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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von Antikörpern zur Herstellung einer
Vakzine zur Immunisierung gegen malignes Melanom, insbesondere zur
passiven Immunisierung gegen High Molecular Weight Melanome Associated
Antigen (HMW-MAA) – einem
wichtigen Antigen – auf
Melanomem, sowie die Kombination von Antikörpern und aktiven Substanzen
zur Herstellung einer Vakzine zur Behandlung von malignem Melanom.
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Antigene
können
entweder körperfremde oder
körpereigene
(Selbstantigene) Stoffe sein. Im Falle von Fremdantigenen – meist
Proteine oder Polysaccharide – werden
diese vom Immunsystem erkannt, und falls sie als gefährlich eingestruft
werden, durch eine entsprechende Immunantwort eliminiert. Das Immunsystem,
welches einen unspezifischen und einen spezifischen Wirkungsschenkel
besitzt, agiert mittels humoraler und zellulärer Faktoren. Diese spezifische
zelluläre
Abwehr wird hauptsächlich über zytotoxische
T-Zellen durchgeführt,
die entweder direkt ein krankmachendes Agens oder Zellen, die von
pathogenen Antigenen befallen sind, auflösen, oder die Zellen agieren über bestimmte
Botenstoffe, die anderen Zellen helfen, die krankmachende Substanz
oder den krankmachenden Zustand zu eliminieren.
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Zu
den humoralen Faktoren des spezifischen Immunsystems werden die
Antikörper
gezählt, die
von B-Zellen bzw. Plasmazellen produziert werden. Diese Antikörper werden
mit Hilfe von bestimmten Botenstoffen, die wiederum von T-Zellen
(T-Helfer-Zellen) stammen, produziert und sezerniert. Die gebildeten
Antikörper
sind spezifisch für
einen bestimmten Abschnitt an der Oberfläche eines Antigens, welchen
man B-Zellepitop nennt (es gibt auch T-Zellepitope, die meist linear
sind und nicht die selbe Lokalisation wie die B-Zellepitope an der
Moleküloberfläche haben).
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Es
gibt mehrere Möglichkeiten
wie ein Antikörper
agieren kann: Prinzipiell bindet ein Antikörper mit seinen spezifischen
Bindungsstellen, den Idiotopen/Paratopen, die in der hypervariablen
Region des Fab-Teils des Antikörpers
gelegen sind, an spezifische Regionen des Antigens, die Epitope
genannt werden – diese
Bindung erfolgt nach dem "Schlüssel-Schloß-Prinzip".
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Durch
diese Bindung kann nun ein Antigen neutralisiert und unschädlich gemacht
werden; im Falle einer proliferierenden Zelle kann durch die Antikörperbindung
das Wachstum der Zelle gestoppt (oder auch erhöht) werden; es kann das Antigen durch
den gebundenen Antikörper
leichter von Zellen aufgenommen werden (Opsonisation und Phagozytose
durch entsprechende "Freßzellen" – z.B. Makrophagen); oder es
können
durch die Bindung des Antikörpers
mit seinem Fc-Teil an Effektorzellen (Makrophagen, NK-Zellen) diese
Zellen aktiviert werden um die Zielzellen oder Zielorganismen leichter
attackieren und eliminieren zu können.
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Im
Unterschied zu den Fremdantigenen werden körpereigene Stoffe, Zellen etc.
nicht als fremd und gefährlich
angesehen. Im Gegenteil, es ist sogar wünschenswert, dass diese Selbstantigene
vom Immunsystem toleriert werden, da es sonst ständig zu schweren Inflammationen
und Gewebeschäden durch
die Aktivierung des Immunsystems kommen würde (ein Beispiel für eine Fehlleitung
des Immunsystems gegenüber
Selbstantigen sind Autoimmunerkrankungen).
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Wenn
es nun – durch
eine Fehlleitung oder Versagen des Regulationssystems – zum überschießenden Wachstum
von körpereigenen
Zellen kommt, wie das bei einem Tumor der Fall ist, dann reagiert das
Immunsystem in der Regel nicht, da es gegenüber körpereigenen Proteinen eine
Toleranz aufgebaut hat. Auf Grund dieser Tatsache kann sich der Tumor
ungehindert im Körper
ausbreiten.
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Mit
Hilfe von spezifischen Immunisierungen kann ein Schutzzustand gegen
gewisse Erreger oder krankmachende Agentien erreicht werden. Bei
der spezifischen Immuntherapie/Immunisierung unterscheidet man 2
Arten: die aktive Immunisierung – gleichbedeutend mit einer
Impfung – wobei
dem Körper
Stoffe (abgeschwächte
Erreger, Toxine etc.) zugeführt
werden, gegen die der Körper
selbst einen Schutz aufbaut. Die Erreichung des Schutzzustandes
dauert mehrere Wochen, der Schutz kann mehrere Jahre, in manchen
Fällen
sogar lebenslang bestehen.
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Im
Unterschied dazu steht die passive Immunisierung (die keine Impfung
ist). Hierbei werden dem Körper
bereits formierte Antikörper
zugeführt,
der Schutz beginnt sofort mit Applikation und hält aber nicht sehr lange an,
da die Antikörper
abgebaut werden. Durch wiederholte Gabe der Antikörper kann
der Schutzzustand auf längere
Zeit aufrecht erhalten werden.
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Im
Falle der Behandlung von Tumoren bietet sich an, mit Hilfe von passiver
Immunisierung mit Antikörpern,
die gegen ein bestimmtes Turmorantigen gerichtet sind, eine Reduktion
des Tumorwachstums zu erreichen. Dies konnte bei der Behandlung
von Brustkrebs mit der Applikation des Antikörpers Trastuzumab in Kombination
mit einem Standard-Chemotherapeutikum (McLaughlin, P. et al. J.
Clin. Oncol. 16, 2825–2833
1898), oder Rituximab zur Behandlung von Rückfällen von Non-Hodgkin Lymphomen (Baselga,
J., Norton, L et al. Cancer Research 58, 2825–2831 (1998)) gezeigt werden.
Bei den Antikörpern
handelt es sich um humanisierte Mausantikörper (d.h. Mäuse werden
mit menschlichen Tumorzellen immunisiert und bilden gegen diese
Fremdantigene spezifische Antikörper;
durch einen Austausch des murinen gegen einen humanen Fc-Teil mittels molekularbiologischer
Methoden wird der humanisierte Antikörper für den Menschen besser verträglich).
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Das
Melanom gehört
zu einer Gruppe von sehr malignen, häufig therapieresistenten Tumoren, die
in 90 % der Fälle
ohne genetische Prädisposition, und
in 10 % mit familiärer
Häufung
auftreten können. Die
Inzidenz der Erkrankungen an malignem Melanom hat in den letzten
Jahren enorm zugenommen.
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Nur
ein primärer
Tumor im Stadium I/II, bei dem es zu keinem Durchbruch durch die
Basalmembran gekommen ist, kann durch eine chirurgische Entfernung
in 85 % der Fälle
geheilt werden. Bei den Fällen,
wo das Tumorwachstum aber > 1,5
mm ist, bzw. bereits Lymphknoten befallen sind (Stadien III/IV),
ist die Prognose sehr schlecht, u.a. deshalb weil es in diesen Stadien
nur in einem unbefriedigend geringem Prozentsatz (ca. 20 %) eine
wirksame Therapie gibt.
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Es
konnte gezeigt werden, dass das aggressive Wachstum dieses Tumors
mit einer abnormen Proteinexpression assoziiert ist. Eines der wichtigsten dieser
Melanomantigene ist das HMW-MAA (high molecular weight melanoma
associated antigen), das sich auf 90 % aller primären und
metastasierenden Tumoren befindet. Das HMW-MAA ist besonders für das rasche
Tumorwachstum und die Tumorinvasivität verantwortlich.
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Biochemische
Analysen haben gezeigt, daß es
sich beim HMW-MAA um einen Glyokprotein-Proteogykan-Komplex handelt,
mit einer molekularen Größe von > 450 kDa. Dieses Antigen
zeigt eine starke Immunogenität,
da es zahlreiche Epitope enthält, gegen
die verschiedene monoklonale Mausantikörper produziert wurden.
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Einer
dieser monoklonalen Antikörper
ist der 225.28 S Antikörper,
der durch Immunisierung von BALB/c Mäusen mit der humanen Melanomzelllinie M21
erzeugt wurde. Das Epitop, das vom 225.28 S Antikörper erkannt
wird, unterscheidet sich in der Lokalisation klar von denen, die
durch andere monoklonale Antikörper
erkannt werden. Der gebundene Antikörper wird nicht endozytiert
und bleibt an der Membran der Tumorzellen haften.
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Ein
F(ab)2 Fragment vom 225.28 S, das konjugiert wurde an 99mTc
(Technetium), wurde als Immunokonjugat (Technemab-K1; Sorin Biomedica,
Italien) zur Diagnose vom Melanom eingesetzt: Im Artikel "Effects of Diagnostic
Application of Monoclonal Antibodyon Survival in Melanoma Patients" von H. Bender et
al, Seite 65–68,
Hybridoma vo. 16, Nr. 1, 1997, Mary Ann Liebert, Inc., wird die
Kopplung des F(ab)2 Teils eines Anti Melanomantikörpers an
eine radioaktive Substanz (Technetium) beschrieben, wobei dieser
radioaktiv markierte Antikörperteil
zur Diagnose von Melanomen – bzw.
zur Diagnose des Tumorverlaufs herangezogen wird. Dabei hat sich
herausgestellt, dass bei den Menschen bei denen der markierte Antikörperteil
verwendet wurde, eine verlängerte Überlebenszeit
zu vermerken war. Es konnte des weiteren gezeigt werden, dass die
tumorreduzierende Wirkung meistens dem verwendeten Radiokonjugat
zuzuschreiben ist.
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Allerdings
besteht ein großes
Anliegen, auf Radiokonjugate bei der Behandlung von Patienten verzichten
zu können.
Es ist daher von großen
Interesse, eine passive Immunisierung möglichst ohne Einsatz von Konjugaten
zu erreichen.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen Behandlungsweg
zu finden, welcher geeignet ist, das Melanomwachstum und die Metastasenbildung
zu reduzieren bzw. zu unterbinden, wobei auf Radiokonjugate größtenteils
verzichtet werden kann.
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Der
Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß man Antikörper verwendet, die zur passiven
Immunisierung gegen malignes Melanom geeignet sind.
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Die
Erfindung ist daher Antikörper
zu verwenden, die zur Herstellung einer Vakzine zur passiven Immunisierung
gegen das High Molecular Weight-Melanoma
Associated Antigen auf malignen Melanomem geeignet sind.
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Das
High Molecular Weight-Melanoma Associated Antigen (HMW-MAA) befindet
sich auf 90 % aller primären
und metastasierenden Tumoren und ist eines der wichtigsten Melanomantigene,
da dieses Antigen mit der Tumorausbreitung und der Invasivität assoziiert
wird. Die Verwendung von Antikörpern,
die gegen HMW-MAA gerichtet sind, ist eine besonders wirkungsvolle
Immunisierung, da sich dieses Antigen in hoher Anzahl auf malignen
Melanomen befindet. Es ist besonders bevorzugt, daß es sich
bei den verwendeten Antikörpern
zur Herstellung einer Vakzine zur passiven Immunisierung gegen HMW-MAA
auf malignen Melanomen um monoklonale Antikörper handelt.
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Des
weiteren ist bevorzugt, daß es
sich bei dem Antikörper
um den monoklonalen Antikörper 225.28S
handelt. Dieser monoklonale Antikörper wird durch Immunisierung
(BALB/c-) Mäuse
mit humanen Melanom M21-Zellen
generiert. Der monoklonale Antikörper
225.285 reagiert stark mit den Melanomzellen, die das HMW-MAA exprimieren.
Aus diesem Grund eignet sich der monoklonale Antikörper 225.28S
besonders gut für
eine passive Immunisierung gegen HMW-MAA auf malignen Melanomen.
Es konnte durch Versuche gezeigt werden, daß der monoklonale Antikörper 225.28S
in vivo das Tumorwachstum von Melanomen starkt reduziert. So läßt sich
aus 2 erkennen, daß das Wachstum
von humanen Tumorzellen in SCID-Mäusen, welche diesen Antikörper passiv
appliziert bekommen, deutlich zurückbleibt gegenüber Tumorzellen
in Mäusen,
die mit Kontrollantikörper
oder Kochsalzlösung
behandelt wurden.
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Es
wird in dieser Erfindung damit erstmalig beschrieben, dass intravenöse Applikationen
dieser Antikörper
zu einer massiven Tumorreduktion führt. Des Weiteren ist zu bemerken,
dass diese Tumorreduktion ohne zusätzliche Gabe eines Chemotherapeutikum
(wie das für
andere monoklonale Antikörper
gegen z.B. Brustkrebs beschrieben wurde) erreicht wird.
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Des
weiteren ist bevorzugt, daß der
Antikörper
markerfrei ist. Antikörper
werden vor allem dazu genutzt, sie mit Markern zu konjugieren und
diese Konjugate dann für
diagnostische Zwecke bei Tumoren einzusetzen. Dabei werden bevorzugt
Fluoreszens- und/oder radioaktive Marker verwendet. Der Antikörper in
solch einem Konjugat dient nur dazu, die wirkende Substanz an den
Wirkort zu bringen und zu binden. In der vorliegenden Erfindung
ist jedoch bevorzugt, daß der
Antikörper
selbst als Wirkstoff dient und somit direkt gegen das HMW-MAA wirkt.
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Des
weiteren ist bevorzugt, daß der
Antikörper
konjugatfrei ist, d. h. daß der
Antikörper
nicht mit einer weiteren Substanz verbunden ist. Dabei wird unter "verbunden" in der vorliegenden
Erfindung verstanden, daß es
sich um kovalente oder ionische Bindungen handelt oder andere Wechselwirkungen
bestehen, wie z.B. Wasserstoffbrückenbindung
oder van der Walls-Kräfte.
Es ist insbesondere bevorzugt, daß der monoklonale Antikörper 225.285
nicht konjugiert ist.
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Des
weiteren ist bevorzugt, daß der
ganze Antikörper
zur Herstellung einer Vakzine zur passiven Immunisierung gegen HMW-MAA
auf malignen Melanomen verwendet wird. Insbesondere wird bevorzugt,
daß es
sich bei dem ganzen Antikörper
um den monoklonalen Antikörper
225.285 handelt.
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Des
weiteren ist aber auch denkbar, daß Fragmente von Antikörpern eingesetzt
werden können.
Insbesondere ist bevorzugt, daß F(ab')2-Fragmente von Antikörpern Verwendung
finden zur Herstellung einer Vakzine zur passiven Immunisierung gegen
HMW-MAA auf malignen Melanomen. Dabei handelt es sich bei den F(ab)-Fragmenten
um die Teile des Moleküls
des Antikörpers,
die an das Antigen binden (Fab=Fragment, daß das Antigen bindet). Der Prototyp
des Antikörpers
ist symmetrisch aufgebaut, wobei es aus vier Proteinketten besteht,
die durch nicht- kovalente
Bindungen und Disulfitbrücken
zusammengehalten werden. Nach Lösung
dieser Bindungen entstehen zwei Kettenpaare, die aufgrund ihrer
unterschiedlichen Molekulargewichte als schwere (heavy oder H) und
leichte (light oder L) Ketten bezeichnet werden. Wird der Antikörper jedoch
einer protolytischen Spaltung unterzogen, so entstehen drei Bruchstücke, von
denen sich zwei jeweils aus der L-Kette und den terminalen Enden
der H-Kette zusammensetzen. Bei diesen Bruchstücken handelt es sich um die
oben genannten F(ab)'-Fragemente.
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Es
ist insbesondere bevorzugt, daß F(ab')2-Fragmente
des monoklonalen Antikörper 225.285
Verwendung finden.
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Des
weiteren ist bevorzugt, daß der
Antikörper,
insbesondere ein monoklonaler Antikörper und davon insbesondere
der monoklonale Antikörper 225.285,
mit anderen aktiven Substanzen, welche gegen HMW-MAA wirken, zur Herstellung einer Vakzine
zur passiven Immunisierung gegen HMW-MAA auf malignen Melanomem
verwendet werden.
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Vorzugsweise
sind die aktiven Substanzen Chemotherapeutika. Besonders bevorzugt
sind Chemotherapiecytostatika, am meisten bevorzugt sind Dacarbine-DTIC,
Temozolamide, Cisplatin, Fotemustine-muphoran und Vincristine-vinblastine.
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Insbesondere
wird bevorzugt, daß es
sich bei den aktiven Substanzen um monoklonale Antikörper handelt
und dabei wiederum vorzugsweise um Antikörper, die das HMW-MAA binden.
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Des
weiteren ist bevorzugt, daß diese
weiteren monoklonalen Antikörper
an andere Epitope des High Molecular Weight-Melanoma Associated
Antigen binden als der monoklonale Antikörper 225.285.
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Im
folgenden wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.
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Tiere
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6-Wochen
alte pathogen-freie C.B.17 scid/scid Mäuse, erhalten von Harlan Winckelmann Deutschland
und gehalten in Mikroisolatorkäfigen, haben
während
der Experimentalphase autoklaviertes Futter und Wasser ad libitum
erhalten. Alle Experimente wurden von der Tierversuchsethikkommission
der Universität
Wien und des Ministeriums für
Entwicklung, Forschung und Kultur genehmigt.
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Zelllinie
und Antikörper
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Die
humane Melanomzelllinie 518 A2 (von Dr. Peter Schrier, Leiden, Niederlande)
wurde in einem DMEM-Medium (life technologies, Carlsbad, CA) aufbewahrt,
versehen mit 10% fötalem
Kälberserum
und 1 Antibiotika in einer 5% CO2 und 95%
befeuchteten Luftatmosphäre
bei 37°C.
Die Zellkultur war frei von Mycoplasma und pathogenen Virus. Der monoklonale
Mausantikörper
225.285 wurde von Soldano Ferrone zur Verfügung gestellt. Der monoklonale
Maus-IgG-Antikörper
Klon LC1, welcher als Kontrollantikörper dient, wurde von NeoMarkers,
Fremont, CA erworben.
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Humanmelanom SCID-Xenotransplantationsmodell
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Experimenteller Ablauf
(1)
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1×107 der Humanmelanomzelllinie 518A2 resuspendiert
in 200 μl
sterilem PBS wurden subcutan in die linke Flanke der Maus injiziert.
Ca. 14 Tage später,
nachdem die Tumore einen durchschnittlichen Durchmesser von 5 mm
erreicht hatten, wurde die Vakzine intravenös verabreicht.
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Die
Mäuse wurden
in drei Gruppen zu je 5 Mäusen
eingeteilt. Eine Gruppe erhielt den monoklonalen Antikörper 225.285,
die zweite Gruppe erhielt einen Kontrollantikörper (Maus-IgG) und der dritten Gruppe
wurde nur Kochsalzlösung
(unbehandelt) appliziert. 100 μg
des jeweiligen Antikörpers
(d. h. 5mg/kg Körpergewicht)
wurden intravenös
in einem Volumen von 250 μl
vier mal in 3-tägigen
Abständen verabreicht.
Die Tumorgröße wurde
zwei mal wöchentlich
durch Kalibriermessung bestimmt. Das Tumorvolumen wurde nach folgender
Formel berechnet: Volumen =(längster
Tumordurchmesser × kürzester
Tumordurchmesser2)/2. Fünf Tage nach der letzten Injektion
wurden die Mäuse
getötet.
Die Tumore wurden freigelegt und ihr Gewicht gemessen. Die Experimente
wurden drei mal unter den selben Bedingungen wiederholt.
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Ergebnisse
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Reduktion
des Tumorwachstums durch Verabreichung von monoklonalen Antikörper 225.285
in vivo.
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Um
die biologische Aktivität
von monoklonalen Antikörpern
225.285 in vivo zu studieren, wurde der monoklonale Antikörper vier
mal in einem Interval von drei Tagen an SCID-Mäusen (immun-inkompetente Mäuse, deren
funktionelle T- und B-Lymphzyten fehlen) mit einem etablierten humanen
Melanom verabreicht. Schon nach drei intravenösen Applikationen von monoklonalen
Antikörpern
225.285 konnte eine signifikante Reduktion des Tumorvolumens bei den
Mäusen,
die mit monoklonalen Antikörpern
behandelt wurden, im Vergleich zu den nicht-behandelten Mäusen (scheinbehandelt mit Natriumchloridlösung) festgestellt
werden (2). Nach der
dritten Antikörperbehandlung
wurde ebenfalls ein geringeres Tumorvolumen gegenüber den
Mäusen
festgestellt werden, die mit einem unspezifischen Kontrollantikörper behandelt
wurden. Fünf
Tage nach der letzten Antikörperbehandlung
war das Tumorvolumen der Mäuse,
welche mit dem monoklonalen Antikörper behandelt wurden, 50 %
geringer im Vergleich zu den Mäusen,
welche mit dem Kontrollantikörper behandelt
wurden, sowie den unbehandelten Vergleichsmäusen (mit Natriumchlorid behandelt).
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Zu
diesem Zeitpunkt wurde auch das Tumorgewicht bestimmt, welches ebenfalls
50 % geringer ausfiel zu den Kontrollmäusen (3). Die Experimente wurden drei mal unter
den selben Bedingungen durchgeführt
wobei die dargestellten Daten den Mittelwert der drei Versuchsreihen
wiedergeben.
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Statistk
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Die
Daten aller drei unabhängigen
Experimente wurden statistisch evaluiert durch Verwendung von Varianzanalyse
und Kontrastanalyse (* = P < 0.05;
* * = P < 0.01).
Pro Experiment werden 5 Mäuse/Gruppe
verwendet.
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Experimenteller Ablauf
(vergl. 1)
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Das
Experiment wurde durch subkutane Injektion von 1×107 Melanonzellen
(518 A2) in die Flanke der Mäuse
(d0) gestartet. 14 Tage später,
nachdem der Durchmesser der Tumore durchschnittlich 5mm erreicht
hatte, wurde die erste intravenöse
Injektion des monoklonalen Antikörpers
225.28S (100μg/250μl) injiziert,
bzw. der Kontrollantikörper (100μg/250μl) oder die
Natriumchloridlösung
(Natrumchlorid, 250μl)
verabreicht. Die Behandlung wurde vier mal in einem Zeitintervall
von drei Tagen durchgeführt
(d14, 17, 20, 23) und anschließend, nach
jeder Antikörperverabreichung
die Tumorgröße gemessen.
Fünf Tage
nach der letzten Antikörperverabreichung
wurden die Mäuse
umgebracht (d28) und die Tumore freigelegt und gewogen.
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Tumorvolumen (vergl. 2)
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14
Tage nach der Inoculation der Tumorzellen (d0) nachdem der durchschnittliche
Durchmesser der Tumore 5mm erreicht hatte, wurde die erste intravenöse Injektion
des monoklonalen Antikörpers 225.28S
(100μg/
250μl) oder
die Injektion von Kontrollantikörper
(100μg/250μl) oder die
Injektion von Natriumchlorid (Natrumchlorid, 250μl) durchgeführt. Die Behandlung wurde nach
14, 17, 20 und 23 Tagen durchgeführt.
Fünf Tage
später
(d28) wurden die Mäuse
getötet.
Nach jeder Antikörperapplikation
und nach Ende des Experiments wurde das Tumorvolumen evaluiert.
Schon nach der dritten Applikation konnte eine 50%-ige Reduktion
der Tumorvolumens verglichen zu dem Kontrollantikörper-behandelten oder
mit dem Natriumchlorid behandelten Mäusen festgestellt werden (*
= P < 0,5; * *
= P<0,01).
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Tumorgewicht (vergl. 3)
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Nach
28 Tagen wurden die Tiere getötet
und der Tumor freigelegt und gewogen. Entsprechend des reduzierten
Tumorvolumens war ebenfalls das Tumorgewicht, nach Behandlung mit
den monoklonalen Antikörpern
225.285, 50% reduziert gegenüber dem
der Kontrolltiere.