JPH07504802A - 遺伝子操作抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子操作抗体 本発明は、ヒト定常領域と、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（ＢＭＷ−ＭＡＡ）の 内部像（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｉｍａｇｅ）を抱える、可変領域とを含んで成る抗 イデイオタイプモノクローナル抗体、及びこの抗体の誘導体を考慮している。本 発明の抗体及びそれらの誘導体は診断、予防及び治療目的、例えば黒色腫の治療 に有用である。

発明の背景 黒色腫は皮膚、あまり頻繁ではないが粘膜の腫瘍であり、その一部は良性である 。悪性黒色腫は一般にメラノサイト（色素産生細胞）に由来する、時折り粘膜、 脈絡膜コート又は髄膜に由来する神経外胚葉起源の癌腫である。場所、蔓延の仕 方、及び転移の発生において異なるいくつかのタイプの悪性黒色腫がある。

黒色腫の慣用の処置には、外科、放射線又は化学治療、及び生物応答改善剤の適 用が含まれる。しかしながら、これらの方法は病気を打倒する、例えば腫瘍の再 発を防ぐことにとっては不十分であると実証されており、そして数多くのひどい 副作用によって複雑となっている。従って、これらの欠点を解消し、且つ慣用の 処置にとって代わる又は組合せて利用する治療的アプローチの開発が所望されて いる。

免疫系はこの疾患の病原にかなり関与しているようであるため、最も適切な処置 は、例えば特異的な抗イデイオタイプ抗体の適用に基づくような能動的な免疫療 法であろう。治療用途にとって特に注目されるのは、−次抗原を擬態し、そして それを代替しつる内部像タイプの抗イデイオタイプ抗体である。

腫瘍治療に関して、適当な抗イデイオタイプ抗体は腫瘍関連抗原に対して特異的 な抗体に対して高揚せしめたものである。黒色腫において、今までに同定された 関連抗原（ＭＡＡ）のうちの一つは＞　１．０００．０００の分子量を存する高 分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）である。ｌ（ＭＷ−ＭＡＡに対する 抗体に対して高揚せしめたネズミ抗イディオタイプモノクローナル抗体は欧州特 許出願Ｎｏ、　４２８．４８５号に開示されている。

ところで、診断及び治療剤としての前記ネズミ由来型抗イディオタイプモノクロ ーナル抗体の利用の主たる制約は、外来タンパク質としてのその免疫原性、循環 系の中でのそのやや長めの存続性、及び傷害性免疫複合体の形成にある。他方、 ヒトモノクローナル抗体による処置も、ヒトハイブリドーマ細胞系は調製するの が困難であり、一般に不安定であり、そして十分な量及び妥当な価格で適当な特 異性のモノクローナル抗体を産生じないことにより、制約されている。

従って、抗イデイオタイプ抗体であって、その用途が、所望されない抗−ネズミ イムノグロブリン免疫応答の誘発の危険性の低さを本質的に備えており、且つ例 えばイディオタイプ免疫応答、そしてそれ故内因性抗イディオタイプ抗体の産生 に影響を及ぼさないような抗イデイオタイプ抗体の要望がある。

発明の目的 本発明の目的はかかる抗体及びその製造方法の提供にある。本発明の抗体は、Ｈ ＭＷ−ＭＡＡの内部像を抱えるネズミ抗イディオタイプモノクローナル抗体を「 ヒト化」することにより獲得できる。

本発明の抗体は、診断、予防及び治療目的のために、例えば黒色腫の制御、予防 及び処置のために利用できつる。本発明の抗体は免疫抑制機能、例えば体液性及 び細胞性免疫の刺激化を有する。

本発明の別の目的は、本発明にかかわる抗体をエンコードする組換ＤＮＡ分子、 及びその製造方法の提供にある。

更に、本発明はかかる組換ＤＮＡ分子の発現にとって適当な発現系に関する。

発明の詳細 イムノグロブリン分子の可変領域及び各定常ドメインは自己スプライス部位を有 する別々のエクソンにおいてエンコードされる事実に基づき、組換ＤＮＡ技術を 、個々の部分のクローン化イムノグロブリン遺伝子を単離する及びイムノグロブ リンのその他の部分にそれらをリゲートするのに利用できつる。再構築した遺伝 子は適当な形質転換宿主により発現される。ネズミ抗体は、例えばネズミ定常領 域エクソンをヒトイムノグロブリン定常領域エクソンに交換することにより［ヒ ト化」抗体に変換することができ、それ故ネズミ抗体−結合部位及びヒト定常領 域を育するキメラ抗体を作ることができる。このキメラ抗体はネズミ可変領域に より決定される抗原特異性を有するが、しかし重鎮ポリペプチドのカルボキシ末 端定常領域セグメントにより決定されるヒトエフェクター機能（例えば補体結合 、食細胞の刺激、マスト細胞による顆粒放出の誘発）も示す。

より詳しくは、本発明は、ヒト定常領域と、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（、Ｈ ＭＷ−ＭＡＡ）上のエピトープの内部像である可変領域とを含んで成る抗イデイ オタイプモノクローナル抗体を考慮している。このことは、本発明の抗イデイオ タイプモノクローナル抗体（抗−ｉｄＭＡｂ）が、ヒト抗体より獲得されたもの である定常領域を存するか、又はこの定常領域のアミノ酸配列がヒト抗体の配列 に相同性であり、そして本発明の抗−ｉｄ　ＭＡｂが、Ｉ（ＭＷ−ＭＡＡ抗原に 対して特異的な（選択的結合性）抗体（−次Ａｂｓ−１）を認識するモノクロー ナル抗イデイオタイプ内部像抗体、例えばネズミ抗体から獲得されたものである 可変領域を存するか、又はその可変領域のアミノ酸配列がかかる抗−ｉｄ　ＭＡ ｂの配列に相同性であることを意味する。

抗イデイオタイプ抗体は、その他の抗体分子の可変領域に対して、即ち、特定の 抗体イディオタイプに対して特異的であり、そして免疫原として抗体を利用して 製造される。従って、抗イデイオタイプ抗体はＡｂ−２（抗体２）とよく呼ばれ ており、そして免疫用抗体はＡｂ−１と呼ばれている。この内部像タイプの抗イ デイオタイプ抗体は、この抗原に相補性である免疫用抗体（Ａｂ−１）上の抗原 −結合性構造との反応性を有しており、即ち、かかる抗体（Ａｂｓ−２）はこの 抗原の立体鏡像を示す。内部像抗体は、インビトロで、標的細胞に対する免疫用 抗体（Ａｂ−１）の結合を阻害し、そしてインビボで、抗原に対して特異的であ り、且つＡｂ−１と同−又は非常に類似の反応性パターンを有するＡｂ−３とも 呼ばれる抗−抗イデイオタイプ抗体を誘発する。

本発明により供される内部像タイプ抗体は、免疫用抗体により認識されるＢＭＷ −ＭＡＡの前記の決定基を擬態する。これらは免疫用抗−〇ＭＷ−ＭＡＡモノク ローナル抗体Ａｂ−１の抗原結合部位内のイデイオトーブを認識し、それ故１（ ＭＷ−ＭＡＡを発現する黒色腫細胞に対するＡｂｌの結合を阻害し、モしてＨＭ Ｗ−ＭＡＡと反応性である抗−抗イデイオタイプ抗体（Ａｂ−３）を誘発する。

免疫用抗−ＨＭＷ−ＭＡＡモノクローナル抗体（Ａｂ−１）　、例えばネズミモ ノクローナル抗体７６３．７４に対する本発明の抗体の特異性を、イムノアッセ イ、例えば結合アッセイにおいて試験し、これにおいては担体をＡｂ−１でコー トし、本発明のラベル化、例えば放射活性又は酵素ラベル化抗イデイオタイプモ ノクローナル抗体とインキュベートシ、次いで結合ラベルを検出する。本発明の 抗体が、免疫のために用いたモノクローナル抗体の抗原結合部位内のイデイオト ープを認識するかどうかを調べるため、ＨＭＷ−ＭＡＡを発現する黒色腫細胞に 対するＡｂｌの結合を阻害する能力を、例えばイムノアッセイで試験した。かか るイムノアッセイは競合放射性又は酵素イムノアッセイであってよく、ここでは ラベル化、例えば放射活性又は酵素ラベル化された免疫用抗−〇ＭＷ−ＭＡＡモ ノクローナル抗体を、本発明の対応の抗体とインキュベートし、その混合物をＨ ＭＷ−ＭＡＡ保有黒色腫細胞、例えば培養黒色腫細胞Ｃｏ１ｏ　３８に加え、次 いで更なるインキュベーションの後に結合ラベルを測定する。本発明の抗体が内 部像タイプであるかを確認するため、それらが、ＢＭＷ−ＭＡＡと反応性であり 、且つＡｂｌと同一の反応性パターンを示す抗−抗イデイオタイプ抗体を誘発で きるかどうかを調べた。抗−抗イデイオタイプ抗体の誘発は動物モデル、例えば マウスで実施できつる。作製された抗−抗イデイオタイプ抗体を例えばＢＭＷ− ＭＡＡに対するその特異性について、例えばＨＭＷ−ＭＡＡ保有黒色腫細胞に対 するその結合性を調べるイムノアッセイにおいて、及びその細胞から免疫沈殿し た抗原の電気泳動分析、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（５ＯＳ−ＰＡＧＥ）において試験する。この抗−抗イデイオタイプ 抗体は作製のために用いた抗体とのその反応性についても試験されつる。

特に、本発明はヒト定常領域と、ＭＡｂ　７６３．７４と呼ぶモノクローナル抗 体及びその誘導体、又はＢＭＷ−ＭＡＡに対する結合についてＭＡｂ７６３、７ ４と競合することのできる任意の抗体により認識されるＨＭＷ−ＭＡＡ上の決定 基の内部像である可変領域とを含んで成る抗イデイオタイプモノクローナル抗体 を考慮する。このモノクローナル抗体ＭＡｂ　７６３．７４はＰ、　Ｇｉａｃｏ ｍｉｎｉら（Ｊ、　Ｉｍｏ＋ｕｎｏ１．１３５．６９６　（１９８５））に記載 しである。

かかる抗イデイオタイプ抗体の例は、ヒト定常領域と、ネズミモノクローナル抗 体より獲得できる可変領域とを含んで成る、ＭＫ２−２３と呼ぶキメラ抗体であ る。この抗イデイオタイプ抗体ＭＫ２−２３は７６３、７４と呼ばれるネズミモ ノクローナル抗体に対して高揚され、そしてこの抗体により認識される）ＩＭＷ −ＭＡＡ上の決定基の内部像である。

最も好ましいのは、軽鎖ヒト定常領域に、重鎮ヒト定常領域γ及びネズミ抗イデ ィオタイプモノクローナル抗体ＭＫ２−２３の可変領域を含んで成るＭＫ２−Ｃ Ｈγ１と呼ぶキメラ抗体、並びに抗体ＭＫ２−ＣＨγｌの誘導体、好ましくはフ ラグメント、例えばＰａｂ−、Ｆａｂ’−、Ｆ（ａｂ’）ｚ−及びＦｖ−フラグ メントである。この抗体Ｍに２−２３は、モノクローナル抗体７６３．４の特徴 を擬態する抗体（ＡＢｓ−３）を誘発することができる。

欧州特許出願に記載の抗体の「ヒト化」における別の技術は、ネズミ可変領域内 のその他の保存性の高めの領域、いわゆるフレームワーク領域（ＦＲｓ）の、ヒ ト抗体に由来する対応のフレームワーク領域との交換も行う。かかるヒト化抗体 において、ネズミ抗体より獲得される唯一の部分は、抗原に対する特別な特異性 を規定する超可変領域、いわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）である。

従って、本発明は、次式のポリペプチドＦＲ，−ＣＤＲＬ、Ｌ−ＰＲ，−ＣＤＲ ，、−ＰＲ，−ＣＤＲ，Ｌ−ＰＲ，（Ｉ　）（式中、ＰＲ，は１９〜２３個の天 然アミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＰＲ，は１３〜１７個の天然 アミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＰＲ，は３０〜３４個の天然ア ミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＰＲ，は７〜１１個の天然アミノ 酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＣＤＲｌＬはＳＥＱ　１０　ＮＯ：　 １のアミノ酸配列２２〜３６のポリペプチド残基であり、ＣＤＲｌＬはＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ　：　２のアミノ酸配列５２〜５８のポリペプチド残基であり、そし てＣＤＲ１，、はＳＥＱ　ｒＤＮＯ：３のアミノ酸配列９１〜９９のポリペプチ ド残基であり、そしてここでアミノ酸ＣｙｓはＳ−３架橋を形成している酸化状 態にあってよい）を含んで成る軽鎖可変領域を含んで成る、抗イデイオタイプモ ノクローナル抗体及びその誘導体に関する。これらの特定の相補性決定領域は、 Ａｒ　ｇ−Ａ　１ａ−Ｓｅｒ−Ｇ　１　ｕ−Ｓｅｒ−Ｖａ　１−Ｇ　１ｕ−Ｔｙ ｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ　（ＣＤＲ ＋Ｌ）、Ａｌａ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ　（ＣＤＲ ｔｈ）及びＧｉｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−１Ｇ１ｎ−Ｇｌｎ−５ｅ ｒ−Ａｒ　（ＣＤＲｓｔ、）である。

特に、本発明は、フレームワーク領域ＰＲ，，ＰＲ，、ＰＲ，及びＰＲ，のポリ ペプチド残基が、哺乳動物、特にネズミ又はヒトの抗体において好適に見い出せ るものである式Ｉの軽鎖可変領域を含んで成るモノクローナル抗体に関する。

好ましいのは、アミノ酸配列１〜２１　（ＰＲ＋）、３７〜５１　（ＰＲｌ）、 　５９〜９０　（ＦＲｓ）及び／又は１００〜ｔｏｅ　（ＦＲ４）内の任意的ｌ 又は数個、例えば１，２．３又は４個の単独のアミノ酸が別のアミノ酸により変 換されている、又は欠失しており、そしてアミノ酸ＣｙｓがＳ−８架橋を形成し ている酸化状態にあるＳＥＱ　１０　ＮＯ：　１のアミノ酸配列のポリペプチド を含んで成る軽鎖可変領域を存する本発明にかかわるモノクローナル抗体、特に 、アミノ酸ＣｙｓがＳ−３架橋を形成している酸化状態にあるＳＥＱ　１０　Ｎ Ｏ：　１のアミノ酸配列のペプチドを含んで成る軽鎖可変領域を有するキメラ抗 体及びその誘導体である。

例えば、フレームワーク領域内の疎水性アミノ酸は別のアミノ酸、好ましくはそ れも疎水性であるアミノ酸により置換されていてよく、２個のアミノ酸により置 換されていてよく、又は欠失していてよい。

同様に、フレームワーク領域内の親水性アミノ酸は別のアミノ酸、好ましくはそ れも親水性であるアミノ酸により置換されていてよく、２個のアミノ酸により置 換されていてよく、又は欠失していてよく、ここで、アミノ酸の置換は対応のフ レームワーク領域の水素結合構造を維持することが好ましい。

同様に、本発明の好適な抗イデイオタイプモノクローナル抗体は、次式のポリペ プチド ＰＲ，−ＣＤＲＬ、　、−ＰＲ，−ＣＤＲ，、−ＰＲ，−ＣＤＲ，□−ＦＲ＃　 （ｎ）（式中、ＰＲ，は２５〜２９個の天然アミノ酸を含んで成るポリペプチド 残基であり、ＰＲ，は１２〜１６個の天然アミノ酸を含んで成るポリペプチド残 基であり、ＰＲ，は３０〜３４個の天然アミノ酸を含んで成るポリペプチド残基 であり、ＰＲ，は６〜１０個の天然アミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であ り、ＣＤＲ、、はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３のアミノ酸配列２８〜３２のポリペ プチド残基であり、ＣＤＲ２ＨはＳＥＱ　［ＯＮｏ　：　３のアミノ酸配列４７ 〜６３のポリペプチド残基であり、そしてＣＤＲ５，ＩはＳＥＱ　ＩＤＮ０：３ のアミノ酸配列９６〜１０９のポリペプチド残基であり、そしてここでアミノ酸 ＣｙｓはＳ−８架橋を形成している酸化状態にあってよい）を含んで成る。これ らの特定の相補性決定領域は、５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＩＪｅｔ−Ｈｉｓ　（ ＣＤＲ＋ｘ）、Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｔ−Ｓｅｒ−Ａ ｓｎ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇ ＩＹ　（ＣＤＲＩＩＩ）及びＳｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ −）１ｉｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ　（Ｃ ＤＲｓ＋＋）である。

特に、本発明は、フレームワーク領域ＦＲ１，ＰＲ，、ＰＲ，及びＰＲ，のポリ ペプチド残基が、哺乳動物、特にネズミ又はヒトの抗体において好適に見い出せ るものである式■の軽鎖可変領域を含んで成るモノクローナル抗体に関する。

好ましいのは、アミノ酸配列１〜２７　（ＦＲｉ）、　３３〜４６　（ＦＲＹ） 、６４〜９５　（ＦＲ））及び／又は１１０〜１１７　（ＦＲＹ）内の任意的ｌ 又は数個、例えば１．　２．　３又は４個の単独のアミノ酸が別のアミノ酸によ り変換されている、又は欠失しており、そしてアミノ酸ＣｙｓがＳ−３架橋を形 成している酸化状態にあるＳＥＱ　１０　ＮＯ：　３のアミノ酸配列のポリペプ チドを含んで成る重鎮可変領域を有する本発明にかかわるモノクローナル抗体、 特に、アミノ酸ＣｙｓがＳ−８架橋を形成している酸化状態にあるＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：　３のアミノ酸配列のペプチドを含んで成る軽鎖可変領域を存するキメ ラ抗体及びその誘導体である。例えば、このフレームワーク領域内のアミノ酸は 軽鎖について詳しく記載した通り、その他のアミノ酸により置換又は欠失してい てよい。

軽鎖可変領域及び重鎮可変領域はそれぞれＳＥＱ　１０　ＮＯ：　１及びＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：　３に記載のアミノ酸配列のＮ末端においてアシル残基、例えば ホルミル又はアルカノイル、例えばバルミトイル、ミリストイル、又は低級アル カノイル、例えばアセチルもしくはプロピオニルを含んで成りつる。

抗体（イムノグロブリン、Ｉｇ）分子のクラスは重鎮領域により規定される。本 発明のモノクローナル抗体は任意のイムノグロブリンのクラス、即ち、ｒｇＡ、 ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭであってよい。抗イデイオタイプ抗体の異な るアイソタイプは異なる免疫−抑制作用を有しうるため、この抗イデイオタイプ ＭＡｂは適宜選ばれつる。本発明にかかわる好適なモノクローナル抗体は、軽鎖 ヒト定常領域に又はλ、特にヒト定常領域に、及び重鎮ヒト定常領域γｌ、γ２ ．γ３又はγ４、特にヒト定常領域γｌを含んで成るクラスＧのイムノグロブリ ンである。

本発明は、好適な意義を有する、例えばＳＥｏ　１０　ＮＯ：　ｌに示すアミノ 酸配列を有する式Ｉの軽鎖可変領域（ここで、そのアミノ酸ＣｙｓはＳ−８架橋 を形成している酸化状態にあってよい）、軽鎖ヒト定常領域に、好適な意義を有 する、例えばＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３に示すアミノ酸配列を有する式■の重鎮 可変領域（ここで、そのアミノ酸ＣｙｓはＳ−８架橋を形成している酸化状態に あってよい）、及び重鎖ヒト定常領域γ１を育する抗イデイオタイプモノクロー ナル抗体及びその誘導体を主に考慮する。

本発明の抗イデイオタイプモノクローナル抗体の誘導体は前記抗イデイオタイプ モノクローナル抗体の抗原特異性を有する。かかる誘導体の例は、抗イデイオタ イプモノクローナル抗体フラグメント、及び修飾、例えば化学修飾により本発明 の抗体又はそのフラグメントにより得られる任意の分子である。例えば、その意 図する用途に応じて、本発明の分子は吸着又は当業界に公知のカップリング技術 を利用して任意の様々な化合物の付加により修飾されてよく、これによりコンジ ュゲートが形成される。かかるフンシュゲートの例には、抗体又はそのフラグメ ントと、抗原性を高める化合物との、酵素との、蛍光マーカーとの、ケミルミネ ッセンスマーカーとの、金属キレートとの、アビジンとの、ビオチン等とのコン ジュゲート、又は放射性ラベル化抗体又はフラグメントが含まれる。

本発明の抗体フラグメントは例えば−価フラグメントＦａｂもしくはＦａｂ’、 二価フラグメントＦ（ａｂ’）ｚ又はＰｖフラグメントである。

本発明の抗体の抗原性を高める適当な化合物は例えば、カップリングのために有 用な自由アミノ基を有するリジンに富むタンパク質、特に高分子量タンパク質、 例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ　；　ＭＷ６６．２００）　、バチルス　スブ チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）由来のα−アミラーゼ（ＭＷ　 ５８．０００）又はキーホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ；　Ｍｗ　＞　 １，００ｏ、０Ｏｏ）であり、これらは大量に市販されている。

ブタチログプリン、毒素、例えばヘビー、コレラ−又はジフテリア−毒素、ヒト 血清アルブミン（ＩＳＡ）、β−２マイクログロブリン等も、抗原性を高める化 合物として利用できつる。その他の可能な化合物には多糖類、天然又は合成リボ 多糖類、合成ポリペプチド、例えばポリリシン、活性化膜、ラテックス粒子、細 菌、例えばサルモ旦菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）等が含まれる。フロインドアジ ュバント、任意的に殺傷されたミコバクテリア、例えばバチルス　カルメツチー ブニリン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕ６ｒｉｎ）　（ＢＣＧ） を更に含む油中水エマルションも利用できうる。抗原性を高める好適な化合物は ムラミルペプチド、特にムラミルペプチドＭＴＰ−ＰＨである。かかるムラミル ペプチド及びそのコンジュゲートは欧州特許出願０．００３．８３３及び０、６ ２５．４９５号に開示されている。その他の別の抗原性を高める化合物はみょう ばんである。

本発明の抗体コンジュゲートのために利用される酵素は例えば西洋ワサビペルオ キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース オキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリ ンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ又はグリコース−６− リン酸デヒドロゲナーゼである。

本発明の抗体又はフラグメントのコンジュゲートされた蛍光マーカーはフルオレ セイン、フルオロクローム、ローダミン等でありうる。

ケミルミネッセンスマーカーは例えばルミノールのアクリジニウムエステルであ る。

かかるコンジュゲートにおいて、この抗体又はフラグメントはそのコンシュゲー ジコンパ−トナーに直接、又はスペーサーもしくはリンカ−基を介して結合して いる。

金属キレートの例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、ジエチレントリ アミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、１．４．８．１１−テトラアザテトラデカン、１． ４，８．１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８゜１１−四酢酸、ｌ−オキ サ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢 酸等である。

本発明の放射性ラベル化抗体又はフラグメントは、例えば放射性ヨウ素（Ｉ″＄ Ｉ、Ｉ′ｓ■、１″’Ｉ）、重水素（’Ｈ）　、炭素（”Ｃ）、硫黄（”Ｓ）　 、イツトリウム（”Ｙ）　、テクネチウム（９１′″Ｔｃ）等を含む。

本発明は、本発明にかかわる抗体及びそのフラグメントの製造方法を更に考慮す る。

本発明にかかわる抗イデイオタイプモノクローナル抗体及びその誘導体は、本発 明のタンパク質を生産する以下に更に定義付けする適当な宿主細胞をインビトロ 又はインビボで増殖させ、そして所望するなら、所望のタンパク質を単離し、そ して任意的にその誘導体に変換せしめることを特徴とする、本質的に公知の方法 により製造される。本発明のタンパク質は、当業界において有用な任意の適当な 形質転換可能な宿主を、前記タンパク質の発現を可能にする条件のもとで培養し 、前記タンパク質を単離し、そして任意的にこの単離したタンパク質を、例えば タンパク質分解切断により、又は別の化合物、例えばタンパク質もしくは非タン パク質性分子の前記の通りによる付加により変改せしめることを含んで成る方法 により製造されうる。

適当な宿主細胞には、真核細胞、例えば動物細胞、植物細胞及び菌類、並びに原 核細胞、例えばダラム陽性菌及びグラム陰性菌、例えば大腸菌（）ｉ、　ｃｏｌ ｉ）が含まれる。好適な真核細胞は哺乳類起源の細胞及び酵母細胞である。

本明細書で用いているインビトロとは、生体外を意味し、それ故、例えば細胞培 養及び組織培養条件を含む。

例えば、インビトロでの哺乳細胞の増殖は、適当な培養培地、即ち、慣用の標準 培養培地、例えばダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＲＰＭＩ　１６ ４０培地であって、任意的に哺乳動物血清、例えば胎児牛血清、又は微量元素、 及び成長持続補助因子、例えば支持細胞、例えば正常マウス腹腔滲出細胞、牌臓 細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェ リン、低密度リポタンパク質、オレイン酸等の添加された培地の中で実施される 。

インビトロ生産は比較的純粋な抗体調製物を提供し、そして大量の所望の抗体を 供するためのスケールアップを可能にする。細菌細胞、酵母及び哺乳動物細胞の 培養についての技術は当業界に公知であり、そして例えばエアーリフトリアクタ ーの中での、もしくは連続スターラーリアクターの中での均質懸濁培養、又は例 えば中空ファイバー、マイクロカプセル中での、アガロースマイクロビーズもし くはセラミックカートリッジ上での固定型もしくは捕捉型細胞培養が含まれる。

本発明の大量の所望の抗イデイオタイプモノクローナル抗体は哺乳動物細胞をイ ンビトロで増殖させることによっても得られうる。

この目的のため、所望の抗体を生産するハイブリドーマ細胞を組織適合性哺乳動 物に注射して抗体生産性腫瘍の増殖を引き起こす。任意的に、これらの動物に炭 化水素、特に鉱物油、例えばブリスタン（テトラメチルペンタデカン）を注射の 前に服用させておく。１〜３週間後、これらの抗体をその動物の体液から単離す る。例えば、所望の抗体を生産するハイブリドーマ細胞系ｓｐ　２１０由来のト ランスフェクト細胞を、任意的にブリスタンで予備処置しておいたＢａ１ｂ／ｃ マウスに腹腔膜内的に注射し、次いで１〜２週間後、腹水をその動物から獲得す る。

この細胞上精液を、所望の抗イデイオタイプモノクローナル抗体について、主と して酵素イムノアッセイ、例えばサンドイッチアッセイもしくはドツトアッセイ 、又は放射性イムノアッセイによりスクリーンにかける。例えば、サンドイッチ 酵素イムノアッセイは適切に集成したイムノグロブリンが細胞上清液の中に存在 しているか否かを決定するために用いることができ、ここでは軽鎖ヒト定常領域 にもしくはλ（適宜）に特異的な抗体と、所望のサブクラスの重鎮ヒト定常領域 γに特異的な別の抗体を利用し、その一方は固相支持体にコートしておき、そし て他方は適当な酵素基質により検出を可能とする酵素にコンジュゲートしておく 。細胞上清液が所望の特異性の抗イデイオタイプ抗体を含むかどうかを決定する ため、固相支持体にコートされているイディオタイプ（Ａｂ−１）　、例えばモ ノクローナル抗体７６３．７４と、適当な軽鎖又は好ましくは重鎮定常領域に特 異的な酵素コンジュゲート化抗体を含んで成るサンドイッチ酵素イムノアッセイ が使用されつる。

抗イデイオタイプモノクローナル抗体の単離のため、培養上清液中又は腹水中の イムノグロブリンを、例えば硫酸アンモニウムによる沈殿、吸湿性材料、例えば ＰＥＧに対する透析、選択膜を介する濾過、等により濃縮してよい。必要ならば 、及び／又は所望するならば、それらの抗体を慣用のクロマトグラフィー法、例 えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィ ー又はアフィニティークロマトグラフィー、例えばイムノアフィニティークロマ トグラフィーにより精製する。好ましくは、この抗イデイオタイプモノクローナ ル抗体を、それらを含む細胞上清液から、例えばプロティン八によるアフィニテ ィークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び／又はゲル濾過を 含んで成る手順により単離する。

抗イデイオタイプモノクローナル抗体のフラグメント、例えばＦａｂ、　Ｆａｂ ’　又はＰ（ａｂ’）ｚフラグメントは、本質的に周知の方法により、例えばパ パインもしくはペプシンの如きの酵素による消化及び／又は化学還元によるジス ルフィド結合の切断により、又は組換ＤＮＡ技術により、上記の通りに製造され た抗体から得られつる。

高められた抗原性を有する本発明の抗イデイオタイプモノクローナル抗体誘導体 は、本発明の抗体又はフラグメントのその抗原性を高める化合物への吸着による 、又は化学結合コンジュゲートを供するカップリングのいづれかによる本質的に 周知な方法により製造される。本発明の抗体又はフラグメントと、上記の免疫原 化合物との、又は酵素とのコンジュゲートは、例えば上記の通りに調製した抗体 又はフラグメントを、免疫原化合物又は酵素と、カップリング剤、例えばグルタ ルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ、Ｎ’　−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ− （ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）−スクシニミド、Ｎ−（３−（２’−ピリ ジルジチオ）−ブロビオノキシ）−スクシニミド、Ｎ−エチル−Ｎ’　−（３− ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド等の存在下で反応させることにより 調製される。ビオチンとのコンジュゲートは、例えば抗体又はフラグメントをビ オチンの活性化エステル、例えばビオチンＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル と反応させることにより調製される。蛍光又はケミルミネッセントマーカーとの コンジュゲートはカップリング剤、例えば上記したものの存在下で、又はイソチ オシアネート、好ましくはフルオレセイン−イソチオシアネートとの反応により 調製される。

ヨウ素（＋２ＪＩ、１ｔｌｉ、１３１ｉ）で放射性ラベルされた抗イデイオタイ プモノクローナル抗体又はフラグメントは本発明の抗体又はフラグメントより、 本質的に周知なヨウ素化、例えば放射性ヨウ化ナトリウム又はカリウム及び化学 酸化剤、例えば次塩素酸ナトリウム、クロラミンＴ等、又は酵素的酸化剤、例え ばラクトペルオキシダーゼ、もしくはグルコースオキシダーゼ、及びグルコース により獲得される。本発明にかかわる抗体又はフラグメントはイ・ソトリウム（ ”Ｙ）に、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）−キレート化により カップルされる。テクテチウムー９ｍラベル化抗体又はフラグメントは、リガン ド交換プロセスによって、例えばノ（−チクネート（ＴｅＯ２−）を第一スズイ オン溶液で還元し、還元したテクネチウムをセファデックスカラム上でキレート 化し、次いでこのカラムにこの抗体又はフラグメントを適用することによって、 又は直接ラベリング技術によって、例えばパーチクネート、還元剤、例えば５ｎ Ｃ１，、バッファー溶液、例えばナトリウム−カリウムフタレート溶液及びこの 抗体又はフラグメントをインキュベートすることによって調製される。

フラグメント及び抗体又はフラグメントの抗原性を高める化合物又は酵素とのコ ンジュゲートは、例えば以下に説明するような組換ＤＮＡ技術によっても直接調 製されつる。

本発明はまた、ヒト定常領域と、ｌ（ＭＷ−ＭＡＡ上のエピトープの内部像であ る可変領域とを含んで成る抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎮可変領域をコード するインサートを含んで成る組換ＤＮＡに関する発明も考慮する。定義により、 かかるＤＮＡは一本鎖ＤＮＡ　、前記コードＤＮＡ及びそれに相補性なりＮＡよ り成る二本１１１ＤＮＡ　、又はそれら自身に相補性な（−重鎖）　ＤＮＡを含 んで成る。

より特別には、本発明は本発明の抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎮可変領域に ついてコードするインサートを含んで成る組換ＤＮＡに関し、その可変領域はＩ （ＭＷ−ＭＡＡ上のＭａｂ　７６３．７４と呼ばれるモノクローナル抗体及びそ の誘導体、又はＨＭＷ−ＭＡＡに対する結合に関してＭａｂ　７６３．７４と競 合することのできる任意の抗体により認識される決定基の内部像である。

特に、本発明はハイブリドーマ細胞系ＭＫ２−２３のゲノムＤＮＡより獲得され るか、又は前記細胞系のゲノムＤＮＡに相同性であり、且つモノクローナル抗体 ＭＫ２−２３の軽鎖可変領域に相同なアミノ酸配列についてコードする軽鎖可変 領域についてコードするインサートを含んで成る組換ＤＮＡを考慮する。このハ イブリドーマ細胞系ＭＫ２−２３は、マウスミエローマ細胞と、ネズミモノクロ ーナル抗体７６３．７４により免疫化されたＢａ１ｂ／ｃマウスの８９２８球と の融合により作られている（Ｐ、　Ｇｉａｃｏｍｉｎｉら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、　１３５．６９６．１９８５）　ａこの細胞系ＭＫ２−２３は、）ＩＭＷ− ＭＡＡ上の、ネズミモノクローナル抗体７６３．３４により認識される決定基の 内部像であるネズミ抗イディオタイプモノクローナル抗体ＭＫ２−２３を産生ず る。

本発明の式Ｉのポリペプチドについてコードするインサートを含んで成る組換Ｄ ＮＡに関し、ここでＰＲ，、ＰＲ２，ＰＲｌ、　ＰＲ４，ＣＤＲ，Ｌ。

ＣＤＲｌＬ及びＣＤＲｌＬは上記した意味を有し、任意的にイントロンを更に含 む。特に好ましいのは、ネズミ又はヒトフレームワーク領域ＰＲ，，ＰＲ，、Ｐ Ｒ，及びＰＲ，をコードするインサート、並びにＳＥＱ　ＩＤＮ０　：　１のＤ ＮＡ配列７０〜１１４　（ＣＤＲ，Ｌ）　、　ＤＮＡ配列１６３〜１８０（ＣＤ ＲｌＬ　）及びＤＮＡ配列２７７〜３０３　（ＣＤＲｌＬ）の相補性決定領域を コードするインサートを含んで成る式Ｉのポリペプチドについてコードする組換 ＤＮＡである。最も好ましいのはＳＥＱ　１０　ＮＯ：　１のＤＮＡ配列７〜３ ３４のインサートを含んで成るＤＮＡ（ここで任意的に１又は複数の、例えば１ 〜ＩＯ個のヌクレオチドは別のヌクレオチドにより交換されている）、特にＳＥ Ｑ　１０　ＮＯ：　１のＤＮＡ配列７〜３３４のインサートを含んで成るＤＮＡ である。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１に示す配列のヌクレオチドが別のヌクレオチ ドにより交換されているＤＮＡにおいて、かかる交換は、コードする相補性決定 領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を変更しない場合に好ましい。このことは、かか るヌクレオチドの交換はフレームワーク領域（ＦＲｓ）についてコードするイン サートの中に、又は三重コトンの縮重に基づきコードするアミノ酸を変更しない 位置の中にありうることを意味する。

同様に、本発明は、ハイブリドーマ細胞系ＭＫ２−２３のゲノムＤＮＡから獲得 されるか、又は前記細胞系のゲノムＤＮＡに相同性であり、且つモノクローナル 抗体ＭＫ２−２３の重鎮可変領域に相同性なアミノ酸配列についてコードする、 重鎮可変領域についてコードするインサートを含んで成る組換ＤＮＡを考慮する 。

本発明は式■のポリペプチドについてコードするインサート（ここで、ＰＲ＝、 　ＦＲ−、ＰＲｌ、　ＦＲａ、　ＣＤＲＩＮ、　ＣＤＲ１□及びＣＤＲ，、は上 記の意味を育する）を含んで成り、任意的にイントロンを更に含む組換ＤＮＡに 関する。特に好ましいのは、ネズミ又はヒトフレームワーク領域ＦＲ６，ＰＲ， 、ＰＲ？及びＰＲ，についてコードするインサート、並びにＳＥＱ　１０　ＮＯ ：　３のＤＮＡ配列９０〜＋０４　（ＣＤＲＩＮ）　、ＤＮＡ配列１４７〜１９ ７　（ＣＤＲ１，）及びＤＮＡ配列２９４〜３３５　（ＣＤＲ２Ｈ）の相補性決 定領域についてコードするインサートを含んで成る式■のポリペプチドについて コードする組換ＤＮＡである。最も好ましいのはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ’　：　３ のＤＮＡ配列９〜３６８のインサートを含んで成るＤＮＡ　（ここで、任意的に １又は複数の、例えば１〜１０個のヌクレオチドは別のヌクレオチドにより交換 されている）、特にＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３のＤＮＡ配列９〜３６８のインサ ートを含んで成るＤＮＡである。ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　３に示す配列のヌクレ オチドが別のヌクレオチドにより変換されているＤＮＡにおいて、かかる交換は 、軽鎖可変領域についてコードするＤＮＡについて前記した通り、コードする相 補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を変更しない場合が好ましい。

完全四量体イムノグロブリン分子の集成及び活性抗体の発現のため、軽鎖及び重 鎮可変領域についてコードする組換ＤＮＡインサートを、軽鎖及び重鎮ヒト定常 領域についてコードする対応のＤＮＡと融合させ、次いで適当な宿主細胞に、例 えばベクターに一体化させた後に移入する。

従って、本発明はヒト定常領域に又はλに融合した、前記の軽鎖可変ドメインに ついてコードするインサートを含んで成る組換ＤＮＡも考慮する。好ましいのは 、ヒト定常領域にに融合した前述の好適な可変領域についてコードする組換ＤＮ Ａである。

同様に、本発明はヒト定常領域γ、例えばγ１．γ２．γ３又はγ４に融合した 前述の重鎮可変領域についてコードするインサートを含んで成る組換ＤＮＡを考 慮する。好ましいのは、ヒト定常領域γｌに融合した、前述の好適な可変領域に ついてコードする組換ＤＮＡである。

本発明は更に、前述の抗イデイオタイプモノクローナル抗体のフラグメント、例 えばかかる抗体のＦａｂ、　Ｆａｂ’　もしくはＦｖフラグメントをコードする 組換ＤＮＡ　、並びに前述の抗体又はフラグメントのコンジュゲート、例えば前 述の抗原性を高める化合物に融合したもしくは酵素に融合したかかる抗体の軽鎖 及び／もしくは重鎮を含んで成る融合タンパク質についてコードするＤＮＡを考 慮する。

更に、本発明は、軽鎖可変ドメイン及び／又は重鎮可変ドメインについてコード するインサートを含んで成るバイブリドベクターである組換ＤＮＡを考慮する。

本発明の好適なバイブリドベクターは、前述の軽鎖についてコードするインサー ト、特にキメラのネズミ／ヒト軽鎖、及び／又は重鎮についてコードするインサ ート、好ましくは前述のキメラのネズミ／ヒト重鎖を含んで成る。

好ましくは、本発明のバイブリドベクターは、発現コントロール配列、特に後述 するものに作動連結している前述のインサートを含んで成る。

本発明のバイブリドベクターは任意的に複製起点もしくは自己複製配列、ｌもし くは複数の優勢マーカー配列、並びに任意的に、発現コントロール配列、シグナ ル配列及び追加の制限部位を含んで成る。

ベクターは典型的には適合性宿主細胞と協同して二つの機能を担う。−の機能は イムノグロブリン鎖をエンコードする核酸のクローニングを助長する、即ち、有 用な量の核酸（クローニングベクター）を産生ずることにある。他の機能は、染 色体外因子として維持されることにより、又は宿主染色体の中に組込まれること により（発現ベクター）、適当な宿主の中での遺伝子構築体の複製及び発現を供 することにある。クローニングベクターは前述の遺伝子構築体、複製起点もしく は自己複製配列、選択マーカー配列、並びに任意的に、シグナル配列及び追加の 制限部位を含んで成る。発現ベクターは更に遺伝子の転写及び翻訳にとって必須 の発現コントロール配列を含んで成る。

複製起点又は自己複製配列は、シミアンウィルス（ＳＶ４０）もしくはその他の ウィルス源に由来するが如きの外生起点を含ませるようにベクターを構築する、 又は宿主細胞染色体機能のいづれかにより供される。

マーカーはベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする。選択マーカーには、銅 の如きの重金属に対する、又はテトラサイクリン、アンピシリン、ジエネチシン （Ｇ−４１８）、ネオマイシン、カナマイシンもしくはヒグロマイシンの如きの 抗生物質に対する耐性を授ける遺伝子であるか、又は宿主細胞遺伝子的損傷、例 えばチミジンキナーゼ、ヒボキサンチンホスホリルトランスフェラーゼ、ジヒド ロホレートリダクターゼ等の欠落を補完する遺伝子が含まれる。

シグナル配列は、例えばプレ配列、抗体の分泌を誘導する分泌配列、又はスプラ イスシグナル等でありうる。

発現コントロール配列として、このベクターＤＮＡはプロモーター、ｍＲＮＡの 転写の開始及び終止にとって、並びに安定化にとって必須な配列、更には任意的 にエンハンサー及び追加の調節配列を含んで成る。

広範囲にわたる様々なプロモート配列が、宿主細胞の性質（こ依存して利用でき つる。強力であり、且つ同時によく制御されるプロモーターが最も有用である。

転写の開始のための配列は例えばシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇ ａｒｎｏ）配列である。ａ＋ＲＮＡの転写の開始及び終止並びに安定化にとって 必須な配列は、例えば発現宿主に由来するウィルス又は真核系ｃＤＮＡの非コー ド５′−領域及び３′−領域それぞれより一般に獲得される。エンハンサーは、 例えばシミアンウィルス、ポリオマウイルス、牛バビロマウイルス又はモロニー サルコマウィルスに由来するウィルス起源、又はゲノム、特にネズミ起源の転写 刺激ＤＮＡ配列である。

このベクターＤＮＡの様々なりＮＡ上セグメント作動連結している、即ち、それ らは互いに連なり、そして機能的に配置されている。

大腸菌株の中での複製及び発現にとって適当であるベクターの例はバクテリオフ ァージ、例えばλバクテリオファージの誘導体又はプラスミドである。適当なベ クターは完全レプリコン、マーカー遺伝子、制限エンドヌクレアーゼにとっての 認識配列（これにより外来ＤＮＡ　、そして任意的に発現コントロール配列はこ れらの部位に挿入されつる）、並びに任意的にシグナル配列及びエンハンサーを 含む。

微生物プロモーターは例えば温度感受性レプレッサーにより制御されるバクテリ オファージλの強力な左方向プロモーターＰＬである。更に適当なのは大腸菌プ ロモーター、例えばｌａｃレプレッサーにより抑制され、そしてイソプロピル− β−Ｄ−チオガラクトシドにより誘発される１ａｃ（ラクトース）プロモーター 、ｔｒｐレプレッサーにより抑制され、そして例えばトリプトファン飢餓により 誘発されるｔｒｐｃ　）リブトファン）プロモーター、及びｌａｃレプレッサー により抑制されるｔａｃ（バイブリドｔｒｐ−１ａｃプロモーター）である。

酵母における複製及び発現にとって適当なベクターは酵母複製起点及び酵母にと っての選択遺伝子マーカーを含む。かかるベクターの一グループは複製起点とし てのいわゆるａｒｓ配列（自己複製配列）が含まれる。これらのベクターは形質 転換を経て酵母細胞の中に染（２ミクロン）プラスミドＤＮＡの全体又は一部を 含むベクターが利用できうる。かかるベクターは細胞の中に既にある２μプラス ミドの中に組換えにより組込まれるか、又は自己的に複製するであろう。

２μ配列は高形質転換頻度及び高コピー数を達しめるときに特に適する。

ＡＤＩ（ＩもしくはＡＤＨＩＩ遺伝子、酸性ホスファターゼ（亜亜もしくはＰＩ （０５）遺伝子、イソ　チトクローム遺伝子にとってのプロモーター、又は解糖 経路にかかわるプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホ スフェートキナーゼ（ＰＧＫ）　、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラ ーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホ スホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ 、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ遺伝子のプロモーターが利 用できつる。

哺乳動物宿主細胞にとって適当なプロモーターは、シミアンウィルス４０　（Ｓ Ｖ４０）　、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、アデノウィルス２、牛バピロマウ ィルス（ＢＰＶ）、バボバウィルスＢＫ突然変異体（ＢＫＶ）、又はマウスもし くはヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）の如きのウィルスから獲得される。他 方、これらのベクターは哺乳動物発現産物、例えばアクチン、コラーゲン、ミオ シン等に由来するプロモーター、又はイムノグロブリン遺伝子配列に通常結合し ている天然プロモーター及びコントロール配列を含んで成りうる。

これらのベクターは原核系及び真核系宿主にとって適当でありうる。

軽鎖及び重鎮にとっての遺伝子構築体は、二つのベクターの助けを借りて宿主細 胞の中に順次又は同時に移入される。他方、重鎮及び軽鎖を両方とも同一のバイ ブリドベクターの中にクローンし、そして宿主細胞の中に単一構築体として一段 手順で組込む。第三の択一法は、連結していないＤＮＡフラグメントの同時感染 を利用する。

所望の抗イデイオタイプモノクローナル抗体についてコードする組換ＤＮＡは例 えば形質転換宿主細胞を培養することにより調製できつる。

特に、かかるＤＮＡは、 ａ　）　ＨＭＷ−ＭＡＡの内部像を抱える可変重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン についてコードするＤＮＡを、例えば適当なハイブリドーマ細胞系のゲノムから ＤＮＡを単離し、そしてＤＮＡプローブを用いて所望のＤＮＡを選別することに より、又は適当なハイブリドーマ細胞系からｍＲＮＡを単離し、そして所望の重 鎮及び／又は軽鎖ドメインをコードするｃＤＮＡを調製することにより、調製す る：ｂ）ヒト抗体の重鎮及び／又は軽鎖定常領域についてコードするＤＮＡを、 例えばゲノムライブラリーからＤＮＡを単離し、そしてＤＮＡプローブを用いて 前記抗体の定常領域についてコードする所望のＤＮＡを選別することにより調製 する；Ｃ）段階ａ）とｂ）のＤＮＡを適当なバイブリドベクターの中に組込むこ とにより、所望の遺伝子を構築する。

ｄ）獲得したバイブリドベクターを受容宿主細胞の中に移入するか、又は所望の 遺伝子についてコードするＤＮＡを回収し、そして未連結のＤＮＡを適当な受容 宿主細胞の中に移入する：ｅ）形質転換宿主細胞を選別して培養する；並びにｆ ）任意的に所望のＤＮＡを単離する；ことを含んで成る方法により調製されうる 。

上述の工程の段階ａ）にかかわるＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの単離により、又は単 離したｍＲＮＡからのｃＤＮＡの調製により獲得できつる。ハイブリドーマ細胞 由来のゲノムＤＮＡは当業界に公知の方法により単離でき、その方法は例えばＴ ｒｉｔｏｎ　（商標）の如きの清浄剤の存在下での溶解にするその細胞の破壊、 例えばフェノール及びＣＩ（Ｃ１ｓ　／イソアミルアルコールによる処理による ＤＮＡの抽出、並びにＤＮＡの沈殿についての段階を含む。このＤＮＡは、好都 合にはｌ又は複数の制限エンドヌクレアーゼ、例えばＸｂａｌ、ＢｇｌＩｌ、　 ＥｃｏＲｌ、　ＨｉｎｄＩ［。

Ｂａｍ１（Ｉにより断片化し、得られるフラグメントを適当な担体、例えばニト ロセルロース膜上で複製し、そして課題のポリペプチド配列についてコードする ＤＮＡ配列の存在、特に再配列したＨ−及びＬ−鎖■ｇ遺伝子座の存在について 、前述、そしてより詳しくは後述するようにＤＮＡプローブでスクリーンにかけ る。この手順により、ＤＮＡフラグメントは重鎖Ｖ、　Ｄ及びＪ領域並びに軽鎖 Ｖ及びＪ領域を、それぞれあるならばリーダー配列及びイントロンと一緒に含む ことが見い出された。ハイブリドーマ細胞由来のｃＤＮＡを同様に当業界に公知 の方法により、例えば全細胞性ＲＮＡを抽出し、適当なりロフトグラフィー法、 例えばオリゴ（ｄＴ）−セルロースでのクロマトグラフィーにより単離し、ｃＤ ＮＡをデオキシヌクレオチド三リン酸及び逆転写酵素の混合物により、ネズミイ ムノグロブリン重鎮及び軽鎖定常遺伝子の中の適当な領域に対して相補性なオリ ゴヌクレオチドブライマーの存在下で合成し、そしてこのｃＤＮＡを単離するこ とにより調製される。ＤＮＡ単離を簡略化する手段として、所望のゲノムＤＮＡ 又はｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用して増幅してよい。

ＰＣＲはＤＮＡ領域に特異的な二本のプライマーからのその遺伝子の両端での伸 長の反復ラウンドを包括する。好ましくは、適当なハイブリドーマ細胞系由来の 全ｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物を、加熱／冷却サイクルにおいてＴａｇ、　ＤＮＡ ポリメラーゼにより、Ｉｇ（７）　Ｈ及びＬ鎖可変領域のそれぞれにハイブリダ イズするように仕立てたプライマーの存在下で処理する。

上記の工程の段階ｂ）にかかわるゲノムヒトＤＮＡは、当業界に公知の方法に従 って、適当なヒト組織、好ましくはヒト胎盤又はヒト胎児肝細胞から単離する。

ゲノムＤＮＡライブラリーをそれより、適当な制限エンドヌクレアーゼ、例えば ）Ｉａｅ　Ｉ［及びＡｌｕ　Ｉによる限界消化により構築し、次いでλシャロン （Ｃｈａｒｏｎ）ファージ、例えばλシャロン４ａの中に、樹立された手順に従 い組込む。このゲノムＤＮＡライブラリーを例えばニトロセルロース膜上で複製 し、次いで課題のＤＮＡ配列について下記の通りにＤＮＡプローブでスクリーン にかけた。所望のＤＮＡはＰＣＲ技術を利用して増幅されつる。

マウス可変領域又はヒト定常領域についてのＤＮＡプローブは合成りＮＡ　、所 望のイムノグロブリンについてコードするｍＲＮＡのｃＤＮＡ、又は既知のヌク レオチド配列のゲノムＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントでありうる。Ｌ−／Ｈ−鎖 の可変領域の再配列１ｇ遺伝子座の検出及び／又は増幅のためのプローブとして 、そのＤＮＡが由来する哺乳動物、例えばＢａ１ｂ／ＣマウスにおけるＬ−／Ｈ −鎖の１ｇ座を構成する隣接の保存型可変又は定常領域の既知のヌクレオチド配 列のＤＮＡフラグメントを選別する。ヒトＤＮＡ配列の検出のためのネズミＤＮ Ａプローブの可能な利用はネズミとヒトＤＮＡとの間での配列相同性を基礎とす る。このＤＮＡプローブは合成したものであるか、又は適当な哺乳動物の適当な 組織、例えばＢａ１ｂ／ｃマウスの肝臓から単離し、そして標準の方法により精 製したものである。必要ならば、このプローブＤＮＡをラベル化、例えばよく知 られたニック−翻訳技術により放射性ラベルし、次いで補助剤、例えばカルシウ ムキレート化剤、粘度調節化合物、タンパク質、非特異的ＤＮＡ等を含むバッフ ァー及び塩溶液の中で、選択ハイブリダイゼーションを優先する温度でこのヒト ＤＮＡライブラリーとハイブリダイズさせる。

所望のＤＮＡ配列を含むフラグメントが同定されたら、このフラグメントを非本 質的なりＮＡを除去するために更に操作にかける、一端又は両端で修飾する１５ 次いで介在配列の全体又は一部を除去するために処理する、等してよい。

所望の遺伝子を作るための様々なりＮＡフラグメントの連結は慣用技術に従い、 例えば平滑又は付着末端リゲーション、適当な付着末端を供するための制限酵素 消化、適宜の付着末端における補完（フィルイン）、所望されない連結を回避す るためのアルカリホスファターゼ処理、及び適当なりガーゼによるリゲーション によって実施される。

組換ＤＮＡの移入、例えばバイブリドベクターの移入、及び形質転換細胞の選別 は下記の通りである。

更に、本発明は上記の組換ＤＮＡにより形質転換された適当な宿主細胞、即ち、 本発明の所望の抗イデイオタイプモノクローナル抗体の軽鎖をエンコードするＤ ＮＡ及び／又は重鎮をエンコードするＤＮＡにより形質転換された宿主細胞に関 する。

本発明の宿主細胞はインビトロでの培養が可能でなくてはならない。適当な宿主 細胞は原核又は真核超厚であり、そして細菌細胞、特に大腸菌、酵母、例えばサ ツカロマイシス　セレビシェ、又は哺乳動物細胞が含まれる。機能性の四量体抗 体の産生のための適切な環境を供するため、真核系の宿主細胞、特に哺乳動物又 は酵母起源が好ましく、なぜなら機能性四量体抗体分子の生合成は適正な新生ポ リペプチド鎖の折りたたみ及び集成を必要とするからである。原核系宿主、特に 大腸菌は本発明の抗体フラグメント、例えばＦａｂ−及びＦｖ−フラグメントの 産生のために用いられつる。

適当な宿主は改変又は修飾酵素の欠く又は少ない微生物、例えば細菌、特に大腸 菌の特定の株、及び酵母、例えばサツカロマイシスセレビシェである。

本発明に関する最も好ましい宿主細胞は哺乳動物細胞、例えばＣＯ５−７細胞、 Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、胎芽肺細 胞Ｌ−１３２、及び特にリンパ起源の哺乳動物細胞、例えばリンホーマ、ミエロ ーマ、ハイブリドーマ、トリオーマ又はクアドローマ細胞、例えばＦＡｌ、　ｓ ｐ　２１０又はＸ６３−Ａｇ３．６５３細胞である。好ましいのは細胞系Ｓｐ　 ２１０の細胞であり、これはよく特徴付けられた、マウス牌臓細胞とミエローマ Ｘ６３−Ａｇ３との融合に由来するＩｇ非分泌性マウス細胞系である。

これらの宿主細胞をＬ−鎖遺伝子構築体単独で、Ｈ−ｉＪｔ遺伝子構築体単独で 、又は両者で、二つの独立のベクターの助けを借りて順次又は同時に移入させる ことにより、又は上記した通り二本鎖−構築体（Ｌ−鎖／Ｈ−鎖）ベクターを用 いることによる一段手順でトランスフェクトせしめる。別の方法においては、未 連結の遺伝子構築体を順次又は同時に宿主細胞にトランスフェクトさせることが あ好ましいのは、両遺伝子構築体でトランスフェクトされた前述の抗イデイオタ イプモノクローナル抗体を分泌する宿主細胞、例えば細胞系ＭＫ２−ＣＨγ１の 細胞である。本発明の宿主細胞の更なる例は、択一的な配向のＨ−及びＬ−鎖遺 伝子構築体を含み、本発明のモノクローナル抗体の高いレベルの発現を助長する 追加のＤＮＡ因子の組込まれた類似の組換プラスミドでトランスフェクトされた 細胞である。

本発明の宿主細胞は遺伝的に安定であり、一定の特異性の本発明の抗イデイオタ イプモノクローナル抗体を産生及び好ましくは分泌し、そして深凍結培養物から 融解により活性化され、そして再クローニングできる。

この形質転換宿主細胞は当業界に公知の方法により、炭素の同化源、例えば炭水 化物、例えばグルコース又はラクトース、窒素、例えばアミノ酸、ペプチド、タ ンパク質又はその分解産物、例えばペプトン、アンモニウム塩等、並びに無機塩 、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、リン酸 塩及び／又は炭酸塩を含む液体培地の中で培養される。この培地は更に、成長促 進物質、例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マグネシウム等を含む。

この培地は好ましくは淘汰圧を及ぼし、且つ形質転換されていないか又はバイブ リドベクターを失った細胞の増殖を防止するように選ぶ。そこで、例えば抗生物 質を、もしバイブリドベクターか抗生物質耐性遺伝子をマーカーとして含むなら その培地に加える。例えば、必須アミノ酸において栄養素要求性であり、そのバ イブリドベクターがその宿主の欠陥を補完する酵素をコードする遺伝子を含む宿 主細胞を用いるとき、前記アミノ酸を欠くの最少培地を形質転換細胞の培養に用 いる。

培養は、当業界に公知である方法により行われる。その培養条件、例えば温度、 培地のｐＨ値及び発酵時間は、最大力価の本発明のポリペプチド又は誘導体が獲 得できるように選ぶ。従って、大腸菌又は酵母株を好ましくは好気性条件のもと で、振盪又は撹拌しながら、約２０°Ｃ〜４０°Ｃ１好ましくは約３０℃の温度 で、４〜８のｐＨ値、好ましくは約ｐＨ７で、約４〜３０時間、好ましくは本発 明のポリペプチド又は誘導体の最大収率が達せられるまで浸漬培養することによ り培養する。

細胞密度が十分な値に到達したら、その培養を中止し、そしてポリペプチド又は 誘導体を単離してよい。もしそのバイブリドベクターが適当な分泌シグナル配列 を含むなら、そのポリペプチド又は誘導体はその形質転換細胞により培養培地の 中に直接分泌される。そうでなければ、その細胞を例えばＳＯ３，ＮＰ−４０（ 商標）　、Ｔｒｉｔｏｎ　（商標）又はデオキシコール酸の如きの清浄剤による 処理によって破壊、リゾチームもしくは類似の活性酵素により溶解、又は浸透圧 ショックもしくは超音波により崩壊しなければならない。細胞の破砕はもしシグ ナル配列が細胞のペリプラズマへの所望のタンパク質の分泌をもたらしめる場合 も必要である。もし宿主微生物として酵母を使用すると、その細胞壁はグルコシ ダーゼによる酵素消化によって除去できつる。他方、又は追加的に、機械的な力 、例えば剪断力（例えばフレンチプレス、Ｄｙｎｏ　ｍ１ｌ１等）又はガラスピ ーズもしくは酸化アルミニウムを伴っての振盪、又は液体窒素の中での交互の凍 結と、例えば３０℃〜４０°Ｃでの融解、並びに超音波がその細胞を破壊するの に利用できうる。

タンパク質、核酸及びその他の細胞構成成分を含む、細胞を破砕した後に獲得さ れる混合物の遠心の後に得られる細胞上清液又は溶液を、本発明のポリペプチド を含むタンパク質において、公知の方法で富化せしめる。従って、例えばほとん どの非タンパク質性構成成分をポリエチレンイミン処理により除去し、そして本 発明のポリペプチド及び誘導体を含むタンパク質を例えば上記の方法により単離 する。

本発明は形質転換宿主細胞の調製のための方法（こも関連し、その方法は、上述 の適当な受容宿細胞を本発明にかかわるｌ又は２種のベクターで形質転換し、そ してこの形質転換細胞を選別することを特徴とする。

微生物、例えばＳ、セレビシェ（Ａ、　１ｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７５　：　１９２９．１９７８）及び大腸菌 （Ｍ、　Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　５３　＋　１５９．１ ９７０）の形質転換については文献に記載の通りに実施される。

従って、大腸菌細胞の形質転換手順は、例えばＤＮＡの取込みを可能にする細胞 のＣａ”予備処理、及びバイブリドベクターとのインキュベーションを含む。そ の後の形質転換細胞の選別は、例えばその細胞を、ベクターＤＮＡのマーカー配 列の種類に応じて親細胞からのその形質転換細胞の選別を可能にする選択増殖培 地に移すことにより達成されうる。好ましくは、このベクターを含まない細胞を 増殖させない増殖培地を使用する。酵母の形質転換は、例えば酵母細胞壁のグル コシダーゼによる酵素除去、ポリエチレングリコール及びＣａ２“イオンの存在 下での獲得されたスフェロプラストのこのベクターによる処理、並びにこのスフ ェロプラストを寒天の中に包埋することによる細胞壁の再生の段階を含んで成る 。好ましくは、この再生用寒天は再生及び前述の形質転換細胞の選別を同時に可 能にするように調製する。

高等真核起源、例えば哺乳動物細胞系の細胞の形質転換はトランスフェクション により好適に成される。トランスフェクションは慣用技術、例えばリン酸カルシ ウム沈殿、細胞核へのマイクロインジェクション、プロトプラスト融合、エレク トロポレーション、即ち、細胞膜の浸透性を一時期に高める短い電気パルスによ るＤＮＡの導入、等によって実施される。トランスフェクションはヘルパー化合 物、例えばジエチルアミノエチルデキストラン、ジメチルスルホキシド、グリセ ロール、ポリエチレングリコール等の存在下で、又はベクター　ＤＮＡとリン酸 カルシウムとの共沈殿により実施されうる。

トランスフェクション手順の後、トランスフェクト細胞を同定し、そしてトラン スフェクションのために用いたＤＮＡの選択マーカーに対応する選別手順の助け を借りて選別する。選択マーカーには、重金属、例えば銅、又は抗生物質、例え ばＧ　−４１８（ジエネチシン、ネオマイシン誘導体）もしくはヒグロマイシン に対する耐性を授ける遺伝子、又は宿主細胞の遺伝子的欠損、例えばチミジンキ ナーゼ、ヒポキサンチン　ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ジヒドロホレー ト　リダクターゼ等の欠落を補完する遺伝子が含まれる。例えば、もしトランス フェクションに用いたＤＮＡがジエネチシン耐性についてのマーカーを含んで成 るなら、形質転換細胞を同定し、そしてこの抗生物質ジエネチシンの存在下での 培養により非形質転換細胞から分ける。

本発明にかかわる抗イデイオタイプモノクローナル抗体及びその誘導体は数多く の予防的、治療的及び診断的目的にとって有用である。特に、本発明はＨＭＷ− ＭＡＡに対する免疫応答の調節によって黒色腫を処置する方法を考慮する。

能動的な免疫療法は抗体の誘発及び／又は患者もしくは動物におけるＴ−細胞応 答を含んで成る。能動的な免疫療法においては、本発明の抗体を、その免疫系の 有利な成分を刺激するように免疫応答を高めるために投与してよい：例えば黒色 腫の処置において、ＨＭＷ−ＭＡＡに対して特異的な体液性及び細胞性応答を誘 発することが所望される。

本発明にかかわる抗イデイオタイプモノクローナル抗体及びその誘導体は、その 免疫調節がイディオタイプ−抗イデイオタイプ反応ネットワークにおいて機能す ることに基づき、例えばＨＭＷ−ＭＡＡに対する免疫応答を調節するために利用 されつる。その調節は特異的であり、そして可変領域が由来しているネズミ抗イ ディオタイプモノクローナル抗体の産生のために用いた抗体（Ａｂ−１）の選択 、即ち免疫用Ａｂ−１の特異性により、及び本発明の抗体のアイソタイプにより 決定され、なぜなら異なるアイソタイプの抗イデイオタイプ抗体は異なる免疫調 節機能を有するからである。本発明の抗体に対する有害な免疫応答の機会は、比 較のネズミ又はその他の非ヒト抗体の繰返り適用により生ずる有害な反応に比べ てかなり引き下げられる。本発明の抗体は内部像タイプであるため、それらはＨ ＭＷ−ＭＡＡに対して特異的な抗体（Ａｂｓ−３）を誘発することができる（能 動的免疫療法）。これらの誘発抗体は免疫のために最初に用いた抗体（Ａｂ−１ ）と同一の一般反応性パターンを有する。ＨＭＷ−ＭＡＡに対して特異的な抗体 （Ａｂ−３）の内生産生の刺激は受動的な免疫療法におけるかかる免疫用抗体（ Ａｂｓ−１）の直接適用の欠点、即ち、多大な回数の注射及び大用量の必要性を 解消する。

本発明のＭａｂは、免疫用抗体の適当な選択によりＨＭＷ−ＭＡＡの特異的な決 定基を擬態するように［受注生産」できうる。従って、本発明にかかわる抗イデ イオタイプモノクローナル抗体及びその誘導体、特にフラグメント及び抗原性を 高める化合物を有するコンジュゲートは、黒色腫の制御及び処置にとって有用な 試薬であり、即ちそれらは例えば腫瘍退化を起こす及び／又は腫瘍の再発を防止 するのに有効に利用できつる。

更に、本発明の抗イデイオタイプＭＡｂは、免疫用モノクローナル抗体により認 識される高分子量黒色腫関連抗原の決定基に対する免疫性の誘発により黒色腫を 予防するために有用である。

本発明は、本発明にかかわる抗イデイオタイプモノクローナル抗体及び／又はそ の誘導体を含んで成る薬理組成物も考慮している。

この薬理組成物は例えばこの抗イデイオタイプモノクローナル抗体及び／又はそ の誘導体を、治療的に有効な量において、適当な薬理学的に許容されている担体 と一緒に、又は混入されて含んで成る。

考慮される抗体の誘導体はフラグメント、又は抗原性を高める化合物とのコンジ ュゲートである。

好ましいのは非経口的適用、及び吸入、例えば経鼻適用のための薬理組成物であ る。筋肉内、皮下もしくは静脈適用、又は吸入のための組成物は、例えば等張性 水性溶液又は懸濁物であり、任意的に使用直前に凍結乾燥又は濃縮製剤から用意 するものである。油中の懸濁物は油状成分として、注射目的のために慣用な植物 、合成又は半合酸油を含む。この薬理組成物は滅菌されていてよく、そして補助 剤、例えばその成分の保存、安定化、湿潤、乳化又は溶解のためのもの、浸透圧 の調節のための塩、バッファー、及び／又は粘度を調節する化合物、例えばナト リウムカルボキシセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボ キシメルチセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン又はゼラチンを含 みうる。

好ましいのは、内因性抗体（Ａｂｓ−３）の形成を積極的に及ぼす補助剤を更に 含んで成る薬理組成物である。考慮される補助剤は、完全フロイント補助剤（鉱 物油、水及びミコバクテリア抽出物のエマルション）、不完全フロインドアジュ バント（水及び油のみのエマルション）、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム ゲル、界面活性物質、例えばリソレシチン、ポリアニオン、ペプチド、ＢＣＧ（ バチルス　カルメツチーブニリン）、又は上記の抗原性を高める化合物である。

特に好ましいのはムラミルペプチドＭＴＰ−ＰＥ又はみょうばんである。もしこ の薬理組成物が本発明の抗体又はフラグメントと、抗原性を高める化合物とのコ ンジュゲートを含むなら、更なる補助剤は必要でないことがある。

この薬理組成物は当業界に公知の方法、例えば慣用の混合、溶解又は凍結乾燥に より調製され、そして約０．Ｏ１％〜約５０％の活性成分を含む。これらは投与 単位形態、例えば即時に使用されるアンプルもしくはバイアル、又は凍結乾燥固 形状態であってもよい。

投与の特定の態様及び用量は、かかりっけの医師により、患者の個性、疾患の状 態、処置する黒色腫のタイプ等を考慮して選ばれるであろう。哺乳動物にとって の治療用量は、患者の状態及び適用の態様に応じて体重のｋｇ当り、約３０μｇ 〜１００μｇの本発明の抗イデイオタイプモノクローナル抗体及び／又は誘導体 である。

本発明の薬理組成物は当業界に公知の方法により、例えば慣用の混合、溶解、糖 衣化又は凍結乾燥工程により調製される。注射のための薬理組成物を加工し、ア ンプル又はバイアルの中に充填し、そして当業界に公知の方法に従って無菌状態 のもとてシールする。

本発明にかかわる抗イデイオタイプＭＡｂ及びその誘導体はＨＭＷ−ＭＡＡに対 して特異的な抗体の定性及び定量決定のためにも利用できつる。これは黒色腫を モニターするために、黒色腫の診断のために、その疾患が本発明の抗イデイオタ イプモノクローナル抗体で処置してよいかを決断するため、並びにこの抗イデイ オタイプモノクローナル抗体及びその誘導体によるその疾患の処置をモニターす るために特に有用である。本発明の抗体は例えばネズミ定常領域に対する免疫応 答性が排除されるため、インビボ診断におけるその利用が特に有利である。

一般に、本発明にかかわる抗イデイオタイプモノクローナル抗体又はその誘導体 は、ＨＭＷ−ＭＡＡに対して特異的な抗体のイデイオトーブと抗イデイオタイプ 抗体のイディオトーブ間の結合相互作用を頼りとする任意の公知のイムノアッセ イにおいて利用できつる。かかるアッセイの例は、放射性、酵素、蛍光、ケミル ミネッセンス、免疫沈殿、ラテックス凝集及びヘムアグルチネーションイムノア ッセイである。

本発明にかかわる抗イデイオタイプモノクローナル抗体はそのまま、又は放射性 ラベル化誘導体の形態においてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に利用できうる 。ＨＭＷ−ＭＡＡに対して特異的な抗体の直接的又は間接的（競合）決定が伴う 任意の公知のＲＩＡの改良法、例えば可溶性相（均質）　ＲＩＡ　、固相（不均 質）　ＲＩＡ　、シングルＲＩＡ又はダブル（サンドイッチ）　ＲＩＡが利用で きつる。

かかるラジオイムノアッセイの例はサンドイッチＲＩＡであり、それにおいては 適当な抗体、例えばマイクロタイタープレート又は試験管、例えばポリスチレン 、ポリプロピレンもしくはポリビニルクロリドのプラスチック面、ガラスもしく はプラスチックビーズ、濾紙、デキストラン等、セルロースアセテートもしくは ニトロセルロースシート、磁性粒子等に、本発明の抗イデイオタイプモノクロー ナル抗体を、単純吸着により、又は任意的にグルタルアルデヒドもしくは臭化シ アンによる担体の活性化を経て、コートする。次にＢＭＷ−ＭＡＡ抗体に対して 特異的な抗体及びこれも抗−ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体と反応し、且つ例えばＩ’ｌｌ で放射性ラベルされている最終的なポリクローナル抗体を含む試験溶液を加える 。この試験溶液中のＢＭＷ−ＭＡＡに対して特異的な抗体の量は結合したポリク ローナル抗体の量に正比例し、従って固相の放射活性を測定することにより決定 され本発明にかかわる抗イデイオタイプモノクローナル抗体はそのまま、又は酵 素コンジュゲート誘導体の形態において酵素イムノアッセイに利用できつる。ラ ジオイムノアッセイについて前述した通り、任意の公知の酵素イムノアッセイの 改良法が利用できうる。

この試験は上述のイムノアッセイに類似する、放射性ラベルの代わりに酵素ラベ ルを使用する方法で実施される。その試験溶液中に存在するＨＭＷ−ＭＡＡに対 して特異的な抗体の量に対応して形成される免疫複合体の量は酵素基質溶液を加 えることによって決定される。

この酵素基質反応は例えば目により又は光学測定装置により観察される色調変化 をもたらす。

本発明にかかわる抗イデイオタイプモノクローナル抗体はそのまま、又はケミル ミネッセントマーカーにコンジュゲートされた誘導体の形態でケミルミネッセン スイムノアッセイに利用できうる。ラジオイムノアッセイについて前述した通り 、任意の公知のケミルミネッセスイムノアッセイの改良法が利用できつる。

この試験は上述のイムノアッセイに類似する、放射性ラベルの代わりにケミルミ ネッセントラベルを使用する方法で実施される。その試験溶液中に存在するＨＭ Ｗ−ＭＡＡに対して特異的な抗体の量に対応して形成される免疫複合体の量はル ミネッセンスを誘発する化合物、例えばＨ２Ｏ，及びＮａ０）ｌを加える、そし て光学測定手段により光の放射を測定することによって決定される。

ＢＭＷ−ＭＡＡに対して特異的な抗体の決定のための前述した抗イデイオタイプ モノクローナル抗体及びその誘導体の発明にかかる使用は、その他の本質的に知 られるイムノアッセイ、例えばイムノフルオレセンスアッセイ、ラテックス凝集 、ヘムアグルチネーション、抗イデイオタイプＭＡｂでコートされた光ファイバ ー及び結合現象を電気又は光信号に変換するその他直接作用イムノセンサーを利 用する消失光アッセイを含む。

本発明はまた、本発明の抗イデイオタイプモノクローナル抗体及び／又はその誘 導体、並びにその他のポリクローナル又はチックローナル抗体及び／又は補助剤 を含んで成る、ＨＭＷ−ＭＡＡに対して特異的な抗体の定性及び定量決定のため の検査キットも考慮する。

ラジオイムノアッセイのための本発明にかかわる検査キットは例えば適当な担体 、任意的に１もしくは数種のポリクローナル及び／もしくはモノクローナル抗体 の凍結乾燥化溶液、放射性ラベル抗体の溶液、ＨＭＷ−ＭＡＡ抗原に対して特異 的な抗体の標準溶液、バッファー溶液、並びに任意的に、非特異的な吸着及び凝 集の生成を防ぐためのポリペプチド又は清浄剤、ピペット、反応槽、検量曲線、 仕様書等を含む。この検査キットの抗体の一つは本発明の抗イデイオタイプモノ クローナル抗体である。

酵素イムノアッセイのための本発明にかかわる検査キットは例えば適当な担体、 任意的にＩもしくは数種のポリクローナル及び／もしくはモノクローナル抗体の 凍結乾燥化溶液、任意的に酵素−又はビオチンコンジュゲート抗体の凍結乾燥又 は濃縮溶液、ビオチンラベル化抗体を使用するなら酵素アビジンコンジュゲート の溶液、固形又は溶解形質の酵素基質、ＨＭＷ−ＭＡＡ抗原に対して特異的な抗 体の標準溶液、バッファー溶液、並びに任意的に、非特異的な吸着及び凝集の生 成を防ぐためのポリペプチド又は清浄剤、ピペット、反応槽、検量曲線、仕様書 等を含む。この検査キットの抗体の一つは本発明の抗イデイオタイプモノクロー ナル抗体である。

本発明は特に実施例に記載の抗体、組換ＤＮＡ　、形質転換細胞、薬理組成物及 びそれらの製造方法を考慮する。

以下の実施例は本発明を例証し、何ら限定するものではない。

略語 ＾ＴＰ　アデノシン三リン酸 ｂｐ　塩基対 ＢＳＡ　牛血清アルブミン ＣＤＲ相補性決定領域 ＣＩＡＰ　仔牛小腸アルカリホスファターゼＣＩＡＰ−バッフｙ−（ＩＯＸ）　 １０ｍＭ　ＺｎＣ１，、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、０．５Ｍト　’ノスーＨＣ１， ｐＨ７゜６ ＤＮＡ　Ｉ３ガーゼバｔ７ｙ−（ＩＯＸ）　ｏ、ＬＭ　ＭｇＣ１＊、０．５Ｍ　 ）　’Ｊ　ス−ＨＣｌ、ｐＨ７，６ｄＮＴＰ　デオキシリボヌクレオチド三リン 酸ＤＴＴ　ジチオスレイトール ＥＤＴＡ　エチレンジアミン四酢酸 ＦＣＳ　胎児牛血清 Ｈ−鎖　重鎖 ＨＥＰＥＳ　Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ“−２−エタンスルホ ン酸 ＨＭＷ−ＭＡＡ　高分子量−黒色腫関連抗原ＨＴ　ヒボキサンチン／チミジン Ｌ−鎖　軽鎖 ｒｇ　イムノグロブリン ｋｂ　キロ塩基対 ＭＡｂ　（複数の）モノクローナル抗体ＮＴ−バフフＴ−（ＩＯＸ）　０．ＩＭ 　ＭｇＣ１ｚ、１ｍＭ　ジチオスレイトール。

５００　Ｍｇ　ＢＳＡ／ｍｌ　（Ｓｅｒｖａ、画分Ｖ）、　０．５Ｍトリス−Ｍ ＣＩ、　ｐＨ７゜５ ＰＢＳ　リン酸緩衝食塩水溶液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　＆Ｖｏｇｔ、　Ｊ、　Ｅｘ ｐ、　Ｍｅｄ、　９９．１６７、１９５４）ＰＢＳ−ＣＭ　ＭｇＣ１，及びＣａ Ｃ１ｘ抜きのＰＢＳＰＣＲ−バッフｙ−（ＩＯＸ）　１５ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、０ ．５Ｍ　ＫＣｌ、０．ＩＭβ−メルカプトエタノール、０．５％（ｗ／ｖ）　Ｔ ｗｅｅｎ　−２０”　（Ｍｅｒｃｋ）、　０．５％（ｗ／ｖ）　ＮＰ−４０”（ Ｍｅｒｃｋ）、　０．１Ｍ　）リス−ＩＣ１，ｐｎｓ、ａＰＮＫ−バッフｒ−０ ，１Ｍ　ＭｇＣ１＊、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　）　リス−ＩＣ１，ｐＨ７ ，５ ＲＩＡ−バッフｒ−１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファ　−（Ｓｅｒｖａ。

画分Ｖ）、　０．２％ＮａＮ５　（Ｍｅｒｃｋ）、　０．０５％（ｗ／ｖ）　Ｔ ｗｅｅｎ−２０”　（Ｍｅｒｃｋ）ＲＴ−バッフｙ−（５Ｘ）　１５ｍＭ　Ｍｇ Ｃｂ、０．３７５Ｍ　ＫＣＩ、５０ｍＭ　ＤＴＴ。

０．２５Ｍ　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，３基質バフフｙ−１０％（ｖ／ｖ）ジ ェタノールアミン（Ｍｅｒｃｋ）。

０．２％ＮａＮａ　（Ｍｅｒｃｋ）、　０．１％ＭｇＣｌ　＊　。

ｐＨは９．８にＨＣＩで調整 ＴＡＢ−バッフｙ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．０４Ｍ　）リスーアセテートＴＢ Ｅ−バフ１ｒ−８９ｍＭ　硼酸、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、８９ｍＭ　）リス−硼酸塩 ＴＥ−バッフｙ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０ト リス　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＶ−領域　可変領域 実施例 ブリドーマＭＫ２−２３の機能的１ｇ　Ｈ−及びＬ−鎖Ｖ−領域エクソンのクロ ーニング及び順応 利用した一般方法はＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ 　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９）により詳しく述べられている。

１、１　ネズミハイブリドーマＭＫ２−２３の起源及びＲＮＡの調製：　ＭＫ２ −２３と呼ばれるネズミハイブリドーマの製造及び性質は欧州特許出願第４２８ 、４８５に記載されている。これは抗−ＨＭＷ−ＭＡＡネズネズノクローナル抗 体７６３．７４上のイディオタイプ決定基に対してＢａ１ｂ／ｃマウスにおいて 高揚されたＢリンパ球より調製される。全ＲＮＡをＬｅ　Ｍｅｗら（Ｃｅｌｌ　 ２３．５６１−５７１．１９８１）により述べられている手順を利用して、約０ ．５〜ｌＸｌ０”の細胞から単離する。

１．２　機能的なＨ−及びＬ−鎖１ｇ　ｃＤＮＡ配列のインビトロ増幅・ハイブ リドーマＭＫ２−２３の中で発現された［ｇ遺伝子のコード領域に相当するヌク レオチド配列を全ハイブリドーマＲＮＡの逆転写、及びＴａｑＤＮＡポリメラー ゼを用いるＩｇ　ｃＤＮＡ転写物のインビトロでの増幅により獲得した。以下の オリゴヌクレオチドブライマーを使用した（かっこ内の文字は、その位置での縮 重ヌクレオチドを記号化してＭ／Ｃにはマウス［ｇ　Ｌ　−ｉｌ　Ｃに定常領域 エクソンの逆アンチＶＨＩＦＯＲ，ＶＨＩＢＡＣＫ、　ＶＫＩＦＯＲ及びＶＫＩ ＢＡＣＫは、０ｒｌａｎｄｏら（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６．３８３３−３８３７．１９ ８７）により述べられている　Ｉｇ　Ｈ−及びｒｇ　Ｌ−ＩＩＶ−領域プライマ ーに相当するが、ただしここで用いたＶＫＩ　ＦＯＲは２個の縮重塩基置換を存 する（上記で下線を付した）。後者のプライマーのセットは増幅Ｖ−領域のその 後のクローニングを助長するＤＮＡ制限部位を含む（実施例１３参照のこと）。

これらは：　ＶＨＩＦＯＲ：　ＢｓｔＥＩ［（ＧＧＴＧＡＣＣ）　；　Ｖ）ＩＩ ＢＡＣＫ　：　ＰｓｔＩ（ＣＴＧＣＡＧ）　；　ＶＫＩＦＯＲ：　ＢｇＬＩ［（ ＡＧＡＴＣＴ）　；　ＶＫＩＢＡＣＫ　：　ＰｖｕＩｒ（ＣＡＧＣＴＧ）。

Ｉｇ　Ｈ−鎖ｍＲＮＡの逆転写及び増幅のため、全ＭＫ２−２３ハイブリドーマ ＲＮＡ　（１０Ｍｇ）を、１０μｌのＲＴ−バッファー、１４μｌのＨ＊０．２ ．５μｍのスベリミジン（１０ｍＭ）、　０．５μｍのＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ ）　、　１０μｍの混合ｄＮＴＰ　（２ｍＭづツ；Ｎ＝Ａ、　Ｔ、　Ｇ及びＣ） 、１０μｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００”　（１０％、　ｖ／ｖ）　、　１．５　 μｍのＲＮＡ−ｍｅ　Ｂｌｏｃｋ”（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び１μ＋のＶＨ ＩＦＯＲブライｖ　−（５０ｐｍｏｌ）を含む溶液の中ノ２００単位（７）ＭＭ ＬＶ逆転写酵素（１ｕ　１　；　Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）ｌ：より３７°Ｃで９０ ｍ１ｎ処理する。

Ｉｇ　ｃＤＮＡを含むこの溶液の一部（５μｌ）を、６２．５μｌのＨ２Ｏ。

ｌＯμｌのＰＣＲ−バッファー、ｌＯμｌのｄＮＴＰ混合物（２１ｎＭづつ、Ｎ ＝Ａ。

Ｔ、　Ｇ及びＣ）　、　１０ｍ１のジメチルスルホキシド（Ｍｅｒｃｋ）及び２ μｌのプライ７−ＶＨＩＦＯＲ及びＶＨＩＢＡＣＫ　（Ｈ，０中で５０ｐｍｏｌ ）を含む溶液ｉｏ。

μｍの中でのインビトロ増幅に委ねる。この溶液を混合し、そして９３℃で３　 ｍｉｎ熱し、３７°Ｃに冷却し、０．４μｌのＡｍｐｌｉ　Ｔａｑ”　ＤＮＡポ リメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を加え、そしてこの溶液 に、１ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆＴＭチューブの中で１００μｌのパラフィン油 を載せる。

次いでこの溶液を温度サイクラ−（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ｈｅａｔｉｎｇ　 Ｂｌｏｃｋ。

Ｈｙｂａｉｄ）の中で下記の通りにインキュベートするＤＮＡ鎖の最終合成を終 了させるゴ１”Ｃで０．２　ｗｉｎ　、続いて９３℃で０．０１＋ｎｉｎ　、続 いて３７℃で０．２ｍ１ｎ（４サイクル）；７１℃で０．２　ｍｉｎ　、続いて ９３°Ｃで０，０１ｗ１ｎ　、続いて６２°Ｃで０．２　ｍ１ｎ（３０サイクル ）；７１″Ｃで３ｍ１ｎ、続いて６２°Ｃで０．２　ｍｉｎ　、続いて７１”Ｃ で３ｍ１ｎｏこの溶液の１／１０の容量を、増幅ＤＮＡ産物を識別化するための エチジウムプロミドを含む１％のアガロースゲル上での電気泳動により分析する 。Ｉｇ　Ｈ−鎖の有効な選択的増幅は、Ｕ、Ｖ、イルミネーションのもとで見て 、約３５０ｂｐのＤＮＡバンドをもたらしめた。時折り、増幅反応の別の無関係 な副産物が異なるサイズのＤＮＡバンドとして観察される。

Ｉｇ　Ｌ−１ｄｉ　ｍＲＮＡの逆転写及びインビトロ増幅をＨ−鎖ｍＲＮＡにつ いて上記した通りに実施するが、ただし逆転写段階については、ＶＨＩＦＯＲプ ライマーをＭＣ／Ｃにオリゴヌクレオチドブライマーに置き換え、そしてインビ トロ増幅段階については、ＶＨＩＦＯＲ及びＶＨＩＢＡＣＫプライマーをＶＫＩ ＦＯＲ及びＶＫＩＢＡＣＫオリゴヌクレオチドブライマーに置き換える。有効な 増幅をＨ−鎖配列について上述した通りに、アガロースゲル電気泳動を利用して モニターし、そしてＵ、　Ｖ、イルミネーションのもとて約３３０　ｂｐのＤＮ Ａバンドの存在により示される。

両ケースにおいて、増幅材料をまずフェノール／ＣＨＣｌ、　、次いでＣＩＣＩ ｇによる抽出によって精製する。この材料を最後に０．３ＭのＮａ０Ａｃ、　ｐ Ｈ７，０の存在下で一２０°Ｃで２容量のエタノールで沈殿させ、その温度で７ ０％のエタノールで洗い、そしてそのＤＮＡペレットを風及びＬ−ｉＪｊｃＤＮ Ａ（実施例１．２参照）を、フレノウＤＮＡポリメラーゼ及びポリヌクレオチド キナーゼによる処理によるＤＮＡフラグメントの末端を準備した後に平滑末端ク ローンに付する。

実施例１．２に従って調製したＤＮＡフラグメントをＴＥ−バッファー（２０μ ｌ）の中に溶かし、別々に、１７μｍのＯ＊Ｏ，Ｓμｌの混合ｄＮＴＰ　（ｌ　 ｍＭづツ；Ｎ＝Ａ、　Ｔ、　Ｇ及びＣ）及び５μｍのＮＴ−バフ７アーに加え、 そして１５単位（３μｍ）のフレノウフラグメントＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）により室温で３０１１１ｉｎ処理する。この酵素を６５℃ で１０ｍ１ｎその溶液を熱することにより不活性化し、次いでその処理サンプル をエチジウムプロミドを含む１％のアガロースゲル上でＴＡＥ−バッファーを用 いて電気泳動にかける。Ｕ、　Ｖ、イルミネーションのもとて識別化される増幅 Ｈ−鎖ＤＮＡについての約３５０　ｂｐ及び増幅り一部ＤＮＡについての約３３ ０　ｂｐのＤＮＡバンドをメスで切り出し、そして分別ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ”カ ラム（ＢＩＯ１０１Ｉｎｃ、）上でその製造者の仕様書に従って精製する。各Ｄ ＮＡを、７．５μｌのＨ２Ｏを加えた３０μｍの製造者の溶離バッファーにおい て溶離させる。

精製Ｈ−及びＬ−鎖ｃＤＮＡフラグメント（３７，５μｍ）を別々に、５μｌの ＰＮＫ−バッファー、０．５μＩのジチオスレイトール、１μｌのスペルミジン （５０ｍＭ）及び５μｌのＡＴＰ（１０ｍＭ）の添加により４９μｍにし、そし てそれぞれを１μｍのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０単位；　Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）により３７°Ｃで３０ｍ１ｎ処理する。その反応を、５μｍの０．５ ｍＭの二ナトリウムーＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５、続いて３５μｌのＴＥ−バッフ ァー及び１０ｍ１の３Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ７，０の添加により停止させ、次 にそのＤＮＡ溶液をフェノール／ＣＨＣｌ５．　ＣＨＣｌ！で抽出し、そして２ ．５容量（Ｖ／Ｖ）の９５％のエタノールで沈殿させる。遠心後、上清液を除去 し、そしてＤＮＡベレットを乾かし、次いで５μｌのＴＥ−バッファーに溶かす 。

ＤＮＡフラグメントをＳｍａ　Ｉ−消化、脱リン酸化　ＢＬＵＥＳＣＲ［ＰＴＴ ｌ″ＫＳ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中にクローンする。このポリヌ クレオチドキナーゼ処理したＨ−又はＬ　−１ｃＤＮＡフラグメントの一部（２ μｌ）を別々に、ｌμｌのＤＮＡリガーゼバッファー、１μｍの１０Ｘのジチオ スレイトール（０，１Ｍ）　、　０．５　ｔｔ　１の２０ＸのＡＴＰ（１０ｍＭ ）。

３．５μｍのＨ２Ｏ及び１μｍ　（４００単位）のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅ ｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で１４°Ｃで４ｈかけて、１００ 　ｎｇ　（１ｔｔ　１　）の調製ＢＬＵＥＳＣＲｒＰＴＴｌ″ベクターにリゲー トさせる。

ＤＮＡリゲーション産物を標準の手順を利用して調製した大腸菌に１２／ＢＺ２ ３４のコンピテント細胞の中に形質転換せしめる。アンピシリン耐性クローンを 採取し、そしてプラスミドＤＮＡを調製する。適度のサイズのＤＮＡインサート を存するクローンは、プラスミドＤＮＡのＥｃｏＲＩ　＋ＸｂａＩ　（これはＳ ｍａｌＩクローニング部位の対立側上にあるベクターポリリンカー配列を切断す る）の同時消化、及びエチジウムプロミドを含む１％のアガロースゲル上での電 気泳動によるＤＮＡフラグメントの分析により同定されうる。

１．４　機能的なＴｇ　）Ｉ−及びＬ−鎖遺伝子再配列の同定：適正なサイズの ＤＮＡインサートを存するクローン化プラスミドのヌクレオチド配列を、５ＥＱ ｔＪＥＮＡＳＥ”システムにより、Ｔ３及びＴ７オリゴヌクレオチドプライマー 並びに製造者のプロトコール（Ｕｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌ）を用いて二本鎖ＤＮＡ鋳型上で決定する。同一の配列を有する複数のプラ スミドクローンが獲得される。典型的なりローン（ＭＫ２−２３ＬＰＣＲ１及び ＭＫ２−２３１（ＰＣＲＩ）の配列を、Ｌ−及びＨ−鎖それぞれについてＳＥｏ 　１０　ＮＯ：　１及びＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２に示す。示す配列はＩｇ関連 配列の選択的インビトロ増幅のために用いたオリゴヌクレオチドブライマー、プ ライマー内に位置するＤＮＡ制限部位の位置、並びにネズミｒｇｖ−領域配列の データーベース（Ｋａｂａｔら、ｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　１ｎｔｅｒｅｓｔ　Ｊ第４版。

Ｕ、　Ｓ、　Ｄｅｐｔ、　Ｈｅａｌｔｈ　＆　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ、 　１９８７）との比較により推定したＩｇ　Ｌ−及びＨ−鎖Ｖ−領域の相補性決 定領域（ＣＤＲｓ）の位置を含んでいる。ＭＫ２−２３ＨＰＣＲ１から推定した 予ｆｆ１ｌｌＮ−末端配列はマウスＭＡｂ　ＭＫ２−２３の独立のＨ−及びＬ− 鎖のＮ−末端配列分析から実験的に決定したものに相当する。上記に加えて、第 ２の異なる再配列Ｉｇ　Ｌ−鎖Ｖ−領域、更には別の再配列ｒｇ　Ｈ−鎖Ｖ−領 域に相当するＤＮＡクローンが得られた。これらの追加のＨ−及びＬ−鎖再配列 の両者の予測のＮ−末端配列はマウスＭＡｂ　ＭＫ２−２３のそれとは異なる。

ＭＫ２−２３ＬＰＣＲ１のＶ−領域再配列はＪ２　Ｌ−鎖Ｊ−ミニ遺伝子連結エ クソン（ヌクレオチド位置２９８で始まる。ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：　１　）を使 用しており、そして機能的なＩｇ　Ｌ−鎖遺伝子再配列の特徴であるＶ−Ｊエク ソンの融合により形成されるポリペプチド配列をエンコードする連続オーブンリ ーディングフレームを含む。

ＭＫ２−２３ＨＰＣＲ１（７）　Ｖ−領域再配列１；！ＪＨＩＨ−鎖Ｊ−ミニ遺 伝子連結エクソン（ヌクレオチド位置３２１で始まる；ＳＥｏ　ＩＤ　ＮＯ：　 ２　）を使用しており、そして機能的なＩｇ　Ｈ−鎖遺伝子再配列の特徴である Ｖ−Ｄ−Ｊエクソンの融合により形成されるポリペプチド配列をエンコードする 連続オーブンリーディングフレームを含む。

上記の配列とは別に、ＭＫ２−２３細胞ｍＲＮＡを用いて時折りその他のＤＮＡ クローンが得られるが、どれもＩｇ　Ｈ−又はＬ−ＩＶ−領域配列と共通点がな い。インビトロ増幅より得られる配列がＶ−領域配列の中に点突然変異を含む可 能性を低めるため、Ｈ−及びＬ−鎖配列を含む少なくとも２種の独立クローン化 プラスミドの配列を比較し、そして同一であることが示される。

実施例Ｚ　ＤＮＡ操作のためのクローニングベクターの構築２．１　ベクターＫ Ｓ＋ｅｘ　ＰｖｕＫ　二ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”　ＫＳ＋プラスミドベクター（ Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅ）の中での発現のためのＭＫ２−２３ＬＰＣＲ１配列のク ローニングを助長するため、（２つの）非本質的なＰｖｕ　Ｉ［制限部位を排除 する。ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”　ＫＳ＋プラスミドＤＮＡ（１０℃ｇ　）をＰｖ ｕ　Ｉｆにより完全消化して約２３００及び３６０　ｂｐの２本の直鎖ＤＮＡフ ラグメントを作り上げる。これらのＤＮＡフラグメントをエチジウムプロミドを 含む１％のアガロースゲル上での電気泳動により分け、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡ Ｎ”　（ＢＩＯ１０１Ｉｎｃ、）を用いて精製する。このことは、約１５０　ｎ ｇの精製された３６０　ｂｐフラグメントと、約６００　ｎｇの２３００ｂｌ） フラグメントを供する。この大きめ（２３００ｂｌ））のフラグメントを２０章 位の仔牛小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ　：　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） で処理する。このＣＩＡＰ−処理フラグメントを次にフェノール／ＣＨＣｌ５　 、次いでＣＨＣｌ、で抽出し、０．５４容量のイソプロパツールにより、０．３ ＭのＮａ０Ａｃ、　ｐ）１７．０の存在下で沈殿させ、そしてそのＤＮＡベレッ トで一２０°Ｃで７０％（Ｖ／Ｖ）のエタノールで洗う。そのペレットを風乾し 、そして６μｌのＴＥ−バッファーの中に溶かす。

ＮｃｏＩ　ＤＮＡ制限部位を含むオリゴヌクレオチドリンカー（１μＩのＩ（， ０の中で１０ｎｇ）　（ｐＣＣＣＡＴＧＧＧ　；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂｓ）を、３６．５ａ　Ｉ　ｃＤＨｔＯ、５ｉｔ　１　（７）ＩＯＸ　 ノＰＮＫバッファー、０．５　μｍ（７）０．１　Ｍノジチオスレイトール、ｌ μｌの５０ｍＭのスペルミジン及び５μｌの１０ｍＭのＡＴＰを含む溶液の中で 、１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ） により３０ｎ＋ｉｎ　３７°Ｃで処理する。リン酸化リンカ−を１１．ｔ　Ｉ　 （１５０ｎｇ）の３６０　ｂｐのＰｖｕ　Ｉ［−消化ＫＳ＋プラスミドＤＮＡフ ラグメント及び５μｌのＣＩＡＰ−処理化２３００ｂｐフラグメント（２００ｎ ｇ）に加える。この混合物のフラグメントをフェノール／ＣｌＣ１，、次いでＣ ＨＣｌ２で抽出し、モして０，３ＭのＮａ０Ａｃ、　ｐＨ７，０の存在下で一２ ０°Ｃでエタノールにより沈殿させ、７０％（Ｖ　／　Ｖ　）のエタノールで洗 い、風乾し、そして０．５＋＋＋Ｉの８２０の中に溶かす。このプラスミドＤＮ Ａ／リンカ−混合物を、１０．０００単位１５μｍのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、）を用いて、１００　μｌのＤＮＡ　 リガーゼバッファー、１００　μｌの０．１Ｍのジチオスレイトール、５０μｍ の２０ｍＭのＡＴＰ及び２４５μｌの８２０を含む全容量１ｍｌの溶液の中で４ ℃で一夜すゲートさせる。リゲーション産物を大腸菌に１２／Ｂ２２３４に形質 転換し、アンピシリン耐性コロニーを選別し、そして標準の手順（３ＨＩｂｒｏ ｏｋら、前掲、第１．８２−８４章及び第１．２５−２８章）を利用してプラス ミドＤＮＡ調製品を作る。３６０　ｂｐ及び２３００ｂｐ　ＤＮＡフラグメント 間の両方の連結部においてリゲートされた後天的Ｎｅｏ　Ｉ−リンカ−を有する プラスミドをＮｅｏ　Ｉを用いるＤＮＡ制限分析により検出する。

Ｎｃｏ　Ｉ制限部位をかかるプラスミドの一つから、Ｎｃｏ　Ｉにより最後まで 消化することにより排除し、この消化ＤＮＡのサンプルをフレノウＤＮＡポリメ ラーゼにより平滑末端フラグメントが作り上げられるように処理し、そしてＮｃ ｏＩｒ付着末端」を排除し、次いでＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてそのフラグメン トを再すゲートに付する。これらは全て前記及び実施例１．３に記載の標準手順 を利用する。

ＫＳ＋ｅｘ　Ｐｖｕｎと呼ぶ最終プラスミドは、ＫＳ＋ベクターの中のＰｖｕ　 ＩＩ制限部位のもとの位置においてＮｅｏ　Ｉリンカ−を含み、それにおいては そのＮｅｏ　Ｉ部位はフレノウＤＮＡポリメラーゼを用いて排除されている。３ ６０　ｌａｐ及び２３００ｂｐ　ＫＳ＋ＤＮＡフラグメントの相対配向及びポリ リンカーＤＮＡクローニング部位はＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”　ＫＳ＋ベクターに おけるのと同じのままとなっている。

３８３３−３８３７．１９８９　；　Ｔｈｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ、　２０　ＰａｒｋＣｒｅｓｃｅｎｔ、　Ｌｏｎｄｏｎ　Ｗ ＩＮ　４ＡＬにより入手可能となっている）はそれぞれ８１７　ｂｐ及び６８４ １）ｐのＢａ１ｌ（Ｉ　／ＨｉｎｄＩ［制限フラグメントを含み、実施例１．２ 及び１．３に記載のオリゴヌクレオチドを用いてＭＫ２−２３細胞ＲＮＡから増 幅させたＩｇ　Ｈ−及びＬ−ＩＶ−領域ＤＮＡ配列を受容可能である。これらの ＢａｍＨＩ　／　Ｈｉｎｄｌ［［ベクターＤＮＡフラグメントはマウス１ｇプロ モーター、リーダーペプチドエクソン及び機能的に再配列したＶ−Ｄ−Ｊ及びＶ −Ｊ−Ｖ領域エクソンを含む。

このＤＮＡを大腸菌に１２／ＴＧＩに形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡを標 準の手順を利用して調製する：各バクテリオファージＤＮＡ調製品をそれぞれＢ ａｍＨＩ及び旧ｎｄＩ［Ｉを用いて最後まで消化し、そして各ケースにおいて小 さめのＢａｍＨＩ　／　Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ［［フラグメント（Ｍ１３−ＶＨＰＣＲ Ｉニツイては８１７１）ｐ、そしテＭ１３−ＶＫＰＣＲＩＩ：ツイテは６４８　 ｂｐ）を、エチジウムプロミドを含む０．８％のアガロースゲル上で電気泳動に より単離する。Ｕ、Ｖ、イルミネーションのもとて識別化される適正なサイズの ＤＮＡバンドをそのゲルから切り出し、そしてそのアガロースから電気溶離によ りＤＮＡを回収し、それに続いてフェノール／Ｃ１（Ｃ１，抽出、及びイソプロ パツールによる沈殿を行う。ＤＮＡベレットを風乾し、そして別々に１０μｍの ＴＥ−バッファーに溶かす。

２．２．１　ベクターＫＳ＋ＶＨＸ−Ｖｅｃ　：　Ｍ１３−ＶＨＰＣＲＩにおい て、ＢａｍＨＩ　／ＨｉｎｄＩＩｌ［セグメントは酵素ＰｓｔＩ及びＢｓ　ｔＥ 　ＩＩにとっての固有の内在ＤＮＡ制限部位を含み、「無関係」なＩｇ　Ｈ−鎖 Ｖ−領域の除去及びＭＫ２−２３ＨＰＣＲ１のＰｓｔＩとＢｓｔＥＩ［制限部位 との間に位置するが如きのＶ−領域配列による交換が可能となっている。ＤＮＡ 増幅プライマーＶＨＩＦＯＲ及びＶＨＩＢＡＣＫの中でのＰｓｔＩ及びＢｓｔＥ Ｉ［の正確な位置は、Ｈ−鎖ポリベブチドコード配列が、このＶ−領域タンパク 質の発現を助長するまわりのＤＮＡ配列と共に、適正な翻訳フレームの中に維持 されることを確実にする。

この８１７　ｂｐ　Ｍ１３−ＶＨＰＣＲＩ　ＤＡＮフラグメントをＢＬＵＥＳＣ ＲＩＰＴＴＭＫＳ＋ベクターにリゲートした後にクローンする。このベクターは 使用のために制限酵素ＢａｍＨＩ　＋Ｈｉｎｄｌ［［による消化、それに続くフ ェノール／　ＣＨＣ１，及びＣＨＣｌ、による抽出、エタノール沈殿、遠心、７ ０％のエタノールによる洗浄、そのＤＮＡベレットの乾燥及びＴＥ−バッファー の中での溶解により調製する。リゲーションは、２μｍのＢａｍＨＩ＋Ｈｉｎｄ Ｉ［処理済ベクターＤＮＡ（４０μｇ）　、　２．５　μｍのＭ１３−ＶＨＰＣ ＲＩ　ＤＮＡフラグメント（２，５μｍ）　、　１．５　ｕ　１の１０ｍＭのＡ ＴＰ、　ｔ、ｓ４１の０．１Ｍのジチオスレイトール、１．５μｍのＤＮＡリガ ーゼバッファー、４．５μｍのＴＥ−バッファー及び１゜５μｌ　（６００単位 ）のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む １５μｌの溶液の中で１４°Ｃで６ｈ行う。

リゲーション産物を大腸菌に１２／ＴＧＩに形質転換し、アンピシリン耐性コロ ニーを選別し、そして標準の手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、第１、８２−８ ４及び１．２５−２８章）を利用してプラスミドＤＮＡを調製する。

８１７　ｂｐのＢａｍＨＩ　／ＨｆｎｄｌＩ［インサー）−ＤＮＡフラグメント を有する組換プラスミドを含むクローンを選別し、そしてその配列を、Ｔ３／７ ７オリゴヌクレオチドブライマーを用いてＳＥＱＵＥＮＡＳＥＴＭシステムを利 用して、その製造者（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ） により供される条件を用い、Ｍ１３−ＶＨＰＣＲＩに由来する推測フラグメント に相当するかを確認する。このプラスミドをＫＳ＋ＶＨ−Ｖｅｃと称する。

ＫＳ＋Ｖ）Ｉ−Ｖｅｃを、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”　ＫＳ＋ポリリンカーに由来 するはじめからあるものに加えて第二のＸｂａ　Ｉ　ＤＮＡ制限部位の導入によ って更に改変させる。ＫＳ−ＶＨ−Ｖｅｃ　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨ ｉｎｄｎ［により最後まで消化し、そしてそのフラグメントを仔牛小腸アルカリ ホスファターゼにより標準の手順（実施例２．１参照）を利用して脱リン酸化す る。処理後、そのＤＮＡをＴＥ−バッファーの中に１２０　ｎｇ／ｍｌの濃度で 溶かす。溶解後、そのＤＮＡフラグメント（０，５μｌ）を、１μｍのＸｂａ　 Ｉオリゴヌクレオチドリンカー（ｐＣＴＣＴＡＧＡＧ　；５００　ｎｇ／　ｕ　 １　；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、）、１．５μｍの１０ｍＭ のＡＴＰ、１．５μｌの０．１Ｍのジチオスレイトール、１．５μｌのＤＮＡリ ガーゼバッファー及び７．５μｌのＴＥ−バッファーに加え、そして１．５μｍ （６００単位）Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ ｓ　）を用いて１４°Ｃで一夜すゲートする。リゲーションの後、その混合物を 大腸菌に１２／ＴＧＩを形質転換するために用い、アンピシリン耐性コロニーを 選別し、そしてプラスミドＤＮＡ調製品を上記の通り、標準の手順（Ｓａｍｂｒ ｏｏｋら、前掲、第１．８２−８４及び１．２５−２８章）を利用して作る。

後天Ｘｂａ　Ｉ−リンカ−配列を存するプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＸ ｂａ　Ｉを用いる消化によって検出する。−のプラスミドを選別し、そしてその ヌクレオチド配列が、ＢＬＵＥＳＣＲｒＰＴ”　ＫＳ＋配列の中のもとの旧ｎｄ Ｉ［制限部位において組込まれた追加のＸｂａ　Ｉ−リンカ−配列を有するか確 認する。

２、Ｚ２　ベクターＫＳ＋ＶＫＸ−Ｖｅｃ　：　Ｈ１３−ＶＫＰＣＲＩにおいて 、Ｂａｍ１（Ｉ　／Ｂｉｎｄｌ［セグメントは酵素Ｐｖｕ　Ｉｆ及びＢｅ１ｌに とっての固有の内在ＤＮＡ制限部位を含み、［無関係ＪなＩｇ　Ｌ−ＭＶ−領域 の除去及びＶＫ２−２３ＬＰＣＲ１のＰｖｕ　ＩＩとＢｇｌｌＩ制限部位との間 に位置するが如きのＶ−領域配列による変換が可能となっている。ＤＮＡ増幅プ ライマーＶＫＩＦＯＲ及びＶＫＩＢＡＣＫの中でのＰｖｕ　ＩＩ及びＢｇｌＩ［ の正確な位置は、Ｌ−鎖ポリペプチドコード配列が、Ｖ−領域タンパク質の発現 を助長するまわりのＤＮＡ配列と共に適正な翻訳フレームの中に維持されること を確実にする。このＤＮＡ制限酵素ＢｃｌＩはＤａｍ＋メチル化に対して感受性 であるため、適当なりａｍ−宿主株、例えば大腸菌に１２／ＢＺ１０３．　Ｋ１ ２／Ｅ３２２５又はに１２／Ｒ８３２を、クローニング目的のためにＢｃｌ　Ｉ 制限部位を利用するため、ここで意図するファージ及びプラスミドの増幅のため に使用しなければならない。

Ｈ１３−ＶＫＰＣＲＩの６４８　ｂｐのＢａｍＦＩ　１　／　）ｌｉｎｄＩ［Ｄ ＮＡフラグメントをＨ１３−ＶＨＰＣＲＩと類似の手法で（実施例２．２．１　 ）　、ＢａｍＨＩ　／１（ｉｎｄｌｌ［−消化法ＫＳ＋ｅｘ　ＰｖｕＩ［ベクタ ー（実施例２．１に記載）へのリゲーションによってクローンする。形質転換後 、コロニーを選別し、６４８　ｂｐのＢａｍＨＩ　／　ＨｉｎｄＩ［インサート フラグメントを有する組換プラスミドを含むものを分析し、そしてその配列を９ 、上記の通りにＴ３／Ｔ７オリゴヌクレオチドブライマーを伴う５ＥＱＵＥＮＡ ＳＥ”システムを利用してＭｌ　３−ＶＫＰＣＲ１に由来する予測のフラグメン トに相当するかを確認する。

このプラスミドをＫＳ　＋　ＶＫ　−Ｖｅｃと称する。

このＫＳ　＋　ＶＫ　−Ｖｅｃベクターを、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”　ＫＳ＋ポ リリンカー配列中でのＨｉｎｄＩ［制限部位でのＸｂａ　Ｉ−リンカ−の導入に より更に改変し、そしてその配列をＫＳ＋Ｖｌ（Ｘ−Ｖｅｃについて記載したの と類似の手法で確認する（実施例Ｚ２．１）。プラスミドＤＮＡを大腸菌に１２ ／Ｒ８３２（Ｄａｍ−）の中に、そのｅｅｌ　Ｉ制限部位をクローニング目的の ために非メチル化状態に保つために形質転換する。最終プラスミドベクターをＫ Ｓ＋ＶＫＸ−Ｖｅｃと称する。

ヒトＤＮＡライブラリーをバクテリオファージスベクターシャロン４ａの中で、 ヒト胎児肝臓ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼＨａｅｌ［ｒ及びＡｌｕ　Ｉによ り公開の手順（Ｌａｗｎら、Ｃｅ１ｌ　１５．１１５７．１９７８）を用いる限 界消化により構築する。約ｌＸｌ０’の個の組換ファージを大腸菌Ｋｌ　２／８ ０３上にプレートし、そして相同性ネズミＩｇ　Ｈ−鎖ＤＮＡプローブを用いて ヒトＩｇＨ−ＩＤＮＡ配列の存在についてスクリーンする。

マウスＩｇγ２ｂ遺伝子座のＸｂａ　Ｉ　／　Ｈｈａ　Ｉフラグメントに相当す るニック翻訳済３２ｐ−ラベルマウスＩｇＧ　Ｈ−鎖ＤＮＡプローブを前述の通 り（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ら、Ｃｅ１ｌ　２９．６７１−６７９．１９８２）組 換ファージをスクリーンするために用いる。分析したーのＤＮＡクローン（＃　 ９５／　４　）は、制限地図化及びヌクレオチド配列分析による決定に従い、ヒ トＩｇＧ１定常領域エクソンＣＨＩ　、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３を包括す る７ｋｂのＨｉｎｄｌｌ［ＤＮＡセグメントを含む。配列決定したクローン＃９ ５／４の一部は公開のヒトＩｇＧ１遺伝子配列（ＥＭＢＬデーターベース配列エ ントリー１（ＵＭｒＧＣＣ４）に相当し、これは７ｋｂのＨｉｎｄＩ［［セグメ ントの−の末端（）１ｉｎｄＩ［Ｉ）制限部位から始まる（Ｅｌｌｉｓｏｎら、 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１０．４０７１−４０７９．１９８２）。

ヒトＩｇＧ１定常領域エクソンを含むクローン＃９５／４由来の７ｋｂのＨｉｎ ｄＩ［ＤＮＡフラグメントを脱リン酸化ＢＬＵＥＳＣＲｒＰＴ”　ＫＳ＋ベクタ ーのＨｉｎｄＩ［Ｉ部位の中にサブクローンし、そして大腸菌Ｋ１２／ＴＧＩに 形質転換せしめる。アンピシリン耐性コロニーを採取し、プラスミドＤＮＡを調 製し、そしてサブクローンされた７ｋｂのＤＮＡフラグメントを含むものを標準 の手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、第１．８２−８４及び１．２５−２８章） を利用して単離する。−のクローンに由来するプラスミドＤＮＡを同定し、それ においてはヒトＩｇＧＩ　Ｃ）Ｉｆエクソンの５′に位置するＨｉｎｄｌ１１部 位はＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”　ＫＳ＋のポリリンカーのＸｂａＩ　ＤＮＡ制限部 位の隣りに並んでいる。このプラスミドをγＩ−ＫＳ＋と称する。

ヒトＩｇＧ１コード配列を含むγ１−ＫＳ＋の全７ｋｂＤＮＡインサートを、こ のヒトＤＮＡインサートの両側上でＫＳ＋ポリリンカーを切断するＥｃｏＲＩ　 ／　Ｘｂａ　Ｉを用いるγ１−ＫＳ＋の消化の後に（いづれの酵素もγ１−ＫＳ ＋の７ｋｂの）ｌｉｎｄｎ［インサー）　ＤＮＡフラグメントを含まない）、エ チジウムプロミドを含む１％のアガロースゲル上での電気泳動により回収する。

このＤＮＡフラグメントを電気溶離し、フェノール／ＣＨＣｌ、　、次いでＣＨ Ｃ１，で抽出し、そして標準の手順を利用してエタノール沈殿／遠心により回収 する。このＤＮＡをフラグメント１と称する。このＤＮＡをＴＥ−バッファーの 中に溶かし、そして−２０°Ｃで保存する。

３．２　ネズミＩｇＨ−鎖転写エンハンサーを含むＤＮＡフラグメント［ｇ　Ｈ −鎖遺伝子座のヌクレオチド２８７７−３５６３に相当する６８６　ｂｐのＸｂ ａ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡフラグメント（ＧＥＮＢＡＮにデーターベース エントリーＭＵＳＳ　ＩＧＣＤＯ７）をＥｃｏＲＩ　／　Ｘｂａ　Ｉ−消化法Ｂ ＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”　ＫＳ＋ベクターの中にクローンし、そしてＴ３及びＴ７ オリゴヌクレオチドブライマーを伴う５ＥＱＵＥＮＡＳＥ”システムを利用して その配列を確認する。

このプラスミドをｐＤＡ２４／　３と呼ぶ。このｐＤＡ２４／　３のインサート ＤＮＡウムブロミドを含む１％のアガロースゲル上での電気泳動の後に回収する 。このＤＮＡをＴＥ−バッファーの中に溶かし、そして−２０°Ｃでｐｓｖｇｐ ｔ　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　＆　Ｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｔ）１）、　Ｇ ｅｎｅｔ、　１．３２７．１９８２）の中への同時リゲーションにクローンし、 ＥｃｏＲＩを用いる消化により線状化する。このＤＮＡリゲーション混合物は消 化法のｐｓＶ２ｇｐｔベク　−ターＤＮＡ（ＩｇＩのＴＥ−バッファー中ｓｏｎ ｇ）　、フラグメント１（１，３μｌのＴＥ−バッファー中７０ｎｇ）　、フラ グメント２（１，０μｍのＴＥ−バッファー中７ｎｇ）　、１．５　ａ　１の１ ０ｍＭのＡＴＰ、　１．５μｍの０．１Ｍのジチオスレイトール、１．５μｌの ＤＮＡリガーゼバッファー、５．７　μｍ　（７）ＴＥ−バッファー及び１．５ 　ｔｔ　Ｉ　ノＴ４　ＤＮＡリガーゼ（６００単位；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ 　Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む。リゲーションは１４℃で一夜行う。

大腸菌に１２／ＴＧＩの中への形質転換の後、アンピシリン耐性組換体を同定し 、そしてプラスミドＤＮＡを標準の手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、第１．８ ２−８４及び１．２５−２８章）を利用して調製する。ＤＮＡクローンを、酵素 ＥｃｏＲＩ、　ＢａｍＨＩ、　ＨｉｎｄＩ［［、ＰｖｕＩｒ及びＸｂａ　Ｉを用 いる制限分析結果に基づいて選択する。適当なりＮＡ制限特性を有するプラスミ ドを選び、そしてＨｕγＩ−ＥＨ−ｇｐｔと呼ぶ。このプラスミドはｐｓＶ２ｇ ｐｔ配列、並びに固有Ｘｂａ　Ｉ切断部位により分割されたマウスＩｇＨ−鎖エ ンハンサー及びヒトＩ［ｉＧ１定常領域エクソンを含む。

Ｘｂａ　Ｉセグメント（公開の生殖細胞系列１ｇ　Ｌ−鎮座のヌクレオチド位置 ６５９−２９００　；　１Ｊａｘら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　７６、３４５０−３４５４．１９７９　；　ＥＭＢＬデーター ベース配列エントリーＭｔｊＳ　ＩＧＫＪＣ２）に相当するニック翻訳済３ｆｆ ｉＰ−ラベル化ネズミＩｇ生殖細胞系列り一部Ｊ−領域ゲツムＤＮＡプローブを 調製する。このプローブを、相同性ヒトＣにＬ−鎖ＤＮＡ配列を含むセグメント についてのヒト組換λフアージＤＮＡライブラリーをスクリーンするのに、Ｉｇ 　Ｈ−鎖配列について記載のと類似の手順を利用して用いる（実施例３．１）。

陽性ハイブリダイズ用組換ファージを選び、そして標準の手順を利用してＤＮＡ を調製する。

ヒトＩｇ（、ｃ定常領域エクソンを含む約２．５ｋｂのＢａｔ　Ｉ　／　Ｅｃｏ ＲＩフラグメントに相当するＤＮＡフラグメントをクロスハイブリダイズ用組換 ファージよりサブクローンする（ｔｌｉｅｔｅｒら、Ｃｅ１ｌ　η、　１９７− ２０７、１９８０）。このＢａ１Ｉ　ＤＮＡ制限部位及びＣにコード領域はＥＭ ＢＬデーターベース配列エントリーＨＵＭＩＧＫＣ３に記載されている；Ｂａ１ ＩＤＮＡ切断部位＝ヌクレオチド位置３１．Ｃにコード領域＝ヌクレオチド位置 ３３４−６５６　。使用するクローニングベクターはＳｍａ　Ｉ　／　ＥｃｏＲ Ｉ消化法ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ”　ＫＳ＋とし、そして利用する方法は標準のク ローニング手順とする（　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、第１．６３−７０章）。

所望のＤＮＡ制限特徴を有する組換プラスミドを選び、そしてその構造をＴ３及 びＴ７オリゴヌクレオチドブライマーを伴う５ＥＱＵＥＮＡＳＥ”システムを利 用し、その製造者のプロトコールに従って部分配列決定により確認する。このプ ラスミドをｐＤＡ２７と呼ぶ。

ｐＤＡ２７は酵素Ｘｂａ　Ｉにとっての２つのＤＮＡ制限部位を含む；一方はＫ Ｓ＋ポリリンカーに由来し、第二はＥｃｏＲＩ部位から約１ｋｂに位置するｐＤ Ａ２７のヒトＣにＤＮＡインサートにおける部位にある。発現ベクターの構築に おけるその後の利用を助長するため、後者のＤＮＡ制限部位を下記の通りに排除 する：　ｐＤＡ２７　ＤＮＡ（３０℃ｇ）を４μｍのＸｂａＩ（１単位／　μｌ 　；　１３ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）により３７°Ｃで４５ｍ１ｎ部分消化する。次 にこのＤＮＡをフェノール／ＣＨＣｌ、　、　Ｃ）Ｉｃ１．で抽出し、エタノー ル沈殿に付し、そして１０８ｍのＮＴ−バッファー、４μｌの混合ｄＮＴＰ　（ ２ｍＭづツ；Ｎ＝Ａ、　Ｔ、　Ｇ及びＣ）の加えた８２μｌの蒸留Ｈ，０に溶か す。フレノウフラグメントＤＮＡポリメラーゼ（４μｍ；４．９単位／μＩ　： 　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を加え、そしてその混合物を室温で３０ｍ１ｎインキ ユベートし、その後その酵素を６５°Ｃで５ｍ１ｎ熱することにより熱不活性化 せしめる。部分消化は、約５．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを作り上げ、これを エチジウム　プロミドを含む０．８％のアガロースゲル上での電気泳動により最 終消化産物から分離する。電気泳動後、その５．５ｋｌ）のＤＮＡバンドをその アガロースゲルから電気溶離させ、そしてフェノール／クロロホルム抽出により 回収し、そして前述の通りエタノール沈殿に付す。このＤＮＡペレットを２０μ ｌのＴＥ−バッファーの中に溶かす（収量的４０ｎｇ）。この材料の半分を再す ゲートし、大腸菌に１２／ＢＺ２３４に形質転換し、そしてアンピシリン耐性コ ロニーを選別する。プラスミドＤＮＡを適当なりローンから調製し、そしてＥｃ ｏＲＩ　十Ｘｂａ　ｒの組合せにより消化する。適正にＸｂａ　Ｉ部位の排除さ れたプラスミドは二つのＥｃｏＲＩ／　ＸｂａＩ　ＤＮＡ制限フラグメントを作 り上げるニ一方は約３ｋｂ（ＫＳ＋ベクター配列を含む）、そして他方は２．ｓ ｋｂ／ヒトＣに一含有フラグメント）。かかるプラスミドの一つを選別し、そし てｐＤＡ２８と呼ぶ。

ここで、ヒトＣに一コード領域の５′に位置するＸｂａＩ　ＤＮＡ制限部位（Ｋ Ｓ＋ポリリンカー由来）を含むｐＤＡ２８の２．５ｋｂのヒトＤＮＡフラグメン トをＥｃｏＲＩ　／　Ｘｂａ　Ｉによる消化によってこのプラスミドから回収し 、そして０．８％のアガロースゲル上での電気泳動により精製し、続いてフェノ ール／ＣＨＣｌ２　、次いでＣ）ＩＣ１ｚによる抽出、エタノール沈殿、乾燥及 びＴＥ−バッファーの中での溶解を行う。このント２（ネズミＩｇＩ４−鎖　転 写エンハンサ−を含む約７００　ｂｐのント：実施例４．１）をベクターｐＳＶ ２ｎｅｏ　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　＆　Ｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ａｐｌ）　ｃ、Ｇｅｎｅｔ、Ｉ　、　３２７．１９８２）への同時リゲーション によりクローン、ＢｃｏＲＩを用いる消化によって線状化する。ＤＮＡを、２０ ｎｇのＤＮＡリガーゼバッファー、２μｌのｌ０ｍＭのＡＴＰ、２μｍの０．１ Ｍのジチオスレイトール及び１０μｍの８１０を含む混合物の中で、１μｍのＴ ４　ＤＮＡリガーゼ（４００単位／　μｌ　；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ ｏｌａｂｓ）を用いて１４℃で一夜すゲートする。このリゲーション混合物を大 腸菌ＫＩ２／８０３に形質転換し、アンピシリン−耐性コロニーを選別し、そし て標準の手順を利用してプラスミドＤＮＡを調製する（　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、 前掲、第１．８２−８４及び１．２５−２８章）。プラスミドをＥｃｏＲＩ　／ 　Ｘｂａ　Ｉ及びＰｓｔｌによる消化によって分析し、そしてＤＮＡフラグメン トの所望の配向を有するものを選び、ＨｕＣに−ＥＨ−ｎｅｏと称する。

ターＫＳ＋ＶＨＸ−Ｖｅｃ　（７，５ｔｔ　ｇ　；実施例２．２．１）を制限エ ンドヌクレアーゼＢｓｔＥＩＩ／　Ｘｂａｒを用いて最後まで消化し、次いでそ のＤＮＡフラグメントをエチジウムプロミドを含む０．８％のアガロースゲル上 で分画する。消化は、「無関係」なＶ−領域遺伝子セグメント（約３３０　ｂｌ ｌ）及び約３．３ｋｂのＢｓｔＥＩＩ／　ＸｂａＩベクターＤＮＡ　：７ラグメ ントを示し、それをゲルから切り出し、電気溶離により回収し、フェノール／Ｃ ＨＣｌ２　、次いでｃｏｃｔｓで抽出し、そしてエタノールで沈殿に付す。遠心 後に得られるＤＮＡベレットを７０％のエタノールの中で一２０℃で洗い、そし て蒸留Ｈ，Ｏに溶かす。

プラスミドＭＫ２−２３ＨＰＣＲ１（約３０μｇ；実施例１．４）を制限エンド ヌクレアーゼＢｓｔＥＩＩ／　ＰｓｔＩにより完全に消化し、クローン化ＭＫ２ −２３Ｉｇ　Ｈ−鎖Ｖ−領域を含む約３３０　ｂｐのＤＮＡフラグメント（ＳＥ ｏ　１ＯＮＯ：３）が遊離される。このフラグメントを１％のアガロースゲル上 での電気泳動によりベクター配列から分離し、Ｇ２ＮＥＣＬＥＡＮ”（ＢＩＯ１ ０１Ｉｎｃ、）を用い、その製造者により供される手順を利用して分画により回 収する。ＤＮＡを一２０゛Ｃで２．５容量の９５％のエタノールにより、０．３ ＭのＮａ０Ａｃ、　ｐＨ７，ｏの存在下で沈殿させ、同一の温度で７０％のエタ ノールを用いて洗い、そしてＴＥ−バッファーの中に溶解する。その収量は約６ ００１ｇのＤＮＡである。

前記の通りｌ：　ＫＳ＋Ｖ）ＩＸ−Ｖｅｃより単離した約３．３ｋｂ（７）ベク ターＤＮＡ　７ラグメント（２μｌの８２０中１０１００Ｏを、単離した約３３ ０　ｂｐのＭＫ２−２３　［ｇ　Ｈ−！ＩＩＶ−領域ＤＮＡフラグメント（ｌμ ｌのＴＥ−バッファ−中１０ｎｇ）と共に４℃で、１ｕ１のＤＮＡリガーゼバッ ファー、１μｍの０．１Ｍのジチオスレイトール、０．５μｌの２０ｍＭのＡＴ Ｐ　、　３．５μｌのＨｚＯ及びｌμｌのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（４００単位／ μｌ；ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でリゲートさせる。Ｄ ＮＡリゲーション産物を大腸菌に１２／ＢＺ２３４の中に形質転換せしめ、アン ピシリン耐性コロニーを選別し、そしてプラスミドＤＮＡクローンを同定する。

予測のＤＮＡ制限特性を有するいくつかのクローンを同定し、モしてＭＫ２−２ ３　１ｇ　Ｈ−ＭＶ−領域を含む一クローンをＴ３／Ｔ７オリゴヌクレオチドブ ライマーを伴う５ＥＱＵＥＮＡＳＥ”システムを用い、その製造者のプロトコー ルを利用して配列決定する。このＤＮＡクローンをクローン＃７８２と呼ぶ。。

りｏ−：／＃４０７　Ｉｔ、Ｍ１３−ＶＨＰＣＲ１カセット（実施例２．２ニ記 載）への一体化により発現のために適応されたＭＫ２−２３　ｒｇ　Ｈ−鎖Ｖ− 領域を含む。この適応したＨ−鎖Ｖ−領域エクソンと、Ｈ−鎖リーダーペプチド エクソン、及びＭ１３−Ｖ）ＩＰＣＲＩカセットに由来するプロモーター因子は 、Ｘｂａ　ｒによる消化によって約８３０　ｂｐのＤＮＡフラグメント上にクロ ーン＃４０７から一緒に遊離する。このＸｂａ　Ｉフラグメントを大型のベクタ ー含ＷＤＮＡフラグメントから、０．８％のアガロースゲル上での電気泳動によ り分け、フェノール／ＣｌＣ１，抽出により精製し、そして標準の手順によりエ タノール沈殿に付し、次いでＴＥ−バッファーに溶解する。このＤＮＡフラグメ ントをプラスミドベクター〇ｕγ１−ＥＨｇｐｔ　（実施例３．３）に下記のよ うにリゲートする二２００　ｎｇのＸｂａ　Ｉ消化法、脱リン酸化Ｈｕγ１−Ｅ Ｈ−ｇｐｔ（２ｔｔ　１のＴＥ−バッファー中）及び１０ｎｇの単離化ＤＮＡフ ラグメント（０，５μｌのＴＥ−バッファー中）を、２μｌのＤＮＡリガーゼバ ッファー、２μｌの０．１Ｍのジチオスレイトール、ｌμｌの２０ｍＭのＡＴＰ 及び１０．５μｌのＨ，０に加える。ＤＮＡリゲーションを４℃で、２μｍの７ ４　ＤＮＡリガーゼ（８００単位；　Ｎｅｗ　ＩＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ ｓ）を用いて一夜行う。ＤＮＡリゲーション産物を大腸菌に１２／ＢＺ２３４に 形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選び、そして標準の手順を利用してプ ラスミドＤＮＡを調製する（　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、第１．８２−８４及 び１．２５−２８章）。挿入された約８３０　ｂｐのＸｂａＩ　ＤＮＡフラグメ ントを発現のために必要な方向で含むプラスミドをＢｓｔＥＩＩにより検出する 。プラスミドＤＮＡを−のＤＮＡクローンから調製し、ＭＫ２−２３−Ｈｕｒ　 Ｉ　Ｈ３と称する。

５．２　キメラＩｇ　Ｌ−鎖発現ベクターＭＫ２−２３−　Ｈｕ　Ｃｔｃの作製 二ベクターＫＳ＋ＶＫＸ−Ｖｅｃ　（６０μｇ　；実施例２’１Ｌ２）を制限エ ンドヌクレアーゼＢｃｌ　Ｉ　／　ＰｖｕＩ［を用いて最後まで消化し、仔牛小 腸アルカリホスファターゼにより標準の手順（実施例２．１参照）を利用して脱 リン酸化し、そしてそのＤＮＡフラグメントを、ＴＢＥ−バッファーを用いてエ チジウムプロミドを含む０．８％のアガロースゲル上で分画する。

消化は、「無関係ｊなＶ−領域セグメント（約３００　ｂｐ）及び約３．３ｋｂ のＢｃｌ　Ｉ　／　ＰｖｕＩ［ベクターＤＮＡフラグメントを遊離させ、これを ゲルから切り出し、電気溶離により回収し、フェノール／ＣＨＣｌ、、次いでＣ ＨＣ１，で抽出し、そしてイソプロパツールで沈殿させる。遠心により得られる ＤＮＡペレットを７０％のエタノールの中で一２０°Ｃで洗い、そして１００μ ｌのＴＯ−バッファーの中に溶かす。

プラスミドＭＫ２−２３　ＬＰＣＲＩ　（実施例１．４）を制限エンドヌクレア ーゼＢｇｌＩＩ／　Ｐｖｕπにより完全に消化し、クローン化ＭＫ２−２３　１ ｇ　Ｌ−鎖Ｖ−領域を含む約３８０　ｂｐのＤＮＡフラグメント（ＳＥＱ　＋Ｏ ＮＯ：　１）を遊離する。このフラグメント・を０，８％のアガロースゲル上で の電気泳動によりベクター配列から分け、電気溶離により回収し、フェノール／ ＣＨＣｌ、　、次いでＣＨＣｌ、により抽出し、−２０℃で２．５容量の９５％ のエタノールにより０．３ＭのＮａ０Ａｃ、　ｐＨ７，０の存在下で沈殿させ、 ７０％のエタノールで同じ温度で洗い、モしてＴＥ−バッファーの中に溶かす。

前記のとおりにＫＳ＋ＶＫＸ−Ｖｅｘから単離した約３．３ｋｂの脱リン酸化ベ クターＤＮＡフラグメント（２μｍのＴＥ−／＜ソファ−中２００　ｎｇ）を、 ２μｌの０．１Ｍのジチオスレイトール、１μｍの２０ｍＭのＡＴＰ　、　１０ μｌの１ｌｔＯ，２μｌのＤＮＡリガーゼノくソファー及び２μ］　（８００単 位；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）のＴ４　ＤＮＡリガーゼの存 在下で、単離した約３２０　ｂｐノＭＫ２−２３　１ｇ　Ｌ−鎖Ｖ−領域ＤＮＡ ７ラグメント（１μｍのＴＥ−バッファー中５０ｎｇ）と共にリゲートする。Ｄ ＮＡリゲーション産物を大腸菌に１２／ＢＺ２３４に形質転換し、アンピシリン 耐性コロニーを選別し、プラスミドＤＮＡを単離し、そしてＸｂａ　Ｉを用ｔ） る制限分析によりクローンを同定し、そして配列分析をＴ３及びＴ７オリゴヌク レオチドブライマーを有する５ＥＱＬＩＥＮＡＳＥ”システムを用Ｊ、Ｘ、製造 者のプロトコールに従い行う。−のクローンを選ぶ。このクローンをクローン＃ １４０１と呼ぶ。

クローン＃　１４０１は、Ｍ１３−ＶＫＰＣＲＩカセット（実施例Ｚ２に記載） への一体化により発現のために適応されたＭＫ２−２３　１ｇ　Ｌ−鎖Ｖ−領域 を含む。この適応したＬ−ＭＶ−領域エクソンと、Ｌ−鎖す−ダーペプチドエク ソン、及びＭ１３−ＶＫＰＣＲＩカセットに由来するプロモーター因子は、Ｘｂ ａ　Ｉによる消化によって約６５０　ｂｌｌのＤＮＡフラグメント上にクローン ＃　１４０１から一緒に遊離する。この小さめのＸｂａ　Ｉフラグメントを大型 のベクター含有ＤＮＡフラグメントから、０．８％のアガロースゲル上での電気 泳動により分け、フェノール／ＣＨＣｌ！　抽出により精製し、そして標準の手 順によりエタノール沈殿に付し、次いでＴＥ−バッファーに溶解する。このＤＮ ＡフラグメントをプラスミドベクターＨｕＣに−ＥＨ−ｎｅｏ（実施例４．２） に下記のようにリゲートする：　１００　ｎｇのＸｂａ　Ｉ消化法、脱リン酸化 ＨｕＣｔｃ　−ＥＨ−ｎｅｏ（１μｌのＴＥ−バッファー中）及び２０ｎｇの単 離化ＤＮＡフラグメント（４μｌのＴＥ−バッファー中）を、ｌμｌのＤＮＡリ ガーゼバッファー、１μｌの０．１Ｍのジチオスレイトール、０．５μｌの２０ ｍＭのＡＴＰ、　１．５μｍのＨ，０及び１μｌの７４　ＤＮＡリガーゼ（４０ ０単位；　Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を加える。リゲーションは １５°Ｃで２ｈ行う。ＤＮＡリゲーション産物を大腸菌に１２／ＢＺ２３４に形 質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選び、そして標準の手順を利用してプラ スミドＤＮＡを調製する（　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、第１．８２−８４及び １．２５−２８章）。挿入された約６５０　ｂｐのＸｂａ　Ｉ　ＤＮＡフラグメ ントを発現のために必要な方向で含むプラスミドをＢｓｔＥＩ［により検出する 。プラスミドＤＮＡを−のＤＮＡクローンから調製し、ＭＫ２−２３−　Ｈｕ　 Ｃｐｃ　１４０６と称する。

実施例６、　ＭＫ２−２３−ＥｕｒＩ　Ｈ３及びＭＫ２−２３−　ＨｕＣｔｃ　 １４０６を用いるｓｐ　２１０ミエローマ細胞のトランスフェクション６、１　 細胞の増殖及び調製：　Ｓｐ　２１０　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１）はリンパ 起源のよく特徴付けられたマウス細胞系である。これはマウス牌臓細胞と、ミｘ 　ｏ　−ｖ　ＭＯＰＣ−２１のサプラインである（にｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅ ｉｎ。

Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６．　５１１．　１９７６　；　Ｓｈｕｌｍａｎ 　ら、Ｎａｔｕｒｅ　２７６゜２７０、１９７８）ミエローマＸ６３−Ａｇ３と の融合により得られる［ｇ非分泌性細胞系変異体である。Ｓｐ　２１０細胞を３ ７°Ｃで、５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（Ａｍｉｍｅｄ）、　１　ｍＭのピルビン酸ナ トリウム（Ｇｉｂｃｏ）、２　ｍＭのし一グルタミン（Ａｍｉｍｅｄ）　、　ｌ ０ｍＭのＨＥＰＥＳバッフｙ　＋、　ｐＨ７，４（Ｓｅｒｖａ）及び１０μｇ／ ｒｎｌのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）の加えたＨＢＩＯｆ”培地（ＨａｎａＢ ｉｏｌｏｇｉｅｓ）の中で増殖させる。

細胞を、１７５　ｃがの組織培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ、　３１５１）の中で 、組織培養インキュベーター中で湿った雰囲気のエアー及び５％のＣＯ３におい て増殖させる。細胞を５０ｍ１の滅菌チューブ（Ｆａｌｃｏｎ２０７０）の中で 、４°Ｃ（２００ｘ　ｇ、　８００　ｒｅｖ／ｗｉｎ　；　Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ 、　６Ｂ／Ｐ遠心株）の中での緩やかな遠心により回収し、−１２０“Ｃで、清 浄な滅菌プラスチックキャップ付きチューブの中の１５％のＦＣＳ　（Ａｍｉｍ ｅｄ）及び７．５％（Ｖ　／　Ｖ　）のジメチルスルホキシド（５ｅｒｖａ）の 中に凍結及び保存する。

感染の２４ｈ前、Ｓｐ　２１０細胞を新鮮な増殖培地の中へとｌＸｌ０″細胞／ ＋ｎｌの濃度で継代培養する。トランスフェクションの直前に、細胞を上述の通 りに回収し、そしてその細胞ペレット（全部で約９×１０７の細胞数）をＰＢＳ −ＣＭの中で４°Ｃで２回洗い、そして同一のバッファーに約ｌＸｌ０”細胞／ ｍｌの濃度で再懸濁する。

６．２　ＤＮＡフラグメントの調製及び感染：トランスフェクションのため、プ ラスミドＤＮＡ　ＭＫ２−２３−Ｈｕｒ　ｌ　Ｈ３（実施例５．１）及びＭＫ２ −２３−Ｉ（ｕＣに１４０６　（実施例５．２）を制限エンドヌクレアーゼＥｃ ｏＲＩを用い、キメラマウス：ヒトＩｇ　Ｈ−及びＬ−鎖インサートＤＮＡフラ グメントを遊離させるために最後まで消化する。消化したＤＮＡをフェノール／ Ｃ）Ｉｃ１．　、次いでＣｌＣｌ５で抽出し、−２０°Ｃでエタノールにより０ ．３ＭのＮａ０Ａｃ、　ｐＨ７，０の存在下で沈殿に付し、７０％のエタノール により同一の温度で洗い、そしてＴＥ−バッファーの中に再懸濁させる。

それぞれの消化したプラスミドＤＮＡのサンプル（５ｇｇ）を合わせ（ＴＥ−バ ッファー中で！５μｍの全容量）、そして事前に増殖させておいた２　Ｘ　１０ ７（２００μｍ）のｓｐ　２１０細胞に０℃で加え、前述の通りに洗い、そして ＰＢＳ−ＣＭの中に再懸濁させる（実施例６．１）。この細胞とＤＮＡを、水冷 滅菌ＰＢＳ−ＣＭを用いて０°Ｃに予め冷却しておいたＴＡ７５０エレクトロト ランスフェクション装置（Ｋｒｕｅｓｓ　Ｇ＋ｎｂＨ）のバレルの中に引き入れ る。細胞を、その製造者により供されるシリンダー状エレクトロポレーションチ ャンバーを用い、２回の１０μｓにわたる３５００　ｖ　／　ｃｍの電気パルス に、パルスの間で３０ｓの間隔を伴って委ねる。細胞を清浄な滅菌冷凍チューブ （Ｎｕｎｃ）の中にゆっくり注ぎ入れ、そして氷上にＩＯ分保ぢ、その後それら を１５％（Ｖ　／　Ｖ　）のＦＣＳ（Ａｍｉｍｅｄ）を含む付加ＨＢＩＯＩ”増 殖培地（前記の実施例６を参照）の中で希釈しく１’：　３．　ｖ／ｖ）　、そ して室温で２０＋＋＋ｉｎインキユベートする。次にこれらの細胞を１００　ｍ ｌの同じ増殖培地の中に更に希釈し、そして１ｍｌのサンプルを２４−ウェルＮ ｕｎｃｌｏｎＴＩ１組織培養クラスター（Ｄｅｌｔａ）のウェルに分注する。３ ７°Ｃで２４ｈのインキュベーション後、各ウェル中の０．５ｍｌの増殖培地を 除去し、そして付加ＨＢＩＯＩＴ′″（Ｈａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）　＋　 １　：　４５の希釈率のＨＴ　（Ｓｉｇｍａ、　５０　ＸＨＴ培地補助物）及び １ｍｇ／ｍｌのジエネチシン（Ｇｉｂｃｏ）の付加された１５％（ｖ　／　ｖ　 ）のＦＣＳ（Ａｍｉｍｅｄ）を含む予め温めておいた選択培地０．５ｍｌに置き 換える。この培地の半分を４８１１毎に追加の前述の選択培地と交換し、そして 選別を少なくとも１４日間続ける。

１ｇを分泌するクローンを抗−ヒトＩｇに一部及び抗−ヒトＩｇＧ抗体を用いる ＥＬＩＳＡにより以下の通りに同定する：９６穴マイクロタイタープレート（Ｎ ｕｎｃｌｏｎＴＭｍａｘｉｓｏｒｐ）にＰＢＳ中の１　：５００（ｖ／ｖ）の希 釈率のヤギ抗−ヒトに抗体（Ｔａｇｏ、　４１０６）　５０μｌを、４℃での一 夜インキュベーションによりコートする。次にプレートをＰＢＳ＋０．０５％の Ｔｗｅｅｎ−２０”　（Ｆｌｕｋａ）で６回洗い、続いて３７°Ｃで２０ｍ１ｎ 　、　ＲＩＡ−バッファー（１００μｌ／ウエル）でインキュベートする。プレ ートを再びＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０”　（Ｆｌｕｋａ）で洗う。

トランスフェクト−マクローン（実施例６．１）由来の細胞培養上清液をＲＩＡ −バッファーを用いて希釈し、各ウェルに５０μｍのサンプルを加え、そしてそ のマイクロタイタープレートを３７°Ｃで２ｈインキユベートする。細胞培養上 溝液によるインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅ ｎ−２０Ｔ１″（Ｐｌｕｋａ）を用いて６回洗い、その後ＲＩＡ中のアルカリホ スファターゼコンジュゲート化モノクローナルマウス抗−ヒトγ重鎖抗体５０ｕ ｌ／ウェル（１：　１０００．　ｖ／ｖ希釈率；　Ｓｉｇｍａ　Ａ−１６６８） を加え、そしてそのプレートを３７°Ｃで２ｈインキユベートする。再びプレー トをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０”　（Ｆｌｕｋａ）で６回洗い、モ してｐ−ニトロフェニルホスフェート基質を加え（１００μｍ／ウェル；Ｓｉｇ ｍａ　１０４ホスファターゼ基質錠剤；４％５ｍｇの錠剤を２０ｍ１の基質バッ ファーに溶かす）、その後そのプレートを暗所で室温で１０ｍ１ｎインキユベー トする。それらのプレートを０．５ＭのＮａＯＨ（１００μＩ／ウエル）とイン キュベートし、そして光度計（ＴｒＴＥＲＴＥＫ”。

ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　ＭＣＣ）を用いてＡ４６＠を測定する。組換ＭＡｂの濃度 を、精製マウス：同一のヒトアイソトープのヒトキメラ抗体（ＩｇＧ１．　に） の希釈系列より成る標準品を対照に決定する。

陽性ウェル由来のサンプルを限界希釈によりクローンする。組換ＭＡｂ　ＭＫ２ −ＣＨγｌを産生するＭに２−ＣＢｒ４−６と称する−のクローンが選別される 。

実施例＆　マウス／ヒトキメラＭＡｂ　ＭＫ２−Ｃ）ｌγ１の特異性ａ）　ＥＬ ＩＳＡ ネズミ抗−イディオタイプＭＡｂ　ＭＫ２−２３は、ネズミＭＡｂ　７６３．７ ４　（実施例１参照）　、ＩｇＧ１．　にアイソトープのモノクローナル抗体上 のイディオタイプ決定基を認識する。

マイクロタイタープレート（９６穴Ｎｕｎｃｌｏｎ”　ｍａｘｉｓｏｒｐ）に、 ＰＢＳ中の１：８５（ｖ／ｖ）の希釈率の精製ネズミＭＡｂ　７６３．７４　（ ストック濃度０．８５ｍｇ／ｍｌ）　５０μｍを、４°Ｃでの一夜のインキュベ ーションによりコートする。次にプレートをＰＢＳ４０．０５％のＴｗｅｅｎ− ２０”　（Ｆｌｕｋａ）で６回洗い、続いて３７°Ｃで２０ｍ１ｎ　、　ＲＩＡ −バッファ　（１００μ！／ウエル）でインキュベートする。プレートを再びＰ ＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０”　（Ｆｌｕｋａ）で洗う。トランスフェ クト−７ＭＫ２−Ｃｌ７１−６並びに陰性コントロールとしての異なる別個の特 異性の２つの対合（ＩｇＧ１゜に）キメラ抗体（ＣＨ（’ｆ−１３−３３及びＦ ５−ＣＩ（γｌ）由来の細胞培養上溝液をＲＩＡ−バッファーを用いて希釈し、 その５０μｍをマイクロタイターウェルに加え、そしてそのプレートを３７℃で ２ｈインキユベートする。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ＋０．０ ５％のＴｗｅｅｎ−２０”　（Ｆｌｕｋａ）を用いて６回洗い、その後ＲＩＡ中 のアルカリホスファターゼコンジュゲート化モノクローナルマウス抗−ヒトγ重 鎖抗体５０μｌ／ウェル（１：　１０００．　ｖ／ｖ希釈率；　Ｓｉｇｍａ　Ａ −１６６８）を加え、そしてそのプレートを３７°Ｃで２ｈインキユベートする 。再びプレートをＰＢＳ４０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０”　（Ｆｌｕｋａ）で ６回洗い、そしてｐ−ニトロフェニルホスフェート基質を加え（１００μｌ／ウ ェル；　Ｓｉｇｍａ　１０４ホスファターゼ基質錠剤；４％５ｍｇの錠剤を２０ ＋ｎｌの基質バッファーに溶かす）、その後そのプレートを暗所で室温で１０ｍ １ｎインキユベートする。それらのプレートを０．５ＭのＮａＯＨ（１００μｍ ／ウェル）とインキュベートし、そして光度計（ＴＩＴＥＲＴＥＫ”、　ｍｕｌ ｔｉｓｃａｎ　ＭＣＣ）を用いてＡ４．、を測定する。結果（Ａ４−１値）を下 記の表に示す二発色抗体　Ｆ５−Ｃｌ７１　ＣＨＣｌ−１３−３３ＭＫ２−Ｃｌ ７１（上清液） 抗−ヒトｒ　Ｏ，０１７０，０１３ｏ、７８０ｂ）オフタロ二−二重拡散アッセ イ オクタロニー二重拡散アッセイは、５μｌの精製Ｍａｂ　７６３，７４゜ＭＡｂ 　ＭＫ２．２３又１；！ＭＡｂ　ＭＫ２−Ｃｌ７１　（０，５ｍｇ／ｍｌ）　、 ヤギ抗−ヒトｒｇｃ（Ｐｃ）　（Ｊａｃｋｓｏｎ　１０９−００５−０８９）及 びヤギ抗−マウスＩｇＧ　（Ｐｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ　１１５−００５−０７１ ）を用いて行った。Ｍａｂ　ＭＫ２−Ｃｌ７１はＭＡｂ７６３、７４、抗−ヒト ＩｇＧ　（Ｐｃ）及び抗−ヒトに抗血清とのみ沈殿系を形成した。

ＭＫ２−ＣＨγ１　°　＋　＋　＋　−ＭＫ２−２３　＋　−−＋ ｇ／ｌのＤ−グルコースを含むＤＭＥＭ　（Ｇｉｂｃｏ）、　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ 　Ｍｉｘ　Ｆ１２）ＩＡＭ　（Ｇｉｂｃｏ）及びＲＰＭＩ　（Ｇｉｂｃｏ）のｌ 　：　１　：　１　（ｖ／ｖ）の混合物であり、以下の添加物を伴う：Ｌ−グル タミン（３００ｍｇ／　１　、　Ｓｉｇｍａ）、ピルビン酸ナトリウム（７３ｍ ｇ／　Ｉ　＋　Ｇｉｂｃｏ）、グルコース（１，７ｇ／ｌ、　Ｆｌｕｋａ）、β −メルカプトエタノール（２，３ｍｇ／　１　、　Ｓｉｇｍａ）、エタノールア ミン（１３，３ｍｇ／　１．　Ｓｉｇｍａ）、ＮａＨＣＯａ　（２，３ｇ／　１ 　、　Ｍｅｒｃｋ）及びゲンタマイシン（１０ｍｇ／　１　、　Ｓｉｇｍａ）。

隻里且は竺１０工と同じ組成を有するが、しかし更に２％（ｖ　／　ｖ　）のυ １ｔｒｏｓｅｒ”　ＨＹ　（Ｇｉｂｃｏ）を含む。

トランスフエフトーマＭＫ−Ｃ８γ１−６の細胞（実施例７）を培地２の中で無 血清条件のもとての増殖に順応させる。無血清順応細胞の永久ストックを凍結保 存する。培養のため、細胞を培地２の中に４×１０４細胞／ｍｌの初期細胞濃度 において、３７゛Ｃ１５％のＣＯ！　＋　９５％の湿度において、Ｂｒｏｕｗｅ ｒインキュベータータイプ３０３５の中で継代培養する。５０ｍ１中の５Ｘ１０ ”の細胞（９１％の生存率、Ｔｒｙｐａｎ　Ｂｌｕｅ”染色を利用して測定）を 、Ａｃｕｓｙｔ　−ＪｒＴＩ′ｌ１１動中空ファイノく一細胞培養システム（Ｅ ｎｄｏｔｒｏｎｉｃｓ　Ｉｎｃ、、　Ｃｏｏｎ　Ｒａｐｉｄｓ、　ＴＭ　５５４ ３３．　ＵＳＡ）を接種せしめるのに用いる。この培養システムはその製造者の 仕様に従い、循環培地として培地ｌを、そして細胞増殖培地として培地２を用い て作動させる。３７°Ｃで７日間の増殖後、培地ｌの循環を開始し、そして培養 上演液の最初の収穫物を取る。細胞培養は正常な運転条件で７０日まで続ける。

細胞培養上清液中の抗体の濃度を実施例７のＥＬＩＳＡを利用して決定する。

実施例１Ｏ，キメラＭＡｂ　ＭＫ２−ＣＨγ１の精製−７０℃に保った１０１０ ０Ｏの細胞培養上清液を室温で融解し、そして０．２２μｍのフィルターを介し て無菌条件のもとで濾過する。その濾液を３ｍｌ／ｗｉｎで５ｅｐｈａｒｏｓｅ ７ＴｈＩＣＬ−４８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に汲み入れて、その溶液から全ての 大型の凝集物を除去する。このカラムが出る液体を直接、プロティン−Ａアガロ ースの第二カラム（２，５ｃｍ×７　ｃｍ）（ＩＰＡ　３００　、固定化組換プ ロティン−Ａ、　Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ。

ＵＳＡ）に通す。１００　ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６，０を両力ラムに 、３ｍｌ／ｎ＋ｉｎにて、その溶離液の２８０１ｍでの吸光度（ＵＶ−１モニタ ー、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が０に達し、且ツｐ）１が６．０（タイプ２１９５ｐ Ｈ／導電率メーター、ＬＫＢ）となるまで通す。このプロティン−へカラムに結 合した所望の抗体を次にその両力ラムに１００　ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐ １４．０で３ｍｌ／ｍｉｎで浸入れることにより溶離させる。溶離した抗体を２ ８０　ｎｍでの吸光度により検出し、そして大傷的に滅菌５０ｍ１プラスチツク チユーブ（Ｃｏｓｔａｒ）の中に集める。１２０　ｍｌの全容量を集める。

プールしたプロティン−Ａ溶離液を、導電率（モデル４０７０導電率メーター、 Ｊｅｎｗａｙ、　Ｅｓ５ｅｘ、　ＵＫ）が２．３ｍＳに下がるまで（全容量５０ ０ｍ１）滅菌水で希釈する。この溶液を５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０ で平衡化したＳ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ”　ＨＰ　（ＨＲ３５／１００．　Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）のプレパックカラムに５ａ＋ｌ／ｍｉｎで通ずる。このカラムを ５０ｍＭの酢酸ナトリウムで５ｍｌ／ｍｉｎにて、その導電率及びｐＨがもとの 平衡値に達し、且つＵｖ吸光度が０に達するまで洗う。結合した抗体を、１００ ％の５０ＩＩＩＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０から１００％の５０ｍＭの酢酸 ナトリウム及び５００　ｍＭ（７）ＮａＣ１，ｐＨ５，０に至る、８５ｍ１ｎに わたる３ｍｌ／ｍｉｎの流速での勾配により溶離させる。この抗体はメジャービ ーク及びマイナーピークにおいて５３＋ｎｉｎで溶離し始める。両ピークを大傷 的に２本の滅菌プラスチックの３００　ｍｌのボトルに集め、そのｐＨをＩＭの トリスペースでｐＨ７，０に合わせ、そしてその溶液を０．２２μｍのフィルタ ー　（Ｓｔｅｒｉｖｅｘ−ＧＳ”、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を介して無菌条件の もとで濾過し、そして４°Ｃで保存する。メジャー及びマイナービークは共に所 望の抗体を含む。Ｓ５−５ｅｐｈａｒｏｓｅＴ上での泳動度における相違は、抗 体のグリコジル化の相違の結果と思われる。

メジャーピークのタンパク質を含む溶離液を、ＹＭＩＯマイクロ濾過膜を有する Ａｍ１ｃｏｎ　８０５０撹拌セルを利用するマイクロ濾過により２０ｍ１の容量 に下げる。この抗体のサンプル２０ｍ１を次に自動的に、ＰＢＳで平衡化された ５３００　）ＩＲゲル濾過カラム（１，３ｘ６５ｃｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ） に載せる。溶離する抗体を２８０　ｎｍでのＵ■吸収により検出する。そのタン パク質を大傷的に集め、そして０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ）を介して滅菌ポリスチレンフラスコの中に滅菌濾過する。その調製品を暗所で ４°Ｃで保存する。

実施例１１．非経口投与のための薬理製剤実施例１Ｏ由来の１０ｍｇのキメラ抗 イデイオタイプモノクローナル抗体ＭＫ−ＣＨγ１を５０ｍ１のＰＢＳに溶かす 。この溶液を滅菌フィルターに通し、その濾液を１０等分し、そして無菌条件の もとてアンプルに充填する。そのアンプルは低温、例えば４°Ｃで保存すること が好ましい。この薬理製剤は注射のために適切であり、そしてそのまま、又はみ ょうばんを含む薬理製剤、ＢＣＧ　（バチルス　カルメツチーブニリン）を含む 薬理製剤、もしくはムラミルペプチドＭＴＰ−ＰＥを含む薬理製剤と一緒に適用 する。

寄託データｍ： ハイブリドーマ細胞系ＭＫ２−ＣＩγ１６は、寄託番号９２０３０６４２のもと で、１９９２年３月６日に、ヨーロピアン　コレクション　オブ　アニマル　セ ル　カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）、ボートン　ダウン、サリズノくリー、ウィル ツ５Ｐ４０ＪＧ、英国に寄託した。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：チバーガイギーエージー （Ｂ）通り：クリベクストリー）　：　１４１（Ｃ）市：バセル （Ｅ）国；スイス （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　４００２（Ｇ）電話番号：　＋４１６１６９１ １１１（Ｈ）テレファックス番号：　＋４１６１６９６７９７６（Ｉ）テレック ス番号：　９６２９９１（ｉｉ）発明の名称：遺伝子操作抗体 （ｉｉ）配列の数＝４ （ｉｖ）コンピューター読取方式 （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣ コンパチブル（Ｃ）作動システム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフト ウェアー：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０．　Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５　（ＥＰＯ） （ｖ）現出願人データｍ： 出願番号： （２）　ＩＤ　Ｎｏ　：　Ｉについての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３３４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー２直鎖 （ｉｉ）分子の梨：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉ）ヒボセティカル：ＮＯ （汁）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端 （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置ニア、、３３０ （Ｄ）その他の情報：／備考＝［抗体ＭＫ２−ＣＨガンマ−１の軽鎖可変ドメイ ン」 （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ｍ１ｓｃ特徴 （Ｂ）位置：　１．．２４ （Ｄ）その他の情報：／機能＝「プライマーＶＫＩＢＡＣＫＪ（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：組ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置ニア、、１２ （Ｄ）　ソ（７）他の情報：／機能＝［制限部位ＰＶＵＩＩＪ（欣）特徴： （Ａ）名称／キー：ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置：　７０．．１１４ （Ｄ）その他の情報：／機能＝　ｒＣＤＲル」（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置：　１６３．．１８０ （Ｄ）その他の情報：／機能＝　ｒＣＤＲ２Ｌ　Ｊ（ｉｘ）特徴： （Ｂ）位置：　２７７、　、３０３ （Ｄ）その他の情報：／機能＝　ｒｃＤＲ３Ｌ　Ｊ（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 −ら （１ｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置：　３２６．．３３１ （Ｄ）その他の情報：／機能＝「制限部位ＢＧＬＩＩＪ（ｘｉ）配列の詳細：Ｓ ＥＱ　ｉＤ　Ｎｏ　：　１　：ＧＡＣＡＴｒ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＡＣＣＣＡＧ　 ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＴＣＴ　ＣＴＴ　 ＧＧＧＧｉｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌ ｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙｌ　５　１０ ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡ　ＧＣＣＡＧＴ　ＧＭ 　ＡＧＴ　ＧＴｒ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＴＡＴＧｌｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ工 ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇ ｌｕ　Ｔｙｒ　、ＴｙｒＧＧＣＴＣＡ　ＡＧＴ　ＴＴＡ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＴＧ Ｇ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＣＣ ＣＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｍｅセ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ 　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

人ＡＡ　ＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　ＴＣＣＡＡＣＧＴＡ　Ｇ ＡＡ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＧＴＣＣＣＴ　ＧＣＣＬｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　工１ｅ 　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ 　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａｓｏ　５５　６；Ｑ ＡＧＧ　ＴＩＴ　ＡＧＴ　ＧＧＣＡＧＴ　ＧＧＧ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＡＣＡ　Ｇ ＡＣＴｒＣＡＧＣＣＴＣＡＡＣＡ”ＩＮ：　ＣＡＴＡｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌ ｅｕ　Ａｓｎ　工１ｅ　ＨｉｓＣＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡに　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＧＡ Ｔ　ＡＴＴ　ＧＣＡ　ＡＴＧ　ＴＡＴ　ＴＴＣＴＧＴ　ＣＡＧ　ＣＭ　ＡＧＴ　 ＡＧＧＰｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　工ｌｅ　Ａｌａ　Ｍ ｅヒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＡＭ　ＡＴｒ 　ＣＣＧ　ＴＡＣＡＣＧ　ＴＴＣＧＧＡ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＡＣＣＡＡＧ　ＣＴ Ｇ　ＧＡＧ　ＡＴＣＴＡＡＣＬｙｓ工ｌｅ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ工１ｅ（２）　ＳＥ Ｑ　ＩＤＮ０　：　２についての情報：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：１０８アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の詳細＋　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２　：Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ 　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｉｒ 　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｒｇｌ　５　１０　１５ Ｖａｌ　Ｔｈｒ工ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓ ｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　５ｅｒＳｅｒ　Ｌａｕ　Ｍｅ ＬＧｉｎ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ 　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　八ｌａ　 Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ａｒｇ　ＰｈｅＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ工１ｅ　Ａｌａ　Ｍｅｊ　Ｔｙ ｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ工１ｅＰｒｏ　 Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｕ　ｌ１ｅ（２）　ＳＥＱ　ＩＤＮ０　：　３についての情報：（１）配列 の特徴： （Ａ）長さ・３６８塩基対 （Ｂ）型二核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位１１：　９．．３５９ （Ｄ）その他の情報：／備考＝「抗体ＭＫ２−ＣＨガンマ−１の重鎮可変ドメイ ン」 （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ｗｉｓｅ特徴 （Ｂ）位置：　１．．２２ （Ｄ）　ソ（７）他の情報：／機能；［ブラー１’？　−Ｖ）ＩＩＢＡＣＫＪ（ ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：、ｍ１ｓｃ特徴 （Ｂ）位置：１０．夏４ （Ｄ）その他の情報：／機能；「制限部位ＰＳＴＩＪ（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ｍ１ｓｃ特徴 （Ｂ）位置：　９０．、ｌ０４ （Ｄ）ソノ他ノ情Ｉｉｌ：／機能＝　ｒｃＤＲＩＨＪ（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ｍ１ｓｃ特徴 （Ｂ）位置：　１４７．、ｌ９７ （Ｄ）その他の情報：／機能；　ｒｃＤＲ２ＨＪ（ｉｘ）特徴： （Ｂ）位置：　２９４．．３３５ （Ｄ）その他の情報：／機能；　ｒＣＤＲ３）Ｉ　Ｊ（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ｍ１ｓｃ−特徴 （Ｂ）位置：　３５３．．３５９ （Ｄ）その他の情報：／機能；「制限部位ＢｓｔＥＩＩＪ（ｘｉ）配列の詳細： 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３　：ＡＧＧ％ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　Ｔ ＣＴ　ＧＧＧ　ＧＧＡ　ＧＧＣＴｒＡ　ＧＴＧ、ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＧＧ Ｇ　ＴＣＣＬｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ 　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　５ｅｒＣＧＧ　ＡＡＡ　ＣＴＣＴ ＣＣＴＧＴ　ＧＣＡ　ＧＣＣＴＣＴ　ＧＧＡ　ＴＴＣＡＣＴ　ＴｒＣＡＧＴ　Ａ ＧＣ７７ｍ’　ＧＧＡＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｌ ａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌ ｙＡＴＧ　ＣＡＣＴＧＧ　ＧＴｒ　ＣＧＴ　ＣＡＧ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　 ＡＡＧ　ＧＧＧ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴＣＧＣＡＭｅｊ　Ｈｉｓ　Ｔｒ ｐ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　ＡｌａＴＡＣＡＴＴ　ＡＧＴ　ＡＧＴ　ＧＡＣＡ ＧＴ　ＡＧＴ　ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＣＡＣＡ　ＧＴＧ　Ｍ ＧＴｙｒ工ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ工１ｅ　Ｔ ｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＬｙｓＣＭ　ＡＴＧ　ＡＣＣ ＡＧＴ　ＣＴＡ　ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣＡＣＧ　ＧＣＣＡＴＧ　ＴＡ Ｔ　ＴＡＣＴＧＴ　ＧＣＡＧｉｎ　Ｍｅｌｌ、Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ 　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｍｅｎ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ 　Ａｌ■ ＡＧＡ　ＴＣＧ　ＡＡＣＴＡＴ　ＧＴＴ　ＧＧＴ　ＴＡＣＣＡＣＧＴＣＣＧＧ　 ＴＧＧ　ＴＡＣＴＴＣＧＡＴ　ＧＴＣＴＧＧＡｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　 Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　 Ａｓｐ　Ｖａｌ　ＴｒｐＧＧＣＣＭ　ＧＧＧ　ＡＣＣＡＣＧ　ＧＴＣＡＣＣＧＴ ＣＴＣＣＴＣＡＧｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ（ｉ ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１１７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｌ）配列の詳細：　ＳＥＱ　ＩＤＮｏ　：　４　：Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ 　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ 　Ｐｈｅ　Ｇｕｙ　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ２０　’　２５　３０ Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｙｒ工１ｅＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓ ｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ工ｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ 　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＳｏ　５５　６０ Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　 Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　ＭｅｔＴｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌ ｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｍｅｊ　Ｔｙｒ　Ｔ ｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　５ｅｒＡｓｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｙ ｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｒ ｐ　Ｇｌｙ　Ｇ１ｎＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ田Ｉｌ！！損審輻 台 １．７１１．７４１．１１．Ｈａ”丁／ＥＰ９３１００５０５フロントページの 続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１６／４６　 ８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０ １５１０９　ＺＮＡ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　７０５５−２Ｊ３３１５７４　Ｚ　７０５５−２Ｊ ３３１５７７　Ｂ　７０５５−２Ｊ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト定常領域と、ヒト高分子量一黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）上のエ ピトープの内部像である可変領域とを含んで成る抗イディオタイプモノクローナ ル抗体及びこの抗体の誘導体。 ２．前記可変領域が、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）上の、ＭＡｂ ７６３．７４と呼ばれるネズミモノクローナル抗体により認識される決定基の内 部像である請求項１記載の抗体及びその誘導体。 ３．その軽鎖可変領域が次式のポリペプチドＦＲ１−ＣＤＲ１Ｌ−ＦＲ２−ＣＤ Ｒ２Ｌ−ＦＲ２−ＣＤＲ２Ｌ−ＦＲ４（Ｉ）（式中、ＦＲ１は１９〜２３個の天 然アミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＦＲ２は１３〜１７個の天然 アミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＦＲ２は３０〜３４個の天然ア ミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＦＲ４は７〜１１個の天然アミノ 酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＣＤ１ＬはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミ ノ酸配列２２〜３６のポリペプチド残基であり、ＣＤＲ２ＬはＳＥＱＩＤＮＯ： １のアミノ酸配列５２〜５８のポリペプチド残基であり、そしてＣＤＲ２ＬはＳ ＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列９１〜９９のポリペプチド残基であり、そして ここでそのアミノ酸ＣｙｓはＳ−Ｓ架橋を形成している酸化状態でありうる） を含んで成る請求項１記載の抗体及びその誘導体。 ４．その軽鎖可変領域が次式のポリペプチドＦＲ５−ＣＤＲＩＨ−ＦＲ４−ＣＤ Ｒ２Ｈ−ＦＲ７−ＣＤＲ３Ｈ−ＦＲ６（ＩＩ）（式中、ＦＲ５は２５〜２９個の 天然アミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＦＲ６は１２〜１６個の天 然アミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＦＲ７は３０〜３４個の天然 アミノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＦＲ６は６〜１０個の天然アミ ノ酸を含んで成るポリペプチド残基であり、ＣＤＲ１ＨはＳＥＱＩＤＮＯ：３の アミノ酸配列２８〜３２のポリペプチド残基であり、ＣＤＲ２ＨはＳＥＱＩＤＮ Ｏ：３のアミノ酸配列４７〜６３のポリペプチド残基であり、そしてＣＤＲ２Ｈ はＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列９６〜１０９のポリペプチド残基であり、 そしてここでそのアミノ酸ＣｙｓはＳ−Ｓ架橋を形成している酸化状態でありう る） を含んで成る請求項１記載の抗体及びその誘導体。 ５．ヨーロピアンコレクションオブアニマルセルカルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）に １９９２年３月６日に、寄託番号９２０３０６４２のもとで奇託されているハイ プリドーマ細胞系ＨＫ２−ＣＨγ１−６により産生される、ＭＫ２−ＣＨγ１と 称される請求項１記載の抗体及びその抗体の誘導体。 ６．前記抗体のフラグメントであるか、又は修飾により前記抗体もしくは前記フ ラグメントより獲得できる分子である、請求項１記載の抗体の誘導体。 ７．請求項１記載の抗体又はその誘導体の製造方法てあって、本発明のタンパク 質を産生する適当な宿主細胞をインビトロ又はインビロで増幅し、そして必要で あれば、その所望のタンパク質を単離し、そして任意的にその誘導体に変換せし めることを特徴とする方法。 ８．請求項１記載の抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコードするイ ンサートを含んで成る組換ＤＮＡ。 ９．請求項３記載の式Ｉのポリペプチド（式中、ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３及びＦ Ｒ４は哺乳動物の抗体にあるフレームワーク領域であり、ＣＤＲ１ＬはＳＥＱＩ ＤＮＯ：１のアミノ酸配列２２〜３６のポリペプチド残基であり、ＣＤＲ２Ｌは ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列５２〜５８のポリペプチド残基であり、そし てＣＤＲ２ＬはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列９１〜９９のポリペプチド残 基である）をコードするインサートを含んで成る、請求項８記載の組換ＤＮＡ。 １０．請求項４記載の式ＩＩのポリペプチド（式中、ＦＲ５，ＦＲ６，ＦＲ７及 びＦＲ８は哺乳動物の抗体にあるフレームワーク領域であり、ＣＤＲ１ＨはＳＥ ＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列２８〜３２のポリペプチド残基であり、ＣＤＲ２ ＨはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列４７〜６３のポリペプチド残基であり、 そしてＣＤＲ３ＨはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列９６〜１０９のポリペプ チド残基である）をコードするインサートを含んで成る、請求項８記載の組換Ｄ ＮＡ。 ｌｌ．ハイブリドベクターである、請求項８記載の組換ＤＮＡ。 １２．請求項１１記載の組換ＤＮＡにより形質転換された宿主細胞。 １３．黒色腫の予防又は治療のための方法において使用するための、請求項１記 載の抗体又はその誘導体。 １４．請求項１記載の抗体及び／又はその鋳導体、並びに薬理学的に許容されて いる担体を含んで成る薬理組成物。 １５．ＨＨ−ＷＡＡに対して特異的な抗体の定性的及び定量的決定のための請求 項１記載の抗体及び／又はその誘導体の利用。 １６．請求項１記載の抗体及び／又はその誘導体を含んで成る、ＨＭＷ−ＭＡＡ に対して特異的な抗体の定性的及び定量的決定のための検査キット。