CN101146909A - 针对MCSP的并且具有增加的Fc受体结合亲和性和效应子功能的抗原结合分子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗原结合分子(ABMs)。在具体的实施方案中,本发明涉及重组单克隆抗体,包括特异于人MCSP的嵌合的、灵长类化或人源化抗体。此外,本发明涉及编码这些ABMs的核酸分子,和包含所述核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及生产本发明的ABMs的方法,和使用这些ABMs治疗疾病的方法。此外,本发明涉及具有修饰的糖基化的ABMs,所述ABMs具有改善的治疗性质,包括具有增加的Fc受体结合和增加的效应子功能的抗体。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及抗原结合分子(ABMs)。在具体的实施方案中,本发明涉及重组单克隆抗体,包括对于高分子量--黑素瘤-相关抗原(HMW-MAA),也称作黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)特异性的嵌合的、灵长类化(primatized)和人源化的抗体。此外,本发明涉及编码这些ABM的核酸分子,以及包含这些核酸分子的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及生产本发明的ABM的方法,以及利用这些ABM治疗疾病的方法。此外,本发明涉及具有增强治疗特性的修饰糖基化的ABM,包括具有增加的Fc受体结合和增加的效应子功能的抗体。
背景技术
黑素瘤相关的抗原
恶性黑素瘤是人类最常见的致命皮肤癌类型,并且据估计它的发病率以每年5%的速率提高。Campoli等,Crit.Rev.Immunol.24(4):267-296(December2004)。死亡率也在过去的十年中上升,尽管诊断和治疗有所进步。尽管早期黑素瘤是高度可治疗的,但晚期黑素瘤经常耐受常规治疗方案。常规治疗的局限刺激了新策略的研究,用来治疗患有恶性黑素瘤的患者。大多数研究集中在免疫疗法上。
正在开发的大多数人类黑素瘤免疫治疗方案着眼于黑素瘤相关抗原(MAA)。对于免疫治疗来说优选的MAA是这样的抗原,其在大部分黑素瘤中表达但在正常组织中分布有限。一种这样的抗原是黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP),也称作高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)。Pluschke等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:9710-9715(1996);Yang等,J.Cell Biol.165(6):881-891(June2004)。MCSP是高度糖基化的整合膜硫酸软骨素蛋白聚糖,其由N-连接的280kDa糖蛋白组分和细胞膜上表达的450-kDa硫酸软骨素蛋白聚糖组分组成。Ross等,Arch.Biochem.Biophys.225:370-383(1983)。蛋白聚糖是共价连接到糖胺聚糖(GAG)上的蛋白质。MCSP的280-kDa组分和450kDa组分都包含相同的核心蛋白。Ross等,Arch.Biochem.Biophys.225:370-383(1983);Bumol等,J.Biol.Chem.259:12733-12741(1984)。
已经鉴定了编码全长MCSP核心蛋白的cDNA并推定了氨基酸序列。Pluschke等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:9710-9715(1996);Yang等,J.Cell Biol.165(6):881-891(2004年6月)(将每一篇文献的全部内容都并入本文作为参考)。已经登录了MCSP序列并指定了下列登记号:GenBank登记号MIM:601172(基因);GI:1617313,GI:21536290,GI:34148710,和GI:47419929(mRNA);GI:1617314,GI:4503099,GI:34148711,和GI:47419930(蛋白质)。由2322个氨基酸组成的核心蛋白包含3个主要结构域:大的细胞外结构域,疏水跨膜区,和短的细胞质尾巴。利用MCSP序列进行的同源性检索表明在其它动物物种中表达同源物。具体地,大鼠和小鼠的MCSP的同源物分别称作NG2和AN2。每一种都与MCSP具有实质上的氨基酸序列同一性并且具有类似的表达模式。Stallcup等,J.Neurocytol31:423-435(2002);Schneider等,J.Neurosci.21:920-933(2001)。
最初据认为MCSP具有限制的组织分布,因为它一开始仅在黑色素细胞系的细胞,以及毛囊内的细胞,皮肤表皮的基底细胞层,上皮细胞,和周细胞中检测到。Ferrone等,Pharmacol.Ther.57:259-290(1993);Schlingemann等,Am.J.Pathol.136:1393-1405(1990)。不过,最近,已经确定MCSP更广泛地分布在许多正常和转化细胞中。具体地,MCSP在几乎所有的表皮基底细胞中被发现。
MCSP和黑素瘤之间的联系是明确的。MCSP在黑素瘤细胞中差异表达,并且被发现在90%以上受分析的良性痣和黑素瘤损伤中表达。Campoli等,Crit.Rev.Immunol.24(4):267-296(2004年12月)。另外,在所有类型的黑素瘤中于原发和转移病灶之间未发现MCSP表达变化。Kageshita等,Int.J.Cancer56:370-374(1994)。还发现MCSP在非黑素细胞源的肿瘤中表达,包括基底细胞癌,各种神经嵴源的肿瘤,以及在乳腺癌中。Kageshita等,J.Invest.Dermatol.85:535-537(1985);Chekenya等,Int.J.Dev.Neurosci.17:421-435(1999);Chekenya等,J.Neurocytol.31:507-521(2002);Shoshan等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA96:10361-10366(1999);Godal等,Br.J.Cancer53:839-841(1986);Dell′Erba等,Anticancer Res.21:925-930(2001)。
实质性的证据表明MCSP差异性地参与影响黑素瘤细胞的恶性表现。众所周知蛋白聚糖的GAG成分和核心蛋白一般负责结合几种不同的配体,包括,但不限于,粘附分子,趋化因子,细胞因子,细胞外基质(ECM)组分,以及生长因子。Bernfield等,Ann.Rev.Biochem.68:729-777(1999)。具体地,对于MCSP来说,研究证明MCSP特异性抗体可以抑制黑素瘤细胞附着到毛细管内皮和扩散在各种ECM组分上,包括胶原质和胶原质-纤连蛋白复合物。Harper等,J.Natl.Cancer Inst.71:259-263(1983);de Vries等,Int.J.Cancer38:465-473(1986);Iida等,Cancer Res.55:2177-2185(1995);Burg等,J.Cell.Physiol.177:299-312(1998)。其它研究显示MCSP表达局限于转移的黑素瘤细胞上的细胞表面微突结构域。Garrigues等,J.Cell Biol.103:1699-1710(1986)。微突结构域是富含肌动蛋白的结构,它对于转移细胞中与ECM组分的粘连的形成是重要的。总之,证据表明MCSP促进转移细胞的前缘上初始粘连的形成。
其它证据表明MCSP还通过第二种机制调节黑素瘤细胞转移,包括细胞内信号事件的起始。具体地,MCSP和NG2都已显示通过Rho GTP酶家族蛋白的激活促进信号转导。Stallcup等,J.Neurocytol.31:423-435(2002);Eisenmann等,Nat.Cell Biol.1:507-513(1999)。其它研究表明MCSP表达通过整合素依赖型机制导致黏着斑激酶(FAK)的增强激活,并且通过独立机制导致胞外信号调节激酶(ERK)的增强激活。Yang等,J.Cell Biol.165:881-891(June2004)。
MCSP还涉及黑素瘤细胞增殖。具体地,经转染表达MCSP或NG2的黑素瘤细胞呈现提高的体外增殖速率和提高的体内生长速率。这些效应被抗MCSP或抗NG2单克隆抗体所抑制。
实质性的证据表明MCSP在血管发生和黑素瘤细胞入侵中起到关键作用。首先,MCSP在“激活”的周细胞和肿瘤生血管脉管中的周细胞中都得到高水平表达。Ruiter等,Behring Inst.Mitt.92:258-272(1993)。已知周细胞与内皮细胞形成脉管相关联,并且据认为它们通过控制内皮细胞增殖和入侵参与调控血管发生。Witmer等,J.Histochem.Cytochem52(1):39-52(2004);Erber等,FASEB18:338-340(2004);Darland等,Dev.Biol.264:275-288(2003)。其次,MCSP和NG2在正常发育的组织中由血管原性血管广泛表达。Chekenya等,FASEB16:586-588(2002);Ruiter等,Behring Inst.Mitt.92:258-272(1993)。
MCSP在黑素瘤细胞上的高水平表达,以及它在正常组织中的有限分布和MCSP特异性mAbs的存在,使得MCSP成为黑素瘤损伤的合理标记以及免疫疗法的候选靶标。事实上,已经开发了许多针对MCSP的鼠单克隆抗体。Campoli等,Crit.Rev.Immunol.24(4):267-296(2004)。尽管鼠抗MCSP mAb已经显示控制动物模型的肿瘤生长,但在使用这些抗体进行的临床试验中只观察到小的临床反应。观察到何种益处一般取决于抗MCSP抗体影响黑素瘤细胞生物学的能力,而不取决于抗体介导的免疫学机制。因此,大多数MCSP靶向的免疫疗法利用模拟MCSP表位的抗个体基因型的抗体。
未缀合的单克隆抗体(mAbs)可以是用于治疗癌症的药,如由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)所批准的下列药物所证明:用于治疗晚期乳腺癌(Grillo-Lopez,A.-J.,等,Semin.Oncol.26:66-73(1999);Goldenberg,M.M.,Clin.Ther.21:309-18(1999))的曲妥单抗(HerceptinTM;Genentech Inc,),用于治疗CD20阳性B细胞,低级或滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤的利妥昔单抗(RituxanTM;IDEC Pharmaceuticals,SanDiego,CA,和Genentech Inc.,San Francisco,CA),用于治疗复发性急性骨髓白血病的吉姆单抗(MylotargTM,细胞tech/Wyeth-Ayerst),和用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的阿仑单抗(CAMPATHTM,MilleniumPharmaceuticals/Schering AG)。这些产品的成功不仅依赖于它们的功效,还依赖于它们突出的安全模式(Grillo-Lopez,A.-J.,等,Semin.Oncol.26:66-73(1999);Goldenberg,M.M.,Clin.Ther.21:309-18(1999))。尽管在这些药物上所取得的成就,目前在获得更高特异性抗体活性中存在巨大的目标,所述特异性活性比典型地由未缀合的mAb疗法所提供的要高。
许多研究的结果显示Fc-受体依赖性机制相当大地有利于对针对肿瘤的细胞毒性抗体的作用,并且指示针对肿瘤的最佳抗体将优先结合激活Fc受体,并且与抑制性配偶体FcγRIIB结合程度最小(Clynes,R.A.,等,NatureMedicine6(4):443-446(2000);Kalergis,A.M.,和Ravetch,J.V.,J.Exp.Med.195(12):1653-1659(June2002)。例如,至少一项研究的结果显示FcγRIIIa受体特别地与抗体疗法的功效紧密相关(Cartron,G.,等,Blood99(3):754-757(February2002))。该研究显示对于FcγRIIIa是纯合的患者,与对于FcγRIIIa是杂合的患者相比,具有更好的针对利妥昔单抗的应答。作者得出结论为更优的应答是由于抗体与FcγRIIIa的更好的体内结合,其导致了针对淋巴瘤细胞的更好的ADCC活性(Cartron,G.,等,Blood99(3):754-757(February2002))。
已经报道了靶向MCSP的各种免疫治疗策略。早期的免疫疗法在晚期黑素瘤患者中使用MCSP作为基于抗体的被动免疫疗法中的靶标。一般,向患者单独施用抗MCSP抗体或缀合毒素施用抗MCSP抗体。Schroff等,Cancer Res.45:879-885(1985);Spitler等,Cancer Res.47:1717-1723(1987);Bumol等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA80:529-533(1983)。尽管这些抗体在动物模型中呈现肿瘤抑制作用,但只在少数患者中观察到很小的临床反应。Matsui等,Jap.J.Cancer Res.76:119-123(1985);Morgan等,J.Natl.CancerInst.78:1101-1106(1987);Ghose等,Cancer Immunol.Immunother.34:90-96(1991)。最近,用单链Fv免疫缀合物和用靶向MCSP的抗个体基因型抗体单克隆抗体观察到提高的治疗性应答。Wang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:1627-1632(1999);Kang等,Clin.Cancer Res.6:4921-4931(2000);Mittelman等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:466-470(1992);美国专利号5,270,202;美国专利号5,780,029;美国专利号5,866,124。不过,这些免疫疗法有缺陷。具体地,抗个体基因型抗体不可用于靶向表达MCSP的细胞。另外,scFv构建体缺少Fc区并且因此不能单独地诱导MCSP阳性靶细胞的裂解。
已经开发的大多数抗MCSP单克隆抗体是鼠类的。它们包括mAb149.53,mAb225.28;mAb763.74;和mAb9.2.27。Campoli等,Crit.Rev.Immunol24(4):267-296(2004)。到目前为止,仅从人类来源分离出少数抗MCSP抗体。Wang等,Proc.Nat.Acad.Sci.96:1627-1632(1999)。据信到目前为止尚无鼠(或任何其它非人)抗MCSP抗体被人源化。在治疗中使用鼠抗体的潜在问题是非人单克隆抗体可以被人宿主识别为异源蛋白;所以,反复注射这些异源抗体可以导致免疫应答的诱导,致成有害的过敏反应。对于基于鼠的单克隆抗体,这经常被称为人抗小鼠抗体应答,或″HAMA″应答。此外,这些“异源”抗体可以被宿主的免疫系统所攻击从而使它们,在达到它们的靶位点前被有效地中和。另外,非人单克隆抗体(即,鼠单克隆抗体)通常缺乏人效应子功能,即它们不能,特别是通过抗体依赖性细胞毒性或Fc-受体介导的吞噬作用来介导补体依赖性的裂解或溶解人靶标细胞。
已经将包括来自两种或更多种不同物种(例如,小鼠和人)的抗体的部分的嵌合抗体开发为“缀合”抗体的备选。
抗体糖基化
寡糖成分可以显著地影响与治疗性糖蛋白的功效有关的特性,包括物理稳定性,对蛋白酶攻击的抗性,与免疫系统的相互作用,药物代谢动力学,和特异性生物活性。这些特性可以不仅依赖于寡糖的存在或缺乏,还依赖于寡糖的特异性结构。可以在寡糖结构和糖蛋白功能之间进行一些总结。例如,某些寡糖结构通过与特异性糖结合蛋白相互作用介导糖蛋白从血流中快速清除,而其它的可以被抗体结合并且触发不需要的免疫反应。(Jenkins等,Nature Biotechnol.14:975-81(1996))。
哺乳动物细胞是用于产生治疗性糖蛋白的优选宿主,由于它们具有以对于人应用的最相容的形式使蛋白质糖基化的能力。(Cumming等,Glycobiology1:115-30(1991);Jenkins等,Nature Biotechnol.14:975-81(1996))。细菌极少使蛋白质糖基化,并且类似的其它类型的常见宿主,诸如酵母,丝状真菌,昆虫和植物细胞,产生糖基化模式,所述糖基化模式与从血流中快速清除,不理想的免疫相互作用有关,并且在一些特别的情形中,减少生物学活性。在哺乳动物细胞中,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是过去的20年间最常用的细胞。除了给出适合的糖基化模式之外,这些细胞容许持续的产生遗传稳定性,高生产性的克隆细胞系。使用无血清培养基,它们可以在简单生物反应器中被培养到高密度,并且容许开发安全和可再现的生物工艺。其它常用的动物细胞包括幼仓鼠肾(BHK)细胞,NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。最近,还已经测试了来自转基因动物的产物。(Jenkins等,Nature Biotechnol.14:975-81(1996))。
所有的抗体在重链恒定区的保守位置包含糖结构,其中每种同种型都具有N-连接的糖结构的独特阵列,其可变地影响蛋白质排列,分泌或功能活性。(Wright,A.,和Morrison,S.L,Trends Biotech.75:26-32(1997))。连接的N-连接糖的结构取决于加工的程度而相当大地变化,并且可以包括高-甘露糖,多支链以及双触角的复合物寡糖(Wright,A.,和Morrison,S.L,Trends Biotech.I5:26-32(1997))。典型地,存在在特定糖基化位点连接的核心寡糖结构的不均匀加工从而使均一的单克隆抗体作为多种糖形存在。类似地,已经显示在抗体糖基化中的主要不同发生在不同细胞系之间,并且在不同培养条件下,甚至观察到对于给定细胞系的微小差异。(Lifely,M.R.等,Glycobiology 5(8):813-22(1995))。
获得潜能的大的增加,同时维持简单的生产过程并潜在地避免明显的,不理想的副作用的一种方式是通过改造它们的寡糖成分增加单克隆抗体的天然的、细胞介导的效应子功能,如在P.等,Nature Biotechnol.I7:176-180(1999)和美国专利号6,602,684中所述,将它们全部内容并入作为参考。IgGl型抗体,在癌症的免疫疗法中最常用的抗体是在每个CH2结构域的Asn297具有保守N-连接糖基化位点的糖蛋白。与Asn297连接的两个复合双触角寡糖隐藏在CH2结构域之间,形成了与多肽主链的广泛接触,并且它们的存在对于抗体介导效应子功能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)是必要的。(Lifely,M.R.,等,Glycobiology 5:813-822(1995);Jefferis,R.,等,Immunol Rev.I63:59-76(1998);Wright,A.andMorrison,S.L,Trends Biotechnol.75:26-32(1997))。
等先前显示了β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“GnTIII”),其是催化分叉寡糖的形成的糖基转移酶,在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达,显著增加了由改造的CHO细胞产生的抗-成神经细胞瘤嵌合单克隆抗体(chCE7)的体外ADCC活性。(见P.等,Nature Biotechnol.17:176-180(1999);和国际公开号WO99/54342,将其全部内容并入作为参考)。抗体chCE7属于未缀合的mAbs的大类,其具有高肿瘤亲和性和特异性,但是当在缺乏GnTIII酶的标准工业化细胞系中生产时,潜能过低而无法进行临床应用(Umana,P.,等,Nature Biotechnol.17:176-180(1999))。该研究首先显示ADCC活性的大量增加可以通过将产生抗体的细胞改变为表达GnTIII而获得,其也导致了恒定区(Fc)-关联的,分叉的寡糖的比例增加到在天然存在的抗体中发现水平以上,所述寡糖包括分叉的(bisected)、非岩藻糖基化的寡糖。
仍旧存在对于靶向MCSP以治疗包括但不限于人中的哺乳动物中的细胞增殖性病症的改进的治疗性方法的需要,其中这些病症的特征是MCSP表达,特别是异常的表达(例如,过表达),包括但不限于黑素瘤,神经胶质瘤,小叶性乳腺癌,还有诱导新血管系统的肿瘤。
发明简述
认识到抗原结合分子(ABMs)的巨大治疗潜能,本发明人开发了生产这些ABMs的方法,所述ABMs具有鼠225.28S抗体的结合特异性并且已经进行了糖基改造(glycoengineered)以增加Fc受体结合亲和性和效应子功能。特别地,该方法包括生产重组的、嵌合(包括人源化的)抗体或其嵌合片段。这些ABMs的功效还通过改变抗体Fc区域的糖基化模式而进一步提高。
因此,在一个实施方案中,本发明涉及分离的多核苷酸,其包括:(A)选自由:SEQ ID NO:61;SEQ ID NO:63;SEQ ID NO:65;SEQ ID NO:67;SEQ ID NO:69;SEQ ID NO:71;SEQ ID NO:73;SEQ ID NO:75组成的组的序列;和(B)选自由:SEQ ID NO:77;SEQ ID NO:79;SEQ ID NO:81;SEQID NO:83;SEQ ID NO:85;SEQ ID NO:87;SEQ ID NO:89;SEQ ID NO:91;和SEQ ID NO:93组成的组的序列;和(C)SEQ ID NO:95。优选地,分离的多核苷酸编码融合蛋白。
在另一个实施方案中,本发明涉及分离的多核苷酸,其包括:(A)选自由:SEQ ID NO:97;SEQ ID NO:99;和SEQ ID NO:101组成的组的序列;和(B)SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:105;和(C)SEQ ID NO:107。优选地,分离的多核苷酸编码融合蛋白。
在又一个实施方案中,本发明涉及分离的多核苷酸,其包括选自由:SEQ ID No:3;SEQ ID No:5;SEQ ID No:7;SEQ ID No:9;SEQ ID No:11;SEQ ID No:13;SEQ ID No:15;SEQ ID No:17;SEQ ID No:19;SEQ ID No:21;和SEQ ID No:23组成的组的序列。本发明还涉及分离的多核苷酸,其包括选自由SEQ ID No:29,SEQ ID No:31,和SEQ ID No:33;SEQ ID NO:35;SEQ ID NO:37;SEQ ID NO:39;SEQ ID NO:41;SEQ ID NO:43;SEQ IDNO:45;SEQ ID NO:47;SEQ ID NO:49;SEQ ID NO:51组成的组的序列。优选地,分离的多核苷酸编码融合蛋白。
本发明的又一个实施方案涉及分离的多核苷酸,其包括:(A)编码具有选自由SEQ ID No:2;SEQ ID No:4;SEQ ID No:6;SEQ ID No:8;SEQ IDNo:10;SEQ ID No:12;SEQ ID No:14;SEQ ID No:16;SEQ ID No:18;SEQID No:20;SEQ ID No:22;SEQ ID No:24组成的组的序列的多肽的序列;和(B))编码具有选自由:SEQ ID NO:28SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQID NO:34和SEQ ID NO:36;SEQ ID NO:38;SEQ ID NO:40;SEQ IDNO:42;SEQ ID NO:44;SEQ ID NO:46;SEQ ID NO:48;SEQ ID NO:50;SEQ ID NO:52组成的组的序列的多肽的序列。
另一个实施方案中,本发明涉及分离的多核苷酸,其包括这样的序列,所述序列与选自由:SEQ ID No:1;SEQ ID No:3;SEQ ID No:5;SEQ IDNo:7;SEQ ID No:9;SEQ ID No:11;SEQ ID No:13;SEQ ID No:15;SEQ IDNo:17;SEQ ID No:19;SEQ ID No:21;和SEQ ID No:23组成的组的序列具有至少80%,或者至少85%,或者至少90%,或者至少95%,或者至少99%的同一性,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。这些分离的多核苷酸可以进一步包含编码人抗体轻或重链恒定区的核苷酸序列。
在又一个实施方案中,本发明还涉及分离的多核苷酸,其包括这样的序列,所述序列与选自由:SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31;SEQ ID NO:33;SEQ ID NO:35;SEQ ID NO:37;SEQ ID NO:39;SEQ IDNO:41;SEQ ID NO:43;SEQ ID NO:45;SEQ ID NO:47;SEQ ID NO:49;和SEQ ID NO:51组成的组的序列具有至少80%,或者至少85%,或者至少90%,或者至少95%,或者至少99%的同一性,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。这些分离的多核苷酸可以进一步包含编码人抗体轻或重链恒定区的核苷酸序列。
本发明还涉及分离的多核苷酸,其包括:(A)编码具有选自由SEQID No:2;SEQ ID No:4;SEQ ID No:6;SEQ ID No:8;SEQ ID No:10;SEQ IDNo:12;SEQ ID No:14;SEQ ID No:16;SEQ ID No:18;SEQ ID No:20;SEQID No:22;和SEQ ID No:24组成的组的序列的多肽的序列;和(B)编码来自除鼠物种之外物种的多肽的序列,所述多肽具有抗体Fc区的序列,或其片段。或者,本发明涉及分离的多核苷酸,其包括:(A)编码具有选自由:SEQ ID NO:28SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34;SEQ IDNO:36;SEQ ID NO:38;SEQ ID NO:40;SEQ ID NO:42;SEQ ID NO:44;SEQ ID NO:46;SEQ ID NO:48;SEQ ID NO:50;和SEQ ID NO:52组成的组的序列的多肽的序列;和(B)编码来自除小鼠之外物种的具有抗体轻链恒定结构域,或其片段的序列的多肽的序列。
本发明进一步涉及分离的多核苷酸,其编码具有选自由SEQ ID No:4;SEQ ID No:6;SEQ ID No:8;SEQ ID No:10;SEQ ID No:12;SEQ ID No:14;SEQ ID No:16;SEQ ID No:18;SEQ ID No:20;SEQ ID No:22;和SEQ IDNo:24组成的组的序列的多肽。另一个实施方案中,本发明涉及分离的多核苷酸,其编码具有选自由SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32;SEQ ID NO:34;SEQ ID NO:36;SEQ ID NO:38;SEQ ID NO:40;SEQ ID NO:42;SEQ IDNO:46;SEQ ID NO:48;和SEQ ID NO:52组成的组的序列的多肽。
本发明还涉及包括一种或多种上述本发明的多核苷酸的表达载体。优选地,所述表达载体至少编码抗体的轻或重链。在一个实施方案中,所述表达载体编码抗体的轻和重链两者。载体可以是多顺反子性的载体。
本发明进一步涉及包含一种或多种本发明的表达载体或一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在一个实施方案中,所述宿主包含分离的多核苷酸,其包括这样的序列,所述序列与选自由:SEQ ID No:1;SEQ IDNo:3;SEQ ID No:5;SEQ ID No:7;SEQ ID No:9;SEQ ID No:11;SEQ IDNo:13;SEQ ID No:15;SEQ ID No:17;SEQ ID No:19;SEQ ID No:21;和SEQ ID No:23组成的组的序列具有至少80%,或者至少85%,或者至少90%,或者至少95%,或者至少99%的同一性,并且进一步包含第二种多核苷酸,其包含编码抗体轻链的可变区的序列。在又一个实施方案中,本发明的宿主细胞包含分离的多核苷酸,其包括这样的序列,所述序列与选自由:SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31;SEQ ID NO:33;SEQID NO:35;SEQ ID NO:37;SEQ ID NO:39;SEQ ID NO:41;SEQ ID NO:43;SEQ ID NO:45;SEQ ID NO:47;SEQ ID NO:49;和SEQ ID NO:51组成的组的序列具有至少80%,或者至少85%,或者至少90%,或者至少95%,或者至少99%的同一性,并且进一步包含第二种多核苷酸,其包含编码抗体重链的可变区的序列。
在另一个实施方案中,本发明涉及融合多肽,其包括选自由SEQ IDNo:2;SEQ ID No:4;SEQ ID No:6;SEQ ID No:8;SEQ ID No:10;SEQ IDNo:12;SEQ ID No:14;SEQ ID No:16;SEQ ID No:18;SEQ ID No:20;SEQID No:22;和SEQ ID No:24组成的组的序列,或其变体。
本发明还涉及融合多肽,其包括选自由:SEQ ID NO:28;SEQ IDNO:30,SEQ ID NO:32;SEQ ID NO:34;SEQ ID NO:36;SEQ ID NO:38;SEQ ID NO:40;SEQ ID NO:42;SEQ ID NO:46;SEQ ID NO:48;和SEQ IDNO:52组成的组的序列,或其变体。
本发明还涉及抗原结合分子。因此,在一个实施方案中,本发明涉及抗原结合分子,其包括一种或多种本发明的融合多肽。优选地,所述抗原结合分子选择性地结合人MCSP。在一个优选的实施方案中,所述抗原结合分子是抗体。人源化抗体是特别优选的抗原结合分子。或者,所述抗体可以被灵长类化。在其它实施方案中,本发明的抗原结合分子包括具有抗体Fc区或等同于抗体Fc区的区域的抗体片段。在又一个实施方案中,本发明的抗原结合分子是scFv,二抗体,三链抗体,和四链抗体,Fab或Fab2片段。在优选的实施方案中,所述抗原结合分子是重组抗体,例如,人源化的,重组抗体。重组抗体一般将包括人Fc区,优选人IgG Fc区。
在另一个实施方案中,本发明涉及如上所讨论的抗原结合分子,其已经进行糖基改造以具有Fc区域,其含有修饰的寡糖。在一个实施方案中,与未经糖基改造的抗原结合分子相比,经修饰的Fc区具有减少数目的岩藻糖。在另一个实施方案中,与未经糖基改造的抗原结合分子相比,Fc区具有增加比例的分叉寡糖。在又一个实施方案中,分叉的寡糖是占优势的分叉复合物。在另一个实施方案中,与未经糖基改造的抗原结合分子相比,本发明的经糖基改造的抗原结合分子在所述抗原结合分子的Fc区中具有增强比例的分叉的、未岩藻糖化的寡糖。或者,与未经糖基改造的抗原结合分子相比,本发明的抗原结合分子在Fc区中的GlcNAc残基/岩藻糖残基的比率提高。
在一个实施方案中,分叉的,未岩藻糖化的寡糖是占优势的杂合形式。或者,分叉的、未岩藻糖化的寡糖是占优势的复合类型。在某些实施方案中,至少20%,至少30%,至少35%或至少40%的Fc区中的寡糖是分叉的,未岩藻糖化的。在其它实施方案中,至少50%,或至少60%,或至少70%,或至少80%,或至少90%,或至少95%的Fc区中的寡糖是分叉的。在又一个实施方案中,至少50%,或者至少60%,或者至少70%,或者至少75%的Fc区中的寡糖是未岩藻糖化的。
本发明还涉及生产抗原结合分子的方法,该抗原结合分子能够与鼠225.28S单克隆抗体竞争结合人MCSP,所述方法包括:(a)在容许编码所述抗原结合分子的多核苷酸表达的条件下,培养本发明的宿主细胞;和(b)回收所述抗原结合分子。在一个实施方案中,所述抗原结合分子是抗体,如人源化抗体。
本发明还涉及包含本发明的抗原结合分子以及药用载体的药物组合物。所述药物组合物可以任选地包含佐剂。
本发明还进一步涉及在样品或受试者中鉴定表达MCSP的细胞的方法,包括向所述样品或受试者施用本发明的抗原结合分子。在一个实施方案中,所述鉴定是用于诊断目的的。在另一个实施方案中,所述鉴定是用于治疗目的的,如疾病或病症的治疗。因而,在某些方面,本发明涉及在需要的受试者中治疗MCSP介导的细胞增生病症的方法,包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。优选地,所述受试者是人。在一个实施方案中,治疗包括阻断MCSP介导的相互作用,其选自由:MCSP配体结合,黑素瘤细胞粘附,周细胞活化,对于纤连蛋白的趋化反应,在ECM蛋白上的细胞扩散,FAK信号转导和ERK信号转导组成的组。在另一个实施方案中,治疗的疾病或病症选自由:黑素瘤,神经胶质瘤,小叶性乳腺癌,急性白血病,或实体瘤诱导的新血管生成组成的组。在又一个实施方案中,所述治疗包括杀死表达MCSP的细胞,优选过表达MCSP的细胞。
本发明进一步涉及宿主细胞,其经糖基改造以表达至少一种编码具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的第一多肽的核酸,其表达量足以修饰由所述宿主细胞产生的第二多肽的Fc区中的寡糖,其中所述第二多肽是本发明的抗原结合分子。在一个实施方案中,宿主细胞进一步表达具有甘露糖苷酶II活性的多肽。在特定的实施方案中,所述第一多肽进一步包括高尔基体定居(resident)多肽的定位结构域。优选地,本发明的抗原结合分子是抗体或抗体片段。在另一个实施方案中,抗原结合分子包括人IgG的Fc区或等价于人IgG的Fc区的区域。
与由未经糖基改造的宿主细胞产生的抗原结合分子相比,由本发明的宿主细胞产生的抗原结合分子呈现增加的Fc受体结合活性和/或增加的效应子功能。
在某些实施方案中,由宿主细胞表达的第一多肽包括β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III的催化结构域。在一个实施方案中,所述第一多肽进一步包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域,如甘露糖苷酶II的定位结构域,β(1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶I的定位结构域,β(1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶II的定位结构域,甘露糖苷酶I的定位结构域,或α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
由本发明的宿主细胞产生的抗原结合分子呈现的增加的效应子功能是增加的Fc-介导的细胞毒性,增加的与NK细胞的结合,增加的与巨噬细胞的结合,增加的与多形核细胞的结合,增加的与单核细胞的结合;增加的定向信号传导诱导程序性细胞死亡;增加的树突细胞成熟;和增加的T细胞引发中的一种或多种。
在一个实施方案中,由本发明的抗原结合分子呈现的增加的Fc受体结合是增加的与Fcγ激活受体,如FcγRIII的结合。在特定的实施方案中,增加的结合是与人FcγRIIIa受体或其天然存在的变体的结合。
在某些实施方案中,本发明的宿主细胞是HEK293-EBNA细胞,CHO细胞,BHK细胞,NSO细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞。在一个实施方案中,本发明的宿主细胞包括至少一种核酸,其编码具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽,可操作性地连接到组成型启动子元件上。在另一个实施方案中,由宿主细胞表达的具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽是融合多肽。
本发明还涉及分离的多核苷酸,其包括至少一种,或者至少两种,或者至少三种,鼠225.28S单克隆抗体的互补决定区,或至少包含所述互补决定区的特异性决定残基的其变体或截短形式,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。优选地,互补决定区选自由:SEQ ID NO:61;SEQ ID NO:63;SEQ ID NO:65;SEQ ID NO:67;SEQ ID NO:69;SEQ ID NO:71;SEQ IDNO:73;SEQ ID NO:75;SEQ ID NO:77;SEQ ID NO:79;SEQ ID NO:81;SEQ ID NO:83;SEQ ID NO:85;SEQ ID NO:87;SEQ ID NO:89;SEQ IDNO:91;SEQ ID NO:93;和SEQ ID NO:95组成的组。在另一个实施方案中,互补决定区选自由:SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:101;SEQID NO:103;SEQ ID NO:105;SEQ ID NO:107组成的组。优选地,融合多肽编码本发明的抗原结合分子。
在特定的实施方案中,CDRs包含至少一种选自由:SEQ ID NO:61;SEQ ID NO:63;SEQ ID NO:65;SEQ ID NO:67;SEQ ID NO:69;SEQ IDNO:71;SEQ ID NO:73;SEQ ID NO:75;SEQ ID NO:77;SEQ ID NO:79;SEQ ID NO:81;SEQ ID NO:83;SEQ ID NO:85;SEQ ID NO:87;SEQ IDNO:89;SEQ ID NO:91;SEQ ID NO:93;和SEQ ID NO:95组成的组的序列;和至少一种选自由:SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:101;SEQID NO:103;SEQ ID NO:105;SEQ ID NO:107组成的组的序列,或包含每种所述互补决定区的特异性决定残基的其变体或截短形式。本发明还涉及编码这些多核苷酸的多肽,以及包含这些多肽的抗原结合分子。
在一些实施方案中,本发明的抗原结合分子将包括抗体轻或重链的可变区。在其它实施方案中,所述ABM将是嵌合的或人源化的抗体。
本发明进一步涉及在宿主细胞中生产抗原结合分子的方法,所述抗原结合分子具有经修饰的寡糖,所述方法包括:(a)在容许所述抗原结合分子产生和容许在所述抗原结合分子的Fc区域上存在的寡糖的修饰的条件下,培养这样的宿主细胞,所述宿主细胞被糖基改造从而表达至少一种编码具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽的核酸;和(b)分离所述抗原结合分子,其中所述抗原结合分子能够与鼠225.28S单克隆抗体竞争结合人MCSP,并且其中所述抗原结合分子或其片段是嵌合的或人源化的。在本发明的一个方法中,与非经糖基改造的抗原结合分子相比,经修饰的寡糖的岩藻糖残基比例降低。在某些实施方案中,经修饰的寡糖主要是杂合形式。在备选的实施方案中,经修饰的寡糖主要是复合形式。在另一个实施方案中,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,或至少90%的经修饰的寡糖是分叉的,未岩藻糖化的。
在本发明的方法的其它实施方案中,与由未经糖基改造的细胞产生的抗原结合分子相比,由所述宿主细胞产生的重组抗体或其片段在所述多肽的Fc区中具有提高比例的分叉的,未岩藻糖化的寡糖。在一个实施方案中,分叉的,未岩藻糖化的寡糖主要是杂合形式。另一个实施方案,分叉的,未岩藻糖化的寡糖主要是复合形式。在某些实施方案中,所述多肽的Fc区中至少20%,至少30%,至少35%,或至少40%的寡糖是分叉的,未岩藻糖化的。
在某些实施方案中,通过本发明的方法生产的抗原结合分子将具有增加的效应子功能和或增加的Fc受体结合亲和性。在一个实施方案中,所述抗原结合分子是抗体。增加的效应子功能是增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性;增加的与NK细胞的结合;增加的与巨噬细胞的结合;增加的与单核细胞的结合;增加的与多形核细胞的结合;增加的定向信号传导诱导程序性细胞死亡;增加的树突细胞成熟;和增加的T细胞引发中的一种或多种。优选地,增加的Fc受体结合是增加的与Fc激活受体,如FcγRIII a的结合。
本发明还涉及作为融合蛋白的抗原结合分子,其包括具有选自由:SEQ ID No:2;SEQ ID No:4;SEQ ID No:6;SEQ ID No:8;SEQ ID No:10;SEQ ID No:12;SEQ ID No:14;SEQ ID No:16;SEQ ID No:18;SEQ ID No:20;SEQ ID No:22;和SEQ ID No:24组成的组的序列的多肽;以及等同于免疫球蛋白的Fc区的区域,并经改造从而具有增加的效应子功能。在另一个实施方案中,所述抗原结合分子这样的融合蛋白,其包括具有选自由SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:36;SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQID NO:46,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:50,和SEQ ID NO52组成的组的序列的多肽,以及等同于免疫球蛋白的Fc区的区域,并经改造从而具有增加的效应子功能。本发明还涉及包含这些抗原结合分子以及药用载体的药物组合物。
本发明还涉及在其需要的受试者的肿瘤新血管系统中诱导活化周细胞的裂解的方法,包括向所述受试者施用本发明的抗原结合分子或包含所述抗原结合分子的药物组合物。优选地,所述受试者是人。在一个实施方案中,所述新血管系统不是黑素瘤新血管系统或成胶质细胞瘤新血管系统。在另一个实施方案中,所述抗原结合分子与另一种抗血管生成剂,如抗VEGF-1抗体共施用。
附图简述
图1显示三种重链构建体M-HHA,M-HHB,和M-HHC以及三种轻链构建体M-KV1,M-KV2,和M-KV3的结合活性。人源化重链构建体与鼠轻链(mVL)共表达,而人源化轻链构建体与鼠重链(mVH)共表达。当与鼠VL结合时,M-HHA和M-HHB或多或少地保留了它们的结合特性。相反地,M-HHC显著丧失了它的结合潜力。与鼠对应物相比,M-KV1和M-KV2显示强烈不同的结合活性,而M-KVC显示与鼠轻链相似的结合性质。
图2显示″低同源性″构建体M-HLA,M-HLB,和M-HLC的结合数据。
图3显示当与M-HHB重链配对时轻链构建体M-KV4,M-KV5,M-KV6,M-KV7,M-KV8和M-KV9的结合数据。与ch-225.28S抗体相比,M-KV4显示提高的抗原亲和性,而M-KV5和M-KV6丧失了功能特性,M-KV7显示与ch-225.28S相似的结合。
图4显示当重链构建体M-HLE1,M-HLE2,M-HLF和M-HLG与轻链构建体m-KV4配对时抗原结合测定的结果。构建体M-HLE1和M-HLE2显示一些残余的结合,而M-HLF显示几乎没有结合。在另一方面,M-HLG显示比亲本抗体ch-225.28S更高的抗原亲和性。
图5显示当与M-HHB组合时轻链变体M-KV9的结合。此构建体显示良好的结合数据。
图6显示利用人PBMC细胞进行的抗体介导的细胞杀伤中,225.28S抗体的人源化M-HLG/M-KV9构建体的不同糖形式的比较。靶细胞是人A2058细胞,并且可以观察到与野生型抗体相比,糖基改造构建体的效能和效率的强烈提高。
图7显示组合了M-HLG重链的轻链构建体M-KV10,M-KV11,和M-KV12的抗原结合性质的比较。与M-KV9轻链构建体相比,这些变体全部都显示减弱的结合。另外此图中还显示了配对以M-KV9轻链的M-HLD重链。M-HLD是完全失活的构建体M-HLC的Tyr27Phe和Thr30Ser变体。因而,这两处突变部分恢复了抗原结合活性。这表明这两个残基对于整个人源化过程的重要性。
图8显示未经糖基改造的M-HLG/M-KV9G2人源化IgG l225.28S抗人MCSP抗体的PNGaseF释放Fc-寡糖的MALDI/TOF-MS图谱。在1485.5和1647.6m/z上的两个主峰都对应于杂合的分叉岩藻糖化的糖。
图9显示经糖基改造的M-HLG/M-KV9G2人源化IgGl225.28S抗人MCSP抗体的PNGaseF释放Fc-寡糖的MALDI/TOF-MS图谱。糖基改造由抗体基因与编码具有β-1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnT-III)催化活性的基因以及编码具有高尔基体α-甘露糖苷酶II催化活性的基因在宿主细胞中的共表达而实施。在1542.9,1688.7,1704.6,和1850.5上的四个主峰都对应于复合的分叉糖,所述分叉糖以其岩藻糖化及其非岩藻糖化的形式存在。
图10显示不同N-连接寡糖的示意图,其可以通过GnTIII和/或ManII共表达由糖基改造而被影响。
图11显示抗体依赖型的细胞毒性(ADCC),利用M-HLG/M-KV9抗体,人平滑肌细胞(HuSMC)作为靶标,人PBMC作为效应细胞。效应物/靶标比率为25/1,实验持续时间为4h。
图12显示抗体依赖型的细胞毒性(ADCC),利用未经糖基改造以及经糖基改造(G2)形式的M-HLG/M-KV9抗体,人成胶质细胞瘤细胞系LN229作为靶标,和人PBMC作为效应细胞。效应物/靶标比率为25/1,实验持续时间为4h。
发明详述
本文所用的术语如本领域通常所用的,除非如下另外指出。
用于本文时,术语抗体意欲包括整个抗体分子,以及具有Fc区域并保留结合特异性的抗体片段,和融合蛋白,所述融合蛋白包括等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域并保留结合特异性,所述整个抗体分子包括单克隆抗体,多克隆抗体和多特异性(例如,二特异性)的抗体。还包括嵌合的和人源化的,以及骆驼化(camelized)和灵长类化抗体。
用于本文时,术语Fc区域意欲指人IgG重链的C-末端区域。尽管IgG重链的Fc区域的范围可以轻微变化,人IgG重链Fc区域通常限定为从位点Cys226的氨基酸残基延伸到羧基末端一段。
用于本文时,术语“等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域”意欲包括免疫球蛋白的Fc区域的天然存在的等位基因变体以及具有改变的变体,所述改变产生替换,添加,或缺失,但是基本不会减少免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性的细胞的细胞毒性)的能力。例如,在免疫球蛋白的Fc区域的N-末端或C末端可以缺失一个或多个氨基酸,而基本不丧失生物学功能。可以按照本领域已知的一般规则来选择这些变体从而对活性具有最小的影响。(见,例如Bowie,J.U.等,Science247:1306-10(1990)。
本文所用的术语MCSP指人黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(也称作高分子量-黑素瘤-相关的抗原(HMW-MAA)),及其天然存在的异型和变体。已经将MCSP序列登录并指定下列登记号:GenBank登记号MIM:601172(基因);GI:1617313,GI:21536290,GI:34148710,和GI:47419929(mRNA);GI:1617314,GI:4503099,GI:34148711,和GI:47419930(蛋白质)。
本文所用的术语MCSP配体指这样的多肽,其结合和/或激活MCSP。该术语包括MCSP配体的膜结合前体形式,以及MCSP配体的蛋白水解加工的可溶形式。
本文所用的术语特征为MCSP或MCSP配体的异常激活、表达或生产的疾病或病症,或涉及MCSP表达的病症指这样一种病症,其可包括或不包括恶性肿瘤或癌症,其中MCSP和/或MCSP配体的异常激活和/或生产发生在受试者的细胞或组织中,所述受试者患有或易患所述疾病或病症。
本文所用的术语过表达(overexpress,overexpressed,和overexpressing),当与表达MCSP的细胞关联使用时,指与相同组织类型的正常细胞相比在其表面上具有可测量较高水平的MCSP的细胞。这种过表达可以由基因扩增或由增加的转录或翻译而引起。在诊断或预后测定中可以通过评估存在于细胞表面上的MCSP的水平而测定MCSP表达(例如通过免疫组化测定,免疫荧光测定,免疫酶测定,ELISA,流式细胞分析,放射免疫测定,蛋白质印迹分析,配体结合,激酶活性,等等)(通常参见,CELL BIOLOGY:A LABORATORY HANDBOOK,Celis,J.,ed.,Academic Press(2d ed.,1998);CURRENT PROTOCOLSINPROTEIN SCIENCE,Coligan,J.E.等,eds.,John Wiley&Sons(1995-2003);还参见,Sumitomo等,Clin.Cancer Res.10:794-801(2004)(描述蛋白质印迹分析,流式细胞分析,和免疫组化),将其内容并入本文作为参考))。备选地,或另外,可以通过例如荧光原位杂交,DNA印迹分析,或PCR技术来测量细胞中的MCSP-编码核酸分子的水平。将正常细胞中的MCSP水平与被细胞增殖病症(例如,癌症)影响的细胞的水平相比较,以确定MCSP是否过表达。
本文所用的术语抗原结合分子或ABM在其最宽泛的意义上指特异性结合抗原决定子的分子。更加具体地,结合MCSP的抗原结合分子是特异性结合如上所定义的MCSP的分子。优选地,ABM是抗体;不过,本发明还包括单链抗体,单链Fv分子,Fab片段,二抗体,三链抗体,和四链抗体,等等。
″特异性结合″或″以相同的特异性结合″指结合对于抗原是选择性的并且可以与不需要的或非特异性相互作用区别开。
本文所用的术语融合的和嵌合的,当关于多肽如ABM使用时,指这样的多肽,所述多肽包括来自两个或更多异源多肽的氨基酸序列,诸如来自不同物种的抗体的部分。例如,对于嵌合ABMs而言,非抗原结合成分可以来自广泛种类的物种,包括灵长类动物诸如黑猩猩和人。最优选嵌合ABM的恒定区与天然人抗体的恒定区基本相同;最优选嵌合抗体的可变区与重组抗MCSP抗体的可变区基本相同,所述抗MCSP抗体具有鼠可变区的氨基酸序列。人源化的抗体是融合或嵌合抗体的特别优选的形式。
用于本文时,具有“GnTIII活性”的多肽指这样的多肽,所述多肽能够催化以β-1-4连接将N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基添加到N-联寡糖中的三甘露糖基核心的β连接的甘露糖苷上。这包括融合多肽,所述多肽显示类似于但不必须相同于β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III的活性的酶活性,如在特别的生物测定中所测量的,具有或不具有剂量依赖性,按照国际生化和分子生物学命名委员会(NC-IUBMB),其也被称为β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰基葡糖胺基-转移酶(EC2.4.1.144)。在其中确实存在剂量依赖性的情形中,其不需要与GnTIII的剂量依赖性相同,但是与GnTIII活性相比,基本类似于在给定活性中的剂量依赖(即,相对于GnTIII,候选多肽将显示更大的活性或不超过约25倍更少,并且优选地,不超过约10倍更少的活性,并且最优选地,不超过约三倍更少的活性)。
用于本文时,术语变体(或类似物)指通过使用,例如重组DNA技术产生的氨基酸插入,缺失,和替换而与本发明特别陈述的多肽区别开的多肽。本发明的ABMs的变体包括嵌合的,灵长类化或人源化的抗原结合分子,其中氨基酸残基的一个或数个通过以这样的方式替换,添加和/或缺失进行修饰,所述方式基本上不影响抗原(例如,MCSP)结合亲和性或抗体效应子功能。可以通过将特定多肽的序列与同源肽的序列进行比较并使在高同源性的区域(保守区域)中所作的氨基酸序列变化的数量最少化,或通过用共有序列来替代氨基酸来发现确定哪种氨基酸可以被替换,添加,或缺失而不会破坏目标活性的指导。
或者,编码这些相同或类似多肽的重组变体可以通过使用在遗传密码中的“丰余性”来合成或选择。各种密码子替换,诸如产生各种限制性位点的沉默改变可以被引入从而优化克隆到质粒或病毒载体中,或在特定原核或真核系统中的表达。在多核苷酸序列中的突变可以反映在多肽或被加入多肽的其它肽的结构域中从而修饰多肽的任何部分的特性,从而改变特性诸如配体结合亲和性,链间亲和性,或降解/更新率。
优选地,氨基酸“替换”是用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸替换一个氨基酸的结果,即保守性氨基酸替换。“保守性”氨基酸替换可以在涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性基础上进行。例如,非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,缬氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,色氨酸和甲硫氨酸;极性中性氨基酸包括甘氨酸,丝氨酸,苏氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰胺,和谷氨酰胺;带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸,赖氨酸和组氨酸;并且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。“插入”或“缺失”优选地在约1到20个氨基酸的范围内,更优选在1-10个氨基酸范围内。容许的变化可以使用重组DNA技术和测定得到的重组变体的活性,通过系统性在多肽分子中进行氨基酸插入,缺失或替换来实验性地进行确定。
用于本文时,术语人源化用于指来自非人抗原结合分子,例如,鼠抗体的抗原结合分子(ABM),其保持或基本保持母体分子的抗原结合特性,但是在人中具有更少的免疫原性。这可以通过各种方法来实现,所述方法包括(a)仅将非人CDRs移植到人构架和恒定区上,保留或不保留关键的构架残基(例如,对于保持良好的抗原结合亲和性或抗体功能是重要的那些),或(b)移植整个非人的可变结构域,但是通过表面残基的替换用人样片段来“遮蔽”它们。这些方法公开于Jones等,Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851-6855(1984);Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988);Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988);Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991);Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994),将它们全部并入本文作为参考。在抗体的重链和轻链可变结构域中的每一个通常存在3个互补决定区,或CDRs,(CDR1,CDR2和CDR3),其侧面是抗体的重链和轻链可变结构域的每个中的四个构架亚区域(即,FR1,FR2,FR3,和FR4):FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。人源化抗体的讨论可以,见于特别是美国专利号6,632,927,和公开的美国申请号2003/0175269中,将它们两者全文并入本文作为参考。
类似地,用于本文时,术语灵长类化用于指来自非灵长类动物抗原结合分子的抗原结合分子,例如,鼠抗体,其保留或基本保留母体分子的抗原结合性质,但是在灵长类动物中具有更少的免疫原性。
在本领域使用和/或接受的术语存在两个或多个定义的情形中,用于本文时的术语的定义倾向于包括所有的这些含义,除非明确地以相反的意思指出。具体的实例是使用术语“互补决定区”(″CDR″)来描述在重链和轻链多肽的可变区中发现的非连续抗原结合位点。这一特定区域已经被Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,″序列s of Proteins ofImmunological Interest″(1983)和Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)中进行了描述,将它们并入本文作为参考,其中当针对彼此比较时,所述定义包括氨基酸残基的重叠或子集。但是,将任一定义用于指抗体或其变体的CDR的应用倾向于在本文所限定和使用的术语的范围内。涵盖如上面引用的参考文献的每个所定义的CDRs的适合的氨基酸残基在下面的表I中提出作为比较。涵盖特定CDR的精确残基数目将根据CDR的序列和大小而变化。假定抗体的可变区氨基酸序列,本领域技术人员可以常规地确定那些残基包含特定的CDR。
表1.CDR定义1
Kabat | Chothia | AbM2 | |
VH CDR1 | 31-35 | 26-32 | 26-35 |
VH CDR2 | 50-65 | 52-58 | 50-58 |
VH CDR3 | 95-102 | 95-102 | 95-102 |
VL CDR1 | 24-34 | 26-32 | 24-34 |
VL CDR2 | 50-56 | 50-52 | 50-56 |
VL CDR3 | 89-97 | 91-96 | 89-97 |
1表1中的所有的CDR定义的编号是按照Kabat等(见下)的编号方式进行的。
2“AbM”指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDRs。
Kabat等还定义了用于可变结构域序列的编号系统,其可应用于任何抗体。本领域普通技术人员可以明确地将这种“Kabat编号”系统用于任何可变结构域序列,而不依赖于超出序列本身之上的任何实验数据。用于本文时,“Kabat编号”指由Kabat等,U.S.Dept.of Health and HumanServices,″序列of Proteins of Immunological Interest″(1983)提出的编号系统。除非另外指出,对于在ABM中特定氨基酸残基位点的编号的参考是按照Kabat编号系统进行的。序列表的序列(即,SEQ ID NO:1到SEQ IDNO:10)不是按照Kabat编号系统进行编号的。不过,如上所述,本领域技术人员完全能够基于其中所给出的序列编号来确定序列列表中任何可变区序列的Kabat编号方案。
至于具有与本发明的参比核苷酸序列存在至少,例如95%“同一性”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸,意指多核苷酸的核苷酸序列与参比序列相同,除了多核苷酸序列可以包括参比核苷酸序列的每100个核苷酸中多到5个的点突变。换言之,为了获得具有与参比核苷酸序列有至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸,在参比序列中多到5%的核苷酸可以缺失或被另一个核苷酸所置换,或在参比序列中多到5%的总核苷酸数目的核苷酸可以插入参比序列中。
作为实践的问题,可以使用已知的计算机程序来常规确定是否任何特定的核酸分子或多肽与本发明的核苷酸序列或多肽序列具有至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%的同一性。确定在查询序列(本发明的序列)和目标序列之间的最佳全面匹配的优选方法,也被称为全域序列比对(总序列比对),可以使用基于Brutlag等,Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序进行确定。在序列比对中,查询序列和目标序列都是DNA序列。RNA序列可以通过将U′s转化为T′s进行比较。所述全域序列比对的结果以百分比同一性表示。用在DNA序列的FASTDB比对中计算百分比同一性的优选参数是:矩阵=单式,k-字长=4,不匹配罚分=1,合并罚分(Joining Penalty)=30,随机组长=0,截断值评分=1,空隙罚分=5,空隙大小罚分0.05,窗口大小=500或目标核苷酸序列的长度,无论哪一个更短。
如果目标序列比查询序列更短是因为5′或3′缺失,而不是因为内部缺失,可以对结果进行手工校正。这是因为当计算百分比同一性时,该FASTDB程序并不说明目标序列的5′和3′截短。对于相对于查询序列,在5′或3′末端被截短的目标序列,通过将不匹配/比对的在目标序列的5′和3′的查询序列的碱基的数量计算为查询序列的总碱基百分比来对百分比同一性进行校正。通过FASTDB序列排列的结果来确定是否核苷酸匹配/比对。接着,将该百分比从使用指定参数通过上述FASTDB程序进行计算的百分比同一性中减去来达到最终的百分比同一性评分。这种校正评分用于本发明的目的。如通过FASTDB比对展示,仅有不与查询序列匹配/比对的,在目标序列的5′和3′碱基外侧的碱基出于手工调整百分比同一性评分的目的进行计算。
例如,将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列进行比对来确定百分比同一性。该缺失发生在目标序列的5′末端,并且因此,FASTDB比对没有显示在5′末端首先的10个碱基的匹配/比对。这10个未配对碱基代表序列的10%(未匹配的在5′和3′末端碱基的数量/与查询序列的碱基总数),因此将10%从通过FASTDB程序计算的百分比同一性评分中减去。如果剩余的90个碱基完全匹配,最终的百分比同一性将是90%。在另一个实例中,将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列进行比较。这次,缺失是内部缺失从而使在目标序列的5′或3′上不存在与查询序列不匹配/比对的碱基。在该情形中,通过FASTDB计算的百分比同一性没有进行手工校正。再一次,只对在不与查询序列匹配/比对的目标序列的5′和3′碱基进行手工校正。出于本发明的目的,没有进行其它的手工校正。
至于具有与本发明的查询氨基酸序列有至少例如95%“同一性”的氨基酸序列的多肽而言,意指目标多肽的氨基酸序列与查询序列相同,除了目标多肽序列可以在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中包括多到5个氨基酸改变。换言之,为了获得具有与查询氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列的多肽,在目标序列中多到5%的氨基酸残基可以被插入,缺失,或被另一个氨基酸置换。参比序列的这些改变可以发生在参比氨基酸序列的氨基或羧基末端位点,或在那些末端位点之间的任何地方,其单独散在参比序列的残基中或在参比序列的一个或多个连续组中。
作为实践的问题,可以使用已知的计算机程序来常规确定是否任何特定的多肽与参比多肽具有至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%的同一性。确定在查询序列(本发明的序列)和目标序列之间的最佳全面匹配的优选方法,也被称为全域序列比对,可以使用基于Brutlag等,Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序进行确定。在序列比对中,查询序列和目标序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述全域序列比对的结果以百分比同一性表示。用在FASTDB氨基酸比对中的优选参数是:矩阵=PAM0,k-字长=2,不匹配罚分=1,合并罚分(Joining Penalty)=20,随机组长=0,截断值评分=1,窗口大小=序列长度,空隙罚分=5,空隙大小罚分0.05,窗口大小=500或目标氨基酸序列的长度,无论哪一个更短。
如果目标序列比查询序列更短是因为N端或C端缺失,而不是因为内部缺失,必须对结果进行手工校正。这是因为当计算全域百分比同一性时,该FASTDB程序并不说明目标序列的N端和C端截短。对于相对于查询序列,在N端和C端被截短的目标序列,通过将与相应的目标残基不匹配/比对的在目标序列的N端和C端的查询序列的残基的数量计算为查询序列的总碱基百分比来对百分比同一性进行校正。通过FASTDB序列比对的结果来确定是否残基是匹配/比对的。接着,将该百分比从使用指定参数通过上述FASTDB程序进行计算的百分比同一性中减去来达到最终的百分比同一性评分。这种最终百分比同一性评分用于本发明的目的。出于手工调整百分比同一性评分的目的,仅考虑不与查询序列匹配/比对的,在目标序列的N端和C端的残基。即,仅是在目标序列的最远N和C端残基外侧的查询残基位点。
例如,将90个氨基酸残基的目标序列与100个残基的查询序列进行比对来确定百分比同一性。该缺失发生在目标序列的N端,并且因此,FASTDB比对没有显示在N端前10个残基的匹配/比对。这10个未配对残基代表序列的10%(未匹配的在N端和C端残基的数量/查询序列的残基总数),因此将10%从通过FASTDB程序计算的百分比同一性评分中减去。如果剩余的90个残基完全匹配,最终的百分比同一性将是90%。在另一个实例中,将90个残基的目标序列与100个残基的查询序列进行比较。这次,缺失是内部缺失从而使在目标序列的N端或C端上不存在与查询序列不匹配/比对的残基。在该情形中,通过FASTDB计算的百分比同一性没有进行手工校正。再一次,如通过FASTDB比对所显示的,只对在不与查询序列匹配/比对的目标序列的N端和C端末端残基外侧的残基位点进行手工校正。出于本发明的目的,没有进行其它的手工校正。
用于本文时,“在严格条件下杂交”于本发明的核酸序列的核酸指在这样的条件下进行杂交的多核苷酸,所述条件为在包括以下各项的溶液中于42℃进行过夜温育,50%的甲酰胺,5x SSC(750mM NaCl,75mM柠檬酸钠),50mM磷酸钠(pH7.6),5x Denhardt′s溶液,10%硫酸葡聚糖,和20μg/ml的变性、已剪切的鲑精DNA,随后于约65℃在0.1x SSC中洗涤滤器。
用于本文时,术语高尔基体定位结构域指负责将多肽锚定在高尔基复合体的位置中的高尔基体定居多肽的氨基酸序列。通常,定位结构域包括酶的氨基末端“尾”。
用于本文时,术语效应子功能指可归因于抗体的Fc区域(天然序列Fc区域或氨基酸序列变体Fc区域)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括,但不限于,Fc受体结合亲和性,抗体依赖性细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原吸收,细胞表面受体的下调等。
用于本文时,认为术语改造,被改造,进行改造和糖基改造包括天然存在或重组多肽,如抗原结合分子(ABM)或其片段的糖基化模式的任何操作。糖基改造包括细胞的糖基化作用的代谢改造,所述代谢改造包括对寡糖合成途径进行遗传操作从而获得改变的在细胞中表达的糖蛋白的糖基化。此外,糖基改造包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中,糖基改造是糖基转移酶活性的改变。在特定的实施方案中,改造导致葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性的变化。
用于本文时,术语宿主细胞包括任何种类的细胞系统,其可以进行改造从而产生本发明的多肽和抗原结合分子。在一个实施方案中,对宿主细胞进行改造从而容许产生具有修饰的糖形式的抗原结合分子。在一个优选的实施方案中,抗原结合分子是抗体,抗体片段,或融合蛋白。在某些实施方案中,对宿主细胞进一步操作从而使其表达增加水平的一种或多种具有GnTIII活性的多肽。在其它实施方案中,对宿主细胞进行改造从而具有消除的,减弱的或抑制的核心α1,6-岩藻糖基转移酶活性。术语“核心α1,6-岩藻糖基转移酶活性”包括核心α1,6-岩藻糖基转移酶基因的表达以及核心α1,6-岩藻糖基转移酶与其底物的相互作用。宿主细胞包括培养的细胞,例如,哺乳动物培养细胞,诸如CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞,和植物细胞,仅举几个例子,但是还包括被包含在转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
用于本文时,术语Fc-介导的细胞毒性包括抗体依赖性细胞的细胞毒性和由包含人Fc-区域的可溶Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。这是一种导致“人免疫效应细胞”裂解“抗体靶向细胞”的免疫机制,其中:
人免疫效应细胞是在它们的表面上显示Fc受体的白细胞群,通过所述Fc受体它们结合于抗体或Fc-融合蛋白的Fc-区域并且执行效应子功能。这样的群可以包括,但不限于,外周血单核细胞(PBMC)和/或天然杀伤(NK)细胞。
抗体靶向细胞是由本发明的ABMs(例如,抗体或Fc融合蛋白)结合的细胞。一般,抗体或Fc融合蛋白通过Fc区的蛋白部分N末端结合靶细胞。
用于本文时,将术语增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性定义为通过上述定义的Fc-介导的细胞的细胞毒性的机制,在围绕靶细胞的培养基中,以给定浓度的抗体,或给定浓度的Fc-融合蛋白,在给定时间内裂解的“抗体-靶向细胞”的数量的增加,和/或将其定义为通过Fc介导的细胞的细胞毒性的机制,在给定的时间内,获得给定数量的“抗体靶向细胞”的裂解所需要的在围绕靶细胞的培养基中抗体浓度,或Fc-融合蛋白的浓度的减少。Fc-介导的细胞的细胞毒性的增加涉及由相同的抗体,或Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒性,所述抗体或Fc-融合蛋白使用本领域那些技术人员已知的相同的标准产生,纯化,配制和贮存方法由相同类型的宿主细胞产生,若非不是由通过本文所述的方法进行了改造从而表达糖基转移酶GnTIII的宿主细胞产生。
所谓具有增加的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的抗体,意指如本文所定义的术语的抗体,所述抗体如通过本领域那些普通技术人员已知的任何适合方法所确定的具有增加的ADCC。一种被接受的体外ADCC测定如下:
1)该测定使用已知表达靶抗原的靶细胞,所述靶抗原由抗体的抗原结合区域所识别;
2)该测定使用分离自随机选择的健康供体的血液的人外周血单核细胞(PBMCs),来作为效应细胞;
3)该测定按照下列方法进行:
i)使用标准的密度离心方法来分离PBMCs并将其以5x106细胞/ml悬浮在RPMI细胞培养基中;
ii)通过标准的组织培养方法培养靶细胞,在生存力大于90%的指数生长阶段来收集细胞,在RPMI细胞培养基中将其进行洗涤,用100微居的51Cr将其进行标记,并用细胞培养基将其洗涤两次,并以105细胞/ml的密度将其重悬于细胞培养基中;
iii)将100微升的上述最终靶细胞混悬液转移到96孔微量滴定板的每孔中;
iv)将抗体从4000ng/ml到0.04ng/ml在细胞培养基中进行系列稀释,将将50微升的得到的抗体溶液加入96孔微量滴定板中的靶细胞,以三次重复测试各个抗体浓度,所述抗体浓度覆盖整个的上述范围的抗体浓度;
v)对于最大释放(MR)对照,在包含标记的靶细胞的板中的3个另外的孔接受50微升的2%(V/V)的非离子去污剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的水溶液,替换抗体溶液(上述的第iv点);
vi)对于自发释放(SR)对照而言,在包含标记的靶细胞的板中的3个另外的孔接受50微升的RPMI细胞培养基,替换抗体溶液(上述的第iv点);
vii)接着将96孔微量滴定板以50xg离心1分钟并在4℃温育1小时;
viii)将50微升的PBMC混悬液(上述第i点)加入每个孔中从而产生25∶1的效应物:靶细胞比率,并将板置于温箱中于37℃在5%CO2气氛下达4小时。
ix)从每个孔中收集无细胞的上清液,并使用γ射线计数器来量化实验释放的放射性(ER);
x)按照式(ER-MR)/(MR-SR)x100来计算每个抗体浓度的特定裂解的百分比,其中ER是对于该抗体浓度量化的平均放射性(见上述第ix点),MR是对于MR对照而言(见上面的第v点)量化的平均放射性(见上面的第ix点),并且SR是对于SR对照而言(见上面的第vi点)量化的平均放射性(见上面的第ix点);
4)将“增加的ADCC”定义为在上述测试的抗体浓度范围内观察的特定裂解的最大百分比的增加,和/或在上面测试的抗体浓度范围内观察到的获得特定裂解的最大百分比的一半所需要的抗体的浓度的减少。在ADCC中的增加涉及这样的ADCC,其是在上述测定中测量的,由相同抗体介导的ADCC,所述抗体使用本领域那些技术人员已知的相同的标准产生,纯化,配制和贮存方法由相同类型的宿主细胞产生,若非不是由被改造从而过表达GnTIII的宿主细胞所产生。
在一方面,本发明涉及具有与鼠225.28S抗体相同的结合特异性(即,以基本上相同的亲和性结合基本上相同的表位)的抗原结合分子,并涉及它们的效应子功能可以通过改变糖基化来增加的发现。在一个实施方案中,抗原结合分子是嵌合抗体。在一个优选的实施方案中,本发明涉及嵌合抗体,或其片段,其包含表3或表4(SEQ ID NOs:62-108.)的CDRs中的至少一种,或者至少两种,或者至少三种,或者至少四种,或者至少五种,或者至少六种。具体而言,在优选的实施方案中,本发明涉及分离的多核苷酸,其包括:(a)选自由:SEQ ID NO:61SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:69SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:73,和SEQ IDNO:75组成的组的序列;(b)选自由:SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:79,SEQID NO:81,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:91,和SEQ ID NO:93组成的组的序列;和(c)SEQ IDNO:95。在另一个优选的实施方案中,本发明涉及分离的多核苷酸,其包括:(a)选自由:SEQ ID NO:97;SEQ ID NO:99;和SEQ ID NO:101组成的组的序列;(b)选自由:SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105组成的组的序列;和(c)SEQ ID NO:107。在一个实施方案中,任何这些多核苷酸都编码融合多肽。
在另一个实施方案中,抗原结合分子包括表6中的序列(SEQ IDNOS:1-23奇数)编码的225.28S抗体的VH结构域,或其变体;和非鼠多肽。在另一个优选的实施方案中,本发明涉及抗原结合分子,其包括由SEQ IDNOS:27-51(奇数)编码的大鼠抗体的VL结构域,或其变体;和非鼠多肽。
在另一个方面,本发明涉及抗原结合分子,其包括一个或多个截短的225.28S的CDRs。这些截短的CDRs将至少包含,给定的CDR的特异性决定氨基酸残基。所谓“特异性决定残基”意为直接涉及与抗原的相互作用的那些残基。通常,在给定的CDR中只有约1/5到1/3的残基参与与抗原的结合。在特定的CDR中的特异性决定残基可以通过,例如计算来自三维模型的原子间的接触和按照全部内容并入本文作为参考的Padlan等,FASEB J.9(1):133-139(1995)所述方法在给定的残基位点确定序列可变性来鉴别。
因此,本发明还涉及分离的多核苷酸,其包括鼠225.28S抗体的至少一个互补决定区,或包含至少所述互补决定区的特异性决定残基的其变体或截短形式,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。优选地,这些分离的多核苷酸编码作为抗原结合分子的融合多肽。在一个实施方案中,多核苷酸包括鼠225.28S抗体的两个或三个或四个或五个或六个互补决定区,或包含至少所述两个或三个或四个或五个或六个互补决定区的每个的特异性决定残基的其变体或其截短形式。在一个实施方案中,所述多核苷酸包含下面表2和5中给出的CDRs中的至少一个。在另一个实施方案中,多核苷酸编码嵌合(例如,人源化)抗体的轻链或重链的整个可变区。本发明还涉及由这些多核苷酸编码的多肽。
在另一个实施方案中,本发明涉及抗原结合分子,其包括鼠225.28S抗体的至少一个,或者至少两个,或者至少三个,或者至少四个,或者至少五个,或者至少六个互补决定区,或包含至少每个所述互补决定区的特异性决定残基的其变体或截短形式,并包含来自异源多肽的序列。在一个实施方案中,抗原结合分子包括鼠225.28S抗体的三个互补决定区,或包含至少每个所述三个互补决定区的特异性决定残基的其变体或截短形式。在一个实施方案中,抗原结合分子包括下面表3和表4中给出的CDRs中的至少一种,或者至少两种,或者至少三种,或者至少四种,或者至少五种,或者至少六种。在另一个方面,抗原结合分子包括抗体的轻链或重链的可变区。在一个特别有用的实施方案中,抗原结合分子是嵌合的,例如人源化的抗体。本发明还涉及制备这些抗原结合分子的方法,及其在治疗疾病中,特别是细胞增殖疾病中的应用,其中与相同组织类型的正常细胞相比,MCSP得以表达,特别是得以异常表达(例如过表达)。这些病症包括但不限于:黑素瘤,神经胶质瘤,小叶性乳腺癌,一些急性白血病,以及所有诱导新血管系统的肿瘤。MCSP表达水平可以通过本领域已知的方法以及本文所述的方法(例如通过免疫组化测定,免疫荧光测定,免疫酶测定,ELISA,流式细胞分析,放射免疫测定,蛋白质印迹分析,配体结合,激酶活性,等等)来测定。
本发明还涉及体内或体外靶向表达MCSP的细胞的方法。可以靶向表达MCSP的细胞用于治疗性目的(例如,治疗一种病症,其可以通过破坏MCSP与配体的结合,或通过免疫系统靶向表达MCSP的细胞而进行破坏来治疗)。在一个实施方案中,本发明涉及靶向受试者体内表达MCSP的细胞的方法,其包括向受试者施用包含本发明的ABM的组合物。可以靶向表达MCSP的细胞用于诊断目的(例如,确定它们是否正常或异常地表达MCSP)。因而,本发明还涉及体内或体外检测MCSP或表达MCSP的细胞的存在的方法。根据本发明的检测MCSP表达的方法之一包括将待测样品,任选地伴以对照样品,在容许形成ABM和MCSP之间的复合物的条件下,与本发明的ABM接触。随后检测复合物形成(例如,通过ELISA或其它本领域已知的方法)。当将对照样品与测试样品一起使用时,当将测试和对照样品相比较时,在ABM-MCSP复合物的形成上任何统计学上显著的差异都是测试样品中MCSP存在的指示。
表2
CDR | 核苷酸序列 | SEQIDNO | |
重链CDR1MCSP | Kabat | AATTACTGGATGAAC | 61 |
AGCTATTGGATGAGC | 63 | ||
Chothia | GGATTCACTTTCAGTAAT | 65 | |
GGATACACATTCACCAAC | 67 | ||
GGATTCACATTTAGCAGC | 69 | ||
AbM | GGATTCACTTTCAGTAATTACTGGATGAAC | 71 | |
GGATACACATTCACCAACTATTGGATGAAC | 73 | ||
GGATTCACATTTAGCAGCTATTGGATGAGC | 75 | ||
重链CDR2MCSP | Kabat | GAAATTAGATTGAAATCCAATAATTTTGGAAGATATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGG | 77 |
GAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCTGCAAGCGTGAAGGGC | 79 | ||
AACATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCTGAGAGCGTGAAGGGC | 81 | ||
GAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCACAGAAGTTTCAGGGC | 83 | ||
GAAATCCGGTTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATACTACGCACAGAAGTTCCAGGAG | 85 | ||
GAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAG ATATTACGCTGCAAGCGTGAAGGGC | 87 | ||
Chothia | AGATTGAAATCCAATAATTTTGGAAGATAT | 89 | |
AbM | GAAATTAGATTGAAATCCAATAATTTTGGAAGATAT | 91 | |
AACATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATAT | 93 | ||
重链CDR3MCSP | KabatChothiaAbM | TATGGTAACTACGTTGGGCACTATTTTGACCAC | 95 |
表3
CDR | 氨基酸序列 | SEQ ID NO | |
重链CDR1MCSP | Kabat | NYWMN | 62 |
SYWMS | 64 | ||
Chothia | GFTFSN | 66 | |
GYTFTN | 68 | ||
GFTFSS | 70 | ||
AbM | GFTFSNYWMN | 72 | |
GYTFTNYWMN | 74 | ||
GFTFSSYWMS | 76 | ||
重链CDR2MCSP | Kabat | EIRLKSNNFGRYYAESVKG | 78 |
EIRLKSNNFGRYYAASVKG | 80 | ||
NIRLKSNNFGRYYAESVKG | 82 | ||
EIRLKSNNFGRYYAQKFQG | 84 | ||
EIRLKSNNFGRYYAQKFQE | 86 | ||
EIRLKSNNFGRYYAASVKG | 88 | ||
Chothia | RLKSNNFGRY | 90 | |
AbM | EIRLKSNNFGRY | 92 | |
NIRLKSNNFGRY | 94 | ||
重链CDR3MCSP | KabatChothiaAbM | YGNYVGHYFD H | 96 |
表4
CDR | 氨基酸序列 | SEQIDNO |
Kabat轻链CDR1(MCSP) | KASQNVDTNVA | 98 |
RASQNVDTNLA | 100 | |
RA SQNVDTNVA | 102 | |
Kabat轻链CDR2(MCSP) | SASYRYT | 104 |
SASYLQS | 106 | |
Kabat轻链CDR3(MCSP) | QQYNSYPLT | 108 |
CDR | 核苷酸序列 | SEQ IDNO |
Kabat轻链CDR1MCSP | AAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAATGTAGCG | 97 |
AGGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACTTAGCT | 99 | |
AGGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTGGCT | 101 | |
Kabat轻链CDR2MCSP | TCGGCATCCTACCGTTACACT | 103 |
TCGGCATCCTACCTGCAGAGC | 105 | |
Kabat轻链CDR3MCSP | CAGCAATATAACAGCTATCCTCTGACG | 107 |
已知几种机制涉及抗-MCSP抗体的治疗功效,所述机制包括结合MCSP,MCSP配体的阻断,抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC),黑素瘤细胞粘附和转移的抑制,对纤连蛋白趋化反应的抑制,和周细胞的抑制/杀伤,抑制在ECM蛋白如胶原质和纤连蛋白上的细胞扩散,细胞骨架重组的抑制,和MCSP介导的信号转导网络(例如,FAK和ERK网络)的抑制。因此,本发明的ABM可以用于任何这些目的。
鼠单克隆抗体225.28S已经用于恶性黑素瘤的放射免疫检测。Buraggi等,Nuklearmedizin25(6):220-224(1986)。最近,已经将它克隆在单链Fv构型中用于在细菌中的可溶性表达。Neri等,J.Invest.Dermatol.107(2):164-170(1996),将其全部内容并入本文作为参考。
已经描述了嵌合的小鼠/人抗体。见,例如,Morrison,S.L等,PNASI1:6851-6854(1984年11月);欧洲专利公开号173494;Boulianna,G.L,atal.,Nature312:642(1984年12月);Neubeiger,M.S.等,Nature314:268(1985年3月);欧洲专利公开号125023;Tan等,J.Immunol.135:8564(1985年11月);Sun,L.K等,Hybridoma5(1):517(1986);Sahagan等,J.Immunol.137:1066-1074(1986)。通常见,Muron,Nature312:597(1984年12月);Dickson,Genetic Engineering News5(3)(1985年3月);Marx,Science229:455(1985年8月);和Morrison,Science229:1202-1207(1985年9月)。
在特别优选的实施方案中,本发明的嵌合ABM是人源化的抗体。使非人的抗体人源化的方法是本领域已知的。例如,本发明的人源化ABMs可以按照Winter的美国专利号5,225,539,Queen等的美国专利号6,180,370,Adair等的美国专利号6,632,927,Foote的美国专利申请公开号2003/0039649;Sato等的美国专利申请公开号2004/0044187;或Leung等的美国专利申请公开号2005/0033028的方法来进行制备,将其每个的全部内容特此并入作为参考。优选地,人源化的抗体具有一个或多个从非人的来源被引入其的氨基酸残基。这些非人的氨基酸残基通常被称作“输入”残基,其典型地取自“输入”可变结构域。人源化基本上可以按照Winter和合作者的方法(Jones等.,Nature,321:522-525(1986);Riechmann等.,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen等.,Science,239:1534-1536(1988)),通过用高变区序列置换人抗体的相应序列来进行。因此,这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567),其中基本上(substantially)小于完整的人可变结构域被非人的物种的相应序列所替换。实际上,人源化的抗体典型地是人抗体,其中一些高变区残基和可能地一些FR残基被来自啮齿类动物抗体的类似位点的残基所替换。目标人源化抗-MCSP抗体通常将包括人免疫球蛋白,诸如IgGl的恒定区。
选择待用于制备人源化抗体的人可变结构域,轻链和重链两者的可变结构域对于减少抗原性是非常重要的。按照所谓的“最佳-拟合”方法,针对已知人可变结构域序列的整个文库来筛选啮齿类动物抗体的可变结构域的序列。接着,最接近于啮齿类动物的序列的人序列被接受作为人源化抗体的人构架区(FR)(Sims et al.,J.Immunol.,151:2296(1993);Chothia etal.,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。选择人构架序列的另一方法是针对相应于该构架亚区(例如,通过Kabat编号所确定)的已知人可变区序列的文库,比较完整啮齿类动物构架的每个单独的亚区(即,FR1,FR2,FR3,和FR4)或单独亚区的组合(例如,FR1和FR2)的序列,并选择对于每个亚区或组合最接近啮齿类动物的序列的人序列(Leung美国专利申请公开号2003/0040606A1,2003年2月27日公开)(将其全部内容特此并入作为参考)。另一种方法使用来自特定亚组的轻链或重链的所有的人抗体的共有序列的特定构架区。相同的构架可以用于一些不同的人源化抗体(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993))(将其每个的全部内容特此并入作为参考)。
也是重要的是抗体被人源化,同时保持对于抗原的高亲和性和其它有利的生物学性质。为了达到这个目标,按照优选的方法,通过使用母体序列和人源化序列的三维模型分析母体序列和各种概念上的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型可以使用本领域技术人员熟悉的计算机程序(例如InsightII,accelrys inc(former MSI),或在http://swissmodel.expasy.org/由Schwede等,Nucleic acid Res.2003(13):3381-3385所述)来生成。检验这些模型容许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用,即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式,FR残基可以从受体和输入序列中进行选择和组合从而获得所需的抗体特性,诸如对于靶抗原的维持不变的亲和性。通常,高变区残基直接和最主要地涉及影响抗原结合。在一个特定的实施方案中,本发明的ABM包括在位点46(Kabat)具有脯氨酸的抗体轻链可变区。在另一个实施方案中,本发明的ABM包括在位点27具有一个或多个苯丙氨酸残基,在位点30具有丝氨酸残基,或在位点94具有丝氨酸或苏氨酸残基的抗体重链可变区。这些残基在特定的轻或重链可变区中可以是天然存在的或可以通过氨基酸置换被引入。
在一个实施方案中,本发明的抗体包含人Fc区。在具体的实施方案中,人恒定区是IgGl,如在SEQ ID NOs109和110中提出,并显示如下:
人IgGl恒定区核苷酸序列(SEQ ID NO:110)
ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG
GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT
GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG
GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGC
CCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCC
CAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC
TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC
TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGA
GGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC
AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGG
GAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC
ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAG
CCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG
AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAA
CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC
GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCT
CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA
CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAG
GCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAT
GA
人IgGl恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO:109)
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL
PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE
SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTQKSLSLSPGK
然而,本发明还涵盖人Fc区的变体和同种型。例如,可以按照在Presta的美国专利号6,737,056中所教导的方法(由于一个或多个氨基酸修饰具有改变的效应子功能的Fc区变体);或在美国专利申请号60/439,498;60/456,041;60/514,549;或WO2004/063351中所教导的方法(由于氨基酸修饰具有增加的结合活性的变体Fc区);或在美国专利号10/672,280或WO2004/099249中所教导的方法(由于氨基酸修饰对FcgammaR具有改变的结合的Fc变体)来产生适合用在本发明的变体。将其每个的内容全部结合在此作为参考。
在另一个实施方案中,本发明的抗原结合分子按照一定方法被改造以具有增加的结合亲和性,所述方法例如在Balint等的美国专利公开号2004/0132066中公开的方法,将其全部内容特此并入作为参考。
在一个实施方案中,本发明的抗原结合分子与另外的部分诸如放射性标记或毒素缀合。这些缀合的ABMs可以通过本领域众所周知的许多方法来生产。
可以将多种放射性核素用于本发明,并且本领域那些技术人员有能力容易地确定哪种核素在多种情况下是最合适的。例如,131碘是用于靶向免疫疗法的众所周知的放射性核素。然而,131碘的临床有效性可以被下列一些因素所限制,其包括:8天生理半衰期;在血液和在肿瘤位点的碘化抗体的脱卤;和会对于在肿瘤中的局部化剂量沉积不是最佳的发射特性(例如,大量γ组成)。随着更好的螯合剂的出现,将金属螯合基团连接于蛋白质的机会已经增加了使用其它的放射性核素诸如111铟和90钇的机会。90钇提供了用于放射性免疫治疗应用中的一些优点:90钇的64小时半衰期足够持久以容许肿瘤聚集抗体,并且不像,例如131碘,90钇是高能量的纯β放射体,并且在其衰变中没有伴随γ辐射,在100-1000个细胞直径的组织范围内。此外,贯穿辐射的最少量容许给门诊病人施用90钇标记的抗体。此外,对于细胞杀伤不需要被标记的抗体的内化,并且电离辐射的局部发射应该对于缺乏靶抗原的邻近肿瘤细胞是致死因子。
关于放射性标记的抗-MCSP抗体,以其进行的疗法也可以使用单次疗法治疗或使用多次治疗来进行。因为放射性核素成分,优选的是在治疗前,“收集”外周干细胞(″PSC″)或骨髓(″BM″)用于经历了由照射引起的潜在致命骨髓毒性的患者。使用标准技术来收集BM和/或PSC,并且接着进行清洗和冷冻用于可能的再输注。此外,最优选的是在治疗前,使用诊断标记的抗体(例如,使用111铟)对患者进行诊断剂量学研究,其目的是确保治疗性标记的抗体(例如,使用90钇)将不会导致在任何正常器官或组织中的不必要的“浓缩”。
在优选的实施方案中,本发明涉及分离的多核苷酸,其包括编码具有在下面的表7中显示的氨基酸序列(SEQ ID NOS:2-52偶数)的多肽。本发明还涉及分离的核酸,其包括与在下面的表6中显示的核苷酸序列(SEQ IDNOS:2-52奇数)具有至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的序列。在另一个实施方案中,本发明涉及分离的核酸,所述核酸包括编码多肽的序列,所述多肽具有与表7中的氨基酸序列(SEQ IDNOS:2-52偶数)有至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%的同一性的氨基酸序列。本发明还涵盖分离的核酸,其包括编码多肽的序列,所述多肽具有表7中的构建体(SEQ ID NOS:2-52偶数)的任一个的氨基酸序列,所述氨基酸序列具有保守性氨基酸置换。
表6
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
VH225.28S | CAGGTGAAGCTGCAGCAGTCAGGAGGGGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGTCTCTGGATTCACTTTCAGTAATTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGATTGCAGAAATTAGATTGAAATCCAATAATTTTGGAAGATATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGCCTACCTGCAAATGATCAACCTAAGAGCTGAAGATACTGGCATTTATTACTGTACCAGTTATGGTAACTACGTTGGGCACTATTTTGACCACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGT | 1 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
M-HHA | GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGGAGAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCTGCAAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCCGTGTATTACTGTACCACATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT | 3 |
M-HHB | GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGGAGAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCTGAGAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCCGTGTATTACTGTACCTCCTACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT | 5 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
M-HHC | GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGCCAACATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCTGAGAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCCGTGTATTACTGTACCTCCTACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT | 7 |
M-HLA | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGC GCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGATACACATTCACCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGCGAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCACAGAAGTTTCAGGGCAGAGTCACAATGACACGGGACACGTCCACTTCCACCGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCCGAGGATACGGCCGTCTACTACTGCGCAAGATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT | 9 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
M-HLB | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGATACACATTCACCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGCGAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCACAGAAGTTTCAGGGCAGAGTCACAATCACACGGGACACGAGCATGTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCCGAGGATACGGCCGTCTACTACTGCGCAGCCTACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT | 11 |
M-HLC | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGATACACATTCACCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGCGAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATACTACGCAGAGTCCGTGAAGGGCAGAGTCACAATCACACGGGACACGAGCATGTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCCGAGGATACGGCCGTCTACTACTGCGCAGCCTACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT | 13 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
M-HLD | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCCGGATTCACATTCAGCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGCGAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATACTACGCAGAGTCCGTGAAGGGCAGAGTCACAATCACACGGGACACGAGCATGTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCCGAGGATACGGCCGTCTACTACTGCGCAGCCTACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT | 15 |
M-HLE1 | GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCACCAGGAAAGGGACTCGAGTGGGTGGGCGAAATCCGGTTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATACTACGCACAGAAGTTCCAGGAGAGAGTCACAATCACACGGGACATGAGCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCCGAGGATACGGCCGTCTACTACTGCGCAGCCTACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT | 17 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
M-HLE2 | GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCACCAGGAAAGGGACTCGAGTGGGTGGGCGAAATCCGGTTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATACTACGCAGAGTCCGTGAAGGGAAGAGTCACAATCACACGGGACATGAGCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCCGAGGATACGGCCGTCTACTACTGCGCAGCCTACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT | 19 |
M-HLF | GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAGCTATTGGATGAGCTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCTGCAAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCCGTGTATTACTGTACCACATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT | 21 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
M-HLG | GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACATTTAGCAACTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGCCGAGATCAGATTGAAATCCAATAACTTCGGAAGATATTACGCTGCAAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGATGATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGACCGAGGATACGGCCGTGTATTACTGTACCACATACGGCAACTACGTTGGGCACTACTTCGACCACTGGGGCCAAGGGACCACCGTCACCGTCTCCAGT | 23 |
VH信号序列 | ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCACAGGAGCCCACTCC | 25 |
VL225.28S | GATATCGAGCTCACCCAATCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAATGTAGCGTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTGAACCACTGCTTTTCTCGGCATCCTACCGTTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCTCTGACGTTCGGTGGCGGCACCAAGCTGGAAATCAAA | 27 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
M-KV1 | GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATTCGGCATCCTACCGTTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG | 29 |
M-KV2 | GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTGAGCTCCTGATCTATTCGGCATCCTACCGTTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG | 31 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
M-KV3 | GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATAC TAACGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTGAGCCTCTTCTGTTCTCGGCATCCTACCGTTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG | 33 |
M-KV4 | GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTGAGCCTCTTCTGTTCTCGGCATCCTACCGTTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG | 35 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
M-KV5 | GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTGGCTTGGTACCTGCAGAAGCCCGGGCAGTCTCCTCAGCTCCTGATCTATTCGGCATCCTACCGTTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG | 37 |
M-KV6 | GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTGGCTTGGTTCCAGCAGAGGCCCGGGCAGTCTCCTCGACGACTGATCTATTCGGCATCCTACCGTTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG | 39 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
M-KV7 | GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTAAGCCTCTGATCTATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG | 41 |
M-KV8 | GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTAAGCTTCTGATCTTCTCGGCATCCTACCGTTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG | 43 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
M-KV9 | GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCACCTAGGCCTCTGATCTATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTG | 45 |
M-KV10 | GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCACCTAGGCCTCTGATCTATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACG | 47 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
M-KV11 | GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCACCTAGGCCTCTGATCTATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACG | 49 |
M-KV12 | GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCACCTAGGCCTCTGATCTATTCGGCATCCTACCTGCAGAGCGGCGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTC GCAACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTGACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACG | 51 |
VL信号序列 | ATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGCCTCCTGCTGCTCTGGTTCCCAGGTGCCAGGTGT | 53 |
构建体 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO |
恒定-轻 | GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG | 55 |
构建体 | 氨基酸序列 | SEQ IDNO |
225.28S VH | QVKLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVVSGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWIAEIRLKSNNFGRYYAESVKGRFTISRDDSKSSAYLQMINLRAEDTGIYYCTSYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS | 2 |
M-HHA | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRLKSNNFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS | 4 |
构建体 | 氨基酸序列 | SEQ IDNO |
M-HHB | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRLKSNNFGRYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS | 6 |
M-HHC | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVANIRLKSNNFGRYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS | 8 |
M-HLA | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEWMGEIRLKSNNFGRYYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELS SLRSEDTAVYYCARYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS | 10 |
M-HLB | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEWMGEIRLKSNNFGRYYAQKFQGRVTITRDTSMSTAYMELS SLRSEDTAVYYCAAYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS | 12 |
M-HLC | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPGQGLEWMGEIRLKSNNFGRYYAESVKGRVTITRDTSMSTAYMELS SLRSEDTAVYYCAAYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS | 14 |
构建体 | 氨基酸序列 | SEQ IDNO |
M-HLD | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSNYWMNWVRQAPGQGLEWMGEIRLKSNNFGRYYAESVKGRVTITRDTSMSTAYMELS SLRSEDTAVYYCAAYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS | 16 |
M-HLE1 | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRLKSNNFGRYYAQKFQERVTITRDMSTSTAYMELS SLRSEDTAVYYCAAYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS | 18 |
M-HLE2 | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVGEIRLKSNNFGRYYAESVKGRVTITRDMSTSTAYMELS SLRSEDTAVYYCAAYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS | 20 |
M-HLF | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYWMSWVRQAPGKGLEWVAEIRLKSNNFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS | 22 |
M-HLG | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVAEIRLKSNNFGRYYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS | 24 |
VH信号序列 | MDWTWRILFLVAAATGAHS | 26 |
构建体 | 氨基酸序列 | SEQ IDNO |
225.28S VL | DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVDTNVAWYQQKPGQSPEPLLFSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFGGGTKLEIK | 28 |
M-KV1 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQNVDTNLAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRT | 30 |
M-KV2 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPELLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTIS SLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRT | 32 |
M-KV3 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTVTCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPEPLLFSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRT | 34 |
M-KV4 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPEPLLFSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRT | 36 |
M-KV5 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRT | 38 |
M-KV6 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWFQQRPGQSPRRLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRT | 40 |
构建体 | 氨基酸序列 | SEQ IDNO |
M-KV7 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKPLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRT | 42 |
M-KV8 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKLLIFSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRT | 44 |
M-KV9 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPRPLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRT | 46 |
M-KV10 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQNVDTNLAWYQQKPGQAPRPLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRT | 48 |
M-KV11 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQNVDTNVAWYQQKPGQAPRPLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRT | 50 |
M-KV12 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPRPLIYSASYLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIKRT | 52 |
VL信号序列 | MRVPAQLLGLLLLWFPGARC | 54 |
在另一个实施方案中,本发明涉及表达载体和/或宿主细胞,其包括一种或多种本发明的分离的多核苷酸。
一般而言,任何类型的培养的细胞系可以用于表达本发明的ABM。在一个优选的实施方案中,将HEK293-EBNA细胞,CHO细胞,BHK细胞,NSO细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,其它哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,或植物细胞用作背景细胞系以产生本发明的被改造的宿主细胞。
本发明的ABMs的治疗功效可以通过将它们在这样的宿主细胞中产生来得以增加,所述宿主细胞还表达下列的一个或多个:编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸,编码具有ManII活性的多肽的多核苷酸,或编码具有GalT活性的多肽的多核苷酸。在优选的实施方案中,宿主细胞表达编码具有GnTIII活性或ManII活性的多肽的多核苷酸。在另一个优选实施方案中,宿主细胞表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸以及编码具有ManII活性的多肽的多核苷酸。在又一个优选的实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包括高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。在另一个优选的实施方案中,在宿主细胞中表达本发明的ABMs导致了具有增加的Fc受体结合亲和性和增加的效应子功能的ABMs,所述宿主细胞表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸。因此,在一个实施方案中,本发明涉及这样的宿主细胞,所述宿主细胞包括(a)包括编码具有GnTIII活性的多肽的序列的分离的核酸;和(b)编码本发明的ABM的分离的多核苷酸,所述ABM诸如结合人MCSP的嵌合的,灵长类化或人源化的抗体。在优选的实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包括GnTIII的催化结构域的融合多肽,并且该高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶II的定位结构域。产生这样的融合多肽的方法和使用它们产生具有增加的效应子功能的抗体的方法公开于美国临时专利申请号60/495,142和美国专利申请公开号2004/0241817A1,将其每个的全部内容特别并入本文作为参考。在另一个优选的实施方案中,嵌合的ABM是嵌合的抗体或其片段,其具有鼠225.28S单克隆抗体的结合特异性。在特别优选的实施方案中,嵌合抗体包括人Fc。在另一个优选的实施方案中,该抗体被灵长类化或人源化。
在备选的实施方案中,本发明的ABMs可以通过在宿主细胞中产生它们得以增强,所述宿主细胞已经被改造以具有至少一种岩藻糖基转移酶的减少的、抑制的或消除的活性。
在一个实施方案中,一个或多个编码本发明的ABM的多核苷酸可以在组成型启动子或备选地调节表达系统的控制下进行表达。适合的调节表达系统包括,但不限于,四环素调节的表达系统,可蜕皮素诱导的表达系统,lac-转换表达系统,可糖皮质激素诱导的表达系统,可温度诱导的启动子系统,和金属硫蛋白金属可诱导表达系统。如果编码本发明的ABM的一些不同核酸被包括在宿主细胞系统中,它们中的一些可以在组成型启动子的控制下进行表达,而其它的可以在调节启动子的控制下进行表达。认为最大表达水平是稳定的多肽表达的最高可能水平,其对细胞生长速率不具有显著的不利影响,并且将使用常规实验进行测定。表达水平通过本领域通常了解的方法进行确定,所述方法包括使用特异于ABM的抗体或特异于融合ABM的肽标签的抗体进行的蛋白质印迹分析;和RNA印迹分析。在另外的备选方案中,多核苷酸可以操作性地连接于报道基因;具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性的嵌合ABM的表达水平通过测量与报道基因的表达水平相关的信号来进行确定。报道基因可以与编码所述融合多肽的核酸一起被转录为单个mRNA分子;它们各自的编码序列可以通过内部核糖体进入位点(IRES)或通过不依赖帽的翻译增强子(CITE)进行连接。该报道基因可以与至少一个编码嵌合ABM的核酸一起翻译从而形成单一的多肽链,所述ABM具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性。编码本发明的AMBs的核酸可以在单一启动子控制下操作性地连接于报道基因从而使编码融合多肽的核酸和报道基因转录为RNA分子,所述RNA分子选择性地被剪接成两个单独的信使RNA(mRNA)分子;得到的mRNAs之一翻译成所述报道蛋白质,而另一个被翻译成所述融合多肽。
本领域那些技术人员众所周知的方法可以用于构建表达载体,所述表达载体包含具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性的ABM的编码序列以及适合的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术,合成技术和体内重组/遗传重组。见,例如,描述在Maniatis etal.,MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborLaboratory,N.Y.(1989)和Ausubel etal.,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR B IOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中的技术。
多种宿主表达载体系统可以用于表达本发明的ABMs的编码序列。优选地,将哺乳动物细胞用作用重组质粒DNA或黏粒DNA表达载体转染的宿主细胞系统,所述重组质粒DNA或黏粒DNA表达载体包含目标蛋白质的编码序列和融合多肽的编码序列。最优选地,将CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,其它哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,或植物细胞用作宿主细胞系统。表达系统和选择方法的一些实例描述在下列参考文献,及其参考文献中:Borth etal.,Biotechnol.Bioen.71(4):266-73(2000-2001),在Werner etal.,Arzneimittelforschung/DrugRes.48(8):870-80(1998)中,在Andersen和Krummen,Curr.Op.Biotechnol.13:117-123(2002)中,在Chadd和Chamow中,Curr.Op.Biotechnol.12:188-194(2001)中,和在Giddings,Curr.Op.Biotechnol.12:450-454(2001)中。在备选的实施方案中,可以使用其它的真核生物宿主细胞系统,包括用重组酵母表达载体转化的酵母细胞,所述载体包含本发明的ABM的编码序列,诸如在美国专利申请号60/344,169和WO03/056914中所教导的表达系统(用于在非人真核宿主细胞中产生人样糖蛋白的方法)(将其每个的全部内容并入本文作为参考);用重组病毒表达载体(例如,杆状病毒)感染的昆虫细胞系统,所述病毒表达载体包含嵌合ABM的编码序列,所述嵌合ABM具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性;用重组的病毒表达载体(例如,花椰菜花叶病毒,CaMV;烟草花叶病毒,TMV)感染的植物细胞系统或用重组质粒表达载体(例如,Ti质粒)转化的植物细胞系统,所述质粒表达载体包含本发明的ABM的编码序列,包括,但不限于,在美国专利号6,815,184(用于从遗传改造的浮萍中表达和分泌生物活性多肽的方法),WO2004/057002(通过引入糖基转移酶基因在苔藓植物细胞中产生糖基化蛋白)和WO2004/024927(在藓类植物原生质体中产生细胞外异源非植物蛋白的方法);和美国专利申请号60/365,769,60/368,047,和WO2003/078614(在包含功能性哺乳动物GnTIII酶的转基因植物中的糖蛋白加工)(特此将其每个的全部内容并入作为参考)教导的表达系统;或用重组病毒表达载体(例如,腺病毒,痘苗病毒)感染的动物细胞系统,其包括被改造从而包含编码嵌合ABM的DNA的多个拷贝的细胞系,所述嵌合ABM具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性,所述DNA的多个拷贝稳定扩增(CHO/dhfr)或在双微染色体(例如,鼠细胞系)中不稳定扩增。在一个实施方案中,包含编码本发明的ABM的多核苷酸的载体是多顺反子的。此外,在一个实施方案中,上面讨论的ABM是抗体或其片段。在一个优选的实施方案中,该ABM是人源化的抗体。
对于本发明的方法而言,稳定的表达通常优选进行瞬时表达,因为其典型地获得更可再现的结果并且对于大规模生产也是易于控制的,尽管瞬时表达也由本发明所涵盖。优于使用包含病毒的复制起点的表达载体,宿主细胞可以用受适合的表达控制元件(例如,启动子,增强子,序列,转录终止子,聚腺苷酸化位点等)控制的各自的编码核酸,和可选择的标志物转化。在引入外源DNA后,被改造的细胞可以容许在富集培养基中生长1-2天,并接着转到选择性培养基中。在重组质粒中的可选择标志物赋予对于选择的抗性并容许细胞的选择,所述细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中并生长形成转化灶,其又可以克隆和扩增到细胞系中。
可以使用许多选择系统,包括,但不限于,单纯疱疹病毒的胸苷激酶(Wigler etal.,Cell11:223(1977)),次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:2026(1962)),和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy etal.,Cell22:817(1980))基因,它们分别可以用在tk,hgprt-或aprt-细胞中。此外,抗代谢物抗性可以用作对于下列的选择的基础:赋予针对甲氨蝶呤的抗性的dhfr基因(Wigler etal.,Natl.Acad.Sci.USA77:3567(1989);O′Hareetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1527(1981));赋予针对霉酚酸的抗性的gpt基因(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072(1981));赋予针对氨基糖苷G-418的抗性的neo基因(Colberre-Garapin etal.,J.Mol.Biol.150:1(1981));和赋予针对潮霉素的抗性的hygro基因(Santerre etal.,Gene30:147(1984)。最近,已经描述了另外的可选择基因,即容许细胞使用吲哚替换色氨酸的trpB基因;容许细胞使用组氨醇替换组氨酸的hisD(Hartman&Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8047(1988));谷氨酰胺合成酶系统;和赋予针对鸟氨酸脱羧酶抑制剂,2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸,DFMO的抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶)(McConlogue,在Current Communications在Molecular Biology,ColdSpring Harbor Laboratory ed.(1987)中)。
本发明还涉及修饰由宿主细胞产生的本发明的ABMs的糖基化模式的方法,所述方法包括在所述宿主细胞中表达编码本发明的ABM的核酸和编码具有GnTIII活性的多肽的核酸或包括这些核酸的载体。优选地,修饰的多肽是IgG或其片段,所述IgG或其片段包含Fc区域。在特别优选的实施方案中,该ABM是人源化的抗体或其片段。备选地,或此外,这些宿主细胞可以被改造以具有至少一种岩藻糖基转移酶的减少的、抑制的或消除的活性。在另一个实施方案中,所述宿主细胞被改造以共表达本发明的ABM,GnTIII和甘露糖苷酶II(ManII)。
由本发明的宿主细胞产生的被修饰的ABMs作为修饰的结果,显示增加的Fc受体结合亲和性和/或增加的效应子功能。在特别优选的实施方案中,该ABM是包含Fc区域的人源化的抗体或其片段。优选地,增加的Fc受体结合亲和性是与Fcγ激活受体,诸如FcγRIIIa受体的增加的结合。增加的效应子功能优选地是下列的一个或多个的增加:增加的抗体依赖性细胞的细胞毒性,增加的抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP),增加的细胞因子分泌,增加的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的吸收,增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性,增加的与NK细胞的结合,增加的与巨噬细胞的结合,增加的与多形核细胞(PMNs)的结合,增加的与单核细胞的结合,增加的靶结合抗体的交联,增加的定向信号传导诱导的程序性细胞调亡,增加的树突细胞成熟,和增加的T细胞引发。
可以通过本领域技术人员已知的各种测定法来测量和/或确定效应子功能。测量效应子功能,包括Fc受体结合亲和性和依赖于补体的细胞毒性的各种测定法描述在美国申请公开号2004/0241817A1中,将其全部内容并入本文作为参考。可以例如,使用见,例如McRae等,J.Immunol.164:23-28(2000)的夹层ELISA和可在www.bdbiosciences.com/pharmingen /protocols获得的细胞因子夹层ELISA法,或通过在Takahashi等,British J.Pharmacol.137:315-322(2002)中所述的方法来测量细胞因子分泌,将其每个的全部内容并入本文作为参考。例如,可以使用如在Kalergis和Ravetch,J.Exp.Med.195:1653-59(2002)中提出的测定法来确定树突细胞成熟,将其全部内容并入本文作为参考。由Gresham等,J.Exp.Med.191:515-28(2000);Krauss等,J.Immunol.153:1769-77(1994);和Rafiq等,J.Clin.Invest.110:71-79(2002),和Hamano等,J.Immunol.164:6113-19(2000)提供噬菌作用和抗原吸收/呈递测定法的实例,将其每个的全部内容并入本文作为参考。可以例如通过Liao等,Blood83:2294-2304(1994)提出的方法测量细胞-表面受体的下调,将其全部内容并入本文作为参考。一般方法,方案和测定法可以见于细胞生物学:A LABORATORY HANDBOOK,Celis,J.E.,ed.,(2d ed.,1998),将其全部内容并入本文作为参考。其在本领域的技术内以适应用于本发明的上述参考的方法,方案和测定法。
本发明还涉及在宿主细胞中产生具有修饰的寡糖的本发明的ABM的方法,所述方法包括(a)在容许产生按照本发明的ABM的条件下,培养被改造从而表达至少一个编码具有GnTIII活性的多肽的核酸的宿主细胞,其中所述具有GnTIII活性的多肽以一定量来进行表达,所述量足以修饰在由所述宿主细胞产生的所述ABM的Fc区域中的寡糖;和(b)分离所述ABM。在优选的实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包括GnTIII的催化结构域的融合多肽。在特别优选的实施方案中,该融合多肽还包括高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域。
优选地,高尔基体定位结构域是人甘露糖苷酶II或人GnTI的定位结构域。或者,高尔基体定位结构域选自由下列组成的组:甘露糖苷酶I的定位结构域,GnTII的定位结构域,和α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。由本发明的方法产生的ABMs具有增加的Fc受体结合亲和性和/或增加的效应子功能。优选地,增加的效应子功能是下列的一个或多个:增加的Fc-介导的细胞毒性(包括增加的抗体依赖性细胞的细胞毒性),增加的抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP),增加的细胞因子分泌,增加的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的吸收,增加的与NK细胞的结合,增加的与巨噬细胞的结合,增加的与单核细胞的结合,增加的与多形核细胞的结合,增加的定向信号传导诱导的程序性细胞调亡,增加的靶结合抗体的交联,增加的树突细胞成熟,或增加的T细胞引发。优选地,增加的Fc受体结合亲和性是与Fc激活受体,诸如FcγRIIIa的增加的结合。在特别优选的实施方案中,该ABM是人源化抗体或其片段。
在另一个实施方案中,本发明涉及嵌合的ABM,其具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性,通过本发明的方法产生,在所述多肽的Fc区域中具有增加比例的分叉寡糖。意欲这样的ABM涵盖包括Fc区域的抗体和其片段。在优选的实施方案中,该ABM是人源化抗体。在一个实施方案中,在ABM的Fc区域中的分叉的寡糖的百分比是总寡糖的至少50%,更优选地,至少60%,至少70%,至少80%,或至少90%,并且最优选地是至少90-95%。在另一个实施方案中,通过本发明的方法产生的ABM作为其通过本发明的方法修饰其寡糖的结果在Fc区域中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。在一个实施方案中,非岩藻糖基化寡糖的百分比是至少50%,优选地,至少60%到70%,最优选地至少75%。非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合的或复合的类型。在特别优选的实施方案中,由宿主细胞和本发明的方法产生的ABM在Fc区域中具有增加比例的分叉的、非岩藻糖基化的寡糖。该分叉的、非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合的或复合的。具体而言,本发明的方法可以用于产生ABMs,其中在ABM的Fc区域中的至少15%,更优选地至少20%,更优选地至少25%,更优选地至少30%,更优选地至少35%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。本发明的方法还可以用于产生多肽,其中在多肽的Fc区域中的至少15%,更优选地至少20%,更优选地至少25%,更优选地至少30%,更优选地至少35%的寡糖是分叉的杂合非岩藻糖基化的。(在图10中,描述了术语“复合物”“分叉复合物”和“杂合”寡糖的命名法)
在另一个实施方案中,本发明的方法涉及嵌合ABM,其具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合亲和性,并被改造从而具有增加的效应子功能和/或增加的Fc受体结合亲和性,通过本发明的方法产生。优选地,增加的效应子功能是下列的一个或多个:增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性(包括增加的抗体依赖性细胞的细胞毒性),增加的抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP),增加的细胞因子分泌,增加的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的吸收,增加的与NK细胞的结合,增加的与巨噬细胞的结合,增加的与单核细胞的结合,增加的与多形核细胞的结合,增加的定向信号传导诱导的程序性细胞调亡,增加的靶结合抗体的交联,增加的树突细胞成熟,或增加的T细胞引发。在优选的实施方案中,增加的Fc受体结合亲和性增加到与Fc激活受体,最优选地,FcγRIIIa结合。在一个实施方案中,该ABM是包含Fc区域的抗体,抗体片段,或包括等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域的融合蛋白。在特别优选的实施方案中,该ABM是人源化抗体。
本发明还涉及药物组合物,其包括本发明的ABMs和药用载体。
本发明还涉及这些药物组合物在治疗癌症的方法中的应用。具体而言,本发明涉及治疗癌症的方法,所述方法包括施用治疗有效量的本发明药物组合物。
在另一个实施方案中,本发明涉及按照本发明的ABM用作药物的应用,所述药物特别用于治疗或预防癌症或用在癌症前期病症或病灶中。所述癌症可以是,例如肺癌,非小细胞肺癌(NSCL),支气管细胞肺癌,骨癌,胰腺癌,皮肤癌,头或颈部癌症,皮肤或眼内黑素瘤,子宫癌,卵巢癌,直肠癌,肛门区癌,胃癌,胃癌,结肠癌,乳腺癌,子宫癌,输卵管癌,子宫内膜癌,子宫颈癌,阴道癌,外阴癌,恶性淋巴肉芽肿病,食道癌,小肠癌,内分泌系统癌,甲状腺癌,甲状旁腺癌,肾上腺癌,软组织肉瘤,尿道癌,阴茎癌,前列腺癌,膀胱癌,肾癌或输尿管癌,肾细胞癌,肾盂癌,间皮瘤,肝细胞癌,胆管癌,慢性或急性白血病,淋巴细胞淋巴瘤,中枢神经系统(CNS)肿瘤,脊柱轴肿瘤,脑干神经胶质瘤,多形性成细胞胶质瘤,星细胞瘤,神经鞘瘤,室鼓膜瘤,成神经管细胞瘤,脑脊膜瘤,鳞状细胞癌,垂体腺瘤,包括上述癌症任一种的顽固形式,或一种或多种上述癌的组合。癌症前期病症或病灶包括,例如由口腔粘膜白斑病,光化性角化病(日光性角化病),结肠或直肠癌症前期息肉,胃上皮发育不良,腺瘤发育不良,遗传性非息肉性结肠癌综合征(HNPCC),巴雷特食道,膀胱发育不良,和癌症前期宫颈病症组成的组。
优选地,所述癌选自由乳腺癌,膀胱癌,头或颈部癌,皮肤癌,胰腺癌,肺癌,卵巢癌,结肠癌,前列腺癌,肾癌,和脑癌。
另一个实施方案是将按照本发明的ABM用于制备治疗或预防癌症的药物的应用。癌症如上定义。
优选地,所述癌症选自由乳腺癌,膀胱癌,头&颈部癌,皮肤癌,胰腺癌,肺癌,卵巢癌,结肠癌,前列腺癌,肾癌和脑癌组成的组。
此外优选地,所述抗原结合分子以约1.0mg/kg到约15mg/kg的治疗有效量使用。
此外更优选地,所述所述抗原结合分子以约1.5mg/kg到约12mg/kg的治疗有效量使用。
此外更优选地,所述所述抗原结合分子以从约1.5mg/kg到约4.5mg/kg的治疗有效量使用。
此外更优选地,所述所述抗原结合分子以从约4.5mg/kg到约12mg/kg的治疗有效量使用。
最优选地,所述抗原结合分子以约1.5mg/kg的治疗有效量使用。
此外最优选地,所述抗原结合分子以约4.5mg/kg的治疗有效量使用。
此外最优选地,所述抗原结合分子以约12mg/kg的治疗有效量使用。
本发明还提供产生和使用产生本发明的ABMs的糖形的宿主细胞系统的方法,所述本发明的ABMs的糖形具有增加的Fc受体结合亲和性,优选地增加的与Fc激活受体的结合,和/或具有增加的效应子功能,包括依赖于抗体的细胞细胞毒性。可以用于本发明的ABMs的糖基改造的方法详细描述于美国专利号6,602,684,美国专利申请公开号2004/0241817A1,美国专利申请公开号2003/0175884A1,临时美国专利申请号60/441,307和WO2004/065540,将其每个的全部内容并入本文作为参考。按照在美国专利申请公开号2003/0157108(Genentech)或在EP1176195A1,WO03/084570,WO03/085119和美国专利申请公开号2003/0115614,2004/093621,2004/110282,2004/110704,2004/132140(都授予KyowaHakko Kogyo Ltd.)中所公开的技术,本发明的ABMs可以备选地被糖基改造以在Fc区具有减少的岩藻糖残基。将这些文献的每个的内容特此并入作为参考。本发明的糖基改造的ABMs也可以在产生修饰的糖蛋白的表达系统中产生,如在美国专利申请公开号60/344,169和WO03/056914(GlycoFi,Inc.)或在WO2004/057002和WO2004/024927(Greenovation)中所教导的那些,将其每个的全部内容并入本文作为参考。
用于制备具有改变的糖基化模式的蛋白质的细胞系的产生
本发明提供宿主细胞表达系统,其用于产生具有修饰的糖基化模式的本发明的ABMs。特别地,本发明提供宿主细胞系统,其用于产生具有提高的治疗价值的本发明的ABMs的糖形。因此,本发明提供被选择或被改造以用于表达具有GnTIII活性的多肽的宿主细胞表达系统。在一个实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。具体而言,这样的宿主细胞表达系统可以进行改造从而包括编码具有GnTIII的多肽的重组核酸分子,其操作性地连接于组成型或调节性启动子系统。
在一个具体实施方案中,本发明提供宿主细胞,其已经被改造从而表达至少一个编码融合多肽的核酸,所述融合多肽具有GnTIII活性并包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域。在一个方面,宿主细胞被改造具有核酸分子,所述核酸分子包括编码融合多肽的至少一个基因,所述融合多肽具有GnTIII活性,并包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域。
一般而言,任何类型的培养的细胞系,包括上述讨论的细胞系,可以用作背景来改造本发明的宿主细胞系。在一个优选的实施方案中,将CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,其它哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,或植物细胞用作背景细胞系以产生本发明的被改造的宿主细胞。
本发明意欲涵盖任何被改造的宿主细胞,其表达具有GnTIII活性的多肽,包括包含如本文定义的异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。
一个或数个编码具有GnTIII活性的多肽的核酸可以在组成型启动子,或备选地,调节性表达系统控制下进行表达。这些系统是本领域众所周知的,并且包括上面讨论的系统。如果编码具有GnTIII活性并包括异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽的几种不同核酸被包括在宿主细胞系统中,它们中的一些可以在组成型启动子的控制下进行表达,而其它的在调节性启动子的控制下进行表达。具有GnTIII活性的融合多肽的表达水平由本领域通常了解的方法所确定,所述方法包括蛋白质印迹分析,RNA印迹分析,报道基因表达分析或测量GnTIII活性。或者,可以使用结合GnTIII的生物合成产物的凝集素,例如,E4-PHA凝集素。或者,可以使用功能性测定,其测量由这样的细胞产生的抗体介导的增加的Fc受体结合或增加的效应子功能,所述细胞用编码具有GnTIII活性的多肽的核酸进行改造。
表达具有修饰的糖基化模式的蛋白质的转染子或转化体的鉴定
包含嵌合ABM的编码序列并表达生物学活性基因产物的宿主细胞可以通过至少下列四个常规方法进行鉴定;(a)DNA-DNA或DNA-RNA杂交;(b)“标志物”基因功能的存在或缺乏;(c)如通过各个mRNA转录物在宿主细胞中表达所测量的评估转录的水平;和(d)如通过免疫测定或通过其生物学活性所测量的来检测基因产物,所述嵌合ABM具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性。
在第一个方法中,嵌合ABM的编码序列和具有GnTIII活性的多肽的编码序列的存在可以使用包含核苷酸序列的探针,通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交来进行检测,所述嵌合ABM具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性,所述核苷酸序列与各个编码序列、或其部分或衍生物分别具有同源性。
在第二个方法中,重组表达载体/宿主系统可以基于某些“标志物”基因功能(例如,胸苷激酶活性,对抗生素的抗性,对甲氨蝶呤的抗性,转化表型,在杆状病毒中的包含体形成等)来进行鉴定和选择。例如,如果本发明的ABM的编码序列,或其片段,和具有GnTIII活性的多肽的编码序列被插入载体的标志物基因序列中,包含各个编码序列的重组体可以通过标志物基因功能的缺乏而进行鉴定。或者,标志物基因可以在用于控制编码序列的表达的相同或不同启动子控制下与编码序列一起串联排列。响应于诱导或选择的标志物的表达显示本发明的ABM的编码序列和具有GnTIII活性的多肽的编码序列的表达。
在第三个方法中,本发明的ABM的编码区,或其片段,和具有GnTIII活性的多肽的编码序列的转录活性可以通过杂交测定进行评估。例如,RNA可以进行分离和使用探针通过RNA印迹来分析,所述探针与本发明的ABM的编码序列,或其片段,和具有GnTIII活性的多肽的编码序列,或其特定部分具有同源性。或者,可以对宿主细胞的总核酸进行抽提并测定与这些探针的杂交。
在第四个方法中,蛋白质产物的表达可以,例如通过蛋白质印迹法,免疫测定诸如放射免疫沉淀法,酶联免疫测定等来进行免疫活性地评估。然而,表达系统成功的最终测试包括检测生物学活性的基因产物。
产生和使用具有增加的效应子功能的ABMs,所述效应子功能包括抗体依赖性细胞的细胞毒性
在优选的实施方案中,本发明提供嵌合的ABMs的糖形,所述嵌合的ABMs具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性并具有增加的效应子功能,所述效应子功能包括抗体依赖性细胞的细胞毒性。已经在前面描述了抗体的糖基化改造。见,例如美国专利号6,602,684,将其全部内容并入本文作为参考。
将未缀合的单克隆抗体(mAbs)用于治疗一些类型的癌症的临床试验最近已经产生了令人鼓舞的结果。Dillman,Cancer Biother.&Radiopharm.12:223-25(1997);Deo etal.,Immunology Today18:127(1997)。一种嵌合的,未缀合的IgGl已经被批准用于低级或滤泡性的B-细胞非霍奇金氏淋巴瘤。Dillman,Cancer Biother.&Radiopharm.12:223-25(1997),而另一种未缀合的mAb,靶向实体乳腺肿瘤的人源化IgGl已经显示了在III期临床试验中的有前景的结果。Deo etal.,Immunology Today18:127(1997)。这两种mAbs的抗原在它们各自的肿瘤细胞中高度表达并且抗体在体外和体内通过效应细胞介导有效的肿瘤破坏。与此相对,许多其它的具有优良肿瘤特异性的未缀合mAbs不能引发在临床上有用的足够潜能的效应子功能。Frostetal.,Cancer80:317-33(1997);Surfus etal.,J.Immunother.19:184-91(1996)。对于这些弱mAbs中的一些而言,目前测试了辅助的细胞因子疗法。另外的细胞因子可以通过增加循环淋巴细胞的活性和数量而刺激抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。Frost etal.,Cancer80:317-33(1997);Surfus etal.,J.Immunother.19:184-91(1996)。ADCC,一种对抗体靶向的细胞的溶胞攻击,在白细胞受体与抗体的恒定区(Fc)结合后得以引发。Deo etal.,Immunology Today18:127(1997)。
一种增加未缀合的IgGls的ADCC活性的不同的,但是补充性的方法是改造抗体的Fc区域。蛋白质改造研究已经显示FcγRs主要与IgG分子的铰链区相互作用。Lund etal.,J.Immunol.157:4963-69(1996)。然而,FcγR结合也需要在CH2区域中的保守Asn297处共价连接的寡糖的存在。Lund etal.,J.Immunol.157:4963-69(1996);Wright和Morrison,TrendsBiotech.15:26-31(1997),提示寡糖和多肽两者都直接有利于相互作用的位点或需要寡糖来维持活性CH2多肽构象。因此可以开发对寡糖结构的修饰用作增加相互作用亲和性的方式。
IgG分子在其Fc区域中携带两个N连接的寡糖,每个在各自的重链上。作为任何糖蛋白,抗体作为糖形的群产生,其共享相同的多肽主链但是具有不同的连接于糖基化位点的寡糖。通常见于血清IgG的Fc区域中的寡糖是复合的双触角的类型(Wormald etal.,Biochemistry36:130-38
(1997),其具有低水平的末端唾液酸和分叉的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),和不同程度的末端半乳糖基化和核心岩藻糖基化。一些研究显示FcγR结合所需要的最小糖结构位于寡糖核心中。Lund etal.,J.Immunol.157:4963-69(1996)。
用于产生未缀合的治疗性mAbs的用在工业和学术研究中的小鼠或仓鼠来源的细胞系通常将所需的寡糖决定子连接于Fc位点。然而,在这些细胞系中表达的IgGs,缺乏以低量见于血清IgGs的分叉GlcNAc。Lifelyetal.,Glycobiology318:813-22(1995)。与此相对,最近观察到大鼠的骨髓瘤产生的,人源化IgGl(CAMPATH-1H)在其糖形的一些中携带分叉的GlcNAc。Lifelyetal.,Glycobiology318:813-22(1995)。大鼠的细胞衍生的抗体与由标准的细胞系产生的CAMPATH-1H抗体相比,达到了相似的最大体外ADCC活性,但是其以显著更低的抗体浓度存在。
CAMPATH抗原通常以高水平存在于淋巴瘤细胞上,并且这种嵌合的mAb在缺乏分叉的GlcNAc时具有高ADCC活性。Lifely etal.,Glycobiology318:813-22(1995)。在N-连接的糖基化途径中,分叉的GlcNAc通过GnTIII加入。Schachter,Biochem.Cell Biol.64:163-81(1986)。
以前的研究使用单一的抗体产生CHO细胞系,其被预先改造从而以外部调节的方式,表达不同水平的克隆的GnT III基因酶(Umana,P.,etal.,Nature Biotechnol.17:176-180(1999))。这种方法首次在修饰的抗体的GnTIII的表达和ADCC活性之间建立严格的关联。因此,本发明意欲这样的重组的,嵌合或人源化的ABM(例如抗体)或其片段,其具有鼠225.28S单克隆抗体的结合特异性,具有由增加的GnTIII活性所导致的改变的糖基化。增加的GnTIII活性导致在ABM的Fc区域中,分叉的寡糖的百分比中的增加,以及岩藻糖残基的百分比的减少。这种抗体,或其片段,具有增加的Fc受体结合亲和性和增加的效应子功能。此外,本发明涉及抗体片段和融合蛋白,它们包括等价于免疫球蛋白的Fc区域的区域。
按照本发明的方法产生的ABMs的治疗性应用
在最广泛的意义上,本发明的ABMs可以用于体内或体外靶向表达MCSP的细胞。表达MCSP的细胞可以被靶向用于诊断或治疗目的。在一方面,本发明的ABMs可以用于检测样品中MCSP的存在。另一个方面,本发明的ABMs可以用于在体外或在体内结合表达MCSP的细胞,例如用于鉴定或靶向。更具体而言,本发明的ABMs可以用于阻断或抑制MCSP结合于MCSP配体,或备选地靶向表达MCSP的细胞以破坏。在一个实施方案中,表达MCSP的细胞是周细胞。此外,本发明的ABMs可以用于抑制黑素瘤细胞黏附和迁移,以抑制对纤连蛋白的趋化反应,并且抑制周细胞,抑制细胞在ECM蛋白如胶原蛋白和纤连蛋白上的扩散,抑制FAK和ECR信号传导网络,并且抑制或减少在表面上的表达MCSP的细胞中的MCSP-介导的信号传导。
MCSP在许多人肿瘤中过表达。因此本发明的ABMs特别用于预防肿瘤形成,消除肿瘤并抑制肿瘤生长。本发明的ABMs可以用于治疗表达MCSP的任何肿瘤。可以用本发明的ABMs治疗特定的恶性肿瘤,其包括但不限于黑素瘤和肿瘤血管发生。在一个实施方案中,本发明的ABMs与抗-VEGF抗体或另一个抗生血管抗体共施用以预防,抑制或治疗肿瘤血管发生。
本发明的ABMs可以单独用于体内靶向和杀伤肿瘤细胞。ABMs还可以与适合的治疗剂组合使用以治疗人癌症。例如,该ABMs可以与标准或常规治疗方法诸如化学疗法,放射治疗组合使用或可以缀合或连接于治疗性药物,或毒素,以及淋巴因子或肿瘤抑制生长因子,以将治疗剂递送给癌症位点。非常重要的本发明的ABMs的缀合物是(1)免疫毒素(ABM和细胞毒性部分的缀合物)和(2)标记的(例如,放射性标记的,酶标记的或荧光染料标记的)ABMs,其中该标记提供鉴定包括标记的ABM的免疫复合物的方法。该ABM还可以用于通过天然补体方法来诱导裂解,并且与正常存在的抗体依赖性细胞毒性细胞相互作用。
免疫毒素的细胞毒性部分可以是细胞毒性药物或细菌或植物起源的酶促活性毒素,或这样的毒素的酶促活性片段(“A链”)。所用的酶促活性毒素及其片段是白喉毒素A链,白喉毒素、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相似豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白IIA链、α-帚曲霉素、光桐蛋白、香石竹毒蛋白、垂序登陆蛋白(PAPI,PAPII,和PAP-S)、苦瓜蛋白抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白,sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素,和伊诺毒素的非结合活性片段。在另一个实施方案中,该ABMs与小分子抗癌药物缀合。ABM和这些细胞毒性部分的缀合物使用多种双功能蛋白偶联剂进行制备。这些试剂的实例是SPDP,IT,亚氨酸酯的双功能衍生物诸如二甲基adipimidate盐酸,活性酯诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯,醛诸如戊二醛,二叠氮化合物诸如二-(p-二叠氮苯甲基)已二胺,二重氮化衍生物诸如二-(p-二重氮苯甲基)-乙二胺,二异硫氰酸酯诸如甲苯基2,6-二异硫氰酸酯,和双活性氟化合物诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯。毒素的溶解部分可以连接于ABMs的Fab片段。本领域已知另外的适合毒素,如在例如公开的美国专利申请号2002/0128448中显示的,将其全部内容并入本文作为参考。
在一个实施方案中,具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性的嵌合的糖基改造的ABM缀合于蓖麻毒蛋白A链。最有利地,蓖麻毒蛋白A链是脱糖基化并通过重组方式产生的。制备该蓖麻毒蛋白的免疫毒素的有利方法描述于Vitetta et al.,Science238,1098(1987),将其并入作为参考。
当出于诊断目的,体外用于杀伤人癌细胞时,该缀合物将典型地以至少约10nM的浓度加入细胞培养基中。配制和进行体外应用的施用方式不是关键的。将通常使用与培养或灌流介质相容的水性制剂。可以通过常规技术来读出细胞毒性以确定癌症的存在或程度。
如上讨论的,可以通过将放射性的放射性核素(例如,I,Y,Pr)缀合于嵌合的,糖基改造的ABM而制备细胞毒性的放射性药物以治疗癌症,所述ABM具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性。用于本文时,术语“细胞毒性部分”倾向于包括这些放射性核素。
在另一个实施方案中,将脂质体填充以细胞毒性药物并将脂质体包被以本发明的ABMs。因为在表达MCSP的恶性细胞的表面上存在许多MCSP分子,该方法容许将大量药物递送给正确的细胞类型。
将这些治疗剂缀合于抗体的技术是众所周知的(见,例如Amon et al.,″Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy″,在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Reisfeld etal.(eds.),243-56页(Alan R.Liss,Inc.1985)中;Hellstrom etal.,″Antibodies For DrugDelivery″,在Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)中,Robinson etal.(eds.),623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe,″Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review″,在Monoclonal Antibodies′84:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),475-506页(1985)中;和Thorpeetal.,″The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates″,Immunol.Rev.,62:119-58(1982))。
另外,本发明的ABMs的其它治疗性应用包括,例如通过重组DNA技术缀合或连接于能够将前药转化成细胞毒性药物的酶,和将抗体-酶缀合物与前药组合使用从而在肿瘤位点将前药转化成细胞毒性剂(见,例如Senter et al.,″Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase″,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4842-46(1988);″Enhancement of the in vitro and invivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and EtoposideDerivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates″,Cancer Research49:5789-5792(1989);and Senter,″Activation ofProdrugs byAntibody-Enzyme Conjugates:A New Approach to Cancer Therapy,″FASEBJ.4:188-193(1990))。
此外,本发明的ABMs的另外的治疗性应用,包括,在存在补体的情况下使用未缀合的,或作为抗体-药物或抗体毒素缀合物的部分从而从癌症患者的骨髓中去除肿瘤细胞。按照该方法,可以通过用抗体处理并将骨髓输注回患者来对自体骨髓进行离体清洗[见,例如Ramsay et al.,″BoneMarrow Purging Using Monoclonal Antibodies″,J.Clin.Immunol.,8(2):81-88(1988)]。
此外,意欲本发明包括单链免疫毒素,其包括容许与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性的抗原结合结构域(例如,包括鼠225.28S单克隆抗体的CDRs的多肽)和另外包括毒素多肽。本发明的单链免疫毒素可以用于体内治疗人癌症。
类似地,可以将融合蛋白用于体内治疗人癌症,所述融合蛋白包括与第二蛋白的至少功能活性部分连接的本发明的ABM的至少抗原结合区,所述第二蛋白具有抗肿瘤活性,例如淋巴因子或制癌蛋白。
本发明提供用于选择性杀伤表达MCSP的肿瘤细胞的方法。该方法包括将本发明的免疫缀合物(例如,免疫毒素)与所述肿瘤细胞反应。这些肿瘤细胞可以来自人癌症。
此外,本发明提供体内治疗癌症(例如,人癌症)的方法。该方法包括将药用有效量的组合物施用于受试者,所述组合物包括至少一种本发明的免疫缀合物(免疫毒素)。
在另一个方面,本发明涉及一种改善的方法,用于治疗其中MCSP被表达的细胞增殖性疾病,特别是其中MSCP被异常表达(例如过表达)的细胞增殖性疾病,包括黑素瘤,所述方法包括向需要其的人受试者施用治疗有效量的本发明的ABM。此外,因为MCSP在激活的和未激活的周细胞上表达,本发明的ABMs可以用于治疗诱导新血管形成的任何肿瘤中的血管发生。因为周细胞接触并支持内皮细胞,此外可以稳定新血管,它们的靶向将抑制肿瘤诱导的血管发生。Ozerdem&Stallcup,Angiogenesis7(3):269-76(2004);Erber等,FASEB J.18(2):338-40(Feb.2004);Grako等,J.Cell Sci.112:905-915(1999);Iivanainen等,FASEB J.17:1609-1621(2003)。在优选的实施方案中,ABM被糖基改造,抗-MCSP抗体具有与鼠225.28S单克隆抗体基本相同的结合特异性。在另一个优选的实施方案中,所述抗体被人源化。可以用本发明的ABM治疗的细胞增殖性疾病的实例包括,但不限于,位于下列中的肿瘤:腹部,骨,乳腺,消化系统,肝,胰腺,腹膜,内分泌腺体(肾上腺,副甲状腺,垂体,睾丸,卵巢,胸腺,甲状腺),眼睛,头和颈部,神经系统(中枢和外周),淋巴系统,骨盆,皮肤,软组织,脾,胸区和泌尿生殖器系统。
类似地,也可以用本发明的ABMs治疗其它细胞增殖性疾病。这些细胞增殖性疾病的实例包括,但不限于:高丙种球蛋白血病,淋巴增生性疾病,副球蛋白血症,紫癜,结节病,塞泽里综合征,瓦尔登斯特伦巨球细胞血症,戈谢病,组织细胞增多病和位于上面列出的器官系统中除了肿瘤之外的任何其它细胞增殖性疾病。
按照本发明的实践,受试者可以是人,马,猪,牛,鼠,犬,猫,和鸟受试者。此外本发明还包括其它的温血动物。
本发明还提供抑制人肿瘤细胞生长,治疗受试者中肿瘤,和治疗受试者中增殖型疾病的方法。这些方法包含向所述受试者施用有效量的本发明的ABM组合物。
本发明还涉及在哺乳动物中治疗非恶性疾病或病症的方法,所述疾病或病症的特征在于异常激活或产生MCSP或一种或多种MCSP的配体,所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本发明的ABMs。所述受试者将通常例如在其疾病组织中具有表达MCSP的细胞,从而使本发明的ABMs能够结合受试者中的细胞。
MCSP或MCSP配体的异常激活或表达可以发生在受试者的细胞中,例如在受试者的疾病组织中。MCSP的异常激活可以归因于MCSP和/或MCSP配体的扩增,过表达或异常产生。在本发明的一个实施方案中,可以实施诊断性或预后性测定以确定受试者是否发生MCSP(或MCSP配体)的异常产生或激活。例如,可以测定MCSP和/或配体的基因扩增和/或过表达。本领域现有多种测定这种扩增/过表达的测定方法,包括IHC,FISH和上述的shed抗原测定法。或者,或另外,可以根据已知的方法测定样品中的或与样品相关的MCSP配体的水平。这些测定可以检测待测样品中的蛋白质和/或编码它的核酸。在一个实施方案中,可以利用免疫组化(IHC)测定样品中的MCSP配体水平;见,例如,Scher等Clin.CancerResearch1:545-550(1995)。或者,或另外,可以通过例如FISH,DNA印迹分析,或PCR技术来估计待测样品中的中MCSP-编码核酸的水平。
另外,可以利用体内诊断测定法,例如通过施用结合待测分子并标签以可检测标记(例如放射性同位素)的分子(如抗体)并且外在扫描患者以便定位标记来评估MCSP或MCSP配体过表达或扩增。
因此,显而易见的是,本发明涵盖药物组合物,治疗人恶性肿瘤如黑素瘤和膀胱、脑、头和颈、胰、肺、乳腺、卵巢、结肠、前列腺和肾癌的方法。例如,本发明包括用在治疗人恶性肿瘤中的药物组合物,其包括药用有效量的本发明的抗体和药用载体。
本发明的ABM组合物可以使用常规施用方式进行施用,所述方式包括,但不限于,静脉内、腹膜内、口服、淋巴内或直接施用于肿瘤中。静脉内施用是优选的。
在本发明的一个方面,以冻干制剂或水溶液形式存在的包含本发明的ABMs的治疗性制剂通过将具有所需纯度的抗体与任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences第十六版,Osol,A.Ed.(1980))混和来进行制备以用于贮存。可以接受的载体,赋形剂,或稳定剂在所用的剂量和浓度上对于受者是无毒的,并且包括缓冲剂诸如磷酸盐,柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵;氯化已烷双胺;苯扎氯铵;苄索氯铵;酚,丁醇或苄醇;对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环已醇;3-戊醇;和间甲苯酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清白蛋白,明胶,或免疫球蛋白;亲水性聚合物诸如聚乙烯基吡咯烷酮;氨基酸诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸;单糖,二糖,和其它的糖包括葡萄糖,甘露糖,或糊精;鳌合剂诸如EDTA;糖诸如蔗糖,甘露糖醇,岩藻糖或山梨糖醇;成盐抗衡离子诸如钠;金属复合物(例如,锌-蛋白复合物);和/或非离子表面活性剂诸如TWEENTM,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
可以向受试者单独施用本发明的ABMs或组合以例如化疗剂和/或放疗来治疗疾病或病症,所述疾病或病症的特征是异常的MCSP或MCSP配体活性,如肿瘤。合适的化疗剂包括顺铂,多柔比星,托泊替康,紫杉醇,长春碱,卡铂,和依托泊苷。
将适合于皮下施用的冻干制剂描述在WO97/04801中。这些冻干制剂可以用适合的稀释剂重构到高蛋白质浓度并且可以将该重构的制剂皮下施用给本文的待治疗的哺乳动物。
根据被治疗的具体适应症的需要,本文的制剂也可以含有多于一种的活性化合物,优选具有互补活性而不彼此不利影响的那些。例如,可能理想的是另外提供细胞毒剂,化学治疗剂,细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的一种,如环孢菌素或结合T细胞的抗体,例如结合LFA-1的一种)。这些其它试剂的有效量取决于制剂中存在的拮抗剂的量,疾病或病症或治疗的类型,和以上讨论的其它因素。这些通常以相同剂量和以上文所用的给药途径使用或迄今使用的剂量的约1至99%使用。
活性成分还可以被包裹在,例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中,例如,分别在胶体药物递送系统(例如,脂质体,白蛋白微球体,微乳,纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳状液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(异丁烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开在Remington′s PharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.Ed.(1980)中。
可以制备持续释放的制剂。持续释放的制剂的适合的实例包括包含拮抗剂的固体疏水聚合物的半透性基质,所述基质以成形制品,例如薄膜,或微胶囊的形式存在。持续释放的基质的实例包括聚酯,水凝胶(例如,聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯),或聚(乙烯醇)),聚丙交酯(美国专利号3,773,919),L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物,不可降解的乙烯乙酸乙烯酯,可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙立德组成的可注射微球体),和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可以以无菌过滤膜通过过滤来容易地实现。
本发明的组合物可以以多种剂型存在,所述剂型包括,但不限于,液体溶液或混悬液,片剂,丸剂,粉末,栓剂,聚合物微胶囊或微泡,脂质体,和可注射的或可输注的溶液。优选的形式取决于施用和治疗应用的方式。
本发明的组合物还优选地包括本领域已知的常规药用载体和佐剂诸如人血清白蛋白,离子交换剂,钒土,卵磷脂,缓冲物质诸如磷酸盐,甘氨酸,抗坏血酸,山梨酸钾,和盐或电解质诸如硫酸鱼精蛋白。
用于本发明的药物组合物的最有效施用方式和剂量方案取决于疾病的严重性和进程,患者的健康和对治疗的反应,以及治疗的医师的判断。因此,对个体患者应该对该组合物的剂量进行滴定。然而,本发明的组合物的有效剂量将通常在约0.01到约2000mg/kg的范围内。
本文所述的分子可以以多种剂型存在,所述剂型包括,但不限于,液体溶液或混悬液,片剂,丸剂,粉末,栓剂,聚合物微胶囊或微泡,脂质体,和可注射的或可输注的溶液。优选的形式取决于施用和治疗应用的方式。
在一些情况下,本发明的剂量可以通过使用生物标记来确定。生物标记是用来估测治疗剂的药物动力学和确定哪些受试者最有可能应答的分离标记。例如,抗MCSP治疗的生物标记可以是MCSP下游信号途径中的分子(例如,黏着斑激酶(FAK),胞外信号调节激酶(ERK),或其它),所述信号途径导致细胞增殖病症。因而,可以使用生物标记来确定以何种量来施用本发明的ABM。本发明还提供向患者施用一定量ABM的方法,所述方法首先测定特征是MCSP表达的病症的生物标记的表达。
在一些情况下,本发明的剂量可以通过使用预测性生物标记来确定。预测性生物标记是用来确定(即,观察和/或量化)肿瘤相关基因或蛋白质的表达和/或激活模式的分子标记,或肿瘤相关信号途径的细胞组分。阐明肿瘤组织中靶向治疗的生物学效应以及将这些效应与临床应答相联系有助于鉴定在肿瘤中有效的主要生长和存活途径,由此确立有可能应答者的模式并反向推理来设计策略以克服耐受性。例如,抗MCSP疗法的生物标记可以包含导致细胞增殖病症的MCSP下游信号途径中的分子,包括,但不限于:FAK,ERK,3型膜基质金属蛋白酶(MT3-MMP),Cdc42,Ack-1,和p130cas。Yang等,J.Cell Biol.165(6):881-891(June2004);Iida等,J.Biol.Chem.276(22):18786-18794(2001);Eisenmann等,Nat.Cell Biol.1(8):507-513(1999)。
通过本领域公知的细胞测定法可以测量预测性生物标记,所述测定法包括,但不限于免疫组化,流式细胞计数分析,免疫荧光,捕获与检测测定法,和反相测定法,和/或在美国专利申请公开号2004/0132097A1中给出的测定法,将其全部内容并入本文作为参考。抗MCSP治疗的预测性生物标记自身可以根据在美国专利申请公开号2003/0190689A1中给出的技术进行鉴定,特此将其全部内容并入作为参考。
在一方面,本发明提供治疗MCSP相关病症的方法,包括预测需要治疗的人类受试者中对于抗MCSP治疗的应答,这种预测通过在治疗前用一种或一组试剂测定来自人受试者的样品进行,所述试剂检测MCSP相关病症如癌症的预测性生物标记的表达和/或激活;测定一种或多种预测性生物标记的表达和/或激活模式,其中所述模式预测人受试者对于抗MCSP治疗的应答;以及向经预测对于抗MCSP治疗阳性应答的人受试者施用治疗上有效量的包含本发明的ABM的组合物。本文所用的“经预测对于抗MCSP治疗阳性应答的人受试者”是这样的人,对于他来说抗MCSP将对MCSP相关病症具有可测量的效应(肿瘤衰退/收缩),并且对于他来说抗MCSP治疗的益处超过副作用(例如,毒性)。本文所用的样品意指来自生物,特别是人的任何包含一个或多个细胞的生物学样品,其包括任何起源的单一细胞、组织或生物活检样品,它移除自器官如乳腺、肺、胃肠道、皮肤、子宫颈、卵巢、前列腺、肾、脑、头和颈,或身体的任何其它器官或组织,以及其它身体样品,包括,但不限于,涂片、唾液、分泌物、脑脊髓液、胆汁、血液、淋巴液、尿液和粪便。
包括本发明的ABM的组合物将以与良好的医疗实践保持一致的方式来进行配制,给药和施用。在该环境中考虑的因素包括被治疗的具体疾病或病症,被治疗的具体哺乳动物,个体患者的临床条件,疾病或病症的起因,递送该试剂的位点,施用的方法,施用的时间表,和执业医生已知的其它因素。待施用的拮抗剂的治疗有效量将由这些考虑所支配。
作为一般的建议,每剂量中肠胃外施用的抗体的治疗有效量将在约0.1到20mg/kg患者体重/日范围内,其中所用的拮抗剂的典型起始范围在约2到10mg/kg的范围内。
在一个优选的实施方案中,该ABM是抗体,优选地是人源化的抗体。这种未缀合的抗体的适合的剂量在,例如,约20mg/m2到约1000mg/m2的范围内。例如,可以向患者施用一次或多次基本少于375mg/m2的抗体的剂量,例如其中该剂量在约20mg/m2到约250mg/m2的范围内,例如从约50mg/m2到约200mg/m2的范围内。
而且,可以施用一次或多次起始剂量的抗体,随后施用一次或多次随后的剂量,其中在随后的剂量中的抗体的mg/m2剂量的量超过在起始剂量中的抗体的mg/m2剂量的量。例如,起始剂量可以在约20mg/m2到约250mg/m2(例如,从约50mg/m2到约200mg/m2)的范围内,并且随后的剂量可以在约250mg/m2到约1000mg/m2的范围内。
然而,如上指出,ABM的这些提示量要进行大量的治疗性判断。在选择适当的剂量和时间表中的关键因素是如上所示的获得的结果。例如,起初可能需要相对更高的剂量用于进行中的和急性疾病的治疗。为了获得最有效的结果,取决于疾病或病症,将拮抗剂在尽可能接近于疾病或病症的首次症状,诊断,征兆或发生的时候施用或在疾病或病症减轻的时候进行施用。
对于治疗肿瘤的抗MCSP抗体来说,优化的治疗结果一般是以足以完全将靶细胞上的MCSP分子饱和的剂量实现的。达到饱和的剂量将取决于每个肿瘤细胞上表达的MCSP分子数目(其可在不同的肿瘤类型之间有所不同)。低到30nM的血清浓度可以在治疗一些肿瘤中有效,而高于100nM的浓度可能对于其它肿瘤达到优化治疗效果是必需的。对于给定的肿瘤达到饱和的必需剂量可以在体外通过放射免疫测定或免疫沉淀而轻易确定。
一般,对于与放射一起进行的组合疗法,一种合适的治疗方案包括以100-500mg/m2的剂量八周输注本发明的抗MCSP ABM,后接以100-250mg/m2的维持剂量,并以2.0Gy每天的剂量放射70.0Gy的量。对于与化疗一起进行的组合疗法,一种合适的治疗方案包括以每周100/100mg/m2,400/250mg/m2,或500/250mg/m2的加载/维持剂量施用本发明的抗MCSPABM,组合以每三周100mg/m2剂量的顺铂。或者,可以使用吉西他滨或伊立替康代替顺铂。
通过任何适合的方式来施用本发明的ABM,所述方式包括肠胃外,皮下,腹膜内,intrapulinonary,和鼻内,和如果对于局部免疫抑制性治疗是需要而言,病灶内施用。肠胃外输注包括肌内,静脉内,动脉内,腹膜内,或皮下施用。此外,拮抗剂可以通过脉冲输注,例如以下降剂量的拮抗剂来适当地施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的,优选地,将给药通过输注,最优选地静脉内或皮下注射进行。
可以与本文的拮抗剂一起,施用其它的化合物,诸如细胞毒性剂,化学治疗剂,免疫抑制剂和/或细胞因子。组合的施用包括使用单独的制剂或单独的药物组合物的共同施用,和以任一顺序的连续施用,其中优选地,在两种(或所有的)活性剂同时发挥它们的生物学活性的时候,存在时间周期。
将清楚的是实现治愈所需要的本发明的组合物的剂量可以随时间表优化进一步地减少。
按照本发明的实践,药用载体可以是脂质载体。该脂质载体可以是磷脂。此外,脂质载体可以是脂肪酸。此外,脂质载体可以是去污剂。用于本文时,去污剂是改变液体的表面张力,通常是降低其的任何物质。
在本发明的一个实例中,所述去污剂可以是非离子型去污剂。非离子型去污剂的实例包括,但不限于,聚山梨醇酯80(也称为Tween80或(聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯),Brij,和Triton(例如Triton WR-1339和Triton A-20)。
或者,所述去污剂可以是离子型去污剂。离子型去污剂的实例包括,但不限于,烷基三甲基溴化铵。
另外,根据本发明,所述脂质载体可以是脂质体。如本申请中所用的,“脂质体”是任何膜束缚的囊泡,其包含本发明的任何分子或其组合。
生产的制品
在本发明的另一个实施方案中,提供包含可用于治疗上述病症的物质的生产的制品。所述生产的制品包括容器和在容器上或与容器相关联的标记或包装说明书。合适的容器包括,例如,瓶,小瓶,注射器等。所述容器可以由多种材料形成,如玻璃或塑料。所述容器容纳可有效治疗病症的组合物,并且可以具有无菌的进出口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射器针头穿刺的塞子)。在组合物中至少一种活性制剂是抗MCSP抗体。所述标记或包装说明书指出所述组合物用于治疗选定的病症,如非恶性疾病或病症,其中所述疾病或病症包括MCSP和/或MCSP配体的异常激活,例如良性过度增生疾病或病症。另外,生产的制品可以包括(a)包含组合物的第一容器,其中所述组合物包括结合MCSP并抑制过表达MCSP的细胞的生长的第一抗体;和(b)包含组合物的第二容器,其中所述组合物包括结合MCSP并阻断MCSP受体的配体激活的第二抗体。在本发明的这一实施方案中,生产的制品可以进一步包括包装说明书,其指出所述第一和第二抗体组合物可以用于治疗非恶性疾病或病症,所述疾病或病症来自上面定义部分所列的这些疾病或病症。另外,包装说明书可以教导组合物(包括结合MCSP并阻断MCSP受体的配体激活的抗体)的使用者将使用抗体的疗法与操作部分中所述的任何辅助疗法(例如化疗剂,MCSP靶向药物,抗血管生成剂,免疫抑制剂,酪氨酸激酶抑制剂,抗激素化合物,保心药和/或细胞因子)相结合。或者,或另外,生产的制品可以进一步包括第二(或第三)容器,其包含药用的缓冲液,如注射用的抑菌水(BWFI),磷酸盐缓冲盐溶液,林格溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户观点来看所需要的其它材料,包括其它缓冲剂,稀释剂,滤器,针头和注射器。
下面的实施例更加详细地解释本发明。给出下列制备和实施例以使得本领域技术人员能够更加清楚地理解并实施本发明。不过,本发明的范围并不受例示的实施方案所限制,所述实施方案只是意在作为发明单一方面的举例说明,并且功能上等同的方法在本发明的范围之内。事实上,由前述描述和附图,对于本领域技术人员来说,除了本文所述之外,本发明的各种改进将是显而易见的。这些改进将会落入后附的权利要求书的范围之内。
特此将本申请中所引用的所有专利、申请和公开出版物全部并入作为参考。
实施例
除非另外指定,在下列实施例中的特定氨基酸残基位置的编号是按照KABAT编号系统进行的。除非另外指定,在这些实施例中用来制备抗原结合分子的材料和方法是根据美国专利申请号10/981,738的实施例中所给出的那些,特此将其全部内容并入作为参考。
实施例1
人源化抗MCSP Mabs的生成
A.高同源性受体方法
根据此方法,通过将源自小鼠源的scFv抗体225.28S与人种系序列集合相比对并挑出显示最高序列同一性的人序列来进行高同源性抗体受体构架的搜索,同时在功能水平上保留所有规范残基。在此,取来自IMGT数据的序列IGHV3-15(登记号X92216)和IGHV3-7(登记号M99649)作为构架受体序列。二者都是VH3家族成员。选择来自相同数据库的VK1家族的IGKV1-9序列(登记号Z00013)作为轻链的构架受体。这三种受体构架上移植每种鼠225.28S重和轻可变结构域的三个互补决定区(CDRs)。由于构架4区(FR4)并不是种系基因的可变区的部分,则对该位置的比对单独地进行。对于重链选择JH6区,对于轻链选择JK4区。设计的免疫球蛋白结构域的分子建模揭示一些位置潜在地需要鼠氨基酸残基而非人残基,该位置在CDR区外侧。向人构架中再引入鼠氨基酸残基将生成所谓的回复突变。例如,位于Kabat位点94上的人受体氨基酸残基(IGHV3-15中的苏氨酸)回复突变为变体之一中的丝氨酸残基。设计人源化的抗体变体,其包括或忽略回复突变,来证明需要这些回复突变的假说。
在225.28S轻链的序列中,统计学分析揭示FR2中“稀有”残基的整个序列片段。这些是Glu45,Pro46,Leu48,和Phe49。3D分子模型显示所有这些残基都与轻链CDRs有强烈的相互作用,并且与VH的CDR3也有强烈的相互作用(除了Leu48)。在这一建模步骤中,还发现Pro46与VHCDR3有重要接触。为了研究这些残基的重要性,并入它们作为回复突变成人源化VL构建体。将包含回复突变的人源化构建体与根据下述“混合构架”方法制备的人源化构建体比较它们结合抗原的能力。
B.混合构架方法
为了避免在人受体构架的关键性位点(对于保持良好的抗原结合亲和性或抗体功能是关键性的)上引入回复突变,研究了功能性人源化抗体的构架区1(FR1),构架区1(FR1)和2(FR2)一起,或FR3是否能够被人抗体序列所替代,所述人抗体序列在天然人种系序列的那些重要位点上已经具有供体残基,或功能等同残基。为此目的,将鼠225.28S序列的VH构架FR1、FR2和FR3个别地与人种系序列相比对。在此,最高的序列同一性并不重要,并且未被用于选择受体构架,但是却假定几个关键性残基的匹配更加重要。那些关键性残基包含残基27,28,和30(Kabat编号方式),其位于Kabat的CDR1定义之外,但经常涉及抗原结合。在此,最高的序列同一性不重要,不用于选择受体构架,而几个关键残基的匹配被认为更重要。那些关键性残基包含所谓的规范残基,并且是在位点27,28,和30(Kabat编号)上的那些,其位于Kabat的CDR1定义范围外,但是经常参与抗原结合。此外,关键残基是显示与CDRs具有重要作用的那些残基,可以利用分子建模来确定。将IMGT序列IGHV1-58(登记号M29809),和IGHV1-46(登记号X92343)选作合适的候选物来替代FR1、FR2或FR3。简言之,将IGHV1-46用作所有构架的受体,因而生成单一的构架受体,其在氨基酸水平上与供体FR区有53%的同一性。还将IGHV1-46用作FR1和FR2受体,而将IGHV1-58用作FR3受体。还将IGHV3-7用作FR1和FR2受体,而将IGHV3-15用作FRI,FR2,和/或FR3受体。将IGHV3-7与IGHV3-15混合的基本原理是在FR1和FR2中具有优化的同源性,并且在Kabat位置71和94上具有匹配残基。在所有这些构建体中对于FR4区使用JH6。
关于高同源性方法如上所述,人源化轻链的FR2区将需要一些努力。我们引入了其它种系抗体的几个FR2区,即IGKV2-28(登记号X63397)和IGKV2D-30(登记号X63402)。显而易见,“稀有”残基在人种系系统中很少发现。因而,源自人外周B-细胞而且并入了脯氨酸46残基的非种系抗体的FR2(Gen Bank登记号AAA17574),也包括在受体FR集合中。
为了仔细检查去除CDR区内的轻链构建体中的“稀有”残基的想法,构建变体M-KV10,M-KV11,和M-KV12。它们全部都起始自M-KV9设计。M-KV10通过人精氨酸来替代鼠Lys24,还通过人亮氨酸来替代Val33。M-KV11只通过人亮氨酸来替代鼠Val33。M-KV12通过人VK1来源的Leu-Gln-Ser三肽来替三氨基酸片段Arg-Tyr-Thr(54-56)。
在已经设计了蛋白质序列后,如下细述地合成编码这些蛋白的DNA序列。利用这些方法可以在大多数重链构建体中避免回复突变,以便保持抗原结合的良好水平。
在结果部分解释混合构架构建体的次序排列和推理。
C.抗体基因的合成
在已经设计了人源化抗体V区的氨基酸序列之后,必需生成DNA序列。在人种系序列的数据库(例如the International ImmunogeneticsInformation System maintained by the European B ioinformatics Institute,http://imgt.cines.fr)中发现了单个构架区的DNA序列资料。由鼠225.28S抗体的公布的蛋白质序列推导出CDR区的DNA序列信息。Neri等,J.Invest.Dermatol.107(2):164-170(1996)。用这些序列,基本上组装出完整的DNA序列。具有这一DNA序列数据,通过引入沉默突变,产生限制性核酸内切酶的识别位点,在虚拟序列(virtual sequence)中引入诊断性限制性酶切位点。为了获得物理的DNA链,进行基因合成(例如,Wheeler等1995)。在此方法中,由目标基因设计寡核苷酸,从而使一系列寡核苷酸源自编码链,而另一系列源自非编码链。每个寡核苷酸的3’和5’端(除了一行中的第一个和最后一个)总是显示与源自相反链的两条引物的互补序列。当将这些寡核苷酸放入适于任何热稳定聚合酶的反应缓冲液中,并加入Mg2+,dNTPs和DNA聚合酶时,每个寡核苷酸都从其3’端延伸。新形成的一条引物的3’端随后与相反链的下一个引物退火,并且在适于模板依赖型DNA链延伸的条件下进一步延伸其序列。将最终产物克隆入常规载体中以便在大肠杆菌中进行增殖。
D.抗体生产
将人重链(SEQ ID NO:25)和轻链(SEQ ID NO:53)前导序列(用于分泌)加至以上可变区序列的上游。利用标准分子生物学技术,分别将用于重链的人IgGl的恒定区和用于轻链的人κ恒定区加入到可变区的下游。将得到的全长人源化抗体重链和轻链DNA序列亚克隆到哺乳动物表达载体(一种对于轻链的,一种对于重链的),在MPSV启动子控制之下和合成的聚腺苷酸位点上游,每个载体携带EBV OriP序列。
通过利用磷酸钙转染方法将HEK293-EBNA细胞与哺乳动物抗体重链和轻链表达载体共转染来生产抗体。通过磷酸钙方法转染指数生长的HEK293-EBNA细胞。利用添加了10%FCS的DMEM培养基将细胞在T烧瓶中培养为粘附的单层培养物,并且当它们介于50和80%汇合之间时进行转染。对于T75烧瓶的转染,在转染前24小时将8百万个细胞接种于添加了FCS(10%V/V终浓度),250μg/ml新霉素的14ml DMEM培养基中,并将细胞于37℃置于具有5%CO2气氛的培养箱中过夜。对于每个待转染的T75烧瓶,通过将在轻链和重链表达载体之间平分的47μg总质粒载体DNA,235μl的1M CaCl2溶液混合,并加水至终体积469μl而制备DNA、CaCl2和水的溶液。向此溶液中加入469μl的50mM HEPES,280mM NaCl,1.5mM Na2HPO4溶液pH7.05,立即混合10秒并留置于室温20秒。用添加了2%FCS的12ml DMEM稀释混悬液,并加入到T75中代替现有的培养基。将细胞于37℃,5%CO2温育约17到20小时,随后以12ml DMEM,10%FCS替换培养基。在转染后的第5-7天,收集条件培养基,于1200rpm离心5分钟,随后于4000rpm第二次离心10分钟并保持于4℃。通过蛋白质A层析,随后通过阳离子交换层析,和最后的大小排除层析步骤在Superdex200柱(Amersham Pharmacia)上交换缓冲液至磷酸盐缓冲溶液并收集纯化的单体IgGl抗体来纯化分泌的抗体。利用分光光度计由280nm上的吸光度来估计抗体浓度。在pH6.7的25mM磷酸钾、125mM氯化钠,100mM甘氨酸溶液中对抗体进行配制。
E.人源化抗体的糖基改造
通过抗体表达载体与GnT-III糖基转移酶表达载体一起,或与GnT-III表达载体及高尔基体甘露糖苷酶II表达载体一起共转染到哺乳动物细胞中进行人源化变体的糖基改造。具有GnTIII活性的多肽是一种融合多肽,其包含异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域,所述多肽是根据美国专利申请公开号20040241817A1中教导的方法制备的,特此将其全部内容并入作为参考。如上对于未经糖基改造的抗体所述的那样对糖基改造的抗体进行纯化和配制。如下所述通过MALDI/TOF-MS对附着在抗体Fc区上的寡糖进行分析。可以用本发明的ABM进行的糖基改造方法已经在美国专利号6,602,684和临时美国专利申请号60/441,307和WO2004/065540中作了更加详细的描述,将每一篇的全部内容都并入作为参考。本发明的经糖基改造的ABM在Fc区具有减少量的岩藻糖残基。还可以根据EP1176195A1中披露的技术来对本发明的ABM进行糖基改造以便在Fc区具有减少量的岩藻糖残基,将其全部内容并入作为参考。
实施例2
材料和方法
A.寡糖分析
1.溶液中抗体的寡糖释放方法
将介于40和50μg之间的抗体与2.5mU的PNGaseF(Glyko,U.S.A.)在2mM Tris,pH7.0中于25微升的最终体积混合,并将混合物于37℃温育3小时。
2.用于MALDI/TOF-MS的样品制备
在加入醋酸至终浓度150mM后将含有释放的寡糖的酶消化物于室温再温育3h,并随后通过塞入micro-bio-spin层析柱(BioRad,Switzerland)的0.6ml阳离子交换树脂(AG50W-X8树脂,氢形式,100-200网眼,BioRad,Switzerland)以去除阳离子和蛋白质。将1μl的得到的样品施用到不锈钢目标板上,并在所述板上与1μl的sDHB基质混合。通过溶解2mg的2,5-二羟基苯甲酸加0.1mg的5-甲氧基水杨酸于1ml的乙醇/10mM氯化钠水溶液1∶1(v/v)中来制备sDHB基质。将样品风干,施用0.2微升的乙醇,最后使样品进行空气下的再结晶。
3.MALDI/TOF-MS
用来获得质谱的MALDI-TOF质谱仪是Voyager Elite(PerspectiveBiosystems)。以线性配置操作该仪器,其中具有20kV的加速和80ns延迟。使用寡糖标准物的外部校准进行离子的质量赋值。将来自200次激光射击的光谱相加以获得最终的光谱。典型的光谱显示于图8中。
B.抗原结合测定
利用基于流式细胞术的测定法,在A375人黑素瘤细胞系上对纯化的单体人源化抗体变体测定与人HMW-MAA/MCSP抗原的结合。将200,000个细胞(在180μl FACS缓冲液中(包含2%FCS和5mM EDTA的PBS)转移到5ml聚苯乙烯管中并加入20μl的10倍浓缩的抗-MCSP抗体(一级抗体)样品(1-5000ng/ml终浓度)或仅加入PBS。在轻柔混合样品后,将管在4℃避光温育30分钟。随后,将样品用FACS缓冲液洗涤2次,并在300g沉淀3分钟。将上清液吸去,并将细胞吸收在50μl FACS缓冲液中,加入2μl二级抗体(抗-Fc-特异性F(ab’)2-FITC片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories,USA)),并将管在4℃温育30分钟。样品用FACS缓冲液洗涤2次并吸收在500μl的FACS缓冲液中以通过流式细胞术进行分析。通过用几何平均荧光针对抗体浓度作图来测定结合。
C.抗体依赖性细胞毒作用测定
将人外周血单核细胞(PBMC)用作效应细胞并利用Histopaque-1077(Sigma Diagnostics Inc.,St.Louis,MO63178USA)以及基本上按照生产商的说明书进行制备。简言之,以肝素化的注射器从健康志愿者体内取静脉血。用PBS(不含Ca++或Mg++)将血液稀释1∶0.75-1.3并铺于Histopaque-1077上。将梯度于室温(RT)以400x g不间断离心30分钟。收集含有PBMC的中间相并用PBS进行洗涤(来自两种梯度的每一种的细胞50ml)并通过于RT以300x g离心10分钟进行收集。在用PBS重悬沉淀物后,对PBMC计数并通过于RT以200x g离心10分钟进行第二次洗涤。随后将细胞重悬于适当的培养基中以便进行接下来的操作。
对于PBMC细胞而言,用于ADCC测定的效应细胞与靶标的比率是100∶1和25∶1。于适当的浓度在AIM-V培养基中制备效应细胞以便加入50微升/圆底96孔板的孔。一组靶细胞是来自黑素瘤患者的在包含10%FCS的DMEM中培养的表达人MCSP的细胞(例如,A375,A2058,或SK-Mel5)。另一组靶细胞应该是周细胞的模型,是人主动脉平滑肌细胞,称为HuSMC(获自Promocell,Heidelberg德国)。将HuSMC细胞培养在由Promocell供应的培养基中。在PBS中洗涤靶细胞,计数并以0.3百万/ml重悬于AIM-V中以便以100μl/微孔加入30000个细胞。将抗体稀释在AIM-V中,加入50μl到预铺板的靶细胞中并让其于RT结合靶标10分钟。随后加入效应细胞并于37℃在含有5%CO2的加湿气氛中将板对于黑素瘤细胞和HuSMC分别温育过夜和温育4小时。通过使用细胞毒性检测试剂盒(Roche Diagnostics,Rotkreuz,Switzerland)测量由受损细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)来评估靶细胞的杀伤。在4小时的温育后将板于800xg进行离心。将来自每孔中的100μl上清液转移到新的透明平底96孔板中。每孔加入100μl来自试剂盒的颜色底物缓冲液。使用SOFTmax PRO软件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA94089,USA),在ELISA读数器中于490nm测定颜色反应的Vmax值至少10分钟。由只包含靶和效应细胞但不包含抗体的孔测定自发的LDH释放。由只包含靶细胞和1%Triton X-100的孔测定最大释放。将特异性抗体介导的杀伤百分比计算如下:((x-SR)/(MR-SR)*100,其中x是在特定抗体浓度下的Vmax的平均值,SR是自发释放的Vmax的平均值,而MR是最大释放的Vmax的平均值。
D.结果和讨论
分析三个起始重链构建体M-HHA,M-HHB,和M-HHC以及三个起始轻链构建体M-KV1,M-KV2,和M-KV3与其相关抗原,MCSP的结合性质。为此,将人源化重链构建体与鼠轻链(mVL)共表达,将人源化轻链与鼠重链(mVH)共表达。结果显示在图1中,其显示当与鼠VL组合时,两个重链构建体M-HHA和M-HHB或多或少保持它们的结合性质。与此相反,构建体M-HHC明显失去了其结合能力。M-HHC与M-HHB的不同仅存在于两个改变,即Gly49Ala,和Glu50Asn。因为在位点49上的丙氨酸实际上是鼠源的,在位点50上的天冬酰胺被严格限制。因此,鼠谷氨酸50在所有的另外的变体中保持。这意味着,IGHV3-15构架满足规范和其它关键残基残基的所有要求(注意位点50是Kabat CDR2的部分)。与其鼠的对应物相比,人源化轻链构建体M-KV1和M-KV2显示大大减少的结合活性。而构建体M-KV3显示类似于鼠轻链的结合性质。这意味着突变Ile21Val,Leu46Pro,Ile48Leu,和Tyr49Phe恢复了以前失活的变体M-KV2的结合。这些氨基酸残基协同作用或单一的残基负责全部的效果。
图2显示“低同源性”构建体M-HLA,M-HLB,和-HLC组合以轻链构建体M-KV3的结合数据。显而易见,这三种变体的结合被完全破坏,导致了这样的结论,即一个或多个关键残基(包括规范的)在人源化VH构建体中是不令人满意的。因为预期残基27和30负责结合活性的一些“精细调控”而不是完全破坏结合特性,预期重要的残基位于构架3内。两个明显的候选物似乎是225.28S序列的Thr93,和Ser94。如果使用IGHV1-58FR3序列,那么推定Ala93和Ala94为减少抗原结合活性负责。其它FR残基的影响不能被排除在外,但是基于数据分析以及225.28S抗体的3D结构的分子模型的分析似乎相当不可能。在图7中显示对于残基27和30的重要性的支持,因为构建体M-HLD保持了一些残余的结合活性,显示残基Phe27和Ser30的引入可以影响结合性质。
为了指出轻链的关键残基,产生了构建体M-KV4,5,6,7,8,和9。M-KV4去除了M-KV3的一个回复突变(Val21Ile)。M-KV5使用新的FR2(IGKV2-28;登记号X63397),其具有天然存在的Gln42和Ser43,以及类似于(在某种程度上)鼠Glu45的Gln45。M-KV6具有IGKV2D-30(登记号X63402)FR2序列。M-KV7是M-KV1的FR2区的Leu46Pro衍生物(因此将一个回复突变引入到FR2中)。M-KV8是M-KV1的FR2区的Tyr49Phe变体(因此将另一个回复突变引入到FR2中)。当与M-HHB重链配对时,将这些轻链构建体的结合数据的结果显示在图3中。与ch-225.28S抗体相比,构建体M-KV4已经获得了对其抗原的亲和性。构建体M-KV5和6还没有恢复它们的功能性质,显示被引入它们的突变是不相关的。M-KV7抗体显示与ch-225.28S轻链一样好的结合特性,显示一个单一的点突变(Leu46Pro)是必要的并且足以恢复以前失活的轻链构建体M-KV1的全部的结合活性。
为了研究产生人源化重链的杂合构架构建体的可能性,我们用IGHV3-15(登记号X92216)替换M-HLB和M-HLC的FR1和FR2区,产生构建体M-HLE1和M-HLE2。这两个构建体的不同在于这样的事实,即残基61-64(其是如Kabat所定义的CDR2的编号,但不是由Chothia所定义)是人(M-HLE1)或鼠(M-HLE2)源的。这些构建体将告诉我们使构建体M-HLB和C失活的关键残基是否位于FR1和FR2区域内,或如所预期的在FR3区域内。新的构建体将包含来自1和3类VH家族的构架区。因此稳定性可以增加,尽管在3D分子模型的分析中,其没有明显的来源可以被鉴定。同时,将IGHV3-15(其被证实在M-HHB构建体中具有功能)的FR3与IGHV3-7序列的FR1和2区组合,导致形成构建体M-HLF和M-HLG。M-HLF的CDR1完全被人源化,并且与M-HLG的不同仅存在于位点31和35。M-HLG在这些位点具有鼠序列。当将重链构建体M-HLE1,E2,F,和G与轻链构建体M-KV4配对时,图4显示抗原结合实验的结果。构建体M-HLE1,和M-HLE2显示一些残余的结合,显示超过其前体M-HLB和C的一些提高。仍然,这种结合远不是有用的。构建体M-HLF几乎没有结合,其可以通过引入两个突变Ser31Asn和Ser35Asn(M-HLG)来恢复。类似于M-HHB,M-HLG对于抗原显示与母体抗体ch-225.28S相比相同的或甚至更高的亲和性。此外,这还显示在FR3中的一些关键残基的重要性(位点93苏氨酸和94丝氨酸,或如上提及的苏氨酸)。尽管由M-HLE1和2变体所证实,在FR1和2的残基(例如苯丙氨酸27或苏氨酸30)上存在一定程度的重要性。
最终,通过将非种系抗体(Gen Bank登记号AAA17574)的FR2引入M-KV2构建体来产生轻链变体M-KV9。这种受体FR来自人外周B细胞(Weber等J Clin Invest.93(5):2093-2105.(1994))。这种抗体被重新排列,并且来自VK3家族。这种轻链与M-HHB,或与M-HLG重链共表达并且对其结合功能进行分析。该结果显示在图5中。M-KV9,与M-HLG一起显示优越的结合性质,与M-HHB组合,M-KV9也显示良好的结合数据,尽管与ch-225.28S相比,稍微减少。图7显示在轻链的CDR1和DR2中去除稀有残基不是可行的,因为构建体M-KV10到12都显示减少的抗原结合活性。
E.“稀有”残基的分析
通过定义,“稀有”残基是在相应种系序列总体中以等于或少于1%的频率存在的那些残基。
在225.28S VH序列中,发现两个“稀有”残基:甘氨酸88和丝氨酸94。甘氨酸88可以被“常见的”人残基丙氨酸替换。丝氨酸94似乎可以被苏氨酸替换,但是不被精氨酸或丙氨酸替换。在规范残基上的列表数据预期在Kabat位点94上的丙氨酸和精氨酸将导致在CDR1中的相同规范环构象,如当丝氨酸存在时(http://www.rubic.rdg.ac.uk/abeng/canonicals.html)。该观点仅考虑了规范的环结构,而没有考虑可能涉及到对于一些规范残基观察到的抗原结合;例如在位点94上(见规范分析)。
F.ADCC实验的结果
图6显示在通过人PBMC细胞的抗体介导的细胞杀伤中,225.28S抗体的人源化的M-HLG/M-KV9构建体的功效。靶细胞是人A2058细胞,并且可以观察到在抗体介导的细胞杀伤中强烈的增加。当将人平滑肌细胞用作靶细胞时,可以观察到相同的效果。这些细胞是原代细胞,并且不是来自肿瘤。它们作为周细胞的靶向的模型,因为那些平滑肌细胞是在新血管系统中的周细胞的一种前体细胞。在这些实验中,一种差异是值得注意的。黑素瘤细胞与平滑肌细胞相比,显示对于PBMC诱导的杀伤的更高程度的抗性。为此,将靶标与抗体和效应物一起温育24小时,而对于平滑肌细胞,在4小时内获得了大约相同的杀伤。在图11中显示平滑肌细胞的抗体介导的细胞杀伤。
对于神经胶质瘤细胞系LN229,可以清楚地显示(图12):人源化抗-MCSP抗体的糖基改造可以强烈增加其在抗体介导的细胞的细胞毒性(ADCC)中的潜能。未修饰的抗体几乎不显示任何活性,而相同的抗体的G2形式引起显著水平的靶细胞的杀伤。这证实糖基改造可以增加以前显示不令人满意的活性的抗体的效能。
序列表
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<223>IgGl
<400>110
Claims (193)
1.一种分离的多核苷酸,其包含:
a.选自由下列各项组成的组的序列: SEQ ID NO:61;SEQ ID NO:63;SEQ ID NO:65;SEQ ID NO:67;SEQ ID NO:69;SEQ ID NO:71;SEQ IDNO:73;SEQ ID NO:75;和
b.选自由下列各项组成的组的序列:SEQ ID NO:77;SEQ ID NO:79;SEQ ID NO:81;SEQ ID NO:83;SEQ ID NO:85;SEQ ID NO:87;SEQ IDNO:89;SEQ ID NO:91;和SEQ ID NO:93;和
c.SEQ ID NO:95。
2.一种分离的多核苷酸,其包含
a.选自由下列各项组成的组的序列:SEQ ID NO:97;SEQ ID NO:99;和SEQ ID NO:101;和
b.SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:105;和
c.SEQ ID NO:107。
3.按照权利要求1或权利要求2的分离的多核苷酸,其编码融合多肽。
4.一种分离的多核苷酸,其包含选自由下列各项组成的组的序列:SEQID No:3;SEQ ID No:5;SEQ ID No:7;SEQ ID No:9;SEQ ID No:11;SEQ IDNo:13;SEQ ID No:15;SEQ ID No:17;SEQ ID No:19;SEQ ID No:21;和SEQ ID No:23。
5.按照权利要求4的分离的多核苷酸,其中所述分离的多核苷酸包含SEQID NO:23。
6.按照权利要求4的分离的多核苷酸,其中所述分离的多核苷酸包含SEQID NO:5。
7.按照权利要求4的分离的多核苷酸,其中所述分离的多核苷酸包含SEQID NO:3。
8.一种分离的多核苷酸,其包含选自由下列各项组成的组的序列:SEQID No:29,SEQ ID No:31,和SEQ ID No:33;SEQ ID NO:35;SEQ IDNO:37;SEQ ID NO:39;SEQ ID NO:41;SEQ ID NO:43;SEQ ID NO:45;SEQ ID NO:47;SEQ ID NO:49;SEQ ID NO:51。
9.按照权利要求8的分离的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO:45。
10.按照权利要求4或8的分离的多核苷酸,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
11.一种分离的多核苷酸,其包含
a)编码具有选自由下列各项组成的组的序列的多肽的序列:SEQ IDNo:2;SEQ ID No:4;SEQ ID No:6;SEQ ID No:8;SEQ ID No:10;SEQ IDNo:12;SEQ ID No:14;SEQ ID No:16;SEQ ID No:18;SEQ ID No:20;SEQID No:22;SEQ ID No:24;和
b)编码具有选自由下列各项组成的组的序列的多肽的序列:SEQ IDNO:28 SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36;SEQ ID NO:38;SEQ ID NO:40;SEQ ID NO:42;SEQ ID NO:44;SEQ IDNO:46;SEQ ID NO:48;SEQ ID NO:50;SEQ ID NO:52。
12.一种分离的多核苷酸,其包含与选自由下列各项组成的组的序列具有至少80%同一性的序列:SEQ ID No:1;SEQ ID No:3;SEQ ID No:5;SEQID No:7;SEQ ID No:9;SEQ ID No:11;SEQ ID No:13;SEQ ID No:15;SEQID No:17;SEQ ID No:19;SEQ ID No:21;和SEQ ID No:23,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
13.一种分离的多核苷酸,其包含与选自由下列各项组成的组的序列具有至少80%同一性的序列:SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31;SEQ ID NO:33;SEQ ID NO:35;SEQ ID NO:37;SEQ ID NO:39;SEQ IDNO:41;SEQ ID NO:43;SEQ ID NO:45;SEQ ID NO:47;SEQ ID NO:49;和SEQ ID NO:51,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
14.按照权利要求12的分离的多核苷酸,其包含与选自由下列各项组成的组的序列具有至少85%同一性的序列:SEQ ID No:1;SEQ ID No:3;SEQID No:5;SEQ ID No:7;SEQ ID No:9;SEQ ID No:11;SEQ ID No:13;SEQID No:15;SEQ ID No:17;SEQ ID No:19;SEQ ID No:21;和SEQ ID No:23,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
15.按照权利要求13的分离的多核苷酸,其包含与选自由下列各项组成的组的序列具有至少85%同一性的序列:SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31;SEQ ID NO:33;SEQ ID NO:35;SEQ ID NO:37;SEQ IDNO:39;SEQ ID NO:41;SEQ ID NO:43;SEQ ID NO:45;SEQ ID NO:47;SEQ ID NO:49;和SEQ ID NO:51,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
16.按照权利要求14的分离的多核苷酸,其包含与选自由下列各项组成的组的序列具有至少90%同一性的序列:SEQ ID No:1;SEQ ID No:3;SEQ IDNo:5;SEQ ID No:7;SEQ ID No:9;SEQ ID No:11;SEQ ID No:13;SEQ IDNo:15;SEQ ID No:17;SEQ ID No:19;SEQ ID No:21;和SEQ ID No:23,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
17.按照权利要求15的分离的多核苷酸,其包含与选自由下列各项组成的组的序列具有至少90%同一性的序列:SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31;SEQ ID NO:33;SEQ ID NO:35;SEQ ID NO:37;SEQ IDNO:39;SEQ ID NO:41;SEQ ID NO:43;SEQ ID NO:45;SEQ ID NO:47;SEQ ID NO:49;和SEQ ID NO:51,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
18.按照权利要求16的分离的多核苷酸,其包含与选自由下列各项组成的组的序列具有至少95%同一性的序列:SEQ ID No:1;SEQ ID No:3;SEQ IDNo:5;SEQ ID No:7;SEQ ID No:9;SEQ ID No:11;SEQ ID No:13;SEQ IDNo:15;SEQ ID No:17;SEQ ID No:19;SEQ ID No:21;和SEQ ID No:23,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
19.按照权利要求17的分离的多核苷酸,其包含与选自由下列各项组成的组的序列具有至少95%同一性的序列:SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQID NO:31;SEQ ID NO:33;SEQ ID NO:35;SEQ ID NO:37;SEQ ID NO:39;SEQ ID NO:41;SEQ ID NO:43;SEQ ID NO:45;SEQ ID NO:47;SEQ IDNO:49;和SEQ ID NO:51,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
20.按照权利要求18的分离的多核苷酸,其包含与选自由下列各项组成的组的序列具有至少99%同一性的序列:SEQ ID No:1;SEQ ID No:3;SEQ IDNo:5;SEQ ID No:7;SEQ ID No:9;SEQ ID No:11;SEQ ID No:13;SEQ IDNo:15;SEQ ID No:17;SEQ ID No:19;SEQ ID No:21;和SEQ ID No:23,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
21.按照权利要求19的分离的多核苷酸,其包含与选自由下列各项组成的组的序列具有至少99%同一性的序列:SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQID NO:31;SEQ ID NO:33;SEQ ID NO:35;SEQ ID NO:37;SEQ ID NO:39;SEQ ID NO:41;SEQ ID NO:43;SEQ ID NO:45;SEQ ID NO:47;SEQ IDNO:49;和SEQ ID NO:51,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
22.一种分离的多核苷酸,其包含
a)编码具有选自由下列各项组成的组的序列的多肽的序列:SEQ IDNo:2;SEQ ID No:4;SEQ ID No:6;SEQ ID No:8;SEQ ID No:10;SEQ IDNo:12;SEQ ID No:14;SEQ ID No:16;SEQ ID No:18;SEQ ID No:20;SEQID No:22;和SEQ ID No:24;和
b)来自除鼠物种以外的物种的序列,所述序列编码具有抗体Fc区域的序列的多肽,或其片段。
23.一种分离的多核苷酸,其包含
a)编码具有选自由SEQ ID No:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32;SEQ ID NO:34;SEQ ID NO:36;SEQ ID NO:38;SEQ ID NO:40;SEQ IDNO:42;SEQ ID NO:46;SEQ ID NO:48;和SEQ ID NO:52组成的组的序列的多肽的序列;和
b)来自除小鼠以外的物种的序列,所述序列编码具有抗体轻链恒定结构域的序列的多肽,或其片段。
24.一种分离的多核苷酸,其编码具有选自由下列各项组成的组的序列的多肽:SEQ ID No:4;SEQ ID No:6;SEQ ID No:8;SEQ ID No:10;SEQ IDNo:12;SEQ ID No:14;SEQ ID No:16;SEQ ID No:18;SEQ ID No:20;SEQID No:22;和SEQ ID No:24。
25.一种分离的多核苷酸,其编码具有选自由下列各项组成的组的序列的多肽:SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32;SEQ ID NO:34;SEQ ID NO:36;SEQID NO:38;SEQ ID NO:40;SEQ ID NO:42;SEQ ID NO:46;SEQ ID NO:48;和SEQ ID NO:52。
26.一种表达载体,其包含按照权利要求1-25中任一项的分离的多核苷酸。
27.权利要求26的载体,其中所述载体编码抗体的至少轻或重链。
28.权利要求27的载体,其中所述载体编码抗体的轻和重链两者。
29.权利要求28的载体,其是多顺反子载体。
30.一种宿主细胞,其包含权利要求26-28任一项的表达载体。
31.一种宿主细胞,其包含按照权利要求1-25中任一项的分离的多核苷酸。
32.按照权利要求4或8的分离的多核苷酸,其还包含编码人抗体轻或重链恒定区的序列。
33.一种宿主细胞,其能够表达按照权利要求12的第一多核苷酸和包含编码抗体轻链的可变区的序列的第二多核苷酸。
34.一种宿主细胞,其能够表达按照权利要求13的第一多核苷酸和包含编码抗体重链的可变区的序列的第二多核苷酸。
35.一种融合多肽,其包含选自由下列各项组成的组的序列:SEQ ID No:2;SEQ ID No:4;SEQ ID No:6;SEQ ID No:8;SEQ ID No:10;SEQ ID No:12;SEQ ID No:14;SEQ ID No:16;SEQ ID No:18;SEQ ID No:20;SEQ ID No:22;和SEQ ID No:24,或其变体。
36.一种融合多肽,其包含选自由下列各项组成的组的序列:SEQ IDNO:28;SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32;SEQ ID NO:34;SEQ ID NO:36;SEQ ID NO:38;SEQ ID NO:40;SEQ ID NO:42;SEQ ID NO:46;SEQ IDNO:48;和SEQ ID NO:52,或其变体。
37.一种抗原结合分子,其包含权利要求35或权利要求36的融合多肽。
38.按照权利要求37的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子选择性结合于人MCSP。
39.一种抗原结合分子,其包含权利要求35的融合多肽和权利要求36的融合多肽。
40.权利要求37-39任一项的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子是抗体。
41.权利要求40的抗原结合分子,其中所述抗体是人源化的。
42.权利要求40的抗原结合分子,其中所述抗体是灵长类化的。
43.权利要求37的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子是抗体片段,其包含等价于抗体的Fc区的区域。
44.权利要求37的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子是scFv,二抗体,三抗体,Fab或Fab2片段。
45.权利要求40的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子是重组抗体。
46.权利要求45的抗原结合分子,其中所述重组抗体是人源化的。
47.权利要求40的抗原结合分子,其中所述重组抗体包含人Fc区。
48.权利要求47的抗原结合分子,其中所述人Fc区是人IgG Fc区。
49.按照权利要求40-48任一项的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子已经被糖基改造以具有Fc区,该Fc区具有修饰的寡糖。
50.按照权利要求49的抗原结合分子,其中所述Fc区已经被修饰以与非糖基改造的抗原结合分子相比具有减少数量的岩藻糖残基。
51.按照权利要求49的抗原结合分子,其中所述Fc区与非糖基改造的抗原结合分子相比具有增加比例的分叉寡糖。
52.按照权利要求51的抗原结合分子,其中所述分叉寡糖主要是分叉复合物。
53.按照权利要求49的抗原结合分子,其中所述糖基改造的抗原结合分子与非糖基改造的抗原结合分子相比,在所述抗原结合分子的Fc区中具有增加比例的分叉的、非岩藻糖基化的寡糖。
54.按照权利要求49的抗原结合分子,其中所述糖基改造的抗体与非糖基改造的抗原结合分子相比,在Fc区中具有GlcNAc残基与岩藻糖残基的增加的比率。
55.按照权利要求53的抗原结合分子,其中所述分叉的、非岩藻糖基化的寡糖主要是杂合形式。
56.按照权利要求53的抗原结合分子,其中所述分叉的、非岩藻糖基化的寡糖主要是复合形式。
57.按照权利要求49的抗原结合分子,其中在所述Fc区中至少20%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
58.按照权利要求57的抗原结合分子,其中在所述Fc区中至少30%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
59.按照权利要求58的抗原结合分子,其中在所述Fc区中至少35%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
60.按照权利要求59的抗原结合分子,其中在所述多肽的Fc区中至少40%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
61.按照权利要求60的抗原结合分子,其中在所述Fc区中至少50%的寡糖是分叉的。
62.按照权利要求61的抗原结合分子,其中在所述Fc区中至少60%的寡糖是分叉的。
63.按照权利要求62的抗原结合分子,其中在所述Fc区中至少70%的寡糖是分叉的。
64.按照权利要求63的抗原结合分子,其中在所述Fc区中至少80%的寡糖是分叉的。
65.按照权利要求64的抗原结合分子,其中在所述Fc区中至少90%的寡糖是分叉的。
66.按照权利要求49的抗原结合分子,其中在所述Fc区中至少50%的寡糖是非岩藻糖基化的。
67.按照权利要求66的抗原结合分子,其中在所述Fc区中至少60%的寡糖是非岩藻糖基化的。
68.按照权利要求67的抗原结合分子,其中在所述Fc区中至少70%的寡糖是非岩藻糖基化的。
69.按照权利要求68的抗原结合分子,其中在所述Fc区中至少75%的寡糖是非岩藻糖基化的。
70.一种生产抗原结合分子的方法,所述抗原结合分子能够与鼠225.28S单克隆抗体竞争结合人MCSP,所述方法包括:
a)在容许编码所述抗原结合分子的所述多核苷酸表达的条件下培养权利要求30或权利要求31的宿主细胞;和
b)回收所述抗原结合分子。
71.权利要求70的方法,其中所述抗原结合分子是抗体。
72.权利要求71的方法,其中所述抗原结合分子是人源化抗体。
73.一种药物组合物,其包含按照权利要求37-69任一项的抗原结合分子和药用载体。
74.权利要求73的药物组合物,其中所述组合物还包含佐剂。
75.一种在样品或受试者中鉴定表达MCSP的细胞的方法,其包含向所述样品或受试者施用按照权利要求37-69任一项的抗原结合分子。
76.按照权利要求75的方法,其中所述鉴定用于诊断目的。
77.按照权利要求75的方法,其中所述鉴定用于治疗目的。
78.一种在需要其的受试者中治疗MCSP-介导的细胞增殖性疾病的方法,其包含向所述受试者施用治疗有效量的权利要求73或权利要求74的药物组合物。
79.按照权利要求78的方法,其中所述受试者是人。
80.按照权利要求78的方法,其中所述治疗包含阻断MCSP-介导的相互作用,其选自由下列各项组成的组:MCSP配体结合,黑素瘤细胞黏附,周细胞活化,对于纤连蛋白的趋化反应,在ECM蛋白上的细胞扩散,FAK信号转导和ERK信号转导。
81.一种宿主细胞,其被糖基改造以足以修饰在由所述宿主细胞产生的第二多肽的Fc区中的寡糖的量来表达至少一种核酸,所述至少一种核酸编码具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的第一多肽,其中所述第二多肽是按照权利要求37-69任一项的抗原结合分子。
82.权利要求81的宿主细胞,其中所述宿主细胞还表达具有甘露糖苷酶II活性的多肽。
83.权利要求81的宿主细胞,其中所述第一多肽还包含高尔基体定居多肽的定位结构域。
84.权利要求81的宿主细胞,其中所述抗原结合分子是重组抗体。
85.权利要求81的宿主细胞,其中所述抗原结合分子是抗体片段。
86.权利要求81的宿主细胞,其中所述抗原结合分子包含人IgG的Fc区或等价于人IgG的Fc区的区域
87.权利要求81的宿主细胞,其中由所述宿主细胞产生的所述抗原结合分子显示与由非糖基改造的宿主细胞产生的抗原结合分子相比,增加的Fc受体结合亲和性。
88.权利要求81的宿主细胞,其中由所述宿主细胞产生的所述抗原结合分子显示与由非糖基改造的宿主细胞产生的抗原结合分子比较,增加的效应子功能。
89.按照权利要求83的宿主细胞,其中所述第一多肽包含β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III的催化结构域。
90.按照权利要求83的宿主细胞,其中所述第一多肽还包含异源高尔基体定居多肽的高尔基体定位结构域。
91.按照权利要求90的宿主细胞,其中所述高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶II的定位结构域。
92.按照权利要求90的宿主细胞,其中所述高尔基体定位结构域是β(1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶I的定位结构域。
93.按照权利要求90的宿主细胞,其中所述高尔基体定位结构域是β(1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶II的定位结构域。
94.按照权利要求90的宿主细胞,其中所述高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶I的定位结构域。
95.按照权利要求90的宿主细胞,其中所述高尔基体定位结构域是α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。
96.按照权利要求88的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的Fc-介导的细胞细胞毒性。
97.按照权利要求88的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的与NK细胞的结合。
98.按照权利要求88的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的与巨噬细胞的结合。
99.按照权利要求88的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的与多形核细胞的结合。
100.按照权利要求88的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的与单核细胞的结合。
101.按照权利要求88的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的定向信号传导诱导的程序性细胞死亡。
102.按照权利要求88的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的树突细胞成熟。
103.按照权利要求88的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的T细胞引发。
104.按照权利要求87的宿主细胞,其中所述Fc受体是Fcγ激活受体。
105.按照权利要求87的宿主细胞,其中所述Fc受体是FcγRIIIA受体。
106.按照权利要求81的宿主细胞,其中所述宿主细胞是HEK293-EBNA细胞,CHO细胞,BHK细胞,NSO细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞。
107.权利要求81的宿主细胞,其中所述编码具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽的至少一种核酸可操作地连接于组成型启动子元件。
108.权利要求81的宿主细胞,其中具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的所述多肽是融合多肽。
109.按照权利要求78的方法,其中所述疾病选自由下列各项组成的组:黑素瘤,神经胶质瘤,小叶性(lobular)乳腺癌,急性白血病,或实体瘤诱导的血管的新血管生成。
110.一种分离的多核苷酸,其包含鼠225.28S单克隆抗体的至少一个互补决定区,或包含所述互补决定区的至少特异性决定残基的其变体或截短形式,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
111.按照权利要求110的分离的多核苷酸,其包含鼠225.28S单克隆抗体的至少两个互补决定区,或包含所述互补决定区的至少特异性决定残基的其变体或截短形式。
112.按照权利要求110的分离的多核苷酸,其包含鼠225.28S单克隆抗体的至少三个互补决定区,或包含至少所述互补决定区的特异性决定残基的其变体或截短形式。
113.按照权利要求110的分离的多核苷酸,其中所述互补决定区选自由下列各项组成的组:SEQ ID NO:61;SEQ ID NO:63;SEQ ID NO:65;SEQ IDNO:67;SEQ ID NO:69;SEQ ID NO:71;SEQ ID NO:73;SEQ ID NO:75;SEQ ID NO:77;SEQ ID NO:79;SEQ ID NO:81;SEQ ID NO:83;SEQ IDNO:85;SEQ ID NO:87;SEQ ID NO:89;SEQ ID NO:91;SEQ ID NO:93;和SEQ ID NO:95。
114.按照权利要求110的分离的多核苷酸,其中所述互补决定区选自由下列各项组成的组:SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:101;SEQID NO:103;SEQ ID NO:105;SEQ ID NO:107。
115.按照权利要求110的分离的多核苷酸,其中所述融合多肽编码抗原结合分子。
116.按照权利要求111的分离的多核苷酸,其中所述互补决定区包含选自由下列各项组成的组的序列的至少一个序列:SEQ ID NO:61;SEQ IDNO:63;SEQ ID NO:65;SEQ ID NO:67;SEQ ID NO:69;SEQ ID NO:71;SEQ ID NO:73;SEQ ID NO:75;SEQ ID NO:77;SEQ ID NO:79;SEQ IDNO:8 1;SEQ ID NO:83;SEQ ID NO:85;SEQ ID NO:87;SEQ ID NO:89;SEQ ID NO:91;SEQ ID NO:93;和SEQ ID NO:95;和选自由下列各项组成的组的序列的至少一个序列:SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:99,SEQ IDNO:101;SEQ ID NO:103;SEQ ID NO:105;SEQ ID NO:107,或包含至少所述互补决定区的每个的特异性决定残基的所述序列的变体或截短形式。
117.一种分离的多肽,其由权利要求110-116任一项的分离的多核苷酸编码。
118.一种抗原结合分子,其包含按照权利要求117的多肽。
119.按照权利要求118的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子包含抗体轻或重链的可变区。
120.按照权利要求118的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子是嵌合的或人源化抗体。
121.一种在宿主细胞中生产具有修饰的寡糖的抗原结合分子的方法,所述方法包含:
a.在容许所述抗原结合分子产生并且容许修饰在所述抗原结合分子的Fc区的寡糖的条件下培养宿主细胞,所述宿主细胞被糖基改造从而表达编码具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽的至少一种核酸;和
b.分离所述抗原结合分子,其中所述抗原结合分子能够与鼠225.28S单克隆抗体竞争结合MCSP,并且其中所述抗原结合分子或其片段是嵌合的或人源化的。
122.按照权利要求121的方法,其中所述修饰的寡糖与非糖基改造的抗原结合分子相比,具有减少比例的岩藻糖残基。
123.按照权利要求121的方法,其中所述修饰的寡糖主要是杂合形式。
124.按照权利要求121的方法,其中所述修饰的寡糖主要是复合形式。
125.按照权利要求121的方法,其中由所述宿主细胞产生的所述重组抗体或其片段与由非糖基改造的细胞产生的抗原结合分子相比,在所述多肽的Fc区中具有增加比例的分叉的、非岩藻糖基化的寡糖。
126.按照权利要求125的方法,其中所述分叉的、非岩藻糖基化的寡糖主要是杂合形式。
127.按照权利要求125的方法,其中所述分叉的、非岩藻糖基化的寡糖主要是复合形式。
128.按照权利要求125的方法,其中在所述多肽的Fc区中至少20%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
129.按照权利要求128的方法,其中在所述多肽的Fc区中至少30%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
130.按照权利要求129的方法,其中在所述多肽的Fc区中至少35%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
131.一种抗原结合分子,其被糖基改造从而具有增加的效应子功能,其按照权利要求121-130任一项的方法所产生。
132.权利要求131的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子是抗体。
133.一种抗原结合分子,其被改造以具有增加的Fc受体结合活性,其由权利要求121-130任一项的方法所产生。
134.权利要求133的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子是抗体。
135.按照权利要求131的抗原结合分子,其中所述增加的效应子功能是增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性。
136.按照权利要求131的抗原结合分子,其中所述增加的效应子功能是增加的与NK细胞的结合。
137.按照权利要求131的抗原结合分子,其中所述增加的效应子功能是增加的与巨噬细胞的结合。
138.按照权利要求131的抗原结合分子,其中所述增加的效应子功能是增加的与单核细胞的结合。
139.按照权利要求131的抗原结合分子,其中所述增加的效应子功能是增加的与多形核细胞的结合。
140.按照权利要求131的抗原结合分子,其中所述增加的效应子功能是定向信号传导诱导的程序性细胞死亡。
141.按照权利要求131的抗原结合分子,其中所述增加的效应子功能是增加的树突细胞成熟。
142.按照权利要求131的抗原结合分子,其中所述增加的效应子功能是增加的T细胞引发。
143.按照权利要求133的抗原结合分子,其中所述Fc受体是Fc激活受体。
144.按照权利要求133的抗原结合分子,其中所述Fc受体是FcγRIIIa受体。
145.通过权利要求121-130任一项的方法产生的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子是包含Fc区的抗体片段并被改造以具有增加的效应子功能。
146.由权利要求121-130任一项对方法生产的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子是包括具有选自由下列各项组成的组的序列的多肽和等价于免疫球蛋白的Fc区的区域的融合蛋白:SEQ ID No:2;SEQ ID No:4;SEQ ID No:6;SEQ ID No:8;SEQ ID No:10;SEQ ID No:12;SEQ ID No:14;SEQ ID No:16;SEQ ID No:18;SEQ ID No:20;SEQ ID No:22;和SEQ IDNo:24;并被改造以具有增加的效应子功能。
147.由权利要求121-130任一项的方法生产的抗原结合分子,其中所述抗原结合分子是融合蛋白,其包括具有选自由下列各项组成的组的序列的多肽:SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:34,SEQID NO:36;SEQ ID NO:3 8,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:50,和SEQ ID NO 52和等价于免疫球蛋白的Fc区的区域,所述抗原结合分子被改造从而具有增加的效应子功能。
148.一种药物组合物,其包含权利要求131-147中任一项的抗原结合分子和药用载体。
149.按照权利要求4或8的分离的多核苷酸,其中所述分离的多核苷酸编码融合多肽。
150.按照权利要求78的方法,其中所述治疗包含杀死表达MCSP的细胞。
151.按照权利要求150的方法,其中所述细胞过表达MCSP。
152.按照权利要求125的方法,其中在所述多肽的Fc区中至少40%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
153.按照权利要求 152的方法,其中在所述多肽的Fc区中至少50%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
154.按照权利要求153的方法,其中在所述多肽的Fc区中至少60%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
155.按照权利要求154的方法,其中在所述多肽的Fc区中至少70%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
156.按照权利要求155的方法,其中在所述多肽的Fc区中至少80%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
157.按照权利要求156的方法,其中在所述多肽的Fc区中至少90%的寡糖是分叉的、非岩藻糖基化的。
158.一种在需要其的受试者中诱导肿瘤新血管系统中的活化的周细胞裂解的方法,其包含向所述受试者施用按照权利要求49-69任一项的抗原结合分子。
159.按照权利要求158的方法,其中所述新血管系统不是黑素瘤新血管系统或成胶质细胞瘤新血管系统。
160.按照权利要求158的方法,其中所述抗原结合分子与另一种抗生血管试剂共施用。
161.按照权利要求160的方法,其中所述抗生血管药剂是抗-VEGF-1-抗体。
162.按照权利要求37-69,118-120,或131-147任一项的抗原结合分子,其用作药物,所述药物用在治疗MCSP介导的细胞增殖性疾病中。
163.按照权利要求162的抗原结合分子,其中所述MCSP-介导的细胞增殖性疾病选自由下列各项组成的组:黑素瘤,神经胶质瘤,小叶性乳腺癌,急性白血病,或实体瘤诱导的血管的新血管生成。
164.按照权利要求37-69,118-120,或131-147任一项的抗原结合分子,其用作药物,所述药物用于肿瘤新血管系统中的活化的周细胞的裂解。
165.按照权利要求37-69,118-120,或131-147的任一项的抗原结合分子,其用作药物,所述药物特别用于癌症。
166.按照权利要求37-69,118-120,或131-147任一项的抗原结合分子用于制备药物的应用,所述药物用于治疗或预防癌症。
167.按照权利要求166的应用,其中所述抗原结合分子以从约1.0mg/kg到约15mg/kg的治疗有效量使用。
168.按照权利要求167的应用,其中所述治疗有效量从约1.5mg/kg到约12mg/kg。
169.按照权利要求167的应用,其中所述治疗有效量从约1.5mg/kg到约4.5mg/kg。
170.按照权利要求167的应用,其中所述治疗有效量从约4.5mg/kg到约12mg/kg。
171.按照权利要求167的应用,其中所述治疗有效量是约1.5mg/kg。
172.按照权利要求167的应用,其中所述治疗有效量是约4.5mg/kg。
173.按照权利要求167的应用,其中所述治疗有效量是约12mg/kg。
174.本文所述的新化合物,工艺,药物组合物,方法和应用。
175.一种宿主细胞,其被糖基改造以足以修饰在由所述宿主细胞产生的第二多肽的Fc区中的寡糖的量表达编码第一多肽的至少一种核酸分子,其中所述第一多肽选自由下列各项组成的组:具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽;具有α-甘露糖苷酶II活性的多肽;和具有β-(1,4)-半乳糖基转移酶活性的多肽,其中所述第二多肽是按照权利要求37-69中任一项的抗原结合分子。
176.按照权利要求175的宿主细胞,其中所述第一多肽是具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽。
177.按照权利要求175的宿主细胞,其中所述第一多肽是具有α-甘露糖苷酶II活性的多肽。
178.按照权利要求175的宿主细胞,其中所述第一多肽是具有β-(1,4)-半乳糖基转移酶活性的多肽。
179.按照权利要求176的宿主细胞,其中所述宿主细胞还表达编码具有α-甘露糖苷酶II活性的多肽的核酸分子。
180.按照权利要求179的宿主细胞,其中所述宿主细胞还表达编码具有β-(1,4)-半乳糖基转移酶活性的核酸分子。
181.按照权利要求175或权利要求176的宿主细胞,其中所述第一多肽是融合多肽,其包含异源高尔基体定居多肽的定位结构域。
182.权利要求175-181的任一项的宿主细胞,其中由所述宿主细胞产生的所述抗原结合分子与由非糖基改造的宿主细胞产生的抗原结合分子相比,显示增加的效应子功能。
183.权利要求175-181中任一项的宿主细胞,其中由所述宿主细胞产生的所述抗原结合分子与由非糖基改造的宿主细胞产生的抗原结合分子相比,显示增加的Fc受体结合亲和性。
184.按照权利要求182的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的Fc-介导的细胞的细胞毒性。
185.按照权利要求182的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的与NK细胞的结合。
186.按照权利要求182的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的与巨噬细胞的结合。
187.按照权利要求182的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的与多形核细胞的结合。
188.按照权利要求182的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的与单核细胞的结合。
189.按照权利要求182的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的定向信号传导诱导的程序性细胞死亡。
190.按照权利要求182的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的树突细胞成熟。
191.按照权利要求182的宿主细胞,其中所述增加的效应子功能是增加的T细胞引发。
192.按照权利要求183的宿主细胞,其中所述Fc受体是Fcγ激活受体。
193.按照权利要求183的宿主细胞,其中所述Fc受体是FcγRIIIA受体。
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