Т-клітинна цитотоксичність може бути опосередкована біспецифічними антитілами, що зв'язуються одним плечем з СОЗ, а іншим плечем - з пухлиноспецифічною мішенню типу НЕК2. Одночасне зв'язування біспецифічного антитіла й з Т-клітинами, і з клітинами пухлини буде призводити до активації Т-клітин і специфічної до пухлинних клітин цитотоксичності. У цьому прикладі вивчали опосередковану Т-клітинами цитотоксичність проти
НЕН2-позитивних пухлинних клітин за допомогою біспецифічних антитіл проти СОЗ3 (гуманізовані варіанти) і НЕК2.
Для цього клітини АШ5Ьб65 (карцинома молочної залози людини) культивували в середовищі
ЕРМІ 1640 з додаванням 10 95 (об/0б) інактивованої нагріванням СС5, 1,5 г/л бікарбонату натрію (І оп7а), 1 мМ пірувата натрію, 4,5 г/л глюкози (5ідта), 50 МО/мл пеніциліну й 50 мкг/мл стрептоміцину. Клітинна лінія утримувалася при 37 "С в зволожувальному інкубаторі з 5 95
Зо (06/06) СО». Клітини АШ5Об5О культивували майже до злиття, після чого клітини обробляли трипсином, ресуспендували в культуральному середовищі й пропускали через клітинний фільтр, щоб одержати суспензію одиночних клітин. У кожну лунку 96-ямкового планшета висівали по 5х107 клітин і інкубували їх щонайменше З год. при 37 "С, 595 СО» до повного зчеплення із планшетом.
Виділяли РВМС людини або макаки із цільної крові або лейкоцитарної плівки. Виділені
РВМС промивали РВ5, ресуспендували в культуральному середовищі й додавали в співвідношенні 1:11 до пухлинних клітин АО5б65 в 96-ямкових планшетах. Вміст Т-клітин серед
РВМС вимірювали методом РАС5 за допомогою мишачого антитіла проти СОЗ людини з РегоР (Вр, Ж345766) (для фарбування Т-клітин), яке дає перехресну реакцію з СОЗ макаки. Вміст Т- клітин у популяціях РВМС, що використовувалися, зазвичай становило від 50 до 60 95.
Готували серійні розведення (кінцеві концентрації від 0,001 до 10000 нг/мл) варіантів біспецифічних антитіл Б5Ідд!-СОЗхНЕК2-ГЕГЕБА, рзгІдд1-СОЗ3хр12-ІРГЕБА, Бз5ідд1-пиСОЗ3-
НЗІТХхНЕНК2-ГЕГЕВБА, рзідд1-пиСОЗ3-НЗІ ЗхНЕК2-І РЕВА, рвіда1-пиСО3-НІТІ 1ХхНЕК2-Ї ЕГЕВА, ре5Іда1-пиСОЗ3-НІТІ ЗхНЕК2-І РГЕСА, 0 реіда1-пиСО3-НЯ4 1хНЕК2-ІЇБГЕСА ої /р5ідд1-пиСО3-
Н4АІЗхНЕК2-І РГЕВА у культуральному середовищі й вносили на планшети. У якості контролю включали Ідд1-НЕН2-ГЕГЕВА і Ідд1-612. Поряд з неактивуючими мутаціями І РІГЕВА-варіанти антитіл містять мутації Е405Ї або К409К для отримання їх у біспецифічному форматі (див. приклад 1). Планшети інкубували протягом З днів при 37 "С, 595 СО». У якості контролю на 100 95 загибель пухлинних клітин використовували інкубацію клітин з 1 мкМ стауроспорина (я556942-200, Зідта). Планшети двічі промивали РВЗ і в кожну лунку додавали 150 мкл культурального середовища, що містить 10 95 Аіатаг Біше. Планшети інкубували протягом 4 годин при 37 "С, 5 95 СО». Вимірювали поглинання при 590 нм (Епмізіоп, РегКіп ЕІтег, Ума тат,
МА).
Варіанти біспецифічних антитіл типу СОЗх НЕК2-І РГЕБА (рзіІад9д1-пиСіІ В-Т3/4хНЕК2-Г ГГ ЕВБА і 55І9941-СОЗХхНЕК2-І РІГ ЕБА) викликали загибель клітин АО5Уб65 у низьких концентраціях при використанні ефекторних клітин людини (Фіг. 5А) або ефекторних клітин макаки (Фіг. 58).
Контрольне біспецифічне антитіло до СОЗ пиСІ В-Т3/4хНЕК2-І ЕГЕВА, яке не дає перехресної реакції з СОЗ макаки, викликало загибель клітин А5Бб5 тільки при використанні РВМС людини (Фіг. БА). Таким чином, загибель клітин мішені не спостерігалася при використанні ефекторних бо клітин макаки при аналізі (Фіг. 58). Інкубація з моноспецифічними антитілами Ідча1-р012 або Ідд1-
НЕН2-ІРГЕВА або БзіІдд1-СО3х012-ІЕГЕВА не викликала неспецифічної загибелі клітин мішені.
Варіанти біспецифічних антитіл Б5Ідд1!-пиСОЗ3-НЗІїхНЕК2-ГРГЕБА, /Б5Іда1-пиСО3-
НЗІЗХхНЕК2-ГЕГЕВБА, рзідд1-пиСОЗ3-НІТІ Ї1хНЕК2-І РЕВА, рвіда1-пиСО3-НІТІ ЗхНЕК2-Ї ЕГЕВА, р5Ідд1-пиСО3-Н4АГ1хНЕК2-ГРГЕСА і рз5ідд1-пиСОЗ3-Н4 ЗхНЕК2-ІРГЕСА викликали загибель клітин АШ5Ьб5 у низьких концентраціях при використанні ефекторних клітин людини (Фіг. 10А) або ефекторних клітин макаки (Фіг. 108). Інкубація з моноспецифічними антитілами Іда1-012 або
І491-НЕН2-ГРГЕрА не викликала неспецифічної загибелі клітин мішені (Фіг. 10А і В). Таким чином, гуманізовані варіанти антитіл до СОЗ, що містять неактивуючу Ес-область, не викликають неспецифічної загибелі клітин мішені, що вказує на те, що варіанти, які містять неактивуючу Ес-область, можна використовувати для отримання адресної активації Т-клітин і тим самим запобігти неадресній активації Т-клітин.
Приклад 6. Активація Т-клітин макаки-резус гуманізованими варіантами антитіл до СОЗ
Для вивчення ранньої активації Т-клітин визначали експресію СОб6ОУ в Т-клітинах макаки- резус після інкубації з гуманізованими варіантами антитіл до СОЗ (пиСОЗ) з Есо-областю Іда1 дикого типу. Виділення РВМС макаки-резус і визначення експресії СО69 методом проточної цитометрії проводили, як описано в прикладі 3.
З Фіг. 11 видно, що гуманізовані варіанти антитіл до СОЗ Ідд1-пиСОЗ3-НІ111, Ідд1-пиСОЗ3-
НІТІ2, Ід91-пиСО3-НІ1 3, Ідд1-пиСОЗ3-НЗІЗ ї Ідд1-пиСО3-Н4Ї1 викликали експресію СОб69 в Т- клітинах з макаки-резус до такого ж рівня, що й Ід91-СО3З (як описано в прикладі 1). Антитіло негативного контролю Ідд1-612 не викликало експресії СО69 в Т-клітинах макаки. Таким чином, варіанти пиСОЗ за даним винаходом можна використовувати в експериментах по СОЗ макаки- резус. Варіанти пиСОЗ дають перехресну реакцію з СОЗ макаки-резус.
Приклад 7. Активація Т-клітин неактивуючими варіантами пис В-13/4
Для вивчення ранньої активації Т-клітин визначали експресію СОб69 в Т-клітинах методом
ЕАСЗ після інкубації з варіантами Ідд1-пиСіІ В-Т3/4 з мутаціями в Ес-області (див. приклад 1).
Виділяли клітини РВМС із цільної крові або лейкоцитарної плівки методом поділу в градієнті щільності, використовуючи пробірки Іеисозер (5227290; Сгеіпег Віо-опе, АІрпеп а/й Вііп,
Нідерланди), промивали в РВ5 і ресуспендували в культуральному середовищі.
Готували серійні розведення варіантів Ід91-пиСіІ В-13/4, негативного контролю (Іда1-пиСіІ В-
Зо Т3/4-Раб) і позитивного контролю (ІДЕ-пиСІ В-13/4) у культуральному середовищі (від 0,1 до 1000 нг/мл у вигляді З-кратних розведень) і вносили в лунки 96б-ямкового круглодонного планшета, що містять РВМС. Після 24-годинної інкубації клітини осаджували центрифугуванням, а супернатант (що містить цитокіни) збирали й зберігали при -20 "С. Потім клітини промивали РВЗ/0О,1 95 ВБА/0,02 95 азиду й фарбували 30 хвилин при 4 "С мишачим антитілом проти СО28 людини з РЕ (854.222.010; Запдціп, Атеїегаат, Нідерланди; Т-клітинний маркер) і мишачим антитілом проти СО6О людини з АРС (340560; ВО Віозсіепсе5, ЕгапкКіїп
І аКе5, М)). Антитіла, які не зв'язалися, видаляли шляхом двократного промивання в РВЗ/О,1 95
ВЗА/0,02 95 азиду. Клітини ресуспендували при 150 мкл на лунку й вимірювали експресію СО69 в Ср28-позитивних клітинах на приладі ЕАС5З Сапіо ІІ (ВО Віозсіепсев5).
З Фіг. 12А видно, що експресія СЮО69 була високою в тих клітинах, які інкубували з ІДЕ- писСІ В-13/4, Ід91-пиСІ В-13/4,. ІдЯа1-пиСІ В-13/4-БА ії Ідо1-пиСіІ В-13/4-ВАРЗ. Інкубація з Ідд1- пиСІ В-13/4-М2970 викликала трохи менший рівень експресії СО69 у порівнянні з Ід91-писСіІ В-
Т3/4 дикого типу, а інкубація з Ідд1-пиСІ В-13/4-І РЕ ї Ідд1-пиСІ В-13/4-І ЕГЕРБ індукувала експресію СО69 меншою мірою. Інкубація РВМС з антитілами Іде 1-СО3-Раб, Іда1-писСІ В-Т3/4-
ГРГЕВА, Ід91-писСІ В-13/4-І ГГ ЕМО, Іда1-писСІ В-13/4-ОАМО і Ід91-пиСіІ В-13/4-І Р ЕВАМОРБ не викликала якої-небудь експресії СЮО69 в Т-клітинах.
З Фіг. 128 видно, що експресія СЮО6Є9 була високою в тих клітинах, які інкубували з ІДЕ- пиСІ В-Т3/4 і Ідо1-пиСіІ В-13/4. Інкубація з Ідд1-пиСІ В-13/4--АГА викликала трохи менший рівень експресії СО69 у порівнянні з Ід91-пиСіІ В-Т3/4 дикого типу, а інкубація з Ід91-пиСІ В-Т3/4-
ГРГЕВА і Ідд1-612 (негативний контроль) не викликала якої-небудь експресії СО69 в Т-клітинах.
Приклад 8. Проліферація Т-клітин неактивуючими варіантами пис В-Т3/4
Вивчали вплив варіантів пис В-Т3/4 (описаних у прикладі 1) на проліферацію Т-клітин за допомогою набору Сеїї ргоїїїтегайоп ЕГІЗА фірми Коспе Арріїєа Зсієепсе (СеїЇ Ргоїїегайоп ЕГІЗА,
Вгаи Кі, Ж11647229001; Коспе Арріїеа Зсіепсе, Мапппеїт, Німеччина), яку визначали згідно з інструкціями виготовлювача.
Клітини РВМС, виділені із цільної крові або лейкоцитарної плівки, інкубували в 96-ямкових планшетах із серійними розведеннями (від 0,1 до 1000 нг/мл) варіантів І(3991-СОЗ3. У якості позитивного контролю включали ІДЕ-СОЗ і І491-СО3, а в якості негативного контролю - Ід91-012 (з мутацією К409Е. для одержання біспецифічних антитіл). Після З днів інкубації з антитілами в бо середовище додавали ВгйО (Коспе Арріїй бсіепсе, Мапппейт, Німеччина) і інкубували планшети протягом 5 годин. Потім клітини осаджували центрифугуванням, а супернатант збирали й зберігали при -20 "С. Планшети сушили й зберігали при 4 "С аж до проведення
ЕПЗА.
Включення ВгаШ у ДНК визначали методом ЕГ ІА згідно з інструкціями виготовлювача (СеїЇ
Ргоїйегайоп ЕПІЗА, Віа КИ, 9Ж11647229001; Коспе Аррієай Зсіепсе). Клітини фіксували на планшетах, після чого планшети інкубували 90 хвилин за кімнатної температури з антитілами проти Вга), кон'югованими з пероксидазою. Планшети відмивали РВ5Т і визначали зв'язування за допомогою буфера АВТ5 (замість розчину ТМВ, що входить у набір). Через 30 хв. зупиняли розвиток фарбування додаванням у лунки 2 95 щавлевої кислоти. Потім вимірювали ОЮдо на зчитувальному обладнанні ЕЇ! 808 для ЕГІ5А.
З Фіг. 13А видно, що інкубація РВМС з Ідд1-пиСІ В-13/4, І491-пиСІ В-13/4-ОБА і Ідд1-пиСіІ В-
Т3/4-ОАРЗ викликала сильну проліферацію Т-клітин навіть при дуже низьких концентраціях антитіл. Інкубація з Іда1-пиСІ В-13/4-М2970) викликала дозозалежну проліферацію, яка була порівнянна з позитивним контролем ІДЕ-пиСІ В-13/4. Інкубація РВМС з антитілами Іда1-писСіІ В- 15. Т3/4-тар, Іда1-612-М2970О, Ідд1-нпиСІ В-13/4-І РГЕ, Ід91-пиСІ В-13/4-І РГЕВА, Ід91-пиСІ В-Т3/4-
ГРГЕМО, Іда1-пиСІ В-13/4-І РІ ЕРБ, Іда1-пиСІ В-13/4-ВАМО і Ідоа1-пиСІ В-13/4-І ГГ ЕСАМОРЗ не викликала проліферації Т-клітин.
З Фіг. 13В видно, що інкубація РВМС з Ідд1-пиСІ В-1Т3/4 викликала сильну проліферацію Т- клітин навіть при дуже низьких концентраціях антитіла. Інкубація з ІЧЕ-пиСІ В-13/4 (позитивний контроль) і Ід91-пиСІ В-13/4-І АГА викликала дозозависимую проліферацію. Інкубація РВМС з
Ід91-пиСІ В-13/4-І ЕГЕВА не викликала проліферації Т-клітин.
Виходячи з результатів із прикладів 7 і 8, для подальшого аналізу була обрана підгрупа мутантів, які виявилися найменш активуючими.
Приклад 9. Опосередкована Т-клітинами цитотоксичність іп міго, викликана неактивуючими варіантами антитіл пис В-13/4
Клітини АО5Б65 (карцинома молочної залози людини) культивували в середовищі КРМІ 1640 з додаванням 10 95 (06/06) інактивованої нагріванням СС, 1,5 г/л бікарбонату натрію (І опга), 1
ММ пірувата натрію, 4,5 г/л глюкози (Зідта), 50 МО/мл пеніциліну й 50 мкг/мл стрептоміцину.
Клітинна лінія утримувалася при 37 "С в зволожувальному інкубаторі з 5 95 (06/06) СО». Клітини
Зо АШ5Бб65 культивували майже до злиття. Потім клітини обробляли трипсином, ресуспендували в культуральному середовищі й пропускали через клітинний фільтр, щоб одержати суспензію одиночних клітин. У кожну лунку 96-ямкового планшета висівали по 5х102 клітин і інкубували їх щонайменше З год. при 37 "С, 5 95 СО» до повного зчеплення із планшетом.
Виділяли мононуклеари периферичної крові (РВМС) із крові від здорових добровольців, використовуючи пробірки І еисозер на 30 мл за методикою виробника (Сгеїіпег Віо-опе). Виділені
РВМС промивали РВ5, ресуспендували в культуральному середовищі й додавали в співвідношенні 1:11 до пухлинних клітин АО5б65 в 96-ямкових планшетах. Вміст Т-клітин серед
РВМС вимірювали методом РАС5 за допомогою мишачого антитіла проти СОЗ людини з РегР (ВО, жЖ345766) (для фарбування Т-клітин). Вміст Т-клітин у популяціях РВМС, що використовувалися, зазвичай становило від 50 до 60 95.
Готували серійні розведення (кінцеві концентрації від 0,004 до 1000 нг/мл) антитіл Ід91-012,
Ід91-пиСІ В-13/4, Ід991-НЕК2 і біспецифічних антитіл пиСІ В-Т3/4хр12 і пПисСІ В-Т3/АхНЕК2, експресованих у вигляді різних Ес-варіантів: дикого типу, М297О, І РЕ, ГАГА, ГЕГЕМО), І РЕВА,
БАМО ї ГРГЕОЕМОРБЗ, у культуральному середовищі і вносили на планшети. Планшети інкубували протягом З днів при 37 "С, 5 95 СО». У якості контролю на 100 95 загибель пухлинних клітин використовували інкубацію клітин 3 17 мкМ стауроспорина (256942-200, бідта). Після інкубації одержували супернатанти й зберігали при -20 "С. Планшети двічі промивали РВЗ і в кожну лунку додавали 150 мкл культурального середовища, що містить 10 95 АІатаг Біне.
Планшети інкубували протягом 4 годин при 37 "С, 5 95 СО». Вимірювали поглинання при 590 нм (Епмізіоп, Реїкіп ЕІтег, УМайтат, МА).
Проводили два експерименти, використовуючи РВМС від різних донорів. У першому експерименті тестували Ес-варіанти М2970, РГЕ, ГЕГЕМО, ГЕГЕВА, САМО і ГЕГЕВСАМОРЗ (Фіг. 14А-б). У другому експерименті тестували Ес-варіанти І РГЕБВА ії ГАГА (фіг. 15А-С). В обох експериментах у якості контролю включали антитіла з Ес-доменами дикого типу. Інкубація з моноспецифічним антитілом Ідд1-пиСіІВ-13/4 дикого типу або біспецифічними антитілами пиСІ В-Т3/4х512 викликала неспецифічну загибель клітин мішені (Фіг. 14А-6 і 15А-С). Варіанти
М2970) (Фіг. 14А-0) і ГАГА (Фіг. 15А-С) моноспецифічного Ідд1-пиСіІ В-13/4 ії Б5Ід91-писСІ В-
Т3/4хр12 все-таки викликали деяку неспецифічну загибель клітин мішені, хоча й меншою мірою, ніж антитіла дикого типу, досліджувані в тому ж експерименті. Жодне з інших досліджуваних 60 антитіл Ід91-пиСІ В-13/4 або Б5Ід91-пиСІ В-Т3/4х512 з неактивуючими мутаціями не викликало неспецифічної загибелі клітин мішені (Фіг 14А- і 15А-0).
Всі біспецифічні антитіла пиСІ В-Т3/4хНЕК2 викликали дозозалежну загибель клітин АОБб5 з ефективністю, щонайменше порівнянною з біспецифічним антитілом пис В-Т3/4хНЕК2 дикого типу без неактивуючих мутацій (Фіг. 14А-о і 15А-С). Максимальна загибель відбувалася при дуже низьких концентраціях.
Моноспецифічні антитіла 512 або НЕКЗ дикого типу або неактивуючі варіанти не викликали ніякої цитотоксичності (Фіг. 14А-с і 15А-С), як і очікувалося.
Приклад 10. Дослідження зв'язування С14 з неактивуючими варіантами антитіла пис В-13/4
Взаємодія С14 з антитілами, пов'язаними із клітинами мішені, є першою стадією класичного шляху активації комплементу. Оскільки 991 дикого типу містить сайт для взаємодії з С14, то досліджували взаємодію С14 з цими неактивуючими варіантами Ідд1 методом ЕГІЗА.
На 96-ямкові планшети Місгоїоп ЕГІЗА (Огеїпег, Німеччин) наносили серійні розведення (від 7 до 30 000 нг/мл у вигляді 4-кратних розведень) Ідд1-писСіІ В-13/4, Б5І991-пиСІ В-Т3/А4хНЕКЗ й
Іда1-С020 (позитивний контроль) і неактивуючих варіантів антитіл, описаних вище у прикладі 1, протягом ночі при 4 "С. Планшети відмивали й блокували РВ5 з додаванням 0,025 95 Тмееп 20 і 0,196 желатину. З відмиваннями між інкубаціями, планшети послідовно інкубували з З 95 збірною сироваткою людини (Запаціп, продукт 2МО008) протягом 1 год. при 37 "С, з 100 мкл на лунку кролячого антитіла проти С14 людини (САКО, продукт ЖАО136, 1:4000) протягом 1 год. за кімнатної температури й з 100 мкл на лунку свинячого антитіла проти (до людини з НЕР (САКО,
РОЗ99, 1:10000) у якості детектуючого антитіла протягом 1 год. за кімнатної температури.
Детектування проводили шляхом додавання 1 мг/мл 2,2-азино-біс(З-етилбензотіазолін-б- сульфонової кислоти) (АВТ5; Коспе, Мапппеїйт, Німеччина) приблизно на 30 хв. Реакцію зупиняли додаванням 100 мкл 2 95 щавлевої кислоти. Вимірювали поглинання при 405 нм на зчитувальному обладнанні (Віоїек, М/іпоо5Ккі, МТ). Після логарифмічного перетворення дані аналізували шляхом побудови сигмоїдальних кривих доза-відповідь зі змінним нахилом за допомогою програмного забезпечення Сгарпраа Ргізт.
З Фіг. 16А видно, що антитіла з Ес-областю ІдЧ1і дикого типу: Їд91-С020 ї Ідд1-пиСІ В-Т3/4 проявляють зв'язування з С14д. Але зв'язуванн з С14 не виявлялось у всіх досліджених варіантів антитіл з неактивуючими мутаціями (М2970, ЕСЕ, ГЕСЕМО, ГЕГЕБА, БА, ЮАРБ5, САМО,
Коо) ІГРГЕРБ, І РГЕСАМОРБ, І АГ А).
З Фіг. 168 видно, що антитіло з Ес-областю Ід91 дикого типу р5Ідд1-пиСІ В-Т3/АхНЕК2 проявляє зв'язування з С1д. Але зв'язування з С14 не виявлялося у всіх досліджених варіантів антитіл з неактивуючими мутаціями (М2970, ЕСЕ, ГЕСЕМО, ГЕГЕБА, БА, БАРБ5, ОАМО,
ІГРГЕРБ, І РГЕСАМОРБ, І АГ А).
З Фіг. 16С і Фіг. 160 видно, що антитіла з Ес-областю Ідд1 дикого типу: Ід91-С020, Іда1- пиСІ В-13/4 і Б51991-пиСІ В-Т3/АхНЕКЗ2 проявляють зв'язування з С1д. Але зв'язування з С14 не виявлялося у варіантів антитіл з неактивуючими мутаціями (І РЕВА і ГАГА).
Приклад 11. Фармакокінетичний (РК) аналіз неактивуючих варіантів антитіл
У цьому дослідженні мишей розміщали в бар'єрному блоці Сепіга! І абогаїогу Апітаї! Расіїйу (Оггесіїї, Нідерланди) і утримували в клітках з фільтром нагорі, даючи їм воду і їжу ай Ірйшит. Усі експерименти були схвалені комітетом з етики тварин в Штгеспї Опімегейгу. 7-10-тижневим мишам 5СІЮ С.8В-17 (0.8-17/сі-Рікас«всіа»ЛстісосСті, Спапевз-Кімег) внутрішньовенно вводили 100 мкг антитіла дикого типу (Ід91-пиСІ В-13/4, ІДд1-НЕК2 або Бзідс-пиСіІ В-Т3/АхНЕК2) або його неактивуючого варіанта (ГАГА, ІРГЕБА, ІРГЕМО, БАМО або ІРГЕРАМОРБ), використовуючи по З миші на 1 групу. Через 10 хв., 4 години, 1 день, 2 дні, 7 днів, 14 днів і 21 день після введення антитіла брали проби крові по 50 мкл із підшкірної вени. Кров відбирали в утримуючі гепарин пробірки й центрифугували 5 хв. при 10000х9. Плазму зберігали при -20 С аж до визначення концентрації антитіл.
Концентрації Ід людини визначали методом сендвіч-ЕГ ІЗА на загальний пІдс. Для цього на 96-ямкові планшети Місгоїоп ЕГІЗА (СОгеїпег, Німеччина) наносили мишаче тАБ проти ІдС- каппа людини клону МН16 (2М1268, СІ В Западпіп, Нідерланди) у концентрації 2 мкг/мл у якості захоплюючого антитіла. Після блокування планшета РВ5 з додаванням 0,295 бичачого сироваткового альбуміну додавали зразки у вигляді серійних розведень у буфері ЕГІЗА (РВЗ з додаванням 0,05 95 Тмееєп 20 і 0,2 95 бичачого сироваткового альбуміну) і інкубували на качалці протягом 1 год. за кімнатної температури (КТ). Після цього планшети інкубували з козячим імуноглобуліном проти (9 людини (Ж109-035-098, ЧасКбоп, УМеб5і Сгасе, РА) і проявляли за допомогою 2,2'азино-біс(З-етилбензотіазолін-б-сульфонової кислоти) (АВТО; Коспе, Мапппеїт,
Німеччина). Через 30 хв. реакцію зупиняли додаванням у лунки 295 щавлевої кислоти.
Вимірювали поглинання на зчитувальному обладнанні (Віоїек, М/іпоо5кі, МТ) при 405 нм. бо Швидкість виведення із плазми (мл/день/кг) розраховували, виходячи із площі під кривою
(АС), зюваФфтулнийм рівнянням:
Дис (мкг/мл/день) швидкість виведення із плазми -
Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення сгарпрай Ргіхт.
З Фіг. 17А видно, що концентрація |0 людини в плазмі була нижча у варіантів антитіл мМ2970, БАМО, ГРЕГЕМО ії СЕГЕОАМОРЗ у порівнянні з антитілами дикого типу, що свідчить про більш швидке виведення. Концентрація до людини в плазмі у варіантів антитіл НГЕЕОА і ГАГА була близька до такої в антитіл дикого типу.
З Фіг. 17В видно, що швидкість виведення із плазми у варіантів антитіл М2970, САМО і
ІГРСГЕМО була в 2-3 рази вища, ніж у антитіл дикого типу. Швидкість виведення із плазми у варіанта антитіл ГЕГЕОАМОРБ була в 3-5 разів вища, ніж у антитіла дикого типу. Швидкість виведення із плазми у варіантів антитіл І РЕВА і ГАГА була близька до такої в антитіл дикого типу.
Приклад 12. Оцінка імуногенності остова Ідое1-І ЕГЕВА іп міо
Для того, щоб визначити потенціал клінічної імуногенності в остова Ідо1-ІРГЕРА-К409В, застосовували платформу Ерізсгееп "М фірми Апійоре до Ід91-НЕН2-І РГЕВА. Коротко, виділяли
РВМС у когорти з 50 НІ А-типованих здорових донорів, що представляють населення Європи й
Північної Америки. Після виснаження Т-клітин СО8- препарати РВМСО окремо заморожували й зберігали. Згодом розморожені РВМС культивували й інкубували з Ід91-НЕР2-І РГЕВА-КА09А або одним з контрольних зразків (991-НЕК2 або Ідд1-НЕР2-І РІ Е-К409Р) від 5 до 8 днів.
Здатність зразків викликати відповіді Т-клітин СО4- оцінювали шляхом вимірювання клітинної проліферації (за включенням (|ЗНІ-тимідину) і продукції І/-2 (методом ЕГІЗро). Донори, що проявляли відповіді з індексом стимуляції (5І; співвідношення сигнал/фон) 2 1,9 при обох аналізах, уважалися позитивними.
Аналіз методом Ерібсгееп'м показав, що для Ід91-НЕН2-ІРІГЕОСА в 4 донорів (8 95) проявлялися позитивні відповіді Т-клітин СО4--, що порівнянно з 4 (8 905) і З (б 95) позитивними відповідями для Ід91-НЕКІ2 ї Ід91-НЕН2-ГЕГЕ, відповідно (Фіг. 18). Таким чином, Ід9Я1-НЕН2-
ІГРГЕОСА-К409К (а також Іда1-НЕКЗ2 ї Іда1-НЕН2-І РІ Е-К409К) проявляють низький потенціал імуногенності із частотою відповідей нижче 1095. У якості позитивного контролю
Зо використовували гуманізоване антитіло АЗЗ (наприклад, І84|) як клінічний еталон контрольного антитіла, яке проявляє високий рівень імуногенності в клініці й зазвичай викликає 20-30 Фо Т- клітинних відповідей при аналізі методом Ерізсгееп.
Джерела інформації:
ПІ Хи ет а!., 2000, Сеї! Іттипої. 200(1):16-26.
І2І Негоїй еїаї., 2005, Оіабетез, 54(6):1763-9.
ІЗ) іає" єї аї., 1985, Мате 314:628-631. (4 МиПег апа Копіептапп, 2010, Віодгидв 24: 89-98.
ІБЇ ит апа Тпакиг, 2011, Віодгидв 25: 365-379.
ІЄЇ НпкКе еї аї., 2010, Мабз 2: 129-136.
ГЛ Аитега!., 2010, Вг У Сіїп Рнаптасої 69: 617-625.
ІВ) Вокетеуєг" єї а!., 2009, У Сіїп Опсої (Меевїїпду Абрвігасів), 3036.
І9| Неїз5 єї а!., 2010, Іпі У Сапсег 127: 2209-2221.
ПОЇ допез єї а!., 2009, І апсеї Опсої! 10:1179-1187.
П1І Кієме єї а!., 2006, Сіїп Сапсег Нез 12:3085-3091. 21 УМО 2012/162067. 19) УМО 2008/119567.
П14Ї Рипдатепіаї! Іттипоїіоду С. 7, Раці, МУ., єд., 2па єд. Намеп Ргевв, М.У. (1989). 151 Геїтапс МР еї аї., 2003, Оєм Сотр Іттипої. дап;27(1):55-77. 16) Вгоснеї Х. єї а!., 2008, Мисі. Асіа5 Нез. 36, М/503-508.
БО П 7 Сіцаісеїїї, М., Вгоснеї, Х, І емапс, М.-Р., 2011, Сода бргіпу Нагь Ргоїос. дип 120116). 81 Затбгоок еї аї., 1989, МоїІесшаг Сіопіпд: А Іабогаїгу Мапиа!ї, Мем Моїк: Соїй Зргіпа
Натбог І арогаюгу Ргев55, Сп. 15. 19) УМО 92/22653. (26О|Ї ЕР 0 629 240. (211 Е. Меуегз апа Му. Міїег, 1988, Сотриї. Аррі. Віовсі 4, 11-17. (22) Меєдіетап апа УУип5сп, 1970, 9. Мої. Віо!. 48, 444-453. (231 Сіивіа! М аідопйнт, Тнпотрзоп, 1994. (24) Т сеїї Ерпоре Раїавазе їот е.4. пир:/Лимли. ївдБ.огд/. (251 Реїту єеїгаї., 2008 Огидз А 0 9 (6):385-396.
(26) Вгузоп вї аї., 2010, Віодито5 24 (1):1-8. (27| Кабаї Е.А. евї аї., 1991, бедиєпсев ої ргоїєїп5 ої іттипоіодіса! іпієгте5і. Бій Еайіоп-О5
Рераптетпі ої Неайй апа Нитап 5егуісев, МІН рибіїсайоп Мо. 91-3242, рр 662,680,689. (28) Одапезуап єї а!., 2008, Асіа Сгуві. (064):700-4. (29 Сапіїеєа єї а1ї., 1991, У. Ехр.Меа. (173):1483-91.
ІЗО)Ї Оипсап еї а!., 1988, Маїшге (332):7 38-40.
ІЗ1Ї Зпівїаз еї аї., 2001, 9. Віо!. Спет. (276):6591-604.
ІЗ2| Ідизодіє ЕЕ еї а!., 2000, ) Іттипої. 164: 41 78-84.
ІЗЗ| еартап єї аї., 2013, Мабрз; 5(6):896-903.
ЇЗ4Ї Раїтеп вї а!., 1992, 9. Сіїп Іпмезі. 90: 1537-1546.
ЇЗ5ІЇ Вгиппз еїа!., 2009, Віоса 113: 3716-3725.
ІЗ6Ї УМО 2011/066501.
ІЗ7Ї Пойше 5. еї а!., 2010, Ргоївіп Зсієпсе (19):753-62.
ІЗ8І Вгекке вї аї., 2006, у Іттипої! 177:1129-1138.
ІЗ9| ОаІгАсдпа МУЕ еї а!., 2006, У Іттипої! 177:1129-1138.
І4ОЇ Ми єї аї., 2010, Сепегайоп апа СНагасієгігайоп ої а ЮОша! Мапаріе Оотаїп Іттиподіориїїп (Ома-ід м) МоїІесшіе, Іп: Апіроду Епдіпеегіпу, Зргіпдег Вегіїп Неїідеїрега.
ІТ УМО 2011/131746. (421 МО 2002/020039. 43) УО 98/050431.
І44| УМО 2011/117329. 45) ЕР 1 870 459. (46 УО 2009/089004. (47 052010 00155133. 481 КО 2010/129304. 49) МО 2007/110205.
ІБОТ УМО 2010/015792
ІБ УМО 2011/143545. 521 МО 2012/058768.
Ко) 53 УМО 2011/028952. 541 УМО 2008/003116. 551 05 7,262,028.
І56Ї 05 7,612,181.
ІБ УМО 2010/0226923. 581 05 7,951,918. 591) СМ 102250246.
ІФ УМО 2012/025525.
ІТ УМО 2012/025530.
Іб2І УМО 2008/157379.
ІЗ УХО 2010/080538.
ІЄ4) з5уке5 апа доппзюп, 1997, Маї Віоїесйі 17, 355- 59.
І65| 05 6,077,835.
ІЄЄЇ УМО 2000/70087.
ІЄ7| Зспакомузкі єї а!., 2001, Мої ТНег З, 793- 800.
ІЄ8І УМО 2000/46147.
ІЄЗ) Вепмепівіу апа Резнеї, 1986, РМАБ ОБА 83, 9551- 55.
Ї701 М/ідіег єї аї., 1978, Сеї! 14, 725.
Г1Ї Согаго апа Реагзоп, 1981, 5отаїйс Сеї! Сепеїісз 7, 603. 721 05 5,589,466.
Ї791 05 5,973,972.
Ї74Ї Мап Нееке 4 Зспивіег, 1989, У Віої Снет 264, 5503-5509.
Ї751 Р. А!йвибеї еї аї., 1987, ед. Ситепі Ргоїосої5 іп Моїесшіаг Віоіоду, Стеепе Рибіїзпіпа апа
УМіеу Іпіегзсіеєпсе Мем МогКк.
І76Ї Сгапі евї а!., 1987, Меїнподз іп Епгутої 153, 516-544.
Ї/7| Ветіпдіоп: Те 5сіепсе апа Ргасіїсе ої Ріаптасу, 191 Еаййоп, Сеппаго, Ед., Маск
Рибріївпіпу Со., Еазюп, РА, 1995.
І/8| Зивіаіпей апа Сопігоєд Неієазе Огпа ОеїЇїмегу бувієтв, У.А8. Вобіпзоп, ей., Магсеї
Оеккег, Іпс., Мем МогК, 1978.
І79| 5гімавіама (еа.), ВадіоїареІед Мопосіопа! Апііродієвз ог Ітадіпд апі ТНегару, Ріепит (510) Ргезз 1988.
ІВОЇ Спазе, "Медіса! Арріїсайоп5 ої РНадіоізоїорев, " іп Ветіпдіоп'є Рнаптасеціїса! Зсієпсев, 181п Едіоп, Сеппаго еї а. (єдв.), рр. 624-652, Маск Рибіїзпіпду Со., 1990.
ІВ1Ї Вгомлп, "Сііпісаї Обе ої Мопосіопа! Апііродієв, " іп Віоїесппоїоду апа Ріпаптасу 227-49,
Рег2ціо вї а!. (єдз.), Снартап «5 Наї! 1993.
ІВ2І 05 5,057,313.
ІВЗІ 05 6,331,175.
ІВ) Віцег С. евї аі.; 2001, Сапсег Везв., 61:6851-9.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«ІН ГЕНМАБ А/С «1205 РУМАНІЗОВАНІ АБО ХИМЕРНІ АНТИТІЛА ДО СОЗ «130». РОВНО «1502 30 «170» Патентна версія 3,5 «2юзі1 «112 8 «2175. РАТ (ГРУПА ЗАХИСНОМ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ «2135 Ното зарієпз (людина) «400. 1, сіу рре Твт Ре Ахо ТАу ТУг АВ 1 8 ши «2102 2 «Ні о «2195 РЕТ(ТРУПА ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «21325. Ното зарівпз (людина) «4005 2
Це Ате бег Гу Туг Ап АБ Туг Аа ТАг 1 5. 10 «210» З «21їх 16 «212х РВТ (ГРУПА ЗАХИСНОЇ, РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «213» Ното зарівп: (людина!) «005 З
Ма! Аге Ні Су Ази не іх Авп баг Туб уві бег Тгр Ре Дів Тут 1 5 10 15 «2105 4 «2115 9 «2125 РАТІГРУПА ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «2132 Ното зарівп5 людина) «Од» 8
Тв Віу Аа Ма! ТАг ТАг5ег Авв о Туг 1 5 «2025 «ії 9 ятї19». РЕТ (ГРУПА ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) х213» Ното:варієйв (людина) «ЩЮ 5
Аз бец Тр Тугбег Аз Геи їтв ма! 1 5
-210х 6 «3112 135 «21225 РЕТ (ГРУПА ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «213» Нота зарієпе ілюдина) «1005 6 бішуаі ув ей ма о бег у Су біу цей Уві вій РО бу У 1 5 10 ї5
Зегівч Аг Гей бегСув Афа діа бег Сім РНе тп еле Ап т Туг 20 25 зо
Аза Ме Ап Тер ма! Агр бій Айва Рго Сіу (уз бі ви бі Тгр Уа 35 40 45
Аа Агв в Аге Баг Цу5 Тут Абпо Ази Туг АВ Те Тут Туг Аа Азр 50 85 БО
Бек Уві ув Аз Агя Ре ТЕ Це 5ет Аге Аби Ар зег Куб аг 5ег 65 70 75 80 їй Тугієв Сів Мет Ап Азпіеи Сує ТАг син Азр ТАК Аа Мех Тут 83. 90 95
ТукСух Уа! Агв Ні Су Ап яВе бу Асп бег Тус Маг ет Ттр Ре 100 105 110 діа туге су бій у Тегі Ма Тит Уа) бек заг 120 125 «Й 7 «2115 125 «9125 РЕТ (ГРУПА ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇЙ «в13» Ноппо 5арівп5 (людина! «400 7 бій Майіузіво магбінц бег іх су су їемй ма! (ух Ро бу Ага 1 5 13 15
Зег ей Ат Гей ет Су Дів Дів бе Оу пре Тпу Рпе Аза Те Тух 70 25 30
Аа МегАхи ттрУаї Атя Сіп дів Вто Сік тує БМ ви іо Тер Ма до 45 дія Агр йе Ат бег ух Туг Абло Аа Туг Діа тв тує Тух Ав Дер 60 зег Узі (ух Авр.Ате Рпе Та Пе 5ег Агв Ар Ахроег ух 5ег Ле 65 70 75 ВО ви тугівв бій Ме Ап Ап ве у Тит ої Ар тат дів Меєтуг 85 20 35
Ту Суб УвЕАге Ні БІУ Ап РІВ ОК Ав 5ег Туг Ма! 5ег Тр РА 100 105 150
Аа Туг Тер-Сіу біп Су Тігіго Ма! Ті Уві 5ег бег бо
115 120 125 «2115 125 «219» РАТ (ГРУПА ЗАХИСНОЇ/ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЩІЇ) «713». Ното зарієпз людина) «НЮх 8 ош Ма! ух Геи Уві 5ег Ру Сім Оу бе Маї бух Рко СЛУ, Аг: 1 5 10 15 чех Гей Ага (ву 5егсух Дів Аа 5ег сту Ре Тиг Рене Аз ТАг тус а 0
Аїа Меї Ап Тер Уві Агв біло діа то Чу ук і ен Он Тгв Уві що 45
Діа Агв Це Дгу Зег ух Тут Ав Ай Туг Аа Таг Туг Тут Аа Азр 50
Баг Уа! у Ар. АгЕ ле ТВ Пе ет Аг Абр Азр бег ув бег Це 59 70 75 о
Бгц Туг Гец бій Ме Ази бек ен ух Те бій Ар тиг Ав Меї Тук я5 сл
Туг Суз Уві Аг Ні біу Азп. Рве біу Абі 5ег Туг Уві бех Тер Рпе 100 105 мо
Аа тує тер Ім Зіп СУ трете Уві Так УВІ Зег бег 115 120 125 «2105 5 «Мі» 125 «217» РЕТ (ТРУПА ЗАХИСНОЇРАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «2135 Ното з5арієй5 (людина) «до 9
Сію Ма! уз іец аг сін бег біх Я бік іец Уа ув Вго у Агр ї 5 10 15 5егієц АгЕ цеи бег Су Аіз Ав Зег біу Ре Ті Рве Аза ТАг Тут 20 25 за
АІв Ме Аа Ттр Уві Агв біп Аа Рго бу Суб О1у їви бів Тгр Ма! 35 40 45
Аа Атгв Пе Ат Зег Гух Туг Абп Ап ТубАЇв ТВг Тут Туг Аа Ар: 50 Бу 50 зегМагіу» Ар Агв Ріхе Те Пе 5ег Аг Ар Абр 5ег у5 ет Не 65 70 75 ВО
Гей туге 3 МегАви бе йви ув Те ою Абр ТЕ Аа Местуг 85 Зо 55
Тут Сує ма! Ага Ніє Су Аєп Ре біу Ауп бек Тух Ма! бек Тр Ре 100 105 110
Аа Ту Тер ам біо у ТА Меєуаї ТАг ма! ет бе 115 1250 125 «210510 «21125 109 «2122 ВАТ (ГРУПА ЗАХИСНОМ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ «13» Ното харіеп5 (ЛЮДИНА) «4005 10 бів Аа Уа ма! Ти бій сі Рго 5ег Рпє 5ег Уаї Заг Рго 61 Оу 1 5 10 15
Тв ма! Ти іец Те Су Аг бег бе ТВг Оу Аа Ма! Тв ТАгбег 20 25 30
Ап Туг Аа Ява Тер уві бій біп Те вго У бій Ав Ве Аге Оу 35 о 45 ев Не у бу Те Аа 1у5 Агро Аїа Рго Су Уа! Рез Аа Аг Рне о 55 Бо бет сіу ет Тем Це Бу Ар ув Ага Дія Сет Нести су Аа 655 70 7а 80
Чіп Аа Ар А5р сту Зег Не Тус Рне Суз Ач Бе Тер Туг зе? Ап 85 90 55 меш Тео узі вне оіу Оу сім ТВ бух бе тре Маг їм 100 105 «в» Лі «2115 303 «2і2» РЕТ (ГРУПА ЗАХИСНОМРАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЙ «2135 Ното зарієнз (людина) «Ох її
СІВ АВ Маї Маі Тпг бій бій Рго 5ег пе бег уві зег РГО бу бу 1 5 10 15
ТЕ Ма! ТАгіви Те Суз Аге 5ег бег Тк Оу Ав Уа! ТА Те 5еї 2а 25 30
Ага Туг Ав Ав Тео Май сій біл Тр Рго біу бів Аа Рпе Аге Оу 35 40 а меш Не Су су ТігАбп ух Агр. А!а го Су Уві Рго Дів Аге РНе 50 85 бо 5ег Оу баг Це їец бі А5п Гуз Аа дів се ТВ Не Твг су Аа вв) 75 во біп-Аїв Ар Ар бін зе Че Тут Ре Суз Аа (ем Тер Туг ЗегАБп 85 9о 955 їеи Тер Уа РНа У КОМУ ТНЕУ Тео Ти Ууацьен 100 юш «0» 12
«2115 309 - «2122 РВТ (ГРУПА ЗАХИСНОЇ/РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ); «2135 Ното заріеп5 (людина!) «00512 біп Аа узі Маї Тит біп Сім Рко бег РНе:зег Уа 5ег Рго бу 01 1 5 ве; 15
ТНт Уа! ТЬк ес Тит Су Ага ет 5ет ТВ СТУ Аа Ма! ТЕТ ТА бег ха 25 зо
Авп Тут Діда Ап Тгромаі іп бій Тег Рго Су бів Аа рве Атв Су 35 да 45 їеи Пе сту БІК ТНК Ал ме Атр Аа Рго СУ Ма Рго Аа: Агр Рпе 50 55 о 5ег біу Бек Не їв Ру Ави Гу Аїд Ав цей Тис пе ТНг Оу Ав 65 70 75 ко сп Аа Ар Абр он 5ег Азо тугТуг Сує Діва Сецй Тер Туг 5ег Ап 85 90 95
Їзи Тер Ма Ре Спу ЗУ бу ТА туз Сем Тік Уві їеи 100 105 «2105 13 «ії» 186 «2125 РВТ (ГРУПА ЗАХИСНОМРАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ «213 Ното зарісп5 (людина) «аг 13 бій Абр бу Аєп и бін ме бі о Ме ТНг бів Тиг Рго Ту ту 1 5 10 15
Маї бег Пе бег біж Пас Те уві Пе во Тв Сує Рго ій ТугРго 70 25 30
Фу бег бі Пе ев Тер Оп Ніх Авт Або ув Ав Не бу іх Ар 35 о 45
Бій Авр Ар Цу5 Ап Ше СПУ 5ег Ар Бі АБО Нієїец зегіви ух 50 55 БО ши небес біштен Ост зеє ОК тТує тує ма Суз Тугрко Аг 70 75 о
ОЦЕ Баг ух Рго іш Ар Аа Ап ре Туг Гей Тугіви Ат Аа Аге 85 90 95
Уа Сузлаін Ап Сух Меї бі Меї Ав Уа! Ме бе Уа АЇз Ти Не ло 105 не,
Уа Уві А5р Не Сує Пе Те бу Су Ге ви бен (ес Ма) Туг 120 125
Туб Тгр-багу5 Авп Ага у5 Ма ув Ага Сух Рто Маг пт Аге Ох 130 І135 140
Аа су Аа сім фу Аве ЗІ Аг Оу віп Ап у бі Аге Рго го 145 155 155 Ба
Рго Ма! со Ав Рго АвроТуг Сію Рго Пе Аге ух іу сій Агв Ар 165. 175 єю їги тусзет біу тез Ап бів Аге Ав Не 180 185 «2102 14 -231їх 150 «12» РВТ (ГРУПА ЗАХИСНОЇМРАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «ка13» Ното барівив (людина) «каз 14
Рпе ух Ме Рго Не бій си ей бі Ар АгеЕ Уа! РНе МаїАсп Сух 1 5 юю 15 деп Тв 5ег ле Твг тр Уа ол Оу Твг узі ОК Пгіев его бег
Ахр Пе ТР Аге Ге Ар бе Оу Бу Аге Не Се Або Рто Ага Бу
Пе Тук Ат Суб Абп Оу Тип Абр пе Тугіуз Авр ух Сім Бе ТЕ о ча бій Уаї Ні5 ТуєАгте Ме Су іп Зег Су Ма! б ви Ар Рго 55 70 75 во
Аа ТНг Ма) Ав пу Пе Пе ма! Та? Абр Уаї Не Аа ТР во Кей 85 50 55 зей Аве оїу Ма! вне су ве Ав су Ні сіб Ту Оу Аг Беш 100. 105 110 баг Оу Ав дів Ар ТАг бій Дія ео ец Аг Азп Ар бій Магтуг 115 150 125 сів го ен Аг Абр Ага Ар Авр. Ав СІп Туєбаї Ніз Те цу іу бу 130 135 140 дей Тгр Ага Аге Авп ув 145 150 «2105 15 «211» 330 «2122 РЕТ ГРУПА ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «213» Мото зарівль (людина!) «400» 15
Аа бег Тнеїух Оу Рго Зех Ма! Реве Рго ем Ай Рго 5ег 5ег ух 1 5 10 15
Бег Те 5ебсіу зіу ТАг Аа Ав гео Оу був ей ма! ух Аз туг 20 25 30
Ре Ро бі Вго Уві Тв Уві бет. Тер Ав Зег біу Аа Тем Те бе
35 40 45
Спіу Маї Ні Тит РКе Рго Аа Маг фей бе бе біу те тує бе 50 35 650
Ген бегЗег ма Уві ТЕ Уві Рго бег 5ег5еї те БМ Те ОН Ті 70 75 80
Туг Ме Суб Ап Уві Ази Ніх Бу5 Рго бХег Аз Тит у Уві А5р ух 85 ЗО 95
Атв Ма! сій Рго у 5ег Сух Ахр ух Тпї НІ ТНР Су Рго Рго Су 190 105 ло
РГО Аа вто Сіціешьев Су сіру Рго 5ег Ма! ве зей рве Ргосрго 115 120 125
Гук Рго уз Ахр ТА Тви Меї Пе ет Аг Ти го Са Уві ТВ Сух 130 115 140 маї Уві Уа! Ар Маї Зег Ні бій АзроРго у Уа ук ве Авп Тр 1458 150 155 160
Тука! Аер Бім аг сти маї Ні Авп діа бух ТАг ух Рго дв ВІ 165 то 175 сій бій Туг Авпобег ТВг тує Аге Уві Уві бет У їеа Те мМабей 180 185 1930
Ні бів АзроТгрівоАви бу у іш тугі ух сує ух аг 5ег Ах 195 00 205
Гуз діа ец Рго Аа го Це ба Ку Аг Пе бек ух ів ув Су: 210 215 220
Фів Рго Агв бін бго бів магтує Те цей Рго Ргобег Ав оч о. 235 230 235 24
Ме тиг ух Ав бій Уві бег ен Тиг Сугзіви Ма ух біу вве Туг 245 250 55
Рго зег Ахр Пе Аа Маї бій Тр ов бегдап ох бій Рго сів Ав 60 255 270 два Тук Ту5 ТНК ТВг Рго вто Уа фе дер бег Ар Су ес впе рве 275 280 85 іїей Тугбегіув цех Твг ма Ар у зе Асв Тр вів о у Ав 290 295 зво
УагРне бег Сув Зег Ма Мей Ні бі аз Геи Ні Ази Ні ТуЄтАс 305 310 315 320 діпіузбегіви бегіви бег Рго БІУ ув 325 330 «20» 16 «11» 330 «217» РЕТ (ТРУПА ЗАХИСНОМЙРАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇЇ «213» Ното зарівля (людина)
«ах 16
Аа ес Те ух у Реа ек Уа! Не го бе Аа Руо 5ег бегіу5 1 5 10 15 5ег Твг бе Сіу Су ТАК Аа Аа Бе Оу Суб сво маї Був Абі Туг 29 25 30
Ре Рго Сію Рго ма! Тв уві баг Тер Аза бег Оу Аа Бей ТВ оег 35 що 45 сі марні п РНе Рго- Аа маніву бір Зег бе бу Те Тут зег 50 55 що
Гей 5ег бек Маї Уа! Тиг агро есе бег це ої ТАг зів ТНе 85 70 75 80
Ту Не Су Азп Ма! Аза Ні Ту Рго 5еє Або Пт Сує ма! Авр бух 85 90 9
Аг ві бі го Су Заг Су Ар м ТВ Нів Тк Суб Рго Рго Суб 100 105 ії
Рго Дів Рео бів Вбе ів ох Ту Рго бек Уві Ре Тв Ре Реосрто 415 120 125 ух Рго ув Авр ТП бво Месне ет Ати ТНК Рто 0 Уві ТНу Сух 130 135 150
Уа ма! уві Ав ма бес ні іо Аза Рго ін Ма 1у5 вне Аза Тр 145 150 155 160
Ти Уві Ар Су Уа сів Ма! Ні Ал Ага Бу То Цу5 Рго Атв Б 165 170 175
ОВО ТугАзп ек ТЕ Туг Ага Уа! Ма! бебма|ї Гей Тир Уа! цей 180 185 480
Ніє бій Дер Ттріеч Ап Оу бух віч Туг су Суз уз Ма! беє Дей 155 700 205
Гуз діви Рго Ага Рто Це Сім Гу Так Че 5егіуз їв у бу 210 215 220 бікРго ДЯ БНЕРгО бій мар тує Три ео Рур го Бек Ат СИ 230 235 240
Мет уз Аз Он ма Зегец Ту Суб Сео Майї Оу Ве стух 245 350 255
Вго 5ег Ар Це Дів Ма! бо тр бі бег А5побІу Ов Рго БЦ АЗИ 250 255 27 деп Тук Циетве Тит Рг Рго Ма! Гей Азр 5ег Ахр ом зе Ре рве 375 280 285 мештТугзегіуєкеи Тит Уа! Ар Був 5ег Ав Тр бів ст Оу Ай 290 295 ЗО)
Уві Рне 5ег Суб бег Уві Меснік іш Ав бе Ніз Ап Ні Тут Те
ЗОп З зі5 320
СІЙ ух бег ви баг Кен бе Рго БІК ув 325 за «2» 17 каї» ЦО «12» РАТ (ГРУПА ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ «213» Ното 5аріепз (людина) «005 17 бій Уа біпїею уагсін Зег СПУ бу сіх ец Ма туз то Су у ї 5 10 во бегієцч Агвієц зег Су Дій Аа 5ег Оу не Те Ре ех 5ег Тут 20 25 30
СіумМегРне Тр Уві Атв іп Діас ву 1 у5 ОР бе ів Тур Ма 35 40 45
Ага ТА Пе бек Ате Туг ет Аге Туг Це Туи бує Рго Ар бег ма 50 55 бо.
Куб СУ Аге Ре. Тк Не бе Агр Аер Авп Дів ух Ап бегіеи Тут в5 70 75 80 іїво бій Ме Аа бек ген Аге Аа Ла Або ТВ АЇВ Маг тує туг Суб 55 90 95
Ав Ага Аге Ро Тем Туг с1у зегзегРго Ар тує Тер су су то 5 пло
Та Се Ма! Ти Ма! беє ес 115 «2105 18 «21125 106 «2122 РЕТ (ГРУПА ЗАХИСНОМ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) к7і3» Ното заріепз ілЛюдина! «4005 18 бій Не Уві їву ТНгбіп Зег Ре Ав тт ів его 5ег Рг ту 1 5 і0 15 и Ат Ада Тиггес бе суб бер Ав Зег бер бе Уа ТВ Туг УВІ 20 25 ЗО
НКіЄтто Ту бій ОО Су Рто у Оп Аа Ріо Ав гер ви Ме Туг 35 рій 43 дер ТП бегіуєтенй Аа зег Бі Пе Рго Дів Атв РНе бе біу баг 50 іх бег бу Тег Ар РаЄ Тут ден Тв Не 5ег ет бен Їй Бгто Си 65 73 75 50
АзрРНе Ав уві Туг Туг Суз Рне бій Сіу бег Су Туг Ро цео тат 55 90 95
Рпе ім бе ТЕ (узіви ою МекАнтя
100 105 «2102 15 «її» 121 . «97125 РЕТ (ГРУПА ЗАХИСНОМРАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «213» Ното заріепе (людина) «00» а бів уві біпеи ма дів 5ег Су Ав сні Уа! ух був го БУ ДІВ 1 5 19 15 баг Уа Гуз Уа! Заг Сух їу5 Аа 5ег ту Тук Тиг РАйе Тк Або тух 70 25 80 сік Пе бек ер Уві агро БІАна Рго Су сій Оу ви Ом Тр Меї 35 40 85
СІу Тгр ев зег Ав Тут зег у Ав ТВК Це Туга іп ув мем 5О 55 50 бів У Аге Уа Те Мет тв Азротвг Бег Те ТА Тв Ав Туг 7 75 8о мес бісів Аг бегієц Агр бЗег Ахр Ахр Ті Ав Ма! Тує Тує Сує 85 що 95 діа-Аге Ар Аг Пе Уа! Маг Аге Рго- др Туг пе Абр Тут Тр Оу то 105 116 ої су Те Бец Уа! Тит ма 5егзег 115 120 «105 20 «11 107 «2125: РЕТ (ГРУПА ЗАХИСНОБ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ «8132 Ногто зарієнз (людина) «400520
Сн Пе Маг цею Тіт бій ек из Аа ТВгіен бег сен бе Рго біу 1 5 о 15 сій Аг Аа Тпг зви 5егсує Аге Аа бег бій зе Уві ей бек Тут 2 25 Ів)
Гев Аа тр тує біп бій бу го у біл Ав Рео Аг еу без Пе 5 40 Ах
Тук Ахр-Аїв 5ег АяпАгеЕ Аа тну СТУ Пе Ргодіз Аг РНе.5ег су о
Бех сіу бег СіуУ Пп Ар Ре тат Сед ТАг Ле 5ег 5ет цец ої Рго ро о 75 що бішАер ра дія Маї тує ТугСує с1п іп Аг 5ет Аби Тур РО Аге 85 ЧО 95
ТВ РНе і сл Оу Тит Гуз ма сій іє ух 500 105
«2105 71 к21ї2 177 «2125 РЕТ (ГРУПА ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «213» Ното заріепе (людина) «00з 21 бій дер Су асп си бів Месом хе Петре дій твер Тут бів 1 5 10 15 маїбеє Це Бексту Таг Те мМаєце бец Тк Сує Зек ов Ні ги 25 30 сі ет ім Аіа Сію гр. бів Ніб Ах Зіу Гуз Абп 1у5 СИ Акробеє ві Ар Аг мен рве Беи Рго С Рів бес бів Меї Сію біп 5ег біу о 55 50 туктує мар сує Ту Рго Агв у бер дп Рго бін А5р АВ бег Ні 70 75 80
Ні цеи Тук тен Су Аа Ага Ма! Сух бі АБ су Меко Ме Ар 85 Фо 95 чаї Меї Ав Уві Аа Тег Уа! Пе Уа А5р Пе Суб Це Те Те що 5 1ю візи іец ен ец Уа! ТуєтуєтТер зе ув Або Агр; Цу5 Аа був 115 150 125
Аа ух Рго ма! ТВ Аге Оу Аза Оу лів Оу У Аге СТАРЕ Оу 130 735 150 біп Ази ув іш Атго вто Рго Сто Ма! РеарАбА Рго Аво Туг іі го і145 І50 155 160
Не Агр уз бу біп бій дер ей Тук 5ет Су (ен Ахп І Аге Ат 165. 170 175
Че «5102 27 «212 177 «9122 РЕТ (ГРУПА ЗАХИСНОМРАДИКАЙ ТРАНСЛОКАЦІЙ «132 Ното зарієня ІлЮюЮдина) «00» 22
СІЙ Ар. біу Ази сін бів Ме сім зег Не тру бів ТАК Рто Туг Ні» 1 5 10 15 ма зег Небес ої ти Ти Уві Пе Тв Су зе бій Мі ей 29 25 за
Оу бек сін маг бій Тер. іх Ай су їу5 Ап ув Сід Азо бе 35 до 45 віх Ар Ага ви Ре Гец Рго бін Рбе баг ів Меї бій бій бегоу
50 55 50
Ту ти уа Су Ту Рго Ага сіу баг Аєп Рго сію Дер Аа баг Ні 55 70 75 ВО
Ніз ем Туг геи ух Аа Аке Уві Су О1у Доп Су МеК Он Мет Азр 85 90 95
Уві Мет Аїа Уві Аза Тег Пе Уа! Не Уа! Азропе Су Пе Тк ер 100 105 110 омівенівцівнітвн Уа! Туг тує Тер 5ег Бу Ап АгЕ Гу Аа ух. 115 20 125
А буз го маг тег Аг су Аа БМ Ав біжу Аг біп АТЕ Оіу
І30 135 140 і Авп ут З)и Аг рто Рго Рго Уа Рго Ай го двр туге рго 145 150 155 160
Не Агв ув Біу біл бів Авр Мем Тук 5ег Оу ГесАвп ой Ага Аг 165 го 175
Пе «2105 23 «21іх 330 «ТУ». РЕТ (ГРУПА ЗАХИСНОМРАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЙ «213» Нато заріеп5 (людина) «аа» 23
Ав бег Пгіуєсіу Рго баг Уві Це Всі ец Аа Рго 5егт баг Гу їх 5 10 15
Зек Те Бе ої су ти Аа Ав беу бу Сук їви ув ув Ар тує 29 Ще БІ0)
Ріпа го бій Рго уві Тит Ма 5ег Тр Ап ес оу Аа во Тнс5ес до 45
Оу Ма! Ніз ТАт Рве-Рго діа Майівр біл хаб 5ег бу Те тус ет
ЗО 55 бо іецбегбет Уа! Уві ТАг Ма! Рго бегбесоегієн сіу ТВг ТА 70 75 Во
Тус Це Сув ки Уа Ап Ні Гу Рео бе Аза Тл уз Уві Ар ух 85 оо. 95
Ате Уаі би бго у5 5ег Сух Аза мя ТА Ні ТАг Суз го Ро Су ко 05 1
Рго Ага Рко ОВ бец бен Оу Су Рубет Уві Ре ви Не Рто Ро 115 120 155
Зуб Рто ух Або Тс фей Меї Не 5егАге ТА Ро Сім маг т Сух ї130 135 140
Уві ув Уа! Ар Ма ее Ні Я Ар го би Май їує Ре Ав То
155 150 155 160.
Тег Уа! Ар біу Мана Манів Аза Ав бух Гн ух Рго Аге СІ 165 170 175 окксів туг деп бег Те ТУсАге Уа! Уві Бет Ма цво Те Мао. 180 185 190
Ніб бів Азр Три Аа у (ув Бі тує бує Сух Гує маї бат Асп 195 200 205 (ув Аа фен Рто Аа Рго Не си Дух Тв це бег ус Аа (ув біу 210 215 220 а Рго Акр сім Ро іп ма! тує Теуем Руо Рего 5ег Ага Сію 0 235 230 235 240 маектне ух Ап біп маг зегівц п Суз Гей ма бух ом пе Тут 245 250 255
Бго 5ег Азр-Не Авіа маг соч Тгр бін 5егАвп су біт Рут 10 Аби 250 265. 270
Ав тус вуз Те Те Рго Ро Май еу Азрозек Азр бу бегвпе те 275 280 285 уви Тукбег ух Бей тип маг Авр ув бек Ат Тур біо бій біу Ап 290 295 00 ма! впебегСухє зет Ма Ме нів (Но Дія во Ніх Доп Ні тує ТА 305 310 315 320
Сіпіухозегіво Зегівгц бег Вго біх Гу 325 330 «2302-24 «2115 330 «2193 РВТ (ГРУПА ЗАХИСНОМРАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЙ «2132 Ното зарієпоілюдина) «Оз ий
Ав бе ВГ іув Сі Рго бек Маї Рва Рго пе Дів Рго Зег Зех Гує ї а 10 ї5 бег ТигЗегііу БіуУ Тк АВ оаа Гео ху Су сечу ма! тує Або Туг вве рго бі Рга ма! Тс Уа 5еє То Аеп зе су Аа ви ТАЕ5ег
За 40 "5 сім магнітну Рне Рго Дів Магіеціа заг5ег обі їгио Тусбехг бо іч хек5ег ув Уві Тиг мві Рго Зег бег 5ег СТец у Твае о ТВ 655 7 75 о
Тук Не Сух Аєп Уаї Авп Ні ух Рго бег Ав Пн ух Ма! Ар у5 95 9а 95
Агв а сію Рго бує Зег Суб Аз (5 Те Ні Те Сує Рто Ргб Суб
100 105 10 рго Дів Рго бін во їеи біу Су Рго хег уві Ре Ге Ре вто Рго 115 120 125 ух го ух Ар Тк Гец Меспе хег Ага ТВ Рго бів Уа ТНг Сув 130 135 145 уві ма! Уа дер Ма! чек Ніє Сід Ар Рто ой Увагу Ре Авп Тгр 145 150 155 1650
Туг Уа! Азр ту Ма! Ой ма! Ніз Ай Дів Був ТИР же Рго Агов СМ 155 170 175
ФО біо тує Ав Зег Тк Туг Аг Уві Уві Зет Мате тпг Уа ей 180 185 150
Ні іп Ар тро бец Ап Оу у Со Туг Бу Суб бух Ма! зе АБИ 195 2700 205
Гуз Аа іш Рго Аа Рго Че 010 Буз ПОС Не бек Гу Аа ув іх 2ю 215 220 вія Рео Але З Рго ціп Ма! Тут Те бе Рго Рго бег Аг Бі бу 225 23 235 240
Ме Ти ту Абп бій Ма! 5ег ви Тит Суківи ув ут оту Ре Туг 245 250 255
Вго бег Ар Пе Ада Магойо Тра вет Аза Я в Ро а Аби 260 2655 273
Ап Тут Ту Те Тйг рго бо аг ви Аза бег Ар Су ет РНе Рпе 275 во 285 ївбтугбег Аг цеи Тіт Уа! Авр ув бек Аге Тер бів. біпгог Абп 290 295 300
МА РЕ бег Суз 57 УВІ Мет Ні5 С Ав ем Ні Ап НІі5 Туг Те 305 330 315 320
Ов уз бегіви ет бе зегрРго Оу ух 325 330 «2102 75 «2115 330 «42» РВТ (ГРУПА ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «213ж Ното х5арієпу (людина!) «Оз 25
Аа Баг Тк ие су Рго бес Маг Рве Рго сей Ада Рго бе оег у» ї З 10 15 "Бег ТВ 5ег біу пу Так Дів Ав ец 01уСух цвц Узі ух Ар Туг
КІ
ВпеРге юю РО Уві ТР Маг Бех Тер А5п ет ОМ Аа цву Те беє
Сім ма! Ні ТВг Ре Рго Ав Ма бец віп зе бек сіу Гец тує 5ег
5о 55 60 іецбегбег уві Уві Тр уУагРуо 5ег Зо 5егіец бі ни сій ТАг 65 70 75 50
Туг це Сук Ал Мі Аби НІ Бу Рго б5ег дей ТНе ув УВІ Ав гу 85 90 35
Ате Ма! біш Рго Щуз 5ег Су Абр Су Ти Нів Твг Сух РКО Рго Суб то 105 що
Рго Ага Рго сій Ре бі у су Рго 5ег ма Ре їец Рае Рго бго 315 120 125 ук Рго ув дер Тігіви Ме ііе бег Ага Те Рго бій ма! тік Сух 130 135 150 мама уві Аа Уа хек Ніз Зі Ар Рго біб Маг Гуз РА Ап гр 145 150 155 180
Тис Уві Ар пу Ма! Си Ма нів Авп лів БуУЄТтВг цу Рго Аге и 155 170 175 сі біо тусАзи баг ТАпг Туг Аг Уві Уві зег Уві бен Тс Уагбем
І80 185 то
НЕ Вій А5р Тер бе дей ох ув 9ію Туг ух Суб Гуз Ма! 5ег Азії 195 200 205
Гу5 Аа гец го Аа Рго Пе бід ух Ти Пе бег зу Аа Ту су 2 215 220 вів бго Атв Сів Рго бів Уа! Туг Тгви Рго Рко бегАг ої С 225 230 235 240
Мета уз Аепо о Ма бегіец Ту Сух Геи Уві цух СУ Вйе Тут 250 253
Рга зак Ар Не Аа Уа ою Терен ет Ап Ну сів Ртоз Авп 250 255 270
Ап Тук Буз ТВг ТВ бго Рго Маг сей Ар бег Азр Оу бег пе тен 275 280 285
ГецтТуг век уз во те Ма! Ао ух бег Аг Тр бій ій Оу Або 250 295 300 ма! Рне бет Сух баг магмеснія бів Діаїес Нів Дб 5 Тук Тл
ЗО5 30 ЗІ 320 віп ух зег ви 5ег цеи бех Рго су ув 355 330 «ин 26 «9115 330 «2125 РВТ (ГРУПА ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) кі» Напто харієп5 (людина) «ОО» 26
Аз 5ег Те іух бі Ро зе" Маг вве Рут ви дів Рто бегоег Гуз
1 5 10 15
Бей тТВеЗеєу аім ТА АВ Аа еи БА Сух Цей Уві су дер Туг 29 25 30
Рнебхо бій Рго Узі Тег уві 5ег Ттр.Ави зег іу ліз ев Те оег 35 що 45 сіу маї Ніє Тит Рне Рго А!в Уві їеи бігпобег бе бу Тео тує бег 50 5 БО ей баг бек Уві Уві Тр Уві Рго заг Заг бек еи бі ТА с Тву 55 7о 75 БО
Туг Не Сує лей ма! Аз Ні цу Рео бек Ап ТА ух Маг Абр ух 85 ЗО да
Акв Маї Сі Ро Гуз 5ег Сух Авр уз Тагнце ТВт Су РО Бгто Суз 100 105 що
Рго Ав Рго біб бле Он Оу бу бго баг Ма! РНе Ге еве Рго Рго 115 1270 125
Гук Рго гу Ар ТНг Те Ме Не бег Аге ТЕГ Ро бів ма! Те сСує о 135 146 ша маг Ма! діа Уві Хей Ні СІ Ар го сх УВІ ух Ре Аза ТА 145 159 155 І5О
Ту Уві Ар сім Мао Ма! Ніб-Азп Аа Гу ТВг ух Рго Ага СІЮ 155 172 175 сі ов Ту Ап бетг ТНг Тут Аг УВЕМаїбег Уві Ген ТНЕУ гей 1850 185 ча
НЕ ОА АЗр Трави Ля у уз Бій тУгіух Сує бух Ма! 5ет. Доп 195 ?00 205 тує Ав се Рео Ав Рго Пе біо бу ТІ Пе бег (ук Аа Су СУ 10 215 220
Оп РГО Ат ОР іп Уа! Тує ТАг ви рго Рео аг Агр бів ОВ 725 230 235 240 ме тнтіує Ав сій магбегівц ТУ Суб ву Уа! ух у вне тує 245 рало 55
Рео зегАвр Не Аз Ма! ій ТО со бег Аби СБ Я Рго со деп 250 2655 270
Ав тупу т МТК го РО Маг бец Ар бег Ар ом баг Не овНе 280 285 іестугзаг Ат їви Тр ма А5р Гуз зег Ага Тер от сій СОУ Авп 290 235 Зоо
Уві Ре бег Сух Зег Уві Меї Ні бій Аа Те Ні Ап Ніх тує ТАг 305 10 315 320 біп буєзег ви 5ег Ген бег Рго Оу Гу 325 330
«105 37 «11» 125. «2125 РЕТ(ГРУПАЗАХИСНОЇРАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «2132 Ното зарівп5 ілюдина) «008? біс уві уз ївм цем Сн Баг Сну Су Су цен ма! бій бо гу Су 1 5 19 15 зегівеиу ук іви бег Су Дів Ав еп оу спе Твт РВе Ах Те тує 20 25 30 діа Ме Аха Тгр Уві Аге бів Ав Рго Сім ух у ем б тр Уа! 35 40 48.
Ав АтЕ Не Атв бе бує Тут Авт АбпоТуг Дів ТАт Туг Туг Дів Азр 5 ва
Зег уві ух Ар АгЕ не ТНг Це 5ег Ас Ав Абр зет бій ес Це 65 70 у ЕВ) бе Тукгіви бій МегА5І Аз цео був ТР Ію Або ТА Аа Меєтує 85 ФО 95
ТУКСуз Уві Асе ННЯ ЯМУ Азії Рве С1уУ Абп Зег Тут Ма! Бек тр Рпе 100 105 цо
Аа Туєттв біу бій су Тасіец Уа! Тиг ма! зага 115 120 125 хи» В «а1їх 109 «217». РВТ (ГРУПА ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «в13» Ното зарієль (ЛЮДИНІ) «Од» 28 іп. Аз Маг Уа! тис и бер дія рес ТВг Те 5ег Рго біУ іш 1 5 10 15
ТвгУагтвківн Тих Су Аг ет баг ТВ ОТу Аїд Уді тн тпг зер
Ази Тут Аа Ап Тер магів 51 бує Рго Азроніз бен Рпе лік бу іїеш небі біх тп Аа бує Аге Дів го БУ Ма Ре АЇв Ага пе
БЕ 20 бек Оу бег бео Це БУ Ар їм Аа лів Сей ТАє Пе ТВ Су Аа 70 75 о
Сів ТА бію Аер.СТи Дів Пе Ту Рве Су Дів ем Тгр. Тут зе Ав ве 90 98
Гевттр ма Ре БУ у СУ Тигіуз ев Ма! щей 100 105 «5105 29
«113 122 «2125 РТ ІГРУПА: ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЙ «2132 Ното зарівп5 (людина!) «00» 23 сіш ума бій се уві бі бег біу СУ біуїен ма! біп РгоАхр АгЕ 1 5 1 15 5ег БешАгв тео вег СУуєАів Діва зег Оу РНе тет вне Ні Або Тут
Ав Ме нія Ттр.УагАге сів Лів Ро су уз ЄТу сей ти Тер Ма! 4о 45 5ег Тит Ме баг Тер Азп баг бу Тре Не Оу Тут Аа Ахр бег Уа бо
Гуз Су Ате РКестне Пе обег Ага А5роАвв Ада Гу Аби 5егіви Тут 65. 70 75 що їва бій МегАбп 5ег і еи Ат Аз біб Ар. ТНг Ав во Туг Тут бух 55 Зо де
Ав Буз Ар. Пе бів Ту О1Х Ап Тук Туг Туї біу Меє Ар Уві тр 100 105 110
Сіх сіл о)уУ Тв Тс Ма! Тег Узі Зет 5ег 115 120 «210» 30 «2112 107 к212» РАТ(ГРУПА ЗАХИСНОЇ РАДИКАЛ ТРАНСЛОКАЦІЇ) «2132» Нота 5арієп5 (лЮюДИнНа) «ДО 30 оце аг уео Тк ой 5ег Ви Аа Твг сей бе без ес Оу 1 5 юю 15 бій Аг Аа Твгітен бег Су Ате Ав 5ег біл 5ег чаї зег Зег Тут 20 25 зо їги дів Ттр Гуг біл бір Гу го у віп Айя Рго Ат беи Тео Пе 35 да 45
Ти Авр Аа бег Аби Атгр Аба ТВ су Пе Ро Ав Ага Ре 5ет Оу 50 55 50 5ег Оу Заг Сіу ТП Ар ре. таг бе тк Пе бегбегіви Си Рго 55. 79 75 во
Сіц Азр Ре Аа Маї Тут Туг Суз біп Сіл Аг бет Авп Ттр Рго-е 85 ча 95
Тв РВе Оу ія БІУ Тит Аге ев обію Че ух 100 105:

Claims (32)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Гуманізоване антитіло, що зв'язується з СОЗ людини, яке містить у собі зв'язувальну область, що містить варіабельну область важкого ланцюга (МН), послідовності ЗЕО ІЮО МО: 6 і варіабельну область легкого ланцюга (М), послідовності ЗЕО ІЮ МО: 10.
2. Антитіло за пунктом 1, яке відрізняється тим, що є повнорозмірним антитілом.
3. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що містить у собі Ес- область, яка містить перший і другий важкі ланцюги імуноглобуліну.
4. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що дані перший і другий важкі ланцюги належать до ізотипу, вибраного із групи, яка складається з Ідс1, Ідс2, доз і
ІС.
5. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що містить у собі Ес- область, яка була модифікована так, щоб зв'язування С14 з даним антитілом зменшилося у порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 70 95, на 80 95, на 90 95, на 95 95, на 97 9б, на 99 95 або на 100 95 при визначенні зв'язування з С1д методом ЕГІЗА.
6. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що містить у собі Ес- область, яка була модифікована так, щоб це антитіло викликало зниження Ес-опосередкованої проліферації Т-клітин у порівнянні з антитілом дикого типу щонайменше на 50 95, на 60 95, на 70 до, на 80 95, на 90 95, на 99 95 або на 100 95 при вимірюванні такої проліферації Т-клітин методом функціонального аналізу на основі мононуклеарів периферичної крові (РВМО),
7. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що містить у собі Ес- область, яка була модифікована так, щоб це антитіло знижувало Ес-опосередковану експресію СО69 щонайменше на 50 95, на 60 95, на 70 95, на 80 95, на 90 95, на 99 95 або на 100 95 у порівнянні з антитілом дикого типу при визначенні Ес-опосередкованої експресії СО69 методом функціонального аналізу на основі РВМС.
8. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що містить перший і другий важкі ланцюги імуноглобуліну, причому щонайменше в одному із цих першого й другого важких ланцюгів імуноглобуліну амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 901 людини, представлені Е, Е ї А чи А, А і А, відповідно.
9. Антитіло за п. 8, яке відрізняється тим, що щонайменше в одному із першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі ІдД1 людини, представлені Е, Е і А, відповідно.
10. Антитіло за п. 8, яке відрізняється тим, що щонайменше в одному із першого й другого важких ланцюгів амінокислоти в положеннях, які відповідають положенням 1234, 1235 і 0265 у важкому ланцюзі ІдД1 людини, представлені А, А і А, відповідно.
11. Антитіло будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що містить Ес-область, що включає перший і другий важкі ланцюги імуноглобуліну, в яких амінокислоти в положенні, які відповідають положенням 1234, І 235 і 0265 у важкому ланцюзі 951 людини, представлені Е, Е і А, відповідно, амінокислоти в положенні М297 і РЗЗІ у важкому ланцюзі ІдДСї людини, представлені М ії Р відповідно і позиції амінокислот пронумеровані відповідно до системи нумерації БО.
12. Антитіло за п. 11, яке відрізняється тим, що включає константну область важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 16.
13. Антитіло за п. 11, яке відрізняється тим, що включає константну область важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 25.
14. Антитіло за п. 11, яке відрізняється тим, що включає константну область важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 26.
15. Біспецифічне антитіло, яке містить першу зв'язувальну область антитіла за будь-яким з пп. 1-4 і другу зв'язувальну область, яка зв'язується з іншою мішенню, ніж дана перша область, яка зв'язує антиген.
16, Біспецифічне антитіло за п. 15, яке відрізняється тим, що антитіло містить у собі, перший і другий важкі ланцюги.
17. Біспецифічне антитіло за п. 16, яке відрізняється тим, що: а) містить Ес-область, модифіковану за будь-яким з пп. 5-7; або в якому БЮ) щонайменше один із першого й другого важких ланцюгів містить одну або кілька амінокислот, модифікованих так, як визначено в будь-якому з пп. 8-14.
18. Біспецифічне антитіло за будь-яким з пп. 15-17, яке відрізняється тим, що кожен із першого й другого важких ланцюгів містить принаймні шарнірну область, область Сн2 і область СнЗ, бо причому в першому важкому ланцюзі щонайменше одна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням, вибраних із групи, яка складається з 7366, І 368, К370, 0399, Е405, У407 і К409 у важкому ланцюзі (ДС1 людини, була замінена, і в другому важкому ланцюзі щонайменше одна з амінокислот у положеннях, які відповідають положенням, вибраних із групи, яка складається з 7366, І 368, К370, 0399, Е405, 407 ії К409 у важкому ланцюзі ІД51 людини, була замінена, причому перший і даний другий важкі ланцюги замінені не в тих самих положеннях.
19. Біспецифічне антитіло за п. 18, яке відрізняється тим, що у першому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає Е405 у важкому ланцюзі Їд01 людини, представлена Ї, а в другому важкому ланцюзі амінокислота в положенні, що відповідає К409 у важкому ланцюзі 901 людини, представлена КЕ, або ж навпаки.
20. Біспецифічне антитіло за будь-яким з пп. 15-19, яке відрізняється тим, що перша зв'язувальна область відповідає будь-якому з пп. 1-7, а друга зв'язувальна область зв'язується з іншою мішенню, ніж перша зв'язувальна область.
21. Конструкція з нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну область важкого ланцюга (УН) послідовності «ЕО ІЮ МО: 6 або варіабельну область легкого ланцюга (МІ) послідовності ЗЕО ІО МО: 10.
22. Експресуючий вектор, який містить: (ї) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність важкого ланцюга гуманізованого або химерного антитіла за будь-яким з пп. 1-20; (ії) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність легкого ланцюга гуманізованого або химерного антитіла за будь-яким з пп. 1-20; або (її) - 10), ї (ії).
23. Клітина хазяїна, яка містить експресуючий вектор за п. 22.
24. Клітина хазяїна за п. 23, яка є рекомбінантною еукаріотичною, рекомбінантною прокаріотичною або рекомбінантною мікробною клітиною хазяїна.
25. Композиція, яка містить антитіло за будь-яким з пп. 1-14 або біспецифічне антитіло за будь- яким з пп. 15-20.
26. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за будь-яким з пп. 1-14 або біспецифічне антитіло за будь-яким з пп. 15-20 і фармацевтично прийнятний носій. Зо
27. Антитіло за будь-яким з пп. 1-14, біспецифічне антитіло за будь-яким з пп. 15-20, композиція за п. 25 або фармацевтична композиція за п. 26 для застосування як лікарського засобу.
28. Антитіло за будь-яким з пп. 1-14, біспецифічне антитіло за будь-яким з пп. 15-20, композиція за п. 25 або фармацевтична композиція за п. 26 для застосування при лікуванні захворювання.
29. Спосіб одержання антитіла за будь-яким з пп. 1-14 або біспецифічного антитіла за будь- яким з пп. 15-20, який включає стадії: а) культивування клітин хазяїна за будь-яким з пп. 23-24; і Ю) виділення даного антитіла з культурального середовища.
30. Діагностична композиція, яка містить антитіло за будь-яким з пп. 1-14 або біспецифічне антитіло за будь-яким з пп. 15-20.
31. Спосіб виявлення наявності антигену СОЗ або клітин, експресуючих СОЗ, у зразку, який включає стадії: а) контактування зразка з антитілом за будь-яким з пп. 1-14 або біспецифічним антитілом за будь-яким з пп. 15-20 в умовах, що сприяють утворенню комплексу між даним антитілом 15 або біспецифічним антитілом і СОЗ, і р) аналізу того, чи утворився комплекс.
32. Набір для виявлення наявності антигену СОЗ або клітин, експресуючих СОЗ, у зразку, який включає: ї) антитіло за будь-яким з пп. 1-14 або біспецифічне антитіло за будь-яким з пп. 15-20; і її) інструкції із застосування даного набору.
А ОО І і яю вба-воєьм тая цу р пд -восюВ А ТЬя т ордою ову- вуст ьо воло е й : ! пен - ра ох шк ж Зоо вобз-йкасоз-на а З А дю ве косюЗ Зої МОСрОя ж «й -по САНЯ ща лай ре ба: висо М МЕЕСЕБА тя се В СОВА ЕрА ві 5 З буку «ок.
Завеї Енн вна: нивниа ні ние вижаальнкь пава ОДН або 1 16000500 АБИ Ї днтнтопо кС5о ГМО ПАНА. всі есе я НН Сас всі пишоа-вИ о КИМ Е ех НИМИ КЕЙ вс -посоЗНЯЗ 1002 іа ни соня Зі ШСЗ вод ів б1-503-ШЕЕВА і в чаплі Знни О веб ово ке то Ж сі й Я вва ппа же уки А Ж «або оре нн С хи подо изд ато її ши К доп є В р Ж дос і-ниспа вста кер зоевйх Я Я в А замсазовевах Е й дув : Козлов го і: рент ттержттютн в жк інет скрін пол о б 1 то Тож АБ мами опи Кл Аніжело | ІМКЛМл) зх ІЙ 0.58 Іоєюст соз х БІЯЕЦЕВА і Бета посознЗстхнЕа- ОА іс.ав 1 шві внсоЗ-НЗ Р ЕпА ог вс ОораетьнОА 9.07. и.:4 їж Фіг 1
А 209060 Й г о бванисіВ-ТаМ ни това ож 2 еллосоУн Ж не а 2-7 засво? Я горою / шо дові-поСсоЗ Низ а дк 2 1юбл-нисоз-НаЗ ех «у ІдбЛАпИСОЗНЗІ З ЕЕОА який й ві в у в 8 я ідоі-соЗт ОА щи ехо п ці 5 108 Ав'мкамиї 7 їй (ИКРМИ) ' блупосю-ни о 31
2.28 іде писемна Й ТИ ішеіписра:ня Й асгтсовна ля твА 15 Б А 15добо -- 100009 а ш щі 7
Б. вороб я і У оди ВИСтЗ-мЗілхНЕВО ЕЕ Е К я Ве пиСОЗНаОЛяЕКТА БГЕОА
5. воопо / щі -- Бвіобі СОЗХНЕВНОЯ В ЕДА в т З1-вОСОД-НЗ М ЕЕОА Я «робо й я іди пос Із. ЕСЕРА ЩО г ви як 1-СОЗ- БСЕСА ово не ой й вб1-012 ві ск НЯ: се Й гонок ен есе квоти укр рт тест собі 0010 1 чо Арман мл) й Ес5О бзішОї посоз НеіХНЕНО- ЦЕ КОА бі вуз ні РЕА ЗО00О6; яю Б ПОСОЯ -к- дев я шк я г іс ж юБіСсоЗ - 80000 гро пед ЩА усі-писОоЗНТ и щдр вбі-йоСоЗ нь та І й «ве Іі нос НТ З зо. СИ як вості З не --к- ДО ї-висра НЯ б І Яд юизи-пьСОа ЗІР БЕОА й ка ШИН З в о пу ДЕ роти і юбі-СОЗ Б ЕВА ника шашки: змевда о митьиді Ше ме ша ве са -вТе вм о 1 ко ово ою Концентрація АБ (нг/мл
А ж ок ідЕепуєоЗ ери дО пи В З8 й ВА ня: иа З шо ЕЕ рек ан це Мет деле со й Я о абіпююьит 2 Ше ко «й ЩО поСОЗ-НТЬ? і «А р « -й ДО ВоСОЗ НИЗ с в ; не -й- добіпосю ная 14 ще - -- ІдсивИСрЗ: НАС ЕКО, : Ця Я дні звіті я тА ра Болю ЧИН ще Ол СЮьнНУи МОБ ЕСА о си Мини нн ни -е юОвСОоЗА РЕА вони ванни: Швлна засн малька ІИШНННИ Ід -ріаКкаоВ до і: МОЮ зо ТО00ю Концентрація АВ (влмл) а о -0- ідЕ-вкиСОЗ й -- юдбі-висьвВтУа - Ера рент й що
1.8. й. нн: Я вО1-сОоЗ 3 ий У -е ей восСОЗН г ий й Й . 5 10 в й ДОБ виООЗРНіо ме лк -й- юбінисюзні я о й. 5 щбі-песоз-наця фІ : : 06 о о щфелАнисОакАЕя АЙ чаш чи НК о дебінисоЗ ЕЕ ЕВА 00 Й і й й но ще СО ЕВА Енн» мив а мив ві дві пекла сі; кавваьс вливань З перен Іде века о 0 1 10 т обо 0000 Концентрація До (нгмлі
Ж во й є - інш ншше свт нн : А з ре й М сова -вуту вола Ах а ЩО зо оби? МУ й Й ш Ф вхбізносолнастк АЙ ув Кох їж га | СО вес:совзхнена кв ок ев) З ЇЇ розбіасвпосознавіхвлР сть А поаватої ! МОМ й о пебі Нева оА (дент ненні коріння ення «й Ер -ВІя о та удо я су що ад о срах зола ок Концентрація ДО (ЯМА) в зла
- . о 1 взмуснудув гам ЕВ ЕВ А й авта" їх Го ва зон гааМм АХ, щ їх В Бзбасвьсо диаі зи ЕВ Кг А а і А ГІ вес созЕВО І ЕВА га чишицн Ж вабіопьсо зх вів 2 бо й й і х А пане ЕМЕСА ! кс й о шевовлу кни тини никикивини Ки 34 дих ню за й ж яйе лх яд та и Концентрація Аб- (німи)
Фіг. 5 7 ІГ.
А зажо й ШЕ: ОО сірдй путі нав ви тА Ш вода де а я ба сви сб ЗЬЬкОЕох Во УК ай 5 п мк й ЖЕ воалевуод назві вт зе м ні оди іти - «вцаВ. її я Ще пропо солдатів по ай га же щезвишожмняцтая ета або М, й шасско она уРувоА РЕК | й В. а НН 4 ї ща Ж ов 2 илЯ й в Уа НАю сон ж у СЗЗ ЕТЕВА шої 901 в і та 15 конувнтрація антитіла: (мМкКглМл) СО лнтитело ПИКА Е ідсн-песоЗ ЗТ ЬРЕВА фо ! І ас ясюЗ-нЗя: БЕСЕСА І тастеависов нт. ЕН ЕОА, вдбіспосОоВУНІя. СРЕВА Гі ід -висЮВинИі- ЬКСБОА 0.06 ідеі-висОоЗ-нава ІКЕВА 0001008 ів с08 САЕВА 0.57 !
Фіг. 6 й Ана і | У вад спасовВ нас зхнеЕна АСВ А Е «взво я про ве т побознісзхнЕВа ку ОА -- ах ко бБешоі-писл»З- НІ нНЕБІ Ед тя я ЯК вешоізпистЗз-нНІінНЕВ ЕО Зо рода з ЖЕ відбив ні зх нео ЕВ А У у ла : А не ЕД діт я
2 я. че аг бл-восоОЗ на теме сода зоря я й з звідсеспебОоз-наг зно уп ВА щ ой З вав: з сх сеЖи 0 о юзАЕЕЕОК пообж оя ва з 18 120 концентрація антипла (меми ГЕС Аніитвло о Д(чкгМл) Бхівоз-ноСоВНЗІХНЕНО НЕ ЕВА вів виСО НВО КЕ вро ноСОЗ-НІІхНЕВО НК ЕОА оевсі висо Ні ЗкНЕВ ЕК 258 І вірсі-писоз-нАІХНЕВо ІКЕрА 282 ові пьсо НАІЗХНЕВО І НЕВА ОТ СОМ ІРЕВА
ФІГ. б (продовження)
А запо - В ЯУ вбівлосоЗ нео р но ян се В рвріи щу зов шо Я ідбт-весоЗ НЗьВ РЕА Фо звиов ой ЯТЬ оті ниСОа Ні вд ш ! у Як ще нео нт еЕКЕОХ 2 гообо ж «ве дв і-ньсоз нав вва 8 -к даі-висоЗ нас івівоА зва БУ Й ! Кк рута г ан песто пише ие Ж- фо 1 СОЦ ЕТ ЕВА проб: д.д 0. 1 12 та Концентрація антитіла (мкг/мл) щи Щ і СО Антитело імкомлі тасі-вчоюа. НУ ЕРОЕОА тає вшисоЗ-нагЗ-СВСЕВА, тасі нас а -ЕЦЕОА Фі пово нів КЕШ ри СЮ наці в А дбі-виова НА ЕВА Гіабі-соа п вОА 0.06 2
Фіг. 7 В пат пт й КУ вхід еносОнНасіхнЕвЕЬЕЕВА с рлотая -3- піп ла-нуспзіналумя во ж - аоо2 В ве шк МТ Бе в, : Я вкшді-висвз нене ув ВА ІК ой «Що ввіз і-нвсра не УВО О здоро м. ке відо л-песоз нар тхнЕВ КЕ ВА и: св веде восоЗ же вЕНВУКЮА ! 7 ШЯ Я в. 515 4 се суку й Й й і ск ів ВВЕ А по од й 1 18 той Кониентраців. автизіпа (мкм) і ни СТЕ с5о Антитело лаку веівбі висо На ІХНЕКІ НТ ОА Гагя 1 Беів3имоСОЗУНЗІаХНЕНОЗ РІК ОА вквоі писОЗ ні іхНЕКІ У ЕЕОА феівс песо ні ЗХНЕВО НЕО 0351 реівОІиСВа На ІхНЕВІ РОД (оз інді воСОЗ-На 1ХНЕВО-АЕОА Го внбі-сОЗ А ЕЕрА ооо ФІГ 7 (продовження)
А попе ! ще шосе ВЗН РЕА Ф зв0ов як больова РЕВА а 5 - ; Я діви доЗ НИ 1 ЕСТЕОА М одава: й ЯК щатапвсовитМАьЕВА що р яке а епос Ва НАС ТВ ЕВА ; т 9 пові ра р. -й- аа ководнанЗ і вЬЕва : р з дл зв'я ві 54 у се У: ї -ф- звв-соЗ тету ут пр єттут т Нр я тк тр тк дл Ге 1 15 190 таза Яос0о Концентрація АБ (мг/мл) в тасбоо ; що | и у ідші-посОЗ нові ЕСЕ ВА "3 ДОНУ й щовтве / : Ще дв'-яасюа-нЗьЗА во ХА Ж вбос 0 за -воСОоЗ Міст АРіЕВА ще : у ЖЕ івб'посоу ев А ій 4208 р де за бБ'-вабряня ьо А с І | те щ ! ра , у й ро нив оз нава ЬКувВА що Е сив Й зебія-в15 є: ре іл її г Сех, Кр нен -Щ- іще са нн п о ВІ А 0:11 з та 15090 торою Концентрація АВ (НГ/МЛ)
С аа . -Щ0- Звід висО нік ЕВ ОВ збите ра Я Бк носОЗ НЕ ЗХМЕКО ВЕДЕ А й | ре ча ЯЛЬь ввівві-льсСОІ НІ НЕ Ч вОлО В шк у це Є вк я ще шк ШО завбо я р.й Я ввід пис ніЗкН ЕМВ ЗА По збвбо - ! са ве взіра -висбзнагіхнЕвСКБЕЗА ща тов пас рашіаі-песоЗ ЯЗ о кВА , т- М» зал? й пн нн ше ся Зо още сова ртиеитортиететт юри етери, злі йх 1 ПГУ іо а03 зов Концентвація. Аб(нНІЛЯт) Іі гоп й і яти ко вже во нс ЕВО КУ ОК вн. ж ко веюбі-пьсоз-я Зі акнЕВО ШЕ ЕВА - у Я вові свудовонзтхнЕ ВІТЬ ОА - зоова я Ще ввізі-пьсоЗнНлЕЗХНЕВа ЕЕ ТА що | дв -й: вдо вс нЯІхнЕНО СЕОЕВА о ог ї ДВ з ьвівстлюсораіяізкнЕвт вико Ж ро о ідс-віз : Й ше : 4- го, же вс соз ема ва оо мав ва мав кни у пав во мававюст Мал ван ща 0 ї Кк топ 1553 кода Концентрація АБ (НИМИ) й ; й Фіг 8 (продовження)
А й ж. мбі-висо на твер Е 59 НН що Я фол поро НО ВІЕВА ю | / х Я реве оя вів. кЕЕ ВА ї вх / ке Я щас нНлІ ав ЕОА Ж ув / се озвеснисв ня ВСЕ ВА ся І / яке ідіома ато
6.5 і З ївбіві? щи Де ее я З п завіс З ника: ньне вил нен азс нежилі: ви пи ві нь вва 1 тб. ооо зошо з00бо Концентрація: Аз (нмМмлі в ще Я» по а-восоа наз ЕСЕвА Я ув у. В іо вус р НУ ЕЕ ЕТА «НИ От С ідбівьова нт во - ї я - ідол песо лізь А й зд с / -йе о пудл-воєва варто г ! ї -к іабіснасоз Над аАвІвоОд ту 0.5 . 9 | / в вет; - ЩІ онко ннне Ех званні --- гезл.сОЗ реч іквутттт пере керу тертя уки тт рт т его пла п ї ІЙ то тво 18005 Концентрація ДЮ (НІМІ с як -О- взшоа і пьСОЗ З ІхНЕНИ ЕБА Е я : - пушя Жах : -Ф свшбі-пуСо3 Ви ахВЕВО КУ ОпА з КТ ніх и К - т р ЯЬ бвізді- вес мах НЕва пт БА а й НВ о звубі-висбЗ ні изхненІ ві ЕЕ а - з З З ; 1 / й бвбфі-зьові на тмМЕНО ВИКО меш ; -й- Вшедіновоб ма кувна ву кА ВА
Го. ЩЕ Я шо Ме зві с м зе рщех дя ие ВЕ 223 є | Я ж мрал 80 Пенали свосслька гі сишьни шал ники позі: нин нав ТЕН ї ій мих апп збо Концентрація 2о (нг/мл)
св. в нн Не У БавО вус Ти нНИЗ ВЕК ТА - ІЗ Ні, Ж ках у кова спьсоЗ Зако сЬвоВ а я 03 їх відб пЗсрванНавінНЕМа КІ їм І Я вашим ЗхнЕй о РЕА Я де» р с вадбіноспавнУ МЕНІ РІ Я ВХ га Госкотрння (дені са -й- веб -нибоп- нар мЕНУК ВУХ З | х сосні ВЕ Козу й - й Бі ва --- а ові детектор трете тепер тертя тек, голку 1 то 1-5 та0о што Концентрація АВ (ним Фіг 9 (продовження)
А що ВОІВ Сб о ведві пт яз онеЕкшькикох ре - прик р Кан я шо релі воль аЬІдНиДдо гу А Не в М дих І т . І оо кН, й У С овідубаво плоти вико А ШУ ощо"» жа | кплодіізацевно вуст - хи ШО охідот-веш ані жене о ву, - Те А вБащал-ноєбз-наззнЕноекера З защоя й а зр по наз КЕНЕ КЕ ЕСА о Д, ся ч еще БозхвеВво ті лоя вима тисячі ВОНО у суб омЕВоОлЕскох а Фо втсвту во їз ща 1 9 АК щи поз ховцентрація АЮ (ВгЛЯлІ в во й Щ ! С вкрО ве сФ З АЗІЯ КЬЕВА га ит Бсса а: жев, ік ши жна ше ше яна; що вхід евпУсо наз но ого я пен ра: и че З вВешоблавосоЗ лька ях І Й їх ШО Зхіботво поз млі акне вок Во Ге | ; А овал і-носю маска Увовоа її в яма г ша ;5 А смерубі-взознаахнеяоькКьЕг А: с ! кл в х свкрро1- то ахнеЕвВаАл Ес ЕВАХ з пи о оон ч ар е»нЕНІ ЕЕ ВвА Певна вав ванна вання: Еш кн вовни Фо па азві2 й бро ви 1 то 3до 3005 ло3об Концентрація Аб (нг/мл) запа і . ; па м - ; ЇХ пксе і ї ЯК шо з-поовЗ НТ 500 др е З Же ж. вив рр ж | ри ср -- збі -пишп НІ - а п тех Ї ке -7 о іде. ниві З ГК їоба5- ний ін 936 пет -х - | ча молвасоз ня Її ка я І Би те фриз НЯ СО вода | Уж пе і ОЗ диф «й 150-554 паси пе - рити, и гас З Гевко: нів вель НВ ВЕК: Мой зи пах пава жк ака какая яз и 1 15 і00о твою лоооо Концентрація Аб (г/мл а
Фіг. 11
А шов» 4з00й І КІ рт т 5 о ше веб ВТ г - І ж евосі діви «6 заою о ! я іфзівесів-там о Е ше ши ми У По щежттисів-там хата я Ясне ща : : ш взіпесьвугаввий щ В. що - Вени нн ; писати вве о знраі У я і їх Ф Я зба свисев та кв її 5951 у М ї А лаб'іунуєув ту ВА о Х Й - М лайл-вепья тносоА дн Дріт жо заваісвувьвогамовава ще ; са та2о9 дон, в ГУ 7 є даі-внсьн кала пАНИ ре о . зп сі дотя відних зр туту З ПДВ од етан спеклемтітой -ї5 їх пвалсвопьво та ВОЛА. тиеневнононі ; я щ Я фа єьВКІМовях а в 1 то. Уа то Концентрація АВ (вг'Млі В гзбов За 1 з рення 5 др ЛА Я
0. годбво ! 5 Ло / | ОХ івЕсвуствітлия Бе / | я здіхаопибувох их т Ж Ї а Г цеба-повив гум тов вА Ган туя Го Ше знай Фф : ТО бі леудійзка аа ра де ідо оці? що 7 о ; вл ! а 104 чо5о Концентрація Англ ще 2 Фіг, 1
А. о ідЕнасСеВ- там опа а-виЬВТ га за А ЯК щбБівосов:тааУкО що ще пло і змолУни сь г ЕЕ - Ех ше 1-пибі ВТ ЕЕ МО 2 раці на -к- або сі вотум ВЕК - : . й що 55 й вх со дблочнемвотЗиа А а зу я -к- ібн в-тЗ и див й с я мбі-васьВот ма ЗАНО о 5 4 ; о | брюк дстй се вісвисьвто АВР я Ки І - вели суВ ту ЕКАМО І ки асо: синь льнио овал, милих шивав сьо іван З «у: бл-висьвт Ява 1 а, ї ї 5 Бе зо ОО й щ ' я Тбоо о де іввіфів-мо5та Концентрація ДВ (нг/мл) -- ВВЕ ву В з їх . Я ізЕ НИ СЬВОТ З ж Ох -кис т Жак е ко вбанися Вт і КО ЯР па -вусіВвотЗЯ сво Ах СІ 7 фе. о щотносіВ ТЯ АМА - о Ше г не - ввела Сі аж Що нотннєі --- абз о - ши ши виш не кед ом сво жить ом ва иа ВИ кіс, ВВА 00 а 4 19 КАХ аби зов Концентрація 2 (в/Млі
А зк4алуре - тя НЕ ! ш --Є Я шен Ск заа-вУєувигум - 1-8 с: я нт тя ши й МО м смота Уч сн НН а: вкаці носі тзехнино є ра чо «й-й й й г око кискв-тзантя Ж жк жов ож Що ана в зна: в - Фовбі-ві? я Фе ш-а- о КУ тибеліх - т, й чен й , ння баапи ває ви ї то ЧАК паб гебох Концентрація АВ НИМЛІ В мЕ97 х-х Ж зда" Го Би" со сщютВ У -е- чо. Ес й й де зе ся В Кох ЛИ ОЗ сфбі-пьсса 3 їх здат ЯЗ ва х а її Що веде ліпаєуВ тЯнінЕВ ни й маплоачсі втіх Ф іі ТЗ вина спусі вет Зав З » Щ о впаі-нЕВво щепи оє вн они 5 заба-ті - з - свибель в и Бе евдя кол св и У йо зов лою Концентрація АБ (НИМ! . -
Фіг. 14 д «Пазуве І - КХ Я п шою про дя їй но сіней палях о Брлоте да оя ПЕ за це ще й я 5 й швом вазони Мо т іже те . є в ее й Є взшбл комі так - в Її в. шо шеекаво що ах З т З зафьзти ші в-ва КУ гиСеалх їУ 2 стерегти іетя Февіоаю Вл 010 Я дб соби сов Концентрація АБНИМА В кота - з - Ден : що Щ з ооо ОП Б КОТ в я шана ймвОгМй т яра я і 4 ще ш З о вмаша забювстаьняво 4) ; 7 (1 вябяасувиттАхні? ЩЕ й й Я одпз-нЕв Шоситоя ше йо г е зв б гибел за ша нос вва шив шах микжлю Я го собі ва ва Е 15 185 боб поко Концентрація.
АБ (вЕйшл)
с
УК. х їх с: ан зво о що В Дня 0000 уд нУЮрасто ще ще Ве с Я і МУ Бе во сцлтаса ою я га йо шаівнен? Ж в - і якої вій Е 2: ЗО В вн сезвгАбені їх в: ПИ зов аа свя Я зже осв осо Концентрація АБ (НИМИ) о іБїЕмО що осі - г 73 х Ї зв яене. Ок ЗНА в яна Ж А Ф вкШОБВеШІВ ГЗлхНЕНЯ тк. за, 2 екхюі висів тамкої Ж ше що Що пише Еражи х зі фах оо що во обох с загийел речи о и чн и и и и КВ са ар Н 15 хба лпйо а) Концентрація АВ (ніМл) з ; Фіг, 14. (продовження)
Е І ГЛЕЕВА Кі з хе з т У д-в-всвть
В. «ідеалу ее ее НН ОО пазхвосьвостяя ою: вка В ові кута Кі Ко вебивисі втіха о й п т вв. шо сваінкво що лих Ж . В їк1о а вис ні Фі сцюал.ої3 ше пов под дж в 1 Щ бо :б00 зпува Концентрація АБ (НМЛ) Е ко рана ш ж зе: о ТУ зт: еще С Яд оте ве у :
Х. Щ- меч ИН а ве ее - соті Я Є ї ж я Бифбі вугівотвкня? ш х СС. вєевсавосі в га квІі: в Ж Ж шана оте Ас -в--й- фев 2 вів - їлож й У ТИбалЛьно нку авіа дії шко р того тособ Концентрація. АБ (НЕМЛ) і дея Й ІБ ЕВАНИКО гі ; Б шт ОВ їг й вв Ех Дани соч
Ж. же я Б: СЕ спр інею вот не шия щ І б вл: вевфеталвЕне р с ТІ вима бчисастуташву ЕЕ як й г б Бозі нЕЦІЯ шОО ЦИ, й пий леву в ча І тя леж зо повер и Ге зас лавах ана сіни пвнйвйлнь яоьлаасня во доню Засн Вивих! же вик ші т тво йо то Концентрація АБ (НМЛ Ощк З Фіг 14 (продовження)
А. дів ря. х хе» ще х Ка в п А «вн а У зе ОО Бшіслодрнком о. | : й: й без котув тн нед Ф вт за У 0 вел внасьвотахваа а не в «вена ой з заїжшті щї ее ВИННА ур в ие чи ЧНО Ехзагибаль : е псавжо фу ОМ лож збой ово Концентрація АБ (НІМ) в СЕБЕ в А ТЕ гаї у ще зни п сон п го зи ман 0 о пеевосув тів с Фосззщоузипев ілі ко іс - щи з вжив я щої ЛЯ ОБЕРЕ деяхВ ЇХ З ма ивАх хатка щи: ЧИ ово ве щока иа НК о сзагібвл , іннтчкя : 3 : | тик ї-ї- шо в ва ї с як ІК ни, Концентрація Ав ном іІЛБА ЩЕ вне я Ко Б от, Б ми? ще я В з ГІ ве ззнвовуд ти щ й Ще Х і чех вибув пани - жк Я і Ж вкихк вийду з 2 Ж хи і з а г заяві ЕВ е ее ни сняно 53 щи: Тер оси чт Що а шк фронтит Вк федри -Затовль Я Е Шя сети вето овен тертееті тик ЕЕ ча облі й ї Ге бпй У зЯМех Концентрація Аб (чилі е е
Фіг. 15
А пе х Є поа-спае І)
с. най Фо если бів-та іс і попиті в а ча шк пра / із Шо ще і-весЬв-т3 ке я ; Ї ж до осно ствтЗ вно й 283 / А біле вв-Т3 СЕ ЕВА оо, їй дк о -песувот як меш й Ж зебру вза: оАВВ о Х шоалнисуВАт а ОА У Я 22 те - б щшевнпаисьвот ма ЗАМ древня де я ше їспусЕВ-тт гівно
9». Ф во -осів-тано відо АВС 1 т чаж їпоб пс 00009 Концентрація Аб'ними) 8 3 ж 2 звева-согу . їх 7 й - в ко о вел пУСіВ-тЗуєхіяй Е / ГІ зешо вцсСувстатхнаса нев о що дв Шо овен пив -талакнев ік ха 7 я Й За Юої нУссдутаяхнЯєВі вся МО щоОЄ і Ж фбащої нова тайна кій і я і й Щ вмафівасьп-тамахнеок а Її Я ввід писСьВ-т3З єна ВАВ аз й -й 5 Біда списувотамхкас ато нако ант ння с рана Фо вк і носі в-тамхн війн віку та о взшщша йппсув тім кров мово ї ще то зва обо твузоу Концентрація Авінгми)
Фіг. 16 ІС !
С Ш кожи І х ї2 і АХ со же оо я «й І г З ша овисьвогяй як | м ГІ сзабі-рьсентам ке А З Б іа й двоі-насьвотзйАтХ не що 1 г Фе Ї, г обя І; вх Ж, дей ще іс вн ло; Н 15 нг Пр сиву нору егерноя Концентрація Ай (нг/мл)
Ез.
2. « | ш-е-й шо ш ла щі «
Ге. Ї ве і ОО зав свий що Га " ; я; 8 о пвшбі нубі тане в й | в. ЩО ваше в-таахнЕІ ВО Х З 325 / у ШО ва) небу Зх нНЕНІ УВА й й і вів ї зи 150 00 2чпдо осо зей Концентрація АБ (нем)
ФІГ. 16 (продовження)
UAA201600940A 2013-07-05 2014-07-04 Гуманізоване антитіло, що зв`язується з сd3 людини UA119646C2 (uk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2013/064330 WO2014006217A1 (en) 2012-07-06 2013-07-05 Dimeric protein with triple mutations
DKPA201400009 2014-01-09
PCT/EP2014/050340 WO2014108483A1 (en) 2013-01-10 2014-01-09 Inert format
PCT/EP2014/064326 WO2015001085A1 (en) 2013-07-05 2014-07-04 Humanized or chimeric cd3 antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA119646C2 true UA119646C2 (uk) 2019-07-25

Family

ID=52143134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201600940A UA119646C2 (uk) 2013-07-05 2014-07-04 Гуманізоване антитіло, що зв`язується з сd3 людини

Country Status (28)

Country Link
US (5) US10465006B2 (uk)
EP (4) EP3693385A1 (uk)
JP (7) JP6546162B2 (uk)
KR (3) KR102363220B1 (uk)
CN (4) CN105722529B (uk)
AU (3) AU2014286116A1 (uk)
BR (1) BR122023002590B1 (uk)
CA (1) CA2915575A1 (uk)
CY (1) CY1122840T1 (uk)
DK (1) DK3016681T5 (uk)
EA (1) EA201690167A1 (uk)
ES (1) ES2776706T3 (uk)
HK (1) HK1231369A1 (uk)
HR (1) HRP20200382T1 (uk)
HU (1) HUE048722T2 (uk)
IL (4) IL290613B1 (uk)
LT (1) LT3016681T (uk)
ME (1) ME03675B (uk)
MX (2) MX2015017487A (uk)
NZ (1) NZ715896A (uk)
PL (1) PL3016681T3 (uk)
PT (1) PT3016681T (uk)
RS (1) RS60131B1 (uk)
SG (2) SG10201800982QA (uk)
SI (1) SI3016681T1 (uk)
UA (1) UA119646C2 (uk)
WO (2) WO2015001085A1 (uk)
ZA (1) ZA201800385B (uk)

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103429737B (zh) 2010-11-30 2020-07-14 中外制药株式会社 细胞毒诱导治疗剂
EP2869845B1 (en) 2012-07-06 2019-08-28 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
PL3016681T3 (pl) 2013-07-05 2020-06-15 Genmab A/S Humanizowane lub chimeryczne przeciwciała CD3
US11161906B2 (en) 2013-07-25 2021-11-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
SG11201607434WA (en) * 2014-04-07 2016-10-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Immunoactivating antigen-binding molecule
JP6894702B2 (ja) 2014-05-13 2021-06-30 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子
JP7020909B2 (ja) 2014-07-25 2022-02-16 シトムクス セラピューティクス，インコーポレイティド 抗－ｃｄ３抗体、活性化可能抗－ｃｄ３抗体、多重特異的抗－ｃｄ３抗体、多重特異的活性化可能抗－ｃｄ３抗体、及びそれらの使用方法
SI3221359T1 (sl) 2014-11-17 2020-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Metode zravljenja tumorja z uporabo bispecifičnega protitelesa CD3XCD20
CN107660214B (zh) 2015-01-08 2022-02-08 根马布股份公司 针对cd3和cd20的双特异性抗体
EP3277725B1 (en) 2015-03-30 2020-11-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors
NZ739028A (en) 2015-07-15 2023-05-26 Genmab As Humanized or chimeric cd3 antibodies
EP3371311B1 (en) 2015-11-06 2021-07-21 Orionis Biosciences BV Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
EP3378488A4 (en) 2015-11-18 2019-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR ENHANCING THE HUMORAL IMMUNE RESPONSE
WO2017086367A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
CN105296421B (zh) * 2015-11-24 2019-01-29 高岱清 一种双特异性抗体活化的t细胞及制备方法与应用
EP4026848A1 (en) 2015-12-09 2022-07-13 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing the cytokine release syndrome
CN116813799A (zh) 2016-02-05 2023-09-29 奥里尼斯生物科学私人有限公司 Clec9a结合剂及其用途
SI3433280T1 (sl) * 2016-03-22 2023-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag S proteazo aktivirane bispecifične molekule celic T
CN108884170A (zh) * 2016-03-22 2018-11-23 豪夫迈·罗氏有限公司 蛋白酶活化的t细胞双特异性分子
TW201902512A (zh) 2016-06-02 2019-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 治療方法
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
BR112018076281A2 (pt) 2016-06-20 2019-03-26 Kymab Limited imunocitocina, uso de uma imunocitocina, método, composição farmacêutica, método para tratar uma doença proliferativa em um animal, ácido nucleico, vetor, hospedeiro e anticorpo ou fragmento do mesmo
CN117247458A (zh) 2016-07-14 2023-12-19 健玛保 针对cd40和cd137的多特异性抗体
US10610104B2 (en) 2016-12-07 2020-04-07 Progenity, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
EP3576765A4 (en) 2017-02-06 2020-12-02 Orionis Biosciences, Inc. TARGETED ENGINEERING INTERFERON AND USES OF IT
SG11201908088RA (en) 2017-03-09 2019-10-30 Genmab As Antibodies against pd-l1
US20210138213A1 (en) 2017-03-30 2021-05-13 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
JP7009517B2 (ja) 2017-06-21 2022-01-25 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｈｉｖ ｇｐ１２０およびｃｄ３を標的とする多重特異性抗体
EP3668898B1 (en) 2017-08-14 2023-07-05 MorphoSys AG Humanized antibodies for cd3
US20190100587A1 (en) * 2017-10-02 2019-04-04 Covagen Ag IgG1 Fc MUTANTS WITH ABLATED EFFECTOR FUNCTIONS
US11472889B2 (en) 2017-10-14 2022-10-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
KR101973060B1 (ko) * 2017-10-20 2019-04-26 주식회사 녹십자 항-cd3 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
CN107860925B (zh) * 2017-11-03 2019-07-12 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 用于检测血清中HuA21抗体的ELISA检测试剂盒
CN109971725B (zh) * 2017-12-28 2024-02-02 上海细胞治疗研究院 抗体修饰的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
JP7337079B2 (ja) * 2018-02-15 2023-09-01 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型ｃｄ３結合ドメイン、及び疾患の治療のための併用療法におけるその使用
SG11202008399QA (en) 2018-03-12 2020-09-29 Genmab As Antibodies
JP7377590B2 (ja) * 2018-03-14 2023-11-10 ノビミューン エスアー 抗ｃｄ３イプシロン抗体およびそれを使用する方法
PE20210127A1 (es) * 2018-05-23 2021-01-19 Pfizer Anticuerpos especificos para cd3 y sus usos
EA202092847A1 (ru) * 2018-05-24 2021-04-20 Янссен Байотек, Инк. Антитела к cd3 и их применение
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
IL280875B1 (en) 2018-08-31 2024-08-01 Regeneron Pharma Cytokine Release Syndrome Attenuating Dosing Strategy for Bispecific Antibodies to CD3 and CD20
CN113166261A (zh) 2018-10-11 2021-07-23 印希比股份有限公司 B7h3单域抗体及其治疗性组合物
EP3864045A2 (en) 2018-10-11 2021-08-18 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
US11208485B2 (en) 2018-10-11 2021-12-28 Inhibrx, Inc. PD-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
TW202021986A (zh) 2018-10-11 2020-06-16 美商英伊布里克斯公司 5t4單域抗體及其治療性組合物
US20220249814A1 (en) 2018-11-19 2022-08-11 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
US20230037682A1 (en) * 2018-12-04 2023-02-09 Novartis Ag Binding molecules against cd3 and uses thereof
US20230257479A1 (en) 2019-09-12 2023-08-17 Genmab A/S Bispecific antibodies binding to 5t4 and cd3 for use in treatment of cancer
EP4039707A4 (en) * 2019-09-30 2022-11-16 Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd CD3-TARGETING ANTIBODY, BISPECIFIC ANTIBODY AND USE THEREOF
US11707610B2 (en) 2019-12-13 2023-07-25 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
AU2020411480B2 (en) 2019-12-23 2023-12-21 Denali Therapeutics Inc. Progranulin variants
WO2021141996A1 (en) * 2020-01-06 2021-07-15 Cytomx Therapeutics, Inc. Single- and multi-chain polypeptides that bind specifically to cd3 epsilon
BR112022014667A2 (pt) 2020-01-29 2022-09-20 Inhibrx Inc Anticorpos de domínio único de cd28 e construtos multivalentes e multiespecíficos dos mesmos
WO2021167952A2 (en) * 2020-02-20 2021-08-26 The Feinstein Institutes For Medical Research Agonist antibodies against endoglin and uses thereof
AR121599A1 (es) 2020-03-18 2022-06-22 Genmab As Anticuerpos
CN113563473A (zh) * 2020-04-29 2021-10-29 三生国健药业（上海）股份有限公司 四价双特异性抗体、其制备方法和用途
MX2022013797A (es) * 2020-05-08 2022-11-30 Genmab As Anticuerpos biespecificos contra cd3 y cd20.
EP4204092A1 (en) 2020-08-25 2023-07-05 Gilead Sciences, Inc. Multi-specific antigen binding molecules targeting hiv and methods of use
CN116472060A (zh) 2020-09-02 2023-07-21 健玛保 抗体疗法
AU2021340232A1 (en) 2020-09-10 2023-04-13 Genmab A/S Bispecific antibody against CD3 and CD20 in combination therapy for treating diffuse large B-cell lymphoma
MX2023002540A (es) 2020-09-10 2023-03-14 Genmab As Anticuerpo biespecifico contra el cumulo de diferenciacion 3 (cd3) y el cumulo de diferenciacion 20 (cd20) en terapia combinada para el tratamiento del linfoma folicular.
BR112023004216A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-11 Genmab As Método para tratar linfoma folicular em um sujeito humano
WO2022053657A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
EP4210745A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
US20230312757A1 (en) 2020-09-10 2023-10-05 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating chronic lymphocytic leukemia
KR20230080437A (ko) 2020-10-02 2023-06-07 젠맵 에이/에스 Ror2에 결합할 수 있는 항체 및 ror2 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
KR102671734B1 (ko) * 2021-04-13 2024-06-04 건국대학교 글로컬산학협력단 개과 동물의 CD3ε 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편
CA3213632A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
IL307821A (en) 2021-04-30 2023-12-01 Hoffmann La Roche Dosage for treatment with BISPIFIC ANTI-CD20/ANTI-CD3 antibody
AU2022268652A1 (en) 2021-05-07 2023-10-05 Genmab A/S PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING BISPECIFIC ANTIBODIES BINDING TO B7H4 and CD3
CN115558023A (zh) * 2021-07-02 2023-01-03 安源医药科技（上海）有限公司 抗cd3抗体及其用途
MX2024003615A (es) 2021-10-08 2024-04-09 Genmab As Anticuerpos que se unen al cumulo de diferenciacion 30 (cd30) y al cumulo de diferenciacion 3 (cd3).
US20230241211A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
US20230303693A1 (en) 2022-01-28 2023-09-28 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
US20230414750A1 (en) 2022-03-23 2023-12-28 Hoffmann-La Roche Inc. Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
WO2023198839A2 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
JP2024517042A (ja) 2022-04-13 2024-04-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体の薬学的組成物及び使用方法
TW202408554A (zh) * 2022-05-09 2024-03-01 大陸商杭州微諾邁博生物科技有限公司 包含多特異性抗體的治療劑及其在腫瘤治療中的應用
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer
WO2024094822A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating richter's syndrome
WO2024102948A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Celgene Corporation Fc receptor-homolog 5 (fcrh5) specific binding molecules and bispecific t-cell engaging antibodies including same and related methods

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
ES2246069T3 (es) 1997-05-02 2006-02-01 Genentech, Inc. Procedimiento de preparacion de anticuerpos multiespecificos que tienen componentes comunes y multimericos.
ATE276199T1 (de) 1999-02-03 2004-10-15 Biosante Pharmaceuticals Inc Methoden zur herstellung von therapeutische kalzium-phosphat partikeln
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
DE10043437A1 (de) 2000-09-04 2002-03-28 Horst Lindhofer Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen Antikörpern zur Behandlung von malignem Aszites
ES2368733T3 (es) 2002-07-18 2011-11-21 Merus B.V. Producción recombinante de mezclas de anticuerpos.
MXPA05004022A (es) 2002-10-17 2005-10-05 Genmab As Anticuerpos monoclonales humanos contra cd20.
EP2357201B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
EP1740946B1 (en) 2004-04-20 2013-11-06 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
US7741568B2 (en) 2005-01-13 2010-06-22 The Wiremold Company Downward facing receptacle assembly for cable raceway
AU2006210724A1 (en) * 2005-02-03 2006-08-10 Antitope Limited Human antibodies and proteins
CN101155832B (zh) 2005-02-08 2013-02-06 一般财团法人化学及血清疗法研究所 抗体的改良方法
CA2603408C (en) 2005-03-31 2018-08-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
BRPI0615026A8 (pt) 2005-08-19 2018-03-06 Abbott Lab imunoglobulina de domínio variável duplo e seus usos
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
ES2856451T3 (es) 2005-10-11 2021-09-27 Amgen Res Munich Gmbh Composiciones que comprenden anticuerpos específicos para diferentes especies, y usos de las mismas
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
AU2007227292B2 (en) 2006-03-17 2012-04-12 Biogen Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
JP5474531B2 (ja) 2006-03-24 2014-04-16 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 操作されたヘテロ二量体タンパク質ドメイン
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
KR101626988B1 (ko) * 2007-04-03 2016-06-02 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 종간 특이적 이중특이적인 결합제들
CN101687915B8 (zh) 2007-04-03 2018-08-03 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
CN107226864A (zh) 2007-06-21 2017-10-03 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
US8592562B2 (en) 2008-01-07 2013-11-26 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
WO2010015792A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Argenta Discovery Limited Nitrogen containing heterocyclic compounds useful as bifunctional modulators of m3 receptors and beta-2 receptors
DE102008039957A1 (de) 2008-08-27 2010-03-04 Continental Automotive Gmbh Verfahren zur Ermittlung eines Unfallschwerekriteriums mittels eines Beschleunigungssignals und eines Körperschallsignals
JP5397668B2 (ja) 2008-09-02 2014-01-22 ソニー株式会社 記憶素子および記憶装置
FR2935974B1 (fr) 2008-09-15 2010-10-08 Centre Nat Rech Scient Derives de metalloporphyrines, nanoparticules les comprenant
WO2010045340A1 (en) * 2008-10-14 2010-04-22 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods of humanizing and affinity-maturing antibodies
HUE043084T2 (hu) 2008-12-19 2019-08-28 Macrogenics Inc Kovalens diatestek és alkalmazásaik
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
DK2506871T3 (da) 2009-11-30 2017-01-02 Janssen Biotech Inc ANTISTOF-Fc-MUTANTER MED ABLATEREDE EFFEKTORFUNKTIONER
US8786135B2 (en) 2010-03-25 2014-07-22 Mitsubishi Electric Research Laboratories, Inc. Wireless energy transfer with anisotropic metamaterials
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
TWI653333B (zh) * 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
CA2796181C (en) 2010-04-20 2023-01-03 Genmab A/S Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
CA2797981C (en) 2010-05-14 2019-04-23 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
WO2011147986A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
ES2573135T3 (es) * 2010-07-14 2016-06-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Anticuerpo monoclonal anti-ADDL y usos del mismo
AR082693A1 (es) * 2010-08-17 2012-12-26 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 afucosilado con un anticuerpo anti-vegf
RU2013110876A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Рош Гликарт Аг Активируемые биспецифические антитела
KR101586128B1 (ko) 2010-08-24 2016-01-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 디술피드 안정화 ― Ｆｖ 단편을 포함하는 이중특이적 항체
CA2815266C (en) 2010-11-05 2023-09-05 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
CN103429737B (zh) * 2010-11-30 2020-07-14 中外制药株式会社 细胞毒诱导治疗剂
KR102003075B1 (ko) * 2011-02-23 2019-07-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 인간 il33r에 대한 항체 및 이의 용도
JP2014514314A (ja) * 2011-04-20 2014-06-19 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２およびｃｄ３に対する二重特異性抗体
EP2714733B1 (en) 2011-05-21 2019-01-23 MacroGenics, Inc. Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
CN102250246A (zh) 2011-06-10 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
JP6475017B2 (ja) 2011-10-27 2019-02-27 ゲンマブ エー／エス ヘテロ二量体タンパク質の作出
KR102086061B1 (ko) * 2012-01-27 2020-03-11 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 알파-시누클레인을 인식하는 인간화된 항체
EP2869845B1 (en) * 2012-07-06 2019-08-28 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
PL3016681T3 (pl) 2013-07-05 2020-06-15 Genmab A/S Humanizowane lub chimeryczne przeciwciała CD3
NZ721309A (en) * 2013-12-17 2019-11-29 Genentech Inc Anti-cd3 antibodies and methods of use
CN107660214B (zh) * 2015-01-08 2022-02-08 根马布股份公司 针对cd3和cd20的双特异性抗体
NZ739028A (en) 2015-07-15 2023-05-26 Genmab As Humanized or chimeric cd3 antibodies
CH713600A2 (de) 2017-03-21 2018-09-28 Digi Sens Ag Vorrichtung und Verfahren zum Messen einer Last.

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201510739TA (en) 2016-01-28
MX2015017487A (es) 2016-03-21
CY1122840T1 (el) 2021-05-05
IL311371B1 (en) 2024-05-01
CN118063621A (zh) 2024-05-24
IL311371A (en) 2014-04-01
EP3091998A1 (en) 2016-11-16
JP6619342B2 (ja) 2019-12-11
ZA201800385B (en) 2019-09-25
JP2022163009A (ja) 2022-10-25
CN106255507A (zh) 2016-12-21
JP7104000B2 (ja) 2022-07-20
AU2020202792A1 (en) 2020-05-21
IL276530A (en) 2020-09-30
JP2020048564A (ja) 2020-04-02
CN113248615A (zh) 2021-08-13
AU2020202792B9 (en) 2022-07-07
KR20160027177A (ko) 2016-03-09
KR20220025210A (ko) 2022-03-03
SI3016681T1 (sl) 2020-04-30
IL276530B (en) 2022-03-01
JP2022101539A (ja) 2022-07-06
LT3016681T (lt) 2020-03-25
JP2016529882A (ja) 2016-09-29
HUE048722T2 (hu) 2020-08-28
AU2020202792B2 (en) 2022-06-23
KR102363220B1 (ko) 2022-02-15
ES2776706T3 (es) 2020-07-31
IL243127B (en) 2020-08-31
US20200123255A1 (en) 2020-04-23
DK3016681T5 (da) 2020-05-04
US11613575B2 (en) 2023-03-28
ME03675B (me) 2020-10-20
RS60131B1 (sr) 2020-05-29
AU2022203851A1 (en) 2022-06-23
CN105722529A (zh) 2016-06-29
HRP20200382T1 (hr) 2020-06-12
KR20230073341A (ko) 2023-05-25
BR112015032986A2 (pt) 2017-08-22
JP6546162B2 (ja) 2019-07-17
HK1231369A1 (zh) 2017-12-22
WO2015104346A1 (en) 2015-07-16
EP4249515A3 (en) 2023-11-15
SG10201800982QA (en) 2018-03-28
CN105722529B (zh) 2021-06-08
US10407501B2 (en) 2019-09-10
US20160168247A1 (en) 2016-06-16
EP3693385A1 (en) 2020-08-12
US20230374131A1 (en) 2023-11-23
US20160333095A1 (en) 2016-11-17
EA201690167A1 (ru) 2016-06-30
DK3016681T3 (da) 2020-03-09
JP2020005635A (ja) 2020-01-16
BR122023002590B1 (pt) 2023-12-05
JP7208129B2 (ja) 2023-01-18
AU2014286116A1 (en) 2016-02-04
MX2020004503A (es) 2020-08-13
US20200199229A1 (en) 2020-06-25
KR102531517B1 (ko) 2023-05-12
IL290613B1 (en) 2024-07-01
US10465006B2 (en) 2019-11-05
EP3016681A1 (en) 2016-05-11
PT3016681T (pt) 2020-03-26
EP4249515A2 (en) 2023-09-27
PL3016681T3 (pl) 2020-06-15
CA2915575A1 (en) 2015-01-08
NZ715896A (en) 2022-02-25
EP3016681B1 (en) 2019-12-18
JP2017505121A (ja) 2017-02-16
IL290613A (en) 2022-04-01
WO2015001085A1 (en) 2015-01-08
JP2024026114A (ja) 2024-02-28
JP7389833B2 (ja) 2023-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA119646C2 (uk) Гуманізоване антитіло, що зв`язується з сd3 людини
EP3227340B1 (en) Humanized anti-trop-2 monoclonal antibodies and uses thereof
UA126441C2 (uk) Химерні антигенні рецептори, націлені на bcma, та способи їх застосування
US8933202B2 (en) AXL antibodies
UA126964C2 (uk) Конструкція біспецифічного антитіла, що зв'язується з дпб3 (dll3) і кд3 (cd3)
CN107810011A (zh) 使用抗ox40抗体治疗癌症的方法
UA124417C2 (uk) БІСПЕЦИФІЧНИЙ КОНСТРУКТ АНТИТІЛА, ЩО ЗВ'ЯЗУЄ EGFRvIII І CD3
CN102958534B (zh) Notch1结合剂及其使用方法
UA128057C2 (uk) Гуманізоване або химерне антитіло, яке зв'язує cd3 людини
CN109715667A (zh) 抗-gprc5d抗体、结合gprc5d和cd3的双特异性抗原结合分子及其用途
UA125580C2 (uk) Конструкція біспецифічного антитіла, що зв'язується з мезотеліном і кд3 (cd3)
UA118749C2 (uk) Конструкція антитіла до cdh19 і cd3
CN110505883A (zh) 供治疗癌症的方法中使用的白介素-2免疫缀合物,cd40激动剂,和任选地pd-1轴结合拮抗剂
UA126275C2 (uk) Конструкція антитіла для cd70 та cd3
CN108368179A (zh) 使用pd-1轴结合拮抗剂和抗cea/抗cd3双特异性抗体治疗cea阳性癌症的方法
CN107922471A (zh) 靶向ny‑eso‑1肽/mhc复合物的构建体及其用途
CN107428835A (zh) 抗cd3抗体、抗cd123抗体和与cd3和/或cd123特异性结合的双特异性抗体
UA119659C2 (uk) Антитіло до pd-1, його антигензв'язуючий фрагмент та їхнє медичне застосування
CN106103486A (zh) 抗ox40抗体和使用方法
EA012835B1 (ru) Антитела против фактора роста эндотелия сосудов (vegf) и способы их применения
UA114883C2 (uk) Антитіло до рецептора епідермального фактора росту-3 (her3)
CN110520441A (zh) 抗TGF-β抗体及其用途
CN110267678A (zh) 抗mic抗体和使用方法
CN104080809A (zh) 抗cd134(ox40)抗体及其应用
CN108373504A (zh) Cd24特异性抗体和抗cd24-car-t细胞