BRPI0608468A2 - moléculas de ligação a antìgeno direcionadas a mcsp e tendo afinidade de ligação a receptor de fc e função efetora aumentadas - Google Patents

Abstract

MOLéCULAS DE LIGAçãO A ANTìGENO DIRECIONADAS A MCSP E TENDO AFINIDADE DE LIGAçãO A RECEPTOR DE Fc E FUNçãO EFETORA AUMENTADAS. A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a antígeno (ABMs). Em concretizações particulares, a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais recom binantes, incluindo anticorpos quiméricos, primatizados ou humanizados, específicos para MCSP humano. Além disso, a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nuclélco que codificam tais ABMs, e vetores e células de hospedeiro compreendendo tais moléculas de ácido nucléico. A invenção refere-se adicionalmente a métodos para a produção das ABMs da invenção, e a métodos de uso destas ABMs no tratamento de doença. Além disso, a presente invenção refere-se a ABMs com glicosilação modificada tendo propriedades terapêuticas aperfeiçoadas, incluindo anticorpos com ligação a receptor de Fc aumentada e função de efetor aumentada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DIRECIONADAS A MCSP E TENDO AFINIDADE DE LIGAÇÃO A RECEPTOR DE Fc E FUNÇÃO EFETORA AUMENTADAS".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a antígeno (ABMs). Em concretizações particulares, a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais recombinantes, incluindo anticorpos quiméricos, primatizados e humanizados, específicos para o antígeno associado a mela-noma de elevado peso molecular (HMW-MAA), também conhecido como o proteoglicano de sulfato de condroitina de melanoma (MCSP). Além disso, a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico que codificam tais ABMs, e vetores e células de hospedeiro compreendendo tais moléculas de ácido nucléico. A invenção refere-se adicionalmente a métodos para a produção das ABMs da invenção, e a métodos de uso destas ABMs no tratamento de doença. Além disso, a presente invenção refere-se a ABMs com glicosilação modificada tendo propriedades terapêuticas aperfeiçoadas, incluindo anticorpos com ligação a receptor de Fc aumentada e função de efetor aumentada.

Antecedentes da Técnica

Antígenos Associados a Melanoma

O melanoma maligno é o tipo mais comum de câncer de pele fatal em seres humanos, e sua incidência é estimada a ser crescente em uma taxa de 5% ao ano. Campoli et ai, Crit. Rev. Immunol 24(4):267-296 (Dezembro 2004). A taxa de mortalidade também aumentou ao longo da última década, apesar dos avanços em diagnose e terapia. Embora o melanoma em estágio inicial seja altamente tratável, o melanoma em estágio a-vançado é freqüentemente resistente aos regimes terapêuticos convencionais. As limitações de terapias convencionais estimularam a pesquisa sobre novas estratégias para tratar pacientes com melanoma maligno. Muito da pesquisa se concentrou em imunoterapias.A maioria dos regimes de imunoterapia de melanoma humano sendo desenvolvidos se concentra nos antígenos associados a melanoma (MAA). Os MAAs preferidos para imunoterapia são antígenos que são expressos em uma grande porcentagem de melanomas, mas, que tenham distribuição restrita em tecidos normais. Um tal antígeno é o proteoglicano de sulfato de condroitina de melanoma (MCSP), a que refere-se também o antígeno associado a melanoma de elevado peso molecular (HMW-MAA). Plus-chke et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:9710-9715 (1996); Yang et ai, J. Cell Biol. 765^:881-891 (Junho 2004). MCSP é um proteoglicano de sulfato de condroitina de membrana integral altamente glicosilado, consistindo em um componente de glicoproteína de 280 KDa N-ligado e em um componente de proteoglicano de sulfato de condroitina de 450 KDa, expresso na membrana celular. Ross et ai, Arch. Biochem. Biophys. 225:370-383 (1983). Os proteoglicanos são proteínas ligadas de maneira covalente a glicoaminogli-canos (GAG). Tanto o componente de 280 KDa quanto o componente de 450 KDa de MCSP contêm a mesma proteína de núcleo. Ross et al. , Arch. Biochem. Biophys. 225:370-383 (1983); Bumol et al., J. Biol Chem. 259:12733-12741(1984).

O cDNA que codifica a proteína de núcleo de MCSP de comprimento completo foi identificado e a seqüência de aminoácidos foi deduzida. Pluschke era/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:9710-9715 (1996); Yang era/., J. Cell Biol 165(6):88\-89\ (Junho 2004) (o conteúdo de cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade). A seqüência de MCSP foi depositada e a ela foram designados os seguintes números de acesso: Número de Acesso ao GenBank MIM.601172 (gene); Gl:1617313, Gl:21536290, Gl:34148710 e Gl:47419929 (mRNA); GM617314, GW503099, Gl:34148711 e GI.47419930 (proteína). A proteína de núcleo, consistindo em 2.322 aminoácidos, contém 3 domínios principais: um grande domínio extracelular, uma região de transmembrana hidrofóbica e uma cauda citoplasmica curta. Pesquisas de homologia usando-se a seqüência de MCSP indicam que os homólogos são expressos em outras espécies animais. Especificamente, os homólogos de MCSP de ratos e de camundongossão conhecidos como NG2 e AN2, respectivamente. Cada um deles compartilha identidade de seqüências de aminoácidos substancial com o MCSP e tem um perfil de expressão similar. Stallcup et ai, J. Neurocytol 37:423-435 (2002); Schneider et ai, J. Neurosci. 27:920-933 (2001).

Originariamente, pensou-se que o MCSP tivesse restrita distribuição em tecidos, já que ele foi inicialmente detectado somente em células de linhagem de melanócitos, assim como em células dentro dos folículos capilares, na camada de células basal da epiderme da pele, em células endoteliais e em perfeitos. Ferrone et ai, Pharmacol. Ther. 57:259-290 (1993); Schlingemann et al., Am. J. Pathol. 736:1393-1405 (1990). Mais recentemente, contudo, foi determinado que o MCSP está mais amplamente distribuído em inúmeras células normais e transformadas. Em particular, o MCSP é encontrado em quase todas as células basais da epiderme.

A ligação entre MCSP e melanoma está bem estabelecida. O MCSP é expresso de maneira diferente em células de melanoma, e foi encontrado a ser expresso em mais do que 90% das lesões nevi benignas e de melanoma analisadas. Campoli et al., Crit. Rev. Immunol. 24(4):267-296 (Dezembro 2004). Além disso, constatou-se que a expressão de MCSP não varia entre lesões primárias e metastáticas em todos os tipos de melanoma. Kageshita et al., Int. J. Câncer 56:370-314 (1994). Constatou-se, também que o MCSP é expresso em tumores de origem não melanocítica, incluindo carcinoma celular basal, vários tumores de origem em crista neural e em carcinomas de seio. Kageshita et al., J. Invest. Dermatol. 35:535-537 (1985); Chekenya et ai, Int. J. Dev. Neurosci. 77:421-435 (1999); Chekenya et ai, J. Neurocytol. 37:507-521 (2002); Shoshan et ai, Proc. Nat. Acad. Sei USA 96:10361-10366 (1999); Godal et ai, Br. J Câncer 53:839-841 (1986); DeH'Erba et ai, Anticancer Res. 27:925-930 (2001).

Evidência substancial indica que o MCSP está envolvido de maneiras diferentes na influência do comportamento maligno de células de melanoma. É bem sabido que tanto o constituinte de GAG quanto a proteína de núcleo de proteoglicanos são responsáveis pela ligação a vários ligantes diferentes, incluindo, mas, não limitados a, moléculas de adesão, quimioci-nas, citocinas, componentes de matriz extracelular (ECM) e fatores de crescimento. Bernfield et ai, Ann. fíev. Biochem. 60:729-111 (1999). Com respeito ao MCSP especificamente, estudos demonstraram que anticorpos específicos para MCSP podem inibir a ligação de células de melanoma ao endotélio capilar e a disseminação de vários componentes de ECM, incluindo o colágeno e complexos de colágeno-fibronectina. Harper et ai, J. Natl. Câncer Inst. 77:259-263 (1983); de Vries et ai, Int. J. Câncer 38:465-473 (1986); lida eí ai, Câncer Res. 55:2177- 2185 (1995); Burg et ai, J. Celi Physiol. 777:299-312 (1998). Outros estudos mostraram que a expressão de MCSP está restrita aos domínios de microestaca da superfície celular em células de melanoma migrantes. Garrigues et ai, J. CelIBiol. 703:1699-1710 (1986). Domínios de microestaca são estruturas ricas em actina, que são importantes para a formação de contatos adesivos com componentes de ECM em células migrantes. Coletivamente, a evidência indica que MCSP promove a formação de contatos adesivos iniciais na borda principal de células migrantes.

Evidência adicional indica que MCSP também modula a migração de células de melanoma através de um segundo mecanismo envolvendo a iniciação de eventos de sinalização intracelulares. Em particular, tanto MCSP quanto NG2 têm se mostrado a desencadear vias de transdução de sinal através da ativação de proteínas da família da Rho GTPase. Stallcup et ai, J. Neurocytol 37:423-435 (2002); Eisenmann et ai, Nat. CelIBiol. 7:507-513 (1999). Outros estudos indicam que a expressão de MCSP conduz à ativação intensificada de quinase de adesão focai (FAK) por um mecanismo dependente de integrina, e à ativação intensificada de quinase regulada por sinal extracelular (ERK) por um mecanismo independente. Yang et ai, J. Cell Biol. 765:881-891 (Junho 2004).

MCSP também está implicado na proliferação de células de melanoma. Especificamente, células de melanoma transfectadas para exprèssar MCSP ou NG2 exibem taxas de proliferação intensificadas in vitro e taxas de crescimento aumentadas in vivo. Esses efeitos são inibidos por anticorpos monoclonais anti-MCSP ou anti-NG2.Evidência substancial indica que MCSP desempenha um papel chave na angiogênese e na invasão de células de melanoma. Primeiro, MCSP é expresso em níveis elevados em ambos os perícitos "ativados" e perícitos em vasculatura angiogênica de tumor. Ruiter et ai, Behring Inst. Mitt. 92:258-272 (1993). Sabe-se que perícitos estão associados com células endoteliais desenvolvendo musculatura e concebe-se que eles participem na regulação de angiogênese por controle da proliferação e invasão de células endoteliais. Witmer etal., J. Histochem. Cytochem 52(1):39-52 (2004); Erber et ai, FASEB 70:338-340 (2004); Darland et ai, Dev. Biol. 264:275-288 (2003). Segundo, MCSP e NG2 são amplamente expressos por vasos sangüíneos angiogênicos em tecidos que se desenvolvem normalmente. Che-kenya et ai, FASEB 76:586-588 (2002); Ruiter et ai, Behring Inst. Mitt. 92:258-272(1993).

O nível elevado de expressão de MCSP em células de melanoma, em conjunto com sua distribuição restrita em tecidos normais e a disponibilidade de mAbs específicos para MCSP tornam o MCSP um marcador lógico para lesões de melanoma e um candidato alvo para imunoterapia. De fato, inúmeros anticorpos monoclonais murinos para MCSP foram desenvolvidos. Campoli et ai, Crit. Rev. Immunol. 24(4):267-296 (2004). Embora tenha sido demonstrado que mAbs anti-MCSP murinos controlem o crescimento de tumor em modelos animais, somente foram observadas pequenas respostas clínicas em testes clínicos com estes anticorpos. Quais benefícios são vistos são, em geral, atribuídos à capacidade do anticorpo anti-MCSP em influenciar a biologia de células de melanoma e não a mecanismos imunológicos mediados por anticorpos. Conseqüentemente, a maioria das imu-noterapias direcionadas a MCSP utilizam anticorpos antiidiotípicos que mi-metizam o epitopo de MCSP.

Anticorpos monoclonais não conjugados (mAbs) podem ser fár-macos úteis para o tratamento de câncer, conforme demonstrado pela aprovação do U.S. Food and Drug Administration do Trastuzumab (Herceptin®; Genentech, Inc.) para o tratamento de câncer de seio avançado (Grillo-Lopez, A.-J., et ai, Semin. Oncoi 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin.Ther. 27:309-18 (1999)), Rituximab (Rituxan®; IDEC Pharmaceuticals (agora Biogen IDEC), San Diego, CA e Cambridge, MA, e Genentech Inc., San Francisco, CA), para o tratamento de linfoma não-Hodgkin de baixo grau ou folicular, de células B positivas para CD20, Gemtuzumab (Mylotarg®, Cellte-chA/Vyeth-Ayerst) para o tratamento de leucemia mielóide aguda reicidivante, e Alemtuzumab (CAMPATH®, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) para o tratamento de leucemia linfocítica crônica de células B. O sucesso desses produtos se baseia não somente em sua eficácia, mas, também, em seus notáveis perfis de segurança (Grillo-Lopez, A.-J., et ai, Semin. Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 27:309-18 (1999)). Apesar das realizações desses fármacos, atualmente, existe um grande interesse em se obter atividade de anticorpos específicos mais elevada do que é tipicamente permitido por terapia com mAb não conjugado.

Os resultados de inúmeros estudos sugerem que mecanismos dependentes de receptor de Fc contribuem substancialmente para a ação de anticorpos citotóxicos contra tumores e indicam que um anticorpo ótimo contra tumores ligar-se-ia preferencialmente para ativação de receptores de Fc e minimamente ao parceiro inibidor FcyRIIB (Clynes, R. A., et ai, Nature Medicine 6^:443-446 (2000); Kalergis, A.M., e Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195(12):1653-1659 (Junho 2002). Por exemplo, os resultados de pelo menos um estudo sugerem que o receptor de FcYRIIIa em particular está fortemente associado com a eficácia de terapia com anticorpos. (Cartron, G., et ai., Blo-od 99(3):1'54-757 (Fevereiro 2002)). Aquele estudo mostrou que pacientes homozigotos para um polimorfismo em FcyRllla têm uma melhor resposta ao Rituximab do que pacientes heterozigotos. Os autores concluíram que a resposta superior foi devido à melhor ligação in vivo do anticorpo a FcyRllla, o que resultou em melhor atividade de ADCC contra células de linfoma. (Cartron, G., et ai., Blood 99(3)154-757 (Fevereiro 2002)).

Várias estratégias de imunoterapia que objetivam MCSP têm sido relatadas. As primeiras imunoterapias usaram MCSP como um alvo em imunoterapia passiva à base de anticorpos em pacientes com melanoma avançado. Em geral, anticorpos anti-MCSP foram administrados a pacientes,isoladamente ou conjugados a toxinas. Schroff et ai, Câncer Res. 45:879-885 (1985); Spitler et ai, Câncer Res. 47:1717-1723 (1987); Bumol et ai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 50:529-533 (1983). Embora tais anticorpos exibiam inibição de tumor em modelos animais, somente pequenas respostas clínicas foram observadas em uns poucos pacientes. Matsui et ai, Jap. J. Câncer Res. 76:119-123 (1985); Morgan et ai, J. A/aí/. Câncer Inst. 78:1101-1106 (1987); Ghose et ai, Câncer Immunoi Immunother. 34:90-96 (1991). Mais recentemente, respostas terapêuticas aperfeiçoadas foram observadas com imunoconjugados de Fv de cadeia única e com anticorpos monoclonais de anticorpos antiidiotípicos que objetivam MCSP. Wang et ai, Proc. Natl Acad. Sei USA 06:1627-1632 (1999); Kang et ai, Clin. Câncer Res. 6:4921-4931 (2000); Mittelman et ai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 89:466-470 (1992); patente norte-americana de número 5.270.202; patente norte-americana de número 5.780.029; patente norte-americana de número 5.866.124. No entanto, essas imunoterapias têm desvantagens. Especificamente, anticorpos antiidiotípicos não são úteis em se atingir células que expressem MCSP. Também construetos scFv carecem de regiões de Fc e, portanto, não podem induzir isoladamente a lise de células alvo positivas de MCSP.

A maioria dos anticorpos monoclonais anti-MCSP, que foram desenvolvidos são murinos. Eles incluem mAb 149.53, mAb 225.28; mAb 763.74 e mAb 9.2.27. Campoli et ai, Crit. Rev. Immunoi 24(4):267 -296 (2004). Atualmente, somente uns poucos anticorpos anti-MCSP, a partir de fontes humanas, foram isolados. Wang et ai, Proc. Nat. Acad. Sei. 96:1627-1632 (1999). Acredita-se, atualmente, nenhum dos anticorpos anti-MCSP murinos (ou qualquer outro não humano) foi humanizado. Um problema potencial com o uso de anticorpos murinos em tratamentos terapêuticos é que anticorpos monoclonais não humanos pode ser reconhecido pelo hospedeiro humano como uma proteína exógena; portanto, injeções repetidas de tais proteínas exógenas podem conduzir à indução de respostas imunes conduzindo a reações de hipersensibilidade nocivas. Para anticorpos monoclonais à base de murinos, refere-se freqüentemente a isso como uma resposta de Anticorpo Anti-Camundongo Humano, ou resposta "HAMA", ou uma respos-ta de Anticorpo Anti-Rato Humano, ou resposta "HARA". Adicionalmente, esses anticorpos "exógenos" podem ser atacados pelo sistema imune do hospedeiro, tal que eles sejam, com efeito, neutralizados antes que eles alcancem seu sítio alvo. Além disso, anticorpos monoclonais não humanos (por exemplo, anticorpos monoclonais murinos) tipicamente carecem de funcionalidade de efetor humana, isto é, eles são incapazes de, interalia, mediar lise dependente de complemento ou de lisar células alvo humanas através toxicidade celular dependente de anticorpo ou fagocitose mediada por receptor de Fc.

Anticorpos quiméricos compreendendo porções de anticorpos a partir de duas ou mais espécies diferentes (por exemplo, camundongo ou ser humano) foram desenvolvidos como uma alternativa aos anticorpos "conjugados".

Glicosilação de anticorpos

O componente de oligossacarídeo pode afetar significativamente as propriedades relevantes para a eficácia de uma glicoproteína terapêutica, incluindo estabilidade física, resistência ao ataque por protease, interações com o sistema imune, farmacocinéticas e atividade biológica específica. Tais propriedades podem depender não somente da presença ou da ausência, mas, também, das estruturas específicas, de oligossacarídeos. Algumas generalizações entre a estrutura de oligossacarídeo e a função de glicoproteína podem ser feitas. Por exemplo, certas estruturas de oligossacarídeo mediam a rápida eliminação da glicoproteína a partir da corrente sangüínea através de interações com proteínas de ligação a carboidrato específico, embora outras possam estar ligadas por anticorpos e desencadear reações imunes indesejadas. (Jenkins etal., Nature Biotechnol. 14:975- 81 (1996)).

Células de mamíferos são os hospedeiros preferidos para a produção de glicoproteínas terapêuticas, devido a sua capacidade de glicosilar proteínas na forma mais compatível para aplicação humana. (Gumming et al, Glycobiology 7:115-30 (1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol. 74:975-81 (1996)). Bactérias muito raramente glicosilam proteínas, e como outros tipos de hospedeiros comuns, tais como leveduras, fungos filamentosos, cé-lulas de insetos e vegetais, fornecem padrões de glicosilação associados com rápida eliminação a partir da corrente sangüínea, interações imunes indesejáveis, e, em alguns casos específicos, reduzem a atividade biológica. Dentre as células de mamíferos, células de ovário de hamster chinês (CHO) foram as mais comumente usadas durante as últimas duas décadas. Em adição a dar padrões de glicosilação adequados, essas células permitem a geração consistente em linhagens de células clonais altamente produtivas, geneticamente estáveis. Elas podem ser cultivadas em elevadas, em biorre-atores simples usando-se meios livres de soro, e permitem o desenvolvimento de bio-processos seguros e reprodutíveis. Outras células animais comumente usadas incluem células de rim de hamster bebê (BHK), células de mieloma de camundongo de NSO e de SP2/0. Mais recentemente, a produção a partir de animais transgênicos também foi testada. (Jenkins et ai, Na-ture Biotechnol. 74:975-81 (1996)).

Todos os anticorpos contêm estruturas de carboidrato em posições conservadas nas regiões constantes de cadeia pesada, com cada isó-tipo possuindo uma disposição distinta de estruturas de carboidrato fungadas, que afetam, de maneira variável a montagem de proteínas, secre-ção e atividade funcional. (Wright, A., e Morrison, S. L, Trends Biotech. 75:26-32 (1997)). A estrutura do carboidrato N-ligado fixado varia consideravelmente, dependendo do grau de processamento, e podem incluir oligossa-carídeos de elevado teor em manose, multirramificados assim como de complexos biantenários. (Wright, A., e Morrison, S. L, Trends Biotech. 75:26-32 (1997)). Tipicamente, existe processamento heterogêneo das estruturas de oligossacarídeo de núcleo ligadas em um sítio de glicosilação particular, tal que, mesmo anticorpos monoclonais existem como glicoformas múltiplas. Igualmente, mostrou-se que as diferenças principais em glicosilação de anticorpos ocorrem entre linhagens de células, e mesmo diferenças secundárias são vistas para uma dada linhagem de células cultivadas sobcondições de cultura diferentes. (Lifely, M. R. et ai, Glycobiology 5(8):8\3-22 (1995)).

Uma maneira de se obter grandes aumentos de potência, en-quanto se mantém um método de produção simples e se evitando efeitos colaterais indesejáveis, significativos, é intensificar as funções de efetor mediadas por células, naturais, de anticorpos monoclonais por engenharia de seu componente de oligossacarídeo, conforme descrito em Umana, P. et al, Nature Biotechnol. 77:176-180 (1999) e na patente norte-americana de número 6.602.684, os teores dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Anticorpos tipo IgGI, os anticorpos mais comumente usados em imunoterapia de câncer, são glicoproteínas que têm um sítio de gli-cosilação N-ligado conservado em Asn297 em cada domínio de CH2. Os dois oligossacarídeos biantenários complexos ligados a Asn297 estão enterrados entre os domínios de CH2, formando extensos contatos com a cadeia principal de polipeptídeo, e sua presença é essencial para o anticorpo mediar funções de efetor, tal como citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., era/., Immunol Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. e Morrison, S. L, Trenós Biotechnol. 75:26-32(1997)).

Umanã et al. mostraram previamente que a sobreexpressão em células de ovário de hamster chinês (CHO) de p(1,4)-N-acetilglicosa-miniltransferase III ("GnTIU"), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de oligossacarídeos bisseccionadas, aumenta de maneira significativa a atividade de ADCC in vitro de um anticorpo monoclonal quimérico antineuro-blastoma (chCE7) produzido pelas células de CHO engenheiradas. (ver Umaha, P. era/., Nature Biotechnol. 77:176-180 (1999); e Publicação Internacional de número WO 99/54342, o inteiro teor dos quais são aqui incorporados por referência). O anticorpo chCE7 pertence a uma classe grande de mAbs não conjugados, que têm grande afinidade e especificidade por tumor, mas, têm potência pequena demais para serem clinicamente úteis, quando produzidos em linhagens de células industriais padrão, carecendo da enzima GnTIM (Umana, P., era/., Nature Biotechnol. 77:176- 180 (1999)). Aqueleestudo foi o primeiro a mostrar que grandes aumentos de atividade de ADCC poderiam ser obtidos por engenharia das células que produzem anticorpos para expressarem GnTIll, o que também conduziu a um aumento na produ-ção de oligossacarídeos bisseccionados, associados a região (Fc) constante, incluindo oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, acima dos níveis encontrados em anticorpos que ocorrem naturalmente.

Resta uma demanda por abordagens terapêuticas intensificadas tendo por alvo MCSP para o tratamento de distúrbios de proliferação celular em mamíferos, incluindo, mas, não limitados a, seres humanos, sendo que tais distúrbios são caracterizados por expressão de MCSP, particularmente a expressão anormal (por exemplo, sobreexpressão), incluindo, mas, não limitada a, melanomas, gliomas, câncer de seio lobular e também tumores que induzam neovasculatura.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

O reconhecimento do tremendo potencial terapêutico de moléculas de ligação a antígeno (ABMs), que tenham especificidade de ligação do anticorpo 225.28S murino e que tenham sido glicoengenheiradas para intensificar a afinidade de ligação a receptor de Fc e a função de efetor, os presente inventores desenvolveram um método para produção de tais ABMs. Inter alia, esse método envolve a produção de anticorpos quiméricos (incluindo humanizados), recombinantes, ou de seus fragmentos quiméricos. A eficácia dessas ABMs é adicionalmente intensificada por engenharia do perfil de glicosilação da região de Fc do anticorpo.

Portanto, em uma concretização, a presente invenção é dirigida a um polinucleotídeo isolado compreendendo: (A) uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 71; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO.75; e (B) uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 79; SEQ ID NO: 81; SEQ ID N0.83; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 91 e SEQ ID NO: 93; e (C) SEQ ID NO: 95. De preferência, o polinucleotídeo isolado codifica uma proteína de fusão.

Em outra concretização, a invenção é dirigida a um polinucleotídeo isolado compreendendo: (A) uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 97; SEQ ID NO: 99 e SEQ ID NO: 101; e (B)SEQ ID NO: 103 ou SEQ ID NO: 105; e (C) SEQ ID NO: 107. De preferência, o polinucleotídeo isolado codifica uma proteína de fusão.

Em uma concretização adicional, a presente invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; e SEQ ID NO: 23. A invenção também refere-se a um polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51. De preferência, o polinucleotídeo isolado codifica uma proteína de fusão.

Uma concretização adicional da invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado compreendendo: (A) uma seqüência que codifica um poli-peptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 24 e (B) uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52.

Em outra concretização, a invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 80%, alternativamente pelo menos 85%, alternativamente pelo menos 90%, alternativamente pelo menos 95%, alternativamente pelo menos 99%, de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 23, sendo que o polinucleotídeo iso-lado codifica um polipeptídeo de fusão. Tais polinucleotídeos isolados podem compreender adicionalmente uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma região constante de cadeia leve ou pesada de anticorpo humano.

Em ainda outra concretização, a invenção também refere-se a um polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 80%, alternativamente pelo menos 85%, alternativamente pelo menos 90%, alternativamente pelo menos 95%, alternativamente pelo menos 99%, de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 51, sendo que o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão. Tais polinucleotídeos isolados podem compreender adicionalmente uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma região constante de cadeia leve ou pesada de anticorpo humano.

A presente invenção também refere-se a um polinucleotídeo isolado compreendendo: (A) uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24; e (B) uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo a seqüência de uma região de Fc de anticorpo, ou um seu fragmento, a partir de uma espécie diferente de uma espécie murina. Alternativamente, a invenção engloba um polinucleotídeo isolado compreendendo: (A) uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 52; e (B) uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo a seqüência de um domínio constante de cadeia leve de anticorpo, ou um seu fragmento, a partir de uma espécie diferente do que camundongo.

A invenção é adicionalmente dirigida a um polinucleotídeo isola-do que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24. Em outra concretização, a invenção é dirigida a um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 52.

A presente invenção também engloba um vetor de expressão compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos da invenção descritos a-cima. De preferência, o vetor de expressão codifica pelo menos a cadeia leve ou pesada de um anticorpo. Em uma concretização, o vetor de expressão codifica a cadeia tanto leve quanto pesada de um anticorpo. O vetor pode ser um vetor policistrônico.

A presente invenção refere-se adicionalmente a uma célula de hospedeiro compreendendo um ou mais vetores de expressão da presente invenção ou um ou mais polinucleotídeos da invenção. Em uma concretização, o hospedeiro compreende um polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 80%, alternativamente pelo menos 85%, alternativamente pelo menos 90%, alternativamente pelo menos 95%, alternativamente pelo menos 99%, de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 23, e compreende adicionalmente um segundo polipeptídeo compreendendo uma seqüência que codifica a região variável de uma cadeia leve de anticorpo. Em ainda outra concretização, a célula de hospedeiro da invenção compreende um polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 80%, alternativamente pelo menos 85%, alternativamente pelo menos 90%, alternativamente pelo menos 95%, alternativamente pelo menos 99%, de identidade com relação a uma seqüência sele-cionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 51, e compreende adicionalmente um segundo polipeptídeo compreendendo uma seqüência que codifica a região variável de uma cadeia pesada de anticorpo.

Em outras concretizações, a presente invenção é dirigida a um polipeptídeo de fusão compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 e SEQ ID No:24, ou uma sua variante.

A invenção é também dirigida a um polipeptídeo de fusão compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 52, ou uma sua variante.

A presente invenção também refere-se a moléculas de ligação a antígeno. Portanto, em uma concretização, a invenção é dirigida a uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um ou mais polipeptídeos de fusão da invenção. De preferência, a molécula de ligação a antígeno se ligue de maneira seletiva a MCSP humano. Em uma concretização preferida, a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo. Um anticorpo humanizado é uma molécula de ligação a antígeno particularmente preferida. Alternativamente, o anticorpo pode estar primatizado. Em outras concretizações, a molécula de ligação a antígeno da invenção compreende um fragmento de anticorpo tendo uma região de Fc de anticorpo ou um equivalente de região com relação à região de Fc de um anticorpo. Ainda em outras concretizações, a molécula de ligação a antígeno da invenção é um fragmento de scFv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo, Fab ou Fab2. Em uma concretização preferida, a molécula de ligação a antígeno, por exemplo, um anticorpo recombinante, humanizado. O anticorpo humanizado, em geral, compreenderá, uma regiãode Fc humana, de preferência, uma região de Fc de IgG humana.

Em outra concretização, a presente invenção refere-se a uma molécula de ligação a antígeno, conforme discutida acima, que tenha sido glicoengenheirada para ter uma região de Fc com oligossacarídeos modificados. Em uma concretização, a região de Fc fora modificada para ter um número reduzido de resíduos de fucose, quando comparada à molécula de ligação a antígeno não glicoengenheirada. Em outra concretização, a região de Fc tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos bisseccionados quando comparada à molécula de ligação a antígeno não glicoengenheirada.

Ainda em outra concretização, os oligossacarídeos bisseccionados são predominantemente complexo bisseccionado. Em outra concretização, as moléculas de ligação a antígeno glicoengenheiradas da invenção têm uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, na região de Fc da molécula de ligação a antígeno, quando comparadas à molécula de ligação a antígeno não glicoengenheirada. Alternativamente, as moléculas de ligação a antígeno da invenção podem ter uma razão aumentada de resíduos GlcNAc com relação aos resíduos de fucose na região de Fc, comparadas à molécula de ligação a antígeno não glicoengenheirada.

Em uma concretização, os oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, são estão predominantemente na forma híbrida. Alternativamente, os oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, são predominantemente do tipo complexo. Em certas concretizações, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40%, dos oligossacarídeos na região de Fc estão não fucosiladas, bisseccionadas. Em outras concretizações, pelo menos 50% ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, dos oligossacarídeos na região de Fc são bisseccionados. Ainda em outra concretização, pelo menos 50%, alternativamente pelo menos 60%, alternativamente pelo menos 70%, alternativamente pelo menos 75%, dos oligossacarídeos na região de Fc não estão fucosilados.

A presente invenção é também dirigida a um método de produção de uma molécula de ligação a antígeno, capaz de competir com o anti-corpo monoclonal 225.28S murino pela ligação ao MCSP humano, o método compreendendo: a) cultivo da célula de hospedeiro da invenção sob condições que permitam a expressão de um polinucleotídeo que codifique a molécula de ligação a anticorpo; e b) recuperação da molécula de ligação a antígeno. Em uma concretização, a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo, tal como um anticorpo humanizado.

A invenção é adicionalmente dirigida a uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação a antígeno da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode compreender opcionalmente um adjuvante.

A invenção é ainda adicionalmente dirigida a um método para identificação de células que expressam MCSP em uma amostra ou sujeito, compreendendo a administração, à amostra ou sujeito, de uma molécula de ligação a antígeno da invenção. Em uma concretização, a identificação é para finalidades diagnosticas. Em outra concretização, a identificação é para finalidades terapêuticas, tal como tratamento de uma doença ou distúrbio. Portanto, em certos aspectos, a invenção é dirigida a um método de tratamento de um distúrbio de proliferação celular mediado por MCSP, em um sujeito necessitando do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica da invenção ao sujeito. De preferência, o sujeito é um ser humano. Em uma concretização, o tratamento compreende o bloqueio de interações mediadas por MCSP selecionados a partir do grupo consistindo em: ligação de ligante de MCSP, adesão de células de melanoma, ativação de perícitos, respostas quimiotáticas à fibronectina, disseminação de células em proteínas de ECM, transdução de sinal FAK e transdução de sinal ERK. Em outra concretização, a doença ou o distúrbio tratados é selecionado a partir do grupo consistindo em: melanoma, glioma, câncer de seio lobular, leucemia aguda, ou uma neovascularização indutora de tumor sólido de vasos sangüíneos. Ainda em outra concretização, o tratamento compreende a morte de células que expressem MCSP, de preferência, células que sobreexpressem MCSP.

A presente invenção é adicionalmente dirigida a uma célula dehospedeiro glicoengenheirada para expressar pelo menos um ácido nucléico que codifica um primeiro polipeptídeo tendo atividade de (3(1,4)-N-acetilgli-cosaminiltransferase III em uma quantidade suficiente para modificar os oli-gossacarídeos na região de Fc de um segundo polipeptídeo produzido pela célula de hospedeiro, sendo que o segundo polipeptídeo é uma molécula de ligação a antígeno da invenção. Em uma concretização, a célula de hospedeiro expressa adicionalmente um polipeptídeo tendo atividade de manosi-dase II. Em uma concretização específica, o primeiro polipeptídeo compreende adicionalmente o domínio de localização de um polipeptídeo residente em Golgi. De preferência, a molécula de ligação a antígeno da invenção é um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em outra concretização, a molécula de ligação a anticorpo compreende a região de Fc de uma IgG humana ou uma região equivalente à região de Fc de uma IgG humana.

As moléculas de ligação a antígeno produzidas pelas células de hospedeiro da invenção exibem afinidade de ligação a receptor de Fc aumentada e/ou funções de efetor aumentadas, comparadas à molécula de ligação a antígeno produzida pela célula de hospedeiro não glicoengenheirada.

Em certas concretizações, o primeiro polipeptídeo expresso pela célula de hospedeiro compreende o domínio catalítico de (3 (1,4)-N-ace-tilglicosaminiltransferase III. Em uma concretização, o primeiro polipeptídeo compreende adicionalmente o domínio de localização em Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi heterólogo, tais como o domínio de localização de manosidase II, o domínio de localização de (3 (1,2)-N-acetilglicosami-niltransferase I, o domínio de localização de (3 (1,2)-N-acetilglicosa-miniltransferase II, o domínio de localização de manosidase I, ou o domínio de localização de fucosiltransferase de núcleo de a1-6.

A função de efetor aumentada exibida pelas moléculas de ligação a antígeno pelas células de hospedeiro da invenção é uma ou mais de cítotoxicidade celular mediada por Fc aumentada, ligação aumentada a células de NK, ligação aumentada a macrófagos, ligação aumentada a células polimorfonucleares, ligação aumentada a monócitos, apoptose indutora desinalização direta aumentada, maturação de células dendríticas aumentada ou iniciação de células T aumentada.

A ligação a receptor de Fc aumentada exibida pelas moléculas de ligação a antígeno da invenção é, em uma concretização, ligação aumentada a um receptor de ativação de Fcy, tal como FcyRIII. Em uma concretização específica, a ligação aumentada e a receptor de FcyRllla humano ou a uma sua variante que ocorra naturalmente.

Em certas concretizações, a célula de hospedeiro da invenção é célula HEK293-EBNA, uma célula de CHO, uma célula de BHK, uma célula de NSO, uma célula de SP2/0, uma célula de mieloma de YO, uma célula de mieloma de camundongo dê P3X63, uma célula de PER, uma célula de PER.C6 ou uma célula de hibridoma. Em uma concretização, a célula de hospedeiro da invenção compreende pelo menos um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de P(1,4)-N-acetilglicosaminiltrans-ferase III, que esteja operavelmente ligada a um elemento de promotor constitutivo. Em outra concretização, o polipeptídeo tendo atividade de p (1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III, que é expresso pela célula de hospedeiro, é um polipeptídeo de fusão.

A presente invenção também engloba um polinucleotídeo isolado compreendendo pelo menos um, alternativamente pelo menos dois, alternativamente pelo menos três, regiões que determinam complementarie-dade do anticorpo monoclonal 225.28S murino, ou uma sua variante ou forma truncada contendo pelo menos os resíduos que determinam a especificidade para a região que determina a complementariedade, sendo que o poli-peptídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão. De preferência, a região que determina a complementariedade é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 71; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 79; SEQ ID NO: 81; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 93 e SEQ ID NO: 95. Em outra concretização, a região que determina a complementariedade é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 97;SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101; SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 107. De preferência, o polipeptídeo de fusão codifica uma molécula de ligação a antígeno da invenção.

Em uma concretização específica, os CDRs compreendem pelo menos uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 71; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 79; SEQ ID NO: 81; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 93 e SEQ ID NO: 95; e pelo menos uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 97; SEQ ID NO: 99; SEQ ID NO: 101; SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 107; ou variantes ou formas truncadas das seqüências que contêm pelo menos os resíduos que determinam a especificidade para cada uma das regiões que determinam a complementariedade. A invenção também engloba os polipeptídeos englobados por tais polinucleotídeos, assim como moléculas de ligação a antígeno compreendendo tais polipeptídeos.

As moléculas de ligação a antígeno da invenção compreenderão, em algumas concretizações, a região variável de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo. Em outras concretizações, a ABM será um anticorpo quimérico ou humanizado.

A presente invenção é adicionalmente dirigida a um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno tendo oligossacarídeos modificados em uma célula de hospedeiro, o método compreendendo: (a) cultivo de uma célula de hospedeiro glicoengenheirada para expressar pelo menos um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de B (1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III sob condições que permitam a produção da molécula de ligação a antígeno, e que permitam a modificação dos oligossacarídeos presentes na região de Fc da molécula de ligação a antígeno; e (b) isolamento da molécula de ligação a antígeno, sendo que a molécula de ligação a antígeno é capaz de competir com o anticorpo monoclo-nal 225.28S murino pela ligação a MCSP, e sendo que a molécula de ligação a antígeno ou seu fragmento é quimérica ou humanizada. Em um meto-do da invenção, os oligossacarídeos modificados têm uma proporção reduzida de resíduos de fucose, quando comparados aos oligossacarídeos da molécula de ligação a antígeno não glicoengenheirada. Em certas concretizações, os oligossacarídeos modificados estão predominantemente na forma híbrida. Em uma concretização alternativa, os oligossacarídeos modificados estão predominantemente na forma complexa. Em outra concretização, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%, dos oligossacarídeos modificados são não fucosilados, bisseccionados.

Em outras concretizações dos métodos da invenção, o anticorpo recombinante ou seu fragmento, produzido pela célula de hospedeiro, tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, na região de Fc do polipeptídeo, quando comparado à molécula de ligação a antígeno, produzida pela célula não glicoengenheirada. Em umaconcretização, os oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, estão predominantemente na forma híbrida. Em outra concretização, oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, estão predominantemente na forma complexa. Em certas concretizações, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, dos oligossacarídeos na região de Fc dopolipeptídeo são não fucosilados, bisseccionados.

As moléculas de ligação a antígeno produzidas pelos métodos da invenção terão, em certas concretizações, função de efetor aumentada e/ou afinidade de ligação a receptor de Fc aumentada. Em uma concretização, a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo. A função de efetor aumentada pode ser uma ou mais de citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada, ligação a células NK aumentada, ligação a macrófagos aumentada, ligação a monócitos aumentada, ligação a células polimorfonucleares aumentada, apoptose indutora de sinalização direta, maturação de células dendríticas aumentada ou iniciação de células T aumentada. De preferência, a ligação a receptor de Fc aumentada é ligação a um receptor de ativação de Fc aumentada, tal como FCyRllla.

A presente invenção é também dirigida a uma molécula de liga-ção a antígeno, que é uma proteína de fusão, que inclui um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24; e uma região equivalente à região de Fc de uma imunoglobulina e engenheirada para ter função de efetor aumentada. Em outra concretização, a molécula de ligação a antígeno é uma proteína de fusão, que inclui um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 52; e uma região equivalente à região de Fc de uma imunoglobulina e engenheirada para ter função de efetor aumentada. A invenção é também dirigida a uma composição farmacêutica compreendendo uma tal molécula de ligação a antígeno e um veículo farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção é também dirigida a um método de indução de lise de perícitos ativados em neovasculatura de tumor em um sujeito necessitando do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma molécula de ligação a antígeno da invenção ou de uma composição farmacêutica compreendendo a mesma. De preferência, o sujeito é um ser humano. Em uma concretização, a neovasculatura não é neovasculatura de mela-noma ou neovasculatura de glioblastoma. Em outra concretização, a molécula de ligação a antígeno é co-administrada com outro agente antiangiogêni-co, tal como um anticorpo anti-VEGF.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 mostra a atividade de ligação dos três constructos de cadeia pesada M-HHA, M-HHB e M-HHC, assim como dos três constructos de cadeia leve M-KV1, M-KV2 e M-KV3. Os constructos de cadeia pesada humanizados foram co-expressos com cadeia leve murina (mVL), e os constructos de cadeia leve humanizados foram co-expressós com a cadeia pesada murina (mVH). M-HHA e M-HHB mais ou menos retiveram suas propriedades de ligação quando combinados com VL murino. Ao contrário, M-HHCperde seu potencial de ligação de maneira significativa. M-KV1 e M-KV2 mostram atividade de ligação fortemente diminuída comparados à contrapar-te murina, enquanto que M-KVC mostra comportamento de ligação similar à cadeia leve murina.

A figura 2 mostra os dados de ligação dos constructos de "baixa homologia" M-HLA, M-HLB e M-HLC.

A figura 3 mostra os dados de ligação de constructos de cadeia leve M-KV4, M-KV5, M-KV6, M-KV7, M-KV8 e M-KV9, quando pareados com a cadeia pesada de M-HHB. M-KV4 mostrou afinidade aumentada com relação a antígeno comparada ao anticorpo ch-225.28S, enquanto que M-KV5 e M-KV6 perderam propriedades funcionais, e M-KV7 mostrou ligação similar a ch-225.28S.

A figura 4 mostra os resultados de ensaio de ligação a antígeno, quando constructos de cadeia pesada M-HLE1, M-HLE2, M-HLF e M-HLG foram pareados com o constructo de cadeia leve m-KV4. Os constructos M-HLE1 e M-HLE2 mostraram alguma ligação residual, embora M-HLF mostrou quase nenhuma ligação. M-HLG, por outro lado, mostrou afinidade mais elevada com relação a antígeno do que o anticorpo parental ch-225.28S.

A figura 5 mostra a ligação da variante de cadeia leve M-KV9, quando combinada com M-HHB. Esse constructo mostrou bons dados de ligação.

A figura 6 mostra a comparação de diferentes glicoformas do constructo M-HLG/M-KV9 humanizado do anticorpo 225.28S, na morte de células mediada por anticorpo usando-se células de PBMC humanas. As células alvo são células A2058 humanas, e pode-se ver um forte aumento de potência e de eficácia do constructo glicoengenheirado, comparado ao anticorpo de tipo selvagem.

A figura 7 mostra a comparação do comportamento de ligação a antígeno dos constructos de cadeia leve M-KV10, M-KV11 e M-KV12, combinados com a cadeia pesada de M-HLG. Todas essas variantes mostram ligação reduzida comparadas ao constructo de cadeia leve de M-KV9. Também mostrada nessa figura é a cadeia pesada de M-HLD pareada com acadeia leve de M-KV9. M-HLD é a variante de Tyr27Phe e Thr30Ser do constructo completamente inativo M-HLC. Portanto, essas duas mutações parcialmente restabelecem a atividade de ligação a antígeno. Isso indica a importância desses dois resíduos para o método de humanização como um todo.

A figura 8 mostra o perfil MALDI/TOF-MS de oligossacarídeos de Fc liberados por PNGaseF do anticorpo de MCSP anti-humano de lgG1 225.28S humanizado de M-HLG/M-KV9 G2 não glicoengenheirado. Os dois picos principais em 1.485,5 e 1.647,6 m/z ambos correspondem a açúcares fucosilados bisseccionados híbridos.

A figura 9 mostra o perfil MALDI/TOF-MS de oligossacarídeos de Fc liberados por PNGaseF do anticorpo de MCSP anti-humano de lgG1 225.28S humanizado de M-HLG/M-KV9 G2 glicoengenheirado. A glicoenge-nharia feita por co-expressão em células de hospedeiro de genes de anticorpo e de genes que codificam enzima com atividade catalítica de p(1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III (GnT-lll) e que codificam enzima com atividade catalítica de a-manosidase II de Golgi. Os quatro picos principais 1.542,9, 1.688,7, 1.704,6 e 1.850,5 correspondem todos a açúcares bisseccionados complexos, que estão presentes em sua forma fucosilada, assim como em sua forma não fucosilada.

A figura 10 mostra um desenho esquemático dos diferentes oligossacarídeos N-ligados que podem ser afetados pela glicoengenharia via co-expressão de GnTIll e/ou de Manll.

A figura 11 mostra citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) usando o anticorpo de M-HLG/M-KV9, células de músculo liso humano (HuSMC) como alvos, e PBMC humano como células de efetor. A razão efetor/alvo foi de 25/1, e a duração do experimento foi de 4 horas.

A figura 12 mostra citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) usando o anticorpo de M-HLG/M-KV9 em sua forma não glicoen-genheirado, assim como em sua forma glicoengenheirado (G2), linhagem de células de glioblastoma humano LN229 como alvos, e PBMC humano como células de efetor.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Termos são usados aqui conforme são usados em geral na técnica, a menos se definido de maneira diferente como se segue.

Conforme usado aqui, o termo anticorpo pretende incluir todas as moléculas de anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais, policlonais e multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos), assim como fragmentos de anticorpos tendo a região de Fc e retendo a especificidade de ligação, e proteínas de fusão que incluem uma região equivalente à região de Fc de uma imunoglobulina e que retém a especificidade de ligação. Também englobados são anticorpos quiméricos e humanizados, assim como anticorpos ca-melizados e primatizados.

Conforme usado aqui, o termo região de Fc pretende se referir a uma região C-terminal de uma cadeia pesada de IgG humana. Embora os limites da região de Fc de uma cadeia pesada de IgG pudessem variar levemente, a região de Fc de cadeia pesada de IgG humana é usualmente definida para se estender desde o resíduo de aminoácido na posição Cys226 ao terminal de carboxila.

Conforme usado aqui, o termo região equivalente à região de Fc de uma imunoglobulina pretende incluir variantes alélicas que ocorrem naturalmente da região de Fc de uma imunoglobulina, assim como variantes tendo alterações que produzam substituições, adições ou eliminações, mas, que não diminuam substancialmente a capacidade da imunoglobulina mediar funções de efetor (tal como citotoxicidade celular dependente de anticorpo). Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser eliminados a partir do terminal N ou do terminal C da região de Fc de uma imunoglobulina sem perda substancial de função biológica. Tais variantes podem ser selecionadas de acordo com regras gerais conhecidas na técnica, de modo a ter efeito mínimo sobre atividade. (Ver, por exemplo, Bowie, J. U. et ai, Science 247:1306-10(1990).

Conforme usado aqui, o termo MCSP refere-se ao proteoglicano de sulfato de condroitina de melanoma humano (também conhecido o antí-geno associado a melanoma de elevado peso molecular (HMW-MAA)), as-sim como suas isoformas e variantes que ocorrem naturalmente. As seqüências de MCSP foram depositadas e designadas com os seguintes números de acesso: Número de Acesso ao GenBank MIM:601172 (gene); GM617313, Gl:21536290, GL34148710 e GL47419929 (mRNA); GI.-1617314, Gl:4503099, Gl:34148711 e Gl:47419930 (proteína).

Conforme usado aqui, o termo ligante de MCSP refere-se a um polipeptídeo, que se liga a e/ou ativa MCSP. O termo inclui formas de precursor ligados a membrana de um ligante de MCSP, assim como formas solúveis processadas proteoliticamente de um ligante de MCSP.

Conforme usado aqui, o termo doença ou distúrbio caracterizado por ativação, expressão ou produção anormal de MCSP ou de um ligante de MCSP ou distúrbio relacionado à expressão de MCSP refere-se a uma condição, que pode ou não envolver malignância ou câncer, onde ativação e/ou produção anormal de MCSP e/ou um ligante de MCSP esteja ocorrendo em células ou tecidos de um sujeito tendo, ou predisposto a, a doença ou o distúrbio.

Conforme usado aqui, os termos sobreexpresso, sobreexpres-sado e sobreexpressão, conforme usado em conexão com células que expressam MCSP, refere-sem a células, que tenham níveis mensuravelmente mais elevados de MCSP na sua superfície, comparados a uma célula normal do mesmo tipo de tecido. Tal sobreexpressão pode ser causada por amplifi-cação de gene ou por transcrição ou tradução aumentada. A expressão de MCSP pode ser determinada em um ensaio diagnóstico ou prognóstico por avaliação de níveis de MCSP presentes sobre a superfície de uma célula (por exemplo, via um ensaio de imunohistoquímica; ensaio de imunofluores-cência, ensaio de imunoenzima, ELISA, citometria de escoamento, radioi-munoensaio, Western blot, ligação a ligante, atividade de quinase, etc). {Ver, em geral, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, Celis, J., ed., Academic Press (2â ed., 1998); CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coligan, J.E. et al., eds., John Wiley & Sons (1995-2003); ver também, Sumitomo et al., Clin. Câncer Res. 10: 794-801 (2004) (descrevendo Western blot, citometria de escoamento e imunohistoquímica) os inteirosconteúdos dos quais são aqui incorporados por referência)). Alternativamente, ou adicionalmente, pode-se medir os níveis de moléculas de ácido nu-cléico que codifiquem MCSP na célula, por exemplo, via hibridização in situ fluorescente, Southern blotting ou técnicas de PCR. Os níveis de MCSP em células normais são comparados aos níveis de células afetadas por um distúrbio de proliferação celular (por exemplo, câncer) para determinar se MCSP é sobreexpresso.

Conforme usado aqui, o termo molécula de ligação de antígeno ou ABM refere-se, em seu sentido mais amplo, a uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigênico. Mais especificamente, uma molécula de ligação antígeno que se liga a MCSP é uma molécula que se liga de maneira específica a MCSP conforme definido acima. De preferência, a ABM é um anticorpo; no entanto, anticorpos de cadeia única, moléculas de Fv de cadeia única, fragmentos Fab, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e os similares, também são contemplados pela presente invenção.

Por "se liga de maneira específica" ou "se liga com a mesma especificidade" entende-se que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser discriminada a partir de interações indesejadas ou não específicas.

Conforme usados aqui, os termos fusão e quimérico, quando usados em referência a polipeptídeos, tais como ABMs, refere-sem a poli-peptídeos compreendendo seqüências de aminoácidos derivadas a partir de dois ou mais polipeptídeos heterólogos, tais como porções de anticorpos a partir de espécies diferentes. Para ABMs quiméricos, por exemplo, os componentes de ligação de não antígeno podem ser derivados a partir de uma ampla variedade de espécies, incluindo primatas, tais como chimpanzés e humanos. A região constante da ABM quimérica é muitíssimo preferivelmen-te substancialmente idêntica a é região constante de um anticorpo natural humano; a região variável do anticorpo quimérico é muitíssimo preferivel-mente substancialmente idêntica àquela de um anticorpo anti-MCSP recombinante tendo a seqüência de aminoácidos da região variável murina. Anticorpos humanizados são uma forma particularmente preferida de anticorpo de fusão ou quimérico.Conforme usado aqui, um polipeptídeo tendo "atividade de GnTI-//" refere-se a polipeptídeos que são capazes de catalisar a adição de um resíduo de N-acetilglicosamina (GlcNAc) em ligação {3-1-4 ao manosídeo p-ligado do núcleo de trimanosila de oligossacarídeos N-ligados. Isso inclui polipeptídeos de fusão que exibam atividade enzimática similar a, mas, não necessariamente idêntica a, uma atividade de p (1,4)-N-acetilglicosaminil-transferase III, também conhecida como 4-beta-N-acetilglicosaminil-transfe-rase de (3-1,4-manosil-glicoproteína (EC 2.4.1.144), de acordo com o Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular(NC-IUBMB), conforme medida em um ensaio biológico particular, com ou sem dependência de dose. No caso em que exista dependência de dose, ela não necessita ser idêntica àquela de GnTIll, mas, ao invés disso, substancialmente similar à dependência de dose em uma dada atividade, quando comparada à GnTIll (isto é, o polipeptídeo candidato exibirá maior atividade ou não mais do que cerca de 25 vezes menos, e, preferivelmente, não mais do que cerca de 10 vezes menos atividade, e, muitíssimo preferivelmente, não mais do que cerca de 3 vezes menos atividade com relação à GnTIll).

Conforme usado aqui, o termo variante (ou análogo) refere-se a um polipeptídeo que difere de um polipeptídeo da invenção mencionado especificamente por inserções, eliminações e substituições de aminoácido(s), criado usando-se, por exemplo, técnicas de DNA recombinante. Variantes das ABMs da presente invenção incluem moléculas de ligação a antígeno quiméricas, primatizadas ou humanizadas, nas quais um ou mais do que um dos resíduos de aminoacidos estão modificados por substituição, adição e/ou eliminação, de uma maneira tal que não afetem substancialmente a atividade de ligação a antígeno (por exemplo, MCSP) ou a função de efetor de anticorpo. A diretriz na determinação de quais resíduos de aminoacidos podem estar substituídos, adicionados ou eliminados, sem abolir as atividades de interesse, pode ser encontrada por comparação da seqüência do polipeptídeo particular com aquela de peptídeos homólogos e minimizando-se o número de mudanças de seqüência de aminoacidos feitas em regiões de elevada homologia (regiões conservadas) ou por substituição de aminoáci-dos com seqüências de consenso.

Alternativamente, variantes recombinantes, que codificam esses mesmos polipeptídeos ou polipeptídeos similares, podem ser sintetizadas ou selecionadas fazendo-se uso da "redundância" no código genético. Várias substituições de códon, tais como as mudanças silenciosas, que produzem vários sítios de restrição, podem ser introduzidas para se otimizar a clonagem em um plasmídeo ou vetor viral ou a expressão em um sistema procari-ótico ou eucariótico particular. Mutações na seqüência de polinucleotídeos podem estar refletidas no polipeptídeo ou domínios de outros peptídeos adicionados ao polipeptídeo para modificar as propriedades de qualquer parte do polipeptídeo, para modificar características, tais como afinidades de ligação a ligante, afinidades entre cadeias ou taxa de degradação/transferência.

De preferência, "substituições" de aminoácidos são o resultado de substituição de um aminoácido por outro aminoácido tendo propriedades estruturais e/ou químicas similares, isto é, substituições conservativas de aminoácidos. Substituições "conservativas" de aminoácidos podem ser feitas com base em similaridade de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicida-de, hidrofilicidade e/ou natureza antipática dos resíduos envolvidos. Por e-xemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenil-alanina, triptofano e metionina; aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagi-na e glutemina; aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. "Inserções" ou "eliminações" estão, de preferência, na faixa de cerca de 1 a cerca de 20 aminoácidos, mais preferivelmente, cerca de 1 a cerca de 10 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada experimentalmente fazendo-se, de maneira específica, inserções, eliminações ou substituições de aminoácidos em uma molécula de polipeptídeo, usando-se técnicas de DNA recombinante e ensaiando-se as variantes recombinantes resultantes com relação à atividade.

Conforme usado aqui, o termo humanizado é usado para se referir a uma molécula de ligação a antígeno (ABM) derivada a partir de umamolécula de ligação a antígeno não humano, por exemplo, um anticorpo mu-rino, que retenha ou substancialmente retenha as propriedades de ligação a antígeno da molécula parental, mas, que seja menos imunogênico em seres humanos. Isso pode ser conseguido por vários métodos, incluindo (a) enxerto de somente os CDRs não humanos por sobre a grade humana e regiões constantes, com ou sem retenção de resíduos de grade críticos (por exemplo, aqueles que sejam importantes para reter boa afinidade de ligação a antígeno ou funções de anticorpo), ou (b) transplante dos domínios variáveis não humanos completos, mas, "ocultando" os mesmos com uma seção semelhante à humana, por substituição de resíduos de superfície. Tais métodos são descritos em Jones et ai, Nature 327:6069, 522-525 (1986); Morri-son era/., Proc. Natl. Acad. Sei., 87:6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et ai, Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994), todos os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Em geral, existem 3 regiões de determinação comple-mentares, ou CDRs (CDRí, CDR2 e CDR3) em cada um dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo, que estão flanqueadas por quatro subregiões de grade (isto é, FR1, FR2, FR3 e FR4): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Uma discussão sobre anticorpos humanizados pode ser encontrada, inter alia, na patente norte-americana de número 6.632.927, e no Pedido norte-americano publicado de número 2003/0175269, ambos os quais são aqui incorporados em sua totalidade por referência.

Similarmente, conforme usado aqui, o termo primatizado é usado para se referir a uma molécula de ligação a antígeno derivada a partir de uma molécula de ligação a antígeno de não primata, por exemplo, um anticorpo murino, que retenha ou substancialmente retenha as propriedades de ligação a antígeno da molécula parental, mas, que seja menos imunogênico em primatas.

No caso em que existam duas ou mais definições de um termo que seja usado e/ou aceito dentro da técnica, a definição do termo conforme usada aqui pretende incluir todos tais significados, a menos se afirmado ex-plicitamente de maneira contrária. Um exemplo específico, é o uso do termo "região de determinação de complementariedade" ("CDR") para descrever os sítios de combinação de antígeno não contíguos, encontrados dentro da região variável de polipeptídeos de cadeias tanto pesadas quanto leves. Essa região em particular foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983), e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 796:901-917 (1987), os quais são aqui incorporados por referência, onde as definições incluem a sobreposição de subconjuntos de resíduos de aminoácidos, quando comparados um contra os outros. Entretanto, a aplicação de cada definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou sua variante pretende estar dentro do escopo do termo conforme definido e usado aqui. Os resíduos de aminoácido apropriados, que englobam as CDRs, conforme definidas por cada uma das referências citas acima e descritas abaixo na Tabela 1, como uma comparação. Os números exatos de resíduos que englobam uma CDR particular variará dependendo da seqüência e do tamanho da CDR. Os versados na técnica podem determinar de maneira rotineira quais resíduos compreendem uma CDR particular, dada seqüência de aminoácidos de região variável do anticorpo.

TABELA I. DEFINIÇÕES DE CDR1<table>table see original document page 32</column></row><table>

1 Numeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 é de acordo com as convenções de numeração descritas por Kabat et al. (ver abaixo).

2 "AbM" refere-se às CDRs conforme definidas por programa de computador de modelagem de anticorpos de "Abm" da Oxford Molecular.

Kabat et al., também definiram um sistema de numeração paraseqüências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Um versado na técnica pode designar, de maneira não ambígua, esse sistema de "numeração de Kabat" a qualquer seqüência de domínio variável, sem se basear em quaisquer dados experimentais além da própria seqüência. Conforme usada aqui, a "numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração descrito por Kabat et ai, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos se especificado de maneira diferente, as referências à numeração de posições de resíduos de aminoácido específicas em uma ABM estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat. As seqüências da listagem de seqüências (isto é, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 110) não estão numeradas de acordo com o sistema de numeração de Kabat. No entanto, conforme afirmado acima, está bem dentro da capacidade ordinária de um técnico determinar o esquema de numeração de Kabat de qualquer seqüência de região variável na Listagem de Seqüências, com base na numeração das seqüências conforme apresentada aqui.

Por um ácido nucléico ou polinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma seqüência de nucleotídeos de referência da presente invenção, pretende-se que a seqüência de nucleotídeos do polinucleotídeo seja idêntica à seqüência de referência, exceto pelo fato de que a seqüência de polinucleotídeos pode incluir até cinco mutações pontuais para cada 100 nucleotídeos da seqüência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, para se obter um polinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeos pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de nucleotídeos de referência, até 5% dos nucleotídeos, na seqüência de referência, podem ser eliminados ou substituídos por outro nucleotídeo, ou um número de nucleotídeos, de até 5% do total de nucleotídeos na seqüência de referência, pode ser inserido na seqüência de referência.

Como uma questão prática, se qualquer molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo particular for pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a uma seqüência de nucleotídeos ou seqüênciade polipeptídeo da presente invenção, pode ser determinada de maneira convencional, usando-se programas de computador conhecidos. Um método preferido para a determinação do melhor pareamento global entre uma seqüência pesquisada (uma seqüência da presente invenção) e uma seqüência objeto, a que refere-se também como um alinhamento de seqüência global, pode ser determinado usando-se o programa de computador FASTDB, com base no algoritmo de Brutlag et ai., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). Em um alinhamento de seqüências, as seqüências pesquisadas e objetos são, ambas, seqüências de DNA. Uma seqüência de RNA pode ser comparada convertendo-se U's em T's. O resultado de tal alinhamento de seqüências global está em identidade percentual. Parâmetros preferidos u-sados em um alinhamento com FASTDB de seqüências de DNA, para calcular a identidade percentual, são: Matrix=Unitary, k-tuple-4, Mismatch Pe-nalty=l, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=l, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty 0.05, Window Size=500 ou o comprimento da seqüência de nucleotídeos objeto, a que for mais curta.

Se a seqüência objeto for mais curta do que a seqüência de pesquisa, por causa de eliminações de 5' ou de 3', não por causa de eliminações internas, uma correção manual tem que ser feita para os resultados.

Isso é porque o programa FASTDB não leva em consideração truncamentos de 5' e 3' da seqüência objeto quando calcula a identidade percentual. Para seqüências objeto truncadas nas extremidades 5' e 3', com relação à seqüência de pesquisa, a identidade percentual é corrigida por cálculo do número de bases da seqüência de pesquisa que sejam 5' e 3' da seqüênciaobjeto, que não estejam pareadas/alinhadas, como um percentual das bases totais da seqüência de pesquisa. Se um nucleotídeo estiver parea-do/alinhado é determinado por resultados do alinhamento de seqüências por FASTDB. Essa percentagem é, então, subtraída da identidade percentual, calculada pelo programa FASTDB acima usando os parâmetros especificados, para se chegar a uma classificação de identidade percentual final. Essa classificação corrigida é que é usada para as finalidades da presente invenção. Somente bases do lado de fora das bases de 5' e 3' da seqüência obje-to, conforme exibidas pelo alinhamento por FASTDB, que não estiverem pa-readas/alinhadas com a seqüência de pesquisa, são calculadas para as finalidades de ajuste manual da classificação de identidade percentual.

Por exemplo, uma seqüência objeto de 90 bases é alinhada com uma seqüência de pesquisa de 100 bases para determinar a identidade percentual. As eliminações ocorrem na extremidade 5' da seqüência objeto e, portanto, o alinhamento por FASTDB não mostra um pareamento/alinha-mento das primeiras 10 bases na extremidade 5'. As 10 bases não pareadas representam 10% da seqüência (número de bases nas extremidades 5' e 3' não pareadas/número total de bases na seqüência de pesquisa), assim, 10% é subtraído da classificação de identidade percentual calculada pelo programa FASTDB. Se as 90 bases restantes estiverem perfeitamente pareadas, a identidade percentual final seria de 90%. Em outro exemplo, uma seqüência objeto de 90 bases é comparada com uma seqüência de pesquisa de 100 bases. Dessa vez, as eliminações são eliminações internas, de modo que não há bases na 5' ou 3' da seqüência objeto que não estejam parea-das/alinhadas com a seqüência de pesquisa. Nesse caso, a identidade percentual calculada por FASTDB não é corrigida manualmente. Uma vez mais, somente bases de 5' e 3' da seqüência objeto, que não estão pareadas/alinhadas com a seqüência de pesquisa são manualmente corrigidas. Nenhuma outra correção manual deve ser feita para as finalidades da presente invenção.

Por um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma seqüência de aminoácidos de pesquisa da presente invenção, pretende-se que a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo objeto seja idêntica à seqüência de pesquisa, exceto pelo fato de que a seqüência do polipeptídeo objeto possa incluir até cinco alterações de aminoácidos para cada 100 aminoácidos da seqüência de a-minoácidos de pesquisa. Em outras palavras, para se obter um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácidos de pesquisa, até 5% dos resíduos de aminoácidos na seqüência objeto podem ser inseridos, eliminados ou substituídos poroutro aminoácido. Essas alterações da seqüência de referência podem ocorrer nas posições terminais de carbóxi ou de amino da seqüência de aminoacidos de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posições terminais, intercaladas ou individualmente entre resíduos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência.

Como uma questão prática, se qualquer polipeptídeo particular for pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a um polipeptídeo de referência pode ser determinado, de maneira convencional, usando-se programas de computador conhecidos. Um método preferido para a determinação do melhor pareamento global entre uma seqüência pesquisada (uma seqüência da presente invenção) e uma seqüência objeto, a que refere-se também como um alinhamento de seqüência global, pode ser determinado usando-se o programa de computador FASTDB, com base no algoritmo de Brutlag era/., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). Em um alinhamento de seqüências, as seqüências pesquisada e objeto são ou ambas seqüências de nucleotídeos ou ambas seqüências de aminoacidos. O resultado de tal alinhamento de seqüências global está em identidade percentual. Parâmetros preferidos usados em um alinhamento de aminoacidos com FASTDB são: Matrix=PAM, k-tuple=2, Mismatch Penalty=l, Joining Penalty=20, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=l, Window Si-ze=sequence length, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty 0.05, Window Si-ze=500 ou o comprimento da seqüência de aminoacidos objeto, a que for mais curta.

Se a seqüência objeto for mais curta do que a seqüência de pesquisa, por causa de eliminações de terminal N ou C, não por causa de eliminações internas, uma correção manual tem que ser feita para os resultados. Isso é porque o programa FASTDB não leva em consideração trun-camentos de terminal N e C da seqüência objeto quando calcula a identidade percentual global. Para seqüências objeto truncadas nos terminais C e N, com relação à seqüência de pesquisa, a identidade percentual é corrigida por cálculo do número de resíduos da seqüência de pesquisa que sejam terminal N e C da seqüência objeto, que não estejam pareados/alinhados,como um resíduo objeto correspondente, como um percentual das bases totais da seqüência de pesquisa. Se um resíduo estiver pareado/alinhado é determinado por resultados do alinhamento de seqüências por FASTDB. Essa percentagem é, então, subtraída da identidade percentual, calculada pelo programa FASTDB acima usando os parâmetros especificados, para se chegar a uma classificação de identidade percentual final. Essa classificação de identidade percentual final é que é usada para as finalidades da presente invenção. Somente resíduos com relação aos terminais N e C da seqüência objeto, que não estiverem pareados/alinhados com a seqüência de pesquisa, são considerados para as finalidades de ajuste manual da classificação de identidade percentual. Em outras palavras, somente posições de resíduos de pesquisa do lado de fora dos mais afastados resíduos de terminal N e C da seqüência objeto.

Por exemplo, uma seqüência objeto de 90 resíduos de aminoácidos é alinhada com uma seqüência de pesquisa de 100 resíduos para determinar a identidade percentual. A eliminação ocorre no terminal N da seqüência objeto e, portanto, o alinhamento por FASTDB não mostra um pare-amento/alinhamento dos primeiros 10 resíduos no terminal N. Os 10 resíduos não pareados representam 10% da seqüência (número de resíduos nos terminais N e C não pareados/número total de resíduos na seqüência de pesquisa), assim, 10% é subtraído da classificação de identidade percentual calculada pelo programa FASTDB. Se os 90 resíduos restantes estiverem perfeitamente pareados, a identidade percentual final seria de 90%. Em outro exemplo, uma seqüência objeto de 90 resíduos é comparada com uma seqüência de pesquisa de 100 resíduos. Dessa vez, as eliminações são eliminações internas, de modo que não há resíduos nos terminais N ou C da seqüência objeto que não estejam pareados/alinhados com a seqüência de pesquisa. Nesse caso, a identidade percentual calculada por FASTDB não é corrigida manualmente. Uma vez mais, somente posições de resíduos do lado de fora das extremidades de terminais NeCda seqüência objeto, conforme exibidas no alinhamento com FASTDB, que não estão pareados/alinhados com a seqüência de pesquisa são manualmente corrigidos.Nenhuma outra correção manual deve ser feita para as finalidades da presente invenção.

Conforme usado aqui, um ácido nucléico que "se hibridize sob condições restritivas" com uma seqüência de ácidos nucléicos da invenção, refere-se a um polinucleotídeo que se hibridize em uma incubação durante uma noite, a 42°C, em uma solução compreendendo formamida à 50%, 5x de SSC (NaCI 750 mM, citrato de sódio 75 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), 5x de solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10% e 20 ug/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado, desnaturado, seguida por lavagem dos filtros em 0,1 x de SSC, a cerca de 65°C.

Conforme usado aqui, o termo domínio de localização de Golgi refere-se a uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo residente em Golgi, que seja responsável pela ancoragem do polipeptídeo em localização dentro do complexo de Golgi. Em geral, domínios de localização compreendem "caudas" terminais de amino de uma enzima.

Conforme usado aqui, o termo função de efetor refere-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região de Fc (uma região de Fc de seqüência nativa ou região de Fc de variante de seqüência de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplo de funções de efetor de anticorpo incluem, mas, não estão limitadas a, afinidade de ligação a receptor de Fc, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), secreção de citocina, assimilação de antígeno mediada por imunocomplexo por células que apresentem antígeno, regulação à jusante de receptores de superfície celular, etc.

Conforme usado aqui, os termos engenheiro, engenheirado, engenharia, glicoengenheirado e engenharia de glicosilação são considerados a incluir qualquer manipulação do padrão de glicosilação de um polipeptídeo que ocorre naturalmente ou recombinante, tal como uma molécula de ligação a antígeno (ABM), ou seu fragmento. A engenharia de glicosilação incluia engenharia metabólica da maquinaria de glicosilação de uma célula, incluindo manipulações genéticas das vias de síntese de oligossacarídeos para se conseguir glicosilação alterada de gliçoproteínas expressas em células.Além disso, a engenharia de glicosilação inclui os efeitos de mutações e ambiente celular sobre a glicosilação. Em uma concretização, a engenharia de glicosilação é uma alteração de atividade de glicosiltransferase. Em uma concretização particular, a engenharia resulta em atividade de glicoaminil-transferase e/ou atividade de fucosiltransferase alteradas.

Conforme usado aqui, o termo célula de hospedeiro cobre qualquer tipo de sistema celular, que possa ser engenheirado para gerar os poli-peptídeos e moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Em uma concretização, a célula de hospedeiro é engenheirada para permitir a produção de uma molécula de ligação a antígeno com glicoformas modificadas. Em uma concretização preferida, a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo, fragmento de anticorpo ou proteína de fusão. Em certas concretizações, as células de hospedeiro têm sido adicionalmente manipuladas para expressarem níveis aumentados de um ou mais polipeptídeos tendo atividade de GnTIll. Em outras concretizações, as células de hospedeiro têm sido engenheiradas para ter eliminada, reduzida ou inibida a atividade de a 1,6-fucosiltransferase de núcleo. O termo "atividade de a 1,6-fucosiltransferase de núcleo" engloba tanto a expressão do gene de a 1,6-fucosiltransferase de núcleo, assim como a interação da enzima de a 1,6-fucosiltransferase de núcleo com seu substrato. Células de hospedeiro incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas de mamíferos, tais como células de CHO, células de BHK, células de NSO, células de SP2/0, células de mieloma de YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células de PER, células de PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de insetos e células vegetais, para citar somente umas poucas, mas, também, células compreendidas dentro de um animal transgênico, de uma planta transgênica ou planta cultivada ou tecido animal.

Conforme usado aqui, o termo citotoxicidade celular mediada por Fc inclui citotoxicidade celular dependente de anticorpo e citotoxicidade cèlular mediada por uma proteína de fusão de Fc solúvel contendo uma região de Fc humana. É um mecanismo imune conduzindo à lise de "células direcionadas a anticorpo" por "células efetoras imunes humanas", em que:As células efetoras imunes humanas são uma população de leu-cócitos que exibem receptores de Fc sobre sua superfície, através dos quais eles se ligam à região de Fc de anticorpos ou de proteínas de fusão e realizam funções de efetor. Uma tal população pode incluir, mas, não está limitada a, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e/ou células assassinas naturais (NK).

As células direcionadas a anticorpo são células ligadas pelas ABMs (por exemplo, anticorpos ou proteínas de fusão de Fc) da invenção. Em geral, os anticorpos ou proteínas de fusão de Fc se ligam a células alvo por meio do terminal N da parte de proteína da região de Fc.

Conforme usado aqui, o termo citotóxicidade celular mediada por Fc é definido ou como um aumento no número de "células direcionadas a anticorpo" que são lisadas em um dado instante, em uma dada concentração de anticorpo, ou de proteína de fusão de Fc, no meio circundando as células alvo, pelo mecanismo de citotóxicidade celular mediada por Fc definido acima, e/ou uma redução na concentração de anticorpo, ou de proteína de fusão de Fc, no meio circundando as células alvo, necessária para se alcançar a lise de um dado número de "células direcionadas a anticorpo", em uma dado instante, pelo mecanismo de citotóxicidade celular mediado por Fc.

O aumento de citotóxicidade celular mediada por Fc é relativo à citotóxicidade celular mediada pelo mesmo anticorpo, ou proteína de fusão de Fc, produzido pelo mesmo tipo de células de hospedeiro, usando a mesma produção, purificação, formulação e métodos de armazenamento padrão, que são conhecidos pelos versados na técnica, mas, que não tenha sido produzido por células de hospedeiro glicoengenheiradas para expressar a glicosiltransferase GnTIll pelos métodos aqui descritos.

Por anticorpo tendo citotóxicidade celular dependente de anticorpo aumentada (ADCC) entende-se um anticorpo, como aquele termo é aqui definido, tendo ADCC aumentada, conforme determinada por qualquer método adequado conhecido pelos versados na técnica de capacidade ordinária. Um ensaio de ADCC in vitro aceito é como se segue:o ensaio usa células alvo que são conhecidas a expressarem o antígeno alvo, reconhecido pela região de ligação a antígeno do anticorpo;

o ensaio usa células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs), isoladas a partir de sangue de um doador saudável escolhido aleatoriamente, como células efeto-ras;

o ensaio é realizado de acordo com o seguinte protocolo:

i) as PBMCs são isoladas usando-se procedimentos de centrifugação por densidade padrão e são suspensas em 5 x 106 células/mL em meio de cultura de células RPM1;

ii) as células alvo são cultivadas por métodos de cultura de tecidos padrão, coletadas a partir da fase de crescimento exponencial com uma viabilidade mais elevada do que 90%, lavadas em meio de cultura de células RPM1, marcadas com 100 microCurie de 51Cr, lavadas duas vezes com meio de cultura de células, e ressuspensas em meio de cultura de células em uma densidade de 105 células/mL;

iii) 100 microlitros da suspensão de células alvo final a-cima são transferidas para cada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades;

iv) o anticorpo é diluído em série desde 4.000 ng/mL a 0,04 ng/mL em meio de cultura de células e 50 microlitros das soluções de anticorpo resultantes são adicionadas às células alvo na placa de microtitulação de 96 cavidades, testagem em triplicata várias concentrações de anticorpos cobrindo toda a faixa de concentrações acima;

v) para os controles de liberação máxima (MR), 3 cavidades adicionais na placa contendo as células alvomarcadas, recebem 50 microlitros de uma solução aquosa a 2% (v/v) de detergente não iônico (Nonidet, Sigma, St. Louis), ao invés da solução de anticorpo (ponto iv acima);

vi) para os controles de liberação espontânea (SR), 3 cavidades adicionais na placa contendo as células alvo marcadas, recebem 50 microlitros de meio de cultura de células de RPM1, ao invés da solução de anticorpo (ponto iv acima);

vii) a placa de microtitulação de 96 cavidades é, então, centrifugada a 50 x g durante 1 minuto e incubada durante 1 hora, a 4°C;

viii) 50 microlitros da suspensão de PBMC (ponto i acima) são adicionados a cada cavidade para fornecer uma razão de células efetoras : alvo de 25:1 e as placas são colocadas em uma incubadora sob atmosfera de 5% de C02, a 37°C, durante 4 horas;

ix) o sobrenadante livre de células a partir de cada cavidade é coletado e a radioatividade liberada experimentalmente (ER) é quantificada usando-se um contador gama;

x) a percentagem de lise específica é calculada para cada concentração de anticorpo de acordo com a fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, em que ER é a radioatividade média quantificada (ver ponto ix acima) para aquela concentração de anticorpo, MR é a radioatividade média quantificada (ver ponto ix acima) para os controles MR (ver ponto v acima), e SR é a radioatividade média quantificada (ver ponto ix acima) para os controles SR (ver ponto vi acima);

"ADCC aumentada" é definida ou como um aumento na percentagem máxima de lise específica observada dentroda faixa de concentrações de anticorpo testada acima, e/ou uma redução na concentração de anticorpo necessária para se conseguir metade da percentagem máxima de lise específica observada dentro da faixa de concentrações de anticorpo testada acima. O aumento de ADCC é relativa à

ADCC, medida com o ensaio acima, mediada pelo mesmo anticorpo, produzida pelo mesmo tipo de células de hospedeiro, usando a mesma produção, purificação, formulação e métodos de armazenamento padrão, que são conhecidos pelos versados na técnica, mas, que não tinham sido produzidos por células de hospedeiro engenheiradas para so-breexpressarem GnTIll. Em um aspecto, a presente invenção está relacionada a moléculas de ligação a antígeno tendo a mesma especificidade de ligação que o anticorpo 225.28S murino (isto é, se liga substancialmente ao mesmo epito-po com substancialmente a mesma afinidade) e à constatação de que suas funções de efetor possam ser intensificadas por glicosilação alterada. Em uma concretização, a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo quimé-rico. Em uma concretização preferida, a invenção é dirigida a um anticorpo quimérico, ou um seu fragmento, compreendendo pelo menos uma, alternativamente pelo menos duas, alternativamente pelo menos três, alternativamente pelo menos quatro, alternativamente pelo menos cinco ou alternativamente pelo menos seis das CDRs das Tabelas 3 ou 4 (SEQ ID NOs: 62 -108). Especificamente, em uma concretização preferida, a invenção é dirigida a um polinucleotídeo isolado compreendendo: (a) uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 71; SEQ ID NO: 73 e SEQ ID NO: 75; (b) uma seqüência selecionada a partir de um grupo consistindo em: SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 79; SEQ ID NO: 81; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 91 e SEQ ID NO: 93; e (c) SEQ ID NO: 95. Em outra concretização preferida, a invenção é dirigida a um polinucleotídeo isolado compreendendo (a)uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 97; SEQ ID NO: 99; e SEQ ID NO: 101; (b) uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 103 e SEQ ID NO: 105; e (c) SEQ ID NO: 107. Em uma concretização, qualquer desses polinucleotídeos codifica um polipeptídeo de fusão.

Em outra concretização, a molécula de ligação a antígeno compreende o domínio de VH do anticorpo 225.28 codificado por uma seqüência na Tabela 6 (SEQ ID NOs:1 - 23 ímpar), ou uma sua variante; e um polipeptídeo não murino. Em outra concretização preferida, a invenção é dirigida a uma molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio de VL do anticorpo de rato codificado por SEQ ID NOs: 27 - 51 (ímpar) ou uma sua variante; e um polipeptídeo não murino.

Em outro aspecto, a invenção é dirigida a moléculas de ligação a antígeno compreendendo uma ou mais CDRs truncadas de 225.28S. Tais CDRs truncadas conterão, no mínimo, os resíduos de aminoácidos determinantes de especificidade para a dada CDR. Por "resíduo determinante de especificidade" entende-se aqueles resíduos que estejam diretamente envolvidos na interação com o antígeno. Em geral, somente cerca de um quinto a um terço dos resíduos, em uma dada CDR, participam da ligação a antígeno. Os resíduos determinantes de especificidade, em uma CDR particular, pode ser identificada, por exemplo, por computação dos contatos intera-tômicos a partir de modelagem tridimensional e determinação da variabilida-de de seqüência em uma dada posição de resíduo, de acordo com os métodos descritos em Padlan et aí., FASEB J. 9(7): 133-139 (1995), o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Conseqüentemente, a invenção é também dirigida a um polinu-cleotídeo isolado compreendendo pelo menos uma região determinante de complementariedade do anticorpo 225.28S murino, ou uma sua variante ou forma truncada contendo pelo menos os resíduos determinantes de especificidade para a região determinante de complementariedade, sendo que o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão. De preferência, tais polinucleotídeos isolados codificam um polipeptídeo de fusão, que éuma molécula de ligação a antígeno. Em uma concretização, o polinucleotí-deo compreende duas ou três ou quatro ou cinco ou seis regiões determinantes de complementariedade do anticorpo 225.28S murino, ou suas variantes ou formas truncadas contendo pelo menos os resíduos determinantes de especificidade para cada um das duas ou três ou quatro ou cinco ou seis regiões determinantes de complementariedade. Em uma concretização, o polinucleotídeo compreende pelo menos um dos CDRs descritos nas Tabelas 2 e 5, abaixo. Em outras concretização, o polinucleotídeo codifica a região variável completa da cadeia leve ou pesada de um anticorpo quimérico (por exemplo, humanizado). A invenção é adicionalmente dirigida aos poli-peptídeos codificados por tais polinucleotídeos.

Em outra concretização, a invenção é dirigida a uma molécula de ligação a antígeno compreendendo pelo menos um, alternativamente pelo menos dois, alternativamente pelo menos três, alternativamente pelo menos quatro, alternativamente pelo menos cinco ou alternativamente pelo menos seis regiões determinantes de complementariedade do anticorpo 225.28S murino, ou uma sua variante ou forma truncada contendo pelo menos os resíduos determinantes de especificidade para cada região determinante de complementariedade, e compreendendo uma seqüência derivada a partir de um polipeptídeo heterólogo. Em uma concretização, a molécula de ligação a antígeno compreende três regiões determinantes de complementariedade do anticorpo 225.28S murino, ou suas variantes ou formas truncadas contendo pelo menos os resíduos determinantes de especificidade para cada das três regiões determinantes de complementariedade. Em uma concretização, a molécula de ligação a antígeno compreende pelo menos um, alternativamente pelo menos duas, alternativamente pelo menos três, alternativamente pelo menos quatro, alternativamente pelo menos cinco ou alternativamente pelo menos seis das CDRs descritas nas Tabelas 3 e 4, abaixo. Em outro aspecto, a molécula de ligação a antígeno compreende a região variável de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo. Em uma concretização particularmente útil, a molécula de ligação a antígeno de um anticorpo quimérico, por exemplo, humanizado. A invenção está também dirigida a meto-dos de preparação de tais moléculas de ligação a anticorpo, e ao uso das mesmas no tratamento de doença, particularmente, distúrbios de proliferação celular, em que MCSP seja expresso, particularmente nos quais MCSP seja expresso de maneira anormal (por exemplo, sobreexpresso), comparado a células normais do mesmo tipo de tecido. Tais distúrbios incluem, mas, não estão limitados a, melanoma, glioma, câncer de seio lobular, algumas leucemias agudas e todos os tumores que induzam neovasculatura. Os níveis de expressão de MCSP podem ser determinados por métodos conhecidos na técnica e aqueles descritos aqui (por exemplo, ensaio de imunohisto-química, ensaio de imunofluorescência, ensaio de imunoenzima, ELISA, ci-tometria de escoamento, radioimunoensaio, Western blot, ligação a ligante, atividade de quinase, etc).

A invenção é também dirigida a um método para direcionamento in vivo ou in vitro de células que expressam MCSP. Células que expressam MCSP podem ser atingidas para finalidades terapêuticas (por exemplo, para tratar um distúrbio que seja tratável por rompimento de ligação a um ligante, ou atingindo-se células que expressem MCSP para destruição pelo sistema imune). Em uma concretização, a presente invenção é direcionada a um método para atingir células que expressem MCSP em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição compreendendo uma ABM da invenção. Células, que expressem MCSP, podem também ser atingidas para finalidades diagnosticas (por exemplo, para determinar se elas estão expressando MCSP, normalmente ou anormalmente). Portanto, a invenção é também dirigida a métodos para detecção da presença de MCSP ou uma célula expressando, in vivo ou in vitro. Um método de detecção de expressão de MCSP de acordo com a presente invenção compreende a colocação em contato de uma amostra a ser testada, opcionalmente, com uma amostra de controle, com uma ABM da presente invenção, sob condições que permitam a formação de um complexo entre a ABM e MCSP. A formação de complexo é, então, detectada (por exemplo, por ELISA ou outros métodos conhecidos na técnica). Quando se usa uma amostra de controle com a amostra de teste, qualquer diferença estatisticamente significativa, na for-mação de complexos ABM-MCSP, quando se compara às amostras de teste de controle, é indicativa da presença de MCSP na amostra de teste.

TABELA 2<table>table see original document page 47</column></row><table>TABELA 3

<table>table see original document page 48</column></row><table>

TABELA 4

<table>table see original document page 48</column></row><table>TABELA 5

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Sabe-se que vários mecanismos estão envolvidos na eficácia terapêutica de anticorpos anti-MCSP, incluindo ligação a MCSP, bloqueio de ligantes a MCSP, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), inibição de adesão e de migração de células de melanoma, inibição de respostas quimiotáticas à fibronectina e inibição/morte de perfeitos, inibição de disseminação celular sobre proteínas de ECM, tais como colágeno e fibronectina, inibição de reorganização de citoesqueleto e inibição de redes de transdução de sinal mediada por MCSP (por exemplo, redes FAK e ERK). Portanto, as ABMs da invenção podem ser usadas para quaisquer dessas finalidades.

O anticorpo monoclonal murino 225.28S tem sido usado na ra-dioimunodetecção de melanoma maligno. Buraggi et ai, Nuklearmedizin 25(6):220-224 (1986). Mais recentemente, ele foi clonado em configuração de Fv de cadeia única para expressão solúvel em bactérias. Neri et ai, J. Invest. Dermatol. 107(2): 164-170 (1996), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Anticorpos de camundongo/humanos quiméricos foram descritos. Ver, por exemplo, Morrison, S. L. et ai, PNAS 7 7:6851-6854 (Novembro 1984); Publicação de Patente Européia de número 173494; Boulianna, G. L, et al, Nature 312:642 (Dezembro 1984); Neubeiger, M. S. et ai, Nature 374:268 (Março 1985); Publicação de Patente Européia de número 125023;Tan et ai, J. Immunol. 735:8564 (Novembro 1985); Sun, L. K et ai, Hybri-doma 5(1):5M (1986); Sahagan et ai, J. Immunol. 737:1066- 1074 (1986). Ver, genericamente, Muron, Nature 372:597 (Dezembro 1984); Dickson, Ge-netic Engineering News 5(3) (Março 1985); Marx, Science 229.455 (Agosto 1985); e Morrison, Science 229.1202-1207 (Setembro 1985).

Em uma concretização particularmente preferida, a ABM quimé-rica de presente invenção é um anticorpo humanizado. Métodos para huma-nização de anticorpos não humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, ABMs humanizados da presente invenção podem ser preparados de acordo com os métodos da patente norte-americana de número 5.225.539 para Winter; patente norte-americana de número 6.180.370 para Queen et al.\ patente norte-americana de número 6.632.927 para Adair et a/.; publicação de pedido de patente norte-americana de número 2003/0039649 para Foote; publicação de pedido de patente norte-americana de número 2004/0044187 para Sato et ai; ou publicação de pedido de patente norte-americana de número 2005/0033028 para Leung et ai, a totalidade dos conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência. De preferência, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos, a partir de uma fonte que não seja humana. A esses resíduos de aminoácidos não humanos refere-se freqüentemente como resíduos de "importação", que são tipicamente tomados a partir de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e outros. (Jones et ai, Nature, 321:522- 525 (1986); Rie-chmann et ai, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et ai, Science, 239. 1534-1536 (1988)), substituindo-se seqüências de região hipervariável pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Conseqüentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (patente norte-americana de número 4.816.567), sendo que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente a partir de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são, tipicamente, anticorpos humanos, nos quais alguns resíduos de região hipervariável e, possivelmente, alguns resíduos de FR estãosubstituídos por resíduos a partir de sítios análogos em anticorpos de roedo-res. Os anticorpos de anti-MCSP humanizados objeto, em geral, compreenderão regiões constantes de imunoglobulinas humanas, tais como lgG1.

A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem usados na preparação dos anticorpos humanizados, é muito importante reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim chamado método de "melhor ajuste", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada em face da biblioteca completa de seqüências de domínio variável humanas conhecidas. A seqüência humana, que estiver mais próxima àquela do roedor é, então, aceita como a região de quadro humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et ai, J. Immunol, 757:2296 (1993); Chothia et ai, J. Mol. Biol, 796:901 (1987)). Outro método de seleção da seqüência de quadro humana é comparar a seqüência de cada subregião individual do quadro de roedor completo (isto é, FR1, FR2, FR3 e FR4) ou alguma combinação das subregiões individuais (por exemplo, FR1 e FR2) em face de uma biblioteca de seqüências de região variável humanas conhecidas, que correspondam àquela subregião de quadro (por exemplo, conforme determinado pela numeração de Kabat), e escolher a seqüência humana para cada subregião ou combinação que seja a mais próxima àquela do roedor (Leung publicação de pedido de patente norte-americana de número 2003/0040606A1, publicado em 27 de fevereiro de 2003) (a totalidade dos conteúdos dos quais é aqui incorporada por referência). Outro método usa uma região de quadro particular derivada a partir da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leve e pesada. O mesmo quadro pode ser usado para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 00:4285 (1992); Presta et ai, J Immunol, 757:2623 (1993)) (a totalidade dos conteúdos dos quais é aqui incorporada por referência).

É adicionalmente importante que anticorpos sejam humanizados com retenção de elevada afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para se atingir esse objetivo, de acordo com um método preferido, anticorpos humanizados são preparados por um método de análi-se das seqüências parentais e vários produtos humanizados conceituais u-sando-se modelos tridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais podem ser gerados usando-se programas de computador familiares aos versados na técnica (por exemplo, Insightll, accelrys inc (antigo MSI), ou em http://swissmodel.expasv.org/ descrito por Schwede era/., Nucleic Acids Res. 2003 (13):3381-3385). A inspeção desses modelos permite a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar a seu antígeno. Dessa maneira, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências de receptor e de importação, de modo que a característica de anticorpo desejada, tal que seja alcançada a afinidade mantida para o(s) antígeno(s). Em geral, os resíduos de região hipervariável estão diretamente e muitíssimo substancialmente envolvidos na influência de ligação a antígeno. Em uma concretização particular, a ABM da invenção compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo com uma prolina na posição 46 (Kabat). Em outra concretização, a ABM da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada de anticorpo, com um ou mais de um resíduo de fenil-alanina na posição 27, um resíduo de serina na posição 30, ou um resíduo de se ri na ou de treonina na posição 94. Esses resíduos podem ser de ocorrência na região variável de cadeia leve ou pesada particular, ou podem ser introduzidos por substituição de a-minoácidos.

Em uma concretização, os anticorpos da presente invenção compreendem uma região de Fc humana. Em uma concretização específica, a região constante humana é lgG1, conforme descrita em SEQ ID NOs:109 a 110, descrita abaixo:Seqüência de Nucleotídeos de Região Constante de lgG1 Humana (SEQ ID NO: 110)

ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG

GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT

GACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG

GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC

CTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA

GCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC

ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCC

TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC

ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACT

GGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGA

GCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG

GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCC

AGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA

CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCA

GCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTG

GGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG

GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG

GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTGTGCACA

ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

Seqüência de Aminoácidos de Região Constante de lgG1 Humana (SEQ ID

NO: 109)

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

No entanto, variantes e isoformas da região de Fc humana são também englobados pela presente invenção. Por exemplo, regiões de Fc variantes adequadas para uso na presente invenção podem ser produzidasde acordo com os métodos ensinados na patente norte-americana de número 6.737.056 para Presta (variantes de região de Fc com função de efetor alterada devido a uma ou mais modificações de aminoácidos); nos pedidos de patentes Norte-americanas Nes 60/439,498, 60/456,041, 60/514,549 ou WO 2004/063351 (variantes de região de Fc com aumento de afinidade de ligação devido à modificação de aminoácido) ou no pedido de Patente Norte-americana de número 10/672.280 ou WO 2004/099249 (variantes de Fc com ligação alterada a FcgammaR, devido à modificação de aminoácidos), os conteúdos de cada um dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Em outra concretização, as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção são engenheiradas para ter afinidade de ligação intensificada de acordo com, por exemplo, os métodos descritos no pedido de patente norte-americana de número 2004/0132066 para Balin et a/:, o conteúdo completo do qual é aqui incluído por referência.

Em uma concretização, a molécula de ligação a antígeno da presente invenção está conjugada a uma porção adicional, tal como um ra-diomarcador ou uma toxina. Tais ABMs conjugadas podem ser produzidas por inúmeros métodos, que são bem-conhecidos na técnica.

Uma variedade de radionuclídeos são aplicáveis à presente invenção é os versados na técnica são creditados com a capacidade de determinar prontamente, que radionuclídeo é mais apropriado sob uma variedade de circunstâncias. Por exemplo, 131 iodo é um radionuclídeo bem-conhecido usado para a imunoterapia objetivada. No entanto, a utilidade clínica de 131 iodo pode estar limitada por vários fatores incluindo: meia-vida física de oito dias; desalogenação de anticorpo iodado tanto no sangue quanto em sítios de tumor; e características de emissão (por exemplo, componente gama grande), que pode ser subótima para deposição de dose localizada em tumor. Com o advento de agentes quelantes superiores, a oportunidade para ligação a grupos quelantes de metal a proteínas aumentaram as oportunidades de utilizar outros radionuclídeos, tais como 111 índio e 90ítrio. 90ítrio fornece vários benefícios para a utilização em aplicações radioimuno-terápicas: a meia-vida de 64 horas de ítrio é longa o bastante para permitir cumulação de anticorpo por tumor, e, de maneira diferente, por exemplo, 131 iodo, 90ítrio é um emissor beta puro de energia elevada com nenhuma irradiação gama acompanhante em seu decaimento, com uma faixa em tecido de 100 a 1.000 diâmetros celulares. Além disso, a quantidade mínima de radiação penetrante permite administração fora do paciente de anticorpos marcados com 90ítrio. Adicionalmente, a internalização de anticorpo marcado não é necessária para matar a célula, e a emissão local de radiação ionizan-te deve ser letal para células de tumor adjacentes carecendo do antígeno alvo.

Com respeito aos anticorpos anti-MCSP rádiomarcados, a terapia com eles pode também ocorrer usando-se um tratamento de terapia única ou usando-se tratamentos múltiplos. Por causa do componente de radio-nuclídeo, prefere-se que, antes do tratamento, células troco periféricas ("PSC") ou medula óssea ("BM") sejam "coletadas" para pacientes que experimentem toxicidade de medula óssea potencialmente fatal, resultando de radiação. BM e/ou PSC são coletadas usando-se técnicas padrão, e, então, purgadas e congeladas para possível reinfusão. Adicionalmente, é muitíssimo preferido que, antes do tratamento, um estudo de dosimetria diagnostica, usando um anticorpo marcado diagnóstico (por exemplo, usando-se 111 índio), seja conduzido no paciente, uma finalidade do qual é assegurar que o anticorpo terapeutícamente marcado (por exemplo, usando-se 90ítrio) não se tornará desnecessariamente "concentrado" em qualquer órgão ou tecido normal.

Em uma concretização preferida, a presente invenção é dirigida a um polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos na Tabela 7, abaixo (SEQ ID NOs:2 - 52 pares). A invenção é adicionalmente dirigida a um ácido nucléico isolado compreendendo uma seqüência pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de nucleotí-deos mostrada na Tabela 6, abaixo (SEQ ID NOs:1 - 55 ímpares). Em outra concretização, a invenção é dirigida a um ácido nucléico isolado compreen-dendo uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácidos na Tabela 7 (SEQ ID NOs:2 - 52 pares). A invenção também engloba um ácido nucléico isolado compreendendo uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de qualquer dos constructos na Tabela 7 (SEQ ID NOs:2 - 52 pares)com substituições de aminoácidos conservativas).

TABELA 6

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TABELA 6 <table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table>

Em outra concretização, a presente invenção é dirigida a um vetor de expressão e/ou célula de hospedeiro, que compreende um ou mais polipeptídeos isolados da presente invenção.

Em geral, qualquer tipo de linhagem de células cultivada pode ser usada para expressar a ABM da presente invenção. Em uma concretização preferida, células HEK293-EBNA, células de CHO, células BHK, células NSO, células de SP2/0, células de mieloma de YO, células de mieloma de camundongo de P3X63, células de PER, células de PER.C6 ou células de hibridoma, outras células de mamífero, células de levedura, células de inseto ou células vegetais são usadas como a linhagem de células básica para gerar as células de hospedeiro engenheiradas da invenção.

A eficácia terapêutica das ABMs da presente invenção pode ser intensificada produzindo-as em uma célula de hospedeiro que expresse adicionalmente um ou mais dos seguintes: um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de GnTIll, um polinucleotídeo que codifica um polinucleotídeo tendo atividade de Manll ou um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de GalT. Em uma concretização preferida, a célula de hospedeiro expressa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de GnTIll ou atividade de Manll. Em outra concretização preferida, a célula de hospedeiro expressa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de GnTIll, assim como um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de Manll. Em ainda outra concretização preferida, o polipeptídeo tendo atividade de GnTIll é um polipeptí-deo de fusão compreendendo um domínio de localização em Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi. Em outra concretização preferida, a expressão das ABMs da presente invenção, em uma célula de hospedeiro, que expresse um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de GnTIM, resulta em ABMs com afinidade aumentada de ligação a receptor de Fc e função de efetor aumentada. Conseqüentemente, em uma concretização, a presente invenção é dirigida a uma célula de hospedeiro compreendendo (a) um ácido nucléico isolado compreendendo uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo atividade de GnTIM; e (b) um polinucleotídeo isolado que codifica uma ABM da presente invenção, tal como um anticorpo quimérico, primatizado ou humanizado que se ligue a MCSP humano. Em uma concretização preferida, o polipeptídeo tendo atividade de GnTIll é um polipeptídeo de fusão compreendendo o domínio catalítico de GnTIM e o domínio de localização em Golgi é o domínio de localização de manosidase II. Métodos para a geração de tais polipeptídeos de fusão e usá-los para produzirem anticorpos com funções de efetor aumentadas são descritos no pedido de patente provisório norte-americano de número 60/495.142 e na publicação de pedido de patente norte-americana de número 2004/0241817 A1, os conteúdos de cada um dos quais são aqui expressamente incorporados por referência. Em outra concretização preferida, a ABM quimérica é um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, tendo a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino. Em uma concretização particularmente preferida, o anticorpo quimérico compreende uma Fc humana. Em outra concretização preferida, o anticorpo é primatizado ou humanizado.

Em uma concretização alternativa, as ABMs da presente invenção podem ser intensificadas produzindo-as em uma célula de hospedeiro que tenha sido engenheirada para ter atividade reduzida, inibida ou eliminada de pelo menos uma fucosiltransferase.

Em uma concretização, um ou vários polinucleotídeos, que codifiquem uma ABM da presente invenção, podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regulado. Sistemas de expressão regulados adequados incluem, mas, nãoestão limitados a, um sistema de expressão regulado por tetraciclina, um sistema de expressão indutível por ecdisona, um sistema de expressão com comutação de lac, um sistema de expressão indutível por glicocorticóide, um sistema de expressão indutível por temperatura e um sistema de expressão indutível por metal metalotioneína. Se vários ácidos nucléicos diferentes, que codificam uma ABM da presente invenção, estiverem compreendidos dentro do sistema de célula de hospedeiro, alguns deles podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo, enquanto que outros são expressos sob o controle de um promotor regulado. O nível de expressão máximo é considerado ser o nível mais alto possível de expressão de polipeptídeo estável, que não tenha um efeito adverso significativo sobre a taxa de crescimento celular, e será determinado usando-se experimentação de rotina. Os níveis de expressão são determinados por métodos geralmente conhecidos na técnica, incluindo análise de Western blot usando-se um anticorpo específico para a ABM ou um anticorpo específico para uma etiqueta de peptídeo fundida à ABM; e análise de Northern blot. Em uma alternativa adicional, o polinucleotídeo pode estar operativamente ligado ao gene de repórter; os níveis de expressão de uma ABM quimérica tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino são determinados por medição de um sinal correlacionado com o nível de expressão do gene de repórter. O gene de repórter pode ser transcrito em conjunto com o(s) ácido(s) nucléico(s) que codifica(m) o polipeptídeo de fusão como uma única molécula de mRNA; suas respectivas seqüências de codificação podem estar ligadas por um sítio de entrada em ribossoma interno(IRES) ou por intensificador de tradução independente de cap (CITE). O gene de repórter pode ser traduzido em conjunto com pelo menos ácido nucléi-co que codifica uma ABM quimérica tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino, tal que uma única cadeia de polipeptídeo seja formada. Os ácidos nucléicos que codificam as ABMs da presente invenção podem estar operativamente ligados ao gene de repórter sob o controle de um promotor único, tal que o ácido nu-cléico, que codifica o polipeptídeo de fusão e o gene de repórter sejamtranscritos em uma molécula de RNA, que é alternativamente clivada em duas moléculas de RNA mensageiro (mRNA) separadas; um dos mRNAs resultantes é traduzido na proteína repórter, e o outro é traduzido no polipep-tídeo de fusão.

Métodos, que são bem-conhecidos pelos versados na técnica, podem ser usados para construir vetores de expressão contendo a seqüência de codificação de uma ABM tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino em conjunto com sinais de controle transcricional/traducional apropriados. Esses métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombi-nação in wVo/recombinação genética. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et ai, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) e Ausubel et ai, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y (1989).

Uma variedade de sistemas de hospedeiro - vetor de expressão pode ser utilizada para expressar a seqüência de codificação das ABMs da presente invenção. De preferência, células de mamífero são usadas como sistemas de célula de hospedeiro, transfectadas com DNA de plasmídeo recombinante ou vetores de expressão de DNA de cosmídeo contendo a seqüência de codificação da proteína de interesse e a seqüência de codificação do polipeptídeo de fusão. Muitíssimo preferivelmente, são usadas, como sistema de célula de hospedeiro, células de CHO, células BHK, células NSO, células de SP2/0, células de mieloma de YO, células de mieloma de camundongo de P3X63, células de PER, células de PER.C6 ou células de hibridoma, outras células de mamífero, células de levedura, células de inseto ou células vegetais. Alguns exemplos de sistemas de expressão e métodos de seleção são descritos nas seguintes referências e nas referências ali: Borth et ai, Biotechnoi Bioen. 71 (4):266-73 (2000-2001), em Werner et ai, Arzneimitíelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998), em Ander-sen e Krummen, Curr. Op. Biotechnoi 73:117- 123 (2002), em Chadd e Chamow, Curr. Op. Biotechnoi. 72:188-194 (2001), e em Giddings, Curr. Op.Biotechnol. 12: 450-454 (2001). Em concretizações alternativas, outros sistemas de células de hospedeiro eucarióticas podem ser usados, incluindo células de levedura transformadas com vetores de expressão em levedura recombinante contendo a seqüência que codifica de uma ABM da presente invenção, tais como os sistemas de expressão ensinados no pedido de patente norte-americana de número 60/344.169 e WO 03/056914 (métodos para produção de glicoproteína semelhante a humana em uma célula de hospedeiro eucariótica não humana) (os conteúdos de cada um dos quais são incorporados por referência em sua totalidade); sistemas de células de inseto infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por e-xemplo, baculovírus) contendo a seqüência de codificação de uma ABM quimérica tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino; sistemas de células vegetais infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus de mosaico de couve-flor, CaMV; vírus de mosaico de tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo de Ti) contendo a seqüência de codificação da ABM da invenção, incluindo, mas, não limitada a, os sistemas de expressão ensinados na patente norte-americana de número 6.815.184 (métodos para expressão e secreção de polipeptídeos biologicamente ativos a partir de lentilha d'água geneticamente engenheirada), WO 2004/057002 (produção de proteínas glicosiladas em células vegetais de briófitas por introdução de um gene de glicosil transferase) e WO 2004/024927 (métodos de geração de proteína não vegetal heteróloga extracelular em protoplasto de musgo); e os pedidos de patente norte-americanos de números 60/365.769, 60/368.047, e WO 2003/078614 (processamento de glicoproteína em plantas transgênicas compreendendo uma enzima de GnTIll de mamífero funcional) (o conteúdo de cada um dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade); ou sistemas de células de animal infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, adenovírus, vírus de vaccinia) incluindo linhagens de células engenheiradas para conter cópias múltiplas do DNA que codifica uma ABM quimérica tendo substancialmente a mesma especifi-cidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino ou amplificado de maneira estável (CHO/dhfr) ou amplificado de maneira não estável em cromossomas de minuto duplo (por exemplo, linhagens de células murinas). Em uma concretização, o vetor, compreendendo o(s) polinucleotídeo(s) que codifica(m) a ABM da invenção, é policistrônico. Também, em uma concretização preferida, a ABM é um anticorpo humanizado.

Para os métodos dessa invenção, a expressão estável é, em geral, preferida para expressão transiente porque, tipicamente, se consegue resultados mais reprodutíveis e também é mais compatível com produção em grande escala, embora a expressão transiente esteja também englobada pela invenção. Ao invés de se usar vetores de expressão que contenham origens virais de replicação, células de hospedeiro podem ser transformadas com os respectivos ácido nucléicos de codificação controlados por elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, intensificador, seqüências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc), e um marcador selecionável. Seguindo a introdução do DNA exógeno, células engenheiradas podem ser deixadas crescer durante 1 - 2 dias em um meio enriquecido, e, então, são transferidas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite a seleção de células que tenham integrado, de maneira estável, o plasmídeo aos seus cromossomas e crescerem para formar loci, que, por sua vez, possam ser clonados e expandidos em linhagens de células.

Inúmeros sistemas de seleção podem ser usados, incluindo, mas, não limitados a, timidina quinase de vírus do Herpes simplex (Wigler et al, Cell 7 7:223 (1977)), genes de hipoxantina-guanina fosforribosiltransfe-rase (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:2026 (1962)), e genes de adenina fosforribosiltransferase (Lowy et ai, Cell 22ÜW (1980)), que podem ser empregados em células tk , hgprt ou aprt, respectivamente. Além disso, resistência antimetabólito podem ser usada como a base de seleção para genes dhfr, que conferem resistência a metotrexato (Wigler et ai, Natl Acad. Sei. USA 77:3567 (1989); 0'Hare et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 1527 (1981)); genes gpt, que conferem resistência ao ácido micofe-nólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072 (1981)); genes neo, que conferem resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)); e genes hygro, que conferem resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Recentemente, genes selecionáveis adicionais foram descritos, a saber, genes trpB , que permitem que as células utilizem indol no lugar de triptofano; genes hisD, que permitem que as células utilizem histinol no lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl Acad. Sei. USA 55:8047 (1988)); o sistema de glutamina sin-tase; e ODC (ornitina descarboxilase), que confere resistência ao inibidor de ornitina descarboxilase, 2-(difluoro-metil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Labo-ratoryed. (1987)).

A presente invenção é adicionalmente dirigida a um método para a modificação do perfil de glicosilação das ABMs da presente invenção, que sejam produzidas por uma célula de hospedeiro, compreendendo a expressão, na célula hospedeira, de um ácido nucléico que codifique uma ABM da invenção e um ácido nucléico que codifique um polipeptídeo com atividade de GnTIll, ou um vetor compreendendo tais ácidos nucléicos. De preferência, o polipeptídeo modificado é IgG ou um seu fragmento, compreendendo a região de Fc. Em uma concretização particularmente preferida, a ABM é um anticorpo humanizado ou um seu fragmento. Alternativamente, ou em adição, tais células de hospedeiro podem ser engenheiradas para terem atividade reduzida, inibida ou eliminada de pelo menos uma fucosiltransferase. Em outra concretização, a célula de hospedeiro é engenheirada para expressar conjuntamente uma ABM da invenção, GnTIll e manosidase II (Manll).

As ABMs modificadas, produzidas pelas células de hospedeiro da invenção, exibem afinidade de ligação a receptor de Fc aumentada e/ou função de efetor aumentada, como um resultado da modificação. Em uma concretização particularmente preferida, a ABM é um anticorpo humanizado ou um seu fragmento contendo a região de Fc. De preferência, afinidade de ligação a receptor de Fc aumentada é ligação aumentada a um receptor de ativação de Fcy, tal como o receptor de FcyRllla. A função de efetor aumen-tada é, de preferência, um aumento em uma ou mais das seguintes: citotoxi-cidade celular dependente de anticorpo aumentada, fagocitose celular dependente de anticorpo aumentada (ADCP), secreção de citocina aumentada, assimilação de antígeno mediada por complexo imune aumentada por células que apresentem antígeno, citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada, ligação aumentada a células de NK, ligação aumentada a macrófagos, ligação aumentada a células polimorfonucleares (PMNs), ligação aumentada a monócitos, reticulação aumentada de anticorpos ligados ao alvo, apoptose indutora de sinalização direta aumentada, maturação de células dendríticas aumentada e iniciação de células T aumentada.

Funções de efetor podem ser medidas e/ou determinadas por vários ensaios conhecidos pelos versados na técnica. Vários ensaios para a medição de funções de efetor, incluindo afinidade de ligação a receptor de Fc e citotoxicidade dependente de complemento, são descritos na publicação de pedido de patente norte-americana de número 2004/0241817A1, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A secreção de citocina pode ser medida, por exemplo, usando-se uma ELISA em sanduíche, ver, por exemplo, McRae et ai, J. Immunol. 164: 23-28 (2000) e o protocolo de ELISA em sanduíche disponível em www.bdbiosciences.com/pharmingen/ protocols, ou pelos métodos descritos em Takahashi et ai, British J. Phar-macol. 137: 315-322 (2002), cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade. A maturação de células dendríticas, por exemplo, pode ser determinada usando-se ensaios conforme descritos em Kalergis e Ravetch, J. Exp. Med. 195: 1653-59 (2002), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Exemplos de ensaios de assimilação/apresentação de antígeno e fagocitose são fornecidos por Gresham et aí., J. Exp. Med. 191:515-28 (2000); Krauss et ai, J. Immunol. 153: 1769-77 (1994); e Rafiq et ai, J. Clin. Invest. 110: 71-79 (2002), e Hamano et ai, J. Immunol. 164: 6113-19 (2000), cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade. A regulação a jusante de receptores de superfície celular pode ser medida, por exemplo, por métodos descritos por Liao et ai, Blood 83: 2294-2304 (1994), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.Métodos gerais, protocolos e ensaios podem ser encontrados em CELL Bl-OLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, Celis, J.E., ed., (2§ ed., 1998), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Está dentro da capacidade de um versado na técnica adaptar os métodos, protocolos e ensaios mencionados acima, para uso com a presente invenção.

A presente invenção também é dirigida a um método para a produção de uma ABM da presente invenção, tendo oligossacarídeos modificados em uma célula de hospedeiro compreendendo (a) cultivo uma célula de hospedeiro engenheirada para expressar pelo menos um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de GnTIll, sob condições que permitam a produção de uma ABM de acordo com a presente invenção, sendo que o polipeptídeo tendo atividade de GnTIll é expresso em uma quantidade suficiente para modificar os oligossacarídeos na região de Fc da ABM produzida pela célula de hospedeiro; e (b) isolamento da ABM. Em uma concretização preferida, o polipeptídeo tendo atividade de GnTIll é um polipeptídeo de fusão compreendendo o domínio catalítico de GnTIll. Em uma concretização particularmente preferida, o polipeptídeo de fusão compreende adicionalmente o domínio de localização em Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi.

De preferência, o domínio de localização em Golgi é o domínio de localização de manosidase II humana ou de GnTI humana. Alternativamente, o domínio de localização em Golgi é selecionado a partir do grupo consistindo em: o domínio de localização de manosidase I, o domínio de localização de GnTIl e o domínio de localização de a 1-6 núcleo fucosiltransferase. As ABMs produzidas pelos métodos da presente invenção têm afinidade de ligação a receptor de Fc aumentada e/ou função de efetor aumentada. De preferência, a função de efetor aumentada é uma ou mais das seguintes: citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada (incluindo citotoxicidade celular dependente de anticorpo aumentada), fagocitose celular dependente de anticorpo aumentada (ADCP), secreção de citociná aumentada, assimilação de antígeno mediada por complexo imune aumentada por células que apresentem antígeno, ligação aumentada a células de NK, ligação aumenta-da a macrófagos, ligação aumentada a monócitos, ligação aumentada a células polimorfonucleares, apoptose indutora de sinalização direta aumentada, reticulação aumentada de anticorpos ligados ao alvo, maturação de células dendríticas aumentada e iniciação de células T aumentada. A afinidade de ligação a receptor de Fc aumentada é, de preferência, ligação aumentada a receptores de ativação de Fc, tais como FcyRllla. Em uma concretização particularmente preferida, a ABM é um anticorpo humanizado ou um seu fragmento.

Em outra concretização, a presente invenção é dirigida a uma ABM quimérica tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino, produzido pelos métodos da invenção, o qual tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos bisseccionados na região de Fc do polipeptídeo. Contempla-se que tal ABM englobe anticorpos e seus fragmentos compreendendo a região de Fc. Em uma concretização preferida, a ABM é um anticorpo humanizado. Em uma concretização, a percentagem de oligossacarídeos bisseccionados, na região de Fc de da ABM, é pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%, e muitíssimo preferivelmente pelo menos 90 - 95% dos oligossacarídeos totais. Em ainda outra concretização, a ABM, produzida pelos métodos da invenção, tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados na região de Fc, como um resultado da modificação de seus oligossacarídeos, pelos métodos da presente invenção. Em uma concretização, as percentagens de oligossacarídeos não fucosilados é de pelo menos 50%, de preferência, pelo menos 60% a 70%, muitíssimo de preferência, pelo menos 75%. Os oligossacarídeos não fucosilados podem ser do tipo híbrido ou do tipo complexo. Em uma concretização particularmente preferida, a ABM, produzida pelas células de hospedeiro e métodos da invenção, tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, na região de Fc. Os oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, podem ser híbridos ou complexos. Especificamente, os métodos da presente invenção podem ser usados para produzir ABMs, nas quais pelo menos 15%, mais preferivelmen-te, pelo menos 20%, mais preferivelmente, pelo menos 25%, mais preferi-velmente, pelo menos 30%, mais preferivelmente, pelo menos 35% dos oli-gossacarídeos, na região de Fc da ABM, são não fucosilados, bissecciona-dos. Os métodos da presente invenção também podem ser usados para produzir polipeptídeos, nos quais pelo menos 15%, mais preferivelmente, pelo menos 20%, mais preferivelmente, pelo menos 25%, mais preferivelmente, pelo menos 30%, mais preferivelmente, pelo menos 35% dos oligos-sacarídeos, na região de Fc do polipeptídeo são não fucosilados híbridos, bisseccionados. (Na figura 10, a nomenclatura de oligossacarídeos "complexos", "complexos bisseccionados" e "híbridos" é descrita).

Em outra concretização, a presente invenção é dirigida a uma ABM quimérica tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino e engenheirada para ter função de efetor aumentada e/ou afinidade de ligação a receptor de Fc aumentada, produzida pelos métodos da invenção. De preferência, a função de efetor aumentada é uma ou mais das seguintes: citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada (incluindo citotoxicidade celular dependente de anticorpo aumentada), fagocitose celular dependente de anticorpo aumentada (ADCP), secreção de citocina aumentada, assimilação de antígeno mediada por complexo imune aumentada por células que apresentem antígeno, ligação aumentada a células de NK, ligação aumentada a macrófagos, ligação aumentada a monócitos, ligação aumentada a células polimorfonucleares, a-poptose indutora de sinalização direta aumentada, reticulação aumentada de anticorpos ligados ao alvo, maturação de células dendríticas aumentada e iniciação de células T aumentada. Em uma concretização preferida, a afinidade de ligação a receptor de Fc aumentada é ligação aumentada a receptor que ative Fc, muitíssimo preferivelmente, FcyRllla. Em uma concretização, a ABM é um anticorpo, um fragmento de anticorpo equivalente à região de Fc de uma imunoglobulina. Em uma concretização particularmente preferida, a ABM é um anticorpo humanizado.

A presente invenção é adicionalmente dirigida a composições farmacêuticas compreendendo as ABMs da presente invenção e um veículofarmaceuticamente aceitável.

A presente invenção é adicionalmente dirigida ao uso de tais composições farmacêuticas no método de tratamento de câncer. Especificamente, a presente invenção é dirigida a um método para o tratamento de câncer compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamen-te eficaz da composição farmacêutica da invenção.

Em ainda outra concretização, a invenção refere-se a uma ABM de acordo com a presente invenção para uso como um medicamento, em particular para uso no tratamento ou na profilaxia de câncer ou para uso em uma condição ou lesão pré-cancerosa. O câncer pode ser, por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula não pequena (NSCL), câncer de pulmão de células brônquio-alveolar, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma intra-ocular ou cutâneo, câncer uterino, câncer ovariano, câncer retal, câncer de região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de seio, câncer uterino, carcinoma dos tubos falopianos, carcinoma do endométrio, carcinoma do cérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer de sistema endócrino, câncer de glândula tireóide, câncer de glândula paratireóide, câncer de glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer de uretra, câncer de pênis, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma da pélvis renal, mesotelioma, câncer hepatocelular, câncer biliar, leucemia aguda ou crônica, linfomas linfocíticos, neoplasmas do sistema nervoso central (SNC), tumores do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwan-nomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenomas pituitários, incluindo versões refratárias de qualquer dos cânceres acima, ou uma combinação de um ou mais dos cânceres acima. A condição ou lesão pré-cancerosa inclui, por exemplo, o grupo consistindo em leucoplaquia oral, queratose actínica (queratose solar), pólipos pré-cancerosos do cólon ou reto, displasia epitelial gástrica, displasia ade-nomatosa, síndrome de câncer de cólon de não polipose hereditário(HNPCC), esôfago de Barret, displasia da bexiga e condições cervicais pré-cancerosas.

De preferência, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de seio, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de rim e câncer de cérebro.

Ainda outra concretização é o uso da ABM de acordo com a presente invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento ou a profilaxia de câncer. Câncer é conforme definido acima.

De preferência, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de seio, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de rim e câncer de cérebro.

Também de preferência, a molécula de ligação a antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz desde cerca de 1,0 mg/Kg a cerca de 15 mg/Kg.

Também mais preferivelmente, a molécula de ligação a antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz desde cerca de 1,5 mg/Kg a cerca de 12 mg/Kg.

Também mais preferivelmente, a molécula de ligação a antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz desde cerca de 1,5 mg/Kg a cerca de 4,5 mg/Kg.

Também mais preferivelmente, a molécula de ligação a antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz desde cerca de 4,5 mg/Kg a cerca de 12 mg/Kg.

Muitíssimo de preferência, a molécula de ligação a antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 1,5 mg/Kg.

Também muitíssimo de preferência, a molécula de ligação a antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 4,5 mg/Kg.

Também muitíssimo de preferência, a molécula de ligação a antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de12 mg/Kg.

A presente invenção adicionalmente fornece métodos para a geração e o uso de sistemas de células de hospedeiro para a produção de glicoformas das ABMs da presente invenção, tendo afinidade de ligação a receptor de Fc aumentada, de preferência, ligação aumentada a receptores de ativação de Fc, e/ou tendo funções de efetor aumentadas, incluindo cito-toxicidade celular dependente de anticorpo. A metodologia de glicoengenha-ria, que pode ser usada com as ABMs da presente invenção, foi descrita em maiores detalhes na patente norte-americana de número 6.602.684, na publicação de pedido de patente norte-americana de número 2004/0241817 A1, na publicação de pedido de patente norte-americana de número 2003/0175884 A1, no pedido de patente norte-americana provisório de número 60/441..307 e WO 2004/065540; os conteúdos completos de cada um dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. As ABMs da presente invenção podem, alternativamente, ser glicoengenheiradas para terem resíduos de fucose reduzidos na região de Fc, de acordo com técnicas descritas na publicação de pedido de patente norte-americana de número 2003/0157108 (Ge-nentech) ou na patente européia de número 1 176 195 A1, WO 03/084570, WO 03/0855119 e nas publicações de pedidos de patente norte-americana de números 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704, 2004/132140 (todos para Kyowa Hakko Kogyo Ltd.). Os conteúdos de cada um desses documentos são aqui incorporados por referência em sua totalidade. ABMs glicoengenheiradas da invenção também podem ser produzidas em sistemas de expressão que produzam glicoproteínas modificadas, tais como aqueles ensinados na publicação de pedido de patente norte-americana de número 60/344.169 e WO 03/056914 (GlycoFi, Inc.) ou em WO 2004/057002 e WO 2004/024927 (Greenovation), o conteúdo de cada um dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Geração de Linhagens de Células para a Produção de Proteínas com Padrão de Glicosilação Alterado

A presente invenção fornece sistemas de expressão de células de hospedeiro para a geração das ABMs da presente invenção tendo pa-drões de glicosilação modificados. Em particular, a presente invenção fornece sistemas de células de hospedeiro para a geração de glicoformas das ABMs da presente invenção tendo um valor terapêutico aperfeiçoado. Portanto, a invenção fornece sistemas de expressão de células de hospedeiro selecionados ou engenheirados para expressarem um polipeptídeo tendo atividade de GnTIll. Em uma concretização, o polipeptídeo tendo atividade de GnTIll é um polipeptídeo de fusão compreendendo o domínio de localização em Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi heterólogo. Especificamente, tais sistemas de expressão de células de hospedeiro podem ser engenheirados para compreenderem uma molécula de ácido nucléico re-combinante que codifique um polipeptídeo tendo atividade de GnTIll, opera-tivamente ligado a um sistema de promotor constitutivo ou regulado.

Em uma concretização específica, a presente invenção fornece uma célula de hospedeiro que tenha sido engenheirada para expressar pelo menos um ácido nucléico que codifique um polipeptídeo de fusão tendo atividade de GnTIll e compreendendo o domínio de localização em Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi heterólogo. Em um aspecto, a célula de hospedeiro é engenheirada com uma molécula de ácido nucléico compreendendo pelo menos um gene que codifique um polipeptídeo de fusão tendo atividade de GnTIll e compreendendo o domínio de localização em Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi heterólogo.

Geralmente, qualquer tipo de linhagem de células cultivadas, incluindo as linhagens de células discutidas acima, podem ser usadas como uma base para se engenheirar as linhagens de células de hospedeiro da presente invenção. Em uma concretização preferida, células de CHO, células de BHK, células de NSO, células de SP2/0, células de mieloma de YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células de PER, células de PER.C6 ou células de hibridoma, outras células de mamífero, células de levedura, células de insetos ou células vegetais são usadas como a linhagem de células de base para gerar as células de hospedeiro engenheiradas da invenção.

A invenção é contemplada a englobar quaisquer células de hos-pedeiro engenheiradas, que expressem um polipeptídeo tendo atividade de GnTIll, incluindo um polipeptídeo de fusão que compreenda o domínio de localização em Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi heterólogo, conforme aqui definido.

Um ou mais de um ácido nucléico, que codifiquem um polipeptídeo tendo atividade de GnTIll, podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regulado. Tais sistemas são bem-conhecidos na técnica e incluem os sistemas discutidos acima. Se vários ácidos nucléicos diferentes, que codifiquem poli- peptídeos de fusão tendo atividade de GnTIll e compreendendo o domínio de localização em Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi heterólogo, estiverem compreendidos dentro do sistema de células de hospedeiro, alguns deles podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo, enquanto outros são expressos sob o controle de um promotor regulado. Os níveis de expressão dos polipeptídeos de fusão tendo atividade de GnTIll são determinados por métodos em geral conhecidos na técnica, incluindo análise de Western blot, análise de Northern blút, análise de expressão de gene de repórter ou medição de atividade de GnTIll. Alternativamente, pode ser empregada uma lecitina que se ligue a produtos biossintéticos da GnTIll, por exemplo, lecitina de E4-PHA. Alternativamente, pode ser usado um ensaio funcional que meça a ligação a receptor de Fc aumentada ou a função de efetor aumentada mediada por anticorpos, produzidos pelas células engenheiradas com o ácido nucléico que codifique um polipeptídeo com atividade de GnTIll.

Identificação de Transfectantes ou de Transformantes que Expressem a Proteína Tendo um Padrão de Glicosilacão Modificado

As células de hospedeiro, que contêm a seqüência de codificação de uma ABM quimérica, tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino e que expressem produtos de gene biologicamente ativos, podem ser identificadas por pelo menos quatro abordagens gerais: (a) hibridização de DNA-DNA ou de DNA-RNA; (b) a presença ou a ausência de funções de gene de "marcador"; (c)avaliando-se o nível de transcrição conforme medido pela expressão dos respectivos transcritos de mRNA na célula de hospedeiro e (d) detecção do produto de gene conforme medido por imunoensaio ou por sua atividade biológica.

Na primeira abordagem, a presença da seqüência de codificação de uma ABM quimérica, tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino, e da seqüência de codificação do polipeptídeo tendo atividade de GnTIll, pode ser detectada por hi-bridização de DNA-DNA ou de DNA-RNA usando-se sondas compreendendo seqüências de nucleotídeos que sejam homólogas às respectivas seqüências de codificação, respectivamente, ou a seus porções ou derivados.

Na segunda abordagem, o sistema vetor de expressão recombi-nante/hospedeiro pode ser identificado e selecionado com base na presença ou na ausência de certas funções de gene de "marcador" (por exemplo, atividade de timidina quinase, resistência a antibióticos, resistência a metotre-xato, fenótipo de transformação, formação de corpo de oclusão em baculoví-rus, etc). Por exemplo, se a seqüência de codificação da ABM da invenção, ou de um seu fragmento, e a seqüência de codificação do polipeptídeo tendo atividade de GnTIll forem inseridos dentro de uma seqüência de gene de marcador do vetor, recombinantes contendo as respectivas seqüências de codificação podem ser identificadas pela ausência da função de gene de marcador. Alternativamente, um gene de marcador pode ser colocado em tandem com as seqüências de codificação, sob o controle do mesmo ou promotor diferente, usado para controlar a expressão das seqüências de codificação. A expressão do marcador em resposta à indução ou à seleção indica a expressão da seqüência de codificação da ABM da invenção e da seqüência de codificação do polipeptídeo tendo atividade de GnTIll.

Na terceira abordagem, a atividade transcricional para a região de codificação da ABM da invenção, ou de um seu fragmento, e a seqüência de codificação do polipeptídeo tendo atividade de GnTIll, pode ser avaliada por ensaios de hibridização. Por exemplo, RNA pode ser isolado e analisado por Northern blot usando-se uma sonda homóloga às seqüências de codifi-cação da ABM da invenção, ou de um seu fragmento, e à seqüência de codificação do polipetídeo tendo atividade de GnTIll ou de porções particulares do mesmo. Alternativamente, ácidos nucléicos totais da célula de hospedeiro podem ser extraídos e ensaiados para hibridização de tais sondas.

Na quarta abordagem, a expressão dos produtos de proteína pode ser ensaiada imunologicamente, por exemplo, por Western blots, imu-noensaios, tais como radioimunoprecipitação, imunoensaios ligados à enzima e os similares. O teste final do sucesso do sistema de expressão, contudo, envolve a detecção dos produtos de gene biologicamente ativos.

Geração e Uso de ABMs tendo Função de Efetor Aumentada Incluindo Cito-toxicidade Celular Dependente de Anticorpo

Em concretizações preferidas, a presente invenção fornece glicoformas de ABMs tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino e tendo função de efetor aumentada incluindo citotoxicidade celular dependente de anticorpo. A engenharia de glicosilação de anticorpos foi previamente descrita. Vide por exemplo, a patente norte-americana de número 6.602.684, aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Testes clínicos de anticorpos monoclonais não conjugados (mAbs), para o tratamento de alguns tipos de câncer, produziram recentemente resultados encorajadores. Dillman, Câncer Biother. & Radiopharm. 72:223-25 (1997); Deo et ai, Immunology Today 78:121 (1997). Uma lgG1 não conjugada, quimérica, foi aprovada para linfoma de não Hodgkin de células B foliculares ou de baixo grau. Dillman, Câncer Biother. & Radiopharm. 72:223-25 (1997), embora outro mAbs não conjugado, uma lgG1 humanizada mirando tumores de seio sólidos, também tem mostrado resultados promissores em testes clínicos de fase III. Deo et ai, Immunology Today 78:127 (1997). Os antígenos desses dois mAbs são altamente expressos em suas respectivas células de tumor e os anticorpos mediam potente destruição de tumor por células efetoras in vitro e in vivo. Ao contrário, muitos outros mAbs não conjugados, com finas especificidades de tumor, não podem desencadear funções de efetor de potência suficiente para serem clinicamente úteis.Frost et ai, Câncer 00:317-33 (1997); Surfus etal.,J. Immunother. 79:184-91 (1996). Para alguns desses mAbs mais fracos, terapia com citocina adjunta está sendo testada atualmente. A adição de citocinas pode estimular citoto-xicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), por aumento de atividade e do número de linfócitos circulantes. Frost et ai, Câncer 80:317-33 (1997); Surfus etal.,J. Immunother. 7& 184-91 (1996). ADCC, um ataque lítico sobre células miradas por anticorpos, é desencadeada quando da ligação de receptores de leucócitos com relação à região constante (Fc) de anticorpos. Deo et ai, Immunology Today 18:127 (1997).

Uma abordagem diferente, porém, complementar, para aumentar a atividade de ADCC de IgGIs não conjugadas, e engenheirar a região de Fc do anticorpo. Estudos de engenharia de proteínas mostraram que FcyRs interagem principalmente com a região de dobradiça da molécula de IgG. Lund et ai, J. Immunol. 757:4963-69 (1996). No entanto, a ligação a FcyR também exige a presença de oligossacarídeos ligados de maneira co-valente ao Asn 297 conservado na região de CH2. Lund et al., J. Immunol. 757:4963-69 (1996); Wright and Morrison, Trenós Biotech. 75:26-31 (1997), sugerindo que, ambos, oligossacarídeo e polipeptídeo, contribuem diretamente para o sítio de interação, ou que o oligossacarídeo é exigido para manter uma conformação de polinucleotídeo de CH2 ativo. A modificação da estrutura de oligossacarídeo pode, portanto, ser explorada com um meio para aumentar a afinidade da interação.

Uma molécula de IgG porta dois oligossacarídeos N-ligados em sua região de Fc, uma em cada cadeia pesada. Como qualquer glicoproteína, um anticorpo é produzido como uma população de glicoformas que compartilham a mesma cadeia principal de polipeptídeo, mas, têm diferentes oligossacarídeos ligados aos sítios de glicosilação. Os oligossacarídeos normalmente encontrados na região de Fc de IgG de soro são de tipo biantenário complexo (Wormald et ai, Biochemistry 35:130-38 (1997), com um baixo nível ácido siálico terminal e bisseccionando N-acetilglicosamina (GlcNAc), e um grau variável de galactosilação terminal e de fucosilação de núcleo. Alguns estudos sugerem que a estrutura de carboidrato mínima, exigida para aligação a FcyR, se situa dentro do núcleo de oligossacarídeo. Lund et al., J. Immunol. 757:4963-69(1996).

As linhagens de células derivadas de camundongo ou de hams-ter, usadas na indústria e na academia, para a produção de mAbs terapêuticos não conjugados, normalmente, ligam os determinantes de oligossacarídeo exigidos ao sítios de Fc. IgGs expressas nessas linhagens de células carecem, contudo, da bissecção de GlcNAc encontrada em pequenas quantidades em IgGs de soro. Lifely et al., Glycobiology 378:813-22 (1995). Ao contrário, foi observado recentemente que uma lgG1 humanizada, produzida por mieloma de rato (CAMPATH-1H), portava uma bissecção de GlcNAc em algumas de suas glicoformas. Lifely et al., Glycobiology 378:813-22 (1995). O anticorpo derivado de células de rato alcançou um máximo similar de atividade de ADCC in vitro como anticorpos de CAMPATH-1H produzidos em linhagens de células padrão, mas, em concentrações de anticorpo significativamente mais baixas.

O antígeno CAMPATH está normalmente presente em níveis elevados em células de linfoma, e esse mAb quimérico tem elevada atividade dè ADCC na ausência de uma bissecção de GlcNAc. Lifely et ai, Glycobiology 378:813-22 (1995). Na via de glicosilação N-ligada, uma bissecção de GlcNAc é adicionada por GnTIll. Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986).

Estudos prévios usaram uma linhagem de células de CHO produtora de anticorpos, que foi previamente engenheirada para expressar, de uma maneira regulada externamente, níveis diferentes de uma enzima de gene GnTIll clonado (Umana, P., et ai, Nature Biotechnol. 77:176-180 (1999)). Essa abordagem estabeleceu, pela primeira vez, uma correlação rigorosa entre a expressão de GnTIll e a atividade de ADCC do anticorpo modificado. Portanto, a invenção contempla uma ABM quimérica ou humanizada, recombinante (por exemplo, um anticorpo) ou um seu fragmento, com a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino, tendo glicosilação alterada resultante da atividade de GnTIll aumentada. A atividade de GnTIll aumentada resulta em um aumento na percentagem de oligos-sacarídeos bisseccionados, assim como uma diminuição na percentagem de resíduos de fucose, na região de Fc da ABM. Esse anticorpo, ou seu fragmento, aumentou a afinidade de ligação a receptor de Fc e aumentou a função de efetor. Além disso, a invenção é dirigida ao fragmento de anticorpo e a proteínas de fusão compreendendo uma região que seja equivalente à região de Fc de imunoglobulinas.

Aplicações Terapêuticas de ABMs Produzidas de Acordo com os Métodos da Invenção

No sentido mais amplo, as ABMs da presente invenção podem ser usadas para atingir células in vivo ou in vitro, que expressem MCSP. As células que expressam MCSP podem ser atingidas para finalidades diagnosticas ou terapêuticas. Em um aspecto, as ABMs da presente invenção podem ser usadas para detectar a presença de MCSP em uma amostra. Em outro aspecto, as ABMs da presente invenção podem ser usadas para se ligarem a células que expressem MCSP in vitro e in vivo para, por exemplo, identificação ou atingimento. Mais particularmente, as ABMs da presente invenção podem ser usadas para bloquear ou inibir a ligação a MCSP a um ligante de MCSP, ou, alternativamente, atingir uma célula que expresse MCSP para destruição. Em uma concretização, as células que expressam MCSP são perícitos. Além disso, as ABMs da invenção podem ser usadas para inibir a adesão e a migração de células de melanoma, para inibir respostas quimiotáticas à fibronectina e para inibir perícitos, para inibir a disseminação celular em proteínas de ECM, tais como colágeno e fibronectina, para inibir redes de transdução de sinal de FAK e de ECR, e para inibir ou reduzir transdução de sinal mediada por MCSP em células que expressem MCSP na superfície.

MCSP é sobreexpresso em muitos tumores humanos. Portanto, as ABMs da invenção são particularmente úteis na prevenção de formação de tumores, na erradicação de tumores e na inibição de crescimento de tumores. As ABMs da invenção podem ser usadas para tratar qualquer tumor que expresse MCSP. Malignancias particulares, que podem ser tratadas com as ABMs da invenção, incluem, mas, não estão limitadas a, angiogêne-se de melanonas e de tumores. Em uma concretização, as ABMs da invenção são administradas em conjunto com um anticorpo anti-VEGF ou outro anticorpo antiangiogênico, para prevenir, inibir ou, de outra maneira, tratar angiogênese de tumores.

As ABMs da presente invenção podem ser usadas isoladamente para atingirem e matarem células de tumores in vivo. As ABMs também podem ser usadas em conjugação com um agente terapêutico apropriado para tratar carcinoma humano. Por exemplo, as ABMs podem ser usadas em combinação com métodos de tratamento padrão ou convencionais, tais como quimioterapia, terapia com radiação, ou podem estar conjugados ou ligados a um fármaco terapêutico, ou toxina, assim como a uma linfocina ou a um fator de crescimento inibidor de tumor, para entrega do agente terapêutico ao sítio do carcinoma. Os conjugados das ABMs dessa invenção, que são de importância capital são (1) imunotoxinas (conjugados da ABM e uma porção citotóxica) e (2) ABMs marcadas (por exemplo, radiomarcadas, marcadas com enzimas ou marcadas com fluorocromos), nas quais o marcador fornece um meio para a identificação de complexos imune, que incluem a ABM marcadas. As ABMs também podem ser usadas para induzir a lise por meio de métodos complementares naturais, e para interagir com células cito-tóxicas dependentes de anticorpo normalmente presentes.

A porção citotóxica da imunotoxina pode ser um fármaco citotó-xico ou uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana ou vegetal, ou um fragmento enzimaticamente ativo ("cadeia A") de uma tal toxina. Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos usadas são fragmentos ativos não ligantes, de cadeia A de difteria, de toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (a partir de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites for-dii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapa-onaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina e enomicina. Em outra concretização, as ABMs estão conjugadas a fármacos anticâncer de molécula pequena. Conjugados da ABM e tais porções citotóxicas sãofeitos usando-se uma variedade de agentes de acoplamento a proteína bi-funcionais. Exemplos de tais reagentes são SPDP, IT, derivados bifuncionais de imidoésteres, tais como um adipimidato de dimetila HCL, ésteres ativos, tal como suberato de dissuccinimidila, aldeídos, tal como glutaraldeído, compostos de bis-azido, tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina, derivados de bis-diazônio, tal como bis-(p-diazôniobenzoil)-etilenodiamina, diisociana-tos, tal como 2,6-diisocianato de tolileno e compostos de flúor bis-ativos, tal como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno. A porção lisante de uma toxina pode estar unida ao fragmento de Fab das ABMs. Toxinas apropriadas adicionais são conhecidas na técnica, conforme evidenciado, por exemplo, no pedido de patente norte-americana de número 2002/0128448, aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Em uma concretização, uma ABM glicoengenheirada quimérica, tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo monoclonal 225.28S murino, está conjugada à cadeia A de ricina. Muitíssimo vantajosamente, a cadeia A de ricina está desglicosilada e é produzida através de meios recombinantes. Um método vantajoso de preparação da imu-notoxina de ricina é descrito em Vitetta et ai, Science 238, 1098 (1987), aqui incorporado por referência.

Quando usados para matar células de câncer humanas, in vitro, para finalidades diagnosticas, os conjugados serão tipicamente adicionados ao meio de cultura de células em uma concentração de pelo menos cerca de 10 nM. A formulação e o modo de administração para o uso in vitro não são críticos. Formulações aquosas, que são compatíveis com o meio de culturaou de perfusão, serão normalmente usadas. A citotoxicidade pode ser lida por técnicas convencionais, para determinar a presença ou o grau de câncer.

Conforme discutido acima, um radiofármaco citotóxico, para tratamento de câncer, pode ser preparado por conjugação de um isótopo radioativo (por exemplo, I, Y, Pr) com uma ABM glicoengenheirada quimérica, tendo substancialmente a mesma especificidade de ligação do anticorpo monoclonal murino. O termo "porção citotóxica", conforme usado aqui, pre-tende incluir tais isótopos.

Em outra concretização, lipossomas são preenchidos com um fármaco citotóxico e os lipossomas são revestidos com as ABMs da presente invenção. Porque existem muitas moléculas de MCSP sobre a superfície da célula maligna que expressa MCSP, esse método permite a entrega de grandes quantidades de fármaco ao tipo de célula correto.

Técnicas para a conjugação de tais agentes terapêuticos a anticorpos são bem-conhecidas (ver, por exemplo, RNAon et ai, "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Reisfeld et ai (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et ai, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2§ Ed.), Robinson et ai (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents em Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biológica! And Clinicai Applications, Pinchera et ai (eds.), pp. 475-506 (1985); e Thorpe et ai, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immu-noi Rev., 62:119-58 (1982)).

Ainda outras aplicações terapêuticas para as ABMs da invenções incluem conjugação ou ligação, por exemplo, por técnicas de DNA re-combinante, a uma enzima capaz de converter um pró-fármaco em um fármaco citotóxico, e o uso daquele conjugado anticorpo-enzima em combinação com o pró-fármaco, para converter o pró-fármaco em um agente citotóxico no sítio do tumor (ver, por exemplo, Senter et ai, "Antitumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sei. USA S5:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phos-phorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Câncer Research 49:5789-5792 (1989); e Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Câncer Therapy", FASEB J. 4:188-193 (1990)).

Ainda outro uso terapêutico para as ABMs da invenção envolve uso, ou não conjugado, na presença de complemento, ou como parte de um conjugado anticorpo-fármaco ou anticorpo-toxina, para remover células apartir da medula óssea de pacientes de câncer. De acordo com essa abordagem, medula óssea autóloga pode ser purgada ex vivo por tratamento com o anticorpo e a medula óssea infundida de volta ao paciente [ver, por exemplo, Ramsay et ai., "Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J.Clin. Immunol, 80:81-88 (1988)].

Além disso, contempla-se que a invenção compreenda uma i-munotoxina de cadeia única compreendendo domínios de ligação a antíge-no, que permitam substancialmente a mesma especificidade de ligação que o anticorpo monoclonal 225.28S murino (por exemplo, polipeptídeos compreendendo as CDRs do anticorpo monoclonal 225.28S murino) e compreendendo adicionalmente um polipeptídeo de toxina. As imunotoxinas de cadeia única da invenção podem ser usadas para tratar carcinoma humano in vivo.

Similarmente, uma proteína de fusão, compreendendo pelo menos a região de ligação a antígeno de uma ABM da invenção unida em pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma segunda proteína tendo atividade antitumor, por exemplo, uma linfocina ou oncostatina, pode ser u-sada para tratar carcinoma humano in vivo.

A presente invenção fornece um método para matar de maneira seletiva células de tumor que expressem MCSP. Esse método compreende a reação do imunoconjugado (por exemplo, a imunotoxina) da invenção com as células de tumor. Essas células de tumor podem ser a partir de um carcinoma humano.

Adicionalmente, essa invenção fornece um método de tratamento de carcinomas (por exemplo, carcinomas humanos) in vivo. Esse método compreende a administração a um sujeito de uma quantidade farmaceutica-mente eficaz de uma composição contendo pelo menos um dos imunoconju-gados (por exemplo, imunotoxina) da invenção.

Em um outro aspecto, a invenção é dirigida a um método aperfeiçoado para o tratamento de distúrbios de proliferação celular, nos quais MCSP é expresso, particularmente nos quais MCSP é expresso de maneira anormal (por exemplo, sobreexpresso), incluindo melanoma, compreenden-do a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ABM da presente invenção a um sujeito humano que dela necessite. Além disso, porque MCSP é expresso em perfeitos ativados e inativos, as ABMs da invenção podem ser usadas para tratar a angiogênese em qualquer tumor que induza neovascularização. Uma vez que perfeitos podem entrar em contato e dar suporte a células endoteliais e também podem estabilizar novos vasos sangüíneos, seu atingimento inibiria a angiogênese induzida por tumor. O-zerdem & Stallcup, Angiogenesis 7(3):269-76 (2004); Erber et ai, FASEBJ. 18(2):338-40 (Feb. 2004); Grako et ai, J. Cell Sei. 7 72:905-915 (1999); livanainen et ai, FASEBJ. 77:1609-1621 (2003). Em uma concretização preferida, a ABM é um anticorpo anti-MCSP glicoengenheirado uma especificidade de ligação substancialmente igual àquela do anticorpo monoclonal 225.28S murino. Em outra concretização preferida, o anticorpo é humanizado. Exemplos de distúrbios de proliferação celular, que podem ser tratados por uma ABM da presente invenção, incluem, mas, não estão limitados a, neoplasmas localizados no: abdômen, osso, seio, sistema digestivo, fígado, pâncreas, peritôneo, glândulas endócrinas (adrenal, paratireóides, pituitária, testículos, ovário, timo, tireóide), olho, cabeça e pescoço, sistema nervoso (central e periférico), sistema linfático, pélvico, pele, tecidos moles, baço, região toráxica e sistema urogenital.

Similarmente, outros distúrbios de proliferação celular também podem ser tratados pelas ABMs da presente invenção. Exemplos de tais distúrbios de proliferação celular incluem, mas, não estão limitados a: hiper-gamaglobulinemia, distúrbios linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidose, Síndrome de Sezary, Macroglobulinemia de Waldenstron, Doença de Gaucher, histiocitose e qualquer outra doença de proliferação celular, além de neoplasia, localizada em um sistema de órgãos listado acima.

De acordo com a prática dessa invenção, o sujeito pode um paciente humano, eqüino, porcino, bovino, murino, canino, felino e aviário. Outros animais de sangue quente estão também incluídos nessa invenção.

A presente invenção fornece adicionalmente métodos para a inibição do crescimento de células de tumor humanas, para tratamento deum tumor em um sujeito, e para tratamento de uma doença de tipo prolifera-tivo em um paciente. Esses métodos compreendem a administração a um sujeito de uma quantidade eficaz de uma composição de ABM da invenção.

A invenção é adicionalmente dirigida a métodos para o tratamento de doenças ou de distúrbios não malignos em um mamífero, caracterizadas por ativação ou produção anormal de MCSP ou um ou mais ligantes de MCSP, compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz das ABMs da invenção. O sujeito, em geral, terá células que expressam MCSP, por exemplo, seus tecidos doentes, tal que as ABMs da invenção sejam capazes de se ligarem às células dentro do sujeito.

A ativação ou expressão anormal de MCSP ou de um ligante de MCSP pode estar ocorrendo em células do sujeito, por exemplo, em tecido doente do sujeito. Ativação anormal de MCSP pode ser atribuível à amplificação, à sobreexpressão ou à produção aberrante do MCSP e/ou do ligante de MCSP. Em uma concretização da invenção, um ensaio diagnóstico ou prognóstico será realizado para determinar se a produção ou a ativação a-normal de MCSP (ou ligante de MCSP) está ocorrendo no sujeito. Por e-xemplo, a amplificação e/ou a sobreexpressão de gene de MCSP e/ou ligante pode ser determinada. Vários ensaios para determinação de tal amplificação e/ou sobreexpressão estão disponíveis na técnica e incluem os ensaios de IHC, FISH antígeno shed (shed antigen assay) descritos acima. Alternativamente, ou adicionalmente, níveis de um ligante de MCSP em ou associados com a amostra podem ser determinados de acordo com procedimentos conhecidos. Tais ensaios podem detectar codificação de proteína e/ou ácido nucléico na amostra a ser testada. Em uma concretização, níveis de ligante de MCSP em uma amostra podem ser determinados usando-se imunohisto-química (IHC); ver, por exemplo, Scher et ai, Clin. Câncer Research 7:545-550 (1995). Alternativamente, ou adicionalmente, pode-se avaliar os níveis de ácido nucléico que codifique MCSP na amostra a ser testada; por exemplo, via técnicas de FISH, de Southern blotting ou de PCR.

Além disso, a sobreexpressão ou amplificação de MCSP ou deligante de MCSP pode ser avaliada usando-se um ensaio diagnóstico in vivo, por exemplo, por administração de uma molécula (tal como um anticorpo), que se ligue à molécula a ser detectada e que esteja marcada com um marcador detectável (por exemplo, um isotopo radioativo) e varrendo-se externamente o paciente para a localização do marcador.

É evidente, portanto, que a presente invenção engloba composições farmacêuticas, combinações e métodos para o tratamento de malig-nâncias humanas, tais como melanomas e cânceres da bexiga, cérebro, cabeça e pescoço, pâncreas, pulmão, seio, ovário, cólon, próstata e rim. Por exemplo, a invenção inclui composições farmacêuticas para uso no tratamento de malignâncias humanas, compreendendo uma quantidade farma-ceuticamente eficaz de um anticorpo da presente invenção e de um veículo farmaceuticamente aceitável.

As composições de ABM da invenção podem ser administradas usando-se modos de administração convencionais, incluindo, mas, não limitados a, administração intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfático ou diretamente no tumor. A administração intravenosa é preferida.

Em um aspecto da invenção, formulações terapêuticas contendo as ABMs da invenção são preparadas para armazenamento por mistura de um anticorpo tendo o grau de pureza desejado com veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ê edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou de soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos a receptores, nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conserrvantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol; álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos,tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, aspa-ragina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tal como sódio; complexos de metal (por e-xemplo, complexos de proteína-Zn); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).

As ABMs da presente invenção podem ser administradas a um sujeito, para tratar uma doença ou distúrbio caracterizado por atividade anormal de MCSP ou de ligante de MCSP, tal como um tumor, ou isoladamente ou em terapia de combinação com, por exemplo, um agente quimiote-rápico e/ou terapia com radiação. Agentes quimiterápicos adequados incluem cisplatina, doxorrubicina, topotecano, paclitaxel, vinblastina, carboplatina e etoposídeo.

Formulações liofilizadas adaptadas para administração subcutânea são descritas em WO97/04801. Tais formulações liofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente adequado para uma elevada concentração de proteína e a formulação reconstituída pode ser administrada subcutane-amente ao mamífero a ser tratado aqui.

A formulação aqui também pode conter mais do que um composto ativo conforme necessário para a indicação particular sendo tratada, de preferência, aqueles com atividades complementares que não afetem adversamente um ao outro. Por exemplo, pode ser desejável fornecer adicionalmente um agente citotóxico, agente quimioterápico, citocina ou agente imunossupressor (por exemplo, um que atue em células T, tais como ciclos-porina ou um anticorpo que se ligue a células T, por exemplo, um que se ligue a LFA-1). A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de antagonista presente na formulação, o tipo de doença ou distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos acima. Esses são usados, em geral, nas mesmas dosagens e com rotas de administração conforme usados aqui anteriormente ou cerca desde de 1 a 99% das dosagens empregadas aqui anteriormente.Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli (metacrilato de metila), respectivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomas, mi-croesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington's Pharma-ceutical Sciences 16§ edição, Osol, A. Ed. (1980).

Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas.

Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antago-nista, matrizes essas estão na forma de partículas conformadas, por exemplo, filmes ou micropartículas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidróxietil-metacrilato) ou poli (álcool vinílico), polilactídeos (patente norte-americana de número 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e y-etil-L-glutamina, acetato de etileno-vinila não degradável, copolímeros degradáveis de ácido lático - ácido glicólico, tal como o LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático - ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido de poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a serem usadas para a administração in vivo têm que ser estéreis. Isso é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéril.

As composições da invenção podem estar em uma variedade de formas de dosagem, que incluem, mas, não estão limitadas a, soluções ou suspensões líquidas, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas ou microvesículas poliméricas, lipossomas e soluções injetáveis ou infusí-veis. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicação terapêutica.

As composições da invenção também incluem, de preferência, veículos farmaceuticamente aceitáveis convencionais e adjuvantes conhecidos na técnica, tais como albumina de soro humano, trocadores de íons,alumina, lecitina, substâncias tampão, tais como fosfatos, glicina, ácido sór-bico, sorbato de potássio, e sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protami-na.

O modo de administração e regime de dosagem mais eficazes para as composições farmacêuticas dessa invenção dependem da severidade e do curso da doença, da saúde do paciente e da resposta ao tratamento e do julgamento do médico assistente. Conseqüentemente, as dosagens das composições devem ser tituladas ao paciente individual. No entanto, a dose eficaz das composições dessa invenção estará, em geral, na faixa de desde cerca de 0,01 a cerca de 2.000 mg/Kg.

As moléculas descritas aqui podem estar em uma variedade de formas de dosagem, que incluem, mas, não estão limitadas a, soluções ou suspensões líquidas, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas ou microvesículas poliméricas, lipossomas e soluções injetáveis ou infusí-15 veis. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicação terapêutica.

As dosagens da presente invenção podem, em alguns casos, ser determinada pelo uso de biomarcadores. Biomarcadores são marcadores moleculares que são usados para avaliar a fármaco-dinâmica de um agente terapêutico e determinam que sujeitos são os mais prováveis a responderem. Por exemplo, biomarcadores para terapia anti-MCSP podem ser moléculas (por exemplo, quinase de adesão focai (FAK), quinase regulada por sinal extracelular (ERK) ou outras), que estejam na via de sinalização à jusante de MCSP, que conduz a um distúrbio de proliferação celular. Portanto, biomarcadores podem ser usados para determinar em qual quantidade se administrar a ABM da presente invenção. A presente invenção também fornece um método de administração de uma quantidade de uma ABM a um paciente determinando-se, primeiramente, a expressão de biomarcadores de distúrbios marcados por expressão de MCSP.

As dosagens da presente invenção podem, em alguns casos, ser determinads pelo uso de biomarcadores preditivos. Biomarcadores predi-tivos são marcadores moleculares que são usados para determinar (isto é,observar e/ou quantificar) um padrão de expressão e/ou ativação de genes ou proteínas relacionados a tumor, ou componentes celulares de uma via de sinalização relacionada a tumor. A elucidação dos efeitos biológicos de terapias alvo em tecido de tumor e a correlação desses efeitos com a resposta clínica auxilia a identificar o crescimento predominante e vias de sobrevivência operativas em tumores, por meio do que se estabelece um perfil de prováveis respondedores e, reciprocamente, fornecendo uma racionalidade para estratégias de projeto para superar a resistência. Por exemplo, biomarca-dores para terapia anti-MCSP podem compreender moléculas que estejam na via de sinalização à jusante de MCSP, que conduzam a um distúrbio de proliferação celular incluindo, mas, não limitados a: FAK, ERK, metaloprotei-nase de matriz de tipo 3 de membrana (MT3-MMP), Cdc42, Ack-1 e p130cas. Yang etal.,J. Cell Biol. 165(6):881-891 (Junho de 2004); lida et ai, J. Biol. Chem. 276(22): 18786-18794 (2001); Eisenmann et ai, Nat. Cell Biol. 7fSj:507-513(1999).

Biomarcadores preditivos podem ser medidos por ensaios celulares, que são bem-conhecidos na técnica, incluindo, mas, não limitados a, imunohistoquímica, citometria de escoamento, imuno-fluorescência, ensaios de captura e detecção e ensaios de fase reversa e/ou ensaios descritos na publicação de pedido de patente norte-americana de número 2004/0132097 A1, o completo conteúdo da qual são aqui incorporados por referência. Biomarcadores preditivos de terapia anti-MCSP, eles mesmos, podem ser identificados de acordo com as técnicas descritas na publicação de pedido de patente norte-americana de número 2003/0190689 A1, o completo conteúdo da qual são aqui incorporados por referência.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para o tratamento de um distúrbio relacionado a MCSP compreendendo a previsão de uma resposta à terapia anti-MCSP em um sujeito humano necessitando de tratamento por ensaio de uma amostra a partir do paciente humano antes da terapia com um ou uma pluralidade de regentes que detectem a expressão e/ou a ativação de biomarcadores preditivos para um distúrbio relacionado a MCSP, tal como câncer; determinação de um padrão e/ou ativaçãode um ou mais dos biomarcadores preditivos, sendo que o padrão prediz a resposta do paciente humano à terapia anti-MCSP; e administração, a um sujeito humano que esteja previsto a responder positivamente a tratamento anti-MCSP, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo uma ABM da presente invenção. Conforme usado aqui, um sujeito humano que esteja previsto a responder positivamente a tratamento anti-MCSP é um para quem anti-MCSP terá um efeito mensurável sobre o distúrbio relacionado a MCSP (por exemplo, regressão/encolhimento de tumor) e para quem os benefícios de terapia anti-MCSP não sem contrabalançados por efeitos adversos (por exemplo, toxicidade). Conforme usado aqui, uma amostra significa qualquer amostra biológica a partir de um organismo, particularmente um ser humano, compreendendo uma ou mais células, incluindo células únicas de qualquer origem, tecido ou amostras de biópsias, que tenham sido removidas a partir de órgãos, tais como seio, pulmão, trato gastrointestinal, pele, cérvix, ovário, próstata, rim, cérebro, cabeça e pescoço ou qualquer outro órgão ou tecido do corpo, e outras amostras do corpo incluindo, mas, não limitadas a, substâncias gordurosas, saliva, secreções, fluido cerebroespinhal, bile, sangue, fluido de linfa, urina e fezes.

A composição compreendendo uma ABM da presente invenção será formulada, dosada e administrada de uma maneira consistente com a boa prática médica. Fatores para consideração, nesse contexto, incluem a doença ou o distúrbio particular sendo tratados, do mamífero particular sendo tratado, da condição clínica do paciente individual, da causa da doença ou do distúrbio, do local de entrega do agente, do método de administração, da programação de administração e de outros fatores conhecidos pelos médicos praticantes. A quantidade terapeuticamente eficaz do antagonista a ser administrado será governada por tais considerações.

Como uma proposição geral, a quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo administrado parenteralmente por dose estará na faixa de cerca de 0,1 a 20 mg/Kg de peso corporal do paciente por dia, com a faixa inicial típica de antagonista usado estando na faixa de cerca de 2 a 10 mg/Kg.Em uma concretização preferida, a ABM é um anticorpo, de preferência, um anticorpo humanizado. Dosagens adequadas para um tal anticorpo não conjugado estão, por exemplo, na faixa de desde cerca de 20 mg/m2 a cerca de 1.000 mg/m2. Por exemplo, pode-se administrar ao paciente uma ou mais doses de substancialmente menos do que 375 mg/m2 do anticorpo, por exemplo, onde a dose estiver na faixa de desde cerca de 20 mg/m2 a cerca de 250 mg/m2, por exemplo, desde cerca de 50 mg/m2 a cerca de 200 mg/m2.

Além disso, pode-se administrar uma ou mais doses iniciais do anticorpo seguidas por uma ou mais doses subseqüentes, sendo que a dose em mg/m2 do anticorpo na(s) dose(s) subseqüente(s) excede(m) a dose em mg/m2 do anticorpo na(s) dose(s) inicial(is). Por exemplo, a dose inicial pode estar na faixa desde cerca de 20 mg/m2 a cerca de 250 mg/m2 (por exemplo, desde cerca de 50 mg/m2 a cerca de 200 mg/m2) e a dose subseqüente pode estar na faixa de desde cerca de 250 mg/m2 a cerca de 1.000 mg/m2.

Conforme observado acima, no entanto, essas quantidades sugeridas de ABM estão sujeitas a uma grande quantidade de ponderação terapêutica. O fator chave na seleção de uma dose e de uma programação apropriadas é o resultado obtido, conforme indicado acima. Por exemplo, doses relativamente mais elevadas podem ser necessárias inicialmente para o tratamento de doenças em andamento ou agudas. Para se obter os resultados mais eficazes, dependendo da doença ou do distúrbio, o antagonista é administrado o mais próximo possível do primeiro sinal, diagnose, aparecimento ou ocorrência da doença ou do distúrbio, ou durante remissões da doença ou do distúrbio.

No caso de anticorpos anti-MCSP usados para tratar tumores, resultados terapêuticos ótimos são, em geral, alcançados com uma dose que seja suficiente para saturar completamente a molécula de MCSP sobre as células alvo. A dose necessária para se alcançar a saturação dependerá do número de moléculas de MCSP expressas por célula de tumor (que pode variar significativamente entre diferentes tipos de tumor). Concentrações sé-ricas tão baixas quanto 30 nM podem ser eficazes no tratamento de algunstumores, enquanto que concentrações acima de 100 nM podem ser necessárias para se alcançar efeito terapêutico ótimo com outros tumores. A dose necessária para se alcançar saturação para um dado tumor pode ser prontamente determinada in vitro por radioimunoensaio ou imunoprecipitação.

Em geral, para terapia de combinação com radiação, um regime terapêutico adequado envolve oito infusões semanais de uma ABM anti-MCSP da invenção em uma dose de carregamento de 100 - 500 mg/m2, seguida por doses de manutenção em 100 - 250 mg/m2 e radiação na quantidade de 70,0 Gy em uma dose diária de 2,0 Gy. Para terapia de combinação com quimioterapia, um regime terapêutico adequado envolve a administração de uma ABM anti-MCSP da invenção como doses de carregamento/manutenção semanal de 100/100 mg/m2, 400/250 mg/m2, ou 500/250 mg/m2 em combinação com cisplatina em uma dose de 100 mg/m2 a cada três semanas. Alternativamente, gemcitabina ou irinoteean podem ser usados no lugar de cisplatina.

A ABM da presente invenção é administrada por quaisquer meios adequados, incluindo administração parenteral, subcutânea, intraperito-neal, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado, para tratamento imunos-supressor local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Em adição, o antagonista pode ser adequadamente administrado por infusão em pulsos, por exemplo, com doses declinantes do antagonista. De preferência, a dosagem é dada por injeções, muitíssimo de preferência, injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração será breve ou crônica.

Pode-se administrar outros compostos, tais como agentes cito-tóxicos, agentes quimioterapicos, agentes imunossupressores e/ou citocinas com os antagonistas aqui. A administração combinada inclui a administração conjunta inclui a administração conjunta, usando-se formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva em qualquer ordem, sendo que, de preferência, existe um período de tempo durante dois (ou todos) agentes ativos exercem simultaneamente suas ativida-des biológicas.

Estaria claro que a dose da composição da invenção exigida para se alcançar curas poderia ser adicionalmente reduzida com a otimização do programa.

De acordo com a prática da invenção, o veículo farmacêutico pode ser um veículo lipídico. O veículo lipídico pode ser um fosfolipídeo. Além disso, o veículo lipídico pode ser um ácido graxo. Além disso, o veículo lipídico pode ser um detergente. Conforme usado aqui, um detergente é qualquer substância que altere a tensão superficial de um líquido, em geral, diminuindoa.

Em um exemplo da invenção, o detergente pode ser um detergente não iônico. Exemplos de detergentes não iônicos incluem, mas, não estão limitados a,' polissorbato 80 (também conhecido como Tween 80 ou (monooleato de poli-oxietileno-sorbitano), Brij e Triton (por exemplo, Triton WR-1339 e Triton A-20).

Alternativamente, o detergente pode ser um detergente iônico. Um exemplo de um detergente iônico inclui, mas, não está limitado a, brometo de alquiltrimetilamônio.

Adicionalmente, de acordo com a invenção, o veículo lipídico pode ser um lipossoma. Conforme usado nesse pedido, um "lipossoma" é qualquer vesícula ligada à membrana, que contenha quaisquer moléculas da invenção ou suas combinações. Artigos de Fabricação

Em outra concretização da invenção, é fornecido um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente e uma etiqueta ou uma inserção de embalagem em ou associado com o recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente abriga uma composição que seja eficaz para o tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou umfrasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo anti-MCSP. A etiqueta ou inserção de embalagem indica que a composição é usada para tratamento da condição de escolha, tal como uma doença ou um distúrbio não maligno, sendo que a doença ou o distúrbio envolve ativação ou produção anormal de MCSP e/ou um ligante de MCSP, por exemplo, uma doença ou um distúrbio hiperproliferativo benigno. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, sendo que a composição compreende um primeiro anticorpo que se liga a MCSP e inibe o crescimento de células que sobreexpressem MCSP; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, sendo que a composição compreende um segundo anticorpo que se liga a MCSP e bloqueia a ativação de ligante de um receptor de MCSP. O artigo de fabricação nessa concretização da invenção pode compreender adicionalmente uma inserção de embalagem indicando que a primeira e a segunda composições de anticorpo podem ser usadas para tratar uma doença ou um distúrbio não maligno a partir da lista de tais doenças ou distúrbios na seção de definição acima. Além disso, a inserção de embalagem pode instruir o usuário da composição (compreendendo um anticorpo que se liga a MCSP e que bloqueia a ativação de ligante de um receptor de MCSP) para combinar terapia com o anticorpo com qualquer das terapias adjuntas descritas na seção precedente (por exemplo, um agente quimioterápico, um fármaco mirado para MCSP, um agente antiangiogênico, um agente imunossupressor, inibidor de tirosina quinase, um composto anti-hormonal, um cárdio-protetor e/ou uma citocina). Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender adicionalmente um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostáti-ca para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

Os exemplos abaixo explicam a invenção em maiores detalhes.As preparações e exemplos seguintes são dados para permitir aos versados na técnica compreenderem mais claramente e a praticarem a presente invenção. A presente invenção, entretanto, não está limitada em escopo pelas concretizações exemplificadas, que são pretendidas somente como ilustra-5 ções de aspectos únicos da invenção, e métodos que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. De fato, várias modificações da invenção, em adição àquelas descritas aqui, tornar-se-ão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição precedente e dos desenhos anexos. Tais modificações pretendem cair dentro do escopo das reivindicações apensas.

Todas as patentes, pedidos e publicações citados nesse pedido são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

EXEMPLOS

A menos se especificado de outra maneira, referências à numeração de posições específicas de resíduos de aminoácidos nos Exemplos seguintes estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Exceto onde observado de maneira diferente, os materiais e métodos usados para preparar as moléculas de ligação a antígeno nesses exemplos de realização estão de acordo com aqueles descritos nos exemplos do pedido de patente norte-americana de número 10/981.738, o qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

EXEMPLO 1

Geração de MAbs anti-MCSP Humanizados

A. Abordagem de Aceptor com Elevada Homologia

Sob essa abordagem, uma pesquisa de quadro de aceptor de anticorpo com elevada homologia foi realizada por alinhamento da seqüência de proteína parental, derivada a partir do anticorpo 225.28S de scFv derivado de camundongo com relação a uma coleção de seqüências de linhagem germinativa humana e pegando-se aquela seqüência humana que mostrou a mais elevada identidade de seqüência, enquanto que, ao mesmo tempo, se conserva todos os resíduos canonicos em um nível funcional. Aqui, as seqüências IGHV3-15 (Número de Acesso X92216) e IGHV3-7 (Número deAcesso M99649) a partir do banco de dados IMGT, foram tomadas como as seqüências de aceptor de quadro. Ambas são membros da família VH3. A seqüência IGKV1-9 (Número de Acesso Z00013), a partir da família VK1 do mesmo banco de dados, foi escolhida para ser o aceptor de quadro para a cadeia leve. Nesses três quadros de aceptor, as três regiões determinantes de complementariedade (CDRs) de cada um dos domínios variáveis pesado e leve de 225.28S murino foram enxertadas. Uma vez que a região de quadro 4 (FR4) não faz parte da região variável do gene de linhagem germinativa, o alinhamento para aquela posição foi feito individualmente. A região JH6 foi escolhida para a cadeia pesada, e a região JK4 foi escolhida para a cadeia leve. A modelagem molecular do domínio de imunoglobulina projetado revelou algumas posições potencialmente exigindo os resíduos de aminoá-cidos murinos ao invés daqueles humanos do lado de fora das regiões de CDR. Reintroduzindo-se resíduos de aminoácidos murinos no quadro humano geraria as assim chamadas retromutações. Por exemplo, o resíduo de aminoácido de aceptor humano na posição 94 de Kabat (treonina em I-GHV3-15) foi retromutado para um resíduo de serina em uma das variantes. Para comprovar a hipótese da necessidade dessas retromutações, variantes de anticorpo humanizadas foram projetadas, as quais ou incluíram ou omitiram as retromutações.

Na seqüência da cadeia leve de 225.28S, uma análise estatística revelou uma extensão completa de resíduos "raros" em FR2. Esses são Glu45, Pro46, Leu48 e Phe49. A análise do modelo molecular tridimensional mostrou que todos desses resíduos exercem fortes interações com relação das CDRs da cadeia leve, e (com exceção de Leu48), também com relação à CDR3 de VH. Nessa etapa de modelagem, constatou-se também que Pro46 faz importantes contatos ao VH CDR3. Para investigar a importância desses resíduos, eles foram incorporados como retromutações aos construc-tos de VL humanizados. Os constructos humanizados contendo retromutações foram comparados a constructos preparados de acordo com a abordagem de "quadro misto" discutida abaixo com relação a sua capacidade de se ligar a antígeno.B. Abordagem de Quadro Misto

A fim de se evitar introduzir retromutações em posições críticas (críticas para reter boa afinidade de ligação a antígeno ou funções de anticorpo) no quadro de aceptor humano, foi investigado se a região 1 de quadro (FR1), as regiões de quadro 1 (FR1) e 2 (FR2) em conjunto ou a FR3 de um anticorpo funcionalmente humanizado poderia ser substituída por seqüências de anticorpo humano já tendo resíduos de doador, ou aqueles funcionalmente equivalentes, naquelas posições importantes na seqüência de linhagem germinativa humana natural. Para essa finalidade, os quadros FR1, FR2 e FR3 de VH, da seqüência VH de 225.28S murino, foram alinhados individualmente às seqüências de linhagem germinativa humana. Aqui a mais elevada identidade de seqüência não era importante, e não foi usada para a escolha de quadros de aceptor, mas, ao invés disso, o pareamento dé vários resíduos críticos foi assumido como sendo mais importante. Aqueles resíduos críticos compreendem os assim chamados resíduos canônicos, e também aqueles resíduos nas posições 27, 28 e 30 (numeração de Kabat), _que se situem do lado de fora da definição de CDR1 por Kabat, mas, do lado de dentro da CDR1 conforme definida por Kabat, e, freqüentemente, estão envolvidos na ligação a antígeno. Além disso, resíduos críticos são aqueles que exibem importante interação com relação às CDRs, conforme pode ser determinado usando-se modelagem molecular. As seqüências de IMGT I-GHV1-58 (Número de Acesso M29809) e IGHV1-46 (Número de Acesso X92343) foram escolhidas como candidatos adequados para a substituição de cada uma FR1, FR2 ou FR3. Resumidamente, IGHV1-46 foi usada como um aceptor para todos os quadros, gerando, assim, um aceptor de quadro único, que seja idêntico às regiões de FR de doador em 53% no nível de aminoácido. IGHV1-46 foi também usada como o aceptor de FR1 e FR2, enquanto que IGHV1-58 foi usada para FR3. Também a IGHV3-7 foi usada como aceptor de FR1 e FR2, e a IGHV3-15 foi usada para FR1, FR2 e/ou FR3. A racionalidade para a mistura da IGHV3-7 com a IGHV3-15 era ter homologia ótima em FR1 e FR2, e tendo resíduos com pareamento em posições de Kabat 71 e 94. Em todos esses constructos, a JH6 foi usada para aregião FR4.

Conforme mencionado acima, com respeito à abordagem de elevada homologia, a região FR2 da cadeia leve humanizada demandaria algum esforço. Foram introduzidas várias regiões FR2 de outros anticorpos de linhagem germinativa, a saber, IGKV2-28 (Número de Acesso X63397) e a IGKV2D-30 (Número de Acesso X63402). Obviamente, resíduos "raros" foram raramente encontrados no repertório de linhagem germinativa humana. Assim, a FR2 de um anticorpo de linhagem não germinativa (Número de A-cesso ao GenBank AAA17574), que é derivada a partir de células B periféricas humanas e incorpora o resíduo 46 de prolina, foi também incluída na coleção FR de aceptor.

Para se examinar a idéia de se remover resíduos "raros" nos constructos de cadeia leve, que estejam dentro das regiões de CDR, as variantes M-KV10, M-KV11 e M-KV12 foram construídas. Todos eles se iniciam a partir do projeto de M-KV9. M-KV10 substitui a Lys24 murina por uma argi-nina humana, e também substitui a Val33 por uma leucina humana. M-KV11 substitui somente a Val33 murina por uma leucina humana. M-KV12 substitui a extensão de três aminoácidos Arg-Tyr-Thr (54 a 56) pela tripeptídeo Leu-Gln-Ser derivado de VK1 humana.

Depois de ter projetado as seqüências de proteína, as seqüências de DNA que codificam essas proteínas foram sintetizadas conforme detalhado abaixo. Usando-se essa abordagem, retromutações poderiam ser evitadas na maioria dos constructos da cadeia pesada, a fim de reter bons níveis de ligação a antígeno.

A cronologia e a racionalidade dos constructos de quadro mistos são explicadas na seção de resultados.

C. Síntese dos genes de anticorpo

Depois de ter projetado a seqüência de aminoácidos da região V de anticorpo humanizado, a seqüência de DNA tinha que ser gerada. Os dados de seqüência de DNA das regiões de quadro individuais foram encontrados nos bancos de dados (por exemplo, o Sistema Internacional de Informação sobre Imunogenética mantido pelo Instituto Europeu de Bioinformáti-ca, http://imgt.cines.fr) para seqüências de linhagem germinativa humana. A informação sobre seqüência de DNA das regiões de CDR foi deduzida a partir da seqüência de proteína publicada do anticorpo 225.28S murino. Neri et ai, J. Invest. Dermatol. 7070:164-170 (1996). Com essas seqüências, a seqüência de DNA completa foi montada de maneira virtual. Tendo-se esses dados sobre seqüência de DNA, sítios de restrição diagnósticos foram introduzidos na seqüência virtual, introduzindo-se mutações silentes, criando-se sítios de reconhecimento para endonucleases de restrição. Para se obter a cadeia de DNA física, síntese de gene foi realizada (por exemplo, Wheeler et al. 1995). Nesse método, oligonucleotídeos foram projetados a partir de genes de interesse, tal que uma série de oligonucleotídeos é derivada a partir da fita de codificação, e uma outra série é derivada a partir da fita de não codificação. As extremidades 3' e 5' de cada oligonucleotídeo (exceto a primeira e a última na linha) sempre mostram seqüências de complementariedade com relação a dois iniciadores derivados a partir da fita oposta. Quando se coloca esses oligonucleotídeos em um tampão de reação adequado para qualquer polimerase estável ao calor, e se adiciona Mg2+, dNTPs e uma DNA polimerase, cada oligonucleotídeo é expandido a partir de sua extremidade 3'. A extremidade 3' recém formada de um iniciador, então, se anela com o próximo iniciador da fita oposta, e estendendo-se sua seqüência adicionalmente sob condições adequadas para o alongamento de cadeia de DNA dependente de molde. O produto final foi clonado em um vetor convencional para propagação em E. coli.

D. Produção de anticorpo

Seqüências líderes (para secreção) humanas de cadeia pesada (SEQ ID NO: 25) e de cadeia leve (SEQ ID NO: 53) foram adicionadas à montante das seqüências de DNA de região variável acima. À jusante das regiões variáveis, a região constante de lgG1 humana para a cadeia pesada e a região constante kappa humana para a cadeia leve, respectivamente, foram adicionados usando-se técnicas de biologia molecular padrão. As seqüências de DNA de cadeias pesada e leve de anticorpo humanizado de cadeia completa resultante foram subclonadas em vetores de expressão demamífero (um para a cadeia leve e um para a cadeia pesada) sob o controle do promotor de MPSV e à montante de um sítio de polyA sintético, cada vetor portando uma seqüência EBV OriP.

Foram produzidos anticorpos para a co-transfecção de células HEK293-EBNA com os vetores de expressão de cadeias pesada e leve de anticorpo de mamífero, usando-se uma abordagem de transfecção com fosfato de cálcio. Cultivando-se exponencialmente células HEK293-EBNA, foram transfectadas pelo método de fosfato de cálcio. Células foram cultivadas como culturas de monocamada aderentes em frescos T, usando-se meio de cultura DMEM suplementado com FCS a 10%, e foram transfectadas quando elas estavam entre 50 e 80% confluentes. Para a transfecção de um frasco T75, 8 milhões de células foram semeadas 24 horas antes de transfecção em 14 mL de meio de cultura DMEM suplementado com FCS (a 10% v/v final), 250 ug/mL de neomicina, e as células foram colocadas, a 37°C, em uma incubadora com atmosfera de 5% de C02, durante uma noite. Para cada frasco T75 a ser transfectado, uma solução de DNA, CaCI2 e água foi preparada por mistura de 47 ug de DNA de vetor de plasmídeo total dividido igualmente entre os vetores de expressão de cadeias leve e pesada, 235 uL de uma solução de CaCI2 1 M, e adicionando-se água para um voiume final de 469 uL A essa solução, 469 uL de uma HEPES 50 mM, NaCI 280 mM, solução de Na2HP04 1,5 mM em pH 7,05 foram adicionados, misturados imediatamente durante 10 segundos e deixados repousar à temperatura ambiente durante 20 segundos. A suspensão foi diluída com 12 mL de DMEM suplementado com FCS a 2%, e adicionados ao T75 no lugar do meio existente. As células foram incubadas a 37°C, em 5% de C02 durante cerca de 17 a 20 horas, então, o meio foi substituído com 12 mL de DMEM, FCS a 10%. O meio de cultura condicionado foi coletado 5 a 7 dias após a transfecção, centrifugado durante 5 minutos a 1.200 rpm, seguida por uma segunda centrifugação durante 10 minutos a 4.000 rpm e mantida a 4°C. Os anticorpos secretados foram purificados por cromatografia por afinidade com Proteína A, seguida por cromatografia por troca iônica e uma etapa croma-tográfica final de exclusão por tamanho em uma coluna Superdex 200 (A-mersham Pharmacia) trocando-se o tampão para salina de tampão de fosfato e coletando-se anticorpos de lgG1 monoméricos puros. A concretização de anticorpo foi estimada usando-se um espectrofotômetro a partir da absor-bância em 280 nm. Os anticorpos foram formulados em uma solução de fos-5 fato de potássio 25 mM, de cloreto de sódio 125 mM, glicina 100 mM de pH 6,7.

E. Glicoengenharia de Anticorpos Humanizados

A glicoengenharia das variantes humanizadas foi realizada por co-transfecção em células de mamífero dos vetores de expressão de anti-corpo em conjunto com um vetor de expressão de glicosiltransferase GnT-lll, ou em conjunto com um vetor de expressão de GnT-lll mais um vetor de expressão de manosidase II em Golgi. O polipeptídeo tendo atividade de GnTI-II é um polipeptídeo de fusão compreendendo o domínio de localização em Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi heterólogo preparado de acordo com os métodos ensinados na publicação de pedido de patente norte-americana de número 2004/0241817 A1, os conteúdos da qual são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Anticorpos glicoengenheirados foram purificados e formulados conforme descrito acima para os anticorpos não glicoengenheirados. Os oligossacarídeos ligados à região de Fc dos anticorpos foram analisados por MALDI/TOF-MS, conforme descrito acima. A metodologia de glicoengenharia que pode ser usada com as ABMs da presente invenção foi descrita em maiores detalhes na patente norte-americana de número 6.602.684 e no pedido de patente norte-americano provisório de número 60/441.307 e WO 2004/065540, os conteúdos completos de cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade. As ABMs glicoengenheiradas da presente invenção têm quantidades reduzidas de resíduos de fucose na região de Fc. As ABMs da presente invenção também podem ser glicoengenheiradas para terem resíduos de fucose reduzidos na região de Fc, de acordo com as técnicas descritas na patente européia de número 1 176 195 A1, o conteúdo completo da qual é aqui incorporado por referência.

EXEMPLO 2Materiais e Métodos

A. Análise de Oligossacarídeo

1. Método de liberação de oligossacarídeo para anticorpos em solução

Entre 40 e 50 ug de anticorpo foram misturados com 2,5 mU de PNGaseF (Glyko, EUA) em Tris 2 mM, pH 7,0, em um volume final de 25 microlitros, e a mistura foi incubada durante 3 horas, a 37°C.

2. Preparação de amostra para MALDI/TOF-MS

As digestões enzimáticas, contendo os oligossacarídeos liberados, foram incubados durante um adicional de 3 horas, à temperatura ambiente, depois da adição de ácido acético para uma concentração final de 150 mM, e foram subseqüentemente passados através de 0,6 ml_ de resina trocadora de cátions (resina AG50W-X8, forma de hidrogênio, 100-200 mesh, BioRad, Suíça) empacotada em uma coluna de cromatografia micro-bio-spin (BioRad, Suíça) para remover cátions e proteínas. Um microlitro da amostra resultante foi aplicada a uma placa alvo de aço inoxidável, e misturado na placa com 1 uL de matriz de sDHB. Matriz de sDHB foi preparada dissolvendo-se 2 mg de ácido 2,5-dihidróxi-benzóico mais 0,1 mg de ácido 5-metóxi-salicílico em 1 mL de etanol/cloreto de sódio aquoso 10 mM 1:1 (v/v). As amostras foram secadas ao ar, 0,2 uL de etanol foram aplicados e as amostras foram finalmente deixadas a recristalizarem sob ar.

3. MALDI/TOF-MS

O espectrômetro de massa MALDI/TOF-MS usado para adquirir os espectros de massa foi um Voyager Elite (Perspective Biosystems). O instrumento foi operado na configuração linear, com uma aceleração de 20 KV e retardo de 80 ns. Calibração externa usando-se padrões de oligossacarídeo foi usado para avaliação de massa dos íons. Os espectros a partir de 200 disparos de laser foram somados para se obter o espectro final. Um espectro típico é mostrado na figura 8.

B. Ensaio de ligação a antígeno

As variantes de anticorpo humanizado monomérico purificadas foram testadas para a ligação ao antígeno HMW-MAA/MCSP humano nalinhagem de células de melanoma humano A375, usando-se um ensaio baseado em citométria de escoamento. 200.000 células (em 180 pL de tampão FACS (PBS contendo FCS a 2% e EDTA 5 mM) foram transferidas para tubos de poliestireno de 5 mL e 20 pL de amostras de anticorpo anti-MCSP (anticorpo primário) concentrado 10 vezes (concentração final de 1 - 5.000 ng/mL) ou somente PBS foram adicionados. Depois de mistura de maneira suave das amostras, os tubos foram incubados a 4°C, durante 30 minutos, no escuro. Subseqüentemente, as amostras foram lavadas duas vezes com tampão de FACS e peletizadas a 300 g durante 3 minutos. O sobrenadante foi removido por aspiração e as células foram absorvidas em 50 pL de tampão de FACS e 2 pL de anticorpo secundário (fragmentos de F(ab')2-FITC anti-Fc específicos (Jackson Immuno Research Laboratories, EUA)) foram adicionados e os tubos foram incubados à 4°C, durante 30 minutos. As a-mostras foram lavadas duas vezes com tampão de FACS e absorvidas em 500 pL de tampão de FACS para análise por citométria de escoamento. A ligação foi determinada por lançamento em gráfico a fluorescência média geométrica contra as concentrações de anticorpo.

C. Ensaio de Citotoxicidade Dependente de Anticorpo Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) foram usadas como células de efetor foram preparadas usando-se Histopa-que-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 EUA) e seguindo essencialmente as instruções do fabricante. Resumidamente, sangue veno-so foi tirado com seringas heparinizadas a partir de voluntários saudáveis. O sangue foi diluído 1:0,75 - 1,3 com PBS (não contendo Ca++ ou Mg++) e estratificado em Histopaque-1077. O gradiente foi centrifugado a 400 x g durante 30 minutos à temperatura ambiente (TA) sem interrupções. A interfase contendo as PBMC foi coletada e lavada com PBS (50 mL por células a partir de dois gradientes) e coletadas por centrifugação a 300 x g durante 10 minutos à TA. Depois de ressuspensão do pélete com PBS, as PBMC foram contadas e lavadas uma segunda vez por centrifugação a 200 x g durante 10 minutos à TA. As células foram, então, ressuspensas no meio apropriado para procedimentos subseqüentes.A razão de efetor para alvo usada para os ensaios de ADCC era de 100:1 e 25:1 para células de PBMC. As células de efetor foram preparadas em meio AIM-V na concentração apropriada, a fim de adicionar 50 uL por cavidade de placas de 96 cavidades de fundo redondo. Um conjunto de células alvo eram células que expressam MCSP humanas derivadas a partir de pacientes com melanoma (por exemplo, A375, A2058 ou SK-Mel5) cultivadas em DMEM contendo FCS a 10%. Outro conjunto de células alvo, que devem ser um modelo para os perfeitos, eram células musculares lisas aórti-cas humanas, denominadas HuSMC (obtidas a partir de Promocell, Heidelberg, Alemanha). Células HuSMC foram cultivadas em meio fornecido por Promocell. As células alvo foram lavadas em PBS, contadas e ressuspensas em AIM-V em 0,3 milhões por mL a fim de adicionar 30.000 células em 100 uL por microcavidade. Os anticorpos foram diluídos em AIM-V, adicionados em 50 uL a células alvo previamente plaquedas e deixadas ligar aos alvos durante 10 minutos à TA. As células de efetor, então, foram adicionadas e a placa foi incubada durante uma noite, e durante quatro horas, para as células de melanoma e as HuSMC, respectivamente, a 37°C, em uma atmosfera umidificada contendo 5% de C02. A morte de células alvo foi avaliada por medição de liberação de lactato desidrogenase (LDH) a partir de células danificadas usando-se o kit de detecção de citotoxicidade (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suíça). Depois de incubação de 4 horas, as placas foram centrifugadas a 800 x g. 100 uL de sobrenadante a partir de cada cavidade foram transferidos para uma nova placa de 96 cavidades de fundo plano transparente. 100 uL de tampão de substrato colorido a partir do kit foram adicionados por cavidade. Os valores de Vmáx da reação de cor foram determinados em uma leitora de ELISA a 490 nm durante pelo menos 10 minutos, usando-se o programa de computador SOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyva-le, CA94089, EUA). A liberação de LDH espontânea foi medida a partir de cavidades contendo somente células alvo e efetoras, mas, nenhum anticorpo. A liberação máxima foi determinada a partir de cavidades contendo somente células alvo e Triton X-100 a 1%. A percentagem de morte mediada por anticorpo específica foi calculada como se segue: ((x-SR)/(MR-SR)*100,em que x é a média de Vmáx em uma concentração de anticorpo específica, SR é a média Vmáx da liberação espontânea e MR é a média de Vmáx da liberação máxima.

D. Resultados e Discussão Os três constructos de cadeias pesadas iniciais M-HHA, M-HHB e M-HHC, assim como os três constructos de cadeias leves iniciais M-KV1, M-KV2 e M-KV3 foram ensaiados para suas propriedades com relação ao seu antígeno cognato, MCSP. Para isso, os constructos de cadeias pesadas humanizados foram expressos em conjunto com a cadeia leve murina (m-VL), e as cadeias leves humanizadas foram expressos em conjunto com a cadeia pesada murina (mVH). Os resultados são mostrados na figura 1, que mostra os dois constructos de cadeias pesadas M-HHA e M-HHB, mais ou menos retêm suas propriedades de ligação, quando combinados com a VL murina. Em contraste, o constructo M-HHC perde seu potencial de ligação de maneira significativa. M-HHC difere de M-HHB somente nas duas mudanças Gly49 Ala e GluõOAsn. Uma vez que a alanina, na posição 49, é realmente aquela murina, a asparagina, na posição 50, é estritamente proibida. Portanto, o glutamato murino 50 foi mantido em todas as variantes adicionais. Isso significa que o trabalho do quadro IGHV3-15 satisfaz todas as exigências para resíduos canônicos e outros resíduos chave (observe-se que a posição 50 faz parte da CDR2 de Kabat). Os constructos de cadeias leves humanizados M-KV1 e M-KV2 mostram atividade de ligação fortemente diminuída comparados a sua contraparte murina. Enquanto o constructo M-KV3 exibe comportamento de ligação similar à cadeia leve murina. Isso significa que as mutações lle21Val, Leu46Pro, He48Leu e Tyr49Phe restauraram a ligação da variante M-KV2 previamente inativa. Cada um desses resíduos de aminoácidos trabalham de maneira sinergística ou um resíduo único é responsável para o efeito como um todo.

A figura 2 exibe dados dos constructos de "baixa homologia" M-HLA, M-HLB e M-HLC combinados com o constructo M-KV3 de cadeia leve. Obviamente, a ligação dessas três variantes é completamente abolida, conduzindo à conclusão de que um ou mais dos resíduos chave (incluindo oscanônicos) não são satisfeitos nos constructos VH humanizados. Uma vez que se espera que os resíduos 27 e 30 sejam responsáveis por alguma "sintonia fina" da atividade de ligação ao invés de se abolir completamente as propriedades de ligação, espera-se que os resíduos importantes estejam localizados no quadro de leitura 3. Dois candidatos óbvios parecem ser Thr93 e Ser94 da seqüência de 225.28S. Se usar a seqüência de IGHV1-58 FR3, então Ala93 e Ala94 seriam os resíduos putativamente responsáveis pela diminuição de atividade de ligação a antígeno. A influência de outros resíduos de FR não pode ser governada, mas, de preferência, pareceu ser improvável, com base na análise estatística, assim como do modelo molecular da estrutura tridimensional do anticorpo de 225.28S. Suporte para a importância de resíduos 27 e 30 é mostrado na figura 7, uma vez que o cons-tructo M-HLD obteve novamente alguma atividade de ligação residual, indicando que a introdução de resíduos Phe27 e Ser30 pode influenciar o comportamento de ligação.

A fim de ressaltar os resíduos chave da cadeia leve, os constructos M-KV4, 5, 6, 7, 8 e 9 foram gerados. M-KV4 remove uma retromutação de M-KV3 (Val21 lie). M-KV5 usa uma nova FR2 (JGKV2-28; Número de A-cesso X63397), que tem Gln42 e Ser43 que ocorre naturalmente, assim como Gln45, que é (em alguma extensão) similar à Gln45 murina. M-KV6 tem a seqüência de FR2 IGKV2D-30 (Número de Acesso X63402). M-KV7 é o derivado de Leu46Pro da região de FR2 de M-KV1 (introduzindo, assim, uma retromutação na FR2). M-KV8 é a variante da região de FR2 de M-KV1 (introduzindo, assim, outra retromutação na FR2). O resultado dos dados de ligação desses constructos de cadeia leve, quando pareados com a cadeia pesada de M-HHB, está retratado na figura 3. O constructo M-KV4 ganhou afinidade com relação a seu antígeno, quando comparado ao anticorpo ch-225.28S. Os constructos M-KV5 e 6 não obtiveram novamente suas propriedades funcionais, indicando que as mutações neles introduzidas eram irrelevantes. O anticorpo M-KV7 exibiram propriedades de ligação tão boas quanto à cadeia leve de ch-225.28S, indicando que uma mutação pontual única (Leu46Pro) foi necessária e suficiente para recuperar a atividade de ligaçãocompleta do constructo M-KV1 de cadeia leve previamente inativo.

A fim de explorar a possibilidade de gerar constructos de quadro de leitura híbrido das cadeias leves humanizadas, substituiu-se as regiões FR1 e FR2 do M-HLB e M-HLC por aquela do IGHV3-15(Número de Acesso X92216), obtendo-se constructos M-HLE1 e M-HLE2. Esses dois constructos diferem somente no fato de que os resíduos 61 a 64 (que são membros da CDR2 conforme definida por Kabat, mas, não conforme definido por Chotia) são, cada um, de origem humana (M-HLE1) ou murina (M-HLE2). Esses constructos nos contariam se os resíduos chave para a falha de constructos M-HLB e C estariam localizados na área de FR1 e de FR2, ou, como era esperado, na área de FR3. Os novos constructos compreenderiam regiões de quadro de leitura derivados a partir da classe 1 e 3 da família VH. Portanto, poderia surgir instabilidade, embora durante a análise do modelo molecular tridimensional, nenhuma fonte óbvia disto pôde ser identificada. Simultaneamente, a FR3 de IGHV3-15 (que provou ser funcional no constructo M-HHB) foi combinado com as regiões FR1 e 2 da seqüência IGHV3-7, conduzindo aos constructos M-HLF e M-HLG. M-HLF tem sua CDR1 completamente humanizada, e difere de M-HLG somente na posição 31 e 35. M-HLG tem a seqüência murina nessas posições. A figura 4 mostra o resultado do experimento de ligação a antígeno, quando pareando os constructos de cadeia pesada M-HLE1, E2, F e G com o constructo de cadeia leve M-KV4. Os constructos M-HLE1 e M-HLE2 mostram alguma ligação residual, indicando algum aperfeiçoamento sobre seu predecessor M-HLB e C. Ainda, essa ligação está muito longe de ser útil. O constructo M-HLF tem quase nenhuma ligação, que poderia ser restaurada por introdução de duas mutações Ser31Asn e Ser35Asn (M-HLG). M-HLG mostrou, de maneira similar a M-HHB, uma afinidade igual ou mesmo mais elevada ao antígeno, do que o anticorpo parental ch-225.28S. Isso indica adicionalmente a importância de alguns resíduos críticos em FR3 (posições 93 treonina e 94 serina, ou treonina conforme mencionado acima). Embora alguma importância tenha que ser colocada nos resíduos em FR1 e 2 (por exemplo, fenil-alanina27 ou tre-onina30), conforme demonstrado pelas variantes M-HLE1 e 2.Finalmente, a variante de cadeia leve M-KV9 foi gerada por introdução da FR2 de um anticorpo de linhagem não germinativa (Número de Acesso ao GenBank AAA17574) ao constructo M-KV2. Essa FR receptora foi derivada a partir de células B periféricas humanas (Weber et ai. J Clin lnvest.93(5):2093^05. (1994)). Esse anticorpo é rearranjado e derivado a partir da família VK3. Essa cadeia leve foi expressa em conjunto, cada uma com M-HHB, ou com a cadeia pesada de M-HLG, e ensaiada para função de ligação. O resultado disso é mostrado na figura 5. M-KV9 com M-HLG mostra excelentes propriedades de ligação, combinadas com M-HHB, M-KV9 também mostra bons dados de ligação, embora levemente reduzidos comparados ao ch-225.28S. A figura 7 mostra que a remoção de resíduos raros dentro da CDR1 e da CDR2 da cadeia leve não é praticável, uma vez que todos os constructos M-KV10 a 12 mostraram atividade de ligação a antíge-no reduzida.

E. Análise de resíduos "raros"

Por definição, resíduos "raros" são aqueles que ocorrem com uma freqüência igual ou menor do que 1% no grupo correspondente de seqüências de linhagens germinativas.

Na seqüência VH de 225.28, foram encontrados dois resíduos "raros": glicina 88 e serina 94. Glicina 88 pode ser substituída pelo resíduo humano "freqüente" alanina. Serina 94 aparentemente pode ser substituída por treonina, mas, não por arginina ou alanina. Dados tabulados sobre resíduos canônicos preveriam que alanina e arginina, na posição 94 de Kabat, conduziriam à mesma conformação de laço canônico em CDR1, como quando serina está presente (http://www.rubic.rdg.ac.uk/abeng/canonicals. html). Essa vista leva em consideração somente a estrutura de laço canôni-ca, mas, não o envolvimento potencial em ligação a antígeno observada para vários resíduos canônicos; por exemplo, na posição 94 (ver a análise de canônicos).

F. Resultados dos experimentos de ADCC

A figura 6 mostra a eficácia do constructo M-HLG/M-KV9 humanizado do anticorpo 225.28S, na morte de células mediada por anticorpo, viacélulas PBMC humanas. Células alvo são células A2058 humanas, e pode-se ver um forte aumento na morte de células mediada por anticorpo. O mesmo efeito pode ser observado, quando se usa células musculares lisas humanas. Essas células são células primárias e não derivadas a partir de um tumor. Elas servem como um modelo para o atingimento de perfeitos, uma vez que aquelas células musculares lisas são um tipo de célula precursora para os perfeitos em neovasculatura. Uma diferença é notável entre esses experimentos. As células de melanoma mostraram um grau mais elevado de resistência em face de morte por PBMC do que as células musculares lisas. Para isso, a incubação dos alvos com o anticorpo e os efetores foi de 24 horas, enquanto que, para as células musculares lisas, aproximadamente a mesma mortalidade foi conseguida dentro de 4 horas. A morte de células mediada por anticorpo das células musculares lisas é mostrada na figura 11.

Para a linhagem de células de glioma LN229, pôde ser claramente mostrado (figura 12) que a glicoengenharia do anticorpo anti-MCSP humanizado poderia aumentar fortemente sua potência em citotoxicidade celular mediada por anticorpo (ADCC). O anticorpo não modificado dificilmente mostraria qualquer atividade, enquanto que a versão G2 do mesmo anticorpo deu origem a um nível significativo de morte de células alvo. Isso demonstra que a glicoengenharia pode intensificar a potência de anticorpos que mostre previamente atividade insatisfatória.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> GlycArt Biotechnology AG

<120> Moléculas de ligação a antígeno direcionadas a MCSP e tendo afinidade de ligação a receptor de Fc e função efetora aumentadas.

<130> 1975.042PC01

<150> 60/665,079 <151> 2005-03-25

<160> 110

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 366

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> VH225.28S

<400> 1

caggtgaagc tgcagcagtc aggagggggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60

tcctgtgttg tctctggatt cactttcagt aattactgga tgaactgggt ccgccagtct 120

ccagagaagg ggcttgagtg gattgcagaa attagattga aatccaataa ttttggaaga 180

tattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240

gcctacctgc aaatgatcaa cctaagagct gaagatactg gcatttatta ctgtaccagt 300

tatggtaact acgttgggca ctattttgac cactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360

tcgagt 366

<210> 2

<211> 122

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> VH225.28S

<400> 2

Gln Vai Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly

Ser Met Lys Leu Ser Cys Vai Vai Ser Gly Phe Thr Phe Ser Abii TyrTrp Met Asn Trp Vai Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Ala Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met lie Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly lie Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Tyr Gly Asn Tyr Vai Gly His Tyr Phe Asp His Trp 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 3

<211> 366

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HHA <400> 3

gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacatttagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggct 120

cctggaaagg gcctcgagtg ggtgggagag atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180

tattacgctg caagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 240

ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtaccaca 300

tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360

tccagt 366

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HHA <400> 4Glu Vai Glrt Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Gly Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Vai Gly His Tyr Phe Asp His Trp 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 5

<211> 366

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HHB

<400> 5

gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacattfcagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggct 120

cctggaaagg gcctcgagtg ggtgggagag atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180

tattacgctg agagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 24Ó

ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtacctcc 300

tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360

tccagt 366

<210> 6

<211> 122

<212> PRT

<213> seqüência artificial<220>

<223> M-HHB <400> 6

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Gly Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 ' 95

Tyr Cys Thr Ser Tyr Gly Asn Tyr Vai Gly His Tyr Phe Asp His Trp 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 7

<211> 366

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HHC

<400> 7

gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc

tcctgtgcag cctccggatt cacatttagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggct 120

cctggaaagg gcctcgagtg ggtggccaac atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180

tattacgctg agagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 240

ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtacctcc 300

tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360 tccagt 366

<210> 8<211> 122

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HHC <400> 8

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asrt Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Asn lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 35

Tyr Cys Thr Ser Tyr Gly Asn Tyr Vai Gly His Tyr Phe Asp His Trp 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 9 <211> 366 <212> DNA<213> seqüência artificial

<220> <223> M-HLA

<400> 9

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgctgag gtgaagaagc ctggcgcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggata cacattcacc aactattgga tgaactgggt gcgacaggct 120

cctggácaag ggctcgagtg gatgggcgag atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180

tattacgcac agaagtttca gggcagagtc acaatgacac gggacacgtc cacttccacc 240gtctacatgg agctgagcag cctgagatcc gaggatacgg ccgtctacta ctgcgcaaga 300 tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360 tccagt 366

<210> 10

<211> 122

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HHA <400> 10

Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Gln 50 55 60

Lys Phe Gln Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr 65 70 75 80

Vai Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Asn Tyr Vai Gly His Tyr Phe Asp His Trp 100 105 no

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 11

<211> 366

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HLB

<400> 11caggtgcagc tggtgcagtc tggcgctgag gtgaagaagc ctggcgcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggata cacattcacc aactattgga tgaactgggt gcgacaggct 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggcgag atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180

tattacgcac agaagtttca gggcagagtc acaatcacac gggacacgag catgtccacc 240

gcctacatgg agctgagcag cctgagatcc gaggatacgg ccgtctacta ctgcgcagcc 300

tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360

tccagt 366

<210> 12

<211> 122

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HLB

<400> 12

Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Giy Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Aen Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Gln 50 55 60

Lys Phe Gln Gly Arg Vai Thr lie Thr Arg Asp Thr Ser Met Ser Thr 65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Tyr Gly Asn Tyr Vai Gly His Tyr Phe Asp His Trp 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 13

<211> 366

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220><223> M-HCL

<400> 13

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgctgag gtgaagaagc ctggcgcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggata cacattcacc aactattgga tgaactgggt gogacaggct 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggcgag atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180

tactacgcag agtccgtgaa gggcagagtc acaatcacac gggacacgag catgtccacc 240

gcctacatgg agctgagcag cctgagatcc gaggatacgg ccgtctacta ctgcgcagcc 300

tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360

tccagt 366

<210> 14

<211> 122

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HLC <400> 14

Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Vai Thr lie Thr Arg Asp Thr Ser Met Ser Thr 65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Tyr Gly Asn Tyr Vai Gly His Tyr Phe Asp His Trp 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 15

<211> 366<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HLD

<400> 15

caggtgcagc tggtgcagtc tggogctgag gtgaagaagc ctggcgcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctccggatt cacattcagc aactattgga tgaactgggt gcgacaggct 120

cctggacaag ggctcgagtg gatgggcgag atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180

tactacgcag agtccgtgaa gggcagagtc acaatcacac gggacacgag catgtccacc 240

gcctacatgg agctgagcag cctgagatcc gaggatacgg ccgtctacta ctgcgcagcc 300

tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 3S0

tccagt 366

<210> 16

<211> 122

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HLD

<400> 16Gln Vai 1 Gln Leu Vai Gln Ser Gly 5 Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala 20 Ser Gly. Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Arg Gln Ala 35 40 Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 45

Gly Glu 50 lie Arg Leu Lys Ser Asn 55 Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Glu 60

Ser Vai 65 Lys Gly Arg Vai Thr lie 70 Thr Arg Asp Thr Ser Met Ser Thr 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu ser Ser Leu 85 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 90 95

Tyr Cys Ala Ala Tyr Gly Asn Tyr 100 Vai Gly His Tyr Phe Aap Ris Trp 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai 115 120 Ser Ser

<210> 17

<211> 366

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HLE1 <400> 17 gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacatttagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggca 12 0

ccaggaaagg gactcgagtg ggtgggcgaa atccggttga aatccaataa cttcggaaga 180

tactacgcac agaagttcca ggagagagtc acaatcacac gggacatgag cacctccacc 240

gcctacatgg agctgagcag cctgagatcc gaggatacgg ccgtctacta ctgcgcagcc 300

tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360

tccagt 366

<210> 18

<211> 122 <212> PRT

<213> seqüência artificial

<220><223> M-HLE1

<400> 18

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Trp Met Abu Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Gly Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Gln 50 55 60

Lys Phe Gln Glu Arg Vai Thr lie Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr 65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Tyr Gly Asn Tyr Vai Gly His Tyr Phe Asp His Trp 100 105 no

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 19

<211> 366

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HLE2

<400> 19

gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacatttagc aactattgga tgaactgggt gcggcaggca 120

ccaggaaagg gactcgagtg ggtgggcgaa atccggttga aatccaataa cttcggaaga 180

tactacgcag agtccgtgaa gggaagagtc acaatcacac gggacatgag cacctccacc 240

gcctacatgg agctgagcag cctgagatcc gaggatacgg ccgtctacta ctgcgcagcc 300

tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360

tccagt 366

<210> 20

<211> 122<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HLE2

<400> 20

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Gly Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Vai Thr lie Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr 65 70 75 80

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Tyr Gly Asn Tyr Vai Gly His Tyr Phe Asp His Trp 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 21

<211> 366

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HLF

<400>21 gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggct tggtccagc ctggcgggtc cctgcggctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacatttagc agctattgga tgagctgggt gcggcaggct 120

cctggaaagg gcctcgagtg gatggccgag atcagattga aatccaataa cttcggaaga 180

tattacgctg caagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 240

ctgtacctgc agatgaacag cctgaagaçc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtaccaca 300

tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggcc aagggaccac cgtcaccgtc 360

tccagt 366</column></row><row><column>tattacgctg caagcgtgaa gggccggttc accatcagca gagatgattc caagaacacg 24G.

ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggatacgg ccgtgtatta ctgtaccaca 300

tacggcaact acgttgggca ctacttcgac cactggggec aagggaccac cgtcaccgtc 360

tccagt 366

<210> 24

<211> 122

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-HLG <400> 24

Glu Vai Í31n Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Asn Tyr Vai Gly His Tyr Phe Asp His Trp 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 25

<211> 56

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de sinal M-VH

<400> 25

atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactc 56<210> 26

<211> 19

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de sinal M-VH

<400> 26

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Vai Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser

<210> 27

<211> 321

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> KV-225.28S

<400> 27

gatatcgagc tcacccaatc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaatgtag cgtggtatca acaaaaacca 120

gggcaatctc ctgaaccact gcttttctcg gcatcctaco gttacactgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atcctctgac gttcggtggc 300

ggcaccaage tggaaatcaa a 321

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> 225.28S VL

<400> 28

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Vai ser Vai Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Pro Leu Leu 35 40 45Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Vai Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105

<210> 29

<211> 330

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-KV1

<400> 29

gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60

atcacctgca gggccagtca gaatgtggat actaacttag cttggtacca gcagaagcca 12 0

gggaaagcac ctaagctcct gatctattcg gcatcctacc gttacactgg cgtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240 gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300

ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg 330

<210> 30

<211> 109

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220> <223> M-KV1

<400> 30

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln. Gln Tyr Asn Ser Tyx Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr 100 105

<210> 31

<211> 330

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> M-KV2 <400> 31

gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc

atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca

gggaaagcac ctgágctcct gatctattcg gcatcctacc gttacactgg cgtcccatca

aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga

ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg

<210> 32

<211> 109

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV2 <400> 32

Asp lie Glh Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn .20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr 100 105

<210> 33

<211> 330

<2Í2> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV3

<400> 33

gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 50

gtcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca 120

gggaaagcac ctgagcctct tctgttctcg gcatcctace gttacactgg cgtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240

gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300 ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg 330

<210> 34

<211> 109

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV3

<400> 34

Asp lie Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Vai Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Pro Leu Leu 35 40 45

Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln. Pro 65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lye Arg Thr 100 105

<210> 35

<211> 330

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV4

<400> 35

gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60

atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca 120

gggaaagcac ctgagcctct tctgttctcg gcatcctacc gttacactgg cgtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatccgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240

gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300

ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg 330

<210> 36 <211> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> M-KV4

<400> 36

Asp lie Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Pro Leu Leu 35 40 45

Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr 100 105

<210> 37

<211> 330

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV5

<400> 37

gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60

atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacct gcagaagccc 120

gggcagtctc ctcagctcct gatctattcg gcatcctacc gttacactgg cgtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240

gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300

ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg 330

<210> 38

<211> 109

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV5

<400> 38

Asp lie Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr 100 105

<210> 39

<211> 330

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV6 <400> 39

gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60

atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggttcca gcagaggccc 120

gggcagtctc cfccgacgact gatctattcg gcatcctacc gttacactgg cgtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240

gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300

ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg <210> 40

<211> 109

<212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> M-KV6

<400> 40

Asp lie Gln Leu Thr.Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn 20 25 30

Vai Ala Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr 100 105

<210> 41

<211> 330

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV7

<400> 41

gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60

atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca 120

gggaaagcac ctaagcctct gatctattcg gcatcctacc ggtacactgg cgtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240

gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300

ggtáccaagg tggagatcaa gcgtacggtg 330

<210> 42

<211> 109

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV7

<400> 42

Asp lie Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Tbx Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr 100 105

<210> 43

<211> 330

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV8 <400> 43 gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60

atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca 120

gggaaagcac ctaagcttct gatcttctcg gcatcctacc gttacactgg cgtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240

gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300

ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg 330

<210> 44 <211> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV8

<400> 44

Asp lie Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr 100 105

<210> 45

<211> 330

<2Í2> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV9

<400> 45

gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60

atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagccà 120

gggcaggcac ctaggcctct gatctattcg gcatcctacc ggtacactgg cgtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240

gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300

ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg 330

<210> 46

<211> 109

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV9

<400> 46

Asp lie Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leü Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr 100 105

<210> 47

<211> 327

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV10

<400> 47

gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60

atcacctgca gggccagtca gaatgtggat actaacttag cttggtacca gcagaagcca 120

gggcaggcac ctaggcctct gatctattcg gcatcctacc ggtacactgg cgtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240

gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300

ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacg 327

<210> 48

<211> 109

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV10

<400> 48

Asp lie Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr 100 105

<210> 49

<211> 327

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV11

<400> 49

gatatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60

atcacctgca gggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtatca gcagaagcca 120

gggcaggcac ctaggcctct gatctattcg gcatcctacc ggtacactgg cgtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag cctgcaacct 240

gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300

ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacg 327

<210> 50

<211> 109

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV11

<400> 50

Asp lie Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe SerGly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr 100 105

<210> 51

<211> 327

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV12

<400> 51

gahatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgggtcacc 60

atcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaacgtgg cttggtacca gcagaagcca 120

gggcaggcac ctaggcctct gatctattcg gcatcctacc tgcagagcgg cgtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc cgggacagag ttcactctca caatctcaag çctgcaacct 240

gaagatttcg caacttacta ctgtcaacag tacaatagtt accctctgac gttcggcgga 300

ggtaccaagg tggagatcaa gcgtacg 327

<210> 52

<211> 109

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> M-KV12 <400> 52

Asp lie Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80Glu Asp Pbe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr 100 105

<210> 53

<211> 60

<2Í2> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de sinal M-VL <400> 53

atgagggtcc ccgctcagct cctgggcctc ctgctgctct ggttcccagg tgccaggtgt 60

<210> 54

<211> 20

<212> PRT ,

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de sinal M-VL

<400> 54

Met Arg Vai Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Phe Pro 15 10 15

Gly Ala Arg Cys

<210> 55

<211> 318

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Constant-Light

<400> 55

gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 60

gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 120

gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 180

gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 240

aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 300

aacaggggag agtgttag 318

<210> 56<400> 56 000

<210> 57

<400> 57 000

<210> 58

<400> 58 000

<210> 59

<400> 59 000

<210> 60

<400> 60

000

<210> 61

<211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> cadeia pesada CDR1 MCSP Kabat

<400> 61 aattactgga tgaac

<210> 62

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP Kabat

<400> 62

Asn Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 63

<211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP Kabat<400> 63 agctattgga tgagc

<210> 64

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP Kabat

<400> 64 Ser Tyx Trp Met Ser 1 5

<210> 65

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP Chothia

<400> 65 ggattcactt tcagtaat

<210> 66

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP Chothia

<400> 66 Gly Phe Thr Phe Ser Asn 1 5

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP Chothia

<400> 67 ggatacacat tcaccaac

<210> 68

<211> 6

<212> PRT<213> Seqüência artificial <220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP Chothia

<400> 68

Gly Tyx Thr Ptae Thr Asn 1 5

<210> 69

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP Chothia

<400> 69

ggattcacat ttagcagc

<210> 70

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP Chothia

<400> 70 Gly Phe Thr Phe Ser Ser 1 5

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP AbM

<400> 71

ggattcactt tcagtaatta ctggatgaac

<210> 72

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP AbM

<400> 72Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn 15 10

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP AbM <400> 73

ggatacacat tcaccaacta ttggatgaac

<210> 74

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP AbM <400> 74

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met Asn 15 10

<210> 75

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP AbM <400> 75

ggattcacat ttagcagcta ttggatgagc

<210> 76

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR1 MCSP AbM

<400> 76

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser 15 10

<210> 77

<211> 57<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Kabat

<400> 77

gaaattagat tgaaatccaa taattttgga agatattatg cggagtctgt gaaaggg

<210> 78

<211> 19

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Kabat

<400> 78

Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Glu Ser 15 10 15

<210> 79

<211> 57

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Kabat

<400> 79

gagatcagat tgaaatccaa taacttcgga agatattacg ctgcaagcgt gaagggc

<210> 80

<211> 19

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Kabat

<400> 80

Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Ala Ser 15 10 15

Vai Lys Gly

<210> 81

<211> 57

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Kabat

<400> 81

aacatcagat tgaaatccaa taacttcgga agatattãcg ctgagagcgt gaagggc

<210> 82

<211> 19

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Kabat

<400> 82

Asn lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Glu Ser X 5 10 15

Vai Lys Gly

<210> 83

<211> 57

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Kabat

<400> 83

gagatcagat tgaaatccaa taacttcgga agatattãcg cacagaagtt tcagggc

<210> 84

<211> 19

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Kabat <400> 84

Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Gln Lys 1 5 10 15

<210> 85

<211> 57

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Kabat

<400> 85gaaatccggt tgaaatccaa taacttcgga agatactacg cacagaagtt ccaggag

<210> 86

<211> 19

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Kabat

<400> 86

Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Gln Lys

1 5 10 15

Phe Gln Glu

<210> 87

<211> 57

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Kabat

<400> 87

gagatcagat tgaaatccaa taacttcgga agatattacg ctgcaagcgt gaagggc

<210> 88

<211> 19

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Kabat

<400> 88

Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Ala Ser

1 5 10 15

Vai Lys Gly

<210> 89

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Chothia

<400>

89agattgaaat ccaataattt tggaagatat

<210> 90

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP Chothia

<400> 90

Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr

1 5 10

<210> 91

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP AbM

<400> 91

gaaattagat tgaaatccaa taattttgga agatat

<210> 92

<211> 12

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP AbM

<400> 92

Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr

1 5 10

<210> 93

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP AbM

<400> 93

aacatcagat tgaaatccaa taaçttcgga agatat

<210> 94

<211> 12

<212> PRT<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR2 MCSP AbM

<400> 94

Asn lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr

15 10

<210> 95

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR3 MCSP Kabat, Chothia, AbM

<400> 95

tatggtaact acgttgggca ctattttgac cac

<210> 96

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada CDR3 MCSP Kabat, Chothia, AbM

<400> 96

Tyr Gly Asn Tyr Vai Gly His Tyr Phe Abp His

1 5 10

<210> 97

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia leve Kabat CDR1 (MCSP)

<400> 97

aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcg

<210> 98

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia leve Kabat CDR1 (MCSP)

<400> 98Lys Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn Vai Ala

1 5 10

<210> 99

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia leve Kabat CDR1 (MCSP)

<400> 99

agggccagtc agaatgtgga tactaactta gct

<210> 100

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia leve Kabat CDR1 (MCSP)

<400> 100

Arg Ala Ser 31n Asn Vai Asp Thr Asn Leu Ala

15 10

<210> 101

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia leve Kabat CDR1 (MCSP)

<400> 101

agggccagtc agaatgtgga tactaacgtg gct

<210> 102

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia leve Kabat CDR1 (MCSP)

<400> 102

Arg Ala Ser Gln Asn Vai Asp Thr Asn Vai Ala

1 5 10

<210> 103 <211> 21<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia leve Kabat CDR2(MCSP)

<400> 103 tcggcatcct accgttacac t

<210> 104

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia leve Kabat CDR2(MCSP)

<400> 104

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 105

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia leve Kabat CDR2(MCSP)

<400> 105

tcggcatcct acctgcagag c

<210> 106

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia leve Kabat CDR2(MCSP)

<400> 106

Ser Ala Ser Tyr Leu Gln Ser

1 5

<210> 107

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia leve Kabat CDR3 (MCSP)<400> 107

cagcaatata acagctatcc tctgacg

<210> 108

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia leve Kabat CDR3 (MCSP)

<400> 108

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 109

<211> 328

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> lgG1

<400> 109

Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 15 10 15

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro 20 25 30

Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai 35 40 45

His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 50 55 ' 60

Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie 65 70 75 80

Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Ala 85 90 95

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 100 105 110

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 115 120 125

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai 130 135 140Vai Asp Vai Ser His Glu Asp pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai 145 150 155 160

Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 165 170 175

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gln 180 185 190

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala 195 200 205

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 210 215 220

Arg Glu Pro Gln Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 225 230 235 240

Lys Asn Gln Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phè Tyr Pro Ser 245 250 255

Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 260 265 270

Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 275 280 285

Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Vai Phe 290 295 300

Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 305 • 310 315 320

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325

<210> 110

<211> 987

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> lgG1

<400>

110accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 60

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 120

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 180

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 240

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagcaga gcccaaatct 300

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 360

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 420

acatgcgtgg tagtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 480

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 540

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 600

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 660

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 720

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 780

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 840

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 900

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 960

agcctctccc tgtctccggg taaatga 987

Claims (193)

1. Polinucleotídeo isolado compreendendo:a. uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 71; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 75 eb. uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 79; SEQ ID NO: 81; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 89;SEQIDNO:91;eSEQIDNO:93ec. SEQ ID NO: 95.

2. Polinucleotídeo isolado compreendendo:a. uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 97; SEQ ID NO: 99 e SEQ ID NO: 101; b. SEQ ID NO: 103 ou SEQ ID NO: 105 ec. SEQ ID NO: 107.

3. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, que codifica um polipetídeo de fusão.

4. Polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 23.

5. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 4, em que o polinucleotídeo isolado compreende SEQ ID NO: 23.

6. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 4, em que o polinucleotídeo isolado compreende SEQ ID NO: 5.

7. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 4, em que o polinucleotídeo isolado compreende SEQ ID NO: 3.

8. Polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49;SEQ ID NO: 51.

9. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 8, em que o dito polinucleotídeo isolado compreende SEQ ID NO: 45.

10. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 4 ou 8, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

11. Polinucleotídeo isolado compreendendo:a) uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 24 eb) uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52.

12. Polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21 e SEQ ID No:23, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

13. Polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 51, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

14. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 12, compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 85% de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21 e SEQ ID No:23, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

15. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 13, compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 85% de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 51, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

16. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 14, compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 23, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

17. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 15, compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 51, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

18. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 16, compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 95% de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQID No:11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID No:15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO :21 e SEQ ID NO: 23, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

19. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 17, compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 95% de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 51, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

20. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 18, compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 99% de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21 e SEQ ID No:23, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

21. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 19, compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 99% de identidade com relação a uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 51, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

22. Polinucleotídeo isolado compreendendo:a) uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24 eb) uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo a se-qüência de uma região de Fc de anticorpo, ou um fragmento do mesmo, a partir de uma espécie diferente de uma espécie de murino.

23. Polinucleotídeo isolado compreendendo: a) uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO:52eb) uma seqüência que codifica um polipeptídeo tendo a seqüência de um domínio constante de cadeia leve de anticorpo, ou um fragmento do mesmo, a partir de uma espécie diferente de uma espécie de camundongo.

24. Polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 e SEQ IDNO.-24.

25. Polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 52.

26. Vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

27. Vetor, de acordo com a reivindicação 26, em que o dito vetor codifica pelo menos a cadeia leve ou pesada de um anticorpo.

28. Vetor, de acordo com a reivindicação 27, em que o dito vetor codifica pelo menos ambas as cadeias leve e pesada de um anticorpo.

29. Vetor, de acordo com a reivindicação 28, o qual é um vetor policistrônico.

30. Célula de hospedeiro compreendendo o vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 26 a 28.

31. Célula de hospedeiro compreendendo um polinucleotídeo isolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

32. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 4 ou 8, compreendendo adicionalmente uma seqüência que codifica uma região constante de cadeia leve ou pesada de anticorpo humano.

33. Célula de hospedeiro capaz de expressar um primeiro polinucleotídeo, como definido na reivindicação 12, e um segundo polinucleotídeo compreendendo uma seqüência que codifica a região variável de uma cadeia leve de anticorpo.

34. Célula de hospedeiro capaz de expressar um primeiro polinucleotídeo, como definido na reivindicação 13, e um segundo polinucleotídeo compreendendo uma seqüência que codifica a região variável de uma cadeia pesada de anticorpo.

35. Polipeptídeo de fusão compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 e SEQ ID No:24, ou uma variante da mesma.

36. Polipeptídeo de fusão compreendendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 52, ou uma variante da mesma.

37. Molécula de ligação a antígeno compreendendo o polipeptídeo de fusão como definido na reivindicação 35 ou reivindicação 36.

38. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 37, em que a dita molécula de ligação a antígeno se liga de maneira seletiva a MCSP humano.

39. Molécula de ligação a antígeno compreendendo o polipeptídeo de fusão, como definido na reivindicação 35, e o polipeptídeo de fusão,como definido na reivindicação 36.

40. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, em que a dita molécula de ligação a antígeno é um anticorpo.

41. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 40, em que o dito anticorpo está humanizado.

42. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 40, em que o anticorpo está primatizado.

43. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 37, em que a molécula de ligação a antígeno é um fragmento de anticorpo compreendendo uma região equivalente à região de Fc de um anticorpo.

44. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 37, em que a dita molécula de ligação a antígeno é um fragmento de scFv, de um diacorpo, de triacorpo, de Fab ou de Fab2.

45. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 40, em que a dita molécula de ligação a antígeno é um anticorpo recombinante.

46. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 45, em que o dito anticorpo recombinante está humanizado.

47. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 40, em que o dito anticorpo recombinante compreende uma região de Fc humana.

48. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 47, em que a região de Fc humana é uma região de Fc de IgG humana.

49. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 48, em que a dita molécula de ligação a antígeno tenha sido glicoengenheirada para ter uma região de Fc com oligossaca-rídeos modificados.

50. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 49, em que a dita região de Fc tenha sido modificada para ter um número reduzido de resíduos de fucose quando comparada à molécula de ligaçãoa antígeno não glicoengenheirada.

51. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 49, em que a dita região de Fc tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos bisseccionados quando comparada à molécula de ligação a antígeno não glicoengenheirada.

52. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 51, em que os ditos oligossacarídeos bisseccionados são predominantemente complexos bisseccionados.

53. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 49, em que as ditas moléculas de ligação a antígeno glicoengenheiradas têm uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, na região de Fc da dita molécula de ligação a antígeno, quando comparadas à molécula de ligação a antígeno não glicoengenheirada.

54. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 49, em que o dito anticorpo glicoengenheirado tem uma razão aumentada de resíduos de GlcNAc para resíduos de fucose na região de Fc, comparado à molécula de ligação a antígeno não glicoengenheirada.

55. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 53, em que os ditos oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, estão predominantemente na forma híbrida.

56. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 53, em que os ditos oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, estão predominantemente na forma complexa.

57. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 49, em que pelo menos 20% dos oligossacarídeos na região de Fc estão não fucosilados, bisseccionados.

58. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 57, em que pelo menos 30% dos oligossacarídeos na região de Fc estão não fucosilados, bisseccionados.

59. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 58, em que pelo menos 35% dos oligossacarídeos na região de Fc estão não fucosilados, bisseccionados.

60. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 59, em que pelo menos 40% dos oligossacarídeos na região de Fc do polipeptídeo estão não fucosilados, bisseccionados.

61. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 60, em que pelo menos 50% dos oligossacarídeos na região de Fc estão bisseccionados.

62. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 61, em que pelo menos 60% dos oligossacarídeos na região de Fc estão bisseccionados.

63. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 62, em que pelo menos 70% dos oligossacarídeos na região de Fc estão bisseccionados.

64. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 63, em que pelo menos 80% dos oligossacarídeos na região de Fc estão bisseccionados.

65. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 64, em que pelo menos 90% dos oligossacarídeos na região de Fc estão bisseccionados.

66. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindica-20 ção 49, em que pelo menos 50% dos oligossacarídeos na região de Fc estão não fucosilados.

67. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 66, em que pelo menos 60% dos oligossacarídeos na região de Fc estão não fucosilados.

68. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 67, em que pelo menos 70% dos oligossacarídeos na região de Fc estão não fucosilados.

69. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 68, em que pelo menos 75% dos oligossacarídeos na região de Fc estão não fucosilados.

70. Método de produção de uma molécula de ligação a antígeno capaz de competir com anticorpo monoclonal 225.28S murino para ligação aMCSP humano, o dito método compreendendo:a) cultivo da célula de hospedeiro, como definida na reivindicação 30 ou 31, sob condições que permitam expressão do polinucleotídeo que codifique a dita molécula de ligação a antígeno; eb) recuperação da dita molécula de ligação a antígeno.

71. Método, de acordo com a reivindicação 70, em que a dita molécula de ligação a antígeno é um anticorpo.

72. Método, de acordo com a reivindicação 71, em que a dita molécula de ligação a antígeno é um anticorpo humanizado.

73. Composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 37 a 69, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

74. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 73, em que a dita composição compreende adicionalmente um adjuvante.

75. Método para identificação de células que expressem MCSP em uma amostra ou um sujeito compreende a administrar, à amostra ou ao sujeito, uma molécula de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 37 a 69.

76. Método, de acordo com a reivindicação 75, em que a dita identificação é para finalidades diagnosticas.

77. Método, de acordo com a reivindicação 75, em que a dita identificação é para finalidades terapêuticas.

78. Método de tratamento de um distúrbio de proliferação celular mediado por MCSP, em um sujeito que necessite do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição terapêutica, como definida na reivindicação 73 ou 74, ao sujeito.

79. Método, de acordo com a reivindicação 78, em que o dito sujeito é ser humano.

80. Método, de acordo com a reivindicação 78, em que o dito tratamento compreende o bloqueio de interações mediadas por MCSP, selecionadas a partir do grupo consistindo em: ligação a ligante de MCSP, ade-são a células de melanoma, ativação de perfeitos, respostas quimiotáticas à fibronectina, disseminação celular em proteínas de ECM, transdução de sinal de FAK e transdução de sinal de ERK.

81. Célula glicoengenheirada para expressar pelo menos um ácido nucléico que codifica um primeiro polipeptídeo tendo atividade de P(1,4)-N-acetilglicossaminiltransferase III, em uma quantidade suficiente para modificar os oligossacarídeos na região de Fc de um polipeptídeo produzido pela célula de hospedeiro, em que o dito segundo polipeptídeo é uma molécula de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 37 a 69.

82. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 81, em que a dita célula de hospedeiro expressa adicionalmente um polipeptídeo tendo atividade de manosidase II.

83. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 81, em que o dito primeiro polipeptídeo compreende adicionalmente o domínio de localização de um polipeptídeo residente em Golgi.

84. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 81, em que a dita molécula de ligação a antígeno é um anticorpo recombinante.

85. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 81, em que a dita molécula de ligação a antígeno é um fragmento de anticorpo.

86. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 81, em que a dita molécula de ligação a antígeno compreende a região de Fc de uma IgG humana ou uma região equivalente à região de Fc de uma IgG humana.

87. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 81, em que a dita molécula de ligação a antígeno, produzida pela dita célula de hospedeiro, exibe afinidade de ligação a receptor de Fc aumentada comparada à molécula de ligação a antígeno produzida pela célula de hospedeiro não glicoengenheirada.

88. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 81, em que a molécula de ligação a antígeno, produzida pela célula de hospedeiro, exibe função de efetor aumentada comparada à molécula de ligação a antí-geno produzida pela célula de hospedeiro não glicoengenheirada.

89. Uma célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 83, em que o dito primeiro polipeptídeo compreende o domínio catalítico de P(1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III.

90. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 83, em que o dito primeiro polipeptídeo compreende adicionalmente o domínio de localização em Golgi de um polipeptídeo residente em Golgi.

91. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 90, em que o dito domínio de localização em Golgi é o domínio de localização de manosidase II.

92. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 90, em que o dito domínio de localização em Golgi é o domínio de localização de p(1,2)-N-acetilglicossaminiltransferase I.

93. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 90, em que o dito domínio de localização em Golgi é o domínio de localização de p(1,2)-N-acetilglicossaminiltransferase II.

94. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 90, em que o dito domínio de localização em Golgi é o domínio de localização de manosidase I.

95. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 90, em que o dito domínio de localização em Golgi é o domínio de localização de a1-6 núcleo fucosiltransferase.

96. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 88, em que a função de efetor aumentada é citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada.

97. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 88, em que a dita função de efetor aumentada é ligação aumentada a células de NK.

98. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 88, em que a dita função de efetor aumentada é ligação aumentada a macrófagos.

99. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 88, em que a dita função de efetor aumentada é ligação aumentada a células poli-morfonucleares.

100. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 88, em que a dita função de efetor aumentada é ligação aumentada a monóci-tos.

101. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 88, em que a dita função de efetor aumentada é apoptose indutora de sinalização direta aumentada.

102. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 88, em que a dita função de efetor aumentada é maturação de células dendríticas aumentada.

103. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 88, em que a dita função de efetor aumentada é iniciação de células T aumentada.

104. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 87, em que o dito receptor de Fc é um receptor de ativação de Fcy.

105. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 87, em que o dito receptor de Fc é receptor de FcyRIIIA.

106. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 81, em que a dita célula de hospedeiro é uma célula HEK293-EBNA, uma célula de CHO, uma célula de BHK, uma célula de NSO, uma célula de SP2/0, uma célula de mieloma de YO, uma célula de mieloma de camundongo de P3X63, uma célula de PER, uma célula de PER.C6 ou uma célula de hibri-doma.

107. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 81, em que a dita pelo menos um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de (3(1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III, está operativa-mente ligado a um elemento de promotor constitutivo.

108. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 81, em que o dito polipeptídeo tendo atividade de (3(1,4)-N-acetilglicossami-niltransferase III é um polipeptídeo de fusão.

109. Método, de acordo com a reivindicação 78, em que o distúrbio é selecionado a partir do grupo consistindo em: melanoma, glioma,câncer de seio lobular, leucemia aguda ou um tumor sólido que induza neo-vascularização de vasos sangüíneos.

110. Polinucleotídeo isolado compreendendo pelo menos uma região determinante de complementariedade do anticorpo monoclonal 225.28S murino, ou uma variante do mesmo ou forma truncada, contendo pelo menos os resíduos determinantes de especificidade para a dita região determinante de complementariedade, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

111. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 110, compreendendo pelo menos duas regiões determinantes de complementariedade do anticorpo monoclonal 225.28S murino, ou uma variante do mesmo ou forma truncada, contendo pelo menos os resíduos determinantes de especificidade para a região determinante de complementariedade.

112. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 110, compreendendo pelo menos três regiões determinantes de complementariedade do anticorpo monoclonal 225.28S murino, ou uma variante ou forma truncada do mesmo, contendo pelo menos os resíduos determinantes de especificidade para a região determinante de complementariedade.

113. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 110, em que a região determinante de complementariedade é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 71; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 79; SEQ ID NO: 81; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 93 e SEQ ID NO: 95.

114. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 110, em que a dita região determinante de complementariedade é selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101; SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 107.

115. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 110, em que o dito polipeptídeo de fusão codifica uma molécula de ligação a antígeno.

116. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 111, em que as ditoas regiões determinantes de complementariedade compreendem pelo menos uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 71; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 79; SEQ ID NO: 81; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 93 e SEQ ID NO: 95; e pelo menos uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101; SEQ ID NO: 103; 10 SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 107, ou suas variantes ou formas truncadas do mesmo das seqüências que contenham pelo menos os resíduos determinantes de especificidade para cada uma das regiões determinantes de complementariedade.

117. Polipeptídeo isolado codificado pelos polinucleotídeos isolados como definidos em qualquer uma das reivindicações 110 a 116.

118. Molécula de ligação a antígeno compreendendo um polipeptídeo de acordo com a reivindicação 117.

119. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 118, em que a dita molécula de ligação a antígeno compreende a região variável de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo.

120. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 118, em que a dita molécula de ligação a antígeno é um anticorpo quimérico ou humanizado.

121. Método para produção de uma molécula de ligação a antígeno tendo oligossacarídeos modificados em uma célula de hospedeiro, o dito método compreendendo:a. cultivo de uma célula de hospedeiro glicoengenheirada para expressar pelo menos um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de P(1,4)-N-acetilglicossaminiltransferase III sob condições que permitam a produção da molécula de ligação a antígeno, e que permitam a modificação dos oligossacarídeos presentes na região de Fc da molécula de ligação a antígeno; eb. isolamento da molécula de ligação a antígeno, emque a dita molécula de ligação a antígeno é capaz de competir com o anticorpo monoclonal 225.28S murino pela ligação a MCSP, e em que a dita molécula de ligação a antígeno ou fragmento do mesmo é quimérica ou humanizada.

122. Método, de acordo com a reivindicação 121, em que os ditos oligossacarídeos modificados têm uma proporção reduzida de resíduos de fucose, quando comparados aos oligossacarídeos da molécula de ligação a antígeno não glicoengenheirada.

123. Método, de acordo com a reivindicação 121, em que os ditos oligossacarídeos modificados estão predominantemente na forma híbrida.

124. Método, de acordo com a reivindicação 121, em que os ditos oligossacarídeos modificados estão predominantemente na forma complexa.

125. Método, de acordo com a reivindicação 121, em que o dito anticorpo recombinante ou fragmento do mesmo, produzido pela célula de hospedeiro, tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosi-lados, bisseccionados, na região de Fc do dito polipeptídeo, quando comparado à molécula de ligação a antígeno produzida pela célula não glicoengenheirada.

126. Método, de acordo com a reivindicação 125, em que os ditos oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, estão predominantemente na forma híbrida.

127. Método, de acordo com a reivindicação 125, em que os ditos oligossacarídeos não fucosilados, bisseccionados, estão predominantemente na forma complexa.

128. Método, de acordo com a reivindicação 125, em que pelo menos 20% dos oligossacarídeos na região de Fc do polipeptídeo estão não fucosilados, bisseccionados.

129. Método, de acordo com a reivindicação 128, em que pelo menos 30% dos oligossacarídeos na região de Fc do dito polipeptídeo estãonão fucosilados, bisseccionados.

130. Método, de acordo com a reivindicação 129, em que pelo menos 35% dos oligossacarídeos na região de Fc do dito polipeptídeo estão não fucosilados, bisseccionados.

131. Uma molécula de ligação a antígeno glicoéngenheirada para ter função de efetor aumentada, produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 121 a 130.

132. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 131, em que a dita molécula de ligação a antígeno é um anticorpo.

133. Molécula de ligação a antígeno glicoéngenheirada para terafinidade de ligação a receptor de Fc aumentada, produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 121 a 130.

134. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 133, em que a dita molécula de ligação a antígeno é um anticorpo.

135. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 131, em que a dita função de efetor aumentada é citotoxicidade celular mediada por Fc.

136. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 131, em que a dita função de efetor aumentada é ligação aumentada a células de NK.

137. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 131, em que a dita função de efetor aumentada é ligação aumentada a macrófagos.

138. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 131, em que a dita função de efetor aumentada é ligação aumentada a monócitos.

139. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 131, em que a dita função de efetor aumentada é ligação aumentada a células polimorfonucleares.

140. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 131, em que a dita função de efetor aumentada é apoptose indutora de sinalização direta.

141. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 131, em que a dita função de efetor aumentada é maturação de células dendríticas aumentada.

142. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 131, em que a dita função de efetor aumentada é iniciação de células T aumentada.

143. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 133, em que o dito receptor de Fc é receptor de ativação de Fc.

144. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 133, em que o dito receptor de Fc é receptor de FcYRIIIa.

145. Molécula de ligação a antígeno, produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 121 -130, em que a molécula de ligação a antígeno é um fragmento de anticorpo contendo a região de Fc e engenheirada para ter função de efetor aumentada.

146. Molécula de ligação a antígeno, produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 121 a 130, em que a molécula de ligação a antígeno é uma proteína de fusão que inclui um poli-peptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO :10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24, e uma região equivalente à região de Fc de uma imunoglobulina e engenheirada para ter função de efetor aumentada.

147. Molécula de ligação a antígeno, produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 121 -130, em que a dita molécula de ligação a antígeno é uma proteína de fusão que inclui um poli-peptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 52, e uma região equivalente à região de Fc de uma imunoglobulina e engenheirada para ter função de efetor aumentada.

148. Composição farmacêutica compreendendo a molécula de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 131 a 147, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

149. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 4 ou 8, em que o dito polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo de fusão.

150. Método, de acordo com a reivindicação 78, em que o dito tratamento compreende a morte de células que expressem MCSP.

151. Método, de acordo com a reivindicação 150, em que as ditas células sobreexpressam MCSP.

152. Método, de acordo com a reivindicação 125, em que pelo menos 40% dos oligossacarídeos na região de Fc do dito polipeptídeo, estão não fucosilados, bisseccionados.

153. Método, de acordo com a reivindicação 152, em que pelo menos 50% dos oligossacarídeos na região de Fc do dito polipeptídeo, estão não fucosilados, bisseccionados.

154. Método, de acordo com a reivindicação 153, em que pelo menos 60% dos oligossacarídeos na região de Fc do dito polipeptídeo, estão não fucosilados, bisseccionados.

155. Método, de acordo com a reivindicação 154, em que pelo menos 70% dos oligossacarídeos na região de Fc do dito polipeptídeo, estão não fucosilados, bisseccionados.

156. Método, de acordo com a reivindicação 125, em que pelo menos 80% dos oligossacarídeos na região de Fc do dito polipeptídeo, estão não fucosilados, bisseccionados.

157. Método, de acordo com a reivindicação 125, em que pelo menos 90% dos oligossacarídeos na região de Fc do dito polipeptídeo, estão não fucosilados, bisseccionados.

158. Método de indução de lise de perícitos ativados em neo-vasculatura de tumor em um sujeito que necessite do mesmo, compreendendo a administração ao dito sujeito da molécula de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 49 a 69.

159. Método, de acordo com a reivindicação 158, em que a ditaneovasculatura não é neovasculatura de melanoma ou neovasculatura de glioblastoma.

160. Método, de acordo com a reivindicação 158, em que a molécula de ligação a dita antígeno é administrada conjuntamente com outro agente antiangiogênico.

161. Método, de acordo com a reivindicação 160, em que o dito agente antiangiogênico é um anticorpo anti-VEGF-1.

162. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 69, 118 a 120 ou 131 a 147, para uso como um medicamento no tratamento de um distúrbio de proliferação celular mediado por MCSP.

163. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 162, em que o dito distúrbio de proliferação celular mediado por MCSP é selecionado a partir do grupo consistindo em melanoma, glioma, câncer de seio lobular, leucemia aguda, ou uma neovascularização indutora de tumor sólido de vasos sangüíneos.

164. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a qualquer uma das reivindicações 37 a 69, 118 a 120 ou 131 a 147, para uso como um medicamento na lise de perfeitos ativados em neovasculatura de tumor.

165. Molécula de ligação a antígeno, de acordo com a qualquer uma das reivindicações 37 a 69, 118 a 120 ou 131 a 147, para uso como um medicamento, em particular para uso em câncer.

166. Uso da molécula de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 37 a 69, 118 a 120 ou 131 a 147, para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou a profilaxia de câncer.

167. Uso, de acordo com a reivindicação 166, em que a molécula de ligação a dita antígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de desde cerca de 1,0 mg/Kg a cerca de 15 mg/Kg.

168. Uso, de acordo com a reivindicação 167, em que a dita quantidade terapeuticamente eficaz é de desde cerca de 1,5 mg/Kg a cerca de 12 mg/Kg.

169. Uso, de acordo com a reivindicação 167, em que a ditaquantidade terapeuticamente eficaz é de desde cerca de 1,5 mg/Kg a cerca de 4,5 mg/Kg.

170. Uso, de acordo com a reivindicação 167, em que a dita quantidade terapeuticamente eficaz é de desde cerca de 4,5 mg/Kg a cerca de 12 mg/Kg.

171. Uso, de acordo com a reivindicação 167, em que a quantidade terapeuticamente eficaz é de cerca de 1,5 mg/Kg.

172. Uso, de acordo com a reivindicação 167, em que a quantidade terapeuticamente eficaz é de cerca de 4,5 mg/Kg.

173. Uso, de acordo com a reivindicação 167, em que a quantidade terapeuticamente eficaz é de cerca de 12 mg/Kg.

174. Compostos, métodos, composições farmacêuticas, métodos e usos conforme aqui descritos.

175. Célula de hospedeiro glicoengenheirada para expressar pelo menos uma molécula de ácido nucléico que codifica um primeiro polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em: um polipeptídeo tendo atividade de p(1,4)-N-acetilglicossaminiltransferase III; um polipeptídeo tendo atividade de a-manosidase II e um polipeptídeo tendo atividade de p-(1,4)-galactosiltransferase, em uma quantidade suficiente para modificar os oligossacarídeos na região de Fc de um segundo polipeptídeo produzido pela dita célula de hospedeiro, sendo que o dito polipeptídeo é uma molécula de ligação a antígeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 37 a 69.

176. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 175, em que o dito primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo tendo atividade de P(1,4)-N-acetilglicossaminiltransferase III.

177. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 175, em que o dito primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo tendo atividade de a-manosidase II.

178. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 175, em que o dito primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo tendo atividade de p-(1,4)-galactosiltransferase.

179. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 176, em que a dita célula de hospedeiro expressa adicionalmente uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de a-manosidase II.

180. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 179, em que a dita célula de hospedeiro expressa adicionalmente uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de p-(1,4)-galactosiltransferase.

181. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 175 ou 176, em que o dito primeiro polipeptídeo é um polipeptídeo de fusão compreendendo o domínio de localização de um polipeptídeo residente em Golgi heterólogo.

182. Célula de hospedeiro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 175 a 181, em que a dita molécula de ligação a antígeno, produzida pela dita célula de hospedeiro, exibe função de efetor aumentada comparada à molécula de ligação a antígeno produzida pela célula de hospedeiro não glicoengenheirada.

183. Célula de hospedeiro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 175 a 181, em que a dita molécula de ligação a antígeno, produzida pela dita célula de hospedeiro, exibe afinidade de ligação a receptor de Fc aumentada comparada à molécula de ligação a antígeno produzida pela célula de hospedeiro não glicoengenheirada.

184. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 182, em que a dita função de efetor aumentada é citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada.

185. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 182, em que a dita função de efetor aumentada é ligação aumentada a células de NK.

186. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 182, em que a dita função de efetor aumentada é ligação aumentada a macrófagos.

187. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 182,em que a dita função de efetor aumentada é ligação aumentada a células polimorfonucleares.

188. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 182, em que a dita função de efetor aumentada é ligação aumentada a monócitos.

189. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 182, em que a dita função de efetor aumentada é apoptose indutora de sinalização direta aumentada.

190. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 182, em que a dita função de efetor aumentada é maturação de células dendríticas aumentada.

191. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 182, em que a dita função de efetor aumentada é iniciação de células T aumentada.

192. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 183, em que o dito receptor de Fc é um receptor de ativação de Fcy.

193. Célula de hospedeiro, de acordo com a reivindicação 183, em que o dito receptor de Fc é um receptor de FcyRIIIA.