CN102046660A - 骨髓性血液学增殖性病症相关的免疫球蛋白和/或toll样受体蛋白及其用途 - Google Patents

骨髓性血液学增殖性病症相关的免疫球蛋白和/或toll样受体蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及在人造血癌症的诊断、预后和治疗中有效的方法和组合物。特别是，本公开提供编码免疫球蛋白(Ig)和/或toll样受体超家族成员的肿瘤相关基因，与诸如正常干细胞的其它细胞相比，所述成员在骨髓来源的造血肿瘤细胞中差异表达。

Description

骨髓性血液学增殖性病症相关的免疫球蛋白和/或toll样受体蛋白及其用途
本申请根据35U.S.C.§119要求美国专利申请系列第61/039,701号的优先权(2008年3月26日提交)，通过引用将其全部并入本文。
1.技术领域
本公开通常涉及能够特异性地靶向于癌症干细胞标志物的试剂和使用所述试剂的方法，特别是在诊断和治疗处理中。特别是，本公开提供了属于免疫球蛋白(Ig)超家族或toll样受体(TLR)超家族的蛋白作为新的癌症干细胞靶标，所述蛋白细胞外表达并被本文公开的抗体和其他试剂所靶向。
2.背景
造血系统细胞起源于多能祖先造血干细胞(HSC)，其通过一系列的发育程序发展以最终形成骨髓系或淋巴系终末分化细胞。据信，在血细胞生成的最初阶段，HSC定型为两种可区别的寡能但发育上受限的祖细胞类型，共同的淋巴祖细胞(CLP)和共同的骨髓祖细胞(CMP)。T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴树突状细胞发育自源于CLP的相应祖细胞，而红细胞、巨核细胞、粒细胞、巨噬细胞和骨髓树突状细胞发育自源于CMP的它们的相应祖细胞。基于独特系列的细胞标志物的程序化表达，每个分化阶段的细胞群体可以区别于造血途径中的其他细胞群体。
尽管HSC可以自我更新(导致至少一个与母代细胞具有相同特征的子代细胞的细胞分裂)，但定型为淋巴系或骨髓系的祖细胞失去其自我更新的潜力。即，定型祖细胞的有丝细胞分裂导致分化型后代，而不是与母体细胞具有相同增殖和分化能力的细胞代。该自我更新潜力的丢失见于，与在宿主动物的生命中可完全地再生并保持造血作用(即长期重建)的HSC相比，在祖细胞移植进免疫低下的动物之后，定型祖细胞只在有限的时间段保持造血作用的能力(即短期重建)。
然而，已观察到，在造血系统的某些疾病状态，细胞调节通路的失调会导致获得自我更新的能力的祖细胞。例如，急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)(AML，也称为急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia))是部分地以异常造血细胞浸润骨髓为标志的骨髓增殖性病症。确实，癌症的干细胞性质首先见于AML中(Lapidot et al.，1994 Nature 17：645-8)。基于形态学特征和细胞化学染色特性，AML被分为不同的亚型，并且尽管大部分类型的AML中的自我更新特征可归于具有与HSC一致的细胞标志物表型的白血病细胞(Bonnet，D.和Dick，J.E.，Nat.Med.3(7)：730-737(1997))，在具有更多骨髓系分化型细胞(CD34-，CD38+)的细胞标志物表型特征的细胞群体中观察到AML M3亚型相关的染色体异常，然而，M3中的HSC群体没有携带易位(Turhan，A.G.et al.，Blood 79：2154-2161(1995))。
定型祖细胞群体中自我更新特征的获得也见于慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia)(CML，也称为慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)或慢性粒细胞性白血病(chronic granulocytic leukemia))中，通常是与费城染色体(Philadelphia chromosome)相关的疾病，该费城染色体是染色体9和22间平衡易位t(9；22)。所述易位产生bcr和c-abl基因间的融合并且导致具有增强酪氨酸激酶活性的嵌合蛋白BCR-ABL的表达。尽管CML中HSC群体通常包含所述染色体异常，但所述BCR-ABL融合蛋白主要在骨髓单核细胞系的定型细胞中表达，而不是在HSC中，这表明骨髓系中的定型细胞可能是白血病细胞的来源，而不是HSC。定型骨髓细胞是CML中白血病克隆来源的其他证据来自于在转基因动物中BCR-ABL的受控表达研究。使用在骨髓祖细胞中特异性起作用的启动子强制BCR-ABL在定型细胞中表达而不在HSC中表达，在这些转基因动物模型中产生了CML的疾病特征(Jaiswal，S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：10002-10007(2003))。
尽管诸如AML和CML的骨髓增殖性病症通常与细胞遗传学异常相关，所述细胞遗传学缺陷可能不是所述增殖性状的唯一原因。在一些实例中，在正常细胞中观察到染色体异常，这表明疾病状态的完全表现需要HSC或定型骨髓细胞中额外突变的累积。即使在CML中，病症表现出多期进程，从慢性期开始，在3-5年以及长达10年之后，导致类似于AML的加速期或急变期。从慢性期(少于5％母细胞或前髓细胞)向急变期(在外周血或骨髓中＞30％母细胞)转变需要的时间段可以反映积累引起从慢性期向更具侵袭性的急变期转变的突变所需时间。然而，大多数情况，白血病细胞表现为保留在正常祖细胞中可检测到的细胞标志物表型。
对于增殖性病症的治疗通常依赖于增殖细胞对细胞毒性或细胞抑制性化疗剂的敏感性。例如，双功能烷化剂白消安(busulfan)和核糖核苷二磷酸抑制剂羟基脲(hydroxyurea)影响DNA合成和稳定性，导致对分裂的细胞的毒性。其他类似活性的治疗剂包括阿糖胞苷(cytosine arabinoside)(阿糖胞苷(cytarabine))和道诺霉素。然而，这些试剂的效果是无差别对待的，并且因此，由于对正常分裂的细胞的毒性，它们具有严重的副作用。
用于具有血液学恶性肿瘤的患者的另一种治疗是骨髓移植(BMT)，其中接受者的造血细胞用放射和/或化疗(例如，环磷酰胺)清除，并且通过移植健康的造血干细胞重建造血系统。通常，所述移植使用来自家庭成员(HLA相同)或血清学匹配的无私供体(MUD)的HLA匹配的同种异体骨髓细胞。大约，＜50％的接受者找到具有完全匹配的组织相容性的供体。用交易的较差匹配供体的移植增加移植相关的发病率和死亡率。由于该治疗方法依赖于合适供体的可获得性并且由于该治疗对于疾病的慢性期或早期的患者相对于急性期或晚期的患者显示更好的结果，所以该治疗途径具有受限的应用。
癌症的抗体治疗涉及使用针对抗原的抗体或抗体片段以靶向于表达抗原肿瘤细胞。由于抗体治疗靶向于表达特定抗原的细胞，存在与正常细胞交叉反应的可能性并且会导致不利结果。大量努力致力于寻找肿瘤特异性抗原。肿瘤特异性抗原是几乎仅在肿瘤上发现或在肿瘤细胞比相应的正常细胞以更高水平表达。因此，肿瘤特异性抗原提供用于表达所述抗原的、癌症或其他疾病相关细胞的抗体靶向的靶标，还提供用于诊断的标志物，例如通过鉴定升高的表达水平。在免疫治疗方法中，特异性针对这类肿瘤特异性抗原的抗体在免疫治疗中可以与细胞毒性化合物结合或可以单独使用。
免疫治疗作为针对诸如AML的造血癌症的治疗选择，受限于肿瘤特异性的并且不同患者间共有的肿瘤相关抗原的缺乏。需要通过开发骨髓系中白血病细胞和正常细胞群体间共同特征，发现利用白血病细胞发育来起源的其他治疗剂。该方法会提供治疗，所述治疗可以补充骨髓性白血病传统治疗，或可以被用作直接靶向于白血病细胞的干细胞组分的可选的治疗。该方法还提供额外的诊断和预后策略，以及监测治疗方案功效的策略。
通常，当控制到特定类型的造血癌症时，治疗处理是更有效的。预测和确定治疗方案随着时间的功效在临床监控方面也是有价值的。因此，需要寻找可被用于诸如AML的骨髓性白血病病症更有效并且更准确的诊断和预后的肿瘤特异性标志物。
蛋白的免疫球蛋白(Ig)超家族成员是细胞表面蛋白并且是可溶性蛋白，其参与细胞的识别、结合和粘附过程。成员包括细胞表面抗原受体、共受体、免疫系统的共刺激分子、参与将抗原呈递到淋巴细胞的分子、细胞粘附分子、一些细胞因子受体和胞内肌肉蛋白。
属于蛋白的toll样受体(TLR)超家族的蛋白通常是识别结合不同微生物组分的模式识别受体。TLRs与病原体相关分子模式(PAMP)的结合诱导活性氧和活性氮中间体的产生，前炎性细胞因子网络的起始以及免疫系统共刺激分子的上调。
3.概述
本发明提供在骨髓来源的人造血癌症的诊断和治疗中有效的方法和组合物。如本文所述，已经发现以下免疫球蛋白(Ig)超家族或toll样受体(TLR)超家族的标志物与骨髓来源的造血肿瘤细胞(HTC)相关：CD84；淋巴细胞抗原86(Ly86)；CD180(RP105)、甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员1(LILRA1)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员2(LILRA2)；神经元生长调节因子1(NEGR1)和toll样受体(TLR2)。
在优选实施方案中，所述公开的Ig超家族或TLR超家族成员在骨髓来源的HTC中与正常HSC相比差异表达。在某些实施方案中，所述公开的Ig超家族或TLR超家族成员至少约两倍地差异表达。在其他实施方案中，所述Ig超家族或TLR超家族成员至少约三倍地差异表达。在其他实施方案中，所述Ig超家族或TLR超家族成员至少约五倍地差异表达等。本公开提供特异性地针对这些标志物的试剂，其在治疗和诊断应用中是有用的。
以下Ig超家族或TLR超家族成员在骨髓性HTC的表面过表达：CD84；CD180(RP105)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员1(LILRA1)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员2(LILRA2)；神经元生长调节因子1(NEGR1)和toll样受体(TLR2)。特异性地针对这些标志物的试剂可以凭借与表面表达的标志物结合而特异性地结合骨髓来源的HTC。
以下细胞外表达的标志物是过表达的并且凭借与其他膜蛋白结合而见于骨髓性HTC的表面：淋巴细胞抗原86(Ly86)。本文提供特异性地靶向于所公开的骨髓性HTC标志物(即，本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员)的组合物，以及在以这些标志物为特征的血液学增殖性病症的诊断、预后和治疗中使用该组合物的方法，所述组合物干扰所述标志物的表达或与表达产物结合。所述组合物包括特异性地结合一种或多种骨髓性HTC相关的细胞外表达的抗原的抗体，所述抗体可以抑制所述HTC的增殖和/或介导其破坏。本发明还提供产生一种或多种这类抗体的永生细胞系。
在一方面，本发明提供特异性地与以下的一种或多种骨髓来源的HTC相关的结合的抗体：CD84；淋巴细胞抗原86(Ly86)；CD180(RP105)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员1(LILRA1)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员2(LILRA2)；神经元生长调节因子1(NEGR1)和toll样受体(TLR2)。在某些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体，例如，从杂交瘤细胞系产生的抗体。在优选实施方案中，所述单克隆抗体特异性地与骨髓来源的造血肿瘤细胞结合，所述肿瘤细胞包括但不限于，慢性骨髓性白血病(CML)母细胞、急性骨髓性白血病(AML)母细胞、以及来自KG-1a、Pfeiffer、MOLT-3、GA-10、Ramos和Jurkat细胞系的细胞。在另一实施方案中，所述单克隆抗体特异性地与AML母细胞结合。
在优选实施方案中，本发明提供抗体，其可以特异性地与一种或多种公开的骨髓性HTC相关的Ig超家族或TLR超家族成员结合并且从而抑制其增殖和/或介导其破坏，但并不介导正常造血干细胞的破坏。在优选实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗体是IgG同种型或人源化抗体。在一个实施方案中，所述人源化抗体是来自包含人免疫球蛋白基因的转基因动物。
在另一实施方案中，本发明提供具有至少一种特异性地与一种或多种公开的骨髓来源的HTC相关的Ig超家族或TLR超家族成员结合的抗体的抗体复合物。在优选实施方案中，所述抗体复合物包含多聚体，所述多聚体包含与一种公开的Ig超家族或TLR超家族成员结合的单克隆抗体。
在可选择的实施方案中，本发明的抗体包含可检测部分、放射性化合物(例如，放射性同位素或放射性核素)或生物活性化合物(例如，药物或小分子)。在某些实施方案中，所述生物活性化合物是细胞毒性剂。
在另一实施方案中，本发明提供小分子，所述小分子与一种或多种本文公开的Ig超家族或TLR超家族多肽的成员结合，优选地特异性地结合。在优选实施方案中，所述小分子是小有机分子，其包括本领域内已知的作为对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员的多肽的激动剂或拮抗剂的小有机分子。已知结合对应于本文公开的其他HTC标志物的多肽的小分子也可以发现在个体治疗、预后和/或诊断应用中的用途。
任选地，所述小分子与诸如毒素的生长抑制剂或细胞毒性剂结合，所述毒素包括，例如美登醇(maytansinoid)或卡奇霉素(calicheamicin)、抗生素、放射性同位素、溶核酶等。在本发明的治疗方法中有用的小分子优选地诱导其结合的细胞的死亡。为了诊断目的，所述小分子可被可检测地标记和/或连接至固体支持物。
针对公开的Ig超家族或TLR超家族成员的主题试剂和抗体具有显著的治疗和诊断效用，并且在其他方面，提供药物组合物、方法和试剂盒，其利用所述主题试剂和抗体用于诊断和治疗特征为存在一种或多种公开的Ig超家族或TLR超家族成员的血液学增殖性病症，所述血液学增殖性病症例如，急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia)、急性骨髓单核细胞白血病、慢性骨髓性白血病和急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)。
在一方面，本公开提供使用抗体靶向于一种或多种公开的Ig超家族或TLR超家族成员的方法。在本教导中，所述抗体提供在治疗涉及骨髓来源的HTC的病症中的免疫治疗方法的基础，所述病症例如，诸如慢性骨髓性白血病(CML)和急性骨髓性白血病(AML)的骨髓增殖性病症，。
在一个实施方案中，本发明提供通过将HTC与包含针对一种或多种公开的Ig超家族或TLR超家族成员的抗体或其他试剂的组合物接触，来抑制骨髓来源的HTC增殖的方法。在另一实施方案中，本发明提供通过将HTC与包含针对一种或多种公开的Ig超家族或TLR超家族成员的抗体或其他试剂的组合物接触，来介导骨髓来源的HTC破坏的方法。在一个实施方案中，所述抗体是特异性结合公开的Ig超家族或TLR超家族成员的表位或其部分的单克隆抗体。在另一实施方案中，所述组合物包含抗体复合物。
在另一实施方案中，提供了在个体中减少过表达一种或多种公开的Ig超家族或TLR超家族成员的HTC的方法，所述个体为有该方面需要的个体，其中将包含如本文所述的抗体或抗体复合物的组合物给予所述个体。在另一实施方案中，本发明提供治疗患有以HTC中一种或多种公开的Ig超家族或TLR超家族成员的过表达为特征的骨髓性血液学增殖性病症的患者的方法，其中将包含如本文所述的抗体或抗体复合物或其他试剂的组合物给予所述患者。
在某些实施方案中，本发明的方法适于治疗骨髓来源的血液学增殖性病症，包括诸如慢性骨髓性白血病(CML)和/或急性骨髓性白血病(AML)的骨髓增殖性病症。
在另一方面，本发明提供骨髓来源的血液学增殖性病症的诊断方法，其中检测对应于一种或多种公开的Ig超家族或TLR超家族成员的表达产物的水平。在一个实施方案中，所述表达产物是诸如RNA的转录产物。检测RNA水平的方法包括利用特异性杂交探针或这些探针的阵列。在另一实施方案中，所述表达产物是翻译产物，例如本文公开的HTC相关的一种或多种Ig超家族或TLR超家族。检测抗原水平的方法包括利用本公开的抗体。RNA或抗原水平可以与对照水平比较，例如获自正常HSC样品的水平。
在另一实施方案中，本发明提供预测治疗骨髓来源的血液学增殖性病症的功效的预后方法，其中检测对应于一种或多种公开的Ig超家族或TLR超家族成员的表达产物的水平，并且其中所述表达产物水平与治疗结果相关。在一个实施方案中，所述表达产物是RNA并且较低的表达水平与较有利的结果相关。
在另一实施方案中，本发明提供监测治疗骨髓来源的血液学增殖性病症的功效的方法，其中在不同时间点检测对应于一种或多种公开的Ig超家族或TLR超家族成员的表达产物的水平；并且其中水平的变化与治疗结果相关。在一个实施方案中，所述表达产物是RNA并且降低的水平指示治疗的阳性反应。
在一些实施方案中，本发明的方法适于诸如骨髓增殖性病症的骨髓来源的血液学增殖性病症的诊断、预后和监测。本发明提供慢性骨髓性白血病(CML)和/或急性骨髓性白血病(AML)的诊断、预后和监测的方法。在特别优选的实施方案中，所述血液学增殖性病症是AML并且使用包含AML HTC的测试样品检测RNA或抗原的水平，该水平与获自正常HSC对照样品的对照水平比较。
4.附图简要说明
图1示出从获自3个未患AML的个体动员外周血(MPB)供体的3个样品中双分选Lin-CD34+CD90+CD45RA-CD38-和Lin-CD34+CD90+CD45RA-CD38+细胞的结果。
图2示出从获自3个被诊断为AML的个体患者外周血的3个样品中双分选Lin-CD34+CD90+CD45RA-CD38-和Lin-CD34+CD90+CD45RA-CD38+细胞的结果。
图3示出将外周血细胞与对于(A)Ly86、(B)CD84和(C)CD180特异性的抗体进行孵育的代表性结果。样品获自被诊断为AML的个体或未患AML的个体动员外周血(MPB)供体。
5.实施方案详述
5.1定义
对于以下描述，本文使用的技术和科学术语将具有本领域技术人员通常理解的含义，除非另作特别定义。因此，以下术语意图具有以下含义：
术语“癌症干细胞(CSC)标志物”或“癌症干细胞(CSC)靶标”以及“造血肿瘤细胞(HTC)标志物”或“造血肿瘤细胞(HTC)靶标”是指凭借诸如增强的表达和/或生物活性被发现与HTC相关的基因及其表达产物，例如mRNA和多肽。例如，对于本文公开的CD180标志物，发现包含AML HTC的样品中的转录自CD180基因的CD180 mRNA与包含正常HSC的样品中相比处于更高水平。给定标志物相关的HTC在本文中被称为“标志物+HTC”。
“骨髓来源的HTC”特别指源自骨髓(非淋巴)系细胞的癌症干细胞，所述骨髓系细胞包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞等。骨髓来源的HTC是发现于诸如AML和CML的骨髓性白血病中的那些，其中据信定型为骨髓系的祖细胞重新获得自我更新特征。不同形式的白血病，例如，表现为在HSC或定型骨髓祖细胞的小的群体中具有所述白血病的起源，在所述群体中细胞获得引起恶性表型的突变的组合。术语“骨髓来源的HTC”和“骨髓HTC”或“骨髓性HTC”在本文中可交换使用。
“造血干细胞”或“HSC”通常是指无性繁殖的、自我更新的多能细胞，其能够最终分化成造血系统的所有细胞类型，包括B细胞、T细胞、NK细胞、淋巴树突状细胞、骨髓树突状细胞、粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞和红细胞。与造血系统的其他细胞一样，HSC通常以特征细胞标志物组的存在来定义。
“标志物分型”是指鉴定细胞上标志物或抗原以确定其表型(即分化状态和/或细胞类型)。这可以通过免疫分型实现，其使用识别存在于细胞上的抗原的抗体。所述抗体可以是单克隆或多克隆的，但通常选择与其他细胞标志物具有最小交叉反应的。应当理解，某些细胞分化或细胞表面标志物对于该细胞所来源的动物物种是特有的，而其他细胞标志物是物种之间共有的。定义物种之间等同细胞类型的这些标志物被给予相同的标志物鉴定，尽管在结构上存在物种差异(例如氨基酸序列)。细胞标志物包括细胞表面分子，在某些情况下也称为细胞分化(CD)标志物和基因表达标志物。所述基因表达标志物是那些组指示细胞类型或分化状态的表达的基因。部分地，所述基因表达谱会反映所述细胞表面标志物，尽管其会包含非细胞表面分子。
系标志物是可被用于对特定发育系的细胞进行免疫分型细胞表面抗原。例如，包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NK1.1、B220、TER-119、Gr-1的‘Lin’抗原组可被用于鉴定成熟的鼠科血细胞。不表达这些标志物抗原或以非常低的水平表达这些标志物抗原的细胞被认为是系标志物阴性(Lin-)。针对这些系标志物的单克隆抗体混合物可被用于从来源组织(例如，骨髓、脐带血、动员外周血，胚胎肝等)中移除表达这些抗原的细胞。该阴性选择操作产生富集了表达(但尚未表达)这些标志物的原始造血干细胞或非常早期的祖细胞或前体细胞(参见，例如KTLS细胞)的细胞群体。这些细胞被称为系阴性细胞，简称为Lin-细胞。已鉴定出数个富集造血干细胞的系阴性细胞亚群。它们包括Lin-CD34+细胞(Krause et al，1994)、Lin-Sca-1+c-Kit+Thy1low细胞(Fleming et al，1993)和人CD34+CD38-细胞群体。
“试剂”是指特异性地针对一种或多种公开的HTC标志物的任何分子，并且其可以作用为抑制(inhibit)、阻碍和/或抑制(suppress)血液学增殖性病症中的所述HTC标志物的生物活性和/或介导所述HTC的破坏。试剂包括特异性地与HTC标志物基因和/或表达产物相互作用的任何分子，包括例如，特异性地与对应于HTC标志物的抗原结合以抑制HTC增殖和/或介导其破坏的抗体；干扰HTC标志物表达的反义分子；或干扰HTC标志物介导的生物活性的分子，例如通过HTC标志物与其配体之间的空间抑制相互作用来干扰癌症干细胞信号转导通路的激活。所述分子可以是本领域内已知的一种，例如，针对本文公开的一种或多种HTC标志物的小分子激动剂或拮抗剂。特异性地与对应于本文公开的HTC标志物的抗原结合的抗体被称为“标志物特异性抗体”。
“小分子”、“小分子化合物”或“小有机分子”是指分子，其通常具有小于约2000道尔顿，可选择地小于约1500、约700、约500、约250或约200道尔顿大小的分子量，其中这些分子在本领域内已知能够与对应于本文公开的HTC标志物的多肽结合(优选地特异性地结合)。
关于小分子化合物与靶分子的结合，术语与特定产物“特异性地相互作用”或“特异性地结合”特定产物或“针对于(directed to or towards)”特定产物，表示测定上不同于非特异性相互作用的结合。可以测量特异性结合，例如，通过本领域已知的方法，例如，使用与相似于所述靶标的对照分子的竞争测定，例如，过量的未标记靶标。特异性地结合靶标的小分子化合物可以具有至少约10-4M，可选择地至少约10-5M、可选择地至少约10-6M、可选择地至少约10-7M、可选择地至少约10-8M、可选择地至少约10-9M、可选择地至少约10-10M、可选择地至少约10-11M、可选择地至少约10-12M或更大的对于所述靶的Kd。在一个实施方案中，术语“特异性地结合”是指结合，其中小分子化合物与其特定靶标结合而基本上不与任何其他多肽或大分子结合。
“抗体”是指包含特异性地与对应的抗原结合并且具有免疫球蛋白的常见一般结构的蛋白质的组合物。术语抗体特别涵盖多克隆抗体、单克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性。抗体可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的或源自其他物种的。通常，抗体会包含通过二硫键互相连接的至少两条重链和两条轻链，当其组合时形成与抗原相互作用的结合结构域。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成，并且可能是μ、δ、γ、α或ε同种型。相似地，轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成，CL可能是κ或λ同种型。VH和VL区可被进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高度变异区，穿插称为框架区(FR)的较保守的区。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(CIq)。重链恒定区介导免疫球蛋白与宿主组织或宿主因子的结合，特别是通过例如Fc受体(例如FcγRI、FcγRII、FcγRIII等)的细胞受体。如本文使用，抗体还包括保留结合抗原能力的免疫球蛋白的抗原结合部分。这些包括，例如，F(ab)，VLCL和VHCH抗体结构域的单价片段；和F(ab)2片段，在铰链区包含两个由二硫桥连接的Fab片段的二价片段。术语抗体也指重组单链Fv片段(scFv)和双特异性分子例如，如双链抗体、三链抗体和四链抗体(参见，例如美国专利第5,844,094号)。
抗体可以以许多形式产生和使用，包括抗体复合物。如本文所使用，术语“抗体复合物(antibody complex)”或“抗体复合物(antibody complexes)”用于表示一种或多种抗体与另一种抗体或与抗体片段(fragment)或片段(fragments)的复合物，或两种或更多抗体片段的复合物。抗体复合物包括针对公开的HTC标志物的抗体的多聚体形式，例如本文描述的同源结合物(homoconjugates)和异源结合物(heteroconjugates)以及其他交联抗体。
“抗原”应当广义解释并且是指可以特异性地与抗体结合的任何分子、组合物或颗粒。抗原具有与抗体相互作用的一个或多个表位，尽管其未必诱导所述抗体的产生。
术语“交联(cross-linked)”、“交联(cross-linking)”及其语法等同词，是指两种或更多种抗体的连接以形成抗体复合物，并且也可以称为多聚化。交联或多聚化包括两个或更多个相同抗体的连接(例如，同型二聚体化)，以及两种或更多种不同抗体的连接(例如，异二聚体化)。本领域技术人员也会认识到，交联或多聚化也称为形成抗体同源结合物和抗体异源结合物。这些结合物可涉及两种或更多种同一克隆起源的单克隆抗体的连接(同源结合物)或两种或更多种不同克隆起源的抗体的连接(也称为异源结合物或双特异性)。抗体可以通过非共价或共价连接进行交联。本领域技术人员会意识到很多适于交联的技术。非共价连接可以通过使用对于一抗物种特异的二抗来实现。例如，山羊抗小鼠(GAM)二抗可用于交联小鼠单克隆抗体。共价连接可以通过使用化学交联剂实现。
“表位”是指能够与抗体特异性结合的决定子。表位是通常存在于分子表面上的化学特征并且容易与抗体相互作用。典型的化学特征是具有三维结构特征的氨基酸和糖部分以及包括电荷、亲水性和亲油性的化学性质。构象表位与非构象表位区别在于，在分子的空间元件改变而基本化学结构没有任何改变后，失去与抗体的反应性。
“人源化抗体”是指包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白分子。人源化抗体包括人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需的特异性、亲和力和能力的、来自例如小鼠、大鼠或兔的非人物种(供体抗体)的CDR的残基替换。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人的残基替换。人源化抗体也可以包含既不见于接受体抗体中也不见于进入的CDR或框架序列中的残基。通常，人源化抗体会基本上包含至少一个并且通常两个可变结构域的全部，其中全部的或基本上全部的CDR区对应于非人的免疫球蛋白的那些CDR区，并且全部的或基本上全部的框架(FR)区是人免疫球蛋白一致序列的那些框架(FR)区。人源化抗体还包括这样的免疫球蛋白：其包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常包含至少部分的人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)。(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Reichmann et al.，Nature 332：323-329(1988))。
“免疫原”是指刺激免疫应答产生的物质、化合物或组合物。
术语“免疫球蛋白基因座”是指包含可被B细胞或B细胞前体利用以表达免疫球蛋白肽的信息的遗传元件或连接的遗传元件组。该肽可以是重链肽、轻链肽或重链和轻链肽的融合。对于未重排的基因座，所述遗传元件由B细胞前体装配以形成编码免疫球蛋白肽的基因。对于重排基因座，所述基因座中包含编码免疫球蛋白肽的基因。
“同种型”是指由其重链恒定区定义的抗体类别。重链通常分为γ、μ、δ、α、ε并且指定为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每种同种型内的变种分为亚型，例如IgG的亚型被分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，而IgA被分为IgA1和IgA2。IgY同种型是特异性对于鸟类的。
“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组分的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性的抗体，其具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和/或恒定区(若存在)。在一个实施方案中，所述人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包含获自诸如转基因小鼠的转基因非人动物的B细胞，所述转基因非人动物具有包含融合至永生化细胞的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
“单链Fv”或“scFv”是指包含抗体VH和VL区的抗体，其中这些结构域存在于单多肽链中。通常，scFv还包含VH和VL结构域之间的多肽连接物，所述连接物使scFv能形成抗原结合所需的结构。
“特异性免疫反应性的”或“特异性地结合的”的抗体是指抗体的结合反应，该反应取决于抗原的异种群体中该抗原的存在。抗体可以描述为“针对(directed to)”或“针对(directed against)”特定抗原。在给定的免疫检测条件下，抗体与抗原结合至少两倍，并且通常10-1000倍或更多倍于背景。“特异性免疫反应性的”或“特异性地结合的抗体”还指能够以足够亲和力结合至抗原的抗体，从而所述抗体可用于靶向于具有与细胞表面结合的所述抗原的细胞或靶向于可溶性抗原本身。在这些实施方案中，非特异性结合的程度是以或低于背景的结合的量并且例如按照荧光激活的细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测定的，会通常少于约10％，优选地少于约5％，并且更优选地少于约1％。
“重组抗体”是指通过重组技术制备和表达、产生或分离的所有抗体。这些抗体包括获自免疫球蛋白基因座转基因的动物的抗体、从重组表达载体表达的抗体或通过将任何免疫球蛋白基因序列剪接至其他核酸序列而产生、制备和表达的抗体。
例如在造血肿瘤细胞(HTCs)“相关的”免疫球蛋白(Ig)超家族或toll样受体(TLR)超家族成员中的术语“相关的”是指所述HTC标志物基因(例如，公开的免疫球蛋白(Ig)超家族或toll样受体(TLR)超家族成员的基因)在HTC中相对于诸如正常HSC的其他哺乳动物细胞中差异性表达的情况。即已发现，包含HTC的一个或多个样品中的对应于所述基因的诸如RNA的转录产物和/或诸如多肽的翻译产物与在一个或多个包含诸如正常HSC的其他哺乳动物细胞的样品中相比处于不同水平。
本文使用的“表达(expression)”或“表达(expressing)”是指由基因指导的转录和翻译过程。即，该术语是指将核酸序列(基因)中编码的遗传信息通过该基因的转录转变为RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA和snRNA等)的过程；和/或将遗传信息通过mRNA的翻译转变为蛋白的过程。类似地，本文使用的“表达产物”是指基因的转录或翻译产物，并且包括，例如，RNA(mRNA、tRNA、rRNA、snRNA等)以及多肽(细胞内表达的蛋白、细胞外表达的蛋白或表面表达的蛋白)。
本文使用的“差异性表达(differential expression)”、“差异性表达的(differentially expressed)”和“不同水平(differential level)”等是指对应于HTC中的标志物的表达产物与在其他哺乳动物细胞，例如特别是正常HSC中相比的水平的差异。该差异可被表示为获自HTC中表达产物的表达水平与HSC中相同表达产物的表达水平的商的表达比或信号比。“差异性表达”通常是指在表达水平的至少约2倍、至少约3倍、至少约5倍、至少约7倍、至少约10倍或至少约15倍的差异。在特别优选的实施方案中，所述表达水平的差异是至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。在仍然更优选的实施方案中，所述表达水平的差异是至少约70倍、至少约100倍、至少约200倍或多至接近300倍、400倍或500倍。
术语“细胞外表达的”是指表达产物发现于细胞外的情况，无论是整体存在于细胞的质膜外部(如分泌、可溶产物的情况)，或如一些膜(表面)表达的产物的情况部分地存在于细胞外部。膜结合蛋白可以是整合的(integral)或外周的(peripheral)，只要至少部分的蛋白易于接近细胞外抗体。术语膜结合包括膜表达的产物以及受体结合产物，所述受体结合产物凭借与膜结合受体结合而与表面膜相关。
“个体”或“患者”可交换地使用并且除已表明情况之外，是指哺乳动物，例如人和非人灵长类，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其他哺乳动物物种。
“血液学增殖性病症”或“造血增殖性病症”是指以一种或多种骨髓和/或淋巴系的造血细胞的克隆增殖为特征的疾病状态。“骨髓系的血液学增殖性病症”是指主要以一种或多种骨髓系而不是淋巴系的造血细胞的克隆增殖为特征的疾病状态。应当注意到，在本文中术语“骨髓来源的”与形容词“骨髓性的(myeloid)”或“骨髓性的(myelogenous)”可交换地使用。骨髓性造血增殖性病症包括，例如，一般分类的(a)骨髓细胞生成异常性疾病(dysmyelopoietic disease)、(b)急性骨髓增殖性白血病和(c)慢性骨髓增殖性疾病。如本领域内已知的，每种一般分类进一步分为不同的亚型。
5.2杂交瘤和单克隆抗体
本公开的教导提供杂交瘤细胞系和特异性地与一种或多种以下免疫球蛋白(Ig)超家族或toll样受体(TLR)超家族成员结合的单克隆抗体：CD84；淋巴细胞抗原86(Ly86)；CD180(RP105)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员1(LILRA1)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员2(LILRA2)；神经元生长调节因子1(NEGR1)和toll样受体(TLR2)。
以下Ig超家族或TLR超家族成员在骨髓来源的HTC的表面过表达：CD84；CD180(RP105)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员1(LILRA1)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员2(LILRA2)；神经元生长调节因子1(NEGR1)和toll样受体(TLR2)。本发明提供抗CD84抗体、抗CD180抗体、抗HAVCR2抗体、抗LILRA1抗体、抗LILRA2、抗NEGR1抗体和抗TLR2抗体，其中所述抗体优选为人源化单克隆抗体。
CD84是Ig SLAM超家族的跨膜蛋白。已知七种可选择的剪接形式，通常见于成熟B细胞、主要包含CD4+CD45RA+的T细胞的亚类、单核细胞、胸腺细胞、树突状细胞和血小板以及CD34+细胞的亚类。该多肽通常参与细胞粘附和嗜同种相互作用并且用于增强IFN-γ从淋巴细胞分泌以及诱导血小板产生。通过CD84的信号转导通过同型相互作用发生并且涉及SAP和EAT-2的磷酸化和征募，这可导致IFNγ的产生以及T细胞活化。CD84也称为Hly9-β、Ly9B、SLAMF5和DKFZp781E2378。尽管正常存在的剪接形式在造血细胞上广泛地表达，HTC(例如，来自AML患者的HTC)会表达较限定性地表达的不同剪接版本。
本发明提供可以特异性地与CD84抗原结合，例如与暴露于骨髓来源的HTC表面的CD84抗原结合的抗CD84抗体，优选地提供单克隆抗体。在优选实施方案中，相对于健康CSC样品中表达的那些CD84剪接形式，所述抗CD84单克隆抗体特异性地靶向于由骨髓性HTC表达的CD84剪接形式(本文称为CD84的AML表达同种型)。如下文更详细讨论的，所述抗CD84抗体优选地结合这类骨髓性HTC，从而抑制其增殖和/或介导其破坏。本领域技术人员会进一步意识到，本领域内已知抗体可发现在本发明中公开的方法中的用途。例如，一种或多种可商业获得自Abcam、AbD Serotec、ABR-Affinity BioReagents、Biolegend、BDBiosciences、eBioscience、GeneTex、Lifespan Biosciences、R&D Systems、Raybiotech和Santa Cruz Antibodies的抗CD84抗体，也可以发现关于本文教导的诊断和/或治疗应用的用途。
CD180，也称为LY64、LY78、MGC126233、MGC126234和RP105，是TLR家族的I型跨膜分子，其与分泌的Ly86物理上相关(下文讨论)。CD180通常部分地表达在B细胞、单核细胞/巨噬细胞、和树突状细胞的细胞表面上，并且其细胞质结构域与I型IL-1受体共享同源性。CD180通常起信号转导分子的作用，在B细胞生长和死亡的调控中起重要作用。更具体而言，CD180/Ly86复合物与TLR4合作介导B细胞识别，以及LPS信号转导。例如，MHR73-11活化B细胞，导致细胞大小增加、共刺激分子CD80的表达和DNA合成。另外，CD180的连接保护B细胞免受放射和地塞米松诱导的凋亡。CD180也被认为在系统性红斑狼疮(SLE)中潜在地起作用。
本发明提供抗可以特异性地与CD180抗原结合，例如与暴露于骨髓来源的HTC表面的CD180多肽结合的CD180抗体，优选地提供单克隆抗体。如下文更详细讨论的，所述抗CD180抗体优选地结合这些骨髓性HTC，从而抑制其增殖和/或介导其破坏。本领域技术人员会进一步意识到，本领域内已知抗体可发现在本发明中公开的方法中的用途。例如，一种或多种可商业获得自Abcam、AbD Serotec、AnaSpec、Atlas Antibodies、Biolegend、BDBiosciences、Cell Sciences、eBioscience、GeneTex、Lifespan Biosciences、Raybiotech和ProSci的抗CD 180抗体，也可以发现关于本文教导的诊断和/或治疗应用的用途。
HAVCR2，也称为TIM3、KIM-3、TIMD3和FLJ14428，是T辅助细胞1型特异性细胞表面蛋白，其小鼠中调节巨噬细胞的活化并增强实验性自身免疫脑脊髓炎的严重程度。本发明提供可以特异性地与HAVCR2抗原结合，例如与暴露于骨髓来源的HTC表面的HAVCR2多肽结合的抗HAVCR2抗体，优选地提供单克隆抗体。如下文更详细讨论的，所述抗HAVCR2抗体优选地结合这些骨髓性HTC，从而抑制其增殖和/或介导其破坏。本领域技术人员会进一步意识到，本领域内已知抗体可发现在本发明中公开的方法中的用途。例如，一种或多种可商业获得自IMGENIX、Novus Biologicals、Lifespan Biosciences和Atlas Antibodies的抗HAVCR2抗体，也可以发现关于本文教导的诊断和/或治疗应用的用途。
LILRA1也称为CD125、CDw125、HSIL5R3和MGC26560本发明提供可以特异性地与LILRA1抗原结合，例如与暴露于骨髓来源的HTC表面的LILRA1多肽结合的抗LILRA1抗体、优选地提供单克隆抗体。如下文更详细讨论的，所述抗LILRA1抗体优选地结合这些骨髓性HTC，从而抑制其增殖和/或介导其破坏。本领域技术人员会进一步意识到，本领域内已知抗体可发现在本发明中公开的方法中的用途。例如，一种或多种可商业获得自Lifespan Biosciences的抗LILRA1抗体，也可以发现关于本文教导的诊断和/或治疗应用的用途。
LILRA2，也称为ILT1、LIR7、CD85H和LIR-7，其主要在单核细胞和B细胞上表达，并且在树突状细胞和自然杀伤(NK)细胞处于较低水平。亚家族A中许多，如果不是全部的话，白细胞免疫球蛋白样受体缺乏免疫受体酪氨酸相关抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif(ITIM))并且可以起始刺激级联。
本发明提供可以特异性地与LILRA2抗原结合，例如与暴露于骨髓来源的HTC表面的LILRA2多肽结合的抗LILRA2抗体，优选地提供单克隆抗体。如下文更详细讨论的，所述抗LILRA2抗体优选地结合这些骨髓性HTC，从而抑制其增殖和/或介导其破坏。本领域技术人员会进一步意识到，本领域内已知抗体可发现在本发明中公开的方法中的用途。例如，一种或多种可商业获得自eBioscience和Novus Biologicals的抗LILRA2抗体，也可以发现关于本文教导的诊断和/或治疗应用的用途。
NEGR1，也称为Ntra、KILON、IGLON4、DMML2433和MGC46680。本发明提供可以特异性地与NEGR1抗原结合，例如与暴露于骨髓来源的HTC表面的NEGR1多肽结合的抗NEGR1抗体，优选地提供单克隆抗体。如下文更详细讨论的，所述抗CD180抗体优选地结合这些骨髓性HTC，从而抑制其增殖和/或介导其破坏。本领域技术人员会进一步意识到，本领域内已知抗体可发现在本发明中公开的方法中的用途。例如，一种或多种可商业获得自AbNova和Novus Biologicals的抗NEGR1抗体，也可以发现关于本文教导的诊断和/或治疗应用的用途。
TLR2，也称为TIL4和CD282，是toll样受体(TLR)家族的成员。其在外周血白细胞中表达最丰富并且通过NF-κB介导对革兰氏阳性细菌和酵母的宿主应答。本发明提供可以特异性地与TLR2抗原结合，例如与暴露于骨髓来源的HTC表面的TLR2多肽结合的抗TLR2抗体，优选地提供单克隆抗体。如下文更详细讨论的，所述抗TLR2抗体优选地结合这些骨髓性HTC，从而抑制其增殖和/或介导其破坏。本领域技术人员会进一步意识到，本领域内已知抗体可发现在本发明中公开的方法中的用途。例如，一种或多种可商业获得自AbCam、Abnova、ABR-Affinity Bioreagents/Thermo Scientific BioLegend、LifeSpan BioSciences和Novus Biologicals的抗TLR2抗体，也可以发现关于本文教导的诊断和/或治疗应用的用途。TLR2激动剂包括许多微生物分子(脂聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、肽聚糖和酵母聚糖)以及合成的脂蛋白。
Ly86，也称为LY86、DJ80N2.1、MD-1、MD1和MMD-1，是B细胞和单核细胞高度表达的分泌产物。分泌的Ly86与CD180(上文讨论的)，以及TLR4形成复合物，从而成为膜结合的。该结合通常介导LPS信号转导。
本发明提供抗Ly86抗体、优选地单克隆抗体，其可特异性地与Ly86抗原结合，例如凭借与CD180(和TLR4)结合而存在于骨髓来源的HTC表面的Ly86多肽。如下文更详细讨论的，该抗Ly86抗体优选地结合这类骨髓性HTC，从而抑制其增殖和/或介导其破坏。本领域技术人员会进一步意识到，本领域内已知抗体可发现在本发明中公开的方法中的用途。例如，一种或多种可商业获得自Abcam、Abgent、Abnova Corporation、ABR-Affinity BioReagents、GeneTex、Lifespan Biosciences、Novus Biologicals和R&D Systems的抗Ly86抗体，也可以发现关于本文教导的诊断和/或治疗应用的用途。
本公开的单克隆抗体凭借与其靶抗原的特异性结合而特异性地结合骨髓性HTC。在优选实施方案中，所述单克隆抗体(或其衍生物)与造血系统骨髓来源的细胞是特异性免疫反应性的，所述细胞例如粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)、KG-1a、K-562、Jurkat、CML母细胞和AML母细胞。例如，在某些这类实施方案中，凭借本文公开的Ig超家族或TLR超家族的成员与HTC特异性的结合介导骨髓来源的造血肿瘤细胞的破坏。
本领域技术人员可以容易地制造抗体。通过杂交瘤制造单克隆抗体的一般方法学现在是本领域熟知的。参见，例如M.Schreier et al.，Hybridoma Techniques(杂交瘤技术)(Cold Spring Harbor Laboratory)；Hammerling et al.，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)(Elsevier Biomedical Press)。如上文所述，本公开提供制造单克隆抗体或其衍生物的方法。在某些实施方案中，这些方法包括在适当的条件下培养杂交瘤细胞，其中所述抗体产生自并且所述抗体和/或其衍生物获得自所述细胞和/或细胞培养基。还在下文的实施例中提供制造本发明的单克隆抗体的具体实例。
抗体可以通过本领域技术人员已知的方法进行纯化。纯化方法包括，选择性沉淀、液相色谱法、HPLC、电泳、色谱聚焦和各种亲和技术等。选择性沉淀可以使用硫酸铵、乙醇(Cohn沉淀)、聚乙二醇或本领域内其他可用的。液相色谱法介质包括离子交换介质DEAE、聚天冬氨酸酯)、羟磷灰石、尺寸排阻(例如，基于交联琼脂糖、丙烯酰胺和葡聚糖等的那些尺寸排阻)、疏水基质(例如，蓝色琼脂糖(Blue Sepharose))。亲和技术通常依赖于与免疫球蛋白Fc结构域相互作用的蛋白。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的蛋白A可被用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。来自C和G链球菌的蛋白G可用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBO J.5：15671575(1986))。蛋白L，通过κ轻链相互作用结合免疫球蛋白(Ig)的大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)细胞壁蛋白(BD Bioscience/ClonTech.Palo Alto，CA)，可用于Ig亚类IgM、IgA、IgD、IgG、IgE和IgY的亲和纯化。这些蛋白的重组形式也是可商业获得的。如果抗体包含金属结合残基，例如构建含有组氨酸标签的噬菌体展示抗体，可以使用金属亲和色谱。当得到足够量的特异性细胞群体时，可以用细胞制造抗原亲和基质以提供纯化抗体的亲和方法。
本发明提供本文所述的抗体以及对应的抗体片段和抗原结合部分。如本文所使用的本发明的术语“抗体片段”或抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)，是指保留与抗原特异性地结合的能力的抗体的一个或多个片段。已经证实抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。包括在术语“抗体片段”或抗体的“抗原结合部分”之内的结合片段的实例包括，(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含铰链区两个通过二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)，以及(vii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)。另外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由分别的基因编码，但是可以使用重组方法通过使他们能够被制成单一蛋白链的合成连接物将它们连接，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见，例如，Bird et al.(1988)Science 242：423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这类单链抗体也意图包含在术语抗体的“抗原结合部分”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且所述片段以与完整抗体相同的方式筛选效用。可以修饰所述抗体片段。例如，可以通过连接VH和VL结构域的二硫桥的合并稳定该分子(Reiter et al.，199θ，Nature Biotech.14：1239-1245)。
本公开还提供本文公开的抗体的片段。免疫球蛋白分子可以被切割为片段。分子的抗原结合区可被分为F(ab’)2或Fab片段。F(ab’)2片段是二价的并且当Fc区是不需要的或不是需要的特征时，是有用的。Fab片段是单价的并且当抗体具有对于其抗原的非常高的亲和力时，是有用的。从抗体移除Fc区降低Fc区和携带Fc受体的细胞间的非特异性结合。为了产生Fab或F(ab)2片段，用酶消化所述抗体。在免疫球蛋白分子铰链区切割的蛋白酶保留连接F(ab)结构域的二硫键，从而F(ab)结构域在切割后仍然在一起。用于此目的合适的蛋白酶是胃蛋白酶。对于制造F(ab)片段，选择这样的蛋白酶，裂解发生在含有连接重链的二硫键的铰链区上，但使连接重链和轻链的二硫键保留完整。制造F(ab)片段的合适的蛋白酶是木瓜蛋白酶。通过除要求完整Fc区的亲和技术(例如，蛋白A亲和色谱)以外的上文所述的方法纯化该片段。
可以通过抗体的限制性蛋白水解制造抗体片段并且所述抗体片段被称为蛋白水解抗体片段。这些片段包括但不限于以下：F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab’-SH片段和Fab片段。“F(ab’)2片段”是通过将抗体限制性地暴露于诸如胃蛋白酶或无花果蛋白酶的蛋白水解酶而从抗体释放的。F(ab’)2片段包含两个“臂”，每个臂包含针对普通抗原并特异性地与普通抗原结合的可变区。两个Fab’分子通过重链的铰链区中的链间二硫键连接；该Fab’分子可以针对相同的(二价)或不同的(双特异性)表位。“Fab’片段”包含单一抗结合结构域，所述单一抗结合结构域包含Fab和额外部分的通过铰链区的重链。“Fab’-SH片段”通常从F(ab’)2片段产生，所述Fab’-SH片段是通过F(ab’)2片段中H链之间的二硫键而保持在一起。用温和还原剂的处理，例如作为非限制性实例的β巯基乙胺，破坏二硫键，并且从一个F(ab’)2片段释放两个Fab’片段。Fab’-SH片段是单价的并且单特异性的。通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化制造“Fab片段”(即含有抗原结合结构域并且包含通过二硫键桥接的轻链和部分重链的抗体片段)。常规方法是使用固定于树脂上的木瓜蛋白酶，这样可以容易地移除酶并且消化终止。Fab片段不具有F(ab’)2片段中存在的H链之间的二硫键。
“单链抗体”是抗体片段的一种类型。术语单链抗体通常缩写为“scFv”或“sFv”。使用分子遗传学和重组DNA技术产生这些抗体片段。单链抗体由包含VH和VL结构域的多肽链组成，所述VH和VL结构域相互作用形成抗原结合位点。VH和VL结构域通常由10-25个氨基酸残基的肽连接。
术语“单链抗体”还包括但不限于，二硫连接的Fv(dsFv)，其中两个单链抗体(每个可以针对不同的表位)通过二硫键连接在一起；双特异性sFv，其中两个不同特异性的分离的scFv以肽连接物连接；双链抗体(二聚体化sFv，当第一sFv的VH结构域与第二sFv的VL结构域组装(assemble)并且第一sFv的VL结构域与第二sFv的VH结构域组装时形成所述二聚体化sFv；双链抗体的两个抗原结合区可以针对相同的或不同的表位)；和三链抗体(三聚化sFV，以与双链抗体相似的方式形成，但是其中在单一复合物中产生三个抗原结合结构域；三个抗原结合结构域可以针对相同的或不同的表位)。
“互补决定区肽”或“CDR肽”是抗体片段的另一形式。CDR肽(也称为“最小识别单元”)是相当于单一互补决定区(CDR)的肽，并且可以通过构建编码目的抗体的CDR的基因来制备。例如，这些基因是通过使用聚合酶链反应从产生抗体的细胞的RNA合成可变区来制备的。参见，例如，Larrick et al.，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：106，1991。
在“半胱氨酸修饰的抗体”中，半胱氨酸氨基酸通过遗传操控在抗体的表面进行插入或取代并且用于通过诸如二硫桥将该所述抗体与另一个分子结合。抗体的半胱氨酸取代或插入已有描述(参见美国专利第5,219,996号)。Stimmel et al.(J.Biol.Chem 275：330445-30450，2000)描述了将Cys残基引入IgG抗体的恒定区用于抗体的位点特异性结合的方法。
本公开还提供人源化和非人源化抗体。非人(例如小鼠)抗体的人源化形式是嵌合抗体，其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体是可变结构域框架区被替换为见于人抗体的序列的非人抗体。人源化抗体可以是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的高变区的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的、来自非人物种(供体抗体)的高变区的残基替换，所述非人物种例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应的非人残基替换。另外，人源化抗体可以包含未见于接受体抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰是为了进一步提高抗体性能。通常，人源化抗体会基本上包含至少一个，并且通常两个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环并且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常包含人免疫球蛋白的恒定区。
通常，在人源化抗体中，除CDR外的整个抗体是由人来源的多核苷酸所编码或与这样的抗体除其CDR外是相同的。一些或全部的所述CDR是由源自非人生物的核酸所编码，所述CDR被移植入人抗体可变区的β折叠框架以产生抗体，所述抗体的特异性是由移植入的CDR所决定。这类抗体产生描述于，例如WO92/11018，Jones，1986，Nature 321：522-525，Verhoeyen et al.，1988，Science 239：1534-1536。使用具有遗传工程的免疫系统的小鼠也可以产生人源化抗体。Roque et al.，2004，Biotechnol.Prog.20：639-654。
本公开还提供人源化和非人源化抗体。非人(例如小鼠)抗体的人源化形式是嵌合抗体，其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的高变区的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的、来自非人物种(供体抗体)的高变区的残基替换，所述非人物种例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应的非人残基替换。另外，人源化抗体可以包含未见于接受体抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰是为了进一步提高抗体性能。通常，人源化抗体会基本上包含至少一个，并且通常两个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环并且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常包含人免疫球蛋白的恒定区。
关于效应功能修饰本发明的抗体是可取的，以便增强例如所述抗体在治疗癌症中的效果。例如，可以将半胱氨酸残基引入Fc区，从而允许在该区中形成链间二硫键。如此产生的同型二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤以及抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.，J.Exp Med.，176：1191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.，148：2918-2922(1992)。也可以使用Wolff et al.，Cancer Research，53：2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体。可选择地，抗体可以被改造具有双Fc区并且可以从而具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design，3：219-230(1989)。
在优选的实施方案中，本文描述的抗体特异性地与对应于HTC细胞表面上存在的一个或多个公开的Ig超家族或TLR超家族成员的抗原结合，所述HTC源于造血系统的骨髓系中的祖细胞群体。骨髓系中的分化导致终末分化细胞的形成，所述终末分化细胞包括巨核细胞、红细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和骨髓树突状细胞等。这些细胞源自造血干细胞(HSC)，所述造血干细胞经过一系列的表现出逐步受限的分化潜能的祖细胞群体进行分化。HSC和祖细胞群体互相区别是基于，它们的分化为特定细胞亚类的能力和特定的对于所述细胞群体特异性的细胞标志物组的存在，以及其他区分特征。在某些实施方案中，本公开的单克隆抗体针对于骨髓系祖细胞，所述骨髓系祖细胞是标志物+HTC。在某些实施方案中，本公开的单克隆抗体针对定型骨髓祖细胞，所述定型骨髓祖细胞是标志物+HTC。
5.2.1修饰的抗体
在另一方面，本发明提供修饰的抗体，其源自特异性地与对应于本文公开的HTC标志物的抗原结合的抗体。修饰的抗体还包括如本文描述的重组抗体。
本领域技术人员会理解许多类型的修饰的或重组抗体。合适类型的修饰的或重组抗体包括但不限于，改造的鼠单克隆抗体(例如鼠单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体)、结构域抗体(例如Fab、Fv、VH、scFV和dsFv片段)、多价或多特异性抗体(例如双链抗体、微抗体(minibodies)、微型抗体(miniantibodies)、(scFV)2、三链抗体和四链抗体)以及如本文描述的抗体结合物。
在一方面，本发明包括结构域抗体。“结构域抗体”是抗体的功能性结合结构域，其相当于人抗体的重(VH)链或轻(VL)链的可变区。结构域抗体可以具有约13kDa的分子量，或少于完整抗体十分之一的大小。它们在多种宿主中良好表达，包括细菌、酵母和哺乳动物细胞系统。另外，结构域抗体是高度稳定的并且即使经受诸如冻干或热变性的严酷条件之后仍保留活性。参见，例如，美国专利第6,291,158号、第6,582,915号、第6,593,081号、第6,172,197号；美国系列号第2004/0110941号；欧洲专利第0368684号；美国专利第6,696,245号、WO 04/058821、WO 04/003019和WO 03/002609。在一个实施方案中，本发明的结构域抗体是单结构域。可以按照诸如美国专利第6,248,516号中描述的制备单结构域抗体，通过引用其全文将其并入本文。在某些实施方案中，本发明提供结构域抗体，其源自特异性地与对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族的一个成员的抗原结合的抗体。
在另一方面，本发明包括多特异性抗体。多特异性抗体包括双特异性抗体、三特异性抗体等。可以通过重组手段产生双特异性抗体，例如，通过使用亮氨酸拉链部分(即，来自Fos和Jun蛋白，其优选地形成异二聚体；Kostelny et al.，1992，J.Immnol.148：1547)或如美国专利第5,582,996号中描述的其他锁匙(lock and key)相互作用结构域结构。其他有用技术包括美国专利第5,959,083号和美国专利第5,807,706号中描述的那些技术。在一个实施方案中，本发明提供多特异性抗体，其包括特异性地与对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员的抗原结合的抗体。在另一实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性的。
双特异性抗体有时也被称为“双链抗体”。这些是与两种(或更多种)不同抗原结合的抗体。本领域内还已知三链抗体(三聚化sFV，以与双链抗体相似的方式形成，但是其中在单一复合物中产生三个抗原结合结构域；所述三个抗原结合结构域可以针对相同的或不同的表位)或四链抗体(在单一复合物中产生四个抗原结合结构域，其中所述四个抗原结合结构域可以针对相同的或不同的表位)等。可以使用本领域内已知的多种方法(Holliger and Winter，1993，Current Opinion Biotechnol.4：446-449)制造双链抗体、三链抗体和四链抗体，例如，化学制备或来自杂种杂交瘤。另外，可以通过基因融合构建这类抗体及其片段(Tomlinson et al.，2000，Methods Enzymol.326：461-479；WO 94/13804；Holliger et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448，以上每个通过引用其全文而将其并入本文)。在一个实施方案中，所述双链抗体、三链抗体或四链抗体源自特异性地与对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员的抗原结合的抗体。在优选实施方案中，所述双链抗体、三链抗体或四链抗体源自两种或更多种特异性地与不同抗原结合的单克隆抗体，每个抗原对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族的不同成员。
在另一实施方案中，本发明提供微抗体，其是包含连接到CH3结构域上的scFV的最小化抗体样蛋白，所述最小化抗体样蛋白源自特异性地与对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员的抗原结合的抗体。可以按照本领域内描述(Hu et al.，1996，Cancer Res.56：3055-3061)制备微抗体。
在另一实施方案中，本发明提供结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，其中所述结合结构域特异性地与对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员的抗原结合。所述融合蛋白可以包含被融合到免疫球蛋白铰链区多肽的标志物特异性地结合结构域多肽，所述免疫球蛋白铰链区多肽被融合到免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽，所述免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽被融合到免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽。在本发明中，可以通过本领域技术人员理解的方法制造标志物特异性抗体融合蛋白(参见，公布的美国专利申请第20050238646号、第20050202534号、第20050202028号、第2005020023号、第2005020212号、第200501866216号、第20050180970号和第20050175614号，以上每个通过引用其全文将其并入本文)。
在另一实施方案中，本发明提供源自标志物特异性抗体的重链蛋白(VHH)。天然存在的重链抗体(例如，没有轻链的骆驼科抗体)已经用于开发抗体来源的治疗蛋白，其通常保留天然存在的重链抗体的结构和功能性质。它们在本领域内称为Nanobodies
Figure BPA00001258869400281
。在本发明中，可以通过本领域技术人员理解的方法制造源自标志物特异性重链抗体的重链蛋白(VHH)(参见，公布的美国专利申请第20060246477号、第20060211088号、第20060149041号、第20060115470号和第20050214857号，以上每个通过引用其全文而将其并入本文)。
在一方面，本发明提供修饰的抗体，所述修饰的抗体是人抗体。在一个实施方案中，本文描述的标志物特异性抗体是完全人抗体。“完全人抗体(fully human antibody)”或“完整人抗体(complete human antibody)”是指仅具有源自人染色体的抗体的基因序列的人抗体。通过使用产生人抗体的小鼠的方法可以获得抗人标志物特异性完整人抗体，所述小鼠具有包含人抗体重链和轻链的基因的人染色体片段[参见，Tomizuka，K.et al.，Nature Genetics，16，p.133-143，1997；Kuroiwa，Y.et al.，Nuc.Acids Res.，26，p.3447-3448，1998；Yoshida，H.et al.，Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects(动物细胞技术：基础和应用方式)vol.10，p.69-73(Kitagawa，Y.，Matuda，T.and lijima，S.eds.)，Kluwer Academic Publishers，1999；Tomizuka，K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，722-727，2000]或通过从选自人抗体库噬菌体展示获得人抗体的方法获得(见Wormstone，I.M.et al.，Investigative Ophthalmology & Visual Science.43(7)，p.2301-8，2002；Carmen，S.et al.，Briefings in Functional Genomics and Proteomics，1(2)，p.189-203，2002；Siriwardena，D.et al.，Ophthalmology，109(3)，p.427-431，2002)。
在一方面，本发明提供的标志物特异性抗体，所述标志物特异性抗体是抗体类似物，有时被称为“合成抗体”。例如，多个近期研究利用具有植入的CDR的替代蛋白骨架(scaffolds)或人工骨架。这类骨架包括但不限于，被引入以稳定结合蛋白的三维结构的突变以及例如由生物相容的聚合物组成的完全合成的骨架。参见，例如Korndorfer et al.，2003，Proteins：Structure，Function，and Bioinformatics，Volume 53，Issue 1：121-129。Roque et al.，2004，Biotechnol.Prog.20：639-654。另外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)，以及基于利用纤连蛋白组分作为骨架的抗体模拟物的成果。
5.2.2交联抗体
在一方面，本发明提供交联抗体，其包括两个或更多个互相连接形成抗体复合物的本文描述的抗体。交联抗体也称为抗体多聚体、同源结合物和异源结合物。在本领域内已经观察到，之前未观察到具有信号转导活性的抗体多聚化可以导致具有强信号转导活性的多聚化抗体。这已经在抗肿瘤剂领域中特别引起注意。例如，已有报道，抗CD19、抗CD20、抗CD21、抗CD22和抗Her-2单克隆抗体的IgG-IgG同型二聚体化赋予这些同型二聚体以强抗肿瘤能力(Ghetie，M.et al.(1997)Proc.Natl.Acad.ScL，USA，Vol.94，pp-7509-7514，通过引用其全文将其并入本文)。另外，已知具有抗肿瘤活性的单克隆抗体的同型二聚体化，例如Rituximab
Figure BPA00001258869400291
，可以导致作为抗肿瘤剂的有效性的增加(Ghetie，M.(2001)Blood，Vo.97；5：1392-1398，通过引用其全文将其并入本文)。
在某些实施方案中，本文提供的抗体复合物包括针对一种或多种抗原的多聚体形式的抗体，所述抗原对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族的一个或多个成员。例如，本发明的抗体复合物可以采取单体免疫球蛋白分子的抗体二聚体、三聚体或高阶多聚体的形式。抗体的交联可以通过本领域内已知的各种方法完成。例如，抗体的交联可以通过抗体的天然聚集、通过化学或重组连接技术或本领域内已知的其他方法实现。例如，纯化的抗体制剂可以自发地形成包含抗体同型二聚体和其他高阶抗体多聚体的蛋白聚集体。在一个实施方案中，本发明提供同型二聚体化的抗体，其特异性地与对应于本发明公开的HTC标志物的抗原结合。
抗体可以通过本领域内已知连接技术进行交联或二聚体化(参见Ghetie et al.(1997)同上；Ghetie et al.(2001)同上)。可以利用非共价连接方法。在具体实施方案中，抗体的交联可以通过使用第二交联剂抗体实现。所述交联剂抗体可以来源于与目的抗体相比的不同的动物。例如，可以将山羊抗小鼠抗体(Fab特异性)添加至小鼠单克隆抗体以形成异二聚体。该二价交联剂抗体识别形成同型二聚体的两个目的抗体的Fab或Fc区。
在本发明的一个实施方案中，特异性地与对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员的抗原结合的抗体是使用山羊抗小鼠抗体(GAM)进行交联的。在另一实施方案中，所述GAM交联剂识别两个抗体的Fab或Fc区，每个抗体特异性地与对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族的相同或不同成员的相同或两个不同抗原结合。
也可以使用抗体的共价或化学连接方法。化学交联剂可以是同双功能的或异双功能的并且会共价结合形成同型二聚体的两个抗体。交联剂公知于本领域内；例如，同双功能连接物或异双功能连接物是公知的(参见，2006 Pierce Chemical Company Crosslinking Reagents Technical Handbook(2006年皮尔斯化学公司交联试剂技术手册)；Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques(生物结合技术)，Academic Press，San Diego，CA(1996)；Aslam M.and Dent AH.，Bioconjugation：protein coupling techniques for the biomedical sciences(生物结合：生物医学科学的蛋白连接技术)，Houndsmills，England：Macmillan Publishers(1999)；Pierce：Applications Handbook & Catalog(皮尔斯应用手册及目录)，Perbio Science，Ermbodegem，Belgium(2003-2004)；Haughland，R.P.，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Eugene(尤金荧光探针及研究化学品手册)，9th Ed.，Molecular Probes，OR(2003)；和美国专利第5,747,641号；通过引用将所有参考资料并入本文)。本领域技术人员应当理解抗体的氨基酸上不同功能性基团适用于修饰，包括交联。用于抗体交联的化学交联剂的合适实例包括但不限于，SMCC[琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯]、SATA[N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫基-醋酸酯]、N-羟基琥珀酰亚胺的半琥珀酸酯；磺基-N-羟基-琥珀酰亚胺；羟基苯并三唑和对硝基酚；二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺(ECD)、1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺甲碘盐(EDCI)(参见，例如，美国专利第4,526,714号，通过引用将该公开全部并入本文)。其他连接剂包括谷胱甘肽、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)、基于鎓盐的连接剂、基于聚氧乙烯的异双功能交联剂和其他试剂(Haitao，et al.，Organ Lett 1：91-94(1999)；Albericio et al.，J Organic Chemistry  63：9678-9683(1998)；Arpicco et al.，Bioconjugate Chem.8：327-337(1997)；Frisch et al.，Bioconjugate Chem.7：180-186(1996)；Deguchi et al.，Bioconjugate Chem.10：32-37(1998)；Beyer et al.，J.Med.Chem.41：2701-2708(1998)；Drouillat et al.，J.Pharm.Sci.87：25-30(1998)；Trimble et al.，Bioconjugate Chem.8：416-423(1997))。
用于抗体同型二聚体的形成的示例性操作步骤在美国专利公布第20060062786号和Ghetie et al.，(1997)(同上)中给出，通过引用其全文而将其并入本文)。在优选实施方案中，使用的化学交联剂是SMCC或SATA交联剂。
另外，本发明的抗体-抗体结合物可以通过本领域内已知技术互相共价结合，例如使用异双功能交联剂GMBS(马来酰亚胺丁氧基琥珀酰亚胺)和SPDP(N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯)[参见，例如，Hardy，″Purification And Coupling Of Fluorescent Proteins For Use In Flow Cytometry(用于流式细胞仪的荧光蛋白的纯化和连接)″，Handbook Of Experimental Immunology(实验免疫学手册)，卷1，Immunochemistry(免疫化学)，Weir et al.(eds.)，pp.31.4-31.12 4th Ed.，(1986)，和Ledbetter et al.美国专利第6,010,902号，以上每个通过引用其全文将其各自并入本文]。
另外，抗体可以通过美国专利公布第20060216284号和美国专利第6,368,596号中描述的硫醚交联进行连接，通过引用将其并入本文。如本领域技术人员所应当理解的，抗体可以在Fab区交联。在某些实施方案中，化学交联剂不与抗体的抗原结合区相互作用是可取的，因为这样可能影响抗体功能。
5.2.3结合抗体
本文公开的抗体可以与无机或有机化合物结合，以举例而非限制的方式包括，其他蛋白、核酸、碳水化合物、类固醇和脂质(参见，例如，Green，et al.，Cancer Treatment Reviews，26：269-286(2000))。所述化合物可以是有生物活性的。有生物活性的是指与未暴露于化合物的细胞相比，具有对于细胞的生理效应的化合物。生理效应是生物过程的变化，所述生物过程以举例而非限制的方式包括，DNA复制和修复、重组、转录、翻译、分泌、膜翻转、细胞粘附、信号转导和细胞死亡等。生物活性化合物包括药物化合物。
在一方面，抗体被结合或修饰以携带可检测化合物。将抗体与可检测的酶、荧光染料或配体结合提供用于靶抗原可视化或定量的信号。可以用各种酶标记抗体以提供高特异探针，其通过作用于底物产生有色或化学发光的产物而使靶标可视并放大信号。辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶是为了该目的常用的酶。荧光染料，例如，异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、藻红蛋白和Cy5，提供用于可视化和检测的有色试剂。合适的荧光化合物描述于Haughland，R.P.，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Eugene(尤金荧光探针及研究化学品手册)，9th Ed.，Molecular Probes(分子探针)，OR(2003)。
在另一方面，结合的化合物是螯合配体或大环有机螯合化合物，特别是用于细胞内离子浓度成像或用作医学成像用途的对比剂的金属螯合化合物。螯合配体是可以与多于一种供体原子结合至同一中心金属离子的配体。已经发现螯合剂或其复合物作为MRI对比剂、放射性药物应用和冷光探针的应用。对于评价细胞内离子浓度有用的螯合化合物的结合物可以是电压敏感染料和非电压敏感染料。用于测量细胞内离子水平的示例性染料分子以举例而非限制的方式包括，Quin-2、Fluo-3、Fura-Red、钙绿(Calcium Green)、钙橙(Calcium Orange)550580、钙深红(Calcium Crimson)、Rhod-2 550 575、SPQ、SPA、MQAE、Fura-2、Mag-Fura-2、Mag-Fura-5、Di-4-ANEPPS、Di-8-ANEPPS、BCECF、SNAFL-1、SBFI和SBFI。
在另一实施方案中，所述配体是结合顺磁金属、超顺磁金属或铁磁金属的螯合配体。这些配体作为用于医学成像的对比剂和用于将放射性金属递送至选择的细胞是有用的。金属螯合配体以举例而非限制的方式包括，二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、二乙烯三胺五乙酸双(甲酰胺)、大环四胺1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)和卟啉(参见，例如，The Chemistry of Contrast Agents in Medical Magnetic Resonance Imaging(医学磁共振成像中对比剂化学)，Merbach A.E.and Toth E.，Ed.，Wiley Interscience(2001))。顺磁金属离子，其可以通过磁共振成像以其螯合形式被检测到，包括例如，铁(III)、钆(III)、锰(II和III)、铬(III)、铜(II)、镝(III)、铽(III)、钬(III)、铒(III)和铕(III)。作为磁共振成像对比剂特别有用的顺磁金属离子包括铁(III)和钆(III)金属复合物。其他顺磁性、超顺磁性或铁磁性是本领域技术人员公知的。
在另一实施方案中，金属螯合物包含放射性金属。放射性金属可以用于诊断或作为基于将小剂量的放射递送至体内的特定部位的治疗。靶向金属放射性药物是通过将放射性金属离子与诸如用于磁成像的那些配体的金属螯合配体连接，并将螯合复合物递送至细胞来构建。示例性放射性金属螯合复合物是DTPA(参见，例如美国专利第6,010,679号)。
在其他方面，所述结合化合物是用于检测目的的肽标签，特别是在使用针对该肽的抗体中。各种标签多肽及其各自的抗体公知于本领域内。实例包括聚组氨酸(聚his)或聚组氨酸-甘氨酸(聚his-gly)标签；Flu Ha标签多肽及其抗体12CA5(Field et al.，Mol.Cell.Biol.8：2159-2165(1988))；c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan et al.，Mol.Cell.Biol.5：3610-3616(1985))；和单纯孢疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky et al.，Protein Engineering 3：547-553(1990))。其他标签多肽包括Flag肽(Hopp et al.，BioTechnology 6：1204-1210(1988))、KT3表位肽(Martin et al.，Science 255：192-194(1992))、微管蛋白表位肽(Skinner et al.，J.Biol.Chem.266：15163-15166(1991))和T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6393-6397(1990))。
在另一实施方案中，结合化合物可包含当被引入细胞时导致细胞死亡或损害细胞存活的毒素。合适的毒素是弯曲杆菌属毒素CDT(Lara-Tejero，M.，Science 290：354-57(2000))。与核酸酶具有同源性的CdtB亚基的表达导致细胞周期逮捕(arrest)并且最终细胞死亡。另一示例性毒素是白喉毒素(以及类似的假单胞菌属外毒素)，其通过细胞中ADP核糖化ef-2(延伸因子2)分子并防止翻译来发挥作用。白喉毒素A亚基的进入在包含该毒素片段的细胞中诱导细胞死亡。其他有用的毒素包括霍乱毒素和百日咳毒素(催化亚基A ADP核糖化调节腺苷酸环化酶的G蛋白)；来自菜粉蝶(cabbage butterfly)的pierisin，其是哺乳动物细胞中的凋亡诱导剂(Watanabe，M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：10608-13(1999))；核糖体失活毒素(例如，蓖麻毒素A链，Gluck，A.et al.，J.Mol.Biol.226：411-24(1992))；和黑杆菌素(Munoz，R.et al.，Cancer Lett.167：163-69(2001))。
适用于通过本文的组合物递送的生物活性化合物包括化疗化合物等，所述化疗化合物以举例而非限制的方式包括，长春碱、博来霉素、紫杉醇、顺铂、阿霉素(adriamycin)和丝裂霉素。适用于本用途的示例性化疗剂是作用于DNA合成和稳定性的化合物。例如，蒽环类化合物的抗肿瘤剂通过造成DNA中链断裂起作用并且被用作针对癌症的标准疗法。该类的示例性抗肿瘤剂是柔红霉素和阿霉素(doxorubicin)。这些化合物与包括抗体在内的蛋白的连接描述于Langer，M.et al.，J.Med.Chem.44(9)：1341-1348(2001)和King，H.D.et al.，Bioconjug.Chem.10：279-288(1999))。通过将抗肿瘤剂连接(attaching)或连接(linking)至抗体，所述化合物被高度特异性地递送至骨髓来源的HTC并且提高靶细胞的杀伤。
其他类抗肿瘤剂是抗生素的烯二炔家族，其代表性成员包括卡奇霉素(calicheamicins)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、埃斯培拉霉素(esperamincins)、达内霉素(dynemicins)、可达菌素(kedarcidin)和maduropeptin(参见，例如，Smith，A.L.and Nicolaou，K.C.，J.Med.Chem.39：2103-21 17(1996))。相似于阿霉素和道诺霉素，这些试剂的抗肿瘤活性归于它们在细胞DNA中产生链断裂的能力。抗体结合物已被用于将这些分子递送至表达被所述抗体识别的抗原的那些肿瘤细胞，并且显示出强抗肿瘤活性，伴随与未结合化合物相比降低的不希望的毒性(Hinman，L.M.et al.，Cancer Res.53：3336-3342(1993))。将烯二炔化合物与本文描述的组合物结合提供了另一种靶向于骨髓来源的HTC的方法。
放射性化合物作为信号(例如示踪剂)或通过将其递送至靶细胞来提供治疗效果(例如以放射性药物制剂的形式)是有用的，并且可以通过下文描述的方法连接至抗体。有用的放射性核素以举例而非限制的方式包括，3H、14C、32P、35S、51Cr、57Co、59Fe、67Ga、82Rb、89Sr、99Tc、111In、123I、125I、129I、131I和186Re。
化合物与抗体间的结合对于本领域技术人员是公知的，并且通常利用存在于所述抗体和化合物上或被引入所述抗体和化合物的功能性基团。功能性基团包括羟基、氨基、硫基、亚氨基和羧基部分等。功能性基团之间的反应可以由连接剂和交联剂辅助。交联剂和连接物以及相应的结合方法描述于Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques(生物结合技术)，Academic Press，San Diego，CA(1996)；Aslam M.and Dent AH.，Bioconjugation：protein coupling techniques for the biomedical sciences(生物结合：生物医学科学的蛋白结合技术)，Houndsmills，England：Macmillan Publishers(1999)；Pierce：Applications Handbook & Catalog(皮尔斯应用手册及目录)，Perbio Science，Ermbodegem，Belgium(2003-2004)；Haughland，R.P.，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Eugene(尤金荧光探针及研究化学品手册)，9th Ed.，Molecular Probes，OR(2003)；和美国专利第5,747,641号；通过引用将所有参考资料并入本文。示例性连接(coupling)剂或连接(linking)剂以举例而非限制的方式包括N-羟基琥珀酰亚胺的半琥珀酸酯、磺基-N-羟基-琥珀酰亚胺、羟基苯并三唑及对硝基酚、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺(ECD)、1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺甲碘盐(EDCI)(参见，例如，美国专利第4,526,714号，通过引用将该公开全部并入本文)。其他连接试剂包括谷胱甘肽、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)、基于鎓盐的连接剂、基于聚氧乙烯的异双功能交联剂和便于抗体与有机药物及肽以及其他配体连接的其他试剂(Haitao，et al.，Organ Lett 1：91-94(1999)；Albericio et al.，J Organic Chemistry 63：9678-9683(1998)；Arpicco et al.，Bioconjugate Chem.8：327-337(1997)；Frisch et al.，Bioconjugate Chem.7：180-186(1996)；Deguchi et al.，Bioconjugate Chem.10：32-37(1998)；Beyer et al.，J.Med.Chem.41：2701-2708(1998)；Drouillat et al.，J.Pharm.Sci.87：25-30(1998)；Trimble et al.，Bioconjugate Chem.8：416-423(1997))。
将治疗化合物与抗体连接的技术还描述于Arnon et al.，″Monoclonal Antibodies for lmmunotargeting of Drugs in Cancers Therapy(癌症治疗中用于药物免疫靶向的单克隆抗体)″于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体与癌症治疗)，Reisfeld et al.，ed.，pp243-256，Alan R.Liss，Inc.(1985)；Thorpe，et al.″The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody Toxin Conjugates(抗体毒素结合物的制备和细胞毒性特性)，″Immunol.Rev.62：119-58(1982)；和Pietersz，G.A.，″The linkage of cytotoxic drugs to monoclonal antibodies for the treatment of cancer(细胞毒性药物与单克隆抗体连接用于癌症治疗)，″Bioconjugate Chemistry 1(2)：89-95(1990)，通过引用将所有参考资料并入本文。
6.反义分子和小分子化合物
本发明的另一方面涉及包含单链核酸序列(RNA或DNA)的反义和有义分子，所述单链核酸序列可以与对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员的mRNA(有义)或DNA(反义)靶序列结合。根据本发明，反义或有义寡核苷酸包含对应于Ig超家族或TLR超家族成员基因的DNA的编码区的片段。该片段通常包含至少约14个核苷酸，优选地从约14至约30个核苷酸。反义或有义RNA或DNA分子通常长度至少约5个核苷酸、可选择地长度至少约15、至少约30、至少约50、至少约100、至少约150、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约700、至少约800、或至少约1000个核苷酸。基于编码给定蛋白的cDNA序列得到反义或有义寡核苷酸的能力描述于，例如，Stein and Cohen(Cancer Res.48：2659，1988)和van der Krol et al.(BioTechniques 6：958，1988)。
反义或有义寡核苷酸与靶核酸序列的结合导致双链体的形成，所述双链体的形成通过包括增强的双链体降解、转录或翻译的过早终止在内的数种手段中之一或其他手段阻断靶序列的转录或翻译。本发明包括这些方法。因此，反义寡核苷酸可被用于阻断对应于Ig超家族或TLR超家族成员的蛋白的表达，其中那些标志物蛋白可能在哺乳动物中骨髓性白血病的诱发和/或持久性中起作用。
对于反义结合优选的基因内位点包括合并了基因的开放读码框(ORF)的翻译起始(initiation)/起始(start)密码子(5’-AUG/5’-ATG)或终止(termination)/终止(stop)密码子(5′-UAA、5′-UAG及5-UGA/5′-TAA、5′-TAG及5′-TGA)的区。这些区涉及包含转录起始或终止密码子的任一方向(即5’或3’)的约25-约50个连续核苷酸的部分mRNA或基因。对于反义结合的其他优选区包括：内含子；外显子；内含子-外显子联结点；开放阅读框(ORF)或“编码区”，其是翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区；mRNA的5’帽，其包括通过5’-5’三磷酸连接连接至mRNA的最5’残基的N7-甲基化的鸟苷残基，并且包括5’帽结构本身以及邻接该帽的前50个核苷酸；5’非翻译区(5’UTR)，其是在翻译起始密码子的5’方向的部分mRNA，并且因此包括mRNA的5’帽位点与翻译起始密码子之间的核苷酸或基因上对应的核苷酸；和3’非翻译区(3’UTR)、其是在翻译终止密码子3’方向的部分mRNA，并且因此包括mRNA的翻译终止密码子与3’末端之间的核苷酸或基因上对应的核苷酸。
反义或有义寡核苷酸还包含具有修饰的糖-磷酸二酯主链(或其他糖连接，例如WO 91/06629中描述的那些)的寡核苷酸，并且其中这些糖连接是抗内源核酸酶的。这些具有抗性糖连接的寡核苷酸在体内稳定(即，能够抵抗酶降解)，但是保留能够与靶核苷酸序列结合的序列特异性。具有修饰的主链的寡核苷酸包括在主链中保留磷原子和在主链中没有磷原子的那些寡核苷酸。在其他实施方案中，核苷酸单元的糖连接和核苷酸间连接，即主链，被不同基团替换。其他修饰包括锁核酸(Locked Nucleic Acids)(LNAs)，其中2’羧基与糖环的3’或4’碳原子连接，从而形成双环(bycyclic)糖部分。有义或反义寡核苷酸分子也可以包含核苷碱基(碱基)修饰或取代。
根据本发明使用的反义和有义化合物可以通过固相合成的公知技术方便地和常规地制造。用于这类合成的设备由数个厂商销售，包括例如，Applied Biosystems(Foster City，Calif)。可以另外或可选择地使用本领域内已知的用于这类合成的任何其他手段。使用相似的技术制备修饰的寡核苷酸是公知的。本发明的化合物还可以与其他分子、分子结构或化合物混合物混合、封装、结合或以其他方法相关联，成为诸如脂质体、受体靶分子、口服剂型、直肠剂型、局部剂型或其他剂型，用于辅助摄取、分布和/或吸收。
可以通过任何基因转移方法或通过使用诸如Epstein-Barr病毒的基因转移载体将反义或有义寡核苷酸引入包含靶核酸序列的细胞，所述基因转移方法包括，例如CaPO4介导的DNA转染、电穿孔。在优选操作中，将反义或有义寡核苷酸插入合适的逆转录病毒载体。包含靶核酸序列的细胞与重组逆转录病毒载体体内或离体接触。合适的逆转录病毒载体包括但不限于，源自鼠逆转录病毒M-MuLV，N2(源自M-MuLV的逆转录病毒)的那些载体或指定为DCT5A、DCT5B和DCT5C的双拷贝载体(参见WO 90/13641)。
如WO 91/04753中所描述，有义或反义寡核苷酸也可以通过与配体结合分子形成结合物而被引入包含靶核苷酸序列的细胞。合适的配体结合分子包括但不限于，细胞表面受体、生长因子、其他细胞因子或与细胞表面受体结合的其他配体。优选地，配体结合分子的结合基本上不干扰该配体结合分子与其对应的分子或受体结合的能力，或基本上不阻碍有义或反义寡核苷酸或其结合形式进入细胞。可选择地，如WO 90/10448所描述，有义或反义寡核苷酸可以通过形成寡核苷酸-脂质复合物而被引入包含靶核酸序列的细胞。所述有义或反义寡核苷酸-脂质复合物优选地在细胞中通过内源脂肪酶解离。
在另一实施方案中，本发明提供小分子，其与本文公开的一种或多种Ig超家族或TLR超家族成员结合，优选地特异性地结合。在优选实施方案中，所述小分子是小有机分子，包括本领域已知的作为对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员的多肽的激动剂或拮抗剂的小有机分子。
在某些实施方案中，所述小分子与生长抑制剂或诸如毒素的细胞毒性剂结合。这些毒素包括，例如美登醇或卡奇霉素、抗生素、放射性同位素、溶核酶等。在本发明的治疗方法中有用的小分子优选地诱导其结合的细胞的死亡。如上文详述，与骨髓来源的HTC结合可以凭借与本文公开的表面表达的标志物结合而发生；或凭借与表面表达的标志物结合而发生，该表面表达的标志物本身与其在骨髓性HTC上的受体结合。
7.药物组合物
在包含本文教导中所描述的抗体和/或反义分子和/或小分子激动剂或拮抗剂的药物组合物的制备中，可以使用多种媒介和赋形剂以及给药途径，这对本领域技术人员应当是显而易见的。典型的剂型技术在inter alia，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：制药科学与实践)，19th Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)和Handbook of Pharmaceutical Excipients(药物赋形剂手册)，3rd Ed，Kibbe，A.H.ed.，Washington DC，American Pharmaceutical Association(2000)中教导；在此通过引用其全文并入本文。
药物组合物通常会包含药学上可接受的载体和药学上有效量的抗体或抗体混合物或其合适的盐。使用对于祖细胞群体特异性的单克隆抗体混合物作为治疗具有很多优点。异常地增殖的细胞具有突变的趋势，并且因此可能丢失被单一类型单克隆抗体识别的抗原。而且，靶细胞中单一靶抗原的抗原密度可能是低的，从而没有免疫系统破坏所述细胞所必需的足够的信号触发。本公开通过提供骨髓来源的HTC相关的免疫球蛋白(Ig)超家族或toll样受体(TLR)超家族的多个成员解决这些问题，不同单克隆抗体的混合物可以靶向于所述骨髓来源的HTC。
对于已知的小分子激动剂或拮抗剂，根据所述分子的已知特征可以相似地制备药物组合物。
所述药物组合物可以配制为粉剂、颗粒剂、溶液、悬液、气雾剂、固体、丸剂、片剂、胶囊剂、凝胶剂、局部霜剂、栓剂、经皮贴剂(transdermal patches)或本领域内已知的其他剂型。
对于本文描述的目的用途，药学上可接受的抗体的盐类意图包括本领域公认的任何药学上可接受的盐类，包括有机及无机酸和/或碱。盐类的实例包括钠、钾、锂、铵、钙、以及伯胺、仲胺和叔胺、低级碳氢化合物的酯，例如甲基，乙基和丙基。其他盐类包括有机酸，例如乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水杨酸等。
如本文所用的“药学上可接受的载体”包括在配制药物组合物中本领域技术人员已知的任何标准的药学上可接受的载体。因此，例如以药学上可接受的盐类或以结合物存在的抗体自身可以被制备为药学上可接受的稀释剂中的剂型；例如，盐溶液、磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)、乙醇水溶液、或葡萄糖溶液、甘露醇溶液、葡聚糖溶液、丙二醇溶液、油(例如，植物油、动物油和合成油等)溶液、微晶纤维素溶液、羟甲基纤维素溶液、羟丙基甲基纤维素溶液、硬脂酸镁溶液、磷酸钙溶液、明胶溶液、聚山梨酯80溶液等，或制备为适当的赋形剂中的固体剂型。
药物组合物通常还会包含一种或多种缓冲液(例如，中性缓冲盐溶液或磷酸盐缓冲盐溶液)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白、多肽或诸如甘氨酸的氨基酸、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基羟基甲苯和丁基羟基苯甲醚等)、抑菌剂、诸如EDTA或谷胱甘肽的螯合剂、佐剂(例如，氢氧化铝)、使剂型与接受体血液等渗、低渗或轻微高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。可选择地，本发明的组合物可以配制为冻干物。
尽管本发明的组合物中可以使用本领域技术人员已知的任何合适的载体，但载体的类型通常根据给药模式而不同。可以为任何适当的给药方式配制抗体组合物，包括例如，口服给药、鼻腔给药、黏膜给药、静脉内给药、腹膜内给药、皮内给药、皮下给药和肌肉内给药。
对于胃肠外给药，可以按照生理上可接受的稀释剂中的物质的溶液或悬液的可注射剂量给予所述组合物，所述稀释剂具有药物载体，所述药物载体可以是无菌液体，例如无菌无热原质水、油、盐溶液、甘油、聚乙二醇或乙醇。另外，组合物中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。药物组合物的其他组分是石油、动物、植物或合成来源的组分，例如，花生油、大豆油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯和豆蔻酸异丙酯等的非水溶液。可以以积存注射和植入物制剂的形式给予抗体，所述积存注射和植入物制剂可以按照允许活性成分持续释放的方式进行配制。示例性组合物包含5mg/ml抗体，配制在由50mM L组氨酸、150mM NaCl组成的水性缓冲液中，以HCl调整至pH 6.0。
通常，组合物被制备为可注射剂，所述可注射剂为液体溶液或悬液；适于注射前用合适的媒介恢复(reconstitution)的固体或粉剂形式，所述媒介以举例而非限制的方式包括，无菌无热原质水、盐溶液、缓冲溶液、葡萄糖溶液等。如下文进一步讨论的(参见，例如，Langer，Science 249：1527(1990)和Hanes，Advanced Drug Delivery Rev.28：97-119(1997))，所述制剂也可以乳化或封装在脂质体或诸如聚交酯、聚乙二醇或共聚物的微颗粒中。
另外，也可以将所述组合物引入或封装在脂质体的腔中，用于递送和延长其离体或体内的寿命。如本领域内已知的，脂质体可以分为不同类型：多层囊泡(MLV)、稳定多层囊泡(SPLV)、小单层囊泡(SUV)或大单层囊泡(LUV)。可以用各种脂质化合物制备脂质体，所述脂质化合物可以是合成的或天然存在的，包括磷脂酰醚和酯，例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；诸如胆固醇的甾类化合物；脑苷脂；鞘磷脂；甘油脂和其他脂质(参见，例如，美国专利第5,833,948号)。
阳离子脂质也适于形成脂质体。通常，所述阳离子脂质具有净正电荷并且具有亲脂性部分，例如甾醇或酰基或二酰基侧链。优选地，头基(head group)是带正电荷的。典型的阳离子脂质包括1，2-二油氧基-3-(三甲基氨基)丙烷、N-[1-(2，3，-二四去环氧基(ditetradecycloxy))丙基]-N，N-二甲基-N-N-羟乙基溴化铵、N-[1-(2，3，-二油氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵、N-[1-(2，3-二油氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵、3-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰]胆固醇和二甲基二十八烷基酰铵(dioctadecylammonium)。
脂质体还包含用亲水聚合物衍生化的囊泡，如美国专利第5,013,556号和第5,395,619号中提供的，在此通过引用并入(也可参见，Kono，K.et al.，J.Controlled Release 68：225-35(2000)；Zalipsky，S.et al.，Bioconjug.Chem.6：705-708(1995))以延长体内循环寿命。用于涂层或脂质体衍生的亲水聚合物包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲醚、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素等。
通过本领域内公知方法制备脂质体(参见，例如，Szoka，F.et al.，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467-508(1980))。一种典型的方法是脂膜水合技术，其中脂质组分混合于有机溶剂中，随后蒸发所述溶剂产生脂膜。优选地包含主题抗体的水性缓冲溶液中膜的水合作用得到乳状液，将所述乳状液超声处理或挤压以降低大小和多分散性。其他方法包括反相蒸发(参见，例如，Pidgeon，C.et al.，Biochemistry 26：17-29(1987)；Duzgunes，N.et al.，Biochim.Biophys.Acta.732：289-99(1983))、磷脂混合物冻融和醚灌注(ether infusion)。
在另一实施方案中，载体是微颗粒、微胶囊、微球和纳米颗粒的形式，其可以是生物可降解的或非生物可降解的(参见，例如，″Microencapsulates：Methods and Industrial Applications(微胶囊：方法和工业应用)，″in Drugs and Pharmaceutical Sciences(药物和制药科学)，Benita，S.ed，VoI 73，Marcel Dekker Inc.，New York(1996)；通过引用并入本文)。如本文所用的微颗粒、微球和纳米颗粒表示通常是固体的颗粒，其包含待递送的物质。所述物质处于所述颗粒的核心或连接至所述颗粒的聚合物网络。通常，微颗粒(或微胶囊或微球)与纳米颗粒间的差异之一是大小。如本文所使用的微颗粒具有约1至约＞1000微米的颗粒大小范围。纳米颗粒具有约10至约1000nm的颗粒大小范围。
多种材料对于制造微颗粒是有用的。非生物可降解的微胶囊和微颗粒包括但不限于，由聚砜，聚(丙烯晴-共-乙烯基氯化物)、乙烯-醋酸乙烯酯、羟基乙基异丁烯酸酯-甲基-异丁烯酸酯共聚物制成的那些微胶囊和微颗粒。这些对于植入用途是有用的，其中封装的组合物从胶囊扩散出来。在另一方面，所述微胶囊和微颗粒是基于生物可降解聚合物，优选地基于那些表现出低毒性并免疫系统充分耐受的生物可降解聚合物。这些生物可降解聚合物包括由纤维蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、胶原蛋白、明胶、卵磷脂、壳聚糖、藻酸盐或诸如聚赖氨酸的聚氨基酸制成的基于蛋白的微胶囊和微颗粒。用于封装的生物可降解的合成聚合物可以包括聚合物，例如聚交酯(PLA)、聚乙二醇(PGA)、聚(交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(己内酯)、聚二氧六环酮三甲烯碳酸酯、聚羟基烷酯(例如，聚(β-羟基丁酸酯))、聚(γ-谷氨酸乙酯)、聚(DTH亚氨基羰基(双酚A亚氨基碳酸酯))、聚(原酸酯)和聚氰基丙烯酸酯。制造包含主题组合物的微颗粒的各种方法是本领域内公知的，包括溶剂去除过程(参见，例如，美国专利第4,389,330号)、乳化和蒸发(Maysinger，D.et al.，Exp.Neuro.141：47-56(1996)；Jeffrey，H.et al.，Pharm.Res.10：362-68(1993))、喷雾干燥和挤出法。
另一类型的载体是纳米颗粒，其通常适用于静脉内给药。亚微米和纳米颗粒通常由本领域内已知的两亲性双嵌段、三嵌段或多嵌段共聚物制成。形成纳米颗粒中有用的聚合物包括但不限于，聚(乳酸)(PLA；参见Zambaux et al.，J.Control Release 60：179-188(1999))、聚(交酯-共-乙交酯)、聚(交酯-共-乙交酯)与聚己内酯的混合物、双嵌段聚合物聚(1-亮氨酸-嵌段-1-谷氨酸酯)、双嵌段与三嵌段聚(乳酸)(PLA)与聚(氧化乙烯)(PEO)(De Jaeghere，F.et al.，Pharm.Dev.Technol.；5：473-83(2000))、丙烯酸酯、芳香酰胺和聚苯乙烯等。如同对于微颗粒的描述，纳米颗粒可以是非生物可降解的或生物可降解的。纳米颗粒也可以由诸如聚(丁基氰基丙烯酸酯)的聚(烷基氰基丙烯酸酯)制成，其中治疗组合物被吸收到纳米颗粒上并且用表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)涂布。制造纳米颗粒的方法类似于制造微颗粒的那些方法，并且包括连续水相中的乳状液聚合、乳化-蒸发、溶液置换和乳化-扩散技术(参见，例如，Kreuter，J.Nano-particle Preparation and Applications，in Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy(纳米颗粒制备与应用，医学和药学中微胶囊和纳米颗粒)，pg.125-148，(M.Donbrow，ed.)CRC Press，Boca Rotan，FL(1991)；通过引用并入本文)。
本文描述的药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿或小瓶。这些容器通常密封，以该方式保护制剂的无菌度和稳定性直至使用。通常，如上文指出的，制剂可以以油或水媒介中的悬液、溶液或乳状液保存。可选择地，药物组合物可以保存在冷冻干燥条件下，只需要在即将使用前添加无菌液体载体。
8.抗体和其他试剂的用途
8.1抗体和小分子的治疗用途
使用抗体或抗体片段免疫靶向癌细胞的方法是本领域内公知的。美国专利第6,306,393号描述了抗CD22抗体在B细胞恶性肿瘤的免疫治疗中的用途，并且美国专利第6,329,503号描述了表达蛇形(serpentine)跨膜抗原的细胞的免疫靶向。可以将本文描述的抗体(包括人源化的或人单克隆抗体或其片段或其他修饰，任选地与细胞毒性剂结合)引入患者，从而所述抗体与癌细胞或其分泌的表达产物结合并且介导所述细胞和肿瘤的破坏和/或抑制所述细胞或肿瘤的生长。并非意图限制本公开，这些抗体可以发挥治疗效果的机制可以包括补体介导的细胞溶解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、调节肿瘤抗原的生理功能、抑制结合或信号转导通路、调节肿瘤细胞分化或增殖、改变肿瘤血管再生因子谱、调节免疫刺激或肿瘤抑制细胞因子和生长因子的分泌、调节细胞粘附和/或通过诱导凋亡。抗体也可以与毒性剂或其他治疗剂结合，例如上文详细讨论的放射性配体或细胞溶质毒素，并且也可以治疗上用于将毒性剂或治疗剂直接递送至肿瘤细胞。
在优选实施方案中，所述组合物具有涉及造血系统骨髓细胞的疾病状态或疾病的治疗的应用。本公开还提供使用所述抗体靶向于骨髓性白血病干细胞的方法。例如，本公开提供使用所述抗体治疗涉及骨髓系细胞的病症的方法。多种疾病具有定型祖细胞群体中的起源，或通过疾病细胞经过骨髓途径的分化而涉及祖细胞。
本文中“治疗”表示治疗性或预防性治疗，或对于疾病、病症或不希望的疾病状态的抑制措施。治疗包括在疾病症状开始之前和/或疾病的临床表现或其他表现之后，以合适的形式给予主题抗体以降低疾病严重程度、阻止疾病发展或根除疾病。疾病的预防包括拖延或延迟病症或疾病的症状的开始，优选地在对所述疾病具有增强的易感性的个体中。
本文描述的抗体特别适用于骨髓增殖性病症的治疗，所述骨髓增殖性病症通常也称为造血恶性肿瘤，其是涉及骨髓系细胞的增殖性病症。术语恶性肿瘤是指一个或多个异常细胞克隆的生长和增殖。白血病典型地描述了异常细胞存在于骨髓和外周血的疾病状态。骨髓增殖性病症，也称为骨髓性白血病或骨髓性白血病，被分为三个一般疾病状态组：骨髓细胞生成异常性病症、急性骨髓增殖性白血病和慢性骨髓增殖性病症。
骨髓增生异常综合症(MDS)包括密切相关的血液形成病症组，其中骨髓显示出提示白血病前期过程的性质上和数量上变化，但具有未必以急性白血病终止的慢性病程。包括白血病前期、难治性贫血、难治性骨髓细胞生成异常性贫血、郁积型(smoldering)或亚急性白血病、骨髓细胞生成异常综合症和脊髓发育不良在内的很多术语被用于描述MDS。这些疾病状态都是以成熟度受损的细胞骨髓(骨髓形成异常)和血细胞数量减少为特征。DMPS是以幼巨红细胞(megablastoid)的存在、巨核细胞发育异常以及反映增强的粒细胞成熟过程的异常母细胞数量的增加为特征。患有DMPS的患者显示出相似于见于急性骨髓性白血病的染色体异常，并且在一部分的患病患者中发展为急性骨髓性白血病(Kardon，N.et al.，Cancer 50(12)：2834-2838(1982))。
急性骨髓增殖性白血病(AML)，也称为急性非淋巴细胞性白血病、急性髓细胞白血病、急性原粒细胞白血病和急性粒细胞白血病，是以异常造血祖细胞的存在为特征，所述异常造血祖细胞被阻断在成熟的未分化或部分分化阶段，并且因此不能分化成骨髓细胞系、红细胞系和/或巨核细胞系。所述异常细胞阻碍骨髓中正常祖细胞的分化，导致血小板减少、贫血和粒细胞减少。当骨髓中至少30％的有核细胞是母细胞时，做出AML的诊断。根据增殖细胞形态学和细胞化学染色特性，急性骨髓性白血病被进一步分为M1至M7亚型。
慢性骨髓增殖性病症是以成熟和未成熟粒细胞、红细胞和血小板数目增加为特征的疾病状态的集合。慢性骨髓增殖性病症可以转变成该组内其他形式，伴随在急性骨髓性白血病中终止的趋势。该组内具体疾病包括真性红细胞增多症、慢性骨髓性白血病、原因不明的骨髓性白血病、原发性血小板增多症和慢性中性粒细胞白血病。
根据抗体的功能性，治疗制剂可以使用未修饰的标志物特异性抗体或与治疗化合物结合的抗体，所述治疗化合物例如毒素或细胞毒性分子。通常，当使用未修饰的抗体时，其通常具有功能性Fc区。本文的“功能性Fc区”表示用于实现Fc的生物功能的最小序列，所述Fc的生物功能例如与Fc受体结合，特别是与FcγR(例如，FcγRI、FcγRII和FcγRIII)结合。并非被理论所约束，据信Fc区可以通过与Fc受体免疫效应细胞结合和调节细胞介导的细胞毒性、内吞作用、吞噬作用、炎性细胞因子的释放、补体介导的细胞毒性和抗原呈递，影响抗肿瘤单克隆抗体的有效性。在这方面，多克隆抗体或单克隆抗体混合物将是有利的，因为它们与不同表位结合(对应于Ig超家族或TLR超家族不同成员的单一抗原或不同抗原的不同表位)，并且因此与使用单一单克隆抗体相比，在细胞表面具有更高的Fc密度。当然，为提高其在减少靶细胞的有效性，或当未修饰的抗体不是治疗有效时，可以使用与毒素或细胞毒性剂结合的抗体。因此，所述抗体不仅其本身作为治疗分子有用，它们还可以用于将治疗分子靶向递送至骨髓细胞。
可选择地，在抗体表现对于抗原和/或细胞功能的直接影响的情况下，增强Fc受体功能性可能较不显著。例如，这可能是由于标志物特异性抗体的结合空间上抑制了抗原与其对应配体之间的相互作用。
抗体组合物可以单独使用或与其他治疗剂联合使用以增强传统治疗对于骨髓性白血病的功效或靶向于该抗体不能靶向的异常细胞。抗体疗法与化疗、放射或外科手术方案的联合在未接受化疗治疗的患者中是优选的，然而，用抗体治疗的处置可适应于已接受了一种或多种化疗的患者。另外，抗体治疗也可以使使用减少的伴随化疗剂量成为可能，特别是在不能良好耐受化疗剂毒性的患者中。另外，在联合中，患有化疗剂抵抗的肿瘤的癌症患者的抗体治疗会诱导对这些试剂的敏感性和反应性。
在一方面，所述抗体辅助性地与治疗细胞毒性剂使用，所述治疗细胞毒性剂以举例而非限制的方式包括，白消安、硫鸟嘌呤、依达比星(idarubicin)、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、阿霉素、道诺霉素、依托泊甙(etoposide)和羟基脲。作为抗体治疗的辅助有用的其他试剂是特异性针对见于疾病状态中的异常细胞分子的化合物。这些试剂可以是疾病特异性的。例如，为了治疗起源于BCR-ABL活性的慢性骨髓性白血病，一类有用的化合物是abl激酶活性的抑制剂，例如，伊马替尼(Imatinib)，其是bcr-abl激酶抑制剂，和针对bcr的反义寡核苷酸(例如，Oblimersen)。其它试剂包括干扰素α、人源化抗CD52、脱乙酰酶抑制剂FR901228(缩酚酸肽(depsipeptide))等。
在另一方面，浆同位素连接于所述抗体和/或片段用于治疗目的。“同位素”表示具有相同数目的质子并且因此是同一元素但具有不同数目的中子的原子(例如，1H相比于2H或D)。术语“同位素”包括诸如非放射性同位素的“稳定同位素”以及诸如随时间衰变的那些同位素的“放射性同位素”和放射性的放射性核素。在一个实施方案中，所述抗体和/或片段用放射性同位素标记，这在放射免疫治疗中是有用的。合适的放射性同位素包括但不限于α发射体、β辐发射体和俄歇电子发射体(Behrt，T.et al.，(2000).Eur.J.Nuclear Med.vol.27(7)：753-765；Vallabhajosula，S.et al.，J.Nucl.Med.(2005)Apr；46(4)：634-41)。这些放射性同位素包括但不限于，[65]锌、[140]钕、[177]镥、[179]镥、[176m]镥、[67]镓、[159]镓、[161]铽、[153]钐、[169]铒、[175]镱、[161]钬、[166]钬、[167]铥、[142]镨、[143]镨、[145]镨、[149]钷、[150]铕、[165]镝、[111]铟、[131]碘、[125]碘、[123]碘、[88]钇和[90]钇。合适的放射性的放射性核素包括但不限于，67Cu、90Y、125I、131I、186Re、188Re、211At、212Bi。根据本文提供的公开，抗体的这些和其他用途对本领域技术人员将是显而易见的。
已知的小分子激动剂或拮抗剂也可以发现在治疗一种或多种上文描述的骨髓性血液学增殖性病症的方法中的用途。通常，所述方法包括给予治疗有效量的小分子(或小分子混合物)。与上文关于免疫治疗详述的类似，所述治疗组合物可以使用未修饰的小分子或任选地与毒素或细胞毒性分子或生长抑制试剂结合的小分子。例如，所述小分子可以与美登醇或卡奇霉素、抗生素、放射性同位素或溶核酶等结合。
所述小分子与骨髓来源的HTC的结合优选地诱导细胞死亡。细胞死亡可以由结合的细胞毒性分子介导或由小分子自身的结合所诱导的生理反应介导。
8.1.1.给药和剂量
达到治疗效果所需的组合物的量会根据特定目的的常规规程以经验为主确定。通常，对于离体或体内给予所述组合物用于治疗目的，以药学上有效的剂量给予所述组合物。“药学上有效的量”或“药学上有效的剂量”表示足以产生所需生理效应的量或可以达到所需结果的量，特别是对于治疗或除退病症或疾病状态，包括降低或消除所述病症或疾病的一种或多种症状或表现。作为说明，将抗体给予患有骨髓增殖性病症的患者不仅在根除或改善基础疾病时，而且在所述疾病相关的症状的严重程度或持续时间降低时提供治疗益处。治疗益处还包括阻止或减缓基础疾病或病症的进程，无论是否实现改善。
给予个体的量会根据给药的试剂、诸如预防或治疗的给药目的、个体状态、给药方式、给药次数、给药间隔等而不同。这些可以由本领域技术人员以经验为主确定并且可以根据治疗反应的程度来调整。在确定合适的剂量中考虑的因素包括但不限于，个体的体型和重量、个体的年龄和性别、症状的严重程度、疾病阶段、试剂递送方法、试剂半衰期、试剂功效以及已经给予或将给予的其他治疗方案。要考虑的疾病阶段包括疾病是否是急性或慢性、复发或缓和期以及疾病的进展性。根据本文提供的公开，确定治疗有效量的给药的剂量和时间完全处于本领域技术人员的技术之中。
对于本公开的任何组合物，通过本领域公知的方法容易地确定治疗有效剂量。例如，可以从细胞培养或其他体外检测估计初始的有效剂量。例如，Sliwkowsky，M X et al.，Semin.Oncol.26(suppl.12)60-70(1999)描述了抗体依赖性细胞毒性的体外测量。然后，可以在动物模型中制定剂量以产生循环浓度或组织浓度，包括通过细胞培养检测测定的IC50的那些循环浓度或组织浓度。下文实施例中详细描述了对于白血病的合适的动物模型。
另外，通常通过细胞培养检测和/或实验动物测定毒性和治疗功效，通常通过测定LD50(测试群体中50％致死的剂量)和ED50(测试群体的50％中的治疗有效性)。毒性和治疗有效性的剂量比是治疗指数。优选的是，单独或联合，表现出高治疗指数的组合物。有效量的确定完全处于本领域技术人员的技术之中，特别是在给出了本文提供的详细公开的情况下。指导也见于标准参考工作，例如，Fingl and Woodbury，General Principles In：The Pharmaceutical Basis of Therapeutics(治疗的药物基础中的一般原理)pp.1-46(1975)，以及其引用的参考资料。
为达到初始耐受剂量，要考虑到所述抗体在人和非人灵长类中是免疫原性的可能性。免疫应答可能是生物学上显著的并且可能损害所述抗体的治疗功效，即使该抗体部分地或主要地由人免疫球蛋白序列组成，例如，诸如嵌合抗体或人源化抗体的情况下。在某些实施方案中，给予初始高剂量的抗体，从而建立对与所述治疗抗体的一定程度的免疫耐受。耐受剂量足以防止或减少对于标志物特异性抗体的重复给药所诱导的抗体反应。耐受剂量的优选范围是10mg/kg体重-50mg/kg体重(含10mg/kg体重和50mg/kg体重)。耐受剂量的更优选的范围是20-40mg/kg(含20和40mg/kg)。耐受剂量的仍然更优选的范围是20-25mg/kg(含20和25mg/kg)。
在这些治疗方案中，优选地以0.1-10mg/kg体重(含0.1和10mg/kg体重)的范围给予抗体的治疗有效剂量。更优选的第二治疗有效剂量范围是0.2-5mg/kg体重(含0.2和5mg/kg体重)。仍然更优选的治疗有效剂量范围是0.5-2mg/kg(含0.5和2mg/kg)。在可选择的治疗方案中，后续治疗剂量(dose)或剂量(doses)可以与耐受剂量是相同或不同的剂型和/或可以通过与耐受剂量相同或不同途径进行给药。
对于本发明的用途，根据待治疗的疾病状态、主题抗体或其他试剂的形式以及药物组合物选择给药方法。抗体组合物或小分子组合物的给药可以以多种方式完成，包括但不限于，连续地、皮下、静脉内、口服、局部、经皮、腹膜内、肌肉内和膀胱内。例如，微颗粒、微球和微胶囊剂型对于口服、肌肉内或皮下给药是有用的。脂质体和纳米颗粒特别适于静脉内给药。药物组合物的给药可以通过单一途径或同时通过几种途径。例如，腹膜内给药可以伴有静脉内注射。优选地静脉内、腹膜内、肌肉内或皮下给予治疗剂量。在某些实施方案中，小分子组合物可以口服给药。
所述组合物可以给予一次或几次。在某些实施方案中，根据所治疗的适应症和开处方医生的判断等，可以每天一次、每天几次或数次或甚至每天多次给予所述组合物。
也可以通过本领域技术人员公知的缓释或长期递送方法实现所述组合物的给药。本文所用的“缓释”或“长期释放”表示递送系统给予药学治疗量的主题试剂多于一天，优选地多于一周，并且最优选地至少约30天-约60天或更长。长期释放系统可以包括含有所述抗体的可植入固体或凝胶，例如上文描述的生物可降解聚合物(Brown，D M et al.，Anticancer Drugs 7507-513(1996))；泵，包括蠕动泵、氟碳化合物推进泵、渗透泵和微渗透泵等。
本发明的方法考虑到标志物特异性单克隆抗体以及不同的mAb组合的给药。如上文所讨论的，两种或更多种单克隆抗体与单一抗体相比可以提供改进的效果。例如，单克隆抗体与结合诸如对应于Ig超家族或TLR超家族成员的抗原的不同抗原另一单克隆抗体的组合与单一抗体相比可以提供改进的效果。这些mAb“混合物”由于其包含mAb而可以具有某些优势，所述mAb开发不同的效应机制或将细胞毒性mAb与依赖于免疫效应功能性的mAb直接组合。特异性mAb组合可以表现出协同治疗效果。本发明的某些方法也考虑到将一种或多种已知的小分子激动剂或拮抗剂单独给药或与一种或多种本文描述的mAb联合给药。小分子联合特异性mAb可以表现出协同治疗效果。
8.2抗体和其他试剂的诊断用途
本发明还提供使用本发明的组合物鉴定抗原的存在的方法，所述组合物任选地与合适的标记结合或用其他手段与合适的标记关联。这些方法包括将测试样品与一种或多种本发明的标志物特异性抗体孵育并且检测与所述测试样品中组分结合的抗体。孵育抗体与测试样品的条件可以变化。孵育条件取决于检测中采用的形式、采用的检测方法和使用的抗体。本领域技术人员应当认识到，任何一个通常可用的免疫学检测形式可以容易地调整以采用本发明的抗体(参见Chard，T.，An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques(放射性免疫测定及相关技术导论)，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands(1986)；Bullock，G.R.et al.，Techniques in Immunocytochemistry(免疫细胞化学技术)，Academic Press，Orlando，Fla.Vol.1(1982)，Vol.2(1983)，Vol.3(1985)；Tijssen，P.，Practice and Theory of immunoassays：Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(免疫测定实践与理论：生物化学与分子生物学实验技术)，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands(1985)。
待评价的样品可以是包含表达产物(例如，RNA转录物或细胞外蛋白)的任何样品。“测试样品”通常是指获自或源自患有或被怀疑患有骨髓来源的血液学增殖性病症的患者的样品。本发明的测试样品包括细胞、细胞的蛋白或膜提取物、或生物流体。样品可以包括脑、血液、血清、血浆、淋巴液、骨髓、血浆、淋巴、尿液、组织、粘液、痰、唾液或其他细胞样品。使用的测试样品会根据检测形式、检测方法的性质和使用的组织、细胞或提取物和待检测的样品而不同。制备细胞的蛋白提取物或膜提取物的方法是本领域内公知的并且可以容易地调整以获得与所使用的系统相容的样品。
在优选实施方案中，所述测试样品获自外周血，特别是来自动员外周血(MPB)。最初获自个体的样品通常富集干细胞。如上文所述，造血干细胞可以通过某些表面标志物的有或无进行鉴定，包括例如，CD34+、CD38-、以及Lin-和/或CD90+。
本发明提供骨髓来源的血液学增殖性病症的诊断方法，其中检测了Ig超家族或TLR超家族的一种或多种公开的成员的表达产物的水平。“检测”及其语法变体，是指评价、测量、读取或用其他方法测定对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族的一种或多种成员的表达产物的水平或量的值。当表达产物是通过编码给定的Ig或TLR超家族成员的基因的转录或翻译而源自所述给定的Ig或TLR超家族成员时，所述表达产物“对应于”所述给定的Ig或TLR超家族成员。如本文所述，表达水平是指表达产物的表达的量。表达水平的值也被称为“信号”。表达水平的值可以是绝对值或相对值，所述相对值例如在与对照水平比较中提供的值。表达水平的值可以是原始值，或任选地是重新调整、过滤和/或标准化的值。使用的方法将取决于，例如表达产物的性质(例如RNA或多肽)以及产物的具体特征和数据的意图用途。
例如，在一个实施方案中，所述表达产物是诸如RNA的转录产物。RNA包括，例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA等，包括从基因转录的任何核酸分子。测量的核酸分子水平可以直接来源于所述基因，或可选择地来源于对应的调节基因或调节序列元件。此外，可以检测基因和基因表达产物的变体包括，例如剪接变体和多态性等位基因。
检测RNA转录物水平的方法包括，例如利用特异性杂交探针或这些探针的阵列。在优选实施方案中，所述探针包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列可以与转录的RNA序列的全部或部分杂交。
允许杂交的严紧性条件可以是高至中至低。如本文所用的中严紧性条件是指本领域技术人员已知的那些中严紧性条件，例如，如Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，2ed.Vol.1，pp.1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)所定义的。中严紧性条件包括，使用对于硝酸纤维素滤器的预洗涤溶液5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)，50％甲酰胺、6×SSC、42℃的杂交条件(或42℃、50％甲酰胺中的其他类似的杂交液，例如斯塔克氏溶液(Stark’s solution))，和约60℃、0.5×SSC、0.1％SDS的洗涤条件。高严紧性条件通常涉及，例如，杂交条件如上，在68℃、0.2×SSC、0.1％SDS洗涤。本领域技术人员应当认识到，如果需要，可以根据诸如探针长度的因素调整温度和洗涤溶液盐浓度。杂交探针可以是任何长度并且通常由至少约5个核苷酸、至少约10个、至少约15个、至少约20个或至少约30个核苷酸组成。较长的长度适用于低严紧性条件。
探针可以包括天然碱基(即A、G、U、C或T)或修饰的碱基(7-脱氮鸟嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷)。另外，探针中的碱基可以通过除磷酸二酯键之外的连接来连接，只要该键不干扰杂交。因此，探针可以是肽核酸，其中组成碱基通过肽键连接，而不是磷酸二酯键。
在某些实施方案中，使用多于一种杂交探针，例如，2、3、4、5、10或更多种探针，直至包括和超过与本文公开的Ig超家族或TLR超家族的成员一样多的探针。在某些实施方案中，不同的探针针对不同的RNA产物，例如，对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族两个或更多不同成员的RNA产物。例如，可以使用用于检测Ig超家族或TLR超家族的2个、3个、4个、5个或更多成员的表达水平的探针。
在优选实施方案中，所述探针被固定在不同已知位置中，例如固定在阵列上。阵列是指具有连接了许多不同核酸序列(探针)的表面的固体支持物。所述阵列可以是合成地或生物合成地制备，并且可以呈现多种形式，例如，限定在树脂珠、二氧化硅芯片或其他固体支持物的化合物库，以及通过将核酸点样在基底上制备的核酸库。所述固体支持物可以是具有刚性或半刚性表面(surface)或表面(surfaces)的任何材料或材料组。通常，所述固体支持物的至少一个表面是基本平坦的，尽管在某些情况下所述阵列会包含孔，突起区、钉、刻沟等。尽管平坦的阵列表面是优选的，但所述阵列可以焊接在几乎任何形状的表面上或者甚至多重表面。固体支持物可以采取珠、树脂、诸如光学纤维的纤维、凝胶、微球或其他几何构型的形式。参见，美国专利号第5,770,358、第5,789,162号、第5,708,153号、第6,040,193号和第5,800,992号，通过对于所有目的引用其全文而将其并入。
这些阵列通常称为“微阵列”，或通俗地“芯片”，并且本领域内已有描述，例如，美国专利第5,143,854号、第5,445,934号、第5,744,305号、第5,677,195号、第6,040,193号、第5,424,186号和Fodor et al.，Science，251：767-777(1991)，通过对于所有目的引用其全文而将以上每个并入。通常使用机械合成方法或光引导合成方法制造这些阵列，所述光引导合成方法可以合并光蚀刻法和固相合成法的组合。使用机械合成方法合成这些阵列的技术描述于，例如，美国专利第5,384,261号，通过对于所有目的引用其全文而将其并入本文。也可以使用可商业获得的探针和阵列，包括，例如，Affymetrix人U133Plus 2.0阵列。
在优选实施方案中，表达产物是mRNA，并且通过将样品与合适的微阵列接触并测定所述样品中的核酸与所述微阵列上的探针杂交的程度获得mRNA水平。
例如，mRNA水平可以获自GeneChipTM探针阵列或微阵列(Affymetrix，Inc.)(美国专利第5,631,734号、第5,874,219号、第5,861,242号、第5,858,659号、第5,856,174号、第5,843,655号、第5,837,832号、第5,834,758号、第5,770,722号、第5,770,456号、第5,733,729号和第5,556,752号，以上所有通过引用其全文而将其并入本文)，并且表达水平可以用软件(例如，Affymetrix GENECHIPTM软件)计算。简要地说，置于特定严紧性条件的来自样品的核酸(例如mRNA)与芯片上的探针杂交。在与阵列杂交之前，将待分析的核酸(例如，对应于HTC标志物的mRNA)进行分离、扩增并且用可检测标记进行标记(例如，32P或荧光标记)。一旦杂交发生，所述阵列被插入可以检测杂交模式的扫描仪。以从标记的基团发射出的光收集杂交数据，所述标记的基团已与探针阵列结合。与对应于HTC标志物的mRNA完全匹配的探针比具有错配的那些探针产生更强的信号。由于序列和阵列上每个探针的位置是已知的，通过互补性，测定所施加的核酸与探针的同一性。来自标记的mRNA/DNA微阵列杂交的定量可以通过扫描微阵列以测量微阵列上每个位置的杂交的量进行。这可以使用例如Affymetrix扫描仪(Affymetrix，Santa Clara，Calif.)进行。微阵列只是检测RNA水平的方法之一。本领域内已知的或未来开发的其他方法可以用于本发明。
在另一实施方案中，所述表达产物是翻译产物，例如，本文公开的一种或多种Ig超家族或TLR超家族蛋白。Ig超家族或TLR超家族蛋白包括任何多肽或其衍生物，包括，例如肽、糖蛋白、脂蛋白、和核酸-蛋白复合物。
用于蛋白检测和定量的技术是本领域内已知的，例如，可以使用本领域内常规方法获得对于蛋白或多肽特异性的抗体，并且可以检测和测量这些抗体与蛋白或多肽表达产物的特异性结合。如上文所讨论的，检测蛋白水平的方法优选地涉及利用本公开的抗体。在某些实施方案中，已知与对应于免疫球蛋白(Ig)超家族或toll样受体(TLR)超家族的公开的成员结合的小分子可以被类似地可检测地标记和/或连接至固体支持物。
在某些实施方案中，使用多于一种抗体，例如两个或更多mAb。在某些实施方案中，不同的mAb针对从自本文公开的Ig超家族或TLR超家族的两个或更多不同成员表达的蛋白质性质的产物。例如，可以使用用于检测本文公开的Ig超家族或TLR超家族的2个、3个、4个、5个或更多成员的表达水平的抗体。在某些实施方案中，在来自个体的给定样品或多个样品中，检测了RNA和蛋白水平两者。
RNA或抗原水平可以与对照水平相比较，例如与使用正常HSC获得的水平比较。包含一种或多种正常HSC的对照样品可以获自，例如未患有血液学增殖性病症的个体，例如未患有骨髓来源的血液学增殖性病症的个体。优选地，以与获得测试样品类似的方式获得对照样品，例如，从相同的器官、组织或液体获得(如上文关于测试样品所详述的)；并且进行分选以富集对应的细胞类型。类似地，优选地以与用于获得测试值的方式类似的方式评价对照样品中的RNA或抗原水平。允许直接比较测试和对照水平的方法是本领域内已知的，并且该比较的具体实例在下文实施例1中详述。在某些实施方案中，由之前获得的数据提供对照水平，例如来自在先前检测中已经检测的对照样品、来自公布的数据、和/或来自易获得的数据库。
诊断是基于测试样品中的给定表达产物水平与对照样品中的给定表达水平比较之间的相关性。例如，如下文实施例1中详述的，与正常HSC样品相比，AML HTC样品中的本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员的mRNA水平更高。优选地，表达水平的差异为至少约2倍、至少约3倍、至少约5倍、至少约7倍、至少约10倍或至少约15倍。在特别优选的实施方案中，表达水平的差异为至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。在仍然更优选的实施方案中，表达水平的差异为至少约70倍、至少约100倍、至少约200倍或多至接近300倍、400倍或500倍。例如，AML HSC中CD84 mRNA水平是正常HSC中的15倍(参见表1)。因此，单独本公开提供的信息或结合其他测试结果，有助于诸如AML的骨髓来源的血液学增殖性病症的样品分类和诊断。
在某些实施方案中，获得和/或检测多于一个测试样品和/或多于一个对照样品。例如，如下文实施例1中所示，所有3个正常样品显示出每个HTC标志物的低水平表达，然而至少3个AML样品中的2个显示出高表达水平。可选择地，AML样品与正常HSC相比至少5倍地过表达细胞因子受体。诊断可考虑到多于一个测试样品和/或多于一个对照样品之间表达水平的差异。在某些实施方案中，使用给定样品进行重复检测。
在某些实施方案中，可以检测多于一个HTC标志物的表达。可以同时检测本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员。例如，在某些实施方案中，检测2个、3个、4个、5个或更多个本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员。多个基因的检测可以提供所述样品更准确的评价。可以使用多种方法测定表达产物水平与诸如AML的给定疾病之间的相关性。样品分类的方法描述于，例如，Golub et al.于2000年4月6日提交的美国专利申请系列第09/544,627号，通过引用其全文将其教导并入本文。
本发明还提供预测治疗骨髓来源的血液学增殖性病症的功效的预后方法，其中检测一种或多种公开的Ig超家族或TLR超家族成员的表达产物的水平，并且其中所述表达产物水平与治疗结果相关。本文所使用的“治疗结果”是指关于疾病的治疗功效，即疾病对与特定治疗的反应。表达产物的水平可以用于检测给定病症会良好地响应于特定治疗的可能性，或确定许多治疗选择中的哪个是更优选的。在某些实施方案中，所述治疗是本文公开的一种，例如，本文所描述的抗体的一种或多种治疗用途。在某些实施方案中，所述治疗是本领域内已知的或使用的或将使用的其他治疗；或这些治疗与本文公开的一种或多种治疗的组合。
关于，例如，测试和对照样品、干细胞分选、Ig超家族或TLR超家族一个或多个成员的用途、RNA和/或抗原水平的检测和数据的相关性等的本公开上文，正如对于诊断方法所提供的，也适用于本文公开的预后方法。
在优选实施方案中，表达产物是RNA并且测试样品中的RNA水平与对照水平比较。在特别优选的实施方案中，表达产物是mRNA，并且通过将样品与合适的微阵列接触并测定样品中的核酸与微阵列上的探针杂交的程度获得mRNA水平。
在特别优选的实施方案中，表达产物是mRNA并且较低的mRNA水平与较有利的治疗结果相关。例如，高于对照水平约10倍的CD84表达水平比高于约30倍的CD84表达水平指示更有利的结果。在某些实施方案中，检测多于一个Ig超家族或TLR超家族成员的表达水平；并且多个标志物的较低表达水平进一步指示更有利的治疗结果。
本发明还提供监测治疗骨髓来源的血液学增殖性病症的功效的方法，其中在不同时间点检测一种或多种公开的Ig超家族或TLR超家族成员的表达产物的水平，并且所述表达产物水平与治疗结果相关。不同时间点可以包括，例如，诊断时、治疗方案开始前、治疗方案期间有间隔的时间和治疗方案结束之后。时刻间隔可以包括治疗方案起始之后数小时；1天；2、3或4天；1周；2、3、4、5或6周；1个月；2、3、4、5或6个月；1年或几年。在某些实施方案中，所述治疗是本文公开的一种，例如，本文所描述的抗体的一种或多种治疗用途。在某些实施方案中，所述治疗是本领域内已知的或使用的或将使用的其他治疗；或这些治疗与本文公开的一种或多种治疗的组合。
关于，例如，测试和对照样品、干细胞分选、Ig超家族或TLR超家族一个或多个成员的用途、RNA和/或蛋白水平的检测和数据的相关性等的本公开上文，正如对于诊断方法所提供的，也适用于本文公开的监测方法。
在优选实施方案中，表达产物是RNA并且测试样品中的RNA水平与对照水平比较。在特别优选的实施方案中，表达产物是mRNA，并且通过将样品与合适的微阵列接触并测定样品中的核酸与微阵列上的探针杂交的程度获得mRNA水平。
监测治疗的功效在例如便于疾病的临床控制中是有用的，例如，在必须做出是否继续治疗过程或进行其他治疗选择的决定时。根据不同时间点采集的测试样品中，例如特定治疗的给药之前和之后，给定表达产物(product)(或产物(products))的水平的变化，可以确定骨髓性白血病是否对于该治疗做出阳性反应。
表达产物水平从与骨髓来源的HTC相关的水平向与正常HSC相关的水平的改变是有效的治疗方案的证据。在某些实施方案中，对应于本文公开的一种或多种Ig超家族或TLR超家族成员的表达产物水平的降低表明对于治疗的阳性反应。所述降低表明向正常HSC样品中所见水平的趋势。例如，如下文实施例1中详述的，对于本文公开的Ig超家族或TLR超家族的每个成员，AML HTC中所述表达产物水平高于正常HSC中的水平。一个或多个公开的HTC标志物的表达水平的降低，例如，在治疗开始之后获得的测试样品中，会表明阳性反应。
在优选实施方案中，在治疗过程期间，一种或多种HTC标志物的表达水平降低至少约5倍、至少约7倍、至少约10倍或至少约15倍。在特别优选的实施方案中，在治疗过程期间，一种或多种HTC标志物的表达水平降低至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍或至少约50倍。在仍然更优选的实施方案中，在治疗过程期间，一种或多种HTC标志物的表达水平降低至少约70倍、至少约100倍、至少约200倍或多至接近约300倍、约400倍或约500倍。例如，AML HSC中CD84 mRNA水平是正常HSC中水平的15倍(参见表1)。降低至10或仅2倍于正常HSC中的CFD mRNA水平是有效的治疗方案的证据。
在某些实施方案中，本发明的方法适于诸如骨髓增殖性病症的骨髓来源的血液学增殖性病症的诊断、预后和/或监测。本发明还提供诊断、预后和监测骨髓增殖性病症的方法，所述骨髓增殖性病症是慢性骨髓性白血病(CML)和/或急性骨髓性白血病(AML)。在特别优选的实施方案中，骨髓性血液学增殖性病症是AML并且使用包含AML HTC的测试样品检测RNA或抗原水平，将该水平与获自正常HSC对照样品的对照水平比较。
9.试剂盒
在本发明的另一方面，提供包含一种或多种实施本发明方法所必需的试剂的试剂盒。具体而言，某些实施方案提供具有一个或多个容器的分格试剂盒，其包含：(a)包含一种本发明的标志物特异性抗体或复合物的第一容器，例如包含特异性地结合对应于一个本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员的第一抗原的第一单克隆抗体；和(b)包含以下一个或多个的一个或多个其他容器：洗涤试剂、能够检测抗体存在的试剂；和/或本发明的另一标志物特异性抗体或复合物，例如特异性地结合对应于本文公开的Ig超家族成员或TLR超家族的不同成员的第二抗原的第二单克隆抗体。在某些实施方案中，试剂盒包括其他容器，所述容器例如包含针对对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族的第三、第四、第五等成员的第三、第四、第五等抗体。在某些实施方案中，其他容器包含一种或多种在本文教导的预后、诊断和/或治疗方法中有用的已知的小分子激动剂或拮抗剂。
试剂盒通常包含容器，所述容器可以用诸如玻璃或塑料的多种材料形成，并且可以包括，例如，瓶(bottles)、小瓶(vials)、注射器和试管。分格试剂盒包括任何试剂盒，其中试剂被容纳在单独容器中。这些容器包括小玻璃容器、塑料容器或塑料带或纸带。这些容器允许试剂从一个分格至另一分格的高效转移，从而样品和试剂不交叉污染并且每个容器的试剂或溶液可以以定量的方式从一个分格添加到另一分格。本领域技术人员应当容易地认识到，本发明的公开的抗体可以被容易地合并入一种本领域内已知的已建立的试剂盒形式。
本文提供的是包括本文描述的组合物的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含本文公开的杂交瘤、复合物、抗体和/或抗体混合物。在某些实施方案中，提供了用于治疗应用的试剂盒，例如容纳药物制剂的试剂盒，所述药物制剂例如一种或多种本文描述的药物组合物。在某些实施方案中，所述试剂盒包含至少一种其他试剂，包括其他抗体、针对HSC的其他单克隆抗体、本文描述的其他试剂、定型祖细胞、多克隆抗体或作为用于检测骨髓细胞类型的试剂的抗体混合物。与所述抗体和试剂反应的冷冻或固定形式的HSC、CMP、GMP和/或MEP形成所述试剂盒其它内容物。
在某些实施方案中，所述试剂盒是用于检测测试样品的诊断试剂盒。所述试剂盒可以包含不与待检测抗原反应的对照抗体，以及特异性地与对应于本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员的抗原结合的标志物特异性抗体或其抗原结合片段。此外，该试剂盒可以包含用于检测所述抗体与抗原结合的手段(例如，所述抗体可以与诸如荧光素或罗丹明的、可以被流式细胞仪检测的荧光化合物结合)。
在优选实施方案中，所述诊断试剂盒包含特异性地结合对应于HTC标志物(例如，本文公开的Ig超家族或TLR超家族成员)的抗原的基本上分离的抗体，以及用于检测抗原-抗体结合的手段。在某些实施方案中，所述抗体连接至固体支持物。在某些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。所述试剂盒的检测手段可以包含第二、标记的单克隆抗体。可选择地或另外地，所述检测手段可以包含标记的竞争抗原。
在一个诊断配置中，测试样本与具有表面结合抗原的固相试剂反应，其中所述抗原对应于的一种(或多种)本文公开Ig超家族或TLR超家族成员。在洗涤以去除未结合组分之后，所述试剂可以与报告标记的抗人抗体反应以测定抗抗原抗体与固体支持物结合的量。这类方法是公知的并且在本领域内已经广泛地描述。报告标记可以是酶，例如，如本领域内标准，通过将固相与合适的荧光测定法底物、冷光底物或测热法底物孵育以检测所述酶。
如上文所述，可以通过将蛋白材料连接至固体支持物材料的已知技术制备携带结合的抗原和/或抗体的固体表面。合适的固体支持物材料包括，例如但不限于，聚合珠、试纸、96孔板或过滤材料。在某些实施方案中，已知与对应于公开的HTC标志物的多肽结合的小分子，根据其化学结构、通过本领域内已知的方法，可被连接至固体支持物，。
文本标签通常伴随所述试剂盒，并且包括任何书写或记录材料，其可以是提供使用一个或多个所述试剂盒的内容物的使用说明或其他信息的电子形式或计算机可读形式(例如磁盘、光碟或磁带)。在某些实施方案中，所述标签表明该内容物是用于根据本文描述的一种或多种方法，诊断或治疗特定病症，例如骨髓来源的造血增殖性病症。在某些实施方案中，AML代表使用该试剂盒的内容物所诊断和/或治疗的病症。在某些实施方案中，CML代表使用该试剂盒的内容物所诊断和/或治疗的病症。
10.实施例
10.1实施例1：HTC相关的免疫球蛋白(Ig)超家族或toll样受体(TLR)超家族成员的鉴定
通过使用微阵列比较正常HSC中和AML CSC中多种基因的RNA转录物水平鉴定HTC标志物。特别是，数据获自包含AML Lin-CD34+CD38-细胞的测试样品，其中三个AML样品取自外周血；双分选Lin-CD34+CD38-和Lin-CD34+CD38+细胞。该分选策略产生还超过90％CD90-的细胞。该分选策略产生大于98％的纯度。
为允许直接比较，然后从包含正常HSC的对照样品中获得数据。样品取自三个独立供体中的每一个的动员外周血(MPB)并且双分选Lin-CD34+CD90+CD45RA-CD38-和Lin-CD34+CD90+CD45RA-CD38+细胞。该分选策略产生大于99％的纯度。
对于两种分选策略，系(Lin)混合物包括针对CD2、CD3、CD11b、CD15、CD19、CD41和CD235a的抗体。对照样品和AML样品的示例性点图分别在图1和图2示出。
然后提取总RNA，RNA进行反转录以及体外转录，从而最终从转录物产生荧光染料标记的cRNA探针。使用Affymetrix全人基因组U133 Plus 2.0阵列检测转录物水平。简要而言，将基因阵列进行杂交并且读出。对于每个探针组的信号强度、探针组编号和有/无评分，使用MS Excel列表。
然后，使用MS Excel和Fisher’s t检验直接比较AML测试样品和对照样品(Lin-CD34+CD90+CD45RA-CD38-正常HSC)中对应于RNA转录物水平的信号值。
然后根据以下标准选择HTC标志物基因：(1)测试和对照样品队列之间信号强度差异的显著性p＜0.05；(2)在所有3个正常HSC样品中不表达的基因(Affymetrix软件评分为“无”)；(3)在3个AML样品中的至少两个中表达的基因(Affymetrix软件评分为“有”)；或(4)AML/HSC信号比≥5和(5)已知表达是在细胞外的基因，编码Ig结构域和/或参与Toll样受体信号转导。
下文表1和表2分别示出，与所有三个正常HSC样品相比，在3个CD38-或CD38+AML CSC样品中的至少两个中差异性表达的8个基因的比较。“阳性样品(Pos.samples)”是指阳性样品(positive samples)，Affymetrix软件评分为“有”。
表1
表2
将Gal et al.公布的数据(“Gene expression profiles of AML derived stem cells：similarity to hematopoietic stem cells(AML来源的干细胞的基因表达谱：与造血干细胞的相似性).”Leukemia 2006，20：2147-2154，通过引用其全文而将其并入本文)与本文描述的对照样品比较，证实Ly86/MD1、CD84、LILRA1和CD180作为癌症干细胞靶标的用途(参见，美国专利申请第61/039,701号，通过引用将其并入本文)。
如图3A-3C所示，通过使用来自Abnova(Walnut，CA)的克隆1H3抗体检测CD84、使用来自BioLegend(San Diego，CA)的克隆CD84.1.21检测CD84或使用来自BioLegend的克隆MHR73-11检测CD180的流式细胞法分析，可检测到AML CSC的Ly86、CD84和CD180表达。相反，通过流式细胞法分析不能检测到正常HSC的这些标志物的表达(图3)。
10.2实施例2：单克隆抗体的制造和体内功效
10.2.1.特异性地与HTC相关的免疫球蛋白(Ig)超家族或toll样受体(TLLR)超家族成员结合的单克隆抗体的制备。
制造单克隆抗体的技术是本领域内已知的，并且描述于，例如，Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理与实践)，pp.59-103(Academic Press，1986)。可使用的免疫原包括对应于CD84、淋巴细胞抗原86(Ly86)、CD180(RP105)、HAVCR2、LILRA1、LILRA2、NEGRI或TLR2的纯化多肽，以及包含其的融合蛋白。可选择地，可以使用在细胞表面上表达CD84、Ly86、CD180、HAVCR2、LILRA1、LILRA2、NEGRI或TLR2的重组AML表达的同种型的细胞。通过适当实验，本领域技术人员可以做出免疫原的选择。
用选择的免疫原使免疫例如Balb/c的小鼠，所述免疫原在完全弗氏佐剂中乳化并且以1-100微克的量皮下或腹膜内注射。可选择地，所述免疫原在MPL-TDM佐剂(Ribi Immunochemical Research，Hamilton，Mont.)中乳化并且注射进动物的后脚肉垫。然后，10-12天之后，用在选择的佐剂中乳化的另外的免疫原加强(boost)已免疫的小鼠。此后，也可以用另外免疫注射加强小鼠数周。可以通过眼球后取血定期从所述小鼠获得血清样品，用于在ELISA检测中测试以检测针对HTC标志物多肽的抗体。
在检测到适合的抗体效价之后，可以将对应于HTC标志物的免疫原的最后静脉内注射注射对于抗体“阳性”的动物。三至四天后，处死小鼠并且收获脾细胞。然后将该脾细胞融合(使用35％聚乙二醇)至选择的鼠骨髓瘤细胞系，例如可从ATCC获得的编号CRL 1597的P3X63AgU.1。该融合产生杂交瘤细胞，然后可以将所述杂交瘤细胞接种于96孔组织培养板，该培养板含有HAT培养基(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)以抑制未融合细胞、骨髓瘤杂交种和脾细胞杂交种的增殖。
然后，在ELISA中筛选该杂交瘤细胞的对于对应于HTC标志物的免疫原的反应性。分泌所需针对HTC标志物多肽的单克隆抗体的“阳性”杂交瘤细胞的确定是本领域技术之内的。
可以将阳性杂交瘤细胞腹膜内注射入同系Balb/c小鼠以产生包含针对对应于HTC标志物的多肽的单克隆抗体的腹水。可选择地，杂交瘤细胞可以在组织培养瓶或转瓶(roller bottles)中生长。如本领域内已知的，可以使用硫酸铵沉淀，然后通过凝胶排阻色谱实现腹水中产生的单克隆抗体的纯化。可选择地，也如本领域内已知的，可以使用基于抗体与蛋白A或蛋白G结合的亲和色谱法。
10.2.2.针对骨髓性白血病的单克隆抗体的体内功效
人癌症的体内模型对于测定候选治疗剂的临床前功效是有用的。对于单克隆抗体，在合适的动物模型中的研究有助于评估在体内生理条件下靶细胞溶解和肿瘤根除。数个小组已经描述将CML慢性期(CP)、加速期(AP)、和/或母细胞期(BP)和AML细胞植入SCID和NOD/SCID小鼠。通常，嵌合体动物的产生显示出人CML细胞的植入与NOD/SCID小鼠中更为一致(参见，Dazzi.F et al，Blood 92：1390-1396(1998)；Wang，J.C.Y.et al，Blood 91：2406-2414(1998)；Dick，J et al Blood 87：1539-1548(1996)；Bonnet，D et al，Blood 106：4086-4092(2005))。可以使用NOD/SCID人CML模型测定针对CML和/或不是HSC的正常GMP的单克隆抗体的体内功效。
可以按照Dazzi et al.所描述的产生异种移植物动物。简要而言，室内饲养或从商业供应商(Jackson Laboratories)购买NOD/SCID小鼠并且在无菌条件下生活。在注射细胞之前，射线照射动物(250cGy，x射线光源)。通过流式细胞仪分析来自CML或AML患者的、获自外周血、动员外周血或骨髓的冷冻保存的细胞，以确定样品中CD34+细胞的百分比。将包含1至10×106 CD34+细胞的样品以总体积1mL静脉内注射进条件化(conditioned)小鼠。可选择地，在移植之前，可以通过FACS从样品中分选CD34+细胞。每周一次处死动物亚组并且分析骨髓和脾的人CD34+细胞。
选择具有移植物潜能的患体样品用于抗体功效研究。对于功效研究，移植CML/AML细胞并且按照安排注射测试单克隆抗体或对照抗体。可选择安排包括每周1-3次、每周1-3次注射持续1-4周或每周1-2次持续1-4个月。注射可以通过尾静脉注射的静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内。治疗安排结束后，处死动物并且收集组织用于分析。可以通过对于在治疗结束时在骨髓和脾中检测到的人表型CML癌症干细胞，CD34+标志物+HTC的存在的FACS分析，评价外周血、脾和骨髓。可以通过PCR检测费城(Ph)染色体以确定细胞是CML还是正常的。
作为实例，用CML样品(MISIRB 31104 750)移植11只小鼠，5×106细胞/小鼠。可以用250rad TBI(x射线光源，Faxitron CP160)和抗asialo GM1条件化小鼠。在第0、5和11天通过腹膜内注射注射抗asialo GM1。移植后4周，每组中一半的小鼠开始接受本文描述的标志物特异mAb克隆或对照抗体的腹膜内或静脉内注射，250-1000mg/剂量，每周两次持续4周。此外，按照上文还用CML(MISIRB 31104750)移植40只小鼠的组。抗体给药在移植的时间开始。通过腹膜内注射以0.5-1mg/剂量的抗体注射小鼠，每周两次持续8周。可选择地，连续地移植分离自之前植入的小鼠中的CML细胞。用标志物特异性mAb克隆、在移植的时间、通过以0.5-1mg/剂量的抗体的腹膜内注射治疗一部分这些间接移植接受体，每周两次持续8周。在用标志物特异性mAb克隆进行上述治疗之后，通过流式细胞仪分析小鼠的肿瘤负荷、CD34表达和特异性HTC标志物基因的表达。对于存活至研究结束的所有小鼠，测定骨髓和脾中人细胞的数量和频数。通过FACS从连续移植的两组小鼠中分选人细胞(标志物+)，以确定是否存在具有功能性癌症干细胞潜能的细胞。
对于CML细胞的间接移植，可以从几只小鼠的骨髓和脾中分选CD34+标志物+细胞用于移植。可以在用骨髓CD34部分移植后8或10周进行对于间接移植的NOD/SCID分析。
标志物特异性单克隆抗体克隆是否可以消除或减少用初始人AML母细胞危象细胞移植的小鼠中肿瘤负荷的测定。用AML细胞移植25只小鼠，以10×106CD34+标志物+细胞/小鼠注射小鼠。将细胞静脉内注射至尾静脉或眼眶的后侧部分。用250rad TBI(x射线光源，Faxitron CP160)和抗asialo GM1条件化小鼠。在第0、5和11天腹腔注射抗asialo GM1。移植之后4周开始，将小鼠随机分为两组，治疗和对照组。用标志物特异性mAb克隆腹腔注射接受治疗的组。通过腹膜内注射给予抗体，每周两次，持续4周。抗体浓度为每次注射1mg(总共2mg/小鼠/周)。根据使用的抗体批次，体积会变化。小鼠IgG作为对照物，在相同的稀释剂中制备并且以与单克隆抗体相同的浓度和体积注射小鼠IgG。在标志物特异性抗体克隆最后注射之后2-3天处死小鼠。分离并计数骨髓和脾。通过FACS分析组织的CD34和特异性HTC标志物基因的表达。对于存活至研究结束的所有小鼠，测定骨髓和脾中人细胞的数量和频数。通过FACS从连续移植的两组小鼠中分选人细胞，以确定抗体治疗后是否存在具有功能性癌症干细胞潜能的细胞。可选择地，在AML细胞移植时开始小鼠抗体治疗。用0.5mg抗体、每周两次、持续8周注射这些小鼠。按上文所述进行分析。
另外，对于白血病体内模型中的功效，可以使用表达相应的抗原的人细胞系测试标志物特异性mAb克隆的功效。用被标志物特异性mAb克隆识别的人白血病细胞系接种免疫功能低下的动物。使用多细胞系测试所述克隆的功效。使用的细胞系应该在体内保持原始表型，具有被标志物特异性mAb克隆识别的表位的持续表达。视情况鉴定和使用这些细胞系。使用不同给药途径表征每种细胞系；静脉内、皮下或腹膜内注射。测试NOD/SCID小鼠注射部位的肿瘤植入和后续骨髓及脾的侵袭。在肿瘤接种时开始用标志物特异性mAb克隆治疗动物或用注射肿瘤植入之后，给予细胞后1-4周开始用标志物特异性mAb克隆治疗动物。通过腹膜内注射给予抗体，每周两次，持续四周。小鼠IgG用作对照物，以与标志物特异性mAb克隆相同的浓度和体积注射小鼠IgG。在单一部位给予测试细胞。在治疗期间，每周称重动物并且观察毒性的临床迹象和死亡。每周两次观察和触诊动物的注射部位的结节形成。二维测量检测到的结节并记录发现。在研究结束时，暴露注射部位并且移除、测量和称重肿瘤。另外，移除骨髓、脾和肿瘤块的样品用于通过FACS分型。分离这些组织并进行制备用于通过流式细胞仪分析。筛选组织的一种或多种人HTC标志物的表达和标志物特异性mAb克隆。
使用上述体内模型，可以表明，用本发明的单克隆抗体组合物的治疗在减小肿瘤大小、改善一种或多种症状和/或延长治疗组中小鼠的存活中是有效的。
展示本发明具体实施方案的以上描述是为了为举例和描述的目的。其不意图是全面的或意图将本发明限制到公开的精确形式，并且显而易见，根据以上教导，多种修改和变化是可能的。选择并描述所述实施方案是为了最好地解释本发明的原理及其实践应用，从而使得本领域其他技术人员可以最好地利用本发明和适于所考虑的特定用途的具有不同修改的不同实施方案。本发明的范围意图由附加权利要求及其等同情况所限定。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物和参考资料通过引用特别并入本文，引用的程度如同特别地和单独地表示将每个单独的出版物或专利申请通过引用并入本文的程度相同。

Claims (28)

1.抗体，其中所述抗体特异性地与免疫球蛋白(Ig)超家族或toll样受体超家族蛋白结合，所述蛋白选自：CD84；淋巴细胞抗原86(Ly86)；CD180(RP105)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员1(LILRA1)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员2(LILRA2)、神经元生长调节因子1(NEGR1)和toll样受体(TLR2)。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性地与基因的表达产物结合，所述基因选自：CD84、淋巴细胞抗原86(Ly86)和CD180(RP105)。
3.如权利要求2所述的抗体，其中所述抗体是人源化单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的抗体，其中所述抗体特异性地与骨髓来源的造血肿瘤细胞(HTC)结合。
5.如权利要求4所述的抗体，其中所述结合抑制所述HTC的增殖和/或介导所述HTC的破坏。
6.药物组合物，其包含权利要求2-5中的任一项所述的抗体。
7.如权利要求6所述的药物组合物，还包含放射性同位素或放射性核素。
8.如权利要求6所述的药物组合物，还包含生物活性化合物。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述生物活性化合物是细胞毒性剂。
10.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述组合物包含至少两种抗体并且其中所述至少两种抗体特异性地与至少两种不同的表达产物结合。
11.介导骨髓来源的HTC的破坏的方法，包括将所述HTC与包含权利要求2-5中任一项所述抗体的组合物接触。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述接触抑制所述HTC的增殖。
13.治疗患有骨髓性血液学增殖性病症的患者的方法，所述病症的特征在于，至少一种HTC相关的Ig超家族或TLR超家族成员的过表达，所述成员选自：CD84；淋巴细胞抗原86(Ly86)；CD180(RP105)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员1(LILRA1)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员2(LILRA2)、神经元生长调节因子1(NEGR1)和toll样受体(TLR2)，其中将包含权利要求2-5中任一项所述的抗体的组合物对所述患者进行给药。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述给药减少所述患者中的所述HTC。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述血液学增殖性病症是AML。
16.诊断患者中骨髓性血液学增殖性病症的方法，其包括：
从所述患者获得测试样品；并且
在所述测试样品中检测对应于HTC相关的Ig超家族或TLR超家族成员的表达产物的水平，所述成员选自：CD84；淋巴细胞抗原86(Ly86)；CD180(RP105)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员1(LILRA1)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员2(LILRA2)、神经元生长调节因子1(NEGR1)和toll样受体(TLR2)；
其中，所述样品中所述表达产物水平与对照的比较表明所述血液学增殖性病症。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述表达产物是mRNA。
18.如权利要求16所述的方法，其中检测至少两种不同表达产物的水平。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述检测使用微阵列。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述诊断的骨髓性血液学增殖性病症是AML。
21.监测患者中治疗骨髓性血液学增殖性病症的功效的方法，其包括：
在所述治疗期间的两个或更多时间点从所述患者获得测试样品；和
在每个所述测试样品中检测对应于HTC相关的Ig超家族或TLR超家族成员的表达产物的水平，所述成员选自：CD84；淋巴细胞抗原86(Ly86)；CD180(RP105)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员1(LILRA1)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员2(LILRA2)、神经元生长调节因子1(NEGR1)和toll样受体(TLR2)；
其中所述表达产物的水平随时间的降低表明对于治疗的阳性反应。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述表达产物是mRNA。
23.如权利要求21所述的方法，其中在两个或更多所述时间点检测至少两种不同表达产物的水平。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述检测使用微阵列。
25.如权利要求21所述的方法，其中所述监测的骨髓性血液学增殖性病症是AML。
26.介导骨髓来源的HTC的破坏的方法，其包括将所述HTC与包含小分子激动剂或拮抗剂的组合物接触。
27.治疗患有血液学增殖性病症的患者的方法，所述病症的特征在于，至少一种HTC相关的Ig超家族或TLR超家族成员的过表达，所述成员选自：CD84；淋巴细胞抗原86(Ly86)；CD180(RP105)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员1(LILRA1)；白细胞免疫球蛋白样受体，具有TM结构域的亚家族A，成员2(LILRA2)、神经元生长调节因子1(NEGR1)和toll样受体(TLR2)，其中将包含小分子激动剂或拮抗剂的组合物对所述患者进行给药。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述血液学增殖性病症是AML。
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