PT1613656E - Anticorpos modificadores de doenças cancerigenas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ANTICORPOS MODIFICADORES DE DOENÇAS CANCERÍGENAS"

ÁREA DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se ao isolamento e produção de anticorpos modificadores de doenças cancerígenas (CDMAB) e à utilização destes CDMAB em processos terapêuticos e de diagnóstico, opcionalmente em combinação com um ou mais agentes quimioterapêuticos. A invenção refere-se suplementarmente a ensaios de ligação que utilizam os CDMABs da presente invenção.

CONTEXTO DA INVENÇÃO

Cada indivíduo com cancro é único e tem um cancro que é diferente de outros cancros, tal como a identidade da pessoa. Apesar disso, a terapia actual trata todos os pacientes com o mesmo tipo de cancro, na mesma fase, da mesma maneira. Para pelo menos 30% destes pacientes a terapia de primeira linha irá falhar, conduzindo assim a rondas suplementares de tratamento e probabilidade acrescida de falha do tratamento, metástases e, por fim, morte. Uma abordagem superior ao tratamento seria a personalização da terapia para o indivíduo particular. A única terapia actual propensa a personalização é cirurgia. A quimioterapia e tratamento com radiação não podem ser personalizados para o paciente e a cirurgia, só por si, é inadequada na maior parte dos casos para produzir curas.

Com o advento dos anticorpos monoclonais, a possibilidade de desenvolver métodos para terapia personalizada tornou-se mais realista, uma vez que cada anticorpo pode ser dirigido para um único epítopo. Suplementarmente, é possível 2 produzir uma combinação de anticorpos dirigidos para a constelação de epítopos que define, de forma única, o tumor de um indivíduo particular.

Depois de ter reconhecido que uma diferença significativa entre células cancerosas e normais é o facto das células cancerosas conterem antigenes que são específicos para células transformadas, a comunidade científica tem sustentado desde há muito que anticorpos monoclonais podem ser concebidos para abordar especificamente células transformadas ao se ligarem especificamente a estes antigenes de cancro, dando assim origem à crença de que os anticorpos monoclonais podem servir de "Balas Mágicas" para eliminar células cancerosas.

Verificou-se que os anticorpos monoclonais isolados de acordo com os ensinamentos da invenção presentemente revelada modificam o processo de doenças cancerígenas de um modo que é benéfico para o paciente, por exemplo, reduzindo a carga tumoral, e serão aqui referidos de forma variada como anticorpos modificadores de doenças cancerígenas (CDMAB) ou anticorpos "anti-cancro".

Presentemente, o paciente com cancro tem, habitualmente, poucas opções de tratamento. A abordagem estritamente controlada à terapia de cancro tem produzido melhorias nas taxas globais de sobrevivência e morbidez. No entanto e para o indivíduo particular, estas estatísticas melhoradas não estão necessariamente correlacionadas com uma melhoria da sua situação pessoal.

Assim, se fosse apresentada uma metodologia que permitisse ao clínico tratar cada tumor independentemente de outros 3 pacientes do mesmo coorte, isto permitiria a abordagem única de terapia personalizada só para essa pessoa. Idealmente, a implementação dessa terapia iria aumentar a taxa de curas e produzir melhores resultados, desse modo satisfazendo uma necessidade sentida desde há muito tempo.

Historicamente, a utilização de anticorpos policlonais tem tido sucesso limitado no tratamento de cancros humanos. Linfomas e leucemias foram tratados com plasma humano, mas houve poucas reduções ou respostas prolongadas. Suplementarmente, observou-se uma ausência de reprodutibilidade e nenhuns benefícios adicionais em comparação com a quimioterapia. Tumores sólidos, como cancros da mama, melanomas e carcinomas de células renais, também foram tratados com sangue humano, soro de chimpanzé, plasma humano e soro de cavalo, com resultados correspondentemente imprevisíveis e ineficazes.

Tem havido muitos ensaios clínicos de anticorpos monoclonais para tumores sólidos. Na década de 1980 realizaram-se pelo menos quatro ensaios clínicos para cancro da mama humano, que resultaram apenas num respondedor de entre pelo menos 47 pacientes utilizando anticorpos contra antigenes específicos ou baseados na selectividade para tecidos. Foi só em 1998 que se realizou um ensaio clínico com êxito utilizando um anticorpo anti-her 2 humanizado em combinação com Cisplatina. Neste ensaio avaliaram-se 37 pacientes quanto a respostas, dos quais cerca de um quarto exibiu uma taxa de resposta parcial e outra metade exibiu progressão da doença muito pequena ou estável. 4

Os ensaios clínicos que investigam o cancro colorrectal envolvem anticorpos contra alvos glicoproteicos e glicolipídicos. Anticorpos tais como ο 17-1A, que tem alguma especificidade para adenocarcinomas, foram submetidos a ensaios clínicos de Fase 2 em mais de 60 pacientes, dos quais apenas um exibiu uma resposta parcial. Noutros ensaios, a utilização do 17-1A deu origem apenas a uma resposta completa e duas respostas muito pequenas entre 52 pacientes em protocolos utilizando ciclofosfamida adicional. Outros ensaios envolvendo ο 17-1A originaram resultados semelhantes. A utilização de um anticorpo monoclonal murino humanizado inicialmente aprovado para imagiologia também não produziu regressão tumoral. Até à data, nenhum anticorpo foi eficaz em cancro colorrectal. Da mesma forma, têm-se registado resultados igualmente fracos para cancro do pulmão, cancros do cérebro, cancros do ovário, cancro pancreático, cancro da próstata e cancro do estômago. Tem havido algum sucesso limitado na utilização do anticorpo monoclonal anti-GD3 para melanoma. Assim, pode observar-se que, apesar de estudos em animais pequenos bem sucedidos, que são um pré-requisito para ensaios clínicos em humanos, os anticorpos que foram testados têm sido, na sua maioria, ineficazes.

Patentes Anteriores A Patente U.S. N° 5 750 102 revela um processo em que células do tumor de um paciente são transfectadas com genes de MHC, que podem ser clonados de células ou tecido do paciente. Em seguida, estas células transfectadas são utilizadas para vacinar o paciente. A Patente U.S. N° 4 861 581 revela um processo que compreende os passos de obter anticorpos monoclonais que 5 são específicos para um componente celular interno de células neoplásticas e normais do mamífero mas não para componentes externos, etiquetar o anticorpo monoclonal, contactar o anticorpo etiquetado com tecido de um mamífero que recebeu terapia para matar células neoplásticas e determinar a eficácia da terapia medindo a ligação do anticorpo etiquetado ao componente celular interno das células neoplásticas degenerativas. Na preparação de anticorpos dirigidos para antigenes intracelulares humanos, o titular da patente reconhece que células malignas representam uma fonte conveniente desses antigenes. A Patente U.S. N° 5 171 665 fornece um novo anticorpo e método para a sua produção. Especificamente, a patente ensina a formação de um anticorpo monoclonal que tem a propriedade de se ligar fortemente a um antigene proteico associado a tumores humanos, por exemplo, os do cólon e pulmão, ligando-se a células normais em muito menor extensão. A Patente U.S. N° 5 484 596 proporciona um método de terapia de cancro que compreende remover cirurgicamente tecido tumoral de um paciente humano com cancro, tratar o tecido tumoral para obter células tumorais, irradiar as células tumorais de modo a serem viáveis mas não tumorigénicas e utilizar estas células para preparar uma vacina para o paciente capaz de inibir a recorrência do tumor primário, inibindo simultaneamente metástases. A patente ensina o desenvolvimento de anticorpos monoclonais que são reactivos com antigenes de superfície de células tumorais. Como apresentado na coluna 4, linhas 45 e seguintes, os titulares da patente utilizam células tumorais autóctones no desenvolvimento de anticorpos 6 monoclonais que expressam imunoterapia específica activa em neoplasia humana. A Patente U.S. N° 5 693 763 ensina um antigene glicoproteico característico de carcinomas humanos e que não depende do tecido epitelial de origem. A Patente U.S. N° 5 783 186 é dirigida a anticorpos Anti-Her2, que induzem apoptose em células que expressam o Her2, linhas de células de hibridoma que produzem os anticorpos, métodos de tratamento de cancro utilizando os anticorpos e composições farmacêuticas que incluem esses anticorpos. A Patente U.S. N° 5 849 876 descreve novas linhas de células de hibridoma para a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra antigenes de mucina purificados de fontes de tecidos tumorais e não tumorais. A Patente U.S. N° 5 869 268 é dirigida a um método para gerar um linfócito humano que produz um anticorpo específico para um antigene desejado e a um método para produzir um anticorpo monoclonal, bem como anticorpos monoclonais produzidos pelo método. A patente é particularmente dirigida à produção de um anticorpo monoclonal humano anti-HD útil para o diagnóstico e tratamento de cancros. A Patente U.S. N° 5 869 045 refere-se a anticorpos, fragmentos de anticorpos, conjugados de anticorpos e imunotoxinas de cadeia única reactivos com células de carcinoma humano. Estes anticorpos funcionam por um mecanismo duplo, pelo qual as moléculas são reactivas com antigenes da membrana celular presentes na superfície de 7 carcinomas humanos e, suplementarmente, por os anticorpos serem capazes de serem interiorizados nas células de carcinoma, subsequentemente à ligação, tornando-os especialmente úteis para formarem conjugados anticorpo-fármaco e anticorpo-toxina. Na sua forma não modificada, os anticorpos também manifestam propriedades citotóxicas em concentrações específicas. A Patente U.S. N° 5 780 033 revela a utilização de autoanticorpos para terapia e profilaxia de tumores. No entanto, este anticorpo é um autoanticorpo antinuclear de um mamífero envelhecido. Neste caso, diz-se que o autoanticorpo é um tipo de anticorpo natural presente no sistema imunológico. Uma vez que o autoanticorpo provém de "um mamífero envelhecido", não é necessário que o autoanticorpo provenha, de facto, do paciente a ser tratado. Adicionalmente, a patente revela autoanticorpos antinucleares naturais e monoclonais de um mamífero envelhecido e uma linha de células de hibridoma que produz um autoanticorpo antinuclear monoclonal.

RESUMO DA INVENÇÃO

Foi previamente atribuída aos presentes inventores a Patente U.S. 6 180 357, intitulada "Individualized Patient Specific Anti-Cancer Antibodies", dirigida a um processo para seleccionar anticorpos anti-cancro personalizados individualmente que são úteis no tratamento de uma doença cancerígena.

Esta candidatura utiliza o método de produção de anticorpos anti-cancro específicos para o paciente como ensinado na patente '357 para isolar linhas de células de hibridoma que codificam para anticorpos monoclonais modificadores de 8 doenças cancerígenas. Estes anticorpos podem ser preparados especificamente para um tumor e, assim, possibilitam a personalização da terapia de cancro. No contexto desta candidatura, anticorpos anti-cancro com a propriedade de matar células (citotóxicos) ou de inibir o crescimento de células (citostáticos) serão, daqui em diante, referidos como citotóxicos. Estes anticorpos podem ser utilizados no auxilio da determinação da fase e diagnóstico de um cancro e podem ser utilizados para tratar metástases tumorais. A perspectiva de um tratamento anti-cancro individualizado provocará uma alteração na gestão de um paciente. Um cenário clinico provável é a obtenção de uma amostra do tumor na altura da apresentação, sendo colocada num banco. A partir desta amostra, o tumor pode ser submetido a tipagem a partir de um painel pré-existente de anticorpos modificadores de doenças cancerígenas. Convenientemente, determinar-se-á a fase do tumor do paciente, mas os anticorpos disponíveis podem ser úteis para determinar suplementarmente a fase do tumor do paciente. 0 paciente pode ser tratado imediatamente com os anticorpos existentes, e pode produzir-se um painel de anticorpos específicos para o tumor utilizando os métodos esboçados aqui ou utilizando bibliotecas de expressão em fagos em conjunção com os métodos de rastreio revelados aqui. Todos os anticorpos gerados serão adicionados à biblioteca de anticorpos anti-cancro, uma vez que há a possibilidade de outros tumores poderem conter alguns dos mesmos epítopos tal como o que está a ser tratado. Os anticorpos produzidos de acordo com este método podem ser úteis para tratar doença cancerígena em qualquer número de pacientes com cancros que se ligam a estes anticorpos. 9

Adicionalmente a anticorpos anti-cancro, o paciente pode escolher ser submetido às terapias presentemente recomendadas como parte de um regime de tratamento multimodal. 0 facto dos anticorpos isolados via a presente metodologia serem relativamente não tóxicos para células não cancerosas permite utilizar combinações de anticorpos em doses elevadas, isoladamente ou em conjunção com terapia convencional. 0 índice terapêutico elevado também permitirá o tratamento de novo numa escala de tempo curta, o que deverá diminuir a probabilidade de emergirem células resistentes ao tratamento.

Suplementarmente, pertence ao âmbito desta invenção conjugar modalidades quimioterapêuticas comuns, por exemplo, radionuclidos, com os CDMABs da presente invenção, desse modo centrando a utilização desses agentes quimioterapêuticos.

Se o paciente não responder ao decurso inicial da terapia ou se se desenvolverem metástases, o processo de gerar anticorpos específicos para o tumor pode ser repetido para o tratamento de novo. Suplementarmente, os anticorpos anti-cancro podem ser conjugados com glóbulos vermelhos obtidos desse paciente e ser novamente infundidos para o tratamento de metástases. Tem havido poucos tratamentos eficazes para cancro metastático, sendo habitual que as metástases prognostiquem um mau resultado, acabando em morte. No entanto, os cancros metastáticos estão habitualmente bem vascularizados, e a distribuição de anticorpos anti-cancro por glóbulos vermelhos pode ter o efeito de concentrar os anticorpos no sítio do tumor. Mesmo antes da formação de metástases, a sobrevivência da maior parte das células cancerosas depende do fornecimento de sangue do hospedeiro, 10 e anticorpos anti-cancro conjugados com glóbulos vermelhos também podem ser eficazes contra tumores in situ. Alternativamente, os anticorpos podem ser conjugados com outras células hematogénicas, por exemplo, linfócitos, macrófagos, monócitos, células assassinas naturais, etc. Há cinco classes de anticorpos, e cada uma está associada a uma função gue lhe é conferida pela sua cadeia pesada. Em geral, pensa-se que a morte de células cancerosas por anticorpos nus é mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpos ou citotoxicidade dependente do complemento. Por exemplo, os anticorpos IgM e IgG2a murinos podem activar o complemento humano por ligação do componente C-l do sistema do complemento, desse modo activando a via clássica da activação do complemento, o que pode conduzir a lise do tumor. Para anticorpos humanos, os anticorpos activadores do complemento mais eficazes são, em geral, IgM e IgGl. Os anticorpos murinos do isotipo IgG2a e IgG3 são eficazes no recrutamento de células citotóxicas com receptores Fc que irão conduzir à morte de células por monócitos, macrófagos, granulócitos e certos linfócitos. Os anticorpos humanos do isotipo IgGl e IgG3 medeiam a ADCC.

Outro mecanismo possivel de morte de cancro mediada por anticorpos é pela utilização de anticorpos cuja função é catalisar a hidrólise de várias ligações químicas na membrana celular e suas glicoproteínas ou glicolípidos associados, denominados anticorpos catalíticos. Há dois mecanismos adicionais de morte de células cancerosas mediada por anticorpos que são mais amplamente aceites. 0 primeiro consiste em utilizar os anticorpos como vacina para induzir o corpo a produzir uma resposta 11 imunológica contra o antigene putativo do cancro que reside na célula tumoral. 0 segundo consiste em utilizar anticorpos para abordar selectivamente receptores do crescimento e interferir na sua função, ou regular negativamente esse receptor de modo que deixe de exercer eficazmente a sua função.

Em conformidade, um objectivo da invenção consiste em utilizar um método para produzir anticorpos modificadores de doenças cancerígenas, a partir de células derivadas de um indivíduo particular, que sejam citotóxicos relativamente a células cancerosas e, simultaneamente, relativamente não tóxicos para células não cancerosas, de modo a isolar linhas de células de hibridoma e os correspondentes anticorpos monoclonais isolados, e respectivos fragmentos de ligação de antigenes, para os quais são codificadas essas linhas de células de hibridoma.

Um objectivo adicional da invenção consiste em ensinar anticorpos modificadores de doenças cancerígenas e respectivos fragmentos de ligação de antigenes.

Um objectivo suplementar da presente invenção consiste em produzir anticorpos modificadores de doenças cancerígenas cuja citotoxicidade é mediada por toxicidade celular dependente de anticorpos.

Ainda um objectivo adicional da presente invenção consiste em produzir anticorpos modificadores de doenças cancerígenas cuja citotoxicidade é mediada por toxicidade celular dependente do complemento. 12

Ainda um objectivo suplementar da presente invenção consiste em produzir anticorpos modificadores de doenças cancerígenas cuja citotoxicidade é uma função da sua capacidade para catalisar a hidrólise de ligações químicas celulares.

Ainda um objectivo suplementar da presente invenção consiste em produzir anticorpos modificadores de doenças cancerígenas que são úteis, num ensaio de ligação, para o diagnóstico, prognóstico e monitorização de cancro.

Outros objectivos e vantagens desta invenção tornar-se-ão claros a partir da descrição seguinte, onde se apresentam, a título ilustrativo e exemplificativo, certas especificações desta invenção.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS A Figura 1 inclui histogramas de FACS representativos de anticorpos 10A304.7, anticorpos de controlo do isotipo, anticorpos anti-EGFR dirigidos contra várias linhas de células cancerosas e células não cancerosas. EXEMPLO 1

Produção de Hibridomas - Linha de Células de Hibridoma 10A304.7 A linha de células de hibridoma 10A304.7 foi depositada, de acordo com o Tratado de Budapeste, na American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, em 26 de Novembro de 2002, com o Número de Acesso PTA-5065. De acordo com 37 CFR 1.808, os depositantes asseguram que todas as restrições impostas à 13 disponibilidade ao público dos materiais depositados serão irrevogavelmente removidas pela concessão de uma patente.

Para produzir o hibridoma que produz anticorpo anti-cancro, prepararam-se em PBS frio suspensões de células isoladas de um tumor do cólon que cresceu em ratinhos SCID a partir da linha de células de cancro do cólon HT-29. Preparou-se o adjuvante IMMUNEASY™ (Qiagen, Venlo, Países Baixos) utilizando vórtice suave. Adicionaram-se 100 microlitros de adjuvante IMMUNEASY™ de ratinho a 10 milhões de células HT-29 no tubo de microcentrífuga, misturou-se e deixou-se à temperatura ambiente durante 15 minutos. Ratinhos BALB/c com oito até nove semanas de idade foram imunizados por injecção intramuscular de 100 microlitros do antigene-adjuvante contendo 2,5 milhões de células. Utilizou-se antigene-adjuvante preparado de fresco para o reforço dos ratinhos imunizados duas semanas após a imunização inicial, a 2,5 milhões de células em 250 microlitros, por injecção intraperitoneal. Utilizou-se um baço para fusão dois dias após a última imunização. Prepararam-se os hibridomas fundindo os esplenócitos isolados com parceiros de mieloma NSO-1. Testaram-se os sobrenadantes das fusões quanto à subclonagem dos hibridomas.

Empregou-se um ensaio ELISA para determinar se os anticorpos segregados pelas células de hibridoma são do isotipo IgG ou IgM. Adicionaram-se às placas de ELISA, durante a noite, 100 microlitros/cavidade de IgG + IgM de cabra anti-ratinho (H+L), a uma concentração de 2,4 microgramas/ml, em tampão de revestimento (tampão de carbonato/bicarbonato 0,1 M, pH 9,2-9,6) a 4 °C. As placas foram lavadas três vezes em tampão de lavagem (PBS + Tween 0,05%) . Adicionaram-se à placa, durante 1 hora à 14 temperatura ambiente, 100 microlitros/cavidade de tampão de bloqueio (leite 5% em tampão de lavagem), que depois foi lavada três vezes em tampão de lavagem. Adicionaram-se 100 microlitros/cavidade de sobrenadante de hibridoma e incubou-se a placa durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavaram-se as placas três vezes em tampão de lavagem e adicionou-se uma diluição de 1/5000 de conjugado de IgG ou IgM de cabra anti-ratinho com peroxidase de rábano bravo (diluído em PBS contendo albumina de soro de bovino 1%), 100 microlitros/cavidade. Depois de incubar a placa durante 1 hora à temperatura ambiente, lavou-se a placa três vezes com tampão de lavagem. Incubaram-se 100 microlitros/ cavidade de solução TMB durante 1-3 minutos à temperatura ambiente. A reacção de cor foi terminada por adição de 100 microlitros/cavidade de H2S04 2 M e a placa foi lida, a 450 nm, com um leitor de placas Perkin-Elmer HTS7000. Como indicado na Tabela 1, os hibridomas 10A304.7 segregaram maioritariamente anticorpos do isotipo IgG.

Tabela 1 Isotipo por ELISA (Teses (udjTAi do de fundo) Citotoxicidade <%í Ligação (acima do nivel de fundo) HT-28 SWhlS SWÊ2S HT-29 SW1116 SW620 Clone SgS tglvl Média CV Média £j>V Média cv Vezes Vezes Vezes 1SA3Q4.7 39.0 0.7 -57 11 13 1: 22.3 13.1 23.S 330-2:7 -34 δ •26 12 76 43 61 10 68 18 Cic1o-hex±m±da 23 s 17 14 -2 fcnti-EGFR (C225) 13 10

Após uma ronda de diluição limitante, os sobrenadantes de hibridoma foram testados quanto a anticorpos que se ligaram a células-alvo num ensaio ELISA de células. Testaram-se três linhas de células de cancro do cólon: HT-29, SW1116 e SW620. As células plaqueadas foram fixadas antes da utilização. As placas foram lavadas três vezes com PBS contendo MgCl2 e CaCl2 à temperatura ambiente. Adicionaram-se a cada cavidade, durante dez minutos à temperatura 15 ambiente, 100 microlitros de paraformaldeído 2% diluído em PBS, tendo depois sido desperdiçados. Lavaram-se novamente as placas com PBS contendo MgCl2 e CaCl2 três vezes à temperatura ambiente. O bloqueio foi efectuado com 100 microlitros/cavidade de leite 5% em tampão de lavagem (PBS + Tween 0,05%) durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem e o sobrenadante de hibridoma foi adicionado, a 100 microlitros/cavidade, durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavaram-se as placas três vezes com tampão de lavagem e adicionaram-se 100 microlitros/cavidade de uma diluição 1/5000 de anticorpo IgG ou IgM de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano bravo (diluído em PBS contendo albumina de soro de bovino 1%) . Após uma hora de incubação à temperatura ambiente, as placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem e 100 microlitros/cavidade de substrato TMB foram incubados durante 1-3 minutos à temperatura ambiente. Terminou-se a reacção com 100 microlitros/cavidade de H2S04 2 M e leu-se a placa, a 450 nm, com um leitor de placas Perkin-Elmer HTS7000. Os resultados apresentados na Tabela 1 estão expressos como o número de vezes acima do nível de fundo em comparação com o controlo do isotipo IgG (3BD-27) . Os anticorpos do hibridoma 10A304.7 exibiram uma ligação maior em 22,8 vezes, 13,1 vezes e 23,9 vezes acima do nível de fundo em células HT-29, SW1116 e SW620, respectivamente. Isto indica que o anticorpo se ligou a um antigene que foi expresso em maior extensão nalgumas células cancerosas do que noutras.

Em conjunção com a realização de testes quanto à ligação do anticorpo, testou-se o efeito citotóxico dos sobrenadantes de hibridoma nas mesmas linhas de células de cancro do 16 cólon: HT-29, SW 1116 e SW620. 0 ensaio de citotoxicidade Live/Dead foi obtido da Molecular Probes (Eu, OR). Os ensaios foram efectuados de acordo com as instruções do fabricante, com as alterações esboçadas abaixo. As células foram plaqueadas antes do ensaio na densidade apropriada predeterminada. Passados 2 dias, transferiram-se para as placas de células 100 microlitros de sobrenadante placas de microtítulo de hibridoma e as placas incubadas num incubador com 5% de CO2 durante 5 dias. As cavidades que serviram de controlos positivos foram aspiradas até ficarem vazias e adicionaram-se 100 microlitros de azida de sódio e/ou ciclo-heximida. Também se adicionou anticorpo monoclonal 3BD-27 como controlo do isotipo, uma vez que se sabe não se ligar a células de cancro do cólon HT-29. Para comparação, também se utilizou no ensaio um anticorpo anti-EGFR (C225) . Após 5 dias de tratamento, a placa foi esvaziada por inversão e seca por coloração. De uma garrafa compressível de múltiplos canais distribuiu-se, em cada cavidade, DPBS à temperatura ambiente contendo MgCl2 e CaCl2, as cavidades foram drenadas três vezes, esvaziadas por inversão e secas por coloração. Adicionaram-se a cada cavidade 50 microlitros do corante fluorescente Live/Dead diluído em DPBS e contendo MgCl2 e CaCl2 e incubou-se o sistema a 37 °C num incubador com 5% de CO2 durante 30 minutos. As placas foram lidas num leitor de placas de fluorescência Perkin-Elmer HTS7000 e os dados foram analisados com o programa Microsoft Excel. Os resultados estão listados na Tabela 1. O hibridoma 10A304.7 produziu citotoxicidade específica de 11% em células SW1116, o que foi semelhante ao obtido com o anticorpo anti-EGFR C225. A ligação forte do 10A304.7 a células SW1116 indicou que este nível de ligação de anticorpo era suficiente para mediar a citotoxicidade contra estas 17 células cancerosas. Apesar de ter ocorrido ligação forte do anticorpo 10A304.7 a células cancerosas HT-29 e SW620, pelo ensaio ELISA de células, este acontecimento não induziu citotoxicidade. Isto sugeriu que a ligação do anticorpo isoladamente não foi suficiente para mediar a citotoxicidade do 10A304.7 contra células HT-29 e SW620. Como listado na Tabela 1, o anticorpo 3BD-27, do mesmo isotipo do anticorpo 10A304.7 e que se sabe de antemão não se ligar a células de cancro do cólon HT-29, não produziu citotoxicidade nessa linha de células de cancro. Os agentes citotóxicos inespecificos conhecidos azida de sódio e ciclo-heximida produziram citotoxicidade como esperado. Como comparação, o anticorpo anti-cancro bem definido C225 produziu 13% de citotoxicidade em células cancerosas SW 1116. Os resultados da Tabela 1 indicam que a ligação do 10A304.7 a células cancerosas pode ser um passo importante na produção de citotoxicidade, mas não é suficiente, por si própria, para mediar este acontecimento. EXEMPLO 2

Produção de Anticorpos

Produziu-se o anticorpo monoclonal 10A304.7 por cultura dos hibridomas em balões CL-1000 (BD Biosciences, Oakville, ON) , com recolhas e novas culturas duas vezes por semana e procedimentos comuns de purificação de anticorpos com Proteína G Sefarose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences, Baie d'Urfé, QC) . Pertence ao âmbito desta invenção utilizar anticorpos monoclonais que são anticorpos humanizados, quimerizados ou murinos. Comparou-se ο 10A304.7 com alguns controlos positivos (anti-Fas (E0S9.1, IgM, kapa, 20 mg/ml, eBioscience, San Diego, CA), anti-Her2/neu (IgGl, kapa, 10 mg/ml, Inter Medico, Markham, ON) , anti-EGFR (C225, IgGl, 18 kapa, 5 mg/ml, Cedarlane, Hornby, ON) , Ciclo-heximida (100 mM, Sigma, Oakville, ON) e NaN3 (0,1%, Sigma, Oakville, ON)) e negativos (107.3 (anti-TNP, IgGl, kapa, 20 mg/ml, BD Biosciences, Oakville, ON) , MPC-11 (especificidade antigénica desconhecida, IgG2b, kapa, 20 mg/ml), Tampão de IgG (2%)) num ensaio de citotoxicidade (Tabela 2) . Testaram-se linhas de células de cancro da mama (MB-231, MCF-7), cancro do cólon (Caco-2, DLD-1, Lovo, HT-29, SW1116, SW620), cancro do ovário (OVCAR), cancro pancreático (BxPC-3), cancro da próstata (PC-3) e não cancerosas (CCD 27sk, Hs888 Lu) (todas provenientes da ATCC, Manassas, VA) . O ensaio de citotoxicidade Live/Dead foi obtido da Molecular Probes (Eugene, OR) . Os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante, com as modificações esboçadas abaixo.

Tabela 2 Cólon Pâncreas Mama Próstata Ovário Cacp-â OU>-1 Lava um SWH* Μβ-23» j MCM OVCAR Ι0Α30Λ.7 «a&wiArf-! 44 4+ f 444+ +++ +41+ w n S i Si Anti-Eas í&Jjiptatj 44 a a L-t 4+4+ j +4 +444 Anti-Her2/neu . ........ J anti-EGER(c32S. 5 +++ 44+4 ++++ 4 j Ciclo-heidjiãda (ίβϊμΜϊ ++++ +444 +Ή+ 4444 m 1 44+4 I 44++ +4++ T*TT Ά 1 11 ®G1 χιΰτΧ&ιΦί) 4 4 + Stj<S3S> íOts.Tii 4 j Tampão de IqG (2%) ____J_

As células foram plaqueadas antes do ensaio na densidade apropriada predeterminada. Passados 2 dias, diluiram-se nos meios 100 microlitros de anticorpo purificado, sendo depois transferidos para as placas de células e incubados num incubador com 5% de CO2 durante 5 dias. Em seguida, a placa foi esvaziada por inversão e seca por coloração. De uma garrafa compressivel de múltiplos canais distribuiu-se, em cada cavidade, DPBS à temperatura ambiente contendo MgCl2 e CaCl2, as cavidades foram drenadas três vezes, esvaziadas por inversão e secas por coloração. Adicionaram-se a cada cavidade 50 microlitros do corante fluorescente Live/Dead 19 diluído em DPBS e contendo MgCl2 e CaCl2 e incubou-se o sistema a 37 °C num incubador com 5% de C02 durante 30 minutos. As placas foram lidas num leitor de placas de fluorescência Perkin-Elmer HTS7000, os dados foram analisados com o programa Microsoft Excel e os resultados foram listados na Tabela 2. Os dados representam uma média de quatro experiências testadas em triplicado e estão apresentados qualitativamente da forma seguinte: 4/4 experiências com 15% de citotoxicidade acima do nível de fundo (++++), 2/4 experiências com 15% de citotoxicidade acima do nível de fundo (+++), pelo menos 2/4 experiências com 10-15% de citotoxicidade acima do nível de fundo (++) e pelo menos 2/4 experiências com 8-14% de citotoxicidade acima do nível de fundo. As células não marcadas na Tabela 2 representam citotoxicidade inconsistente ou efeitos inferiores à citotoxicidade limite. O anticorpo 10A304.7 produziu 35% do efeito citotóxico do anticorpo anti-EGFR bem descrito C225, que induziu 31% de citotoxicidade na linha de células do cólon SW1116. O efeito dos dois anticorpos nesta linha de células é consistente com os resultados da Tabela 1. Suplementarmente, ο 10A304.7 induziu citotoxicidade significativamente mais elevada contra outras células cancerosas, em comparação com o C225, incluindo as linhas de células de cancro da mama MDA MB 231 (111%) e MCF-7 (850%), a linha de células de cancro da próstata PC-3 (375%) e a linha de células de cancro do ovário OVCAR (667%). É importante notar que ο 10A304.7 não produziu citotoxicidade contra algumas células não cancerosas, como CCD 27sk ou Hs888 Lu, indicando que o anticorpo tem especificidade para várias células cancerosas. Os agentes químicos citotóxicos induziram a respectiva citotoxicidade esperada e alguns anticorpos diferentes, que foram incluídos para comparação, também 20 actuaram conforme o esperado, dadas as limitações dos ensaios celulares biológicos.

Prepararam-se as células para FACS lavando inicialmente a monocamada de células com DPBS (sem Ca++ nem Mg++) . Depois utilizou-se tampão de dissociação de células (INVITROGEN) para desalojar as células das suas placas de cultura de células a 37 °C. Após centrifugação e recolha, as células foram novamente suspensas em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco contendo MgCl2, CaCl2 e soro fetal de bovino 25% a 4 °C (meio de lavagem) e foram contadas, transferidas em aliquotas para perfazer a densidade celular apropriada, submetidas a rotação para transformar as células em grânulos e novamente suspensas em meio de coloração (DPBS contendo MgCl2, CaCl2 e soro fetal de bovino 2%) a 4 °C, na presença de anticorpos de teste (10A304.7) ou anticorpos de controlo (controlo do isotipo, anti-EGF-R ou anti-Fas) a 20 microgramas/ml em gelo durante 30 minutos. Antes da adição do anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488, as células foram lavadas uma vez com meio de lavagem. Depois adicionou-se o anticorpo conjugado com Alexa Fluor 488 em meio de coloração durante 20 minutos. As células foram lavadas pela última vez e foram novamente suspensas em meio de coloração contendo 1 micrograma/ml de iodeto de propídio. Avaliou-se a aquisição citométrica de fluxo das células submetendo as amostras a FACScan, utilizando o "software" CellQuest (BD Biosciences). Fixou-se o espalhamento directo (FSC) e lateral (SSC) das células ajustando os ganhos de voltagem e amplitude nos detectores de FSC e SSC. Ajustaram-se os detectores para os três canais de fluorescência (FL1, FL2 e FL3) submetendo células coradas com anticorpo de controlo do isotipo purificado seguido de anticorpo secundário 21 conjugado com Alexa Fluor 488, de modo que as células exibiram um sinal uniforme com uma intensidade fluorescente média, aproximadamente, de 1-5 unidades. As células vivas foram adquiridas por bloqueio de fluxo para FSC e exclusão com iodeto de propidio. Para cada amostra adquiriram-se aproximadamente 10 000 células vivas para análise; os resultados estão apresentados na Tabela 3. Cólon Pâncreas Mama Próstata Ovário Células formais Tabela 3 '··.····· > DLDA LWO: HT-23 sv-vmi? 3W620 MS-23'ϊ MCF-7 PC-3 OVCAR CCO 27sk 10*304.7· ++--+ ++ + ++ ++--+ -++ + 44+ + 4- 44+4 4+ 444 + + 4-4 + 44+ *44* (bimodal) (bimodal) Anti-Fas +4 ++ + 4+ 4+ ++ +4+ Anti-EGFR ~+ 44- »+ + 4 + 4+4 ++++ 4* Λ.+ 4 *++ ++ 4*4 (bino dal) (bimodal) A Tabela 3 lista o aumento de vezes da intensidade da fluorescência média acima do controlo do isotipo e está apresentada qualitativamente da forma seguinte: menos de 3 até 5 ( + ) ; 5 até 25 (++) ; 25 até 50 (+++) , e acima de 50 (+ + + +) . Compilaram-se na Figura 1 histogramas representativos dos anticorpos 10A304.7, evidenciando as características da ligação, inclusivamente picos bimodais ilustrados nalguns casos. Ο 10A304.7 ligou-se inespecificamente a todas as linhas de células, incluindo ligação elevada às células não cancerosas CCD-27sk e Hs888.Lu, mas o grau de ligação diferiu entre as várias linhas de células. Assim, ο 10A304.7 ligou-se selectivamente às linhas de células em níveis diferentes. Os resultados das Tabelas 2 e 3 indicam que a ligação do 10A304.7 a células tumorais é necessária para a citotoxicidade mediada por anticorpos, mas não é suficiente para desencadear este acontecimento.

Lisboa, 8 de Fevereiro de 2007

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal isolado codificado pelo clone depositado na ATCC com o Número de Acesso PTA-5065.

2. Anticorpo da Reivindicação 1 que é um anticorpo humanizado.

3. Anticorpo da Reivindicação 1 que é um anticorpo quimerizado.

4. Clone isolado depositado na ATCC com o Número de Acesso PTA-5065.

5. Ensaio de liqação para determinar a presença de células cancerosas numa amostra de tecido seleccionado de um tumor humano, que compreende: fornecer um anticorpo monoclonal isolado, ou respectivo fragmento de ligação de antigenes, codificado pelo clone depositado na ATCC com o Número de Acesso PTA-5065; contactar o referido anticorpo monoclonal isolado, ou respectivo fragmento de ligação de antigenes, com a referida amostra de tecido, e determinar a ligação do referido anticorpo monoclonal isolado, ou respectivo fragmento de ligação de antigenes, com a referida amostra de tecido; pelo qual é indicada a presença das referidas células cancerosas na referida amostra de tecido.

6. Ensaio de ligação da Reivindicação 5, em que a amostra de tecido tumoral humano foi obtida de um tumor originário num tecido seleccionado do grupo que consiste em tecido do cólon, ovário, pulmão e mama. 2

7. Processo de isolamento ou rastreio de células cancerosas numa amostra de tecido seleccionada de um tumor humano, que compreende: fornecer um anticorpo monoclonal isolado, ou respectivo fragmento de ligação de antigenes, codificado pelo clone depositado na ATCC com o Número de Acesso PTA-5065; contactar o referido anticorpo monoclonal isolado, ou respectivo fragmento de ligação de antigenes, com a referida amostra de tecido, e determinar a ligação do referido anticorpo monoclonal isolado, ou respectivo fragmento de ligação de antigenes, com a referida amostra de tecido; pelo qual as referidas células cancerosas são isoladas pela referida ligação e se confirma a sua presença na referida amostra de tecido.

8. Processo da Reivindicação 7, em que a amostra de tecido tumoral humano foi obtida de um tumor originário num tecido seleccionado do grupo que consiste em tecido do cólon, ovário, pulmão e mama.

9. Fragmentos de ligação de antigenes do anticorpo monoclonal isolado da Reivindicação 1.

10. Fragmentos de ligação de antigenes do anticorpo humanizado da Reivindicação 2.

11. Fragmentos de ligação de antigenes do anticorpo quimerizado da Reivindicação 3.

12. Anticorpo isolado ou fragmentos de ligação de antigenes de qualquer uma das Reivindicações 1, 2, 3, 9, 10 ou 11 conjugados com um membro seleccionado do grupo que consiste 3 3 compostos radioactivos e em fracções citotóxicas, enzimas, células hematogénicas. Lisboa, 8 DE Fevereiro de 2007