MX2007011407A - Moleculas de union a antigeno dirigidas a proteoglicano de condroitinsulfato de melanoma y con aumento de afinidad de union al receptor fc y de funcion efectora. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a moleculas de union de antigenos (ABM). En modalidades particulares, la presente invencion se refiere a anticuerpos monoclonales recombinantes, que incluyen anticuerpos quimericos, primatizados o humanizados especificos de la MCSP humana. Ademas, la presente invencion se refiere a moleculas de acido nucleico que codifican tales ABM, y a vectores de celulas huesped que comprende dichas moleculas de acido nucleico. La invencion tambien se refiere a metodos para producir las ABM de la invencion, y a metodos para usar estas ABM en el tratamiento de una enfermedad. Ademas, la presente invencion se refiere a ABM con una glicosilacion modificada con mejoradas propiedades terapeuticas, que incluyen anticuerpos con aumento en la union al receptor Fc y aumento de la funcion efectora.

Description

MOLÉCULAS DE UNION A ANTIGENO DIRIGIDAS A PROTEOGLICANO DE CONDROITINSULFATO DE MELANOMA Y CON AUMENTO DE AFINIDAD DE UNION AL RECEPTOR FC Y DE FUNCIÓN EFECTORA Campo de la Invención La presente invención se refiere a moléculas de unión a antigeno (ABM, por sus siglas en inglés) . En modalidades particulares, la presente invención se refiere anticuerpos monoclonales recombinantes, incluso anticuerpos quiméricos, primatizados y humanizados específicos para el antigeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) , también denominado proteoglicano de condroitinsulfato de melanoma (MCSP) . Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos codificadores de dichas ABM, y vectores y células huésped que comprenden dichas moléculas de ácidos nucleicos. La invención también se refiere a métodos para producir las ABM de la invención, y a métodos para usar estas ABM para el tratamiento de enfermedades. Además, la presente invención se refiere a ABM con modificaciones de la glicosilación con mejores propiedades terapéuticas, incluso anticuerpos con aumento de la unión con r'eceptor Fe y aumento de la función de efector. Antecedentes de la Invención Antigenos asociados a melanoma El melanoma maligno es el tipo más común de cáncer Ref.185793 de piel fatal en humanos, y se estima que su incidencia crece a una tasa del 5% por año. Campoli y otros, Crit. Rev. Immunol. 24 (4 ): 267-296 (diciembre de 2004). La tasa de mortalidad también aumentó en la última década, a pesar de los adelantos en el diagnóstico y terapia. Si bien el melanoma en estado temprano tiene alta proporción de tratamiento, el melanoma en estado avanzado a menudo es resistente a los regímenes de tratamiento convencionales. Las liimitaciones de las terapias convencionales han estimulado la investigación hacia nuevas estrategias para el tratamiento de pacientes con melanoma maligno. Gran parte de la Investigación ha centrado la atención en las inmunoterapias .

' La mayoria de los regímenes de inmunoterapia de melanoma humano desarrollados han centrado su atención den los antigenos asociados a melanoma (MAA, por sus siglas en inglés) . Los MAA de preferencia para la inmunoterapia son antigenos expresados en gran porcentaje de melanomas pero con restringida distribución en los tejidos normales. Uno de dichos antigenos es el proteoglicano de condroitinsulfato de melanoma (MCSP, por sus siglas en inglés), también denominado antigeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMW- MAA) . Pluschke y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:9710- 9715 (1996); Yang y otros, J. Cell Biol. 165 ( 6) : 881-891 (Junio 2004). MCSP es un proteoglicano de condroitinsulfato iíitegral de membrana altamente glicosilado que consiste en un componente de glicoproteina unido a N de 280 kDa y un componente de proteoglicano de condroitinsulfato de 450 kDa expresado en la membrana celular. Ross y otros, Arch. Biochem. Biophys. 225:370-383 (1983). Los proteoglicanos son proteínas unidas covalentemente a glicoaminoglucanos (GAG) . Tanto el componente de 280kDa como el componente de 450 kDa de MCSP contienen la misma proteina nuclear. Ross y otros, Arch. Biochem. Biophys. 225:370-383 (1983); Bumol y otros, J. Biol. Chem. 259:12733-12741 (1984). , El cADN que codifica la proteina nuclear de longitud total MCSP se ha identificado y se ha deducido la secuencia de aminoácidos. Pluschke y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:9710-9715 (1996); Yang y otros, J. Cell Biol. 165 ( 6) : 881-891 (Junio 2004) (cuyos contenidos se incorporan asi a la presente en su totalidad como referencia) . La secuencia de MCSP ha sido depositada y se le asignaron los siguientes números de acceso: Acceso de GenBank No. MIM:601172 (gen); GI.1617313, GI.21536290, GI.34148710, y GI:47419929 (mARN); GI:1617314, GI.4503099, GI:34148711, y G : 47419930 (proteina) . La proteina nuclear, que consiste en 2322 aminoácidos, contiene 3 dominios principales: un gran dominio extracelular, una región hidrofóbica transmembrana, y ujna corta cola citoplasmática. Las búsquedas por homología con la secuencia de MCSP indican que los homólogos se expresan en otras especies animales. Específicamente, los homólogos de MCSP rata y de ratón se denominan NG2 y AN2, respectivamente. Cada uno comparte sustancial identidad de secuencia de aminoácidos con MCSP y tiene un perfil de expresión similar. Stallcup y otros, J. Neurocytol 31:423-435 (2002); Schneider y otros, J. Neurosci. 21:920-933 (2001). Originalmente se creia que MCSP tenia restringida distribución tisular, dado que sólo se detectó en principio en células de linaje de melanocitos, además de células en los folículos pilosos, la capa celular basal de la epidermis de l|a piel, las células endoteliales, y los pericitos. Ferrone y otros, Pharmacol. Ther. 57:259-290 (1993); Schlingemann y otros, Am. J. Pathol. 136:1393-1405 (1990). Sin embargo, más recientemente se determinó que MCSP tiene distribución más amplia en varias células normales y transformadas. En particular, MCSP se encuentra en casi todas las células básales de la epidermis. Está bien establecida la relación entre MCSP y melanoma. MCSP se expresa en forma diferenciada en las ciélulas de melanoma, y se descubrió que se expresa en más del 9|0% de los lunares benignos y lesiones por melanoma analizadas. Campoli y otros, Crit. Rev. Im unol. 24(4):267-2'96 (Diciembre 2004). Además, no se hallaron variaciones de la expresión de MCSP entre las lesiones primaria y metastática de todos los tipos de melanoma. Kageshita y otros, Int. J. Cáncer 56:370-374 (1994). También se hallaron expresiones de MCSP en tumores de origen no melanocitico, incluso carcinoma de células básales, diversos tumores con origen en la cresta neural, y en carcinomas de mama. Kageshita y otros, J. Invest. Dermatol. 85:535-537 (1985); Chekenya y otros, Int. J. Dev. Neurosci. 17:421-435 (1999); Chekenya y otros, J. Neurocytol . 31:507-521 (2002); Shoshan y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96:10361-10366 (1999); Godal y otros, Br. J. Cáncer 53:839-841 (1986); Dell'Erba y otros, Anticancer Res. 21:925-930 (2001). Sustanciales evidencias indican que MCSP interviene en forma diferenciada como influencia sobre el comportamiento maligno de las células de melanoma. Es bien sabido que los constituyentes de GAG y la proteina nuclear de los proteoglicanos generalmente son responsables de la unión de varios ligandos diferentes incluso, sin limitaciones, I moléculas de adhesión, quimiocinas, citocinas, componentes de I la matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés), y factores de crecimiento. Bernfield y otros, Ann. Rev. Biochem. 68:729-777 (1999). Respecto específicamente de MCSP, los estudios han demostrado que los anticuerpos específicos contra MCSP pueden inhibir la unión de las células de melanoma al endotelio capilar y la diseminación sobre diversos componentes de ECM, tales como colágeno y complejos de colágeno-fibronectina . Harper y otros, J. Nati. Cáncer Inst. 71:259-263 (1983); de Vries y otros, Int. J. Cáncer 38:465-473 (1986); Iida y otros, Cáncer Res. 55:2177-2185 (1995); Burg y otros, J. Cell. Physiol. 177:299-312 (1998). Otros estudios demostraron que la expresión de MCSP está restringida a dominios de microespigas de la superficie celular en las células migrantes de melanoma. Garrigues y otros, J. Cell Biol. 103:1699-1710 (1986). Los dominios de microespiga son estructuras ricas en actina de importancia en la formación de contactos adhesivos con componentes de ECM en las células migrantes. En conjunto, las evidencias indican que MCSP favorece la formación de los contactos adhesivos iniciales en el borde guia de las células migrantes. Otras evidencias indican que MCSP también modula la migración de la célula de melanoma a través de un segundo mecanismo que incluye la iniciación de eventos de señal intracelulares . En particular, se ha demostrado que tanto MCSP como NG2 disparan las avias de transducción de señal por activación de las proteínas de la familia de Rho GTPasa. Stallcup y otros, J. Neurocytol . 31:423-435 (2002); Eisenmann y' otros, Nat. Cell Biol. 1:507-513 (1999). Otros estudios incidan que la expresión de MCSP conduce a un aumento de la activación de la cinasa de adhesión focal (FAK, por sus siglas en inglés) a través de un mecanismo dependiente de integrina y a un aumento de la activación de la cinasa regulada por señal extracelular (ERK, por sus siglas en inglés) por un mecanismo independiente. Yang y otros, J. Cell Biol. 165:881-891 (Junio 2004). También se implica MCSP en la proliferación de las células de melanoma. Específicamente, las células de melanoma transfectadas para expresar MCSP o NG2 exhibieron aumento de las tasas de proliferación in vitro y aumentaron las tasas de crecimiento in vivo. Estos efectos son inhibidos por los anticuerpos monoclonales anti-MCSP o anti-NG2. Evidencias sustanciales indican que MCSP juega un p'apel importante en la angiogénesis y la invasión por las células de melanoma. Primero, MCSP se expresa con altos niveles en pericitos "activados" y pericitos en la v¡asculatura angiogénica tumoral. Ruiter y otros, Behring Inst. Mitt. 92:258-272 (1993). Es sabido que los pericitos se a(socian a las células endoteliales que desarrollan la vasculatura y que participan en la regulación de la a giogénesis al controlar la proliferación y la invasión de las células endoteliales. Witmer y otros, J. Histochem. Cytochem 52(1): 39-52 (2004); Erber y otros, FASEB 18:338-340 (2004); Darland y otros, Dev. Biol. 264:275-288 (2003). Segundo, MCSP y NG2 tienen amplia expresión en los vasos sanguíneos angiogénicos en los tejidos con desarrollo normal. Chekenya y otros, FASEB 16:586-588 (2002); Ruiter y otros, Behring Inst. Mitt. 92:258-272 (1993). El elevado nivel de de expresión de MCSP en células dé melanoma, junto con su restringida distribución en tejidos normales y la disponibilidad de mAb específicos de MCSP hacen que MCSP sea un marcador lógico para las lesiones de melanoma y un candidato para objetivo de la inmunoterapia. De hecho, se han desarrollado numerosos anticuerpos monoclonales murinos contra MCSP. Campoli y otros, Crit. Rev. Immunol. 24 (4) : 267-296 (2004). Si bien se ha demostrado que la mayoria de los mAb murinos anti-MCSP controlan el crecimiento tumoral en modelos animales, sólo se observaron respuestas clínicas menores en estudios clínicos con estos anticuerpos. Los beneficios observados generalmente se atribuyen a la capacidad de los anticuerpos anti-MCSP para influir sobre la biología de las células de melanoma y no a mecanismos inmunológicos mediados por anticuerpo. En consecuencia, la mayoria de las inmunoterapias dirigidas a MCSP utilizan anticuerpos antiidiotipicos que simulan el epitopo MCSP. ' Los anticuerpos monoclonales (mAb, por sus siglas e,n inglés) no conjugados pueden ser medicinas útiles para el tratamiento de cáncer, tal como se demostró con la aprobación p'or la U. S. Food and Drug Administration de Trastuzumab (Herceptin™; Genentech Inc, ) para el tratamiento de cáncer avanzado de mama (Grillo-López, A.-J., y otros, Semin. Oncol. 2¡6:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:309-18 (1999)), Rituximab (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals (no Biogen IDEC) , San Diego, CA y Cambridge, MA, y Genentech Inc., San Francisco, CA) , para el tratamiento de linfoma no Hodgkin positivo para células B CD20 de grado bajo o folicular, Gemtuzumab (Milotarg™, Celltech/ yeth-Ayerst ) para el tratamiento leucemia mieloide aguda recidivante, y Alemtuzumab (CAMPATH™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) para el tratamiento de leucemia linfocitica crónica de células B. El éxito de estos productos se debe no solo a su eficacia, sino también a sus destacados perfiles de seguridad (Grillo-López, A.-J., y otros, Semin. Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:309-18 (1999)). A pesar de los logros de estos fármacos, en la actualidad hay gran interés por obtener mayor actividad especifica de anticuerpo que la generalmente lograda con la terapia con mAB no conjugado . Los resultados de numerosos estudios sugieren que los mecanismos dependientes de receptor Fe contribuyen sustancialmente a la acción de anticuerpos citotóxicos contra tumores e indican que un anticuerpo óptimo contra tumores se une de preferencia a los receptores Fe de activación y mínimamente a la contrapartida inhibitoria FcyRIIB. (Clynes, R'. A., y otros, Nature Medicine 6(4):443-446 (2000); Kalergis, A.M., y Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195 (12) : 1653-1659 (June 2002) . Por ejemplo, los resultados de al menos un estudio sugieren que el receptor Fc?RIIIa en particular se asocia con fuerza a la eficacia de la terapia con anticuerpos. (Cartron, G., y otros, Blood 99 (3) : 754-757 (febrero 2002)). Dicho estudio demostró que los pacientes homocigotos para un polimorfismo en Fc?RIIIa tienen mejor respuesta a Rituximab que los pacientes heterocigotos. Los autores concluyeron que la mayor respuesta se debe a una mejor unión in vivo del anticuerpo a FcyRIIIa, lo cual resulta en mayor actividad ADCC contra células de linfoma. (Cartron, G., y otros, Blood 99 (3) : 754-757 (febrero 2002)). Se han reportado diversas estrategias de inmunoterapia dirigidas a MCSP. Las inmunoterapias usaron MCSP como objetivo en inmunoterapia pasiva basada en anticuerpos en pacientes con melanoma avanzado. En general, se administraron a los pacientes anticuerpos anti-MCSP solos o conjugados con toxinas. Schroff y otros, Cáncer Res. 45:879-885 (1985); Spitler y otros, Cáncer Res. 47:1717-1723 (1987); Bumol y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:529-533 (il 983 ) . Aunque dichos anticuerpos exhibieron inhibición tumoral en modelos animales, solo se observaron respuestas clínicas menores en unos pocos pacientes. Matsui y otros, Jap. J. Cáncer Res. 76:119-123 (1985); Morgan y otros, J. Nati. Cáncer Inst. 78:1101-1106 (1987); Ghose y otros, Cáncer Immunol. Inmunother. 34:90-96 (1991). Más recientemente, se observaron mejores respuestas terapéuticas con inmunoconjugados con Fv y con anticuerpos monoclonales antiidiotipicos dirigidos contra MCSP. Wang y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:1627-1632 (1999); Kang y otros, Clin.

Cáncer Res. 6:4921-4931 (2000); Mittelman y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:466-470 (1992); patente de los Estados Unidos No. 5.270. 202; patente de los Estados Unidos No. 5.780.029; patente de los Estados Unidos No. 5.866.124. Sin embargo, estas inmunoterapias tienen inconvenientes. Específicamente, los anticuerpos antiidiotípicos no son útiles dirigidos contra células que expresan MCSP. Además, las construcciones scFv carecen de regiones Fe y en consecuencia solos no pueden inducir la lisis de células objetivo positivas para MCSP. La mayoría de los anticuerpos anti-MCSP monoclonales que se han desarrollado son murinos. Incluyen mAb 149.53, mAb 225.28; mAb 763.74; y mAb 9.2.27. Campoli y otros, Crit. Rev. Immunol 2 (4 ): 267-296 (2004). Hasta la fecha, solo se han aislado unos pocos anticuerpos anti-MCSP de fuentes humanas. Wang y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. 96:1627-1632 (1999) . Se cree que hasta la fecha no se ha humanizado ninguno de los anticuerpos anti-MCSP murinos (o cualquier otro no humano) . Un problema potencial con el uso d'e anticuerpos murinos en los tratamientos terapéuticos consiste en que los anticuerpos monoclonales no humano pueden ser reconocidos por el huésped humano como proteína extraña; en consecuencia, las inyecciones repetidas de dichos anticuerpos extraños pueden conducir a la inducción de respuestas inmunes que llevan a reacciones de hipersensibilidad dañinas. Para los anticuerpos monoclonales con base murina, a menudo se refiere a una respuesta de anticuerpo humana antimurina, o respuesta "HAMA", o como respuesta de anticuerpo humana antirrata, o respuesta "HARÁ". Además, estos anticuerpos "extraños" pueden ser atacados por el sistema inmune del huésped pues, de hecho, son neutralizados antes del llegar al sitio objetivo. Además, los anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales murinos) generalmente carecen de función de efector humano, es decir, son incapaces, in ter alia , de mediar la lisis dependiente de complemento o de usar las células objetivo humanas mediante toxicidad celular dependiente de anticuerpo o fagocitosis mediada por receptor Fe. Los anticuerpos quiméricos que comprenden porciones d|e anticuerpos de dos o más especies diferentes (por ejemplo, riatón y humano) se han desarrollado como alternativa de los anticuerpos "conjugados". Glicosilación de anticuerpos El componente oligosacárido puede afectar significativamente las propiedades importantes para la eficacia de una glicoproteína terapéutica, incluso estabilidad física, resistencia al ataque de proteasas, interacciones con el sistema inmune, farmacocinética, y actividad biológica específica. Dichas propiedades pueden depender no solo de la presencia o ausencia, sino también de las estructuras específicas de los oligosacáridos. Se pueden hacer algunas generalizaciones entre la estructura del oligosacárido y la función de la glicoproteína. Por ejemplo, Ciertas estructuras de oligosacárido median la rápida depuración de la glicoproteína del torrente sanguíneo mediante interacciones con proteínas de unión a hidratos de carbono específicos, mientras que otros se pueden unir a anticuerpos y desencadenan reacciones inmunes no deseadas I (Jenkins y otros, Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Las células de mamífero son los hospederos preferidos para la producción de glicoproteínas terapéuticas, debido a su capacidad para glicosilar proteínas en la forma más compatible para la aplicación humana. (Cumming y otros, Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins y otros, Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Las bacterias muy rara vez glicosilan proteínas, y al igual que otros tipos de hospederos comunes, tales como levaduras, hongos filamentosos, insectos y células vegetales, generan patrones d'e glicosilación asociados con la rápida depuración del torrente sanguíneo, interacciones inmunes no deseadas, y en algunos casos específicos, reducción de la actividad biológica. Entre otras células de mamíferos, las células de ovario de hámster chino (CHO) se han usado con mucha frecuencia en las últimas dos décadas. Además de proveer patrones de glicosilación adecuados, estas células permiten la constante generación de líneas celulares clónales estables y altamente productivas. Se pueden cultivar hasta lograr grandes densidades en biorreactores simples con medio libre de suero, y permiten el desarrollo de bioprocesos seguros y reproducible. Otras células animales de uso común incluyen las células de riñon de hámster bebé (BHK) , y células de mieloma murino NSO y SP2/0. Más recientemente, también se estudió la producción de animales transgénicos. (Jenkins y Qtros, Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Todos los anticuerpos contienen estructuras de carbohidratos en posiciones conservadas de las regiones constantes de las cadenas pesadas, en donde cada isotipo posee una disposición diferenciada de estructuras de hidratos de carbono ligadas a N, cuya variabilidad afecta el ensamblado, la secreción o la actividad funcional de la rJroteína. (Wright, A., y Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). La estructura del hidrato de carbono ligado a| N varía considerablemente según el grado de procesamiento, y puede incluir oligosacáridos con elevado contenido de mañosa, con ramificaciones múltiples y con complejos de biantenas. (Wright, A., y Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). En general, hay un procesamiento heterogéneo de las estructuras del oligosacárido nuclear adosado a un sitio particular de glicosilación, por lo que incluso existen anticuerpos monoclonales con múltiples glicoformas. De modo similar, se ha demostrado que aparecen diferencias importantes en la glicosilación de anticuerpo entre líneas celulares, y aun se observan diferencias menores para determinada línea celular cultivada en distintas condiciones de cultivo. (Lifely, M. R. y otros, Glycobiology 5(8) :813-22 (1995) ) . Una forma de obtener grandes incrementos de potencia, mientras se mantiene un proceso de producción simple y potencialmente se evitan efectos secundarios significativos indeseables, consiste en aumentar las funciones efectoras naturales mediadas por células de los anticuerpos monoclonales al someter a ingeniería su componente oligosacárido, tal como se describe en Umaña, P. y otros, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) y la patente de los Estados Unidos No. 6.602.684, cuyos contenidos se incorporan así a la presente en su totalidad como referencia. Los anticuerpos de tipo IgGl, los anticuerpos más comúnmente usados en la inmunoterapia del cáncer, son glicoproteinas que conservan el sitio de glicosilación ligado a N en Asn297 de cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos de complejo bi-antenario adosados a Asn297 están hundidos entre los dominios CH2, y forman extensos contactos con el esqueleto polipeptídico, y su presencia es esencial para que el anticuerpo medie las funciones efectoras tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Lifely, M. R., y otros, Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., y otros, Immunol Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. y Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997)). Umaña y otros demostraron previamente que la sobreexpresión en células de ovario de hámster chino (CHO) de ß (1, 4) -N-acetilglicosaminiltransferasa III ("GnTIII"), una glicosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos, aumenta significativamente la actividad in vitro de ADCC de un anticuerpo monoclonal anti-neuroblastoma quimérico (chCE7) producido por las células CHO sometidas a ingeniería (ver Umaña, P. y otros, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999); y Publicación internacional No. WO 99/54342, cuyos contenidos se incorporan así a la presente en su totalidad como referencia) . El anticuerpo chCE7 pertenece a una gran cantidad de mAb no conjugados que tienen elevada afinidad y especificidad por el tumor, pero demasiado baja pptencia para ser clínicamente útil cuando se produce en líneas celulares industriales estándar carentes de la enzima GhTIII (Umana, P., y otros, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) ) . Ese estudio fue el primero en demostrar que se obtienen grandes incrementos de actividad de ADCC por ingeniería de las células productoras de anticuerpo para expresar GnTIII, lo cual también condujo a un incremento en lá proporción de oligosacáridos biseccionados asociados a la región constante de Fe, incluso oligosacáridos biseccionados ?o fucosilados, por encima de los niveles hallados en anticuerpos naturales. Aun persiste una necesidad de mejores abordajes terapéuticos dirigidos a MCSP para el tratamiento de trastornos de la proliferación celular en mamíferos, incluso, s?n limitaciones, humanos, en donde dichos trastornos se caracterizan por la expresión de MCSP, particularmente la expresión anormal (por ejemplo, la sobreexpresión) incluso, sin limitaciones, melanomas, gliomas, cáncer del lóbulo mamario, y también tumores que inducen la neovasculatura. Breve decripción de la Invención Tras reconocer el notable potencial terapéutico de las moléculas de unión a antígeno (ABM) con especificidad de unión del anticuerpo 225.28S murino y que han sido sometidas ai glicoingeniería para aumentar la afinidad de unión de receptor Fe y la función efectora, los inventores de la presente desarrollaron un método para producir dichas ABM. ínter alia , este método incluye la producción de anticuerpos riecombinantes quiméricos (incluso humanizados) o sus fragmentos quiméricos. La eficacia de estas ABM también se aumenta por ingeniería del perfil de glicosilación de la región Fe del anticuerpo. i En consecuencia, en una modalidad, la presente invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende: (A) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 61; SEC ID NO: 63; SEC ID NO: 65; SEC ID NO: 67; SEC ID NO: 69; SEC ID NO: 71; SEC ID NO: 73; SEC ID NO: 75; y (B) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:77; SEC ID NO:79; SEC ID NO:81; SEC ID NO:83; SEC ID NO:85; SEC ID NO:87; SEC ID NO:89; SEC ID NO: 91; y SEC ID NO: 93; y (C) SEC ID NO: 95. De preferencia, el polinucleótido codifica una proteína de fusión. En otra modalidad, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende: (A) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 97; SEC ID NO:99; y SEC ID NO.101; y (B) SEC ID NO:103 o SEC ID NO:105; y (C) SEC ID NO: 107. De preferencia, el polinucleótido codifica una proteína de fusión. En otra modalidad, la presente invención se refiere a1 un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID No: 3; SEC ID No:5; SEC ID No:7; SEC ID No:9; SEC ID No.ll; SEC ID No:13; S'EC ID No: 15; SEC ID No: 17; SEC ID No: 19; SEC ID No:21; y SEC IjD No: 23. La invención también se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No:29, SEC ID No:31, y SEC ID No:33; SEC ID NO: 35; SEC ID NO: 37; SEC ID NO: 39; SEC ID NO: 41; SEC ID NO:43; SEC ID NO:45; SEC ID NO:47; SEC ID NO:49; SEC ID NO: 51. De preferencia, el polinucleótido codifica una proteína de fusión. Otra modalidad de la invención se refiere a un p'olinucleótido aislado que comprende: (A) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 2; SEC ID No: 4; SEC ID No:6; SEC ID No:8; SEC ID No:10; SEC ID No:12; SEC ID No:14; 3EC ID No: 16; SEC ID No: 18; SEC ID No:20; SEC ID No:22; SEC ID No:24; y (B) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID N0:28 SEC ID NO:30, SEC ID NO:32, SEC ID NO:34 y SEC ID NO: 36; SEC ID NO: 38; SEC ID NO: 40; SEC ID NO: 42; SEC ID i NO: 44; SEC ID NO: 46; SEC ID NO: 48; SEC ID NO: 50; SEC ID NO: 52. En otra modalidad, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que tiene ail menos 80%, alternativamente al menos 85%, alternativamente a'l menos 90%, alternativamente al menos 95%, alternativamente ail menos 99%, de identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID No:l; SEC ID No: 3; SEC ID No: 5; SÉC ID No: 7; SEC ID No: 9; SEC ID No: 11; SEC ID No: 13; SEC ID Np:15; SEC ID No: 17; SEC ID No: 19; SEC ID No:21; y SEC ID No: 23, en donde dicho polinucleótido aislado codifica un p'olipéptido de fusión. Dichos polinucleótidos aislados también pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una región constante de cadena ligera o pesada de anticuerpo humano. En otra modalidad, la invención también se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que tiene al menos 80%, alternativamente al menos 85%, alternativamente al menos 90%, alternativamente al menos 95%, alternativamente al menos 99%, de identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:27, SEC ID NO:29, SEC ID NO: 31; SEC ID NO:33; SEC ID NO:35; SEC ID NO:37; SEC ID NO:39; SEC ID NO:41; SEC ID NO:43; SEC ID NO: 45; SEC ID NO: 47; SEC ID NO: 49; y SEC ID NO: 51, en donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. Dichos polinucleótidos aislados también pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una región constante de cadena ligera o pesada de anticuerpo humano. • La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que comprende: (A) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 2; SEC ID No: 4; SEC ID No: 6; SEC ID No : 8 ; SEC ID No: 10; SEC ID No: 12; SEC ID No:14; S;EC ID No: 16; SEC ID No: 18; SEC ID No:20; SEC ID No:22; y SEC I|D No:24; y (B) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpo, o uno de sus fragmentos, proveniente de una especie distinta de una especie murina. Alternativamente, la invención abarca un polinucleótido aislado que comprende: (A) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID No:28, SEC ID NO:30, SEC ID NiO:32; SEC ID NO: 34; SEC ID NO: 36; SEC ID NO: 38; SEC ID NO: 40; SEC ID NO: 42; SEC ID NO: 46; SEC ID NO: 48; y SEC ID NO: 52; y (B) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo, o uno de sus fragmentos, proveniente de una e,specie distinta de la murina. I La invención también está dirigida a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N¡o:4; SEC ID No: 6; SEC ID No: 8; SEC ID No: 10; SEC ID No: 12; SEC ID No: 14; SEC ID No: 16; SEC ID No: 18; SEC ID No:20; SEC ID No: 22; y SEC ID No: 24. En otra modalidad, la invención e'stá dirigida a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NÓ:30, SEC ID NO:32; SEC ID NO:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40; SEC ID NO:42; SEC ID NO:46; SEC ID NO:48; y SEC ID NO:52. La presente invención también abarca un vector de expresión que comprende uno o más de los polinucleótidos de la invención antes establecida. De preferencia, el vector de expresión al menos la cadena ligera o pesada de un anticuerpo. En una modalidad, el vector de expresión codifica las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo. El vector puede ser un vector policistrónico. La presente invención también se refiere a una célula huésped que comprende uno o más vectores de expresión I de la presente invención o uno o más polinucleótidos de la invención. En una modalidad, el huésped comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que tiene ál menos 80%, alternativamente al menos 85%, alternativamente al menos 90%, alternativamente al menos 95%, alternativamente al menos 99%, de identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID No:l; SEC ID No: 3; SEC ID No: 5; SEC ID No:7; SEC ID No:9; SEC ID No:ll; SEC ID No:13; SEC ID No: 15; SEC ID No: 17; SEC ID No: 19; SEC ID No:21; y SEC ID No: 23, y además comprende un segundo polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de uina cadena ligera de un anticuerpo. En aun otra modalidad, la célula huésped de la invención comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que tiene al menos 80%, alternativamente al menos 85%, alternativamente al menos 90%, alternativamente al menos 95%, alternativamente al menos 99%, de identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:27, SEC ID NO:29, SEC ID NO:31; SEC ID Np:33 SEC ID NO: 35; SEC ID NO: 37; SEC ID NO: 39; SEC ID NÓ:41 SEC ID NO: 43; SEC ID NO: 45; SEC ID NO: 47; SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 51, y además comprende un segundo polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de una cadena pesada de anticuerpo. En otras modalidades, la presente invención está dirigida a un polipéptido de fusión que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 2; SEC ID No:4; SEC ID No:6; SEC ID No:8; SEC ID No:10; SEC ID No: 12; SEC ID No: 14; SEC ID No: 16; SEC ID No: 18; SEC ID No:20; SEC ID No:22; y SEC ID No:24, o una de sus variantes. La invención también está dirigida a un polipéptido de fusión que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 28; SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 32; SEC ID NO:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40; SEC ID NO:42; SEC ID NO:46; SEC ID NO:48; y SEC ID NO:52, o una de sus variantes. La presente invención también se refiere moléculas de unión a antígeno. En consecuencia, en una modalidad, la invención está dirigida a una molécula de unión a antígeno que comprende uno o más polipéptidos de fusión de la invención. De preferencia, la molécula de unión a antígeno se une selectivamente a MCSP humano. En una modalidad de preferencia, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo. Un anticuerpo humanizado es una molécula de unión a antígeno de particular preferencia. Alternativamente, el anticuerpo se puede primatizar. En otras modalidades, la molécula de unión a antígeno de la invención comprende un fragmento de anticuerpo con una región Fe de anticuerpo o una región equivalente a la región Fe de un anticuerpo. En aun otras modalidades, la molécula de unión a antígeno de la invención es scFv, un diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, fragmento Fab o Fab2. En una modalidad de preferencia, la molécula de unión a antígeno se un anticuerpo recombinante, por ejemplo, un anticuerpo humanizado recombinante. El anticuerpo recombinante generalmente comprende una región Fe humana, de preferencia una región Fe de IgG humana. En otra modalidad, la presente invención se refiere a una molécula de unión a antígeno, tal como se analizó con anterioridad que se ha sometido a glicoingeniería para tener una región Fe con oligosacáridos modificados. En una modalidad, la región Fe se ha modificado para tener una cantidad reducida de residuos de mucosa, comparado con la molécula de unión a antígeno no sometida a glicoingeniería. En otra modalidad, la región Fe tiene una mayor proporción de oligosacáridos biseccionados, comparado con la molécula de unión a antígeno no sometida a glicoingeniería. En aun otra modalidad, los oligosacáridos biseccionados son predominantemente un complejo biseccionado . En otra modalidad, las moléculas de la invención de antígeno sometidas a ingeniería tienen una mayor proporción de oligosacáridos biseccionados, no fucosilados en la región Fe dé dicha molécula de unión a antígeno, comparado con la molécula de unión a antígeno no sometida a glicoingeniería. Alternativamente, las moléculas de unión a antígeno de la invención pueden tener una proporción aumentada de residuos de GlcNAc respecto de los residuos de mucosa en la región Fe, comparado con la molécula de unión a antígeno no sometida a glicoingeniería. En una modalidad, los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados están predominantemente en forma de híbrido. Alternativamente, los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados son predominantemente del tipo complejo. En ciertas modalidades, al menos 20%, al menos 30%, al menos 35% o al menos 40%, de los oligosacáridos en la región Fe son b'iseccionados, no fucosilados. En otras modalidades, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, de los oligosacáridos en la región Fie son biseccionados. En aun otra modalidad, al menos 50%, alternativamente al menos 60%, alternativamente al menos 70%, alternativamente al menos 75%, de los oligosacáridos en la región Fe son no fucosilados. ' La presente invención también está dirigida a un método para producir una molécula de unión a antígeno capaz de competir con el anticuerpo monoclonal 225.28S murino para la unión de MCSP humano, en donde dicho método comprende: a) cultivar la célula huésped de la invención en condiciones que permiten la expresión de un polinucleótido que codifica dicha molécula de unión a antígeno; y b) recuperar dicha molécula de unión a antígeno. En una modalidad, la molécula de unión a ántígeno es un anticuerpo, tal como un anticuerpo humanizado. La invención también está dirigida a una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede opcionalmente comprender un adyuvante. La invención también está dirigida a un método para identificar células que expresan MCSP en una muestra o en un sujeto que comprende administrar a dicha muestra o sujeto una molécula de unión a antígeno de la invención. En una modalidad, la identificación tiene fines diagnósticos. En otra modalidad, la identificación tiene fines terapéuticos, por ejemplo el tratamiento de una enfermedad o trastorno. En consecuencia, en ciertos aspectos, la invención está dirigida a, un método para tratar un trastorno de proliferación celular mediado por MCSP en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica de la invención a dicho sujeto. De preferencia, el sujeto es un humano. En una modalidad, el tratamiento comprende bloquear interacciones mediadas por MCSP seleccionadas del grupo que consiste en: unión de ligando MCSP, adhesión de célula de melanoma, activación de pericitos, respuestas quimiotácticas a fibronectina, diseminación celular en proteínas ECM, transducción de señales FAK y transducción de señales ERK. En otra modalidad, la enfermedad o trastorno tratado es seleccionada del grupo que consiste en: melanoma, glioma, cáncer de lóbulo mamario, leucemia aguda, o un tumor sólido que induce neovascularización de vasos sanguíneos. En aun otra modalidad, el tratamiento comprende aniquilar las células que expresan MCSP, de preferencia las células que expresar exceso de MCSP. La presente invención también está dirigido a una célula huésped sometida a glicoingeniería para expresar al menos un ácido nucleico que codifica un primer polipéptido con actividad de ß ( 1, 4 ) -N-acetilglicosaminiltransferasa III en cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe de un segundo polipéptido producido por dicha célula huésped, en donde dicho segundo polipéptido es una molécula de unión a antígeno de la invención. En una modalidad, la célula huésped también expresa un polipéptido cion actividad de manosidasa II. En una modalidad específica, el primer polipéptido también comprende la localización del dominio de un polipéptido residente en el Golgi. De preferencia, la molécula de unión a antígeno de la invención es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En otra modalidad, la molécula de unión a antígeno comprende la región Fe de una IgG humana o una región equivalente a la región Fe de una IgG humana. Las moléculas de unión a antígeno producidas por las células huésped de la invención exhiben aumento de la afinidad de unión de receptor Fe y/o aumento de las funciones efectoras, comparado con la molécula de unión a antigeno producida por la célula huésped no sometida a glicoingeniería. En ciertas modalidades, el primer polipéptido expresado por la célula huésped comprende el dominio catalítico de ß ( 1, 4 ) -N-acetilglicosaminiltransferasa III. En una modalidad, dicho primer polipéptido también comprende la localización del dominio en el Golgi de un polipéptido heterólogo residente en el Golgi, tal como la localización del dominio de manosidasa II, la localización del dominio de ß ( 1, 2 ) -N-acetílglicosaminiltransferasa I, la localización del dominio de ß ( 1, 2 ) -N-acetilglicosaminiltransferasa II, la localización del dominio de manosidasa I, o la localización del dominio de al-6 de fucosiltransferasa nuclear. El aumento de función efectora exhibida por las moléculas de unión a antígeno producidas por las células huésped de la invención es uno o más de aumento de citotoxicidad celular mediada por Fe, aumento de unión a células NK, aumento de unión a macrófagos, aumento de unión a células polimorfonucieares, aumento de unión a monocitos, aumento de señales directas inductoras de apoptosis, aumento ele la maduración de células dendríticas, o aumento de cebado de células T. El aumento de unión de receptor Fe exhibido por las moléculas de unión a antígeno de la invención es, en una modalidad, aumento de unión a un receptor de activación Fc?, tal como Fc?RIII. En una modalidad específica, el aumento de unión es al receptor Fc?RIIIa humano o una de sus variantes naturales . En ciertas modalidades, la célula huésped de la invención es una célula HEK293-EBNA, una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula YO de mieloma, una célula P3X63 de mieloma murino, una célula PER, una célula PER.C6 o una célula de hibridoma. En una modalidad, la célula huésped de la invención comprende al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad de ß ( 1 , 4 ) -N-acetilglicosaminiltransferasa III ligado operativamente a un elemento promotor constitutivo. En otra modalidad, el polipéptido con actividad ß(l,4)-N-acetilglicosaminiltransferasa III que es expresado por la célula huésped es un polipéptido de fusión. 1 La presente invención también abarca un polinucleótido aislado que comprende al menos una alternativamente al menos dos, alternativamente al menos tres, regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal 225.28S murino, o una variante o su forma truncada que contiene al menos los residuos determinantes de especificidad para la región determinante de complementariedad, en donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. De preferencia, la región determinante de complementariedad es seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 61; SEC ID NO: 63; SEC ID NO: 65; SEC ID NO: 67; SEC ID NO: 69; SEC ID NO: 71; SEC ID NO: 73; SEC ID NO: 75; SEC ID NO: 77; SEC ID NO: 79; SEC ID NO: 81; SEC ID NO: 83; SEC ID NO: 85; SEC ID NO: 87; SEC ID NO: 89; SEC ID NO: 91; SEC ID NO: 93; y SEC ID NO: 95. En otra modalidad, la región determinante de complementariedad es seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 97, SEC ID NO: 99, SEC ID NO.101; SEC ID NO:103; SEC ID NO:105; SEC ID NO:107. De preferencia, el polipéptido de fusión que codifica una molécula de unión a antígeno de la invención. En una modalidad específica, los CDR comprenden al menos una secuencia seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID NO: 61; SEC ID NO: 63; SEC ID NO: 65; SEC ID NO: 67; SEC ID NO: 69; SEC ID NO: 71; SEC ID NO: 73; SEC ID NO: 75; SEC ID NO:77; SEC ID NO:79; SEC ID NO:81; SEC ID NO:83; SEC ID NO:85; SEC ID NO:87; SEC ID NO:89; SEC ID NO:91; SEC ID NO: 93; y SEC ID NO: 95; y al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 97, SEC ID NO: 99, SEC ID NO: 101; SEC ID NO: 103; SEC ID NO: 105; SEC ID NO: 107, o formas variantes o truncadas de dichas secuencias que contienen al menos los residuos determinantes de especificidad para cada una de las regiones determinantes de complementariedad. La invención también abarca los polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos, además de las moléculas de unión a antígeno que comprenden dichos polipéptidos. Las moléculas de unión a antígeno de la invención, en algunas modalidades, comprenden la región variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpo. En otras modalidades, la ABM será un anticuerpo quimérico o humanizado. La presente invención también está dirigida a un método para producir una molécula de unión a antígeno con oligosacáridos modificados en una célula huésped, en donde dicho método comprende: (a) cultivar una célula huésped sometida a glicoingeniería para expresar al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad ß(l,4)-N-acetilglicosaminiltransferasa III en condiciones que permiten la producción de dicha molécula de unión a antígeno, y que permiten la modificación de los oligosacáridos presentes en la región Fe de dicha molécula de unión a antígeno; y (b) aislar dicha molécula de unión a antígeno en donde dicha molécula de unión a antígeno es capaz de competir con el anticuerpo monoclonal 225.28S murino para unirse a MCSP y en donde dicha molécula de unión a antígeno o su fragmento es quimérico o humanizado. En un método de la invención, los o_igosacáridos modificados tienen una proporción reducida de discos residuos de mucosa, comparado con los oligosacáridos dé la molécula de unión a antígeno no sometida a glicoingeniería. En ciertas modalidades, los oligosacáridos modificados son predominantemente formas híbridas. En una modalidad alternativa, los oligosacáridos modificados son predominantemente formas complejas. En otra modalidad, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o al menos 90% de los oligosacáridos modificados son biseccionados no fucosilados. En otras modalidades de los métodos de la invención, el anticuerpo recombinante o uno de sus fragmentos producidos por dicha célula huésped tiene una proporción aumentada de oligosacáridos biseccionados, no fucosilados de la región Fe de dicho polipéptido, comparado con la molécula de unión a antígeno producida por la célula no sometida a gilicoingeniería . En una modalidad, los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados son predominantemente formas híbridas. En otra modalidad, los oligosacáridos biiseccionados, no fucosilados son predominantemente formas complejas. En ciertas modalidades, al menos 20%, al menos 30%, al menos 35%, o al menos 40%, de los oligosacáridos de la región Fe de dicho polipéptido son biseccionados no fucosilados . Las moléculas de unión a antígeno producidas por los métodos de la invención, en ciertas modalidades tienen aumento de la función efectora o aumento de la afinidad de unión al receptor Fe. En una modalidad, dicha molécula de unión a antígeno es un anticuerpo. El aumento de función efectora puede ser uno o más de aumento de citotoxicidad celular mediada por Fe, aumento de unión a células NK, aumento de unión a macrófagos, aumento de unión a monocitos, aumento de unión a células polimorfonucieares, señales directas inductoras de apoptosis, aumento de la maduración de células dendríticas, o aumento de cebado de células T. De preferencia, el aumento de unión a receptor Fe es aumento de unión a un Receptor activador de Fe, tal como FcyRIIIa. La presente invención también está dirigido a una molécula de unión a antígeno que es una proteína de fusión q-ue incluye un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID No: 2; SEC ID N;o:4; SEC ID No: 6; SEC ID No: 8; SEC ID No: 10; SEC ID No: 12; SEC ID No: 14; SEC ID No: 16; SEC ID No: 18; SEC ID No: 20; SEC ID No:22; y SEC ID No:24; y una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y sometida a ingeniería para tener aumento de la función efectora. En otra modalidad, dicha molécula de unión a antígeno es una proteína de fusión que incluye un polipéptido que tiene una secuencia sieleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 28, SEC ID N'?:30, SEC ID NO:32, SEC ID NO:34, SEC ID NO: 36; SEC ID NO:38, SEC ID NO:40, SEC ID NO:42, SEC ID NO: 44, SEC ID NO:46, SEC ID NO:48, SEC ID NO:50, y SEC ID NO:52, y una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y sometida a ingeniería para tener aumento de la función eifectora. La invención también está dirigida a una composición farmacéutica que comprende dichas moléculas de unión a antígeno y a portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención también está dirigida a un método para inducir la lisis de pericitos activados en neovasculatura tumoral en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una molécula de unión a antígeno de la invención o una composición farmacéutica que lo comprende. De preferencia, dicho sujeto es un humano. En una modalidad, dicha neovasculatura no es neovasculatura de melanoma o neovasculatura de glioblastoma. En otra modalidad, la molécula de unión a antígeno se coadministra con otro agente antiangiogénico, tal como un anticuerpo anti-VEGF-1. Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra la actividad de unión de las tires construcciones de cadena pesada M-HHA, M-HHB, y M-HHC además de tres construcciones de cadena ligera M-KV1, M-KV2, y M-KV3. Las construcciones de cadena pesada humanizada se coexpresaron con cadena ligera murina (mVL) , y las construcciones de cadena ligera se coexpresaron con la cadena pesada murina (mVH) . M-HHA y M-HHB retuvieron más o menos sus propiedades enlazadoras cuando se combina con VL murino. En contraste, M-HHC pierde significativamente su potencial de unión. M-KV1 y M-KV2 muestran fuerte disminución de la actividad de unión, comparado con su contrapartida murina, mientras que M-KVC muestra un comportamiento de unión similar al de la cadena ligera murina. La Figura 2 muestra los datos de unión de construcciones de "baja homología " M-HLA, M-HLB, y M-HLC. La Figura 3 muestra los datos de unión de construcciones de cadenas ligeras M-KV4 , M-KV5, M-KV6, M-KV7, M-KV8 y M-KV9 cuando se aparean con la cadena pesada M-HHB. M-KV4 mostró aumento de afinidad con el antígeno. Comparado con el anticuerpo ch-225.28S, mientras que M-KV5 y M-KV6 perdieron propiedades funcionales y M-KV7 mostró unión similar a ch-225.28S. La Figura 4 muestra los resultados del ensayo de unión de antígeno cuando las construcciones de cadenas pesadas M-HLE1, M-HLE2, M-HLF y M-HLG se aparean con las construcciones de cadenas ligeras m-KV4. Las construcciones M HLE1 y M-HLE2 mostraron cierta unión residual, mientras que M-HLF casi no mostró unión. Por otra parte, M-HLG mostró mayor afinidad con el antígeno que el anticuerpo de progenitor ch-225.28S. La Figura 5 muestra la unión de la variante de cadena ligera M-KV9 cuando se combina con M-HHB. Dicha construcción mostró buenos datos de unión.

La Figura 6 muestra la comparación de distintas glicoformas de la construcción humanizada M-HLG/M-KV9 del anticuerpo 225.28S en la muerte celular mediada por anticuerpo mediante células PBMC humanas. Las células objetivo son células A2058 humanas, y se puede observar un fuerte aumento de potencia y eficacia de la construcción sometida a glicoingeniería, comparada con el anticuerpo de tipo salvaje. La Figura 7 muestra la comparación del comportamiento de unión de antígeno de la construcción de cadena ligera M-KV10, M-KV11, y M-KV12, combinada con la cadena pesada M-HLG. Estas variantes muestran toda reducción de unión, comparado con la construcción de cadena ligera M-KV9. También se muestra en esta Figura la cadena pesada M-HLD apareada con la cadena ligera M-KV9. M-HLD es la variante T'yr27Phe y Thr30Ser de la construcción completamente inactiva M-HLC. En consecuencia, estas dos mutaciones restablecen parcialmente la actividad de unión de antígeno. Esto indica l'a importancia de estos dos residuos para todo el proceso de humanización. La Figura 8 muestra el perfil MALDI/TOF-MS de oligosacáridos Fe liberados por PNGasaF del anticuerpo MCSP no sometido a glicoingeniería M-HLG/M-KV9 G2 humanizado IgG1225.28S antihumano. Los dos picos principales a 1485,5 y 1647,6 m/z corresponden ambos a azúcares híbridos biseccionados fucosilados. i La Figura 9 muestra el perfil MALDI/TOF-MS de oiligosacáridos Fe liberados por PNGasaF del anticuerpo MCSP np sometido a glicoingeniería M-HLG/M-KV9 G2 humanizado IgG1225.28S antihumano. La glicoingeniería realizada por coexpresión en células huésped de genes de anticuerpo y genes que codifican la enzima con actividad catalítica de D-l,4-N-acetilglicosaminiltransferasa III (GnT-III) y que codifica la enzima con actividad catalítica con -manosidasas II de Golgi. Los cuatro picos principales a 1542,9, 1688,7, 1704,6, y 1850,5 corresponden todos a azúcares complejos biseccionados que están presentes en su forma fucosilada y no fucosilada . La Figura 10 muestra un dibujo esquemático de los diferentes oligosacáridos ligados a N que pueden ser afectados por glicoingeniería a través de la coexpresión de GhTIII y/o Manll. La Figura 11 muestra citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) mediante el anticuerpo M-HLG/M-KV9, células musculares lisas humanas (HuSMC) como objetivos, y PBMC humanos como células efectoras. La relación ejfector/objetivo era de 25/1, y la duración del experimento era de 4h. La Figura 12 muestra citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) mediante el anticuerpo M- HLG/M-KV9 en sus formas no sometida a glicoingeniería y sometida a glicoingeniería (G2), líneas celulares de glioblastoma humana LN229 como objetivos, y PBMC humanas como células efectoras. La relación efector/objetivo era de 25/125/1, y la duración del experimento era de 4h. Descripción detallada de la Invención Los términos se usan en la presente tal como se usan generalmente en la técnica, a menos que se defina otra cosa a continuación. Tal como se usa en la presente, el término anticuerpo pretende incluir moléculas de anticuerpo enteras, incluso anticuerpos monoclonales, policlonales y multispecífieos (por ejemplo, biespecíficos) , además de fragmentos de anticuerpo con la región Fe y que mantiene especificidad de unión, y proteínas de fusión que incluyen u'na región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y que retienen la especificidad de unión. También se abarcan anticuerpos quiméricos y humanizados, además de anticuerpos camelizados y primatizados . Tal como se usa en la presente, el término región Fe pretende referirse a una región C terminal de una cadena pesada IgG humana. Aunque los límites de la región Fe de una cadena pesada pueden variar ligeramente, por lo general la región Fe de la cadena pesada de IgG humana se define para alcanzar desde el residuo de aminoácido en la posición Cys226 hasta el carboxilo terminal. Tal como se usa en la presente, el término región equivalen te a la región Fe de una inmunoglobulina pretende incluir variantes alélicas naturales de la región Fe de una inmunoglobulina, además de variantes con alteraciones que producen sustituciones, adiciones, o eliminaciones pero que no disminuyen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina para mediar funciones efectoras (tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo) . Por ejemplo, se puede eliminar uno o más aminoácidos del N terminal o el C terminal de la región Fe de una inmunoglobulina sin pérdida sustancial de la función biológica. Dichas variantes se pueden seleccionar de acuerdo con reglas generales conocidas en la técnica por tener mínimo efecto sobre la actividad. (Ver, por ejemplo, Bowie, J. U. y otros, Science 247:1306-10 (1990). Tal como se usa en la presente, el término MCSP se refiere al proteoglicano de condroitinsulfato de melanoma humano (también denominado antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) ) , además de isoformas naturales y sus variantes. Las secuencias MCSP se han depositado y se les han asignado los siguientes números: No. de acceso a G;enBank MIM:601172 (gen); GI:1617313, GI.21536290, GI.34148710, y GI:47419929 (mARN); GI:1617314, GI.4503099, GT.34148711, y GI.47419930 (proteina) Tal como se usa en la presente, el término ligando MCSP se refiere a un polipéptido que se une a y/o activa MCSP. El término incluye formas precursoras ligadas a membrana de un ligando MCSP, además de formas solubles proteolíticamente procesadas de un ligando MCSP. Tal como se usa en la presente, el término enfermedad o tras torno cara cteri zado por la a ctiva ción , expresión , o producción anormal de MCSP o un ligando MCSP o trastorno rela cionado con la expresión MCSP se refiere a una condición, que puede o no incluir una enfermedad maligna o cáncer, en donde ocurre activación y/o producción anormal de MCSP y/o un ligando MCSP en células o tejidos de un sujeto con la enfermedad o trastorno o predispuesto a ellos. Tal como se usa en la presente, los términos sojreexpresar, sobreexpresado, y que se sobreexpresa , tal como se usa en conexión con células que expresan MCSP, se refieren a células que tienen niveles medibles superiores de MCSP en su superficie, comparado con una célula normal del mismo tipo de tejido. Dicha sobreexpresión puede ser causada p'or amplificación génica o por aumento de la transcripción o la traducción. La expresión de MCSP se puede determinar en un ensayo diagnóstico o pronóstico mediante la evaluación de los niveles de MCSP presentes en la superficie de una célula (por ejemplo, mediante un ensayo inmunohistoquímico; un ensayo de inmunofluorescencia, un ensayo de inmunoenzima, ELISA, citometría de flujo, radioinmunoensayo, Western blot, enlazador de ligando, actividad de cinasa, etc.) (Ver en general, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, Celis, J., ed., Academic Press (2d ed., 1998); CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coligan, J.E. y otros, eds., John Wiley & Sons (1995-2003); ver también, Sumitomo y otros, Clin. Cáncer Res. 10: 794-801 (2004) (describen Western blot, citometría de flujo, e inmunohistoquímica) cuyos contenidos se incorporan así en la presente en su totalidad como referencia) ) . Alternativamente, o. adicionalmente, se pueden medir los niveles de ácidos nucleicos codificadores de MCSP en la célula, por ejemplo, por vía hibridación fluorescente in situ, Southern blot, o técnicas de PCR. Los niveles de MCSP en las células normales se comparan con los niveles de células afectadas por un trastorno de proliferación celular (por ejemplo, cáncer) para determinar si hay sobreexpresión de MCSP. Tal como se usa en la presente, el término molécula de unión a an tígeno o ABM se refiere en el sentido más amplio a' una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Más específicamente, una molécula de unión a antígeno que une MCSP es una molécula que se une específicamente a MCSP tal como se definió con anterioridad. Dé preferencia, la ABM es un anticuerpo; sin embargo, los anticuerpos de cadena única, las moléculas Fv de cadena única, los fragmentos Fab, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y similares también se contemplan en la presente invención. Por "se une específicamen te " o "se une con la misma especificidad" se entiende que la unión es selectiva para el antígeno y se puede diferenciar de interacciones no deseadas o inespecíficas . Tal como se usa en la presente, los términos fusión y quiméri co, usados en referencia a polipéptidos tales como ABM se refieren a polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de dos o más polipéptidos heterólogos, tales como porciones de anticuerpos provenientes de distintas especies. Para las ABM quiméricas, por ejemplo, los componentes no enlazadores de antígeno se pueden derivar de una amplia variedad de especies, incluso primates tales como chimpancés y humanos. La región constante de la ABM quimérica es con mayor preferencia sustancialmente idéntica a la región constante de un anticuerpo natural humano; la región variable del anticuerpo quimérico es con mayor preferencia sustancialmente idéntica a la de un anticuerpo récombinante anti-MCSP con la secuencia de aminoácidos de la r'egión variable murina. Los anticuerpos humanizados son una fprma de particular preferencia de anticuerpo de fusión o quimérico . i Tal como se usa en la presente, un polipéptido con "a ctividad Gn TIII " se refiere a polipéptidos capaces de catalizar la adición de un residuo de N-acetilglicosamina (GlcNAc) en una unión ß-1-4 al manósido ligado a ß del núcleo de trimanosil de oligosacáridos ligados a N. Esto incluye polipéptidos de fusión que exhiben actividad enzimática similar, pero no necesariamente idéntica a una actividad de ß ( 1, 4 ) -N-acetilglicosaminiltransferasa III, también denominada ß~l/ 4-manosil-glicoprotein-4-beta-N-acetilglicosaminil-transferasa (EC 2.4.1.144), de acuerdo con el Nomenclature Committee of the Internacional Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) , medido en un ensayo biológico particular, con dependencia de dosis o no. En el caso en que haya dependencia de la dosis, no necesita ser idéntica a la de GnTIII, sino sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en determinada actividad, comparado con GnTIII (es decir, el polipéptido candidato exhibirá mayor actividad o no mayor de aproximadamente 25 veces inferior y, de preferencia, no mayor de aproximadamente 10 veces menos actividad, y con mayor preferencia aún, no m'ayor de aproximadamente tres veces menos actividad respecto de GnTIII. ) Tal como se usa en la presente, el término varian te (o análogo) se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido de la invención específicamente citado por inserciones, eliminaciones, y sustituciones de aminoácidos creados al usar, por ejemplo, técnicas recombinantes de ADN.

Las variantes de las ABM de la presente invención incluyen moléculas de unión a antígeno quiméricas, primatizadas o humanizadas en donde uno o varios de los residuos aminoácido spn modificados por sustitución, adición y/o eliminación de manera tal que no afectan sustancialmente la afinidad de unión del antígeno (por ejemplo, MCSP) o la función efectora del anticuerpo. Las pautas para determinar qué residuos aminoácido se pueden reemplazar, agregar o eliminar sin abolir las actividades de interés, se pueden hallar por i comparación de la secuencia del polipéptido particular con la i de los péptidos homólogos y minimizar la cantidad de cambios de la secuencia de aminoácidos en las regiones de gran homología (regiones conservadas) o por reemplazo de aminoácidos con secuencias de consenso. i Alternativamente, las variantes recombinantes que codifican estos polipéptidos o similares se pueden sintetizar o, seleccionar al usar la "redundancia" del código genético. Se pueden introducir diversas substituciones de codones tales como los cambios silenciosos que producen diversos sitios de restricción, a fin de optimizar la clonación en un vector plásmido o viral vector o expresión en un particular sistema procarionte o eucarionte. Las mutaciones en la secuencia de p'plinucleótidos se pueden definir en el polipéptido o los dominios de otros péptidos agregados al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido, para cambiar características tales como afinidades de unión de ligando, afinidades entre cadenas, o tasa de degradación/recambio . i De preferencia, "sustituciones" de aminoácido son consecuencia de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido de propiedades estructurales y/o químicas similares, es decir, reemplazos conservadores de aminoácidos. Las sustituciones "conservadoras" de aminoácidos se pueden hacer en base a similitudes de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza antipática de los residuos que intervienen. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina; los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina; los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, e histidina; y los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las "inserciones" o "eliminaciones" de preferencia están en el rango de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoácidos, con mayor preferencia aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar experimentalmente mediante inserciones, eliminaciones, o sustituciones sistemáticas de aminoácidos en una molécula de polipéptido mediante técnicas de ADN recombinante y el ensayo de la actividad con las distintas variantes recombinantes obtenidas. Tal como se usa en la presente, el término humanizado se usa para referirse a una molécula de unión a antígeno (ABM) derivada de una molécula de unión a antigeno no humana, por ejemplo, un anticuerpo murino, que mantiene o mantiene sustancialmente las propiedades de unión de antígeno de la molécula progenitora pero es mucho menos inmunogénica en humanos. Esto se puede lograr por diversos métodos que incluyen (a) injertar solo los CDR no humanos en un marco humano y las regiones constantes con o sin retención de residuos críticos de marco (por ejemplo, los importantes para mantener buena afinidad de unión de antígeno o funciones de anticuerpo) , o (b) trasplantar la totalidad de los dominios variables no humanos, pero "esconderlos" con un corte similar al humano por reemplazo de los residuos de superficie. Dichos métodos se describen en Jones y otros, Nature 321:6069, 522-525 (1986); Morrison y otros, Proc. Nati. Acad. Sci., 81:6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol . , 44:65-92 (1988); Verhoeyen y otros, Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun . , 31 (3) : 169-217 (1994), todos los cuales se incorporan así en su totalidad a la presente como referencia. En general, hay 3 determinantes de región de complementariedad, o CDR, (CDRl, CDR2 y CDR3) en cada uno de los dominios variables de cadena pesada o ligera de un anticuerpo, que están flanqueados por cuatro subregiones marco (es decir, FRl, FR2, FR3, y FR ) : FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Se pueden hallar un análisis de anticuerpos humanizados, in ter alia , en la patente de los Estados Unidos No. 6,632,927, y en la solicitud publicada de los Estados Unidos No. 2003/0175269, ambas se incorporan asi en su totalidad a la presente como referencia. De modo similar, tal como se usa en la presente, el termino prima ti zado se usa para referir a una molécula de unión a antígeno derivada de una molécula de unión a antígeno no primate, por ejemplo, un anticuerpo murino, que mantiene o m ntiene sustancialmente las propiedades de unión a antígeno die la molécula progenitora, pero es menos inmunogénica en pjrimates. ' En el caso de que haya dos o más definiciones de un término usado y/o aceptado en la técnica, la definición del término tal como se usa en la presente pretende incluir todos dichos significados, a menos que se establezca e'specíficamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso del término "región determinan te de complemen tariedad" ('"CDR") para describir los sitios de combinación con el antígeno no contiguos hallados dentro de la región variable die los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Esta región particular fue descrita por Kabat y otros, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia y otros, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), que se incorporan a la presente como referencia, en donde las definiciones incluyen superposición o subconjuntos de residuos de aminoácido, comparados entre sí. No obstante, la aplicación de cualquiera de las definiciones para referirse a un CDR de un anticuerpo o una de sus variantes pretende estar dentro del alcance del término tal como se define y se usa en la presente. Los residuos adecuados de aminoácido que abarcan los CDR tal como se definen por cada una de las antes citadas referencias se establecen a continuación en la Tabla 1 como comparación. La cantidad exacta de residuos que abarcan un CDR particular variará de acuerdo con la secuencia y el tamaño del CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de rutina los residuos que comprenden un CDR particular según la secuencia de aminoácidos de la rfegión variable secuencia del anticuerpo. TABLA 1. DEFINICIONES DE CDR x 1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la Tabla 1 está de acuerdo con las convenciones de numeración establecidas por Kabat y otros (ver más adelante) . 2 "AbM" se refiere a los CDR según la definición del software de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular . Kabat y otros también definieron un sistema de numeración para las secuencias de dominio variable aplicables a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede a¡signar sin ambigüedades este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de cualquier dato experimental, fuera de la propia secuencia. Tal como se usa en la presente, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat y otros, U.S. Dept. of Health abd Human Services, "'Sequence of Proteins of Inmunological Interest" (1983). A menos que se especifique otra cosa, las referencias a la numeración de posiciones específicas de los residuos de aminoácido en una ABM están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Las secuencias del listado de secuencias I (Íes decir, SEC ID NO:l a SEC ID NO: 110) no están numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, tal como se establece más adelante, es parte de la pericia de un experto en la técnica determinar el esquema de numeración dé Kabat de cualquier secuencia de región variable en el Listado de secuencias basado en la numeración de las secuencias tal como se presentan allí. Por ácido nucleico o polinucleótido con una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención, se entiende que la secuencia de n'ucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nµcleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia se pueden eliminar o: sustituir con otro nucleótido, o una cantidad de niucleótidos de hasta 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia . i Desde el punto de vista práctico, se puede d'eterminar si cualquier molécula particular de ácido nucleico o polipéptido tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 9:8% o 99% de identidad a una secuencia de nucleótidos o secuencia de polipéptido de la presente invención convencionalmente mediante programas de computación conocidos. Un método de preferencia para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia incógnita (una secuencia de la presente invención) y una secuencia temática, también denominado alineación global de secuencia, se puede obtener mediante el programa de computación FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y otros, Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). En una alineación de secuencia, las secuencias incógnita y sujeto son ambas secuencias de ADN. Una secuencia ARN se puede comparar al convertir U en T . El resultado de dicha alineación global de secuencia es un porcentaje de identidad. Los parámetros de preferencia usados en la alineación FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=Unitaria, k-túple=4, Margen de discordancia =1, margen de unión =30, longitud del grupo de aleatorización=0, calificación de corte =1, Margen de brecha =5, Margen de tamaño de brecha 0,05, tamaño de ventana =500 o la longitud de la secuencia de nucleótidos del sujeto, cualquiera sea el más corto. Si la secuencia temática es más corta que la secuencia incógnita debido a eliminaciones5 ' o 3', no debido a eliminaciones internas, se puede hacer una corrección manual de los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no considera las truncaciones 5' y 3' de la secuencia temática al calcular el porcentaje de identidad. Para las secuencias sujeto truncadas en los extremos 5' o 3', respecto de la secuencia incógnita, se corrige el porcentaje de identidad mediante el cálculo de la cantidad de bases de la secuencia incógnita que están 5' y 3' de la secuencia temática, y que no coinciden/están alineadas, como porcentaje del total de bases de la secuencia incógnita. Se determina si un nucleótido coincide/está alineado a través de los resultados de la alineación de secuencia de FASTDB. Este porcentaje luego se resta del porcentaje de identidad, calculado por el anterior programa FASTDB mediante los parámetros especificados, a fin de alcanzar una calificación final de porcentaje de identidad. Esta calificación corregida es la que se usa a los fines de la presente invención. Solo se calculan las bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia temática, tal como se muestra en la alineación FASTDB, que no coinciden /están alineadas con la secuencia incógnita, a los fines del ajuste manual del porcentaje de identidad de la calificación de porcentaje de identidad. Por ejemplo, una secuencia temática de 90 bases se alinea con una secuencia incógnita de 100 bases para d terminar el porcentaje de identidad. Las eliminaciones ocurren en el extremo 5' de la secuencia temática y en consecuencia, la alineación FASTDB no muestra coincidencia/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases no apareadas representan el 10% de la secuencia (cantidad de bases en los extremos 5' y 31 no coincidentes/cantidad total de bases en la secuencia incógnita) de manera tal que se resta el 10% de la calificación de porcentaje de identidad calculada mediante el programa FASTDB. Si el resto de las 90 bases coinciden perfectamente, el porcentaje final de identidad sería de 90%. Eh otro ejemplo, se compara una secuencia temática de 90 bases con una secuencia incógnita de 100 bases. Esta vez, las eliminaciones son eliminaciones internas, por lo que no hay bases en 5 ' o 3' de la secuencia del sujeto que no coinciden /están alineadas con la incógnita. En este caso no se corrige manualmente el porcentaje de identidad calculado por FASTDB. Otra vez, sólo se corrigen manualmente las bases 5' y 3' de la secuencia de sujeto que no coinciden/están alineadas con la secuencia incógnita. No se hacen otras correcciones manuales a los fines de la presente invención. Por polipéptido con secuencia de aminoácidos al írtenos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia incógnita die aminoácidos de la presente invención, se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto es idéntica a la secuencia incógnita excepto en que la secuencia de piolipéptido sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia incógnita de aminoácidos. En otras palabras, para obtener un p.olipéptido con una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia incógnita de aminoácidos, se puede insertar, eliminar o sustituir hasta el 5% de los residuos de aminoácido en la secuencia temática por otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones aminoterminal o carboxiterminal de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier sitio entre esas posiciones terminales, disperso individualmente entres residuos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia . A los fines prácticos, se puede determinar convencionalmente si un polipéptido particular tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con un polipéptido de referencia mediante programas de computación conocidos. Un método de preferencia para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia incógnita (una secuencia de la presente invención) y una secuencia temática, también denominada alineación de secuencia global, se puede determinar con el programa de computación FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y otros, Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990) . En una alineación de secuencia, las secuencias incógnitas y sujeto son ambas secuencias de nucleótidos o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha alineación global de secuencia es un porcentaje de identidad. Los parámetros de preferencia usados en la alineación FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=PAM 0, k-túple=2, margen de discordancia =1, margen de unión =20, longitud del grupo de aleatorización =0, calificación de corte =1, tamaño de ventana =longitud de secuencia, margen de brecha =5, Margen de tamaño de brecha 0,05, tamaño de ventana =500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos sujeto, cualquiera sea más corto. Si la secuencia temática es más corta que la secuencia incógnita debido a eliminaciones N terminal o C terminal, no debido a eliminaciones internas, se debe hacer una corrección manual a los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no considera las truncaciones N terminal o C terminal de la secuencia temática al calcular el porcentaje de identidad. Para las secuencias sujeto truncadas en los N terminal o C terminal, respecto de la secuencia incógnita, se corrige el porcentaje de identidad mediante el cálculo de la cantidad de residuos de la secuencia incógnita que están N terminal o C terminal de la secuencia temática, y que no cpinciden/están alineadas, como porcentaje del total de bases de la secuencia incógnita. Se determina si un nucleótido coincide/está alineado a través de los resultados de la alineación de secuencia de FASTDB. Este porcentaje luego se resta del porcentaje de identidad, calculado por el anterior programa FASTDB mediante los parámetros especificados, a fin de alcanzar una calificación final de porcentaje de identidad. Esta calificación corregida es la que se usa a los fines de la presente invención. Solo se calculan los residuos de los N terminal o C terminal de la secuencia temática que no coinciden/están alineadas con la secuencia incógnita, a los fines del ajuste manual del porcentaje de identidad de la calificación de porcentaje de identidad. Es decir, solo las posiciones de los residuos incógnita por fuera de los residuos más extremos N terminal y C terminal de la secuencia temática . Por ejemplo, una secuencia temática de 90 residuos de aminoácido se alinea con una secuencia incógnita de 100 residuos para determinar porcentaje de identidad. La eliminación ocurre en el N terminal de la secuencia temática y en consecuencia, la alineación FASTDB no muestra coincidencia/alineación de los primeros 10 residuos en el N terminal. Los 10 residuos no apareados representan el 10% de la secuencia (cantidad de residuos en N terminal y C terminal no coincidentes/cantidad total de residuos en la secuencia incógnita) por lo que se resta el 10% de la calificación de porcentaje de identidad calculada mediante el programa FÁSTDB. Si el resto de las 90 bases coinciden perfectamente, el porcentaje final de identidad sería de 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia temática de 90 bases con una secuencia incógnita de 100 bases. Esta vez, las eliminaciones son eliminaciones internas, por lo que no hay residuos en el N terminal o el C terminal de la secuencia del sujeto que no coinciden/están alineadas con la incógnita. En este caso no se corrige manualmente el porcentaje de identidad calculado por FASTDB. Otra vez, sólo se corrigen m'anualmente las posiciones de los que están por fuera de los extremos residuos N terminal y C terminal de la secuencia de sujeto, tal como se muestra en la alineación FASTDB, que no coinciden/están alineadas con la secuencia incógnita. No se hacen otras correcciones manuales a los fines de la presente invención . Tal como se usa en la presente, un ácido nucleico que "se hibridi za en condi ciones rigurosas" a una secuencia de ácido nucleico de la invención se refiere un polinucleótido que se hibrida en una incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende 50% de formamida, 5'x SSC (750 mM de NaCl, 75 mM de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), 5x de solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrina, y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón desagregado y desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en O.lx SSC a aproximadamente 65°C. i Tal como se usa en la presente, el término dominio d'e locali za ción en Golgi se refiere a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido residente en el Golgi que es responsable de anclar el polipéptido en la ubicación dentro del complejo de Golgi. Por lo general, los dominios de localización comprenden "colas" amino terminales de una enzima.

Tal como se usa en la presente, el término función efectora se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen, sin limitaciones, afinidad de unión a receptor Fe, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) , fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) , secreción de citocinas, captación de antígeno por células presentadoras de antígeno mediada por complejo inmune, regulación hacia debajo de receptores de superficie celular, etc. Tal como se usa en la presente, los términos ingeniería , sometido a ingeniería , someter a ingeniería , sometida a glicoingeniería y ingeniería de glicosilación se consideran incluyentes de cualquier manipulación del patrón d glicosilación de un polipéptido natural o recombinante, ppr ejemplo una molécula de unión a antígeno (ABM), o uno de sus fragmentos. La ingeniería de glicosilación incluye la ingeniería metabólica de la maquinaria de glicosilación de una célula, incluso las manipulaciones genéticas de las vías de síntesis de oligosacáridos para obtener alteraciones de la gjlicosilación de glicoproteínas expresadas en las células. Además, la ingeniería de glicosilación incluye los efectos de mµtaciones y el ambiente celular sobre la glicosilación. En una modalidad, la ingeniería de glicosilación es una alteración de la actividad de glicosiltransferasa . En una particular modalidad, la ingeniería da por resultado alteraciones de la actividad de glicosaminiltransferasa y/o dé la actividad de la fucosiltransferasa . Tal como se usa en la presente, el término cél ula huésped cubre cualquier tipo de sistema celular que pueda ser sometido a ingeniería para generar los polipéptidos y las moléculas de unión a antígeno de la presente invención. En una modalidad, la célula huésped es sometida a ingeniería para permitir la producción de una molécula de unión a antígeno con glicoformas modificadas. En una modalidad de preferencia, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o proteína de fusión. En ciertas modalidades, las células huésped también han sido manipuladas para expresar mayores niveles de uno o más polipéptidos con actividad GnTIII. En otras modalidades, las células huésped han sido sometidas a ingeniería para eliminar, reducir o inhibir la actividad de al,6-fucosiltransferasa nuclear. El término "actividad de al, 6-fúcosiltransferasa nuclear" abarca la expresión del gen de al, 6-fucosiltransferasa nuclear además de la interacción de la enzima al , 6-fucosiltransferasa nuclear con su sustrato. Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células YO de mieloma, células P3X63 de mieloma murino, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levaduras, células de insecto, y células vegetales, para nombrar solo algunas, pero también las células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o planta o tejido animal cultivados . Tal como se usa en la presente, el término ci totoxi cidad cel ular mediada por Fe incluye la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo y la citotoxicidad celular mediada por una proteína de fusión Fe soluble que contiene una región Fe humana. Es un mecanismo inmune que conduce a la lisis de "células objetivo de anticuerpo" por "células efectoras inmunes humanas", en donde: Las cél ulas efectoras inmunes humanas son una población de leucocitos que presentan receptores Fe en su superficie, a través de los cuales se unen a la región Fe de los anticuerpos o de las proteínas de fusión Fe y realizan funciones efectoras. Dicha población puede incluir, sin limitaciones, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y/o células natural aniquiladoras (NK) . Las cél ulas activadas de an ti cuerpo son células uñidas a las ABM (por ejemplo, anticuerpos o proteínas de fusión Fe) de la invención. En general, los anticuerpos o proteínas de fusión Fe se unen a las células objetivo a través de la parte N terminal de la región Fe de la proteína.

Tal como se usa en la presente, el término aumen to de ci totoxicidad cel ular mediada por Fe se define como un incremento de la cantidad de "células objetivo de anticuerpo" usadas en determinado tiempo, con determinada concentración de anticuerpo, o de proteína de fusión Fe, en el medio que rodea las células objetivo, por los mecanismos de citotoxicidad celular mediada por Fe antes definidos, y/o reducción de la concentración de anticuerpo, o de proteína de fusión Fe, en el medio que rodea las células objetivo, requerido para lograr la lisis de determinada cantidad de "células objetivo de anticuerpo", en determinado tiempo, por los mecanismos de citotoxicidad celular mediada por Fe. El aumento de citotoxicidad celular mediada por Fe es relativo a la citotoxicidad celular mediada por el mismo anticuerpo, o proteína de fusión Fe, producido por el mismo tipo de células huésped, con los mismos métodos estándar de producción, purificación, formulación y almacenamiento conocidos por los expertos en la técnica, pero que no han sido producidos por las células huésped sometidas a glicoingeniería para expresar la glicosiltransferasa GnTIII por los métodos descritos en el presente . Por an ti cuerpo con a umen to de ci totoxicidad cel ular dependien te de an ticuerpo (ADCC) se entiende un anticuerpo, tal como se definió dicho término en la presente, con aumento de ADCC tal como se determina por cualquier método adecuado conocido por los expertos en la técnica. Un ensayo in vitro de ADCC aceptado es el siguiente: 1) el ensayo utiliza células objetivo conocidas por expresar el antígeno reconocido por la región de unión a antígeno del anticuerpo; 2) el ensayo utiliza células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), aisladas de sangre de donante sano elegido al azar, como células efectoras; 3) el ensayo es realizado de acuerdo con el siguiente protocolo: i) Las PBMC se aislan mediante procedimientos estándar de centrifugación por densidad y se suspenden a 5 x 106 células /ml en un medio de cultivo celular RPMI; ii) Las células objetivo se cultivan por métodos estándar de cultivo de tejidos, se cosechan de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior a 90%, se lavan en medio de cultivo celular RPMI, se rotulan con 100 micro-Curies de 51Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo celular, y se resuspenden en medio de cultivo celular con una densidad de 105 células /ml; i iii) 100 microlitros de la suspensión final de células objetivo anterior se transfieren a cada cavidad de una placa de microtitulación de 96 cavidades; iv) el anticuerpo se diluye en serie de 4000 ng/ml a 0.04 ng/ml en medio de cultivo celular y 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo obtenidas se agregan a las células objetivo en la placa de microtitulación de 96 cavidades, donde se analizan por triplicado diversas concentraciones de anticuerpo que cubren todo el rango de concentraciones anterior; v) para los controles de máxima liberación (MR) , 3 cavidades adicionales de la placa que contiene las células objetivo rotuladas reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2% (V/V) de un detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis), en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv anterior) ; vi) para los controles de liberación espontánea (:SR) , 3 cavidades adicionales de la placa que contiene las células objetivo rotuladas reciben 50 microlitros de de medio d'e cultivo celular RPMI en lugar de la solución de anticuerpo (punto iv anterior) ; vii) luego se centrifuga la placa de microtitulación de 96 cavidades a 50 x g durante 1 minuto y sie incuba durante 1 hora a 4°C; i viii) 50 microlitros de la suspensión de PBMC (punto i anterior) se agregan a cada cavidad para obtener una relación células efectoras : objetivo de 25:1 y las placas se colocan en incubadora con atmósfera de 5% C02 a 37°C durante 4 hdras; ' ix) el sobrenadante libre de células de cada cavidad se cosecha y se cuantifica la radiactividad liberada experimentalmente (ER) mediante un contador gamma; • x) se calcula el porcentaje de lisis específica para cada concentración de anticuerpo de acuerdo con la fórmula (ER-MR) / (MR-SR) x 100, donde ER es el promedio de la radiactividad cuantificada (ver punto ix anterior) para dicha concentración de anticuerpo, MR es el promedio de la radiactividad cuantificada (ver punto ix anterior) para los controles MR (ver punto v anterior) , y SR es el promedio de la radiactividad cuantificada (ver punto ix anterior) para los controles SR (ver punto vi anterior) ; 4) "Aumen to de ADCC" se define como un aumento del porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del rango de concentración de anticuerpo analizado con anterioridad, y/o la reducción de la concentración de anticuerpo requerido para obtener la mitad del porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del rango de concentración de anticuerpo analizado con anterioridad. El a mento de ADCC es respecto de ADCC, medido por el ensayo anterior, mediado por el mismo anticuerpo, producido por el mismo tipo de células huésped, con los mismos métodos estándar de producción, purificación, formulación y almacenamiento métodos conocidos por los expertos en la técnica, pero que no han sido producidos por las células huésped sometidas a ingeniería para sobreexpresa GnTIII.

En un aspecto, la presente invención se refiere a moléculas de unión a antígeno con la misma especificidad de unión que el anticuerpo 225.28S murino, (es decir, se une sústancialmente al mismo epítopo con sustancialmente la misma afinidad) y al descubrimiento de que sus funciones efectoras pueden estar aumentadas por la glicosilación alterada. En una modalidad, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo quimérico. En una modalidad de preferencia, la invención está dirigida a un anticuerpo quimérico, o uno de sus fragmentos, que comprende al menos uno, alternativamente al menos dos, alternativamente al menos tres, alternativamente al menos cuatro, alternativamente al menos cinco, o alternativamente al menos seis de los CDR de las Tablas 3 o 4 (SEC ID NOs: 62-108.) Específicamente, en una modalidad de preferencia, la invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende: (a) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en: SEC ID NO: 61 SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 65, SEC ID NO:67, SEC ID NO:69 SEC ID NO:71, SEC ID NO:73, y SEC ID N0:75; (b) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en: SEC ID NO:77, SEC ID NO:79, SEC ID NO:81, SEC ID N?:83, SEC ID NO:85, SEC ID NO:87, SEC ID NO:89, SEC ID NO: 91, y SEC ID NO: 93; y (c) SEC ID NO: 95. En otra modalidad de preferencia, la invención está dirigida a un pblinucleótido aislado que comprende (a) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en: SEC ID NO: 97; SEC ID NO: 99; y SEC ID NO: 101; (b) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 103 y SEC ID NO: 105; y (c) SEC ID NO: 107. En una modalidad, cualquiera de estos polinucleótidos codifica un polipéptido de fusión. En otra modalidad, la molécula de unión a antígeno comprende el dominio VH del dominio anticuerpo 225.28 codificado por una secuencia de la Tabla 6 (SEC ID NOS: 1-23 impar), o una de sus variantes; y un polipéptido. En otra modalidad de preferencia, la invención está dirigida a una molécula de unión a antígeno que comprende el dominio V del anticuerpo de rata codificado por SEC ID NOS:27-51 (impar) o una de sus variantes; y un polipéptido no murino. En otro aspecto, la invención está dirigida a moléculas de unión a antígeno que comprenden uno o más CDR truncados de 225.28S. Dichos CDR truncados contienen como mínimo los residuos de aminoácido determinantes de e'specificidad para determinado CDR. Por "residuo determinante de especifi cidad " se entienden los residuos que intervienen directamente en la interacción con el antígeno. En general, splo aproximadamente un quinto a un tercio de los residuos de determinado CDR participan en la unión del antígeno. Los r'esiduos determinantes de especificidad en un CDR particular sé pueden identificar, por ejemplo, mediante el cálculo de l'os contactos interatómicos por modelado tridimensional y determinación de la variabilidad de secuencia en determinada posición de residuo de acuerdo con los métodos descritos en Padlan y otros, FASEB J. 9(1): 133-139 (1995), cuyos contenidos se incorporan así a la presente en su totalidad como referencia. En consecuencia, la invención también está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende al menos una región determinante de complementariedad de un anticuerpo 225.28S murino, o una de sus variantes o formas truncadas que contienen al menos los residuos determinantes de especificidad para la región determinante de complementariedad, en donde dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. De preferencia, dichos polinucleótidos aislados codifican un polipéptido de fusión que es una molécula de unión a antígeno. En una modalidad, el polinucleótido comprende dos o tres o cuatro o cinco o seis regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo 225.28S murino, o sus variantes o formas truncadas que contienen al menos los residuos determinantes de especificidad para cada uno de dichas dos o tres o cuatro o pinco o seis regiones determinantes de complementariedad. En una modalidad, el polinucleótido comprende al menos uno de los CDR establecidos en la Tabla 2 y Tabla 5 siguientes) . En otra modalidad, el polinucleótido codifica toda la región variable de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo quimérico (por ejemplo, humanizado). La invención también está dirigida a los polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos . En otra modalidad, la invención está dirigida a una molécula de unión a antígeno que comprende al menos una, alternativamente al menos dos, alternativamente al menos tres, alternativamente al menos cuatro, alternativamente al menos cinco, o alternativamente al menos seis regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo 225.28S murino, o sus variantes o formas truncadas que contienen al menos los residuos determinantes de especificidad para cada una de las regiones determinantes de complementariedad, y que c'omprende una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo. En una modalidad, la molécula de unión a antígeno comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo 225.28S murino, o sus variantes o formas truncadas que contienen al menos los residuos determinantes die especificidad para una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En una modalidad, la molécula de unión a antígeno que comprende al menos uno, alternativamente al menos dos, alternativamente al menos tres, alternativamente al menos cuatro, alternativamente al menos cinco, o alternativamente al menos seis de los CDR establecidos en la Tabla 3 y Tabla 4 siguientes. En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno comprende la región variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpo. En una modalidad particularmente útil, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo quimérico, por ejemplo, humanizado. La invención también está dirigida a métodos para preparar dichas moléculas de unión a antígeno, y su uso en el tratamiento de enfermedades, particularmente trastornos de la proliferación celular en donde se expresa MCSP, particularmente en donde MCSP se expresa anormalmente (por ejemplo, se sobreexpresa) , comparado con células normales del mismo tipo de tejido. Dichos trastornos incluyen, sin limitaciones, melanoma, glioma, cáncer de lóbulo mamario, algunas leucemias agudas, y todos los tumores que inducen neovasculatura. Los niveles de expresión de MCSP se pueden determinar por métodos conocidos en la técnica y los descritos en la presente (por ejemplo, por ensayos inmunohistoquímicos, ensayo de inmunofluorescencia, ensayo de iinmunoenzima, ELISA, citometría de flujo, radioinmunoensayo, Western blot, unión de ligando, actividad de cinasa, etc.). La invención también está dirigida a un método para hiacer objetivo in vivo o in vitro en células que expresan M'CSP. Las células que expresan MCSP pueden ser objetivo con fines terapéuticos (por ejemplo, para tratar un trastorno que se puede tratar por disrupción de la unión de MCSP a un ligando, o al hacer objetivo en células que expresan MCSP para la destrucción por el sistema inmune) . En una modalidad, la presente invención está dirigida a un método hacer objetivo en células que expresan MCSP en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende uña ABM de la invención. Las células que expresan MCSP también se pueden analizar con fines diagnósticos (por ejemplo, para determinar si expresan MCSP, ya sea en forma normal o anormal). En consecuencia, la invención también está dirigida a métodos para detectar la presencia de MCSP o una célula que expresa MCSP, in vivo o in vitro. Un método para detectar la expresión de MCSP de acuerdo con la presente invención comprende poner en contacto una muestra a analizar, opcionalmente con una muestra control, con una ABM de la presente invención, en condiciones que permiten la formación de un complejo entre ABM y MCSP. La formación de complejo luego se detecta (por ejemplo, por ELISA u otros métodos conocidos en la técnica) . Cuando se usa una muestra control con la muestra de prueba, cualquier diferencia estadísticamente significativa en la formación de los complejos de ABM-MCSP al comparar las muestras de prueba y control es indicativa de la presencia de MCSP en la muestra dé prueba .

TABLA 2 TABLA 3 TABLA 4 TABLA 5 Es sabido que varios mecanismos intervienen en la eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-MCSP, incluso unión de MCSP, bloqueo de ligados MCSP, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) , inhibición de adhesión y migración de células de melanoma, inhibición de respuestas quimiotácticas a fibronectina, e inhibición/eliminación de péricitos, inhibición de diseminación celular en proteínas ECM tales como colágeno y fibronectina, inhibición de la reorganización esquelética, e inhibición de las redes de transducción de señales mediadas por MCSP (por ejemplo, redes FAK y ERK) . En consecuencia, las ABM de la invención se pueden usar para cualquiera de estos fines. El anticuerpo monoclonal 225.28S murino se ha usado eh la radioinmunodetección de melanoma maligno. Buraggi y otros, Nuklearmedizin 25 (6) : 220-224 (1986). Más recientemente, se clonó en una configuración Fv de cadena única para la expresión soluble en bacterias. Neri y otros, J. Invest. Dermatol. 107 (2 ): 164-170 (1996), que se incorpora a la presente en su totalidad como referencia. Se han descrito anticuerpos quiméricos ratón/humano. Ver, por ejemplo, Morrison, S. L. y otros, PNAS 11:6851-6854 (Noviembre 1984); Publicación de patente europea No. 173494; Boulianna, G. L, at al., Nature 312:642 (Diciembre 1984); Neubeiger, M. S. y otros, Nature 314:268 (Marzo 1985); Publicación de patente europea No. 125023; Tan y> otros, J. Immunol. 135:8564 (Noviembre 1985); Sun, L. K y otros, Hybridoma 5(1): 517 (1986); Sahagan y otros, J. Immunol. 137:1066-1074 (1986). Ver en general, Muron, Nature 312:597 (Diciembre 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5'(3) (Marzo 1985); Marx, Science 229:455 (Agosto 1985); y Morrison, Science 229:1202-1207 (Septiembre 1985). En una modalidad de particular preferencia, la ABM quimérica de la presente invención es un anticuerpo humanizado. Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede preparar ABM humanizada de la presente invención de acuerdo con los métodos de la patente de los Estados Unidos No. 5.225.539 de Winter; la patente de los Estados Unidos No. 6.180.370 de Queen y otros; la patente de los Estados Unidos No. 6.632.927 de Adair y otros; la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2003/0039649 de Foote; la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2004/0044187 de Sato y otros; o la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2005/0033028 de Leung y otros, cuyos contenidos totales se incorporan así a la presente como referencia. De preferencia, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducido proveniente de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácido humano a menudo se denominan residuos "importados", generalmente obtenidos de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente según el método de Winter y colaboradores (Jones y otros, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y otros, Science, 239:1534-1536 (1988)), por sustitución de las secuencias de la región h'ipervariable por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de los Estados Unidos No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la correspondiente secuencia proveniente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados generalmente son anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos provenientes de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Los anticuerpos anti-MCSP de sujeto humanizado generalmente comprenden regiones constantes de inmunoglobulinas humanas, tales como IgGl. La elección de dominios variables humanos, tanto livianos como pesados, para usarlos en la preparación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado "el más adecuado", se busca la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor comparado con toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana más cercada a la del roedor luego se acepta cómo región marco humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims y otros, J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia y otros, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método para seleccionar la secuencia marco humana consiste en comparar la secuencia de cada subregión particular de la totalidad del marco del roedor (es decir, FRl, FR2 , FR3, y FR4 ) o alguna combinación dé subregiones particulares (por ejemplo, FRl y FR2 ) respecto dé una biblioteca de secuencias de región variable humana conocida que corresponda con la subregión marco (por ejemplo, tal como se determina por la numeración de Kabat) , y se elige la secuencia humana para cada subregión o combinación que es más cercana la del roedor (Leung publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2003/0040606A1 , publicada el 27 de Feb. 2003) (cuyos contenidos se incorporan así a la presente en su totalidad como referencia) . Otro método utiliza una región marco particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Se puede usar el mismo marco para diferentes anticuerpos humanizados (Cárter y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y otros, J. Immunol., 151:2623 (1993)) (cuyos contenidos se incorporan así a la presente en su totalidad como referencia) . También es importante humanizar los anticuerpos con retención de la elevada afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorable. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método de preferencia, se prepararan los anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias progenitoras y diversos productos conceptuales humanizados mediante modelos tridimensionales de las secuencias de los progenitores y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se pueden generar mediante programas de computación conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, InsightlI, accelrys inc (antes MSI), o at http://swissmodel.expasy.org/ descrito por Schwede y otros, Nucleic Acid Res. 2003 ( 13) : 3381-3385) . La inspección de estos modelos permite el análisis del posible papel de los residuos en la función de la secuencia candidata de inmunoglobulina, es decir, el análisis de los residuos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse al antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar los residuos FR y combinar con las secuencias del r'eceptor e importadas, de manera tal que se obtienen las características deseadas del anticuerpo, tales como mantenimiento de la afinidad por los antígenos objetivo. En general, los residuos de la región hipervariable intervienen en forma directa y más sustancialmente en la influencia sobre la unión del antígeno. En una modalidad particular, la ABM de la invención comprende una región variable de cadena ligera dte anticuerpo por ejemplo una prolina en la posición 46 (Kabat) . En otra modalidad, la ABM de la invención comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo con uno o más residuos de fenilalanina en la posición 27, un residuo serina en la posición 30, o un residuo serina o treonina en la posición 94. Estos residuos pueden ser naturales en la particular región variable de cadena ligera o pesada, o pueden ser introducidos por sustitución de aminoácido. i En una modalidad, el anticuerpo de la presente invención comprende una región de Fe humana. En una modalidad específica, la región constante humana es IgGl, tal como se establece en SEC ID NO: 109 y 110, y a continuación: Secuencia de nucleótidos de la región constante de IgGl humana (SEC ID NO: 110) ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGT CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTC AGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACC TACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCA AATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCAC GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA A GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAA GAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TiGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCG A'CGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAA CGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC T'CCCTGTCTCCGGGTAAATGA Secuencia de nucleótidos de la región constante de IgGl humana (SEC ID NO: 109) TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Sin embargo, también se abarcan las variantes e isoformas de la región Fe humana en la presente invención. Por ejemplo, las regiones Fe variantes adecuadas para el uso en la presente invención se pueden producir de acuerdo con los métodos enseñados en la patente de los Estados Unidos No. 6'.737.056 de Presta (variantes de regiones Fe con alteraciones de la función efectora debidas a modificaciones de uno o más aminoácido) ; o en las solicitudes de patente de los Estados Unidos No. 60/439.498; 60/456.041; 60/514.549; o WO 2004/063351 (regiones variantes Fe con aumento de afinidad de unión debido a modificación de aminoácidos); o en la patente de los Estados Unidos No. 10/672.280 o WO 2004/099249 (variantes de Fe con alteraciones de la unión a FcgammaR diebido a modificación de aminoácidos), cuyos contenidos se incorporan así a la presente en su totalidad como referencia. En otra modalidad, las moléculas de unión a antígeno de la presente invención son sometidas a ingeniería para aumentar la afinidad de unión de acuerdo con, por ejemplo, los métodos descritos en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2004/0132066 de Balint y otros, cuyos contenidos se incorporan así a la presente en su totalidad como referencia. En una modalidad, la molécula de unión a antígeno de la presente invención se conjuga a otro residuo, tal como una marca radiactiva o una toxina. Dichas ABM conjugadas se pueden producir mediante numerosos métodos bien conocidos en la técnica. Diversos radionúclidos se pueden aplicar a la presente invención y los expertos en la técnica pueden determinar con facilidad cuál es el radionúclido más adecuado según las circunstancias. Por ejemplo, 131yodo es un radionúclido muy conocido utilizado para inmunoterapia dirigida. Sin embargo, la utilidad clínica de 131yodo se puede ver limitada por diversos factores, que incluyen: vida media física de ocho días; deshalogenación del anticuerpo yodado en la sangre y los sitios de tumor; y características de emisión (por ejemplo, grandes componentes gama) que pueden ser subóptimos para el depósito localizado de dosis en el tumor.

Con el advenimiento de agentes quelantes superiores, la posibilidad de adosar grupos quelantes metálicos a las proteínas ha incrementado las oportunidades para utilizar otros radionúclidos tales como 11:Lindio e 90itrio. El 90itrio provee varios beneficios para la utilización de aplicaciones radioinmunoterapéuticas : la vida media de 64 horas de 90itrio es suficiente para permitir la acumulación del anticuerpo en el tumor y a diferencia de por ejemplo, 131yodo, 90itrio es un emisor beta puro de alta energía, sin irradiación gama acompañante en su degradación, con un rango en tejido de 100 a 1000 diámetros celulares. Además, la cantidad mínima de radiación penetrante permite la administración ambulatoria de anticuerpos con rótulo de 90itrio. Además, no se requiere al internalización del anticuerpo marcado para la muerte celular, y la emisión local de radiación ionizante debe ser letal para las células tumorales adyacentes que carecen del antígeno objetivo. Respecto de los anticuerpos anti-MCSP con marca radiactiva, la terapéutica que los utiliza también se puede aplicar mediante un único tratamiento terapéutico o con múltiples tratamientos. Debido al componente de radionúclido, se prefiere que antes del tratamiento se cosechen células madre periféricas ("PSC") o de la médula ósea ("BM") para los pacientes que experimental toxicidad potencialmente fatal de la médula ósea por la radiación. Se cosechan BM y/o PSC mediante técnicas estándar, y luego se purgan y se congelan para la posible reinfusión. Además, se prefiere que antes del tratamiento se realice un estudio de dosimetría diagnóstico con un anticuerpo de diagnóstico con marca radiactiva (por ejemplo, con ulindio) en el paciente, con la finalidad de asegurar que el anticuerpo con marca terapéutica (por ejemplo, con 90itrio) no se "concentre" innecesariamente en un órgano o tejido normal.

En una modalidad de preferencia, la presente invención está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 7 siguiente (SEC ID NOS: 2-52 pares) . La invención también está dirigida a una ácido nucleico aislado que comprende una secuencia al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad a una secuencia de nucleótidos que se muestra en la Tabla 6 siguiente (SEC ID N0S:1-51 impar) . En otra modalidad, la invención está dirigida a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a U'na secuencia de aminoácidos de la Tabla 7 (SEC ID NíOS:2-52 pares) . La invención también abarca un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las construcciones de la Tabla 7 (SEC ID NOS: 2-52 pares) con sustituciones conservadoras de aminoácidos. TABLA 6 CONSTRUCCIÓN SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS S?C ID NO M-KV7 GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCT 41 GCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAG GCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTGGCTTGGTAC CAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTAAGCCTCTGATC TATTCGGCATCCTACCGGTACACTGGCGTCCCATCA AGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACT CTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCA ACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTG ACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGT ACGGTG M-KV8 GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCT 43 GCATCTGTGGGCGACCGGGTCACCATCACCTGCAAG GCCAGTCAGAATGTGGATACTAACGTGGCTTGGTAC CAGCAGAAGCCAGGGAAAGCACCTAAGCTTCTGATC TTCTCGGCATCCTACCGTTACACTGGCGTCCCATCA AGGTTCAGCGGCAGTGGATCCGGGACAGAGTTCACT CTCACAATCTCAAGCCTGCAACCTGAAGATTTCGCA ACTTACTACTGTCAACAGTACAATAGTTACCCTCTG ACGTTCGGCGGAGGTACCAAGGTGGAGATCAAGCGT ACGGTG TABLA 7 En otra modalidad, la presente invención está orientada un vector de expresión y/o a una célula huésped que comprenden uno o más polinucleótidos de la presente invención . En términos generales, puede utilizarse cualquier tipo de línea de células de cultivo para expresar la ABM de la presente invención. En una modalidad preferida, las células HEK293-EBNA, las células CHO, las células BHK, las células NSO, las células SP2/0, las células de mieloma YO, las células de mieloma de ratón P3X63, las células PER, las células PER.C6 o las células de hibridoma, otras células de mamíferos, células de levadura, células de insectos, o células de plantas, se utilizan como lineas de células antecedentes para generar las células huésped diseñadas de la invención . La eficacia terapéutica de las ABM de la presente invención puede reforzarse mediante su producción en una célula huésped que además expresa uno o más de los siguientes: un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de GnTIII, un polinucleótido que tiene actividad de Manll, o un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de GalT. En una modalidad preferida, la célula huésped expresa un polinucleótido que tiene actividad de GnTIII o una actividad de Manll. En otra modalidad preferida, la célula huésped expresa un pblinucleótido que tiene actividad de GnTIII como también un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de Manll. Y en otra modalidad más, el polipéptido que tiene actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización en el Golgi de un polipéptido residente en Golgi. En otra modalidad preferida, la expresión de las ABM de la presente invención en una célula huésped que expresa un polinucleótido decodifica un polipéptido que tiene actividad de GnTIII, resulta en ABM con una mayor afinidad de unión al receptor Fe y una mayor función efectora. Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención está orientada a una célula huésped que comprende (a) un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene actividad de GnTIII, y (b) un polinucleótido aislado que codifica un ABM de la presente invención, tal como un anticuerpo quimérico, primatizado u humanizado, que liga el MCSP humano. En una modalidad preferida, el polipéptido que tiene actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII, y el dominio de localización en el Golgi es el dominio de localización de manosidasa II. Los métodos para generar dichos polipéptidos de fusión y para utilizarlos a efectos de producir anticuerpos con funciones efectoras acrecentadas, se revelan en la Solicitud Provisoria de Patente de los Estados Unidos No. 60/495,142 y en la publicación de Solicitudes de Patente de los EE. UU . No. 2004/0241817 Al, la totalidad de cuyos contenidos se incorpora expresamente en la presente a título de referencia. En otra modalidad preferida, la ABM quimérico es un anticuerpo quimérico o uno de sus fragmentos que tiene la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales 225.28S m'urino. En una modalidad particularmente preferida, el anticuerpo quimérico comprende un Fe humano. En otra modalidad preferida, el anticuerpo está primatizado u humanizado . En una modalidad alternativa, las ABM de la presente invención pueden reforzarse produciéndoselos en una élula huésped que ha sido diseñada de manera de tener una actividad reducida, inhibida o eliminada, de por lo menos una fucosiltransferasa. En una modalidad, uno o varios polinucleótidos que codifican un ABM de la presente invención pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, o como alternativa, de un sistema de expresión regulado. Los sistemas de expresión regulados adecuados incluyen pero no se limitan a un sistema de expresión regulado por tetraciclina, un sistema de expresión inducible por ecdisona, un sistema de expresión por conmutación lac, un sistema de expresión inducible mediante glucocorticoides, un sistema promotor inducible por temperatura, un sistema promotor inducible por temperatura, y un sistema de expresión inducible por metalotioneína metálica. Si hay varios ácidos nucleicos diferentes que codifican con ABM de la presente invención comprendidos dentro del sistema de la célula huésped, algunos de ellos pueden ser expresados bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que otros se expresan bajo el control d un promotor regulado. Se considera que el máximo nivel de expresión es el máximo nivel posible de expresión estable de polipéptidos que no tiene un efecto adverso significativo sobre la velocidad de crecimiento de la célula, y se d'eterminará mediante experimentación rutinaria. Los niveles de expresión se determinan mediante métodos generalmente conocidos en la técnica, que incluyen en análisis Western blot en el que se utiliza un anticuerpo específico para la ABM o un anticuerpo específico para un rótulo péptido fusionado al ABM; y análisis Northern blot. En otra alternativa más, el polinucleótido puede estar operativamente vinculado a un gen informante, teniendo los niveles de expresión de un ABM quiméricos sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 225.28S murino se determina mediante la medición de una señal correlacionada con el nivel de expresión del gen informante. El gen informante puede transcribirse junto con el/los ácido (s) nucleico (s) decodifican dicho polipéptidos de fusión como una molécula de ARNm; sus respectivas secuencias codificantes pueden estar ligadas sellan mediante un sitio de ingreso de ribosoma interior (IRES) sea mediante un reforzador de producción cap-independiente (CITE) . El gen informante puede traducirse junto con por lo menos un ácido nucleico decodificado con ABM genérico que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 225.28S murino, de modo tal que se forma una única cadena de polipéptido. Los ácidos nucleicos que codifican las ABM de la presente invención pueden estar operativamente ligados al gen informante bajo el control de un solo promotor, de modo tal que el ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión y el gen informante se transcriben en una molécula de ARN que se desdobla alternativamente en dos moléculas ARN mensajeras separadas (ARNm) ; uno de los ARNm se traduce en dicha proteína informante, y la otra se traduce en dicho polipéptido de fusión. Pueden utilizarse métodos bien conocidos por las personas con pericia en la técnica para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de un ABM que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo monoclonal 225.28S murino junto con señales de transcripción/de traducción adecuadas. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y de recombinación in vivo/recombinación genética. Véase por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis y otros, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989) y en Ausubel y otros, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989) . Puede utilizarse una variedad de sistemas de vectores que expresan el hospedante, para expresar la secuencia codificante de las ABM de la presente invención. Es preferible utilizar células de mamífero como sistemas de células huésped efectuadas con ADN plásmido recombinante o con vectores de expresión de ADN que contienen la secuencia codificante de la proteína de interés y la secuencia Codificante del polipéptidos de fusión. Es más preferible utilizar como sistema de célula huésped células de CHO, células de BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, otras células de mamíferos, células de levadura, células de insectos, o células de plantas. Algunos ejemplos de sistemas de expresión y de métodos de selección se describen en los siguientes ejemplos, y en las referencias de ellos: Borth y otros, Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001), en Werner y otros, Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998), en Andersen and Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), in Chadd and Chamow, Curr. Op . Biotechnol. 12:188-194 (2001), y en Giddings, Curr. Op . Biotechnol. 12: 450-454 (2001). En modalidades alternativas, pueden utilizarse otros sistemas de células huésped eucariotas, que incluyen células de levadura transformadas con sectores de expresión de levadura recombinante que contienen la secuencia codificante de un ABM de la presente invención, tales como los sistemas de expresión enseñados en la Solicitud de Patente de los EE . UU. No. 60/344,169 y en el documento WO 03/056914 (métodos para producir glicoproteína similar a humana en una célula huésped eucariota no humana) (los contenidos de cada uno de lbs cuales se incorpora en la presente en su totalidad, a título de referencia) ; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen la secuencia codificante de un ABM quimérico que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo monoclonal 225.28S murino, sistemas de células de planta infectadas con vectores de expresión del virus recombinante (por ejemplo, el virus del mosaico del coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) que contienen la secuencia codificante de la ABM de la invención, lo cual incluye pero no se limitan a, los sistemas de expresión enseñados en la Patente de los Estados Unidos No. 6,815,184 (métodos para la expresión y secreción de polipéptidos biológicamente activos a partir de maleza lenteja de agua diseñada genéticamente) ; el documento WO 2004/057002 (producción de proteínas glicosiladas en células de plantas briofitas mediante la introducción de un gen de glicosiltransferasa) y el documento WO 2004/024927 (métodos para generar proteína no vegetal extracelular en protoplasto de musgo); y las Solicitudes de Patente de los EE. UU . Nos. 6,0/365,769, 60/368,047, y el documento WO 2003/078614 (procesamiento de glicoproteína en plantas transgénicas que comprenden una enzima funcional GnTIII de mamífero) (el contenido de cada uno de los cuales se incorpora en la piresente en su totalidad a título de referencia) ; o sistemas de células animales infectados con vectores de expresión del virus recombinante (por ejemplo, adenovirus, virus de vacuna) que incluyen líneas de células diseñadas para contener múltiples copias del ADN decodificado o un ABM quimérico que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 225.28S murino sea establemente amplificado (CHO/dhfr) sea quien establemente ampliado en cromosomas de doble minuto (por ejemplo, línea de células de murinos) . En una modalidad, el sector que comprende el/los polinucleótido (s) que codifican la ABM mencionado anteriormente, es un anticuerpo o uno de sus fragmentos. En una modalidad preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado. Para los métodos de esta invención, se prefiere por lo general la expresión estable para la expresión transitoria, por cuanto típicamente se logran resultados más reproducibles y también se presta más fácilmente a la producción en gran escala, si bien la invención también abarca la expresión transitoria. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células huésped puede transformarse con los respectivos ácidos nucleicos codificantes controlados mediante elementos de control de expresión adecuados (por ejemplo, promotor, reforzador, secuencias, terminadores de t'rascripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Después de la introducción de ADN extraño, puede permitirse a las células diseñadas desarrollarse durante 1-2 días en un medio enriquecido, después de lo cual son las conmuta a un medio selectivo. El marcador selectivo en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite la selección de células que hayan integrado establemente el plásmido en sus cromosomas y crecer de manera de formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en forma de líneas de células. Puede utilizarse una cantidad de sistemas de selección, que incluyen pero no se limitan a la timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler y otros, Cell 11:223 (1977)), los genes de la hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), y la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy y otros, Cell 22:817 (1980)), que pueden emplearse en células tk~, hgprt~ o aprt", respectivamente. Asimismo, es posible utilizar antimetabolitos como base de selección para dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y otros, Nati. A'cad. Sci. USA 77:3567 (1989); O'Hare y otros, Proc. Nati. Aicad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Nati. Acad. S'ci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin y otros, J. Mol. Biol. 150:1 (1981)); e higro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y otros, Gene 30:147 (1984). Recientemente, se han descrito genes seleccionables aidicionales, a saber el Trp, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); el sistema de glutamina sintasa; y la ODC (ornitina decarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor ornitina descarboxilasa, 2- (difluorometil) -DL-ornitina, DFMO (McConlogue, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)). La presente invención está también orientada a un método para modificar el perfil de glicosilación de las ABM de la presente invención que se producen por una célula huésped, que comprende la expresión en dicha célula huésped de un ácido nucleico que codifica un ABM de la invención y de un ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad de GnTIII, o un vector que comprenda dichos ácidos nucleicos. Es preferible que el polipéptido modificado sea IgG o uno de sus fragmentos que comprenda la región Fe. En una forma particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado o uno de sus fragmentos. Como alternativa, o a título adicional, dichas células huésped pueden diseñarse de manera que tengan una actividad reducida, inhibida, o eliminada de p:or lo menos una fucosiltransferasa . En otra modalidad, la délula huésped está diseñada para co-expresar un ABM de la invención, GnTIII y manosidasa II (Manll). Los ABM producidos mediante las células huésped de la invención presentan una mayor afinidad de unión con el receptor Fe y/o una función efectora incrementada como resultado de la modificación. En una modalidad particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado o fragmentos del mismo que contiene la región Fe. Es preferible que la afinidad de unión del receptor de Fe se incremente mediante su unión a un receptor activante Fcy, tal como el receptor Fc?RIIIa. Es preferible que la función efectora incrementada consista en un incremento de uno o más de los siguientes: una mayor citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente, una mayor fagocitosis celular anticuerpo-dependiente (ADCP) , una mayor secreción de citocinas, una mayor absorción de antígeno mediada mediante inmunocomplejo por células que presenten antigeno, una mayor citotoxicidad celular mediada por FC, una mayor unión a las células NK, una mayor unión a los macrófagos, una mayor unión a: células polimorfonucieares (PMNs), una mayor unión a los m'onocitos, una mayor reticulación de anticuerpos vinculados a objetivos, una mayor señalización directa que induzca apoptosis, una mayor maduración de las células dendríticas, y una mayor imprimación de células T. Las funciones efectoras se pueden medir y/o determinar a través de varios ensayos conocidos por los expertos en la técnica. Se describen varios ensayos para m dir las funciones efectoras, incluyendo afinidad de unión del receptor Fe y citotoxicidad dependiente de complemento, en la Publicación de Solicitud de E.U.A. No. 2004/0241817A1, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. La secreción de citocina puede medirse, por ejemplo, utilizando un ELISA de emparedado, por ejemplo, ver, McRae y otros, J. Immunol. 164:23-28 (2000) y el protocolo de ELISA de emparedado de citocina disponible en www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols, o por medio de los métodos descritos en Takahashi y otros, British J. Pharmacol. 137:315-322 (2002), cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. La maduración de la célula dendrítica, por ejemplo, se puede determinar utilizando ensayos como los establecidos por Kalergis y Ravetch, J. Exp. Med. 195:1653-59 (2002), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Ejemplos de ensayos de absorción/presentación de fagocitosis y antígeno son provistos por Gresham y otros, J. Exp. Med. 191:515-28 (2000); Krauss y otros, J. Immunol . 153: 1769-77 (1994); y Rafiq y otros J. Clin. Invest. 110: 71-79 (2002), y Hamano y otros, J. Im unol. 164: 6113-19 (2000), cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. La regulación descendente de los receptores de superficie de célula se puede medir, por ejemplo, mediante métodos establecidos por Liao y otros, Blood 83: 2294-2304 (1994), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Los métodos, protocolos y ensayos generales, se pueden encontrar en CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, Celis, J.E., ed., (2a. Edición, 1998), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Está dentro de la experiencia del técnico adaptar los métodos, protocolos y ensayos mencionados anteriormente para uso con la presente invención. La presente invención está también dirigida a un método para producir un ABM de la presente invención que tiene oligosacáridos modificados en una célula huésped, que comprende: (a) cultivar una célula huésped diseñada para expresar por lo menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de GnTIII bajo condiciones que permiten la producción de un ABM de acuerdo con la presente invención, en el que dicho polipéptidos que tiene actividad de GnTIII se expresa en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe de dicho ABM producido por dicha célula huésped; y (b) aislar dicho ABM. En una modalidad preferida, el polipéptido que tiene actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII. En una modalidad particularmente preferida, el polipéptido de fusión comprende además el dominio de localización en el Golgi de un polipéptido residente en Golgi. Es preferible que el dominio de localización en el Giolgi sea el dominio de localización de la manosidasa humana I'I o del GnTI humano. Como alternativa, el dominio de localización en el Golgi se selecciona del grupo consistente en: el dominio de localización de la manosidasa I, el dominio de localización de GnTII, y el dominio de localización de una al-6 fucosiltransferasa nuclear. Los ABM producidos por los métodos de la presente invención tienen una mayor afinidad de unión con el receptor Fe y/o una mayor función efectora. Es preferible que la mayor función efectora sea uno o más de los siguientes: una mayor citotoxicidad celular mediada por Fe (que incluye una mayor citotoxicidad anticuerpo-dependiente) , una mayor fagocitosis celular anticuerpo-dependiente (que incluye una mayor citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente) , una mayor fagocitosis celular anticuerpo-dependiente (ADCP) , una mayor secreción de citocinas, una mayor absorción de antígenos mediados por inmunocomplejo, una mayor unión a las células NK, una mayor unión a los macrófagos, una mayor unión a los monocitos, una mayor unión a las células polimorfonucieares, una mayor señalización directa que induce apoptosis, una mayor reticulación de anticuerpos ligados a objetivos, una mayor maduración de las células dendríticas, o una mayor imprimación de células T. La m'ayor actividad de unión con el receptor Fe se asocia preferiblemente con una mayor unión a los receptores activantes de Fe tales como Fc?RIIIa. En una modalidad particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado o; uno de sus fragmentos.

En otra modalidad, la presente invención está orientada a un ABM quimérico que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo monoclonal 225.28S murino producido mediante los métodos de la invención que tiene una mayor proporción de oligosacáridos biseccionados en la región Fe de dicho polipéptido. Se considera que un ABM de este tipo abarca anticuerpos y fragmentos de los mismos que comprende la región Fe. En una modalidad preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado. En una modalidad, el porcentaje de oligosacáridos biseccionados en la región Fe de la ABM es de por lo menos 50%, más preferiblemente, de por lo menos 60%, por lo menos 70%, al menos 80%, o por lo menos 90%, y más preferiblemente aún por lo menos 90-95% del total de oligosacáridos. Y en otra modalidad más, la ABM producido mediante los métodos de la invención tiene una mayor proporción de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe como resultado de la modificación dé sus oligosacáridos mediante los métodos de la presente invención. En una modalidad, el porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es de por lo menos 50%, preferiblemente de por lo menos 60% a 70%, más preferiblemente, de por lo menos 75%. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser de tipo híbrido o. complejo. En una modalidad particularmente preferida, la ABM producido por las células huésped y el método de la invención tienen una mayor proporción de oligosacáridos bisecados no fucosilados en la región Fe. Los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados, pueden ser sea híbridos sea complejos. Específicamente, los métodos de la presente invención pueden utilizarse para producir ABM en los que por lo menos 15%, más preferiblemente por lo menos 20%, más preferiblemente aún al menos 25%, más preferiblemente por lo menos 30%, y más preferiblemente por lo menos 35% de los oligosacáridos en la región Fe de la ABM están biseccionados, no fucosilados. Los métodos de la presente invención también puede utilizarse para producir polipéptidos en los que por lo menos 15%, más preferiblemente por lo menos 20%, más preferiblemente aún por lo menos 25%, más preferiblemente al menos 30%, más preferiblemente aun al menos 35% de los polisacáridos en la región Fe del polipéptidos son biseccionados híbridos no fucosilados. (En la Figura 10 se describe la nomenclatura de oligosacáridos "complejos", "complejos biseccionados" e "híbridos") En otra modalidad, la presente invención está orientada a un ABM quimérico que tiene sustancialmente la m'isma especificidad del unión que el anticuerpo monoclonal 2:25.28S murino y diseñado de manera de tener una mayor función efectora y/o una mayor afinidad de unión con el receptor FC, producido mediante los métodos de la presente invención. Es preferible que la mayor función efectora sea una o más de las siguientes: una mayor citotoxicidad celular mediada por Fe (que incluye una mayor citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente) , una mayor fagocitosis celular anticuerpo-dependiente (ADCP) , una mayor secreción de citocinas, una mayor absorción de antígenos mediada por inmunocomplejo por las células que presentan antígeno, una mayor unión a las células NK, una mayor unión a los macrófagos, una mayor unión a los monocitos, una mayor unión a las células polimorfonucieares, una mayor señalización directa que induce apoptosis, una mayor reticulación de los anticuerpos ligados a objetivo, una mayor maduración de las células dendríticas, o una mayor imprimación de las células T. En una modalidad preferida, la mayor afinidad de unión al receptor Fe consiste en una mayor unión a un receptor activador del Fe, más preferiblemente Fc?RIIIa. En una modalidad, la ABM es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que contiene la región Fe, o una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina. En una modalidad particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado. La presente invención está además orientada a composiciones farmacéuticas que comprenden las ABM de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención está además orientada al uso de dichas composiciones farmacéuticas en el método del tratamiento del cáncer. Específicamente, la presente invención está orientada a un método para el tratamiento del cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la invención. En otra modalidad más, la invención se refiere a un ABM de acuerdo con la presente invención para utilizar como un medicamento, en particular para el uso en el tratamiento profiláctico del cáncer o para uso en una condición o lesión precancerosa. El cáncer puede ser por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de las células no pequeñas de pulmón (NSCL) , cáncer de las células broncoalveolares, cáncer de los huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo u intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pecho, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de cerviz, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedades de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de glándula ajdrenal, sarcoma de los tejidos blandos, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata cáncer de vejiga, cáncer de los ríñones o de los uréteres, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, leucemia crónica o aguda, linfomas linfocíticos, neoplasmas del sistema nervioso central (CNS), tumores del eje espinal de glioma del cerebro, glioma de vastago del cerebro, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwannomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenomas de pituitaria, que incluyen las versiones refractarias de algunos de los cánceres recién mencionados, o una combinación de uno o más de los cánceres recién mencionados. La condición o lesión precancerosa incluye por ejemplo, el grupo consistente en leucoplaquia oral, queratosis actínica (queratosis solar) , pólipos precancerosos del colon o recto, displasia epitelial gástrica, displasia adenomatoso, síndrome de cáncer de colon hereditario no de poliposis (HNPCC) , esófago de Barrett, displasia de vejiga, y condiciones cervicales precancerosas. Es preferible que dicho cáncer sea seleccionado del grupo consistente en cáncer de pecho, cáncer de vejiga, cjáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer piancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cplon, cáncer de próstata, cáncer de riñon, y cáncer de cierebro . Y otra modalidad es el uso de la ABM de acuerdo con lia presente invención para la manufactura de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de cáncer. El cáncer como se define lo que precede. Es preferible que dicho cáncer sea seleccionado del grupo consistente en cáncer de pecho, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñon, y cáncer de cerebro . También es preferible que dicha molécula de unión a antígeno sea utilizado en una cantidad terapéuticamente efectiva de aproximadamente 1.0 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg . También, y más preferentemente, se utiliza dicha molécula de unión a antígeno en una cantidad terapéuticamente efectiva de aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg. También de manera más preferible, dicha molécula de unión a antígeno se utiliza en una cantidad terapéuticamente efectiva de aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 4.5 mg/kg . También de manera más preferible, dicha molécula de unión a antígeno se utiliza en una cantidad terapéuticamente efectiva de aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg . Es más preferible que se utilice dicha molécula de unión a antígeno en una cantidad terapéuticamente efectiva de aproximadamente 1.5 mg/kg. También y de manera más preferible, se utiliza dicha molécula de unión a antígeno en una cantidad terapéuticamente efectiva de aproximadamente 4.5 mg/kg. También más preferiblemente, dicha molécula de unión a antígeno se utiliza en una cantidad terapéuticamente efectiva de aproximadamente 12 mg/kg. La presente invención provee además métodos para la generación y uso de sistema de células huésped para la p'roducción de glicoformas de las ABM de la presente invención, que tiene una mayor afinidad de unión con el receptor Fe, preferiblemente una mayor unión con los receptores activadores del Fe, y/o que tienen funciones efectoras acrecentadas, que incluyen una citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente. La metodología de glicodiseño que puede utilizarse con las ABM de la presente invención ha sido descrita con detalle en la Patente de los Estados Unidos No. 6,602,684, en la Solicitud de Patente de los EE. UU . , Publ. No. 2004/0241817 Al, en la Solicitud de Patente de los EE. UU. Publ. No. 2003/0175884 Al, en la Solicitud de Patente Provisoria de los EE. UU. No. 60/441,307 y en el documento WO 2004/065540, la totalidad del contenido de cada una de ellas se incorpora en la presente en su totalidad a título de referencia. Los ABM de la presente invención pueden alternativamente ser glicodiseñadas de manera de tener reducidos residuos fucosa en la región Fe de acuerdo con las técnicas descritas en la Solicitud de Patente de EE. UU. Pub. No. 2003/0157108 (Genentech) o en el documento EP 1 176 195 Al, documento WO 03/084570, WO 03/085119 y en la Solicitud de Patente de los EE. UU . Pub. Nos. 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704, 2004/132140 (todas ellas a Kyowa Hakko Kogyo Ltd.). El contenido de cada uno de estos documentos se incorpora en la presente en su totalidad a título de referencia. Los ABM glicodiseñados de la invención también pueden producirse en sistemas de expresión que tienen glicoproteínas modificadas, tales como las que se enseñan en la Solicitud de Patente de los EE. UU . Pub. No. 60/344,169 y en el documento WO 03/056914 (GlycoFi, Inc.) o en los documentos WO 2004/057002 y WO 2004/024927 (Greenovation) ; el contenido de cada uno de éstos se incorpora en la presente en su totalidad, a título de referencia. Generación De Lineas De Células Para La Producción De Proteínas Con Un Patrón De Glicosilación Alterado La presente invención provee sistemas de expresión de células huésped para la generación de las ABM de la presente invención que tienen patrones de glicosilación modificados. En particular, la presente invención provee sistemas de células huésped para la generación de glicoformas de las ABM de la presente invención que tienen un valor terapéutico mejorado. Por ello, la invención provee sistemas de expresión de células huésped seleccionadas o diseñadas para expresar un polipéptido que tiene una actividad de GnTIII. En una modalidad, el polipéptido que tiene actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización en el Golgi de un polipéptido residente en el Golgi heterólogo. Específicamente, dicho sistemas de células huésped pueden diseñarse de manera que comprendan una molécula de ácido núcleo recombinante que codifica un polipéptido que tiene GnTIII, operativamente vinculado a un sistema promotor constitutivo o regulado. En una modalidad específica, la presente invención provee una célula huésped que ha sido diseñada para expresar por lo menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad de GnTIII y que comprende el dominio de localización en el Golgi de un polipéptido residente en el Golgi heterólogo. En un aspecto, la célula huésped está diseñada con una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad de GnTIII y que comprende el dominio de localización en el Golgi de un polipéptido heterólogo residente en el Golgi. En términos generales, puede utilizarse cualquier línea de células cultivadas, que incluyen las células huésped anteriormente mencionadas, como segundo plano para diseñar las líneas de células huésped de la presente invención. En una modalidad preferida, las células CHO, las células BHK, las células NSO, las células SP2/0, las células de mieloma YO, las células de mieloma de ratón P3X63, las células PER, las células PER.C6 o células de hibridoma, otras células de mamíferos, células de levadura, células de insectos o células de plantas, se utilizan como líneas de células de segundo plano para generar las células huésped diseñadas de la invención . Se considera que la invención abarca cualesquiera células huésped diseñadas que expresan un polipéptido que tiene una actividad de GmTIII, que incluyen un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización en el Golgi de un polipéptido heterólogo residente en el Golgi, tal como se define en la presente. Uno o varios ácidos nucleicos que decodifican un p lipéptido que tiene actividad de GnTIII pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, o como alternativa, un sistema de expresión regulado. Dichos sistemas son bien conocidos en la técnica, e incluyen los sistemas anteriormente mencionados. Si dentro del sistema de células huésped se incluyen diversos ácidos nucleicos que tienen actividad de GnTIII y que comprenden el dominio de localización en el Golgi de polipéptidos heterólogos rßsidentes en el Golgi, algunos de ellos pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que otros se expresan bajo el control de un promotor regulado. Los niveles de expresión de los polipéptidos de fusión que tienen actividad GnTIII se determinan mediante métodos generalmente conocidos en la técnica, que incluyen el análisis de Western Blot, análisis de expresión de gen informante, análisis de expresión de medición de la actividad de GnTIII. Como alternativa, puede utilizarse una lectina que se ligará con los productos y/o sintéticos del GnTIII, por ejemplo, la lectina E -PHA. Como alternativa, puede utilizarse un ensayo funcional que mide la función efectora de unión o incrementada del receptor FC, mediada por anticuerpos producidos por las células diseñadas con el ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad de GnTIII. Identificación De Transfectantes O De Transformantes Que Expresan La Proteina Que Tiene Un Patrón De Glicosilación Modificado Las células huésped que contienen la secuencia codificante de un ABM quimérico que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 225.28S murino el que expresan los productos biológicamente abtivos, pueden identificarse mediante por lo menos cuatro enfoques generales; (a) hibridación ADN-ADN o ADN-ARN; (b) la presencia o ausencia de funciones de genes "marcadores", (c) evaluando el nivel de trascripción medido mediante la expresión de los respectivos transcripciones de ARNm en la célula huésped; y (d) detección del producto génico medido mediante inmunoensayo o mediante su actividad biológica. En el primer enfoque, la presencia de la secuencia codificante con ABM quimérico que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo monoclonal murino 225.28S y la secuencia codificante del polipéptido que tiene actividad de GnTIII, puede detectarse mediante hibridación ADN-ADN o ADN-ARN utilizando sondas que comprenden secuencias del nucleótidos que son homólogos con respecto a las respectivas secuencias codificantes, respectivamente, o porciones o derivados de las mismas. En el segundo enfoque, el sistema vector de expresión recombinante anfitrión/hospedante puede identificarse y seleccionarse sobre la base de la presencia o ausencia de determinadas funciones génicas (por ejemplo, actividad de timidina quinasa, resistencia a los antibióticos, resistencia al metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.), Por ejemplo, si la secuencia codificante de la ABM de la invención, o uno de sus fragmentos, y la secuencia codificante de un polipéptido que tiene actividades de GnTIII, se inserta dentro de una secuencia de gen marcador del vector del vector, es posible identificar recombinantes que contienen las respectivas secuencias codificantes mediante la ausencia de la función de gen marcador. Como alternativa, un gen marcador se colocará en tándem con las secuencias codificantes bajo el control del mismo promotor, o de otro promotor diferente, utilizado para controlar la expresión de las secuencias codificantes. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o selección indica la expresión de la secuencia codificante de la ABM de la invención y de la secuencia codificante del polipéptido que tiene actividad de GnTIII. En el tercer enfoque, la actividad transcripcional para la región codificante de la ABM de la invención, o de uno de sus fragmentos, y la secuencia codificante del polipéptido que tiene actividad de GnTIII, puede evaluarse mediante ensayos de hibridación. Por ejemplo, el ARN puede aislarse y analizarse mediante Northern Blot utilizando una sonda homologa a las secuencias codificantes del polipéptidos que tiene actividad de GnTIII o porciones particulares del mismo. Como alternativa, la totalidad de los ácidos nucleicos de la célula huésped puede extraerse y someterse a ensayo de hibridación con respecto a las mismas. i En el cuarto enfoque, la expresión de los productos de proteína puede evaluarse inmunológicamente, por ejemplo mediante Western Blot, inmunoensayos tales como radioinmunoprecipitación, inmunoensayos vinculados a enzimas, y similares. Sin embargo, el ensayo último del sistema de expresión, implica la detección de los productos génicos biológicamente activos. Generación Y Uso De ABM Que Tienen Una Función Efectora Incrementa Que Incluye Anticuerpo-Dependiente de Una Citotoxicidad Celular En modalidades preferidas, la presente invención provee glicoformas de ABM quiméricos que tienen sustancialmente la misma especificidad de unión del anticuerpo monoclonal 225.28S murino y que tienen una función efectora acrecentada que incluye una citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente. El diseño de la glicosilación de los anticuerpos ha sido anteriormente descrito. Véase, por ejemplo, la USP No. 6,602,684, incorporada en la presente en su totalidad a título de referencia. Los ensayos clínicos de anticuerpos monoclonales no conjugados (mAbs) de algunos tipos de cáncer han producido riecientemente resultados prometedores. (Ba Dillman, Cáncer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997); Deo y otros, Immunology Today 18:127 (1997) . Se ha aprobado una IgGl quimérica, no conjugada, para el linfoma de bajo grado o de células foliculares, que no es linfoma de Hodgkin. Dillman, Cáncer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997), mencionan oitro mAb no conjugado, o un IgGl humanizado que apunta a tumores de pecho sólidos, que también han mostrado resultados prometedores en ensayos clínicos de fase III. Deo y otros, Immunology Today 18:127 (1997). Los antígenos de estos dos Abs se expresan en alto grado en sus respectivas células femorales, y los anticuerpos median una potente destrucción tumoral mediante células efectoras in vitro e in vivo. En cambio, muchos otros mAbs no conjugados con las mismas especificidades finas para tumores, no pueden desencadenar funciones efectoras de suficiente potencia para ser clínicamente útiles. Frost y otros, Cáncer 80:317-33 (1997); S rfus y otros, J. Immunother. 19:184-91 (1996). Para algunos de estos mAbs más débiles, se está ensayando actualmente una terapia citocinética adjunta. La adición de citocinas puede estimular la citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente y (ADCC) por el hecho de incrementar la actividad y cantidad de linfocitos circulantes. Frost y otros, Cáncer 80:317-33 (1997); Surfus y otros, J. Immunother. 19:184-91 (1996). ADCC, un ataque lítico sobre células apuntadas por anticuerpos, se desencadena mediante la unión de receptores de leucocitos a la región constante (Fe) de leucocitos. Deo y otros, Immunology Today 18:127 (1997). Un enfoque diferente, pero complementario para incrementar la actividad de DAC de las IgGl no conjugadas, consiste en diseñar la región Fe del anticuerpo. Los estudios dé diseños de proteínas han demostrado que los FcyRs interactúan principalmente con la región bisagra de la molécula de IgG. Lund y otros, J. Immunol. 157:4963-69 (1996) . Sin embargo, la unión de FcyR también requiere la presencia de oligosacáridos covalentemente unidos al Asn conservado en la región CH2. Lund y otros, J. Iinmuno1. 157:4963-69 (1996); Wright and Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997), que sugieren que sea el oligosacárido sea el polipéptidos contribuyen ambos directamente en el sitio de interacción o que se requiere el oligosacárido para mantener una conformación activa del polipéptidos CH2. La modificación de la estructura del oligosacárido puede por lo tanto explorarse como un medio para incrementar la afinidad de la interacción. Una molécula de IgG lleva dos oligosacáridos N-ligados en su región FC, uno en cada cadena pesada. Lo mismo que cualquier glicoproteína, se produce un anticuerpo como una población de glicoformas que comparten la misma estructura básica del polipéptido que tienen diferentes oligosacáridos unidos en los sitios de glicosilación. Los oligosacáridos normalmente encontrados en la región Fe del I.gG del suero son de tipo complejo biantenario (Wormald y otros, Biochemistry 36:130-38 (1997), con un bajo nivel de ácido siálico terminal y con y N-acetilglicosamina (GlcNAc) bisectante, y con un grado variable de galactosilación terminal y fucosilación de núcleo. Algunos estudios sugieren que la estructura carbohidrato mínima requerida para la unión de Fc?R se encuentra dentro del núcleo de oligosacárido Lund y otros, J. Im unol. 157:4963-69 (1996) Las líneas de células derivadas de ratón o hámster utilizadas en la industria y la academia para la producción de mAbs terapéuticos no conjugados normalmente unen los determinantes oligosacáridos requeridos en los sitios Fe. Sin embargo, los IgGs expresados en estas células carecen de los GlcNAc bisectantes hallados en bajas cantidades en IgGs de suero. Lifely y otros, Glycobiology 318:813-22 (1995). En cambio, se ha descubierto recientemente que el IgGl producido mediante mieloma de rata, humanizado, (CAMPATH-1H) llevaba un GlcNAc bisectante en algunas de sus glicoformas. Lifely y otros, Glycobiology 318:813-22 (1995). El anticuerpo derivado de célula de rata llevaba una actividad de DAC in vitro máxima similar a la de los anticuerpos CAMPATH-1H producidos en líneas de células estándar, pero con concentraciones de anticuerpos significativamente más bajas. ; El antígeno CAMPATH se halla normalmente presente con elevadas concentraciones en células de linfoma, y este mAb quimérico tiene una elevada actividad de ADCC en ausencia dé un GlcNAc bisectante. Licely y otros, Glycobiology 318:813-22 (1995). En la trayectoria de glicosilación N-ligante, se adiciona un GlcNAc bisectante mediante GnTIII. Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986). Los estudios anteriores han mostrado una línea de CHO productoras de un único anticuerpo, que había sido previamente diseñado para expresar, de una manera regulada externamente, diferentes niveles de encima de gen GnT clonado (Umana, P., y otros, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Este enfoque estableció por primera vez una rigurosa correlación entre la expresión de GnTIII y la actividad de ADCC del anticuerpo modificado. Por lo tanto, la invención considera un ABM recombinante, quimérico o humanizado, del anticuerpo modificado, uno de sus fragmentos con la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales 225.28S murino, que tiene una glicosilación alterada resultante de una mayor actividad de GnTIII. La mayor actividad de GnTIII resulta en un aumento en el porcentaje de oligosacáridos biseccionados, como también en una disminución en el porcentaje de radicales fucosa, en la región Fe de la ABM. Este anticuerpo, o fragmento del mismo, tiene una mayor afinidad de unión al receptor Fe y una mayor función e'fectora. Además, la invención está orientada a un fragmento de anticuerpo y a proteínas de fusión que comprenden una región que es equivalente a la región Fe de las inmunoglobulinas . Aplicaciones Terapéuticas De ABM Producidas De Acuerdo Con Los Métodos De La Invención En el sentido más amplio, las ABM de la presente invención pueden utilizarse para apuntar células que in vivo o in vitro expresan MCSP. Las células que expresan MCSP pueden apuntarse para fines de diagnóstico o terapéuticos. En un aspecto, las ABM de la presente invención pueden utilizarse para detectar la presencia de MCSP en una muestra. En otro aspecto, las ABM de la presente invención pueden utilizarse para ligar células que expresan MCSP in vitro o in vivo para, por ejemplo la identificación o apuntado (objetivo) . Más particularmente, las ABM de la presente invención pueden utilizarse para bloquear o inhibir la unión a un ligando MCSP, o como alternativa, apuntar una célula que expresa MCSP para su destrucción. En una modalidad, las células que expresan MCSP son pericitos. Por otra parte, las ABM de la invención pueden utilizarse para inhibir la adhesión de células de melanoma, para inhibir las respuestas quimiotácticas a la fibronectina, y para inhibir los pericitos, para inhibir la dispersión de las células sobre l'as proteínas ECM tales como el colágeno y la fibronectina, para inhibir las redes de transducción de las señales de FAK y ECR, y para inhibir o reducir la transducción de las señales mediadas por MCSP, en células que expresan MCSP sobre su superficie. El MCSP se sobreexpresa en muchos tumores humanos.

Por lo tanto, las ABM de la invención son particularmente Útiles en la prevención de la formación de tumores, erradicación de tumores e inhibición del desarrollo tumoral. Las ABM de la invención pueden utilizarse para tratar cualquier tumor que exprese MCSP. Las enfermedades malignas particulares que pueden tratarse con las ABM de la invención incluyen pero no se limitan a, melanoma y angiogénesis de tumores. En una modalidad, las ABM de la invención se coadministran con un anticuerpo anti-VEGF o con otro anticuerpo antiangiogénico para prevenir, inhibir o tratar de alguna otra manera la angiogénesis de los tumores. Las ABM de la presente pueden utilizarse solos para apuntar y aniquilar células tumorales in vivo. Las ABM también pueden utilizarse en conjunción con un agente terapéutico apropiado para tratar carcinoma humano. Por ejemplo, las ABM pueden utilizarse en combinación con métodos de tratamiento estándar o convencionales tales como quimioterapia, terapia de radiación, o pueden conjugarse o ligarse con una droga terapéutica, o toxina, como también a un factor que inhiba el desarrollo de linfocinas o de tumores, para la entrega de un agente terapéutico en el sitio del carcinoma. Los conjugados de las ABM de la invención que sion de importancia primaria son: (1) o (conjugados de la ABM y' una parte citotóxica), y (2) ABM etiquetados (por ejemplo, riadioetiquetados, etiquetados con enzimas o etiquetados con fluorocromo) , en los que la etiqueta, o rótulo, provee un miedio para identificar inmunocomplejos que incluyen la ABM etiquetado. Las ABM también pueden utilizarse para inducir lisis mediante el proceso complementario natural, y para interactuar con células citotóxicas anticuerpos-dependientes normalmente presentes. La parte citotóxica de la inmunotoxina puede ser una droga citotóxica o una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano o vegetal, o un fragmento enzimáticamente activo ("cadena A") de una toxina tal. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos utilizados son la cadena A de difteria, los fragmentos activos no de unión de toxina de difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modecina, la alfa-sarcina, proteínas de Aleurites proteínas de fordii proteins, proteínas de diantina, proteína de Phytolacca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor momordica charantia inhibitor, curcina, crotina, inhibidor sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, y enomicina. En otra modalidad, las ABM están conjugadas con drogas anticáncer de pequeña molécula. Los conjugados de la ABM y de dichas partes citotóxicas se producen utilizando una variedad de agentes de acoplamiento disfuncional de proteínas. Los ejemplos de dichos reactivos abarcan SPDP, IT, derivados bifuncionales de imidoésteres tales como dimetil dipimidato HCl, esteres activos tales como disuccinimidil suberata, aldehidos tales como glutaraldehído, compuestos bis-azido tales como (p-azidobenzoil) hexanodiamina, derivados de bis-diazonio tales como bis- (p-diazoniobenzoil) - etilenodiamina, los diisocianatos tales como tolilen-2,6-diisocianato, y los compuestos flúor bis-activos tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno . La porción usante de una toxina puede unirse al fragmento Fab de las ABM. Toxinas adecuadas se conocen en la técnica, tal como se pone en evidencia en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos, publicada, No. 2002/0128448, incorporada en la presente en su totalidad, a título de referencia. En una modalidad, un ABM quimérico glicodiseñado que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo monoclonal 225.28S murino, se conjuga con la cadena A de ricina. Es más ventajoso que la cadena A de ricina sea deglicosilada y producida mediante recombinantes. Un método ventajoso para preparar la inmunotoxina de ricina se describe en: Vitetta y otros, Science 238, 1098 (1987), incorporada en la presente a título de referencia. Cuando se utilizan para aniquilar célula de cáncer humano in vitro para fines de diagnóstico, se adicionan típicamente los conjugados al medio de cultivo celular con una concentración de aproximadamente 10 nM. La formulación y modo de administración para el uso in vitro no son críticos. Nbrmalmente se utilizan formulaciones acuosas que sean compatibles con el cultivo un medio de perfusión. La citotoxicidad puede leerse mediante técnicas convencionales para determinar la presencia o grado de cáncer.

Tal como se expuso anteriormente, es posible preparar un producto radiofarmacéutico citotóxico para tratar el cáncer conjugando un isótopo radioactivo (por ejemplo, I, Y, Pr) a un ABM quimérico, glicodiseñado que tiene sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo monoclonal murino. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "parte citotóxica" tiene por objeto incluir dichos isótopos. En otra modalidad, se llenan liposomas con una droga citotóxica, y los liposomas se recubren con las ABM de la presente invención. Dado que hay muchas moléculas de MCSP sobre la superficie de la célula maligna que expresa MCSP, este método permite la entrega de grandes cantidades de droga al tipo de célula correcto. Las técnicas para conjugar tales agentes terapéuticos con anticuerpos son bien conocidas (Véase, por ejemplo, Arnon y otros, "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Reisfeld y otros (eds.), Págs. 2'43-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y otros, "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (i2nd Ed.), Robinson y otros (eds.), Págs. 623-53 (Marcel Dékker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y otros (eds.), pp. 475-506 (1985); y Thorpe y otros, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)). Y otras aplicaciones terapéuticas para las ABM de la invención incluyen conjugación o unión, por ejemplo, mediante técnicas de ADN recombinante, a una enzima capaz de convertir un profármaco en una droga citotóxica y el uso de dicho conjugado anticuerpo-enzimas en combinación con el profármaco a efectos de convertir el profármaco en un agente citotóxico en el sitio del tumor (Véase, por ejemplo, Senter y otros, "Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cáncer Research 49:5789-5792 (1989); y Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cáncer Therapy," FASEB J. 4:188-193 (1990)). Otros usos terapéuticos para las ABM de la invención implican el uso, sin conjugar, en la presencia de un complemento, o como parte de un conjugado anticuerpo-droga o- anticuerpo-toxina, para remover las células tumorosas de la médula espinal de los pacientes cancerosos. De acuerdo con este enfoque, es posible purgar la médula espinal autóloga ex vivo mediante tratamiento con el anticuerpo y la médula se re-infunde en el paciente [Véase, por ejemplo, Ramsay y otros, "Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Ciin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)]. Por otra parte, dentro de los alcances de la invención se considera que la misma comprende una inmunotoxina de cadena simple que comprende dominios enlazadores de antígenos que permiten sustancialmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo monoclonal 225.28S murino (por ejemplo, los polipéptidos que comprenden los CDR del anticuerpo monoclonal 225.28S murino), y que además comprenden un polipéptido de toxina. Las inmunotoxinas de cadena simple de la invención pueden utilizarse para tratar el carcinoma humano in vivo. De manera similar, una proteína de fusión que comprende por lo menos la región de unión a antígeno de un ABM de la invención con respecto a al menos una porción funcionalmente activa de una segunda proteína que tiene actividad antitumoral, por ejemplo una linfocina u oñcostatina, puede utilizarse para tratar el carcinoma humano in vivo. La presente invención provee un método para aniquilar de manera selectiva células tumorales que expresan MCSP. Este método comprende seleccionar el inmunoconjugado (por ejemplo, la inmunotoxina) de la invención con dichas células tumorales. Estas células tumorales pueden proceder de un carcinoma humano Adicionalmente, esta invención provee un método para tratar carcinomas (por ejemplo, carcinomas humanos) in vivo. Este método comprende administrar a un sujeto una cantidad farmacéuticamente activa de una composición que contiene por lo menos uno de los inmunoconjugados (por ejemplo, la inmunotoxina) de la invención. En otro aspecto más, la invención está orientada a un método mejorado para tratar los trastornos de la proliferación de células en las cuales se expresa MCSP, particularmente las cuales se expresa MCSP de manera anormal (es decir, se sobreexpresa) , que incluye melanoma, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un ABM de la presente invención a un sujeto humano que lo necesite. Por otra parte, dado que el MCSP se expresa en pericitos activados e inactivos, las ABM de la invención pueden utilizarse para tratar la angiogénesis en cualquier t,umor que induzca una neovascularización. Dado que los p'ericitos entran en contacto con, y dan soporte a, células y pueden también estabilizar nuevos vasos, el utilizarlos como objetivo inhibiría la angiogénesis inducida por el tumor. Ozerdem & Stallcup, angiogénesis 7(3):269-76 (2004); Erber y otros, FASEB J. 18(2):338-40 (Feb. 2004); Grako y otros, J. Cell Sci. 112:905-915 (1999); Iivanainen y otros, FASEB J. 17:1609-1621 (2003). En una modalidad preferida, la ABM es un anticuerpo glicodiseñado anti-MCSP con una especificidad de unión sustancialmente igual a la del anticuerpo monoclonal 225.28S murino. En otra modalidad preferida, el anticuerpo está humanizado. Los ejemplos de trastornos de proliferación de células que pueden tratarse con un ABM de la presente invención incluyen pero no se limitan a los neoplasmas situados en el: abdomen, huesos, pecho, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (adrenal, paratiroides, pituitaria, testículos, ovarios, timo, tiroides), ojos, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejidos blandos, bazo, región torácica y sistema urogenital. De manera similar, otros trastornos de proliferación de células también pueden tratarse mediante las ABM de la presente invención. Los ejemplos de tales trastornos de proliferación de células incluyen pero no se limitan a: hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemias, purpura, sarcoidosis, síndrome de Sezary, macroglobuloinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histiocitosis, y cualesquiera otras enfermedades de proliferación de células, además de las neoplasias situados en un sistema de órganos anteriormente mencionado, De acuerdo con la práctica de la invención, el sujeto puede ser un ser humano, y sujetos equinos, porcinos, bovinos, murinos, caminos, felinos, y aviarios. En esta invención se incluyen también otros animales de sangre caliente . La invención de la presente también provee métodos para inhibir el desarrollo de células tumorales humanas, para tratar un tumor en un sujeto, y para tratar una enfermedad de tipo proliferante en un sujeto. Estos métodos comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición de ABM de la invención. La invención está además dirigida a métodos para tratamiento de enfermedades o trastornos no malignos en un mamífero, caracterizados por una activación o producción anormal de MCSP o de uno o más ligandos de MCSP, que comprenden administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de las ABM de la invención. El sujeto tendrá por lo general células que expresan MCSP, por ejemplo en un tejido enfermo del mismo, de modo tal que las ABM de la invención sean capaces de ligarse a células dentro del sujeto. i La activación o expresión anormal de MCSP o de un ligando de MCSP puede presentarse en células del sujeto, por ejemplo en un tejido enfermo del sujeto. La activación anormal de MCSP puede ser atribuible a la amplificación, sbbreexpresión o producción aberrante del MCSP y/o del ligante de MCSP. En una modalidad de la invención, se lleva a cabo un ensayo de diagnóstico o de pronóstico para establecer si en el sujeto está teniendo lugar una producción o activación anormal de MCSP (o de ligando de MCSP) . Por ejemplo, puede determinarse la amplificación y/o sobre expresión genética de MCSP y/o de un ligando. En la técnica se dispone de diversos ensayos para determinar la amplificación/sobreexpresión, que incluyen los ensayos IHC, FISH y de antígeno de derrame antes descritos. Como alternativa, o a título adicional, es posible, mediante procedimientos conocidos, determinar niveles de un ligando de MCSP ligando dentro de una muestra, o asociado con la misma. Dichos ensayos permiten detectar proteína y/o ácido nucleico que lo codifica, en la muestra sometida a ensayo. En una modalidad, es posible determinar los niveles de ligando de MCSP mediante inmunohistoquímica (IHC); véase, por ejemplo, sicher y otros Clin. Cáncer Research 1:545-550 (1995). Como alternativa, o a título adicional, es posible evaluar niveles de asilo nucleico que codifica MCSP en la muestra a ensayarse, por ejemplo mediante técnicas FISH, Southern Blotting, o de PCR. Por otra parte, es posible evaluar la sbbreexpresión o amplificación de MCSP o de ligando de MCSP mediante un ensayo de diagnóstico in vivo, por ejemplo, mediante la administración de una molécula (tal como un anticuerpo) que se liga a la molécula al detectarse y que está rotulada o etiquetada con un rótulo o etiqueta detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo) y efectuando un escaneo externo sobre el paciente para localizar la etiqueta . Por ello es evidente que la presente invención abarca composiciones farmacéuticas, combinaciones y métodos para tratar enfermedades malignas humanas tales como melanomas y cánceres de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, páncreas, pulmones hecho, ovarios, colon, próstata, y ríñones. Por ejemplo, la invención incluye composiciones farmacéuticas destinadas a utilizarse en el tratamiento de enfermedades malignas humanas que comprende una cantidad farmacéuticamente activa de un anticuerpo de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de ABM de la invención pueden administrarse utilizando modos convencionales de administración que incluyen pero no se limitan a la vía intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática, o la administración directa en el tumor. Se prefiere la administración intravenosa. En uno de los aspectos de la invención, las formulaciones terapéuticas que contienen las ABM de la invención se preparan para su almacenamiento mediante el mezclado de un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos farmacéuticos, excipientes o estabilizantes, opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o de soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizantes, aceptables, carecen de toxicidad con respecto a los recipientes en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen reguladores de pH tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos, antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina, agentes conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; los alquilparabenos tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciciohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (tales como de aproximadamente 10 radicales), las proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen la glicosa, mañosa, o las dextrinas; los agentes quelantes tales como el EDTA; los azúcares tales como la sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; los contra-iones formadores de sales tales como el sodio; los complejos de metales (por ejemplo, los complejos de Zn-proteína) ; y/o los agentes tensioactivos no-iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o el polietilenglicol (PEG) . Las ABM de la presente invención pueden administrarse a un sujeto para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por una actividad anormal de MCSP o de ligando de MCSP, tal como un tumor, sea sólo sea en una terapia combinada con por ejemplo un agente quimioterapéutico, y/o terapia de radiación. Los agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen cisplatino, doxorrubicina, topotecano, paclitaxel, vinblastina, carboplatino y etopósido. Las formulaciones liofilizadas adaptadas para la administración subcutánea se describen en el documento WO 97/04801. Dichas formulaciones liofilizadas pueden reconstituirse con un diluyente adecuado hasta una elevada concentración de proteínas, y la formulación reconstituida puede administrarse subcutáneamente al mamífero a tratarse en la presente. La formulación de la presente también puede contener más de un compuesto activo en la medida de lo necesario para la indicación particular que se está tratando, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se interfieran adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proveer además un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, citocinas o un agente inmunosupresor (por ejemplo, uno que actúe sobre las células T, tales como la ciclosporina un anticuerpo que actúe sobre las células T, por ejemplo, uno que ligue LFA-1) . La cantidad efectiva de dichos otros agentes depende de la cantidad de antagonista presente en la formulación, del tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y de otros factores anteriormente mencionados. Los mismos se utilizan por lo general en las mismas dosificaciones y con dosis de administración como las utilizadas hasta ahora o de aproximadamente 1 a 99% de las dosis empleadas hasta ahora. Los ingredientes activos pueden también estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de entrega coloidales de drogas (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o eh macroemulsiones . Dichas técnicas se revelan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Es posible preparar preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el antagonista, las cuales matrices se encuentran en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen pbliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (alcohol vinílico)), poliláctidos (Patente de los EE . UU. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, copolímero etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímero ácido láctico- ácido glicólico degradable tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico . Las formulaciones a utilizarse para la administración ín vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones de la invención pueden estar en una variedad de formas de dosificación que incluyen pero no se limitan a soluciones o suspensiones líquidas, tabletas, pildoras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas, y soluciones inyectables o infusibles. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica. ; Las composiciones de la invención también comprenden preferiblemente vehículos convencionales y adyuvantes farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica, tales como albúmina de suero humano, intercambiadores de iones, alúmina, lecitina, sustancias reguladoras de pH tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, y sales o electrolitos tales como sulfato de protamina. El modo de administración y el régimen de dosificación más efectivos para las composiciones farmacéuticas de esta invención, dependen de la gravedad y desarrollo de la enfermedad, de la salud del paciente y de la respuesta al tratamiento y del criterio del médico cantante. Por lo tanto, las dosis de las composiciones deben titularse de acuerdo con paciente individual. Sin embargo, una dosis efectiva de las composiciones de esta invención estará por lo general en el intervalo de valores de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 2.000 mg/kg. : Las moléculas descritas en la presente pueden estar en una variedad de formas de dosificación que incluyen pero no se limitan a, soluciones y suspensiones liquidas, tabletas, piedras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas y soluciones inyectables o imposibles. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica. Las dosificaciones de la presente invención, pueden en algunos casos determinarse mediante el uso de biomarcadores. Los biomarcadores son marcadores moleculares que se utilizan para evaluar la farmacodinámica de un método terapéutico, y para determinar cuáles sujetos tienen mayor probabilidad de responder. Por ejemplo, los biomarcadores para la terapia anti-MCSP pueden ser moléculas (por ejemplo, quinasa de adhesión focal (FAK), quinasa extracelular regulada por señal (ERK), u otros) que se hallan en la trayectoria de señalización corriente debajo de MCSP que conduce a un trastorno de la proliferación de células. Por lo tanto, los biomarcadores pueden utilizarse para determinar en qué cantidad administrar la ABM de la presente invención. La presente invención también provee un método para la administración de una cantidad de un ABM a un paciente, empezándose por determinar la expresión de biomarcadores de trastornos marcados por expresión de MCSP. Las dosis de la presente invención pueden, en algunos casos, determinarse mediante la utilización de biomarcadores predictivos, Los biomarcadores predictivos son marcadores moleculares que se utilizan para determinar (es decir, observar y/o cuantificar) un patrón de expresión y/o activación de genes o proteínas relacionados con tumores, o componentes celulares de una trayectoria de señalización relacionado con un tumor. La dilucidación de los efectos biológicos de terapias apuntadas en el tejido tumoral y la correlación de estos efectos con respuestas clínicas ayuda a identificar el crecimiento predominante y la trayectoria de supervivencia operativos en los tumores, con lo que se establece un perfil de pacientes que probablemente responderán, y a la inversa, - se determina un criterio para diseñar estrategias para superar resistencias. Por ejemplo, los biomarcadores para la terapia anti-MCSP pueden comprender moléculas que se hallan en la trayectoria de señalización corriente abajo de MCSP que conduce a un trastorno de proliferación de células que incluye pero no se limitan a: FAK, ERK, metaloproteínasa de matriz de membrana de tipo 3 (ÍMT3-MMP), Cdc42, Ack-1, y pl30cas. Yang y otros, J. Cell Biol. 165(6) .881-891 (Junio 2004); Iida y otros, J. Biol. Chem. 276(22) :18786-18794 (2001); Eisenmann y otros, Nat. Cell Biol. 1(8) .507-513 (1999). Los biomarcadores predictores pueden medirse mediante valoraciones que son bien conocidos en el estado de la técnica, incluyendo la inmunohistoquímica, la citometría de flujo, la inmunofluorescencia, las valoraciones por captura y detección, y las valoraciones de fase inversa, y/u oitras valoraciones expuestas en la solicitud de patente eistadounidense publicada N° 2004/0132097 Al, todo cuyo contenido queda incorporado en ésta por referencia. Los mismos biomarcadores de la terapia anti-MCSP pueden ser identificados de acuerdo con técnicas expuestas en la solicitud de patente estadounidense publicada N° 2003/0190689 Al, todo cuyo contenido queda incorporado en ésta como referencia . En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar un trastorno relacionado con MCSP, que comprenda predecir la respuesta a una terapia anti-MCSP en un sujeto humano que necesite tratamiento, haciendo con una muestra tomada de un sujeto humano con anterioridad a la terapia, una valoración con un reactivo o una pluralidad de reactivos que detectan la expresión y/o la activación de biomarcadores predictores para un trastorno relacionado con MCSP, tal como el cáncer; determinando un modelo de expresión y/o activación de uno o más biomarcadores predictores, en el que el modelo predice la respuesta del sujeto humano a la a lá terapia anti-MCSP; y administrando a un sujeto humano del cual se predice que responderá positivamente al tratamiento anti-MCSP, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprenda un ABM de la presente invención. Tal como se usa en ésta, un sujeto humano del cual se predice que responderá positivamente al tratamiento anti-MCSP es alguien en el cual el anti-MCSP tendrá un efecto mensurable sobre el trastorno relacionado con MCSP (por ejemplo, regresión/reducción del tumor) y en el cual los beneficios de la terapia anti-MCSP no son sobrepasados por efectos adversos (por ejemplo, la toxicidad) . Tal como se usa en ésta, una muestra significa cualquier muestra biológica tomada de un organismo, particularmente un organismo humano, que comprenda una o más células, incluyendo células individuales de cualquier origen, muestras de tejido o biopsia extirpadas de órganos tales como el pecho, el pulmón, el tracto gastrointestinal, la piel, el cuello del útero, el ovario, la próstata, el riñon, el cerebro, la cabeza o la nuca, o de cualquier otro órgano o tejido del cuerpo, y cualesquiera otras muestras del cuerpo que incluyan, aunque sin limitarse a ellos: frotis, esputos, secreciones, fluido cerebroespinal, bilis, sangre, fluido linfático, orina y heces. La composición que comprende un ABM de la presente invención será formulada, dosificada y administrada de una manera consistente con la buena práctica médica. Los factores que han de ser considerados en este contexto incluyen la enfermedad o trastorno particular al que se aplica el tratamiento, el mamífero particular que es tratado, el estado clínico del paciente individual, la causa de la enfermedad o del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, la programación de la administración, y otros factores que son conocidos por los practicantes de medicina. La cantidad terapéuticamente eficaz del antagonista qiue habrá de administrarse se regirá por consideraciones de e¡sa índole. Como proposición general, la cantidad por dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo administrado por vía parenteral estará dentro del intervalo de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg del peso del cuerpo del paciente por día, y el típico intervalo inicial del antagonista que se use, dentro del intervalo de aproximadamente 2 a 10 mg/kg. En una modalidad preferida, el ABM es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo humanizado. Dosificaciones apropiadas para un anticuerpo de esa índole que no es conjugado están, por ejemplo, dentro del intervalo de aproximadamente 20 mg/m2 a aproximadamente 1000 mg/m2. Por ejemplo, se le pueden administrar al paciente una o más dosis que sean sustancialmente inferiores a los 375 mg/m2 del anticuerpo, por ejemplo donde la dosis esté en el intervalo que va de aproximadamente 20 mg/m2 a aproximadamente 250 mg/m2, por ejemplo de aproximadamente 50 mg/m2 a aproximadamente 200 mg/m2. Además, se puede (n) administrar una o más dosis iniciales del anticuerpo seguidas de una o más dosis subsiguientes, en las cuales la dosis mg/m2 del anticuerpo en las dosis subsiguientes excede la dosis de mg/m2 del anticuerpo en la(s) dosis inicial (es). Por ejemplo, la dosis inicial puede estar dentro del intervalo de aproximadamente 20 mg/m2 a aproximadamente 250 mg/m2 (por ejemplo, de aproximadamente 50 mg/m2 a aproximadamente 200 mg/m2) y la dosis subsiguiente puede estar dentro del intervalo de aproximadamente 250 mg/m2 a aproximadamente 1000 mg/m2. Tal como se señaló anteriormente, in embargo, esas cantidades sugeridas de ABM están sujetas en buena medida a la discreción terapéutica. El factor clave en la selección de la dosis apropiada y en la programación es el resultado obtenido, tal como se indicó supra. Por ejemplo, inicialmente pueden necesitarse dosis relativamente más altas para el tratamiento de enfermedades progresivas y agudas. A fin de obtener los resultados más eficaces, según la enfermedad o trastorno, el antagonista es administrado tan próximo como sea posible al primer signo, diagnóstico, aparición u ocurrencia de la enfermedad o trastorno, o durante disminuciones de la intensidad de la enfermedad o del trastorno . En el caso de los anticuerpos anti-MCSP usados para tratar tumores, se obtienen por lo común resultados terapéuticos óptimos con una dosis que es suficiente para saturar enteramente la molécula MCSP sobre las células objetivo. La dosis necesaria para lograr la saturación dependerá del número de moléculas de MCSP expresadas por cada célula tumoral (número que puede variar significativamente según los diferentes tipos de tumor) . En el tratamiento de algunos tumores pueden ser eficaces concentraciones de suero tan bajas como las de 30 nM, mientras que con otros tumores, para obtener un efecto terapéutico óptimo, podrán ser necesarias concentraciones superiores a los 100 nM. La dosis necesaria para lograr la saturación para un tumor dado puede determinarse fácilmente in vitro mediante radioinmunoensayo o inmunoprecipitación . En general, para combinar terapia con radiación, un régimen terapéutico apropiado implica ocho infusiones semanales de un ABM anti-MCSP de la invención, con una dosis de carga de 100-500 mg/m2, seguida de dosis de mantenimiento de 100-250 mg/m2, y radiación en la cantidad de 70.0 Gy a una dosis de 2.0 Gy diarios. Para la combinación de terapia con quimioterapia, un régimen terapéutico apropiado implica administrar un ABM anti-MCSP de la invención, en forma de dosis semanales de carga/mantenimiento de 100-100 mg/m2, 400/250 mg/m2, ó 500/250 mg/m2 en combinación con cisplatino, con una dosis de 100 mg/m2 cada tres semanas. Como alternativa, en vez de cisplatino puede usarse gemcitabina o irinotecano. La ABM de la presente invención es administrada por cualesquiera medios apropiados, incluyendo la administración parenteral, la subcutánea, la intraperitoneal, la intrapulmonar y la intranasal y, si se lo desea para el tratamiento inmunosupresor local, la administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, la endovenosa, la intraarterial, la intraperitoneal o la subcutánea. Adicionalmente, el antagonista puede administrarse apropiadamente mediante infusión en el pulso, por ejemplo cuando se administran dosis declinantes del antagonista. Preferentemente, la dosificación es dada por inyecciones, siendo la manera más preferida la de las inyecciones endovenosas o subcutáneas, lo cual depende en parte de si la administración habrá de ser breve o prolongada. Pueden administrarse otros compuestos, tales como agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunosupresores y/o citotoxinas con los antagonistas mencionados en ésta. La administración combinada incluye coadministración, usando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y administración consecutiva en cualquier orden, habiendo preferentemente un período de tiempo en el cual ambos (o todos los) agentes activos ejercen sus actividades biológicas de manera simultánea. Quedaría claro que la dosis necesaria para lograr curas de la composición que es objeto de la invención, puede ser reducida aún más mediante optimización del programa. De acuerdo con la práctica de la invención, el portador farmacéutico puede ser un portador lipídico. El portador lipídico puede ser un fosfolípido. Además, el portador lipídico puede ser un ácido graso. El portador lipídico también puede ser un detergente. Para el uso en la presente solicitud, el detergente es cualquier sustancia que altera la tensión superficial de un líquido, generalmente bajándola.

En un ejemplo de la invención, el detergente puede ser un detergente no iónico. Los ejemplos de detergentes no iónicos incluyen polisorbato 80 (también conocido como Tween 80 o monooleato de polioxietilensorbitan) , Brij, y tritón (por ejemplo, tritón WR-1339 y tritón A-20) , pero sin estar limitados a ellos. Alternativamente, el detergente puede ser un detergente iónico. Un ejemplo de detergente iónico incluye bromuro de alquil-trimetilamonio, pero no está limitado a él. Adicionalmente, de acuerdo con la invención, el portador lipídico puede ser un liposoma. Para el uso en esta solicitud, un "liposoma" es cualquier vesícula formada por una membrana, que contiene cualesquiera moléculas de la invención o combinaciones de éstas. Artículos manufacturados En otra modalidad de la invención, se provee un artículo manufacturado que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El a'rtículo manufacturado comprende un envase y un rótulo o inserto de paquete, en el envase o asociado a éste. Los envases apropiados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos ampolla, jeringas, etc. Los envases pueden estar elaborados a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que es eficaz para tratar la afección y puede tener una abertura de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución endovenosa o un frasco ampolla que tiene un tapón perforable por una aguja hipodérmica de inyección) . Por lo menos un principio activo en la composición es un anticuerpo anti-MCSP. El rótulo o el inserto de paquete indica que la composición es usada para tratar la afección seleccionada, tal como una enfermedad o un trastorno no malignos, involucrando la enfermedad o el trastorno una activación anormal de la producción de MCSP y/o un ligando de MCSP, por ejemplo, una enfermedad o un trastorno hiperproliferativos benignos. Además, el artículo manufacturado puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en éste, comprendiendo la composición un primer anticuerpo que enlace MCSP e inhiba el crecimiento de células que sobreexpresan MCSP; y (b) un segundo envase con una composición contenida en éste, comprendiendo la composición un segundo anticuerpo que enlace MCSP y bloquee la activación como ligando de un receptor de MCSP. El artículo manufacturado en esta modalidad de la invención puede comprender, además, un inserto de paquete que indique que las composiciones de anticuerpos primera y la segunda pueden usarse para tratar una enfermedad un trastorno no malignos de la lista de tales enfermedades o trastornos, presentada en la sección de definiciones precedente. Además, el inserto de paquete puede instruir al usuario de la composición (que comprende un anticuerpo que enlaza MCSP y bloquea la activación como ligando de un receptor de MCSP) acerca de la combinación de la terapia con el anticuerpo con cualquiera de las terapias auxiliares, descritas en la sección precedente (por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un medicamento dirigido hacia MCSP, un agente antiangiogénico, un agente inmunosupresor, un inhibidor de la tirosinacinasa, un compuesto antihormonal, un protector cardiaco y/o una citocina) . Alternativamente o adicionalmente, el artículo manufacturado además puede comprender un segundo (o tercer) envase, que contenga un regulador de pH aceptable en farmacia, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina regulada por fosfatos, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además, puede incluir otros materiales, deseables desde el punto de vista comercial y de los usuarios, incluyendo otros reguladores de pH, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Los siguientes ejemplos explican la invención en más detalle. Las siguientes preparaciones y ejemplos se dan para posibilitar a los expertos en la materia una mayor claridad para entender y practicar la presente invención. No obstante, la presente invención no está limitada en su alcance por las realizaciones ejemplificadas, que sólo están destinadas a ilustrar aspectos simples de la invención y métodos que son funcionalmente equivalentes, están dentro del alcance de la invención. En efecto, varias modificaciones de lá invención, además de las descritas aquí, se harán evidentes para los expertos en la materia, a partir de la descripción precedente y los dibujos acompañantes. Tales modificaciones están destinadas a caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. De esta manera, todas las patentes, solicitudes y publicaciones citadas en esta solicitud se incorporan como referencia en su totalidad. EJEMPLOS A menos que se indique otra cosa, las referencias a la numeración de las posiciones de los residuos de aminoácidos específicos en los ejemplos siguientes, responde al sistema de numeración de Kabat. Los ejemplos están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Salvo donde se indique otra cosa, los materiales y métodos utilizados para producir las moléculas de unión a antígeno en estos ejemplos de trabajo concuerdan con los indicados en los ejemplos de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 10/981,738, que se incorpora en la presente en su totalidad, a título de referencia . EJEMPLO 1 Generación de MAbs anti- MCSP humanizado A. Enfoque del Aceptor de Elevada Homologia Bajo este enfoque, se llevó a cabo una investigación estructural del aceptor del anticuerpo de elevado homología mediante la alineación de la secuencia de proteína madre, derivada del anticuerpo scFv derivado de r tón 225.28S con respecto a una colección de secuencias de líneas germinales humanos y recogiéndose aquella secuencia humana que mostraba la máxima identidad de secuencia y que al mismo tiempo conservaba todos los residuos canónicos en un nivel funcional. En este caso, las secuencias IGHV3-15 (Acc. No. X92216) y IGHV3-7 (Acc. No. M99649) de la base de datos de IMGT fueron tomados como secuencias aceptoras de la estructura. Ambas eran miembros de la familia VH3. Se eligió la secuencia IGKV1-9 (Acc. No. Z00013) de la familia VK1 de la misma base de datos para que fuese el aceptador de estructura para la cadena ligera. Sobre estas tres estructuras aceptoras se injertaron las tres regiones determinantes complementarias (CDR) de cada uno de los dominios variables pesado y liviano de 225.28S murino. Ya que lá región de estructura 4 (FR4) no forma parte de la región viariable del gen de líneas germinales, la alineación para dicha posición fue efectuada individualmente. La región JH6 fue la elegida para la cadena pesada, y se eligió la región JK4 para la cadena ligera. La modelación molecular del dominio de inmunoglobulina diseñado reveló algunas posiciones que potencialmente requerían en los residuos aminoácidos m rinos el lugar fuera de las regiones de CDR. La reintroducción de los residuos aminoácidos murinos en la estructura humana generaría las denominadas mutaciones inversas. Por ejemplo, el residuo aminoácido aceptor humano en la posición de Kabat 94 (treonina en IGHV3-15) fue retromutado en un residuo serina en una de las variantes. Para probar la hipótesis de la necesidad de estas retromutaciones, se diseñaron variantes anticuerpo humanizados que sea incluían sea omitían las retromutaciones. En la secuencia de la cadena ligera 225.28S, un análisis estadístico reveló una tira completa de residuos "raros" en FR2. Se trata de Glu45, Pro46, Leu48 y Phe49. El análisis del modelo molecular 3D mostró que la totalidad de estos residuos tienen fuertes interacciones con respecto a los CDR de la cadena liviano, y (aparte de eu48) también con el CDR3 de VH . En este paso de modelación, también se diescubrió que Pro46 establece contactos importantes con el VH CDR3. Para investigar la importancia de estos residuos, se los incorporó como retromutaciones en las construcciones VL hµmanizados. Las construcciones humanizadas que contenían retromutaciones se compararon con construcciones humanizados preparados de acuerdo con el enfoque de "estructura mixta" anteriormente mencionado, para establecer su capacidad de ligarse con antígeno. B . Enfoque de estructura mixta A efecto de evitar introducir retromutaciones en posiciones críticas (críticas a efectos de retener una buena afinidad de unión con antígeno o funciones de anticuerpo) en la estructura del aceptor humano, se investigó si sea la región de estructura 1 (FRl) sea 2 ( FR2 ) juntos, o el FR3 de un anticuerpo funcionalmente humanizado podía reemplazarse por secuencias de anticuerpo humano que ya tenían residuos donantes, o por otros funcionalmente equivalentes, en aquellas posiciones importantes en la secuencia de linea germinal natural humano. A tal efecto, las estructuras de VH FRl, FR2 y FR3 de la secuencia 225.28S VH murina fueron alineadas individualmente en secuencias de línea germinal humano. En este caso, la máxima identidad de secuencia no era importante, y no se utilizó para elegir estructuras aceptoras; en cambio, se supuso que la concordancia de diversos residuos críticos era más importante. Aquellos residuos críticos comprenden los denominados residuos canónicos, y también aquellos residuos en las posiciones 27, 28, y 30 (numeración de Kabat), que están situados fuera de lá definición de CDRl de Kabat, pero dentro de la CDRl tal como definió Kabat, e intervienen frecuentemente en la unión de antígeno. Además, los residuos críticos son aquellos que muestran una importante interacción con los CDR, como puede determinarse utilizando modelación molecular. Las secuencias IMGT IGHV1-58 (No. Acceso M29809), y IGHV1-46 (Accession No. X92343) se eligieron como candidatos adecuados para reemplazar sea FRl, FR2, o FR3. En pocas palabras, se utilizó IGHV1-46 como un aceptor para todas las estructuras, con lo que se genera un aceptor de estructura simple que es idéntica a las regiones de FR donantes al 53% a nivel de los aminoácidos. También se utilizó IGHV1-46 como el aceptador FRl y FR2, mientras que el IGHV1-58 se utilizó para FR3. También se utilizó el IGHV3-7 como aceptor FRl y FR2, y se utilizó el IGHV3-15 para FRl, FR2 , y/o FR3. La explicación de la mezcla de IGHV3-7 con el IGHV3-15 consistió en tener una homología óptima en FRl y FR2, y en tener residuos concordantes en las posiciones de Kabat 71 y 94. En todas estas construcciones se utilizó el JH6 para la región FR4. Tal como se mencionó anteriormente con respecto al enfoque de elevado homología, la región FR2 de la cadena ligera humanizada requeriría algún esfuerzo. Hemos introducido varias regiones de FR2 de otros anticuerpos de líneas germinales, a saber el IGKV2-28 (Acc. No. X63397) y el IGKV2D-30 (Acc. No. X63402) . Obviamente, los residuos "raros" se encuentran claramente en el repertorio de la línea germinales humanos. Por ello, el FR2 de un anticuerpo de línea germinal (Gen Bank Acc. No. AAA17574), que se deriva de las células B periféricas humanas y que lleva incorporado el residuo prolina 46, también fue incluido en la colección de aceptor FR. Para escudriñar la idea de remover los residuos "raros" en las construcciones de cadena ligera, que se hallan dentro de las regiones, se construyeron las variantes M-KV10, M-KVll, y M-KV12. Todas ellas parten del diseño de M-KV9. El M-KV10 reemplaza el Lys24 murino por una arginina humana, y también reemplaza el Val33 por una leucina humana. El M-KVll reemplaza solamente el Val33 murino con una leucina humana. El M-KV12 reemplaza la tira de tres aminoácidos Arg-Tyr-Thr (54 a 56) con el VKl humano derivado del tri-péptido Leu-Gln-Ser derivado de K. Después de haber diseñado la secuencia de proteínas, las secuencias de ADN que codifican estas proteínas fueron sintetizadas como se detalla más adelante. Mediante la utilización de este enfoque pudieron evitarse retromutaciones en la mayoría de las construcciones de la cadena pesada, a efectos de retener buenos niveles de unión dé antígeno. La cronología y el razonamiento de las construcciones de estructura mixta se explican en el capítulo siguiente . C. Sintesis de los genes de anticuerpos Después de haber diseñado la secuencia de aminoácidos de la región del anticuerpo V humanizado, había que generar la secuencia de ADN. Los datos para la secuencia de ADN de las regiones de la estructura individual se encontraron en las bases de datos (por ejemplo, el sistema International Immunogenetics Information System mantenido por el Instituto de Bioinformática Europeo, http://imgt.cines.fr) para las secuencias de líneas germinales humanas. La información de secuencias de ADN para las regiones de CDR se dedujo de la secuencia de proteínas publicada de anticuerpo 225.28S murino. Neri y otros, J. Invest. Dermatol. 107 (2 ): 164-170 (1996). Con esta secuencia, se ensambló virtualmente la totalidad de la secuencia del ADN. Al disponer de estos datos de la secuencia de ADN, se introdujeron sitios de restricción de diagnóstico en la secuencia virtual, mediante la introducción de mutaciones silentes, creándose seis sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción. Para obtener la cadena física de ADN, se llevó a cabo la síntesis de genes (por ejemplo, Wheeler y otros 1995) . En este método, los oligonucleótidos se diseñan a partir de los genes de interés, de modo tal que se deriva una serie de oligonucleótidos a partir del filamento codificante, y otra serie proviene del filamento no codificante. Los extremos 3' y 5' de cada oligonucleótido ('excepto los extremos primero y último en la fila) siempre muestran secuencias complementarias con respecto a dos cebadores derivados del filamento opuesto. Cuando se ponen e^stos sólidos nucleótidos en un regulador de pH de reacción adecuado para cualquier polimerasa termoestable, y se adiciona Mg2+, dNTPs y una polimerasa de ADN, cada oligonucleótido se extiende desde su extremo 3' . El extremo 3' recién formado de un cebador seguidamente reacciona térmicamente con el siguiente cebador del filamento opuesto, y extiende su secuencia más lejos aún bajo condiciones adecuadas para la elongación de la cadena de ADN templado-dependiente. El producto final se clonó en forma de un vector convencional para su propagación en E. coli. D . Producción de anticuerpos Unas secuencias líder humanas de cadena pesada (SEC ID NO:25) y de cadena ligera (SEC ID NO: 53) (para secreción) se adicionaron corriente arriba de las secuencias de ADN de región variable anteriormente mencionadas. Corriente debajo d'e las regiones variables, la región constante de IgGl humano para la cadena pesada y para la revisión constante kappa humana para la cadena ligera, respectivamente, se adicionaron utilizando técnicas de biología molecular estándar. Las secuencias de ADN de cadena pesada y ligera de anticuerpo humanizados de longitud completa se subclonaron en vectores dé expresión de mamífero (uno para la cadena ligera y uno para la cadena pesada) bajo el control del promotor MPSV y corriente arriba de un sitio poliA sintético, llevando cada sector una secuencia EBV OriP. Se produjeron anticuerpos cotransfectando células HEK293-EBNA con los vectores de expresión de cadena ligera y pesada de anticuerpos de mamífero utilizando un enfoque de transfección mediante fosfato de calcio. Las células HEK293-EBNA de crecimiento exponencial fueron transfectadas mediante el método del fosfato de calcio. Las células se cultivaron como cultivos monocapa adherentes en frascos T mediante la utilización de un medio de cultivo DMEM complementado con FCS al 10%, y se transfectaron cuando presentaron una confluencia entre 50 y 80%. Para la transfección de un frasco T75, se sembraron 8 millones de células 24 horas antes de la transfección en un medio de cultivo de 14 ml DMEM complementado con FCS (con una concentración final volumen/volumen del 10%), 250 µg/ml de neomicina, y las células se colocaron a 37°C en una incubadora bajo una atmósfera de 5% de C02 durante la noche. Para cada frasco T75 a transfectarse, se preparó una solución de ADN, CaCl2 y agua, mediante el mezclado de 47 µg total ADN de vector plásmido dividido igualmente entre los vectores de expresión de cadena pesada y ligera, 235 µl de una solución de CaCl2 1 M, y adicionándose agua hasta un volumen final µl. A esta solución se adicionarde 469on 469 µl de HEPES 50mM, NaCl 280 mM, una solución de Na2HP04 1.5 mM a pH 7.05, se mezcló inmediatamente durante 10 seg y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 20 seg. La suspensión fue diluida con 12 ml de DMEM complementado con FCS al 2%, y se adicionó al T75 en lugar del medio existente. Las células fueron incubadas a 37 °C, 5% C02 durante aproximadamente 17 a 20 horas, seguidamente se reemplazó el medio con 12 ml de DMEM, FCS al 10%. El medio de cultivo condicionado fue cosechado a los 5 a 7 días después de la transfección, centrifugado durante cinco minutos a 1.200 rpm, seguido por una segunda centrifugación durante diez minutos a 4.000 rpm y mantenido a 4°C. Los anticuerpos secretados fueron purificados mediante cromatografía de afinidad con Proteína A, seguido por cromatografía de intercambio de iones y un paso final de cromatografía de exclusión de tamaños sobre una columna Superdex 200 (Amersham Pharmacia) que intercambiaba el tapón por solución salina de regulador de pH fosfato y se recolectaba los anticuerpos IgGl monoméricos puros. Se estimó la concentración de anticuerpos utilizando un espectrofotómetro a partir de una absorción a 280 nm. Los anticuerpos se formularon en una solución de fosfato de potasio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, glicina 100 mM, con un pH 6.7. E . Glicoingenieria de anticuerpos humanizados La glicoingeniería de las variantes humanizadas fue llevado a cabo por cotransfección en células de mamífero de los vectores de expresión de anticuerpo junto con un vector de expresión GnT-III glicosiltransferasa, o junto con un vector de expresión de GnT-III más un vector de expresión de manosidasa II en el Golgi. El polipéptido que tiene actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización en el Golgi de un polipéptidos heterólogos residentes en el Golgi preparado de acuerdo con los métodos enseñados en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos. Publ. No. 20040241817 Al, cuyo contenido se incorpora en la presente en su totalidad a título de referencia. Los anticuerpos glicodiseñados se purificaron y formularon como anteriormente descrito para los anticuerpos no glicodiseñados. Los oligosacáridos unidos a la región Fe de los anticuerpos fueron analizados mediante MALDI/TOF-MS, como se describe más adelante. La metodología de glicoingeniería que puede utilizarse con las ABM de la presente invención han sido descritos con mayor detalle en la Patente de los Estados Unidos No. 6,602,684 y en la Solicitud Provisoria de Patente de los Estados Unidos No. 60/441,307 y en el documento WO 2004/065540, la totalidad del contenido de cada uno de los cuales se incorpora en la presente a título de referencia. Los ABM glicodiseñados de la presente invención tienen reducidas cantidades de residuos fucosa en la región Fe región. Los ABM de la presente invención también pueden ser glicodiseñados de manera tener reducidos residuos fucosa en la región Fe de acuerdo con las técnicas reveladas en el documento EP 1 176 195 Al, la totalidad de cuyo contenido se incorpora en la presente a título de referencia.

EJEMPLO 2 Materiales y métodos A. Análisis de oligosacáridos 1. Método de liberación de oligosacáridos para anticuerpos en solución Se mezclaron entre 40 y 50 µg de anticuerpo con 2.5 mU de PNGaseF (Glyko, EE. UU . ) en Tris 2 mM, pH7.0 en un volumen final de 25 microlitros, y la mezcla se incubó durante tres horas a 37°C. 2. Preparación de la muestra para MALDI/TOF-MS Los digestos enzimáticos que contenían los oligosacáridos liberados fueron sometidos a incubación durante otras tres horas a temperatura ambiente después de la adición de ácido acético hasta una concentración final de 150 mM, y se hicieron pasar subsiguientemente a través de 0.6 ml de resina intercambiadora de cationes (resina AG50W-X8, forma de hidrógeno, malla 100-200, BioRad, Suiza) empacados en una columna de cromatografía micro-bio-spin (BioRad, Suiza) a eifectos de remover los cationes y las proteínas. Se aplicó 1 míicrolitro de la muestra resultante a una placa objetivo de acero inoxidable, y se mezcló con 1 µl de matriz DHB. La matriz de DHB se preparó disolviendo 2 mg de ácido 2,5-dihidroxibenzoico más 0.1 mg de ácido 5-metoxisalicílico en 1 ml de solución acuosa de etanol/cloruro de sodio 10 mM 1:1 (v/v). Las muestras se secaron al aire, se aplicó 0.2 µl de etanol, y se dejó finalmente que las muestras se recristalizaran bajo el aire. 3. MALDI/TOF-MS El espectrómetro de masa MALDI-TOF utilizado para adquirir los espectros de masa era un Voyager Élite (Perspective Biosystems). El instrumento se operó en la configuración lineal, con una aceleración de 20kV y un retardo de 80 ns . Se utilizó una calibración externa con normas de oligosacáridos para la asignación de masas de los iones. Los espectros de 200 disparos de láser fueron sumados de manera de obtener el espectro final. En la Figura 8 se muestra un espectro típico. B . Ensayo de unión de antigeno Las variantes de anticuerpo humanizadas, purificadas, monoméricas fueron sometidos a ensayo a efecto de establecer su unión al antígeno HMW-MAA/MCSP humano en la línea de células de melanoma humano A375, para lo cual se utilizó un ensayo basado en citometría de flujo. 200.000 células (en 180 µl de regulador de pH FACS (PBS que contenía 2% FCS y 5mM EDTA) fueron transferidas a tubos de poliestireno de 5 ml y se adicionaron 20 µl de muestras de anticuerpo anti-CSP con una concentración del décuplo (anticuerpo primario) (concentración final 1-5000 ng/ml) o PBS solamente. Después de una mezcla suave de las muestras, los tubos fueron sometidos a incubación a 4°C durante 30 minutos. Posteriormente, las muestras se lavaron dos veces con regulador de pH FACS buffer y se formaron comprimidos de 300 g durante 3 min. El material sobrenadante se retiró por aspiración, y las células fueron recolectadas en 50 µl de regulador de pH FACS, y se adicionó 2 µl de fragmentos de anticuerpo secundario (anti-Fc-específico F(ab')2-FITC (Jackson Immuno Research Laboratories, USA)), y los tubos fueron sometidos a incubación a 4°C durante 30 min. Las muestras fueron lavadas dos veces con regulador de pH FACS y recolectadas en 500 µl de regulador de pH FACS para su análisis mediante citometría de flujo. Se determinó la unión mediante el trazado de la fluorescencia media geométrica en función de las concentraciones de anticuerpo. C . Ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) como células efectoras, y se las preparó utilizando Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 USA), siguiéndose esencialmente las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, se extrajo sangre venosa con jeringas heparinizadas de donantes voluntarios sanos. La sangre se diluyó a 1:0,75-1,3 con PBS (que no contenía Ca++ ni Mg++) y se aplicó estratificadamente sobre Histopaque-1077. Se centrifugó el gradiente a 400 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente sin interrupciones.

La interfaz que contenía el PBMC se recolectó y lavó con PBS (50 ml de células a partir de dos gradientes), y se cosechó por centrifugación a 300 x g durante 10 minutes a temperatura ambiente. Después de la resuspensión de las pellas con PBS, se contaron los PBMC y se los lavó una segunda vez por centrifugación a 200 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron seguidamente suspendidas en el medio apropiado para los procedimientos subsiguientes. La relación entre efector y objetivo utilizada para los ensayos de ADCC era DE 100:1 y de 25:1 para las células PBMC. Las células efectoras fueron preparadas en un medio AIM-V bajo la concentración adecuada a efectos de agregar 50 µl por cavidad de fondo redondo de placas de 96 cavidades. Un conjunto de células objetivo eran células MCSP humanas derivadas de pacientes con melanoma (por ejemplo, A375, AÍ2058, o SK-Mel5) cultivados en DMEM que contiene 10% de FCS. Otro conjunto de células objetivo, que deberían ser un modelo para los pericitos, eran células de músculo liso aórtico humano, denominados HuSMC (provistos por Promocell, Heidelberg, Alemania) . Las células de HuSMC se cultivan en un medio provisto por Promocell. Las células objetivo fueron lavadas en PBS, contadas y vueltas en suspender en AIM-V a razón de 0.3 millones por ml a efectos de adicionar 30.000 células en 100 µl por microcavidad. Los anticuerpos se diluyeron en AIM-V, se adicionaron en 50 µl a células objetivo pre-aplicadas sobre las placas, y se las dejó ligarse a los objetivos durante diez minutos a temperatura ambiente. Seguidamente se agregaron las células efectoras, y la placa fue sometida a incubación durante la noche, y durante cuatro horas, para las células de melanoma y el HuSMC, respectivamente, a 37°C en una atmósfera humedecida que contenía 5% de C02. La muerte de las células fue evaluada mediante medición de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) desde las células dañadas mediante el kit de detección de citotoxicidad (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suiza). Después de la incubación de cuatro horas, las placas fueron sometidas a centrifugación a 800 x g. Se transfirieron 100 µl de material sobrenadante desde cada cavidad, a una placa de 96 cavidades de fondo plano, transparente. Se adicionaron 100 µl de regulador de pH sustrato de color proveniente del kit, én cada una de las cavidades. Se determinaron los valores Vmáx de la reacción de color mediante una lectora ELISA a 490 nm durante los primeros diez minutos utilizándose un software SiOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA) . Se midió la liberación espontánea a partir de cavidades que contenían solamente células blancas y efectoras pero no anticuerpos. Se determinó la liberación máxima a partir de cavidades que contenía solamente células objetivo y 1% Tritón X-100. El porcentaje de la mortandad específica mediada por anticuerpo se calculó como sigue: ( (x - SR) / (MR - SR)*100, siendo x el valor medio de Vmáx con una concentración específica de anticuerpos, SR es la media de Vmáx de la liberación espontánea, y MR es la media de Vmáx de la liberación máxima. D. Resultados y Discusión Los tres construcciones iniciales de cadena pesada; M-HHA, M-HHB, y M-HHC, como también los tres construcciones iniciales de cadena ligera M-KV1, M-KV2, y M-KV3 fueron sometidos a ensayo a efectos de establecer sus propiedades de unión con respecto a su antígeno cognato, MCSP. Para ello, las construcciones de cadena pesado humanizados fueron coexpresados con la cadena ligera de murino (mVL) , y las cadenas ligeras humanizadas fueron coexpresadas con la cadena pesada murina (mVH) . Los resultados se muestran en la Figura 1, que muestra que los dos construcciones de cadena pesada M-H'HA y M-HHB, retienen más o menos sus propiedades de unión cuando se los combina con el VL murino. En cambio, la construcción M-HHC pierde de manera significativa su potencial ligante. El M-HHC difiere del M-HHB solamente en los dos cambios Gly49Ala, y Glu50Asn. Ya que la alanina en la posición 49 es realmente el murino, la asparagina en la posición 50 está estrictamente prohibida. Por ello, el glutamato 50 murino se mantuvo en todas las otras variantes. Esto significa que la estructura de IGHV3-15 satisface todos los requisitos para residuos canónicos y para otros residuos clave (obsérvese que la posición 50 es parte del CDR2 de Kabat) . Las construcciones de cadena ligera humanizados M-KV1 y, M-KV2 muestran una actividad ligante fuertemente disminuida en comparación con su contraparte murina, si bien la construcción M-KV3 muestra un comportamiento del unión similar a la cadena ligera murina. Esto significa que las mutaciones Ile21Val, Leu46Pro, Ile48Leu, y Tyr49Phe han restaurado la unión de la variante M-KV2 previamente inactiva. O bien algunos de estos residuos aminoácidos trabajan de manera sinergista, o bien un solo residuo es responsable por la totalidad el efecto. La Figura 2 muestra los datos de unión de las construcciones "de baja homología" M-HLA, M-HLB, y M-HLC combinados con la construcción de cadena ligera M-KV3. Obviamente, la unión de estas tres variantes se ha abolido pior completo, lo cual lleva a la conclusión que uno o más de los residuos clave (los canónicos incluidos) no se satisfacen en las construcciones VH humanizados. Ya que se espera que los residuos 27 y 30 son responsables de alguna "sintonía f;ina" de la actividad ligante en lugar de abolir las propiedades gigantes por completo, se espera que los residuos importantes estén situados en la estructura 3. Dos candidatos obvios parecen ser Thr93, y Ser94 de la secuencia 225.28S. Si se utiliza la secuencia IGHV1-58 FR3, entonces Ala93 y Ala94 serían los residuos putativamente responsables de disminuir la actividad ligante del antígeno. La influencia de los otros residuos no puede descartarse, pero parecía más bien improbable sobre la base del análisis estadístico como también del análisis del modelo molecular de la estructura 3D del anticuerpo 225.28S. En la Figura 7 se muestra un soporte de la importancia de los residuos 27 y 30, ya que el constructor M-HLD ha recuperado alguna actividad ligante residual, lo cual indica que la introducción de los residuos Phe27 y Ser30 puede influir sobre el comportamiento ligante. A efectos de señalar los residuos clave de la cadena ligera, se generan las construcciones M-KV4, 5, 6, 7, 8, y 9. El M-KV4 remueve una retromutación de M-KV3 (Val21Ile) . M-KV5 utiliza un nuevo FR2 (IGKV2-28; Acc. No. X63397), que tiene Gln42 y Ser43 que se presenta naturalmente, como también Gln45 que es (hasta cierto punto) similar al Glu45 murino. M-KV6 tiene la secuencia IGKV2D-30 (Acc. No. X63402) FR2. M-KV7 es el derivado Leu46Pro de la región FR2 de M-KVl (con lo que se introduce una retromutación en el FR2 ) . M-KV8 es la variante Tyr49Phe de la región FR2 de M-KVl (con lo cual se introduce otra retro mutación en el FR2 ) . El resultado de los datos delegación de estos constructores de cadena ligera, cuando se aparecían con lá cadena pesada M-HHB, se ilustra en la Figura 3. La construcción M-KV4 ha ganado afinidad con respecto a su antígeno en comparación con el anticuerpo ch-225.28S. Las construcciones M-KV5 y 6 no han recuperado sus propiedades funcionales lo cual indica que las mutaciones introducidas en ellos han sido irrelevantes. El anticuerpo M-KV7 mostró propiedades de unión tan buenas como las de la cadena ligera ch-225.28S, lo cual demuestra que fue necesaria una mutación de un solo punto (Leu46Pro) y suficiente para recuperar la actividad ligante completa del constructor de cadena ligera previamente inactiva M-KVl. A efectos de explorar la posibilidad de generar construcciones de estructura híbridos de las cadenas pesadas humanizadas, hemos reemplazado las regiones FRl y FR2 del M-HLB y M-HLC con la del IGHV3-15 (Acc. No. X92216) , obteniéndose las construcciones M-HLE1 y M-HLE2. Estos dos construcciones defieren solamente en el hecho que los residuos 61 a 64 (que son miembros del CDR2 tal como define Kabat, pero no tal como define Chothia) son de origen sea humano (M-HLE1) sea murino (M-HLE2). Estos construcciones nos iinformarían si los residuos clave para el fallo de las construcciones M-HLB y C estarían situados en el área FRl y FjR2, o, como se esperaba, en el área FR3. Las nuevas construcciones comprenderían regiones de estructura derivadas de las clases 1 y 3 de la familia VH . Por lo tanto, podría sµrgir una inestabilidad, si bien durante el análisis del modelo molecular 3D no pudieron identificarse fuentes obvias de esto. Al mismo tiempo, el FR3 de IGHV3-15 (que demostró ser funcional en el constructor M-HHB) se combinó con las regiones FRl y 2 de la secuencia IGHV3-7, lo cual conduce a las construcciones M-HLF y M-HLG. M-HLF tiene su CDRl completamente humanizado, y difiere de M-HLG solamente en la posición 31 y 35. M-HLG tiene la secuencia murina en estas posiciones. La Figure 4 muestra el resultado del experimento de unión de antígeno cuando se aparean las construcciones de cadena pesada M-HLE1, E2, F, y G con las construcciones de cadena ligera M-KV4. Las construcciones M-HLE1, y M-HLE2 muestra alguna unión residual, lo cual indica alguna mejora con respecto a su predecesor M-HLB y C. Aun así, esta unión está muy lejos de ser útil. La construcción M-HLF casi no tiene unión, que debería restaurarse mediante la introducción de las dos mutaciones Ser31Asn y Ser35Asn (M-HLG) . M-HLG mostró, de manera similar a M-HHB una afinidad igual o superior al antígeno que el anticuerpo progenitor ch-225.28S. Esto indica además la importancia de algunos residuos críticos en FR3 (posiciones 93 treonina y 94 serina, o treonina como anteriormente mencionado) . Si bien cabe poner alguna importancia sobre los residuos en FRl y 2 (por ejemplo, fenilalanina 27 o treonina 30), como demuestran las variantes M-HLE1 y 2. Finalmente, se generó la variante de cadena ligera M-KV9 mediante la introducción del FR2 de un anticuerpo de linea no germinal (Gen Bank Acc. No. AAA17574) en la construcción M-KV2. Este FR aceptor fue derivado de células B periféricas humanas (Weber y otros J Clin Invest. 93(5):2093-2105. (1994)). Este anticuerpo se reordena y deriva de la familia VK3. La cadena ligera fue coexpresada, sea con el M-HHB, sea con la cadena pesada M-HLG, y se ensayó su función ligante. El resultado de estos se muestra en la Figura 5. El M-KV9, junto con M-HLG muestra excelentes propiedades de unión, combinados con M-HHB, M-KV9 también muestra buenos datos de unión, si bien ligeramente reducidos en comparación con el ch-225.28S. La Figura 7 muestra que la remoción de los residuos raros dentro del CDRl y CDR2 de la cadena ligera no es factible, ya que las construcciones M-KV10 a 12 mostraron, todos ellos una actividad ligante de antígeno reducida. E. Análisis de los residuos "raros" Por definición, los residuos "raros" son aquellos que tienen lugar con una frecuencia igual o inferior al 1% en el conjunto correspondiente de secuencias de líneas germinales . En la secuencia 225.28S VH se encuentran dos residuos "raros": glicina 88 y serina 94. Glicina 88 puede reemplazarse con el residuo humano "frecuente" alanina. La serina, aparentemente puede reemplazarse por treonina, pero no por arginina ni alanina. Los datos tabulados acerca de residuos canónicos indicarían que la alanina y la arginina en la posición Kabat 94 conducirían a la misma configuración de bucle canónico en CDRl que cuando hay serina presente (http://www.rubic.rdg.ac.uk/abeng/canonicals.html) . Este punto de vista toma en cuenta solamente la estructura de bucle canónico, pero no la potencial intervención en la unión de antígeno observado para diferentes residuos canónicos, por ejemplo en la policía 94 (ver análisis de canónicos) . F. Resultados de experimentos de ADCC La Figura 6 muestra la eficacia del constructor M- HLG/M-KV9 humanizado del anticuerpo 225.28S en la matanza de células mediada por anticuerpo por medio de células PBMC humanas. Las células objetivación células A2058 humanas, y es pbsible observar un fuerte incremento en la matanza de células mediada por anticuerpo. Puede observarse el mismo efecto cuando se utilicen células de músculos lisos humanos Gomo células objetivo. Estas células son células primarias y no derivan de un tumor. Sirven como un modelo para el aipuntado de pericitos, ya que aquellas células de músculos lisos de un tipo de células precursora para los pericitos en la neovasculatura. Hay una diferencia notable entre estos experimentos. Las células de melanoma mostraron un mayor grado de resistencia con respecto a la matanza inducida por PBMC que las células de músculos lisos. Para esto, la incubación de los objetivos con el anticuerpo y los sectores e'ra de 24 horas, mientras que para las células de los músculos lisos se lograba la misma matanza dentro de 4 horas.

La matanza de las células de los músculos lisos, inducida por el anticuerpo, se muestra en la Figura 11. Para la línea de células de glioma, LN229, podía demostrarse claramente (Figura 2) que la glicoingeniería del anticuerpo anti-MCSP humanizado podía acrecentar fuertemente su potencia en la citotoxicidad celular mediada por anticuerpo (ADCC) . El anticuerpo no modificado mostró apenas alguna actividad, mientras que la versión G2 del mismo anticuerpo dio lugar a un incremento significativo de matanza de células objetivo. Esto demuestra que la glicoingeniería puede reforzar la potencia de anticuerpos que previamente mostraron una actividad no satisfactoria. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (193)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 5 1. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende : a. una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69; SEC ID N0:71; SEC ID NO: 73; SEC ID 0 NO : 75 ; y b. una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:77; SEC ID NO:79; SEC ID NO:81; SEC ID NO:83; SEC ID NO: 85; SEC ID NO: 87; SEC ID NO: 89; SEC ID NO: 91; y SEC 5 ID NO: 93; y c. SEC ID NO:95.
2. 2. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende _ a. una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 97; SEC ID NO: 99; y SEC ID NO: 101; y b. SEC ID NO:103 o SEC ID NO:105; y i c. SEC ID NO: 107.
3. 3. Un polinucleótido aislado de conformidad con 5 la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque codifica un polipéptido de fusión.
4. 4. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID No:3; SEC ID No:5; SEC ID No:7; SEC ID No:9; SEC ID No: 11; SEC ID No: 13; SEC ID No: 15; SEC ID No: 17; SEC ID No: 19; SEC ID No: 21; y SEC ID No: 23.
5. 5. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polinucleótido aislado comprende SEC ID NO: 23.
6. 6. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende SEC ID NO: 5.
7. 7. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende SEC ID NO: 3.
8. 8. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No:29, SEC ID No:31, y SEC ID No:33; SEC ID NO:35; SEC ID NO: 37; SEC ID NO: 39; SEC ID NO: 41; SEC ID NO: 43; SEC ID NO:45; SEC ID NO:47; SEC ID NO:49; SEC ID NO:51. :
9. 9. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende SEC ID NO: 45.
10. 10. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4 u 8, caracterizado porque codifica un pplipéptido de fusión.
11. 11. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende a) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 2; SEC ID No: 4; SEC ID No: 6; SEC ID No: 8; SEC ID No : 10; SEC ID ?o:12; SEC ID ?o:14; SEC ID ?o:16; SEC ID ?o:18; SEC ID ?o:20; SEC ID ?o:22; SEC ID ?o:24; y b)una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID ?O:28 SEC ID ?O:30, SEC ID ?O:32, SEC ID ?O:34 y SEC ID ?O:36; SEC ID ?O:38; SEC ID ?O:40; SEC ID ?O:42; SEC ID ?O:44; SEC ID ?O:46; SEC ID ?O:48; SEC ID ?O:50; SEC ID ?O:52.
12. 12. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID ?o:l; SEC ID ?o:3; SEC ID ?o:5; SEC ID ?o:7; SEC ID ?o:9; SEC ID ?o.ll; SEC ID ?o:13; SEC ID ?o:15; SEC ID ?o:17; SEC ID ?o:19; SEC ID ?o:21; y SEC ID ?o:23, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
13. 13. un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID ?O:27, SEC ID ?O:29, SEC ID ?O:31; SEC ID ?Ó:33; SEC ID ?O:35;. SEC ID ?O:37; SEC ID ?O:39; SEC ID ?O:41; Sal ID ?O:43; SEC ID ?O:45; SEC ID ?O:47; SEC ID NO: 49; y SEC ID NO: 51, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
14. 14. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 12 caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos un 85% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID No:l; SEC ID No: 3; SEC ID No: 5; SEC ID No: 7; SEC ID No: 9; SEC ID No: 11; SEC ID No: 13; SEC ID No: 15; SEC ID No: 17; SEC ID No: 19; SEC ID No:21; y SEC ID No:23, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
15. 15. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 13 caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos un 85% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:27, SEC ID NO:29, SEC ID NO:31; SEC ID NO:33; SEC ID NO: 35; SEC ID NO: 37; SEC ID NO: 39; SEC ID NO : 41 ; SEC ID NO: 43; SEC ID NO: 45; SEC ID NO: 47; SEC ID NO: 49; y SEC ID NO: 51, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
16. 16. Un polinucleótido aislado de conformidad con la r ivindicación 14 caracterizado porque comprende una siecuencia que tiene al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No:l; SEC ID No: 3; SEC ID No: 5; SEC ID No: 7; SEC ID No: 9; SEC ID No: 11; SEC ID No: 13; SEC ID No: 15; SEC ID No: 17; SEC ID No:19; SEC ID No: 21; y SEC ID No:23, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
17. 17. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 15 caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:27, SEC ID NO:29, SEC ID NO:31; SEC ID NO:33; SEC ID NO:35; SEC ID NO:37; SEC ID NO:39; SEC ID NO:41; SEC ID NO: 43; SEC ID NO: 45; SEC ID NO: 47; SEC ID NO: 49; y SEC ID NO: 51, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
18. 18. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 16 caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID No:l; SEC ID No: 3; SEC ID No: 5; SEC ID No : 7 ; SEC ID No: 9; SEC ID No: 11; SEC ID No: 13; SEC ID No: 15; SEC ID No: 17; SEC ID No: 19; SEC ID No: 21; y SEC ID No: 23, en donde el piolinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
19. 19. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 17 caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos un 95% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NQ:27, SEC ID NO:29, SEC ID NO:31; SEC ID NO:33; SEC ID NO:35; SEC ID NO: 37; SEC ID NO: 39; SEC ID NO: 41; SEC ID NO: 43; SEC ID NO:45; SEC ID NO:47; SEC ID NO:49; y SEC ID NO: 51, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
20. 20. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 18 caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos un 99% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID No:l; SEC ID No:3; SEC ID No:5; SEC ID No:7; SEC ID No:9; SEC ID No: 11; SEC ID No: 13; SEC ID No: 15; SEC ID No: 17; SEC ID No:19; SEC ID No:21; y SEC ID No:23, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
21. 21. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 19 caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos un 99% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:27, SEC ID NO:29, SEC ID NO:31; SEC ID NO:33; SEC ID NO:35; SÉC ID NO: 37; SEC ID NO: 39; SEC ID NO : 41 ; SEC ID NO: 43; SEC ID NO: 45; SEC ID NO: 7; SEC ID NO: 49; y SEC ID NO: 51, en donde el pplinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
22. 22. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende i a) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 2; SEC ID No : 4 ; SEC ID No: 6; SEC ID No: 8; SEC ID Nb:10; SEC ID No:12; SEC ID No:14; SEC ID No:16; SEC ID No:18; SEC ID No:20; SEC ID No:22; y SEC ID No:24; y b) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe del anticuerpo, o uno de sus fragmentos, de una especie distinta a una especie murina.
23. 23. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende a) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID No:28, SEC ID NO:30, SEC ID NO:32; SEC ID NO:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40; SEC ID NO:42; SEC ID NO: 46; SEC ID NO: 48; y SEC ID NO: 52; y b)una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de un dominio constante de la cadena ligera de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, de una especie distinta del ratón. 24. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada diel grupo que consiste en SEC ID No: 4; SEC ID No: 6; SEC ID N'o:8; SEC ID No:10; SEC ID No:12; SEC ID No:14; SEC ID No:16; SEC ID No:18; SEC ID No:20; SEC ID No:22; y SEC ID No:
24. 24.
25. 25. Un polinucleótido aislado caracterizado pprque codifica un polipéptido que está seleccionado del grupo que consiste en SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 32; SEC ID NQ:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40; SEC ID NO:42; SEC ID NO:46; SEC ID NO:48; y SEC ID NO:52.
26. 26. Un vector de expresión caracterizado porque comprende un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25.
27. 27. El vector de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque codifica al menos la cadena ligera o pesada de un anticuerpo.
28. 28. El vector de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el vector codifica tanto la cadena ligera como la cadena pesada de un anticuerpo.
29. 29. El vector de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque es un vector policistrónico.
30. 30. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26-28.
31. 31. Una célula huésped caracterizada porque comprende un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25.
32. 32. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4 u 8 caracterizado porque también comprende una secuencia que codifica una región constante de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo humano.
33. 33. Una célula huésped capaz de expresar un primer polinucleótido de conformidad con la reivindicación 12 y un segundo polinucleótido caracterizada porque comprende una secuencia que codifica la región variable de una cadena ligera de anticuerpos.
34. 34. Una célula huésped capaz de expresar un primer polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13 y un segundo polinucleótido caracterizada porque comprende una secuencia que codifica la región variable de una cadena pesada de un anticuerpo.
35. 35. Un polipéptido de fusión caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID No: 2; SEC ID No: 4; SEC ID No: 6; SEC ID No: 8; SEC ID No: 10; SEC ID No: 12; SEC ID No: 14; SEC ID No: 16; SEC ID No: 18; SEC ID No:20; SEC ID No:22; y SEC ID No:24, o una de sus variantes .
36. 36. Un polipéptido de fusión caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO:28; SEC ID NO:30, SEC ID NO:32; SEC ID NO:34; SEC ID NO:36; SEC ID NO:38; SEC ID NO:40; SEC ID NO:42; SEC 10 NO: 46; SEC ID NO: 48; y SEC ID NO: 52. o una de sus variantes .
37. 37. Una molécula de unión a antígeno caracterizada porque comprende el polipéptido de fusión de conformidad con lá reivindicación 35 o la reivindicación 36.
38. 38. Una molécula de unión a antígeno de conformidad cbn la reivindicación 37, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno se une selectivamente a MCSP humana.
39. \ 39. Una molécula de unión a antígeno caracterizada pprque comprende el polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 35 y el polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 36.
40. 40. La molécula de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-39, caracterizada porque es un anticuerpo.
41. 41. La molécula de unión a antigeno de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el anticuerpo es humanizado.
42. 42. La molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el anticuerpo es primatizado.
43. 43. La molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno es un fragmento de anticuerpo que comprende una región equivalente a la región Fe de un anticuerpo.
44. 44. La molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la molécula die unión a antígeno es un scFv, un diacuerpo, un tiiacuerpo, un fragmento de Fab o Fab2. i
45. 45. La molécula de unión a antígeno de conformidad Con la reivindicación 40, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo recombinante.
46. 46. La molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque el anticuerpo recombinante es humanizado.
47. 47. La molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el anticuerpo recombinante comprende una región Fe humana.
48. 48. La molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 47, en donde dicha región Fe humana es una región Fe de IgG humana.
49. 49. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-48, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno fue sometida a glucoingeniería para tener una región Fe con oligosacáridos modificados .
50. 50. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la región Fe fue modificada para tener una cantidad reducida de residuos de fucosa en comparación con la molécula de unión a antígeno no sometida a glucoingeniería.
51. 51. Una molécula de unión a antígeno de conformidad cpn la reivindicación 49, caracterizada porque la región Fe tiiene una mayor proporción de oligosacáridos bisectados en ciomparación con la molécula de unión a antigeno no sometida a glucoingeniería .
52. 52. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque los oligosacáridos bisectados son un complejo predominantemente bisectado.
53. 53. Una molécula de unión a antigeno de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque las moléculas de unión a antígeno sometidas a glucoingeniería tienen una mayor proporción de oligosacáridos no fucosilados bisectados en la región Fe de la molécula de unión a antígeno en comparación con la molécula de unión a antígeno no sometida a glucoingeniería.
54. 54. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque el anticuerpo sometido a glucoingeniería tiene una mayor relación de residuos GlcNAc a residuos de fucosa en la región Fe en comparación con la molécula de unión a antígeno no sometida a glucoingeniería.
55. 55. Una molécula de unión a antígeno de conformidad cpn la reivindicación 53, caracterizada porque los oiigosacáridos no fucosilados bísectados son predominantemente formas híbridas.
56. 56. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque los oligosacáridos no fucosilados bisectados son predominantemente formas complejas.
57. 57. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque al menos el 20% de los oligosacáridos en la región Fe son no fucosilados, bisectados.
58. 58. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos el 30% de los oligosacáridos en la región Fe son no fucosilados, bisectados .
59. 59. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque al menos el 35% de los oligosacáridos en la región Fe son no fucosilados, bisectados .
60. 60. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque al menos el 40% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son no fucosilados, bisectados.
61. 61. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque al menos el 50% de los oligosacáridos en la región Fe son bisectados.
62. 62. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque al menos el 60% de los oligosacáridos en la región Fe son bisectados.
63. 63. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada porque al menos el 70% de los oligosacáridos en la región Fe son bisectados.
64. 64. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque al menos el 80% de los oligosacáridos en la región Fe son bisectados.
65. 65. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada porque al menos el 90% de los oligosacáridos en la región Fe son bisectados.
66. 66. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque al menos el 50% de los oligosacáridos en la región Fe son no fucosilados.
67. 67. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada porque al menos el 60% de los oligosacáridos en la región Fe son no fucosilados.
68. 68. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque al menos el 70% de los oligosacáridos en la región Fe son no fucosilados.
69. 69. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque al menos el 75% de los oligosacáridos en la región Fe son no fucosilados.
70. 70. Un método para producir una molécula de unión a antígeno capaz de competir con el anticuerpo monoclonal 225.28S murino por unión a MCSP humana, caracterizado porque Comprende a) cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 30 o la reivindicación 31 en condiciones que permitan la expresión de dicho polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno; y b) recuperar la molécula de unión a antígeno.
71. 71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo.
72. 72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo humanizado.
73. 73. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una molécula de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-69 y un portador farmacéuticamente aceptable.
74. 74. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque la composición también comprende un coadyuvante.
75. 75. El método para identificar células que expresan MCSP en una muestra caracterizado porque comprende administrar a dicha muestra una molécula de unión a antígeno d'e conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-69.
76. 76. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la identificación está destinada a fines diagnósticos. i
77. 77. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la identificación está destinada a fines terapéuticos.
78. 78. Un método para tratar un trastorno de proliferación de célula mediado por MCSP en un sujeto en la necesidad del mismo caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de conformidad con la reivindicación 73 o la reivindicación 74 al sujeto.
79. 79. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el sujeto es un ser humano.
80. 80. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el tratamiento comprende bloquear interacciones mediadas por MSCP seleccionadas del grupo que consiste de: unión de ligando MCSP, adhesión celular de melanoma, activación de pericito, respuestas quimiotácticas a fibronectina, expansión celular en proteínas ECM, transducción de señal FAK y transducción de señal ERK.
81. 81. Una célula huésped sometida a glucoingeniería para expresar al menos un ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que tiene actividad de ß(l,4)-N-ácetilglucosaminiltransferasa III en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe de un segundo polipéptido producido por la célula huésped, caracterizada porque el segundo polipéptido es una molécula de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-69.
82. 82. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque la célula huésped también expresa un polipéptido que tiene actividad de manosidasa II.
83. 83. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque el primer polipéptido también comprende el dominio de localización de un polipéptido residente en el Golgi.
84. 84. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo recombinante.
85. 85. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno es un fragmento de anticuerpo.
86. 86. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno comprende la región Fe de una IgG humana o una región equivalente a la región Fe de una IgG humana.
87. 87. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno producida por dicha célula huésped exhibe un aumento de la afinidad de unión al rieceptor Fe en comparación con la molécula de unión a antígeno producida por la célula huésped no sometida a' glucoingeniería.
88. 88. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque la molécula de unión a ahtígeno producido por dicha célula huésped exhibe un aumento de la función efectora en comparación con la molécula de unión a antígeno producido por la célula huésped no sometida a glucoingeniería.
89. 89. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 83, caracterizada porque el primer polipéptido comprende el dominio catalítico de ß(l,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III .
90. 90. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 83, caracterizada porque el primer polipéptido también comprende el dominio de localización en el Golgi de un polipéptido heterólogo residente en el Golgi.
91. 91. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 90, caracterizada porque el dominio de localización en el Golgi es el dominio de localización de manosidasa II.
92. 92. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 90, caracterizada porque el dominio de localización en el Golgi es el dominio de localización de ß'(l, 2 ) -Nacetilglucosammiltransferasa I .
93. 93. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 90, caracterizada porque el dominio de localización en el Golgi es el dominio de localización de ß ( 1 , 2 ) -Nacet i lglucosaminil trans ferasa IJ .
94. 94. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 90, caracterizada porque el dominio de localización en el Golgi es el dominio de localización de manosidasa I.
95. 95. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 90, caracterizada porque el dominio de localización en el Golgi es el dominio de localización de al-6 fucosiltransferasa nuclear.
96. 96. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque el aumento de la función efectora es una mayor citotoxicidad celular mediada por Fe.
97. 97. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la unión a células NK.
98. 98. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la unión a macrófagos.
99. 99. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la unión a células piolimorfonucleares . i
100. 100. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la unión a monocitos.
101. 101. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de las señales directas inductoras de apoptosis.
102. 102. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la maduración de células dendríticas .
103. 103. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento del cebado de células T.
104. 104. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 87, caracterizada porque el receptor Fe es un receptor activador de Fcy.
105. 105. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 87, caracterizada porque el receptor Fe es un receptor de FcyRIIIA.
106. 106. Una célula huésped de conformidad con la riei vindicación 81, caracterizada porque es una célula HEK293-EBNA, una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula de mieloma de ratón P3X63, una célula PER, una célula PER.C6 o una célula de hibridoma.
107. 107. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque al menos dicho ácido nµcleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de ß'(l,4)- N-acetilglucosaminiltransferasa III está operativamente ligado a un elemento promotor constitutivo.
108. 108. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque el polipéptido que tiene actividad de ß ( 1 , 4 ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III es un polipéptido de fusión.
109. 109. Un método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el trastorno está seleccionada del grupo que consiste en: melanoma, glioma, cáncer de mama lobular, leucemia aguda o un tumor sólido que induce neovascularización de vasos sanguíneos.
110. 110. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende al menos una región determinante de complementariedad de un anticuerpo monoclonal murino 225.28S, una de sus variantes o formas truncadas que contienen al menos los residuos determinantes de especificidad para dicha región determinante de complementariedad, en donde el pblinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
111. 111. Un polinucleótido aislado de conformidad con lá reivindicación 110 caracterizado porque comprende al menos dos regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo monoclonal murino 225.28S, o una de sus variantes o formas truncadas que contienen al menos los residuos determinantes de especificidad para dicha región determinante de complementariedad.
112. 112. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 110 caracterizado porque comprende al menos tres regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo monoclonal murino 225.28S, o una de sus variantes o formas truncadas que contienen al menos los residuos determinantes de especificidad para dicha región determinante de complementariedad.
113. 113. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 110, caracterizado porque la región determinante de complementariedad está seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 61; SEC ID NO: 63; SEC ID NO: 65; SEC ID NO: 67; SEC ID NO: 69; SEC ID NO:71; SEC ID NO:73; SEC ID NO:75; SEC ID NO:77; SEC ID NO:79; SEC ID NO:81; SEC ID NO:83; SEC ID NO: 85; SEC ID NO: 87; SEC ID NO: 89; SEC ID NO: 91; SEC ID NO:93; y SEC ID NO:95. :
114. 114. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 110, caracterizado porque la región determinante de complementariedad está seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 97, SEC ID NO: 99, SEC ID NO: 101; SEC ID NO: 103; SEC ID NO: 105; SEC ID NO: 107.
115. 115. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 110, caracterizado porque el polipéptido de fusión codifica una molécula de unión a antígeno.
116. 116. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque las regiones determinantes de complementariedad comprenden al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 61; SEC ID NO: 63; SEC ID NO: 65 SEC ID NO: 67; SEC ID NO: 69; SEC ID NO: 71; SEC ID NO: 73 SEC ID NO: 75; SEC ID NO: 77; SEC ID NO: 79; SEC ID NO: 81, SEC ID NO: 83; SEC ID NO: 85; SEC ID NO: 87; SEC ID NO: 89, SEC ID NO: 91; SEC ID NO: 93; y SEC ID NO: 95; y al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 97, SEC ID NO: 99, SEC ID NO: 101; SEC ID NO: 103; SEC ID NO: 105; SEC ID NO: 107, O variantes o formas truncadas de dichas secuencias que contienen al menos los residuos determinantes de especificidad para cada una de dichas regiones determinantes de complementariedad .
117. 117. Un polipéptido aislado, caracterizado porque es codificado por los polinucleótidos aislados de acuerdo con una de las reivindicaciones 110-116.
118. 118. Una molécula de unión a antígeno caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con la reivindicación 117.
119. 119. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 118, caracterizada porque comprende la región variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpos.
120. 120. Una molécula de unión a antígeno de conformidad cpn la reivindicación 118, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo quimérico o humanizado .
121. 121. Un método para producir una molécula de unión a antígeno que tiene oligosacáridos modificados en una célula huésped, caracterizado porque comprende: a. cultivar una célula huésped sometida a glucoingeniería para expresar al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de ß(l,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III en condiciones que permiten la producción de la molécula de unión a antígeno, y que permiten la modificación de los oligosacáridos presentes en la región Fe de la molécula de unión a antígeno; y b. aislar la molécula de unión a antígeno, en donde la molécula de unión a antígeno es capaz de competir con el anticuerpo monoclonal 225.28S murino por la unión a MCSP y caracterizada porque la molécula de unión a antígeno o su fragmento es quimérica o humanizada.
122. 122. Un método de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado porque los oligosacáridos modificados tiienen una reducida proporción de residuos de fucosa en cpmparación con los oligosacáridos de la molécula de unión a ahtígeno no sometida a glucoingeniería.
123. 123. Un método de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado porque los oligosacáridos modificados son predominantemente formas híbridas.
124. 124. Un método de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado porque los oligosacáridos modificados son predominantemente formas complejas. 1
125. 125. Un método de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado porque el anticuerpo recombinante o su fragmento producido por dicha célula huésped tiene una mayor proporción de oligosacáridos no fucosilados bisectados en la región Fe de dicho polipéptido en comparación con la molécula de unión a antígeno producida por la célula no sometida a glucoingeniería.
126. 126. Un método de conformidad con la reivindicación 125, caracterizado porque los oligosacáridos no fucosilados bisectados son predominantemente formas híbridas.
127. 127. Un método de conformidad con la reivindicación 125, caracterizado porque los oligosacáridos no fucosilados bisectados son p edominantemente formas complejas.
128. 128. Un método de conformidad con la reivindicación 125, caracterizado porque al menos el 20% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son no fúcosilados, bisectados.
129. 129. Un método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque al menos el 30% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son no fucosilados, bisectados.
130. 130. Un método de conformidad con la reivindicación 129, caracterizado porque al menos el 35% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son no fucosilados, bisectados.
131. 131. Una molécula de unión a antígeno caracterizada porque se somete a glucoingeniería para obtener un aumento de la función efectora producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-130.
132. 132. La molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 131, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo.
133. 133. Una molécula de unión a antígeno caracterizada porque se somete a glucoingeniería para tener mayor afinidad de unión al receptor Fe producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-130. i
134. 134. La molécula de unión a antígeno de conformidad cbn la reivindicación 133, caracterizada porque es un anticuerpo .
135. 135. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 131, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fe.
136. 136. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 131, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la unión a células NK.
137. 137. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 131, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la unión a macrófagos.
138. 138. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 131, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la unión a monocitos.
139. 139. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque el aumento de la función efectora es un aumento de la unión a células polimorfonucieares.
140. 140. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque el aumento de la función efectora es un aumento de señales directas inductoras de apoptosis.
141. 141. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 131, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la maduración de células dendríticas .
142. 142. Una molécula de unión a antígeno de con formidad con la reivindicación 131, caracterizada piorque el aumento de la función efectora es un aumento del cebado de células T.
143. 143. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 133, caracterizada porque el receptor Fe es el receptor activador de Fe.
144. 144. Una molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 133, caracterizada porque el receptor Fe es el receptor FcyRIIIa.
145. 145. Una molécula de unión a antígeno producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-130, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno es un fragmento de anticuerpo que contiene la región Fe y que está sometida a ingeniería para obtener un aumento de la función efectora.
146. 146. Una molécula de unión a antígeno producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-130, caracterizada porque es una proteína de fusión que incluye un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID No:2; SEC ID No:4; SEC ID No:6; SEC ID No : 8 ; SEC ID No:10; SEC ID No:12; SEC ID No:14; SEC ID No:16; SEC ID No:18; SEC ID No:20; SEC ID No:22; y SEC ID No:24; y una región equivalente a> la región Fe de una inmunoglobulina y sometida a ingeniería para obtener un aumento de la función efectora.
147. 147. Una molécula de unión a antígeno producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-130, caracterizada porque es una proteína de fusión que incluye un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:28, SEC ID NO:30, SEC ID NO:32, SEC ID NO: 34, SEC ID NO: 36; SEC ID NO: 38, SEC ID NO:40, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 44, SEC ID NO:46, SEC ID NO:48, SEC ID NO:50, y SEC ID N052, y una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y sometida a ingeniería para obtener un aumento de la función efectora.
148. 148. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la molécula de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 131-147 y un portador farmacéuticamente aceptable.
149. 149. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4 u 8, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión.
150. 150. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el tratamiento comprende la eliminación de células que expresan MCSP.
151. 151. El método de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado porque las células sobre expresan MCSP. i
152. 152. Un método de conformidad con la reivindicación 125, caracterizado porque al menos el 40% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son no fucosilados, bisectados.
153. 153. Un método de conformidad con la reivindicación 152, caracterizado porque al menos el 50% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son no fucosilados, bisectados.
154. 154. Un método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque al menos el 60% de los oiligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son no fucosilados, bisectados.
155. 155. Un método de conformidad con la reivindicación 154, caracterizado porque al menos el 70% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son no fucosilados, bisectados.
156. 156. Un método de conformidad con la reivindicación 155, caracterizado porque al menos el 80% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son no fucosilados, bisectados.
157. 157. Un método de conformidad con la reivindicación 156, caracterizado porque al menos el 90% de los oligosacáridos en la región Fe de dicho polipéptido son no fiucosilados, bisectados.
158. 158. Un método para inducir las lisis de per i ci tos en la neovasculatura de tumor en un sujeto en la necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto la molécula de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49-69.
159. 159. El método de conformidad con la reivindicación 158, caracterizado porque la neovasculatura no es neovasculatura de melanoma o neovasculatura de glioblastoma.
160. 160. El método de conformidad con la reivindicación 158, caracterizado porque la molécula de unión a antígeno se coadministra con otro agente anti-angiogénico.
161. 161. El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado porque el agente anti-angiogénico es un anticuerpo anti-VEGF-1.
162. 162. La molécula de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-69, 118-120, o 131-147 caracterizada por se usa como medicamento en el tratamiento de un trastorno de proliferación celular mediada por MCSP.
163. 163. La molécula de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 162, caracterizada porque el trastorno de proliferación celular mediada por MCSP está seleccionado del grupo que consiste en: melanoma, glioma, cáncer de mama lobular, leucemia aguda, o un tumor sólido que induce neovascularización de vasos sanguíneos.
164. 164. La molécula de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-69, 118-120 ó 131-147 caracterizada porque se usa como medicamento en la lisis de pericitos activados en la neovasculatura tumoral.
165. 165. La molécula de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-69, 118-120 ó 131-147 caracterizada para usarse como medicamento, en particular para usarse en el cáncer.
166. 166. Uso de la molécula de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-69, 118-120 ó 131-147 para la producción de un medicamento para el tratamiento o la prevención del cáncer.
167. 167. El uso de conformidad con la reivindicación 166, en donde la molécula de unión a antígeno se usa en una cantidad terapéuticamente efectiva de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg.
168. 168. El uso de conformidad con la reivindicación 167, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva varía de aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg.
169. 169. El uso de conformidad con la reivindicación 167, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva varía de aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 4.5 mg/kg.
170. 170. El uso de conformidad con la reivindicación 167, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva varía de aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg.
171. 171. El uso de conformidad con la reivindicación 1Í67, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva es de aproximadamente 1.5 mg/kg.
172. 172. El uso de conformidad con la reivindicación 167, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva es de aproximadamente 4.5 mg/kg.
173. 173. El uso de conformidad con la reivindicación 167, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva es de aproximadamente 12 mg/kg.
174. 174. Los nuevos compuestos, procesos, composiciones farmacéuticas, métodos y usos, caracterizados porque son tal como se describen en la presente.
175. 175. Una célula huésped caracterizada porque es sometida a glucoingeniería para expresar al menos una molécula de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: un polipéptido que tiene actividad de 13 (1, 4) -Nacetilglucosaminiltransferasa III; un polipéptido que tiene actividad de a-manosidasa II, y un polipéptido que tiene actividad de ß(l,4)-galactosiltransferasa, en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe de un segundo polipéptido producido por dicha célula huésped, caracterizado porque el segundo polipéptido es una molécula de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-69.
176. 176. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 175, caracterizada porque el primer polipéptido es un polipéptido que tiene actividad de ß(l,4)-Nacetilglucosaminiltransferasa III .
177. 177. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 175, caracterizada porque el primer polipéptido es un polipéptido que tiene actividad de a-manosidasa II.
178. 178. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 175, caracterizada porque el primer polipéptido es un polipéptido que tiene actividad de ß-(l,4)-galactosiltransferasa.
179. 179. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque también expresa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de a-manosidasa II.
180. 180. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 179, caracterizada porque también expresa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de ß- ( 1, 4 ) -galactosiltransferasa .
181. 181. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 175 o la reivindicación 176, caracterizada porque el primer polipéptido es un polipéptido de fusión caracterizado porque comprende el dominio de localización de un polipéptido heterólogo residente en el Golgi.
182. 182. La célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 175-181, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno producido por dicha célula huésped exhibe un aumento de la función efectora en comparación con la molécula de unión a antígeno producida por la célula huésped no sometida a glucoingeniería.
183. 183. La célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 175-181, caracterizada porque la molécula de unión a antígeno producida por dicha célula huésped exhibe un aumento de la afinidad de unión con el receptor Fe en comparación con la molécula de unión a antígeno producida por la célula huésped no sometida a glucoingeniería .
184. 184. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 182, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fe.
185. 185. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 182, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la unión a células NK.
186. 186. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 182, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la unión a macrófagos.
187. 187. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 182, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la unión a células polimorfonucleares .
188. 188. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 182, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la unión a monocitos.
189. 189. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 182, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de las señales directas inductoras de apoptosis.
190. 190. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 182, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento de la maduración de células dendríticas .
191. 191. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 182, caracterizada porque el aumento de la función efectora es un aumento del cebado de células T.
192. 192. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 183, caracterizada porque el receptor Fe es un receptor activador de Fcy.
193. 193. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 183, caracterizada porque el receptor Fe es un receptor de FcyRIIIA.