ES2278309T3 - Anticuerpos que modifican una enfermedad cancerosa. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal aislado codificado por el clon depositado en la ATCC con el número de referencia PTA-5065.
Description
Anticuerpos que modifican una enfermedad
cancerosa.
Esta invención se refiere al aislamiento y
producción de anticuerpos que modifican una enfermedad cancerosa
(ACMEC) y al uso de estos ACMEC en procedimientos terapéuticos y
diagnósticos, opcionalmente en combinación con uno o más agentes
quimioterapéuticos. La invención además se refiere a ensayos de
unión que utilizan los ACMEC de la presente invención.
Cada individuo que presenta un cáncer es único y
tiene un cáncer que es tan diferente de otros cánceres como la
identidad de esta persona. A pesar de esto, la terapia actual trata
a todos los pacientes con el mismo tipo de cáncer, en la misma
fase, de la misma forma. Al menos el 30% de estos pacientes no
responderán a la terapia de primera línea lo que, de este modo,
llevará a rondas adicionales de tratamiento y al aumento de la
probabilidad de que falle el tratamiento, a metástasis y finalmente
a la muerte. Una aproximación destacada para el tratamiento sería
la personalización de la terapia para el individuo en particular. La
única terapia actual que se presta en sí a la personalización es la
cirugía. Los tratamientos de quimioterapia y de radiación no pueden
adaptarse al paciente y la cirugía en sí, en la mayoría de los
casos, no es adecuada para obtener la curación.
Con la llegada de los anticuerpos monoclonales,
la posibilidad de desarrollar procedimientos para una terapia
personalizada se convirtió en algo más realista ya que cada
anticuerpo puede dirigirse a un único epítopo. Adicionalmente, es
posible producir una combinación de anticuerpos que se dirijan hacia
un grupo de epítopos que definan exclusivamente el tumor de un
individuo en particular.
Habiendo reconocido que una diferencia
significativa entre células cancerosas y normales es que las células
cancerosas contienen antígenos que son específicos de las células
transformadas, la comunidad científica ha mantenido largamente que
pueden diseñarse anticuerpos monoclonales que se dirijan
específicamente a las células transformadas uniéndose
específicamente a estos antígenos cancerígenos, dando lugar de este
modo a la creencia de que los anticuerpos monoclonales puede servir
como "balas mágicas" para eliminar células cancerosas.
Se ha demostrado que los anticuerpos
monoclonales aislados según los resultados de la invención descrita
a continuación modifican el proceso de la enfermedad cancerosa de
una forma beneficiosa para el paciente, por ejemplo, reduciendo la
carga tumoral, y se referirán de forma diversa en este documento
como anticuerpos que modifican una enfermedad cancerosa (ACMEC) o
anticuerpos "anticáncer".
En el momento actual, el paciente de cáncer
normalmente tiene escasas opciones de tratamiento. La aproximación
pautada como terapia contra el cáncer ha producido mejoras en la
supervivencia global y en las tasas de morbilidad. Sin embargo,
para el individuo en particular, estas mejoras estadísticas no se
relacionan necesariamente con una mejora de su situación
personal.
De este modo, si se presentase una metodología
que permitiera al médico tratar cada tumor independientemente del
de otros pacientes de la misma cohorte, esto podría permitir la
aproximación exclusiva de la terapia personalizada apropiada para
esta persona. Este ciclo de terapia idealmente podría aumentar la
tasa de curaciones y producir mejores resultados, satisfaciendo de
este modo una necesidad sentida desde hace tiempo.
Históricamente, el empleo de anticuerpos
policlonales ha sido utilizado con un éxito limitado en el
tratamiento de cánceres humanos. Se han tratados linfomas y
leucemias con plasma humano, pero se dieron remisiones o respuestas
poco prolongadas. Adicionalmente, carecían de reproductibilidad y no
se obtenían beneficios adicionales en comparación con la
quimioterapia. También se han tratados tumores sólidos como cánceres
de mama, melanomas y carcinomas de células renales con sangre
humana, suero de chimpancé, plasma humano y suero de caballo con
los correspondientes resultados impredecibles e ineficaces.
Se han realizado muchos ensayos clínicos de
anticuerpos monoclonales para tumores sólidos. En la década de los
80, se hicieron al menos cuatro ensayos clínicos para cáncer de mama
humano que produjeron respuesta sólo en un paciente de al menos 47
pacientes usando anticuerpos frente a antígenos específicos o
basados en la selectividad de tejido. No fue hasta 1998 cuando se
realizó un ensayo clínico con éxito usando un anticuerpo humanizado
anti-her 2 en combinación con cisplatino. En este
ensayo, 37 pacientes consiguieron respuestas, de los cuales
aproximadamente la cuarta parte tenían una tasa de respuesta parcial
y otra mitad presentaban una enfermedad estable o en progresión
menor.
Los ensayos clínicos que investigaban el cáncer
colorrectal implicaban a anticuerpos tanto frente a dianas
glucoproteicas como glucolipídicas. Anticuerpos tales como
17-1A, que tiene cierta especificidad por
adenocarcinomas, han sido utilizados en ensayos clínicos de fase 2
en más de 60 pacientes de los cuales sólo un paciente tuvo una
respuesta parcial. En otros ensayos, el uso de 17-1A
produjo sólo una respuesta completa y dos respuestas menores entre
52 pacientes en protocolos que utilizan ciclofosfamida adicional.
Otros ensayos que implican a 17-1A proporcionaron
resultados que eran similares. El uso de un anticuerpo monoclonal
murino humanizado aprobado inicialmente para imagenología tampoco
producía regresión del tumor. Hasta la fecha, no ha habido ningún
anticuerpo que haya sido eficaz en el cáncer colorrectal. Asimismo,
se han obtenido resultados igualmente pobres en el cáncer de
pulmón, cánceres de cerebro, cánceres de ovario, cáncer pancreático,
cáncer de próstata y cáncer de estómago. Se han obtenido cierto
éxito limitado en el uso del anticuerpo monoclonal
anti-GD3 para el melanoma. De este modo, puede
verse que a pesar del pequeño éxito en estudios animales que son un
requisito previo para los ensayos clínicos en humanos, los
anticuerpos que se han ensayado no han sido eficaces en su mayor
parte.
La patente de EE.UU. Nº 5.750.120 describe un
procedimiento en el que se transfectan células del tumor de un
paciente con genes MHC, que pueden ser clonados a partir de células
o tejidos del paciente. Estas células transfectadas se usan a
continuación para vacunar al paciente.
La patente de EE.UU. Nº 4.861.581 describe un
procedimiento que comprende las etapas de obtener anticuerpos
monoclonales que son específicos de un componente celular interno de
células neoplásicas y normales del mamífero pero no de los
componentes externos, marcar el anticuerpo monoclonal, poner en
contacto el anticuerpo marcado con el tejido de un mamífero que ha
recibido la terapia para matar a las células neoplásicas y
determinar la eficacia de la terapia midiendo la unión del
anticuerpo marcado al componente celular interno de las células
neoplásicas en degeneración. Para la preparación de anticuerpos
dirigidos frente a antígenos intracelulares humanos, los
propietarios de la patente reconocen que estas células malignas
representan una fuente conveniente de estos antígenos.
La patente de EE.UU. Nº 5.171.665 proporciona un
nuevo anticuerpo y un procedimiento para su producción.
Específicamente, la patente muestra la formación de un anticuerpo
monoclonal que tiene la propiedad de unirse fuertemente a un
antígeno proteico asociado con tumores humanos, por ejemplo, los de
colon y pulmón, mientras que se une a células normales en un grado
mucho menor.
La patente de EE.UU. Nº 5.484.596 proporciona un
procedimiento de terapia frente al cáncer que comprende extraer
quirúrgicamente el tejido tumoral a partir de un paciente con un
cáncer humano, tratar el tejido tumoral para obtener células
tumorales, irradiar las células tumorales para que sean viables pero
no tumorigénicas y usar estas células para preparar una vacuna para
que el paciente sea capaz de inhibir la recurrencia del tumor
primario mientras que simultáneamente se inhibe la metástasis. La
patente muestra el desarrollo de anticuerpos monoclonales, que
reaccionan con antígenos de la superficie de las células tumorales.
Como se muestra en la col. 4, líneas 45 y siguientes, los
propietarios de la patente utilizan células tumorales autóctonas en
el desarrollo de inmunoterapia específica activa que expresa
anticuerpos monoclonales en neoplasia humana.
La patente de EE.UU. Nº 5.693.763 muestra un
antígeno glucoproteico característico de carcinomas humanos y no
dependiente del tejido epitelial de origen.
La patente de EE.UU. Nº 5.783.186 se refiere a
anticuerpos Anti-Her2 que inducen apoptosis en
células que expresan Her2, a líneas celulares de hibridomas que
producen los anticuerpos, a procedimientos para el tratamiento del
cáncer usando los anticuerpos y composiciones farmacéuticas que
incluyen dichos anticuerpos.
La patente de EE.UU. Nº 5.849.876 describe
nuevas líneas celulares de hibridoma para la producción de
anticuerpos monoclonales frente a antígenos de mucina a partir de
fuentes tumorales y no tumorales.
La patente de EE.UU. Nº 5.869.268 se refiere a
un procedimiento para generar un linfocito humano que produce un
anticuerpo específico frente a un antígeno deseado, un procedimiento
para producir un anticuerpo monoclonal, así como los anticuerpos
monoclonales producidos por el procedimiento. La patente se refiere
especialmente a la producción de un anticuerpo monoclonal humano
anti-HD útil para el diagnóstico y el tratamiento de
cánceres.
La patente de EE.UU. Nº 5.869.045 se refiere a
anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, conjugados del anticuerpo e
inmunotoxinas de cadena única reactivos con células de carcinoma
humano. El mecanismo por el cual estos anticuerpos funcionan es
doble, en el sentido de que las moléculas reaccionan con antígenos
de la membrana celular presentes en la superficie de carcinomas
humanos y además en el sentido de que los anticuerpos tienen la
capacidad de internalizar en las células del carcinoma,
posteriormente a su unión, lo que los hace especialmente útiles
para formar conjugados anticuerpo-fármaco y
anticuerpo-toxina. En su forma sin modificar los
anticuerpos también manifiestan propiedades citotóxicas a
concentraciones específicas.
La patente de EE.UU. Nº 5.780.033 describe el
uso de autoanticuerpos para terapia tumoral y profilaxis. Sin
embargo, este anticuerpo es un autoanticuerpo antinuclear de un
animal de edad avanzada. En este caso, se dice que el
autoanticuerpo es un tipo de anticuerpo natural encontrado en el
sistema inmune. Debido a que el autoanticuerpo procede de "un
mamífero de edad avanzada", no se requiere que el autoanticuerpo
realmente proceda del paciente que se está tratando. Además, la
patente describe autoanticuerpos antinucleares naturales y
monoclonales de un mamífero de edad avanzada, y una línea celular de
hibridoma que produce un autoanticuerpo monoclonal antinuclear.
Los inventores actuales han obtenido previamente
la patente de EE.UU. 6.180.357, titulada "anticuerpos específicos
anticáncer de pacientes individualizados" dirigida a un
procedimiento para seleccionar anticuerpos anticáncer
personalizados de forma individual que son útiles para el
tratamiento de una enfermedad cancerosa.
Esta solicitud utiliza el procedimiento de
producción de anticuerpos anticáncer específicos de pacientes como
se muestra en la patente 6.180.357 para aislar líneas celulares de
hibridomas que codifican anticuerpos monoclonales que modifican una
enfermedad cancerosa. Estos anticuerpos pueden hacerse
específicamente para un tumor y, por tanto, hacer posible la
personalización de la terapia del cáncer. En el contexto de esta
solicitud, los anticuerpos anticáncer que tienen la propiedad de
matar células (citotóxicos) o de inhibir el crecimiento celular
(citostáticos) se denominarán, a partir de ahora en este documento,
citotóxicos. Estos anticuerpos pueden usarse como ayuda para
clasificar y diagnosticar un cáncer y pueden usarse para tratar las
metástasis tumorales.
La perspectiva del tratamiento anticáncer
individualizado proporcionará una posibilidad en la forma en que se
trata a un paciente. Un probable escenario clínico es que se obtenga
una muestra del tumor en el momento de su aparición y se almacene.
A partir de esta muestra, el tumor puede clasificarse a partir de un
panel de anticuerpos preexistentes que modifican una enfermedad
cancerosa. El paciente será clasificado por fases de forma
convencional pero los anticuerpos disponibles pueden usarse en una
clasificación por fases adicional del paciente. El paciente puede
ser tratado inmediatamente con los anticuerpos existentes y puede
producirse un panel de anticuerpos específicos del tumor usando los
procedimientos subrayados en este documento o mediante el uso de
bibliotecas de despliegues de fagos junto con los procedimientos de
selección descritos en este documento. Todos los anticuerpos
generados se añadirán a la biblioteca de anticuerpos anticáncer, ya
que existe la posibilidad de que otros tumores puedan expresar
alguno de los epítopos que están siendo tratados. Los anticuerpos
producidos según este procedimiento pueden ser útiles para tratar
enfermedades cancerosas en cualquier número de pacientes que tengan
cánceres que se unan a estos anticuerpos.
Además de los anticuerpos anticáncer, el
paciente puede elegir recibir las terapias actualmente recomendados
como parte de un régimen de tratamiento multimodal. El hecho de que
los anticuerpos aislados mediante la presente metodología no sean
relativamente tóxicos para las células no cancerosas permite que se
usen combinaciones de anticuerpos a altas dosis, solos o junto con
terapia convencional. El alto índice terapéutico también permitirá
un segundo tratamiento en una corta escala de tiempo que descenderá
la probabilidad de la aparición de células resistentes al
tratamiento.
Además, está dentro del alcance de esta
invención conjugar modalidades quimioterapéuticas convencionales,
por ejemplo, radionucleidos, con los ACMEC de la presente invención,
dirigiendo así el uso de dichos agentes quimioterapéuticos.
Si el paciente es refractario al curso inicial
de la terapia o desarrolla metástasis, el procedimiento de
generación de anticuerpos específicos del tumor puede repetirse para
un nuevo tratamiento. Además, los anticuerpos anticáncer pueden
conjugarse con eritrocitos obtenidos de este paciente e infundirse
de nuevo para el tratamiento de la metástasis. Ha habido pocos
tratamientos eficaces para el cáncer metastásico y normalmente las
metástasis son presagio de un mal resultado que termina con la
muerte. Sin embargo, los cánceres metastásicos normalmente están
bien vascularizados y el suministro de anticuerpos anticáncer
mediante eritrocitos puede tener el efecto de concentrar los
anticuerpos en el sitio del tumor. Incluso antes de las metástasis,
la mayoría de las células cancerígenas dependen para su
supervivencia del suministro de sangre del hospedador y el
anticuerpo anticáncer conjugado con eritrocitos también puede ser
eficaz frente a tumores in situ. Alternativamente, los
anticuerpos pueden conjugarse con otras células hematógenas, por
ejemplo, linfocitos, macrófagos, monocitos, linfocitos citolíticos
naturales, etc.
Hay cinco clases de anticuerpos y cada uno se
asocia con una función que le otorga su cadena pesada. Generalmente
se piensa que la muerte de las células cancerosas por anticuerpos
desnudos está mediada por la citotoxicidad celular dependiente de
anticuerpo o por la citotoxicidad dependiente de complemento. Por
ejemplo, los anticuerpos IgM e IgG2a murinos pueden activar el
complemento humano uniéndose al componente C-1 del
sistema de complemento, activando así la ruta clásica de activación
del complemento, que puede llevar a la lisis del tumor. Para
anticuerpos humanos, los anticuerpos que activan el complemento más
eficazmente generalmente son IgM e IgG1. Los anticuerpos murinos de
los isotipos IgG2a e IgG3 son eficaces reclutando células
citotóxicas que tienen receptores para Fc que llevarán a la muerte
celular mediante monocitos, macrófagos, granulocitos y ciertos
linfocitos. Los anticuerpos humanos tanto de isotipo IgG1 como IgG3
median la CCDA.
Otro posible mecanismo de muerte del cáncer
mediada por anticuerpo puede ser mediante el uso de anticuerpos que
funcionan catalizando la hidrólisis de diversos enlaces químicos en
la membrana celular y sus glucoproteínas o glucolípidos asociados,
denominados anticuerpos catalíticos.
Hay dos mecanismos adicionales de muerte de
células cancerosas mediada por anticuerpo que son los más
ampliamente aceptados. El primero es el uso de anticuerpos como una
vacuna para inducir al organismo a producir una respuesta inmune
frente al probable antígeno cancerígeno que reside en la célula
tumoral. El segundo es el uso de anticuerpos dirigidos a receptores
de crecimiento y que interfieren con su función o que regulan por
disminución este receptor de modo que su función se pierde de forma
eficaz.
Por lo tanto, es un objetivo de la invención
utilizar un procedimiento para producir anticuerpos que modifican
una enfermedad cancerosa a partir de células derivadas de un
individuo en particular que son citotóxicos con respecto a las
células del cáncer, mientras que simultáneamente no son
relativamente tóxicos para células no cancerosas, para aislar
líneas celulares de hibridoma y los correspondientes anticuerpos
monoclonales aislados y fragmentos de unión a antígeno de los
mismos para los que codifican dichas líneas celulares de
hibridoma.
Un objetivo adicional de la invención es mostrar
anticuerpos que modifiquen una enfermedad cancerosa y fragmentos de
unión a antígeno de los mismos.
Un objetivo adicional de la presente invención
es producir anticuerpos que modifiquen una enfermedad cancerosa
cuya citotoxicidad está mediada a través de toxicidad celular
dependiente de anticuerpo.
Aún un objetivo adicional de la presente
invención es producir anticuerpos que modifiquen la enfermedad
cancerosa cuya citotoxicidad está mediada a través de toxicidad
celular dependiente de complemento.
Todavía un objetivo adicional de la presente
invención es producir anticuerpos que modifiquen una enfermedad
cancerosa cuya citotoxicidad es una función de su capacidad para
catalizar la hidrólisis de los enlaces químicos celulares.
Aún un objetivo adicional de la presente
invención es producir anticuerpos que modifiquen una enfermedad
cancerosa, que son útiles en un ensayo de unión para diagnosis,
prognosis y control del cáncer.
Otros objetos y ventajas de esta invención serán
aparentes a partir de la siguiente descripción en la que se
muestran, a modo de ilustración y ejemplo, ciertas realizaciones de
esta invención.
La Fig. 1 incluye histogramas de FACS
representativos de los anticuerpos 10A304.7, anticuerpos de control
de isotipo, anticuerpos anti-EGFR dirigidos frente a
varias líneas celulares cancerosas y células no cancerosas.
Ejemplo
1
La línea celular de hibridoma 10A304.7 se
depositó, según el Tratado de Budapest, en la American Type Culture
Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA
20110-2209 el 26 de noviembre de 2002, con el número
de referencia PTA-5065. Según la normativa 37 CFR
1.808, los depositarios aseguran que todas las restricciones
impuestas sobre la disponibilidad pública de los materiales
depositados serán eliminadas de forma irrevocable tras la concesión
de la patente.
Para obtener el hibridoma que produce el
anticuerpo anticáncer, se prepararon suspensiones de células
individuales de un tumor de colon cultivado en ratones SCID a
partir de la línea celular de cáncer de colon HT-29
en PBS frío. El adyuvante IMMUNEASY™ (Qiagen, Venlo, Holanda) se
preparó para su uso mediante agitación vigorosa. Se añadieron 100
microlitros de adyuvante de ratón IMMUNEASY™ a 10 millones de
células HT-29 en el tubo de microcentrífuga, se
mezcló y se dejó a temperatura ambiente durante 15 min. Se
inmunizaron ratones BALB/c de ocho a nueve semanas por vía
intramuscular mediante la inyección de 100 microlitros del
antígeno-adyuvante que contenían 2,5 millones de
células. Se usó antígeno-adyuvante recién preparado
para reinmunizar a los ratones inmunizados dos semanas después de
la inmunización inicial a 2,5 millones de células en 250 microlitros
mediante inyección intraperitoneal. Se usó el bazo para la fusión
dos días después de la última inmunización. Los hibridomas se
prepararon mediante la fusión de los esplenocitos aislados con
parejas del mieloma NSO-1. Para subclonar los
hibridomas se ensayaron los sobrenadantes de las fusiones.
Para determinar si los anticuerpos secretados
por las células del hibridoma eran de isotipo IgG o IgM se empleó
un ensayo de tipo ELISA. Se añadieron a las placas de ELISA 100
microlitros/pocillo de anticuerpo de cabra anti IgG + IgM (H+L) de
ratón a una concentración de 2,4 microgramos/ml en tampón de
recubrimiento (tampón carbonato/bicarbonato 0,1 M, pH
9,2-9,6) a 4ºC durante una noche. Las placas se
lavaron tres veces en tampón de lavado (PBS + Tween al 0,05%). Se
añadieron a la placa 100 microlitros/pocillo de tampón de bloqueo
(leche al 5% en tampón de lavado) durante 1 h a temperatura
ambiente y, a continuación, se lavaron dos veces con tampón de
lavado. Se añadieron 100 microlitros/pocillo del sobrenadante del
hibridoma y la placa de incubó durante 1 h a temperatura ambiente.
Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado y se añadieron
100 microlitros/pocillo de una dilución 1/5.000 anticuerpo de cabra
anti IgG o IgM de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante
(diluido en PBS que contenía albúmina de suero bovina al 1%). Tras
incubar la placa durante 1 h a temperatura ambiente, la placa se
lavó dos veces con tampón de lavado. Se incubaron 100
microlitros/pocillo de solución TMB durante 1-3
minutos a temperatura ambiente. La reacción de color se terminó
añadiendo 100 microlitros/pocillo de H_{2}SO_{4} 2 M y la placa
se leyó a 450 nm con un lector de placas HTS7000 de
Perkin-Elmer. Como se indica en la Tabla 1, los
hibridomas 10A304.7 secretaban principalmente anticuerpos del
isotipo IgG.
\newpage
Después de una ronda de dilución limitación, se
analizó la presencia de anticuerpos en los sobrenadantes de los
hibridomas que se unen a las células diana en un ensayo de ELISA
celular. Se ensayaron tres líneas celulares de cáncer de colon:
HT-29, SW1116 y SW620. Las células en las placas se
fijaron antes de su uso. Las placas se lavaron tres veces con PBS
que contenían MgCl_{2} y CaCl_{2} a temperatura ambiente. Se
añadieron a cada pocillo 100 microlitros de paraformaldehido al 2%
diluido en PBS durante diez minutos a temperatura ambiente y a
continuación se eliminaron. Las placas se lavaron una vez más tres
veces con PBS que contenían MgCl_{2} y CaCl_{2} a temperatura
ambiente. El bloqueo se realizó con 100 microlitros/pocillo de leche
al 5% en tampón de lavado (PBS + Tween al 0,05%) durante 1 h a
temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón
de lavado y se añadieron 100 microlitros/pocillo del sobrenadante de
hibridoma durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron
tres veces con tampón de lavado y se añadieron 100
microlitros/pocillo de una dilución 1/5.000 de anticuerpo de cabras
anti IgG o IgM de ratón o IgM conjugado con peroxidasa de rábano
picante (diluido en PBS que contenía albúmina de suero bovina al
1%). Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, las
placas se lavaron tres veces con tampón de lavado y se incubaron 100
microlitros/pocillo de sustrato TMB durante 1-3
minutos a temperatura ambiente. La reacción se terminó con 100
microlitros/pocillo de H_{2}SO_{4} 2M y la placa se leyó a 450
nm con un lector de placas HTS7000 de Perkin-Elmer.
Los resultados según se exponen en la Tabla 1, se expresaron como
el número de veces por encima del fondo en comparación con el
control de isotipo IgG (3BD-27). Los anticuerpos del
hibridoma 10A304.7 tenían una unión 22,8 veces, 13,1 veces y 23,9
veces mayor que el fondo en células HT-29, SW1116 y
SW620, respectivamente. Esto indica que el anticuerpo se unía a un
antígeno que se expresaba más en algunas células cancerígenas que en
otras.
Junto con el ensayo de unión del anticuerpo, se
ensayó el efecto citotóxico de los sobrenadantes de los hibridomas
en las mismas líneas celulares de cáncer de colon:
HT-29, SW1116 y SW620. El ensayo de citotoxicidad
vital se obtuvo de Molecular Probes (Eu,OR). Los ensayos se
realizaron según las instrucciones del fabricante con los cambios
señalados a continuación. Las células se dispusieron en placas antes
del ensayo a la densidad predeterminada apropiada. Después de 2
días, se transfirieron 100 microlitros del sobrenadante de las
placas de microvaloración del hibridoma a las placas de las células
y se incubaron en un incubador de CO_{2} al 5% durante 5 días.
Los pocillos que servían como los controles positivos se aspiraron
hasta vaciarlos y se añadieron 100 microlitros de azida sódica y/o
cicloheximida. También se añadió el anticuerpo monoclonal
3BD-27 como control de isotipo puesto que se
conocía que no se une a las células de cáncer de colon
HT-29. También se usó en el ensayo un anticuerpo
anti-EGFR (C225) para comparación. Después de 5 días
de tratamiento, las placas se vaciaron entonces por inversión y se
dejaron secar. En cada pocillo se repartió DPBS a temperatura
ambiente que contenía MgCl_{2} y CaCl_{2} con un frasco lavador
blando multicanal, la placa se golpeó tres veces, se vació por
inversión y a continuación se secó. Se añadieron en cada pocillo 50
microlitros del colorante vital fluorescente en DPBS que contiene
MgCl_{2} y CaCl_{2} y se incubaron a 37ºC en un incubador de
CO_{2} al 5% durante 30 minutos. Las placas se leyeron en un
lector de placas de fluorescencia HTS7000 de
Perkin-Elmer y los datos se analizaron con el
programa Excel de Microsoft. Los resultados se expusieron en la
Tabla 1. El hibridoma 10A304.7 producía una citotoxicidad específica
del 11% en células SW1116, que era similar a la obtenida con el
anticuerpo anti-EGFR C225. La fuerte unión de
10A304.7 a las células SW116 indicaba que este nivel de de unión
del anticuerpo era suficiente para mediar en la citotoxicidad frente
a estas células cancerosas. Aunque había una fuerte unión del
anticuerpo 10A304.7 a las células cancerosas HT-29
y SW620 en el ensayo de tipo ELISA celular, este no inducía
citotoxicidad. Esto sugería que la simple unión del anticuerpo no
era suficiente para mediar en la citotoxicidad de 10A304.7 frente a
las células HT-29 y SW620. Como se expone en la
Tabla 1, el anticuerpo 3BD-27, del mismo isotipo que
el anticuerpo 10A304.7 y del que previamente se conocía que no se
une a las células de cáncer de colon HT-29, no
producía citotoxicidad en esta línea de células cancerosas. Los
agentes conocidos de citotoxicidad no específica, azida sódica y
cicloheximida, producían citotoxicidad como se esperaba. A modo de
comparación, el anticuerpo anticáncer bien definido C225 producía
el 13% de citotoxicidad en las células cancerígenas SW1116. Los
resultados de la Tabla 1 indican que la unión de 10A304.7 a células
cancerosas puede ser una etapa importante para producir
citotoxicidad, pero no es suficiente en sí para mediar en este
suceso.
Ejemplo
2
El anticuerpo monoclonal 10A304.7 se producía
cultivando los hibridomas en botellas CL-1000 (BD
Biosciences, Oakville, ON) con recogidas y resiembras dos veces a
la semana y procedimientos de purificación de anticuerpos
convencionales con Proteína G Sepharose 4 de alto flujo (Amersham
Biosciences, Baie d'Urfé, QC). Está dentro del alcance de esta
invención utilizar anticuerpos monoclonales que son anticuerpos
humanizados, quiméricos o murinos. 10A304.7 se comparó con varios
controles tanto positivos (anti-Fas (EOS9.1, IgM,
kappa, 20 mg/ml, eBioscience, San Diego, CA),
anti-Her2/neu (IgG1, kappa, 10 mg/ml, Inter Medico,
Markham, ON), anti-EGFR (C225, IgG1, kappa, 5
mg/ml, Cedarlane, Hornby, ON), cicloheximida (100 mM, Sigma,
Oakville, ON) y NaN_{3} (al 0.1%, Sigma, Oakville, ON)) como
negativos (107.3 (anti-TNP, IgG1, kappa, 20 mg/ml,
BD Biosciences, Oakville, ON), MPC-11
(especificidad antigénica desconocida, IgG2b, kappa, 20 mg/m),
tampón IgG (al 2%)) en un ensayo de citotoxicidad (Tabla 2). Se
ensayaron líneas celulares de cáncer de mama
(MB-231, MCF-7), cáncer de colon
(Caco-2, DLD-1, Lovo,
HT-29, SW1116, SW620), cáncer de ovario (OVCAR),
cáncer pancreático (BxPC-3), cáncer de próstata
(PC-3) y no cancerosas (CCD 27sk, Hs888 Lu) (todas
ellas de la ATCC, Manassas, VA). El ensayo de citotoxicidad vital
se obtuvo de Molecular Probes (Eugene, OR). Los ensayos se
realizaron según las instrucciones del fabricante con los cambios
señalados a continuación.
Las células se dispusieron en placas antes del
ensayo a la densidad predeterminada apropiada. Después de 2 días,
se diluyeron 100 microlitros de anticuerpo purificado en medio y, a
continuación, se transfirieron a las placas de células y se
incubaron en Un incubador de CO_{2} al 5% durante 5 días. A
continuación, la placa se vació por inversión y se dejó secar. En
cada pocillo se repartió DPBS a temperatura ambiente que contenía
MgCl_{2} y CaCl_{2} con un frasco lavador blando multicanal, se
golpeó tres veces, se vació por inversión y a continuación se secó.
Se añadieron en cada pocillo 50 microlitros del colorante vital
fluorescente diluido en DPBS que contenía MgCl_{2} y CaCl_{2} y
se incubaron a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5% durante 30
minutos. Las placas se leyeron en un lector de placas de
fluorescencia HTS7000 de Perkin-Elmer, y los datos
se analizaron en el programa Excel de Microsoft y los resultados se
expusieron en la Tabla 2. Los datos representaban una media de
cuatro experimentos ensayados por triplicado y presentados
cualitativamente de la siguiente manera: 4/4 experimentos con el
15% de citotoxicidad por encima del fondo (++++), 2/4 experimentos
con el 15% de citotoxicidad por encima del fondo (+++), al menos 2/4
experimentos con el 10-15% de citotoxicidad por
encima del fondo (++) y al menos 2/4 experimentos con el
8-14% de citotoxicidad por encima del fondo. Las
células no marcadas de la Tabla 2 representaban datos incoherentes o
efectos menores que el umbral de citotoxicidad. El anticuerpo
10A304.7 producía el 35% del efecto citotóxico del anticuerpo
anti-EGFR bien descrito, C225, que inducía el 3l%
de citotoxicidad en la línea celular de colon SW1116. El efecto de
ambos anticuerpos sobre esta línea celular coincide con los
resultados de la Tabla 1. Adicionalmente, 10A304.7 inducía una
citotoxicidad significativamente más alta frente a otras células
cancerosas, en comparación con C225, incluyendo las líneas
celulares de cáncer de mama MDA MB 231 (111%) y
MCF-7 (850%), la línea celular de cáncer de
próstata PC-3(375%) y la línea celular de
cáncer de ovario OVCAR (667%). En gran medida, 10A304.7 no producía
citotoxicidad frente a varias células no cancerosas, tales como CCD
27sk o Hs888 Lu, lo que indica que el anticuerpo tiene
especificidad hacia diversas células cancerosas. Los agentes
citotóxicos químicos inducían su citotoxicidad esperada mientras
otros anticuerpos que se incluían para comparación también se
comportaban como se esperaba dadas las limitaciones del ensayo
biológico celular.
Las células se prepararon para el FACS lavando
inicialmente la monocapa de células con DPBS (sin Ca^{2+} y
Mg^{2+}). El tampón de disociación celular (INVITROGEN) se usó a
continuación para despegar las células de sus placas de cultivo
celular a 37ºC. Tras la centrifugación y recogida, las células se
resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
que contenía MgCl_{2}, CaCl_{2} y suero bovino fetal al 25% a
4ºC (medio de lavado) y se contaron, alicuotaron a la densidad
celular adecuada, se centrifugaron para sedimentar las células y se
resuspendieron en medio de tinción (DPBS que contenía MgCl_{2},
CaCl_{2} y suero bovino fetal al 2%) a 4ºC en presencia de
anticuerpos del ensayo (10A304.7) o anticuerpos control (control de
isotipo, anti-EGF-R o
anti-FAs) a 20 microgramos/ml en hielo durante 30
minutos. Antes de la adición del anticuerpo secundario conjugado
con Alexa Fluor 488, las células se lavaron una vez con medio de
lavado. A continuación, se añadió l anticuerpo conjugado con Alexa
Fluor 488 en medio de tinción durante 20 minutos. A continuación,
las células se lavaron al final de este tiempo y se resuspendieron
en medio de tinción que contenía 1 microgramo/ml de yoduro de
propidio. La adquisición por citometría de flujo de las células se
evaluó aplicando las muestras en un FACScan usando el software de
CellQuest (BD Biosciences). La dispersión hacia adelante (FSC) y
lateral (SSC) de las células se establecieron ajustando el voltaje y
las ganancias de amplitud en los detectores del FSC y SSC. Los
detectores para los tres canales de fluorescencias (FL1, FL2 y FL3)
se ajustaron analizando células teñidas con anticuerpo control de
isotipo purificado seguido del anticuerpo secundario conjugado con
Alexa Fluor 488, de modo que las células tuviesen un pico uniforme
con una intensidad de fluorescencia media de aproximadamente
1-5 unidades. Las células vivas se obtuvieron
mediante selección de puerta para FSC y exclusión de yoduro de
propidio. Para cada muestra, se obtuvieron aproximadamente 10.000
células vivas para análisis y los resultados se presentaron en la
Tabla 3.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La Tabla 3 exponía la media de veces que aumenta
la intensidad de fluorescencia sobre el control de isótopo y
cualitativamente se presenta como: menos de 3 a 5 (+); 5 a 25 (++);
25 a 50 (+++) y más de 50 (++++). Los histogramas representativos
de los anticuerpos 10A304.7 se recopilaron de la Figura 1 y
evidencian las características de la unión, incluyendo los picos
bimodales ilustrados en algunos casos. 10A304.7 se une de forma no
específica a todas las líneas celulares, incluyendo alta afinidad a
las células no cancerosa CCD-27 sk y Hs888 Lu, pero
el grado de unión difiere entre las diversas líneas celulares.
10A304.7 se une, de este modo, selectivamente a las líneas
celulares a niveles diferentes. Los resultados de las tablas 2 y 3
indican que la unión de 10A304.7 a las células tumorales es
necesaria para la citotoxicidad mediada por anticuerpo pero no es
suficiente para desencadenar este suceso.
Claims (12)
1. Un anticuerpo monoclonal aislado codificado
por el clon depositado en la ATCC con el número de referencia
PTA-5065.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es
un anticuerpo humanizado.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es
un anticuerpo quimérico.
4. El clon aislado depositado en la ATCC con el
número de referencia PTA-5065.
5. Un ensayo de unión para determinar la
presencia de células cancerosas en una muestra de tejido
seleccionado de un tumor humano, que comprende:
proporcionar un anticuerpo monoclonal aislado o
un fragmento de unión a antígeno del mismo codificado por el clon
depositado en la ATCC con el número de referencia
PTA-5065;
poner en contacto dicho anticuerpo monoclonal
aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo con dicha
muestra de tejido;
por lo que se indica la presencia de dichas
células cancerosas en dicha muestra de tejido.
6. El ensayo de unión de la reivindicación 5 en
el que la muestra de tejido de tumor humano se ha obtenido de un
tumor que se origina en un tejido seleccionado entre el grupo
constituido por tejido de colon, ovario, pulmón y mamario.
7. Un procedimiento para aislar o analizar
células cancerosas en una muestra de tejido seleccionada de un
tumor humano que comprende:
proporcionar un anticuerpo monoclonal aislado o
un fragmento de unión a antígeno del mismo codificado por el clon
depositado en la ATCC con el número de referencia
PTA-5065;
poner en contacto dicho anticuerpo monoclonal
aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo con dicha
muestra de tejido; y
determinar la unión de dicho anticuerpo
monoclonal aislado o del fragmento de unión a antígeno del mismo con
dicha muestra de tejido;
por lo que se aíslan dichas células cancerosas
mediante dicha unión y se confirma su presencia en dicha muestra de
tejido.
8. El procedimiento de la reivindicación 7 en el
que la muestra tejido tumoral humano se ha obtenido de un tumor que
se origina en un tejido seleccionado entre el grupo constituido por
tejido de colon, ovario, pulmón y mama.
9. Fragmentos de unión a antígeno del anticuerpo
monoclonal aislado de la reivindicación 1.
10. Fragmentos de unión a antígeno del
anticuerpo humanizado de la reivindicación 2.
11. Fragmentos de unión a antígeno del
anticuerpo quimérico de la reivindicación 3.
12. El anticuerpo aislado o los fragmentos de
unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3,
9, 10 u 11 conjugados con un miembro seleccionado entre el grupo
constituido por restos citotóxicos, enzimas, compuestos radiactivos
y células hematógenas.
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