CN103204935B - 具有改变的细胞信号传导活性的修饰的抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及修饰的抗原结合分子(ABMs)。在具体的实施方案中,本发明涉及重组单克隆抗体或片段,包括嵌合的,灵长类化或人源化的抗体或片段,其具有改变的由靶抗原介导细胞信号传导活性的能力,和/或改变的介导一个或多个靶抗原交联的能力。另外,本发明涉及编码所述修饰的ABM的核酸分子,以及包含所述核酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生本发明修饰的ABM的方法,以及在治疗疾病中应用这些修饰的ABM的方法。另外,本发明涉及具有改善的治疗特性的具有修饰的糖基化的修饰ABM,所述修饰的ABM包括具有增强的Fc受体结合和增加的效应子功能的抗体。

Description

具有改变的细胞信号传导活性的修饰的抗原结合分子
本申请是国际申请号PCT/TR2006/003294,国际申请日为2006年8月25日,进入中国国家阶段日期为2008年4月18日,中国申请号为200680038849.1的分案申请。
发明背景
发明领域
本发明涉及抗原结合分子(ABMs)。在具体的实施方案中,本发明涉及重组单克隆抗体或片段,包括嵌合的,灵长类化(primatized)的或人源化的抗体或片段,其具有改变的介导靶抗原的细胞信号传导(signaling)活性的能力,和/或改变的介导一个或多个靶抗原交联的能力。另外,本发明涉及编码所述ABMs的核酸分子,以及包含所述核酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生本发明的ABMs的方法,以及在疾病治疗中利用这些ABMs的方法。另外,本发明涉及具有提高的治疗特性的具有修饰的糖基化的ABMs,其包括具有增加的Fc受体结合和增加的效应子功能的抗体。
背景技术
抗体,也称为免疫球蛋白,其具有包括四条多肽链的基本结构:两条相同的重(H)链,与之成对的两条相同的轻(L)链。每条重链和轻链包括可变区(分别地,VH和VL)和恒定区(分别地,CH和CL)。CH区域具有3个结构域(CH1,CH2,和CH3),而较小的CL区域仅具有1个结构域(简单地称为CL)。每个VH和VL区域包括3个互补决定区(CDRs),其侧邻处于下列顺序的四个构架区域:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。CDRs是V区域最可变的部分,并且决定抗体的抗原特异性。总之,一对VH和VL形成抗原结合位点,并且二价抗体具有两个这样的抗原结合位点。应该注意的是该基本抗体结构可以通过多种方法修饰(例如,通过产生该结构的片段),而仍然保持或甚至改善所需的功能和/或抗原结合活性。
VH和CH1结构域之间的界面包含保守的氨基酸。可以将该接触区域描述为“分子球窝关节”。该关节决定了“肘运动”以及还有所谓的VH和VL区域相对于CH1和CL区域的“肘角度”,并且防止在V和C区域间形成刚性接触(Lesk和Chothia,自然(Nature)(1988)335(8):188-190))。所述球窝关节的窝通过VH构架区中的氨基酸残基,特别是在位置11,110和112的那些形成(按照Kabat等,(1987)免疫性靶标的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第4版(公共健康服务部(Public Health Services),NIH,华盛顿(Washington),DC)的编号系统)。(参见Lesk和Chothia,自然(Nature)(1988)335(8):188-190.)所述球窝关节的“球”在CH1结构域中,并且主要通过位置148和149的两个氨基酸形成(参见Landolfi等,免疫学杂志(J.Immunol.)(2001)166:1748-1754;Lesk和Chothia,自然(Nature)(1988)335(8):188-190)(其中将形成所述“球”的CH1残基分别编号为149和150))。这些位置的氨基酸的区别可以指示在V和C区域间形成的肘角度,以及由此的VH-VL二聚体的方向(参见Lesk和Chothia,自然(Nature)(1988)335(8):188-190)。占据这些VH位置的氨基酸残基在全免疫球蛋白序列上是高度保守(参见,例如Lesk和Chothia,自然(Nature)(1988)335(8):188-190)。该关节中所涉及的所有残基(例如,位置11,110,112,148,和149)都位于构架区(例如,残基11,110,和112)或恒定结构域(例如,按照Landolfi等,148和149;按照Lesk和Chothia,149和150)中,并且似乎不直接涉及于抗原结合中。Landolfi等,免疫学杂志(J. Immunol.)(2001)166:1748-1754。
除介导效应子功能,如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)外,单克隆抗体可以通过诱导或抑制细胞信号传导途径调节细胞功能。例如,已显示出单克隆抗体介导抗原交联,激活死亡受体(例如,通过促进受体的低聚作用或模仿配体的结合),并阻断细胞生长分化和/或增殖途径中配体介导的细胞信号传导(参见,例如Ludwig等,致癌基因(Oncogene)(2003)22:9097-9106)。
程序性细胞死亡(Apoptosis或programmed cell death)可以通过若干不同的机制触发。例如,通过细胞膜结合的“死亡受体”,例如肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员的信号传导途径活化可以导致程序性细胞死亡的诱发。同样地,表面抗原,例如CD20的二聚作用或交联也可以诱导程序性细胞死亡(参见,例如,Ludwig等,致癌基因(Oncogene)(2003)22:9097-9106)。
仍旧存在对增强的靶向与细胞信号传导有关的抗原的治疗方法的需要,以治疗灵长类动物包括,但不限于,人的疾病,所述细胞信号传导包括,但不限于,程序性细胞死亡的诱导。
发明简述
认识到修饰的抗原结合分子(ABMs)巨大的治疗潜力,所述ABMs具有改变的介导靶抗原的细胞信号传导活性的能力,和/或改变的介导一个或多个靶抗原交联的能力,本发明人开发了所述ABMs,以及产生所述ABMs的方法。此外,该方法还涉及产生重组、嵌合抗体或其嵌合片段。这些修饰的ABMs的功效进一步通过改造抗体Fc区域的糖基化模式来增强。
因此,在一个方面。本发明涉及包括重链或轻链可变区的修饰抗原结合分子,所述重链或轻链可变区与母体抗原结合分子的重链或轻链的可变区相比较,在所述重链或轻链的可变区的至少一个构架区中包括至少一个氨基酸残基的替换,其中当所述修饰的抗原结合分子与所述靶抗原复合时,所述替换导致靶抗原改变的细胞信号传导活性。在具体实施方案中,所述改变的细胞信号传导活性是程序性细胞死亡。在一个实施方案中,修饰的抗原结合分子具有增强的诱导程序性细胞死亡的能力。在另一个实施方案中,修饰的抗原结合分子具有降低的诱导程序性细胞死亡的能力。
在另一个方面,本发明涉及包括重链或轻链可变区的修饰抗原结合分子,所述重链或轻链可变区与母体抗原结合分子的重链或轻链的可变区相比较,在所述重链或轻链可变区的至少一个构架区中包括至少一个氨基酸残基的替换,其中作为所述替换的结果,所述修饰的抗原结合分子具有改变的介导一个或多个靶抗原交联的能力。
在一个实施方案中,本发明修饰的抗原结合分子包括重链可变区的FR1中的替换。在另一个实施方案中,所述替换包括选自由至少2,至少3或至少4个氨基酸组成的组中的取代。
在一个实施方案中,所述替换包括重链可变区的整个FR1的取代。在进一步的实施方案中,所述整个FR1被种系VH FR1所取代。在具体的实施方案中,所述种系VH FR1包括Kabat位置8-13的氨基酸序列,其选自由下列各项组成的组:SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74,SEQ IDNO:75,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,和SEQ IDNO:105。
在一个实施方案中,修饰的ABM包括重链可变区的FR1中的替换,其包括位于Kabat位置8,9,10,11,12,或13的一个或多个的氨基酸残基的取代。
在特殊的实施方案中,重链可变区的FR1中的替换包括位于Kabat位置8的氨基酸残基的取代。在更具体的实施方案中,重链可变区的FR1中的替换包括将位于Kabat位置8的氨基酸残基取代为选自由精氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸残基。
在另一个具体的实施方案中,重链可变区的FR1中的替换包括位于Kabat位置9的氨基酸残基的取代。在更具体的实施方案中,重链可变区的FR1中的替换包括将位于Kabat位置9的氨基酸残基取代为选自由下列各项组成的组的氨基酸残基:丙氨酸,脯氨酸,甘氨酸,丝氨酸和组氨酸。
在一个具体的实施方案中,重链可变区的FR1中的替换包括位于Kabat位置10的氨基酸残基的取代。在更具体的实施方案中,该替换包括将位于Kabat位置10的氨基酸残基取代为选自由下列各项组成的组的氨基酸残基:谷氨酸,苏氨酸,甘氨酸,丙氨酸和缬氨酸。
在另一个具体的实施方案中,重链可变区的FR1中的替换包括位于Kabat位置11的氨基酸残基的取代。在具体的实施方案中,该替换包括将位于Kabat位置11的氨基酸残基取代为除亮氨酸以外的任意氨基酸。在另一个具体的实施方案中,该替换包括将位于Kabat位置11的氨基酸残基取代为非极性氨基酸。在另一个特定的实施方案中,该替换包括将位于Kabat位置11的氨基酸残基取代为选自由下列各项组成的组的氨基酸残基:缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,丝氨酸和苯丙氨酸。在具体的实施方案中,该替换包括将位于Kabat位置11的氨基酸残基取代为亮氨酸。
在另一个具体的实施方案中,重链可变区的FR1中的替换包括位于Kabat位置12的氨基酸残基的取代。在特定的实施方案中,该替换包括将位于Kabat位置12的氨基酸残基取代为选自由下列各项组成的组的氨基酸残基:赖氨酸,缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸。
在另一个特殊的实施方案中,重链可变区的FR1中的替换包括位于Kabat位置11和12的氨基酸残基的取代。在具体的实施方案中,该替换包括将位于Kabat位置11的氨基酸残基取代为缬氨酸和将位于Kabat位置12的氨基酸残基取代为赖氨酸;将位于Kabat位置11的氨基酸残基取代为亮氨酸和将位于Kabat位置12的氨基酸残基取代为缬氨酸;将位于Kabat位置11的氨基酸残基取代为缬氨酸和将位于Kabat位置12的氨基酸残基取代为异亮氨酸;或将位于Kabat位置11的氨基酸残基取代为缬氨酸和将位于Kabat位置12的氨基酸残基取代为缬氨酸。
在另一个特殊的实施方案中,重链可变区的FR1中的替换包括位于Kabat位置13的氨基酸残基的取代。在特定的实施方案中,该替换包括将位于Kabat位置13的氨基酸残基取代为选自由下列各项组成的组的氨基酸残基:赖氨酸,精氨酸,谷氨酰胺和谷氨酸。
在本发明的另一个方面中,ABM的替换包括重链可变区的FR4中的至少一个氨基酸残基取代。在特殊的实施方案中,重链可变区的FR4中的替换包括Kabat位置110或112的一个或多个的氨基酸残基的取代。
在特殊的实施方案中,该替换包括将位于Kabat位置110的氨基酸残基取代为选自由下列各项组成的组的氨基酸:亮氨酸,异亮氨酸,苏氨酸或丝氨酸。在更特定的实施方案中,该替换包括将位于Kabat位置110的氨基酸残基取代为异亮氨酸。
在另一个实施方案中,该替换包括将位于Kabat位置112的氨基酸残基取代为选自由下列各项组成的组的氨基酸:缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸或苏氨酸。在更特定的实施方案中,该替换包括将位于Kabat位置112的氨基酸残基取代为异亮氨酸。
在一个方面。本发明进一步涉及包括CH1结构域的修饰抗原结合分子,所述CH1结构域与母体多肽的CH1结构域相比较,包括至少一个氨基酸残基的替换,其中当修饰的抗原结合分子与靶抗原复合时,所述替换导致该靶抗原改变的细胞信号传导活性。
在另一个方面,本发明进一步涉及包括CH1结构域的修饰的抗原结合分子,所述CH1结构域与母体多肽的CH1结构域相比较,包括至少一个氨基酸残基的替换,其中作为该替换的结果,所述抗原结合分子具有改变的介导一个或多个靶抗原交联的能力。
在特殊的实施方案中,CH1中的替换包括位于位置148,149或150的一个或多个处的氨基酸残基的取代。在更特定的实施方案中,该替换包括将位置149的氨基酸残基取代为亮氨酸。在另一个实施方案中,该替换包括整个CH1结构域的取代。在另一个实施方案中,该替换包括将IgGCH1结构域取代为IgM CH1结构域。
在另一个方面,本发明涉及包含至少一个氨基酸替换的修饰抗原结合分子,其中所述替换包括位于可变和恒定区之间界面区域中的轻链中的氨基酸残基取代,其中当所述修饰的抗原结合分子与所述靶抗原复合时,所述替换导致靶抗原结合分子的改变的细胞信号传导活性。
在另一个方面。本发明涉及包含至少一个氨基酸替换的修饰的抗原结合分子,其中所述替换包括位于可变和恒定区之间界面区域中的轻链中氨基酸残基的取代,其中作为该替换的结果,所述修饰的抗原结合分子具有改变的介导一个或多个靶抗原交联的能力。
在具体的实施方案中,ABM的轻链可变区中的替换包括位于Kabat位置10,12,39,40,41,80,81,83,84,103,105,106,和108的一个或多个处的氨基酸的取代。在具体的实施方案中,ABM的轻链可变区中的替换包括位于Kabat位置40,80,83,105,或106的一个或多个处的氨基酸残基的取代。
在另一个具体的实施方案中,ABM的轻链中的替换包括将位于Kabat位置40,80,83,105,或106的一个或多个处的氨基酸残基取代为非极性氨基酸。
在另一个具体的实施方案中,ABM的轻链中的替换包括将位于Kabat位置40的氨基酸残基取代为丙氨酸。
在另一个具体的实施方案中,ABM的轻链中的替换包括将位于Kabat位置80的氨基酸残基取代为脯氨酸。
在另一个具体的实施方案中,ABM的轻链中的替换包括将位于Kabat位置83的氨基酸残基取代为苯丙氨酸。
在另一个具体的实施方案中,ABM的轻链中的替换包括将位于Kabat位置105的氨基酸残基取代为丙氨酸。
在另一个具体的实施方案中,ABM的轻链中的替换包括将位于Kabat位置106的氨基酸残基取代为丙氨酸。在更具体的实施方案中,ABM的轻链中的替换包括位于Kabat位置106的氨基酸残基的取代,其中减弱了抗原结合分子诱导程序性细胞死亡的能力。
在一些实施方案中,本发明的替换包括上述重链和/或轻链可变和/或恒定区中任何氨基酸残基取代的组合。
在一个方面,当修饰的ABM与靶抗原复合时,本发明的修饰的ABMs中的氨基酸替换导致该靶抗原改变的细胞信号传导活性。
在本发明的一个方面,改变的细胞信号传导活性是增强的激动剂活性。在一个实施方案中,该增强的激动剂活性选自由下列各项组成的组:程序性细胞死亡的诱导和细胞分化的诱导。
在本发明的另一个方面,改变的细胞信号传导活性是增强的拮抗剂活性。在一个实施方案中,该拮抗剂活性是细胞信号传导途径的阻断,所述细胞信号传导途径选自由下列各项组成的组:细胞生存,细胞生长,细胞增殖和血管发生。
在进一步的方面,本发明修饰的抗原结合分子与人CD20特异性结合。在另一个方面,该修饰的抗原结合分子与人TNF受体超家族的成员特异性结合。在具体的实施方案中,TNF受体超家族选自由下列各项组成的组:TNFR1,CD95,TRAILR1,TRAILR2,EDAR,和p75NGFR。
在本发明的另一个方面,修饰的抗原结合分子与受体酪氨酸激酶特异性结合。在具体的实施方案中,受体酪氨酸激酶选自由下列各项组成的组:HER1(EGFR1),HER2/neu,HER3,HER4,IGF-1R,FGFR,PDGFR,VEGFR1,VEGFR2,和VEGFR3。在更具体的实施方案中,受体酪氨酸激酶是HER1(EGFR1)。
在另一个方面,本发明进一步涉及修饰的ABM,其可以选自,但不限于,由下列各项组成的组:完整抗体,Fab片段或其融合蛋白,F(ab′)2片段或其融合蛋白,微型抗体(minibody),双抗体,三链抗体和四链抗体。在具体的实施方案中,修饰的ABM是嵌合或完全人的。在更具体的实施方案中,嵌合的修饰ABM是人源化的。在另一个具体的实施方案中,修饰的ABM是多特异性的。在更具体的实施方案中,修饰的ABM是双特异性的。
在另一个方面,按照本发明的母体抗原结合分子包括重链可变区,所述重链可变区选自由下列各项组成的组:SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ IDNO:61,和SEQ ID NO:62。
在另一个方面,按照本发明的母体抗原结合分子包括轻链,所述轻链选自由下列各项组成的组:SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:130,SEQ IDNO:131,SEQ ID NO:132,SEQ ID NO:133,和SEQ ID NO:134。
在进一步的方面,本发明还涉及进一步包括人Fc区域的修饰ABM。按照一个实施方案,已将修饰的ABM的Fc区域修饰为具有改变的寡糖。在更具体的实施方案中,已将Fc区域修饰为与未修饰Fc区域相比具有减少比例的岩藻糖残基。在另一个具体的实施方案中,Fc区域与未修饰的Fc区域相比,具有增高比例的等分寡糖。在另一个具体实施方案中,修饰的寡糖是等分的复合物。在另一个特定的实施方案中,修饰的寡糖在Fc区域中与未修饰的Fc区域相比具有增加比例的等分的非岩藻糖基化的寡糖。在另一个特定的实施方案中,Fc区域在修饰的Fc区域中与未修饰的Fc区域相比,具有增高的GlcNAc残基相对于岩藻糖残基的比率。在另一个特定的实施方案中,等分的非岩藻糖基化的寡糖是杂化物。在另一个特定的实施方案中,等分非岩藻糖基化的寡糖是复合物。
按照另一个方面,按照本发明的靶抗原是细胞表面受体,其选自由下列各项组成的组:膜输送受体,G-蛋白-连接的受体,和酶-连接的受体。在具体的实施方案中,膜输送受体是通道-连接的受体。在另一个具体的实施方案中,酶-连接的受体选自由下列各项组成的组:受体鸟苷酸环化酶,受体酪氨酸激酶,酪氨酸激酶相关受体,受体酪氨酸磷酸酶和受体丝氨酸/苏氨酸激酶。
在另一个方面,本发明涉及包含本发明修饰的ABM的药物组合物。预期该药物组合物可以进一步包含药用载体,佐剂或其组合。
本发明还涉及治疗患者中可以通过改变的细胞信号传导活性治疗的疾病的方法,该方法包括向所述患者施用治疗有效量的药物组合物,所述药物组合物包含按照本发明的修饰ABM和药用载体。
在另一个方面,本发明涉及分离的多核苷酸,其编码包括重链或轻链可变区的多肽,其中所述重链或轻链可变区与母体重链或轻链可变区相比,在至少一个构架区包括至少一个氨基酸残基替换,并且其中当所述多肽与靶抗原复合时,所述替换导致该靶抗原改变的细胞信号传导活性。
在进一步的方面中,本发明涉及分离的多核苷酸,其编码包括重链或轻链可变区的多肽,其中所述重链或轻链可变区与母体重链或轻链可变区相比,在至少一个构架区包括至少一个氨基酸残基替换,并且其中作为该替换的结果,所述多肽具有改变的介导一个或多个靶抗原交联的能力。
在一个实施方案中,按照本发明的多核苷酸编码这样的多肽,其中所述多肽包括抗体重链或轻链。在另一个实施方案中,按照本发明的多核苷酸编码这样的多肽,其中所述多肽包括融合蛋白。本发明还涉及由本发明的多核苷酸编码的多肽。
本发明还涉及包含按照本发明的多核苷酸的载体和包含该载体的宿主细胞。
本发明进一步涉及编码包括重链或轻链可变区的多肽的多核苷酸,所述重链或轻链可变区与母体抗原结合分子的重链或轻链可变区相比,在所述重链或轻链可变区的至少一个构架区包括至少一个氨基酸残基替换,其中所述多肽是按照本发明的修饰ABM。
本发明还涉及宿主细胞,其被改造为表达至少一种编码多肽的核酸,所述多肽具有一定量的β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性,该量足以修饰由所述宿主细胞产生的多肽Fc区域中的寡糖,其中所述多肽是按照本发明的修饰ABM。在一个实施方案中,具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽是融合多肽。在特殊的实施方案中,所述融合多肽包括β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III的催化结构域。在另一个实施方案中,所述融合多肽进一步包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域。高尔基体定位结构域可以选自,但不限于,由下列各项组成的组:甘露糖苷酶II的定位结构域,β(1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶I的定位结构域,β(1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶II的定位结构域,甘露糖苷酶I的定位结构域,和α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
在另一个实施方案中,修饰的ABM包括与人IgG的Fc区域等价的区域。
在进一步的实施方案中,作为寡糖修饰的结果,由本发明的宿主细胞产生的修饰ABM表现出增强的Fc受体结合亲和性和/或增强的效应子功能。按照本发明,增强的效应子功能选自由下列各项组成的组:增强的Fc介导的细胞的细胞毒性,与NK细胞增强的结合,与巨噬细胞增强的结合,与多形核细胞增强的结合,与单核细胞增强的结合,增强的诱导程序性细胞死亡的定向信号传导,增强的树突细胞的成熟,和增强的T细胞引发。在一个实施方案中,Fc受体是Fcγ激活受体。在另一个实施方案中,Fc受体是FcγRIIIA受体。
本发明的宿主细胞可以选自包括,但不限于下列各项组成的组:CHO细胞,HEK293-EBNA细胞,BHK细胞,NSO细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞。
在另一个方面,本发明涉及用于产生包括重链或轻链可变区的修饰的ABM的方法,其中所述重链或轻链可变区与母体ABM的重链或轻链可变区相比,在所述重链或轻链可变区的至少一个构架区中包括至少一个氨基酸残基替换,其中当所述修饰的ABM与靶抗原复合时,所述替换导致该靶抗原改变的细胞信号传导活性,所述方法包括:(i)在允许多核苷酸表达的条件下培养本发明的宿主细胞;和(ii)从培养基中回收修饰的ABM。
在进一步的方面,本发明涉及用于产生包括重链或轻链可变区的修饰ABM的方法,其中所述重链或轻链可变区与母体抗原结合分子的重链或轻链可变区相比,在所述重链或轻链可变区的至少一个构架区中包括至少一个氨基酸残基替换,其中作为该替换的结果,所述修饰的抗原结合分子具有改变的介导交联的能力,所述方法包括:(i)在允许多核苷酸表达的条件下培养本发明的宿主细胞;和(ii)从培养基中回收修饰的ABM。
在进一步的方面,本发明涉及用于改变ABM以促进包含ABM靶抗原的复合物形成的能力的方法,该方法包括:取代母体ABM的至少一个重链或轻链可变区构架区中的至少一个氨基酸残基。在一个实施方案中,ABM在表达靶抗原的细胞中增加程序性细胞死亡的诱导。在另一个实施方案中,ABM在表达靶抗原的细胞中增加细胞分化的诱导。
本发明还涉及用于在细胞中诱导程序性细胞死亡的方法,该方法包括用包括重链或轻链可变区的修饰ABM接触所述细胞,所述重链或轻链可变区与母体ABM的重链或轻链可变区相比,在所述重链或轻链可变区的至少一个构架区中包括至少一个氨基酸残基替换,其中所述修饰的ABM与母体多肽相比,具有增强的诱导程序性细胞死亡的能力。在具体的实施方案中,所述细胞是肿瘤细胞。在一个实施方案中,所述接触发生在体内。
在另一个方面,本发明还涉及用于治疗可以通过靶抗原改变的细胞信号传导活性治疗的疾病或病症的方法,该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的修饰的ABM,其中所述修饰的ABM包括重链或轻链可变区,所述重链或轻链可变区与母体ABM的重链或轻链可变区相比,在重链或轻链可变区的至少一个构架区中包括至少一个氨基酸残基替换,并且其中当所述修饰的ABM与靶抗原复合时,所述替换导致该靶抗原改变的细胞信号传导活性。
在进一步的方面,本发明涉及用于治疗可以通过改变的介导一个或多个靶抗原交联的能力治疗的疾病或病症的方法,该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的修饰的ABM,其中所述修饰的ABM包括重链或轻链可变区,所述重链或轻链可变区与母体ABM的重链或轻链可变区相比,在重链或轻链可变区的至少一个构架区中包括至少一个氨基酸残基替换,并且其中作为该替换的结果,所述修饰的ABM具有改变的介导一个或多个靶抗原交联的能力。
在具体的实施方案中,按照本发明施用的修饰的ABM包括重链可变区,所述重链可变区其选自由下列各项组成的组:SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:36,和SEQ ID NO:38。
在一个方面,将利用本发明的修饰的ABM治疗的疾病或病症是细胞增殖病症。在一个实施方案中,细胞增殖病症是癌症。在另一个方面,将利用本发明修饰的ABM治疗的疾病或病症是B细胞病症。在特定的实施方案中,B细胞病症是B细胞淋巴瘤。
本发明还涉及按照本发明的修饰的ABM用于制备治疗或预防癌症药物的应用。
在具体的实施方案中,本发明还涉及按照本发明的修饰的ABM用于制备治疗或预防癌症药物的应用,其中所述癌症选自由下列各项组成的组:B细胞淋巴瘤,乳腺癌,膀胱癌,头和颈部癌症,皮肤癌,胰腺癌,肺癌,卵巢癌,结肠癌,前列腺癌,肾癌和脑癌。
在另一个具体的实施方案中,本发明还涉及按照本发明的修饰的ABM用于制备治疗或预防癌症药物的应用,其中所述抗原结合分子以约1.0mg/kg-约15mg/kg的治疗有效量使用。在进一步的实施方案中,治疗有效量是约1.5mg/kg-约12mg/kg。在进一步的实施方案中,治疗有效量是约1.5mg/kg-约4.5mg/kg。在进一步的实施方案中,治疗有效量是约4.5mg/kg-约12mg/kg。在进一步的实施方案中,治疗有效量是约1.5mg/kg。在进一步的实施方案中,治疗有效量是约4.5mg/kg。在进一步的实施方案中,治疗有效量是约12mg/kg。
本发明还涉及用于治疗或预防癌症的方法,其包括向需要其的患者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在具体的实施方案中,癌症选自由下列各项组成的组:B细胞淋巴瘤,乳腺癌,膀胱癌,头和颈部癌症,皮肤癌,胰腺癌,肺癌,卵巢癌,结肠癌,前列腺癌,肾癌和脑癌。
本发明还涉及用于治疗或预防癌症前期病症或病灶的方法,其包括向需要其的患者施用治疗有效量的权利要求85或158的药物组合物。在特殊的实施方案中,癌症前期病症或病灶选自由下列各项组成的组:口腔粘膜白斑病,光化性角化病(日光性角化病),结肠或直肠癌症前期息肉,胃上皮发育不良,腺瘤发育不良,遗传性非息肉性结肠癌综合征(HNPCC),巴雷特食道,膀胱发育不良,和癌症前期宫颈病症。
本发明还涉及为了用于治疗或预防癌症的本发明修饰的抗原结合分子。在特殊的实施方案中,癌症选自由下列各项组成的组:B细胞淋巴瘤,乳腺癌,膀胱癌,头和颈部癌症,皮肤癌,胰腺癌,肺癌,卵巢癌,结肠癌,前列腺癌,肾癌和脑癌。
本发明还涉及为了用于治疗或预防癌症前期病症或病灶的本发明修饰的抗原结合分子。在具体的实施方案中,癌症前期病症或病灶选自由下列各项组成的组:口腔粘膜白斑病,光化性角化病(日光性角化病),结肠或直肠癌症前期息肉,胃上皮发育不良,腺瘤发育不良,遗传性非息、肉性结肠癌综合征(HNPCC),巴雷特食道,膀胱发育不良,和癌症前期宫颈病症。
本发明还涉及这样的根据本发明的修饰的抗原结合分子,其用于治疗与改变的细胞信号传导活性和/或改变的一个或多个靶抗原的交联相关的病症。
附图简述
图1.多种抗CD20抗体重链可变区构建体的氨基酸序列的排比。单克隆抗体1F5的可变重链区的氨基酸序列用作参比序列。用阴影显示与1F5的氨基酸区别。
图2.不同的人源化抗CD20抗体与Raji B细胞的结合。母体(嵌合)B-ly1与那两个人源化重链变体,以及(人源化,非程序性细胞死亡的)B-HL8变体的那些衍生物进行比较,所述人源化重链变体被识别为诱导强大的程序性细胞死亡(BHH2和BHH6),所述B-HL8变体被假设为恢复该作用(B-HL11-17)。所有人源化重链变体与相同的BKV1人源化轻链变体配对。
图3.利妥昔单抗(O)和chB-ly1(Δ)与Raji B淋巴瘤细胞上CD20的结合。
图4.通过三种抗CD20抗体进行抗体依赖性程序性细胞死亡的比较。chB-ly1wt代表嵌合B-ly1抗体构建体,其具有鼠的可变区和人的恒定区。BHH2-BKV1代表人源化变体,其包含鼠的B-ly1CDRs和人的源自重链的VH1种类人种系V基因并且与BKV1人源化B-ly1轻链配对的构架区。BHL8-BKV1wt代表人源化变体,其包含鼠的B-ly1CDRs和人的源自2个不同人种系V基因,并且与BKV1人源化B-ly1轻链配对的构架区。
图5.通过5种B-ly1抗CD20抗体的人源化变体进行抗体依赖性程序性细胞死亡的比较。BHH2-BKV1代表人源化变体,其包含鼠的B-ly1CDRs和人的源自重链的VH1类(BHH2)并且与BKV1人源化B-ly1轻链配对的构架区。BHL8-BKV1wt代表人源化变体,其包含鼠的B-ly1CDRs和人的源自2个不同人种系V基因并且与BKV1人源化B-ly1轻链配对的构架区。BHL14-BKV1代表BHL8的衍生物,其在重链可变区Kabat位置12处具有缬氨酸到赖氨酸的替换,且在Kabat位置48处具有缬氨酸到甲硫氨酸的替换,并且与BKV1轻链构建体配对。BHL15-BKV1W1也源自BHL8,其在重链可变区Kabat位置16处具有甘氨酸到丝氨酸的替换,且在Kabat位置48处具有缬氨酸到甲硫氨酸的替换,并且与BKV1轻链构建体配对。BHL16-BKV1W1源自BHL8,其在重链可变区Kabat位置20处具有亮氨酸到缬氨酸的替换,且在Kabat位置48处具有缬氨酸到甲硫氨酸的替换,并且与BKV1轻链构建体配对。BHL17-BKV1W1源自BHL8,其在重链可变区Kabat位置48处具有缬氨酸到甲硫氨酸的替换,并且与BKV1轻链构建体配对。
图6.通过C2B8抗CD20单克隆抗体和B-ly1抗体的两种人源化变体,即BHH2-BKV1和BHL13-BKV1,在Z-138细胞内进行抗体依赖性程序性细胞死亡的比较。BHH2-BKV1代表人源化变体,其包含鼠的B-ly1CDRs和人的源自重链的VH1种类人种系V基因并且与BKV1人源化B-ly1轻链配对的构架区。BHL13-BKV1源自BHL8(见图5,见上),其在重链可变区Kabat位置11处具有亮氨酸到缬氨酸的替换,且在Kabat位置48处具有缬氨酸到甲硫氨酸的替换,并且与BKV1轻链配对。
图7.由三种不同种类FcγRIIIa-158V/F基因型的全血中的利妥昔单抗(◇)和chB-ly1(■)引起的B细胞损耗:(A)来自F/F供体的全血,对更低亲和性受体纯合;(B)来自F/V供体的全血,对亲和性受体杂合;和(C)来自V/V供体的全血,对更高亲和性受体纯合。
图8.糖改造的嵌合B-ly1抗体的MALDI-TOF模式图。(A)详细描述特异性峰百分比的表;(B)糖改造的嵌合B-ly1的光谱;(C)经Endo-H处理过的糖改造嵌合B-Ly1的光谱。
图9.不同的人源化抗CD20抗体与Raji B细胞的结合。在所有3个CDRs相同的条件下,B-HH2构建体和B-HL8和B-HL11构建体之间的区别位于构架1和2区。B-HL8和B-HL11具有源自任何VH3类的FR1和FR2序列,而完整的B-HH2构架是人VH1来源的。B-HL11是具有单一突变Glu1Gln的B-HL8的衍生物,其中Gln是B-HH2构建体中的氨基酸残基。这意味着Glu1Gln交换不改变结合亲和性或强度。B-HH2和B-HL8之间的其他区别是14个FR残基,其中的一个或多个影响该抗体的抗原结合表现。
图10.Raji靶细胞上人源化抗CD20抗体BHL4-BKV1的结合。B-HL4构建体通过将B-HH2的FR1取代为人种系序列IGHV1-45(Acc No X92209)的FR1,来源于B-HH2抗体。该构建体尽管仅在FR1内的4个位置具有不同的氨基酸,但却显示出被极大降低了的抗原结合能力。按照Kabat编号,这些残基位于位置2,14,28和30。在其中,位置28和30似乎是有影响力的位置,其原因在于它们是CDR1的Chothia定义的一部分。
图11.B-HH1,B-HH2,B-HH3(全部与BKV1人源化B-ly1轻链配对),和母体抗体B-ly1之间结合表现的比较。数据显示全部Abs表现出相似的EC50值,但是B-HH1构建体以比变体B-HH2和B-HH3更低的强度/化学计量结合。B-HH1可以通过其部分的人CDR1和CDR2区域(Kabat定义),以及位置28(Kabat编号)处的Ala/Thr多态性,与B-HH2和B-HH3相区别。这显示位置28,完整CDR1,和/或完整CDR2任一对于抗体/抗原相互作用很重要。
图12.B-HL1,B-HH1,和B-ly1母体抗体之间结合表现的比较。数据显示了B-HL1构建体中任意结合活性的缺乏,以及与B-ly1相比,B-HH1大约一半的结合强度/化学计量。B-HL1和B-HH1都是基于源自人VH1种类的受体构架而设计的。在其他区别中,B-HL1构建体的位置71(Kabat.编号)明显地不同,这显示出其对抗原结合推定的重要性。
图13.抗CD20抗体重链构建体B-HL2和B-HL3之间对其抗原结合表现的比较。在全部两种情形中,鼠的VL序列与人源化重链组合。数据显示B-HL2和B-HL3构建体不表现出CD-20的结合活性。
图14.抗CD20抗体对Z-138MCL细胞的程序性细胞死亡作用。
图15.抗CD20抗体的程序性细胞死亡。测定的详述:将5x105细胞/孔接种于24孔板中的培养基(5x105细胞/ml)中。向孔中加入最终浓度为10μg/ml的各种抗体,对于阴性对照加入PBS,或对于阳性对照加入5mM喜树碱(CPT)。过夜(o/n)培养样品(16小时),用AnnV-FITC染色,并且通过FACS进行分析。测定一式三份地进行。(*):被减去的单独PBS的信号(单独的PBS对于PR-1和Z-138细胞分别给出8%和2%的AnnV+)。所使用的抗体是:C2B8(嵌合的,非糖改造的);BHH2-BKV1(人源化的,非糖改造的)。注意:该测定不涉及任何其他效应细胞,仅是靶标加抗体或对照。
图16.由抗CD20抗体和免疫效应物细胞引起的靶细胞杀伤。测定的详细信息:通过过夜培养和由FACS进行的CD19+/CD3+的分析确定了正常全血中B细胞的损耗。利用PBMC作为效应物,以4小时的培养和25:1的效应子:靶标比,确定ADCC。通过相对于去污剂-裂解(100%)和无抗体的裂解(0%)的钙荧光素-保留测量靶标杀伤。所使用的抗体是:C2B8(嵌合的,非糖改造的形式);BHH2-BKV1-wt(BHH2-BKV1的人源化的,非糖改造形式);BHH2-BKV1-GE(BHH2-BKV1的人源化的,糖改造形式)。
图17.未修饰非糖改造BHH2-BKV1的人源化IgG1B-ly1抗人CD20抗体的PNGaseF-释放Fc-寡糖的MALDI/TOF-MS模式图。
图18.糖改造BHH2-BKV1g1的人源化IgG1B-ly1抗人CD20抗体的PNGaseF-释放Fc-寡糖的MALDI/TOF-MS模式图。糖改造是通过在宿主细胞中共表达抗体基因和编码具有β-1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnT-III)催化活性的酶的基因而进行的。
图19.糖改造BHH2-BKV1g2的人源化IgG1B-ly1抗人CD20抗体的PNGaseF-释放Fc-寡糖的MALDI/TOF-MS模式图。糖改造是通过在宿主细胞中共表达抗体基因以及编码具有β-1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnT-III)催化活性的酶和编码具有高尔基体α-甘露糖苷酶II催化活性的酶的基因而进行的。
图20.非糖改造和糖改造(g2形式;见图17-19的糖基化的模式图)抗体与呈现在表达重组CD16的CHO细胞表面上的人FcγRIIIa受体的结合。
图21.非Fc改造的和Fc改造的抗CD20抗体对Z-138MCL细胞的程序性细胞死亡作用。测定的详细信息:将5x105细胞/孔接种于24孔板中的培养基(5x105细胞/ml)中。向孔中加入最终浓度为10μg/ml的各种抗体,或对于阴性对照加入PBS。过夜培养样品(16小时),用AnnV-FITC染色,并且通过FACS进行分析。测定一式三份地进行。所使用的抗体是:C2B8=利妥昔单抗(嵌合的,非糖改造形式);BHH2-BKV1(人源化的,非糖改造的-关于糖改造模式,见图17-19);BHH2-BKV1g1(人源化的,糖改造的);BHH2-BKV1g2(人源化的,糖改造的)。注意:该测定不涉及任何其他效应细胞,仅是靶标加抗体或对照。(*):减去单独PBS的信号。
图22.不同的人源化抗CD20抗体与Raji B细胞的结合。人源化重链构建体BHH2与其衍生物BHH4和BHH7进行比较。还显示了变体,所述变体显示Kabat位置28和30(BHH8和BHH9)的影响。
图23.单一氨基酸交换通过Z-138MCL细胞上的抗CD20抗体对程序性细胞死亡的作用。测定的详细信息:将5x105细胞/孔接种于中24孔板的培养基(5x105细胞/ml)中。向孔中加入最终浓度为10μg/ml的各种抗体,或对于阴性对照(无Ab)加入PBS。过夜培养样品(16小时),用AnnV-FITC染色,并且通过FACS进行分析。测定一式三份地进行。所使用的抗体是:C2B8(嵌合的,非糖改造的),BHH2(人源化的,非糖改造的),BHH2-A(BHH2的衍生物,其在Kabat位置11处具有缬氨酸到亮氨酸的替换),和BHH2-B(BHH2的衍生物,其在Kabat位置12处具有赖氨酸到缬氨酸的替换),后三者与BKV1轻链配对。抗原结合的KD通过替换保持不变。注意:该测定不涉及任何其他效应细胞,仅是靶标加抗体或对照。
图24.单一氨基酸交换通过Z-138MCL细胞上先前的失活抗CD20抗体对程序性细胞死亡的作用。测定的详细信息:将5x105细胞/孔接种于24孔板中的培养基(5x105细胞/ml)中。向孔中加入最终浓度为10μg/ml的各种抗体,或对于阴性对照加入PBS。过夜培养样品(16小时),用AnnV-FITC染色,并且通过FACS进行分析。测定一式三份地进行。所使用的抗体是:C2B8(嵌合的,非糖改造的),BHL8(人源化的,非糖改造的),BHL13(BHL8的衍生物,其在Kabat位置11处具有亮氨酸到缬氨酸的替换,以及在Kabat位置48处具有缬氨酸到甲硫氨酸的替换),和BHL14(BHL8的衍生物,其在Kabat位置12处具有缬氨酸到赖氨酸的替换,以及在Kabat位置48处具有缬氨酸到甲硫氨酸的替换),后三者与BKV1轻链配对。注意:该测定不涉及任何其他效应细胞,仅是靶标加抗体或对照。
图25.轻链中单一氨基酸交换通过Z-138MCL细胞上的抗CD20抗体对程序性细胞死亡的作用。测定的详细信息:将5x105细胞/孔接种于24孔板中的培养基(5x105细胞/ml)中。向孔中加入10μg/ml最终浓度的各种抗体,对于阴性对照(无Ab)加入PBS,或对于阳性对照加入5mM喜树碱(CPT)。过夜培养样品(16小时),用AnnV-FITC染色,并且通过FACS进行分析。测定一式三份地进行。所使用的抗体是:BHH2-A(BHH2的衍生物,其在Kabat位置11处具有缬氨酸到亮氨酸的替换),其与BKV1轻链配对,BHH6(BHH2的衍生物,其在Kabat位置34处具有甲硫氨酸到异亮氨酸的替换),其与BKV1轻链配对,和与BKV14轻链(BKV1的衍生物,其在Kabat位置106处具有异亮氨酸到丙氨酸的替换)配对的BHH6。
图26.VH和CH1结构域之间界面处分子“球窝关节”的三维描述。
发明详述
除非另外如下和在本文中进行定义,术语在本文中的使用如同本领域中的一般用法。
用于本文时,术语抗原结合分子(ABM)在其最广泛的意义上指特异性结合于抗原决定子的分子。所谓“特异性结合”意指该结合对于抗原是选择性的并且可以与不需要的或非特异性相互作用区别开。用于本文时,术语修饰的抗原结合分子(或修饰的ABM)意欲指这样的ABM,其包括重链可变区和/或CH1区域中的至少一个氨基酸残基替换和/或轻链可变区和/或CL区域中的至少一个氨基酸残基替换。
用于本文时,术语抗体意欲包括完整抗体分子,以及具有Fc区域并保留结合特异性的抗体片段,和包括等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域并保留结合特异性的融合蛋白,所述完整抗体分子包括单克隆抗体,多克隆抗体和多特异性(例如,二特异性)的抗体。还包括保留结合特异性的抗体片段,其包括,但不限于,VH片段,VL片段,Fab片段,F(ab’)2片段,scFv片段,Fv片段,微型抗体,二抗体,三链抗体,和四链抗体(见,例如,Hudson和Souriau,自然医学(Nature Med.)9:129-134(2003),将其全部内容引入本文作为参考)。还包括人源化的,灵长类化的和嵌合的抗体。用于本文时,完整抗体指包括两条重链和两条轻链的免疫球蛋白分子,其中每条链包括可变区和恒定区。
用于本文时,术语可变区意指免疫球蛋白重链或轻链的N末端结构域。按照本发明的一个实施方案,修饰的ABM可以包括可变区的功能片段。
用于本文时,术语重链可变区意指免疫球蛋白重链的N末端结构域。在一个实例中,重链可变区通过Kabat位置1-113(如Kabat等,美国健康与人类服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services),“免疫性靶标的蛋白质的序列”(″Sequence ofProteins of Immunological Interest″)(1983)所指定地,在特殊残基处具有可能的插入)定义。按照本发明的一个实施方案,修饰的ABM可以包括重链可变区的功能片段。
用于本文时,术语重链恒定区意指免疫球蛋白重链的C末端结构域。存在5类天然存在的重链恒定区:IgA,IgG,IgE,IgD,和IgM。在一个实例中,重链恒定区包括CH1结构域,CH2结构域和CH3结构域。
用于本文时,术语CH1区域意指这样的免疫球蛋白重链仅从C末端到可变区和从N末端到铰链区的结构域。例如,在IgG类型的免疫球蛋白中,CH1通常由Kabat位置114-228定义。
用于本文时,术语程序性细胞死亡意指程序性的细胞死亡,其由某些细胞事件表征,所述细胞事件诸如细胞核断裂和/或通过浓缩细胞质、质膜和/或细胞器形成程序性细胞死亡体。
用于本文时,术语激动剂活性意指试剂(例如,抗原结合分子)在与结合于细胞表面的分子相互作用(例如,结合于),并起始或诱导反应时的活性。
用于本文时,术语拮抗剂活性意指试剂(例如,抗原结合分子)在与细胞上的分子相互作用(例如,结合于),并阻止反应的起始或诱导,或停止正在进行的反应时的活性。
用于本文时,术语融合和嵌合,当关于多肽如ABM使用时,指这样的多肽,所述多肽包括来自两个或更多异源多肽的氨基酸序列,诸如来自不同物种的抗体的部分。例如,对于嵌合ABMs而言,非抗原结合成分可以来自广泛种类的物种,包括灵长类动物诸如黑猩猩和人。最优选嵌合ABM的恒定区与天然人抗体的恒定区基本相同;最优选嵌合抗体的可变区源自与目标抗原特异性结合的非人(即,供体)抗原结合分子。嵌合ABM可以包括完整的供体可变区;备选地,嵌合抗体可以包括人源化的或灵长类化的抗体。人源化的抗体是融合或嵌合抗体特别优选的形式。
用于本文时,术语“人源化”用于指源自非人抗原结合分子的抗原结合分子,例如,鼠抗体,其保持或基本保持母体分子的抗原结合特性,但是在人中具有较少的免疫原性。这可以通过多种方法来实现,所述方法包括(a)将完整非人可变结构域结合到人恒定区上,从而产生嵌合抗体,(b)仅将非人CDRs结合到人构架和恒定区上,保留或不保留关键的构架残基(例如,对于保持良好的抗原结合亲和性或抗体功能是重要的那些),或(c)移植整个非人的可变结构域,但是通过取代表面残基,用人样片段来“遮蔽”它们。这些方法公开于Jones等,Morrison等,国家科学院会刊(Proc.Natl.Acad.Sci.),81:6851-6855(1984);Morrison和Oi,免疫学进展(Adv.Immunol.),44:65-92(1988);Verhoeyen等,科学(Science),239:1534-1536(1988);Padlan,免疫分子学(Molec.Immun.),28:489-498(1991);Padlan,免疫分子学(Molec.Immun.),31(3):169-217(1994),将它们全部并入本文作为参考。
在抗体的每一个重链和轻链可变结构域中通常存在3个互补决定区,或CDRs(CDR1,CDR2和CDR3),在抗体的每一个重链和轻链可变结构域中它们侧邻四个构架亚区域(即,FR1,FR2,FR3,和FR4):FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。人源化抗体的讨论可以,见于特别是美国专利号6,632,927,和公开的美国申请号2003/0175269中,将它们两者全文并入本文作为参考。
类似地,用于本文时,术语灵长类化用于指来自非灵长类动物抗原结合分子的抗原结合分子,例如,鼠抗体,其保留或基本保留母体分子的抗原结合性质,但是在灵长类动物中具有更少的免疫原性。
在本领域使用和/或接受的术语存在两个或多个定义的情形中,用于本文时的术语的定义倾向于包括所有的这些含义,除非明确地以相反的意思指出。具体的实例是使用术语“互补决定区”(″CDR″)来描述在重链和轻链多肽的可变区中发现的非连续抗原结合位点。这一特定区域已经在Kabat等,美国健康与人类服务部(U.S.Dept.ofHealth and Human Services),“免疫性靶标的蛋白质的序列”(″Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest″)(1983)和Chothia等,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196:901-917(1987)中进行了描述,将它们并入本文作为参考,其中当针对彼此比较时,所述定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而,将任一定义用于指抗体或其变体的CDR的应用倾向于在本文所限定和使用的术语的范围内。涵盖如上面引用的参考文献的每个所定义的CDRs的适合的氨基酸残基在下面的表1中提出作为比较。涵盖特定CDR的精确残基数目将根据CDR的序列和大小而变化。假定已知抗体的可变区氨基酸序列,本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定的CDR。
表1.CDR定义1
Kabat Chothia OxAbM2
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-34
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
1表1中的所有的CDR定义的编号是按照Kabat等(见下)的编号方式进行的。
2“OxAbM”指由牛津分子(Oxford Molecular)的“AbM”抗体模型软件定义的CDRs。
Kabat等还定义了用于可变结构域序列的编号系统,其可应用于任何抗体。本领域普通技术人员可以明确地将这种“Kabat编号”系统用于任何可变结构域序列,而不依赖于超出序列本身之上的任何实验数据。用于本文时,“Kabat编号”指由Kabat等,美国健康与人类服务部,“免疫性靶标的蛋白质的序列”(″Sequences of Proteins of Immunological Interest″)(1983)提出的编号系统。除非另外指定,ABM中特异性氨基酸残基位置的编号参考按照Kabat编号系统。序列表的序列不是按照Kabat编号系统编号的。
用于本文时,具有“GnTIII”活性的多肽指这样的多肽,所述多肽能够催化以β-1-4连接将N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基添加到N-连接的寡糖中的三甘露糖基核心的β-连接的甘露糖苷上。这包括融合多肽,所述多肽显示类似于但不必须相同于β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III的活性的酶活性。按照国际生化和分子生物学命名委员会(Nomenclature Committee oftheInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology)(NC-IUBMB),其也被称为β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰基葡糖胺基-转移酶(EC2.4.1.144),如通过存在或不存在剂量依赖性的特殊生物测定来测量。在其中确实存在剂量依赖性的情形中,其不需要与GnTIII的剂量依赖性相同,但是与GnTIII活性相比,基本类似于在给定活性中的剂量依赖(即,相对于GnTIII,候选多肽将显示更大的活性或不超过约25倍更少,并且优选地,不超过约10倍更少的活性,并且最优选地,不超过约三倍更少的活性)。
用于本文时,术语变体(或类似物)指通过使用,例如重组DNA技术产生的氨基酸插入,缺失,和替换而与本发明特别陈述的多肽区别开的多肽。本发明的ABMs的变体包括嵌合的,灵长类化或人源化的抗原结合分子,其中氨基酸残基的一个或数个通过以这样的方式替换,添加和/或缺失进行修饰,所述方式基本上不影响抗原结合亲和性。可以通过将特定多肽的序列与同源肽的序列进行比较并使在高同源性的区域(保守区域)中所作的氨基酸序列变化的数量最少化,或通过用共有序列来取代氨基酸来发现确定哪个氨基酸残基可以被替换,添加,或缺失而不会破坏目标活性的指导。
或者,编码这些相同或类似多肽的重组变体可以通过使用在遗传密码中的“丰余性”来合成或选择。各种密码子替换,诸如产生各种限制性位点的沉默改变可以被引入从而优化克隆到质粒或病毒载体中,或在特定原核或真核系统中的表达。在多核苷酸序列中的突变可以反映在多肽或被加入多肽的其它肽的结构域中从而修饰多肽的任何部分的特性,从而改变特性诸如配体结合亲和性,链间亲和性,或降解/更新率。
用于本文时,氨基酸残基替换意指取代参比序列(例如,母体分子,如抗原结合分子)中的一个或多个氨基酸。在一个实施方案中,氨基酸残基替换可以通过,例如,编码多肽的核酸序列中与母体序列相比的点突变实现。在另一个实施方案中,氨基酸残基的替换可以通过将母体多肽的整个构架区取代为,例如来自种系VH序列的构架区来实现,所述种系VH序列的构架区包括在待替换位置处参比母体所需要的氨基酸。
“保守性”氨基酸替换是通过将一个氨基酸取代为另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸形成的那些,即保守性氨基酸取代,并且可以在涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性基础上进行。例如,非极性(疏水)氨基酸包括甘氨酸,丙氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,缬氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,色氨酸和甲硫氨酸;极性中性氨基酸包括丝氨酸,苏氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰胺,和谷氨酰胺;带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸,赖氨酸和组氨酸;并且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。“插入”或“缺失”优选地在约1到约20个氨基酸的范围内,更优选在约1-约10个氨基酸范围内。容许的变化可以使用重组DNA技术系统性在多肽分子中进行氨基酸插入,缺失或替换,和通过测定得到的重组变体的活性,来实验性地进行确定。
用于本文时,术语母体抗原结合分子,或母体分子指具有由多核苷酸序列编码的特殊氨基酸序列的多肽。母体分子的序列(即,母体序列)用作进行氨基酸残基替换的参比序列,所述氨基酸残基替换改变由此生成的分子(例如,修饰的抗原结合分子)诱导或阻断细胞信号传导活性和/或抗原交联的能力。同样地,母体分子的活性在确定替换是否具有对细胞信号传导活性和/或抗原交联的作用,以及如果相关时,确定作用的程度时用作参比。与其母体(例如,修饰的ABM)相比,含有一个或多个氨基酸替换的序列可以又起到母体序列的作用,进行进一步替换。
用于本文时,术语改变的细胞信号传导活性意指ABM增强的或降低的诱导或抑制靶抗原细胞信号传导活性的能力。
用于本文时,术语改变的一个或多个靶抗原交联意指ABM增强的或降低的将彼此引至更近的邻近状态,和/或将其引至与其他膜结合分子更近的邻近状态,和/或将其引至更有利于与靶抗原相互作用的构象中的能力,所述靶抗原能够形成复合物(例如,通过蛋白质的交联,或膜结合的受体的低聚作用),从而起始细胞信号传导途径。
用于本文时,细胞信号传导机制或细胞信号传导活性意指完整的信号传导(即,信号转导)途径,其导致特殊细胞事件或生物功能,以及沿着该途径的任何信号传导步骤。
至于与本发明的参比核苷酸序列具有至少,例如95%“同一性”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸,意指多核苷酸的核苷酸序列与参比序列相同,除了多核苷酸序列可以包括参比核苷酸序列的每100个核苷酸中多到5个的点突变。换言之,为了获得具有与参比核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸,在参比序列中多到5%的核苷酸可以缺失或被另一个核苷酸所替换,或在参比序列中多到总核苷酸数目5%的核苷酸可以插入参比序列中。
作为实践的问题,可以使用已知的计算机程序来常规确定是否任何特定的核酸分子或多肽与本发明的核苷酸序列或多肽序列具有至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%的同一性。确定在查询序列(本发明的序列)和目标序列之间的最佳全面匹配的优选方法,也被称为全域序列比对,可以使用基于Brutlag等,生物科学编辑附录(Comp.App.Biosci.)6:237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序进行确定。在序列比对中,查询序列和目标序列都是DNA序列。RNA序列可以通过将U′s转化为T′s进行比较。所述全域序列比对的结果以百分比同一性表示。用在DNA序列的FASTDB比对中计算百分比同一性的优选参数是:矩阵=单式,k-字长=4,不匹配罚分=1,合并罚分(Joining Penalty)=30,随机组长=0,截断值评分=1,空隙罚分=5,空隙大小罚分0.05,窗口大小=500或目标核苷酸序列的长度,无论哪一个更短。
如果目标序列比查询序列更短是因为5′或3′缺失,而不是因为内部缺失,必须对结果进行手工校正。这是因为当计算百分比同一性时,该FASTDB程序并不说明目标序列的5′和3′截短。对于相对于查询序列,在5′或3′末端被截短的目标序列,通过将不匹配/比对的在目标序列的5′和3′的查询序列的碱基的数量计算为查询序列的总碱基百分比来对百分比同一性进行校正。通过FASTDB序列排列的结果来确定是否核苷酸匹配/比对。接着,将该百分比从使用指定参数通过上述FASTDB程序进行计算的百分比同一性中减去来达到最终的百分比同一性评分。这种校正评分用于本发明的目的。如通过FASTDB比对展示,仅有不与查询序列匹配/比对的,在目标序列的5′和3′碱基外侧的碱基出于手工调整百分比同一性评分的目的进行计算。
例如,将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列进行比对来确定百分比同一性。该缺失发生在目标序列的5′末端,并且因此,FASTDB比对没有显示在5′末端首先的10个碱基的匹配/比对。这10个未配对碱基代表序列的10%(未匹配的在5′和3′末端碱基的数量/在查询序列中的碱基总数),因此将10%从通过FASTDB程序计算的百分比同一性评分中减去。如果剩余的90个碱基完全匹配,最终的百分比同一性将是90%。在另一个实例中,将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列进行比较。这次,缺失是内部缺失从而使在目标序列的5′或3′末端上不存在与查询序列不匹配/比对的碱基。在该情形中,通过FASTDB计算的百分比同一性没有进行手工校正。再一次,只对在不与查询序列匹配/比对的目标序列的5′和3′末端的碱基进行手工校正。出于本发明的目的,没有进行其它的手工校正。
至于与本发明的查询氨基酸序列具有至少,例如95%“相同”的氨基酸序列的多肽,意指目标多肽的氨基酸序列与查询序列相同,除了目标多肽序列可以在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中包括多到5个氨基酸改变。换言之,为了获得具有与查询氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的多肽,在目标序列中多到5%的氨基酸残基可以被插入,缺失,或被另一个氨基酸替换。参比序列的这些改变可以发生在参比氨基酸序列的氨基或羧基末端位点,或在那些末端位点之间的任何地方,其单独散在参比序列的残基中或在参比序列的一个或多个连续组中。
作为实践的问题,可以使用已知的计算机程序来常规确定是否任何特定的多肽与参比多肽至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%的相同。确定在查询序列(本发明的序列)和目标序列之间的最佳全面匹配的优选方法,也被称为全域序列比对,可以使用基于Brutlag等,Comp.App.Biosci.(生物科学编辑附录)6:237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序进行确定。在序列比对中,查询序列和目标序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述全域序列比对的结果以百分比同一性表示。用在FASTDB氨基酸比对中的优选参数是:矩阵=PAM0,k字长=2,不匹配罚分=1,合并罚分(Joining Penalty)=20,随机组长=0,截断值评分=1,窗口大小=序列长度,空隙罚分=5,空隙大小罚分=0.05,窗口大小=500或目标氨基酸序列的长度,无论哪一个更短。
如果目标序列比查询序列更短是因为N端或C端缺失,而不是因为内部缺失,必须对结果进行手工校正。这是因为当计算全域百分比同一性时,该FASTDB程序并不说明目标序列的N端和C端截短。对于相对于查询序列,在N端和C端被截短的目标序列,通过将与相应的目标残基不匹配/比对的在目标序列的N端和C端的查询序列的残基的数量计算为查询序列的总碱基百分比来对百分比同一性进行校正。通过FASTDB序列比对的结果来确定是否残基是匹配/比对的。接着,将该百分比从使用指定参数通过上述FASTDB程序进行计算的百分比同一性中减去来达到最终的百分比同一性评分。这种最终百分比同一性评分用于本发明的目的。出于手工调整百分比同一性评分的目的,仅考虑不与查询序列匹配/比对的,在目标序列的N端和C端的残基。即,仅是在目标序列的最远N和C端残基外侧的查询残基位点。
例如,将90个氨基酸残基的目标序列与100个残基的查询序列进行比对来确定百分比同一性。该缺失发生在目标序列的N端,并且因此,FASTDB比对没有显示在N端前10个残基的匹配/比对。这10个未配对残基代表序列的10%(未匹配的在N端和C端残基的数量/查询序列的残基总数),因此将10%从通过FASTDB程序计算的百分比同一性评分中减去。如果剩余的90个残基完全匹配,最终的百分比同一性将是90%。在另一个实例中,将90个残基的目标序列与100个残基的查询序列进行比较。这次,缺失是内部缺失从而使在目标序列的N端或C端上不存在与查询序列不匹配/比对的残基。在该情形中,通过FASTDB计算的百分比同一性没有进行手工校正。再一次,如通过FASTDB比对所显示的,只对在不与查询序列匹配/比对的目标序列的N端和C端末端外侧的残基位点进行手工校正。出于本发明的目的,没有进行其它的手工校正。
用于本文时,“在严格条件下杂交于”本发明的核酸序列的核酸指在这样的条件下进行杂交的多核苷酸,所述条件为在包括以下各项的溶液中于42℃进行过夜温育:50%的甲酰胺,5x SSC(750mM NaCl,75mM柠檬酸钠),50mM磷酸钠(pH7.6),5x Denhardt′s溶液,10%硫酸葡聚糖,和20μg/ml的变性、已剪切的鲑精DNA,随后于约65℃在0.1x SSC中洗涤滤器。
用于本文时,术语Fc区域意欲指IgG重链的C-末端区域。尽管IgG重链的Fc区域的边界可以轻微变化,人IgG重链的Fc区域通常定义为从位于Cys226的氨基酸残基延伸到羧基末端的一段序列。
用于本文时,术语等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域意欲包括免疫球蛋白的Fc区域的天然存在的等位基因变体以及具有改变的变体,所述改变产生替换,添加,或缺失,但是基本不会减少免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性的细胞的细胞毒性)的能力。例如,在免疫球蛋白的Fc区域的N-末端或C末端可以缺失一个或多个氨基酸,而基本不丧失生物学功能。可以按照本领域已知的一般规则来选择这些变体从而对活性具有最小的影响。(见,例如Bowie,J.U.等科学(Science)247:1306-10(1990)。在一个实施方案中,等价于Fc区域的区域还可以形成异源融合蛋白的一部分。在一些实施方案中,等价于Fc区域的区域还包括来自另一类免疫球蛋白重链(例如,IgA,IgE,IgD,和IgM)的相应区域。
用于本文时,术语高尔基体定位结构域指负责将多肽锚定在高尔基复合体的位置中的高尔基体定居多肽的氨基酸序列。通常,定位结构域包括酶的氨基末端“尾”。
用于本文时,术语效应子功能指可归因于抗体的Fc区域(天然序列Fc区域或氨基酸序列变体Fc区域)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括,但不限于,Fc受体结合亲和性,抗体依赖性细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合体介导的抗原呈递细胞的抗原吸收,细胞表面受体的下调等。
用于本文时,认为术语改造,改造的,进行改造,糖改造,糖改造的,进行糖改造和糖基化改造包括天然存在或重组多肽,如抗原结合分子(ABM)或其片段的糖基化模式的任何操作。糖基化改造包括细胞的糖基化作用的代谢改造,所述代谢改造包括对寡糖合成途径进行遗传操作从而获得改变的在细胞中表达的糖蛋白的糖基化。在一个实施方案中,糖基化改造是糖基转移酶活性的改变。在特定的实施方案中,改造导致葡糖胺转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性的变化。
用于本文时,术语宿主细胞包括任何种类的细胞系统,能够对该细胞系统进行改造从而产生本发明的多肽和抗原结合分子。宿主细胞包括培养的细胞,例如,哺乳动物培养细胞,诸如CHO细胞,BHK细胞,HEK293-EBNA细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,Y0骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞,和植物细胞,仅举几个例子,但是还包括被包含在转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。在一个实施方案中,对宿主细胞进行改造从而容许产生具有修饰的糖形的抗原结合分子。在一个优选的实施方案中,抗原结合分子是抗体,抗体片段,或融合蛋白。在某些实施方案中,对宿主细胞进一步操作从而使其表达增加水平的一种或多种具有GnTIII活性的多肽。在其它实施方案中,对宿主细胞进行改造从而具有消除的,减弱的或抑制的核心α1,6-岩藻糖基转移酶活性。术语核心α1,6-岩藻糖基转移酶活性涵盖核心α1,6-岩藻糖基转移酶基因的表达以及核心α1,6-岩藻糖基转移酶与其底物的相互作用。
用于本文时,术语Fc-分导的细胞毒性包括抗体依赖性细胞毒性和由包含人Fc-区域的可溶性Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。这是一种导致“人免疫效应细胞”裂解“抗体靶向细胞”的免疫机制,其中:
人免疫效应细胞是在它们的表面上显示Fc受体的白细胞群,通过所述Fc受体它们结合于抗体或Fc-融合蛋白的Fc-区域并且执行效应子功能。这样的群可以包括,但不限于,外周血单核细胞(PBMC)和/或天然杀伤(NK)细胞。
抗体靶向细胞是由抗体或Fc融合蛋白结合的细胞。抗体或Fc融合蛋白通过Fc区N末端的蛋白部分结合靶细胞。
用于本文时,将术语增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性定义为通过上述定义的Fc-介导的细胞的细胞毒性的机制,在围绕靶细胞的培养基中,以给定浓度的抗体,或给定浓度的Fc-融合蛋白,在给定时间内裂解的“抗体-靶向细胞”的数量的增加,和/或将其定义为通过Fc介导的细胞的细胞毒性的机制,在给定的时间内,获得给定数量的“抗体靶向细胞”的裂解所需要的在围绕靶细胞的培养基中抗体浓度,或Fc-融合蛋白的浓度的减少。Fc-介导的细胞的细胞毒性的增加涉及由相同的抗体,或Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒性,所述抗体或Fc-融合蛋白使用本领域那些技术人员已知的相同的标准产生,纯化,配制和贮存方法由相同类型的宿主细胞产生,若非不是由通过本文所述的方法进行了改造从而表达糖基转移酶GnTIII的宿主细胞产生。
所谓具有增加的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的抗体,意指如本文所定义的术语的抗体,所述抗体如通过本领域那些普通技术人员已知的任何适合方法所确定的具有增加的ADCC。在下文所述的实施例中描述了一种被接受的ADCC测定。另一种被接受的体外ADCC测定如下:
1)该测定使用已知表达靶抗原的靶细胞,所述靶抗原由抗体的抗原结合区域所识别;
2)该测定使用分离自随机选择的健康供体的血液的人外周血单核细胞(PBMCs),来作为效应细胞;
3)该测定按照下列方法进行;
i)使用标准的密度离心方法来分离PBMCs并将其以5x106细胞/ml悬浮在RPMI细胞培养基中;
ii)通过标准的组织培养方法培养靶细胞,在生存力大于90%的指数生长阶段来收集细胞,在RPMI细胞培养基中将其进行洗涤,用100微居的51Cr将其进行标记,并用细胞培养基将其洗涤两次,并以105细胞/ml的密度将其重悬于细胞培养基中;
iii)将100微升的上述最终靶细胞混悬液转移到96孔微量滴定板的每孔中;
iv)将抗体从4000ng/ml到0.04ng/ml在细胞培养基中进行系列稀释,并将50微升的得到的抗体溶液加入96孔微量滴定板中的靶细胞,一式三份地测试各个抗体浓度,所述抗体浓度覆盖整个的上述范围的抗体浓度;
v)对于最大释放(MR)对照,在包含标记的靶细胞的板中的3个另外的孔接受50微升的2%(V/V)的非离子去污剂(Nonidet,希格玛(Sigma),St.Louis)的水溶液,替换抗体溶液(上述的第iv点);
vi)对于自发释放(SR)对照而言,在包含标记的靶细胞的板中的3个另外的孔接受50微升的RPMI细胞培养基,替换抗体溶液(上述的第iv点);
vii)接着将96孔微量滴定板以50xg离心1分钟并在4℃温育1小时;
viii)将50微升的PBMC混悬液(上述第i点)加入每个孔中从而产生25∶1的效应物:靶细胞比率,并将板置于温箱中于37℃在5%CO2气氛下达4小时。
ix)从每个孔中收集无细胞的上清液,并使用γ射线计数器来量化实验释放的放射性(ER);
x)按照式(ER-MR)/(MR-SR)x100来计算每个抗体浓度的特异性裂解的百分比,其中ER是对于该抗体浓度量化的平均放射性(见上述第ix点),MR是对于MR对照而言(见上面的第v点)量化的平均放射性(见上面的第ix点),并且SR是对于SR对照而言(见上面的第vi点)量化的平均放射性(见上面的第ix点);
4)将“增加的ADCC”定义为在上述测试的抗体浓度范围内观察的特异性裂解的最大百分比的增加,和/或在上面测试的抗体浓度范围内观察到的获得特异性裂解的最大百分比的一半所需要的抗体的浓度的减少。在ADCC中的增加涉及这样的ADCC,其是在上述测定中测量的,由相同抗体介导的ADCC,所述抗体使用本领域那些技术人员已知的相同的标准产生,纯化,配制和贮存方法由相同类型的宿主细胞产生,若非不是由被改造从而过表达GnTIII的宿主细胞所产生。
具有重链和/或轻链氨基酸替换的抗原结合分子
在一个方面中,本发明涉及包括修饰的重链和/或轻链V区域和/或C区域的ABMs,并且涉及对通过所述修饰可以增强(即,诱导或增强)或减弱(即,抑制或降低)这些ABMs诱导靶抗原细胞信号传导活性和/或介导靶抗原交联能力的发现。因此,本发明提供具有修饰的重链和/或轻链V区域和/或C区域的多肽,其包括ABMs,编码所述多肽的核酸序列(例如,载体),用于产生具有修饰的重链和/或轻链V区域和/或C区域的多肽的方法,以及在多种疾病和病症的治疗中使用其的方法。
已知若干机制涉及抗体的治疗功效,包括抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC),补体依赖性细胞毒性(CDC),和生长停滞或程序性细胞死亡的诱导以及细胞生长的阻滞或抑制,细胞增殖,细胞存活和/或其他细胞事件。例如,已经报告了由对抗单克隆抗体诱导细胞死亡以及其他细胞信号传导事件的实例。Cerisano等,显示了由程序性细胞死亡样特性(包括磷脂酰丝氨酸(PS)的暴露,形态的改变和/或碘化丙锭(PI)的吸收)表征的胱天蛋白酶不依赖性细胞死亡的诱导,以及通过用针对穿膜糖蛋白的对抗抗体,即CD99(例如,抗CD99013MAb和O662MAb)的刺激引起的尤文肉瘤细胞的同型集聚(Cerisano等,致癌基因(Oncogene)23:5664-5674(2003))。同样地,Hahn等,报告了通过用抗CD99单克隆抗体(例如,DN16和YG32)接合CD99引起的MAPK信号传导途径的活化,其导致细胞的同型集聚(Hahn等,FEBS通讯(FEBSLetters)470:350-354(2000))。Pettersen等,识别了可以被抗CD99单克隆抗体,即Ad20活化的CD99的新功能结构域,其活化作用诱导转化T细胞中的程序性细胞死亡(Pettersen等,免疫学杂志(J. Immunol.)166:4931-4942(2001))。针对CD47的单克隆抗体(例如,B6H12)也可以诱导胱天蛋白酶不依赖性细胞死亡,其与细胞骨架重构信号传导途径有关(Mateo等,血液(Blood)100:2882-2890(2002))。将上述每篇参考文献的全部内容引入本文作为参考。
在其他实例中,针对CD20的某些抗体(例如,利妥昔单抗和托昔莫单抗)和针对CD52的某些抗体(CAMPATH-1H)已经显示出直接诱导肿瘤细胞中的程序性细胞死亡。见Ludwig等,致癌基因(Oncogene)22:9097-9106(2003)。对于利妥昔单抗和若干其他具有很小或无信号传导活性的单克隆抗体(抗CD19,CD21,CD22和Her2),诱导程序性细胞死亡或生长停滞的能力通过将抗体化学转换为IgG-IgG同型二聚体得到增强。Ghetie等,国家科学院会刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)94:7509-14(1997)。推测该增强是因为增加的负信号传导和/或四价抗体同型二聚体的超交联(hypercrosslinking)。Ghetie等,国家科学院会刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)94:7509-14(1997)。还通过使用二级抗体或具有Fc受体的佐细胞获得了交联和增加的程序性细胞死亡。见Jazhirehi和Bonavida,致癌基因(Oncogene)24:2121-43(2005)。将上述每篇参考文献的全部内容引入本文作为参考。
在不希望受到理论限制的条件下,本发明人确定了抗原结合分子肘铰链区中氨基酸残基的修饰可以影响ABM诱导或抑制信号传导活性和/或靶抗原交联的能力。肘铰链区的角度控制免疫球蛋白V区域相对于C区域的方向,并且同样地,促进抗体与抗原和效应子蛋白的相互作用。见Lesk和Chothia,自然(Nature)335:188-90(1988)。Lesk和Chothia鉴定了组成抗体中肘铰链区分子球窝关节的残基,即VH区域中Kabat位置11,110和112,以及CH1区域中位置149和150,并且注意到了组成该关节的残基的抗体的高度保守性。Lesk和Chothia,自然(Nature)335:188-90(1988)。(将其全部内容引入本文作为参考)。然而,他们没有对球窝残基或在他们附近的残基做出修饰。Landolfi等显示在AF2,一种针对人IFNγ的中和抗体的Kabat位置10-13的修饰导致抗体的中和活性的明显损失,但是没有影响抗体与其靶抗原的结合。Landolfi等,J.Immunol.(免疫学杂志).166:1748-54(2001)(将其全部内容结合在本文作为参考)。然而,Landolfi等没有显示出对抗体诱导细胞信号传导或介导抗原交联的能力的影响。
关于多价ABM,改变抗原结合位点方向的能力容许当结合的抗原单位与多抗原结合位点复合时,调节其接近度。抗原单位彼此间的接近度促进抗原单位间较大或较小的相互作用(例如,交联,二聚体形成,等)。例如,如果定向ABM中每个VH/VL-CH1/CL对的肘角度,以使抗原结合位点彼此更接近,则结合的抗原单位(例如,细胞表面受体分子)也应该彼此更加接近,或形成更加有利于相互作用的构象。该接近度或构象改变可以介导结合的抗原间的相互作用,例如,交联和低聚作用。在另一方面,定向抗原结合位点,以使它们更加远离或具有更加不适合的构象,可以防止它们相互作用。
还可以修饰位于VL-CL界面处的氨基酸残基,从而影响抗原结合位点的定向。例如,轻链可变区构架中的Kabat残基40,80,83,105,和106位于VL/CL界面处。
任何细胞信号传导机制的活性可以受到本发明ABM的影响(即,受到诱导或抑制)。在本发明的一个方面,涉及的细胞信号传导机制是通过细胞表面受体蛋白,包括离子通道连接的、G蛋白连接的和酶联细胞表面受体蛋白起始的那些。一般见于,第15章:Cell Signaling in MOLECULARBIOLOGY OF THE CELL(细胞分子生物学中的细胞信号传导),Alberts等,eds.(第3版,1994)(引入本文作为参考)。因此,例如,本发明的细胞信号传导活性包括,但不限于,导致程序性细胞死亡、细胞分化、细胞生长、细胞增殖和细胞生存的那些,以及沿该途径的任何信号传导步骤。在一个实施方案中,细胞信号传导活性通过酶联受体发生;在具体的实施方案中,所述酶联受体是受体酪氨酸激酶。在另一个实施方案中,细胞信号传导活性是通过离子通道连接的受体。
本发明ABM的修饰的重链或轻链V区域和/或C区域以至少一个氨基酸替换区别于相应的未修饰母体多肽(例如,母体抗原结合分子)区域。该“母体,”“起始,”或“未修饰”多肽优选地包含抗体重链或轻链的至少部分,并且可以通过利用本领域中用于产生包含重链V区域或CH1区域或其部分和/或轻链V或C区域或其部分的多肽的可用技术而制备。在具体的实施方案中,母体多肽是抗原结合分子,并且包括VH或VL区域的至少部分。在某些实施方案中,可以产生修饰的重链和/或轻链V区域(例如,按照本文所公开的方法)并且可以将其与选择的异源多肽,如抗体Fc相融合。在本发明的一个实施方案中,修饰的ABM或其片段包括融合蛋白,其中修饰的重链V区域或其片段与选自由下列各项组成的组的重链恒定区相融合;IgA,IgG,IgE,IgD,和IgM,或其片段或衍生物。在具体的实施方案中,重链恒定区是IgG。在本发明的另一个实施方案中,修饰的ABM或其片段包括融合蛋白,其中修饰的轻链V区域或其片段与选自下列各项组成的组的轻链恒定区相融合:IgA,IgG,IgE,IgD,和IgM,或其片段或衍生物。在具体的实施方案中,轻链恒定区是IgG。在具体的实施方案中,本发明的多肽包括完整的抗体(例如,IgG),其包括具有修饰的重链和/或轻链V区域的轻链和重链。
编码这样的多肽的多核苷酸可以通过本领域中已知的利用对特殊序列现有说明的指导方法进行制备,所述多肽包括修饰的重链V区域或CH1区域或轻链V区域或CL区域。这些方法包括,但不限于,通过位点定向的(或寡核苷酸介导的)诱变,PCR诱变和早期制备的编码该多肽的核酸的盒式诱变的制备。位点定向的诱变是用于制备替换变体的优选方法。该技术在本领域中众所周知(见,例如,Carter等,核酸研究(Nucleic AcidsRes.)13:4431-4443(1985)和Kunkel等,美国国家科学院会刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82:488(1987),将其二者都引入本文作为参考)。简要地,在进行DNA的位点定向诱变中,通过首先对编码所需突变的寡核苷酸和起始DNA单链的进行杂交,改变该起始DNA。杂交后,利用杂交的寡核苷酸作为引物,并利用该起始DNA单链作为模板,使用DNA聚合酶合成完整的第二条链。由此,将编码所需突变的寡核苷酸引入到由此生成的双链DNA中。
PCR诱变还适合于制备未修饰的起始多肽的氨基酸序列变体(见,例如,Vallette等,核酸研究(Nuc.Acids Res.)17:723-733(1989),将其引入本文作为参考)。简要地,当少量模板DNA在PCR中用作起始材料时,与模板DNA中相应区域的序列稍有不同的引物可以用于产生相对大量的特异性DNA片段,其仅与模板序列区别在引物与模板相区别的位置。
用于制备ABM变体的另一种方法,即盒式诱变,基于Wells等,基因(Gene)34:315-323(1985)所述的技术,将其引入本文作为参考。原材料是包含待修饰的起始多肽DNA的质粒(或其他载体)。鉴定了待突变起始DNA中的密码子。在鉴定的突变位点每一侧必须存在唯一的限制性核酸内切酶位点。如果没有该限制性位点存在,则可以利用上述寡核苷酸介导的诱变方法产生它们,从而将它们引入到起始多肽DNA中合适的位置。在这些位点切割质粒DNA,从而使其线性化。利用标准步骤合成编码所述限制性位点之间但含有所需突变的DNA序列的双链寡核苷酸,其中分别合成寡核苷酸的两条链,并再利用标准技术将它们杂交在一起。该双链寡核苷酸称为盒。将该盒设计为具有与线性化质粒末端相容的5’和3’末端,由此,它可以直接与质粒连接。该质粒现在含有突变的DNA序列。
备选地,或另外地,可以确定编码多肽变体的所需氨基酸序列,并且可以合成地产生编码该氨基酸序列变体的核酸序列。
可以修饰母体多肽的氨基酸序列,从而产生这样的ABM,所述ABM具有修饰的重链V区域和/或修饰的CH1区域,和/或修饰的轻链V区域和/或修饰的CL区域,当修饰的ABM与靶抗原复合(例如,结合)时,其具有改变的诱导靶抗原细胞信号传导活性的能力。细胞信号传导活性可以是激动剂活性或拮抗剂活性。按照本发明的一个方面,修饰的抗原结合分子当其与细胞膜结合受体结合,并起始细胞信号传导途径时,诱导激动剂活性。在特定的实施方案中,细胞信号传导途径是程序性细胞死亡途径。在另一个实施方案中,细胞信号传导途径是细胞分化途径。按照本发明的另一个方面,由修饰的抗原结合分子引起的拮抗剂活性发生在,例如,当ABM与细胞膜结合受体结合,并且阻止细胞信号传导途径的诱导或中断正在进行的信号传导时。拮抗剂活性可以通过,例如,阻断内源配体的结合和后继的信号转导,和/或通过阻止受体或其他对诱导细胞信号传导途径必要的分子的交联或低聚作用获得。在一个实施方案中,受抑制或中断的细胞信号传导途径是细胞生长途径。在另一个实施方案中,受抑制或中断的细胞信号传导途径是细胞分裂途径。在另一个实施方案中,受抑制或中断的细胞信号传导途径是细胞生存途径。
同样地,还可以修饰母体多肽的氨基酸序列,以产生这样的ABM,所述ABM具有修饰的重链V区域或修饰的C区域(例如,修饰的CH1区域),和/或修饰的轻链V区域和/或修饰的CL区域,当修饰的ABM与靶抗原复合(例如,结合)时,其具有改变的介导一个或多个靶抗原交联的能力。在一个实施方案中,与由相应的未修饰母体ABM所引起结合的靶抗原的情形相比,结合的靶抗原(例如,细胞表面受体分子)被引至彼此更加接近的状态,和/或者形成更加适合相互作用的构象,由此增加结合的抗原之间的交联和低聚作用。在另一个实施方案中,与由相应的未修饰母体ABM所引起的结合的靶抗原的情形相比,结合的靶抗原(例如,细胞表面受体分子)保持为彼此更加远离的状态,和/或更加不利于相互作用的构象中,由此降低或阻止结合的抗原之间的交联和低聚作用。在具体的实施方案中,增加的交联或低聚作用导致增加的程序性细胞死亡。在另一个实施方案中,增加的交联或低聚作用导致增加的细胞分化。在另一个实施方案中,交联或低聚作用的降低导致减少的细胞生长,减少的细胞分裂,或减少的细胞生存。
重链V区域或CH1区域,或轻链V区域或CL区域生物特性中的大量修饰可以通过选择替换完成,所述替换在维持下列各项作用中显著不同:(a)替换区域中多肽主链的结构,例如作为片层或螺旋构象,(b)靶位点处分子的电荷或疏水性,或(c)侧链的大小。基于下列常见侧链特性,将天然存在的残基分类:
(1)疏水性:met,ala,val,leu,ile;
(2)中性亲水性:cys,ser,thr;
(3)酸性:asp,glu;
(4)碱性:asn,gln,his,lys,arg;
(5)影响链方向的残基:gly,pro;和
(6)芳香族的:trp,tyr,phe。
非保守性替换引起这些分类中一类中的成员与另一类中成员间的交换。保守性替换引起这些分类中一类中的成员与该相同种类中另一成员间的交换。
包含修饰的ABM的示范多肽
在一个方面,本发明涉及具有氨基酸修饰的抗原结合分子,其改变ABM诱导细胞信号传导活性和/或介导抗原交联的能力。在一个实施方案中,对ABM的修饰,与母体分子相比,包括重链或轻链可变区中至少一个构架区中的至少一个氨基酸残基替换。在具体的实施方案中,该替换取代重链FR1中的氨基酸残基。在优选的实施方案中,对ABM的修饰包括重链可变区中Kabat位置8,9,10,11,12,或13一个或多个处氨基酸残基的替换。在另一个实施方案中,对ABM的修饰包括重链FR4中氨基酸残基的替换。在具体的实施方案中,对ABM的修饰包括重链可变区中Kabat位置110或112一个或多个处氨基酸残基的替换。在另一个实施方案中,对ABM的修饰包括轻链中V和C区域间界面处的至少一个氨基酸残基替换。在更具体的实施方案中,对ABM的修饰包括Kabat位置40,80,83,105,或106的一个或多个处的氨基酸残基的替换。
在一个实施方案中,可以通过在母体序列中产生导致氨基酸残基中所需改变的点突变替换氨基酸。备选地,对ABM的修饰可以包括将母体分子的完整构架区取代为在特定位置包含所需氨基酸残基的构架区。在具体的实施方案中,对ABM的修饰包括将母体分子的FR1取代为由种系可变基因序列编码的FR1。
在本发明的另一个实施方案中,ABM至少包括CH1区域,并且ABM的修饰与母体多肽相比,包括至少一个氨基酸残基替换。在具体的实施方案中,对ABM的修饰包括位于重链恒定区位置148,149和/或150处的一个或多个氨基酸残基的替换。
在另一个方面,本发明涉及修饰的抗原结合分子,其包含母体抗原结合分子的一个或多个截短的CDRs。对于给定的CDR,该截短的CDRs应该含有,最低限度地,特异性决定氨基酸残基。“特异性决定残基”意指在与抗原的相互作用中直接涉及的那些残基。一般而言,在给定CDR中仅有大约1/5-1/3的残基参与与抗原的结合。可以通过,例如,按照Padlan等,FASEB杂志(FASEB J.)9(1):133-139(1995)中所述的方法计算来自三维模型的原子间接触以及确定给定残基位置处的序列可变性,鉴定特定CDR中的特异性决定残基,将其全部内容引入本文作为参考。
因此,本发明还涉及分离的多核苷酸,其包括母体分子的至少一个互补决定区,或其至少含有所述互补决定区特异性决定残基的变体或截短形式,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。优选地,该分离的多核苷酸编码这样的融合多肽,其为修饰的抗原结合分子。在一个实施方案中,多核苷酸包含母体分子的三个互补决定区,或其至少含有所述三个互补决定区中每个的特异性决定残基的变体或截短形式。在另一个实施方案中,多核苷酸编码嵌合(例如,人源化的)抗体轻链或重链的完整可变区。本发明进一步涉及由该多核苷酸编码的多肽。
在另一个实施方案中,本发明涉及这样的修饰抗原结合分子,其包含母体分子的至少一个互补决定区,或其至少含有所述互补决定区特异性决定残基的变体或截短形式,并包含源自异源多肽的序列。在一个实施方案中,修饰的抗原结合分子包含母体分子的三个互补决定区,或其至少含有所述三个互补决定区中每个的特异性决定残基的变体或截短形式。在另一个方面,修饰的抗原结合分子包含抗体轻链或重链的可变区。在一个特别有效的实施方案中,抗原结合分子是嵌合,例如,人源化的抗体。本发明还涉及制备所述修饰的抗原结合分子的方法,及其在疾病,包括细胞增殖病症的治疗中的应用。
已知若干机制涉及抗体的治疗功效,其包括抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC),互补依赖性细胞毒性(CDC),以及生长停滞、细胞分化或程序性细胞死亡的诱导。
本发明涉及这样的修饰ABM,其与相应的未修饰母体ABM相比,具有增强的诱导程序性细胞死亡的能力。例如,按照本发明可以修饰具有很小或无诱导程序性细胞死亡能力的母体ABM,从而产生修饰的ABM,其确实具有诱导程序性细胞死亡能力或具有增强的诱导程序性细胞死亡能力。本发明还涉及这样的修饰ABM,其与相应的未修饰母体ABM相比,具有增强的诱导生长停滞或细胞分化的能力。例如,按照本发明可以修饰具有很小或无诱导生长停滞或细胞分化能力的母体ABM,从而产生修饰的ABM,其确实具有诱导生长停滞或细胞分化能力或具有增强的诱导生长停滞或细胞分化能力。
例如特别地,关于抗CD20抗体,大多数试验证据显示利妥昔单抗通过由CDC和ADCC测量的常规效应子机制起作用。相似地,显示了不同淋巴瘤细胞对利妥昔单抗的体内抗性是它们对于体外CDC敏感性的函数。相反地,另一种已经被批准进行治疗应用的抗CD20抗体,即B1的体内作用模式既不需要补体也不需要天然杀伤细胞(NK)细胞活性。更适合地,B1的体内功效归因于其诱导有效程序性细胞死亡的能力。通常,基于它们在根除淋巴瘤细胞中的作用机制,抗体CD20单克隆抗体分成2个不同的种类。I型抗CD20抗体首先利用补体杀伤靶细胞,而II型抗体通过不同的机制进行起作用,主要是程序性细胞死亡。利妥昔单抗和1F5是I型抗CD20抗体的实例,而B1是II型抗体的实例。见,例如,Cragg,M.S.和Glennie,M.J.,血液(Blood)103(7):2738-2743(2004年4月);Teeling,J.L.等,血液(Blood)104(6):1793-1800(2004年9月),将其全部内容引入本文作为参考。
等的美国专利申请公开号2005/0123546(其全部内容被引入本文作为参考)公开了第一个已知的实例,其中将I型抗CD20抗体改造为具有增强的效应子功能,如ADCC,和产生有效的程序性细胞死亡能力,从而有效地将I型抗CD20抗体改变为II型抗CD20抗体。在一个实施方案中,本发明涉及修饰的抗CD20抗体,其与I型母体抗CD20抗体相比,在重链或轻链可变区中包含替换,其中所述替换通过修饰的抗CD20抗体导致增强的程序性细胞死亡的诱导。在另一个实施方案中,本发明涉及改造的II型抗CD20抗体,其具有作为增强的效应子功能改造结果的增强的ADCC,并且不缺失诱导程序性细胞死亡的基本能力。在一个实施方案中,II型抗CD20抗体与母体分子相比,在重链或轻链可变区中包含一个或多个氨基酸的替换。在另一个实施方案中,将I型和/或II型抗CD20抗体改造为在Fc区域中具有改变的糖基化模式。在特定的实施方案中,修饰ABM的改变的糖基化包括Fc区域中增高水平的等分复合物残基。在另一个具体的实施方案中,修饰ABM的改变的糖基化包括Fc区域中降低水平的岩藻糖残基。见于Shitara等的美国专利申请公开号20040093621,将其全部内容引入本文作为参考。在另一个实施方案中,I型或II型抗CD20抗体经历了如下列文献所讲述的多肽改造,所述文献是Presta的美国专利号6,737,056或美国专利申请公开号20040185045(Macrogenics)或美国专利申请公开号20040132101(Xencor),将其每篇的全部内容引入本文作为参考。本发明进一步涉及制备所述改造的I型或II型抗体的方法,以及在治疗多种B细胞病症,包括B细胞淋巴瘤中应用所述抗体的方法。
嵌合的和人源化的修饰ABM
描述了嵌合小鼠/人抗体。见于例如,Morrison,S.L.等,PNASI1:6851-6854(1984年11月);欧洲专利公开号173494;Boulianna,G.L,等,自然(Nature)312:642(1984年12月);Neubeiger,M.S.等,自然(Nature)314:268(1985年3月);欧洲专利公开号125023;Tan等,免疫学杂志(J.Immunol.)135:8564(1985年11月);Sun,L. K等,杂交瘤(Hybridoma)5(1):517(1986);Sahagan等,免疫学杂志(J. Immunol.)137:1066-1074(1986)。通常见于,Muron,自然(Nature)312:597(1984年12月);Dickson,遗传工程消息(Genetic Engineering News)5(3)(1985年3月);Marx,科学(Science)229:455(1985年8月);和Morrison,科学(Science)229:1202-1207(1985年9月)。Robinson等,在PCT公开号WO/88104936中描述了具有人恒定区和鼠可变区的嵌合抗体,其具有对CD20表位的特异性;Robinson参考文献中嵌合抗体的鼠部分源自2H7小鼠单克隆抗体(λ2b,κ)。虽然参考文献注意到所述嵌合抗体是治疗B细胞病症的“最初候选者”,但是该陈述可以仅被看作是对本领域技术人员的建议,从而确定该建议对于该特定抗体是否准确,特别地,这是因为参考文献缺乏支持评估治疗效率的任何数据,以及重要地,利用更高级哺乳动物,如灵长类或人类的数据。
产生嵌合抗体的方法学可为本领域技术人员所用。例如,利用,例如单独质粒中或单一(例如多顺反子性)载体上的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链,可以单独地表达轻链和重链。然后可以对这些纯化,并体外装配为完整的抗体;描述了用于完成该装配的方法学。见于,例如,Scharff,M.,Harvey Lectures69:125(1974)。还描述了用于形成来自减少的分离轻链和重链的IgG抗体的体外反应参数。见于,例如,Sears等,生物化学(Biochem.)16(9):2016-25(1977)。
在特别优选的实施方案中,本发明的嵌合ABM是人源化的抗体。人源化非人抗体的方法在本领域中已知。例如,可以按照下列文献中的方法制备本发明的人源化ABM,所述文献是:Winter的美国专利号5,225,539,Queen等的美国专利号6,180,370,或Adair等的美国专利号6,632,927,Foote的美国专利申请公开号2003/0039649;Sato等的美国专利申请公开号2004/0044187;或Leung等的美国专利申请公开号2005/0033028,将其每篇的全部内容引入本文作为参考。优选地,人源化抗体具有被引入其中的一个或多个由非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“引进”残基,其典型地取自“引进”可变结构域。按照Winter和其同事的方法,通过替换人抗体相应序列的高变区序列,可以基本实现人源化作用(Jones等,自然(Nature),321:522-525(1986);Riechmann等,自然(Nature),332:323-327(1988);Verhoeyen等,科学(Science),239:1534-1536(1988))。因此,所述“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567),其中基本小于完整人可变结构域的人可变结构域被来自非人物种的相应序列所替换。实际上,人源化抗体典型地是人抗体,其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体类似位点的残基所替换。所述人源化抗CD20抗体应该包括人免疫球蛋白的恒定区。
对用于制备人源化抗体的人可变结构域,轻链和重链二者的选择,对减少抗原性非常重要。根据所谓的“最佳匹配”方法,针对完整的已知人可变结构域序列库对啮齿动物抗体可变结构域序列进行筛选。接着接受与啮齿动物序列最相近的人序列作为人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等,J. Immunol.(免疫学杂志),151:2296(1993);Chothia等,J. Mol.Biol.(分子生物学杂志),196:901(1987))。另一种选择人构架序列的方法是将完整啮齿动物构架的每个单独亚区的序列(即,FR1,FR2,FR3,和FR4)或这些单独亚区的一些组合(例如,FR1和FR2)与对应于该构架亚区的已知人可变区序列库(例如,由Kabat编号决定的)进行比较,并对每个亚区或组合选择最接近于啮齿动物序列的人序列(Leung美国专利申请公开号2003/0040606A1,2003年2月27日公开)。另一种方法使用源自轻或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架区域。可以将相同的构架用于一些不同的人源化抗体(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院会刊),89:4285(1992);Presta等,J. Immunol.(免疫学杂志),151:2623(1993))(特此将其每个的全部内容并入本文作为参考)。
抗体经人源化保持对所述抗原高亲和性和其他有利生物特性也很重要。为实现该目的,根据一种优选的方法,通过利用母体和人源化序列的三维模型分析母体序列和多种概念上人源化的产物的方法制备人源化抗体。利用本领域技术人员所熟悉的计算机程序(例如,InsightII,accelrys inc(从前的MSI),或在由Schwede等,Nucleic Acids Res.(核酸研究)2003(13):3381-3385所描述的http://swissmodel.expasy.org/)能够生成三维免疫球蛋白模型。这些模型的检验容许了对该残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能的作用进行分析,即,对影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基的分析。以这种方法,能够从受体和引进序列中选择和组合FR残基,以获得所要求的抗体特征,如对靶抗原维持的亲和性。通常,该高变区残基直接地和最主要地涉及影响抗原结合。
在另一个实施方案中,将本发明的抗原结合分子改造为具有增强的结合亲和性,这是根据,例如,Balint等在美国专利申请公开号2004/0132066中所公开的方法进行的,特此将其全部内容并入本文作为参考。
在一个优选的实施方案中,本发明涉及这样的分离的多核苷酸,其包含编码具有表3和/或5中所示氨基酸序列的多肽的序列,见下。本发明进一步涉及这样的分离的核酸,其包含至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同于表2和/或4中所示核苷酸序列的序列,见下。在另一个实施方案中,本发明涉及这样的分离的核酸,该核酸包含编码这样的多肽的序列,所述多肽具有与表3和/或5中氨基酸序列至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同的氨基酸序列,见下。本发明还涵盖这样的分离的核酸,该核酸包含编码具有表3和/或5中任意构建体氨基酸序列的多肽的序列,所述多肽具有保守氨基酸替换。在某些实施方案中,可以将表2-5中的任意多核苷酸或多肽排除在外。因此,例如,在某些实施方案中,修饰的ABM,和/或编码该修饰ABM的多核苷酸不包含任意或全部SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ IDNO:37,或SEQ ID NO:38。在另一个实施例中,在某些实施方案中,本发明修饰的ABM不包含任意或全部的SEQ ID NOs:55-62。
在另一个实施方案中,本发明涉及这样的分离的多肽,其包含表3和/或5中所示的氨基酸序列,见下。本发明进一步涉及这样的分离的多肽,其包含由表2和/或4中所示的核苷酸序列所编码的序列,见下。在另一个实施方案中,本发明涉及这样的分离的多肽,其包含至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同于表3和/或5中所示氨基酸序列的氨基酸序列,见下。本发明还涵盖这样的分离的多肽,其包含表3和/或5中任意构建体的氨基酸序列,所述多肽具有保守的氨基酸替换。在某些实施方案中,可以将表2-5中的任意多核苷酸或多肽排除在外。因此,例如,在某些实施方案中,多肽不包含与下列任意或全部序列对应的或由其编码的氨基酸序列,所述序列是SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:35,SEQ IDNO:36,SEQ ID NO:37,或SEQ ID NO:38。在另一个实施例中,在某些实施方案中,本发明修饰的ABM不包含任意或全部的SEQ ID NOs:55-62。表2
表3
表4
表5
在另一个特别的实施方案中,本发明涉及这样的分离的多核苷酸,该多核苷酸包含编码具有这样的氨基酸序列的多肽的序列,所述氨基酸序列源自图1和表6中所示的母体序列,并且该多核苷酸在至少一个重链FR区域中包含至少一个氨基酸替换。在另一个实施方案中,本发明涉及这样的分离的多肽,其包含源自图1和表6中所示的母体序列的氨基酸序列,并且在至少一个重链FR区域中包含至少一个氨基酸替换。
表6
在一个方面,本发明修饰的ABM与母体ABM相比,可以包含完整构架区的替换。因此,例如,本发明进一步涉及这样的分离的多核苷酸,其包含编码这样的多肽的序列,所述多肽具有至少一个源自人种系VH序列的重链FR。在优选的实施方案中,FR1区域中,或Kabat位置8-13处的人VH种系序列源自表7中所鉴定的任意一个序列,见下。可以从IMGT数据库(http://imgt.cines.fr:8104/textes/IMGTrepertoire)获得这些序列,并且将每个通过其登记号识别的序列的全部内容清楚地引入本文作为参考。
表7
在另一个实施方案中,本发明涉及这样的分离的多核苷酸,其包含编码这样的多肽的序列,所述多肽包含按照下表8中所出现的任意一个序列,位于重链可变区Kabat位置8-13处的氨基酸序列,或其任何子集(例如,位置9-12,位置10-12,等)的氨基酸序列。在另一个实施方案中,本发明涉及这样的分离的多肽,其包含按照下表8中所出现的任意一个序列,位于Kabat位置8-13处的氨基酸序列,或其子集(例如,位置9-12,位置10-12,等)的氨基酸序列。
表8
氨基酸序列 SEQIDNO
GAEVKK 63
GPTLVK 64
GPVLVK 65
GPALVK 66
GGGLVQ 67
GGGLVK 68
氨基酸序列 SEQ ID NO
GGGLVE 69
GGGVVR 70
GGGVVQ 71
GGVVVQ 72
GGGLIQ 73
RGVLVQ 74
GPGLVK 75
GSGLVK 76
GAGLLK 77
GSELKK 78
GHEVKQ 79
GAELKK 101
GAEVVK 102
GGEVKK 103
GAGVKK 104
GGGVVK 105
在另一个实施方案中,本发明涉及这样的分离的多核苷酸,其包含编码这样的多肽的序列,所述多肽包含位于重链可变区Kabat位置108-113的氨基酸序列,或其子集(例如,位置110-112,位置110和112,等)的氨基酸序列。在特定的实施方案中,位于位置108-113的序列如下表9中所示。在另一个实施方案中,本发明涉及这样的分离的多肽,其包含按照下表9中所出现的任意一个序列,位于Kabat位置108-113的氨基酸序列,或其子集(例如,位置110-112,位置110和112,等)的氨基酸序列。
表9
氨基酸序列 SEQIDNO
LVTVSS 106
LVIVSS 107
LVTVIS 108
LVIVIS 109
LVGVSS 110
LVTVGS 111
LVGVGS 112
LVAVSS 113
LVTVAS 114
LVAVAS 115
LVVVSS 116
氨基酸序列 SEQIDNO
LVTVVS 117
LVVVVS 118
LVLVSS 119
LVTVLS 120
LVLVLS 121
LVSVSS 122
LVTVTS 123
在另一个实施方案中,本发明涉及表达载体和/或宿主细胞,其包括一个或多个本发明的分离的多核苷酸。
一般而言,任何类型的培养的细胞系可以用于表达本发明的ABM。在一个优选的实施方案中,将CHO细胞,HEK293-EBNA细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,其它哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,或植物细胞用作背景细胞系以产生本发明的被改造的宿主细胞。
进一步包含Fc区域和Fc区域变体的修饰的ABM
在一个实施方案中,本发明的在重链V和/或CH1区域和/或轻链V和/或C区域中包含一个或多个氨基酸替换的ABM可以进一步包含人Fc区域。在特定的实施方案中,人恒定区是IgG1,如SEQ ID Nos80和81所示,并且显示如下:
IgG1核苷酸序列(SEQ ID NO:80)
ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTC
TGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAAC
CGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACC
TTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTG
ACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAA
TCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCAAATCT
TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGG
GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGA
TCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAA
GACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAA
TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG
GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA
CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA
TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCC
CCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGT
CAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG
GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAG
CAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCA
CTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
IgG1氨基酸序列(SEQ ID NO:81)
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTIMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL
PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE
SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTQKSLSLSPGK
然而,该人Fc区域的变体和同种型也涵盖于本发明中。例如,适合用于本发明的变体Fc区域能够根据以下文献所教导的方法产生,这些文献包括Presta的美国专利号6,737,056(具有由于一个或多个氨基酸修饰所改变的效应子功能的Fc区域变体);或美国专利申请号60/439,498;60/456,041;60/514,549;或WO2004/063351(具有由于氨基酸修饰增加结合亲和性的变体Fc区域);或美国专利申请号10/672,280或WO2004/099249(由于氨基酸修饰改变了对FcγR的结合的Fc变体),并将其每个的全部内容并入本文作为参考。
在本发明的另一个方面,在重链V和/或CH1区域和/或轻链V和/或C区域中包含一个或多个氨基酸替换的ABM可以进一步包含Fc区域变体。可以改造Fc区域,从而产生这样的变体,其具有改变的对一种或多种FcRs结合的亲和性。可以,例如,修饰Fc区域中的一个或多个氨基酸残基,从而改变(例如,增强或减弱)与FcR的结合,如美国临时专利申请号60/678,776所述,将其全部内容引入本文作为参考。通常,在通过影响FcR结合所鉴定的一个或多个Fc区域残基处进行氨基酸的替换,从而产生所述Fc区域变体,在优选的实施方案,缺失或替换不超过1到约10个Fc区域残基。本文中包含一个或多个氨基酸修饰(例如,替换)的Fc区域优选地保持至少约80%,优选地至少约90%,和最优选地至少约95%的母体Fc区域序列或天然序列人Fc区域。
还可制备氨基酸插入修饰的Fc区域,该变体具有改变的效应子功能。例如,可在邻近一个或多个本文所确定影响FcR结合的Fc区域位置处引入至少一个氨基酸残基(例如,一到两个氨基酸残基,且通常不超过10个残基)。邻近指在本文所鉴定的Fc区域残基的一到两个氨基酸残基内。这样的Fc区域变体可表现出增加的或减低的FcR结合和/或效应子功能。为了产生这样的插入变体,可评估多肽的共晶体结构,从而合理地设计表现,例如提高的FcR结合能力的,修饰的Fc区域,所述多肽包含FcR结合区域(例如,目标FcR的细胞外结构域)和将氨基酸残基插入其中的Fc区域(参见,例如,Sondermann等,自然(Nature)406:267(2000);Deisenhofer,生物化学(Biochemistry)20(9):2361-2370(1981);和Burmeister等,自然(Nature)3442:379-383,(1994),将其全部并入本文作为参考)。
通过在母体Fc区域中引入适合的氨基酸序列修饰,能够产生变体Fc区域,该Fc区域(a)在人效应细胞存在下,或多或少有效地介导一种或多种效应子功能,和/或(b)与母体多肽相比,以更好的亲和性与Fcγ受体(FcγR)或Fc新生儿受体(FcRn)结合。这些修饰的Fc区域通常会包含Fc区域中的至少一个氨基酸修饰。
在优选的实施方案中,母体多肽Fc区域是人Fc区域,例如,天然人Fc区域人IgG1(A和非A同种异型),IgG2,IgG3,IgG4,和在任意物种Fc区域中已知或已发现的所有同种异型。这些区域具有如美国临时专利申请号60/678,776中所公开那些的序列,将其全部内容引入本文作为参考。
在某些实施方案中,为了产生这样的ABM,母体多肽优选地具有预先存在的ADCC活性(例如,母体多肽包含人IgG1或人IgG3Fc区域),所述ABM在重链V和/或CH1区域和/或轻链V和/或C区域中包含一个或多个氨基酸替换,并且进一步包含具有改良的效应子功能(例如,ADCC)的修饰Fc区域。在一些实施方案中,具有改良ADCC的修饰Fc区域比具有天然序列IgG1或IgG3Fc区域的抗体,明显更加有效地介导ADCC。
在特定的实施方案中,将氨基酸修饰引入到母体Fc区域的CH2结构域中。
可对本发明具有修饰的Fc区域的多肽进行一个或多个另外的修饰,这依赖于对该多肽所要求的或所意欲的用途。这些修饰可包括,例如,氨基酸序列的进一步改变(氨基酸残基的替换、插入和/或缺失),与异源多肽的融合和/或共价修饰。这些进一步的修饰可在如上公开的导致Fc受体结合和/或效应子功能改变的氨基酸修饰之前、同时或之后进行。
备选地或另外地,氨基酸修饰与一个或多个改变Fc区域的Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性功能的另外的氨基酸修饰的组合可以是有用的。本文中在这点上特别引起兴趣的起始多肽是与Clq结合且显示补体依赖性细胞毒性(CDC)的多肽。本文描述的氨基酸替换可用于改变该起始多肽结合Clq的能力和/或修饰其补体依赖性细胞毒性功能(例如,降低和优选地消除这些效应子功能)。然而,本文意欲这样的多肽,该多肽包含在一个或多个已述位置的替换且具有提高的Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)功能。例如,该起始多肽可能不能与Clq结合和/或介导CDC,且可根据本文所教导的内容对其进行修饰,从而使其获得这些另外的效应子功能。此外,可对具有预先存在的Clq结合活性,任选地还具有介导CDC能力的多肽进行修饰,从而增强这两种活性之一或全部。描述了改变Clq和/或修饰其补体依赖性细胞毒性功能的氨基酸修饰,例如,在WO00/42072中,特此将其并入本文作为参考。
如上所公开,能够设计具有改变的效应子功能的Fc区域或其部分,例如,通过修饰Clq结合和/或FcR结合,并由此改变CDC活性和/或ADCC活性。例如,能够产生具有提高的Clq结合和提高的FcγRIII结合的修饰的Fc区域(例如,具有提高的ADCC活性和提高的CDC活性)。或者,当要求降低或消除效应子功能时,可改造具有降低的CDC活性和/或降低的ADCC活性的修饰的Fc区域。在其他实施方案中,可仅增加这些活性中的一种,并任选地也降低其他活性,例如,为产生具有提高的ADCC活性但降低的CDC活性的修饰的Fc区域且反之亦然。
另一类型的氨基酸替换用于改变多肽的糖基化模式。这可以,例如,通过缺失一个或多个该多肽中存在的碳水化合物部分,和/或增加一个或多个该多肽中不存在的糖基化位点,来完成。多肽的糖基化典型地是N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链的连接。肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列,其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸。因而,多肽中这些肽序列任意之一的存在造成潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指糖N-乙酰基半乳糖胺(N-aceylgalactosamine)、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接,所述羟基氨基酸最常见的是丝氨酸或苏氨酸,尽管也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
在一些实施方案中,本发明提供这样的组合物,所述组合物包含具有Fc区域的母体多肽的修饰,其中该修饰的Fc区域包括至少一个表面残基氨基酸修饰(参见,例如,Deisenhofer,生物化学(Biochemistry),28,20(9):2361-70,1981年4月,和WO00/42072,特此将其二者都并入本文作为参考)。在其他实施方案中,本发明提供这样的组合物,其中所述组合物包含具有Fc区域的母体多肽的修饰,其中该修饰的Fc区域包括至少一个非表面残基氨基酸修饰。在其它的实施方案中,本发明包括具有Fc区域的母体多肽的变体,其中所述变体包括至少一个表面氨基酸修饰和至少一个非表面氨基酸修饰。
本发明修饰的ABM的治疗功效可以进一步通过它们在这样的宿主细胞中的产生得以提高,所述宿主细胞经糖改造具有至少一种糖蛋白修饰的糖基转移酶的改变的表达。在一个实施方案中,糖改造的宿主细胞进一步表达下列各项中的一项或多项:编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸,编码具有ManII活性的多肽的多核苷酸,或编码具有GaIT活性的多肽的多核苷酸。在优选的实施方案中,宿主细胞表达编码具有GnTIII活性或ManII活性的多肽的多核苷酸。在另一个优选的实施方案中,宿主细胞表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸,以及编码具有ManII活性多肽的多核苷酸。在再一个优选的实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是融合多肽,其包含高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域。在另一个优选的实施方案中,本发明修饰的ABM在宿主细胞中的表达导致具有增加的Fc受体结合亲和性以及增强的效应子功能的修饰ABM,其中所述宿主细胞表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸。因此,在一个实施方案中,本发明涉及这样的宿主细胞,所述宿主细胞包括(a)包括编码具有GnTIII活性的多肽的序列的分离的核酸;和(b)编码本发明的ABM的分离的多核苷酸,所述ABM诸如与人CD20结合的嵌合,灵长类化或人源化抗体。在优选的实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包括GnTIII的催化结构域的融合多肽,并且该高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶II的定位结构域。产生这样的融合多肽的方法和使用它们产生具有增加的效应子功能的抗体的方法公开于美国临时专利申请号60/495,142和美国专利申请公开号2004/0241817中,将其每个的全部内容特别并入本文作为参考。在另一个优选的实施方案中,嵌合的ABM是这样的嵌合抗体或其片段,其具有鼠B-Ly1抗体的结合特异性。在特别优选的实施方案中,嵌合抗体包括人Fc。在另一个优选的实施方案中,该抗体被灵长类化或人源化。
在一个实施方案中,一个或多个编码本发明的ABM的多核苷酸可以在组成型启动子或备选地调节表达系统的控制下进行表达。适合的调节表达系统包括,但不限于,四环素调节的表达系统,可蜕皮素诱导的表达系统,lac-转换表达系统,可糖皮质激素诱导的表达系统,可温度诱导的启动子系统,和金属硫蛋白金属可诱导表达系统。如果编码本发明的ABM的一些不同核酸被包括在宿主细胞系统中,它们中的一些可以在组成型启动子的控制下进行表达,而其它的可以在调节启动子的控制下进行表达。认为最大表达水平是稳定的多肽表达的最高可能水平,其对细胞生长速率不具有显著的不利影响,并且将使用常规实验进行测定。表达水平通过本领域通常了解的方法进行确定,所述方法包括使用特异于ABM的抗体或特异于融合ABM的肽标签的抗体进行的蛋白质印迹分析;和RNA印迹分析。在另外的备选中,多核苷酸可以操作性地连接于报道基因;基本具有与母体抗体相同结合特异性的修饰ABM的表达水平通过测量与报道基因的表达水平相关的信号来进行确定。报道基因可以与编码所述融合多肽的核酸一起被转录为单个mRNA分子;它们各自的编码序列可以通过内部核糖体进入位点(IRES)或通过不依赖帽的翻译增强子(CITE)进行连接。该报道基因可以与至少一个编码这样的修饰ABM的核酸一起翻译从而形成单一的多肽链,所述修饰的ABM基本具有与母体抗体相同的结合特异性。编码本发明的ABMs的核酸可以在单一启动子控制下操作性地连接于报道基因从而使编码融合多肽的核酸和报道基因转录到RNA分子中,所述RNA分子交错地被剪接成两个单独的信使RNA(mRNA)分子;得到的mRNAs之一翻译成所述报道蛋白质,而另一个被翻译成所述融合多肽。
修饰的ABM的表达
本领域那些技术人员众所周知的方法可以用于构建表达载体,所述表达载体包含这样的修饰ABM的编码序列以及适合的转录/翻译控制信号,所述修饰的ABM基本具有与母体抗体相同的结合特异性。这些方法包括体外重组DNA技术,合成技术和体内重组/遗传重组。参见,例如,描述在Maniatis等,分子克隆实验手册(Molecular Cloning A Laboratory Manual),冷泉港实验室,纽约(Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.)(1989)和Ausubel等,现代分子生物学手册(Current Protocols in Molecular Biology),Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中的技术。
多种宿主表达载体系统可以用于表达本发明的ABMs的编码序列。优选地,将哺乳动物细胞用作用重组质粒DNA或黏粒DNA表达载体转染的宿主细胞系统,所述重组质粒DNA或黏粒DNA表达载体包含目标蛋白质的编码序列和融合多肽的编码序列。最优选地,将CHO细胞,HEK293-EBNA细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,其它哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,或植物细胞用作宿主细胞系统。表达系统和选择方法的一些实例描述在下列参考文献,及其引用的参考文献中:Borth等,生物技术生物工程(Biotechnol.Bioen.)71(4):266-73(2000-2001),在Werner等,Arzneimittelforschung/Drug Res.48(8):870-80(1998)中,在Andersen和Krummen,现代生物技术观点(Curr.Op.Biotechnol.)(13:117-123(2002)中,在Chadd和Chamow,现代生物技术观点(Curr.Op.Biotechnol.)12:188-194(2001)中,和在Giddings,现代生物技术观点(Curr.Op.Biotechnol.)12:450-454(2001)中。在备选的实施方案中,可以预期其它的真核生物宿主细胞系统,包括用重组酵母表达载体转化的酵母细胞,所述表达载体包含本发明的ABM的编码序列,如美国专利申请号60/344,169和WO03/056914(在非人真核宿主细胞中产生人样糖蛋白的方法)中所教导的表达系统(将其每个的全部内容并入本文作为参考);用重组病毒表达载体(例如,杆状病毒)感染的昆虫细胞系统,所述病毒表达载体包含这样的修饰ABM的编码序列,所述修饰的ABM基本具有与母体抗体相同的结合特异性;用重组的病毒表达载体(例如,花椰菜花叶病毒,CaMV;烟草花叶病毒,TMV)感染的植物细胞系统或用包含本发明的ABM的编码序列的重组质粒表达载体(例如,Ti质粒)转化的植物细胞系统,包含但不限于美国专利号6,815,184(从经遗传改造的浮萍(duckweed)表达和分泌生物学活性多肽的方法)中所教导的表达系统;WO2004/057002(通过引入糖基转移酶基因在苔藓类植物细胞中产生糖基化蛋白质)和WO2004/024927(在藓类原生质体中产生胞外异源非植物蛋白质的方法)中所教导的表达系统;和美国专利申请号60/365,769,60/368,047,和WO2003/078614(在包含功能性哺乳动物GnTIII酶的转基因植物中的糖蛋白加工)中所教导的表达系统(特此将其每个的全部内容并入本文作为参考);或用重组病毒表达载体(例如,腺病毒,痘苗病毒)感染的动物细胞系统,其包括被改造从而包含编码这样的修饰ABM的DNA的多个拷贝的细胞系,所述修饰的ABM基本具有与母体抗体相同的结合特异性,所述DNA的多个拷贝稳定扩增(CHO/dhfr)或在双微染色体(例如,鼠细胞系)中不稳定扩增。在一个实施方案中,包含编码本发明的ABM的多核苷酸的载体是多顺反子的。此外,在一个实施方案中,上面讨论的ABM是抗体或其片段。在一个优选的实施方案中,该ABM是人源化的抗体。
对于本发明的方法而言,稳定的表达通常优选进行瞬时表达,因为其典型地获得更可再现的结果并且对于大规模生产也是更易于控制的。优于使用包含病毒的复制起点的表达载体,宿主细胞可以用受适合的表达控制元件(例如,启动子,增强子,序列,转录终止子,聚腺苷酸化位点等)控制的各自的编码核酸,和可选择的标志物转化。在引入外源DNA后,被改造的细胞可以容许在富集培养基中生长1-2天,并接着转到选择性培养基中。在重组质粒中的可选择标志物赋予对于选择的抗性并容许细胞的选择,所述细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中并生长形成转化灶,其又可以克隆和扩增到细胞系中。
可以使用许多选择系统,包括,但不限于,单纯疱疹病毒的胸苷激酶(Wigler等,细胞(Cell)11:223(1977)),次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski,美国国家科学院会刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:2026(1962)),和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等,细胞(Cell)22:817(1980))基因,它们分别可以用在tk-,hgprt-或aprt-细胞中。此外,抗代谢物抗性可以用作对于下列的选择的基础:赋予针对甲氨蝶呤的抗性的dhfr基因(Wigler等,美国国家科学院会刊(Natl.Acad.Sci.USA)77:3567(1989);O′Hare等,美国国家科学院会刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78:1527(1981));赋予针对霉酚酸的抗性的gpt基因(Mulligan&Berg,美国国家科学院会刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78:2072(1981));赋予针对氨基糖苷G-418的抗性的neo基因(Colberre-Garapin等,分子生物学杂志(J. Mol.Biol.)150:1(1981));和赋予针对潮霉素的抗性的hygro基因(Santerre等,基因(Gene)30:147(1984)。近期,已经描述了另外的可选择基因,即容许细胞使用吲哚取代色氨酸的trpB基因;容许细胞使用组氨醇取代组氨酸的hisD基因(Hartman&Mulligan,美国国家科学院会刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:8047(1988));谷氨酰胺合成酶系统;和赋予针对鸟氨酸脱羧酶抑制剂,2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸,DFMO的抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶)(McConlogue,在分子生物学的当前交流(Current Communications in Molecular Biology),冷泉港实验室版本(1987)中)。
表达包含具有改变的糖基化的Fc区域的修饰ABM
在另一个方面,本发明还涉及修饰由宿主细胞产生这样的修饰ABMs的糖基化模式的方法,所述修饰的ABMs在V或CH1区域中包含至少一个氨基酸替换,所述方法包括在所述宿主细胞中表达编码本发明修饰的ABM的核酸和编码具有GnTIII活性的多肽的核酸或包括这些核酸的载体。优选地,修饰的多肽是IgG或其片段,所述IgG或其片段包含Fc区域。在特别优选的实施方案中,该ABM是人源化的抗体或其片段。在另一个实施方案中,改造该宿主细胞以使其共表达本发明的ABM,GnTIII和甘露糖苷酶II(ManII)。
由本发明的宿主细胞产生的被修饰的ABMs作为修饰的结果,显示增加的Fc受体结合亲和性和/或增加的效应子功能。在特别优选的实施方案中,该修饰的ABM是包含Fc区域的人源化的抗体或其片段。优选地,增加的Fc受体结合亲和性是与Fcγ激活受体,诸如FcγRIIIa受体的增加的结合。增加的效应子功能优选地是下列的一个或多个的增加:增加的抗体依赖性细胞毒性,增加的抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP),增加的细胞因子分泌,增加的免疫复合体介导的抗原呈递细胞对抗原的吸收,增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性,增加的与NK细胞的结合,增加的与巨噬细胞的结合,增加的与多形核细胞(PMNs)的结合,增加的与单核细胞的结合,增加的靶结合抗体的交联,增加的定向信号传导诱导的程序性细胞调亡,增加的树突细胞成熟,和增加的T细胞引发。
效应子功能可以通过多种本领域技术人员已知的测定进行测量和/或确定。在美国申请公开号2004/0241817A1描述了多种用于测量效应子功能的测定,其包括Fc受体结合亲和性和补体依赖性细胞毒性,将其全部内容引入本文作为参考。可以测量细胞因子的分泌,例如,利用夹心式ELISA,参见,例如,McRae等,免疫学杂志(J.Immunol.)164:23-28(2000)和可获自www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols的细胞因子夹心式ELISA方案,或通过在Takahashi等,英国药理学杂志(British J.Pharmacol.)137:315-322(2002)中描述的方法,将其每篇的全部内容引入本文作为参考。树突细胞成熟,例如,可以利用Kalergis和Ravetch,试验医学杂志(J.Exp.Med.)195:1653-59(2002)中所述的测定对其进行确定,将其全部内容引入本文作为参考。吞噬作用和抗原吸收/呈递测定的实例可以由Gresham等,试验医学杂志(J.Exp.Med.)191:515-28(2000);Krauss等,免疫学杂志(J.Immunol.)153:1769-77(1994);和Rafiq等,临床研究杂志(J.Clin.Invest.)110:71-79(2002),和Hamano等,免疫学杂志(J.Immunol.)164:6113-19(2000)提供,将其每篇的全部内容引入本文作为参考。可以测量细胞表面受体的下调,例如,通过Liao等,血液(Blood)83:2294-2304(1994)中所述的方法进行,将其全部内容引入本文作为参考。一般的方法,方案和测定,可参见细胞生物学:实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Handbook),Celis,J.E.版本(第2版,1998),将其全部内容引入本文作为参考。使以上参考的方法,方案和测定适合于在本发明中使用在本领域技术人员的技术范围中。
本发明还涉及在宿主细胞中产生具有修饰的寡糖的本发明的ABM的方法,所述方法包括(a)在容许按照本发明的ABM产生的条件下,培养经改造而表达至少一个编码具有GnTIII活性的多肽的核酸的宿主细胞,其中具有GnTIII活性的所述多肽以一定量来进行表达,所述量足以修饰在由所述宿主细胞产生的所述ABM的Fc区域中的寡糖;和(b)分离所述ABM。在一个优选的实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包括GnTIII的催化结构域的融合多肽。在特别优选的实施方案中,该融合多肽还包括高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域。
优选地,高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶II或GnTI的定位结构域。或者,高尔基体定位结构域选自由下列各项组成的组:甘露糖苷酶I的定位结构域,GnTII的定位结构域,和α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。由本发明的方法产生的ABMs具有增加的Fc受体结合亲和性和/或增加的效应子功能。优选地,增加的效应子功能是下列的一个或多个:增加的Fc-介导的细胞毒性(包括增加的抗体依赖性细胞毒性),增加的抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP),增加的细胞因子分泌,增加的免疫复合体介导的抗原呈递细胞对抗原的吸收,增加的与NK细胞的结合,增加的与巨噬细胞的结合,增加的与单核细胞的结合,增加的与多形核细胞的结合,增加的定向信号传导诱导的程序性细胞死亡,增加的靶结合抗体的交联,增加的树突细胞成熟,或增加的T细胞引发。优选地,增加的Fc受体结合亲和性是增加的与Fc激活受体,诸如FcγRIIIa的结合。在特别优选的实施方案中,该ABM是人源化抗体或其片段。
在另一个实施方案中,本发明涉及由本发明方法所产生的基本具有与母体抗体相同结合特异性的修饰ABM,其在所述多肽的Fc区域中具有增加比例的等分寡糖。意欲这样的ABM涵盖包括Fc区域的抗体和其片段。在优选的实施方案中,该ABM是人源化抗体。在一个实施方案中,在ABM的Fc区域中的等分的寡糖的百分比是总寡糖的至少50%,更优选地,至少60%,至少70%,至少80%,或至少90%,并且最优选地是至少90-95%。在另一个实施方案中,通过本发明的方法产生的ABM作为其通过本发明的方法修饰其寡糖的结果在Fc区域中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。在一个实施方案中,非岩藻糖基化寡糖的百分比是至少50%,优选地,至少60%到70%,最优选地至少75%。非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合的或复合的类型。在特别优选的实施方案中,由宿主细胞和本发明的方法产生的ABM在Fc区域中具有增加比例的等分的,非岩藻糖基化的寡糖。该等分的,非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合的或复合的。具体而言,本发明的方法可以用于产生ABMs,其中在ABM的Fc区域中的至少15%,更优选地至少20%,更优选地至少25%,更优选地至少30%,更优选地至少35%的寡糖是等分的,非岩藻糖基化的。本发明的方法还可以用于产生多肽,其中在多肽的Fc区域中的至少15%,更优选地至少20%,更优选地至少25%,更优选地至少30%,更优选地至少35%的寡糖是等分的杂合非岩藻糖基化的。
在另一个实施方案中,本发明涉及通过本发明的方法所产生的基本具有与母体抗体相同结合特异性的修饰ABM,其经改造而具有增加的效应子功能和/或增加的Fc受体结合亲和性。优选地,增加的效应子功能是下列的一个或多个:增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性(包括增加的抗体依赖性细胞毒性),增加的抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP),增加的细胞因子分泌,增加的免疫复合体介导的抗原呈递细胞对抗原的吸收,增加的与NK细胞的结合,增加的与巨噬细胞的结合,增加的与单核细胞的结合,增加的与多形核细胞的结合,增加的定向信号传导诱导的程序性细胞死亡,增加的靶结合抗体的交联,增加的树突细胞成熟,或增加的T细胞引发。在优选的实施方案中,增加的Fc受体结合亲和性是与Fc激活受体,最优选地,FcγRIIIa的增加的结合。在一个实施方案中,该修饰的ABM是包含Fc区域的抗体,抗体片段,或包括等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域的融合蛋白。在特别优选的实施方案中,该ABM是人源化抗体。
包含修饰的ABM的药物组合物
本发明还涉及药物组合物,其包括本发明的修饰的ABMs和药用载体。
可以使用任何常规载体材料。该载体材料可以是适合eteral、经皮或胃肠外施药的有机或无机材料。适合的载体包括水、明胶、阿拉伯树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚亚烷基二醇、矿脂等。此外,该药物制剂可含有其他药物活性剂。可依照药物配方可接受惯例加入额外的添加剂,如增香剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂等。
本文所使用的术语“药用”指那些化合物、物质、组合物和/或剂型,它们在可靠的医学判断范围内,适合用于与人和动物的组织相接触,而不具过量毒性、刺激、变应性反应或其他问题或并发症,并与合理的益处/危险性比率相匹配。
本发明还涉及这些用于治疗或预防癌症的药物组合物。本发明还涉及用于治疗或预防癌症的方法,所述方法包括施用治疗有效量的本发明药物组合物。
优选地,所述癌选自由乳腺癌,膀胱癌,头和颈部癌,皮肤癌,胰腺癌,肺癌,卵巢癌,结肠癌,前列腺癌,肾癌,和脑癌组成的组。
本发明还涉及这些用于治疗或预防癌症前期病症或病灶的药物组合物。本发明还涉及用于治疗或预防癌症前期病症或病灶的方法,所述方法包括施用治疗有效量的本发明药物组合物。
优选地,所述癌症前期病症或病灶选自由口腔粘膜白斑病,光化性角化病(日光性角化病),结肠或直肠癌症前期息肉,胃上皮发育不良,腺瘤发育不良,遗传性非息肉性结肠癌综合征(HNPCC),巴雷特食道,膀胱发育不良,和癌症前期宫颈病症组成的组。
本发明还提供产生和使用宿主细胞系统用于产生本发明的修饰ABMs的糖形的方法,所述修饰的ABM具有增加的Fc受体结合亲和性,优选地增加的与Fc激活受体的结合,和/或具有增加的效应子功能,所述效应子功能包括抗体依赖性细胞毒性。可以用于本发明的修饰ABMs的糖改造方法详细描述于美国专利号6,602,684,和临时美国专利申请号60/441,307和WO2004/065540中,将其每个的全部内容并入本文作为参考。或者,本发明的修饰的ABMs可以进行糖改造从而在Fc区域中具有减少的岩藻糖残基,所述糖改造按照公布于EP1176195A1中的技术进行,将其全部内容并入本文作为参考。
产生用于制备具有改变的糖基化模式的修饰ABM的细胞系
本发明提供宿主细胞表达系统,其用于产生具有修饰的Fc糖基化模式的本发明修饰的ABMs。特别地,本发明提供宿主细胞系统,其用于产生具有提高的治疗价值的本发明修饰的ABMs的糖形。因此,本发明提供被选择或被改造以用于表达具有GnTIII活性的多肽的宿主细胞表达系统。在一个实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。具体而言,这样的宿主细胞表达系统可以进行改造从而包括编码具有GnTIII的多肽的重组核酸分子,其操作性地连接于组成型或调节性启动子系统。
在一个具体实施方案中,本发明提供宿主细胞,其已经改造而表达至少一个编码融合多肽的核酸,所述融合多肽具有GnTIII活性并包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域。在一个方面,宿主细胞经改造具有核酸分子,所述核酸分子包括至少一个编码融合多肽的基因,所述融合多肽具有GnTIII活性并包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域。
一般而言,任何类型的培养的细胞系,包括上述讨论的细胞系,可以用作背景来改造本发明的宿主细胞系。在一个优选的实施方案中,将CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,其它哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,或植物细胞用作背景细胞系以产生本发明的改造的宿主细胞。
本发明意欲涵盖任何改造的宿主细胞,其表达具有GnTIII活性的多肽,包括包含如本文定义的异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。
一个或数个编码具有GnTIII活性的多肽的核酸可以在组成型启动子,或备选地,调节性表达系统控制下进行表达。这些系统是本领域众所周知的,并且包括上面讨论的系统。如果编码具有GnTIII活性并包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的几种不同核酸被包括在宿主细胞系统中,它们中的一些可以在组成型启动子的控制下进行表达,而其它的在调节性启动子的控制下进行表达。具有GnTIII活性的融合多肽的表达水平由本领域通常了解的方法所确定,所述方法包括蛋白质印迹分析,RNA印迹分析,报道基因表达分析或GnTIII活性测量。或者,可以使用结合GnTIII的生物合成产物的凝集素,例如,E4-PHA凝集素。或者,可以使用功能性测定,其测量由这样的细胞产生的抗体介导的增加的Fc受体结合或增加的效应子功能,所述细胞用编码具有GnTIII活性的多肽的核酸进行改造。
表达具有修饰的糖基化模式的蛋白质的转染子或转化体的鉴定
包含本发明修饰的ABM的编码序列并表达生物学活性基因产物的宿主细胞可以通过至少下列四个常规方法进行鉴定;(a)DNA-DNA或DNA-RNA杂交;(b)“标志物”基因功能的存在或缺乏;(c)如通过各个mRNA转录物在宿主细胞中表达所测量的评估转录的水平;和(d)如通过免疫测定或通过其生物学活性所测量的来检测基因产物。
在第一个方法中,本发明修饰的ABM的编码序列和具有GnTIII活性的多肽的编码序列的存在可以使用包含核苷酸序列的探针,通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交来进行检测,所述核苷酸序列与各个编码序列,或其部分或衍生物分别具有同源性。
在第二个方法中,重组表达载体/宿主系统可以基于某些“标志物”基因功能(例如,胸苷激酶活性,对抗生素的抗性,对甲氨蝶呤的抗性,转化表型,在杆状病毒中的包含体形成等)的存在或缺乏来进行鉴定和选择。例如,如果将本发明修饰的ABM的编码序列,或其片段,和具有GnTIII活性的多肽的编码序列插入载体的标志物基因序列中,包含各个编码序列的重组体能够通过标志物基因功能的缺乏而进行鉴定。或者,标志物基因可以在用于控制编码序列的表达的相同或不同启动子控制下与编码序列一起串联排列。响应于诱导或选择的标志物的表达显示本发明修饰的ABM的编码序列和具有GnTIII活性的多肽的编码序列的表达。
在第三个方法中,本发明修饰的ABM的编码区,或其片段,和具有GnTIII活性的多肽的编码序列的转录活性能够通过杂交测定进行评估。例如,RNA可以使用探针通过RNA印迹来进行分离和分析,所述探针与本发明修饰的ABM的编码序列,或其片段,和具有GnTIII活性的多肽的编码序列,或其特定部分具有同源性。或者,可以对宿主细胞的总核酸进行抽提并测定与这些探针的杂交。
在第四个方法中,蛋白质产物的表达可以,例如通过蛋白质印迹法,免疫测定诸如放射免疫沉淀法,酶联免疫测定等来进行免疫学评估。然而,表达系统成功的最终测试包括检测生物学活性的基因产物。
产生和使用具有增加的效应子功能的修饰的ABMs,所述效应子功能包括抗体依赖性细胞毒性
在优选的实施方案中,本发明提供嵌合的修饰ABMs的糖形,所述嵌合的修饰ABMs基本具有与鼠B-Ly1抗体相同的结合特异性并具有增加的效应子功能,所述效应子功能包括抗体依赖性细胞毒性。已经在前面描述了抗体的糖基化改造。参见,例如美国专利号6,602,684,将其全部内容并入本文作为参考。
将未缀合的单克隆抗体(mAbs)用于治疗一些类型的癌症的临床试验最近已经产生了令人鼓舞的结果。Dillman,癌症的生物疗法和放射性药物(Cancer Biother.&Radiopharm.)12:223-25(1997);Deo等,今日免疫(Immunology Today)18:127(1997)。一种嵌合的,未缀合的IgG1已经获批准用于低级或滤泡性的B-细胞非霍奇金淋巴瘤。Dillman,癌症的生物疗法和放射性药物(Cancer Biother.&Radiopharm.)12:223-25(1997),而另一种未缀合的mAb,靶向实体乳腺肿瘤的人源化IgG1已经显示了在III期临床试验中的有前景的结果。Deo等,今日免疫(Immunology Today)18:127(1997)。这两种mAbs的抗原在它们各自的肿瘤细胞中高度表达并且抗体在体外和体内通过效应细胞介导有效的肿瘤破坏。与此相对,许多其它的具有优良肿瘤特异性的未缀合mAbs不能引发在临床上有用的足够潜能的效应子功能。Frost等,癌症(Cancer)80:317-33(1997);Surfus等,免疫疗法杂志(J. Immunother.)19:184-91(1996)。对于这些弱mAbs中的一些而言,目前测试了辅助的细胞因子疗法。细胞因子的加入可以通过增加循环淋巴细胞的活性和数量而刺激抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。Frost等,癌症(Cancer)80:317-33(1997);Surfus等,免疫疗法杂志(J. Immunother.)19:184-91(1996)。ADCC,一种对抗体靶向的细胞的溶胞攻击,在白细胞受体与抗体的恒定区(Fc)结合后得以引发。Deo等,今日免疫(ImmunologyToday)18:127(1997)。
一种增加未缀合的IgGls的ADCC活性的不同的,但是补充性的方法是改造抗体的Fc区域。蛋白质改造研究已经显示FcγRs与IgG CH2结构域较低的铰链区相互作用。Lund等,免疫学杂志(J. Immunol.)157:4963-69(1996)。然而,FcγR结合也需要在CH2区域中的保守Asn297处共价连接的寡糖的存在。Lund等,免疫学杂志(J. Immunol.)157:4963-69(1996);Wright和Morrison,生物技术趋势(Trends Biotech.)15:26-31(1997),提示寡糖和多肽都直接有利于相互作用的位点或需要寡糖来维持活性CH2多肽构象。因此能够开发对寡糖结构的修饰用作增加相互作用亲和性的方式。
IgG分子在其Fc区域中携带两个N连接的寡糖,每个在各自的重链上。如任何糖蛋白,抗体作为糖形的群产生,其共享相同的多肽主链但是具有不同的连接于糖基化位点的寡糖。通常见于血清IgG的Fc区域中的寡糖是复合的双触角的类型(Wormald等,生物化学(Biochemistry)36:130-38(1997),其具有低水平的末端唾液酸和等分的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),和不同程度的末端半乳糖基化和核心岩藻糖基化。一些研究显示FcγR结合所需要的最小碳水化合物结构位于寡糖核心中。Lund等,免疫学杂志(J.Immunol.)157:4963-69(1996)。
用于产生未缀合的治疗性mAbs的用在工业和研究中的小鼠或仓鼠来源的细胞系通常将所需的寡糖决定子连接于Fc位点。然而,在这些细胞系中表达的IgGs,缺乏以低量见于血清IgGs的等分GlcNAc。Lifely等,糖生物学(Glycobiology)318:813-22(1995)。与此相对,最近观察到大鼠的骨髓瘤产生的,人源化IgG1(CAMPATH-1H)在其糖形的一些中携带等分的GlcNAc。Lifely等,糖生物学(Glycobiology)318:813-22(1995)。大鼠的细胞衍生的抗体与由标准的细胞系产生的CAMPATH-1H抗体相比,达到了相似的最大体外ADCC活性,但是其以显著更低的抗体浓度存在。
CAMPATH抗原通常以高水平存在于淋巴瘤细胞上,并且这种嵌合的mAb在缺乏等分的GlcNAc时具有高ADCC活性。Lifely等,糖生物学(Glycobiology)引8:813-22(1995)。在N-连接的糖基化途径中,等分的GlcNAc通过GnT-III加入。Schachter,生物化学细胞生物学(Biochem.CellBiol.)64:163-81(1986)。
以前的研究使用单一的抗体产生CHO细胞系,其经预先改造从而以外部调节的方式,表达不同水平的克隆的GnTIII基因酶(Umana,P.,等,自然生物技术(Nature Biotechnol.)17:176-180(1999))。这种方法首次在修饰抗体的GnTIII的表达和ADCC活性之间建立严格的关联。因此,本发明预期这样的重组,嵌合抗体或其具有鼠B-Ly1抗体结合特异性的片段,其具有由增加的GnTIII活性所导致的改变的糖基化。增加的GnTIII活性导致在修饰的ABM的Fc区域中,等分的寡糖的百分比的增加,以及岩藻糖残基的百分比的减少。这种抗体,或其片段,具有增加的Fc受体结合亲和性和增加的效应子功能。此外,本发明涉及抗体片段和融合蛋白,它们包括等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域。
按照本发明方法的修饰ABMs的治疗性应用
在最广泛的意义上,本发明修饰的ABMs可以用于体内或体外靶向表达靶抗原的细胞,特别是当所述靶抗原在细胞表面上表达时。可以靶向表达靶抗原的细胞,以用于诊断或治疗的目的。在一个方面中,本发明修饰的ABMs可以用于改变表达靶抗原的细胞中的细胞信号传导活性。在另一个方面中,本发明修饰的ABMs可以用于改变一个或多个靶抗原的交联和/或低聚作用。用于本发明修饰的ABM的靶抗原可以是细胞表面受体,其包括,但不限于CD20,CD21,CD22,CD19,CD47,CD99,CD2,CD45,Her1(EGFR),Her2/neu,Her3,Her4,TRAIL受体(例如,TRAILR1,TRAILR2),TNFR,FGF受体(例如,FGFR1),IGF受体,PDGF受体,VEGF受体,和其他细胞表面结合受体。在特定的实施方案中,靶抗原是CD20。本发明修饰的ABM还用于抑制细胞周期,导致靶细胞(例如,肿瘤细胞)的程序性细胞死亡,抑制血管发生和/或导致靶细胞的分化。
在另一个方面,本发明涉及用于治疗这样的疾病的方法,所述疾病可以通过靶抗原改变的细胞信号传导活性和/或改变的介导一个或多个靶抗原交联能力,得以治疗,所述方法包括将治疗有效量的本发明修饰的ABM施用于需要其的受试者。在具体的实施方案中,所述修饰的ABM是抗体。在更特定的实施方案中,所述抗体是人源化的。可以对其施用修饰的ABM的疾病的实例包括,但不限于,细胞增殖疾病或病症,自体免疫疾病或病症,和与细菌或病毒感染相关的疾病或病症。
在一个实施方案中,所述疾病或病症是细胞增殖病症。可以通过本发明的ABM治疗的细胞增殖病症的实例包括,但不限于,位于腹部、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头和颈部、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸区和泌尿生殖系统中的瘤,癌症,恶性肿瘤和/或肿瘤。可以用本发明的ABM治疗的具体的瘤,癌症,恶性肿瘤和/或肿瘤包括,但不限于,表皮和鳞状细胞癌,神经胶质瘤,胰腺癌,卵巢癌,前列腺癌,乳腺癌,膀胱癌,头和颈部癌症,肾细胞癌,结肠癌,结肠直肠癌,肺癌,脑肿瘤,恶性黑素瘤,白血病,淋巴瘤,T细胞淋巴瘤,多发性骨髓瘤,胃癌,宫颈癌,子宫内膜癌,食道癌,肝癌,皮肤癌,尿道癌,绒毛膜癌,咽癌,喉癌,泡膜细胞增生症,塞尔托利细胞瘤,子宫内膜增生,子宫内膜异位,胚组织瘤,纤维肉瘤,卡波西肉瘤,血管瘤,海绵状血管瘤,成血管细胞瘤,视网膜神经胶质瘤,星形细胞瘤,神经纤维瘤,少突神经胶质细胞瘤,成神经管细胞瘤,成神经节细胞瘤,神经胶质瘤,横纹肌肉瘤,错构胚细胞瘤,骨源性肉瘤,平滑肌肉瘤,甲状腺肉瘤,尤因肉瘤,和维尔姆斯瘤。
类似地,也可以用本发明修饰的ABMs治疗其它细胞增殖性病症。这些细胞增殖性病症的实例包括,但不限于:高丙种球蛋白血病,淋巴增生性疾病,副球蛋白血症,紫癜,结节病,塞泽里综合征,瓦尔登斯特伦巨球细胞血症,戈谢病,组织细胞增多症和位于上面列出的器官系统中除了肿瘤之外的任何其它细胞增殖性病症。
自体免疫疾病或病症的实例包括,但不限于,免疫介导的血小板减少症,诸如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少紫癜,皮肌炎,小舞蹈病,狼疮性肾炎,风湿热,多腺综合征,亨诺赫-舍恩莱因紫癜,链球菌感染后肾炎,结节红斑,Takayasu′s动脉炎,爱迪生氏病,多形红斑,结节性多动脉炎,关节强直性脊椎炎,古德帕斯彻综合征,闭塞性血栓血管炎,原发性胆硬化,桥本甲状腺炎,甲状腺毒症,慢性活性肝炎,多肌炎/皮肌炎,多软骨炎,pamphigus vulgaris,韦格纳肉芽肿病,膜性肾病,肌萎缩性脊髓侧索硬化,脊髓痨,多肌痛(polymyalgia),恶性贫血,快速进行性血管球性肾炎和成纤维齿槽炎,炎症响应,诸如炎性皮肤疾病,其包括牛皮癣和皮炎(例如,特异性皮炎);系统硬皮病和硬化症;与炎性肠疾病相关的响应(诸如局限性回肠炎和溃疡性结肠炎);呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征;ARDS);皮炎;脑膜炎;脑炎;眼色素层炎;结肠炎;肾小球肾炎;变应性疾病,诸如湿疹和哮喘,以及涉及T细胞浸润和慢性炎性响应的其他病症;动脉粥样硬化;白细胞粘附缺陷;类风湿性关节炎;系统性红斑狼疮(SLE);糖尿病(例如,1型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病);多发性硬化;雷诺综合征(Reynaud′ssyndrome);自体免疫甲状腺炎;变应性脑脊髓炎;斯耶格伦综合征(Sjorgen′s syndrome);青少年发作糖尿病;和与由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发超敏性相关的免疫响应,所述细胞因子和T-淋巴细胞典型地见于结核,肉样瘤病,多肌炎,肉芽肿病和脉管炎中;恶性贫血(艾迪生氏病);涉及白细胞血细胞渗出的疾病;中枢神经系统(CNS)炎性病症;多器官损伤综合征;溶血性贫血(包括,但不限于冷球蛋白血症或库姆斯阳性贫血症);重症肌无力;抗原-抗体复合物介导的疾病;抗小球基膜疾病;抗磷脂综合征;变应性神经炎;格雷夫斯病(Graves′disease);兰-伊(Lambert-Eaton)肌无力综合征;大疱性类天疱疮;天疱疮;自体免疫多内分泌腺病;赖特病(Reiter′s disease);僵直人综合征(stiff-mansyndrome);贝赫切特疾病(Behcet disease);巨细胞性动脉炎;免疫复合物肾炎;IgA肾病;IgM多神经病;免疫血小板减少性紫癜(ITP)或自体免疫血小板减少症等。
本发明修饰的ABM可以单独或与其他治疗法或治疗试剂组合使用,从而治疗可以通过增高或降低细胞信号传导活性和/或一个或多个靶抗原交联治疗的疾病。在一个实施方案中,本发明修饰的ABMs可以单独用于体内靶向和杀伤肿瘤细胞。修饰的ABMs还可以与适合的治疗剂组合使用以治疗人癌症。例如,该修饰的ABMs可以与标准或常规治疗方法诸如化学疗法,放射治疗组合使用或可以缀合或连接于治疗性药物,或毒素,以及淋巴因子或肿瘤抑制生长因子,以将治疗剂递送到癌症位点。在特定的实施方案中,本发明修饰的ABMs的缀合物包括(1)免疫毒素(修饰的ABM和细胞毒性部分的缀合物)和(2)标记的(例如,放射性标记的,酶标记的或荧光染料标记的)修饰ABMs,其中该标记提供鉴定包含标记的ABM的免疫复合体的方法。该修饰的ABM还可以用于通过天然补体方法来诱导裂解,并且与正常存在的抗体依赖性细胞毒性细胞相互作用。
免疫毒素的细胞毒性部分可以是细胞毒性药物或细菌或植物起源的酶促活性毒素,或这样的毒素的酶促活性片段(“A链”)。所用的酶促活性毒素及其片段是白喉A链,白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相似豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白IIA链、α-帚曲霉素、光桐蛋白、香石竹毒蛋白、垂序登陆蛋白(PAPI,PAPII,和PAP-S)、苦瓜蛋白(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白,sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素,和伊诺毒素。在另一个实施方案中,该修饰的ABMs与小分子抗癌药物缀合。修饰的ABM和这些细胞毒性部分的缀合物使用多种双功能蛋白偶联剂进行制备。这些试剂的实例是SPDP,IT,亚氨酸酯的双功能衍生物诸如二甲基adipimidate盐酸,活性酯诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯,醛诸如戊二醛,二叠氮化合物诸如二-(p-叠氮苯甲酰基)已二胺,二重氮化衍生物诸如二-(p-重氮苯甲酰基)-乙二胺,二异氰酸酯诸如甲苯基2,6-二异氰酸酯,和双活性氟化合物诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯。毒素的溶解部分可以连接于修饰的ABMs的Fab片段。本领域已知另外的适合毒素,如在例如公开的美国专利申请号2002/0128448中显示的,将其全部内容并入本文作为参考。
在一个实施方案中,将本发明的抗原结合分子缀合于另外的部分,如放射性标记或毒素。该缀合的修饰ABMs能通过本领域众所周知的大量方法产生。
多种放射性核素适用于本发明,且认为本领域的技术人员具有容易地在多种情形下确定哪种放射性核素是最适合的能力。例如,131碘是熟知的用于靶向免疫疗法的放射性核素。然而,131碘的临床有效性可被若干因素所限制,包括:8天物理半衰期;血液中和肿瘤位点处碘化抗体的脱卤作用;和对肿瘤中局部剂量沉积可以是非最适性的发射特征(例如,大γ成分)。随着优秀螯合剂的出现,将金属螯合基团连接到蛋白质上的机会增加了利用其他放射性核素如111铟和90钇的机会。90钇为用于放射免疫疗法应用提供若干益处;90钇的64小时半衰期足够长,从而容许肿瘤的抗体积累,且不同于例如131碘,90钇是在其衰变中不伴随γ照射的,在组织中具有100-1000个细胞直径范围的高能量纯β放射体。此外,贯穿辐射的最少量容许给门诊病人施用90钇标记的抗体。另外,细胞杀伤对标记抗体的内化没有要求,且电离辐射的局部发射应该对缺乏该靶抗原的相邻肿瘤细胞是致死因子。
90钇标记的本发明修饰的ABM的有效单次治疗剂量(即,治疗有效量)在约5-约75mCi的范围内,更优选地,约10-约40mCi的范围内。131碘标记的本发明ABM的有效单次治疗非骨髓可消融剂量在约5-约70mCi的范围内,更优选地,约5-约40mCi。131碘标记的本发明抗体的有效单次治疗可消融剂量(即,可以需要自体同源骨髓移植)在约30-约600mCi的范围内,更优选地,约50-低于约500mCi。在与按照本发明的嵌合抗体的缀合物中,由于比鼠抗体更长的循环半衰期,131碘标记的嵌合抗体的有效单次治疗非骨髓可消融剂量在约5-约40mCi的范围内,更优选地,低于约30mCi。对于,例如111铟标记的成像标准,典型地低于约5mCi。
关于本发明的放射性标记抗体,以其进行的疗法还能利用单独疗法治疗或利用多重治疗发生。由于该放射性核素成分,优选在治疗前,“收获”外周干细胞(“PSC”)或骨髓(“BM”)用于经历了由放射所导致的潜在致命骨髓毒性的患者。利用标准技术收获BM和/或PSC,并且接着进行清洗和冷冻用于可能的再输注。另外,最优选地,在治疗前,对患者进行利用诊断标记抗体(例如,使用111铟)的诊断剂量学研究,其目的是确保治疗性标记抗体(例如,使用90钇)不会在任何正常器官或组织中非必要地“浓缩”。
在一个实施方案中,本发明的嵌合的糖基改造的修饰ABM缀合于蓖麻毒蛋白A链。最有利地,蓖麻毒蛋白A链是去糖基化并通过重组方式产生的。制备该蓖麻毒蛋白的免疫毒素的有利方法描述于Vitetta等,Science(科学)238:1098(1987),特此将其并入作为参考。
当出于诊断目的,用于体外杀伤人癌细胞时,该缀合物将典型地以至少约10nM的浓度加入细胞培养基中。配制和进行体外应用的施用方式不是关键性的。将通常使用与培养物或灌注介质相容的水性制剂。可以通过常规技术来读出细胞毒性以确定癌症的存在或程度。
如上讨论的,可以通过将放射性同位素(例如,I,Y,Pr)缀合于本发明嵌合的,糖基改造的和/或修饰的ABM而制备细胞毒性的放射性药物以治疗癌症。用于本文时,术语“细胞毒性部分”倾向于包括这些同位素。
在另一个实施方案中,用细胞毒性药物填充脂质体并用本发明的ABMs包被脂质体。因为许多本发明修饰的ABM的靶分子在细胞表面上(例如,在恶性B细胞表面上存在许多CD20分子)表达,该方法允许将大量药物递送到正确的细胞类型。
将这些治疗剂缀合于抗体的技术是众所周知的(见,例如Arnon等,“在癌症治疗中使用的药物的免疫靶标的单克隆抗体”(″MonoclonalAntibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy″),在单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy),Reisfeld等(eds.),243-56页(Alan R.Liss,Inc.1985)中;Hellstrom等,“药物递送的抗体”(″Antibodies For Drug Delivery″),在控制药物递送(Controlled DrugDelivery)(第2版)中,Robinson等(eds.),623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe,“在癌症治疗中的细胞毒性剂的抗体载体:综述”(″AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review″),在单克隆抗体′84:生物和临床应用(Monoclonal Antibodies′84:Biological And ClinicalApplications),Pinchera等(eds.),475-506页(1985)中;和Thorpe等,“抗体毒素缀合物的制备和细胞毒性性质”(″The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody Toxin Conjugates″),免疫综述(Immunol. Rev.),62:119-58(1982)(将其每篇全部内容引入本文作为参考)。
另外,本发明的ABMs的其它治疗性应用包括,例如通过重组DNA技术缀合或连接于能够将前药转化成细胞毒性药物的酶,和将抗体-酶缀合物与前药组合使用从而在肿瘤位点将前药转化成细胞毒性剂(见,例如Senter等,“抗体-碱性磷酸酶的抗肿瘤作用”(″Anti-Tumor Effects ofAntibody-alkaline Phosphatase″)美国国家科学院会刊(proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:4842-46(1988);“由单克隆抗体-碱性磷酸酶缀合物引起的磷酸化Mitocycin C和依托泊苷衍生物的体外和体内抗肿瘤活性的增强”(″Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites ofPhosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by MonoclonalAntibody-Alkaline Phosphatase Conjugates″),癌症研究(Cancer Research)49:5789-5792(1989);和Senter,“由抗体-酶缀合物引起的前体药物的活化:癌症治疗的新方法”(″Activation of Prodrugs by Antibody-EnzymeConjugates:A New Approach to Cancer Therapy″),FASEB J.4:188-193(1990))。
此外,本发明的ABMs的另外的治疗性应用,包括,在存在补体的情况下使用未缀合的,或作为抗体-药物或抗体-毒素缀合物的部分从而从癌症患者的骨髓中去除肿瘤细胞。按照该方法,可以通过用抗体处理对自体骨髓进行离体(ex vivo)清洗,并将骨髓输注回患者(见,例如Ramsay等,“利用单克隆抗体进行的骨髓清洗”(″Bone Marrow Purging UsingMonoclonal Antibodies″)临床免疫学杂志(J.Clin.Immunol.),8(2):81-88(1988))。
此外,预期本发明包括包含抗原结合结构域的单链免疫毒素,所述单链免疫毒素基本容许与母体抗体相同的结合特异性(例如,包含母体抗体CDRs的多肽),并且所述单链免疫毒素还包含毒素多肽。本发明的单链免疫毒素可以用于体内治疗人癌症。
类似地,可以将融合蛋白用于体内治疗人癌症,所述融合蛋白包括至少本发明ABM的抗原结合区,和与之连接的至少第二蛋白的功能活性部分,所述第二蛋白具有抗肿瘤活性,例如淋巴因子或制癌蛋白。
本发明提供用于选择性杀伤表达细胞表面受体的肿瘤细胞的方法,所述细胞表面受体包括,但不限于CD20,Her1(EGFR),Her2/neu,Her3,Her4,TRAIL受体(例如,TRAILR1,TRAILR2),TNFR,FGF受体(例如,FGFR1),IGF受体,PDGF受体,VEGF受体,以及其他细胞表面结合受体。该方法包括将本发明修饰的ABM(缀合的,例如,作为免疫毒素,或未缀合的)与所述肿瘤细胞反应。这些肿瘤细胞可以来自人癌症。
此外,本发明提供体内治疗癌症(例如,人癌症)的方法。该方法包括将药用有效量的组合物施用于受试者,所述组合物包括至少一种本发明修饰的ABM(缀合的,例如,作为免疫毒素,或未缀合的)。
在进一步的方面,本发明涉及用于治疗B细胞增殖病症,包括B细胞淋巴瘤,以及完全或部分地由致病自体抗体基于B细胞的损耗而产生的自体免疫疾病的改善的方法,所述方法包括将治疗有效量的本发明的ABM施用于需要其的人类受试者。在优选的实施方案中,ABM是糖改造的抗CD20抗体,其具有与鼠B-Ly1抗体基本相同的结合特异性。在另一个优选的实施方案中,所述抗体是人源化的。在本发明的这个方面,本发明的ABM用于在延长的期限内损耗正常B细胞的血液。
按照本发明的实践,受试者可以是人,马,猪,牛,鼠,犬,猫,和.鸟受试者。此外本发明还包括其它的温血动物。
本发明还提供抑制人肿瘤细胞生长,治疗受试者中肿瘤,和治疗受试者中增殖型疾病的方法。这些方法包含向所述受试者施用有效量的本发明的组合物。
在一个实施方案中,本发明涉及这样的按照本发明的ABM,其用于治疗或预防癌症,癌症前期病症或病灶,或自体免疫病症。在另一个实施方案中,本发明涉及用作药物的按照本发明的ABM,所述药物用于治疗或预防癌症,癌症前期病症或病灶,或自体免疫病症。所述癌症可以是,例如B细胞淋巴瘤,肺癌,非小细胞肺(NSCL)癌,细支气管肺泡细胞肺癌,骨癌,胰腺癌,皮肤癌,头或颈部癌症,皮肤或眼内黑素瘤,子宫癌,卵巢癌,直肠癌,肛门区癌,胃癌,胃癌,结肠癌,乳腺癌,子宫癌,输卵管癌,子宫内膜癌,子宫颈癌,阴道癌,外阴癌,霍奇金病,食道癌,小肠癌,内分泌系统癌,甲状腺癌,甲状旁腺癌,肾上腺癌,软组织肉瘤,尿道癌,阴茎癌,前列腺癌,膀胱癌,肾癌或输尿管癌,肾细胞癌,肾盂癌,间皮瘤,肝细胞癌,胆管癌,慢性或急性白血病,淋巴细胞淋巴瘤,中枢神经系统(CNS)肿瘤,脊柱轴肿瘤,脑干神经胶质瘤,多形性成胶质细胞瘤,星形细胞瘤,神经鞘瘤,室管膜瘤,成神经管细胞瘤,脑脊膜瘤,鳞状细胞癌,垂体腺瘤,包括上述癌症任一种的顽固形式,或一种或多种上述癌的组合。癌症前期病症或病灶包括,例如由口腔粘膜白斑病,光化性角化病(日光性角化病),结肠或直肠癌症前期息肉,胃上皮发育不良,腺瘤发育不良,遗传性非息肉性结肠癌综合征(HNPCC),巴雷特食道,膀胱发育不良,和癌症前期宫颈病症组成的组。
优选地,所述癌选自由下列各项组成的组:B细胞淋巴瘤,乳腺癌,膀胱癌,头和颈部癌,皮肤癌,胰腺癌,肺癌,卵巢癌,结肠癌,前列腺癌,肾癌,和脑癌。提供了自体免疫病症的实例,如上。
另一个实施方案是将按照本发明的ABM用于制备治疗或预防癌症或治疗或预防癌症前期病症或病灶的药物的应用。癌症和癌症前期的病症或病灶如上定义。
因此,显而易见的是,本发明涵盖用于治疗人癌症的药物组合物,组合,应用和方法。例如,本发明包括用在治疗人癌症中的药物组合物,其包括药用有效量的本发明的抗体和药用载体。
本发明的ABM组合物可以使用常规施用方式进行施用,所述方式包括,但不限于,静脉内、腹膜内、口服、淋巴内或直接施用于肿瘤中。静脉内施用是优选的。
在本发明的一个方面,以冻干制剂或水溶液形式存在的包含本发明的ABMs的治疗性制剂通过将具有所需纯度的抗体与任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(雷明顿制药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第十六版,Osol,A.Ed.(1980))混和来进行制备以用于贮存。可以接受的载体,赋形剂,或稳定剂在所用的剂量和浓度上对于受者是无毒的,并且包括缓冲剂诸如磷酸盐,柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵;六甲氯铵;苯扎氯铵;苄索氯铵;苯酚,丁醇或苄醇;对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环已醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清白蛋白,明胶,或免疫球蛋白;亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸;单糖,二糖,和其它的碳水化合物包括葡萄糖,甘露糖,或糊精;鳌合剂诸如EDTA;糖诸如蔗糖,甘露糖醇,海藻糖或山梨糖醇;成盐平衡离子诸如钠;金属复合体(例如,锌-蛋白复合体);和/或非离子表面活性剂诸如TWEENTM,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在WO98/56418中描述了示范的抗CD20ABM制剂,将其明确地引入本文作为参考。该公开文献描述了包含40mg/mL利妥昔单抗,25mM乙酸盐,150mM海藻糖,0.9%苯甲醇,0.02%聚山梨酯20的pH5.0的液体多剂量制剂,其在2-8℃储存时,具有最短贮存期2年。另一种目标抗CD20制剂包含处于9.0mg/mL氯化钠中的10mg/mL利妥昔单抗,7.35mg/mL二水合柠檬酸钠,0.7mg/mL聚山梨醇80,和用于注射的无菌水,pH6.5。在本发明中,用本发明修饰的ABM替换利妥昔单抗。
将适合于皮下施用的冻干制剂描述在WO97/04801中。这些冻干制剂可以用适合的稀释剂重构到高蛋白质浓度并且可以将该重构的制剂皮下施用给本文的待治疗的哺乳动物。
根据被治疗的具体适应症的需要,本文的制剂也可以含有多于一种的活性化合物,优选具有互补活性而不彼此不利影响的那些。例如,可能理想的是另外提供细胞毒剂,化学治疗剂,细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的一种,如环孢菌素或结合T细胞的抗体,例如结合LFA-1的一种)。这些其它试剂的有效量取决于制剂中存在的拮抗剂的量,疾病或病症或治疗的类型,和以上讨论的其它因素。这些通常以相同剂量和以上文所用的给药途径使用或以迄今使用的剂量的约1至99%使用。
活性成分还可以被包裹在,例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中,例如,分别在胶体药物递送系统(例如,脂质体,白蛋白微球体,微乳,纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳状液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate))微胶囊。这些技术公开在雷明顿制药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第16版,Osol,A.版本(1980)中。
可以制备持续释放的制剂。持续释放的制剂的适合的实例包括包含拮抗剂的固体疏水聚合物的半透性基质,所述基质以成形制品,例如薄膜,或微胶囊的形式存在。持续释放的基质的实例包括聚酯,水凝胶(例如,聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯),或聚(乙烯醇)),聚丙交酯(美国专利号3,773,919),L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物,不可降解的乙烯乙酸乙烯酯,可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙立德组成的可注射微球体),和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可以通过以无菌过滤膜过滤来容易地实现。
本发明的组合物可以以多种剂型存在,所述剂型包括,但不限于,液体溶液或混悬液,片剂,丸剂,散剂,栓剂,聚合物微胶囊或微泡,脂质体,和可注射的或可输注的溶液剂。优选的形式取决于施用和治疗应用的方式。
本发明的组合物还优选地包括本领域已知的常规药用载体和佐剂诸如人血清白蛋白,离子交换剂,钒土,卵磷脂,缓冲物质诸如磷酸盐,甘氨酸,抗坏血酸,山梨酸钾,和盐或电解质诸如硫酸鱼精蛋白。
用于本发明的药物组合物的最有效施用方式和剂量方案取决于疾病的严重性和进程,患者的健康和对治疗的反应,以及治疗的医师的判断。因此,对个体患者应该对该组合物的剂量进行滴定。然而,本发明的组合物的有效剂量将通常在约0.01到约2000mg/kg的范围内。
本文所述的分子可以以多种剂型存在,所述剂型包括,但不限于,液体溶液剂或混悬液,片剂,丸剂,散剂,栓剂,聚合物微胶囊或微泡,脂质体,和可注射的或可输注的溶液。优选的形式取决于施用和治疗应用的方式。
在一些情形中,可以通过使用预测性生物标记确定本发明的剂量。预测性生物标记是分子标记,其用于确定(即,观察和/或量化)肿瘤相关基因或蛋白质表达和/或活化的模式,或肿瘤相关信号传导途径的细胞成分。阐明肿瘤组织中靶治疗的生物作用,并将这些作用与临床响应相互联系,帮助识别肿瘤中有效的主要生长和生存途径,从而建立可能的响应器模式,并且相反地,为设计克服治疗抗性的策略提供基本原理。例如,当修饰的ABM是特异于EGFR的抗体时,抗EGFR治疗的生物标记可以包含一个或多个这样的分子,所述分子处于导致细胞增殖病症的EGFR下游信号传导途径中,所述分子包括,但不限于,Akt,RAS,RAF,MAPK,ERK1,ERK2,PKC,STAT3,STAT5(Mitchell,自然生物工程(Nature Biotech.)22:363-364(2004);Becker,自然生物工程(Nature Biotech.)22:15-18(2004);Tsao和Herbst,信号(Signal)4:4-9(2003))。用于抗EGFR治疗的生物标记还可以包含生长因子受体,如EGFR,ErbB-2(HER2/neu),和ErbB-3(HER3),并且可以是患者对于抗EGFR治疗响应阳性或阴性的预测物。例如,生长因子受体ErbB-3(HER3)被确定为抗EGFR抗体ABX-EGF的阴性预测生物标记(美国专利申请公开号2004/0132097A1)。
预测性生物标记可以通过本领域熟知的细胞测定法进行测量,其包括,但不限于免疫组化,流式细胞术,免疫荧光,捕获-和-检测测定,和反相测定,和/或美国专利申请公开号2004/0132097A1中所述的测定,将其全部内容引入本文作为参考。抗EGFR治疗的预测性生物标记自身可以通过按照美国专利申请公开号2003/0190689A1中所述的技术来进行鉴定,将其全部内容引入本文作为参考。
因此,在一个方面,本发明提供用于治疗这样的病症的方法,所述病症与由靶抗原引起的改变的或调节异常的细胞信号传导和/或改变的介导一个或多个靶抗原交联和/或低聚作用的能力相关,所述方法包括:通过测定来自接受一种或多种试剂治疗前的人类受试者的样品,在需要该治疗的人类受试者体内,预测其对于利用修饰的ABM的治疗的响应,所述一种或多种试剂检测对于这样病症的预测性生物标记的表达和/或活化作用,所述病症与由靶抗原引起的改变的或调节异常的细胞信号传导和/或改变的介导一个或多个靶抗原交联和/或低聚作用的能力相关(如癌症);确定一种或多种预测性生物标记表达和/或活化的模式,其中所述模式预测人类受试者对修饰的ABM治疗的响应;和向被预测为对修饰的ABM治疗产生阳性响应的人类受试者施用治疗有效量的组合物,所述组合物包含本发明修饰的ABM。用于本文时,被预测为对修饰的ABM治疗产生阳性响应的人类受试者是这样的人,对于他们,修饰的ABM应该对这样的疾病或病症具有可测量的作用,所述疾病或病症与由靶抗原引起的改变的或调节异常的细胞信号传导和/或改变的介导一个或多个靶抗原交联和/或低聚作用的能力相关(例如,肿瘤退化/收缩),并且对于他们,修饰的ABM治疗的副作用(例如,毒性)不超过其益处。用于本文时,样品意指来自生物体,特别是人的任何生物样品,其包括一个或多个细胞,包括任意起源、组织或活组织检查样品的单细胞,所述任意起源、组织或活组织检查的样品取自器官,如胸,肺,胃肠道,皮肤,子宫颈,卵巢,前列腺,肾,脑,头和颈部,或身体的任意其他器官或组织,以及其他身体样品,包括,但不限于,涂片,唾液,分泌物,脑脊髓液,胆汁,血液,淋巴液,尿和粪。
包括本发明的修饰的ABM的组合物将以与良好的医疗实践保持一致的方式来进行配制,给药和施用。在该情形中考虑的因素包括被治疗的具体疾病或病症,被治疗的具体哺乳动物,个体患者的临床条件,疾病或病症的起因,递送该试剂的位点,施用的方法,施用的时间表,和执业医生已知的其它因素。待施用的拮抗剂的治疗有效量将由这些考虑所支配。
作为一般的建议,每剂量中肠胃外施用的抗体的治疗有效量将在约0.1到20mg/kg患者体重/日范围内,其中所用的拮抗剂的典型起始范围在约2到10mg/kg的范围内。
此外优选地,所述修饰的ABM以约1.0mg/kg到约15mg/kg的治疗有效量使用。
此外更优选地,所述修饰的ABM以约1.5mg/kg到约12mg/kg的治疗有效量使用。
此外更优选地,所述修饰的ABM以从约1.5mg/kg到约4.5mg/kg的治疗有效量使用。
此外更优选地,所述修饰的ABM以从约4.5mg/kg到约12mg/kg的治疗有效量使用。
最优选地,所述修饰的ABM以约1.5mg/kg的治疗有效量使用。
此外最优选地,所述修饰的ABM以约4.5mg/kg的治疗有效量使用。
此外最优选地,所述修饰的ABM以约12mg/kg的治疗有效量使用。
在一个优选的实施方案中,该修饰的ABM是抗体,优选地是人源化的抗体。这种未缀合的抗体的适合的剂量在,例如,约20mg/m2到约1000mg/m2的范围内。在一个实施方案中,抗体的剂量与目前为利妥昔单抗所推荐的剂量不同。例如,可以向患者施用一次或多次基本少于375mg/m2的抗体的剂量,例如其中该剂量在约20mg/m2到约250mg/m2的范围内,例如从约50mg/m2到约200mg/m2的范围内。
而且,可以施用一次或多次起始剂量的抗体,随后施用一次或多次随后的剂量,其中在随后的剂量中的抗体的mg/m2剂量的量超过在起始剂量中的抗体的mg/m2剂量的量。例如,起始剂量可以在约20mg/m2到约250mg/m2(例如,从约50mg/m2到约200mg/m2)的范围内,并且随后的剂量可以在约250mg/m2到约1000mg/m2的范围内。
然而,如上指出,修饰的ABM的这些提示量要进行大量的治疗性判断。在选择适当的剂量和时间表中的关键因素是如上所示的获得的结果。例如,起初可能需要相对更高的剂量用于进行中的和急性疾病的治疗。为了获得最有效的结果,取决于疾病或病症,将拮抗剂在尽可能接近于疾病或病症的首次症状,诊断,征兆或发生的时候施用或在疾病或病症减轻的时候进行施用。
通过任何适合的方式来施用本发明修饰的ABM,所述方式包括肠胃外,皮下,腹膜内,intrapulinonary,和鼻内,和如果需要用于局部免疫抑制性治疗,包括病灶内施用。肠胃外输注包括肌内,静脉内,动脉内,腹膜内,或皮下施用。此外,拮抗剂可以通过脉冲输注,例如以下降剂量的拮抗剂来适当地施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的,优选地,将给药通过注射,最优选地静脉内或皮下注射进行。
可以与本文的拮抗剂一起,施用其它的化合物,诸如细胞毒性剂,化学治疗剂,免疫抑制剂和/或细胞因子。组合的施用包括使用单独的制剂或单一的药物制剂的共同施用,和以任一顺序的连续施用,其中优选地,在两种(或所有的)活性剂同时发挥它们的生物学活性的时候,存在时间周期。
将清楚的是实现治愈所需要的本发明的组合物的剂量可以随时间表优化进一步地减少。
按照本发明的实践,药用载体可以是脂质载体。该脂质载体可以是磷脂。此外,脂质载体可以是脂肪酸。此外,脂质载体可以是去污剂。用于本文时,去污剂是改变液体的表面张力,通常是降低其的任何物质。
在本发明的一个实例中,所述去污剂可以是非离子型去污剂。非离子型去污剂的实例包括,但不限于,聚山梨酯80(也称为吐温80或(聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯),Brij,和Triton(例如Triton WR1339和TritonA-20)。
或者,所述去污剂可以是离子型去污剂。离子型去污剂的实例包括,但不限于,烷基三甲基溴化铵。
另外,根据本发明,所述脂质载体可以是脂质体。如本申请中所用的,“脂质体”是任何膜束缚的囊泡,其包含本发明的任何分子或其组合。
下面的实施例更加详细地解释本发明。给出下列制备和实施例,从而使本领域技术人员能够更加清楚地理解并实施本发明。不过,本发明的范围并不受例示的实施方案的限制,所述实施方案只是意在作为发明单一方面的举例说明,并且功能上等同的方法在本发明的范围之内。事实上,由前述描述和附图,对于本领域技术人员来说,除了本文所述那些之外,本发明的各种改进将是显而易见的。这些改进将会落入后附的权利要求书的范围之内。
实施例
除非另外指定,在下列实施例中的特定氨基酸残基位置的编号的参考是按照Kabat编号系统进行的。
实施例1
材料和方法
重组抗体B-Ly1的克隆和表达
在含有10%FBS和4mML-谷氨酰胺的RPMI中生长表达B-Ly1的杂交瘤细胞(见,例如Poppema,S.,等,1987,第9届生物测试座谈会会刊(Proceedings of the9thBiotest Symposium),教育学会(Institute ofEducation),伦敦,(Sonneborn,H.H.和Tills,D,Eds.);Ling,N.R,等,1987,在白细胞测型会议III:白细胞分化抗原(Leucocyte Typing Conference III:White cell differentiation antigens)中,302-355,牛津大学出版社(OxfordUniversity Press),牛津.(A.J.McMichael,Ed.);Knapp,W.1990.白细胞测型会议IV会刊(Leukocyte Typing Conference IVProceedings),牛津大学出版社(Oxford University Press),牛津)。收获了具有>90%生存力的6x106个细胞,并利用Qiagen RNAeasy midi试剂盒分离总RNA。通过RT-PCR扩增了编码B-Ly1可变轻链和重链的cDNA。RT-PCR反应在下列条件下进行:在50℃保持30分钟,以进行第一条链cDNA的合成;在95℃保持15分钟,以进行最初的变性;94℃保持1分钟,45℃保持1分钟,72℃保持1.5分钟为一个周期,并进行30个周期;以及在72℃保持10分钟的最终延伸步骤。通过凝胶电泳证实所预期的PCR产物尺寸。将PCR产物克隆到适合的大肠杆菌载体中,且DNA测序证实编码可变轻链和重链的基因被分离了。
为了构建嵌合B-Ly1表达载体,通过另外的PCR反应,将合成的信号序列和适当的限制性位点与可变链融合。在正确的可变链DNA序列最终证实后,将它们与相应的人IgG1恒定区组合。一旦构建了所述基因,在MPSV启动子和合成的聚腺苷酸位点上游的控制下,利用两种不同的载体,每条链一种,对它们进行克隆,从而导致形成质粒pETR1808(重链表达载体)和pETR1813(轻链表达载体)。每种载体均携带EBV OriP序列。
通过利用磷酸钙-转染方法用载体pETR1808和pETR1813共转染HEK293-EBNA细胞,而产生嵌合B-Ly1。通过磷酸钙方法转染指数增长的HEK293-EBNA细胞。利用增补了10%FCS的DMEM培养基,使细胞在T瓶中生长为贴壁单层培养物,并且当它们铺满50-80%汇合时,对其进行转染。对于T75瓶的转染,在转染前24小时,将8百万个细胞接种到增补了FCS(最终为10%V/V)和250μg/ml新霉素的14ml DMEM培养基中,并且将细胞置于37℃,含有5%CO2的空气的培养箱中,过夜。对于每个待转染的T75瓶,通过混合等分为轻链和重链表达载体的47μg总质粒载体DNA,235μl的1M CaCl2溶液,并加水至最终体积469μl,来制备DNA,CaCl2和水的溶液。向该溶液中,加入469μl的50mM HEPES,280mM NaCl,1.5mM Na2HPO4溶液,pH7.05,立即混合10秒钟,并且在室温下静置20秒。用12ml增补了2%FCS的DMEM稀释该混悬液,并将其加入到T75中,从而替换现有的培养基。在37℃,5%CO2下,培养该细胞约17-20小时,然后再用12ml DMEM,10%FCS替换培养基。为了产生未修饰的抗体“chB-Ly1”,仅用1∶1比例的抗体表达载体pETR1808和pETR1813转染该细胞。为了产生糖改造的抗体“chB-Ly1-ge”,用4种质粒共转染该细胞,所述4种质粒分别地处于4∶4∶1∶1的比例,两种用于抗体表达(pETR1808和pETR1813),一种用于融合GnTIII多肽表达(pETR1519),和一种用于甘露糖苷酶II表达(pCLF9)。转染后第5天,收集上清液,在1200rpm离心5分钟,随后在4000rpm第二次离心10分钟,并保存在4℃。
利用三个顺序的层析步骤,即Superdex200柱(阿莫仙药业(AmershamPharmacia))上的蛋白质A层析,阳离子交换层析,和尺寸排阻层析步骤,从培养上清液中纯化chB-Ly1和chB-Ly1-ge,其中将缓冲液换为磷酸缓冲盐溶液,并且从该最终步骤中收集单体抗体峰。利用分光光度计,由280nm处的吸光率估算抗体浓度。
寡糖分析
通过PNGaseF消化,从抗体中酶促释放寡糖,其中所述抗体固定在PVDF膜上或溶液中。
直接制备由此产生的含有被释放的寡糖的消化溶液,从而进行MALDI/TOF-MS分析,或者在样品制备前,进一步用EndoH糖苷酶进行消化,从而进行MALDI/TOF-MS分析。
用于PVDG膜固定的抗体的寡糖释放方法
用100μl甲醇湿润具有PVDF(ImmobilonP,密斯博(Millipore),Bedford,马萨诸塞州(Massachusetts))膜的96孔板的孔,并且利用应用于多筛真空抽吸装置(密斯博(Millipore),Bedford,马萨诸塞州(Massachusetts))的真空,经过PVDF膜吸出该液体。用300μl的水洗涤该PVDF膜三次。再用50μl RCM缓冲液(8M尿素,360mM Tris,3.2mM EDTA,pH8.6)洗涤孔。将30-40μg抗体装入容纳10μl RCM缓冲液的孔中。通过应用真空,将孔中的液体经过所述膜吸出,并且随后用50μl RCM缓冲液洗涤该膜2次。通过在RCM中添加50μl的0.1M二硫苏糖醇和在37℃培养1小时,还原二硫键。
还原之后,使用真空从孔中去除二硫苏糖醇溶液。在通过向RCM缓冲液中添加50μl的0.1M碘乙酸,并在黑暗中室温温育30分钟,进行半胱氨酸残基羧甲基化作用前,用300μl水洗涤所述孔三次。
羧甲基化作用后,用真空对所述孔进行吸取,并随后用300μl水洗涤三次。然后通过在室温温育100μl的1%聚乙烯吡咯烷酮360水性溶液1小时,封闭PVDF膜,从而防止内切糖苷酶的吸收。再通过温和的抽真空作用去除封闭试剂,随后用300μl水洗涤三次。
在最终体积为25μl的20mM NaHCO3,pH7.0中,通过添加2.5mU肽-N-糖基化酶(glycosydase)F(重组N-聚糖酶,GLYKO,Novato,CA)和0.1mU唾液酸酶(GLYKO,Novato,CA),从而去除任何潜在的带电单糖残基以释放N-连接的寡糖。在37℃,进行消化3小时。
用于溶液中抗体的寡糖释放方法
将40-50μg抗体与2mM Tris,pH7.0中的2.5mU PNGaseF(Glyko,U.S.A.),混合,所述混合物处于25μl的最终体积,并且将该混合物在37℃温育3小时。
PNGaseF释放的寡糖的内切糖苷酶H消化对于向MALDI/TOF-MS中性寡糖峰分配杂交等分寡糖结构的应用
随后用内切糖苷酶H(EC3.2.1.96)消化PNGaseF释放的寡糖。对于EndoH消化,将15mU EndoH(Roche,瑞士)加入到PNGaseF消化物中(上述抗体在溶液中的方法),从而提供最终体积30μl,并在37℃下培养该混合物3小时。EndoH使N-连接寡糖的几丁二糖核心的N-乙酰葡糖胺残基间断裂。该酶仅能消化寡甘露糖和大多数杂交类型聚糖,而复合类型寡糖是不水解的。
用于MALDI/TOF-MS的样品制备
在添加乙酸至最终浓度150mM后,进一步室温温育含有释放的寡糖的酶消化物3小时,并且随后通过装在微-生物-旋转(micro-bio-spin)层析柱(BioRad,瑞士)中的0.6ml的阳离子交换树脂(AG50W-X8树脂,氢形式,100-200网眼,BioRad,瑞士),去除阳离子和蛋白质。对不锈钢靶板应用1微升由此生成的样品,并在该板上与1μl sDHB基质混合。通过将2mg的2,5-二羟基苯甲酸和0.1mg的5-甲氧基水杨酸溶解在1ml乙醇/10mM水性氯化钠1∶1(v/v)中,制备sDHB基质。空气干燥所述样品,应用0.2μl乙醇,并且最终容许所述样品在空气中再结晶。
MALDI/TOF-MS
用于获得质谱的MALDI-TOF质谱仪是Voyager Elite(远景生物系统(Perspective Biosystems))。以线性配置操作该仪器,其具有20kV的加速度和80ns的延时。为了离子的质量分配,使用了利用寡糖标准的外部校准。总结了来自200个激光点的光谱,从而获得最终光谱。
全血B细胞的损耗
将来自健康供体的495μl肝素化血液等分到5ml的聚苯乙烯管中,加入5ul浓缩了100倍的抗体样品(最终浓度1-1000ng/ml)或单独的PBS,在37℃温育所述管。24小时后,将50μl血液转移到新的管中,并在黑暗中,用抗CD3-FITC,抗CD19-PE和抗CD45-CyChrome(百克顿-迪克森(Becton-Dickinson))室温染色15分钟。分析前,向所述管中加入500μlFACS缓冲液(含有2%FCS和5mM EDTA的PBS)。通过在CD45-CyChrome上设定阈值,通过流式细胞计数分析血液样品的CD3-FITC和CD19-PE荧光。通过绘图CD19+B细胞与CD3+T细胞的比例,确定B细胞的损耗。
抗CD20抗体与Raji细胞的结合
将180μl FACS缓冲液(含有2%FCS和5mM EDTA的PBS)中的200,000个细胞转移到5ml的聚苯乙烯管中。下一步,加入20μl浓缩了10倍的抗CD20抗体样品(最终浓度1-5000ng/ml)或单独的PBS,并在4℃温育管30分钟。随后,用FACS缓冲液洗涤样品2次,并在300xg沉淀3分钟。吸出上清液,并且使细胞吸收于高达100μl的FACS缓冲液中。下一步,加入1μl抗Fc特异性F(ab’)2-FITC片段(杰克逊免疫研究实验室(Jackson Immuno Research Laboratories),美国),并在4℃温育所述管30分钟。用FACS缓冲液洗涤样品2次,并使其吸收于500μl含有0.5μg/ml PI的FACS缓冲液中,从而利用流式细胞术进行分析。通过针对抗体浓度的几何平均荧光绘图确定结合。
实施例2
高度同源受体方法
通过将小鼠B-ly1蛋白质序列与人种系序列集合对比,并选择显示出最高序列同一性的人序列,来进行高度同源抗体受体构架研究。在此,将来自VBase数据库的序列VH1_10(基因座1-e,Acc.No.DP-88)选为重链的构架受体序列,并且将来自IMGT数据库的IGKV2-40(Acc.No X59314)序列选为轻链的构架受体。向这两种受体构架上,结合小鼠重链和轻链可变结构域的三个互补决定区(CDRs)。由于构架4区域不是种系V基因可变区域的一部分,所以单独地针对该位置进行对比。为重链选择了JH4区域,并且为轻链选择了JK4区域。所设计的免疫球蛋白结构域的分子模型显示一个这样的部位,其在CDR外,潜在地需要鼠氨基酸残基,取代人氨基酸残基。向人构架中再引入鼠氨基酸残基将产生所谓的回复突变。例如,位于Kabat位置27处的人受体氨基酸残基被回复突变为酪氨酸残基。将人源化抗体变体设计为包括或省略该回复突变。人源化抗体轻链不需要任何的回复突变。设计了蛋白质序列后,如下所述合成了编码这些蛋白质的DNA序列。
混合的构架方法
为了避免在人受体构架的关键氨基酸残基位置(对保持良好的抗原结合亲和性或抗体功能关键的)引入回复突变,研究在位于天然人种系序列的那些重要位置处,是完整构架区1(FR1),还是构架区1(FR1)和2(FR2)一起,可以被已经具有供体残基的人抗体序列或其功能等价序列取代。为了这个目的,分别地将小鼠B-ly1序列的VH构架1和2与人种系序列进行对比。在此,最高序列同一性对于选择受体构架不重要,并且不被使用,但是代替地,假定若干关键残基的匹配是更重要的。那些关键的残基包括残基24,71,和94(Kabat编号),和还有那些位于位置27,28,和30(Kabat编号)的残基,所述残基位于由Kabat形成的CDR1定义外,但是通常在抗原结合中有所涉及。选择IMGT序列IGHV3-15(Acc NoX92216)为适合的序列。设计了蛋白质序列后,如下所述合成了编码这些蛋白质的DNA序列。利用该方法,为了保持抗原结合的良好水平,轻链或重链都不需要回复突变。
抗体基因的合成
设计了人源化抗体V区域的氨基酸序列后,必须产生DNA序列。个体构架区的DNA序列数据见于人种系序列的数据库。CDR区域的DNA序列取自相应的鼠cDNA数据。用这些序列,实质上装配了完整DNA序列。持有该DNA序列数据,通过引入沉默突变,将诊断限制性位点引入到实质序列中,从而产生限制性核酸内切酶的识别位点。为了获得物质的DNA链,进行了基因合成(例如,Wheeler等,1995)。在该方法中,由目的基因设计寡核苷酸,从而使一个寡核苷酸系列源自编码链,并且一个其他的系列来自非编码链。每个寡核苷酸的3’和5’末端(除了该行中的最开始和末尾)通常显示出与两个源自对等链的引物互补的序列。当将这些寡核苷酸放入对任何热稳定聚合酶合适的反应缓冲液中,并加入Mg2+,dNTPs和DNA聚合酶时,每个寡核苷酸从其3’末端开始延长。一个引物新形成的3’末端再与对等链的下一个引物退火,并进一步在适合模板依赖性DNA链延长的条件下,延伸其序列。将最终产物克隆到大肠杆菌中用于增殖的常规载体中。
抗体产生
利用标准分子生物技术,将人重链和轻链前导序列(用于分泌)添加到上述可变区序列的上游,并且然后将这些分别连接于人IgG1κ恒定重链和轻链序列的上游。将由此产生的完整抗体重链和轻链DNA序列,在MPSV启动子和合成多腺苷酸位点上游的控制下,亚克隆到哺乳动物表达载体中(一个对于轻链,一个对于重链),其中每种载体均携带EBV OriP序列,如以上实施例1中所述。如以上实施例1中所述,即通过下列步骤生产抗体,所述步骤是:用哺乳动物抗体重链和轻链表达载体共转染HEK293-EBNA,转染后5-7天收获条件培养基,并通过蛋白质A亲合层析纯化分泌的抗体,随后进行阳离子交换层析和最终的尺寸排阻层析步骤,从而分离纯单体IgG1抗体。将抗体配制在25mM磷酸钾,125mM氯化钠,100mM pH6.7的甘氨酸溶液中。如以上实施例1中对于嵌合抗体所述的,通过与GnT-III糖基转移酶表达载体一起,或与GnT-III表达载体和高尔基体甘露糖苷酶II表达载体一起,共转染所述抗体表达载体,来产生人源化抗体变体的糖改造变体。如以上对于非糖改造抗体所述,纯化并配制糖改造的抗体。如下述,利用MALDI/TOF-MS分析了连接在抗体Fc区域的寡糖。
寡糖分析
用于溶液中抗体的寡糖释放方法。将40-50μg的抗体与2.5mUPNGaseF(Glyko,U.S.A.)混合于最终体积为25微升的2mM Tris,pH7.0中,并且将该混合物在37℃温育3小时。
用于MALDI/TOF-MS的样品制备
在添加乙酸至最终浓度150mM后,进一步室温温育含有释放的寡糖的酶消化物3小时,并且随后通过装在微-生物-旋转(micro-bio-spin)层析柱(BioRad,瑞士)中的0.6ml的阳离子交换树脂(AG50W-X8树脂,氢形式,100-200网眼,BioRad,瑞士),以去除阳离子和蛋白质。对不锈钢靶板应用1微升的由此生成的样品,并在该板上与1μl sDHB基质混合。通过将2mg的2,5-二羟基苯甲酸和0.1mg的5-甲氧基水杨酸溶解在1ml乙醇/10mM水性氯化钠1∶1(v/v)中,制备sDHB基质。空气干燥所述样品,应用0.2μl乙醇,并且最终容许所述样品在空气中再结晶。
MALDI/TOF-MS
用于获得质谱的MALDI-TOF质谱分光计是Voyager Elite(远景生物系统(Perspective Biosystems))。以线性配置操作该仪器,其具有20kV的加速度和80ns的延时。为了离子的质量分配,使用了利用寡糖标准的外部校准。总结了来自200个激光点的光谱,从而获得最终光谱。
抗原结合测定
利用基于流式细胞术的测定,测试了纯化的,单体人源化抗体变体与Raji B细胞淋巴瘤靶细胞上的人CD20的结合,正如以上实施例1中对于嵌合B-ly1抗体所描述的。
单体IgG1糖变体与NK细胞和表达FcγRIIIA的CHO细胞系的结合
应用富含CD16-和CD56-阳性细胞的阴性选择,从新近分离的外周血单核细胞(PBMC)中分离人NK细胞(MACS系统,Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach/德国)。由CD56表达所确定的纯度是88-95%。在37℃,将新近分离的NK细胞在不含钙和镁离子的PBS(3x105细胞/ml)中温育20分钟,从而去除NK细胞结合的IgG。以106细胞/ml的密度,将细胞温育在含有不同浓度的抗CD20抗体(0,0.1,0.3,1,3,10μg/ml)的PBS,0.1%BSA中。多次洗涤后,通过利用1∶200FITC-缀合的F(ab’)2山羊抗人,F(ab’)2特异性IgG(杰克逊免疫研究(Jackson ImmunoReasearch),WestGrove,PA/USA)和抗人CD56-PE(BD生物科技(BD Biosciences),Allschwil/瑞士)的培养检测抗体结合。以10μg/ml的浓度加入抗FcγRIIIA3G8F(ab’)2片段(Ancell,Bayport,MN/USA),从而竞争抗体糖变体(3μg/ml)的结合。在FACSCalibur(BD生物科技,Allschwil/瑞士)上,对CD56阳性细胞确定指示结合的抗体变体的荧光强度。通过用编码FcγRIIIA Val158α-链和γ-链的表达载体的电穿孔(280V,950μF,0.4cm),转染CHO细胞。通过添加6μg/ml嘌呤霉素选择转染子,并利用10μl FITC-缀合的-抗-FcγRIII3G8单克隆抗体(BD生物科技,Allschwil/瑞士),通过FACS分析了对于106个细胞的稳定克隆。与上述NK细胞结合相似地进行了IgG1与表达FcγRIIIA-Val158的CHO细胞结合。
ADCC测定
人外周血单核细胞(PBMC)用作效应细胞,并且利用Histopaque-1077(希格玛诊断公司(Sigma Diagnostics Inc.),St.Louis,MO63178USA)并基本按照制造商的说明对其进行制备。简要地,利用肝素化的注射器,从志愿者体内取得静脉血。用PBS(不含Ca++或Mg++)稀释该血液为1∶0.75-1.3,并且将其层铺在Histopaque-1077上。将该梯度在室温下(RT),以400x g,无间断地离心30分钟。收集含有PBMC的界面,并用PBS(50ml/来自两种梯度的细胞)对其进行洗涤,再通过在300xg,室温离心10分钟对其进行收获。用PBS重新悬浮该沉淀后,计数PBMC,并通过在200xg室温离心10分钟对其进行洗涤第二次。然后将细胞重新悬浮在适当的培养基中,以进行后继的步骤。
用于ADCC测定的效应子与靶标的比例对于PBMC和NK细胞分别是25∶1和10∶1。在适当浓度的AIM-V培养基中制备效应细胞,以加入50μl/圆底96孔板的孔。靶细胞是在含有10%FCS的DMEM中生长的人B淋巴瘤细胞(例如,Raji细胞)。在PBS中洗涤靶细胞,在AIM-V中,计数,以0.3百万/ml并重新混悬靶细胞,从而加入100μl中的30,000个细胞/微孔。在AIM-V中稀释抗体,将50μl加入到预涂布的靶细胞中,并容许其在室温下与靶标结合10分钟。然后,加入效应细胞,并在37℃,含有5%CO2的潮湿空气中温育该板4小时。通过利用细胞毒性检测试剂盒(罗氏诊断(Roche Diagnostics),Rotkreuz,瑞士)测量来自损伤细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放量,评估靶细胞的杀伤。温育4小时后,以800xg离心该板。将100μl来自每个孔的上清液转移到新的透明平底96孔板中。将100μl来自该试剂盒的颜料底物缓冲液加入到每个孔中。利用SOFTmaxPRO软件(分子装置(Molecular Devices),Sunnyvale,CA94089,USA),在ELISA计数器中,在490nm至少10分钟,以确定颜色反应的Vmax值。从仅含有靶标和效应细胞,而无抗体的孔中,测量同时的LDH释放量。从仅含有靶细胞和1%Triton X-100的孔中确定最大释放量。如下计算由特异性抗体介导的杀伤百分比:((x-SR)/(MR-SR)*100,其中x是在特定抗体浓度时Vmax的平均值,SR是同时释放量的Vmax的平均值,并且MR是最大释放量Vmax的平均值。
补体依赖性细胞毒性测定
计数靶细胞,用PBS对其进行洗涤,并在AIM-V(Invitrogen)中重新混悬细胞为1百万个细胞/ml。将50μl细胞/孔涂布在平底96孔板中。在AIM-V中制备抗体稀释液,并加入50μl到细胞中。容许抗体与细胞在室温下结合10分钟。新鲜冻融人血清补体(Quidel),用AIM-V稀释3倍,并向孔中加入50μl。如制造商所述制备兔补体(Cedarlane实验室),用AIM-V稀释3倍,并将50μl加入到孔中。作为对照,在加入到该测定之前,将补体来源在56℃加热30分钟。
在37℃温育该测定板2小时。通过测量LDH释放量确定细胞的杀伤。简要地,以300xg离心该板3分钟。将50μl上清液/孔转移到新的96孔板中,并加入50μl来自细胞毒性试剂盒(罗氏(Roche))的测试剂。利用ELISA计数器的动力学测量确定了上清液中对应于LDH浓度的Vmax。通过在1%Trition X-100的存在下培养该细胞来确定最大释放量。
全血B细胞损耗测定
如上实施例1中所述实现由抗CD20抗体引起的全血中正常B细胞的损耗。
程序性细胞死亡测定
通过过夜(16-24小时)温育10μg/ml(就抗原结合而言的饱和条件)的抗体和靶细胞(处于靶细胞浓度5x105细胞/ml),评估抗体的程序性细胞死亡潜力。用AnnV-FITC染色样品,并利用FACS对其进行分析。测定一式三份地进行。
通过根据程序性细胞死亡标记,如膜联蛋白V和磷脂酰丝氨酸,的表观,利用流式细胞术进行检测。阴性对照(无诱导的程序性细胞死亡)不含任何抗体,而仅含磷酸缓冲盐溶液。阳性对照(最大程序性细胞死亡)含有5微摩尔的强程序性细胞死亡诱导剂喜树碱(CPT)。
结果和讨论
抗体变体B-HH1,B-HH2,B-HH3,和母体嵌合抗体chB-ly1(以上实施例1中所述)的人CD20抗原结合的比较显示所有抗体都具有相似的EC50值,但是B-HH1构建体与变体B-HH2和B-HH3相比,以较低的强度/化学计量结合(图11),其中所述抗体变体B-HH1,B-HH2,B-HH3是与人源化B-ly1轻链(BKV1)复合的。B-HH1可以通过其部分的人CDR1和CDR2区域(Kabat定义),以及位置28(Kabat编号)处的Ala/Thr的多态性,与B-HH2和B-HH3区分开。这说明位置28,完整CDR1,和/或完整CDR2对于抗体/抗原相互作用都很重要。
B-HL1,B-HH1和嵌合chB-ly1母体抗体的比较显示了B-HL1构建体中任何结合活性的缺乏,以及B-HH1与B-ly1相比大约一半的结合强度/化学计量(图12)。B-HL1和B-HH1均是基于源自人VH1种类的受体构架而设计的。在其他区别中,B-HL1构建体的位置71(Kabat编号)惊人的不同,这说明其对于抗原结合推定的重要性。位置71处的氨基酸是确定重链CDR2的规范环结构的残基之一。在此,丙氨酸或其功能等价物(例如,亮氨酸,缬氨酸,或苏氨酸(见于,例如,Morea等,方法(Methods)20:267-279(2000))似乎对于抗原结合很重要,而精氨酸对于抗原结合似乎是不利的。
当比较图2和9-13的抗原结合数据时,在所测试的不同人源化抗体变体中,BHH2-BKV1,BHL8-BKV1,和BHL11-BKV1变体显示出与人细胞表面上的人CD20良好的结合亲和性。尽管抗原结合的相似EC50值,这些变体在它们诱导CD20阳性靶细胞中的程序性细胞死亡中,严重不同(见图4-6,14,15)。由于原始B-ly1抗体显示了低的程序性细胞死亡诱导,本发明确定了母体B-ly1抗体构建体和B-HL8和B-HH2构建体之间的区别。在B-HH2重链中鉴定了7个不存在于B-HL8或母体B-ly1重链中的残基:Gln1,Ala9,Val11,Lys12,Ser16,Val20,和Met48。全部7个这些残基位于VH结构域的构架区中。除对于Gln1外,直接抗原接触的可能性是不可能的。为了确定这些残基中单独一个是否是形成新产生的程序性细胞死亡诱导特性的原因,产生了B-HL8重链的7种变体,所述变体潜在地可以恢复B-HH2构建体的程序性细胞死亡行为,它们是:B-HL11(具有突变E1Q),B-HL12(G9A,V48M),B-HL13(L11V,V48M),B-HL14(V12K,V48M),B-HL15(G16S,V48M),B-HL16(L20V,V48M),和B-HL17(V48M)。见于SEQ ID NOs:32,34,36,38,40,42,和44(存在于序列表中时,这些不是按照Kabat编号的,但是它们的Kabat编号可以容易地由普通技术人员确定)。这些变体的抗原结合特性,就EC50值和化学计量而言,并不彻底不同(见图2)。然而,可以在它们诱导程序性细胞死亡的能力上发现明显的区别(图4-6,14,15,和24)。具有L11V,V48M修饰的构建体,即B-HL13,显著增高了诱导程序性细胞死亡的能力(见图24)。然而,V48M修饰,单独地,没有明显的作用(见图5)。因此,位于Kabat位置11和12的残基最大范围地影响程序性细胞死亡行为。这些残基不直接影响抗原的结合,而是影响VH和CH1结构域之间的界面,并由此通过肘角度的修饰发生作用。
B-HL4构建体通过用人种系序列IGHV1-45(Acc No X92209)的FR1取代B-HH2的FR1,来源于B-HH2抗体。该构建体尽管仅在FR1中的4个位置具有不同的氨基酸,却显示出极大降低的抗原结合能力。这些残基位于位置2,14,28和30(Kabat编号)。在这些中,位置28和30可能是有影响的位置,其原因在于它是CDR1的Chothia定义的一部分。在变体B-HH8和9(均具有BKV1轻链)中,位置28和30与母体B-ly1序列相比是被修饰的。如图22所示,如果苏氨酸28或苏氨酸30存在,则结合特性不会受到显著的损害(图22)。在人源化轻链中没有引入回复突变,所述轻链具有结合的完整Kabat CDR1,CDR2和CDR3。在程序性细胞死亡的诱导中(见图14,15和21),最有效的变体是人源化B-ly1变体BHH2-BKV1(甚至比原始chB-ly1更有效,并且比具有与利妥昔单抗相同的序列的抗体,C2B8有效得多)。其他可以恢复增加的程序性细胞死亡的人源化变体是:B-HL13和B-HL14(BHL8的衍生物),BHH8(“混合的构架”),BHH9(具有一个回复突变从而检查S30T的作用的“混合的构架”),和B-HH6(B-HH2的M34I衍生物)。变体BHH4是另一种未引入另外的非人序列的人源化B-ly1变体。变体B-HH5,B-HH6和B-HH7是B-HH2构建体的衍生物,其具有部分人源化的Kabat CDR1区域。
人源化B-ly1抗体的重要特性是:它是如Cragg,M.S.和Glennie,M.J.,血液(Blood)103(7):2738-2743(2004年4月)中所定义的II型抗CD20抗体。因此,利用Polyak,M.J.和Deans,J.P.,血液(Blood)99(9):3256-3262(2002)中所述的用于该目的的测定,它在与CD20的结合后,不诱导任何显著的对CD20的非离子型去污剂提取物的抗性,所述CD20的非离子型去污剂提取物来自CD20+人细胞的表面。它与C2B8抗体(另一种抗CD20抗体,其具有与利妥昔单抗相同的序列(见,Reff的美国专利公开号20030003097))相比,诱导对CD20的非离子型去污剂提取物明显更低的抗性。如对II型抗CD20抗体的预测,人源化B-ly1不具有任何显著的补体介导的溶胞活性,并且表现出比抗CD20抗体C2B8(具有与利妥昔单抗相同序列的嵌合IgG1)低得多的补体介导的溶胞活性。人源化B-ly1抗体(变体B-HH2B-KV1)的另一个重要特性是:它在同型聚集测定中非常有效。在该测定中,如在Deans等中所详述地,在哺乳动物细胞培养箱中,以37℃,5%CO2空气,在细胞培养基中培养CD20阳性人细胞,即Daudi细胞和浓度为1微克/ml的抗体,以及平行地浓度为5微克/ml的抗体,长达24小时。作为比较,在与使用抗CD20抗体,即C2B8相同的条件下,进行细胞的平行对照培养。在不同的时间点,包括8小时和24小时培养,利用显微镜视觉检查该细胞。发现人源化B-ly1抗体导致强烈的同型聚集,其聚集显著地大于由添加C2B8对照抗体所诱导的那些。另外,且与作为抗CD20类型II的抗体相一致,当用人源化B-ly1抗体培养CD20阳性人细胞时,与利用具有与利妥昔单抗相同序列的C2B8嵌合IgG1抗体相同的条件下的对照相比,它诱导更高水平的程序性细胞死亡。
通过在哺乳动物细胞中共表达GnTIII糖基转移酶和抗体基因产生人源化抗体的糖改造变体。这导致附着于抗体Fc区域的非岩藻糖基化寡糖片段的增加,其包括等分的非岩藻糖基化寡糖,正如WO2004/065540中所述(图17-19)。糖改造的抗体,与非糖改造抗体和C2B8抗体相比,具有显著更高水平的与人FcγRIII受体的结合(图20),以及更高的ADCC活性(图16)。人源化B-ly1抗体在全血测定中,还比对照C2B8抗体更加有效地诱导人B细胞损耗(图16)。这对于非糖改造的B-ly1抗体和其糖改造形式都是正确的。糖改造抗体在全血测定中损耗B细胞的方面,比C2B8对照抗CD20抗体更有效大约1000倍。该比较对于非糖改造的和糖改造的B-ly1抗体的人源化形式都很重要,原因在于其显示在组合的Fc受体依赖性活性,如ADCC,和补体介导的溶胞,和程序性细胞死亡诱导的测定中,B-ly1的两种形式都比C2B8显著更有效,尽管B-ly1的两种形式都具有明显更低的补体介导的溶胞活性。ADCC,Fc受体依赖性细胞杀伤活性和程序性细胞死亡诱导存在于人源化B-ly1抗体变体的这一优越的活性中。此外,在程序性细胞死亡测定中,该类型II抗CD20抗体的糖改造和非糖改造形式都是有效的,其中具有增加的与Fcγ受体结合亲和性的Fc改造变体在程序性细胞死亡的诱导中比非Fc改造变体甚至更加有效,并且其中所有变体都比对照抗体C2B8显著地更加有效。由类型II抗CD20抗体介导的增强的同型聚集和程序性细胞死亡诱导的精确机制是未知的,并且伴随结合于CD20阳性细胞表面上其他分子,如Fcγ受体可以影响该重要特性。因此,证明这样的II型抗CD20抗体仍然能够诱导甚至高于非Fc改造的强程序性细胞死亡作用和同型聚集是很重要的,其中已经在所述II型抗CD20抗体的Fc区域中进行了改造,从而获得与Fcγ受体,包括FcγRIII增高的结合亲和性和相关的ADCC活性的增高,。程序性细胞死亡的诱导是重要的,因为,在体内,身体中存在着这样的位置,在所述位置可以发现靶CD20阳性细胞,但与FcγRIII阳性细胞的接近比在血液中更难(例如,淋巴结)。在那些位置,由抗CD20抗体自身引起的程序性细胞死亡的诱导对于人类中抗CD20抗体治疗的良好功效可以是关键的,所述抗CD20抗体治疗是对血液恶性肿瘤,如非霍奇金淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞白血病的治疗,和对自体免疫疾病,如类风湿性关节炎和由B细胞损耗方法引起的狼疮的治疗。人源化Fc改造的II型抗CD20抗体与FcγRIII增高的结合亲和性以及较高的ADCC也可以是对该治疗非常重要的性质。最后,该II型抗CD20抗体,包括人源化和Fc改造变体的降低或可忽略不计的补体介导的溶胞活性也可以是重要的,其原因在于已将由抗CD20抗体引起的较高的补体活化与增高的,不需要的副作用联系起来了。
实施例3
为了进一步检查影响程序性细胞死亡活性的残基,产生了BHH2重链的6种变体:BHH2-A(V11L)(SEQ ID NO:124),BHH2-B(K12V)(SEQ IDNO:125),BHH2-C(A9G)(SEQ ID NO:126),BHH2-D(E10G)(SEQ ID NO:127),BHH2-E(T110I)(SEQ ID NO:128),和BHH2-F(S112I)(SEQ ID NO:129)。通过上文所述的方法,测试了这些变体构建体与靶抗原(CD20)的结合。6种变体构建体全保持了结合活性。
通过上文所述的方法,还测试了这些重链变体构建体的程序性细胞死亡作用,其中5种构建体,即BHH2-B,BHH2-C,BHH2-D,BHH-2E,和BHH-2F具有与BHH2母体构建体相同的程序性细胞死亡潜力。然而,BHH2-A(V11L)诱导程序性细胞死亡的能力与BHH2相比,显著降低了(见图23)。
还通过产生5种变体检查了人源化B-ly1轻链(BKV1)中单一氨基酸替换的程序性细胞死亡作用,所述5种变体是:BKV-10(P40A)(SEQ IDNO:130),BKV-11(A80P)(SEQ ID NO:131),BKV-12(V83F)(SEQ IDNO:132),BKV-13(E105A)(SEQ ID NO:133),和BKV-14(I106A)(SEQ IDNO:134)。通过上文所述的方法测试了构建体BKV-11,BKV-12,BKV-13,和BKV-14与靶抗原(CD20)的结合,并且确定全部4种变体都保持了结合活性。还通过上文中所述的方法测试了这4种轻链变体构建体的程序性细胞死亡作用。BKV-11,BKV-12,和BKV-13的程序性细胞死亡潜力不由它们各自的替换而改变。然而,BKV-14证明了与BKV1相比降低的诱导程序性细胞死亡的能力(见,例如,图25)。
将本说明书中提及的所有公开文献,如教科书,杂志文章,GenBank的条目,以及公开的申请和专利申请以这样的程度引入本文作为参考,所述程度如同明确和分别地显示将每篇单独的公开文献或专利申请引入作为参考。

Claims (28)

1.修饰的抗-CD20抗体或其抗原结合片段,其中相比于嵌合B-Ly1抗体与CD20的复合,所述修饰的抗体与CD20复合时诱导更高水平的程序性细胞死亡,并且其中所述修饰的抗体包含SEQ ID NO:12的作为重链可变区序列的第一多肽和SEQ ID NO:134的作为轻链可变区序列的第二多肽。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体包含Fc区域,所述Fc区域已被糖改造以具有增加量的等分复合物寡糖。
3.权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体包含Fc区域,所述Fc区域已被糖改造以具有减少量的岩藻糖残基。
4.权利要求1-2任一项的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体包含Fc区域,所述Fc区域具有已被修饰以增加至少一种效应子功能和/或增加Fc受体结合亲和力的N-连接的寡糖。
5.权利要求3的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体包含Fc区域,所述Fc区域具有已被修饰以增加至少一种效应子功能和/或增加Fc受体结合亲和力的N-连接的寡糖。
6.权利要求4的抗体或其抗原结合片段,其中所述多肽的Fc区域中至少20%寡糖是等分的、非岩藻糖基化的。
7.权利要求4的抗体或其抗原结合片段,其中所述Fc区域中至少50%的寡糖是非岩藻糖基化的。
8.宿主细胞,所述宿主细胞以足以糖改造所述宿主细胞产生的多肽的Fc区域的量表达至少一种编码具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽的核酸,其中所述多肽是权利要求1-7任一项的抗体或其抗原结合片段。
9.权利要求8的宿主细胞,其中所述宿主细胞还表达编码具有甘露糖苷酶II活性的多肽的核酸。
10.权利要求8或权利要求9的宿主细胞,其中作为所述糖改造的结果,由所述宿主细胞产生的所述抗体表现出增加的Fc受体结合亲和力。
11.权利要求10的宿主细胞,其中所述Fc受体是FcγRIIIA受体。
12.权利要求8或权利要求9的宿主细胞,其中作为所述糖改造的结果,由所述宿主细胞产生的所述抗体表现出增加的效应子功能。
13.权利要求12的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的Fc介导的细胞的细胞毒性。
14.权利要求12或权利要求13的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的抗体依赖性细胞毒作用。
15.权利要求8或权利要求9的宿主细胞,其还包含至少一个转染的多核苷酸,其编码权利要求1的第一多肽和第二多肽,其中所述多核苷酸还包含编码等价于人免疫球蛋白的Fc区的区域的序列。
16.药物组合物,其包含权利要求1-7任一项的抗体或其抗原结合片段和药用载体。
17.权利要求1-7任一项的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗可通过减少B细胞而治疗的病症的药物中的应用,其中所述病症是血液恶性肿瘤或自体免疫病。
18.权利要求17的抗体或其抗原结合片段的应用,其中所述血液恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤,非-霍奇金淋巴瘤,或B细胞慢性淋巴细胞性白血病。
19.权利要求17的抗体或其抗原结合片段的应用,其中所述自体免疫病是类风湿性关节炎或狼疮。
20.权利要求18的抗体或其抗原结合片段的应用,其中所述血液恶性肿瘤是B细胞淋巴瘤。
21.分离的多核苷酸,其包含编码SEQ ID NO:134的轻链可变区序列的序列。
22.权利要求21的分离的多核苷酸,其中所述分离的多核苷酸还包含编码SEQ ID NO:12的重链可变区序列的序列。
23.表达载体,其包含权利要求21或22的多核苷酸。
24.宿主细胞,其包含权利要求23的表达载体。
25.在宿主细胞中产生具有Fc区域的抗CD-20抗体或其抗原结合片段的方法,所述Fc区域具有修饰的寡糖并被改造以具有增加的效应子功能,所述方法包括:
a.在允许所述抗体产生和允许修饰存在于所述抗体的Fc区域的寡糖的条件下培养宿主细胞,所述宿主细胞被改造以表达至少一种编码具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽的核酸;和
b.分离所述抗体;
其中所述抗体是权利要求1-7任一项所述的修饰的抗体或其抗原结合片段。
26.权利要求25的方法,其中所述宿主细胞还被改造以表达编码具有甘露糖苷酶II活性的多肽的核酸。
27.权利要求25的方法,其中所述修饰的寡糖与未修饰的寡糖相比具有减少的岩藻糖基化。
28.权利要求25的方法,其中由所述宿主细胞产生的所述抗体在所述多肽的Fc区域具有与未修饰的Fc区域相比增加比例的等分、非岩藻糖基化寡糖。
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