CN107530402B - 抗lilrb抗体及其在检测和治疗癌症中的用途 - Google Patents

Abstract

本公开涉及结合LILRB的抗体以及用其检测和治疗癌症的方法。

Description

抗LILRB抗体及其在检测和治疗癌症中的用途

本申请要求2015年3月6日提交的美国临时申请序列号62/129,572的优先权的权益，所述临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。

背景

公开领域

本公开一般涉及医学、肿瘤学和免疫学的领域。更具体地，本公开涉及LILRB的抗体以及可以治疗癌症(包括白血病)的抗体。

背景

急性髓性白血病(AML)是成人最常见的急性白血病。即使连续治疗，大多数患者仍会在5年内复发。为了有效治疗急性白血病，必须确定新的分子靶标和治疗方法。近来，发明人克隆了人白细胞免疫球蛋白样受体B2(LILRB2)作为几种血管生成素样蛋白(Angptl)的受体(Zheng等人，2012)。LILRB家族受体是含有结合配体的胞外Ig样结构域和细胞内基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的I型跨膜糖蛋白，并且被分类为抑制性受体，因为ITIM基序可以募集磷酸酶SHP-1、SHP-2或SHIP来负调节免疫细胞活化(Takai等人，2011；Daeron等人，2008；Katz等人，2006)。已知LILRB在骨髓细胞和某些其他造血细胞上表达(Mori等人，2008)。令人惊奇的是，发明人已经表明，LILRB2的小鼠直向同源物PirB以及密切相关的ITIM受体LAIR1由AML干细胞(AML-SC)表达并支持AML发育(Zheng等人，2012；Kang等人，出版中)。虽然违反直觉，但是这一结果与抑制性受体在免疫系统中一般的免疫抑制和因此的肿瘤促进作用一致(Ma等人，2011)。

在最近的研究中，发明人发现LILRB家族的几个成员在AML细胞上高度表达，并且其表达与人AML患者的总体存活呈负相关。LILRB由AML-SC和一些分化的急性白血病细胞(包括AML和急性淋巴母细胞性白血病或ALL)表达。不表达测试的任何单独LILRB的小鼠中的正常造血发育不存在缺陷。然而，有趣的是，各个LILRB的敲除在多种AML和急性淋巴母细胞性白血病(ALL)小鼠模型中逆转白血病发展并且摧毁AML-SC(Zheng等人，2012；Kang等人，出版中；还参见PCT/US13/43431)。另外，在培养的不同的人白血病细胞系中单独抑制几种LILRB的表达并且阻断异种移植小鼠中的白血病发展(Kang等人，出版中；还参见PCT/US13/43431)。

发明人已经确定一些白血病干细胞表达高水平的ITIM抑制性受体，包括LILRB。当前用于急性白血病患者的治疗选择(包括化疗)不能有效靶向癌干细胞，因为这些抑制性受体使得白血病干细胞能够在常规疗法下存活，最终导致肿瘤复发。发明人推理LILRB信号转导代表治疗AML的理想靶标，出于以下几个原因：1)几种LILRB对于AML细胞(包括AML-SC)的存活至关重要；2)单个LILRB的敲除不会导致正常血细胞生成的明显缺陷；和3)抑制LILRB活性刺激免疫并间接增加抗肿瘤作用。

概述

因此，根据本公开，提供了一种检测样品或受试者中癌细胞或癌干细胞的方法，所述方法包括(a)使受试者或来自所述受试者的样品与具有图22的克隆配对的重链和轻链CDR序列的抗体或抗体片段接触；和(b)检测所述受试者或样品中所述抗体与癌细胞或癌干细胞的结合。样品可以是活检或体液，诸如血液、痰液、眼泪、唾液、粘液或血清、尿液或粪便。检测可包括免疫组织化学、ELISA、RIA或蛋白质印迹。所述方法还可包括第二次执行步骤(a)和(b)并且确定与第一次测定相比细胞水平的变化。抗体特征可在于图21中列出的克隆配对的可变序列。抗体或抗体片段可以由与图21的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变核酸序列编码。抗体或抗体片段可以由与图21的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变氨基酸序列编码。抗体片段可以是重组ScFv(单链片段可变)抗体、Fab片段、F(ab’)₂片段或Fv片段。抗体可结合或不结合埃博拉病毒。

在另一个实施方案中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用具有图22的克隆配对的重链和轻链CDR序列的抗体或抗体片段。抗体特征可在于图21中列出的克隆配对的重链和轻链可变核酸序列。抗体特征可在于图21中列出的克隆配对的重链和轻链可变氨基酸序列。抗体或抗体片段可以由与图21的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变核酸序列编码。抗体或抗体片段可以由与图21的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变氨基酸序列编码。抗体片段可以是重组ScFv(单链片段可变)抗体、Fab片段、F(ab’)₂片段或Fv片段。抗体可以是IgG和/或嵌合抗体。癌症可以是急性髓性白血病。施用可以是静脉内、动脉内或肿瘤内的。

在又一实施方案中，提供单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体特征在于图22的克隆配对的重链和轻链CDR序列。单克隆抗体或抗体片段可以由根据图21的克隆配对序列的轻链和重链可变核酸序列编码。抗体或抗体片段可以由与图21的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变核酸序列编码。抗体或抗体片段可以由根据图21的克隆配对序列的轻链和重链可变氨基酸序列编码。抗体或抗体片段可以由与图21的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变氨基酸序列编码。抗体片段可以是重组ScFv(单链片段可变)抗体、Fab片段、F(ab’)₂片段或Fv片段。抗体可以是嵌合抗体，或者是双特异性抗体，和/或IgG。抗体可以是人源化的和/或优化的。

另一个实施方案涉及杂交瘤，其编码其中特征在于图22的克隆配对重链和轻链CDR序列的抗体。单克隆抗体可以由根据图21的克隆配对序列的轻链和重链可变核酸序列编码。抗体可以由与图21的克隆配对序列具有70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变核酸序列编码。抗体可以由根据图21的克隆配对序列的轻链和重链可变氨基酸序列编码。抗体可以由与图21的克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变氨基酸序列编码。

当在权利要求和/或说明书中连同术语“包含”一起使用时，使用措辞“一个(a)”或“一种(an)”可意味“一个”，但它也符合“一个或多个”、“至少一个”及“一个或一个以上”的含义。措辞“约”意指所述数字加或减5％。

预期本文描述的任何方法或组合物可相对于本文描述的任何其他方法和组合物来实现。通过以下详细描述，本公开的其他目的、特征和优势将变得显而易见。然而，应理解的是，尽管指示本发明的具体实施方案，但是详细描述和具体实施例仅通过说明的方式给出，因为从此详细描述中，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

附图简述

以下附图形成本说明书的一部分并且被包括来进一步说明本公开的某些方面。本公开可通过参考这些附图中的一个或多个结合本文提出的具体实施方案的详细描述来更好地理解。

以下附图组成本说明书的一部分，并且被包括以进一步证明本发明的某些方面。本发明可通过参考这些附图中的一个或多个结合本文提出的具体实施方案的详细描述来更好地理解。

图1A-D–LILRB在原代人AML细胞中的表达。(图1Al)LILRB4在约50％测试的人AML病例中表达。(图1B)LILRB4对于人单核AML细胞(M5b，外周血)是比CD14更好的标记物，并且LILRB(包括LILRB4)可以与白血病干细胞标志物CD34共表达。

图2A-D–单个LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4的表达与AML患者的总体存活呈负相关。数据来自TCGA数据库(tcga-data.nci.nih.gov/tcga/；2012年11月5日访问)。n＝92，p<0.05。

图3A-D-针对LILRB3或LILRB4的shRNA的表达强烈抑制细胞生长。(图3A)THP-1和MV4-11人AML细胞都在其细胞表面表达LILRB4。(图3B)如通过实时RT-PCR所测定，shRNA被设计特异性敲低单个LILRB表达。(图3C-D)THP-1(图3C)和MV4-11(图3D)细胞分别用表达靶向各个LILRB的shRNA或加扰对照的Pll3.7慢病毒感染。针对LILRB3或LILRB4的shRNA的表达强烈抑制细胞生长。

图4–用于蛋白质印迹的LILRB抗体。指示的mAb在蛋白质印迹中分别结合人LILRB2、LILRB3、LILRB4。

图5–LILRB抗体在LILRB过表达293T细胞上的结合。如通过流式细胞术所测定，指示的2μg/ml的mAb与人LILRB2、LILRB3、LILRB4过表达293T细胞结合。

图6–固定的(包被的)LILRB抗体对报告细胞的作用。指示的靶向人LILRB2、LILRB3、LILRB4开发的固定的mAb分别诱导LILRB2、LILRB3、LILRB4的活化。结合示出可溶性抗LILRB4抑制嵌合受体报告物的活化的图7，结果表明这些抗体分别阻断针对LILRB2、LILRB3、LILRB4的抗体。将指示的mAb固定在组织培养皿(10μg/ml)上。将LILRB2、LILRB3、LILRB4嵌合受体报告细胞培养在这些培养皿中。通过流式细胞术在12小时测量GFP诱导。Deng等人，2014Blood,124(6):924-3中描述了可以测量LILRB激动剂和拮抗剂的活性的嵌合受体报告系统

图7–可溶性抗LILRB4mAb抑制报告细胞的GFP诱导。抗体(包括C84、C53、C92、C201)在LILRB4的嵌合受体报告系统中通过包被的抗体抑制GFP诱导。

图8-9–如通过流式细胞术所测定，THP-1MV4-11细胞在细胞表面上表达LILRB4。

图10-12–C84(抗hLILRB4)在静脉内异种移植NSG小鼠中抑制人AML的发展。将4x10⁶个LILRB4⁺的人AML细胞系THP-1静脉内植入NSG小鼠中。从植入THP-1细胞的第一天开始，每3天(共8次)将200μg C84静脉内注射到每只小鼠中。PBS和小鼠IgG作为对照。通过在受体肝(图10-11)和骨髓(图12)中检查白血病浸润，随时间来监测肿瘤生长。hCD45被用于通过流式细胞术来检测人白血病细胞。

图13–C84抑制所有测试的LILRB4+人白血病细胞的肿瘤移植。只有由LILRB4+人白血病细胞(THP-1和MV4-11)形成的肿瘤才能被C84有效地抑制。由LILRB4^-细胞(U937)形成的肿瘤不能被C84抑制。通过在由THP-1、MV4-11和U937细胞植入的受体肝、脾、骨髓和外周血中检查白血病浸润来示出肿瘤生长的比较。将hCD45用于通过流式细胞术来检测人白血病细胞。通过流式细胞术在THP-1和MV4-11细胞的细胞表面上检测到LILRB4，而在U937细胞上未检测到。(左下图)

图14–C84(抗hLILRB4)在静脉内异种移植NSG小鼠(8个不同患者)中抑制原代患者AML的发展。将4～10x 10⁶个LILRB4⁺的原代人AML细胞静脉内植入NSG小鼠中。从植入AML细胞的第一天开始，每周两次将200μg C84静脉内注射到每只小鼠中。小鼠IgG作为对照。通过在受体肝、脾、骨髓和外周血中检查白血病浸润，随时间来监测肿瘤生长。hCD45和hLILRB4被用于通过流式细胞术来检测人白血病细胞。

图15–在hCB-HSC衍生的人源化NSG小鼠中测试抗hLILRB4。将3x10⁴个人脐带血CD34⁺细胞移植到亚致死照射(250rad)NSG小鼠中，并且在移植后第21天至第41天的各个时间点确认多谱系人造血重建。在第42天，将1x 10⁶个人THP-1-Luc-GFP(稳定表达萤光素酶和GFP以促进实时体内追踪的THP-1细胞)AML细胞静脉内植入NSG小鼠中。在植入AML细胞后，立即将200μg C84静脉注射到每只小鼠中。小鼠IgG作为对照。通过发光成像，随着时间来监测肿瘤生长。

图16–21种兔抗人LILRB4mAb的重链和轻链的可变区的氨基酸序列。

图17–C84在异种移植小鼠中阻断由原代AML细胞引发的AML发展。21种兔抗人LILRB4mAb的重链和轻链的CDR的氨基酸序列。

图18A-U–如通过ELISA所测定的这些抗体与LILRB4结合的EC₅₀，以及固定化抗体对嵌合LILRB4报告系统的活化能力(因此的可溶性抗体的阻断能力)。

图19–mAb对LILRB1-5的抗白血病效力和交叉反应性。通过将指示的抗体施用到AML异种移植模型中来测定抗白血病效力。

图20–4种单独的抗LILRB4抗体的Ig同种分型。

图21-22–单独的抗LILRB抗体的可变区的测序和同种分型结果。

图23–如通过SDS-PAGE所测定，嵌合抗C84(嵌合ab MHC-C84)的表达。

图24–如通过流式细胞术所测定，嵌合ab MHC-C84如C84一样结合LILRB4+THP-1细胞。

图25–如通过流式细胞术所测定，嵌合ab MHC-C84如C84一样结合LILRB4嵌合受体报告细胞。

图26–如通过嵌合受体报告测定所测定，嵌合ab MHC-C84如C84一样是LILRB4的阻断抗体。

图27–嵌合ab MHC-C84在异种移植模型中抑制AML发展(与原始mAb C84相同或比原始mAb C84更好)。将3x 10⁶个人AML细胞系THP-1-Luc-GFP(稳定表达萤光素酶和GFP以促进实时体内追踪的THP-1细胞)静脉内植入NSG小鼠中。在植入3x 10⁶个THP-1-Luc-GFP细胞后30分钟-1小时，将200μg MHC-C84或C84静脉内注射到每只小鼠中仅一次。PBS或小鼠IgG作为对照。通过在受体肝、脾、骨髓和外周血中检查白血病浸润1个月后来监测肿瘤生长。hCD45被用于通过流式细胞术来检测人白血病细胞。

图28–如通过发光成像所测定，嵌合ab MHC-C84在异种移植模型中抑制AML发展。将3x 10⁶个稳定表达荧光素酶的人AML细胞系THP-1(作为THP-1-Luc-GFP细胞)静脉内植入NSG小鼠中。在植入3x 10⁶个THP-1-Luc-GFP细胞后30分钟～1小时，将200μg MHC-C84或C84静脉内注射到每只小鼠中仅一次。小鼠IgG作为对照。通过发光成像，随着时间来监测肿瘤生长。虽然所有条件在第0天(肿瘤植入后4小时)具有相同的荧光素酶强度，但MHC-C84或C84处理的小鼠随时间推移不显示荧光素酶信号(在第16、18和21天将它们与对照相比较)。

图29A-G–抗LILRB4抑制AML细胞迁移并加速动员。(图29A)C84不抑制MV4-11细胞的可塑性。将1x 10⁵个MV4-11细胞在transwell的上室中培养，并用100μg/ml的C84或mIgG处理18小时。计数下室中的细胞。(图29B)C84抑制MV4-11细胞通过内皮细胞的迁移。将3x10⁵个HUVEC细胞在transwell膜上培养3天。将1x 10⁵个MV4-11细胞在transwell的上室中培养，并用100μg/ml的C84或mIgG处理18小时。计数下室中的细胞。(图29C)C84抑制MV4-11细胞归巢。将5x 10⁶个MV4-11细胞静脉内注射到被处死(scarified)后8或20小时的每个NSG小鼠中。hCD45被用于通过流式细胞术来检测人白血病细胞。受体肝、脾和骨髓中白血病细胞的百分比通过外周血中白血病细胞的百分比来标准化。(图29D)C84不抑制HSC归巢。将1x10⁷个人脐带血单核细胞静脉内注射到被处死后20小时的每个NSG小鼠中。hCD45和hCD34被用于通过流式细胞术来检测人HSC。(图29E-F)C84加速MV4-11动员到PB。将5x 10⁶个MV4-11细胞静脉内注射到每个NSG小鼠中。在第0天(MV4-11细胞移植后第3天)、第1天和第4天检查外周血中的白血病细胞。在第0天和第1天将200μg C84或mIgG静脉内注射到每只小鼠中。在第4天将小鼠处死。hCD45被用于通过流式细胞术来检测人白血病细胞。(图29G)与化疗药物阿糖胞苷(cytarabicin)协同的C84治疗抑制AML发展。将1x 10⁶个稳定表达荧光素酶的人AML THP-1细胞(作为THP-1-Luc-GFP细胞)静脉内植入NSG小鼠中。从植入白血病细胞后第6天或14天开始，每天将10mg/kg阿糖胞苷腹膜内注射到每只小鼠中。从植入白血病细胞后第6天或14天开始，每周两次将200μg C84或mIgG静脉内注射到每只小鼠中。在植入白血病细胞后第21天将小鼠处死。hCD45被用于通过流式细胞术来检测人白血病细胞。

图30A-U-抗LILRB4刺激T细胞免疫用于抗癌作用。(图30A-C)c84抑制LILRB4对CTL的抑制。将5x 10⁴个从健康供体的hPBMC中分离的CD8⁺T细胞用抗CD3/CD28/CD137包被的珠粒刺激或者不刺激，持续2天。然后，将5x 10³个THP-1-Luc-GFP细胞与这些T细胞共培养，并用500μg/ml C84或mIgG处理5天。CD8和CD28被用于通过流式细胞术来检测人CTL细胞；并且GFP被用于检测人白血病细胞。(图30D)c84增加CTL细胞因子产生。来自用C84或mIgG处理的刺激的CTL细胞和THP-1细胞的共培养物的细胞上清液被用于通过人细胞因子阵列来检查细胞因子产生。(图30E)THP-1不能移植到PBMC驱动的人源化NSG小鼠中。将1x 10⁷个人PBMC静脉内注射到每个NSG小鼠中。植入hPBMC后3周，这些小鼠具有30～50％的人T细胞移植物。然后，将1x 10⁶个稳定表达荧光素酶的人AML THP-1细胞(作为THP-1-Luc-GFP细胞)静脉内植入这些hPBMC人源化的NSG小鼠或年龄匹配的普通NSG小鼠中。通过发光成像，随着时间来监测肿瘤生长。(图30F)C84在PBMC驱动的人源化NSG小鼠中抑制THP-1细胞的皮下植入。将1x 10⁷个人PBMC静脉内注射到每个NSG小鼠中。植入hPBMC后3周，这些小鼠具有30～50％的人T细胞移植物。然后，将1x 10⁶个稳定表达荧光素酶的人AML THP-1细胞(作为THP-1-Luc-GFP细胞)皮下植入这些hPBMC人源化的NSG小鼠中，且用200μg C84或mIgG每周处理两次。通过发光成像，随着时间来监测肿瘤生长。(图30G-U)C84在人脐带血人源化的NSG小鼠中抑制白血病发展并减少CD8+T抑制细胞。获得与图15所示相同的hCB人源化小鼠。GFP被用于检测人白血病细胞，CD19和CD20被用于检测CB衍生的人B细胞，CD11b、CD14和LILRB4被用于检测CB衍生的人骨髓细胞，CD4和CD8被用于检测CB衍生的人T细胞，CD8、CD28和CD40L被用于检测CB衍生的人CTL和T抑制细胞，

图31–抗LILRB4对AML发展的Fc依赖性和Fc非依赖性作用。将1x 10⁶个稳定表达荧光素酶的人AML THP-1细胞(作为THP-1-Luc-GFP细胞)静脉内植入NSG小鼠中。在植入1x10⁶个THP-1-Luc-GFP细胞后同一天(作为“第0天”)或第3天(作为“第3天”)，将200μg MHC-C84或MHC-C84-N297A静脉内注射到每只小鼠中。抗CMV人IgG抗体(LX-D2-43)作为对照。通过发光成像随时间来监测肿瘤生长，并且hCD45被用于通过流式细胞术来检测人白血病细胞。

图32A-E–APOE是潜在的LILRB4配体。(图32A)人/小鼠血清、APOE和LFA-1诱导LILRB4活化；(图32B)APOE激活人LILRB4和小鼠PIRB；(图32C)SPR显示APOE以高亲和力结合LILRB4，Kd＝2.485nM；(图32D-E)APOE敲除延迟小鼠AML细胞发展和延长总体存活。将1x10⁶个稳定表达GFP的小鼠AML C1498细胞静脉内植入C57BL/6小鼠或APOE敲除小鼠中。在植入C1498细胞后20天，将GFP用于通过流式细胞术来检测外周血中的小鼠白血病细胞。

说明性实施方案的描述

发明人已经开发了多种抗LILRB mAb，其各自有效地在各种异种移植小鼠模型中阻断人AML发展。这些令人兴奋的结果表明，LILRB支持白血病干细胞的活性和白血病发展，但对正常血细胞生成不是至关重要的。具体地，发明人首次证明抗LILRB4抑制人AML的发展(包括在异种移植小鼠中发展的人类患者AML)。重要的是，他们获得10种抗LILRB mAb的可变区序列，并产生具有人恒定区的嵌合抗体。发明人表明一种此类嵌合抗体(MHC-C84)不仅保留与原始mAb C84相同的结合特性，而且在异种移植模型中具有增强的抗白血病活性。因此，抗LILRB抗体可用于治疗在其细胞表面上表达相关LILRB的白血病和其他癌症。它们也可用于治疗具有LILRB组分的免疫疾病。本公开的这些和其他方面在下文讨论。

I.LILR

白细胞免疫球蛋白样受体(LILR)是拥有细胞外免疫球蛋白结构域的受体家族。它们也被称为CD85、ILT和LIR，并且可以在广泛范围的免疫细胞上发挥免疫调节作用。编码这些受体的人类基因存在于染色体区域19q13.4的基因簇中。它们包括LILRA1、LILRA2、LILRA3、LILRA4、LILRA5、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LILRB6或LILRA6以及LILRB7或LILRA5。LILR的一个亚群识别MHC I类分子(在人类中也称为HLA I类)。其中，抑制性受体LILRB1和LILRB2对经典和非经典MHC等位基因表现出广泛的特异性，且优先结合b2m有关的复合物。相比之下，激活受体LILRA1和LILRA3优选MHC I类的b2m非依赖性游离重链，并且特别是HLA-C等位基因。

A.LILRB1

白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1是人类中由LILRB1基因编码的蛋白质。此基因是白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族的成员，其存在于染色体区域19q13.4的基因簇中。编码的蛋白属于LIR受体的亚家族B类，其含有两个或四个细胞外免疫球蛋白结构域、一个跨膜结构域和二至四个细胞质免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。受体在免疫细胞上表达，其中它与抗原呈递细胞上的MHC I类分子结合并转导抑制免疫应答的刺激的负信号。据报道LILRB1还在人类胃癌细胞中表达，并且可增强肿瘤生长(参见Zhang等人，2012)。据认为它可以控制炎症应答和细胞毒性，以有助于集中免疫应答并限制自身反应性。已经发现了此基因的编码不同同种型的多个转录变体。

B.LILRB2

白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2是人类中由LILRB2基因编码的蛋白质。此基因是白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族的成员，其存在于染色体区域19q13.4的基因簇中。编码的蛋白属于LIR受体的亚家族B类，其含有两个或四个细胞外免疫球蛋白结构域、一个跨膜结构域和二至四个细胞质免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。受体在免疫细胞上表达，其中它与抗原呈递细胞上的MHC I类分子结合并转导抑制免疫应答的刺激的负信号。据认为它可以控制炎症应答和细胞毒性，以有助于集中免疫应答并限制自身反应性。所述受体还在人类非小细胞肺癌细胞上表达(参见Sun等人，2008)。已经发现了此基因的编码不同同种型的多个转录变体。LILRB2已表明与PTPN6相互作用。

C.LILRB3

白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员3是人类中由LILRB3基因编码的蛋白质。此基因是白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族的成员，其存在于染色体区域19q13.4的基因簇中。编码的蛋白属于LIR受体的亚家族B类，其含有两个或四个细胞外免疫球蛋白结构域、一个跨膜结构域和二至四个细胞质免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。受体在免疫细胞上表达，其中它与抗原呈递细胞上的MHC I类分子结合并转导抑制免疫应答的刺激的负信号。据认为它可以控制炎症应答和细胞毒性，以有助于集中免疫应答并限制自身反应性。已经发现了此基因的编码不同同种型的多个转录变体。

D.LILRB4

白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4是人类中由LILRB4基因编码的蛋白质。此基因是白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族的成员，其存在于染色体区域19q13.4的基因簇中。编码的蛋白属于LIR受体的亚家族B类，其含有两个或四个细胞外免疫球蛋白结构域、一个跨膜结构域和二至四个细胞质免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。受体在免疫细胞上表达，其中它与抗原呈递细胞上的MHC I类分子结合并转导抑制免疫应答的刺激的负信号。所述受体还可以在抗原捕获和呈递中起作用。据认为它可以控制炎症应答和细胞毒性，以有助于集中免疫应答并限制自身反应性。LILRB4还在人类胃癌细胞中表达，并且可增强肿瘤生长(参见Zhang等人，2012)。已经发现了此基因的编码不同同种型的多个转录变体。LILRB4已表明与PTPN6相互作用。

E.LAIR1

白细胞有关的免疫球蛋白样受体1是人类中由LAIR1基因编码的蛋白质。LAIR1还已被称为CD305(分化簇305)。LAIR1是I型跨膜糖蛋白，其含有一个胞外Ig样结构域和两个细胞内ITIM。像编码LILRB的基因一样，lair1定位于人染色体19q13.4上的白细胞受体复合物(LRC)。LAIR1结合胶原蛋白，并且其ITIM募集SHP-1和SHP-2。LAIR1在T细胞、B细胞，自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和树突细胞以及造血祖细胞(包括人CD34⁺细胞)中表达。发明人已经证明LAIR1在AML干细胞和分化的AML和ALL细胞上表达，并且它的抑制阻断AML-SC活性和白血病发展(未发表的数据)。

II.癌症

A.癌症

虽然过度增生性疾病可以与导致细胞开始不可控制地繁殖的任何疾病有关，但是原型实例是癌症。癌症的关键因素之一是细胞的正常凋亡周期被中断，并且因此中断细胞生长的试剂作为治疗这些疾病的治疗剂是重要的。在本公开中，本文所述的微管溶素(tubulysin)类似物可用于导致细胞计数减少，并且因此可潜在地用于治疗多种类型的癌细胞系。在一些方面，预期本文所述的微管溶素类似物可用于实际治疗任何恶性肿瘤。在这里，唯一的要求是在癌细胞表面上存在LILRB，并且特别是在癌干细胞的表面上。

根据本公开可治疗的癌细胞包括但不限于来自以下的细胞：膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、胃肠、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、胰腺、睾丸、舌头、宫颈或子宫。另外，癌症可具体地具有以下组织学类型，尽管不限于这些：肿瘤，恶性肿瘤；癌；未分化的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；皮母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性肿瘤；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉中的腺瘤；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌肿瘤，恶性肿瘤；分支肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包封硬化性癌；肾上腺皮质癌；内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病，乳腺的；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性肿瘤；卵巢间质肿瘤，恶性肿瘤；泡膜细胞瘤，恶性肿瘤；粒层细胞瘤，恶性肿瘤；男性细胞瘤，恶性肿瘤；塞尔托利氏细胞癌；莱狄希细胞瘤，恶性肿瘤；脂质细胞瘤，恶性肿瘤；副神经节瘤，恶性肿瘤；乳腺外副神经节瘤，恶性肿瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无色素性黑色素瘤；表面扩张黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝色痣，恶性肿瘤；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性肿瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合肿瘤，恶性肿瘤；苗勒管混合肿瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤，恶性肿瘤；布伦纳肿瘤，恶性肿瘤；叶状肿瘤，恶性肿瘤；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性肿瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性肿瘤；甲状腺肿样卵巢瘤，恶性肿瘤；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性肿瘤；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性肿瘤；卡波济氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性肿瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性肿瘤；间质性软骨肉瘤；骨巨细胞肿瘤；尤文氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性肿瘤；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性肿瘤；脊索瘤；胶质瘤，恶性肿瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆型星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；少突神经胶质母细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；神经节母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性肿瘤；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性肿瘤；颗粒细胞瘤，恶性肿瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡状；蕈状真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸粒细胞性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓系肉瘤和毛细胞白血病。在某些方面，肿瘤可包括骨肉瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤文肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤或白血病。

B.急性髓性白血病

急性髓性白血病(AML)也称为急性骨髓性白血病或急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)，是血细胞髓系的癌症，其特征在于积累在骨髓中并干扰正常血细胞的产生的异常白细胞的快速生长。AML是影响成人的最常见的急性白血病，并且其发病率随年龄增长而增加。虽然AML是相对罕见的疾病，大约占美国癌症死亡的1.2％，但是其发病率预计会随着人口年龄的增长而增加。

AML的症状是由白血病细胞替代正常骨髓引起的，这导致红细胞、血小板和正常白细胞下降。这些症状包括疲劳、呼吸短促、容易发生瘀伤和出血以及感染的风险增加。已经确定了几种风险因素和染色体异常，但具体原因尚不清楚。作为急性白血病，AML进展迅速，并且如果不治疗，通常在数周或数月内致死。

AML有几种亚型；亚型之间的治疗和预后各不相同。五年存活从15-70％不等，并且根据亚型，复发率从33-78％不等。AML最初采用旨在诱导缓解的化疗来治疗；患者可继续接受额外的化疗或造血干细胞移植。最近对AML遗传学的研究导致了可以预测哪些药物对特定患者最有效以及患者可能存活多久的测试的可行性。

大多数AML的体征和症状是由白血病细胞替换正常血细胞引起的。缺乏正常的白细胞产生使患者易感染；而白血病细胞本身衍生自白细胞前体，它们没有对抗感染的能力。红细胞计数的下降(贫血)可能导致疲劳、苍白和呼吸短促。缺少血小板可以导致伴随轻微创伤容易瘀伤或出血。

AML的早期体征往往是模糊且非特异性的，并且可能与流行性感冒或其他常见疾病的体征类似。一些广义的症状包括发热、疲劳、体重减轻或食欲不振、呼吸短促、贫血、容易瘀伤或出血、瘀点(由出血引起的皮肤下的平坦的针头大小的斑点)、骨和关节疼痛以及持续或频繁感染。

AML中可能发生脾脏增大，但通常是轻度且无症状的。与急性淋巴母细胞性白血病相比，AML中罕见淋巴结肿胀。在皮肤白血病的形式中大约10％的时间涉及皮肤。罕见地，一种皮肤的副肿瘤性炎症，斯威特氏综合征可以与AML一起发生。

由于白血病细胞浸润到牙龈组织中，一些AML患者可能会出现牙龈肿胀。罕见地，白血病的第一个体征可能是骨髓外的实体白血病块或肿瘤的发展，称为绿色瘤。偶然地，一个人可能不会表现出症状，而在常规血液测试期间可能附带地发现白血病。

已经确定了多种发展AML的风险因素，其包括：其他血液病症、化学暴露、电离放射和遗传学。

“白血病前期的”血液病症(诸如骨髓增生异常综合征或骨髓组织增生性疾病)可演变成AML；确切的风险取决于MDS/MPS的类型。暴露于抗癌化疗，特别是烷基化剂，可以增加随后发展AML的风险。化疗后约三至五年风险最高。其他化疗药物，特别是表鬼臼毒素和蒽环类药物，也与治疗相关的白血病有关。这些治疗相关的白血病往往与白血病细胞中的特异性染色体异常有关。苯和其他芳香族有机溶剂的职业性化学暴露作为AML的原因是有争议的。已知苯和其许多衍生物在体外是致癌的。虽然一些研究已经提出了职业暴露于苯和AML风险增加之间的联系，但其他研究已经提出归因风险(如果有的话)是轻微的。大量的电离放射暴露可增加AML的风险。似乎存在AML的遗传风险。已经报道了家族中发展多例AML的发病率高于单独偶然预测的发病率。几种先天性病状可增加白血病的风险；最常见的可能是唐氏综合征，其与AML的风险增加10至18倍有关。

诊断AML的第一条线索通常是全血计数的异常结果。虽然过量的异常白细胞(白细胞增多)是常见的发现，并且有时可以看到白血病原始细胞，但是AML也可以呈现单独的血小板、红细胞降低或甚至低白细胞计数(白细胞减少)。虽然存在循环的白血病原始细胞时可以通过检查外周血涂片来确定AML的推定诊断，但明确诊断通常需要足够的骨髓穿刺和活检。

通过光学显微镜已经流式细胞术检查骨髓或血液来诊断白血病的存在，以区分AML与其他类型的白血病(例如急性淋巴母细胞性白血病-ALL)并分类疾病亚型(见下文)。骨髓或血液样品通常也通过常规细胞遗传学或荧光原位杂交来测试染色体异常。还可以执行遗传学研究以在基因(诸如FLT3、核仁磷酸蛋白和KIT)中寻找特异性突变，其可影响疾病的结果。

血液和骨髓涂片上的细胞化学染色有助于ALL与AML的区分以及AML的次级分类。髓过氧化物酶或苏丹黑色染色剂和非特异性酯酶染色剂的组合将在大多数情况下提供所需的信息。髓过氧化物酶或苏丹黑色反应在建立AML的个性特征并区分AML与ALL方面是最有用的。非特异性酯酶染色剂用于鉴定AML中的单核细胞组分并且区分低分化单核母细胞性白血病与ALL。

AML的诊断和分类可能具有挑战性，并且应由有资格的血液病理学家或血液学家来执行。在直接的情况下，某些形态特征(诸如奥尔氏杆(Auer rod))或特异性流式细胞术结果的存在可以区分AML与其他白血病；然而，在不存在此类特征的情况下，诊断可能更困难。

根据广泛使用的WHO标准，AML的诊断是通过证明白血病成髓细胞涉及超过20％的血液和/或骨髓来建立的。法国-美国-英国(FAB)分类要更严格一点，需要在用于AML诊断的骨髓(BM)或外周血(PB)中至少30％的原始细胞百分比。AML必须与“白血病前期”病状(诸如骨髓增生异常或骨髓增生综合征)进行仔细的区分，白血病前期病状应不同地治疗。

因为急性前髓细胞性白血病(APL)具有最高的治愈率并且需要独特的治疗形式，因此快速建立或排除这种白血病亚型的诊断很重要。出于这种目的，经常使用对血液或骨髓执行的荧光原位杂交，因为它很容易识别表征APL的染色体易位[t(15；17)(q22；q12)；]。还需要分子检测PML/RARA融合蛋白的存在，它们是所述易位的致癌产物。

AML的一线治疗主要由化疗组成，并且分为两个阶段：诱导和缓解后(或巩固)疗法。诱导疗法的目标是通过将白血病细胞数量减少到不可检测的水平来实现完全缓解；巩固疗法的目标是消除任何残留的不可检测的疾病并实现治愈。如果诱导化疗失败或患者复发后，通常会考虑造血干细胞移植，尽管移植有时也用作高风险疾病患者的一线疗法。

除M3以外所有FAB亚型通常都用阿糖胞苷(ara-C)和蒽环类药物(最常为柔红霉素)给予诱导化疗。这种诱导化疗方案被称为“7+3”(或“3+7”)，因为阿糖胞苷作为连续IV输注给予连续7天，而蒽环类药物作为IV推注给予连续3天。高达70％的患者将通过这种方案实现缓解。还可使用其他另选的诱导方案，包括单独的高剂量阿糖胞苷、FLAG样方案或试验试剂。由于疗法的毒性作用，包括骨髓抑制和增加的感染风险，可能不会向高龄老年人提供诱导化疗，并且选择可包括低强度的化疗或姑息治疗。

AML的M3亚型，也称为急性前髓细胞性白血病(APL)，除了诱导化疗(通常是蒽环类药物)之外，几乎普遍用药物全反式维甲酸(ATRA)进行治疗。必须注意防止弥散性血管内凝血(DIC)，即当前髓细胞将其颗粒的内容物释放到外周循环中时，APL的治疗复杂化。APL是显著可治愈的，具有充分记载的治疗方案。

诱导阶段的目标是达到完全缓解。完全缓解并不意味着疾病已经治愈；相反，它表示用可用的诊断方法检测不到疾病。约50％-75％的新诊断的成年人获得完全缓解，尽管这可能会根据上述预后因素而有所不同。缓解的长度取决于原始白血病的预后特征。一般而言，在没有额外的巩固疗法的情况下，所有的缓解都会失败。

即使在实现完全缓解之后，白血病细胞仍然可能保持在太小的数量以致于不能用当前诊断技术检测到。如果没有进行进一步的缓解后疗法或巩固疗法，几乎所有患者最终都会复发。因此，需要更多的疗法来消除不可检测的疾病并防止复发，即实现治愈。

基于患者的预后因素(见上文)和一般健康状况，缓解后疗法的特定类型是个体化的。对于良好预后的白血病(即，inv(16)、t(8；21)和t(15；17))，患者通常会经历额外的三至五个疗程的强化疗，称为巩固化疗。对于具有高复发风险的患者(例如具有高风险细胞遗传学、潜在MDS或疗法相关AML的患者)，如果患者能够耐受移植并具有合适的供体，通常推荐异源干细胞移植。中度风险AML(不属于无风险或高风险组的正常细胞遗传学或细胞遗传学变化)的最佳缓解后疗法不太明确并且取决于具体情况，其包括患者的年龄和总体健康状况、患者的个人评价以及合适的干细胞供体是否可用。

对于不符合干细胞移植资格的患者，在巩固完成后用二盐酸组胺(Ceplene)和白细胞介素2(Proleukin)组合的免疫疗法已经表明将绝对复发风险降低14％，转化为维持缓解的可能性增加50％。

对于复发性AML患者，唯一被证明是潜在的治愈疗法是造血干细胞移植，如果患者尚未进行造血干细胞移植。2000年，单克隆抗体连接的细胞毒性剂吉妥珠单抗奥唑米星(Mylotarg)在美国被批准用于60岁以上的复发性AML患者，这些患者不是高剂量化疗的候选者。这种药物自2010年起由制造商辉瑞自愿撤出市场。由于复发性AML的治疗选择如此有限，可能会提供姑息治疗。

不是干细胞移植的候选者的复发性AML患者，或在干细胞移植后复发的患者可能会在临床试验中被提供治疗，因为常规治疗选择有限。正在研究的试剂包括细胞毒性药物(诸如氯法拉滨)，以及靶向疗法(诸如法呢基转移酶抑制剂、地西他滨和MDR1的抑制剂(多药耐药蛋白))。对于复发性急性前髓细胞性白血病(APL)，三氧化二砷已经在试验中测试并由美国FDA批准。像ATRA一样，三氧化二砷在AML的其他亚型中不起作用。

虽然急性髓性白血病是可治愈的疾病，但特定患者的治愈的机会取决于许多预后因素。AML中单一的最重要的预后因素是白血病细胞的细胞遗传学或染色体结构。某些细胞遗传学异常与非常好的结果有关(例如，急性前髓细胞性白血病中的(15:17)易位)。大约一半的AML患者具有“正常”细胞遗传学；他们属于中度风险人群。已知多种其他细胞遗传学异常与预后不良和治疗后复发的高风险有关。

由预先存在的的骨髓增生异常综合征(MDS)或骨髓组织增生性疾病(所谓的继发性AML)引起的AML具有较差的预后，对于另一种以前的恶性肿瘤的化疗后引起的治疗相关的AML也是如此。这两个实体都与高比率的不利的细胞遗传学异常有关。

在一些研究中，年龄>60岁和升高的乳酸脱氢酶水平也与较差的结果有关。与大多数形式的癌症一样，行为状态(即，患者的一般身体条件和活动水平)也在预后中起主要作用。

FLT3内部串联重复(ITD)已表明在AML中赋予较差的预后。用更积极的疗法(诸如首次缓解期的干细胞移植)治疗这些患者尚未表明增强长期存活。FLT3的ITD可能与白血病有关。2012年，FLT3抑制剂奎扎替尼在FLT3-ITD突变的AML患者中表现出阳性II期试验结果。

研究人员正在研究c-KIT突变在AML中的临床意义。这些是普遍的并且是临床相关的，因为酪氨酸激酶抑制剂(诸如伊马替尼和舒尼替尼)可以在药理学上阻断c-KIT的活性的可用性。作为预后因素或治疗靶标被研究的其他基因包括CEBPA、BAALC、ERG和NPM1。

B.急性淋巴母细胞性白血病(ALL)

急性淋巴母细胞性白血病(ALL)或急性淋巴样白血病是白血病或白细胞癌症的急性形式，其特征在于癌性的未成熟白血球(称为淋巴母细胞)的过度产生。在ALL患者中，淋巴母细胞在骨髓中过量产生并持续繁殖，通过抑制骨髓中正常细胞(诸如红细胞和白细胞和血小板)的产生并浸润到其他器官而造成损伤和死亡。ALL在儿童中最常见，具有2-5岁的发病高峰和老年高峰。

ALL的症状指示功能性血细胞的产生减少，因为白血病浪费了通常用于产生新的功能性血细胞的骨髓的资源。这些症状可能包括发热、感染风险增加(特别是由于中性粒细胞减少症的细菌感染如肺炎；这种感染的症状包括呼吸短促、胸痛、咳嗽、呕吐、肠或膀胱习性的变化)、出血倾向增加(由于血小板减少)以及指示贫血的体征(包括苍白、心动过速(高心率)、疲劳和头痛)。

美国每年报道约有6000例；虽然在美国、意大利和哥斯达黎加已经更为常见，但其他国家的统计数据很难得出。治愈是一个现实的目标，并且在80％以上的患病儿童中实现，尽管只有20-40％的成年人可以被治愈。“急性”是指将疾病的相对较短的时间过程，以与具有多年的潜在时间过程的慢性淋巴细胞性白血病区分。

所述症状并不是ALL特有的，而是恶化到寻求医疗帮助的程度。它们是由于缺乏正常和健康的血细胞引起的，因为正常和健康的血细胞被恶性和未成熟的白血球(白细胞)排挤。因此，ALL患者经历红血球(红细胞)、白血球和血小板功能异常的症状。可能表现异常的实验室测试包括血细胞计数测试、肾功能测试、电解质测试和肝脏酶测试。

ALL的体征和症状是可变的但是随着骨髓替换和/或器官浸润而变化，并且包括广义的虚弱和疲劳、贫血、头晕、频繁或不明原因的发热和感染、体重减轻和/或食欲不振、过度和不明原因的瘀伤、骨痛、关节痛(由“原始”细胞传播到骨表面或从骨髓腔进入关节引起)、呼吸困难、淋巴结增大、肝和/或脾增大、下肢和/或腹部压凹性水肿(肿胀)以及瘀点(其为由于低血小板水平在皮肤中出现的微小红点或线)。

一般而言，癌症是由DNA损坏造成的，其通过增加引起生长的化学信号或通过中断控制生长的化学信号而导致不受控制的细胞生长并且扩散到全身。通过形成融合基因以及通过将原癌基因并置到另一基因(例如T细胞受体基因)的启动子的原癌基因失调，可以造成损坏。这种损害可由环境因素(诸如化学物质、药物或放射)造成，并且在有丝分裂或其他正常过程中自然发生(尽管细胞有许多有助于减少这种损坏的DNA修复机制)。

ALL与动物和人类暴露于放射和化学物质有关。高水平放射暴露是发展白血病的已知风险因素，如通过广岛和长崎原子弹暴露的幸存者的研究所发现的。在动物中，暴露于苯和其他化学物质会引起白血病。流行病学研究将白血病与工作场所暴露于化学物质相关联，但这些研究并不是决定性的。一些证据表明，继发性白血病可以在用放疗和化疗治疗其他癌症的个体中作为所述治疗的结果发展。

诊断ALL开始于病史、身体检查、全血计数和血液涂片。因为症状如此普遍，许多具有类似症状的其他疾病必须被排除。通常，白细胞计数越高，预后越差。在大多数情况下，在血液涂片上观察到原始细胞(原始细胞是所有免疫细胞系的前体(干细胞))。骨髓活检是ALL的决定性证据。腰椎穿刺(也称为脊椎抽液)将指示脊柱和脑是否已被入侵。

病理检查、细胞遗传学(特别是费城染色体的存在)和免疫分型确定是否成髓细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞)或淋巴母细胞(B淋巴细胞或T淋巴细胞)是否有问题。RNA测试可以确定疾病的攻击性；不同的突变与更短或更长的存活有关。免疫组织化学测试可揭示白血病细胞表面的TdT或CALLA抗原。TdT是前T细胞和前B细胞发育早期表达的蛋白质，而CALLA是在80％的ALL病例以及CML的“原始细胞危象”中发现的抗原。医学成像(诸如超声或CT扫描)通常可以发现其他器官(肺、肝、脾、淋巴结、脑、肾和生殖器官)的侵袭。

越早检测到急性淋巴细胞性白血病，治疗越有效。目的是诱导持久的缓解，定义为体内不存在可检测的癌细胞(通常骨髓中小于5％的原始细胞)。急性白血病的治疗可以包括化疗、类固醇药物、放射疗法、强化组合治疗(包括骨髓或干细胞移植)和生长因子。

化疗是初始治疗的选择。大多数ALL患者将接受不同治疗的组合。由于恶性细胞的全身分布，没有手术选择。一般而言，ALL的细胞毒性化疗组合各种组合中的多种抗白血病药物。ALL的化疗由三个阶段组成：缓解诱导、强化和维持疗法。

由于化疗方案可以是强烈的和延长的(在GMALL UKALL、HyperCVAD或CALGB协议的情况下通常为约2年；对于ALL，根据COG方案的男性为约3年2个月；女性为2年2个月-比男性更长，因为睾丸是潜在的贮药库)，许多患者具有插入大静脉的静脉导管(称为中央静脉导管或希克曼线)或Portacath，其是具有通过手术植入皮肤下通常在颈骨附近的硅酮突出前端的锥形端口，并且由于低感染风险和portacath的长期可行性，其是可获得的最有效的产品。

放射疗法(放疗)用于疼痛的骨质区域上、高度疾病负担中，或作为骨髓移植的预备的一部分(全身照射)。全脑放射形式的放射也用于中枢神经系统预防，以防止脑中白血病的复发。全脑预防放射是治疗儿童ALL的常用方法。最近的研究表明，CNS化疗提供的结果是有利的，但发展的副作用更少。因此，全脑放射的使用更加受到限制。成人白血病的大多数专家已经放弃使用放射疗法用于CNS预防，转而使用鞘内化疗。

对于复发性ALL的一些亚型，针对生物靶标(诸如蛋白酶体)与化疗相结合，已经在临床试验中取得了有希望的结果。基于它们对白血病淋巴母细胞的组合作用的生物靶标的选择可以导致用于改进ALL治疗作用的临床试验。在正在进行的临床试验中，CD19-CD3双特异性单克隆鼠抗体博纳吐单抗(Blinatumomab)表现出了巨大的希望。

已经开发了嵌合抗原受体(CAR)作为ALL的有希望的疗法。此技术使用被设计用于识别细胞表面标志物CD19的单链可变片段(scFv)作为治疗ALL的方法。CD19是在所有B细胞上发现的分子，并且可用作在患者中区分潜在恶性B细胞群体的手段。在此疗法中，小鼠用CD19抗原免疫并产生抗CD19抗体。可以开发从与骨髓瘤细胞系融合的小鼠脾细胞发育而来的杂交瘤作为编码CD19特异性抗体的cDNA的来源。对cDNA进行测序，并且使用小的肽接头将编码这些抗体的可变重链和可变轻链的序列克隆在一起。这种所得到的序列编码scFv。这可以被克隆成编码将成为CAR的内部结构域的转基因。用作内部结构域的亚单元有不同的排列，但它们一般由附接到scFv的铰链区、跨膜区、共刺激分子(诸如CD28)的细胞内区域以及含有ITAM重复序列的CD3-ζ的细胞内结构域组成。经常包括的其他序列是：4-1bb和OX40。然后将含有scFv和内部结构域序列的最终转基因序列插入从患者获得并在体外扩增的免疫效应细胞中。在以前的试验中，这些已经是一种具有细胞毒性的T细胞。将DNA插入效应细胞可以通过几种方法完成。最常见地，这是使用编码转基因的慢病毒来完成的。已经证明，假型自身失活的慢病毒被表明是将所需的转基因稳定插入靶细胞基因组DNA的有效方法。其他方法包括电穿孔和转染，但是由于转基因表达将随时间而减弱，它们的功效受到限制。然后，将基因修饰的效应细胞移植回患者体内。通常，此过程与已经表现出增强输注T细胞的作用的调理方案(诸如环磷酰胺)连同进行。此作用被归因于免疫空间小生境(niche)的创建。所述过程总的来说导致效应细胞，通常是可以以主要的主要组织相容性复合物非依赖性的方式识别肿瘤细胞抗原并引发细胞毒性应答的T细胞

C.慢性淋巴母细胞性白血病(CLL)

B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)也称为慢性淋巴样白血病(CLL)，是成人中最常见的白血病类型(白细胞癌症的类型)。CLL影响B细胞淋巴细胞，其来源于骨髓，在淋巴结中发育，并且通常通过产生抗体来对抗感染。在CLL中，B细胞生长失去控制，并积累在骨髓和血液中，它们在其中排挤健康的血细胞。CLL是小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)的一个分期，所述小淋巴细胞淋巴瘤是一种主要在淋巴结中呈现的B细胞淋巴瘤。CLL和SLL被认为是相同的基础性疾病，只是具有不同的外观。CLL是成人疾病。新诊断为CLL的大多数(>75％)人超过50岁，并且大多数为男人。然而，在极少数情况下，它可能发生在青少年并且偶尔在儿童中。其中一些可能与遗传性易患性相关。

大多数人被诊断为没有症状，是因为返回高白细胞计数的常规血液测试，但是随着CLL的进展，CLL导致淋巴结、脾和肝的肿胀，并且最终导致贫血和感染。早期CLL未治疗，而晚期CLL用化疗和单克隆抗体治疗。

DNA分析区分了两种主要类型的CLL，具有不同的存活时间。对于标志物ZAP-70阳性的CLL平均存活8年，而对于ZAP-70阴性的CLL平均存活超过25年。许多患有缓慢进展的疾病的患者，特别是年龄较大的患者可以放心，并且可能在其一生中不需要任何治疗。

大多数人被诊断为没有症状，是因为返回高白细胞计数的常规血液测试。不常见地，CLL可能存在淋巴结增大，而没有高白细胞计数或血液中无疾病证据。这被称为小淋巴细胞淋巴瘤。在一些个体中，仅在赘生性细胞压倒骨髓导致贫血产生疲劳或虚弱之后，才能发现疾病。

CLL经常首先被怀疑在全血计数(CBC)测试中存在淋巴细胞增多、白细胞类型增加。这经常是常规医师出诊的偶然发现。最经常的是淋巴细胞计数大于4000细胞/微升(μl)血液，但可以高得多。老年个体中存在淋巴细胞增多应该引起CLL的强烈怀疑，并且除非临床上不必要，否则应执行确诊诊断测试，特别是流式细胞术。

CLL的诊断是基于血液、骨髓或组织中B淋巴细胞异常群体的证明，其在细胞表面上展示出异常但特征性的分子模式。此非典型分子模式包括细胞表面标志物分化簇5(CD5)和分化23簇(CD23)的共表达。另外，一个个体内的所有CLL细胞是克隆的，即在遗传上相同。在实践中，这是通过仅检测在异常B细胞的全部群体上互相排斥的抗体轻链(κ或λ)中的一个来推断的。正常B淋巴细胞由大量的产生κ和λ表达细胞的混合物的不同抗体产生细胞组成。缺乏κ和λ产生B细胞的正常分布是证明克隆性的一个基础，克隆性是建立任何B细胞恶性肿瘤(B细胞非霍奇金淋巴瘤)诊断的关键因素。

需要外周血的显微镜检查和通过流式细胞术的淋巴细胞分析的组合以确认克隆性和标志物分子表达来建立CLL的诊断。两者都很容易在少量的血液上完成。流式细胞仪是可以在流体中单个细胞上检测分子表达的仪器。这需要使用具有仪器识别的荧光标记的标志物分子的特异性抗体。在CLL中，淋巴细胞是遗传克隆的B细胞谱系(表达标志物分子簇19(CD19)和CD20)，并且特征性地表达标志物分子CD5和CD23。这些B细胞在显微镜下类似于正常的淋巴细胞，虽然略小，并且当涂在玻片上时易碎，导致许多破碎的细胞，其被称为“破碎”细胞或“涂抹”细胞。

Matutes的CLL分数允许识别经典CLL的同类的亚群，其与五种标记物表达(CD5、CD23、FMC7、CD22和免疫球蛋白轻链)的非典型/混合CLL不同，Matutes的CLL分数系统对于经典CLL和其他B细胞慢性淋巴细胞增生性病症的区分诊断非常有帮助，但不适用于混合/非典型CLL和套细胞淋巴瘤(MCL恶性B细胞)之间的免疫学区别。通过加入非常规标志物(诸如CD54和CD200)可以改进CLL和MCL之间的鉴别。在常规标志物中，最具鉴别性的特征是CD20/CD23平均荧光强度比。相比之下，FMC7表达可能令人惊奇地对于边缘病例造成误导。

分期，确定疾病的程度，使用Rai分期系统或Binet分类(见详述)来完成，并且主要基于低血小板或红细胞计数的存在。早期疾病不需要治疗。

CLL治疗专注于控制疾病及其症状，而不是完全治愈。CLL通过化疗、放射疗法、生物疗法或骨髓移植来治疗。症状有时手术地治疗(移除增大的脾的脾切除术)或通过放射疗法(“去膨胀”肿胀的淋巴结)来治疗。

初始CLL治疗根据确切的诊断和疾病的进展而变化，甚至随着卫生保健从业者的偏好和经验而变化。数十种药物用于CLL疗法。包含氟达拉滨、环磷酰胺和利妥昔单抗(被称为FCR)的初始治疗方案已经证明了更高的总体应答率和完全应答率。

宾夕法尼亚大学的研究人员进行的一项研究使用遗传修饰的T细胞来攻击表达CD19蛋白的细胞以对抗疾病。2013年，研究人员宣布，59例患者中26例已经实现完全缓解，并且原来的病人一直无肿瘤。

白血病很少与妊娠有关，在10,000名孕妇中仅影响约1人。慢性淋巴细胞性白血病的治疗往往可以推迟到妊娠结束。如果必需治疗，则在不太可能导致妊娠丢失或出生缺陷的中期妊娠或晚期妊娠期间进行化疗。

虽然一般被认为是不可治愈的，但在大多数情况下，CLL进展缓慢。许多CLL患者多年来(在某些情况下，几十年)一直过着正常且积极的生活。由于其发作缓慢，早期CLL一般不进行治疗，因为认为早期CLL干预不会改进存活时间或生活质量。相反，随着时间的推移监测病情，以检测疾病模式的任何变化。

当患者的临床症状或血细胞计数表明疾病已进展到可能影响患者生活质量的程度时，做出开始CLL治疗的决定。临床“分期系统”(诸如Rai 4级系统和Binet分类)可以帮助确定何时以及如何治疗患者。确定何时开始治疗以及通过何种手段治疗往往很困难；研究表明，过早治疗疾病没有存活优势。国家癌症研究所工作组已经发布治疗指南，在启动前应满足具体的标志物。

组合化疗方案在新诊断CLL和复发性CLL中均有效。氟达拉滨与烷基化剂(环磷酰胺)的组合产生比单一试剂更高的应答率和更长的无进展存活：

FC(氟达拉滨与环磷酰胺)

FR(氟达拉滨与利妥昔单抗)

FCR(氟达拉滨、环磷酰胺和利妥昔单抗)

CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙)

虽然嘌呤类似物氟达拉滨表现出给予苯丙酸氮芥作为主要疗法的优异应答率，但是没有早期使用氟达拉滨改进总体存活的证据，保全一些临床医生更喜欢为复发性疾病预留氟达拉滨。

用FCR的化学免疫疗法在选择良好体能的CLL患者中在大型随机试验中表现出改进应答率、无进展存活和总体存活。这是首次证明一线疗法的选择可以改进CLL患者的总体存活的临床试验。批准用于CLL的烷基化剂包括苯达莫司汀和环磷酰胺。

靶向疗法在指定靶标处攻击癌细胞，其目的是不伤害正常细胞。CLL中使用单克隆抗体，诸如阿仑单抗(针对CD52)以及利妥昔单抗和奥法木单抗(针对CD20)。酪氨酸激酶抑制剂疗法也可用于CLL。2014年2月，FDA批准依鲁替尼(ibrutinib)用于治疗慢性淋巴细胞性白血病。依鲁替尼是Bruton的酪氨酸激酶(BTK)抑制剂。2014年7月，FDA和EMA批准艾代拉里斯(idelalisib)用于治疗不同类型的白血病。艾代拉里斯是一种靶向PI3Kδ途径的PI3K抑制剂。它通过口服摄取。

使用受体自身细胞的自体干细胞移植并不是治愈性的。年龄较小的个体，如果处于死于CLL的高风险，可考虑使用异源造血干细胞移植(HSCT)。清髓性(骨髓杀伤)形式的异源干细胞移植，是一种使用来自健康供体的血细胞的高风险治疗，其可能是治愈性的，但治疗相关的毒性是显著的。称为降低强度调理的异源干细胞移植的中间水平可被老年或体弱患者更好地耐受。

“难医治的”CLL是一种不再对治疗有利应答的疾病。在这种情况下，考虑更积极的疗法，包括来那度胺、夫拉平度(flavopiridol)和骨髓(干细胞)移植。单克隆抗体阿仑单抗(针对CD52)可用于具有难医治的基于骨髓的疾病的患者。

并发症包括里希特氏综合征，即导致复发感染、10-15％的患者出现温和的自身免疫性溶血性贫血、转变为高度淋巴瘤的低丙种球蛋白血症。慢性淋巴细胞性白血病在慢性淋巴细胞性白血病患者中可转变为里希特氏综合征，即快速生长的弥漫性大B细胞淋巴瘤、幼淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤或急性白血病的发展。CLL患者中的发病率估计约为5％。

胃肠(GI)参与很少可以与慢性淋巴细胞性白血病一起发生。一些报道的表现形式包括肠套叠、小肠细菌污染、结肠炎等。通常，CLL的GI并发症发生在里希特转变后。迄今为止，存在两例病例报道涉及慢性淋巴细胞性白血病，而没有里希特氏转变。

D.非小细胞肺癌

非小细胞肺癌(NSCLC)是除小细胞肺癌(SCLC)之外的任何类型的上皮性肺癌。作为一个分类，与小细胞癌相比，NSCLC对化疗相对不敏感。在可能的时候，尽管在术前(新辅助化疗)和手术后(辅助化疗)都越来越多地使用化疗，但它们还是主要以治愈意图通过手术切除进行治疗。

NSCLC最常见的类型是鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌，但是存在几种发生频率较低的其他类型，并且所有类型都可以发生在不寻常的组织学变体和混合细胞类型的组合中。有时，通常在不能进行更特异性的诊断时，从种属上说使用短语“非小细胞肺癌”(“未另外指定”或NOS)。当病理学家在细胞学或活检标本中检查少量恶性细胞或组织时，情况最为常见。

不吸烟者的肺癌几乎普遍是NSCLC，其中相当多数是腺癌。在相对罕见的情况下，发现恶性肺肿瘤含有SCLC和NSCLC二者的组分。在这些情况下，所述肿瘤应被分类为混合型小细胞肺癌(c-SCLC)，并且(通常)像“纯”SCLC一样来治疗。

肺腺癌目前是“不吸烟者”(终身未吸烟者)中最常见的肺癌类型。腺癌占肺癌的约40％。从历史上看，腺癌比小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌更常见于肺的外周，后两者往往更倾向于中心位置。然而，有趣的是，最近的研究表明，“中心到外周发生病变的比例”可能趋向于朝向腺癌和鳞状细胞癌的统一。

肺鳞状细胞癌(SCC)在男性中比在女性中更常见。它与吸烟史密切相关，比大多数其他类型的肺癌更加相关。根据护理健康研究，与不吸烟者相比，在以前持续吸烟1至20年和20至30年的人，SCC的相对风险约为5.5。以前持续吸烟30至40年的相对风险增加到约16，并且以前持续吸烟超过40年的相对风险增加到约22。

大细胞肺癌(LCLC)是来源于肺中的转化上皮细胞的未分化的恶性肿瘤的异质组。虽然较新的诊断技术似乎降低了“经典”LCLC的诊断发病率，有利于分化不良的鳞状细胞癌和腺癌，但LCLC通常占所有NSCLC的约10％。实际上，LCLC是“排除诊断”，因为肿瘤细胞缺乏可以将肿瘤分类为小细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌或肺癌的其他更具体的组织学类型的光学显微特征。LCLC与小细胞肺癌(SCLC)的区别主要在于更大的退行发育细胞、更高的细胞质-核大小比例以及缺乏“盐和胡椒样”染色质。

往往使用多于一种的治疗，这取决于癌症的分期、个体的总体健康、年龄、对化疗的应答以及其他因素(诸如治疗可能的副作用)。NSCLC通常对化疗和/或放射不太敏感，因此手术是在早期诊断时往往与涉及顺铂的辅助(附属)化疗一起的治疗选择。其他治疗选择包括化疗、放射疗法(放疗)和靶向疗法。

给予放射治疗的新方法使医生能够更准确地治疗肺癌。这意味着更少的放射影响附近的健康组织。新方法包括射波刀和立体定向放射外科(SRS)。其他治疗为射频消融术和化疗栓塞。

晚期(转移性)NSCLC中使用多种化疗。具有特定的EGFR基因突变的一些患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(诸如吉非替尼)有应答。约7％的NSCLC具有EML4-ALK易位；这些可能受益于临床试验中的ALK抑制剂。克唑替尼于2011年8月获得FDA批准。

E.胃癌

胃癌(Stomach cancer)或胃癌(gastric cancer)是从胃内膜发展的癌症。早期症状可包括胃灼热、上腹部疼痛、恶心和食欲不振。晚期体征和症状可包括体重减轻、皮肤发黄、呕吐、吞咽困难以及便血等。癌症可从胃扩散到身体其他部位，特别是肝、肺、骨骼、腹部内膜和淋巴结。胃癌的预后一般较差，因为肿瘤在发现时往往已经转移，并且事实上大部分具有所述病状的人在表现时都是老年人(中位年龄在70与75岁之间)。据报道胃癌的5年存活率低于10％。

最常见的原因是细菌幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的感染，其占病例的60％以上。某些类型的幽门螺杆菌具有比其他类型更大的风险。其他常见的原因包括食用腌渍蔬菜和吸烟。约10％的病例在家族中发生，并且1％与3％之间的病例是由于遗传自个人父母的遗传综合征(诸如遗传性弥漫性胃癌)大多数胃癌病例为胃细胞癌。这种类型可以分为多种亚型。淋巴瘤和间充质肿瘤也可能在胃内发展。大多数时候，胃癌多年来发展通过多个分期。诊断通常通过内窥镜检查期间进行的活检。然后，随后进行医学成像，以确定疾病是否已经扩散到身体的其他部位。日本和韩国，具有高疾病率的两个国家，筛查胃癌。

地中海饮食降低了癌症风险，停止吸烟也是如此。有试验性证据表明，治疗幽门螺杆菌会降低未来风险。如果早期治疗癌症，可以治愈许多病例。治疗可包括手术、化疗、放射疗法和靶向疗法的一些组合。如果治疗较晚，可建议姑息治疗。结果往往较差，且全球5年存活率低于10％。这主要是因为大多数患有所述病状的人出现晚期疾病。在美国，5年存活率为28％，而在韩国则为65％以上，部分由于筛选工作。

在全世界，胃癌是癌症的第五大起因以及癌症死亡的第三大原因，占病例的7％和死亡人数的9％。2012年，它在在950,000人中发生并且造成723,000例死亡。在20世纪30年代以前，在包括美国和英国在内的世界大部分地区，它是癌症死亡的最常见原因。此后，世界许多地区的死亡率一直在下降。这被认为是由于因为作为保持食物新鲜的方法的冷藏的发展，而食用更少的盐制和腌渍食物。胃癌最常发生于东亚和东欧，并且男性发生率往往为女性的两倍。

胃癌往往是无症状的(不产生明显症状)，或者可能仅在早期分期中引起非特异性症状(不仅对胃癌有特异性，对其他相关或不相关的病症也有特异性的症状)。当症状发生时，癌症往往已经进入晚期分期(见下文)，并且还可能已经转移(传播到身体的其他的也许是远处的部分)，这是预后相对较差的主要原因之一。早期癌症可能与消化不良或灼热感(胃灼热)有关。然而，由于消化不良进行内镜检查的每50人中有小于1人患有癌症。可能会发生腹部不适和食欲不振，尤其是对于肉类。

已经增大并入侵正常组织的胃癌可以引起虚弱、疲劳、饭后胃气胀、上腹部腹痛、恶心并偶尔呕吐、腹泻或便秘。进一步增大可导致体重减轻或出血伴随呕血或便血，后者显示为黑色变色(黑便)并且有时导致贫血。吞咽困难提示贲门肿瘤或胃肿瘤扩展到食道。

胃癌是一种多因素疾病。幽门螺杆菌感染在65-80％的胃癌中是主导风险因素，但是仅在此类感染的2％中是主导风险因素。幽门螺杆菌诱导胃癌的机制可能涉及慢性炎症或幽门螺杆菌毒力因子(诸如CagA)的作用。吸烟显著增加发展胃癌的风险，从当前吸烟者的风险增加40％增加到重度吸烟者的82％。由于吸烟引起的胃癌主要发生在食管附近胃部的上部。一些研究显示饮酒也增加风险。

膳食因素被证明不是原因，但是一些食物，包括熏制食物、盐和富盐食物、红肉、加工肉、腌渍蔬菜和蕨菜，都与较高的胃癌风险有关。腌肉中的硝酸盐和亚硝酸盐可以被某些细菌(包括幽门螺杆菌)转化成已被发现在动物中引起胃癌的化合物。另一方面，新鲜水果和蔬菜摄入、柑橘类水果摄入和抗氧化剂摄入与较低的胃癌风险有关。地中海饮食也与较低的胃癌发生率有关，定期的阿司匹林使用也与是如此。

碘缺乏与胃癌之间存在相关性。胃癌显示男性占优势，其在男性中发病率高达女性的两倍。雌激素可以保护妇女免受这种癌症形式的发展。大约10％的病例显示出遗传组分。

人们可能具有某些风险因素，诸如物理或遗传因素，其可以改变其对胃癌的易感性。肥胖症是一种已经被发现通过促进胃食管返流疾病(GERD)的发展来增加胃腺癌风险的此类物理风险因素。肥胖导致GERD的确切机制尚不完全清楚。研究假设，增加的膳食脂肪可能起作用，其导致胃和下食管括约肌由于过量的脂肪组织而压力增加，但还没有收集到统计学上显著的数据。然而，已经发现存在GERD的胃贲门腺癌的风险对于肥胖者增加了超过2倍。胃癌的遗传风险因素是称为遗传性弥漫性胃癌(HDGC)的CDH1基因的遗传缺陷。编码E-钙粘素的CDH1基因位于第16号染色体上。当基因经历特定突变时，胃癌通过尚未完全了解的机制来发展。这种突变被认为是常染色体显性，意味着携带者的孩子的一半可能会经历相同的突变。遗传性弥漫性胃癌的诊断通常在涉及家族成员的至少两例(如父母或祖父母)被诊断出时进行，其中至少有一例在50岁之前诊断出。如果家族中存在至少三个病例，在这种情况下不考虑年龄，也可以进行诊断。

国际癌症基因组联盟正在努力确定涉及胃癌的基因组变化。弥漫型胃癌的很小比例(见下文的组织病理学)来自遗传异常的CDH1基因。遗传测试和治疗选择适用于有风险的家族。

与风险增加有关的其他因素为AIDS、糖尿病、恶性贫血、慢性萎缩性胃炎、梅尼特里埃氏病(增生性分泌过度性胃病)和肠化生。

为了查找症状的原因，医生会询问患者的病史，进行身体检查，并且可安排实验室研究。胃镜检查是诊断方法的选择。这涉及将光纤照相机插入胃中以使其可视化。上胃肠道钡餐检查(可称为钡伦琴射线照相)。腹部的计算机断层摄影术或CT扫描可显示胃癌，但是对于确定入侵到相邻组织中或者存在扩散到局部淋巴结更有用。局灶的、偏心的和增强的超过1cm的壁增厚有利于恶性肿瘤。

在胃镜检查中看到的异常组织将由外科医生或胃肠病学家进行活检。然后将此组织送至病理学家用于在显微镜下组织学检查，以检验癌性细胞的存在。与随后的组织学分析一起的活检是确认癌细胞存在的唯一可靠方式。

已经开发了各种胃镜形态以用染料增加检测到的粘膜的产量，所述染料突出了细胞结构并且可以鉴定发育异常的区域。细胞内镜涉及超高的放大率，以使细胞结构可视化来更好地确定发育异常的区域。其他胃镜形态(诸如光学相干断层成像术)也正在针对类似应用进行研究性测试。

多种皮肤病状与胃癌有关。腋窝和腹股沟的皮肤变黑增生的病状(称为黑棘皮病)往往与腹内癌(诸如胃癌)有关。胃癌的其他皮肤表现形式现包括牛肚掌(tripe palms)(手掌皮肤的类似的变黑增生)和累-特二氏征(Leser-Trelat sign)，其是称为脂溢性角化病的皮肤病变的快速发展。可以执行各种血液测试，其包括检查贫血的全血计数(CBC)以及检查便血的粪便潜血测试。

在感染者中，至少在亚洲人中，除去幽门螺杆菌会降低胃癌的风险。低剂量的维生素，尤其是来自健康的饮食的维生素，降低胃癌的风险。以前的补充给药法的综述没有找到支持证据，并且可能是更差的结果。

胃癌难以治愈，除非在早期发现(在其开始扩散之前)。不幸的是，因为早期胃癌引起的症状很少，所以做出诊断时疾病通常已经晚期。胃癌的治疗可包括手术、化疗和/或放射疗法。在临床试验中正在研究新的治疗方法(诸如生物治疗)以及使用当前方法的改进方法。

手术仍然是胃癌唯一的治愈方法。在不同的手术技术中，内镜下粘膜切除术(EMR)是日本先驱的早期胃癌(肿瘤仅涉及粘膜)的治疗，但在美国的一些中心也可用。在这个程序中，使用电线环通过内镜将肿瘤与胃内膜(粘膜)一起从胃壁除去。优点在于它是比除去胃部要小得多的操作。内镜粘膜下剥离术(ESD)是日本先驱的类似技术，用于将大面积粘膜完整无损地切除。如果切除标本的病理检查显示肿瘤不完全切除或深度入侵，患者将需要正式的胃切除术。

那些在表现时患有转移性疾病的患者可接受姑息手术，而姑息手术仍然有争议性，由于手术本身并发症的可能性以及其可能延迟化疗的事实，到目前为止的数据大多是积极的，且用这种方法治疗的患者的存活率得到改进。

使用化疗治疗胃癌没有牢固建立的护理标准。不幸的是，胃癌对这些药物并不特别敏感，并且化疗(如果使用的话)通常用来姑息性地减小肿瘤的大小、缓解疾病的症状并增加存活时间。用于胃癌治疗的一些药物包括：5-FU(氟尿嘧啶)或其类似物卡培他滨、BCNU(卡莫司汀)、甲基-CNNU(司莫司汀)和多柔比星(阿霉素)以及丝裂霉素C，以及最近的顺铂和多西他赛，通常使用各种组合的药物。单独的和组合的这些不同药物的相对益处尚不清楚。临床研究人员已经探索了在手术前给予化疗以收缩肿瘤或者在手术后作为辅助疗法来破坏剩余的癌细胞的益处。近来，称为曲妥珠单抗的靶向治疗已经可用于化疗，用于治疗在其肿瘤细胞中过表达HER2基因的那些癌症。

放射疗法(也称为放疗)也可用于治疗胃癌，往往作为化疗和/或手术的辅助。

III.单克隆抗体及其生产

使用标准方法制备本文所述的单克隆抗体，然后进行筛选、表征和功能评估。对可变区进行测序，并且然后亚克隆到人表达载体中以产生嵌合抗体基因，然后将其表达和纯化。测试这些嵌合抗体的抗原结合、信号传导阻断和异种移植实验。

A.一般方法

应理解，结合LILRB的单克隆抗体将具有几种应用。这些包括生产用于检测和诊断癌症以及癌症疗法的诊断试剂盒。在这些情况下，可将此类抗体与诊断或治疗剂连接，在竞争性测定中将它们用作捕获剂或竞争剂，或者单独使用它们而不对其附接另外的试剂。抗体可以被突变或修饰，如下文进一步讨论。用于制备和表征抗体的方法在本领域是熟知的(参见，例如Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988；美国专利4,196,265)。

用于生成单克隆抗体(MAb)的方法一般与用于制备多克隆抗体的方法一起开始。这两种方法的第一步都是免疫适当的宿主。如本领域熟知的，用于免疫的给定组合物可以在其免疫原性方面不同。因此，往往需要增强宿主免疫系统，如通过将肽或多肽免疫原偶联到载体可实现的。示例性和优选的载体为钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白(诸如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白)也可以用作载体。将多肽与载体蛋白缀合的手段在本领域是熟知的，并且包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双偶氮联苯胺。也如本领域熟知的，通过使用称为佐剂的免疫应答的非特异性刺激剂可以增强特定免疫原组合物的免疫原性。示例性和优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(含有杀死的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫应答的非特异性刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。

用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫的动物而变化。可以使用多种途径来施用免疫原(皮下、肌肉内、皮内、静脉内和腹膜内)。多克隆抗体的生产可通过在免疫之后在各种点对免疫的动物的血液取样来监测。还可以给予第二加强注射。重复加强和滴定的过程，直至获得合适的滴度。当获得所需水平的免疫原性时，将免疫的动物放血且分离并保存血清，和/或可以使用所述动物来生成MAb。

免疫后，选择具有产生抗体潜力的体细胞，尤其是B淋巴细胞(B细胞)，用于MAb生成方案。这些细胞可从活检的脾或淋巴结或者从循环血液获得。然后将来自免疫动物的产生抗体的B淋巴细胞与永生的骨髓瘤细胞的细胞融合，所述骨髓瘤细胞一般是与免疫的动物相同的物种或人或人/小鼠嵌合细胞的骨髓瘤细胞。适用于杂交瘤产生融合程序的骨髓瘤细胞系优选是非抗体产生性的，具有高融合效率和致使它们不能在仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长的酶缺陷。可使用多种骨髓瘤细胞中的任一种，如本领域技术人员已知(Goding,65-66页,1986；Campbell,75-83页,1984)。

用于生成产生抗体的脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括在促进细胞膜融合的试剂(化学的或电的)的存在下以2:1的比例将体细胞与骨髓瘤细胞混合，尽管所述比例可分别在约20:1至约1:1之间变化。使用仙台病毒的融合方法已由Kohler和Milstein(1975；1976)描述，并且使用聚乙二醇(PEG)(诸如37％(v/v)PEG)的融合方法已由Gefter(1977)等描述。使用电诱导融合方法也是适当的(Goding,71-74页,1986)。融合程序通常在低频率(约1x 10^-6至1x 10^-8)下产生可行的杂交体。然而，这并不造成问题，因为通过在选择性培养基中培养，可行的融合杂交体与亲本输注的细胞(特别是正常将无限期分裂的输注的骨髓瘤细胞)区分开来。选择性培养基一般是含有阻断组织培养基中核苷酸的从头合成的试剂。示例性和优选的试剂为氨喋呤、甲氨蝶呤和偶氮丝氨酸。氨蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶二者的从头合成，而偶氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨喋呤或甲氨蝶呤时，培养基补充有次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用偶氮丝氨酸时，培养基补充有次黄嘌呤。如果B细胞来源是爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)转化的人B细胞系，则为了消除未与骨髓瘤融合的EBV转化细胞系，加入乌巴因。

优选的选择培养基是HAT或具有乌巴因的HAT。只有能够操作核苷酸补救途径的细胞能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶(例如次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT))中是有缺陷的，并且它们不能存活。B细胞可以操作此途径，但它们在培养中具有有限的生存期并且一般在约两周内死亡。因此，可以在选择性培养基中存活的唯一细胞是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂交体。当用于融合的B细胞的来源是EBV转化的B细胞时，如这里，乌巴因也用于杂交体的药物选择，因为EBV转化的B细胞对药物杀伤易感，而所使用的骨髓瘤配偶体被选择为具有乌巴因抗性。

培养提供了选择特异性杂交瘤的杂交瘤群体。通常，杂交瘤的选择通过以下来执行：在微量滴定板中单克隆稀释培养细胞，然后测试各个克隆上清液(约2-3周后)的所需的反应性。所述测定应当是敏感、简单且快速的，诸如放射性免疫测定、酶联免疫测定、细胞毒性测定、斑块测定、免疫酶斑测定等。然后将选定的杂交瘤进行系列稀释或通过流式细胞分选进行单细胞分选，并克隆到各个产生抗体的细胞系中，然后所述克隆可无限期地繁殖以提供mAb。可以两种基本方式将细胞系用于MAb生产。可以将杂交瘤的样品注射到(往往到腹膜腔中)动物(例如小鼠)中。任选地，在注射之前，将动物用烃(尤其是油，诸如姥鲛烷(降植烷))预致敏。当以这种方式使用人杂交瘤时，注射免疫受损小鼠(诸如SCID小鼠)以防止肿瘤排斥是最佳的。注射的动物发展分泌由融合细胞杂交体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后可以导出动物的体液(诸如血清或腹水液)以提供高浓度的MAb。各个细胞系也可以在体外培养，其中MAb被天然分泌到培养基中，从其中可以容易地以高浓度获得MAb。可替代地，人杂交瘤细胞系可以在体外用于在细胞上清液中产生免疫球蛋白。细胞系可适应于无血清培养基中的生长，以优化回收高纯度的人单克隆免疫球蛋白的能力。

如果需要的话，可使用过滤、离心和各种色谱方法(诸如FPLC或亲和色谱法)来进一步纯化由任何方式产生的MAb。本公开的单克隆抗体的片段可以通过包括用酶(诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化的方法和/或通过化学还原裂解二硫键从纯化的单克隆抗体中获得。可替代地，本公开所涵盖的单克隆抗体片段可以使用自动肽合成仪来合成。

还预期分子克隆方法可用于产生单克隆抗体。为此，RNA可以从杂交瘤细胞系和通过RT-PCR获得的抗体基因中分离并克隆到免疫球蛋白表达载体中。可替代地，由从细胞系分离的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌粒文库，并且通过使用病毒抗原淘选来选择表达适当抗体的噬菌粒。这种方法相对于常规杂交瘤技术的优点在于，可以在单次循环中产生并筛选大约10⁴倍的抗体，并且通过H和L链组合生成新的特异性，这进一步增加找到适当的抗体的机会。

各自以引用的方式并入本文的教导了用于本公开的抗体的生产的其他美国专利包括：美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法生产嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制品；和美国专利4,867,973，其描述了抗体-治疗剂缀合物。

B.本公开的抗体

根据本公开的抗体可以在第一种情况下通过它们的结合特异性来定义，所述抗体在这种情况下是针对LILRB的。本领域技术人员可以通过使用本领域技术人员熟知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力来确定此类抗体是否属于本权利要求的范围。在一方面，提供了如图22所示的具有来自重链和轻链的克隆配对的CDR的单克隆抗体。可使用本文所述的方法由下文实施例部分中讨论的克隆来产生此类抗体。

在第二方面，抗体可通过其可变序列来定义，所述可变序列包括额外的“框架”区域。这些由图21中编码或表示完整可变区的序列提供。此外，抗体序列可与这些序列不同，特别是在CDR外部的区域中。例如，核酸序列可与上文陈述的那些不同，其中(a)可变区可分开远离轻链和重链的恒定结构域，(b)核酸可与上文陈述的那些不同，同时不影响由此编码的残基，(c)核酸可以给定百分比(例如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的同源性而与上文陈述的那些不同，(d)核酸可由于在高严格条件下杂交的能力而与上文陈述的那些不同，所述高严格条件例如低盐和/或高温条件(诸如通过在约50℃至约70℃的温度下由约0.02M至约0.15M的NaCl提供的)，(e)氨基酸可以给定百分比(例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的同源性而与上文陈述的那些不同，或(f)氨基酸可通过允许保守取代(下文讨论)而与上文陈述的那些不同。上述各项适用于图21的核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开的抗体衍生物包括V_L和V_H结构域，其具有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守或非保守氨基酸取代，同时仍然表现出所需的结合和功能特性。

虽然本公开的抗体产生为IgG，但是它可用于修饰恒定区以改变它们的功能。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括30免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(C1q)。因此，术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及其亚型)类型的完整的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ型或λ型。在轻链和重链内，可变区与恒定区是通过具有约12个或更多个氨基酸的35“J”区加以接合，其中重链也包括具有另外约10个氨基酸的“D”区。一般参见FundamentalImmunology,第7章(Paul,W.编,第2版,Raven Press,N.Y.(1989)。

本公开还包括与编码本文公开的抗体的核酸杂交的核酸。一般而言，所述核酸在中严格条件或高严格条件下与编码本文公开的抗体以及编码维持特异性结合LILRB的能力的抗体的核酸杂交。当第一核酸分子的单链形式可以在适当的温度和溶液离子强度条件下与第二核酸分子退火时，第一核酸分子与第二核酸分子“可杂交”(参见Sambrook等人，同上)。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严格性”。典型的中严格杂交条件是在42℃下的40％甲酰胺与5X或6X SSC和0.1％SDS。高严格杂交条件是在42℃或任选地更高温度(例如57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下的50％甲酰胺、5X或6X SSC(0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠)。杂交要求两个核酸含有互补序列，虽然根据杂交的严格性，碱基之间有可能存在错配。用于核酸杂交的适当严格性取决于本领域中熟知的变量，核酸的长度和互补的程度。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越大，核酸可能杂交的严格性就越高。对于长度大于100个核苷酸的杂交体，已经得出了用于计算解链温度的方程式(参见Sambrook等人，同上)。为了与较短的核酸(例如寡核苷酸)进行杂交，错配的位置变得更加重要，并且寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrook等人，同上)。

C.抗体序列的工程

在各种实施方案中，可以由于多种原因(诸如改进的表达、根据的交叉反应性或减弱的靶外结合)来选择以工程改造鉴定的抗体的序列。以下是抗体工程相关技术的一般性讨论。

可培养杂交瘤，然后将细胞裂解，并提取总RNA。随机六聚体可与RT一起使用以生产RNA的cDNA拷贝，并且然后使用预期扩增所有人可变基因序列的PCR引物的多重混合物来执行PCR。PCR产物可以被克隆到pGEM-T Easy载体中，然后通过使用标准载体引物的自动化DNA测序进行测序。结合和中和的测定可使用从杂交瘤上清液中收集并使用蛋白G柱通过FPLC纯化的抗体来执行。重组的全长IgG抗体可通过将克隆载体的重链和轻链Fv DNA亚克隆到转染到293Freestyle细胞或CHO细胞中的IgG质粒载体中来生成，并且抗体从293细胞或CHO细胞上清液中纯化并收集。

在与最终cGMP制造过程相同的宿主细胞和细胞培养过程中产生的抗体的快速可用性具有减少过程发展程序的持续时间的潜力。Lonza已经开发了使用在CDACF培养基中生长的合并转染子的一般方法，用于在CHO细胞中快速生产少量(高达50g)的抗体。尽管比真正的瞬时系统略慢，但优点包括较高的产品浓度以及与生产细胞系相同的宿主和过程的使用。在一次性生物反应器中表达模型抗体的GS-CHO库的生长和生产率的实例：在以补料分批模式操作的一次性袋式生物反应器培养物(5L工作体积)中，在转染后9周内获得2g/L的收获抗体浓度。

抗体分子将包括片段(诸如F(ab’)、F(ab’)₂)，其例如通过蛋白水解裂解例如通过重组手段可产生的单克隆抗体或单链免疫球蛋白而产生。这种抗体衍生物是单价的。在一个实施方案中，此类片段可以彼此组合或与其他抗体片段或受体配体组合，以形成“嵌合”结合分子。重要的是，此类嵌合分子可含有能够结合相同分子的不同表位的取代基。

1.抗原结合修饰

在相关的实施方案中，抗体是所公开的抗体的衍生物，例如包含与所公开的抗体相同的CDR序列的抗体(例如嵌合或CDR移植的抗体)。可替代地，可希望进行修饰，诸如向抗体分子中引入保守变化。在做出此类改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。本领域中一般理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能方面的重要性(Kyte和Doolittle,1982)。人们认为，氨基酸的相对亲水特征有助于所得蛋白质的次级结构，其进而界定蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。

在本领域中还应理解，可以基于亲水性有效地制备类似氨基酸的取代。以引用的方式并入本文的美国专利4,554,101指出，由其蛋白质的相邻氨基酸的亲水性所决定的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学特性相关。如美国专利4,554,101中所详述的，以下亲水性值已被指定至氨基酸残基：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水的非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)，含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水的非芳族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水的芳族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。

应理解，氨基酸可以取代具有相似亲水性的另一种氨基酸并产生生物学或免疫学修饰的蛋白质。在此类变化中，优选亲水性值在±2以内的氨基酸取代，特别优选亲水性值在±1以内的氨基酸取代，并且更特别优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸取代。

如上所述，氨基酸取代一般基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员熟知的并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

本公开还涵盖同种型修饰。通过修饰Fc区以具有不同的同种型，可以实现不同的功能性。例如，改变成IgG₁可以增加抗体依赖性细胞毒性，切换到A类可以改进组织分布，并且切换到M类可以改进效价。

修饰的抗体可以通过本领域技术人员已知的任何技术制备，所述技术包括通过标准分子生物学技术的表达或多肽的化学合成。重组表达的方法在本文件的其他地方讨论。

2.Fc区修饰

本文公开的抗体也可以被工程改造以包括Fc区内的修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，诸如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或效应子功能(例如，抗原依赖性细胞毒性)。此外，可以化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分附接到抗体)或修饰本文公开的抗体以改变其糖基化，来再次改变所述抗体的一个或多个功能特性。这些实施方案中的每一个都在下文进一步详细地描述。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。本文公开的抗体还包括具有修饰的(或阻断的)Fc区以提供改变的效应子功能的抗体。参见例如美国专利5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。此类修饰可用于增强或抑制免疫系统的各种反应，且在诊断和治疗中具有可能的有益效果。Fc区的改变包括氨基酸变化(取代、缺失和插入)、糖基化或去糖基化以及加入多个Fc。Fc的改变也可以改变治疗性抗体中的抗体半衰期，能够减少给药频率，并且从而增加便利性并减少材料的使用。已经报道了这种突变以消除铰链区域中重链间二硫键的异质性。

在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中半胱氨酸残基的数量增加或减少。在美国专利5,677,425中进一步描述了这种方法。例如，改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数量，以促进轻链和重链的组装或者增加或降低抗体的稳定性。在另一个实施方案中，修饰抗体以增加其生物半衰期。各种方法都是可能的。例如，可以引入以下突变中的一个或多个：T252L、T254S、T256F，如美国专利6,277,375中所述。或者，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区域内改变抗体以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如美国专利5,869,046和6,121,022中所述。在又其他实施方案中，通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基以改变抗体的效应子功能来改变Fc区。例如，可以用不同的氨基酸残基替换选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322中的一个或多个氨基酸，使得抗体对效应子配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。在美国专利5,624,821和5,648,260中进一步详细描述了这种方法。

在另一个实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，以由此改变抗体固定补体的能力。在PCT公布WO94/29351中进一步描述了这种方法。在又另一个实例中，修饰Fc区以增加或降低抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰在以下位置的一个或多个氨基来增加或降低抗体对Fcγ受体的亲和力：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。在PCT公布WO 00/42072中进一步描述了这种方法。此外，已经描绘了对于FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的人IgG1上的结合位点，并且已经描述了具有改进的结合的变体。在位置256、290、298、333、334和339的特异性突变显示改进与FcγRIII的结合。另外，显示以下组合突变体以根据FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。

在一个实施方案中，修饰Fc区以通过修饰残基243和264来降低抗体介导效应子功能的能力和/或增加抗炎特性。在一个实施方案中，通过将位置243和264的残基改变为丙氨酸来修饰抗体的Fc区。在一个实施方案中，修饰Fc区以通过修饰残基243、264、267和328来降低抗体介导效应子功能的能力和/或增加抗炎特性。在再另一个实施方案中，抗体包含特定的糖基化模式。例如，可以制备未糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可改变抗体的糖基化模式，以例如增加抗体对抗原的亲和力或亲合力。可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成此类修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，导致去除可变区框架糖基化位点中的一个或多个，以由此消除所述位点处的糖基化。此种糖苷基化可增加抗体对抗原的亲和力或亲合力。参见例如美国专利5,714,350和6,350,861。

还可制备抗体，其中糖基化模式包括低岩藻糖化的或无岩藻糖化的聚糖，诸如在聚糖上具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖化的抗体或无岩藻糖化的抗体。抗体还可包括具有增加量的等分GlcNac结构的聚糖。已经证明此类改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。此类修饰可以通过例如在宿主细胞中表达抗体来完成，其中糖基化途径被遗传工程改造以产生具有特定糖基化模式的糖蛋白。这些细胞已经在本领域中进行描述，并且可以用作其中表达本发明的重组抗体的宿主细胞，以由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)-岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。通过使用两个替换载体在CHO/DG44细胞中靶向破坏FUT8基因来创建Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系(参见美国专利公布20040110704。作为另一个实例，EP 1 176 195描述了具有功能性破坏的编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因的细胞系，使得在此种细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1,6键相关酶而展示出低岩藻糖化。EP 1 176 195还描述了具有低酶活性或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)，所述酶活性用于向与抗体的Fc区结合的N-乙酰葡糖胺加入岩藻糖。PCT公布WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lec13细胞，其中将岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，还导致在所述宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化。具有修饰的糖基化特性的抗体也可以在鸡蛋中产生，如PCT公布WO 06/089231中所述的。可替代地，具有修饰的糖基化特性的抗体可以在植物细胞(诸如浮萍属(Lemna))中产生(美国专利7,632,983)。在美国专利6,998,267和7,388,081中公开了在植物系统中产生抗体的方法。PCT公布WO 99/54342描述了经工程改造以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))细胞系，使得在工程改造的细胞系中表达的抗体展示出增加的等分GlcNac结构，其导致抗体的ADCC活性增加。

可替代地，可以使用岩藻糖苷酶裂解抗体的岩藻糖残基；例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中除去岩藻糖残基。本文公开的抗体还包括在低等真核生物宿主细胞中产生的抗体，特别是真菌宿主细胞，诸如已被遗传工程改造以产生具有哺乳动物或人样糖基化模式的糖蛋白的酵母和丝状真菌。这些遗传修饰的宿主细胞相对于当前使用的哺乳动物细胞系的特定优点是控制在细胞中产生的糖蛋白的糖基化特性的能力，使得可以产生其中特定N-聚糖结构占优势的糖蛋白的组合物(参见，例如美国专利7,029,872和7,449,308)。这些遗传修饰的宿主细胞已被用于产生主要具有特定N-聚糖结构的抗体。

另外，由于真菌(诸如酵母或丝状真菌)缺乏产生岩藻糖化的糖蛋白的能力，所以在此类细胞中产生的抗体将缺乏岩藻糖，除非所述细胞被进一步修饰以包括用于产生岩藻糖化的糖蛋白的酶途径(参见例如PCT公布WO2008112092)。在具体实施方案中，本文公开的抗体还包括在低等真核生物宿主细胞中产生的抗体，并且所述抗体包含岩藻糖化和非岩藻糖化的杂合N-聚糖和复合N-聚糖，其包括等分和多触角物质，其包括但不限于N-聚糖，诸如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。在特定实施方案中，本文提供的抗体组合物可包含具有至少一种选自由以下组成的组的杂合N-聚糖的抗体：GlcNAc Man5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2；和NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。在特定方面，杂合N-聚糖是组合物中主要的N-聚糖物质。在另外的方面，杂合N-聚糖是特定的N-聚糖物质，其包含组合物中杂合N-聚糖的约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。

在特定实施方案中，本文提供的抗体组合物包含具有至少一种选自由以下组成的组的复合N-聚糖的抗体：GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在特定方面，复合N-聚糖是组合物中主要的N-聚糖物质。在另外的方面，复合N-聚糖是特定的N-聚糖物质，其包含组合物中复合N-聚糖的约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在特定实施方案中，所述N-聚糖是岩藻糖化的。一般而言，岩藻糖在N-聚糖还原端以α1,3-键与GlcNAc连接，在N-聚糖还原端以α1,6-键与GlcNAc连接，在N-聚糖非还原端以α1,2-键与GlcNAc连接，在N-聚糖非还原端以α1,3-键与GlcNAc连接或在N-聚糖非还原端以α1,4-键与GlcNAc连接。

因此，在上述糖蛋白组合物的特定方面，糖型呈产生选自由以下组成的组的糖型的α1,3-键或α1,6-键岩藻糖形式：

Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；糖型呈产生选自由以下组成的组的糖型的α1,3-键或α1,4-键岩藻糖形式：GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或者糖型呈产生选自由以下组成的组的糖型的α1,2-键岩藻糖形式：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。

在另外的方面，抗体包含高甘露糖N-聚糖，其包括但不限于Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2或由Man3GlcNAc2N-聚糖结构组成的N-聚糖。在上述的另外的方面，复合N-聚糖还包括岩藻糖化的和非岩藻糖化的等分和多触角物质。如本文中所用，术语“N-聚糖”和“糖型”可互换使用并且是指N-连接的寡糖，例如，由天冬酰胺-N乙酰葡糖胺键附接到多肽的天冬酰胺残基上的N-连接的寡糖。N-连接的糖蛋白含有与蛋白质中天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰葡糖胺残基。

D.单链抗体

单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合物，所述可变区用短(通常是丝氨酸、甘氨酸)接头连接在一起。此嵌合分子保留原始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区并引入了接头肽。这种修饰通常不会改变特异性。这些分子在历史上被创建以有助于噬菌体展示，其中它高度方便地将抗原结合结构域表达为单个肽。可替代地，可以直接由衍生自杂交瘤的亚克隆重链和轻链来创建scFv。单链可变片段缺少在完整抗体分子中发现的恒定Fc区，并且因此缺乏用于纯化抗体的常见结合位点(例如蛋白A/G)。这些片段往往可以使用蛋白L进行纯化/固定，因为蛋白L与κ轻链的可变区相互作用。

柔性接头一般由促进螺旋和转角的氨基酸残基(诸如丙氨酸(alaine)、丝氨酸和甘氨酸)构成。然而，其他残基也可以起作用。Tang等人(1996)使用噬菌体展示作为从蛋白质接头文库快速选择单链抗体(scFv)的定制接头的一种手段。构建了随机接头文库，其中重链和轻链可变结构域的基因通过编码可变组合物的18氨基酸多肽的片段进行连接。在丝状噬菌体上展示scFv抗体库(约5×10⁶个不同成员)，并用半抗原进行亲和选择。选定的变体的群体展现出显著增加的结合活性，但保留相当的序列多样性。筛选1054个单独的变体随后生成以可溶形式有效产生的催化活性的scFv。序列分析显示了在V_H C末端之后两个残基的接头中的保守脯氨酸和在其他位置的大量精氨酸和脯氨酸作为选定系链的唯一常见特征。

本公开的重组抗体还可涉及允许受体二聚化或多聚化的序列或部分。此类序列包括衍生自IgA的序列，其允许与J链连同形成多聚体。另一个多聚化域是Gal4二聚化结构域。在其他实施方案中，可用允许两种抗体组合的试剂(诸如生物素/抗生物素蛋白)来修饰链。

在单独的实施方案中，可以通过使用非肽接头或化学单元连接受体轻链和重链来创建单链抗体。一般而言，轻链和重链将在不同的细胞中产生，纯化，然后以适当的方式连接在一起(即，通过适当的化学桥将重链的N末端连接到轻链的C末端)。

交联剂用于形成分子桥，所述分子桥连接两个不同分子的官能团，例如稳定剂和凝结剂。然而，预期可以创建由不同类似物构成的相同的类似物或异聚复合物的二聚体或多聚体。为了以逐步的方式连接两种不同的化合物，可以使用消除不想要的均聚物形成的异双官能交联剂。

示例性的异双官能交联剂还有两个反应性基团：一个与伯胺基(例如N羟基丁二酰亚胺)反应，而另一个与硫醇基(例如吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)反应。通过伯胺反应性基团，交联剂可以与一种蛋白质(例如选定的抗体或片段)的赖氨酸残基反应，并且通过硫醇反应性基团，已经连接到第一种蛋白质的交联剂与另一种蛋白质(例如，选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基)反应。

优选采用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知许多类型的含二硫键的接头可以成功地用于缀合靶向剂和治疗/预防剂。含有空间位阻的二硫键的接头可证明在体内具有更高的稳定性，防止靶向肽在达到作用位点之前释放。因此，这些接头是一组连接剂。

另一种交联剂是SMTP，其是含有由相邻的苯环和甲基“空间位阻”的二硫键的双官能交联剂。据信二硫键的空间位阻具有保护键免受硫醇盐阴离子(诸如可能存在于组织和血液中的谷胱甘肽)攻击的作用，从而有助于防止在将附接的试剂递送至靶位点之前共轭物的去耦合。

与许多其他已知的交联剂一样，SMPT交联试剂具有交联官能团(诸如半胱氨酸或伯胺的SH(例如，赖氨酸的ε氨基))的能力。另一种可能类型的交联剂包括含有可裂解二硫键的异双官能光反应性叠氮苯，诸如硫代琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰胺基)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯氨基反应，而叠氮苯(在光解时)与任何氨基酸残基非选择性地反应。

除了位阻的交联剂之外，还可以采用与其一致的非位阻的接头。被认为不含有或生成受保护的二硫化物的其他有用的交联剂包括SATA、SPDP和2-亚氨基四氢噻吩(Wawrzynczak&Thorpe,1987)。此类交联剂的使用是本领域熟知的。另一个实施方案涉及柔性接头的使用。

美国专利4,680,338描述了双官能接头，其可用于产生具有含胺聚合物和/或蛋白质的配体的缀合物，尤其是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物。美国专利5,141,648和5,563,250公开了可裂解的缀合物，其含有在多种温和条件下可裂解的不稳定键。此接头特别有用，因为目标试剂可直接与接头结合，且裂解导致活性剂的释放。特定的用途包括向蛋白质(诸如抗体或药物)中加入游离氨基或游离巯基。

美国专利5,856,456提供了用于连接多肽组分以制备融合蛋白(例如单链抗体)的肽接头。接头长度高达约50个氨基酸，含有至少一次带电的氨基酸(优选精氨酸或赖氨酸)和随后的脯氨酸的发生，并且特征在于更高的稳定性和降低的聚集。美国专利5,880,270公开了可用于多种免疫诊断和分离技术的含氨氧基的接头。

E.纯化

在某些实施方案中，本公开的抗体可以是纯化的。如本文所用，术语“纯化”旨在指可与其他组分分离的组合物，其中蛋白质相对于其天然可获得的状态被纯化至任何程度。因此，纯化的蛋白质也指脱离其天然存在的环境的蛋白质。在使用术语“大致上纯化”时，这种表示是指如下组合物，其中蛋白质或肽形成组合物的主要组分，诸如构成组合物中的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的蛋白质。

蛋白质纯化技术为本领域技术人员所熟知。在一种水平上，这些技术涉及将细胞环境粗分级分离成多肽和非多肽部分。如果已经从其他蛋白质分离出多肽，则可使用色谱和电泳技术进一步纯化目标多肽，以实现部分或完全纯化(或纯化至均质)。特别适合于制备纯肽的分析方法是离子交换色谱，排阻色谱；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。蛋白质纯化的其他方法包括硫酸铵沉淀、PEG、抗体等或通过热变性，随后离心；凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱；以及这些和其他技术的组合。

在纯化本公开的抗体时，可能需要在原核或真核表达系统中表达多肽，并使用变性条件提取蛋白质。可以使用与多肽的标记部分结合的亲和柱，从其他细胞组分中来纯化多肽。如在本领域中一般已知的，认为进行各种纯化步骤的顺序可以改变，或者某些步骤可以省略，并且仍然导致制备大致上纯化的蛋白质或肽的合适方法。

常见地，利用结合抗体的Fc部分的试剂(即蛋白质A)来分级分离完整的抗体。可替代地，可使用抗原以同时纯化并选择适当的抗体。此类方法通常利用与支持物(诸如柱、过滤器或珠粒)结合的选择剂。抗体与支持物结合，除去污染物(例如洗去)，并且通过施加条件(盐，热等)来释放抗体。

按照本公开，用于定量蛋白质或肽的纯化程度的各种方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括，例如，确定活性部分的比活性，或通过SDS/PAGE分析来评估一个部分内的多肽的量。用于评估一个部分的纯度的另一种方法是计算所述部分的比活性，以将它与初始提取物的比活性比较，从而计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于所选择用来跟踪纯化的特定测定技术以及所表达的蛋白质或肽是否展示出可检测的活性。

已知多肽的迁移在不同SDS/PAGE条件下有时可以显著不同(Capaldi等人，1977)。因此，应了解在不同电泳条件下，纯化或部分纯化的表达产物的表观分子量可不同。

IV.癌症治疗

A.制剂和施用

本公开提供了包含抗LILRB抗体的药物组合物和用于产生所述抗体的抗原。此类组合物包含预防或治疗有效量的抗体或其片段和药学上可接受的载体。在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”意指由联邦监管机构或州政府批准的或者在美国药典或其他一般认可的药典上列出的，用于动物并且更具体地用于人。术语“载体”是指使用其来施用治疗剂的稀释剂、赋形剂和/或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，所述油包括石油、动物、植物或合成来源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是特定的载体。生理盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。其他适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。

如果需要，组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂或PH缓冲剂。这些组合物还可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、持续释放制剂等形式。口服制剂可以包括标准载体，诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物试剂的实例描述于“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。此类组合物将含有预防上或治疗上有效量的抗体或其片段(优选呈纯化形式)和适合量的载体以便提供用于适当施用至患者的形式。所述制剂应适用于以下施用方式：口服、静脉内、动脉内、颊内、鼻内、雾化、支气管吸入或通过机械通气递送。

如本文所述，本公开的抗体可以配制用于胃肠外施用，例如配制用于通过皮内、静脉内、肌内、皮下、肿瘤内或甚至腹膜内途径的注射。所述抗体可以另选地通过局部途径直接施用于粘膜，例如通过鼻滴、吸入或通过喷雾器。药学上可接受的盐包括酸式盐以及与无机酸(例如像盐酸或磷酸)或有机酸(诸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。由游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱(诸如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物)和有机碱(诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)。

抗体的被动转移，称为人工获得性被动免疫，一般涉及使用静脉内注射。抗体的形式可以是人或动物血浆或血清，如合并的人静脉内免疫球蛋白(IVIG)或肌内免疫球蛋白(IG)用途，如来自免疫的或来自疾病恢复的供体的高滴度人IVIG或IG，以及如单克隆抗体(MAb)。此类免疫一般只持续很短的时间段，并且也存在超敏反应和血清病(尤其是来自非人来源的γ-球蛋白的)的潜在风险。然而，被动免疫提供即时保护。抗体将配制在适合注射，即无菌且可注射的载体中。

一般而言，本公开的组合物的成分被分开供应或以单位剂型混合在一起供应，例如在指示活性剂的量的如安瓿或小药囊的气密性密封容器中呈干燥冻干粉末或无水浓缩物的形式。当组合物待通过输注施用时，所述组合物可用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶来分配。当组合物通过注射施用时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿以使得成分可在施用之前混合。

本公开的组合物可以中性形式或盐形式来配制。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，诸如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐；和与阳离子形成的盐，诸如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

B.组合疗法

还可能需要使用本公开的抗体连同额外的抗癌疗法来提供组合治疗。这些疗法将以有效实现一种或多种疾病参数减少的组合量来提供。所述过程可涉及同时使细胞/受试者与两种试剂/疗法接触，例如使用包含两种试剂的单一组合物或药物制剂，或者通过同时使细胞/受试者与两种不同的组合物或制剂接触，其中一种组合物包含抗体，而另一种包含另一种试剂。

可替代地，所述抗体可在其他治疗之前或之后间隔数分钟至数周。一般将会确保在每次递送时间之间的相当长的一段时间内不会过期，使得所述疗法仍然能够对细胞/受试者施加有利的组合作用。在此类情况下，预期在彼此的约12-24小时内、彼此的约6-12小时内，或者仅约12小时的延迟时间内，使细胞与两种形态接触。在一些情形下，可能需要显著延长治疗时期，然而其中各次施用之间经过数十天(2、3、4、5、6或7十天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。

还可以想到，将需要多于一种的施用抗DC-HIL抗体或另一种疗法。可采用各种组合，其中抗体为“A”，而另一种疗法为“B”，如下所示：

可预期其他组合。为了使用本发明的方法和组合物来杀死细胞、抑制细胞生长、抑制转移、抑制血管发生或以其他方式逆转或降低肿瘤细胞的恶性表型，可使靶细胞或位点与抗体和至少一种其他疗法接触。这些疗法将以有效杀死癌细胞或抑制癌细胞增生的组合量来提供。此过程可涉及使细胞/位点/受试者同时与试剂/疗法接触。

考虑用于与本公开的抗体组合治疗的特定试剂包括化疗和造血干细胞移植。化疗可包括除了诱导化疗之外的阿糖胞苷(ara-C)和蒽环类药物(大多数往往是柔红霉素)、单独的高剂量阿糖胞苷、全反式维甲酸(ATRA)，巩固疗法完成后的通常的蒽环霉素、二盐酸组胺(Ceplene)和白细胞介素2(Proleukin)，用于不适用高剂量化疗的60岁以上的复发性AML患者的吉妥珠单抗奥唑米星(Mylotarg)，氯法拉滨，以及靶向疗法诸如激酶抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨和MDR1(多药耐药蛋白)抑制剂，或三氧化二砷或复发性急性前髓细胞性白血病(APL)。

V.抗体缀合物

本公开的抗体可与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物。为了增加抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，常规的是连接或共价结合或复合至少一个所需的分子或部分。此种分子或部分可为但不限于至少一个报告分子。效应分子包含具有所需活性(例如细胞毒性活性)的分子。已经附接到抗体的效应分子的非限制性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗酶、放射性核素、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报告分子被定义为可使用测定检测到的任何部分。已经缀合到抗体的报告分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、光亲和分子、有色粒子或配体，诸如生物素。

抗体缀合物一般优选用作诊断剂。抗体诊断一般分为两类，即用于体外诊断的一类(诸如在各种免疫测定中)，以及用于体内诊断方案的一类(一般称为“抗体-定向成像”)。很多适当的成像剂在本领域是已知的，用于将它们附接到抗体的方法也是已知的(参见，例如美国专利5,021,236、4,938,948和4,472,509)。所使用的成像部分可以是顺磁离子、放射性同位素、荧光染料、NMR可检测的物质和X-射线显像剂。

在顺磁离子的情况下，可以以举例的方式提及离子诸如铬(Ⅲ)、锰(II)、铁(Ⅲ)、铁(II)、钴(Ⅱ)、镍(II)、铜(II)、钕(Ⅲ)、钐(Ⅲ)、镱(Ⅲ)、钆(Ⅲ)、钒(Ⅱ)、铽(Ⅲ)、镝(Ⅲ)、钬(Ⅲ)和/或铒(Ⅲ)，其中特别优选钆。可用于其他情况(诸如X射线成像)中的离子包括但不限于镧(Ⅲ)、金(Ⅲ)、铅(II)以及尤其铋(Ⅲ)。

在用于治疗应用和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，可以提及砹²¹¹、¹⁴碳、⁵¹铬、³⁶氯、⁵⁷钴、⁵⁸钴、铜⁶⁷、¹⁵²Eu、镓⁶⁷、³氢、碘¹²³、碘¹²⁵、碘¹³¹、铟¹¹¹、⁵⁹铁、³²磷、铼¹⁸⁶、铼¹⁸⁸、⁷⁵硒、³⁵硫、锝^99m和/或钇⁹⁰。¹²⁵I往往优选用于某些实施方案，并且锝^99m和/或铟¹¹¹也往往由于其低能量以及适合远距离检测而优选。本公开的放射性标记的单克隆抗体可根据本领域熟知的方法来生产。例如，单克隆抗体可以通过与碘化钠和/或碘化钾以及化学氧化剂(诸如次氯酸钠)或酶氧化剂(诸如乳过氧化物酶)接触而被碘化。根据本公开的单克隆抗体可通过配体交换过程而用锝^99m标记，例如通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上并将所述抗体施加到此柱。或者，可使用直接标记技术，例如通过温育高锝酸盐、还原剂(诸如SNCl₂)、缓冲溶液(诸如邻苯二甲酸钠-钾溶液)和抗体。往往用于将作为金属离子存在的放射性同位素结合到抗体的中间官能团是二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

预期用作缀合物的荧光标记包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、级联蓝、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明和/或德克萨斯红。

本发明中预期的另一种类型的抗体缀合物为主要旨在体外使用的抗体缀合物，其中所述抗体与二次结合配体和/或与显色底物接触连接时将产生有色产物的酶(例如，酶标签)。合适的酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的二次结合配体是生物素或抗生物素蛋白以及链霉亲和素化合物。此类标记的使用对于本领域技术人员是熟知的并且被描述在例如美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149以及4,366,241中。

分子与抗体的位点特异性附接的又另一种已知方法包括抗体与基于半抗原的亲和标记的反应。基本上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的氨基酸反应，从而破坏此位点并阻断特异性抗原反应。然而，这可能不是有利的，因为它导致抗体缀合物的抗原结合丧失。

含有叠氮基的分子还可通过由低强度紫外线所生成的反应性氮宾中间体而用于与蛋白质形成共价键(Potter和Haley,1983)。具体地，嘌呤核苷酸的2-和8-叠氮基类似物已被用作位点定向光探针来识别在细胞粗提取物中的核苷酸结合蛋白(Owens&Haley,1987；Atherton等人，1985)。所述2-和8-叠氮基核苷酸还已被用于绘制纯化蛋白的核苷酸结合区的图谱(Khatoon等人，1989；King等人，1989；Dholakia等人，1989)并且可被用作抗体结合剂。

用于将抗体附接或缀合到其缀合部分的若干方法在本领域是已知的。一些附接方法涉及金属螯合物的使用，采用例如附接所述抗体的有机螯合剂，诸如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；亚乙基三胺四乙酸；N-氯-对-甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(美国专利4,472,509和4,938,948)。单克隆抗体还可在偶联剂(诸如戊二醛或高碘酸盐)的存在下与酶反应。具有荧光素标志物的缀合物在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸盐反应来制备。在美国专利4,938,948中，乳腺瘤的成像使用单克隆抗体来实现，并且使用接头(诸如甲基-对-羟基苯酰亚胺酸酯(methyl-p-hydroxybenzimidate)或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)-丙酸酯)来将可检测的成像部分结合到所述抗体。

在其他实施方案中，预期通过使用不改变抗体结合位点的反应条件来选择性地在免疫球蛋白Fc区中引入巯基而进行免疫球蛋白的衍生化。公开了根据此方法学产生的抗体缀合物展示了改进的寿命、特异性和敏感性(美国专利5,196,066，其以引用的方式并入本文)。其中报告分子或效应分子缀合到Fc区中的碳水化合物残基的所述效应分子或报告分子的位点特异性附接也已经公开在文献中(O'Shannessy等人，1987)。已经报道了这种方法产生当前正在进行临床评估的诊断上和治疗上有希望的抗体。

VI.免疫检测方法

在再另外的实施方案中，本公开涉及用于结合、纯化、除去、定量和/或一般以其他方式检测LILRB相关的癌症的免疫检测方法。虽然此类方法在传统意义上可以应用，但另一种用途将是疫苗和其他病毒原液的质量控制和监测，其中根据本公开的抗体可用于评估病毒中H1抗原的量或完整性(即，长期稳定性)。或者，所述方法可用于针对适当/所需的反应性特性来筛选各种抗体。

一些免疫检测方法包括，举几个例子，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、免疫放射性测定、荧光免疫测定、化学发光测定法、生物发光测定法以及蛋白质印迹。具体地，还提供了用于检测和定量LILRB的竞争性测定。各种有用的免疫检测方法的步骤已经在科学文献中描述，例如像，Doolittle和Ben-Zeev(1999)，Gulbis和Galand(1993)，De Jager等人(1993)，以及Nakamura等人(1987)。一般而言，免疫结合方法包括获得疑似含有LILRB相关的癌症的样品，以及根据情况，在有效允许形成免疫复合物的条件下，使所述样品与根据本公开的第一抗体接触。

这些方法包括用于从样品中检测或纯化LILRB或LILRB相关的癌细胞的方法。抗体将优选与固体支持物(诸如呈柱基质的形式)连接，并且将疑似含有LILRB相关的癌细胞的样品施加至固定抗体。从柱上洗去不想要的组分，留下表达LILRB的细胞与固定抗体免疫复合，然后通过从柱上除去生物体或抗原来收集所述固定抗体。

免疫结合方法还包括用于检测和定量样品中LILRB相关的癌细胞或相关的组分的量的方法以及在结合过程期间形成的任何免疫复合物的检测和定量。在这里，将获得疑似含有LILRB相关的癌细胞的样品，并将所述样品与结合LILRB或其组分的抗体接触，随后在指定条件下检测并定量所形成的免疫复合物的量。在抗原检测方面，分析的生物样品可以是疑似含有LILRB相关的癌症的任何样品，诸如组织切片或标本、均质组织提取物、生物流体(包括血液和血清)或分泌物(诸如粪便或尿液)。

使所选择的生物样品与所述抗体在有效条件下接触足够允许免疫复合物(初次免疫复合物)形成的一段时间一般是这样一件事：简单地将抗体组合物加入样品中，并且温育所述混合物足够长的一段时间以使所述抗体形成免疫复合物(即与LILRB结合)。这段时间之后，一般会洗涤样品-抗体组合物(诸如组织切片、ELISA板、斑点印迹或蛋白质印迹)，以除去任何非特异性结合的抗体种类，仅允许检测特异性结合在初次免疫复合物内的那些抗体。

一般而言，免疫复合物形成的检测在本领域是熟知的并且可以通过应用多种方法来实现。这些方法一般基于标记或标志物(诸如那些放射性、荧光、生物和酶标签中的任一种)的检测。涉及此类标记的使用的专利包括美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。当然，如本领域已知的，通过使用二次结合配体(诸如第二抗体和/或生物素/抗生物素蛋白配体)结合布置，可以发现额外的优点。

在所述检测中采用的抗体本身可与可检测的标记连接，其中然后将会简单地检测这个标记，从而允许确定组合物中初次免疫复合物的量。可替代地，变成结合在初次免疫复合物内的第一抗体可通过具有对所述抗体的结合亲和力的第二结合剂配体来检测。在这些情况下，所述第二结合配体可与可检测的标记连接。所述第二结合配体自身往往是抗体，因此其可以被称为“二次”抗体。使所述初次免疫复合物与标记的二次结合配体或抗体在有效条件下接触足够允许二次免疫复合物形成的一段时间。然后一般洗涤所述二次免疫复合物以除去任何非特异性结合的标记的二次抗体或配体，并且然后检测在二次免疫复合物中剩余的标记。

另外的方法包括通过两步方法检测初次免疫复合物。如上所述，使用具有对所述抗体的结合亲和力的第二结合配体(诸如抗体)来形成二次免疫复合物。洗涤之后，使所述二次免疫复合物与具有对第二抗体的结合亲和力的第三结合配体或抗体再次在有效条件下接触足够允许免疫复合物(三次免疫复合物)形成的一段时间。将第三配体或抗体与可检测的标记连接，允许检测因此形成的三次免疫复合物。如果需要，这个系统可以提供信号放大。

一种免疫检测方法使用两种不同的抗体。第一生物素化的抗体被用于检测靶抗原，而然后将第二抗体用于检测附接到复合生物素的生物素。在所述方法中，待测试的样品首先在包含第一步骤抗体的溶液中温育。如果存在靶抗原，则一些所述抗体结合到所述抗原以形成生物素化的抗体/抗原复合物。然后通过在链霉亲和素(或抗生物素蛋白)、生物素化DNA和/或互补的生物素化DNA的连续溶液中温育来扩增所述抗体/抗原复合物，其中每个步骤将额外的生物素位点加入抗体/抗原复合物中。重复所述扩增步骤直到实现合适的扩增水平，在此时，在含有对抗抗生物素的第二步骤抗体的溶液中温育所述样品。将这个第二步骤抗体例如用酶来标记，所述酶可以用于通过使用发色团底物的组织酶学来检测抗体/抗原复合物的存在。在合适扩增的情况下，可以产生宏观可见的缀合物。

免疫检测的另一种已知的方法利用了免疫-PCR(聚合酶链式反应)的方法学。所述PCR方法与取决于用生物素化DNA温育的Cantor方法类似，然而，所述PCR方法用低pH或高盐缓冲液洗掉DNA/生物素/链霉亲和素/抗体复合物来释放抗体，而不是使用多次链霉亲和素和生物素化DNA温育。然后将所得的洗涤溶液用于执行用合适引物且在适当控制下的PCR反应。至少在理论上，可以利用PCR的巨大扩增能力和特异性来检测单个抗原分子。

1.ELISA

免疫测定，在其最简单和直接意义上，是结合测定。某些优选的免疫测定是本领域已知的各种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也特别有用。然而，应容易地了解，检测不限于此类技术，并且也可以使用蛋白质印迹、斑点印迹、FACS分析等。

在一个示例性的ELISA中，将本公开的抗体固定在展示蛋白质亲和性的选定表面上，诸如聚苯乙烯微量滴定板中的孔。然后，将意思含有LILRB相关的癌细胞的测试组合物加入孔中。在结合并洗涤以除去非特异性结合的免疫复合物后，可检测到结合的抗原。可通过加入与可检测标记连接的另一种抗LILRB抗体来实现检测。这种ELISA是简单的“夹心ELISA”。检测也可通过加入第二抗LILRB抗体，随后加入对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来实现，其中所述第三抗体与可检测标记连接。

在另一个示例性ELISA中，将疑似含有LILRB相关的癌细胞的样品固定在孔表面上，并且然后与本公开的抗LILRB抗体接触。在结合并洗涤以除去非特异性结合的免疫复合物后，可检测到结合的抗LILRB抗体。当初始抗LILRB抗体与可检测标记连接时，可直接检测到免疫复合物。再次，可使用对第一抗LILRB抗体具有结合亲和力的第二抗体来检测免疫复合物，其中第二抗体与可检测标记连接。

不管采用的形式如何，ELISA具有某些共同的特征，例如涂覆、温育和结合、洗涤以除去非特异性结合的物质以及检测结合的免疫复合物。这些在下文描述。

在用抗原或抗体涂覆平板时，一般将板的孔与抗原或抗体的溶液温育过夜或持续指定的时间段。然后洗涤所述板的孔以除去不完全吸附的材料。然后用关于测试抗血清抗原性中性的非特异性蛋白质“涂覆”所述孔的任何剩余的可用表面。这些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。所述涂覆允许阻断固定表面上的非特异性吸附位点，并因此降低由抗血清非特异性结合到表面上引起的背景。

在ELISA中，使用二次或三次检测手段而不是直接程序可能更为习惯。因此，在将蛋白质或抗体结合到孔、用非反应性材料涂覆以减少背景并洗涤以除去未结合的材料之后，使固定表面在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下与待测试的生物样品接触。然后检测免疫复合物需要标记的二次结合配体或抗体，以及与标记的三次抗体或第三结合配体连同的二次结合配体或抗体。

“在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下”意指所述条件优选包括用溶液(诸如BSA、牛γ球蛋白(BGG)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)/吐温)稀释抗原和/或抗体。这些加入的试剂也倾向有助于减少非特异性背景。

“合适的”条件也意指温育在足以允许有效结合的温度或一段时间内。温育步骤通常为约1至2至4小时左右，优选在25℃至27℃的温度下，或者可在约4℃左右过夜。

在ELISA中的所有温育步骤之后，洗涤接触表面以便除去非复合材料。优选的洗涤程序包括用溶液(诸如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液)洗涤。在测试样品与原始结合材料之间形成特异性免疫复合物并随后洗涤之后，可确定甚至微量的免疫复合物的发生。

为了提供检测手段，第二或第三抗体将具有有关的标记以允许检测。优选地，所述标记将是在与适当的显色底物温育时会产生颜色显影的酶。因此，例如，将需要在有利于进一步形成免疫复合物的显影的条件下使第一和第二免疫复合物与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀合的抗体接触或一起温育一段时间(例如，在含PBS的溶液(诸如PBS-吐温)中在室温下温育2小时)。

在与标记的抗体一起温育并随后洗涤以除去未结合的物质之后，例如在过氧化物酶作为酶标记的情况下通过与显色底物(诸如尿素或溴甲酚紫或2,2'-连氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)或H₂O₂)一起温育来定量标记的量。然后通过例如使用可见光谱分光光度计测量生成颜色的程度来实现定量。

2.蛋白质印迹

蛋白质印迹(或者，蛋白质免疫印迹)是用于检测组织匀浆或提取物的给定样品中特异性蛋白质的分析技术。它使用凝胶电泳将天然蛋白质或变性蛋白质分离成多肽长度(变性条件)或蛋白质的3-D结构(天然/非变性条件)。随后将所述蛋白质转移到膜(通常为硝酸纤维素膜或PVDF)，其中使用对靶蛋白质具有特异性的抗体进来探测(检测)它们。

样品可取自完整组织或细胞培养物。在大多数情况下，首先使用掺混器(用于更大的样品体积)、使用均质器(较小体积)或通过超声处理将固体组织机械破碎。也可以通过上述机械方法之一来破碎细胞。然而，应注意，细菌、病毒或环境样品可以是蛋白质的来源，因此，蛋白质印迹不仅限于细胞研究。可采用各种洗涤剂、盐和缓冲剂来促进细胞裂解并溶解蛋白质。往往加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止其自己的酶消化样品。组织制备往往在低温下进行，以避免蛋白质变性。

使用凝胶电泳来分离样品的蛋白质。蛋白质的分离可通过等电点(pI)、分子量、电荷或这些因素的组合来进行。分离的性质取决于样品的处理和凝胶的性质。这是确定蛋白质非常有用的方式。也可能使用二维(2-D)凝胶，其将来自单个样品的蛋白质在两个维度上扩散。根据第一维中的等电点(它们具有中性净电荷的pH)并且根据其在第二维度中的分子量来分离蛋白质。

为了使蛋白质能够进行抗体检测，将其从凝胶内移动到由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的膜上。将所述膜放置在凝胶上，并将一叠滤纸放置在膜上。将整叠放置在缓冲溶液中，所述缓冲溶液通过毛细作用向纸上方移动，使蛋白质与其一起移动。用于转移蛋白质的另一种方法称为电印迹，并使用电流将蛋白质从凝胶中拉入PVDF或硝酸纤维素膜内。蛋白质从凝胶内移动到膜上，同时保持其凝胶内具有的构成。作为这种印迹过程的结果，蛋白质被暴露在薄的表面层上用于检测(见下文)。根据膜的非特异性蛋白质结合性质(即，同样良好地结合所有蛋白质)，来选择两种膜。蛋白质结合基于疏水相互作用，以及膜与蛋白质之间的带电相互作用。硝酸纤维素膜比PVDF便宜，但是要脆弱得多，并且不能很好地支持重复探测。可以通过用考马斯亮蓝或丽春红S染料染色所述膜来检查蛋白质从凝胶转移到膜的均匀性和总体有效性。一旦转移，使用标记的初次抗体或未标记的初次抗体来检测蛋白质，接着使用标记的蛋白质A或与储存抗体的Fc区结合的二次标记的抗体进行间接检测。

3.免疫组织化学

本公开的抗体还可与新鲜冷冻的组织块和/或制备用于免疫组织化学(IHC)研究的福尔马林固定石蜡包埋的组织块连同使用。由这些颗粒标本制备组织块的方法已经成功地用于以前的各种预后因素的IHC研究中，并且是本领域技术人员所熟知的(Brown等人，1990；Abbondanzo等人，1990；Allred等人，1990)。

简单而言，冷冻切片可通过以下来制备：在小塑料胶囊中在室温下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中将50ng冷冻的“粉碎”组织再水化；通过离心使粒子造粒；将它们重悬于粘性包埋培养基(OCT)中；通过离心翻转胶囊和/或再次造粒；在-70℃异戊烷中快速冷冻；切割塑料胶囊和/或除去组织的冷冻圆筒；将组织圆筒固定在恒冷箱切片机卡盘上；和/或从胶囊中切割25-50个连续切片。可替代地，整个冷冻组织样品可用于连续切片切割。

永久切片可通过类似的方法来制备，所述方法涉及在塑料微量离心管中再水化50mg样品；造粒；重悬在10％福尔马林中4小时固定；洗涤/造粒；重悬在温热的2.5％琼脂中；造粒；在冰水中冷却以使琼脂硬化；从管中去除组织/琼脂块；将块浸入和/或包埋到石蜡中；和/或切割多达50个连续永久切片。同样，整个组织样品也可被取代。

4.免疫检测试剂盒

在再另外的实施方案中，本公开涉及用于与上文所述的免疫检测方法一起使用的免疫检测试剂盒。由于抗体可用于检测LILRB相关的癌细胞，所以抗体可包括在试剂盒中。因此，免疫检测试剂盒将在合适的容器装置中包含结合LILRB的第一抗体和任选的免疫检测试剂。

在某些实施方案中，抗体可预结合到固体支持物，诸如微量滴定板的柱矩阵和/或孔。试剂盒的免疫检测试剂可为多种形式中的任一种，包括与给定抗体有关和/或连接的那些可检测标记。还涵盖与二次结合配体有关和/或附接到二次结合配体的可检测标记。示例性二次配体是具有对第一抗体的结合亲和力的那些二次抗体。

用于在本发明试剂盒中使用的另外的合适免疫检测试剂包括双组分试剂，其包含具有对第一抗体的结合亲和力的二次抗体、连同具有对第二抗体的结合亲和力的第三抗体，所述第三抗体与可检测标记连接。如上文所述，做种示例性标记在本领域是已知的，并且所有此类标记可与本公开一起使用。

所述试剂盒还可包含合适等分的无论标记或未标记的LILRB的组合物，因其可用来制备用于检测测定的标准曲线。所述试剂盒可含有呈完全缀合形式、呈中间体形式或作为待由试剂盒的使用者来缀合的单独部分的抗体-标记缀合物。所述试剂盒的组分可在水性介质中包装或包装成冻干的形式。

所述试剂盒的容器装置一般将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，在其中可放置所述抗体或优选合适地等分所述抗体。本公开的试剂盒通常还将包括用于将抗体、抗原和/或任何其他试剂容器容纳在封闭限制中用于商业销售的装置。这些容器可包括注射容器或吹塑成型的塑料容器，在其中保持有所需的小瓶。

VII.实施例

包括以下实施例以证明优选的实施方案。本领域技术人员应理解以下实施例中公开的技术表示由本发明人发现的在实施方案的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，按照本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的指定实施方案中做出许多改变。

实施例1

LILRB和LAIR1在AML细胞(包括AML-SC)上高度表达，并且它们的表达与AML患者的存活负相关。本发明人分析了LILRB1-4对人类AML患者的表面表达，并且发现它们以这些患者的显著百分比来表达(图1，上图)。，LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4分别在总共37个测试的人类AML病例中的8、8、12和18个中表达。包括LILRB4的LILRB可以与白血病干细胞标志物CD34共表达(图1，下图)。本发明人的计算机分析表明，几个密切相关的LILRB家族成员(LILRB1、LILRB2、LILRB3和LILRB4以及LAIR1)的表达与AML患者的总体存活负相关(图2)。这些受体在人类AML细胞上比在正常对应物上更高地表达。重要的是，LILRB⁺/LAIR1⁺细胞因为AML-SC的活性而得到富集(Kang等人，出版中)。

LILRB和LAIR1对于人类白血病细胞的生长和异种移植是至关重要的。为了研究LILRB和LAIR1在人类白血病中的潜在功能，本发明人在具有这些受体(包括MV4-11(AML)、THP-1(AML)、U937(AML)、697(B-ALL)、Kasumi2(B-ALL)和RCH-ACV(B-ALL))的高水平的表面表达的人类白血病细胞系中单独使用shRNA敲低LILRB和LAIR1的表达。各个LILRB2、LILRB3、LILRB4或LAIR1表达的沉默显著地抑制细胞生长。来自THP-1和MV4-11的代表性数据，即具有重排的MLL基因的两个AML细胞系在图3中示出。重要的是，在7种原代人类AML样品中的任一种中，抑制LILRB或LAIR1的表达几乎完全消除了异种移植NSG小鼠中的白血病发展(Kang等人，出版中)。这些结果表明，几种LILRB对于人类AML细胞的生长至关重要。

为了获得对LILRB支持AML发展的机制的更深入的了解，本发明人研究了LILRB3-无效、LILRB4-无效或LAIR1-无效小鼠中的急性白血病发展(Tang等人，2012；Rojo等人，2000，Zheng等人，2012)。这些小鼠具有正常血细胞生成和HSC活性(Tang等人，2012；Rojo等人，2000，Zheng等人，2012)。本发明人在此研究中使用了MLL-AF9、AML1-ETO或N-Myc移植AML或急性淋巴母细胞性白血病(ALL)小鼠模型(Sugihara等人，2011；Kristov等人，2006；Somervaille和Clearly,2006；Yan等人，2006)。移植LILRB-无效或LAIR1-无效白血病细胞的小鼠在连续移植后疾病发展得比对照组慢，并且最终没有白血病。LILRB-无效或LAIR1-无效表型的AML-SC富集细胞的存活和自我更新随时间而下降，而其分化能力增加。本发明人还发现SHP-1和CAMKI是AML-SC中LILRB/LAIR1信号传导途径中的关键组分(Kang等人，出版中)。这些结果表明，LILRB和LAIR1支持AML-SC的活性。

鉴定抗LILRB单克隆抗体(mAb)。本发明人通过在蛋白质印迹(图4)和流式细胞术(图5)中与LILRB的结合开发了针对各个LILRB的抗体。

由于没有LILRB/LAIR1介导的信号传导的报告基因，本发明人生成了稳定的嵌合受体报告细胞系统，以测试抗体结合LILRB或LAIR1的细胞外结构域(ECD)的能力，并触发配对的免疫球蛋白样受体的嵌合融合细胞内结构域的活化或抑制，所述免疫球蛋白样受体β通过衔接子DAP-12发出信号以激活NFAT启动子驱动的GFP表达(图6右图和图7左图)。此报告系统用作使我们能够筛选阻断抗体和刺激抗体的敏感替代品。

使用此系统，本发明人鉴定了一组抑制LILRB2-4信号传导活化的新型单克隆抗体(mAb)(图6-7)。例如，可溶性抗LILRB4mAb(包括C84、C53、C92、C201)在LILRB4的嵌合受体报告系统中抑制GFP诱导(图7)。

抗LILRB mAb阻断白血病发展。本发明人鉴定了在异种移植模型中有效阻断AML发展的几种抗LILRB mAb。例如，C84，一种抗LILRB4mAb在异种移植小鼠模型中阻断AML发展。在这些模型中，本发明人经皮下(sc)或静脉内(iv)将人白血病细胞THP-1或MV4-11(如图8-9所示LILRB4表面表达阳性)或来自三个单独患者的原代人AML细胞移植到免疫缺陷型NSG小鼠中(图10-13为植入异种移植模型的AML细胞系；图14-18为患者AML异种移植模型)。相比之下，如果LILRB4不被癌细胞表达，则C84施用不抑制癌症发展(图13)。因此，抗LILRB4mAb C84对表达LILRB4的人类AML的发育具有明显的特异性抑制作用。重要的是，使用不同异种移植模型的6个独立实验给出了类似的结果。

除了C84之外，本发明人还鉴定了在异种移植模型中具有抗白血病作用的抗LILRB的额外的九个mAb，即C201、C53、C92、C39、C3、C193、C290、C102和C287。这些mAb的抗白血病效力和交叉反应性总结在图19中。

有效抑制白血病发展的mAb可变区的同种分型和测序。本发明人获得了mAb C84、C201、C53、C92、C39、C3、C193、C290、C102和C287的可变区的同种型和测序(图20-22)。

嵌合抗体的生产以及抗白血病效力的证明。为了表达嵌合抗体，本发明人将小鼠mAb的可变区亚克隆到编码人恒定区的表达载体中，并转染到293T细胞中。本发明人从经转染的293T细胞收集条件培养基并纯化嵌合抗体。图23示出了如通过SDS-PAGE所测定，嵌合抗C84(嵌合ab MHC-C84)的表达和纯化。

本发明人比较了嵌合抗体和原始mAb的LILRB结合、信号传导阻断和白血病抑制活性。如通过流式细胞术所测定，嵌合ab MHC-C84分别如C84一样结合THP-1细胞上的LILRB4(图24)以及LILRB4嵌合受体报告细胞上的LILRB4(图25)。本发明人还发现，如通过嵌合受体报告测定所测定，嵌合ab MHC-C84如C84一样是LILRB4的阻断抗体(图26)。最重要的是，如通过流式细胞术分析AML异种移植小鼠的肝、骨髓、脾和外周血(图27)或者通过AML异种移植小鼠中肿瘤随着时间发展的发光成像(图28)所确定的，嵌合ab MHC-C84在异种移植模型中抑制AML发展(具有与原始mAb C84相同或更好的效果)。引人注意的是，在这些实验中，本发明人在整个实验期间仅施用MHC-C84或C84一次(总共200μg抗体/小鼠)。这些结果表明，嵌合抗LILRB具有与原始mAb相同或更大的阻断白血病发展的能力。

概括地说，这些数据证明：1)LILRB/LAIR1由人类AML细胞高度表达，不去LILRB⁺/LAIR1⁺细胞在AML-SC活性中富集；2)LILRB/LAIR1表达与AML患者的总体存活负相关；3)LILRB/LAIR1对原代的和永生的人白血病细胞在体外和体内的生长至关重要；和4)本发明人已经鉴定了几种新型的抗人LILRB4mAb和嵌合抗体，它们基本上在异种移植模型中(包括在患者AML衍生的异种移植模型中)阻断人类AML发展。值得注意的是，各个LILRB基因或lair1的敲除对正常血细胞生成没有明显的影响(Tang等人，2012；Rojo等人，2000，Zheng等人，2012)。此外，LILRB的抑制刺激免疫并且间接加强抗肿瘤作用。因此，LILRB/LAIR1代表治疗AML的理想靶标。

随着本发明人鉴定出LILRB2的多个潜在的配体结合位点(Deng等人，2014)，他们预想大分子(诸如阻断抗体)而不是小分子化学物质将是更合适的LILRB阻断剂。事实上，如他们所证明的，即使单次施用抗LILRB mAb或嵌合抗体也能非常有效地在异种移植模型中阻断人类AML发展。这些结果提供了抗LILRB mAb或嵌合抗体是治疗AML的有希望的候选药物的原理证明。

*****************

按照本公开不需要过度的实验就可以制备和实行本文公开和提出权利要求的所有组合物和方法。尽管本公开的组合物和方法已经根据优选实施方案加以描述，但对本领域技术人员显而易见的是在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可使本文所述的组合物和方法以及本文所述方法的步骤或步骤的顺序发生变化。更具体地，显而易见的是在化学上和生理学上都相关的某些试剂可取代本文所述的试剂，同时达到相同或相似结果。对本领域技术人员来说显而易见的是所有此类相似的取代和修改都被认为在如由随附权利要求限定的本公开的精神、范围和概念内。

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Claims (19)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段能够特异性结合LILRB4，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含:

(a) 重链可变区，所述重链可变区包含以下互补决定区（CDR）：

重链CDR1，所述重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO: 83，

重链CDR2，所述重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO: 84，

重链CDR3，所述重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO: 85；以及

(b) 轻链可变区，所述轻链可变区包含以下CDR：

轻链CDR1，所述轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO: 86，

轻链CDR2，所述轻链CDR2的氨基酸序列为RAS，

轻链CDR3，所述轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO: 87。

2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含:

(a) SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的重链可变区；以及

(b) SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列的轻链可变区。

3.如权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是重组ScFv (单链片段可变)抗体、Fab片段、F(ab’)₂片段或Fv片段。

4.如权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是嵌合的、人源化的或人源的抗体。

5.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。

6.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码如权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。

7.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求6所述的分离的核酸。

8.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求7所述的表达载体。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

10.如权利要求8所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。

11.一种制备抗体的方法，所述方法包括在适于表达所述抗体和回收所述抗体的条件下培养如权利要求8所述的宿主细胞。

12.如权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，其中所述癌症表达LILRB4。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述癌症为急性髓性白血病。

14.如权利要求12所述的用途，其中所述药物是静脉内、动脉内、肿瘤内或皮下施用的。

15.如权利要求12所述的用途，其中所述药物和选自下组的一种或多种药物联合使用：蒽环类拓扑异构酶抑制剂、柔红霉素、阿糖胞苷核苷代谢抑制剂、联合柔红霉素、阿糖胞苷、柔红霉素和阿糖胞苷脂质体注射液、Vyxeos、全反式维甲酸（ATRA）、砷、三氧化二砷、组胺盐酸盐、二盐酸组胺(Ceplene)、白细胞介素-2、白细胞介素2(Proleukin)、吉妥珠单抗奥唑米(Mylotarg)、氯法拉滨、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨、IDH1抑制剂、IDH2抑制剂、恩西地平、Idhifa、IDO抑制剂、epacadostat、铂络合物的衍生物、奥沙利铂，激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂， BTK抑制剂Ibrutinib，PD-1抗体、PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、LAG3抗体、ICOS抗体，TIGIT抗体、TIM3抗体、结合肿瘤抗原的抗体，结合T细胞表面标记的抗体、结合细胞或NK细胞表面标志物的抗体、烷基化剂、亚硝基脲剂、抗代谢药物、抗肿瘤抗生素、来源于植物的生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素治疗药物、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂、和P-糖蛋白抑制剂。

16.如权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段在制备用于检测样品或受试者中癌细胞或癌干细胞的试剂中的用途，其中所述癌细胞或癌干细胞表达LILRB4。

17.如权利要求16所述的用途，其中所述样品是体液或活检。

18.如权利要求16所述的用途，其中所述样品是血液、痰液、眼泪、唾液、粘液或血清、尿液或粪便。

19.如权利要求16所述的用途，其中检测包括免疫组织化学、ELISA、RIA或蛋白质印迹。

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