FI103477B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen vasta-aineen tai vasta-ainef ragmentin valmistamiseksi - Google Patents

Description

103477

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin valmistamiseksi

Jakamalla erotettu FI-patenttihakemuksesta 903056.

5 Tämä keksintö liittyy immunoglobuliinien tuottoon ja luonnossa esiintyvien vasta-aineiden aminohappojaksoihin tehtyihin muunnoksiin. Erityisesti tämä keksintö liittyy yhdistelmä-DNA-tekniikan käyttöön kimeeristen geenien 10 tuottamiseen ja näiden muokkausmenetelmien hyödyntämiseen kimeeristen vasta-aineiden konstruoimisessa.

Vasta-aineet ovat spesifisiä immunoglobuliini (Ig) -polypeptidejä, joita selkärankaisten immuunijärjestelmä tuottaa vasteena altistumisesta vieraille proteiineille, 15 glykoproteiineille, soluille tai muille antigeenisille vieraille aineille. Tapahtumasarja, jonka avulla organismin on mahdollista torjua vieraiden solujen tunkeutuminen tai vapauttaa elimistö vieraista aineista, tunnetaan ainakin osittain. Tärkeä osa tässä prosessissa on spesifisesti 20 tiettyä vierasta ainetta sitovien vasta-aineiden valmistus. Näiden polypeptidien sitoutumisspesifisyys tiettyä antigeeniä vastaan on hyvin hienostunutta, ja niiden spesifisyyksien lukumäärä, joita selkärankaisyksilö kykenee muodostamaan, on huomattava monimutkaisuutensa ja vaihte-·· 25 levuutensa puolesta. Miljoonat antigeenit kykenevät herät tämään vasta-ainevasteita kunkin vasta-aineen ollessa suunnattu miltei yksinomaan sen herättänyttä nimenomaista antigeeniä vastaan.

Nykyisin on käytössä kaksi tärkeintä selkärankais-30 ten vasta-ainelähdettä - muodostaminen nisäkkäiden B-lym-’ .· fosyyttien toimesta in situ ja muodostaminen B-soluhybri- dien toimesta soluviljelmässä. Vasta-aineet muodostuvat in situ tuloksena B-lymfosyyttien esiasteiden erilaistumisesta plasmasoluiksi, joka tapahtuu vasteena tiettyjen anti-35 geenien aiheuttamalle stimulaatiolle. Immunoglobuliini- 2 103477 ketjujen eri alueita koodaavat DNA-alueet ovat erilais-tumattomien B-solujen genomin DNA:ssa erillään toisistaan. Ennen ilmentymistä nämä jaksot kootaan vaiheittain yhteen. Katsauksen tähän prosessiin on laatinut Gough (1981) 5 Trends in Biochem. Sei. 6, 203.

Tulokseksi saatu uudelleenjärjestetty geeni pystyy ilmentymään kypsissä B-lymfosyyteissä halutun vasta-aineen tuottamiseksi. Jopa silloinkin, kun tietty nisäkäs altistetaan vain yhdelle antigeenille, ei saada tulokseksi yh-10 denmukaista vasta-ainepopulaatiota. Tiettyä nimenomaista antigeeniä vastaan suunnattu immuunivaste in situ määräytyy antigeenin pinnalla olevia useita eri determinantteja vastaan muodostuneista vasteista koostuvan mosaiikin perusteella. Kukin homologisten vasta-aineiden alajoukko on 15 yhden B-solupopulaation tuottama - tämän vuoksi vasta-aineiden muodostuminen in situ on "polyklonaalista".

Tämä rajoitettu, mutta luontainen heterogeenisyys on voitettu useissa erityistapauksissa käyttämällä hybri-doomatekniikkaa "monoklonaalisten" vasta-aineiden muodos-20 tamiseksi soluviljelmissä B-soluhybridoomien avulla, [ks. Kohler ja Milstein, C., (1975) Nature 256, 495 - 497], Tässä menetelmässä antigeenillä ruiskutetusta nisäkkäästä saadut suhteellisen lyhytikäiset eli kuolevaiset splenosyytit tai lymfosyytit fuusioidaan kuolemattomaan ·· 25 kasvainsolulinjaan, josta siten muodostuu hybridisoluja eli "hybridoomia", jotka ovat sekä kuolemattomia että pystyvät tuottamaan tämän B-solun geneettisesti koodaamaa vasta-ainetta. Näin muodostuneet hybridit segregoidaan yksiksi geneettisiksi kannoiksi valikoimalla, laimentamal-30 la ja uudelleenkasvatuksella ja kukin kanta edustaa siten .· yhtä geneettistä linjaa. Tämän vuoksi nämä kannat tuotta vat vasta-aineita, jotka varmuudella ovat homogeenisia haluttua antigeeniä vastaan. Puhtaaseen geneettiseen polveutumiseen viitaten näitä vasta-aineita nimitetään "mono-35 klonaalisiksi".

3 103477

Monospesifiset monoklonaaliset vasta-aineet ovat vaikuttaneet immunologiaan suuresti ja niiden käyttökelpoisuus luonnontieteissä, kuten biologiassa, farmakologiassa, kemiassa ja muissa tieteissä on jo osoitettu. Näille 5 monoklonaalisille vasta-aineille on löytynyt laajaa käyttöä ei vain diagnostisina reagensseina [ks. esim. teos Immunology for the 80's, Voller, A., Bartlett, A. ja Bid-well, D. (toim.) MTP Press, Lancaster, 1981] vaan myös hoidossa [ks. esim. Ritz, J. ja Schlossman, S.F., (1982) 10 Blood 59, 1 - 11].

Vaikkakin hybridoomien tuottamat monoklonaaliset vasta-aineet ovat edellä esitetyn tarkastelun mukaisesti teoriassa tehokkaita ja ne ovat spesifisyytensä puolesta polyklonaalisia vasta-aineita edullisempia, niillä on yksi 15 merkittävä heikkous. Monissa sovellutuksissa muissa eläimissä kuin ihmisissä tuotettujen monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö on hyvin rajoitettua, kun monoklonaalisia vasta-aineita aiotaan käyttää ihmiseen. Toistuvat "vieraan" vasta-aineen, kuten hiiren vasta-aineen, ruiskeet 20 ihmisiin voivat johtaa haitallisiin yliherkkyysreaktioihin. Tällainen muusta kuin ihmisestä peräisin oleva mono-klonaalinen vasta-aine aiheuttaa ihmiseen ruiskutettuna ei-ihmisvasta-aineen vastaisen (ANHA) vasteen. Tiettyä hiirestä peräisin olevien vasta-aineiden käytöstä aiheu-25 tunutta ANHA-vastetta, ihmisen hiirivasta-ainetta vastaan syntynyttä (HAMA) vastetta, on tarkasteltu julkaisussa Shawler et ai. . (1985) Journal of Immunology 135, 1530 - 1535 .

Uskotaan, että ihmisen muuttumattomia alueita omaa-30 vat eläinten immunoglobuliinit aiheuttavat ihmiseen injek-' ' toituina pienemmän ANHA-vasteen kuin muusta eläimestä kuin ihmisestä peräisin olevan muuttumattoman alueen sisältävät eläinten immunoglobuliinit. Valittuja antigeenejä vastaan hyviä sitoutumisaffiniteettejä ja ihmiseltä peräisin ole-35 via muuttumattomia alueita omaavilla monoklonaalisilla d 103477 4 vasta-aineilla arvellaan sellaisenaan olevan suurta hyödyntämispotentiaalia immunologisessa diagnostiikassa ja syöpäpotilaiden hoidossa.

Tähän mennessä on tehty useita yrityksiä ihmisestä 5 peräisin olevien monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ihmisen hybridoomia käyttäen. On esimerkiksi valmistettu ihmis-ihmishybridoomia [Olsson et ai. . (1980)

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 5429]; ihmis-hiirihybridoo-mia [Schlom, J., et ai.. (1980) ibid. 77, 6841] ja useita 10 muita vierasperäisiä hybridiyhdistelmiä. Ihmisen mono-klonaalisia vasta-aineita on myös tuotettu transformoimalla lymfosyyttejä Epstein-Barr-virusta käyttäen. Tällaisissa hybridoomissa voi kuitenkin mahdollisesti esiintyä patogeenisiä ihmisviruksia. Vaihtoehtoisesti on vasta-ainei-15 ta tuottavia primäärisiä B-soluja tehty kuolemattomiksi in vitro virus-DNA:11a transformoimalla. Ihmishybridoomaso-lulinjoista saadut monoklonaalisten vasta-aineiden saaliit ovat valitettavasti suhteellisen pieniä (1 μg/ ml ihmis-hybridoomissa verrattuna 100 μg/ml hiiren hybridoomissa) 20 ja tuotantokustannukset ovat korkeat.

Vaikka ihmisen immunoglobuliinit ovat hyvin haluttuja syöpäpotilaiden immunologisessa diagnostiikassa ja hoidossa, eivät ihmishybridoomatekniikat ole vielä saavuttaneet vaihetta, jossa tarvittavia antigeenispesifisyyksiä 25 omaavia ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita voisi olla helposti saatavissa. Lisäksi selvien eettisten syiden vuoksi tutkijat eivät voi immunisoida ihmisiä valituilla toksisilla tai muuten haitallisilla aineilla tiettyä antigeeniä vastaan suunnattujen vasta-aineiden muodostamisek-30 si. Ihmisen kyseessä ollessa tämä asettaa suuria rajoituksia potilaiden immunologiselle diagnostiikalle ja hoidolle.

Ihmisestä peräisin olevien monoklonaalisten vasta-aineiden tuotto on varmasti mahdollista, mutta tämä on 35 vielä tehotonta alhaisen toistettavuuden ja edellä mainit- s 103477 tujen muiden ongelmien vuoksi. [Ks. lisäksi Nature 3 00, 316 - 317 (1982)]. Useimmat monoklonaaliset vasta-aineet ovat tämän vuoksi peräisin muista eläimistä kuin ihmisestä .

5 Suurella sitoutumisaffiniteetilla ihmisen syöpäan- tigeeneihin reagoiva monoklonaalinen vasta-aine, jota ei tunnisteta vieraaksi aineeksi ihmisessä, on hyvin haluttu. Menetelmä tämän vaikeuden välttämiseksi on muodostaa keinotekoisesti vasta-aine, joka on hyvin suuressa määrin 10 ihmisen vasta-aineen kaltainen ja jota ihmisruumis ei tunnista vieraaksi aineeksi, ts. kimeerinen tai "humanisoitu" vasta-aine.

Kimeeristen vasta-aineiden kyseessä ollessa on tyypillistä, että sekä raskaan että kevyen ketjun vaihteleva 15 alue muistuttaa yhdestä nisäkäslajista peräisin olevien vasta-aineiden vaihtelevia alueita ja että muuttumattomat osat ovat homologisia ihmisestä peräisin olevissa vasta-aineissa esiintyvien jaksojen suhteen. Yksi näiden kimeeristen muotojen selvä etu on se, että esimerkiksi vaihte-20 levät alueet voidaan kätevästi saada nykyisin tunnetuista lähteistä, kun käytetään muusta isäntäeläimestä kuin ihmisestä saatuja ja helposti saatavissa olevia B-solujen hyb-ridoomia yhdessä esimerkiksi ihmissoluvalmisteista saatujen muuttumattomien alueiden kanssa. Kun näiden vasta-ai-25 neiden vaihtelevan alueen spesifisyyteen ei vaikuta tämän alkuperä ja kun muuttumaton alue taas on peräisin ihmisestä, on vähemmän todennäköistä, että ne potilaaseen ruiskutettaessa herättävät tässä immuunivasteen verrattuna muusta kuin ihmisestä peräisin olevasta muuttumattomasta 30 alueesta aiheutuvaan vasteeseen.

• :* Yksi tunnettu ihmisen syöpäkasvainantigeeni on syö päkasvaimeen liittyvä glykoproteiini (TAG72). TAG72 liittyy ihmisestä peräisin olevien solujen, erityisesti syöpä-kasvainsolulinjan LS174T pintaan. LS174T [American Type 35 Culture Collection (tässä ATCC) nro CL 188] on linjan 6 103477 LS180 (ATCC nro CL187), paksunsuolen adenokarsinoomalinjan variantti.

LS174T:n karyotyyppi on samanlainen kuin LS180:n, X-kromosomin puuttuessa suurimmasta osassa soluja. On esi-5 tetty julkaisussa Johnson, V.G. et ai.. (1986) Cancer Res.

46, 850 - 857 kuvattuja koetuloksia, joiden perusteella TAG72-molekyyli on luonnehdittavissa mukiiniksi. Tämä johtopäätös perustuu seuraaviin havaintoihin: (a) TAG72:lla on suuri molekyylipaino (> 1 x 106) , jota osoittaa sen 10 ekskluusio Sepharose™ CL-4B -pylväästä; (b) TAG72:n

CsCl:ssä suoritetulla tasapainosentrifugoinnilla määritetty tiheys oli 1,45 g/ml, joka viittaa vahvasti glykosyloi-tuun glykoproteiiniin; (c) TAG72:n havaitaan muuttavan kulkeutumistaan neuraminidaasilla suoritetun pilkkomisen 15 jälkeen, joka viittaa siihen, että se on runsaasti sialyy-liryhmiä sisältävä molekyyli, jossa on runsaasti mukii-neille ominaisia O-glykosidisin sidoksin kytkeytyneitä oligosakkarideja; (d) mukiineissa yleisesti esiintyviä veriryhmäantigeeneja on havaittu affiniteettipuhdistetussa 20 TAG72:ssa ja (e) pilkkominen Chondroitinase ABC:llä ei vaikuttanut TAG72:een, joka osoittaa sen, että TAG72-epi-tooppi ei ilmene proteoglykaanin pinnalla, joka on kond-roitiinisulfaattia.

On kehitetty monia hiiren monoklonaalisia vasta-25 aineita, joilla on sitoutumisspesifisyyttä TAG72:ta vastaan. Yksi näistä monoklonaalisista vasta-aineista, jolle on annettu merkintä B72.3, on hybridooman B72.3 (ATCC nro HB-8108) tuottama hiiren IgGl. B72.3 on ensimmäisen sukupolven monoklonaalinen vasta-aine, joka on kehitetty käyt-30 täen immunogeeninä ihmisen rintasyöpäuutetta [ks. Colcher, D., et ai.. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 3199 - 3203); ja US-patentit 4 522 918 ja 4 612 282] . Ilmaisu "ensimmäisen sukupolven monoklonaalinen vasta-aine" tarkoittaa tässä käytettynä monoklonaalista vasta-ainetta, 7 103477 joka on tuotettu käyttäen immunogeeninä solujen raakauu-tetta.

Muita TAG72:ta vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita merkitään "CC":llä (paksunsuolen syöpä).

5 Monoklonaaliset CC-vasta-aineet ovat toisen sukupolven hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden ryhmä. Ilmaisu "toisen sukupolven monoklonaalinen vasta-aine" tarkoittaa tässä käytettynä monoklonaalista vasta-ainetta, joka on tuotettu käyttäen immunogeeninä ensimmäisen sukupolven mo-10 noklonaalisella vasta-aineella puhdistettua antigeeniä.

Monoklonaaliset CC-vasta-aineet valmistettiin B72.3:lla puhdistettua TAG72:ta käyttämällä. CC-vasta-aineiden tuottamiseen käytetyn menetelmän tarkastelu on esitetty US-pa-tenttihakemusjulkaisussa nro 7-073 685 (USPA 7-073 685) , 15 hakemuksen ovat jättäneet Schlom et ai. 15.7.1987 ja se on yleisesti saatavissa laitoksesta National Technical Information Service. Suhteellisen hyvien TAG72:ta vastaan suunnattujen sitoutumisaffiniteettiensa vuoksi ATCC:hen on talletettu rajoitettua saatavuutta vaatien seuraavat CC-20 vasta-aineet: CC49 (ATCC nro HB 9459), CC83 (ATCC nro HB 9453), CC46 (ATCC nro HB 9458), CC92 (ATCC nro HB 9454), CC30 (ATCC nro HB 9457), CC11 (ATCC nro HB 9455) ja CC15 (ATCC nro HB 9460).

Tällä alalla ei ole tunnettua, että olisi eristetty 25 ihmisen vasta-aine, joka sitoutuu vahvasti TAG72.-een. Tämän vuoksi sopivat vasta-aineet täytyy valmistaa keinotekoisesti .

On tunnettua, että Ig-molekyylin toiminta riippuu sen kolmiulotteisesta rakenteesta, joka puolestaan riippuu 30 sen primaarisesta aminohappojärjestyksestä . Ig:n aminohap-: pojärjestyksen muuttaminen voi siten vaikuttaa huononta- vasti tämän aktiivisuuteen. Muutos Ig:tä koodaavassa DNA-jaksossa voi vaikuttaa DNA-jakson sisältävän solun kykyyn ilmentää tai erittää Ig:tä tai suoriutua tämän kokoonpa-35 nosta.

8 103477 US-patenttihakemusjulkaisuun 7-073 685 sisältyvän opin mukaan voidaan CC-vasta-aineet muuntaa kimeeriseksi muodokseen korvaamalla esim. hiiren muuttumattomat alueet (Fc) ihmisen muuttumattomilla alueilla käyttäen sinänsä 5 tunnettua yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. On luultavaa, että US-patenttihakemusjulkaisussa 7-073 685 esitetyt ehdotukset eivät johtaneet varsinaiseen yritykseen ilmentää mitään kimeerisiä Ig-polypeptidiketjuja, tuottaa Ig-aktii-visuutta, eikä erittää ja panna kokoon Ig-ketjuja halu-10 tuiksi kimeerisiksi Ig-molekyyleiksi .

Tällä alalla sinänsä tunnetuista lähtökohdista katsoen ei sen vuoksi ole lainkaan selvää, että yhdistelmä-DNA- tekniikat tuottavat rutiininomaisesti käytettynä ki-meerisen eläin-ihmisvasta-aineen sellaisista valituista 15 DNA-lähteistä, jotka muodostavat toimivia, spesifisesti ihmisen valittuihin karsinoomiin sitoutuvia kimeerisiä vasta-aineita, joihin ihmiseen ruiskutettuna liittyy ANHA-sivuvaikutusten käynnistyminen vähäisemmässä määrin.

Tämä keksintö kykenee yllättäen täyttämään monet 20 näistä edellä mainituista tarpeista ja tarjoaa käyttöön menetelmän näiden haluttujen vasta-aineiden tuottamiseksi. Tämä keksintö tarjoaa esimerkiksi käyttöön menetelmän, jolla voidaan fuusioida geenejä, jotka koodaavat ainakin osaa TAG72:ta ilmentävistä ihmisen karsinoomiin sitoutu-25 vista eläimen Ig-molekyyleistä geenien kanssa, jotka koodaavat ainakin osaa ihmisen Ig-molekyylistä. Tämä keksintö voi myös tarjota käytettäväksi menetelmän sellaisen proteiinin ilmentämiseksi, joka voidaan erittää ja panna kokoon, jotta saadaan toimiva kimeerinen vasta-aine.

30 Tämä keksintö tarjoaa lisäksi käyttöön ilmentämis- : vektorin, joka sisältää TAG72:ta vastaan suunnattuja vas ta-aineita tai näiden osia koodaavan DNA-jakson.

Tämä keksintö tarjoaa käyttöön myös solut, jotka on transformoitu ilmentämisvektorilla, joka sisältää TAG72:ta 9 103477 vastaan suunnattuja vasta-aineita ja näiden osia koodaavan DNA-jakson.

Lopuksi tämä keksintö tarjoaa käyttöön uusia terapeuttisesti käyttökelpoisia vasta-aineita.

5 Edellä esitetyn perusteella tämä keksintö kohdistuu

menetelmään terapeuttisesti käyttökelpoisen vasta-aineen tai sen fragmentin valmistamiseksi, joka pystyy reagoimaan selektiivisesti TAG72-antigeenin kanssa. Menetelmälle on tunnusomaista, että viljellään jotakin solulinjoista CH44-10 1 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880), CH44-4 (ATCC HB

9877), CH 88-1 (ATCC HB 9882), CH 88-2 (ATCC HB 9881), CH 88-3 (ATCC HB 9876), CH 88-4 (ATCC HB 9874), CH 84-1 (ATCC HB 9883), CH 84-2 (ATCC HB 9879), CH 84-3 (ATCC HB 9878) tai CH 84-4 (ATCC HB 9875) ja otetaan talteen tuotettu 15 vasta-aine.

Tämä keksintö kohdistuu myös menetelmään terapeuttisesti käyttökelpoisen vasta-aine- tai vasta-ainefrag-menttikonjugaatin valmistamiseksi, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että edellä määritelty vasta-aine tai vas-20 ta-ainefragmentti konjugoidaan terapeuttiseen aineeseen.

Tämä keksintö kohdistuu lisäksi solulinjoihin CH44-1 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880), CH44-4 (ATCC HB 9877), CH 88-1 (ATCC HB 9882), CH 88-2 (ATCC HB 9881), CH 88-3 (ATCC HB 9876), CH 88-4 (ATCC HB 9874), CH 84-1 (ATCC 25 HB 9883), CH 84-2 (ATCC HB 9879), CH 84-3 (ATCC HB 9878) ja CH 84-4 (ATCC HB 9875).

Kuvioiden selitykset

Kuviossa 1 on kuvattu immunoglobuliinin perusrakenne, johon on merkitty entsymaattiset pilkkoutumiskohdat. 30 Kuviossa 2 on kuvattu VHaTAG -VH:n, CC46 -VH:n, CC49 : -VH:n, CC83 -VH:n ja CC92 -VH:n nukleotidi jaksot.

Kuviossa 3 on kuvattu VHoTAG -VH:n, CC46 -VH:n, CC4 9 -VH:n, CC83 -VH:n ja CC92 -VH:n aminohappojaksot.

Kuviossa 4a on kuvattu CC49 -VL:n nukleotidijakso ja 35 kuviossa 4b on kuvattu tätä vastaava aminohappojakso.

10 103477

Kuviossa 5a on kuvattu CC83 -VL:n nukleotidijakso ja kuviossa 5b on kuvattu tätä vastaava aminohappojakso.

Kuviossa 6a on kuvattu CC92 -VL:n nukleotidijakso ja kuviossa 6b on kuvattu tätä vastaava aminohappojakso.

5 Kuviossa 7 on kuvattu plasmidista pGDl eristetyn

Hind I - Pst I -fragmentin nukleotidijakso.

Kuviossa 8 on kuvattu pBLUESCRIPT SK(-):n plasmidi- kartta.

Kuviossa 9 on kuvattu pRL101:n plasmidikartta.

10 Kuviossa 10 on kuvattu pRLIOIrssä oleva CC49:n L-ketjun genomisen DNA:n liittymä.

Kuviossa 11 on kuvattu pRL200:n plasmidikartta.

Kuviossa 12 on kuvattu pRLIOIrssä oleva CC83:n L-ketjun genomisen DNA:n liittymä.

15 Kuviossa 13 on kuvattu plasmidista pNP9 eristetty

EcoR I - BamH I -fragmentin nukleotidijakso.

Kuviossa 14 on kuvattu pHH49:n plasmidikartta.

Kuviossa 15 on kuvattu pHS83:n plasmidikartta.

Kuvio 16 esittää CC49 VH:n nukleotidijakson, alle-20 viivattujen segmenttien osoittaessa niitä jaksoja, jotka on saatu käyttämällä oligonukleotidialukkeita lähetti -RNA:n yhteydessä.

Kuvio 17 esittää CC83 VH:n nukleotidijakson, alleviivattujen segmenttien osoittaessa niitä jaksoja, jotka 25 on saatu käyttämällä oligonukleotidialukkeita lähetti-RNA:n yhteydessä.

Kuvio 18 esittää CC49 VH:n aminohappojakson, alleviivattujen segmenttien osoittaessa niitä jaksoja, jotka on määritetty proteiinin sekvenssoinnilla.

30 Kuvio 19 esittää CC83 VH:n aminohappojakson, alle- : viivattujen segmenttien osoittaessa niitä jaksoja, jotka on määritetty proteiinin sekvenssoinnilla.

Kuvio 20 esittää SDS-polyakryyliamidigeelitulokset, jotka kuvaavat CC83-vasta-aineen PNGaasi F -käsittelyn 35 tuloksia.

11 103477

Kuvio 21 kuvaa ihmisen gamma l:n, gamma 2:n, gamma 3:n ja gamma 4:n restriktioentsyymikartan.

Kuviossa 22 on kuvattu pSV2gpt/R/P:n plasmidi- kartta.

5 Kuviossa 23 on kuvattu pSV2gpt-yl-7.8:n plasmidi- kartta.

Kuviossa 24 on kuvattu pSV2gpt-yl-2.3:n plasmidi- kartta.

Kuviossa 25 on kuvattu pSV2gpt-y2:n plasmidikartta. 10 Kuviossa 26 on kuvattu pSV2gpt-y3-7.8:n plasmidi kartta .

Kuviossa 27 on kuvattu pSV2gpt-y4:n plasmidikartta. Kuviossa 28 on kuvattu ρ49γΐ-7.8:η plasmidikartta. Kuviossa 29 on kuvattu ρ49γ1-2.3:η plasmidikartta. 15 Kuviossa 30 on kuvattu ρ49-γ2:η plasmidikartta.

Kuviossa 31 on kuvattu ρ49-γ3:η plasmidikartta. Kuviossa 32 on kuvattu p49-y4:n plasmidikartta. Kuviossa 33 on kuvattu p83yl-7.8:n plasmidikartta. Kuviossa 34 on kuvattu ρ83γΐ-2.3:η plasmidikartta. 20 Kuviossa 35 on kuvattu ρ83-γ2:η plasmidikartta.

Kuviossa 36 on kuvattu ρ83-γ3:η plasmidikartta. Kuviossa 37 on kuvattu ρ83-γ4:η plasmidikartta. Kuviossa 38 on kuvattu kokonaisreaktio hybridigee-nien muodostamiseksi, joka perustuu julkaisussa Horton et . 25 a!·, (1989) Gene 77, 61 esitettyyn menetelmään.

Kuviot 39A, 39B ja 39C esittävät CH44-l:n bioja- kaantumisen ja kerääntymisen koko kehon alueelle.

Kuviot 40A ja 40B esittävät CH84-l:n biojakaantumi-sen ja kerääntymisen koko kehon alueelle.

30 Tämän keksinnön mukainen immunoglobuliini on kehi- : tetty vastaukseksi hiiren monoklonaalisiin vasta-aineisiin liittyviin, aiemmin· tällä alalla kuvattuihin ongelmiin. Tämän luonteenomaisena piirteenä on se, että sillä on ki-meerinen rakenne, joka koostuu VHaTAG:sta peräisin olevan 35 DNA:n koodaamasta raskaan ketjun vaihtelevasta alueesta.

12 103477 Määritelmät "Immunoglobuliini" tarkoittaa tässä käytettynä tet-rameeriä tai tämän aggregaattia riippumatta siitä, onko sille ominaista immunoreaktiivinen aktiivisuus. "Vasta-5 aineet" viittaavat sellaisiin antigeeniä vastaan merkittävää ja tunnettua spesifisyyttä osoittavaa aktiivisuutta omaaviin kokoonpanoihin, jotka käsittävät kevyet ja raskaat ketjut, joiden välillä joko on kovalenttinen sidos tai tämä puuttuu. "Epäspesifinen immunoglobuliini" ("NSI") 10 tarkoittaa niitä immunoglobuliinejä, joilla ei tiedetä olevan tunnettua spesifisyyttä antigeeniä vastaan.

Immunoglobuliinin rakenteen perusyksikkö selkärankaisten järjestelmissä on suhteellisen hyvin tunnettu [Edelman, G.M., (1971) Ann. N.Y. Acad. Sei., 190, 5]. Ku- 15 ten kuviosta 1 nähdään, yksiköt koostuvat kahdesta samanlaisesta kevyestä polypeptidiketjusta, joiden molekyyli-paino on noin 23 000 daltonia, ja kahdesta samanlaisesta raskaasta ketjusta, jonka molekyylipaino on 53 000 - 70 000. Nämä neljä ketjua liittyvät disulfidisidoksin 20 "Y":n muotoiseksi kuvioksi, jossa raskaat ketjut jäävät kevyiden ketjujen väliin alkaen Y:n suulta ja jatkuen vaihtelevaa luonnetta osoittavan alueen läpi.

Raskaat ketjut luokitellaan gammaksi, myyksi, alfaksi, deltaksi tai epsiloniksi, joiden joukossa on joita-.. 25 kin alaluokkia. Sen vuoksi, että tässä ketjussa on pitkä muuttumaton alue, vasta-aineen luokka määräytyy sen luonteen mukaan IgA:ksi, IgDrksi, IgE:ksi, IgGrksi tai IgM:ksi.

Kevyet ketjut luokitellaan joko kappa- (k) tai 30 lambda (λ) -ketjuksi. Kukin raskaan ketjun luokka voi si-*, toutua kevyen joko kappa- tai lambda-ketjun kanssa. Kevyet ja raskaat ketjut sitoutuvat yleensä toisiinsa kovalentti-sesti ja kahden raskaan ketjun "häntä"osat sitoutuvat toisiinsa kovalenttisilla disulfidisidoksilla immunoglobulii-35 nien muodostuessa hybridoomien tai B-solujen toimesta. Jos 13 103477 ketjujen ei-kovalenttinen yhteenliittyminen voidaan saada toteutumaan oikeaa geometriaa noudattaen, kykenevät disul-fidisidoksilla kytkeytymättömien ketjujen muodostamat aggregaatit vielä reagoimaan antigeenin kanssa.

5 Aminohappojaksot alkavat Y:n haarautuneissa päissä olevista N-terminaalisista päistä ja jatkuvat kummankin ketjun alapäässä olevaan C-terminaaliseen päähän. Vaihte-leva osa on N-terminaalisessa päässä ja C-terminaalinen pää on muuttumaton alue.

10 Termejä "muuttumaton" ja "vaihteleva" käytetään toiminnallisesti. Sekä kevyiden (VL) että raskaiden (VH) ketjujen vaihtelevat alueet määräävät sitoutumiseen tarvittavan tunnistuskyvyn ja antigeeniä vastaan suunnatun spesifisyyden. Kevyiden (CL) ja raskaiden (CH) ketjujen 15 muuttumattoman alueen osiin sisältyy tärkeitä biologisia ominaisuuksia, kuten vasta-aineketjujen assosiaatio, eritys, siirtyminen istukasta sikiöön, ja komplementin sitominen .

Kummassakin ketjussa vaihteleva alue liittyy muut-20 tumattomaan alueeseen V-geenijakson ja C-geenijakson liittävällä liitoksella. Liittäminen tapahtuu genomisella tasolla siten, että nukleotidijaksot liittyvät rekombinaa-tiokohtien välityksellä. Liittävä jakso tunnetaan nykyisin 12 aminohappoa koodaavana "J"-jaksona kevyen ketjun gee-.. 25 nissä ja yhteensä noin 25 aminohappoa koodaavana "D"- ja "J"-jakson yhdistelmänä raskaan ketjun geenissä.

"Kimeerinen vasta-aine" tarkoittaa tämän keksinnön yhteydessä vasta-ainetta, jonka raskaassa ketjussa on hiiren ituradan geenistä peräisin olevan nukleiinihappojakson 30 koodaama vaihtelevan alueen aminohappojakso ja ihmisgeenistä peräisin olevan nukleotidijakson koodaamat muuttumattoman alueen aminohappojaksot.

Tämän keksinnön tarkoituksena ei kuitenkaan ole rajoittua kapea-alaisesti vain korvaamaan immunoglobulii-35 nin muuttumattomia alueita koodaavat hiiren C-geenin jak- 14 103477 sot immunoglobuliinin muuttumattomia alueita koodaavilla ihmisen C-geenin jaksoilla. Tätä keksintöä ei siten rajoita se, onko fuusiokohta vaihtelevan ja muuttumattoman alueen rajalla vai ei.

5 Tässä keksinnössä kuvattujen nukleotidijaksojen koodaamia muunnettuja kimeerisiä vasta-aineita, koostettuja kimeerisiä vasta-aineita ja fragmentoituja kimeerisiä vasta-aineita on nykyisin mahdollista tuottaa useilla eri menetelmillä.

10 "Kooste"immunoglobuliinit käsittävät polypeptideis- tä koostuvia vaihtelevia alueita, joiden ei ole aiemmin havaittu luonnossa liittyvän yhteen. Ei ole ratkaisevaa, ovatko nämä liittyneet kovalenttisesti tai ei-kovalentti-sesti, kunhan aggregaatti pystyy valikoivasti reagoimaan 15 tietyn antigeenin tai antigeeniryhmän kanssa.

"Muunnetut" vasta-aineet tarkoittavat vasta-aineita, joissa aminohappoja on muunneltu, varsinkin vaihtele-valla alueella olevien aminohappojaksojen ollessa kyseessä. Koska yhdistelmä-DNA-tekniikat ovat olennaista tälle 20 keksinnölle, ei ole tarpeen rajoittua luonnollisista lähteistä peräisin olevien vasta-aineiden aminohappojaksoihin; vasta-aineiden aminohappojaksot voidaan suunnitella uudelleen haluttujen ominaisuuksien saavuttamiseksi. Mahdollisia variaatioita on monia ja ne ulottuvat yhden tai . 25 muutaman aminohapon muutoksesta vasta-aineen vaihtelevan ja/tai muuttumattoman alueen täydelliseen uudelleenmuokkaukseen .

Muutoksia vaihtelevaan alueeseen tehdään antigeenin sitomisominaisuuksien parantamiseksi. Muutoksia muuttumat-30 tomaan alueeseen tehdään yleensä sellaisten solutoimintojen ominaisuuksien parantamiseksi, kuten komplementin sitominen, vuorovaikutus kalvojen kanssa ja muut efektori-toiminnot. Muutoksia voidaan tehdä tavallisilla yhdistel-mätekniikoilla sekä oligonukleotidikohdemutageneesilla 15 103477 [Dalbadie-McFarland, et ai.. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 79, 6409] .

Immunoglobuliinien "fragmentteihin" kuuluvat vasta-ainemolekyylin proteolyyttisesti pilkotut tai yhdistelmä-5 tekniikoilla valmistetut osat, jotka kykenevät reagoimaan valikoivasti tietyn antigeenin tai antigeeniryhmän kanssa. Keksinnön suoja-aluetta rajoittamattomiin esimerkkeihin näistä proteolyyttisistä ja/tai yhdistelmätragmenteista kuuluvat "Fab", "F(ab')2, ja "Fab1", joiden proteolyysissä 10 pilkkoutuvat kohdat on esitetty kuviossa 1; sekä "Fv" ja "VH". "Fv"-fragmentti tarkoittaa sitä, että kevyen ketjun vaihtelevien ja raskaan ketjun vaihtelevien alueiden osia liittyy yhteen yleensä karboksiterminaalisista osistaan. Fv-fragmenttien tuottamiseen tarkoitettuja yhdistelmätek-15 niikoita on esitetty patenttijulkaisuissa WO 88/01 649, WO 88/06 630, WO 88/07 085, WO 88/07 086 ja WO 88/09 344. "VH"-fragmentti tarkoittaa sitä, että vaihtelevalla alueella on ainakin osa raskaan ketjun vaihtelevaa aluetta, jota kyetään käyttämään antigeenin sitomistoimintona. Kevyen 20 ketjun vaihtelevan alueen (VL) valmistus ja käyttö antigeeniä sitovassa toiminnossa esitetään artikkelissa, jonka otsikko on "Development of biologically active peptides based on antibody structure", Williams et al. . (1989)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5537 - 5541.

25 Tässä keksinnössä "eläimiin" kuuluviksi on tarkoi tettu nautaeläimet, siat, jyrsijät ja kädelliset ihmiset mukaan lukien, ja muut.

"Ilmentämisvektorille" annetaan toiminnallinen määritelmä, johon käsitteeseen liittyy mikä tahansa DNA-jak-30 so, joka kykenee aikaansaamaan määrätyn DNA-koodin ilmentymisen sopivassa isännässä. Nämä vektorit ovat nykyään plasmidien muodossa; "plasmidia" ja " ilmentämisvektoria" käytetään siten usein toisiaan korvaten. On kuitenkin tarkoitus, että tähän keksintöön kuuluvat muutkin vastaavalla 103477 16 tavalla toimivat ilmentymisvektorit, joita tällä alalla opitaan ehkä toisinaan tuntemaan.

"Transformaatiolla" tarkoitetaan sitä, että vastaanottavaan isäntäsoluun viedään DNA:ta, joka muuttaa 5 genotyyppiä sillä seurauksella, että tuloksena on muuttunut vastaanottajasolu.

"Isäntäsolut" tarkoittavat soluja, jotka on transformoitu yhdistelmätekniikoita soveltaen vektoreilla, jotka on konstruoitu yhdistelmä-DNA-tekniikoilla. Tässä yh-10 teydessä määritellysti tapahtuu isäntäsolun vasta-aineen tai tämän muunnoksen tuotto tällaisen transformaation ansiosta .

Kuvattaessa menetelmiä vasta-aineiden eristämiseksi yhdistelmäisännistä, käytetään käsitteitä "solu" ja "solu-15 viljelmä" toisiaan korvaavina tarkoittamaan vasta-aineen lähdettä, ellei toisin selvästi mainita. Toisin sanoen, vasta-aineen talteenotto "soluista" voi tarkoittaa talteenottoa sentrifugoiduista kokonaisista soluista tai soluviljelmästä, joka sisältää sekä ravintoliuoksen että 20 siihen suspendoidut solut.

Lyhenteet

Nukleiinihapot, aminohapot, peptidit, suojaavat ryhmät, aktiiviset ryhmät ja samantyyppiset osat lyhennetään lyhennyksiä käytettäessä IUPABIUB:n (Commission on 25 Biological Nomenclature) tai asianomaisten alojen käytän nön mukaan. Seuraavat ovat esimerkkejä.

Reagenssit EDTA: etyleenidiamiinitertaetikkahappo SDS: natriumdodekyylisulfaatti 3 0 Nukleiinihapot RNA: ribonukleiinihappo DNA: deoksiribonukleiinihappo 17 103477

Typpiemäkset

Puriinit Pyrimidiinit A: adeniini T: tyrniini G: guaniini C: sytosiini 5 U: urasiili

Sekä DNA että RNA sisältävät pitkiä fosforihaposta, sokerista ja typpiemäksistä koostuvia ketjuja. DNA on kak-sinauhainen kierre, jossa sokeri on 2-deoksiriboosi, kun taas RNA on yksinauhainen, ja siinä sokeri on D-riboosi. 10 Neljä typpiemästä, jotka ovat luonteenomaisia DNA-nukleo-tideille, liittyvät komplementaarisina pareina vetysidok-silla DNA:n kaksoiskierteen muodostamiseksi; adeniini liittyy tymiiniin; guaniini liittyy sytosiiniin. RNA:ssa urasiili korvaa tymiinin luetelluissa DNA-pareissa.

15 Aminohapot

Gly: glysiini Phe: fenyylialaniini

Ala: alaniini Tyr: tyrosiini

Vai: väliini Thr: treoniini

Leu: leusiini Cys: kysteiini 20 lieu: isoleusiini Met: metioniini

Ser: seriini Glu: glutamiinihappo

Asp: asparagiinihappo Trp: tryptofaani

Lys: lysiini Pro: proliini

Arg: arginiini Asn: asparagiini ·: 25 His: histidiini Gin: glutamiini

Vaihteleva alue

Raskasta ketjua koodaava DNA koostuu VH-geenijaksosta, DH-geenijaksosta ja JH-geenijaksosta. Kevyttä ketjua koodaava DNA koostuu VL-geenijaksosta ja JL-geenijaksosta. 30 V„-geenijakso Tämä keksintö kohdistuu menetelmään valikoitujen kimeeristen vasta-aineiden valmistamiseksi, joilla olevaa VH:ta koodaa spesifisesti TAG72:ta vastaan reagoivasta ituradan geenistä (VHccTAG) johdettu DNA-jakso, jonka geenin 35 nukleotidijärjestys on esitetty kuviossa 2. Kimeeriset 103477 18 vasta-aineet valikoidaan näiden kyvyn perusteella sitoa TAG72:ta, joka tarkoittaa sitä, että vaihteleva osa sitoutuu TAG72:een ainakin 25 % paremmin kuin B72.3:n vaihteleva osa sitoutuu TAG72:een. Kimeerisen vasta-aineen ja 5 B72.3:n sitoutumisaffiniteetit määritetään yleensä samalla menetelmällä. Esimerkkejä vasta-aineiden sitoutumisaf-finiteetin mittausmenetelmistä esitetään seuraavissa viitteissä: Scatchard, G., (1949) Annals of the N.Y. Acad. of

Sciences 51, 660; Steward, M.W. ja Petty, R.E., (1972) 10 Immunology 23, 881; Muraro, R., et ai.. (1988) Cancer Research 48, 4588 ja Heyman, B., (1984) J. of Immunol. Met hods 68, 193 - 204.

Alan ammattimies käsittää, että tuloksena tästä keksinnöstä, siis VHaTAG:n nukleotidijärjestyksestä (ja 15 tämän koodaamasta aminohappojaksosta), tämän keksinnön on tarkoitus kattaa sisällöltään homologiset nukleotidijaksot ja vastaavat aminohappojaksot. "Sisällöltään homologiset" tarkoittaa sitä, että nukleotidi- tai aminohappojaksot ovat identtiset tai lähes identtiset. Tässä kuvauksessa on 20 siten itsestään selvää, että homologisissa jaksoissa voi esiintyä pientä sekvenssivaihtelua ja että mitkä tahansa jaksot, joilla on ainakin 80-%:inen homologia, tulkitaan toisiaan vastaaviksi.

Homologia ilmoitetaan toisiaan vastaavien emästen • ; 25 (tai aminohappojen) osuutena tai prosenttiosuutena sen jälkeen, kun kaksi (mahdollisesti eripituista) jaksoa on aseteltu toisiinsa nähden rinnakkain. Käsitettä rinnak-kainasettelu käytetään siinä mielessä kuin sen ovat määritelleet Sankoff ja Kruska teoksensa The Time Warps, String 30 Edits, and Macromolecules; The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA (1983) ensimmäisessä luvussa. Pääpiirteissään esitettynä tapahtuu kahden jakson rinnakkainasettelu maksimoimalla toisiaan vastaavien emästen (tai aminohappojen) lukumäärä kahden 35 jakson välillä lisäämällä minimimäärä "tyhjiä"- tai "nol- 103477 19 la"-emäksiä jompaankumpaan jaksoon maksimaalisen limittymisen saavuttamiseksi.

Kuten tällä alalla on selvää, nukleotidien vastaa-vuuseroja voi esiintyä koodisanan kolmannen eli horjuvan 5 emäksen kohdalla ilman, että tästä aiheutuu aminohappojen korvautumisia lopullisessa polypeptidijaksossa. Voidaan myös sietää pieniä merkityksettömiksi katsottavia nukleo-tidimuutoksia (korvautumisia, lisäyksiä tai poistumia) geenijakson tietyillä alueilla aina silloin, kuin muutok-10 sen tuloksena on sellainen muutos aminohappojaksossa, joka ei muuta lopullisen tuotteen toiminnallista luonnetta. On osoitettu, että kemiallisesti syntetisoidut erät kokonaisia geenijaksoja tai jaksojen osia voivat korvata luonnollisen geenin vastaavia alueita geenin toiminnan tästä kär-15 simättä.

Alan ammattimiehet voivat tunnistaa tietyt DNA-jaksojen homologit käyttäen nukleiinihappojen ristiinhybri-disoitumista rajoittavien olosuhteiden vallitessa, kuten tällä alla hyvin tiedetään [kuvaus tästä on esitetty teok-20 sessa Nucleic Acid Hybridization, Hames ja Higgens (toim.) IRL Press, Oxford, UK (1985)]. Kun kaksi jaksoa tunnetaan, on saatavissa algoritmeja näiden homologian laskemiseksi, esim. Needleham & Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48, 443 -453 ja Sankoff ja Kruska (viittaus edellä), sivut 23 - 29.

·: 25 Näiden vertailujen suorittamiseksi on myös saatavissa kau pallisia palveluja, esim. Intelligenetics, Inc. (Palo Alto, CA).

D„- ja JB-geenijaksot

Dh- ja JH-geenijaksoista esiintyy useita eri tyyppe-30 jä, vaikkakin valitun D- tai J-geenisegmentin tyyppi ei ole tämän keksinnön suhteen ratkaiseva. Toisin sanoen DH ja JH voivat olla peräisin mistä tahansa eläimestä. Edullisiin · eläimiin kuuluvat hiiret ja ihmiset. Ihmisen DH- ja/tai JH-geenisegmentit ovat luonnollisesti erityisen edullisia, 35 mutta tätä keksintöä ei rajoiteta näin, jos toisen eläimen 20 103477

Dh- ja JH-geenisegmenteistä saadaan tärkeä ominaisuus, esimerkiksi parempi sitoutumiskyky TAG72:een.

Kuvaavia esimerkkejä hiiren DH- ja JH-jaksoista esitetään julkaisuissa "Organization, Structure, and Assembly 5 of Immunoglobulin Heavy Chain Diversity DNA Segments", Kurosawa ja Tonegawa, (1982) J. Exp. Med. 155, 201 ja

Sequences of the Joining Region Genes for Immunoglobulin Heavy Chains and Their Role in Generation of Antibody Diversity" Gough ja Bernard, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. 10 USA 78, 509.

Kuvaavia esimerkkejä ihmisen DH- ja JH-jaksoista esitetään julkaisussa "Human Immunoglobulin D Segments encoded in Tandem Multigenic Families", Siebenlist et al. . (1981) Nature 294, 631 ja kuvaavia esimerkkejä ihmisen JH-15 jaksoista julkaisussa "Structure of the Human Immunoglobulin μ Locus: Characterization of Embryonic and Rearranged J and D Genes", Ravetch et al.. (1981) Cell 27, 583.

VL- ja JL-geenijaksot

Yleensä voidaan käyttää mitä tahansa VL- ja JL-gee-20 nijaksoa, joka koodaa VHaTAG:n suhteen sisällöltään homologisen nukleotidijakson koodaaman VH:n suhteen komplementaarista VL:n osaa. "Komplementaarisella" tarkoitetaan VL:ää, joka sitoutuu VH:hon ja josta saadaan vasta-aineen vaihte-leva alue, jolla on ainakin 25 % suurempi sitoutumisaf-25 finiteetti kuin B72.3:lla millä tahansa tavallisella si toutumisaf f initeettivakioiden määritysmenetelmällä määritettynä .

Valitun VL- tai JL-geenisegmentin tyyppi ei ole tämän keksinnön suhteen ratkaiseva. Toisin sanoen VL ja JL 30 voivat olla peräisin mistä tahansa eläimestä. Edullisiin : eläimiin kuuluvat hiiret ja ihmiset. Ihmisen VL ja/tai JL- geenisegment it ovat luonnollisesti erityisen edullisia, mutta tätä keksintöä ei rajoiteta näin, jos toisen eläimen VL ja JL-geenisegmenteistä saadaan tärkeä ominaisuus, esi-35 merkiksi parempi sitoutumiskyky TAG72:een.

2i 103477

Hiiren JL-jaksot esitetään julkaisussa "The Nucleotide Sequence of a 5,5-kilobase DNA Segment Containing the Mouse Kappa Immunoglobulin J and C Region Genes", Max et al. , (1981) J. Biol. Chem. 256 5116 - 5120. Ihmisen JL- 5 jaksot esitetään julkaisussa "Evolution of Human Immunoglobulin K J Region Genes", Heiter et al. . (1982) The

Journal of Biological Chemistry 357 1516 - 1522.

Vaihtelevien alueiden johtaminen

Edellä opitun perusteella on mahdollista johtaa 10 useita tämän keksinnön suojapiiriin kuuluvia yksityiskohtaisia sovellutusmuotoja, jotka koskevat vasta-aineiden vaihtelevia alueita, ts. alueita, joiden VH-jaksot ovat sisällöltään homologisia VHaTAG:n suhteen ja jotka sitoutuvat TAG72:een ainakin 25 % paremmin kuin mitä B72.3:n 15 vaihteleva alue sitoutuu TAG72:een, kun vasta-aineen ja B72.3:n sitoutumisaffiniteetit mitataan samalla menetelmällä. Seuraavassa on esitetty useita mahdollisia menetelmiä .

Luonnollisella tavalla muodostetut vaihtelevat alu-20 eet

Reagoidessaan immunogeeniä, TAG72:ta, vastaan immunisoitu eläin lisää valittuja vasta-ainetta tuottavia B-solujaan. B-solujen tuottamien vasta-aineiden vaihteleva alue tulee olemaan ituradan uudelleenjärjestyneiden ras-25 kaan ja kevyen ketjun DNA:n koodaamaa. Uudelleenjärjesty-neeseen ituradan raskaaseen ketjuun kuuluvat esimerkiksi V- D- ja J-geenisegmentit johtojaksoineen sekä mitkä tahansa intronit, jotka voidaan myöhemmin poistaa. Kevyttä ketjua koodaavaan DNA:han tulee sisältymään V- ja J-gee-30 nisegmentit johtojaksoineen sekä mitkä tahansa intronit, : jotka voidaan myöhemmin poistaa.

Vaihtelua voi syntyä B-soluissa tapahtuvista somaattisista mutaatioista VHaTAG:n vasta-ainetta tuottavan uudelleenjärjestymisen aikana. Nämä somaattiset mutaatiot 35 ovat nukleotidimuutoksia, joiden seurauksena voi syntyä 22 103477 tai jäädä syntymättä aminohappomuutos, joka muuttaa vasta-ainetta tuottavasti uudelleenjärjestyneen VH:n aktiivisuutta TAG72:ta kohtaan.

Seulontamenetelmät 5 Monoklonaalisia ja polyklonaalisia vasta-aineita voidaan seuloa sen määrittämiseksi, mitkä mainituista vasta-aineista sitoutuvat valikoivasti TAG72:een. Tällainen seulonta voidaan tehdä millä tahansa monista tunnetuista menetelmistä, kuten kiinteän faasin radioimmunomäärityk-10 sellä, entsyymivälitteisillä immunosorbenttimäärityksillä, rosetinmuodostusmäärityksillä ja toimintakyvyn estoon perustuvilla määrityksillä. Nämä menetelmät ovat sinänsä hyvin tunnettuja.

Tässä keksinnössä on nyt saatu selville VHaTAG:n 15 vasta-aineita tuottavasta uudelleenjärjestymisestä synty viä vaihtelevia alueita koodaavat nukleotidijaksot. Kuviossa 2 esitetään VHaTAG:n nukleotidijakson lisäksi nukleotidi j aksot , jotka koodaavat CC46:n, CC49:n, CC83:n ja CC92:n raskaan ketjun vaihtelevien alueiden nukleotidijak-20 soja. Kuviossa 3 esitetään VHaTAG -VH:n, CC46 -VH:n, CC49 -VH:n, CC83 -VH:n ja CC92 -VH:n aminohappojaksot, jotka vastaavat kuviossa 2 esitettyjä nukleotidijaksoja. VHaTAG -VH:n, CC46 -VH:n, CC49 -V„:n, CC83 -VH:n ja CC92 -VH:n aminohappo jaksojen vertailusta käy ilmi silmiinpistävimpänä 25 piirteenä se, että nämä ketjut ovat hyvin huomattavassa määrin samanlaisia.

CC4 6 -VH-, CC49 -VH-, CC83 -VH- ja CC92 -VH -alueita koodaavan DNA:n samankaltaisuus erityisesti 5'-pään puoleisessa segmentissä on todisteena sille, että nämä DNA-30 jaksot ovat peräisin VHaTAG:sta. B-solussa ilmentyvän VH-: alueen geenin vasta-ainetta tuottavan uudelleenjärjesty misen aikana tapahtuvat somaattiset mutaatiot tuottavat joitakin nukleotidimuutoksia, joiden tuloksena voi syntyä tai jäädä syntymättä homologisen aminohapon muutos kahden 23 103477 vasta-ainetta tuottavasti uudelleenjärjestynyttä vasta-ainetta tuottavan VHaTAG -hybridooman välille.

CC49 VL:n nukleotidijaksot ja vastaavat aminohappo-jaksot on esitetty kuvioissa 4a ja 4b. CC83 VL:n nukleoti-5 dijaksot ja vastaavat aminohappojaksot on esitetty ku vioissa 5a ja 5b. CC92 VL:n nukleotidi jaksot ja vastaavat aminohappojaksot on esitetty kuvioissa 6a ja 6b.

Koetinmenetelmät

Muita VHaTAG:sta peräisin olevan DNA:n koodaamia 10 vasta-aineita voidaan johtaa käyttäen VHaTAG:a koettimena hybridisoinnissa. Alan ammattimiehet voivat yleensä käyttää koet intä, joka on valmistettu VHccTAG: n RNA:sta tai DNA:sta tai rekombinoitunutta V„aTAG:a sisältävistä uudelleenjärj estyneistä geeneistä, havaitsemaan homologisia 15 geenejä tuntemattomissa hybridoomissa. Näillä homologisilla vasta-aineilla on DNA-jakso, jonka lähetti-RNA hybridi -soituu koettimen kanssa, joka koostuu joko kokonaisuudessaan tai osittain VHaTAG:sta ja tämän molemminpuolisista vierusalueista. "Vierusalueisiin" on tarkoitus kuulua ne 20 DNA-jaksot, jotka ulottuvat VHaTAG:n 5'-päästä edeltävän geenin 3'-päähän ja VH«TAG:n 3'-päästä tästä myöhempänä olevan geenin 5'-päähän.

Suunnitelmallisesti syntetisoidut vaihtelevat alueet 25 Vielä yksi lähestymistapa on tässä kuvattujen vas ta-aineiden sekä koettimien avulla löydettyjen vasta-aineiden vaihtelevien alueiden suunnitelmallinen synteesi. Tällä lähestymistavalla on useita mahdollisia etuja. Tutkijan ei nimittäin olisi tarpeen seuloa immunisoituja koe-30 eläimiä yrittäessään ensin löytää ne vasta-aineet, jotka : sitoutuvat TAG:hen ja sitten löytää ne vasta-aineet, joil la erityisesti on VHaTAG:sta peräisin olevan DNA:n koodaamat VH-alueet.

24 103477

Mutageneesimenetelmät VH- ja/tai VL-geenijaksoja voidaan "muokata" muta-geneesillä. Kuvaaviin esimerkkeihin näistä menetelmistä kuuluvat eri nukleotidien pienten määrien lisäykset, de-5 leetiot tai tuotteen ominaisuutta säilyttämättömät korvautumat tai tuotteen ominaisuudet säilyttävät useiden nukleotidien korvautumat edellyttäen, että asianmukainen lu-kuvaiheistus säilyy.

Korvautumia, deleetioita, lisäyksiä tai mitä tahan-10 sa näiden alayhdistelmiä voidaan yhdistää toisiinsa lopullisen konstruktion aikaansaamiseksi. Koska koodisanojen mahdollisia jaksoja on 64 mutta aminohappoja on vain 20, geneettinen koodi on horjuva siinä mielessä, että eri koodisanoista voi olla tuloksena sama aminohappo. Koodi on 15 kuitenkin tarkka kunkin aminohapon suhteen; siten kullekin aminohapolle on ainakin yksi koodisana, ts. jokaisesta koodisanasta saadaan vain yksi aminohappo eikä muita aminohappoja. On selvää, että translaation aikana on lukuvai-heistuksen säilyttävä oikeana, jotta lopputuloksena ole-20 vaan polypeptidiin saadaan oikea aminohappojakso.

Menetelmät ennakolta määrättyihin aminohappokohtiin tehtävien lisäysten suorittamiseksi ovat tunnettuja. Esimerkkeihin näitä menetelmistä kuuluvat oligonukleotidivä-litteinen kohdemutageneesi ja polymeraasiketjureaktio.

2 5 Menetelmät ennakolta määrättyihin aminohappokohtiin tehtävien deleetioiden suorittamiseksi ovat tunnettuja. Esimerkkeihin näitä menetelmistä kuuluvat oligonukleotidi-välitteinen kohdemutageneesi ja polymeraasiketjureaktio.

Menetelmät ennakolta määrättyihin aminohappokohtiin 30 tehtävien korvausten suorittamiseksi ovat tunnettuja. Esi-: merkkeihin näitä menetelmistä kuuluvat oligonukleotidivä- litteinen kohdemutageneesi ja polymeraasiketjureaktio.

Oligonukleotidivälitteinen kohdemutageneesi käsittää olennaisesti haluttua mutaatiota koodaavan oligonukle-35 otidin hybridisoimisen mutatoitavan alueen käsittävään 25 1 0 3 4 7 7 yksinauhaiseen DNAihan ja tämän yksinauhaisen nauhan käytön oligonukleotidin pidentämisen templaattina mutaation sisältävän nauhan tuottamiseksi. Tämä menetelmä eri muotoineen on kuvattu julkaisuissa Zoller, M.J., ja Smith, 5 M., (1982) Nucl. Acids Res. 10, 6487 - 6500; Norris, K.,

Norris, F., Christiansen, L. ja Fiii, (1983) N. Nuc. Acids Res. 11, 5103 - 5112; Zoller, M.J. ja Smith, M., (1984) DNA 3, 479 - 488; Kramer, W. , Schughart, K. ja Fritz, W.J., (1982) Nuc. Acids Res. 10, 6475 - 6485.

10 Polymeraasiketjureaktio (PCR) sisältää olennaisesti DNA:n eksponentinalisen monistamisen in viro käyttäen sekvenssiltään määrättyjä oligonukleotidejä. Oligonukleoti-deihin voi haluttaessa sisältyä jaksojen muutoksia. Poly-meraasiketjureaktiomenetelmä on kuvattu julkaisussa Mullis 15 ja Faloona, (1987) Meth. Enz. 155, 335 - 350. Esimerkkejä PCR:ää käyttävistä mutageneeseistä on kuvattu julkaisuissa Higuchi et ai. . (1988) Nucl. Acids Res. 16, 7351 - 7367;

Ho et ai.. (1989) Gene 77, 51 - 59 ja "Engineering Hybrid

Restriction Genes Without the Use of Restriction Enzymes: 20 Gene Splicing by Overlap Extension", Horton et_al., (1989)

Gene 7 7, 61.

Muutosten teolla vasta-aineen vaihteleviin alueisiin voi olla erityistä käyttöä monoklonaalisten vasta-aineiden terapeuttisessa käytössä. Kun nykyisin annostel-. 25 laan hiiren täydellisen vaihtelevan alueen käsittävää ki- meeristä vasta-ainetta ruiskeina ihmiseen, ihmisruumiin immuunijärjestelmä tunnistaa hiiren vaihtelevan alueen vieraaksi, vaikka tämä alue on pienempi kuin hiiren kokonainen vasta-aine, ja tuottaa tätä vastaan immuunivasteen. 30 Kun sitten ihmiseen injektoidaan myöhemmin hiiren vasta-: ainetta tai kimeeristä vasta-ainetta, tämän aineen tehok kuus pienenee huomattavasti kehon immuunijärjestelmän vierasta vasta-ainetta vastaan suunnatun toiminnan ansiosta. Tästä seuraa se, että hiiren VH- ja VL-alueisiin tehdyt 103477 26 muutokset voivat vähentää ihmisen immuunivastetta muunnettua vasta-ainetta vastaan.

Yhdistelmä-DNA-tekniikät

Vasta-aineita voidaan konstruoida yhdistelmä-DNA-5 tekniikoilla. Toisin sanoen, koska useiden eri VH:ta ja VL:ää koodaavien alueiden nukleotidijaksot on nyt saatu käyttöön, voi alan ammattimies tuottaa täydellisen, raskaiden ja kevyiden ketjujen vaihtelevia alueita koodaavan geenin in viro.

10 Konstruoitu geeni voidaan suunnitella siten, että valitut Dh- ja JH-geenisegmentit ovat siinä toiminnallisessa yhteydessä valitun VH-geenisegmentin kanssa, ts. V„aTAG-segmentin tai CC49:n tai CC83:n VH-geenisegmentin kanssa.

Konstruoitu raskasta ketjua koodaava DNA sisältää 15 esimerkiksi DH- ja JH-geenijaksot, jotka ovat ituradan VHaTAG-geenisegmentin vieressä täydentäen näin CDR3:n ja VH-alueen kehyksen (FR) 4. Johtojakso voi olla läsnä tai se voidaan myöhemmin poistaa.

Käytetystä kevyestä ketjusta riippuen voi olla myös 20 tarpeen saada käyttöön konstruoitua kevyttä ketjua koodaava DNA. Tämä DNA käsittää toiminnallisessa yhteydessä olevan VL-geenisegmentin, joka on esimerkiksi JL-geenisegmen-tin vieressä ja johon liittyy johtojakso, joka voidaan myöhemmin poistaa. JL-geenisegmentti vaihtelee riippuen . 25 siitä, kuuluuko kevyt ketju lambda- vai kappasysteemiin.

J-alueen jakso on VL-eksonin loppupään vieressä täydentäen VL-osan FR 4:n. Tämä konstruktio voidaan tehdä VH-geenin konstruktioon käytetyillä menetelmillä.

Konstruoitu geeni voidaan muokata esimerkiksi ta-30 vanomaisilla yhdistelmätekniikoilla ilmentymiskykyisen • geeni-insertin aikaansaamiseksi plasmidiin. Tämän jälkeen plasmideja voidaan ilmentää isäntäsoluissa. Seuraavassa esitetään esimerkkejä biologisista yhdistelmämenetelmistä.

Kun suunnitellaan otattavaksi käyttöön fragmentti, 35 joka koodaa joko kevyen ketjun tai raskaan ketjun vaihte- 27 1 0 3 4 7 7 levää aluetta, on tavallisesti haluttua se, että J-aluetta jäljempänä oleva introni liitetään mukaan kokonaisuudessaan tai osittain varsinkin silloin, kun vaihteleva alue on peräisin isännästä, jossa fuusioitua geeniä tullaan 5 ilmentämään. Silloin, kun introni säilytetään, tarvitaan intronin päissä olevat toimintakelpoiset irrotuskohdan vastaanottaja- ja luovuttajajaksot. J:n ja fuusioidun geenin muuttumattoman alueen välinen introni voi olla ensisijaisesti intronijakso, joka liittyy (1) muuttumattomaan 10 alueeseen, (2) J-osaan tai (3) osiin molemmista. Viimeksi mainittu voi soveltua käytettäväksi mukavuussyistä silloin, kun kätevä restriktiokohta esiintyy näistä kahdesta lähteestä peräisin olevissa introneissa. Voi olla tarpeen ottaa käyttöön sovittimia intronin liittämiseksi muuttu-15 mattomaan alueeseen. Joissakin tapauksissa introni voidaan muokata kokonaan tai osittain deleetiolla, nukleotidi(e)n korvauksella (-silla) tai insertiolla käsittelyhelppouden, ilmentymisen tai muun sellaisen parantamiseksi. Edullisesti tulisi intronia olla riittävästi, jotta siihen sisäl-20 tyisi ilmentymisen tehostaja-alue, joka on toiminnallisesti aktiivinen luonnossa esiintyvän promoottorin kanssa.

Vaihtoehtoisesti voi olla haluttua se, että fuusioidussa geenissä ei esiinny J-geenin ja C-geenin välistä intronia. J-geenin 31-pää tulee siten olemaan C-geenin 5'-. 25 pään vieressä. Voidaan käyttää eksonukleaasia ja vaihtele- via pilkkoutumisaikoja käyttäen voidaan saada erilaisia 3'-päitä, joita sitten voidaan käyttää muuttumattomaan alueeseen tehtävään liitokseen ja suorittaa valinta toiminnallisen tuotteen suhteen useilla eri tavoilla; tai 30 suorittamalla leikkaus pidentämällä limittäin olevia osia • polymeraasiketjureaktiomenetelmällä (ks. Horton et ai..

yllä). Tässä tapauksessa käytetään yleensä keinotekoista promoottoria, jonka ei tarvitse olla toiminnallisesti aktiivinen tehostaja-alueen kanssa.

103477 28

Yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa voidaan muuttaa VH- ja VL-alueita koodaavia geenejä korvaamalla ainakin osia vasta-aineen vaihtelevien osien kevyessä ja raskaassa ketjussa olevista komplementaarisuutta määrää-5 vistä alueista (CDR) minkä tahansa eri spesifisyyden omaavan vasta-aineen CDR:ien analogisilla osilla. Esimerkkinä CDR:ien korvausmenetelmästä on patenttihakemusjulkaisuihin Gregory Winter, EP-0 239 400 ja Huston, et ai. PCT WO 88/ 09 344 sisältyvä oppi. Tämän keksinnön mukaisessa muunne-10 tussa vasta-aineessa vain vasta-aineen CDR:t ovat ihmisruumiille vieraita ja tämän tulisi minimoida sivuvaikutukset, jos tätä vasta-ainetta käytetään ihmisten hoitoon. Ihmisen ja hiiren kehysalueilla on kuitenkin luonteenomaiset piirteensä, jotka erottavat ihmisen ja hiiren kehys-15 alueet toisistaan. Vasta-aine, joka käsittää hiiren CDR:t ihmisen kehysalueessa ei siten saata olla ruumiille sen enempää vieras kuin oikea ihmisen vasta-aine.

Tässä keksinnössä tarjoutuu käyttöön VHaTAG:n, CC46:n, CC49:n, CC83:n ja CC92:n VH-aminohappojaksoja vas-20 taavat nukleotidijaksot sekä CC49:n, CC83:n ja CC92:n VL-geenisegmenttien nukleotidijaksot. Tämän mukaisesti on ennakoitavissa, että tämän keksinnön mukaisista vasta-aineista saadut CDR:t voidaan liittää ihmisen vasta-aineen kehysalueisiin.

25 Ihmisen VH- tai VL-osista peräisin olevat CDR-alueet voidaan yleensä korvata tämän keksinnön mukaisten vasta-aineiden VH- tai VL-osista peräisin olevilla CDR-alueilla. Esimerkkeihin ihmisen vasta-aineista, joista peräisin olevia kehysalueita voidaan käyttää, kuuluvat ihmisen plasma-30 sytooma NEWM ["Replacing the complementarity-determining v regions in a human antibody with those from a mouse",

Jones et al., (1986). Nature 321 522 - 525], joka on ylei sesti saatavissa Dr. Greg Winteriltä; ja useat muut ihmisen VH- tai VL-geenit, jotka ovat saatavissa Dr. Terrence 35 Rabbittsilta, molempien tutkijoiden ollessa laitoksesta % 29 103477

Medical Research Council, 20 Park Crescent, London, WIN 4AL.

Sen määritys, mistä CDR koostuu ja mistä kehysalue koostuu voidaan tehdä valittujen Ig-molekyylien aminohap-5 pojärjestyksen perusteella, kuten teoksessa Kabat et ai. , (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. painos, US Dept. of Health and Human Services, NIH, on esitetty.

Neljä kehysaluetta esiintyvät suurimmaksi osaksi 10 β-liuskakonformaatiossa ja CDR:t muodostavat näitä β-lius-karakenteita yhdistäviä silmukoita ja joissakin tapauksessa osan näistä rakenteista.

Lisäksi kaikki silmukka-alueiden aminohapporyhmät eivät ole liuottimen ulottuvilla ja yhdessä tapauksessa 15 kehysalueissa sijaitsevat aminohapporyhmät liittyvät antigeenin sitomiseen [Amit, A.G., Mariuzza, R.A., Phillips, S.E.V., ja Poljak, R.J., (1986) Science 233, 747 - 753].

On myös tunnettua, että antigeeniä sitovan kohdan kahden osan vaihtelevat alueet pysyvät oikein orientoitu-20 neena ketjujen välisten ei-kovalenttisten vuorovaikutusten ansiosta. CDR:ssä esiintyvät aminohapot voivat osallistua näihin vuorovaikutuksiin.

Yhden vaihtelevan alueen antigeeniä sitovan kyvyn siirtämiseksi toiseen ei siten saata olla tarpeellista * 25 korvata kaikkia CDR:iä luovuttajalta saatavista täydelli sistä vaihtelevista alueista peräisin olevilla täydellisillä CDRrllä. Voi olla tarpeen siirtää vain ne ryhmät, joita tarvitaan antigeenin sitoutumiskohtaa varten ja tähän voi liittyä kehysalueilla olevien ryhmien siirto sekä 30 CDR-ryhmien siirto.

On siten selvää, että pelkästään yhden tai useamman komplementaarisen CDR:n korvaaminen ei aina johda toimintakykyiseen muunnettuun vasta-aineeseen. EP-patenttihake-musjulkaisussa 0 239 400 esitettyjen selitysten perusteel-35 la voidaan alan ammattimiehen pätevyydellä saada toimiva 103477 30 muunnettu vasta-aine joko rutiinikokeita suorittamalla tai testaamalla yrityksen ja erehdyksen kautta.

Sekä raskaassa että kevyessä olevat vaihtelevat osat muutetaan edullisesti siten, että CDR:t korvataan 5 ainakin osittain ja, mikäli tarpeen, kehysalueet korvataan osittain ja jaksoa muutetaan. Vaikka CDR:t voivat olla peräisin samasta eläinluokasta tai jopa samasta alaluokasta kuin se vasta-aine, josta kehysalueet ovat peräisin, on odotettavaa, että CDR:t ovat peräisin eri eläinluokan vas-10 ta-aineesta ja edullisesti eri eläinlajista.

Koostetut vaihtelevat alueet VL:ää koodaava V-geeni on yleensä sama V-geeni, joka koodaa luonnollisella tavalla vapaasti valittuun VH:hon liittynyttä VL:ää. Esimerkiksi CC49:n ja CC83:n VL-alueita 15 koodaavien V-geeneien käyttö on eduksi käytettäessä V-gee-niä, joka koodaa CC49:n ja CC83:n VH:ta, tässä järjestyksessä ilmoitettuna.

Koska tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen vasta-aineiden VH-alueet ovat VHaTAG:sta peräisin olevien 20 VH-geenien koodaamia, on yllättävää, että koostevasta-ai-neita on edullisesti muodostettavissa. Toisin sanoen, yhden tämän keksinnön mukaisesti valmistetun vasta-aineen VH-alue voidaan liittää toisen tämän keksinnön mukaisesti valmistetun vasta-aineen VL-alueeseen. Vaikka CC49:n ja • 25 CC83:n raskaiden ketjujen aminohappojaksot muistuttavat pinnallisesti tarkasteltuina läheisesti toisiaan, olisi odotettavissa, että muutaman tai yhden aminohapon muutos vaikuttaisi voimakkaasti vasta-aineen sitoutumistoimin-toon, ts. tuloksena olevien vasta-aineiden otaksutaan 30 yleensä olevan epäspesifinen immunoglobuliini (NSI) ts.

. sellainen, jolta vasta-aineluonne puuttuu (ks. EP-hakemus- julkaisu 0 125 023).

On jokseenkin hämmästyttävää, että nyt on havaittu se, että tämän keksinnön mukaisesti valmistetun VH:n omaa-35 vaa vasta-ainetta ei tarvitsekaan yhdistää uudelleen yk- « 31 103477 sinomaan samasta luonnossa esiintyvästä eläimen vasta-aineesta peräisin olevaan VL:ään. Kuten esimerkeissä esitetään, on esimerkiksi mahdollista tuottaa kimeerinen vasta-aine, jonka raskaassa ketjussa oleva VH on peräisin 5 CC83:sta ja kevyessä ketjussa oleva VL on peräisin CC49:stä, jolloin näin muodostetulla koostevasta-aineella on sitoutumisspesifisyys, joka on 25 % suurempi kuin B72.3:lla on TAG72:ta vastaan.

Muuttumattomat alueet 10 Raskasketju- (C,-) osa CH-osat voivat olla ihmisen eri isotyyppejä, ts. IgG (esimerkiksi IgG17 IgG2, IgG3 ja IgG4) , IgA, IgD, IgM sekä kunkin ryhmän eri alatyyppejä.

Ihmisen yl:tä on tarkasteltu julkaisuissa Ellison 15 et ai. . (1982) "The nucleotide sequence of a human immunoglobulin C-gamma-l gene", Nucl. Acid Res. 10, 4071 - 4079 ja Takahashi et al.. (1982) "Structure of human immunoglobulin gamma genes: Implications for evolution of a gene family". Cell 29, 671 - 679. Ihmisen gamma 2:ta (γ2) 20 on tarkasteltu julkaisuissa Krawinkel et ai.. (1982) "Comparison of the hinge-coding segments in human immunoglobulin gamma heavy genes and the linkage of the gamma 2 and gamma 4 subclass genes", EMBO J. 1, 403 - 407, Ellison et al. , (1982) "Linkage and sequence homology of • 25 two human immunoglobulin gamma heavy chain constant region genes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1984 - 1988 ja

Takahashi et al. . ks. yllä. Ihmisen gamma 3-.a (γ3) on tarkasteltu julkaisuissa Krawinkel et al.. (ks. yllä) ja Takahashi et al. . (ks. yllä). Ihmisen gamma 4: ää (γ4) on 30 tarkasteltu julkaisuissa Ellison et al.. (1981) "Nucleo- . tide sequence of a human immunoglobulin C-gamma-4 gene" DNA 1, 11 - 18, Krawinkel et al., (ks. yllä) ja Takahashi et al., (ks. yllä).

Ihmisen myytä on tarkasteltu julkaisussa Rabbitts 35 et al. . "Human Immunoglobulin Heavy Chain Genes: Evol- 32 1 0 3 4 7 7 utionary Comparisons of Cfi, Cö ja C genes and Associated Switch Sequences", Nucl. Acids Res. 9, 4509 - 4524.

Ihmisen alfaa on tarkasteltu julkaisussa Flanagan et ai.. (1984) "Mechanisms of Divergence and Convergence 5 of the Human Immunoglobulin alpha 1 and alpha 2 Constant Region Gene Sequences", Cell 36, 681 - 688.

Ihmisen deltaa on tarkasteltu julkaisussa White et ai.. (1985) "Human Immunoglobulin D: Genomic Sequences of the Delta Heavy Chain" Science 228, 733 - 737.

10 Ihmisen epsilonia on tarkasteltu julkaisussa Max et ai., (1982) "Duplication and Deletion in the Human Immunoglobulin ε Genes", Cell 29, 691 - 699.

Kevytketju (CL) -osa CL-osa voi olla ihmisen kappa (κ) tai ihmisen lambda 15 (λ) .

Ihmisen κ:aa on tarkasteltu julkaisussa Heiter et ai. , (1980) "Cloned Human and Mouse Kappa Immunoglobulin

Constant and J Region Genes Conserve Homology in Functional Segments", Cell 22, 197 - 207.

20 Ihmisen λ: aa on tarkasteltu julkaisussa Hollis et ai., (1982) "Processed Genes: A Dispersed Human Immunoglobulin Gene Bearing Evidence of RNA-type Processing", Nature 296, 321 - 325.

CH- ja/tai CL-geenisegmenttejä voidaan "muuttaa" mu-• 25 tageneesillä. Esimerkkeihin näistä menetelmistä kuuluvat eri nukleotidien pienten määrien lisäykset, deleetiot tai tuotteen ominaisuutta säilyttämättömät korvautumat tai tuotteen ominaisuudet säilyttävät useiden nukleotidien korvautumat edellyttäen, että asianmukainen lukuvaiheistus 30 säilyy. Lisäksi voidaan muuttaa proteiinin kokonaisia ; alueita, kuten esimerkiksi korvaamalla CH3 CH2:lla. Tämä korvaus tehdään DNA-tasolla liittämällä, poistamalla tai korvaamalla kokonaisia jakson eksoneita.

33 1 0 3 4 7 7

Vasta-aineiden konstruktio

Immunisoinnit

Ensimmäinen sellaisten vasta-aineiden tuotossa käytettävä menetelmä, riippumatta siitä, ovatko vasta-ai-5 neet monoklonaalisia vai polyklonaalisia, joiden VH-alueet ovat VHoTAGrsta peräisin olevan DNA:n koodaamaa, on isän-täeläimen immunisointi puhdistetulla TAG72:lla. Esimerkkejä toimenpiteistä, joiden mukaan isäntäeläin immunisoidaan TAG72:11a, esitetään US-patenteissa 4 522 918 ja 10 4 612 282, joissa immunogeeninä on käytetty ihmisen rinta rauhasen karsinoomasta saatua uutetta; ja US-patenttihake-musjulkaisussa 7-073 685 (joka on julkisesti saatavilla), jossa immunogeeninä on käytetty B72.3:lla puhdistettua TAG72:ta.

15 Tämän jälkeen immunisointitoimenpiteillä saadut monoklonaaliset tai polyklonaaliset vasta-aineet seulotaan sen märittämiseksi, mitkä mainituista vasta-aineista sitoutuvat valikoivasti TAG72:een. Tämä seulonta voidaan suorittaa millä tahansa monista tunnetuista menetelmistä, 20 kuten kiinteän faasin radioimmunomäärityksellä, entsyymi-välitteisillä immunosorbenttimäärityksillä, rosetinmuodos-tusmäärityksillä ja toimintakyvyn estomäärityksillä. Nämä menetelmät ovat sinänsä hyvin tunnettuja.

Aminohappojaksojen synteesi 25 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut immunoglobu- liinit voidaan syntetisoida niiden koostumukseen kuuluvista aminohapoista. Sopivia menetelmiä ovat Merrifieldin kiinteän faasin menetelmä, joka on kuvattu artikkelissa J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 - 2154 (1963). Tämä kiinteän faa- 30 sin menetelmä aminohappojaksojen syntetisoimiseksi on myös : kuvattu sivuilla 1-4 Stewartin ja Youngin kirjassa Solid

Phase Peptide Synthesis [W.H. Freeman -and Co., San Francisco, (1969)] .

34 103477 DNA:n konstruktio

VB:ta ja VL:ää koodaava DNA

Vasta-aineen raskasta ja kevyttä ketjua koodaava DNA voidaan saada useista eri lähteistä, jotka ovat tun-5 nettuja alan ammattimiehille, esimerkiksi genomin DNA, cDNA, synteettinen DNA tai näiden yhdistelmät.

Haluttua jaksoa sisältävät solut voidaan eristää ja genomin DNA pilkkoa yhdellä tai useammalla restriktioent-syymillä. Genomin DNA:hän voi liittyä luonnossa esiintyviä 10 introneja tai nämä voivat siitä puuttua. Saatavat fragmentit voidaan sitten kloonata ja seuloa raskaan ketjun J-alueen (JH) koetinta käyttäen mielenkiinnon kohteena olevaa polypeptidijaksoa koodaavan DNA-jakson esiintymisen suhteen. Preparatiivisella agaroosigeelielektroforeesilla 15 eristetyt DNA-fragmentit liitetään ligaasilla. Kirjastojen yhdistelmäplakit seulotaan hiiren JH-koettimella.

DNA voidaan saada myös cDNA-kirjastosta. Raskasta tai kevyttä ketjua koodaava lähetti-RNA eristetään sopivasta lähteestä, joko kypsistä B-soluista tai hybridooma-20 viljelmästä, normaaleja RNA:n eristysmenetelmiä käyttäen ja käyttäen oligo-dT-selluloosakromatografiaa poly-A-lä-hetti-RNA:n erottamiseksi. Poly-A-lähetti-RNA voidaan tarvittaessa lisäksi fraktioida, jotta saadaan sellaiset jaksot, jotka ovat riittävän suuria koodaamaan halutun vasta-25 aineen raskaan tai kevyen ketjun aminohappojaksoja.

Tämän jälkeen lähetti-RNA-seoksesta valmistetaan cDNA-kirjasto käyttäen sopivaa aluketta, joka on edullisesti halutun cDNA:n ominaisuuksien mukainen nukleiinihap-pojakso. Tällainen aluke voidaan syntetisoida vasta-aineen 30 aminohappojaksoon perustuen. Toisena vaihtoehtona voidaan : myös käyttää haluttua vasta-ainetta tuottavasta solulin- jasta saatua fraktioimatonta poly-A-lähetti-RNA:ta tai poly-dT:tä. Tulokseksi saatu cDNA fraktioidaan valinnaisesti koon mukaan polyakryyliamidigeelissä ja pidennetään 35 esimerkiksi dC-ryhmillä sopivalla restriktioentsyymillä, 35 1 0 3 4 7 7 kuten Pst I:llä, pilkottuun pBR 322:een tai muuhun sopivaan kloonausvektoriin liittämistä varten ja pidennetään dG-ryhmillä. Voidaan myös tietenkin käyttää vaihtoehtoisia keinoja cDNA:n sisältävien kloonausvektoreiden muodostami-5 seksi muita päätteitä ja muista vektoreista koostuvia loppuosia käyttäen, mutta tämä on tavallinen ja edullinen vaihtoehto. Sopiva isäntäsolukanta, joka on tyypillisesti Escherichia coli (E. coli), transformoidaan yhteen liitetyillä kloonausvektoreilla ja onnistuneesti transformoitu-10 neet solut tunnistetaan esimerkiksi ampisilliini- tai tet-rasykliiniresistenttiyden tai jonkin muun kloonausvektori-plasmidissa olevan fenotyyppisen ominaisuuden perusteella.

Onnistuneesti transformoituneet solut poimitaan talteen ja siirretään mikrotiitterilevyille tai muulle 15 alustalle jatkokasvatusta ja säilytystä varten. Näistä kasvavista viljelmistä nitroselluloosasuodattimelle tehtyjä siirrostusjälkiä käsitellään nukleiinihappojaksoista koostuvilla koettimilla, jotka sisältävät cDNA:ssa olevia haluttuja jaksoja vastaan komplementaarisia emäksiä. Voi-20 daan käyttää useita koetintyyppejä, joista edullisia ovat synteettiset yksinauhaiset, y32P-ATP:llä kinaasikäsittelyl-lä leimatut DNA-jaksot. Nitroselluloosasuodattimeen kiinnittyneet solut hajotetaan, DNA denaturoidaan ja kiinnitetään sitten ennen kinaasikäsitellyllä koettimellä suori-25 tettavaa reaktiota. Kloonit, joissa hybridisoituminen on onnistunut, havaitaan tuomalla ne valokuvauslevyn yhteyteen, jonka jälkeen kasvavista pesäkkeistä eristetään plasmidit ja suoritetaan sekvenssointi sinänsä tunnetuilla menetelmillä haluttujen geenin osien läsnäolon varmennuk-30 seksi.

: Halutut geenifragmentit irrotetaan ja räätälöidään ohjaussegmenttien suhteen sopivan lukuvaiheistuksen varmistamiseksi sopiviin ilmentämisvektoreihin liitettäessä. Nukleotidejä liitetään tyypillisesti 5'-päähän aloitussig- 103477 36 naalin ja sopivassa paikassa olevan restriktioendonukleaa-sikohdan liittämiseksi mukaan.

Koska tämän keksinnön tekijät ovat esittäneet VHaTAG:n jaksojen nukleotidijärjestyksen, voidaan DNA myös 5 valmistaa synteettisesti, esimerkiksi käyttäen Applied

Biosystems™ mallin 380A DNA-syntetisaattoria ja konstruoida tavallisilla menetelmillä.

Lopuksi esimerkkinä menetelmistä, joissa käytetään näiden menetelmien yhdistelmiä, on leikkaaminen polymeraa-10 siketjureaktiomenetelmällä suoritettavan limitysten piden nyksen avulla, joka on esitetty julkaisussa Horton et ai. (ks. yllä). Synteettisesti valmistettu aluke, jolla on niin sanottu "heiluva häntä", voidaan liittää valittuun jaksoon, esimerkiksi genomin DNA:hän. Tämän jälkeen jaksot 15 monistetaan ja leikataan yhdessä.

CH:ta ja CL:ää koodaava DNA

Ihmisen muuttumattoman alueen aminohappojaksoa koodaava DNA voidaan saada ihmisen immunoglobuliinia tuottavien solujen kromosomaalista DNA:ta seulomalla.

20 Vektorit

Haluttu DNA-fragmentti voidaan sijoittaa biologisesti toimintakykyiseen ilmentämiskantajaan, joka voi sisältää sopivia ohjausjaksoja, joita valitussa DNA-fragmen-tissa ei esiinny. "Biologisesti toimintakykyisellä" tar-25 koitetaan, että ilmentämisvehikkeli on suunniteltu huolehtimaan lisääntymiseen ja/tai ilmentämiseen liittyvistä toiminnoista sopivassa isännässä joko niin, että se lisääntyy kromosomin ulkopuolisena yksikkönä, tai että tämä liittyy isännän genomiin. Käytettävissä on suuri määrä 30 vektoreita tai niitä voidaan valmistaa helposti ja ne tun-: netaan alan ammattimiesten piirissä.

On kuvattu joukko plasmideja, kuten EP-hakemusjulkaisuissa nro 0 036 776, 0 048 970 ja 0 051 873 kuvatut plasmidit, jotka sisältävät valmiiksi geenin kanssa oi- 37 103477 keassa lukuvaiheistuksessa olevan promoottorin, joka on yhteen sopiva ehdotetun isäntäsolun kanssa.

Tässä kuvatut vektorit ja menetelmät ovat sopivia käytettäväksi transformoitavissa olevan joko prokaryoo-5 teista tai eukaryooteista koostuvan laajan mikro-organis mi joukon yhteydessä. Plasmidi tulee olemaan lisääntymiskykyinen tässä mikro-organismissa, erityisesti bakteerissa .

Plasmidivektorit, jotka sisältävät sopivia promootio toreita, joita mikro-organismi voi käyttää oman proteiininsa ilmentämiseen, sisältävät yleensä myös ohjausjakso-ja, ribosomia sitovia kohtia ja transkription lopetuskoh-tia. Isäntäsolun kanssa yhteen sopivista lajeista peräisin olevia replikoni- ja ohjausjaksoja käytetään yleensä näi-15 den isäntäsolujen yhteydessä.

Voidaan käyttää myös pienempiä tai suurempia SV40-fragmentteja, edellyttäen, että mukaan on liitetty noin 250 emäsparin (ep) jakso, joka ulottuu Hind III -kohdasta Pvu II -kohdan suuntaan, joka sijaitsee viruksen replikaa-20 tion aloituskohdassa. On myös lisäksi mahdollista ja usein haluttua käyttää promoottori- tai ohjausjaksoja, jotka tavallisesti liittyvät haluttuun geenijaksoon edellyttäen, että nämä ohjausjaksot ovat yhteen sopivia isäntäsolusys-teemin kanssa.

25 On haluttua, että plasmidissa olisi lopuksi geeni, markkerigeeni, josta voitaisiin saada ilmentämisvektorin sisältävien isäntäsolujen valikoimisen mahdollistava feno-tyyppinen ominaisuus. Erityisen käyttökelpoinen on geeni, joka tarjoaa käytettäväksi valikoinnin eloonjäämisen pe-30 rusteella. Eloonjäämiseen perustuva valikointi suoritetaan tarjoamalla käyttöön kasvua estävää ainetta vastaan suunnattu resistenssi tai tarjoamalla käyttöön kasvutekijän muodostuskyky bakteerille, jolta tämä puuttuu.

Prokaryoottiset organismit ovat yleensä edullisia. 35 Esimerkiksi E. coli -lajista johdettu plasmidi pBR322 38 103477 [Bolivar et ai.. (1977) Gene 2, 95] on erityisen käyttö kelpoinen. pBR322 sisältää ampisilliini- ja tetrasyklii-niresistenssigeenit ja näistä saadaan helppo keino transformoituneiden solujen tunnistamiseksi.

5 Vaikka nämä prokaryoottiset organismit ovat ylei simmin käytettyjä, voidaan käyttää muita mikrobikantoja, joihin kuuluu E. coli -kantoja, kuten E. coli B, E. coli K12 kanta 294 (ATCC nro 31446) ja E. coli X1776 (ATCC nro 31537), E. coli W3110 (F-, γ~, prototrofinen, ATCC nro 10 27325), basillit, kuten Bacillus subtilis ja muut entero- bacteriaceae-ryhmän jäsenet, kuten Salmonella tvohimurium tai Serratia macrcesans ja voidaan käyttää useita eri Pseudomonas-laj ei a. Näiden esimerkkien on tarkoitus olla vain kuvaavia.

15 Prokaryoottien lisäksi voidaan käyttää eukaryootti- sia mikrobeja. Eukaryoottisista mikro-organismeista on yleisimmin käytetty Saccharomvces cerevisiae. eli tavallinen leivontahiiva, vaikka muitakin kantoja on yleisesti saatavilla.

20 Saccharomyces-hiivassa tehtävään ilmentämiseen käy tetään yleensä esimerkiksi plasmidia YRp7 [Stinchcomb et ai., (1979) Nature 282, 39, Kingsman et ai. . (1979) Gene 7, 141 ja Tschemper et ai. , (1980) Gene 10, 157] . Tämä plasmidi sisältää valmiina trpl-geenin, joka tarjoaa käy-.. 25 tettäväksi valikointiin soveltuvan markkerin sellaista hiivan mutanttikantaa varten, jolta puuttuu kyky kasvaa tryptofäänissä, esimerkiksi ATCC nro 44076 tai PEP-1 [Jones, (1977) Genetics 85, 12] . Trpl-vaurion esiintyminen isäntäsolun genomin piirteenä tarjoaa käyttöön tehokkaan 30 ympäristön transformaation havaitsemiseksi ilman tryptof-aania tapahtuvan kasvun perusteella.

Hiivassa käytettäväksi soveltuu mikä tahansa plas-midivektori, joka sisältää hiivan kanssa yhteen sopivan promoottorin, lisääntymisen alkukohdan ja lopetuskohdan.

35 Sopiviin promoottorijaksoihin hiivavektoreissa kuuluvat 39 103477 3-fosfoglyseraattikinaasin [Hitzeman et ai. . (1980) J.

Biol. Chem. 255, 2073] tai muiden glykolyttisten entsyymien [Hess, et ai. . (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149,

Holland et al. (1978) Biochemistry 17, 4900] promoottorit.

5 Nisäkässoluissa tapahtuvaa käyttöä varten ilmentä- misvektorien ohjaustoiminnot saadaan virusperäisestä materiaalista. Yleisesti käytetyt promoottorit ovat peräisin polyoomaviruksesta, adenovirus 2:sta ja useimmin simian virus 40:stä (SV40). SV40-viruksen varhaiset ja myöhäiset 10 promoottorit ovat erityisen käyttökelpoisia, koska molemmat ovat helposti saatavissa viruksesta fragmenttina, joka myös sisältää SV40-viruksen replikaation alkukohdan [Fiers et ai.. (1978) Nature 273, 113].

Esimerkiksi pSV2neo sisältää ampisilliiniresistens-15 si neomysiiniresistenssigeenin, joka on SV40:n promoottorin ohjaama. pSV2neo tarjoaa käyttöön kätevän keinon sekä eläimestä peräisin olevaa vaihtelevaa aluetta että ihmisestä peräisin olevaa muuttumatonta aluetta vastaavilla geeneillä transformoitujen solujen tunnistamiseksi.

20 Kimeerisen DNA:n valmistus

Raskasta ketjua tai kevyttä ketjua koodaavat geenit konstruoidaan liittämällä muuttumatonta aluetta koodaavan DNA-fragmentin 51-pää vaihtelevaa aluetta koodaavan DNA-fragmentin 3'-päähän. Vasta-aineen aminohappojaksoa koo-25 daava DNA-jakso voidaan saada genomin DNA:sta talteen yhdessä promoottori- ja replikaatiokohtien kanssa. Siinä laajuudessa kuin isäntäsolu tunnistaa heterologisiin geeneihin liittyviä transkription ohjaus- ja translaation aloitussignaaleja, voidaan vaihtelevaa aluetta koodaavan 30 jakson 5'- ja 3'-vierusalueet säilyttää yhdessä vaihtele-vaa aluetta koodaavan jakson kanssa ja käyttää ohjaamaan transkriptiota ja translaation aloitusta. Muuttumattoman alueen koodaamaton 3'-vierusalue voidaan säilyttää transkription ohjausjaksojen, kuten lopetus- ja polyadenylaa-35 tiojaksojen vuoksi. Viitattaessa kaksoisnauhassa 5'-suun- 40 103477 taan tai 3'-suuntaan tarkoitetaan transkription suuntaa, jossa 5' edeltää 3':a.

Kutakin asianomaista ketjua vastaavan vaihtelevan alueen välinen intronijakso voidaan liittää vastaavaan ih-5 misen muuttumattoman ketjun DNA-fragmenttiin mitä tahansa kätevää restriktiokohtaa käyttäen. Kun vaihtelevaa aluetta koodaavaa fragmenttia ollaan hankkimassa käyttöön, on tavallisesti haluttavaa se, että mukaan liitetään osa J-alueen jälkeisestä intronista. Silloin, kun introni säi-10 lytetään, on tarpeen, että intronin päissä on irrottamiseen toimintakelpoiset vastaanottaja- ja luovuttajajaksot. Vaihtelevan alueen viereinen, tämän 5'-puolella oleva koo-daamaton jakso sisältää tavallisesti ne jaksot, jotka liittyvät transkription aloitukseen ja translaatioon, ku-15 ten TATA-box-alue, molekyylin pääte (capping) -jakso ja CAAT-jakso. Tavallisesti koodaamattoman 5'-jakson koko ei ylitä noin 1-2 kiloemäksen (ke) kokoa.

Tehostaja-alueen tulisi esiintyä J-alueen ja muuttumattoman alueen välissä. Käytetty tehostaja-alue voi 20 olla joko (1) eläimestä peräisin olevan V-alueen tai (2) ihmisestä peräisin olevan muuttumattoman alueen tehostaja-alue .

Säilyttämällä muuttumatonta aluetta koodaavan DNA-jakson 3'-vierusalue luonnollisessa paikassaan tämän jak-.. 25 son vieressä voidaan geenille saada transkription lopetus- signaalit. Silloin, kun transkription lopetussignaalien toiminta ilmentymisisäntäsolussa ei ole tyydyttävää, voidaan nämä korvata isäntäsolussa toimivalla 3'-alueella. Koodaamaton 31-alue voidaan saada kätevästi ilmentämis-30 isännästä saatavasta muuttumattoman alueen koodaamattomas-"m ta 3'-vierusalueesta. Koodaamaton 31-vierusalue voidaan liittää muuttumattomaan alueeseen millä tahansa aiemmin kuvatulla DNA-fragmenttien manipulointi- ja liittämiskei-nolla. Tätä aluetta voitaisiin sitten käyttää rakennusyk-35 sikkönä geenin valmistuksessa.

41 103477

Ilmentämisvehikkeleiden valmistus

Haluttuja koodaavia ja ohjaavia jaksoja sisältävien sopivien ilmentämisvehikkelikonstruktio voidaan tuottaa seuraavasti. Vektoreiden ja DNA-fragmenttien päät voidaan 5 sitten liittää uudelleen yhteen haluttujen ilmentämisvehikkeleiden muodostamiseksi. Käytetyt menetelmät eivät riipu DNA-lähteestä eivätkä isännäksi aiotusta solusta.

Kevyttä ketjua ja raskasta ketjua koodaavat DNA-fragmentit voidaan liittää erilliseen ilmentämisvehikke-10 liin tai samaan vektoriin. Kevyttä ja raskasta kimeeristä ketjua koodaavat fuusioidut geenit kootaan yhteen edullisesti eri ilmentämisvektoreissa, joita voidaan käyttää joko rinnakkain tai peräkkäin vastaanottajasolun rinnak-kaistransformaatiossa.

15 Keinoihin kimeerisiä geenejä sisältävien DNA-frag menttien liittämiseksi ilmentämisvektoreihin kuuluu rest-riktioendonukleaasien käyttö. "Restriktioendonukleaasit" (tai "restriktioentsyymit") ovat hydrolyyttisiä entsyymejä, jotka kykenevät katalysoimaan kohdespesifistä DNA-mole-20 kyylien pilkkoutumista. Restriktioendonukleaasin vaikutus-kohdan määrää spesifisen nukleotidijakson esiintyminen. Tätä jaksoa nimitetään restriktioendonukleaasin tunnistus-kohdaksi. Useista eri bakteerilajeista on eristetty useita restriktioendonukleaaseja ja ne on luonnehdittu tunnistus-.. 25 kohtiensa nukleotidijaksojen perusteella. Jotkin restrik tioendonukleaasit hydrolysoivat molempien nauhojen fosfo-diesterisidokset samasta kohdasta, jolloin päät jäävät tasaisiksi. Toiset katalysoivat muutamien nukleotidien päässä toisistaan olevien sidosten hydrolyysiä muodostaen 30 vapaita yksinauhaisia alueita pilkotun molekyylin kumpaan-kin päähän. Nämä yksinauhaiset päät ovat itsekomplementaa-risia ja sen vuoksi kohesiivisia ja niitä voidaan käyttää hydrolysoidun DNA:n liittämiseen uudelleen yhteen. Edustaviin esimerkkeihin restriktioendonukleaaseista kuuluvat « 103477

Aat 11, BamH I, EcoR I, Hind 111, Nde I, Spe I, Xba I, Sac I, Bql II, Pst I, Sal I, ja Pvu II.

Ilmentämisvektorissa voi lisäksi olla tähän liitetty liitoskohtaryhmä (polylinker), jossa on useita uniikke-5 ja restriktiokohtia. Pilkottaessa ilmentämisvektori sopivilla restriktioentsyymeillä, pilkkoutuu liitoskohtaryhmä siten, että voidaan liittää ainakin yksi geenin sisältävä DNA-fragmentti. Silloin, kun liitoskohtaryhmästä on saatavissa toisistaan erottuvat päät, voidaan DNA-fragmentti 10 liittää yhdellä tavalla orientoituneena, jos taas päät ovat samoja, seuraa DNA-fragmentin liittämisestä kahden eri orientaation omaavia plasmideja.

Pilkkominen suoritetaan käsittelemällä plasmideja restriktioentsyym(e)illä. Yleensä käytetään noin 10 μg 15 plasmidia noin 10 entsyymiyksikön kanssa noin 100 μΐ-.ssa puskuriliuosta. Endonukleaasilla pilkkominen suoritetaan tavallisesti 37 °C:sta 65 °C:seen ulottuvalla lämpötila-alueella pHrssa 7-9. (Tietyille nimenomaisille restrik-tioentsyymeille sopivat puskurit ja substraattimäärät ovat 20 valmistajien spesifioimia.) Reaktioaika voi olla 1-18 tuntia.

Voi olla hyödyllistä estää pilkotun vektorin liittyminen takaisin yhteen suorittamalla esikäsittely alka-lisella fosfataasilla. Spesifiset olosuhteet ovat valmis-.. 25 tajan kuvaamia.

Kun restriktioentsyymillä pilkkominen on viety loppuun, poistetaan proteiini fenoli- ja kloroformiuutoksel-la. Nukleiinihappo otetaan talteen (0,3 M natriumasetaat-tia sisältävästä) vesifaasista saostamalla noin 2,5-ker-30 täisellä tilavuudella etanolia.

·, Restriktioentsyymeillä suoritettavien pilkkomisme- netelmien kuvauksia on seuraavissa julkaisuissa: Greene et ai., Methods in Molecular Biology, osa 9, (Wickner, R.B., toim.) Marcel Dekker, Inc., New York ja Mertz ja Davis, 43 103477 (1972) "DNA Replication and Biosynthesis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 3370.

Reaktion kulun seuraamiseksi suoritetaan pilkottujen fragmenttien erottaminen koon mukaan kätevästi agaroo-5 sigeelielektroforeesilla. Kun pilkkoutuminen on saavutta nut halutun tason, voidaan endonukleaasi inaktivoida kuumennuksella yli 65 °C:seen noin 10 minuutin ajaksi tai uuttamalla orgaanisella liuotteella.

Haluttu fragmentti puhdistetaan sitten pilkkoutu-10 mistulosten joukosta. Sopiviin puhdistusmenetelmiin kuuluvat geelielektroforeesi tai sakkaroosigradienttisentri-fugointi.

Plasmidikantaja ja vieraan DNA:n fragmentit liitetään sitten DNA-ligaasilla rengasrakenteen uudelleenmuo-15 dostamiseksi. Tätä prosessia kutsutaan pituussuuntaiseksi yhtymiseksi ja DNA-ligaatioksi.

Käytetään sopivalla tavalla puskuroitua liuosta, joka sisältää DNA-fragmentit, DNA-ligaasin ja sopivia ko-faktoreita. Käytetty lämpötila on välillä 25 °C - 4 °C.

20 Kun DNA-segmentit sitoutuvat toisiinsa vetysidoksilla, kykenee DNA-ligaasi muodostamaan kovalenttisen sidoksen kahden segmentin välille. Pituussuuntaiseen yhtymiseen käytettävä aika vaihtelee riippuen käytetystä lämpötilasta, suolaliuoksen luonteesta sekä tarttuvien päiden eli ' 25 kohesiivisten päiden luonteesta. Ligaatioon tarvittava aika voi yleensä olla 5-18 tuntia. Katso Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, yllä.

Isäntäsolut Tämän jälkeen ilmentämisvehikkelikonstruktioita 30 voidaan käyttää transformoimaan sopiva isäntäsolu. Sopi viin isäntäsoluihin kuuluvat yksisoluisista sekä mo-nisoluisista organismeista peräisin olevat solut.

Kimeerisiä immunoglobuliinigeenejä voidaan ilmentää lymfaattiseen järjestelmään kuulumattomissa soluissa kuten 35 bakteereissa ja hiivoissa.

44 103477

Useita eri yksisoluisia mikro-organismeja, kuten bakteereja, voidaan transformoida. Toisin sanoen sellaisia organismeja, joilla on kyky kasvaa viljelmissä tai fermen-taation avulla. Koska bakteerit ovat työskentelyyn yleensä 5 kätevimmin soveltuvia organismeja, niihin viitataan myöhempänä muita yksisoluisia organismeja edustavana esimerkkinä. Transformaatioherkkiin bakteereihin kuuluvat Entero-bacteriaceae-lahkon jäsenet, kuten Escherichia coli -kannat ja Salmonella .· Bacillaceae-lahkon jäsenet, kuten 10 Bacillus subtilis: Pneumococcus; Streptococcus ja Haemophilus influenzae.

Kun immunoglobuliinin raskaita ja kevyitä ketjuja ilmennetään bakteereissa, ne joutuvat inkluusiokappalei-siin. Ketjut on sitten eristettävä, puhdistettava ja 15 koottava tämän jälkeen toimintakykyisiksi immunoglobulii-nimolekyyleiksi.

Prokaryoottien lisäksi voidaan myös käyttää euka-ryoottisia mikrobeja, kuten hiivaviljelmiä. Eukaryootti-sista mikro-organismeista on yleisimmin käytetty Saccharo-20 mvces cerevisiae. eli tavallinen leivontahiiva, vaikka muitakin kantoja on yleisesti saatavilla. Trpl-vaurion esiintyminen isäntäsolun genomin piirteenä tarjoaa käyttöön tehokkaan ympäristön transformaation havaitsemiseksi ilman tryptofaania tapahtuvan kasvun perusteella.

25 Mikro-organismien lisäksi isäntinä voidaan käyttää monisoluisista organismeista peräisin olevia soluviljelmiä. Periaatteessa mikä tahansa tällainen soluviljelmä on käyttökelpoinen riippumatta siitä, onko se selkärankaisten vai selkärangattomien viljelmistä, edellyttäen, että solu-30 linja on sellainen, että se ainakin alunperin on tuottanut vasta-aineita. Selkärankaissolujen lisäämisestä viljelylle on tullut viime vuosina rutiinimenetelmä [Tissue Culture, Kruse ja Patterson, (toim.) Academic Press 1973]. Esimerkkejä näistä käyttökelpoisista isäntäsolulinjöistä ovat 35 Sp2/0, VERO- ja HeLa-solut, kiinanhamsterin munasarja 45 103477 (CHO) -solulinjat ja W138-, ΒΗΚ-, COS-7- ja MDCK-solulin-jat.

Edullinen vastaanottajasolulinja on plasmasytooma-solulinja, kuten B-lymfosyyttisolu- tai hybridoomasolulin-5 ja. Plasmasytoomasolut voivat syntetisoida, koota ja erittää transformoitujen immunoglobuliinigeenien koodaamia immunoglobuliineja. Niissä on lisäksi immunoglobuliinin glykosylaatiomekanismi. Sp2/0 on edullinen vastaanottaja-solu, koska se on immunoglobuliinia tuottamaton plasmasy-10 toomasolu. Tämä solu tuottaa vain transformoitujen immunoglobuliinigeenien koodaamaa immunoglobuliinia. Plasmasy-toomasoluja voidaan kasvattaa viljelmässä tai hiirten vatsaontelossa, jolloin eritetty immunoglobuliini voidaan saada askites-nesteestä.

15 Isäntäsolujen transformaatio

Isäntäsolujen transformaatio suoritetaan seuraavasti. Ilmentämiskantaja linearisoidaan ja DNA viedään isän-täsoluihin vasta-aineen tuottamista varten. Kuvaaviin esimerkkeihin DNA:n viemisestä isäntäsoluihin kuuluvat 20 elektroporaatio, protoplastifuusio, kalsiumfosfaattisaos-tus tai muut tavanomaiset menetelmät, joissa käytetään dekstraanisulfaattia ja PEG:tä.

Jos isäntäsoluina käytetään soluja, joissa ei ole huomattavia soluseinän muodostamia esteitä, transformaatio 25 voidaan suorittaa julkaisussa Graham ja Van der Eb, (1978) Virology 52, 546 kuvatun kalsiumfosfaattisaostusmenetelmän mukaan.

Jos käytetään prokaryoottisia soluja tai vahvoja soluseinärakenteita sisältäviä soluja, edullinen transfor-30 maatiomenetelmä on julkaisussa Cohen, F.N. et ai.. (1972)

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 2110 esitetyn menetelmän mukainen kalsiumkäsittely kalsiumkloridilla.

Isäntäsolut voidaan transformoida joko rinnakkais-transformaatiolla tai kohdetransformaatiolla.

46 103477

Rinnakkaistransformaation suorittamiseksi voidaan käyttää kevyttä ketjua ja raskasta ketjua koodaavia geenejä joko samaa tai eri lajia olevien erillisten soluviljelmien transformaatioon; erillisiä kevyen ja raskaan ketjun 5 plasmideja voidaan käyttää yhden soluviljelmän rinnakkais- transformaatioon tai viimeisenä vaihtoehtona voidaan yhden soluviljelmän transformaatioon käyttää yhtä ilmentämis-plasmidia, joka sisältää molemmat geenit ja joka kykenee ilmentämään sekä kevyttä että raskasta ketjua vastaavia 10 geenejä.

Kohdetransformaatiomenetelmässä isäntäsolut transformoidaan kevyttä ketjua koodaavilla geeneillä ja valikoidaan kevyen ketjun markkerin sisältävät solut. Kevyt ketju havaitaan soluvärjäyksellä tai mahdollisesti havait-15 semalla kevyt ketju supernatantista, jos tämä ketju on erittynyt. Kevyen ketjun esiintymisen suhteen valikoidut solut transformoidaan raskaan ketjun konstruktiolla ja saadut solut valikoidaan näihin lisäksi sisältyvän raskaan ketjun markkerin suhteen.

20 Tiedetään, että jotkin kuolemattomat imusolulinjat, kuten plasmasytoomasolulinjat, erittävät normaalitilassaan erillisiä kevyitä tai raskaita Ig-ketjuja. Tästä seuraa se, että jos tällainen solulinja transformoidaan tämän keksinnön mukaista kimeeristä raskasta tai kevyttä ketjua 25 sisältävällä vektorilla, ei ole tarpeen transformoida tätä solulinjaa tai toista solulinjaa toisella Ig-ketjulla, edellyttäen, että normaalisti erittyvä ketju on komplementaarinen solulinjan alkuperäiseen transformaatioon käytetyn vektorin koodaaman Ig-ketjun vaihtelevan osan suhteen. 30 Transformoitujen isäntäsolujen valikointi ja ilmen täminen

Isäntäsolujen transformaation jälkeen solut voidaan kasvattaa 48 tunnin ajan, jotta markkerigeenien ilmentyminen voisi tapahtua. Solut viedään sitten valikoivaan kas-35 vatusliuokseen, jossa transformoitumattomat solut kuolevat 47 103477 vain DNA-konstruktioilla transformoitujen solujen jäädessä henkiin.

Raskaita ja kevyitä ketjuja tai näiden osia voidaan tuottaa erillään toisistaan ja näistä voidaan saada vasta-5 aineita ja näiden fragmentteja. Tällaisiin preparointeihin vaaditaan erillisten ketjujen kokoamismenetelmien käyttöä.

Se, että tämän keksinnön mukaisella menetelmällä kyetään tuottamaan kevyitä ja raskaita ketjuja erillään toisistaan tarjoaa mahdollisuuden saada ainoalaatuisia 10 immunoglobuliinien, Fab-alueiden ja univalenttien vasta- aineiden yhdistelmiä. On mahdollista yhdistää uudelleen in viro vain ketjujen välisistä disulfidisidoksistaan pilkkomalla erotetut raskaat ja kevyet ketjut ja saada vasta-aineaktiivisuus palautumaan jopa muodostamatta uudelleen 15 ketjujen välisiä disulfidisidoksia [ks. Edelman, G.M. et ai., (1963) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 50, 753].

Transformoidut solut kasvatetaan olosuhteissa, jotka ovat sopivia kevyiden ja/tai raskaiden ketjujen tuottamiseen ja näistä määritetään raskaan ja/tai kevyen ketjun 20 proteiinisynteesi. Esimerkkeihin käytettävistä määritys menetelmistä kuuluvat entsyymivälitteinen immunosorbentti-määritys (ELISA), radioimmunomääritys (RIA), fluoresenssi-aktivoitu solulajitteluanalyysi (FACS), immunohistokemia tai näiden kaltaiset määritykset.

25 Monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumisaffini- teetti TAG72:ta vastaan määritetään sinänsä tunnetuilla keinoilla [ks. Heyman B., (1984) J. Immunol. Methods 68, 193 - 204 ja yksityiskohtainen esimerkeissä esitetty kuvaus] .

30 Valitut positiiviset viljelmät jatkokloonataan puh taiden transformoitujen pesäkkeiden eristämiseksi. Sopiva menetelmä jatkokloonien saamiseksi on äärilaimennusmene-telmä, joka on opetettu McKearan teoksessa Monoclonal Antibodies, Plenum Press, N.Y. (1980).

* 48 103477

Hybridoomat, jotka tuottavat näitä kimeerisiä vasta-aineita, voidaan kasvattaa tunnetuilla menetelmillä. Transformoidut solut voivat erittää suuria määriä kevyitä ja/tai raskaita ketjuja viljeltäessä niitä in viro, kuten 5 ontelokuitusysteemeissä, pyörijäviljelmissä ja staattisissa viljelmissä, tai in vivo, kuten askitesnesteeseen tuotettaessa .

Kimeerisiä vasta-aineita voidaan tuottaa suurissa määrissä viemällä hybridooma ruiskeena pristaanilla esikä-10 siteltyihin hiiriin ja keräämällä sopivan ajan kuluttua (noin 1-2 viikkoa) askitesneste hiiristä talteen, josta on tuloksena korkean tiitterin saavuttavaa homogeenista vasta-ainetta, ja eristämällä tästä monoklonaaliset vasta-aineet sinänsä tunnetuilla menetelmillä [ks. Stramignoni, 15 P. et ai. . (1983) Inti. J. Cancer 31, 543 - 552]. Hybri doomat kasvavat in vivo, kuten syöpäkasvaimet eläimissä, ja näiden seerumista tai askitesnesteestä voidaan saada monoklonaalisia vasta-aineita, joiden pitoisuus voi olla jopa 50 mg/ml. Tavallisesti noin 106 - 107 kudostyypiltään 20 yhteen sopivaa hybridoomasolua sisältävä ruiske hiiriin tai rottiin johtaa syöpäkasvaimen muodostumiseen muutaman viikon kuluttua. Vasta-aineet voidaan sitten ottaa talteen ja käsitellä tunnetuilla menetelmillä. [Ks. yleisesti teos Immunological Methods osat I ja II, Lefkovits, I. ja Per-25 nis, B. (toim.) (1979 & 1981) Academic Press, New York, N.Y. ja Handbook of Experimental Immunology, Weir, D. (toim.) (1978) Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO].

Vasta-aineet voidaan sitten varastoida useissa eri 30 puskuriliuoksissa, kuten fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS), josta saadaan yleensä pysyvä vasta-aineliuos myöhempää käyttöä varten.

Tämän keksinnön mukaisti valmistetut vasta-aineet voidaan pilkkoa tunnettuja proteaasientsyymejä käyttäen, 35 esimerkiksi papaiinilla tai pepsiinillä, jotta saadaan 49 103477

erittäin immunoreaktiivisia F(ab')2-, F(ab')- ja Fab-frag-mentteja. Lisäksi proteolyysin tuloksena muodostuneet Ig-.n aktiiviset fragmentit (mp. noin 50 000) voidaan halkaista täysin pelkistettyihin raskaasta ketjusta ja kevyestä ket-5 justa muodostuviin komponentteihinsa ja rekonstruoida melko tehokkaasti aktiivisen vasta-aineen muodostamiseksi [Haber, E. (1964) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 52, 1099 ja Whitney, P.L. et ai. . (1965) Proc. Natl. Acad. Sei. USA

53, 524]. Tuloksena olevien F(ab')2-, F(ab')- ja Fab-frag-10 menttien reaktiivisuus määritetään samoilla menetelmillä, joita käytettiin täydellisten monoklonaalisen vasta-aineen yhteydessä.

Vasta-aineiden käyttötavat 15 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut vasta-aineet sekä näiden immunoreaktiiviset fragmentit tai rekombinan-tit tarjoavat käyttöön ainoalaatuisia etuja, sillä näillä vasta-aineilla on kyky sitoutua spesifisesti pahanlaatuisiin soluihin ja paikallistaa syöpäkasvaimia, niillä on 20 myös pysyvät vaihtelevat alueet, jotka eivät havaittavasti sitoudu normaaleihin soluihin, kuten fibroblasteihin, en-doteelisoluihin tai suurimpien elinten epiteelisoluihin.

Tarkemmin sanottuna nämä vasta-aineet sekä näiden immunoreaktiiviset fragmentit tai rekombinantit ovat käyt-25 tökelpoisia syövän in vivo -hoidossa käyttäen tämän kek sinnön mukaisesti valmistettuja vasta-aineita yksin tai liitettynä terapeuttiseen aineeseen, kuten radionuklidiin, toksiiniin, efektorisoluihin, muihin vasta-aineisiin tai komplementtimekanismin välityksellä, kuten jäljempänä on 30 kuvattu.

Lisäksi nyt on mahdollista valmistaa farmaseuttinen koostumus, joka käsittää tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja vasta-aineita farmaseuttisesti hyväksyttävässä, ei-toksisessa, steriilissä kantaja-aineessa, kuten fysio- 50 1 0 3 4 7 7 logisessa suolaliuoksessa, ei-toksisissa puskureissa ja näiden tapaisissa aineissa.

Ruiskekoostumukset voivat olla joko suspension tai liuoksen muodossa. Liuosmuodossa kompleksi (tai silloin, 5 kun tätä halutaan, erilliset komponentit) liuotetaan farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen. Nämä kantaja-aineet käsittävät sopivan liuotteen, säilöntäaineita, kuten bentsyylialkoholia, mikäli tällaisia tarvitaan, ja puskureja. Käyttökelpoisiin liuotteisiin kuuluvat esimer-10 kiksi vesi, vesipitoiset alkoholit, glykolit ja fosfonaat-ti- tai karbonaattiesterit. Nämä vesipitoiset liuokset sisältävät orgaanista liuotinta korkeintaan 50 % tilavuudestaan .

Injektoitaviin suspensioihin tarvitaan kantaja-ai-15 neeksi nestemäinen suspendointiliuos, jota käytetään lisäaineiden kanssa tai ilman näitä. Suspendointiliuos voi olla esimerkiksi vesipitoinen polyvinyylipyrrolidoni, in-erttejä öljyjä, kuten kasviöljyt tai pitkälle puhdistetut mineraaliöljyt, tai vesipitoinen karboksimetyylisellu-20 loosa. Sopivia fysiologisesti hyväksyttäviä lisäaineita, jos näitä tarvitaan kompleksin pitämiseen suspendoituna, voivat olla sakeutusaineet, kuten karboksimetyyliselluloo-sa, polyvinyylipyrrolidoni, gelatiini tai alginaatit. Monet pinta-aktiiviset aineet ovat myös käyttökelpoisia sus-25 pendointiaineita, esimerkiksi lesitiini, alkyylifenoli, polyetyleenioksidin adduktioyhdisteet, naf taleenisulf onaa-tit, alkyylibentseenisulfonaatit ja polyoksietyleenisorbi-taaniesterit . Monet aineet, jotka vaikuttavat nestemäisen suspendointiliuoksen hydrofobisuuteen, tiheyteen ja pinta-30 jännitykseen voivat olla apuna injektoitavien suspensioiden valmistuksessa yksittäistapauksissa. Esimerkiksi sili-konivaahdonestoaineet, sorbitoli ja sokerit ovat kaikki käyttökelpoisia suspendointiaineita.

Koska syöpäsolut ovat heterogeenisia, ja tästä joh-35 tuen yksi monospesifinen kimeerinen vasta-aine ei saata 51 103477 kyetä tunnistamaan kaikkia soluja, jotka ilmentävät syöpäkasvaimen eri epitooppeja.

On siten haluttua, että annostellaan useita erilaisia tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja kimeerisiä 5 vasta-aineita. Näiden erilaisten vasta-aineiden peräkkäi-sen käytön pitäisi merkittävästi vähentää potilaiden anti-idiotyyppisiä vasteita verrattuna yhden vasta-aineen toistettuun käyttöön. Potilaalle voitaisiin antaa peräkkäin esimerkiksi vasta-aineita CH92, CH88 ja CH44. Koska näillä 10 vasta-aineilla on erilaiset kevyet ketjut ja itse asiassa myös erilaiset CDR3-alueet, anti-idiotyyppisten vasteiden pitäisi vähentyä minimiin.

Syövän in vivo -hoito Tässä menetelmässä vasta-aineen ja terapeuttisen 15 aineen konjugaatti voidaan tuoda karsinoomakohtaan, jolloin karsinoomakudos altistuu suoraan terapeuttiselle aineelle .

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja vasta-aineita sekä niiden immunoreaktiivisia fragmentteja tai re-20 kombinantteja voidaan antaa farmaseuttisesti tehoava määrä ihmisen syöpäkasvainten ja niiden etäpesäkkeiden hoitamiseksi in vivo. "Farmaseuttisesti tehoava määrä" vasta-ainetta, sen immunoreaktiivista fragmenttia tai rekom-binanttia, joka on joko konjugoitu terapeuttiseen ainee-25 seen tai konjugoimaton, tarkoittaa sitä, että mainittujen vasta-aineiden määrä farmaseuttisessa koostumuksessa pitäisi olla riittävä saamaan aikaan tehokkaan sitoutumiseen niihin antigeeneihin, joita vastaan mainituilla vasta-aineilla on spesifinen affiniteetti. Farmaseuttinen koostu-30 mus voidaan antaa yhtenä tai useampana annoksena.

Menetelmät vasta-aineen ja sen immunoreaktiivisten fragmenttien ja rekombinanttien tai konjugaattien ja terapeuttisen aineen valmistamiseksi ja antamiseksi ovat alan ammattimiesten hyvin tuntemia tai ne ovat helposti määri-35 teltävissä. Lisäksi alan ammattimiesten tiedossa on, tai 52 103477 on helposti määriteltävissä, että sopivat annokset riippuvat potilaan iästä ja painosta sekä käytettävästä terapeuttisesta aineesta. Kyseessä olevia edustavia valmistusohjeita on kuvattu myöhemmin esitetyissä viitteissä.

5 Esimerkkeihin hoidossa käytettävistä vasta-aineen ja terapeuttisen aineen konjugaateista luetaan seuraavat: (1) vasta-aineet, jotka on kytketty radionuklideihin, kuten 13XI, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 99mTc, 153Sm, 123I ja 1UI kuten esimerkiksi julkai-10 suissa Goldenberg, D. M. et ai. . (1981) Cancer Res. 41 4354 - 4360, Carrasquillo, J. A. et ai. . (1984) Cancer

Treat. Rep. 68 317 - 328, Zalcberg, J. R. et ai. . (1984) J. Natl. Cancer Inst. 72 697 - 704, Jones, D. H. et ai.. (1985) J. Cancer 35 715 - 720, Lange, P. H. et ai.. (1985) 15 Surgery 98 143 - 150, Kaltovich, F. A. et ai. . (1986) J.

Nucl. Med. 27 897, Order, S. E. et ai.. (1982) Int. J. Ra- diother. Oncol. Biol. Phys. 8 259 - 261, Courtenay-Luck, N. et ai. . (1984) Lancet 1 1441 - 1443, Ettinger, D. S. et.

ai., (1982) Cancer Treat. Rep. 66 289 - 297 on kuvattu, 20 (2) lääkkeisiin tai biologisen vastetta muuntaviin ainei siin, kuten metotreksaattiin, adriamysiiniin tai lymfokii-neihin, kuten interferoniin, kytketyt vasta-aineet, kuten esimerkiksi julkaisuissa Chabner, B. et ai. . (1985) Can cer, Principles and Practice of Oncology, Philadelphia, 25 PA, J. B. Lippincott Co., osa. 1 s. 290 - 328, Oldham, R.K. et al. . (1985) Cancer, Principles and Practice of

Oncology, Philadelphia, PA, J. B. Lippincott Co. osa 2 s. 2223 - 2245, Deguchi, T. et al. . (1986) Cancer Res. 46 3751 - 3755, Deguchi, T. et al. . (1985) Fed. Proc. 44 30 1684, Embleton, M. J. et al., (1984) Br. J. Cancer 49 559 - 565, Pimm, M. V. et al.. (1982) Cancer Immunol. Immunot- her. 12 125 - 134 on kuvattu, (3) toksiineihin kytketyt vasta-aineet, kuten on kuvattu esimerkiksi teoksissa Uhr, J. W. et al. , (1983) Monoclonal Antibodies and Cancer, 35 Academic Press, Inc. s 85 - 98, Vitetta, E.S. et al. , 53 103477 (1984) Biotechnology and Bio. Frontiers, P. H. Abelson, toim. , s. 73 - 85 ja Vitetta, E. S. et al. . (1983) Sci.

219 644 - 650 on kuvattu, (4) heterofunktionaaliset vasta-aineet, esimerkiksi sellaiset, joissa vasta-aineeseen on 5 kytketty tai yhdistetty toinen vasta-aine siten, että kompleksi sitoutuu sekä karsinooma- että efektorisoluihin, esim. tappajasoluihin, kuten T-solut, kuten esimerkiksi julkaisuissa Perez, P. et ai.. (1986) J. Exper. Med. 163 166 - 178, Lau, M. A. et ai.. (1985) Proc. Natl. Acad. 10 Sei. (USA) 82, 8648 - 8652 on kuvattu ja (5) luontaiset, eli konjugoimattomat tai kompleksoimattomat vasta-aineet, kuten esimerkiksi julkaisuissa Herlyn, D. et ai. . (1982)

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79 4761 - 4765, Schultz, G. et. ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80 5407 - 5411, 15 Capone, P. M. et ai. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80 7328 - 7332, Sears, H. F. et ai.. (1985) Cancer Res. 45 5910 - 5913, Nepom, G. T. et ai.. (1984) Proc. Natl. Acad.

Sci. (USA) 81 2864 - 2867, Koprowski, H. et ai. . (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81 216 - 219 ja Houghton, A. 20 N. et ai.. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82 1242 - 1246 on kuvattu.

Menetelmät vasta-aineen tai vasta-ainefragmentin yhdistämiseksi haluttuun terapeuttiseen aineeseen ovat tavanomaisia ja alalla hyvin tunnettuja. Näitä ovat esi-25 merkiksi aikaisemin esitetyissä viitteissä kuvatut menetelmät .

Seuraavat suojapiiriä rajoittamattomat esimerkit on tarkoitettu ainoastaan kuvaamaan tämän keksinnön mukaisten kimeerisiä DNA-jaksoja koodaavien vasta-aineiden konstruk-30 tiota ja ilmentämistä. Ellei toisin ole mainittu, kaikki lämpötilat on ilmoitettu Celcius-asteina. Kaikki prosenttiluvut ovat painoprosentteja, ellei toisin ole mainittu.

54 103477

Esimerkit

Hiiren muuttumattomien alueiden korvaaminen CC-vasta-aineet olivat peräisin hiiristä ja ne ovat merkittävästi kykenemättömämpiä efektoritoimintojen suori-5 tukseen kuin ihmisen muuttumattomat alueet.

Tämän seurauksena seuraavissa esimerkeissä tietyt vasta-aineet "humanisoidaan" poistamalla geneettisesti raskaiden ja kevyiden ketjujen muuttumattomat alueet sekä korvaamalla ne niiden ihmisissä olevilla vastineilla.

10 Hiiren kevyen ketjun muuttumattoman alueen geenit korvattiin ihmisen kappa (k) -geenillä ja hiiren raskaan ketjun geenit korvattiin kullakin ihmisen neljästä gamma-isotyypistä (γ1, γ2, γ3 ja γ4) . Kullakin näistä neljästä gamma-isotyypistä on ainoalaatuisia biologisia ominaisuuk-15 siä. Yleinen katsaus on saatavilla julkaisusta "The Human IgC subclasses", Hamilton, R.G. (1989) dokum. nro CB0051-289, Calbiochem Corporation.

Raskaan ja kevyen ketjun vaihtelevan alueen valmistus 20 CC49 kevyen ketjun eristäminen CC49-hybridoomasolut erittävät vasta-ainetta, jossa on IgG^raskasketjuisotyyppi ja kevyt kappaketju.

Kokonais-DNA eristettiin CC49-hybridoomasoluista, Balb/C-hiiren munuaissoluista ja NSI-plasmasytoomasoluista 25 julkaisussa Cell 24, 353-356 (1981) esitetyn menetelmän mukaan.

Yleensä noin 10 - 20 μg uutettua DNA:ta kustakin solulinjasta pilkottiin täydellisesti käyttämällä 80 yksikköä Bam Hl, Eco Rl, Hind III, Spe I, Xba I, Sac I, Bql 30 II ja Pst I 50 - 100 mikrolitrassa sopivaa reaktiopuskuria ' sisältävää reaktioseosta 37 °C:n lämpötilassa yli yön.

Seuraavaksi suoritettiin kustakin solulinjasta uutetulle kokonais-DNA:lie Southern-hybridisointi, jonka on kehittänyt E.M. Southern, (1975) J.Mol.Biol. 98, 503 - 35 517. DNA-fragmentit fraktioitiin koon perusteella elektro- 55 103477 foreesissa 0,8-%:isessa agaroosigeelissä. Kaksinauhaiset DNA-fragmentit muunnettiin yksinauhaisiksi emäsliuoksessa, jonka jälkeen nitroselluloosasuodatin asetettiin kosketuksiin geelin kanssa muunnettujen DNA-jaksojen siirtämiseksi 5 suodattimelle korkean suolapitoisuuden omaavan liuoksen läsnä ollessa.

Hybridisointi suoritettiin käyttämällä koettimena satunnaisalukkeiden avulla 32P-leimattua L-ketjua.

Tarkemmin sanottuna koetin oli 1,71 kiloemäsparin 10 (ke) suuruinen, pGDl -plasmidista eristetty Hind III - Pst I -fragmentti, joka sisältää koodaavat eksonit hiiren JL-alueista (J1-J5). Koetinfragmentin nukleotidijakso on esitetty kuviossa 7. Tämä plasmidi on kuvattu julkaisussa "Site Directed Cleavage of Immunoglobulin Gene Segments by 15 Lymphoid Cell Extracts", Agostaro et al. . (1985) Can. J.

Biochem. Cell Biol. 63, 969 - 976. Plasmidi saatiin tutkijoilta Nobumichi Hozumi ja John Roder, Mt. Sinai Research Institute, Toronto, Ontario, Kanada.

Koettimen leimaamiseksi radioaktiivisella merkkiai-2 0 neella hankittiin alfa32P-dCTP Amersham-yhtiöstä, Arlington Heights, IL, USA, ja satunnaisalukepakkaus hankittiin Pharmacia-yhtiöstä, Piscataway, NJ, USA.

Signaalit Southern-siirroista saatiin esille auto-radiografiällä käyttäen Kodak X-OMAT™ AR -filmiä. Yhtäkään 25 selvästi uudelleenjärjestymisen seurauksena syntynyttä vyöhykettä ei havaittu. Suhteessa standardeihin Hind III :11a pilkotun CC49-DNA:n autoradiogrammissa ei siten havaittu yhtäkään uniikkia vyöhykettä. Southetn-määritys-tuloksista ei kuitenkaan voitu sulkea pois sitä, että uu-30 delleenjärjestäytymisen seurauksena syntyneen L-ketjun vyöhykkeen peitti vyöhyke, joka kulkeutui CC49:n Hind 111:11a pilkotussa DNA:ssa samalla tavalla sellaisen vyöhykkeen kanssa, joka oli tuloksena hiiren munuaissolun DNA:n (joka edustaa ituradan DNA:ta) pilkkoutumisesta Hind 35 III :11a. Asian havaittiinkin olevan näin.

56 103477

Hiiren VL-geenejä sisältävän plasmidin valmistus LAMBDA-ZAP™, lambda-faagiin perustuva itsensä irrottamaan kykenevä insertiokloonausvektori, hankittiin Stratagene Co. -yhtiöstä, La Jolla, CA, USA. LAMBDA-ZAP™ 5 on kuvattu Stratagenen vuoden 1987 luettelossa sivuilla 20 - 21. LAMBDA-ZAP™:n kohesiiviset (cos) päät liitettiin ligaasilla yön yli valmistajan käyttöohjeita noudattaen.

Kaksikymmentä mikrogrammaa ligaasilla liitettyä LAMBDA-ZAP™:a pilkottiin käyttäen 5 mikrolitraa (15 yksik-10 köä) Spe I:tä, joka oli hankittu New England Biolabs, Inc.

-yhtiöstä. Pilkkomisliuoksen lopullinen tilavuus oli 100 mikrolitraa. 55 minuutin pilkkomisen jälkeen lisättiin vielä 6 yksikköä Spe I:tä. 70 minuutin kuluttua reaktio pysäytettiin Stratagenen käyttöohjeiden mukaisesti uutta-15 maila fenolilla ja saostamalla etanolilla.

Spe I -restriktioentsyymillä suoritetun pilkkomisen tuloksena kumpaankin päätteeseen muodostui "tarttuvat päät". Nämä tarttuvat päät muunnettiin T4-DNA-polymeraa-silla, jotta saataisiin puoliksi täytetyt Spe I -tarttuvat 20 päät, esim. 51ACT/3'TCATG. Puolitäyttöreaktion suorittamiseksi etanolisaostuksessa aikaansaatu DNA-nappi liuotettiin 8 mikrolitraan vettä. Tähän lisättiin 2 mikrolitraa 10-millimolaarista dTTP:tä, 2 mikrolitraaa 10-millimolaa-rista dCTPrtä, 2 mikrolitraa Stratagenen 10X -ligaasipus-25 kuriliuosta, 4 mikrolitraa deionisoitua, tislattua vettä ja 2 mikrolitraa Klenow-fragmenttia, joka oli hankittu Bethesda Research Laboratories (BRL) -yhtiöstä.

Reaktio suoritettiin huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Reaktio pysäytettiin inaktivoimalla DNA-polyme-30 raasi 65 °C:n lämpötilassa 10 minuutin ajan.

Satakuusikymmentä mikrogrammaa kokonais-CC49-hyb-ridooma-DNA:ta (joka sisältää hiiren kevyen ketjun promoottorin sekä L- ja VJ-eksonit) pilkottiin loppuun saakka Hind III -entsyymillä. 1-20 ke:n pituiset fragmentit 35 leikattiin pois 0,8-%:isistä agaroosigeeleistä. DNA puh- 57 103477 distettiin käyttäen GENECLEAN™:ia, joka on kaupallisesti saatavilla BIO 101 -yhtiöstä (La Jolla, CA, USA) .

Hind III :11a pilkotut kokonais-CC49-hybridooma-DNA: t täytettiin puoliksi samalla tavoin kuin LAMBDA-5 ZAP™: in Spe I -fragmentit, sillä poikkeuksella, että käytettiin dATP:tä ja dGTP:tä. Puoliksi täytetyt Hind III :11a pilkotut fragmentit muodostivat 51AGCTT/3'GAA-tarttuvat päät, jotka ovat yhteen sopivia aikaisemmin mainittujen Spe I -puolitäytettyjen LAMBDA-ZAP™-fragmenttien kanssa. 10 Fenolilla suoritetun uuton ja etanolilla suoritetun saostuksen jälkeen, Maniatisin teoksen oppien mukaan ko-konais-CC49-hybridooman Hind III :11a muunnetut ja LAMBDA-ZAP™: n Spe I:llä muunnetut DNA-fragmentit liitettiin T4-DNA-ligaasin avulla. Ligaasireaktion kokoonpanossa käytet-15 tiin 6,1 mikrolitraa ligaasiliitosseosta, joka sisälsi seuraavat aineet: noin 0,2 mikrogrammaa CC49-hybridooman Hind III :11a muunnettua kokonais-DNA:ta 3 mikrolitrassa liuosta, noin 1 mikrogramma LAMBDA-ZAP™:n Spe I:llä muunnettua DNA:ta 1 mikrolitrassa liuosta, 0,6 mikrolitraa 20 Stratagenen 10X -ligaasipuskuriliuosta, 0,5 mikrolitraa 10-millimolaarista ATP:ta ja 1 mikrolitra Stratagene-li-gaasia. Tätä inkuboitiin yön yli vesihauteessa ja lämpötila laskettiin vähitellen 18 °C:n lämpötilasta noin 4 °C:n lämpötilaan. Tämä ligaasilla liittäminen poisti 25 sekä Hind III- että Spe I -kohdat.

Ligatoidun seoksen genomikirjasto tehtiin Stratagenen käyttöohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 2 mikrolitraa yllä valmistettua ligaatioseosta käytettiin Stratagenen Gigapack Gold pakkaussysteemiin valmistajan ohjeita nou-30 dattaen. Viisitoista 150 mm:n maljaa, joiden plakkitiheys tiheys oli 50 000 plakkia maljaa kohti, seulottiin positiivisten kloonien suhteen valmistajan ohjeiden mukaan hybridisoimalla Schleicher-Schuell-yhtiöstä, Keene, NH, USA hankituille nitroselluloosasuodattimille. Hybridi -35 soinnissa käytettiin 32P-satunnaisleimattua, aikaisemmin 58 103477 kuvatusta pGDl:stä peräisin olevaa koetinta. Saatiin kaksi positiivista kloonia.

Molemmat kloonit puhdistettiin yksittäisten plakkien kautta ja LAMBDA-ZAP™: in CC49 L -ketjun vaihtelevan 5 alueen sisältävät yhdistelmäplasmidit (fagemidit) saatiin käyttämällä Stratagenen automaattista irrotusprotokollaa. Tuloksena olleen rekombinoituneen plasmidin vektoriosaa kutsutaan pBLUESCRIPT SK(-):ksi ja se koostuu 2 964 emäs-parista, kuten Stratagenen vuoden 1987 luettelossa kuva-10 taan. pBLUESCRIPT SK(-):n plasmidikartta on esitetty kuviossa 8 .

Kahdesta positiivisesta kloonista saatu DNA sek-venssoitiin osittain ja kummatkin olivat identtisiä. Yhtä klooneista, jolle annettiin tunnus pRLIOI, käytettiin myö-15 hempiin tutkimuksiin.

CC49:n kevyen ketjun restriktiokartoitus pRLIOI:n koko oli 7,61 ke ja DNA-insertin koko määritettiin restriktioentsyymikartoituksella 4,65 ke:n suuruiseksi. pRLIOI:n plasmidikartta on esitetty kuviossa 9. 20 pRL101:ssä olevan CC49:n L-ketjun genomisesta DNA:sta koostuvan insertin restriktioentsyymikartta on esitetty kuviossa 10.

CC83:n kevyen ketjun vaihtelevan alueen eristäminen

Seuraavaa poikkeusta lukuun ottamatta CC83:n kevyen 25 ketjun eristämiseen käytetyt menetelmät olivat olennaises- ti samat kuin CC49:n kevyen ketjun eristämiseen käytetyt menetelmät.

7 X 105 plakkia sisältävä genomikirjasto seulottiin käyttäen koettimena 32P-satunnaisleimattua pGDl:stä saatua 30 1,71:n suuruista Hind III - Pst I -fragmenttia aikaisemmin j kuvatulla tavalla. Saatiin yksi positiivinen klooni. Posi tiiviselle kloonille annettiin tunnus pRL200.

CC83:n kevyen ketjun restriktiokartoitus pRL200:n koko oli 7,44 ke ja DNA-insertin koko mää-35 ritettiin restriktioentsyymikartoituksella 4,48 ke:n suu- 59 103477 ruiseksi. pRL200:n plasmidikartta on esitetty kuviossa 11. pRL200:ssa olevan CC83:n L-ketjun genomisesta DNA:sta koostuvan insertin restriktioentsyymikartta on esitetty kuviossa 12.

5 CC49:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen eristämi nen CC49:n raskaan ketjun eristämiseen käytetyt menetelmät olivat olennaisesti samat kuin mitä käytettiin CC49:n kevyen ketjun eristämisessä, mukaan lukien saman 10 CC49:n Hind 111:11a muunnetun DNA:n seulonta.

Kirjaston seulontaan käytetty hybridisaatiokoetin muodostettiin pNP9:stä, joka sisältää CC49:n immunoglobu-liinin raskaan ketjun JH3:a ja J„4:ää vastaavat koodaavaat eksonit sisältävän 1,98 ke:n Eco R I - Bam H I -fragmen-15 tin. Koetinfragmentin nukleotidisekvenssi esitetään kuviossa 13. Plasmidi saatiin tutkijoilta Dr. Nobumich Hozu-mi ja Dr. John Roder, Mt. Sinai Research Institute, Toronto, Ontario, Kanada.

Seulottiin 9,5 X 10s plakkia sisältävä genomikirjas-20 to ja siitä saatiin yksi positiivinen klooni. Tämä positiiviselle kloonille annettiin tunnus pHH49.

CC49:n raskaan ketjun restriktiokartoitus pHH49:n koko oli 7,0 ke ja DNA-insertin koko määritettiin restriktioentsyymikartoituksella noin 4,0 ke:n 25 suuruiseksi. pHH49:n plasmidikartta on esitetty kuviossa 14 .

CC83:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen eristäminen

Seuraavin poikkeuksin CC83:n raskaan ketjun eristä-30 miseen käytetyt menetelmät olivat olennaisesti samat kuin ‘ ’ mitä käytettiin CC49:n kevyen ketjun eristämisessä.

Noin kolmetoista mikrogrammaa ligaasilla liitettyä LAMBDA-ZAP™-vektorin DNA:ta pilkottiin käyttäen 12 yksikköä New England Biolabs, Inc. -yhtiöstä hankittua Spe I:tä 35 sopivassa puskuriliuoksessa, jonka kokonaistilavuus oli βο 103477 100 mikrolitraa. LAMBDA-ZAP™ pilkottiin 37 °C:n lämpötilassa yhden tunnin ajan. Reaktioseos uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla Stratagenen käyttöohjeiden mukaan. Spe I:llä pilkottu LAMBDA-ZAP™ defosforyloitiin 5 Maniatisin teoksessa esitettyjen menetelmien mukaisesti, sillä poikkeuksella, että käytettiin 40-kertaista ylimäärää vasikan suolen alkalista fosfataasia (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA).

CC83:sta saatu DNA pilkottiin loppuun saakka käyt- 10 täen Spe I:tä. Noin 3-40 ke:n pituiset fragmentit eristettiin 0,8-%:isen agaroosigeelin viipaleesta sähkövirralla eluoimalla, kuten Maniatisin teoksessa on kuvattu, ja liitettiin ligaasilla defosforyloituun, Spe I:llä katkaistuun LAMBDA-ZAP™-vektoriin.

15 Seulottiin 5 X 105 plakkia sisältävä genomikirjasto käyttäen pNP9:stä muodostettua koetinta, jonka sekvenssi on esitetty kuviossa 13. Siitä saatiin yksi positiivinen klooni. Tälle positiiviselle kloonille annettiin tunnus pHS83.

20 CC83:n raskaan ketjun restriktiokartoitus pHS83:n koko oli 7,95 ke ja DNA-insertin koko määritettiin restriktioentsyymikartoituksella noin 5 ke: n suuruiseksi. pHS83:n plasmidikartta on esitetty kuviossa 15 .

25 CC46:n, CC49:n, CC83:n ja CC92:n lähetti-SNA:n sek- venssointi

Kokonais-RNA uutettiin noin 1 X 107:stä -70 °C:n lämpötilaan pakastetusta CC49-solusta olennaisesti samalla tavoin kuin Maniatisin teoksessa on raportoitu, seuraavin 30 poikkeuksin. Käytetty liuos koostui 4 M:sta guanidiumiso-tiosyanaatista ja 2,5 M:sta natriumsitraatista ja sen pH oli 7,0, sekä sentrifugointi suoritett-iin SW40Ti roottorilla 31000 kierr./min.

Yhteensä saatiin eristetyksi 2,7 mg CC49:n RNA:ta.

35 Sentrifugoinnin jälkeen poly-A+ lähetti-RNA puhdistettiin 61 103477 noin 1,68 mg:sta RNA:ta oligo(dT)selluloosakromatografial-la käyttäen Collaborative Research, Inc. -yhtiöstä, Bedford, MA, USA, hankittua tyypin 3 oligo(dT)selluloosaa. Käytetty menetelmä oli julkaisussa Aviv ja Leder, (1972) 5 Proc. Nat11. Acad. Sei. (USA) 69, 1408 esitetyn mukainen. 1,68 milligrammasta lähetti-RNA:ta saatiin yhteensä 50,24 μg poly-A+ lähetti-RNA:ta.

Yhteensä 3,28 mg CC83:n RNA:ta eristettiin noin 1 X 107 solusta. 1,91 mg:sta kokonais-RNA:ta eristettiin 10 54,6 μg poly-A+ lähetti-RNA:ta.

Yhteensä 0,814 mg CC92:n RNA:ta eristettiin noin 2,6 X 108 solusta. 0,814 mg:sta kokonais-RNA:ta eristettiin 41.88 μg poly-A+ lähetti-RNA:ta.

Yhteensä 1,7 mg CC46:n RNA:ta eristettiin noin 15 2,89 X 108 solusta. 1,7 mg:sta kokonais-RNA:ta eristettiin 68.88 μg poly-A+ lähetti-RNA:ta.

Synteettiset oligonukleotidialukkeet syntetisoitiin käyttäen Applied Biosystems -yhtiön [Applied Biosystems (ABI), Foster City, CA, USA) 380A -mallista DNA-synteti-20 soijaa ABI:n määrittelemää fosforamadiittiin perustuvaa kemiaa käyttäen. 7 M ureaa sisältävällä 20-%:isella poly-akryyliamidigeelillä suoritetun elektroforeesin jälkeen oligonukleotidit puhdistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Oligonukleotidin konsentraatiot määriteltiin spekt-. 25 rofotometrisesti optisesta tiheydestä 260 nm:ssä, jossa 1 optisen tiheyden yksikkö 260 nm:ssä vastaa 33 μg/ml yksi-nauhaista DNA:ta.

Seuraavat oligonukleotidialukkeet tehtiin lähetti-RNA -sekvenssointia varten: (1) CC49:n, CC83:n, CC92:n 30 kevyitä ketjuja varten valmistettua KL(-):a, 22-meeriä: 5'GGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3', joka on komplementaarinen hiiren immunoglobuliinin kappa-ketjujen muuttumattoman alueen 5'-pään koodaavalle jaksolle, käytetään määrittämään kevyen ketjun vaihtelevan jak-35 son 3'-päätä lähimpänä oleva lähetti-RNA-jakso.

103477 o 2

Lisäksi, CC49:n kevyttä ketjua varten valmistettua 49FR1(-):a, 17-meeriä: 5'GGAAGATGGATACATTGGTGC-3’ käytettiin määrittämään jäljellä oleva sekvenssi.

5 Lisäksi, CC83:n kevyttä ketjua varten valmistettua ketjua varten valmistettua J4(-):a, 24-meeriä: 5'-CCAACTTTGTCCCCGAGCCGAACG-3' ja myös 83L CDR2(-):a, 17-meeriä: 5'-CAGGGACTCCAGTGTGC-3' 10 käytettiin määrittämään jäljellä oleva sekvenssi.

Lisäksi, CC92:n kevyttä ketjua varten valmistettua J5(-):a: 5'-CGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3' käytettiin määrittämään jäljellä oleva sekvenssi.

15 CC46:n, CC49:n, CC83:n ja CC92:n 1 raskaita ketjuja varten valmistettiin CH1(-):, 24-meeri: 5'-ATGGATGTAGTTTGGGCAGCAGAT-3’, joka on komplementaarinen hiiren γΐ raskaan ketjun muuttumattoman alueen 5'-pään koodaavalle jaksolle. 24-meeriä 20 CH1 (-) käytetään määrittämään 3'-päätä lähinnä oleva raskaan ketjun vaihtelevien alueiden lähetti-RNA-sekvenssi.

Lisäksi CC49:n raskasta ketjua varten valmistettua JH4(-):ää, 20-meeriä: 5'-GGTGACTGAGGTTCCTTGAC-31 25 käytettiin määrittämään jäljellä oleva jakso.

Lisäksi CC83:n raskasta ketjua verten valmistettua JH2(-):a, 16-meeriä: 5'-CTGAGGAGACTGTGAG- 31 käytettiin määrittämään jäljellä oleva jakso.

'30 Lisäksi CC92:n raskasta ketjua varten ja B72,3:n raskasta ketjua varten valmistettua B72,3/CC92 HC -20 -meeriä: 5'-CCTTGAACTTCTCATTGTAC-3' käytettiin määrittämään jäljellä oleva jakso.

63 103477

Seuraavat menettelyt suoritettiin kuten julkaisussa Jan Gelliebter, (1987), BRL FOCUS 9, 1 on pääkohdittain esitetty.

Oligonukleotidialukkeet leimattiin päätteistään 5 seuraavalla tavalla: 100 ng oligonukleotidia yhdistettiin liuokseen, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl (pH 8) , 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitolia ja 1 mM spermidiiniä, 100 μΟΐ (γ-32Ρ) ATP:ta (Amersham, 5000 Ci/millimooli) ja 7 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia ja jonka tilavuus oli 13 μΐ. Reak-10 tion annettiin edetä 37 °C:n lämpötilassa 30 minuutin ajan, jonka jälkeen se lämmitettiin 65 °C:n lämpötilaan 5 minuutin ajaksi kinaasin inaktivoimiseksi ja tämän jälkeen lisättiin 7 μΐ vettä, jotta konsentraatioksi saataisiin 5 ng/μΐ. Leimatut alukkeet varastoitiin -20 °C:n lämpöti-15 laan kunnes niitä tarvittiin.

Erillisiä näytteitä, joista kukin sisälsi noin 13 mikrogrammaa CC49:n, CC83:n, CC92:n tai CC46:n poly-A+- lähetti-RNA:ta tässä järjestyksessä ilmoitettuna, resus-pendoitiin 10 μΐ-.ssa vastinnauhojen yhtymiseen tarkoitet-20 tua puskuriliuosta [10 mM Tris-HCl (pH 8,3) ja 250 mM KC1] .

5 ng:n näyte päätteistä leimattua oligonukleotidi-aluketta lisättiin kuhunkin lähetti-RNA -näytteeseen, lämmitettiin 80 °C:n lämpötilaan 3 minuutin ajaksi ja vas-. 25 tinnauhojen annettiin yhtyä toisiinsa 45 minuutin ajan 61 °C:n lämpötilassa käytettäessä KL(-)- ja 65 °C:n lämpötilassa käytettäessä CH 1(-) -oligonukleotideja. AMV-kään-teiskopioijaentsyymiä (Boehringer-Mannheim) käytettiin 6 yksikköä kutakin lähetti-RNA:n sekvenssointireaktiota koh-30 ti. Sekvenssoinnin loppuosa suoritettiin julkaisussa BRL FOCUS 9, 1 (1987) esitetyllä tavalla.

Alussa saadut sekvenssointitulokset osoittivat, että raskaat ja kevyet ketjut olivat järjestäytyneet uudelleen seuraavalla tavalla: CC49:n kappa-ketjussa oli 35 käytössä J5, CC49:n raskaassa γΐ -ketjussa oli käytössä 64 103477

Jh4, CC83:n kevyessä ketjussa oli käytössä J4, CC83:n gamma- l:ssä oli käytössä JH2. CC46:n kevyessä kappa-ketjussa oli käytössä J2, CC46:n raskaassa ketjussa oli käytössä JH3, CC92:n kevyessä ketjussa oli käytössä J5 ja CC92:n 5 gamma-l:ssä oli käytössä JH2 .

Kuviossa 16 on esitetty CC49:n VH:n nukleotidisek-venssi, jossa alleviivatut segmentit osoittavat jaksoja, jotka on saatu käyttäen oligonukleotidialukkeita lähetti-RNA: 11a..

10 Kuvio 17 esittää CC83:n VH:n nukleotidisekvenssin, jossa alleviivatut segmentit osoittavat jaksoja, jotka on saatu käyttäen oligonukleotidialukkeita lähetti-RNA:11a.

Kuviossa 2 esitetyt CC46:n VH:n ja CC92:n VH:n kokonaiset nukleotidijaksot saatiin käyttäen oligonukleotidi-15 alukkeita lähetti-RNA:11a.

Kuvio 4a esittää CC49:n VL:n nukleotidisekvenssin, jossa alleviivatut segmentit osoittavat jaksoja, jotka on saatu käyttäen oligonukleotidialukkeita lähetti-RNA:11a.

Kuvio 5a esittää CC83:n VL:n nukleotidisekvenssin, 20 jossa alleviivatut segmentit osoittavat jaksoja, jotka on saatu käyttäen oligonukleotidialukkeita lähetti-RNA:11a.

Kuviossa 6 esitetty CC92:n VL:n kokonainen nukleotidi jakso saatiin käyttäen oligonukleotidialukkeita lähetti-RNA: 11a.

. 25 Proteiinxsekvenssi

Puhdistetut hiiren CC49- ja CC83-immunoglobuliini-molekyylit lähetettiin Dr. George Tarrille, University of Michiganin proteiinisekvenssointipalveluun NH2-pään aminohappo jaksoanalyy siä varten. Dr. Tarr käytti Edman-pilkko-30 mismenetelmää, jota oli muunneltu teoksessa Tarr, G.E., "Manual Edman Sequencing System" Microcharacterization of Polypeptides: A Practical Manual [John E. Shively, toim., Humana Press, Inc., Clifton, N. J. , s. 155 - 194 (1986)] esitetyllä tavalla. Lyhyesti sanottuna Dr. Tarr pelkisti 35 ja alkyloi immunoglobuliinimolekyylit. Immuno-globuliini- „ 103477 65 molekyylien kevyet ja raskaat ketjut erotettiin käänteis-faasi-HPLC:llä.

Kuviossa 4b on esitetty CC49:n VL:n aminohappojakso, jossa on alleviivattuna aminohappojaksomäärityksen tulok-5 set kypsän CC49 VL:n ensimmäisten 24 aminohapon kohdalta. Kuviossa 5b on esitetty CC83:n VL:n aminohappojakso, jossa on alleviivattuna aminohappojaksomäärityksen tulokset kypsän CC83:n VL:n ensimmäisten 51 aminohapon kohdalta. ASN-20: tä ei pystytty määrittämään CC83:n kevyestä ketjusta, 10 tässä paikassa olevien N-kytkeytyneiden hiilihydraattiryh-mien vuoksi, joka on esitetty myöhempänä olevassa PNGaasi F -kokeessa. Jakso Asn-Ile-Thr vastaa konsensusjaksoa Asn-X-Thr/Ser hiilihydraattien liittämiseksi Asnrään.

Koska immunoglobuliinien CC49 ja CC83 raskaat ket-15 jut on suojattu N-päästä eivätkä siten ole käytettävissä aminohappojakson määritykseen, luontaista glykopeptidiä käsiteltiin syanogeenibromidilla (CNBr) metioniiniryhmien kohdalta tapahtuvan pilkkoutumisen aikaansaamiseksi. Pilkkoutumisessa syntyi fragmentteja, jotka puhdistettiin 20 käänteisfaasi-HPLC:llä. N-pään aminohapposekvenssointi suoritettiin CNBR-fragmenteilla.

Aminohappomäärityksen tulokset yhden CC49:n VH:n CNBr-peptidifragmentin kohdalta on esitetty alleviivattuina ryhminä kuviossa 18. Aminohappomäärityksen tulokset .. 25 yhden CC83:n VH:n CNBr-peptidif ragmentin kohdalta on esi tetty alleviivattuina ryhminä kuviossa 19. Kuten CC49:n suhteen oli laita, kaikki muut peptidijaksot vastaavat hiiren γΐ:η muuttumattomasta alueesta saatuja CNBr-frag-mentteja.

30 CC83:n L-ketjussa olevan N-kytketyn hiilihydraatin määritys Tämä koe suoritettiin, jotta voitaisiin varmistua siitä, että CC83:n kevyeen ketjuun on liittynyt N-kytkey-tynyt hiilihydraatti, oletettavasti paikassa ASN-20 (katso 35 kuvio 5b). Entsyymi glykopeptidaasi F (PNGaasi F), joka on 66 1 0 3 4 7 7 eristettävissä Flavobacterium meninaosepticum -bakteeri-viljelmän suodoksesta [Tarentino, A. L et ai., (1985) Bio chemistry 24, 4665 - 4671], pilkkoo ASN:ään N-kytkeytynei-tä korkeita mannoosi- ja/tai kaksiosaisesti haaroittuneita 5 kompleksisokereita vapaan hiilihydraattirakenteen ja ASP-ryhmän muodostamiseksi siitä ASN:stä, johon se oli liittyneenä. Ero saman peptidin glykosyloituneen ja glykosyloi-tumattoman muodon molekyylipainojen välillä voidaan määrittää SDS-PAGE:11a.

10 Suoritettiin kahdentoista mikrogramman reaktiot, joissa joko käytettiin tai ei käytetty PNGaasi F:ää (Boeh-ringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA) vaikuttamaan puhdistettuihin hiiren CC49:n, CC83:n vasta-aineisiin ja CC11:n F(ab')2;een (positiivinen kontrolli) liuoksessa, 15 jonka lopullinen reaktion vesitilavuus oli 40 mikrolitraa. Neljä mikrolitraa 10 x -puskuriliuosta (1 M kaliumfosfaattia, 0,1 M dinatrium-EDTA, pH 7,4) lisättiin kuhunkin reaktioseokseen. "PNGaasi F:ää käytetty" -merkinnällä varustettuihin putkiin lisättiin 7,5 mikrolitraa PNGaasi 20 F: ää ja kaikkia putkia inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa yhden tunnin ajan. Reaktioputkiin lisättiin 40 mikrolitraa Laemmli 2X näytelaimennuspuskuriliuosta, joka sisälsi β-merkaptoetanolia. Elektroforeesi suoritettiin 10-prosent-tisessa SDS-polyakrylamidigeelissä, geeli värjättiin Coo-.. 25 massie Brilliant Blue R-250:lla ja väri poistettiin. Tu lokset on esitetty kuvassa 20. Kuten kanavassa 2 on esitetty, uusi vyöhyke (*) esiintyy PNGase F-käsitellyssä CC83-näytteessä, mutta ei käsittelemättömässä CC83-näyt-teessä (kanava 3). Uusi vyöhyke on noin 2 000-3 000 mole-30 kyylipainoyksikköä pienempi kuin luontainen kevyen ketjun ! vyöhyke, mistä käy ilmi N-kytkeytyneen hiilihydraattiosan poistuminen. Ainoa konsensus-glykosylointipaikka CC83:n kevyelle ketjulle on paikassa ASN 20, joten päättelemällä voidaan olettaa, että tämä on glykosyloinnin todellinen 35 paikka ja tämä on syynä siihen, miksi se ei tullut esille 67 103477 CC83:n kevyen ketjun N-pään sekvenssianalyysissä ASN:nä. CC49:n kevyen ketjun liikkuvuus ei muutu PGNase F:llä käsiteltäessä (kanava 6) , mutta uusi vyöhyke havaitaan CCll:n raskaan ketjun F (AB')2-fragmentilla (kanava 4*) , 5 joka toimii positiivisena kontrollina. CCll:n raskaan ketjun lähetti-RNA:n sekvenssointitulokset osoittavat konsen-susglykosylaatiopaikan V-alueessa (tuloksia ei ole esitetty) . Standardeina (kanava 1) käytettiin naudan seerumin albumiinia (BSA), mp. 68 000 ja soijapavun trypsiini-inhi-10 biittoria (STI), mp. 21 500.

DNA-jakso

Plasmidin DNA sekvenssoitiin suoraan käyttäen Se-quenase-DNA-sekvenssointipakkausta, joka oli hankittu United States Biochemical (USB) -yhtiöstä, Cleveland, OH, 15 USA. Kaksinauhaisen DNA:n sekvenssoimiseksi noudatettiin USB:n käyttöohjeita. Kunkin vaihtelevan alueen DNA sekvenssoitiin käyttäen JH- tai JL-oligonukleotidia, jotka lähetti-RNA-jakson informaation perusteella oli määritetty olemaan spesifisiä kummankin tuottavasti uudelleenjärjes-20 tyneen raskaan ketjun tai kevyen ketjun geenin suhteen, tässä järjestyksessä mainittuna.

Kun alkusekvenssit oli määritetty, sekvenssiä laajennettiin käyttäen lisäalukkeita. Lisäalukkeet syntetisoitiin käyttäen hyväksi aikaisemmin muodostetuista sek-.. 25 vensseistä kerättyä tietoa.

Yllä kuvattua tekniikka käyttäen saatiin aikaan CC49:n ja CC83:n kokonaiset raskaan ketjun vaihtelevien alueiden eksonit ja kevyen ketjun vaihtelevien alueiden eksonit. DNA-jakso koottiin ja analysoitiin käyttäen 30 Hitachin DNA-jakson analysointiohjelmaa DNASIS™.

DNA-sekvenssointia varten valmistettiin seuraavat oligonukleotidialukkeet: (1) Kummallekin kevyelle ketjulle CK-introni(-): 51-GAAAAC-CTGTGTCTTACAC 3'.

68 103477 (2) CC49:n kevyelle ketjulle CC49 FRI ( + ) : 51-GTACCTGTGGGGACATTG 3', ja JK5(-)-23-meeri 5'-CGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3'.

5 (3) CC83:n kevyelle ketjulle CC83 CDR2(-): 5'-CAGGGACTCCAGTGTGC 3', CC83 L-introni (-): 5'GACTTCAAGATACAAATGTTAG-3', ja JK4(-)-20-meeri: 10 5'-CCAACTTTGTCCCCGAGCCGAACG.

CC49 VL:n ja CC83 VL:n täydelliset nukleotidijaksot on esitetty tässä järjestyksessä kuvissa 4a ja 5a.

CC49:n raskaalle ketjulle JH4 (-)-20 meeri: 5'GGTGACTGAGGTTCCTTGAC-3' 15 ja J„4 introni (-) : 5'-GCAATGCTCAGAAAACTCC.

CC83:n raskaalle ketjulle JH2(-)-16 meeri: 51CTGAGGAGACTGTGAG-3' ja Jh2 introni (-) : 20 5'-GCAGTAAAATCTATCTAAGCTG.

Tästä lähtien kunkin raskaan ketjun sekvenssointia laajennettiin seuraavilla jaksoilla: CC49/83 HC/5'(+) 5'-GCACTGCTCATGATATGCAAATC-3', CC49/83 HC/5'(-) 2 5 5'-GATTTGCATATCATGAGCAGTGC- 3', ja CC49/83 H-ketju FRI(-) 5'-CTCAGCGTCAGACTGCTG-3'.

CC49:n VH:n ja CC83:n VH:n täydelliset nukleotidi-jaksot on esitetty kuviossa 2.

30 Suoritettiin vertailuja luonnehditun lähetti-RNA- jakson ja luonnehditun DNA-jakson välillä, sekä luonnehditun aminohappojakson ja DNA-jaksosta ennustetun aminohappo jakson välillä. Näihin vertailuihin perustuen havaittiin plasmidikloonien sisältävän oikean CC49:n ja CC83:n ras- # » 35 69 103477 kaan ja kevyen ketjun vaihtelevia jaksoja koodaavan DNA-jakson.

Kuten kuviosta 2 käy ilmi, CC49:n ja CC83:n raskaan ketjun vaihtelevien alueiden nukleotidijaksoista peräisin 5 olevissa ennustetuissa aminohappojaksoissa on huomattavasti jaksojen välistä samankaltaisuutta kehysalueilla ja suuresti vaihtelevilla alueilla 1 ja 2. Suuresti vaihte-leva alue 3 on melkoisesti erilainen näiden kahden välillä johtuen VH-alueen rekombinoitumisesta erilaisten D- ja JH-10 sekvenssien kanssa nimenomaan siksi, että CC49:n l-raskas ketju käytti JH4:ää ja CC83:n gamma-1 käytti JH2:ta.

CC49:n ja CC83:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen geenien huomattava DNA-jaksojen homologia koodaavien jaksojen 5'-puolella osoittaa, että nämä kaksi raskaan ketjun 15 vaihtelevan alueen geeniä olivat peräisin samoista ituradan eksoneista.

VBaTAG:in, CC46:n, CC49:n, CC83:n ja CC92:n raskaan ketjun ituradan esiastegeenin eristäminen CC46:n, CC49:n, CC83:n ja CC92:n raskaan ketjun 20 vaihtelevien alueiden ituradan esiastegeenin eristämiseen käytetyt menetelmät olivat olennaisesti samoja, kuin mitä käytettiin CC49:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen eristämiseen, paitsi että LAMBDA-ZAP™-kirj aston muodostamiseen käytetty DNA tuli irrelevantista hybridoomasolulinjasta .. 25 (eli solulinjasta, joka tuottaa vasta-aineita, jotka eivät huomattavasti sitoudu TAG72:een). Noin 900 000 plakkia sisältävä DNA-kirjasto seulottiin ja siitä eristettiin yksi positiivinen klooni. Positiivinen klooni sai nimen pVHaTAG. pVHaTAG:in koko oli noin 5,2 ke ja DNA-insertin 30 koon määritettiin restriktioentsyymikartoituksella olevan noin 2,2 ke.

pV„aTAG:in DNA-jakso pVHaTAG:in DNA-jakson määritykseen käytettiin seu-raavia oligonukleotidialukkeita: 35 B72,3/CC92 HC-20 meeri: 5'-CCTTGAACTTCTCATTGTAC-3' 70 103477 CC49/CC83 HC 5' (+): 5'-GCACTGCTCATGATATGCAAATC-3' CC49/CC83 HC 5' (-): 5'-GATTTCGATATCATGAGCAGTGC-3' VHaTAG IVS (+): 51-CTAAAGTGGAGTCAGGGCCTG-3' VHaTAG IVS (-): 5'-CAGGCCCTGACTCCACTTTAG-3' 5 VHaTAG CDR2 (+): 5'-GAATGGATTGGATATATTTCTC-31.

VHaTAG:in täydellinen nukleotidijakso on esitetty kuviossa 2.

Ihmisen raskaiden muuttumattomien geenien eristäminen 10 Erilaisia raskaan ketjun muuttumattomia alueita sisältävät plasmidikonstruktiot (ργΐ, ργ2, ργ3 ja ργ4) saatiin Dr. lian R. Kirschiltä National Cancer Institutes-ta, Betesha, Maryland.

Näille geeneille suoritettiin restriktioentsyymi-15 kartoitus niiden identtisyyden varmistamiseksi. Ihmisen muuttumattomien alueiden restriktiokartat on esitetty kuviossa 21.

Kimeerinen kevyt ketju

Hiiren CC49 V-alue 20 J5 :n ja Ck:n välillä olevaan hiiren intronialueeseen paikallistetun CC49:n kevyen ketjun genomisen DNA:n Hind III -kohta [katso Max, Edward E. et ai., (1981) J. Biol. Chem. 256, 5116] menetettiin kloonausmenettelyssä, jossa puoliksi täytetyt Hind III -kohdat liitettiin ligaasilla .. 25 puoliksi täytettyihin Spe I -kohtiin LAMBDA-ZAP-vektoris- sa. Tämä muunnos kulkeutui plasmidin pRLIOI mukana (kuvio 9). Intronin Hind III -kohta muodostettiin uudelleen myöhemmin esitetyissä vaiheissa pääkohdittain kuvatulla tavalla, jotta Hind III - Bam H I -ihmisen ituradan kappa-30 kevyen ketjun DNA-fragmentti pystyttäisiin liittämään ligaasilla suoraan hiiren vaihtelevaan alueeseen. Kaikki vaiheet suoritettiin käyttäen standardeja ammattimiehille tuttuja molekyylibiologisia menetelmiä ja ne voidaan löytää käsikirjasta, kuten Maniatis.

71 103477 1,6 9 ke:n kokoinen Bam H I - Pst I -fragmentti eristettiin pRLIOIrstä aikaisemmin esitetyllä tavalla. 2,96 ke:n kokoinen Bam H I - Pst I -fragmentti eristetään pBluescript SK(-):sta (hankittu Stratageneltä) aikaisemmin 5 esitetyllä tavalla. Tämän jälkeen nämä kaksi fragmenttia liitetään ligaasilla ja seuraavassa esitetty pRLl03 eristetään .

10 ^ N. , Hindlll

Ar \Lyp st' pRL103 EH J5

4.65 kb H

15 \ f V

20

Plasmidia pGDl (kuvattu aikaisemmin) pilkottiin Pst I- ja Hind III -restriktioentsyymeillä, jotta saataisiin tarpeellinen 1,03 ke:n kokoinen intronin sisältävä frag-·* 25 mentti ja pRL103 pilkottiin myös Pst I- ja Hind III -rest riktioentsyymeillä liitoskohtaryhmässä (polylinker) olevan pienen DNA-fragmentin poistamiseksi.

Tuloksena olleet fragmentit liitettiin ligaasilla, jotta saatiin 5,68 ke:n kokoinen plasmidi, jolle annettiin 30 tunnus pRL104. pGDl:n ja pRL104:n osittainen restriktio-kartta on esitetty seuraavassa.

72 103477

arf\P

/ \VJ2 5 / }^?J3 / pGD1 L· J5

10,788 bp I

\ w—pstl NX Hindlll

Ck 15 ----- /y ^x - Kinclil pRLICM \

5680 bp I

\ X^Pstl ·· 25

BamHI J5

L

Ihmisen CK-alue 30 Plasmidi phum CK hankittiin Dr. John Roderilta, Mt,

Sinai Research Institute, Toronto, Ontario, Kanada. Plasmidi on peräisin pBR322:sta, jossa oli 12 ke:n kokoinen siihen liitetyn ihmisen CK-eksonin sisältävä Bam H I -fragmentti. pBR322 on kuvattu Stratagenen vuoden 1987 luette-35 lon sivulla 171. 12 ke:n Bam H I -fragmentin restriktio- 73 103477 kartta on esitetty seuraavassa [julkaisusta Heiter, P. et ai., (1982) J. Biol. Chem. 257 1516].

phumCk 5

Hindlll \„ enhancer

P BamHI

_-1 10 Ck

Plasmidi phum Ck pilkottiin Hind III- ja Pst I -re-striktioentsyymeillä, jotta saatiin 5,0 ke: n kokoinen fragmentti, joka sisältää ihmisen Ck-eksonin. pRL104:ää 15 pilkottiin Fsp I- ja Hind III -restriktioentsyymeillä, jotta saatiin 4,2 ke:n fragmentti, joka sisältää CC49:n hiiren kevyen ketjun vaihtelevat eksonit.

Nämä kaksi tuloksena ollutta fragmenttia liitettiin T4-DNA-ligaasilla, jotta saatiin 9,2 ke:n fragmentti yh-20 dessä tuloksena olleen fragmenttiseoksen kanssa. Tätä seosta pilkottiin Bam H I:llä, jotta saatiin 7,7 ke:n kokoinen Bam H I CC49 L-ketjun kimeerinen konstruktio, jossa on Bam H I -tarttuvat päät ja joka sisältää sekä hiiren vaihtelevan alueen eksonit että ihmisen muuttumattoman ** 25 alueen (kappa) eksonin. Nämä konstruktiot käyttävät hyväk seen ihmisen tehostajajaksoja sekä hiiren promoottorijak-soj a.

Kimeerinen Bam H I -fragmentti, joka sisälsi sekä hiiren kevyen ketjun vaihtelevan alueen eksonit (L ja VJ) 30 että ihmisen muuttumattoman alueen kappa (k) -eksonin, liitettiin ligaasilla Bam H I -kohtaan plasmidiin pSV2neo (5,6 ke), joka on pBR322:sta johdettu valikoitavan markke-rigeenin neo (hankittu ATCC:ltä) sisältävä plasmidi. Aktiivisen neo-geenin esiintyminen muuttaa solun resisten- 74 103477 tiksi genetisiinin, neomysiinin kaltaisen myös G4l8:ksi kutsutun lääkkeen aiheuttamalle kasvun inhibiitiolle.

Kimeerinen Bam H I -fragmentti liitettiin pSV2neo:on kummassakin orientaatiossa, kuten myöhempänä on 5 esitetty. Konstruoitiin kimeerisen kevyen ketjun geenin kummatkin transkriptiossa esiintyvät orientaatiot suhteessa neo-geeniin. Plasmidi pSV2neo linearisoitiin Bam H I -kohdasta, defosforyloitiin (Maniatisin teoksissa esitettyjen menetelmien mukaan) käyttämällä vasikan suolen al-10 kalista fosfataasia (itseligaation estämiseksi) ja liitettiin ligaasilla aiempana kuvattuun kimeeriseen CC49:n L-ketjun Bam H I -fragmenttiin.

neo f ^150 !

W 13.5 Kb I

BamHI Ck

Hindlll

25 VJS

psii amp iEcoRI BamH|

neo PRU105 I

K ^3-5 kb H—Hincflll

BamHI ZY, 75 103477

Neo-geenin ja CC49:n kimeerisen kevyen ketjun transkriptiossa esiintyvät orientaatiot on osoitettu nuolilla pRL120:ssa ja pRL105:ssä. pSV2neo:sta johdetut osat on osoitettu. Nämä plasraidit puhdistettiin suuressa mittakaa-5 vassa kutakin plasmidia monistavan E. coli -kloonin pre-paratiivisesta fermentaatiosta (1,0 1). Puhdistettuja plasmideja käytettiin viemään kimeerinen CC49:n kevyt ketju SP2/0 plasmasytoomasoluihin, kuten myöhempänä on esitetty.

10 Hiiren CC83:n VL-alue ja ihmisen CK-alue CC83:n kevyen ketjun kloonaamisen yhteydessä menetetty pRL200:ssa oleva Hind III -kohta muodostettiin uudelleen samasta syystä kuin CC49:n kevyen ketjun kimeeri-sessä konstruktiossa. Uudelleen muodostaminen suoritettiin 15 seuraavalla tavalla. Plasmidi pRL200 linearisoitiin uniikista Nhe I -kohdasta ja sen kummatkin tarttuvat päät muutettiin tasalla oleviksi täyttämällä dNTP:illä ja DNA-polymeraasi I:llä. Fosforvloitu Bam H I -kytkijä (hankittu New England Biolabs -yhtiöltä) liitettiin ligaasilla täy-20 tettyyn kohtaan. Uudelle plamidille annettiin tunnus pRL20l ja se on esitetty seuraavassa.

--SP-'/Hindlll

pRL201 I

7.45 kb 30 H.ndlll\SpelNhe'/BamH>

psn * L

76 1 0 3 4 7 7 pRL201:stä saatu 2,5 ke:n Bam H I - Pst I -fragmentti, joka sisälsi CC83:n kevyen ketjun vaihtelevan alueen genomin DNA:n, liitettiin kätevästi ligaasilla pRL104:stä saatuun aikaisemmin CC49:n kevyen ketjun kon-5 struktion yhteydessä kuvattuun 4 ke:n Bam H I - Pst I vek-torifragmenttiin, joka jo sisälsi Hind III:n sisältävän intronifragmentin. Uudelle plasmidille annettiin tunnus pRL202 ja se on esitetty seuraavassa.

10 c , —^/Fspl y Hindlll / pRL 202 \\ 15 6.5 kb J] \ /-------

BamHI

2 0 t J4

L V

pRL202:sta saatu noin 5,05 ke:n Fsp I - Hind III -fragmentti eristettiin ja liitettiin ligaasilla ihmisen 25 Ck:n sisältävään Hind III - Bam H I -fragmenttiin, joka on jo kuvattu CC49:n kevyen ketjun kimeerisen konstruktion yhteydessä. CC83:n kevyen ketjun vektorin muodostaminen suoritettiin tästä eteenpäin täysin samoin kuin CC49:n kevyen ketjun muodostaminen. Tuloksena ollut 8,5 ke: n 30 CC83:n kevyen ketjun kimeerinen Bam H I -konstruktio lii-; tettiin myös ligaasilla pSV2neo-Bam H I:een (fosfataasi- käsitelty) ja saatiin kummankin mahdollisen insertin orientaation omaavia plasmideja, kuten seuraavassa esitetystä diagrammista käy ilmi.

35 77 1 0 3 4 7 7 amp I EeoRl _ I .BamHl

neo I PPIL203 I

Ί l4-3 kb I

10 BamHl Λξ τγ^ξξ^νρϊιι

V J4 4 JS

15 amp jEcoRI g^,

[f PR230 I

ne0 1· 14.3 kb F

^ BamHl Ck

Neo-geenin ja CC83:n kimeerisen kevyen ketjun tran-30 skriptiossa esiintyvät orientaatiot on osoitettu nuolella \ pRL203:ssa ja pRL230:ssa. Nämä plasmidit puhdistettiin suuressa mittakaavassa kutakin plasmidia monistavan E. coli -kloonin preparatiivisesta fermentaatiosta (1,0 1) kaupallisesti saatavilla olevassa inkubaattorissa. Puhdis-35 tettuja plasmideja käytettiin viemään kimeerinen CC83:n 78 1 0 3 4 7 7 kevyt ketju Sp2/0 plasmasytoomasoluihin, kuten myöhempänä on esitetty.

Kaikki neljä kimeeristä kevyen ketjun plasmidikon-struktiota voidaan linearisoida pilkkomalla restriktioent-5 syymillä Aat II. Plasmideissa oleva Aat II -kohta on alueella, joka ei ole välttämätön kimeerisen kevyen ketjun geenin tai valikoitavan markkerigeenin neo:n ilmentymiselle .

Kimeeriset raskaat ketjut 10 Ihmisen gamma-muuttumattornien geenien eksonit

Kimeerisiä raskaan ketjun konstruktioita kantamaan käytetty plasmidivektori on nimetty pSV2gpt:ksi ja se on esitetty julkaisussa Mulligan ja Berg, (1984) "Selection of animal cells that express the E. Coli gene coding for 15 xanthine-guanine phosphoribosyltransferase", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78(4), 2072-2076. pSV2gpt on pBR322:sta johdettu plasmidi, joka sisältää valinnaisen markkerigeenin, guaniinifosforibosyylitransferaasin (gpt), jota voidaan käyttää valikoivaan kasvuun mykofenolihappoa sisältä-20 vässä liuoksessa. pSVgpt:n valmistamiseksi ihmisen Cyl-, Cy2-, Cy3-, Cy4-eksonien vastaanottajaksi se pilkottiin

Eco R I:llä ja Bam H I:llä. Pilkottu DNA fraktioitiin 4-%:isella polyakrylamidigeelillä ja 4,5 ke:n vektorifrag-mentti saatiin geelistä sähkövirralla eluoimalla, kuten 25 Maniatisin teoksessa on kuvattu. Tämä linearisoitu plasmidi nimettiin pSV2gpt/R/B:ksi ja plasmidikartta on esitetty kuviossa 22. Se kykenee ottamaan vastaan Eco R I -Bam H I -päätteisiä fragmentteja.

5'-pään Hind III -kohdat, jotka esiintyvät ihmisen 30 IgG-L-muuttumattoman alueen fragmenteissa, muunnettiin Eco ; R I -kohdiksi pSV2gpt:n Eco R I -kohtaan suunnattua kloo nausta varten, γΐ-.η, γ2:η, γ3:η ja γ4:η tapauksissa käytettiin vektorin pBR322 Eco R I -kohtaa.

79 103477

Cyl

Ihmisen Cyl-eksonit sisältävä fragmentti saatiin aikaan pilkkomalla ja linearisoimalla p 1-plasmidi Hind III:lla ja sen jälkeen täyttämällä Hind III:n tarttuvat 5 päät käyttämällä kaikkia neljää dNTP:tä ja DNA-polymeraa-sin Klenow-fragmenttia Hind III -päiden tasaamiseksi. Eco R I -kytkijä liitettiin ligaasilla tasaisiin päihin Hind III -kohdan korvaamiseksi Eco R I -kohdalla. Tämän jälkeen tämä konstruktio pilkottiin Eco R I:llä ja Bam H I:llä, 10 jotta saatiin vapautetuksi Cyl-eksonit sisältävä 7,8 ke:n fragmentti. Tämä fragmentti nimettiin Cyl-7,8 ke:ksi.

Kukin fragmenteista liitettiin sitten ligaasilla pSV2-gpt/R/B:n Eco Rl- Bam H I -kohtiin. Tämä vektorin (pSV2-gpt-yl-7,2) rakenne mahdollistaa minkä tahansa hii-15 ren raskaan ketjun vaihtelevan alueen geenin (joissa on Eco R I -päät) liittämisen ihmisen raskaan IgG-ketjun vektoreiden Eco R I -kohtaan. Tarkemmin sanottuna 125 ng ihmisen Cyl-7,8 ke -fragmenttia liitettiin ligaasilla 100 ng:aan linearisoitua pSV2gpt/R/B -vektoria liuoksessa, 20 jonka tilavuus oli 10 μΐ, käyttäen 400 yksikköä T4-DNA-ligaasia (hankittu New England Biolabs -yhtiöstä). Pakastetut Invitrogen-yhtiöstä (San Diego, CA) hankitut kompetentit E. coli DH1 -solut transformoitiin ligaasireaktiol-la Invitrogenin käyttöohjeiden mukaisesti. Tuloksena ollut 25 plasmidi nimettiin pSV2gptyl-7,8:ksi. pSV2gptyl-7,8:n plasmidikartta on esitetty kuviossa 23.

Lisäksi muodostettiin toinen lyhyempi fragmentti, joka sisälsi Cyl-eksonit. Huoli kimeerisen 7,8 ke:n Cyl -fragmentin, 4,5 ke:n pSV2-gpt/R/B-vektorin ja 1,9 ke:n 30 CC49:n vaihtelevan alueen sisältävän raskaan ketjun vektorin (yhteensä 14,2 ke) koosta joudutti tarvetta pienentää 7.8 ke:n Cyl Eco Rl- Bam H I -fragmentin suurta kokoa.

7.8 ke:n Cyl:n koodaava alue käsittää ainoastaan ensimmäisen kolmanneksen 51-pään fragmentista.

so ’0\j4T//

Koon pienentäminen suoritettiin muuttamalla jälkimmäinen Pvu II -kohta Bam H I -kohdaksi Bam H I -kytkijän tasaisen pään lisäyksellä. ργ-1:η Hind III -kohta muutettiin Eco R I -kohdaksi pilkkomalla pyiltä Hind 111:11a, 5 täyttämällä 3'-pää tasaisen pään aikaansaamiseksi ja lisäämällä Eco R I -kytkijöitä, kuten aiemminkin. 2,3 keitä jäljempänä oleva Pvu II -kohta muutettiin Bam H I -kohdaksi pilkkomalla seuraavaksi Pvu 11:11a ja liittämällä Bam H I -kytkijät suoraan tasaisiin Pvu II -päihin. Tämän jäl-10 keen tätä konstruktiota pilkottiin Eco R I:llä ja Bam H Iillä, jotta saatiin vapautetuksi 2,3 kein fragmentti, joka sisälsi Cyl-eksonit. Lyhennetty Eco Rl- Bam H I -fragmentti (2,3 ke) sisältää yhä γΐ-eksonit ja 31-pään polyadenylaatiojakson. Tämä pienentää vektorin lopullista 15 kokoa 5,5 keillä, mikä tekee tuloksena olevan konstruktion paremmin hallittavaksi (yhteensä 8,7 ke).

Noin 200 ng ihmisen Cyl-2,3 ke -fragmenttia liitettiin ligaasilla 100 ngiaan linearisoitua pSV2gpt/R/B-vek-toria käyttäen 400 yksikköä T4-DNA-ligaasia (New England 20 Biolabs) liuoksessa, jonka tilavuus oli 10 μΐ. Pakastetut kompetentit Invitrogen-yhtiöstä hankitut E. coli -solut transformoitiin ligaasireaktiolla Invitrogenin käyttöohjeiden mukaisesti. Tuloksena ollut plasmidi nimettiin pSV2gptyl-2,3:ksi. pSV2gptyl-2,3:n plasmidikartta on esi-25 tetty kuviossa 24.

Muut kolme ihmisen IgGm muuttumattoman jakson ek-sonia sisältävät DNA-fragmentit eristettiin myös. Cy2-ek-sonit saatiin plasmidista ργ2 4,0 ke in Eco Rl- Bam H I -fragmenttina. Cy3-eksonit saatiin plasmidista ργ3 8,0 ke in 30 Eco Rl- Bam H I -fragmenttina. Cy4-eksonit saatiin plasmidista ργ4 7,6 kein Eco Rl- Bam H I -fragmenttina. Fragmentit liitettiin erikseen ligaasilla pSVgpt/ R/B:hen, kuten cyl-7,7:n ja Cyl-2,3:n kohdalla on kuvattu. Tulok- m 81 103477 sena olleiden plasmidien plasmidikartat on esitetty siten, että kuviossa 25 on esitetty pSV2gpt-y2, kuviossa 26 pSV2gpt-y3 ja kuviossa 27 pSV2gpt-y4.

Raskaan ketjun kimeeriset konstruktiot 5 Täydelliset raskaan ketjun vaihtelevan alueen ihmi sen γΐ muuttumattoman alueen kimeeriset konstruktiot muodostettiin liittämällä hiiren raskaan ketjun vaihtelevan alueen eksonit sisältävä fragmentti ihmisen γΐ:η muuttumattoman alueen eksonit sisältäviin plasmideihin seuraa-10 vaksi kuvatulla tavalla.

Tämän jälkeen CC49- ja CC83-hybridoomasoluista peräisin olevat hiiren raskaan ketjun vaihtelevan alueen geenit liitettiin ligaasilla kuhunkin γΐ - γ4:η sisältävään pSV2-gpt -vektoriin (pSV2gpt-Yl, pSV2gpt~Y2, pSV2gpt-15 γ3, pSV2gpt-Y4) seuraavalla tavalla.

CC49

Raskaan ketjun vaihtelevan alueen CC49:n raskaan ketjun vaihtelevaa aluetta koodaavat eksonit sisältävä fragmentti valmistettiin pilkkomalla 14 μg pHH49:ää käyt-20 täen 50 yksikköä Eco R I:tä (hankittu BRLrstä) 37 °C:n lämpötilassa 2 tunnin ajan. Pilkkomistuote fraktioitiin 4-%:isella polyakrylamidigeelillä ja 1,9 ke:n CC49.-n raskaan ketjun vaihtelevan alueen eksonit sisältävä Eco I -fragmentti saatiin sähkövirralla eluoimalla, kuten Ma-. 25 niatisin teoksessa on kuvattu. Tämä fragmentti nimettiin f49R:ksi.

γΐ: tä koodaavan 7,8 ke:n jakson sisältävä fragmentti valmistettin seuraavalla tavalla.

Noin 50 μg vektoria pSV2gpt Yl-7.8:aa pilkottiin 30 Eco R I:llä. Tuloksena ollut fragmentti defosforyloitiin ' (itseligaasin estämiseksi) käyttämällä vasikan suolen al kalista fosfataasia Maniatisin teoksessa kuvatulla tavalla. Fragmentti puhdistettiin 0,8-%:iselta agaroosigeeliltä 82 103477 sähkövirralla. Tämä vektori nimettiin pSV2gpt~Yl-7.8/ R:ksi.

Eco R I -kohta sijaitsee 245 ep. aiempana transkription aloituskohdista ja se sisältää promoottorin ja 5 tehokkaaseen ilmentymiseen tarvittavat kudosspesifiset jaksot. Vaihtelevan alueen geenien 3'-puolella olevat int-ronit sisältävät hiiren raskaan ketjun tehostajajaksot, joita ei esiinny ihmisen IgG:n raskaan ketjun vektoreissa. Tästä seurauksena on, että raskaan ketjun kimeeriset vek-10 torit käyttävät sekä hiiren promoottori- että tehostaja-jaksoja.

Noin 325 ng linearisoitua pSV2gpt l-7.8/R:ää liitettiin ligaasilla 188 ng:aan f49R:ää liuoksessa, jonka tilavuus oli 10 μΐ ja joka sisälsi 1 yksikön T4-DNA-ligaa-15 siä (BRL). Pakastetut Stratageneltä hankitut kompetentit E. coli-AG-1 -solut transformoitiin ligaasireaktiolla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tuloksena ollut plasmidi nimettiin ρ49γΐ-7.8:ksi. Kuviossa 28 on esitetty ρ49γ1-7.8:n plasmidikartta.

20 Noin 50 μg vektoria pSV2gptyl-2.3:a pilkottiin Eco R I:llä, kuten SV2gptYl-7.8:nkin tapauksessa. Tuloksena ollut fragmentti defosforyloitiin käyttämällä vasikan suolen alkalista fosfataasia Maniatisin teoksessa kuvatulla tavalla. Fragmentti puhdistettiin 0,8-%:isesta agaroosi-25 geelistä eluoimalla sähkövirralla. Tämä linearisoitu plasmidi nimettiin pSV2gpt l-2.3/R:ksi.

Noin 300 ng linearisoitua pSV2gptYl-2.3/R:ää liitettiin ligaasilla 188 ng:aan f49R:ää liuoksessa, jonka tilavuus oli 10 μΐ ja joka sisälsi 1 yksikön T4-DNA-ligaa-30 siä (BRL). Pakastetut Stratageneltä (La Jolla, CA) hankitut kompetentit E. coli-AG-1 -solut transformoitiin li-gaasireaktiolla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tuloksena · ollut plasmidi nimettiin ρ49γ1-2.3:ksi. Kuviossa 29 on esitetty ρ49γΐ-2.3:η plasmidikartta.

83 103477

Plasmidit pSV2gpt-y2, pSV2gpt-Y3 ja pSV2gpt-y4 pilkottiin erikseen Eco R I:llä, jotta saatiin vastaavassa järjestyksessä ilmoitettuna lineaariset plasmidivektorit pSV2gpt-Y2/R, pSV2gpt~Y3/R ja pSV2gpt-Y4/R. Kukin näistä 5 kolmesta lineaarisesta plasmidivektorista liitettiin erikseen ligaasilla käyttäen f49R:ää. Tuloksena olleiden plas-midien plasmidikartat on esitetty siten, että kuviossa 30 on esitetty ρ49-γ2, kuviossa 31 ρ49-γ3 ja kuviossa 32 p49-Y3 · 10 CC83 CC83:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen sisältävät kimeeriset konstruktiot muodostettiin samalla tavoin kuin CC49:n kimeeriset konstruktiot. Raskaan ketjun vaihtelevan alueen CC83:n raskaan ketjun aluetta koodaavat eksonit si-15 sältävä fragmentti valmistettin pilkkomalla 19 μg pHS83:ää käyttäen 50 yksikköä Eco R I:tä (hankittu BRListä) 37 °C:n lämpötilassa 2 tunnin ajan. Pilkkomistuote fraktioitiin 4-%:isella polyakrylamidigeelillä ja 2,9 ke:n CC83:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen eksonit sisältävä Eco I -frag-20 mentti saatiin sähkövirralla eluoimalla, kuten Maniatisin teoksessa on kuvattu. Tämä fragmentti nimettiin f83R:ksi.

Noin 300 ng linearisoitua plasmidia pSV2gptYl-7.8/ R, joka oli saatu aikaisemmin kuvatulla tavalla, liitettiin ligaasilla 270 ng:aan f83R:ää liuoksessa, jonka tila-25 vuus oli 10 μΐ ja joka sisälsi 1 yksikön T4-DNA-ligaasia (BRL) . Pakastetut Stratageneltä hankitut kompetentit E. coli-AG-1 -solut transformoitiin ligaasireaktiolla Strata-genen ohjeiden mukaisesti. Tuloksena ollut plasmidi nimettiin ρ83γ1-7.8:ksi. Kuviossa 33 on esitetty ρ83γΐ-7.8:η 30 plasmidikartta.

; Noin 90 ng linearisoitua plasmidia pSV2gptYl-2.3/R, joka saatiin aikaisemmin kuvatulla tavalla, liitettiin ligaasilla 270 ng:aan f83R:ää liuoksessa, jonka tilavuus oli 10 μΐ ja joka sisälsi 1 yksikön T4-DNA-ligaasia (BRL). 35 Pakastetut Stratageneltä hankitut kompetentit E, coli-AG-1 • 103477 84 -solut transformoitiin ligaasireaktiolla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tuloksena ollut plasmidi nimettiin ρ83γ1-2.3:ksi. Kuviossa 34 on esitetty ρ83γ1-2.3:η plasmi-dikartta.

5 Plasmidit pSV2gpt-y2, pSV2gpt-y3 ja pSV2gpt-y4 pil kottiin erikseen, kuten aiempana vastaavassa järjestyksessä pSV2gpt-Y2/R:n, pSV2gpt-y3/R:n ja pSV2gpt-y4/R:n kanssa, Eco R I:llä, jotta saatiin vastaavassa järjestyksessä lineaariset plasmidivektorit pSV2gpt-Y2/R, pSV2gpt-y3/R ja 10 pSV2gpt-y4/R. Kukin näistä kolmesta lineaarisesta plasmi- divektorista liitettiin erikseen ligaasilla f83R:ään. Tuloksena olleiden plasmidien plasmidikartat on esitetty kuviossa 30 ρ49-γ2, kuviossa 31 ρ49-γ3 ja kuviossa 32 p49-Y 3 · 15 Tämän jälkeen kaikki kymmenen rengasrakenteista plasmidikonstruktiota (ρ49γ1-7.8, ρ49γ1-2.3, ρ83γ1-7.8, ρ83γ1-2,3, ρ49-γ2, ρ83-γ2, ρ49-γ3, ρ83-γ3, ρ49-γ4 ja ρ83-γ4) linearisoitiin transformaatiota varten pilkkomalla restriktioentsyymillä Nde I. Plasmideissa oleva Nde I 20 -kohta on alueella, joka ei ole olennainen kimeerisen im- munoglobuliinigeenin tai valikoitavan markkerigeenin, gpt:n ilmentymiselle. Ennen transformaatiota vastaanotta-jasoluun plasmidien täytyy olla lineaarisessa muodossa, jotta DNA:n valikoiva integroituminen isäntäsolun genomin 25 DNA:hän vahvistuisi.

Konstruktion varmentaminen

Koska Eco R I -fragmentit voidaan liittää ligaasilla kummassakin orientaatiossa, määritettiin Eco R I -fragmenttien oikea orientaatio pilkkomalla Neo I:llä. Aiemmin 30 esitetyissä konstruktioissa vahvistettiin plasmidikon- struktioiden oikea liittymistäpä suorittamalla plasmidille restriktioentsyymipaikkojen kartoitus. Restriktioentsyy-meillä pilkkomisesta ja geelielektroforeesista saatua restrikt ioentsyymikarttaa verrataan teoreettisesti yksittäi-35 sistä lähtöfragmenteista muodostettuun karttaan. Kevyen ., 103477 ketjun vektoreissa käytetystä transkriptionaalisesta orientaatiosta saatujen kokemusten perusteella raskaan ketjun vektorit konstruoitiin ainoastaan transkriptionaa-liseen orientaatioon, joka on vastakkainen gpt-geenin 5 suhteen.

Plasmidien transformaatio hiiren plasmasytoomaso- luihin

Kun sekä kevyen että raskaan ketjun kimeeriset geenit transformoidaan samaan soluun, saadaan aikaan tetra-10 meerisiä (H2L2) immunoglobuliineja. Näiden "kimeeristen" vasta-aineproteiinien synteesi ja erittyminen saatiin aikaan viemällä kimeeriset (hiiren V-alue:ihmisen C-alue) geenit hiiren plasmasytoomasoluihin (Sp2/). Transformaatio suoritettiin elektroporaatiolla [Sahaga, B.G. et ai. . 15 (1986) J. Immunology 137, 1066].

Transformoiduissa hiiren plasmasytoomasoluissa (Sp2/0) olevien kimeeristen (hiiren V-alue:ihmisen C-alue) geenien ilmentyminen suoritetaan käyttämällä kahta erilaista menetelmää. Toisessa muodossa soluun voidaan viedä 20 samanaikaisesti kevyen ketjun geenejä ja raskaan ketjun geenejä erilaisissa keskinäisissä suhteissa. Tästä käytetään nimitystä rinnakkaistransformaatio. Vaihtoehtoisesti voidaan tehdä kimeerisen kevyen ketjun geeniä kantavia vakaita klooneja, joita sitten voidaan käyttää toisessa . 25 muodossa, josta käytetään nimitystä kohdetransformaatio.

Kummassakin menetelmässä päämääränä on saada aikaan klooneja, jotka sisältävät sekä H- että L-ketjun geenejä, jotka tuottavat aiemmin mainittua intaktia H2L2-immunoglobu-liinia.

3 0 A. Rinnakkais transformaatiot.

' Rinnakkaistransformaatioon sisältyy kummatkin lää- keaineresistenssin markkerit sisältävien solujen samanaikainen transformaatio ja sitä seuraava valikointi yhdellä tai kummallakin lääkeaineella. Raskaan ketjun ja kevyen 35 ketjun vektoreiden (suhteissa 1:1 ja 1:10, tässä järjes- 103477 86 tyksessä ilmoitettuna) rinnakkaistransformaatio suoritettiin alunperin käyttäen ainoastaan neo-valikointia. Saatiin aikaan neo-resistentteja solulinjoja, jotka ilmensivät ensimmäisiä osoitettavissa olevan TAG72-sitomisaktivi-5 teetin omaavia kimeerisiä IgGl-vasta-aineita. Rinnakkaistransf ormaatio suoritettiin seuraten tarkasti teoksessa Cornelia Gorman, (1985) "High Efficiency Gene Transfer into Mammalian Cells", DNA Cloning, osa II, D.M. Glover, toim., IRL Press, Oxford, England, esitettyjä ohjeita.

10 B. Kohdetransformaatiot

Kevyitä ja raskaita kimeerisiä immunoglobuliinigee-nejä sisältävät konstruktiot transformoitiin peräkkäin hiiren plasmasytoomasoluihin Sp2/0. Kohdetransformaatioon sisältyy transformaatio ja valikointi ensimmäisen lääkeai-15 neresistenssigeenin (ts. genetisiiniresistenssin kimeeri-sen kevyen ketjun geenin vektorin kyseessä ollessa) sisältävällä vektorilla, joita seuraa transformaatio ja valikointi toisen lääkeaineresistenssigeenin (ts. mykofenoli-happoresistenssin kimeerisen raskaan ketjun geenin vekto-20 rin kyseessä ollessa) sisältävällä vektorilla. Neo-valikointi

Ennen kimeerisiä kevyen ketjun konstruktioita sisältävillä pSV2-neo-vektoreilla suoritettua transformaatiota vahvistettiin lääkeaineella suoritettavan valikoin-. 25 nin olosuhteet transformoimattoimien Sp2/0 plasmasytooma- solujen kasvun ehkäisyyn titraamalla neomysiinin kaltaisella lääkkeellä, genetisiinillä (GIBCO). Julkaisuissa esiintyvät arvot lääkeaineilla suoritettavassa valikoinnissa käytettävistä genetisiinipitoisuuksista vaihtelevat 30 välillä 100 - 1 000 μg/ml. 400 μg/ml:aa suurempien pitoi- • suuksien havaittiin estävän Sp2/0-solujen kasvua tämän keksinnön yhteydessä käytetyssä kudosviljelmäympäristössä. Kevyen ketjun sisältävien solujen konstruktio Hiiren Sp2/0 plasmasytoomasolut transformoitiin 35 aluksi kevyen ketjun sisältävillä pSV2-neo-vektoreilla 87 103477 seuraavasti. Soluja kasvatettiin RPMI 1640 -liuoksessa, joka sisälsi 5 prosenttia naudan sikiön seerumia. Solut pestiin PBS:ssä ja suspendoitiin pitoisuuteen 1 X 107 elinkykyistä solua/ml PBS. 0,8 ml soluja siirrettiin elektro-5 poraatiokyvettiin (jäissä), joka sisälsi 20 μg kevyen ketjun sisältävää Aat II -restriktioendonukleaasilla lineari-soitua pSV2-neo-vektoria (pRL105 ja pRL150 CC49:n kimee-ristä L-ketjua varten ja pRL203 ja pRL230 CC83:n kimeeris-tä L-ketjua varten). Aat II inaktivoitiin lämmittämällä 10 näytteet 65 °C:n lämpötilaan 10 minuutin ajaksi. Lineari-soitu DNA saostettiin etanolilla ja liuotettiin välittömästi sen jälkeen 10 - 20 mikrolitraan PBSrää. Jäähauteel-la 15 minuutin ajan kestäneen seisotuksen jälkeen suoritettiin elektroporaatio käyttäen Gene Pulser -elektropo-15 raatiolaitetta, johon oli lisätty kapasitanssin laajennin (BioRad), 0,2 kV:n ja 960 μΡ:η voimakkuudella. Aikavakio (t) oli yleensä noin 26 ms.

Transformaation jälkeen solujen annettiin palautua jäähauteella 15 minuutin ajan, jotta perturboituneet kal-20 vot voisivat relaksoitua. Jälkeenpäin solut suspendoitiin 24 ml:aan RPMI 1640 -liuosta, joka sisälsi 5 % naudan sikiön seerumia (RPMI+) ja siirrettiin 96- tai 24-kuoppai-selle levylle. Sen mahdollisuuden pienentämiseksi, että kuoppaa kohti tulisi useampi kuin yksi lääkeaineelle re-25 sistentti solu, soluja laimennettiin myös 10-kertaisesti liuoksessa (RPMI+) ja maljattiin toiselle 96-kuoppaiselle maljalle. Solususpensiota inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa ja 5-%:isessa C02-atmosfäärissä.

48 tunnin kuluttua (jotta resistenssi lääkeaineelle 30 ehtisi ilmentyä) liuos poistettiin ja korvattiin 1 mg/ml • genetisiiniä sisältävällä liuoksella.

7-10 päivän kuluttua genetisiinile resistentit kloonit jatkoviljeltiin ja solut seulottiin kimeeristen kevyiden ketjujen suhteen värjäämällä ne.

88 1 0 3 4 7 7

Soluvärjäys

Eriä soluja sisältävästä liuoksesta sentrifugoitiin solumatoiksi aluslaseille käyttäen Cytospin-2-sentrifuugia (Shandon, Inc.). Ilmakuivauksen jälkeen solut kiinnitet-5 tiin etikkahappo/etanoliliuoksessa (5 osaa etikkahappoa/95 osaa etanolia). Kun solut oli huuhdeltu 3 kertaa PBS:llä (ilman Ca2+- ja Mg2+-ioneja) aluslasit asetettiin kosteaan kammioon (suhteellinen kosteus 100 %) ja ne värjättiin 20 minuutin ajan 20 μ1:1ΐ3 FITC-konjugoidulla vuohen vasta-10 aineella ihmisen kappaa vastaan, joka on ihmisen kevyitä kappa-ketjuja vastaan spesifinen, fluoresoivaan väriaineeseen konjugoitu vasta-aine. Konjugoitua vasta-ainetta laimennettiin suhteessa 1:3 PBS-liuoksella, jossa oli 1 % BSA:ta. Sen jälkeen kun aluslaseja oli pesty yön yli, ne 15 petattiin käyttäen fluoromount-G:tä, histologista petaus-liuosta (hankittu Southern Biotech -yhtiöstä), peitinlasin alle. Levyjä tarkasteltiin Olympuksen BH-2-mallisella mikroskoopilla, joka oli varustettu päältävalaisu-UV-lisä-laitteella.

20 Fluoresenssin intensiteettiin perustuen niiden konstruktioiden, joissa kevyen ketjun orientaatio oli vektorissa olevan neor-geenin transkription suunnan suhteen vastakkaisessa transkriptionaalisessa orientaatiossa, havaittiin antavan voimakkaimman L-ketjun ilmentymisen. Tä-. 25 män vuoksi pRL105 oli edullinen CC49:n L-ketjun ja pRL230 oli edullinen CC83:n L-ketjun konstruktio. Näiden kokeiden tuloksena seuraavia kimeerisen kevyen ketjun sisältäviä solulinjoja (Sp2/0:sta peräisin olevia) käytettiin kohde-transformaatioissa : 30 CC49:n kimeerisen L-ketjun tapauksessa saatiin yksi : solulinja (49K-13-13) , joka ilmensi CC49:stä saatua kimee- ristä kevyttä ketjua. Tätä solulinjaa käytettiin kaikkiin tätä seuraaviin kohdetransformaatioihin kimeerisillä raskaan ketjun vektoreilla niitä konstruktioita varten, jois-35 sa käytettiin kimeeristä CC49:n kevyttä ketjua.

89 103477 CC83:n kimeerisen L-ketjun tapauksessa saatiin kolme solulinjaa (83K-26-5, 83K-34-10 ja 83K-42-2), jotka ilmensivät CC83:sta saatua kimeeristä raskasta ketjua. Yksi solulinja värjäytyi muita voimakkaammin ja siinä 5 esiintyi paikallisia sytoplasman immunofluoresenssia osoittavia alueita. Kaikkia kolmea solulinjaa verrattiin keskenään niiden suhteellisen kimeerisen vasta-aineen tuottamiskyvyn suuruuden suhteen kimeerisellä CC83 gl:n raskaan ketjun vektorilla suoritetun transformaation seulo rauksena. 83K-34-10-kohteen elektroporaatiosta saatiin enemmän kimeerisiä vasta-aineita ilmentäviä klooneja kuin kummastakaan kahdesta muusta kimeerisen kevyen ketjun koh-desolulinjasta. Tämän vuoksi 83K-34-10-kevyen ketjun solulinjaa käytettiin kohteena tätä seuraaviin elektroporaa-15 tioihin, joissa käytettiin kimeerisiä raskaan ketjun vektoreita niissä konstruktioissa, jotka sisälsivät CC83:n kevyen ketjun vaihtelevan alueen.

CC49:n ja CC83:n kimeerisiä H-ketjun konstruktioita kantavien gpt-resistenttejen kloonien muodostaminen 20 Ennen kimeerisiä raskaan ketjun konstruktioita si sältävillä pSV2-gpt-vektoreilla suoritettua transformaatiota vahvistettiin lääkeaineella suoritettavan valikoinnin olosuhteet transformoimattomien Sp2/0-plasmasytooma-solujen [hankittu American Type Culture Collectionista 25 (ATCC)] kasvun ehkäisemiseksi. Olosuhteet pSV2-gpt-vektoreilla transformoitujen solujen lääkeaineilla suoritettavalle valinnalle olivat paljon vaikeammin vahvistettavissa. E. colin gpt-geeni, joka koodaa guanosiinifosforibo-syylitransferaasientsyymiä, antaa kyvyn käyttää hyväksi 30 ksantiinia ja hypoksantiinia guaniinin biosynteesin subs-: traatteina silloin, kun nisäkkäiden guaniinin aineenvaih- duntapolku on estynyt mykofenolihapon (MPA) vaikutuksesta.

Julkaistujen MPA:n pitoisuusarvojen, jotka sallivat muiden pSV2-gpt-vektoreilla transformoitujen imusolulinjo-35 jen kasvun, havaittiin olevan melkein kaksi kertaa liian 90 103477 korkeita pSV2-gpt:llä transformoitujen Sp2/0-solujen kasvun sallimiseksi tässä keksinnössä käytetyssä kudosvilje-ly-ympäristössä. Tämän jälkeen MPA:n optimaalisen pitoisuuden gpt-resistenssin suhteen tapahtuvaan valikointiin 5 havaittiin olevan 0,1 μg/ml. Lisäksi aminopteriinin ja tymidiinin käytön (guaniinitien sulkemiseksi vielä tehokkaammin) havaittiin olevan tarpeetonta.

Kimeeristä 44-vasta-ainetta tuottavien kloonien

muodostaminen 10 CH44-I

49K-13-13-soluja käytettiin kohteena kimeerisille raskaan ketjun konstruktioille. Solut transformoitiin käyttäen 20 μg Nde I:llä pilkottua linearisoitua kimeeris-tä raskaan ketjun DNA-vektoria (ρ49γ1-7.8 tai ρ49γΐ-2.3). 15 Transformaatio elektroporaatiolla suoritettiin kuten aiemmin kimeerisille kevyille ketjuille.

48 tunnin kuluttua suoritettu valikointi suoritettiin kuitenkin korvaamalla genetisiiniä sisältävä liuos liuoksella, joka sisälsi genetisiiniä ja mykofenolihappoa 20 0,3 μg/ml, ksantiinia 250 μg/ml ja hypoksantiinia 10 μg/ml.

Transformoidut solut kasvoivat paljain silmin näkyviksi pesäkkeet 14 päivässä. Tässä vaiheessa 50 μΐ super-natanttia poistettiin ja määritettiin ELISA-menetelmillä . 25 TAG:hen suunnatun sitoutumisen ja ihmisen IgG:n muuttumat toman alueen ilmentymisen suhteen. Positiivista TAG-sitou-tumista osoittavia soluja sisältävät kuopat jatkoviljel-tiin 24-kuoppaisiin levyihin, joissa oli uutta lääkeaine-valikointiliuosta ja niiden annettiin kasvaa 3-7 päivän 30 ajan.

• Jatkokloonaus suoritettiin seuraavalla tavalla.

Elinkykyisten solujen määrä laskettiin ja solut maljattiin uudelleen 96-kuoppaisille levyille. Yhdelle levylle tuli 50 elinkykyistä solua ja toiselle 250 elinkykyistä solua. 35 Uudelleenjatkokloonauksen varalta jatkokloonaamattomia 91 103477 soluja jatkoviljeltiin 6-kuoppaisille maljoille, kunnes solujen tiheys oli tarpeeksi suuri nestetypessä tapahtuvaa varastointia varten.

Jatkokloonauksen jälkeen eniten kimeeristä vasta-5 ainetta tuottavat kloonit valikoitiin bioreaktoreissa suoritettavaa kimeerisen vasta-aineen tuotantoa varten.

CC44-2

Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC44-l:n konstruktiossa 10 toistettiin sillä poikkeuksella, että kimeerisenä raskaan ketjun vektorina käytettiin 20 μ<5 p49-y2:ta.

CC44-3

Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC44-l:n konstruktiossa 15 toistettiin sillä poikkeuksella, että kimeerisenä raskaan ketjun vektorina käytettiin 20 p49-y3:a.

CC44-4

Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC44-l:n konstruktiossa 20 toistettiin sillä poikkeuksella, että kimeerisenä raskaan ketjun vektorina käytettiin 20 μg p49-y4:ää.

Kimeeristä 88-vasta-ainetta tuottavien kloonien muodostaminen CH88-1 . 25 Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor- moinnissa käytetyt menetelmät CC44-l:n konstruktiossa toistettiin seuraavin poikkeuksin.

Kimeeristä CC83:n kevyttä ketjua tuottavat 83K-25- 5-, 83K-34-10- ja 83K-42-2-solut transformoitiin, kuten 30 CH44-l:n transformoinnin yhteydessä on kuvattu, sillä poikkeuksella, että raskaan ketjun vektorina käytettiin 20 μg ρ83γ1-7.8 : aa tai p83Yl-2.3:a, kimeerisen CC83:n raskaan ketjun geenin sisältävää pSV2gpt-vektoria.

92 103477 CC88-2

Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC88-l:n konstruktiossa toistettiin sillä poikkeuksella, että kimeerisenä raskaan 5 ketjun vektorina käytettiin 20 μg p83-y2:ta.

CC88-3

Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC88-l:n konstruktiossa toistettiin sillä poikkeuksella, että kimeerisenä raskaan 10 ketjun vektorina käytettiin 20 μg p83-y3:a.

CC88-4

Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC88-l:n konstruktiossa toistettiin sillä poikkeuksella, että kimeerisenä raskaan 15 ketjun vektorina käytettiin 20 μg p83-y4:ää.

Kimeeristä 84-vasta-ainetta tuottavien kloonien muodostaminen

Koska CC49:n ja CC83:n raskaan ketjun vaihtelevien alueiden välillä on paljon jaksojen samankaltaisuutta, 20 muodostettiin sekakohdetransformaatioilla sellaisia kimee-risiä vasta-aineita, joiden kevyet ja raskaat ketjut polveutuivat eri kannoista. CC49:n ja CC83:n kimeeriset raskaan ketjun γΐ-isotyypin vektorit siirrettiin elektropo-raatiolla vastaavassa järjestyksessä kimeerisen kevyen • : 25 ketjun kohteisiin 83K34-10 ja 49K13-13 kummankin "sekoite tun" kombinaation muodostamiseksi. Tuloksena olleet solu-linjat nimettiin CH48-l:ksi ja CH84-l:ksi, jossa ensimmäinen luku ilmoittaa raskaan ja kevyen ketjun polveutumisen vastaavassa järjestyksessä mainittuna. Esimerkiksi CH48-1 30 tarkoittaa sellaista γΐ-isotyyppiä, jonka raskas ketju on peräisin CC49:stä ja kevyt ketju peräisin CC83:sta.

Koostettu vasta-aine CH48-1 ei sitoutunut TAG72:een. Tämä ei johtunut sen kyvyttömyydestä muodostaa bona fide- kimeeristä vasta-ainetta, koska useimmat lääke-35 aineresistentit solulinjat tuottivat kimeeristä IgG:tä 93 103477 (määritettynä ELISA-analyysillä, jossa käytettiin vuohen vasta-aineesta ihmisen Ig:tä vastaan muodostettua loukkua ja jossa koettimena toimi vuohen vasta-aine ihmisen IgG-alkalinen fosfataasi -konjugaattia vastaan). Jos sitoutu-5 misaffiniteettia esiintyikin, oli se huomattavasti pienempi kuin mitä havaittiin ensimmäisen sukupolven vasta-aineella B72,3, jolla oli noin yhtä kertaluokkaa pienempi affiniteetti TAG72:ta kohtaan, kuin joko CC49:llä tai CC83 :11a..

10 Oli yllättävää, että CH84-1 sitoutui TAG72:een sa malla affiniteetilla kuin sen lähtökannat. Tämä uusi vasta-aine muodostettiin laboratoriossamme de novo. eikä sitä ole vielä tavattu luonnossa.

Tämän uuden sekavasta-aineen, CH84-.n spesifisyyden 15 määrittämiseksi suoritettiin kompetitiotutkimuksia. On syytä ottaa huomioon, että sekä CC49:ssä että CC83:ssa esiintyy jonkin verran TAG72-antigeeniin kohdistuvaa kilpailevaa tunnistuskykyä. Havaittiin, että CH84-1 kilpaili TAG72:een sitoutumisessa enemmän CC49:n kanssa kuin mitä 20 se kilpaili CC83:n kanssa. Tämä viittaisi siihen, että TAG72:een sitoutumisen spesifiteetti sijaitsisi kevyessä ketjussa.

Myös ihmisen γ2, -3 ja -4-isotyyppejä muodostettiin tällä sekavasta-aineella ja tuloksena olivat CH84-2-, . 25 CH84-3- ja CH84-4-kloonit.

CC84-1

Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-moinnissa käytetyt menetelmät CC44-l:n konstruktiossa toistettiin seuraavalla poikkeuksella: 30 49K-13-13-solut, joiden soluvärjäyksellä havaittiin tuottavan CC44:n kevyttä ketjua, transformoitiin CH44-l:n transformoinnin yhteydessä kuvatulla tavalla, sillä poikkeuksella, että 20 μg p83vl-2.3:a, CH83:n raskaan ketjun geenin sisältävää pSV2gpt-vektoria käytettiin ρ49γΐ-2.3:η, 94 103477 CH44:n raskaan ketjun geenin sisältävän pSV2gpt-vektorin sijasta.

CC84-2

Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-5 moinnissa käytetyt menetelmät CH84-l:n konstruktiossa toistettiin sillä poikkeuksella, että 20 μg p83-y2:ta käytettiin ρ83-γ1-2.3:η sijasta.

CC84-3

Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-10 moinnissa käytetyt menetelmät CH84-l:n konstruktiossa toistettiin sillä poikkeuksella, että 20 μg p83-y3:a käytettiin ρ83-γΐ-2.3:η sijasta.

CC84-4

Sp2/0-plasmasytoomasolujen peräkkäisessä transfor-15 moinnissa käytetyt menetelmät CH84-l:n konstruktiossa toistettiin sillä poikkeuksella, että 20 μg p83-Y4:ää käytettiin ρ83-γ1-2.3:η sijasta.

Rekombinattivasta-aineiden puhdistus

Kimeerisiä vasta-aineita ilmentävät solut poistet-20 tiin viljelyliuoksesta sentrifugoimalla ja liuos suodatettiin 0,2 μτη suodattimen läpi. Kimeeriset vasta-aineet puhdistettiin viljelmän supernatanteista kahdessa vaiheessa. Ensimmäisessä puhdistusvaiheessa käytettiin proteiini A -affinitettipakkausta (Nygene Corporation, Yonkers, NY) . 25 valmistajan ohjeiden mukaisesti. Korkeintaan 1,0 1 viljel män supernatanttia päästettiin 5 millilitran minuuttino-peudella 1 mg:n kapasiteetin omaavan pakkauksen läpi. Pakkaus pestiin fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella lopun albumiinin poistamiseksi. Kimeerinen vas-30 ta-aine saatiin eluoimalla 0,1 M natriumnitraattipuskuri-’ liuoksella, pH 3,0. Kimeerisen vasta-aineen sisältävien fraktioiden pH säädettiin välittömästi neutraaliksi 1 M:11a Trizma-emäsliuoksella. Lopullinen puhdistus saatiin aikaan tästä liuoksesta geelisuodatuksella käyttäen Phar-35 macia Superose 12 HR 16/50 -pylvästä valmistajan (Phar- 95 103477 macia, Piscataway, NJ) ohjeiden mukaan, Amicon centricon 30 -laitteella suoritetun konsentroinnin jälkeen.

Esimerkki:

Hiiren ituradan V„aTAG:n vaihtelevan alueen sisäl-5 tävän immunoglobuliinin muodostaminen

Seuraavissa esimerkeissä on esitetty alan ammattimiesten käyttöön toistettava menetelmä VHaTAG:ista peräisin olevan DNA-jakson koodaaman vasta-aineen valmistamiseksi.

Ilmentymiskykyisen VBaTAG:n raskaan ketjun geenin 10 komponentit

On mahdollista muodostaa kimeerinen hiiri-ihmisvas-ta-aine, joka sisältää hiiren V„oTAG:n ituradan raskaan ketjun vaihtelevan alueen, VHaTAG VH:lle komplementaarisen kevyen ketjun vaihtelevan alueen, kuten joko CC49:n tai 15 CC83:n hiiren vaihtelevan alueen ja ihmisen muuttumattomat alueet.

2,2 ke:n V„aTAG VH:n eksonijakson sisältävää ituradan Hind III-DNA-fragmenttia käytetään templaattina, jotta saadaan funktionaalisesti uudelleenjärjestynyt VHaTAG:n 20 vaihteleva alue. Hiiren genomin ιΤ-0μ-ίη^οηί3ΐη6^3 käytetään lähteenä hiiren raskaan ketjun tehostajajaksoille. Jälkimmäinen jakso saadaan plasmidista pNP9 (katso aiempana ollut esimerkki "CC49:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen eristäminen"). Kuviossa 38 on esitetty hybridigee-. 25 nien rakentamiseen käytetty kokonaisreaktio, joka perustuu julkaisussa Horto et ai. , (1989), yllä, kuvattuun menetel mään. Neljä oligonukleotidia (oligot) on suunniteltu käytettäväksi kohde-DNA:n entsyymeillä suoritettavaan monistukseen ja muunteluun. Oligonukleotidi 1 yhtyy pituus-30 suunnassa VHaTAG:n 5'-päähän kattaen Eco R I kohdan, joka : on 249 ep:a ATG-koodisanasta 5'-päätä kohti. Oligonukleo tidi 2 yhtyy VHaTAG:n eksonin 3'-päälle komplementaarisiin jaksoihin ja sisältää myös D-segmenttiä koodaavat jaksot. Oligonukleotidi 2:ssa olevat D-segmentin jaksot eivät yhdy 35 mihinkään VHaTAG:n jaksoon. Oligonukleotidi 3 sisältää hii- 96 103477 ren genomin δ-Ωμ-Άΐ^θη 5'-päälle komplementaariset jaksot ja siihen kuuluvat D-segmenttiä (sama kuin oligonukleotidi 2:ssa) ja J-segmenttiä koodaavat jaksot. Oligonukleotidi 4 yhtyy ιΤ-Ομ-βΙηββη 3 '-päähän ja sisältää 1219 ep: a JH4 : stä 5 3'-päätä kohti sijaitsevalle Eco R I -kohdalle komplemen taariset jaksot. Näiden oligonukleotidien jaksot ovat seu-raavat:

Oligonukleotidi 1 5 ' GTCTAGAATTCATAAAAACTTTATG (25-meeri)

Oligonukleotidi 2 CAGTGTATTTCTGTAAAAGATCTACTATGGTTACG

10 (35-meeri)

Oligonukleotidi 3 5 1TCTACTATGGTTACGTGGGGTCAAGGAACCTCAGT- CACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGCCTCTCCAGGTCT 3' (72-meeri) Oligonukleotidi 4 5' ACTTCTAAAATGTATTTAGAATTCATTTTC 3' Tässä esimerkissä D-jakso on SP2,3, joka on otettu 15 julkaisussa Kurosawa ja Tonegava (1982), J. Exp. Med. 155, 201 julkaistusta jaksosta. Oligonukleotideissä 2 ja 3 D-jakso on esitetty lihavoituna. Mitä tahansa muuta luonnehdittua hiiren tai ihmisen D-segmenttiä voidaan käyttää korvaamalla niillä näissä asemissa oligonukleotideissä 2 20 ja 3 esiintyneet segmentit.

J-segmentti oligonukleotidissä 3 on alleviivattu. Se on julkaisussa Gough ja Bernard, (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 78, 509 julkaistusta jaksosta otettu hiiren JH4-segmentti. Mikä tahansa muu hiiren tai ihmisen J-.· 25 segmentti voidaan liittää korvaamalla niillä oligonukleo- tidissa 3 esiintynyt JH4-segmentti.

Oligonukleotideissä 1 ja 4 Eco R I -kohdat (GAATTC) on esitetty kursivoituna.

Intaktien V„aTAG-geenien kokoaminen 30 Suoritettiin kaksi erillistä DNA-monistusreaktiota *. käyttäen yllä kuvattuja komponentteja. DNA-monistusreaktio 1 kopioi V„aTAG-jakson ja liittää D-segmentin sen 3'-päähän. DNA-monistusreaktio 2 kopioi raskaan ketjun tehosta-jajaksot sisältävät hiiren intronijaksot ja liittää oligo-35 nukleotidin 3 koodaamat D- ja J-segmentit. Reaktioiden 1 103477 97 ja 2 tuloksena olleet monistetut tuotteet puhdistetaan geelissä, yhdistetään ja oligonukleotidit 1 ja 4 lisätään reaktion 3 aloittamiseksi. Reaktiossa 3 reaktioiden 1 ja 2 tuotteet yhtyvät pituussuunnassa yhteisten D-jaksojensa 5 muodostaman sillan välityksellä. Tämän jälkeen oligonuk-leotideista 1 ja 4 suoritettu DNA-monistus saa aikaan kuvion 38 alaosassa esitetyn tuotteen. Tämä fragmentti pilkotaan käyttäen Eco R I-.tä ja se puhdistetaan geelissä. Muunnettu VHaTAG-fragmentti liitetään ligaasilla pSV2gpt 10 1(2.3) :n Eco R I -kohtaan yllä olevan esimerkin "Raskaan ketjun kimeeriset konstruktiot" mukaisesti. Koko VHoTAG-D-J-tehostaja-alueen sisältävä fragmentti sekvenssoidaan täydellisesti, jotta voidaan varmistua, ettei DNA-monis-tusreaktioiden aikana ole päässyt tapahtumaan mutaatioita. 15 Muut kolme raskaan ketjun γ-isotyypit voidaan muodostaa liittämällä ligaasilla sama muunnettu VHaTAG-fragmentti muihin kolmeen γ-.n sisältävään pSV2gpt-vektoriin (pSV2gpt-γ2, pSV2gpt-y3, pSV2gpt-y4).

Muunnetun V„aTAG-geenin ilmentyminen 20 Plasmideja sisältävä muunnettu VHaTAG-geeni voidaan linearisoida Nde I:llä ja viedä elektroporaation välityksellä kimeerisiin CC49:n ja CC83:n kevyttä ketjua ilmentäviin solulinjoihin (katso yllä oleva esimerkki "C. Kohde-transformaatiot") . Transformoidut solut valikoidaan kasvun . 25 suhteen genetisiinin ja mykofenolihapon läsnä ollessa esi merkissä "C. Kohdetransformaatiot" kuvatulla tavalla. Ilmennetyn vasta-aineen esiintymistä tarkkaillaan TAG72 ELISA:11a (katso kohta "Tulokset, Entsyymivälitteiset im-munomääritykset (ELISA)"). Näissä soluissa ilmennetty vas-30 ta-aine sisältää ihmisen Ig:n muuttumattomat γΐ,κ -alueet, joissa on CC49:n tai CC83:n kevyen ketjun vaihteleva alue, ja muunnetuista ituradan VHaTAG VH:n eksoneista peräisin olevan raskaan ketjun vaihtelevan alueen.

4 98 103477

Alla on esitetty neljä esimerkkiä muunnetuista VHaTAG:n raskaan ketjun vaihtelevan alueen konstruktioista, joissa on erilaisia D- ja J-segmenttejä.

V„- segmentti D-segmentti_J-segmentti

5 VHaTAG #i hiiren D (SP2,3) hiiren J

VHaTAG #ii ihmisen D (Dl) hiiren J

V„aTAG #iii hiiren D (SP2,3) ihmisen J

VHaTAG #iv ihmisen D (Dl) ihmisen J

10 Ihmisen D-jakso Dl saatiin julkaisusta Siebenlist, et ai..

(1981) Nature, 294, 631. Ihmisen JH1-jakso saatiin julkaisusta Ravetch, et ai.. (1981) Cell 27, 583.

VHaTAG #i:n muodostaminen on kuvattu taulukossa esitetyillä oligonukleotideilla 1-4. VHocTAG:ien #ii - #iv 15 muodostamiseksi vastaavat D- ja J-segmentit täytyy vaihtaa oligonukleotideissa 2 ja 3. Seuraavissa oligonukleoti- deissa nämä muutokset on esitetty. Näiden oligonukleoti-dien korvaamisen reaktioissa 1 ja 2 tuloksena muodostuvat VH0tTAG: t #ii - #iv.

20 VHaTAG #ii

Oligonukleotidi 2 5' CAGTGTATTTCTGTAAAAGAGTACTGGTGGT

(34-meeri)

Oligonukleotidi 3 5' GTACTGGTGGTGTATTGGGGTCAAGGAACC

TCAGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGCCT 25 CTCCAGGTCT 3' (72-meeri) VHaTAG #iii

Oligonukleotidi 2 5' CAGTGTATTTCTGTAAAAGATCTACTATGG

TTACG (35-meeri)

Oligonukleotidi 3 5' TCTACTATGGTTACGTGGGGCCAGGGCAC

3 0 CCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGCCTCTC- CAGGTCT 3' (72-meeri) VBaTAG #iv

Oligonukleotidi 2 5' CAGTGTATTTCTGTAAAAGAGTACTGGTG

GTGTAT (35-meeri) 99 103477

Oligonukleotidi 3 5' GTACTGGTGGTGTATTGGGGCCAGGGCAC

CCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAATGGC CTCTCCAGGTCT 3' (72-meeri)

Tulokset 5 A. Kimeeristä vasta-ainetta tuottavat solulinjat

Kevyiden ja raskaiden vasta-aineiden samanaikainen tunnistus suoritettiin käyttämällä kahta koetinvasta-ai-netta: 1) Fluoresoivalla FITC-väriaineella leimattu vuohen 10 vasta-aine ihmisen kappaa vastaan ja, 2) Fluoresoivalla TRITC-väriaineella leimattu vuohen vasta-aine ihmisen IgG:tä vastaan.

Solulinjat, joilla oli positiivinen reaktio sekä raskaiden että kevyiden ketjujen suhteen testattiin lisäk-15 si niihin liittyvän kimeerisen immunoglobuliinin tuoton suhteen ja biologisen aktiivisuuden eli niiden sitoutumisen suhteen TAG72:een.

Entsyymivälitteiset immunomääritykset (ELISA) ELISA-menetelmää käytettiin kimeeristä monoklonaa-20 lista vasta-ainetta tuottavan transformoidun solun valitsemiseen. Raskaan ja kevyen ketjun lääkeainevalikointiin tehdyt konstruktiot sisältäviä klooneja valikoitiin niiden kasvun perusteella valikoivassa viljelyliuoksessa. Testattiin seuraavat solulinjat (1) CH44-1: solulinja, jossa on 25 CC49 VH, CC49 VL ja IgG^n muuttumaton alue, (2) CH44-2: solulinja, jossa on CC49 VH, CC4 9 VL ja IgG2:n muuttumaton alue, (3) CH44-4: solulinja, jossa on CC49 VH, CC49 VL ja IgG4:n muuttumaton alue, (4) CH88-1: solulinja, jossa on VH, CC83 VL ja IgG-^n muuttumaton alue, (5) CH88-2: solulin-3 0 ja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG2:n muuttumaton alue, (6) CH88-3: solulinja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG3:n muuttumaton alue, (7) CH88-4: solulinja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG4:n muuttumaton alue, (8) CH84-1: solulinja, jossa on CC83 VH, CC49 VL ja IgGj_:n muuttumaton alue, (9) 35 CH84-2: solulinja, jossa on CC83 VH, CC4 9 VL ja IgG2:n muut- 10. 103477 tumaton alue, (10) CH84-3: solulinja, jossa on CC83 VH, CC4 9 VL ja IgG3:n muuttumaton alue ja (11) CH84-4: solulinja, jossa on CC83 VH, CC4 9 VL ja IgG4:n muuttumaton alue.

Näiden viljelmien supernatanteille suoritettiin 5 ELISA. Kimeerisen TAG72-vasta-aineen vasta-aineen esiintyminen mitattiin suoraan reaktiolla, jossa käytettiin ylimäärin entsyymillä, kuten alkalisella fosfataasilla, leimattua vuohen ihmisen IgG-vasta-aineen vasta-ainetta sen jälkeen, kun kimeerisen TAG72-vasta-aineen vasta-ai-10 neen oli annettu sitoutua antigeenillä (TAG72) päällystettyihin mikrotiitterikuoppiin. TAG72-vasta-aineaktiivisuus määritettiin, jotta saatiin arvosteluperuste onnistuneelle rekombinaatiolle.

14 päivän kasvatuksen jälkeen otettiin 50 μΐ jatko-15 kloonattuja soluja sisältävien kuoppien supernatanteista, joista sitten tehtiin uudelleen ELISA-määritykset TAG-si-toutumisen suhteen. Näytteet (50 μΐ) lääkeaineille resistenttien solulinjojen supernatanteista vietiin Nunc Immu-lon 96-kuoppaisten levyjen kuoppiin, jotka oli aiemmin 20 päällystetty TAG-antigeenillä (laimennettu 1/50). Sitoutumattoman materiaalin poistamiseksi suoritetun pesun jälkeen kuoppia inkuboitiin käyttäen koettimena vuohen ihmisen alkalisen fosfataasilla konjugoidun vuohen ihmisen IgG-vasta-aineen vasta-ainetta (GAHIgG-AP) ihmisen TAG-25 antigeeniin sitoutuneiden levyyn immobilisoituneiden ki-meeristen vasta-aineiden muuttumattomien alueiden tunnistamiseksi. Toinen pesukerta, jota seurasi kromogeenisen alkalisen fosfataasisubstraatin lisääminen, sitoutumattoman koettimen (GAHIgG-AP) poistamiseksi mahdollisti värin 30 kehittymisen niissä kuopissa, joissa oli ihmisen muuttu mattomiin alueisiin liittynyttä TAG-sitoutumiskykyä (toisin sanoen kimeerisiä vasta-aineita TAG72:ta vastaan). 405 nm alueelta saadut absorbanssilukemat osoittavat lääkeaineille resistenttejen solulinjojen kimeerisen vasta-aineen 35 suhteellisen tuoton.

101 103477 CH44-1 TAG72:n vastaan suunnattua aktiivisuutta käytettiin onnistuneen rekombinaation arvosteluperusteena. Mikrotiit-terimaljojen kuopat päällystettiin TAG:llä inkuboimalla 5 50 /il :11a 1:75 laimennettua puhdistettua TAG72:ta [Murano, R., et ai. . (1988) Cancer Research 48 4588 - 4596] 18 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen kuopat pestiin 4 kertaa fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS), jonka jälkeen ne suojattiin BSA:lla in-10 kuboimalla 50 /il :11a PBS-liuosta, jossa oli 0,5-%:ista BSA:ta, 2 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa, jonka jälkeen ne pestiin neljä kertaa PBS:llä. Nämä maljat pysyvät muuttumattomina, jos niitä säilytetään kosteina 4 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen kuhunkin kuoppaan lisätään 50 mik-15 rolitraa näytettä. Kontrollimaljana käytetään maljaa, joka sisältää tuoretta liuosta. Kaikkia näytteitä inkuboitiin joko maljassa 37 °C:n lämpötilassa 90 minuutin ajan tai suljetussa astiassa 4 °C:n lämpötilassa yön yli.

Tämän jälkeen maljat pestiin 4 kertaa PBS:llä ja 20 kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 μΐ 1:250 laimennettua al- kalisen fosfataasin kanssa konjugoidun vuohen ihmisen IgG-vasta-aineen vasta-ainetta (Southern Biotech Assoc.). Liuosta inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa 90 minuutin ajan. Koettimen poistamiseksi suoritetun 4-kertaisen pesun jäl-25 keen tarkasteltiin värin kehittymistä.

Värin kehittymisen aikaansaamiseksi substraattia inkuboitiin huoneen lämpötilassa 6 minuutin ajan 200 /xl:ssa etanoliamiinilla puskuroidussa substraattia, p-nitrofenyylifosfaattia (Kirkegaard ja Perry), sisältä-30 vässä fysiologisessa suolaliuoksessa. Optinen tiheys 450 nm:ssä mitattiin kustakin levystä Dynatechin mikro-tiitterilevylukijalla (Dynatech Inc.).

Kimeerisen vasta-aineen TAG72-sitomisaktiviteettia osoittavia supernatantteja sisältävissä kuopissa olevia 35 Sp2/0-pesäkkeistä jatkokloonattiin äärilaimennuksella.

103477 102

Suhteellisen suuren kimeerisen vasta-aineen tuottokyvyn perusteella valittiin yksittäisiä jatkoklooneja.

CH44-2 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä 5 toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy tettiin CH44-2:ta.

CH44-3 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy- 10 tettiin CH44-3:a.

CH44-4 CH44-1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH44-4:ää.

15 CH88-1 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH88-1:tä.

20 CH88-2 CH44-1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy tettiin CH88-2:ta.

CH88-3 25 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy tettiin CH88- 3:a.

CH88-4 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä 30 toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy tettiin CH88-4:ää.

CH84-1 CH44-1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy- 35 tettiin CH84-l:tä.

X03 103477 CH84-2 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH84-2:ta.

5 CH84-3 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH88-3:a.

CH84-4 10 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH84-4:ää.

CH48-1 15 CH4 4 -1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH84-4:ää.

Karsinoomaan ohjautuminen in vivo

Eläinkokeissa käytetyt ja myöhempänä tulevissa tau-20 lukoissa 1-4 esitetyt kimeeriset monoklonaaliset vasta-aineet leimattiin Na125I:llä käyttäen Iodogeniä (Pierce Chemical, Rockford, IL). Tarkemmin sanottuna noin 0,5 -2 mg puhdistettuja kimeerisiä monoklonaalisia vasta-aineita sisältävän 0,1 M natriumfosfaattiliuoksen tilavuus säädet-·· 25 tiin 0,5 ml:ksi, jonka jälkeen se lisättiin 12 cm x 75 cm kokoiseen 50 ^g:lla Iodogeniä päällystettyyn lasiputkeen, jonka jälkeen lisättiin 0,1 - 0,5 mCi Na125I:a (New England Nuclear, Boston, MA). 2 minuutin huoneenlämmössä tapahtuneen inkuboinnin jälkeen proteiini poistettiin liukenemat-30 tomasta Iodogenistä ja liittymättä jäänyt 125I erotettiin vasta-aineesta geelisuodattamalla se 10 ml:n SephadexMT G-25 -kolonnin läpi käyttäen PBS:ää puskuriliuoksena. Jodi-tusprotokollan tuloksena saatiin leimattu kimeerinen IgG-vasta-aine, jonka spesifinen aktivisuus oli 0,05 - 0,2 35 μCi/μg.

103477 104 ‘

Naaraspuoliset taustaltaan CDl-tyyppiset kateen-korvan suhteen vaillinaiset hiiret hankittiin Charles Riveriltä noin 4 viikon ikäisinä. Yhdeksän päivän kuluttua hiiriin istutettiin ihonalaisesti (0,1 ml/hiiri) LS174T-5 soluja (1 X 106 solua/eläin).

Kateenkorvan suhteen vaillinaisille 70 - 400 mg painoisille hiirille, joihin oli muodostunut karsinoomia, annettiin noin 12 - 13 päivän kuluttua syöpäsolujen istuttamisesta suonensisäisenä ruiskeena 0,5 - 2,0 μϋΐ (10 -10 50 μς; proteiinia) kimeerisiä monoklonaalisia ylläkuvatulla tavalla joditettuja vasta-aineita PBS-liuoksessa. Viiden hiiren ryhmiä lopetettiin eri aikoina laskemalla niistä veri, normaalit ja karsinoomakudokset leikattiin irti ja punnittiin, sekä pulssimäärät minuuttia kohti mitattiin 15 gammalaskurilla. Kunkin kudoksen pulssimäärät minuuttia kohti määritettiin ja verrattiin karsinoomasta saatuihin tuloksiin.

Tulokset CH44-1:n osalta on esitetty taulukoissa 1 - 2 ja kuvissa 39A, 39B ja 39C. Tulokset CH84-l:n koh-20 dalta on esitetty taulukoissa 3 - 4 ja kuvissa 40A ja 40B.

Prosenttimäärä injektoidusta annoksesta 125l-leimat-tua vasta-ainetta kudosgrammaa kohti Taulukko 1 25 CH44-1

Kudos 0,75 h 23,5 h 49,5 h 122 h veri, koko- 29,70 15,84 8,09 7,31 30 maksa 8,13 4,13 2,19 1,96 perna 6,19 3,39 2,12 1,36 munuainen 4,35 2,80 1,52 1,33 syöpäkasvain 3,31 25,95 28,83 44,16 keuhko 7,34 5,39 2,90 2,36 35 syöpäkasvain, villityyppi 0,18 0,12 0,09 0,11 105 103477

Tulokset A. Kimeeristä vasta-ainetta tuottavat solulinjat

Kevyiden ja raskaiden vasta-aineiden samanaikainen tunnistus suoritettiin käyttämällä kahta koetinvasta-ai-5 netta: 1) Fluoresoivalla FITC-väriaineella leimattu vuohen vasta-aine ihmisen kappaa vastaan ja, 2) Fluoresoivalla TRITC-väriaineella leimattu vuohen vasta-aine ihmisen IgG:tä vastaan.

10 Solulinjat, joilla oli positiivinen reaktio sekä raskaiden että kevyiden ketjujen suhteen testattiin lisäksi niihin liittyvän kimeerisen immunoglobuliinin tuoton suhteen ja biologisen aktiivisuuden eli niiden sitoutumisen suhteen TAG72:een.

15 Entsyymivälitteiset immunomääritykset (ELISA) ELISA-menetelmää käytettiin kimeeristä monoklonaa-lista vasta-ainetta tuottavan transformoidun solun valitsemiseen. Raskaan ja kevyen ketjun lääkeainevalikointiin tehdyt konstruktiot sisältäviä klooneja valikoitiin niiden 20 kasvun perusteella valikoivassa viljelyliuoksessa. Testattiin seuraavat solulinjat (1) CH44-1: solulinja, jossa on CC49 VH, CC49 VL ja IgG3:n muuttumaton alue, (2) CH44-2: solulinja, jossa on CC49 VH, CC49 VL ja IgG2:n muuttumaton alue, (3) CH44-4: solulinja, jossa on CC49 VH, CC49 VL ja • 25 IgG4:n muuttumaton alue, (4) CH88-1: solulinja, jossa on VH, CC83 VL ja IgG^n muuttumaton alue, (5) CH88-2: solulinja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG2:n muuttumaton alue, (6) CH88-3: solulinja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG3:n muuttumaton alue, (7) CH88-4: solulinja, jossa on CC83 VH, 30 CC83 VL ja IgG4:n muuttumaton alue, (8) CH84-1: solulinja, . jossa on CC83 VH; CC4 9 VL ja IgG^n muuttumaton alue, (9) CH84-2: solulinja, jossa on CC83 VH, CC49 VL ja IgG2:n muuttumaton alue, (10) CH84-3: solulinja, jossa on CC83 VH, CC4 9 VL ja IgG3:n muuttumaton alue ja (11) CH84-4: solulin-35 ja, jossa on CC83 VH, CC49 VL ja IgG4.-n muuttumaton alue.

Näiden viljelmien supernatanteille suoritettiin ELISA. Kimeerisen TAG72-vasta-aineen vasta-aineen esiin- 103477 106 tyminen mitattiin suoraan reaktiolla, jossa käytettiin ylimäärin entsyymillä, kuten alkalisella fosfataasilla, leimattua vuohen ihmisen IgG-vasta-aineen vasta-ainetta sen jälkeen, kun kimeerisen TAG72-vasta-aineen vasta-ai-5 neen oli annettu sitoutua antigeenillä (TAG72) päällystettyihin mikrotiitterikuoppiin. TAG72-vasta-aineaktiivisuus määritettiin, jotta saatiin arvosteluperuste onnistuneelle rekombinaatiolle.

14 päivän kasvatuksen jälkeen otettiin 50 μΐ jatko-10 kloonattuja soluja sisältävien kuoppien supernatanteista, joista sitten tehtiin uudelleen ELISA-määritykset TAG-si-toutumisen suhteen. Näytteet (50 μΐ) lääkeaineille resistenttien solulinjojen supernatanteista vietiin Nunc Immu-lon 96-kuoppaisten levyjen kuoppiin, jotka oli aiemmin 15 päällystetty TAG-antigeenillä (laimennettu 1/50) . Sitou tumattoman materiaalin poistamiseksi suoritetun pesun jälkeen kuoppia inkuboitiin käyttäen koettimena vuohen ihmisen alkalisen fosfataasilla konjugoidun vuohen ihmisen IgG-vasta-aineen vasta-ainetta (GAHIgG-AP) ihmisen TAG-20 antigeeniin sitoutuneiden levyyn immobilisoituneiden ki- meeristen vasta-aineiden muuttumattomien alueiden tunnistamiseksi. Toinen pesukerta, jota seurasi kromogeenisen alkalisen fosfataasisubstraatin lisääminen, sitoutumattoman koettimen (GAHIgG-AP) poistamiseksi mahdollisti värin .. 25 kehittymisen niissä kuopissa, joissa oli ihmisen muuttu mattomiin alueisiin liittynyttä TAG-sitoutumiskykyä (toisin sanoen kimeerisiä vasta-aineita TAG72:ta vastaan). 405 nm alueelta saadut absorbanssilukemat osoittavat lääkeaineille resistenttejen solulinjojen kimeerisen vasta-30 aineen suhteellisen tuoton.

CH44-1 TAG72:n vastaan suunnattua aktiivisuutta käytettiin onnistuneen rekombinaation arvosteluperusteena. Mikro-tiitterimaljojen kuopat päällystettiin TAG:llä inkuboimal-35 la 50 μΐ:11a 1:75 laimennettua puhdistettua TAG72:a [Mura-no, R., et ai., (1988) Cancer Research 48 4588 - 4596] 18 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen kuopat 103477 107 pestiin 4 kertaa fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS), jonka jälkeen ne suojattiin BSArlla inkuboimalla 50 μΐ-.lla PBS-liuosta, jossa oli 0,5-%:ista BSA:ta, 2 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa, jonka jälkeen 5 ne pestiin neljä kertaa PBS:llä. Nämä maljat pysyvät muuttumattomina, jos niitä säilytetään kosteina 4 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen kuhunkin kuoppaan lisätään 50 mikrolitraa näytettä. Kontrollimaljana käytetään maljaa, joka sisältää tuoretta liuosta. Kaikkia näytteitä inku-10 boitiin joko maljassa 37 °C:n lämpötilassa 90 minuutin ajan tai suljetussa astiassa 4 °C:n lämpötilassa yön yli.

Tämän jälkeen maljat pestiin 4 kertaa PBS:llä ja kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 μΐ 1:250 laimennettua al-kalisen fosfataasin kanssa konjugoidun vuohen ihmisen igG-15 vasta-aineen vasta-ainetta (Southern Biotech Assoc.).

Liuosta inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa 90 minuutin ajan. Koettimen poistamiseksi suoritetun 4-kertaisen pesun jälkeen tarkasteltiin värin kehittymistä.

Värin kehittymisen aikaansaamiseksi substraattia 20 inkuboitiin huoneen lämpötilassa 6 minuutin ajan 200 μΐ-.ssa etanoliamiinilla puskuroidussa substraattia, p-nitrofenyylifosfaattia (Kirkegaard ja Perry), sisältävässä fysiologisessa suolaliuoksessa. Optinen tiheys 450 nm:ssä mitattiin kustakin levystä Dynatechin mikrotiitterilevy-. 25 lukijalla (Dynatech Inc.).

Kimeerisen vasta-aineen TAG72-sitomisaktiviteettia osoittavia supernatantteja sisältävissä kuopissa olevia Sp2/0-pesäkkeistä jatkokloonattiin äärilaimennuksella. Suhteellisen suuren kimeerisen vasta-aineen tuottokyvyn 30 perusteella valittiin yksittäisiä jatkoklooneja.

CH44-2 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH44-2:ta.

108 103477 CH44-3 CH44-1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH4 4-3:a.

5 CH44-4 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH44-4:ää.

CH88-1 10 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH88-l:tä.

CH88-2 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä 15 toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy tettiin CH88-2:ta.

CH88-3 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy- 20 tettiin CH88-3:a.

CH88-4 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH88-4:ää.

25 CH84-1 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH84-1:tä.

CH84-2 30 CH44-l:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy tettiin CH84-2:a.

CH84-3 CH44-1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä 35 toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käy tettiin CH88-3:a.

109 103477 CH84-4 CH4 4 -1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH84-4:ää.

5 CH48-1 CH44-1:n kohdalla käytetty TAG-ELISA-menetelmä toistettiin sillä poikkeuksella, että vasta-aineena käytettiin CH84-4:ää.

Karsinoomaan ohjautuminen in vivo 10 Eläinkokeissa käytetyt ja myöhempänä tulevissa tau lukoissa 1-4 esitetyt kimeeriset monoklonaaliset vasta-aineet leimattiin Na125I:llä käyttäen Iodogeniä (Pierce Chemical, Rockford, IL). Tarkemmin sanottuna noin 0,5 -2 mg puhdistettuja kimeerisiä monoklonaalisia vasta-aineita 15 sisältävän 0,1 M natriumfosfaattiliuoksen tilavuus säädettiin 0,5 mlrksi, jonka jälkeen se lisättiin 12 cm x 75 cm kokoiseen 50 μg:lla Iodogeniä päällystettyyn lasiputkeen, jonka jälkeen lisättiin 0,1 - 0,5 mCi Na125I:a (New England Nuclear, Boston, MA). 2 minuutin huoneenlämmössä tapahtu- 20 neen inkuboinnin jälkeen proteiini poistettiin liukenemattomasta Iodogenistä ja liittymättä jäänyt 125I erotettiin vasta-aineesta geelisuodattamalla se 10 ml:n Sephadex*1- G-25 -kolonnin läpi käyttäen PBS:ää puskuriliuoksena. Jodi-tusprotokollan tuloksena saatiin leimattu kimeerinen IgG-.. 25 vasta-aine, jonka spesifinen aktivisuus oli 0,05 - 0,2 μCi/μg.

Naaraspuoliset taustaltaan CD1-tyyppiset kateen-korvan suhteen vaillinaiset hiiret hankittiin Charles Riveriltä noin 4 viikon ikäisinä. Yhdeksän päivän kulut-30 tua hiiriin istutettiin ihonalaisesti (0,1 ml/hiiri) LS174T-soluja (1 X 106 solua/eläin).

»

Kateenkorvan suhteen vaillinaisille 70 - 400 mg painoisille hiirille, joihin oli muodostunut karsinoomia, annettiin noin 12 - 13 päivän kuluttua syöpäsolujen istut-35 tamisesta suonensisäisenä ruiskeena 0,5 - 2,0 μ^ (10 - no 103477 50 /ig proteiinia) kimeerisiä monoklonaalisia ylläkuvatulla tavalla joditettuja vasta-aineita PBS-liuoksessa. Viiden hiiren ryhmiä lopetettiin eri aikoina laskemalla niistä veri, normaalit ja karsinoomakudokset leikattiin irti ja 5 punnittiin, sekä iskumäärät minuuttia kohti mitattiin gam-malaskurilla. Kunkin kudoksen iskumäärät minuuttia kohti määritettiin ja verrattiin karsinoomasta saatuihin tuloksiin .

Tulokset CH44-1:n osalta on esitetty taulukoissa 10 1 - 2 ja kuvissa 39A, 39B ja 39C. Tulokset CH84-l:n koh dalta on esitetty taulukoissa 3-4 ja kuvissa 40A ja 40B.

Prosenttimäärä injektoidusta annoksesta 125I-leimattua vasta-ainetta kudosgrammaa kohti Taulukko 1 15 ---------------------------------------------- CH44-1

Kudos 0,75 h 23,5 h 49,5 h 122 h 20 veri, koko- 29,70 15,84 8,09 7,31 maksa 8,13 4,13 2,19 1,96 perna 6,19 3,39 2,12 1,36 munuainen 4,35 2,80 1,52 1,33 syöpäkasvain 3,31 25,95 28,83 44,16 ·: 25 keuhko 7,34 5,39 2,90 2,36 syöpäkasvain, villityyppi 0,18 0,12 0,09 0,11

Kuten taulukossa 1 on esitetty, noin 122 tunnin 30 kuluttua injektiosta syöpäkasvaimen sisältämä prosenttimäärä injektoidusta annoksesta oli 44,16 prosenttia CH44-l:n osalta. Tämän perusteella CH44-1 ohjautui tehokkaasti ihmisen syöpäkasvaimeen in situ. Tämä osoittaa, että tämän keksinnön mukaiset kimeeriset monoklonaaliset vasta-aineet 35 ohjautuivat tehokkaasti karsinoomaan in vivo.

Prosenttimäärä injektoidusta annoksesta “^-leimat tua vasta-ainetta elintä kohti

Taulukko 2 103477 111 5 CH44-1

Kudos 0,75 h 23,5 h 49,5 h 122 h veri, koko- 47,72 23,03 13,29 12,01 10 maksa 10,97 5,20 3,20 2,69 perna 1,09 0,48 0,25 0,22 munuainen 1,25 0,72 0,42 0,40 syöpäkasvain 0,57 3,085 2,823 4,55 keuhko 1,20 0,87 0,57 0,37 15 ruoansulatuskanava 6,64 4,78 3,96 2,83 ruho 43,17 49,68 35,35 29,95 koko ruumiin 20 retentio 91,30 76,34 53,28 46,20

Kuten taulukossa 2 on esitetty, noin 122 tunnin kuluttua injektiosta syöpäkasvaimen sisältämä prosenttimäärä injektoidusta annoksesta oli 4,55 prosenttia CH44-·: 25 l:n osalta. Tämän perusteella CH84-1 ohjautui tehokkaasti ihmisen syöpäkasvaimeen in situ. Tämä osoittaa, että tämän keksinnön mukaiset kimeeriset monoklonaaliset vasta-aineet ohjautuivat tehokkaasti karsinoomaan in vivo ja ovat siten käyttökelpoisia syövän in vivo -hoidossa.

Prosenttimäärä injektoidusta annoksesta 125I-leimat- tua vasta-ainetta kudosgraxnmaa kohti

Taulukko 3 103477 112 5 CH84-1

Kudos 1 h 23 h 47 h 118-119 h veri, koko- 30,68 15,65 6,74 6,49 10 maksa 12,55 4,26 2,35 1,57 perna 10,93 3,35 2,56 1,70 munuainen 5,59 2,51 1,53 1,55 syöpäkasvain 4,06 20,52 17,58 30,27 keuhko 10,77 4,80 2,58 2,24 15 syöpäkasvain, villityyppi 0,15 0,22 0,20 0,24

Kuten taulukossa 3 on esitetty, noin 118 tunnin kuluttua injektiosta syöpäkasvaimen sisältämä prosentti-20 määrä injektoidusta annoksesta oli 30,27 prosenttia CH84- l:n osalta. Tämän perusteella CH84-1 ohjautui tehokkaasti ihmisen syöpäkasvaimeen in situ. Tämä osoittaa, että tämän keksinnön mukaiset kimeeriset monoklonaaliset vasta-aineet ohjautuivat tehokkaasti karsinoomaan in vivo ja ovat siten .. 25 käyttökelpoisia syövän in vivo -hoidossa.

Prosenttimäärä injektoidusta annoksesta 125I-leimat- tua vasta-ainetta elintä kohti

Taulukko 4 113 103477 5 CH84-1

Kudos 1 h 23 h 47 h 118-119 h veri, koko- 45,98 22,11 10,08 9,371 10 maksa 13,64 5,34 3,13 1,94 perna 1,35 0,49 0,32 0,16 munuainen 1,39 0,62 0,38 0,38 syöpäkasvain 0,59 4,335 3,633 7,02 keuhko 1,77 0,69 0,42 0,31 15 ruuansulatuskanava 7,38 4,92 3,41 2,32 ruho 44,83 52,19 30,32 24,06 koko ruumiin 20 retentio 93,58 81,00 47,14 45,48

Kuten taulukossa 4 on esitetty, noin 118 tunnin kuluttua injektiosta syöpäkasvaimen sisältämä prosenttimäärä injektoidusta annoksesta oli 7,02 prosenttia CH84-• 25 1:n osalta. Tämän perusteella CH84-1 ohjautui tehokkaasti ihmisen syöpäkasvaimeen in situ. Tämä osoittaa että tämän keksinnön mukaiset kimeeriset monoklonaaliset vasta-aineet ohjautuivat tehokkaasti karsinoomaan in vivo ja ovat siten käyttökelpoisia syövän in vivo -hoidossa.

30 Kimeerlslä vasta-aineita tuottavien solulinjojen talletus

Esimerkeissä valmistetut yksitoista kuvaavaa esimerkkiä kimeerisiä vasta-aineita erittävistä kevyen kappa-ketjun omaavista solulinjoista talletettiin talletuslai-35 tokseen American Type Culture Collection (ATCC) lokakuun 103477 114 19. päivänä 1988. Tarkemmin sanottuna seuraavat solulinjat on talletettu: (1) CH44-1: solulinja, jossa on CC49 VH, CC49 VL ja IgG-^n muuttumaton alue (ATCC no. HB 9884), (2) CH44-2: solulinja, jossa on CC49 VH, CC49 VL ja IgG2:n 5 muuttumaton alue (ATCC nro HB 9880), (3) CH44-4: solulin ja, jossa on CC4 9 VH, CC4 9 VL ja IgG4:n muuttumaton alue (ATCC nro 9877), (4) CH88-1: solulinja, jossa on VH, CC83 VL ja IgGx:n muuttumaton alue (ATCC nro 9882), (5) CH88-2: solulinja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG2:n muuttumaton 10 alue (ATCC nro 9881), (6) CH88-3: solulinja, jossa on CC83 VH, CC83 VL ja IgG3:n muuttumaton alue (ATCC nro 9876), (7) CH88-4: solulinja, jossa on CC83 VH/ CC83 VL ja IgG4:n muuttumaton alue (ATCC nro 9874), (8) CH84-1: solulinja,

jossa on CC83 VH, CC4 9 VL ja IgG-^n muuttumaton alue (ATCC 15 nro 9883), (9) CH84-2: solulinja, jossa on CC83 VH, CC49 VL

ja IgG2:n muuttumaton alue (ATCC nro 9879), (10) CH84-3: solulinja, jossa on CC83 VH, CC49 VL ja IgG3:n muuttumaton alue (ATCC nro 9878) ja (11) CH84-4: solulinja, jossa on CC83 VH, CC49 VL ja IgG4:n muuttumaton alue (ATCC nro 9875) . 20 Vaikka tämä keksintö on kuvattu yksityiskohtaisesti ja viittauksin sen erityisiin sovellutusmuotoihin, on ammattimiehelle kuitenkin selvää, että useita erilaisia muutoksia ja modifikaatioita voidaan tehdä poikkeamatta patenttivaatimusten hengestä ja suojapiiristä.

Claims (6)

103477

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen vasta-aineen tai sen fragmentin valmistamiseksi, joka pystyy 5 reagoimaan selektiivisesti TAG72-antigeenin kanssa, tunnettu siitä, että viljellään jotakin solulin-joista CH44-1 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880), CH44-4 (ATCC HB 9877), CH 88-1 (ATCC HB 9882), CH 88-2 (ATCC HB 9881), CH 88-3 (ATCC HB 9876), CH 88-4 (ATCC HB 9874), CH 10 84-1 (ATCC HB 9883), CH 84-2 (ATCC HB 9879), CH 84-3 (ATCC HB 9878) tai CH 84-4 (ATCC HB 9875) ja otetaan talteen tuotettu vasta-aine.

2. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen vasta-aine- tai vasta-ainefragmenttikonjugaatin valmistamiseksi, 15 tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukainen vasta-aine tai vasta-ainefragmentti konjugoidaan terapeuttiseen aineeseen.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että terapeuttinen aine on radionuklidi, 20 lääkeaine tai biologisen vasteen modifioija, toksiini tai toinen vasta-aine.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lääkeaine tai biologisen vasteen modifioija on metotreksaatti, adriamysiini tai lymfokiini.

5. Solulinja CH44-1 (ATCC HB 9884), CH44-2 (ATCC HB 9880), CH44-4 (ATCC HB 9877), CH 88-1 (ATCC HB 9882), CH 88-2 (ATCC HB 9881), CH 88-3 (ATCC HB 9876), CH 88-4 (ATCC HB 9874), CH 84-1 (ATCC HB 9883), CH 84-2 (ATCC HB 9879), CH 84-3 (ATCC HB 9878) tai CH 84-4 (ATCC HB 9875) . 103477