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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft die Isolierung und Erzeugung von Antikörpern, die
eine Krebserkrankung modifizieren (cancerous disease modifying antibodies,
CDMAB), sowie die Verwendung dieser CDMAB in therapeutischen und
diagnostischen Verfahren, wahlweise in Kombination mit einem oder
mehreren chemotherapeutischen Mitteln. Die Erfindung betrifft ferner
Bindungsassays, die die CDMAB der vorliegenden Erfindung verwenden.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Jedes
von einer Krebserkrankung betroffene Individuum ist einzigartig
und weist eine Krebserkrankung auf, die sich von anderen Krebserkrankungen
ebenso unterscheidet wie die Identitität dieser Person. Dennoch behandelt
die gegenwärtige
Therapie alle Patienten, die dieselbe Art von Krebs im selben Stadium aufweisen,
auf dieselbe Weise. Bei mindestens 30% dieser Patienten wird die
First-Line-Therapie versagen, was folglich zu weiteren Behandlungszyklen
und zu einer erhöhten
Wahrscheinlichkeit von Behandlungsversagen, Metastasen und schließlich des
Versterbens führt.
Ein besserer Behandlungsansatz bestünde in der individuellen Anpassung
der Therapie für
ein bestimmtes Individuum. Die einzige gegenwärtige Therapie, die sich für die individuelle
Anpassung eignet, ist die Chirurgie. Die Chemotherapie und die Bestrahlungsbehandlung
können
nicht auf den Patienten zugeschnitten werden, und die Chirurgie
allein ist in den meisten Fällen nicht
geeignet, um eine Heilung herbeizuführen.
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Mit
dem Aufkommen von monoklonalen Antikörpern wurde die Möglichkeit
der Entwicklung von Verfahren für
eine individuell angepaßte
Therapie realistischer, da jeder Antikörper gegen ein einzelnes Epitop
gerichtet sein kann.
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Des
Weiteren ist es möglich,
eine Kombination von Antikörpern
herzustellen, die gegen die Konstellation von Epitopen gerichtet
ist, welche in einzigartiger Weise einen Tumor des jeweiligen Individuums
definiert.
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Als
erkannt wurde, dass ein signifikanter Unterschied zwischen Krebszellen
und normalen Zellen darin besteht, dass die Krebszellen Antigene
enthalten, die spezifisch für
transformierte Zellen sind, war die wissenschaftliche Gemeinschaft
lange Zeit der Auffassung, dass monoklonale Antikörper erstellt
werden können,
um transformierte Zellen in spezifischer Weise durch spezifische
Bindung an diese Krebsantigene anzugreifen; dies führte zu
dem Glauben, dass monoklonale Antikörper als "Magic Bullets" dienen können, um Krebszellen zu eliminieren.
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Es
hat sich gezeigt, dass monoklonale Antikörper, die gemäß der Lehre
der vorliegenden Erfindung isoliert wurden, den Vorgang der Krebserkrankung
in einer Weise modifizieren, die für den Patienten vorteilhaft ist
(beispielsweise durch Verringerung der Tumorlast); sie werden vorliegend
abwechselnd als die Krebserkrankung modifizierende Antikörper (CDMAB)
oder "Anti-Krebs"-Antikörper bezeichnet.
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Gegenwärtig hat
ein Krebspatient in der Regel wenige Wahlmöglichkeiten in Bezug auf die
Behandlung. Der planmäßige Ansatz
der Krebstherapie hat zu Verbesserungen bei der allgemeinen Überlebensrate und
der allgemeinen Morbiditätsrate
geführt.
Für das
einzelne Individuum sind diese verbesserten Statistiken jedoch nicht
zwangsweise mit einer Verbesserung der persönlichen Situation verbunden.
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Wenn
folglich eine Methodik bereitgestellt würde, die den Arzt in die Lage
versetzt, jeden Tumor unabhängig
von anderen Patienten derselben Gruppe zu behandeln, würde dies
den einzigartigen Ansatz erlauben, eine Therapie für nur eine
Person zu gestalten.
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Ein
solcher Therapieverlauf würde
idealerweise die Heilungsrate erhöhen und bessere Ergebnisse
liefern, wodurch ein lang bestehendes Bedürfnis erfüllt würde.
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In
der Vergangenheit wurde die Verwendung von polyklonalen Antikörpern mit
beschränktem
Erfolg bei der Behandlung humaner Krebserkrankungen eingesetzt.
Lymphome und Leukämien
wurden mit humanem Plasma behandelt, wobei es jedoch nur wenige
anhaltende Remissionen oder Reaktionen gab. Des Weiteren fehlte
die Reproduzierbarkeit, und es gab im Vergleich zur Chemotherapie
keinen zusätzlichen
Vorteil. Solide Tumoren, wie beispielsweise Brustkrebs, Melanome
und Nierenzellkarzinome, sind ebenfalls mit humanem Blut, Schimpansenserum,
humanem Plasma und Pferdeserum behandelt worden, wobei entsprechend unberechenbare
und unwirksame Ergebnisse erhalten wurden.
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Es
gab zahlreiche klinische Studien mit monoklonalen Antikörpern für solide
Tumore. In den 80er Jahren gab es mindestens vier klinische Studien
für humanen
Brustkrebs, die jeweils nur zu einem von mindestens 47 Patienten
als Ansprechenden führten,
wobei Antikörper
gegen spezifische Antigene oder basierend auf der Gewebeselektivität eingesetzt
wurden. Erst 1998 gab es eine erfolgreiche klinische Studie, bei
der ein humanisierter Anti-her2-Antikörper in Kombination mit Cisplatin
verwendet wurde. In dieser Studie wurden 37 Patienten auf ihr Ansprechen
untersucht; etwa ein viertel dieser Patienten zeigte eine teilweise
Ansprechrate und eine weitere Hälfte
zeigte ein geringes oder stabiles Fortschreiten der Erkrankung.
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In
den klinischen Studien, in denen kolorektaler Krebs untersucht wurde,
wurden Antikörper
sowohl gegen Glykoprotein-Ziele als auch gegen Glykolipid-Ziele
verwendet. Antikörper,
wie beispielsweise 17-1A, der einige Spezifität für Adenokarzinome aufweist,
wurde in klinische Studien der Phase 2 mit mehr als 60 Patienten
eingesetzt, wobei lediglich ein Patient ein teilweises Ansprechen
zeigte.
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In
anderen Studien führte
die Verwendung von 17-1A bei 52 Patienten in Protokollen, die zusätzlich Cyclophosphamid
verwendeten, lediglich zu einem vollständigen Ansprechen in einem
Fall und zu einem geringfügigen
Ansprechen in zwei Fällen.
Andere Studien, die 17-1A verwendeten, ergaben ähnliche Ergebnisse. Die Verwendung
eines humanisierten murinen monoklonalen Antikörpers, der ursprünglich für bildgebende Verfahren
zugelassen wurde, erzeugte ebenfalls keine Tumorregression. Bis
heute gibt es keinen Antikörper, der
gegen kolorektalen Krebs wirksam ist. Ähnlich schwache Ergebnisse
gab es auch bei Lungenkrebs, Krebserkrankungen des Gehirns, Krebserkrankungen
der Eierstöcke,
Bauchspeicheldrüsenkrebs,
Prostatakrebs und Magenkrebs. Einen eingeschränkten Erfolg gab es bei der
Verwendung des monoklonalen Anti-GD3-Antikörpers bei Melanomen. Es lässt sich
daher erkennen, dass die untersuchten Antikörper trotz erfolgreicher Untersuchungen
in Kleintieren, welche eine Voraussetzung für klinische Studien beim Menschen bilden,
weitestgehend unwirksam waren.
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Frühere Patente:
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US-Patent
Nr. 5,750,102 offenbart ein Verfahren, bei dem Zellen aus einem
Tumor eines Patienten mit MHC-Genen transfiziert werden, die aus
den Zellen oder aus dem Gewebe des Patienten kloniert werden können. Diese
transfizierten Zellen werden dann verwendet, um den Patienten zu
impfen.
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US-Patent
Nr. 4,861,582 offenbart ein Verfahren, das Schritte umfasst, bei
denen monoklonale Antikörper
erhalten werden, die spezifisch für eine interne zelluläre Komponente
von neoplastischen und normalen Zellen eines Säugetiers sind, jedoch nicht
für externe
Komponenten, der monoklonale Antikörper markiert wird, der markierte
Antikörper
mit Gewebe des Säugetiers
in Kontakt gebracht wird, das eine Therapie erhalten hat, um neoplastische
Zellen abzutöten,
und die Wirksamkeit der Thera pie durch Messung der Bindung des markierten
Antikörpers
an den internen zellulären
Bestandteil der degenerierten neoplastischen Zellen gemessen wird.
Indem man Antikörper
herstellt, die gegen humane intrazelluläre Antigene gerichtet sind,
erkennt der Patentinhaber, dass maligne Zellen eine leicht handhabbare
Bezugsquelle für
solche Antigene darstellen.
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US-Patent
Nr. 5,171,665 stellt einen neuen Antikörper sowie Verfahren für seine
Herstellung bereit. Das Patent lehrt insbesondere die Erzeugung
eines monoklonalen Antikörpers,
der die Eigenschaft aufweist, stark an ein Proteinantigen zu binden,
welches mit humanen Tumoren assoziiert ist, z.B. diejenigen von
Kolon und Lunge, wobei die Bindung an normale Zellen in weitaus
geringerem Ausmaß erfolgt.
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US-Patent
Nr. 5,484,596 stellt ein Verfahren zur Krebstherapie bereit, bei
dem man chirurgisch Tumorgewebe aus einem humanen Krebspatienten
entfernt, das Tumorgewebe behandelt, um Tumorzellen zu erhalten,
die Tumorzellen bestrahlt, so dass sie lebensfähig, jedoch nicht tumorigen
sind, und diese Zellen zur Herstellung eines Impfstoffs für den Patienten
verwendet, welcher in der Lage ist, das Wiederauftreten des Primärtumors
zu verhindern, wobei gleichzeitig Metastasen gehemmt werden. Das
Patent lehrt die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern, die
mit Oberflächenantigenen
von Tumorzellen reagieren. Wie in Spalte 4, Zeilen 45 ff. gezeigt
wird, verwendet der Patentinhaber autochthone Tumorzellen bei der
Entwicklung von monoklonalen Antikörpern, die für eine aktive
spezifische Immuntherapie bei humaner Neoplasie sorgen.
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US-Patent
Nr. 5,693,763 lehrt ein Glykoproteinantigen, das charakteristisch
für humane
Karzinome ist und nicht vom Epithelgewebe des Ursprungs abhängig ist.
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US-Patent
Nr. 5,783,186 bezieht sich auf Anti-Her2-Antikörper, die eine Apoptose in
Her2-exprimierenden Zellen induzieren, Hybridomzelllinien, die diese
Antikörper
erzeugen, Verfahren zur Behandlung von Krebs unter Verwendung der
Antikörper
sowie pharmazeutische Verbindungen, die diese Antikörper umfassen.
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US-Patent
Nr. 5,849,876 beschreibt neue Hybridomzelllinien für die Herstellung
von monoklonalen Antikörpern
gegen Mucin-Antigene,
die aus Tumorgewebequellen und Nicht-Tumorgewebequellen gereinigt
wurden.
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US-Patent
Nr. 5,869,268 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines humanen
Lymphozyten, der einen Antikörper
erzeugt, welcher spezifisch für
ein gewünschtes
Antigen ist, ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, sowie
monoklonale Antikörper,
die nach diesem Verfahren erzeugt werden. Das Patent bezieht sich
insbesondere auf die Herstellung eines humanen, monoklonalen Anti-HD-Antikörpers, der
für die
Diagnose und Behandlung von Krebserkrankungen nützlich ist.
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US-Patent
Nr. 5,869,045 betrifft Antikörper,
Antikörper-Fragmente, Antikörper-Konjugate
und einzelkettige Immuntoxine, die mit humanen Karzinomzellen reagieren.
Der Mechanismus, durch den diese Antikörper wirken, ist von doppelter
Natur; die Moleküle
sind reaktiv mit Antigenen der Zellmembran, die auf der Oberfläche von
humanen Karzinomen vorkommen, und darüber hinaus haben die Antikörper die
Fähigkeit,
nach der Bindung in die Karzinomzellen aufgenommen zu werden, was
sie insbesondere nützlich
bei der Herstellung eines Antikörperwirkstoffs
und bei der Herstellung von Antikörper-Toxin-Konjugaten macht. In ihrer unmodifizierten
Form zeigen die Antikörper
auch zytotoxische Eigenschaften bei bestimmten Konzentrationen.
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US-Patent
Nr. 5,780,033 offenbart die Verwendung von Autoantikörpern für die Therapie
und Prophylaxe von Tumoren. Dieser Antikörper ist jedoch ein antinukleärer Autoantikörper aus
einem alten Säugetier.
In diesem Fall wird behauptet, dass es sich bei dem Autoantikörper um
eine Art von natürlichem
Antikörper
handelt, der im Immunsystem vorgefunden wird. Da der Autoantikörper von "einem alten Säugetier" stammt, gibt es
kein Erfordernis, dass der Autoantikörper tatsächlich von dem zu behandelnden
Patienten stammt. Darüber hinaus
offenbart das Patent natürliche
und monoklonale antinukleäre
Autoantikörper
aus einem alten Säugetier
sowie eine Hybridomzelllinie, die ein monoklonalen antinukleären Autoantikörper erzeugt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfinder haben zuvor das US-Patent 6,180,357 mit dem Titel "Individualized Patient
Specific Anti-Cancer Antibodies" erhalten,
das ein Verfahren zur Selektion individuell angepaßter Anti-Krebs-Antikörper betrifft,
die bei der Behandlung einer Krebserkrankung nützlich sind.
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Diese
Anmeldung verwendet das Verfahren zur Herstellung Patientenspezifischer
Anti-Krebs-Antikörper,
wie es in dem '357
Patent zur Isolierung von Hybridomazelllinien, die für Antikörper kodieren,
welche eine Krebserkrankung modifizieren, beschrieben wird. Diese
Antikörper
können
spezifisch für
einen Tumor hergestellt werden, wodurch die individuelle Anpassung
der Krebstherapie ermöglicht
wird. In Zusammenhang mit dieser Anmeldung werden Anti-Krebs-Antikörper mit
entweder zellabtötenden
(zytotoxischen) oder mit das Zellwachstum inhibierenden (zytostatischen)
Eigenschaften im Folgenden als zytotoxisch bezeichnet. Diese Antikörper können als
Hilfsmittel bei der Stadieneinteilung (staging) und bei der Diagnose
einer Krebserkrankung verwendet werden, und sie können für die Behandlung
von Tumormetastasen verwendet werden.
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Die
Aussicht auf eine individualisierte Krebsbehandlung wird zu einer
Veränderung
der Art und Weise führen,
in der der Patient gehandhabt wird. Ein wahrscheinliches klinisches
Szenario besteht darin, dass eine Tumorprobe zum Zeitpunkt der Vorstellung
entnommen wird und in einer Bank gelagert wird. Ausgehend von dieser
Probe kann der Tumor mit einem Panel von vorbestehenden Antikörpern, die
eine Krebserkrankung modifizieren, typisiert werden. Bei dem Patienten
wird auf herkömmliche
Weise eine Stadieneinteilung (staging) vorgenommen, wobei jedoch
die verfügbaren
Antikörper
bei der weiteren Stadieneinteilung (staging) des Patienten nützlich sein
können.
Der Patient kann unverzüglich
mit den vorhandenen Antikörpern
behandelt werden, und ein Panel der Antikörper, die spezifisch für den Tumor
sind, kann entweder unter Verwendung der vorliegend beschriebenen
Verfahren oder durch die Verwendung von Phagen-Display-Bibliotheken
in Zusammenhang mit den vorliegend beschriebenen Screeningverfahren
erzeugt werden. Alle erzeugten Antikörper werden in die Bibliothek
der Anti-Krebs-Antikörper zugefügt werden,
da die Möglichkeit
besteht, dass andere Tumoren ein Teil desselben Epitops enthalten
wie dasjenige, das behandelt wird. Die gemäß des Verfahrens der vorliegenden
Erfindung erzeugten Antikörper
können
bei der Behandlung von Krebserkrankungen bei einer beliebigen Anzahl
von Patienten nützlich
sein, die Krebs haben, der an diese Antikörper bindet.
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Neben
Anti-Krebs-Antikörpern
kann der Patient die gegenwärtig
empfohlenen Therapien als Teil eines multimodalen Behandlungsverfahrens
wählen.
Die Tatsache, dass die nach der vorliegende Methode isolierten Antikörpern verhältnismäßig nichttoxisch
für Nichtkrebszellen
sind, ermöglicht
die Verwendung von Antikörperkombinationen
in hohen Dosen, entweder allein oder in Verbindung mit einer herkömmlichen
Therapie.
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Der
hohe therapeutische Index wird ferner die erneute Behandlung in
einem kurzen zeitlichen Abstand erlauben, was die Wahrscheinlichkeit
des Auftretens von Zellen verringern sollte, die gegen die Behandlung resistent
sind.
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Es
liegt ferner im Bereich dieser Erfindung, chemotherapeutische Standardmodalitäten, z.B.
Radionuklide, mit den CDMABs der vorliegenden Erfindung zu konjugieren,
wodurch die Verwendung dieser Chemotherapeutika verbessert wird.
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Wenn
der Patient gegenüber
dem anfänglichen
Behandlungsverlauf refraktär
ist oder wenn sich Metastasen entwickeln kann das Verfahren zur
Erzeugung spezifischer Antikörper
gegen den Tumor für
eine erneute Behandlung wiederholt werden. Darüber hinaus können die
Anti-Krebs-Antikörper
an rote Blutzellen konjugiert werden, die aus dem Patienten erhalten
wurden, und für
die Behandlung von Metastasen erneut durch Infusion eingebracht
werden. Es gibt bislang wenig wirksame Verfahren für die Behandlung
von metastatischen Krebs, und Metastasen weisen in der Regel auf
einen ungünstigen
Ausgang hin, der zum Tode führt. Metastatischer
Krebs ist jedoch in der Regel gut vaskularisiert, und die Bereitstellung
der Anti-Krebs-Antikörper durch
rote Blutzellen kann dazu führen,
dass sich die Antikörper
an der Stelle des Tumors konzentrieren. Selbst vor der Ausbildung
von Metastasen sind die meisten Krebszellen im Hinblick auf ihr Überleben
von der Blutzufuhr des Wirts abhängig,
und Anti-Krebs-Antikörper,
die an rote Blutzellen konjugiert sind, können auch gegen in situ-Tumore
wirksam sein. Alternativ dazu können
die Antikörper
an andere hämatogene
Zellen, z.B. an Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten, natürlicher
Killerzellen etc. konjugiert werden.
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Es
gibt 5 Klassen von Antikörpern,
und jede ist mit einer Funktion assoziiert, die durch die schwere Kette
vermittelt wird.
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Es
wird im Allgemeinen angenommen, dass die Abtötung von Krebszellen durch
nackte Antikörper entweder
durch Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität oder durch
Komplement-abhängige Zytotoxizität vermittelt
wird. Beispielsweise können
murine IgM-Antikörper
und IgG2a-Antikörper
das humane Komplementsystem durch Bindung der C-1-Komponente des
Komplementsystems aktivieren, wodurch der klassische Weg der Komplementaktivierung
aktiviert wird, was zur Lyse des Tumors führen kann. Bei humanen Antikörpern sind
IgM und IgG1 im Allgemeinen die Antikörper, die das Komplementsystem
am stärksten
aktivieren. Murine Antikörper
vom IgG2a- und IgG3-Isotyps sind wirksam bei der Rekrutierung zytotoxischer
Zellen, die Fc-Rezeptoren aufweisen, was zum Abtöten der Zellen durch Monozyten,
Makrophagen, Granulozyten und bestimmte Lymphozyten führt. Humane
Antikörper
sowohl vom Isotyp IgG1 als auch vom Isotyp IgG3 vermitteln ADCC.
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Ein
weiterer möglicher
Mechanismus der Antikörper-vermittelten
Abtötung
von Krebs kann durch die Verwendung von Antikörpern erfolgen, die die Hydrolyse
verschiedener chemischer Bindungen in der Zellmembran und ihren
assoziierten Glykoproteinen oder Glykolipiden katalysiert, den sogenannten
katalytischen Antikörpern.
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Es
gibt zwei weitere Mechanismen der Antikörper-vermittelten Abtötung von
Krebszellen, die stärker akzeptiert
sind. Der erste Mechanismus besteht in der Verwendung von Antikörpern als
Impfstoff, um den Körper
dazu zu bringen, eine Immunantwort gegen das putatives Krebsantigen
zu bilden, welches sich auf den Tumorzellen befindet. Der zweite
Mechanismus besteht in der Verwendung von Antikörpern, um Wachstumsrezeptoren
anzugreifen und mit ihrer Funktion zu interferieren oder den Rezeptor
herunter zu regulieren, so dass seine Funktion im Wesentlichen ausgeschaltet
wird.
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Demgemäß ist es
ein Ziel der Erfindung ein Verfahren zu verwenden, um Antikörper, die
eine Krebserkrankung modifizieren, aus Zellen herzustellen, die
von einem bestimmten Individuum erhalten wurden, und die zytotoxisch
gegenüber
Krebszellen sind, wobei sie gleichzeitig verhältnismäßig nichttoxisch gegenüber Nichtkrebszellen
sind, und um Hybridomzelllinien sowie die entsprechenden isolierten
monoklonalen Antikörper
und die Antigen-bindende Fragmente derselben, für die die Hybridomzelllinien
kodieren, zu isolieren.
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Es
ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Antikörper bereitzustellen, die eine
Krebserkrankung modifizieren, sowie Antigen-bindende Fragmente derselben.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Antikörper zu
erzeugen, die eine Krebserkrankung modifizieren, und deren Zytotoxizität durch
Antikörper-abhängige zelluläre Toxizität vermittelt
wird.
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Es
ist ein weiteres zusätzliches
Ziel der vorliegenden Erfindung, Antikörper zu erzeugen, die eine Krebserkrankung
modifizieren, und deren Zytotoxizität durch Komplement-abhängige zelluläre Toxizität vermittelt
wird.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Antikörper bereitzustellen,
die eine Krebserkrankung modifizieren, und deren Zytotoxizität eine Funktion
ihrer Fähigkeit
ist, die Hydrolyse von zellulären
chemischen Bindungen zu katalysieren.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Antikörper zu
erzeugen, die eine Krebserkrankung modifizieren, und die nützlich für einen
Bindungsassay zur Diagnose, Prognose und zum Verfolgen der Krebserkrankung
sind.
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Weitere
Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachstehenden
Beschreibung ersichtlich sein, in der zum Zwecke der Illustration
und als Beispiel bestimmte Ausführungsformen
der Erfindung beschrieben sind.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 umfasst
repräsentative
FACS-Histogramme von 10A304.7-Antikörpern, Isotyp-Kontroll-Antikörpern und
Anti-EGFR-Antikörpern,
die gegen verschiedene Krebszelllinien und Nicht-Krebszelllinien gerichtet sind.
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BEISPIEL 1
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Herstellung der Hybridome – Hybridomzelllinie
10A304.7
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Die
Hybridomzelllinie 10A304.7 wurde am 26. November 2002 nach dem Budapester
Vertrag bei der American Type Culture Collection, 10801 University
Blvd., Manassas, VA 20110-2209 unter der Zugriffsnummer PTA-5065
hinterlegt. Gemäß 37 CFR
1.808 versichern die Hinterleger, dass alle Beschränkungen
in Bezug auf die Verfügbarkeit
des hinterlegten Materials für
die Öffentlichkeit
unwiderruflich bei der Erteilung eines Patentes rückgängig gemacht
werden.
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Um
das Hybridom zu erzeugen, das den Anti-Krebs-Antikörper produziert,
wurden Einzelzellsuspensionen eines Kolontumors, der ausgehend von
der HT-29 Kolonkrebs-Zelllinie in SCID-Mäusen
gezüchtet
worden war, in kaltem PBS hergestellt. IMMUNEASYTM-Adjuvans
(Qiagen, Venlo, Niederlande) wurde durch vorsichtiges Vortexen für die Verwendung
hergestellt. 100 μl
IMMUNEASYTM-Adjuvans aus der Maus wurden
zu 10 Millionen HT-29-Zellen
in das Mikrozentrifugenröhrchen
gegeben, vermischt und für
15 Minuten bei Raumtemperatur gehalten.
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Acht
bis neun Wochen alte BALB/c-Mäuse
wurden durch intramuskuläre
Injektion von 100 μl
des Antigen-Adjuvans, das 2,5 Millionen Zellen enthielt, immunisiert.
Frisch hergestelltes Antigen-Adjuvans wurde verwendet, um die immunisierten
Mäuse 2
Wochen nach der ersten Immunisierung durch intraperitoneale Injektion
mit 2,5 Millionen Zellen in 250 μl
aufzufrischen. Eine Milz wurde 2 Tage nach der letzten Immunisierung für die Fusion
verwendet. Die Hybridome wurden durch Fusionieren der isolierten
Splenozyten mit NSO-1-Myelompartnern hergestellt. Die Überstände der
Fusionen wurden für
die Subklonierung der Hybridome untersucht.
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Um
zu bestimmen, ob die Antikörper,
die von den Hybridomzellen ausgeschieden werden, vom IgG-Isotyp
oder vom IgM-Isotyp sind, wurde ein ELISA-Assay verwendet. 100 μl/Vertiefung
eines Ziegen-anti-Maus-IgG + IgM (H + L) wurden bei einer Konzentration
von 2,4 μg/ml
in Beschichtungspuffer (0,1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,2–9,6) bei
4°C über Nacht
zu den ELISA-Platten
gegeben. Die Platten wurden dreimal mit Waschpuffer gewaschen (PBS
+ 0,05% Tween). 100 μl/Vertiefung
Blockierungspuffer (5% Milch in Waschpuffer) wurden für 1 Stunde
bei Raumtemperatur zu der Platte gegeben, und es wurde anschließend dreimal
mit Waschpuffer gewaschen. 100 μl/Vertiefung
des Hybridomüberstands
wurden zugegeben, und die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit Waschpuffer gewaschen,
und es wurden 100 μl/Vertiefung
einer 1/5000 Verdünnung
eines Ziegen-anti-Maus-IgG-
oder eines Ziegen-anti-Maus-IgM-Meerrettichperoxidasekonjugats (verdünnt in PBS,
das 1% bovines Serumalbumin enthielt) zugesetzt. Nach Inkubation
der Platte für
1 Stunde bei Raumtemperatur, wurde die Platte dreimal mit Waschpuffer
gewaschen. 100 μl/Vertiefung
TMB-Lösung
wurden für
1 bis 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
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Die
Farbreaktion wurde durch Zusatz von 100 μl/Vertiefung 2 M H2SO4 gestoppt, und die Platte wurde bei 450
nm mit einem Perkin-Elmer HTS7000 Plattenlesegerät ausgelesen. Wie in Tabelle
1 gezeigt ist, scheiden die 10A304.7 Hybridome in erster Linie Antikörper vom
Isotyp IgG aus.
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Nach
einer Runde einer limitierender Verdünnung wurden die Hybridomüberstände auf
Antikörper
getestet, die in einem Zell-ELISA-Assay
an Zielzellen binden. Drei Kolonkrebs-Zelllinien wurden untersucht: HT-29,
SW1116 und SW620. Die ausplattierten Zellen wurden vor der Verwendung
fixiert. Die Platten wurden dreimal bei Raumtemperatur mit PBS gewaschen,
das MgCl2 und CaCl2 enthielt.
100 μl 2%
Paraformaldehyd, das in PBS verdünnt
war, wurden für
10 Minuten bei Raumtemperatur in jede Vertiefung gegeben und anschließen verworfen.
Die Platten wurden erneut dreimal bei Raumtemperatur mit PBS gewaschen,
das MgCl2 und CaCl2 enthielt.
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Die
Blockierung wurde für
1 Stunde bei Raumtemperatur mit 100 μl/Vertiefung von 5% Milch in
Waschpuffer (PBS + 0,05% Tween) durchgeführt. Die Platten wurden dreimal
mit Waschpuffer gewaschen, und der Hybridomüberstand wurde mit 100 μl/Vertiefung
für 1 Stunde
bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Platten wurden dreimal mit Waschpuffer
gewaschen, und 100 μl/Vertiefung
einer 1/5000-Verdünnung
eines Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörpers oder
eines Ziegen-anti-Maus-IgM-Antikörpers, der
mit Meerrettichperoxidase konjugiert war (verdünnt in PBS, das 1% bovines
Serumalbumin enthielt), wurden zugesetzt. Nach 1 Stunde Inkubation
bei Raumtemperatur wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer gewaschen,
und 100 μl/Vertiefung TMB-Substrat
wurden für
1 bis 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde
durch 100 μl/Vertiefung
2 M H2SO4 abgestoppt,
und die Platte wurde bei 450 nm mit einem Perkin-Elmer HTS7000 Plattenlesegerät ausgelesen.
Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse wurden als Zahlen oder
als x-faches gegenüber dem
Hintergrund im Vergleich zur IgG-Isotyp-Kontrolle (3BD-27) angegeben.
Die Antikörper
des 10A304.7-Hybridoms hatten einen 22,8-fach, 13,1-fach bzw. 23,9-fach
höhere
Bindung gegenüber
dem Hintergrund in HT-29-, SW1116- bzw. SW620-Zellen. Dies zeigte,
dass der Antikörper
an ein Antigen band, das auf einigen Krebszellen stärker exprimiert
wurde als auf anderen.
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Im
Zusammenhang mit der Untersuchung der Antikörperbindung wurde die zytotoxische
Wirkung der Hybridomüberstände in denselben
Kolonkrebs-Zelllinien getestet: HT-29, SW1116 und SW620. Der Lebend-/Tot-Zytotoxizitätsassay
wurde von Molecular Probes (Eu, OR) erhalten. Die Assays wurden
gemäß den Anweisungen
des Herstellers durchgeführt,
wobei die nachstehend aufgeführten Änderungen
vorgenommen wurden. Die Zellen wurden vor dem Assay bei der vorbestimmten
geeigneten Dichte ausplattiert.
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Nach
2 Tagen wurden 100 μl Überstand
von der Hybridom-Mikrotiterplatte
auf die Zellplatten überführt und
in einem Inkubator mit 5% CO2 für 5 Tage
inkubiert. Die Vertiefungen, die als Positivkontrollen dienten, wurden
abgesaugt, bis sie leer waren, und es wurden 100 μl Natriumazid
und/oder Cycloheximid zugegeben. Der monoklonale Antikörper 3BD-27
wurde als Isotyp-Kontrolle ebenfalls zugegeben, da von diesem bekannt war,
dass er nicht an HT-29-Kolonkrebszellen bindet. Ein Anti-EGFR-Antikörper (C225)
wurde ebenfalls zum Vergleich in dem Assay verwendet. Nach 5 Tagen
Behandlung wurde die Platte durch Umdrehen entleert und getrocknet.
DPBS, das Raumtemperatur aufwies und MgCl2 und
CaCl2 enthielt, wurde mittels einer Mehrkanal-Druckflasche
in jede Vertiefung verteilt, und die Platte wurde nach dreimaligem
Klopfen durch Umdrehen entleert und anschließend getrocknet. 50 μl des fluoreszenten
Lebend-/Tot-Farbstoffs,
der in DPBS verdünnt war,
welches MgCl2 und CaCl2 enthielt,
wurden in jede Vertiefung gegeben, und es wurde bei 37°C in einem Inkubator
mit 5% CO2 für 30 Minuten inkubiert. Die
Platten wurden in einem Perkin-Elmer HTS7000 Fluoreszenz-Plattenlesegerät ausgelesen,
und die Daten wurden in Microsoft Excel analysiert. Die Daten sind
in Tabelle 1 aufgeführt.
Das 10A304.7-Hybridom erzeugte eine spezifische Zytotoxizität in 11%
der SW1116-Zellen, was dem Ergebnis ähnelte, das mit dem Anti-EGFR-Antikörper C225
erhalten wurde. Die starke Bindung von 10A304.7 an SW1116-Zellen
verwies darauf, dass dieses Ausmaß der Antikörperbindung ausreichend war,
um eine Zytotoxizität
gegen diese Krebszellen zu vermitteln. Obwohl es eine starke Bindung
des 10A304.7-Antikörpers
an HT-29-Krebszellen und SW620-Krebszellen im ELISA-Assay gab, induzierte
diese keine Zytotoxizität.
Dies verwies darauf, dass die Antikörperbindung allein nicht ausreichend
war, um eine Zytotoxizität
von 10A304.7 gegen HT-29- und SW620-Zellen zu vermitteln.
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Wie
in Tabelle 1 dargestellt ist, erzeugte der Antikörper 3BD-27, der vom selben
Isotyp ist wie der 10A304.7-Antikörper, und von dem bekannt war,
dass er nicht an HT-29-Kolonkrebszellen
bindet, keine Zytotoxizität
in dieser Krebszelllinie. Die bekannten nicht-spezifischen, zytotoxischen
Mittel Natriumazid und Cycloheximid erzeugten erwartungsgemäß eine Zytotoxizität. Im Vergleich
erzeugte der hinreichend definierte Anti-Krebs-Antikörper C225
13% Zytotoxizität
in SW1116-Krebszellen. Die Ergebnisse von Tabelle 1 zeigen, dass die
Bindung von 10A304.7 an Krebszellen ein wichtiger Schritt bei der
Erzeugung einer Zytotoxizität
ist, jedoch selbst nicht ausreichend ist, um dieses Ereignis zu
vermitteln.
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BEISPIEL 2
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Antikörper-Herstellung
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Der
monoklonale Antikörper
10A304.7 wurde durch Kultivierung der Hybridome in CL-1000-Flaschen (BD
Biosciences, Oakville, ON) produziert, wobei Ernten und erneutes
Aussäen
zweimal pro Woche erfolgten, und eine Standard-Antikörper-Aufreinigungsverfahren
mit Protein G-Sepharose 4-Fast Flow (Amersham Biosciences, Baie
d'Urfé, QC)
durchgeführt
wurde. Es liegt im Bereich der Erfindung, monoklonale Antikörper zu verwenden,
die humanisierte, chimärisierte
oder murine Antikörper
sind. 10A304.7 wurde mit mehreren Positivkontrollen (Anti-Fas (EOS9.1,
IgM, kappa, 20 mg/ml, eBiosciences, San Diego, CA), Anti-Her2/neu
(IgG1, kappa, 10 mg/ml, Inter Medico, Markham ON), Anti-EGFR (C225,
IgG1, kappa, 5 mg/ml, Cedarlane, Hornby, ON), Cycloheximid (100
mM, Sigma, Oakville, ON) und NaN3 (0,1 Sigma,
Oakville, ON)) und Negativkontrollen (107.3 (Anti-TNP, IgG1, kappa,
20 mg/ml, BD Biosciences, Oakville, ON), MPC-11 (Antigen-Spezifität unbekannt,
IgG2b, kappa, 20 mg/ml), IgG-Puffer
(2%)) in einem Zytotoxizitätsassay
verglichen (Tabelle 2).
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Brustkrebs-
(MB-231, MCF-7), Kolonkrebs- (Caco-2, DLD-1, Lovo, HT-29, SW1116,
SW620), Eierstockkrebs- (OVCAR), Bauchspeicheldrüsenkrebs- (BxPC-3), Prostatakrebs-
(PC-3) und Nichtkrebs- (CCD 27sk,
Hs888 Lu) Zelllinien wurden untersucht (alle von der ATCC, Manassas,
VA). Der Lebend-/Tot-Zytotoxizitätsassay
wurde von Molecular Probes erhalten (Eugene, OR). Die Assays wurden
gemäß den Anweisungen des
Herstellers durchgeführt,
wobei die nachstehend beschriebenen Änderungen vorgenommen wurden.
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Die
Zellen wurden vor dem Assay bei der vorbestimmten geeigneten Dichte
ausplattiert. Nach 2 Tagen wurden 100 μl des gereinigten Antikörpers in
Medium verdünnt,
und anschließend
in die Zellplatten überführt und
in einem Inkubator mit 5% CO2 für 5 Tage
inkubiert. Die Platten wurden durch Umdrehen entleert und getrocknet.
DPBS, das Raumtemperatur aufwies und MgCl2 und
CaCl2 enthielt, wurde mittels einer Mehrkanal-Druckflasche
in jede Vertiefung verteilt, und die Platte wurde nach dreimaligem
Klopfen durch Umdrehen entleert und anschließend getrocknet. 50 μl des fluoreszenten
Lebend-/Tot-Farbstoffs, der in DPBS verdünnt war, welches MgCl2 und CaCl2 enthielt,
wurde in jede Vertiefung gegeben und es wurde bei 37°C in einem
Inkubator mit 5% CO2 für 30 Minuten inkubiert. Die
Platten wurden in einem Perkin-Elmer HTS7000 Fluoreszenz-Plattenlesegerät ausgelesen,
und die Daten wurden in Microsoft Excel analysiert; die Ergebnisse
sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Daten zeigen den Durchschnittswert
aus vier Experimenten, die mit Dreifachansätzen getestet wurden und qualitativ
in folgender Weise dargestellt sind: 4/4 Experimenten mit 15% Zytotoxizität gegenüber dem
Hintergrund (++++), 2/4 Experimenten mit 15% Zytotoxizität gegenüber dem
Hintergrund (+++), mindestens 2/4 Experimenten mit 10 bis 15% Zytotoxizität gegenüber dem
Hintergrund (++), und mindestens 2/4 Experimenten mit 8 bis 10%
Zytotoxizität
gegenüber
dem Hintergrund. Nicht gekennzeichnete Zellen in Tabelle 2 stellen
inkonsistente Ergebnisse oder Wirkungen unter dem Schwellenwert
für die
Zytotoxizität
dar. Der Antikörper
10A304.7 produzierte 35% des zytotoxischen Effekts des hinreichend
beschriebenen Anti-EGFR-Antikörpers C225,
der 31% Zytotoxizität
in der Kolonzelllinie SW1116 produzierte. Die Wirkung der beiden Antikörper auf
diese Zelllinie stimmt mit den Ergebnissen in Tabelle 1 überein.
Darüber
hinaus induzierte 10A304.7 im Vergleich mit C225 10A304.7 eine signifikant
höhere
Zytotoxizität
gegen andere Krebszellen, einschließlich der Brustkrebszelllinien
MDA MB 231 (111%) und MCF-7 (850%), der Prostatakrebszelllinie PC-3 (375%),
und der Eierstockkrebszelllinie OVCAR (667%). Es ist zu beachten,
dass 10A304.7 keine Zytotoxizität gegen
mehrere Nichtkrebszellen, wie beispielsweise CCD 27sk oder HS888
Lu zeigte, was darauf verweist, dass der Antikörper eine Spezifität für verschiedene
Krebszellen aufweist. Die chemischen zytotoxischen Mittel induzierten
die erwartete Zytotoxizität,
während
mehrere andere Antikörper,
die zu Vergleichszwecken eingeschlossen waren, im Hinblick auf Beschränkungen
des biologischen Zellassays ebenfalls das erwartete Ergebnis lieferten.
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Die
Zellen wurden für
das FACS vorbereitet, indem der Zellmonolayer zunächst mit
DPBS (ohne Ca++ und Mg++)
gewaschen wurde. Zelldissoziationspuffer (INVITROGEN) wurde anschließend verwendet,
um die Zellen bei 37°C
von ihren Kulturplatten zu entfernen. Nach Zentrifugation und Einsammeln
wurden die Zellen in Dulbecco's
phosphatgepufferter Salzlösung
resuspendiert, die MgCl2, CaCl2 und
25% fetales bovines Serum bei 4°C
(Waschmedium) enthielt, und gezählt,
in geeigneter Zelldichte aliquotiert, zentrifugiert, um die Zellen zu
sedimentieren, und bei 4°C
in Färbemedium
resuspendiert (DPBS, das MgCl2, CaCl2 und 2% fetales bovines Serum enthielt,
in Gegenwart von Testantikörpern
(10A304.7) oder Kontrollantikörpern
(Isotyp-Kontrolle, Anti-EGF-R
oder Anti-Fas) bei 20 μg/ml
auf Eis für
30 Minuten. Vor der Zugabe von sekundärem Antikörper, der mit Alexa Fluor 488
konjugiert war, wurden die Zellen einmal mit Waschmedium gewaschen.
Der mit Alexa Fluor 488 konjugierte Antikörper wurde anschließend in
Färbemedium
für 20
Minuten zugesetzt. Die Zellen wurden anschließend ein letztes Mal gewaschen
und in Färbemedium
resuspendiert, das 1 μg/ml
Propidiumiodid enthielt. Die durchflusszytometrische Gewinnung der
Zellen wurde durchgeführt,
indem man die Proben auf einem FACScan unter Verwendung der CellQuest
Software (BD Biosciences) untersuchte.
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Das
Vorwärtsstreulicht
(forward scatter; FSC) und das Seitwärtsstreulicht (side scatter;
SSC) der Zellen wurden eingestellt, indem die Spannung und der Amplitudenzuwachs
auf den FSC- und SSC-Detektoren angepasst wurde. Die Detektoren
für die
drei Fluoreszenzkanäle
(FL1, FL2 und FL3) wurden angepasst, indem Zellen untersucht wurden,
die mit gereinigten Isotyp-Kontroll-Antikörper gefärbt worden waren, gefolgt von
sekundärem
Antikörper,
der mit Alexa Fluor 488 konjugiert war, so dass die Zellen einen
einheitlichen Ausdruck bei einer mittleren Fluoreszenzintensität von ungefähr 1 bis
5 Einheiten zeigten. Lebende Zellen wurden erhalten, indem das FSC
gesperrt und Propidiumiodid ausgeschlossen wurde. Für jede Probe
wurden ungefähr
10 000 lebende Zellen für
die Analyse erhalten, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
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Tabelle
3 stellt den x-fachen Zuwachs der mittleren Fluoreszenzintensität in Bezug
auf die Isotyp-Kontrolle dar und wird qualitativ wie folgt dargestellt:
weniger als 3 bis 5 (+); 5 bis 25 (++); 25 bis 50 (+++); und über 50 (++++).
Repräsentative
Histogramme von 10A304.7-Antikörpern
wurden in 1 als Beweis für die Bindungscharakteristika
zusammengestellt, einschließlich
der gezeigten bimodalen Maxima in einigen Fällen. 10A304.7 band nichtspezifisch
an alle Zelllinien, einschließlich
einer starken Bindung an die Nichtkrebszellen CCD-27sk und Hs888.Lu,
wobei jedoch das Ausmaß der
Bindung zwischen den verschiedenen Zelllinien variierte. 10A304.7
band folglich selektiv in verschiedenem Ausmaß an die Zelllinien. Die Ergebnisse
aus den Tabellen 2 und 3 verweisen darauf, dass die Bindung von
10A304.7 an Tumorzellen für
die Antikörper-vermittelte Zytotoxizität erforderlich
ist, jedoch nicht ausreicht, um dieses Ereignis auszulösen.