KR20180017088A - B-세포 악성종양의 치료를 위한 수단 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B-세포 악성종양을 진단하거나 치료하기 위한 수단 및 방법을 제공한다. 악성 B 세포 상의 B-세포 수용체의 역 표적화를 위한 신규의 접합체가 제공된다. 접합체는 BCR 항원 및 진단제 또는 치료제를 포함한다. 본 발명의 BCR 항원 접합체를 이용한 치료에 선호적으로 반응하는 경향이 있는 환자를 확인하는 방법이 또한 본원에 제공된다.

Description

B-세포 악성종양의 치료를 위한 수단 및 방법
B-세포 악성종양 - 림프절, 혈액 및/또는 골수에서 B-세포 및 이들의 전구체의 왜곡된 증식 및 발달로 특징지어지는 조혈 기관의 악성 질환 - 은 미국에서 연간 15,000명이 넘는 사망자를 여전히 차지하고 있는 광범위한 다양한 특성과 임상적 행동을 갖는 이질적인 질환 군을 나타낸다.
각 B-세포 악성종양은 B-세포 림프구 형성의 다양한 단계에서 발생하는 유전적 및 후성적 이상의 결과이다. B-세포 림프종, B 림프구 또는 이들의 전구체의 악성 형질전환을 특징으로 하는 림프성 조직의 악성 신생물은 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종(NHL) 둘 모두를 포함하고, 조혈 조직의 악성 신생물의 일 군인 B-세포 백혈병은 혈액 및 골수에서 B-세포 및 이들의 전구체의 비정상적인 증식 및 발생을 특징으로 하며, 가장 흔한 소아암에 속한다. B 세포 발생 동안 다양한 표면 마커의 동적 발현은 필요한 성장, 분화, 성숙 및 생존 신호를 제공한다. 임의의 주어진 단계에서 B 세포가 악성이 되면, 이의 세포 표면 분자 및 관련 세포내 신호전달 분자의 발현 패턴, 및 이러한 발생 단계와 관련된 과발현된 유전자 산물이 이의 클론성 악성 유도체로 전달된다.
임상 케어의 진보에도 불구하고, 많은 성숙 B-세포 악성종양이 치료불가능한 채로 존재한다. 역사적으로, 대부분의 이환 환자는 영속성 관해 및 일부 경우에 완치를 달성하기 위한 목적으로 종종 방사선 요법과 함께 세포독성제를 병용 투여 받았다. 그러나, 많은 전통 요법은 또한 상당한 급성 및 장기 독성과 관련되어 있다. 줄기 세포 이식은 종종 급성 형태를 앓거나 화학 요법 내성을 나타내는 환자에 대한 마지막 대안으로서 생명을 위협하는 거부 반응의 위험이 높다. 최근의 치료적 접근은 B-세포 표면 항원을 인식하는 리툭시맙(항-CD20), 항체-접합체 및 CAR T 세포와 같은 단일클론 항체에 초점이 맞춰져 있다. 많은 환자의 생존율의 개선에도 불구하고, 장기 관해는 드물며 질환의 재발이 여전히 큰 문제이다. 부가적으로, 종래의 생물학적 치료법에 의해 표적화된 대부분의 표면 항원은 질환을 담당하는 악성 B-세포 상에서 배타적으로 발현되는 것은 아니며, 따라서 동일한 표면 분자를 발현하는 다른 (건강한) 세포를 표적화하기 때문에 심각하고 - 잠재적으로 생명을 위협하는 - 부작용의 위험이 따른다. 부가적으로, 다수의 표적화된 표면 마커는 충분히 큰 수치로 악성 B-세포 상에서 발현되지 않아 이들의 효과적인 감소를 허용하지 않는다. 게다가, 대부분의 결합 분자 예컨대 항체는 다소 크며, 이는 그들의 생체분포 및 생체이용률에 부정적 영향을 미치고, 이들의 생산은 상대적으로 비용이 많이 든다.
요약하면, 효과적인 치료법은 가용 치료 옵션의 특이성의 부족에 의해 여전히 제한되며, 이는 종종 심각한 부작용을 초래하고 환자의 모든 악성 B 세포를 효과적으로 제거하지 못하게 한다.
WO 2010/085345 A1은 추가적으로, 치료제, 세포독성제 또는 진단제에 커플링된 인간 인산화된 파라타르그(paratarg) 또는 이의 에피토프를 포괄적으로 개시한다. 파라타르그(스토마틴-유사 단백질 2)는, 미결정 유의성 단일클론 감마글로불린병증(MGUS), 혈액 중 현저히 증가된 수준의 파라단백질의 존재에 의해 구속되는 병태를 앓고 있는 환자에서, 분비된 파라단백질(즉, 말단 분화된 형질 세포의 비정상적인 클론성 증식에 의해 과잉 생산되는 비정상적인 면역글로불린 단편)에 의해 인식되는 공통 항원성 표적으로서 확인되었다. 그러나; 상기 환자의 혈액 중, 비-기능성 파라타르그 "스캐빈저"로서 작용하는 과량의 파라단백질을 고려할 때, 이러한 접근법은 2가지 이유로 인해 환자에서 실행가능성이 매우 낮다: 첫째, MGUS에서의 악성 세포는 형질 세포이고 형질 세포는 자신의 표면 상에 B-세포 수용체를 보유하고 있지 않다. 이에 따라, BCR은 이 질병에서 악성 세포를 표적으로 삼을 수 없고, 오히려 심지어 파라단백질을 생산하는 악성 형질 세포에 도달함이 없이 분비된 "디코이(decoy)" 파라단백질에 의해 구속되고 트랩핑된다. 둘째, MGUS 및 MM 둘 모두, 면역글로불린, 즉 파라단백질 형태의 다량의 가용성 BCR이 각 환자의 혈청 내로 분비되어 존재한다는 사실을 특징으로 한다. 재조합 BCR 항원(즉 파라타르그)의 전신 적용은 면역 복합체 질환의 위험이 높은 면역 복합체의 형성을 초래한다. 독소-접합된 BCR 항원의 사용은 각종 장기의 내피 세포에 독성 면역 복합체가 침착되어 면역 복합체 신염, 면역 복합체 혈관염 및 기타 면역 복합체 매개 염증 반응과 같은 이들의 장기의 상당한 손상 및 추정 괴사를 유발할 수 있다. 따라서, WO 2010/085345 A1으로부터, 비-기능성 분비된 파라단백질 대신에 표면-발현된 BCR을 표적화하는 항원 접합체가, 본원에 기재된 바와 같은, 즉 기능성 표면 BCR을 발현하고 바람직하게는 감마글로불린병증(혈액 중 과량의 파라단백질)과 관련이 없는 악성 B 세포를 특징으로 하는 B-세포 악성종양을 치료하는데 유용할 것이라는 것이 명확하게 예견될 수 없었다.
상기의 관점에서, 특이적이고, 안전하면서 효과적인 B 세포 악성종양을 치료하기 위한 신규의 개선된 치료법을 제공하는 것은 당업계에서 절실히 요구된다.
개요
본 발명은 환자에서 B-세포 악성종양의 진단 및/또는 치료 방법에 사용하도록 의도된 진단제 및/또는 치료제에 접합된 B-세포 수용체(BCR) 항원에 관한 것이다. B-세포 악성종양은 BCR, 특히 세포 표면 상에서 발현되는 기능성 BCR을 발현하는 악성 B-세포, 특히 클론성 악성 B-세포의 존재를 특징으로 하는 것으로 생각된다.
접합된 BCR 항원은 만성 림프구성 백혈병(CLL), B-세포 전림프구성 백혈병, 외투 세포 림프종(MCL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 비장 변연부 림프종(SMZL), 버킷 림프종, B-세포 비호지킨 림프종, 여포성 림프종, 원발성 중추신경계 림프종(PCNSL), 또는 결절성 림프구 우성 호지킨 림프종(NLPHL), 털세포 백혈병, 비장 림프종, 림프형질세포성 림프종, 점막 관련 림프 조직의 결절외 변연부 림프종(MALT 림프종), 결절성 변연부 림프종, 소아 결절성 변연부 림프종, 원발성 피부 여포 중심 림프종, T-세포/조직구 과다 거대 B-세포 림프종, 림프종모양 육아종증, 원발성 종격 (흉선) 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, ALK-양성 거대 B-세포 림프종, 형질모세포 림프종, 또는 원발성 삼출액 림프종을 포함한 다양한 B-세포 악성종양의 치료에 유용할 수 있다.
BCR 항원은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 지질 또는 다당류를 포함할 수 있다. 이는 자가항원, 외생성 항원, 동종항원 또는 이종항원으로부터 선택될 수 있다. BCR은 번역후 변형되거나 비변형될 수 있다.
환자의 악성 B-세포의 BCR은 접합된 BCR 항원을 인식하고/거나, 접합된 BCR 항원은 특히 BCR을 통해 상기 B-세포에 결합할 수 있는 것으로 예상된다. 접합된 BCR 항원은 또한 BCR에 결합한 후 악성 B-세포에 의해 내재화될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 접합된 BCR 항원은 환자에서 BCR을 발현하는 악성 B-세포의 수를 감소시킬 수 있는 것으로 파악된다.
접합된 BCR 항원은 하기의 유리한 효과 중 하나 이상을 도출해낼 수 있는 것으로 파악된다: 악성 B-세포의 수를 감소시킴, 악성 B-세포의 활성화 및/또는 증식을 억제함, 및/또는 악성 B-세포를 살해함.
BCR 항원에 접합되는 치료제는 방사성 핵종, 결합제, CAR T 세포, 또는 독소로부터 선택될 수 있다. 적합한 독소는 화학 독소, 화학치료제, 및 단백질 독소를 포함한다. 결합제는 특히 면역 이펙터 세포, 예컨대 자연 살해 세포, 대식세포, (세포독성) T-세포 또는 호중구에 결합할 수 있다. 본 발명의 BCR 접합체에 사용하기에 특히 적합한 결합제는 CD3 결합제, CD16 결합제, 또는 CD38 결합제를 포함한다. 본원에 기재된 결합제는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 단일쇄 항체, ScFv, 미니바디, Fv, Fab, Fab', 또는 F(ab')2 단편으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 BCR 항원 접합체에서 치료제로서 유용한 화학치료제는 세포정지제 예컨대 에니다이엔(enidyene), 듀오카마이신, 메토트렉세이트, 독소루비신, 멜팔란, 클로람부실, ARA-C, 빈데신, 미토마이신 C, 시스플라틴, 에토포시드, 블레오마이신, 베도틴, 엠탄신, 5-플루오로우라실 또는 티로신 키나제 억제제를 포함한다.
본원에서는 또한, 본원에서 정의된 B-세포 악성종양의 진단 및/또는 치료 방법에서 진단제 및/또는 치료제에 접합된 BCR 항원의 용도가 제공된다.
추가로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 본원에서 정의된 바와 같은 환자에서 B-세포 악성종양을 진단 또는 치료하는 방법에 관한 것이다:
(i) 바람직하게는 본원에서 정의된 바와 같은 진단제 또는 치료제에 접합된 BCR 항원을 제공하는 단계;
(ii) 상기 접합된 BCR 항원을 환자에게 투여하는 단계.
본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 B-세포 악성종양을 앓고 있는 환자에서 악성 B-세포의 BCR에 결합할 수 있고, 추가적으로, 접합된 BCR 항원에 BCR의 결합 후 내재화될 수 있는, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 치료제에 접합된 BCR 항원을 제공한다.
추가로, 본 발명은 본원에서 정의된 접합된 BCR 항원, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 접합된 BCR 항원에 선호적으로 반응하는 경향이 있는, 본원에서 정의된 B-세포 악성종양을 앓고 있는 환자를 확인하기 위한 비침습적 방법에 관한 것이다.
도 1: ARS2 결합 및 ARS2에 대해 특이성을 갖는 BCR을 운반하는 ABC- DLBCL 세포주 OCI - Ly3에 의한 내재화의 입증. A: 세포의 제조; B-D: t=0에서 유세포 분석; E-G: 1시간 인큐베이션 후 (t =1) 유세포 분석.
도 2: 독소- 접합된 BAR에 의한 ABC- DLBCL 림프종 세포의 증식 억제. 재조합 ARS2/슈도모나스 외독소 접합체(ARS-ETA)는 ARS2에 대해 특이적인 BCR을 갖는 ABC-DLBCL 세포주 유래의 세포(U2932, OCI-LY3)를 특이적으로 사멸시키는 반면, ARS2 이외의 BCR 특이성을 갖는 ABC-DLBCL 세포(HBL-1, TMD8)는 영향을 받지 않는다. 뉴라빈1(원발성 CSN 림프종의 2/3의 항원성 표적)의 대조군 BAR/독소 접합체, NRB1-ETA는 세포주 중 어떠한 세포주에도 독성을 나타내지 않는다.
도 3: 시험관내에서 슈도모나스( Pseudomonas )-외독소- 접합된 ARS2에 의한 OCY-L3 세포의 BCR -특이적 사멸. ARS2-독소 만이 ARS2에 특이적인 BCR을 갖는 OCY-L3을 사멸시킨다; 대조군으로서, 슈도모나스-외독소-접합된 뉴라빈(CNS 림프종의 2/3의 BCR에 특이적인 항원)은 OCY-L3 세포에 영향을 주지 않는다.
도 4: 생체내에서 ARS2에 특이적인 BCR을 갖는 ABC- DLBCL 세포주( OCI - Ly3 )에 대한 재조합 슈도모나스-외독소 접합된 ARS2의 특이적 세포독성. 9일째 5x106 OCI-Ly3 세포를 SCID 베이지 마우스의 옆구리에 주사했다. 6일째 마우스는 15 ㎍ 독소-접합된 ARS2 또는 독소-접합된 뉴라빈의 단회 정맥내 주사를 제공받았다. 녹색 곡선은 ARS2 독소를 제공받은 3마리 마우스의 종양 부피(±SEM)를 나타내고, 적색 곡선은 대조군 독소(슈도모나스-외독소 접합된 뉴라빈, 원발성 CNS 림프종의 2/3의 BCR 항원)를 제공받은 3 마리 마우스의 종양 부피(±SEM)를 나타낸다.
도 5: DLBCL 세포주에 이중특이성 CD3- ARS2 구축물의 결합. A: U2932 (ARS2 반응성), B: HBL-1 (ARS2 반응하지 않음), C: OCI-Ly3 (ARS2 반응성). 컬러 코드: 적색 =림프종 세포 + PBS; 검정색 =림프종 세포 + ARS2; 녹색 =림프종 세포 + ARS2-CD3. 구축물은 ARS2에 특이성을 갖는 BCR을 발현하는 세포주에 특이적으로 그리고 배타적으로 결합한다.
도 6: 말초혈 단핵구( PBMC )에 CD3- ARS2의 결합. A: 건강한 대조군의 PBMC에의 결합. 결과에 따르면 CD3-ARS 구축물이 건강한 공여자의 말초 혈액에서 CD4-양성 및 CD8-양성 T-세포에 결합한다. B: CD4-FITC 및 CD3-ARS(APC)를 이용한 이중 염색. C: CD8-FITC 및 CD3-ARS(APC)를 이용한 이중 염색.
도 7: 상이한 미만성 거대 B-세포주에 대한 말초혈 단핵구(T-세포)의 CD3-ARS-2 매개 세포독성. 세포독성 효과는 ARS-2에 대한 특이성을 갖는 BCR을 발현하는 세포주( OCILy3 , U2932)에서만 관찰된다. A-C: 상이한 림프종 세포주 및 PBMC는 상이한 농도의 CD3-ARS2와 함께 인큐베이트되었다. 세포독성은 제조자의 지시에 따라 LDH 방출을 측정하여 평가되었다.
상세한 설명
본원에서, 본 발명자들은 B-세포 수용체(BCR)에 대한 독성 미끼를 사용하여 B-세포 악성종양에서 신생물 B-세포를 표적화하는 신규의 접근법을 제공한다. 물론, 정상 (및 악성) B-세포의 표면 상의 BCR의 주요 기능은 이의 특이적 항원의 인식 및 결합이다. 항원의 결합 후, B-세포 수용체/항원 복합체는 빠르게 내재화된다. 항원이 프로세싱되고 이의 단편이 항원 제시 세포로서 B-세포의 표면 상의 MHC-복합체와 관련하여 T-세포에 제시된다.
BCR에 결합 후, BCR 항원은 B-세포를 자극하고 증식을 유도한다. BCR을 통한 B-세포의 만성 항원성 자극은 B-세포 림프종의 발생에 수반된 메카니즘으로서 제안되었으며, B-세포 림프종의 발달 초기에는 생존을 위해 상기 항원에 의존한다. 본 발명자들은 BCR 항원의 BCR에의 결합이 BCR/항원-복합체의 빠른 내재화("이팅(eating)")을 초래하기 때문에, BCR 항원이 림프종 세포를 살해할 수 있는 작용 물질에 커플링되면 치명적인 미끼로서 사용될 수 있는 것으로 예상했다. 실제로, 본 발명자들은 SCID 마우스에서 ABC-DLBCL 세포의 종양 크기의 뚜렷한 감소에 의해 입증되는 바와 같이 독소-접합된 BCR 항원이 시험관내, 및 심지어 생체내에서 표적화된 B-세포를 억제하거나 사멸할 수 있음을 발견했다. 당해 기술 분야에서 특정 항원과 B-세포의 만남이 B-세포의 활성화 및 증식을 초래한다는 것이 잘 알려져 있기 때문에 이러한 발견은 매우 놀라운 것이었다. 이에 따라, 접합된 BCR 항원이 실제로 반대로 작용하고 악성 B-세포를 억제하거나 심지어 살해할 수 있음을 예견할 수는 없었다. 이러한 원리 또한 신규한데, 그 이유는 소수의 BCR 항원만이 B-세포 림프종의 병인 및 병인론에 대한 연구의 결과로서 지금까지 독점적으로 분자적으로 정의되었기 때문이다. BCR 항원을 B-세포 악성종양의 치료를 위한 치료제로서의 사용은 지금까지 제안된 적이 없다. BCR 항원에 대한 체계적인 검색에서, 본 발명자들은 각종 B-세포 악성종양에서 우성 BCR 항원을 동정하는 것을 개척했다. 이러한 모든 타입의 B-세포 악성종양의 경우, BCR 항원 접합체는 새로운 치료 옵션이며, 충족되지 않은 의학적 니즈를 충족시킬 수 있다.
BCR이 림프종 세포의 표면에 풍부하기 때문에 (모든 B-세포 림프종의 표준 1 차 치료의 일부인 단일클론 항체 리툭시맙의 표적인 CD20 분자보다 대략 10배 더 빈번함), B-세포 림프종 세포는 특이적인 접합된 BCR 항원에 매우 민감하다. 게다가, BCR 항원은 개개 림프종 세포에 특이적이고 다른 어떤 B 세포 또는 신체의 다른 세포에서는 발견되지 않기 때문에, 그러한 치료법은 높은 궁극적인 특이성을 갖는다. 따라서 본원에서 제공된 바와 같은 BCR 항원 접합체는 신체의 다른 모든 세포에 영향을 미치지 않으면서 악성 세포만을 표적으로 하기 때문에 독특한 특이성을 갖는다.
이는 접합된 BCR 항원이 CAR-T-세포의 일부로서 또는 이중특이성 구축물로서 사용되는 경우 특히 중요하다. CAR T-세포 및 블리나투모맙과 같은 이중특이성 항체는 강력한 치료 전략이지만, 아마도 정상적인 교반 반응 세포에 의한 비특이적 활성화로 인해 매우 독성이다.
또 다른 이점으로서, BCR 결합 에피토프는 단지 소수의 분자, 예를 들어 10 내지 20개의 아미노산에 걸친 펩티드로 구성되어 생산 비용을 낮게 유지할 수 있다. 접합체의 잠재적인 작은 크기로 인해, 접합체는 약리학적 변형(예를 들어, 혈뇌 장벽 침투를 위해)과 관련하여 엄청난 유연성과 다양한 기회를 제공한다.
본원에서 제시된 접근법은 또한 "역 표적화를 위한 B-세포 수용체 항원( B -cell receptor a ntigens for r everse targeting)"의 머리글자 약어인 "BAR"로 명명되는데, 그 이유는 이러한 접근법이, 항체가 악성 세포 상의 항원에 결합하는 널리 사용되는 항체 전략에 역행하는 것에 반해 BAR은 B-세포 림프종 세포의 표면 상의 BCR에 결합하는 항원이기 때문이다. 항체의 친화성이 돌연변이에 의해 증가될 수 있기 때문에, 돌연변이가 또한 BAR의 자신의 BCR에의 친화성을 증가시킬 것으로 예상된다.
BCR 항원 접합체의 예상되는 낮은 독성과 높은 효능과 관련하여, 본원에 제시된 접근법은 결국 대부분의 B-세포 림프종의 경우 R-CHOP(화학요법과 리툭시맙의 조합)로 구성되는 표준 1차 치료의 일부가 될 것으로 추정된다. BCR 항원 접합체의 표준 R-CHOP에의 추가가 실현가능해야 하지만, R-CHOP 조합의 성분 치환(가장 유력 후보: 빈크리스틴)이 또한 100%에 가까운 완치율을 보이는 환자(예컨대 양호한 DLBCL이 있는 어린 환자)의 하위 집단에서 구상될 수 있으며, 여기서는 보다 적은 독성이 문제가 된다.
따라서 본 발명은 환자에서 B-세포 악성종양의 진단 및/또는 치료 방법에 사용될 진단제 및/또는 치료제에 접합된 B-세포 수용체(BCR) 항원을 제공한다.
BCR 항원 접합체
"진단제 및/또는 치료제에 접합된 B-세포 수용체 항원"은 또한 본원에서 "접합된 BCR 항원", "BCR 항원 접합체", "BAR" 또는 "접합체"로서 약칭되며 치료제 및/또는 진단제에 접합된, 즉 연결된, 바람직하게는 환자에 존재하는 악성 B-세포의 BCR에 의해 인식되는 항원을 의미한다. 본 발명의 접합체는 또한 "항원성 부분" 또는 "항원성 표적", 즉 BCR 항원, 및 "치료/진단 부분", 즉 치료제 또는 진단제를 포함하는 것으로 한다. 용어 "항원"은 BCR과 같은 선택적 결합제에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 모든 문법적 형태에서 "접합된"이라는 용어는 항원 및 작용 물질이 하나 이상의 공유 결합, 하나 이상의 이온 결합, 하나 이상의 영구 쌍극자 결합, 하나 이상의 순간 쌍극자 - 유도 쌍극자 결합 (반 데르 발스) 중 하나 이상에 의해 서로에 연결되거나 결합되는 것을 의미한다. 용어 "(~에) 결합된(커플링된)", "(~에) 연결된", "(~에) 접합된"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 특히, BCR 항원 접합체는 B 세포 악성 종양을 앓고 있는 환자에 존재하는 악성 B-세포의 BCR에 결합할 수 있는 것으로 예상된다. 예를 들어, 독소에 커플링되면, 의도된 작용 방식에 따라, BCR 항원 접합체는 악성 B-세포로 내재되어야 하며, 바람직하게는 악성 B-세포를 살해하기 위해 독소를 방출해야 한다. 그러나, 예컨대 결합제, CAR T 세포 또는 진단제에 커플링되면, BCR 항원 접합체가 악성 B-세포의 BCR에 결합하여, 악성 세포와 치료제 또는 진단제를 근접시키는 것으로 충분할 수 있으며, 이에 따라 악성 세포의 검출(예컨대 진단제가 BCR 항원에 접합되는 경우) 또는 악성 세포의 사멸(예컨대 CAR T 세포, 또는 T-세포, 자연 살해 세포, 대식세포 또는 호중구(이에 한정되지 않음)를 포함한 세포독성 이펙터 세포에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 항체가 BCR 항원에 접합된 경우)이 가능하다.
B-세포 및 BCR
용어 "B-세포" 또는 "B 림프구"는 최광의의 의미로서 전구(pre)-B 세포, 미성숙 B 세포, 성숙 나이브 B 세포, 성숙 활성화 B 세포, 기억 B 세포, B 계통 림프구, 또는 임의의 다른 B 계통 세포를 포함한다. 당업자는, - 환자에 존재하는 악성 B-세포의 BCR에 대해 "독성 미끼"(즉, BCR 항원 접합체)를 표적화하는 것이 본 발명의 기본 원리이기 때문에 - 악성 B 세포가 바람직하게는 BCR을 발현하는, 바람직하게는 본 발명의 BCR 항원 접합체를 인식, 즉 여기에 결합할 수 있는 세포 표면 상의 기능성 BCR을 발현하는 것을 용이하게 인식할 것이다. 다시 말해, 본 발명의 맥락에서 용어 "B-세포"는 바람직하게는 형질 세포, 즉 항체를 고 비율로 분비하고 표면 상에서 (기능성) B-세포 수용체(BCR)의 발현을 결여하는 것으로 알려진 B-세포 계통의 말단 분화된 세포를 배제하는 것으로 구상된다. B-세포는 추가적으로 유세포 분석에 의해 동정 가능한 CD19, CD20, CD22, CD23, CD79, IgM, IgD, IgG 또는 IgA를 포함한 특이적 세포 표면 마커의 발현을 특징으로 할 수 있다.
"B-세포 수용체" 또는 "BCR"은, B 세포에 의해 배타적으로 발현되고, Ig-α/Ig-β(CD79)로 불리는 헤테로다이머와 회합되고 디설파이드 브리지에 의해 함께 결합되는 클론성 가변 항원-결합 부위들 - 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 - 를 포함하는 막관통 수용체 단백질 복합체이다. 다이머의 각 멤버는 원형질막에 걸쳐 있으며 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프( ITAM )를 보유한 세포질 꼬리를 가지고 있다. B-세포 수용체 복합체의 항원-결합 부위는, B 세포가 결국 생산할 분비된 항체와 동일한 항원 특이성을 갖는 세포-표면 면역글로불린이다. 이에 따라 완전한 B-세포 수용체는 6개의 쇄 - 2개의 동일한 경쇄, 2개의 동일한 중쇄, 하나의 Igα, 및 하나의 Igβ의 복합체인 것으로 생각된다. 이론에 구속되기를 원하는 것은 아니지만, BCR이 바람직하게는 미성숙 B-세포, 나이브 B-세포 및 성숙 B-세포에 의해 발현되는 반면, 세포 표면 상의 B-세포 수용체 발현이 형질 세포에서 상실될 수 있는 것으로 생각된다.
B-세포 악성종양
용어 "B-세포 악성종양" 또는 "B-세포 신생물"은 최광의의 의미로서 B 세포의, 즉, B 세포의 임의 단계에서 유래한 악성종양 또는 신생물을 지칭한다. 이 용어는 B-세포 림프종, B-세포 백혈병, 및 골수종을 포괄한다. 본 발명에 따른 B-세포 악성종양은 악성 B-세포, 바람직하게는 BCR을 발현하는 클론성 악성 B-세포의 존재를 특징으로 한다. "악성" 세포는 일반적으로 성장 자체가 제한적이지 않고, 인접한 조직으로 침투할 수 있으며, 먼 조직으로 퍼질 수 있다 (전이). 본원에서 사용되는 "악성"은 "암성"과 동의어이다. 본원에서 사용시, 용어 "악성 B-세포"는 특히, 당업계에 공지된 일상적인 방법을 사용하여 확인 가능한 바와 같이, 아폽토시스를 회피할 수 있고/거나, 성장 신호의 자급 자족을 나타내고/거나, 항성장 신호에 무감각함을 나타내는 B-세포를 지칭하는 것으로 한다. 예컨대, 아폽토시스의 회피는 문헌[Elmore S Toxicol Pathol. 2007; 35(4): 495-516]에서 개괄된 바와 같이, 예를 들면 카스파제 활성을 평가함으로써 결정될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 BCR 항원 접합체를 이용한 치료를 위해 구상되는 B-세포 악성종양은 특히 클론성 악성 형질 세포, 및/또는 감마글로불린병증과 관련되지 않은 것들을 포함한다.
용어 "클론성" B-세포는, 바람직하게는 단일 조상에서 유래하고 일반적으로 이와 유전적으로 동일한 B-세포의 군을 지칭한다. "일반적으로 유전적으로 동일한"은 클론성 B-세포가 서로를 구별하는 자발적인 돌연변이를 포함할 수 있음을 의미한다. 그러나, 클론성 악성 B-세포가 동일한 항원 특이성을 갖는, 즉 동일한 항원을 인식하는 BCR을 발현하여, 이에 동일한 BCR 항원 접합체로 표적화될 수 있는 것으로 예상된다.
클론성 악성 B-세포의 존재는 당업계에 공지된 일상적인 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 클론성 악성 B-세포의 존재는 대개, 완전 혈액 카운트(CBC) 검사에서, 확대된 림프절의 출현 또는 백혈구 타입의 증가인 림프구 증가증의 존재에 의해 최초로 의심된다. 나아가, B-세포 악성종양의 타입에 따라 현미경 검사 및/또는 유세포 분석을 사용하여 환자에서, 일반적으로 혈액, 골수, 림프절 또는 림프외 조직 등에서 얻어진 샘플에서, B 림프구의 비정상적인 (즉, 클론성 악성) 집단을 입증할 수 있다. 악성 B-세포는, 상기 마커 분자를 인식하는 형광성 표지를 갖는 특이적 항체를 사용하는 유세포 분석에 의해 확인될 수 있는 바와 같이, 세포 표면상의 비정형이면서 특징적인 분자 패턴을 종종 발현한다. 클론성은 일반적으로 비정상적인 B 세포의 전체 집단에 대해 상호 배타적인 면역글로불린 경쇄, 카파 또는 람다 중 하나만의 검출에 의해 추정될 수 있다. 정상 B 림프구는 다른 면역글로불린 생산 세포의 스튜(stew)로 이루어지며, 이에 카파 및 람다 발현 세포 둘다의 혼합물을 생성한다. 카파 및 람다 생산 B 세포의 정상 분포의 결핍은 클론성을 입증하는 하나의 기준이 된다.
본 발명의 접합된 BCR 항원은 각종 B-세포 악성종양, 바람직하게는, 본원에서 설명된 바와 같이, 그 표면 상에 기능성 BCR을 발현하는 클론성 악성 B 세포의 존재에 의해 그리고 이와 관련된 각종 B-세포 악성종양의 치료에 유용할 것으로 예상된다. 이러한 악성종양은 만성 림프구성 백혈병(CLL), B-세포 전림프구성 백혈병, 외투 세포 림프종(MCL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 비장 변연부 림프종(SMZL), 버킷 림프종, B-세포 비호지킨 림프종, 여포성 림프종, 원발성 중추신경계 림프종(PCNSL), 또는 결절성 림프구 우성 호지킨 림프종(NLPHL), 털세포 백혈병, 비장 림프종, 림프형질세포성 림프종, 점막 관련 림프 조직의 결절외 변연부 림프종(MALT 림프종), 결절성 변연부 림프종, 소아 결절성 변연부 림프종, 원발성 피부 여포 중심 림프종, T-세포/조직구 과다 거대 B-세포 림프종, 림프종모양 육아종증, 원발성 종격 (흉선) 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, ALK-양성 거대 B-세포 림프종, 형질모세포 림프종, 또는 원발성 삼출액 림프종을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 접합된 BCR 항원은 환자에 존재하는 악성 B-세포의 BCR을 표적화하도록 의도되기 때문에, 상기 접합체를 이용한 치료가 바람직하게는 악성 B-세포, 특히, BCR을 발현하는, 바람직하게는 세포 표면 상의 기능성 BCR을 발현하는 클론성 악성 B-세포의 억제 또는 사멸을 일으킬 것으로 인식될 것이다. B-세포 악성종양은 전형적으로 복잡한 병인이며, 일부 B-세포 악성종양(예컨대 MGUS)은 BCR을 발현하는 악성 B-세포(즉, 항체-생산 형질 세포에 대한 전구 세포)의 존재뿐만 아니라, BCR을 발현하지 않는 악성 B-세포(예컨대, 항체 생산 형질 세포)의 존재를 특징으로 한다. 이론에 구속되길 원함이 없이, 이러한 경우에, BCR, 특히 세포 표면 상의 기능성 BCR을 발현하는 악성 B-세포가 본 발명의 BCR-항원 접합체로 표적화될 수 있는 반면에, BCR, 특히 세포 표면 상의 기능성 BCR을 발현하지 않는 악성 B-세포는 그렇지 못한 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 BCR-항원 접합체를 이용한 치료는 환자에서 BCR, 특히 세포 표면 상의 기능성 BCR을 발현하는 B-세포의 수를 감소시키는 것으로 생각되는 반면에, 이러한 BCR을 발현하지 않는 B-세포를 제거하기 위해서는 추가 치료가 요구될 수 있다. 치료될 B-세포 악성종양이 예컨대 악성 비-(기능성 표면) BCR 발현 B-세포에 대한 전구 세포인 (기능성 표면) BCR 발현 악성 B-세포의 존재를 특징으로 한다면, 본 발명의 BCR 항원 접합체를 이용한 치료가 전구 세포의 억제 또는 사멸에 특히 유용할 수 있어, 바람직하게는 악성 딸 B-세포의 생산 공급원을 제거하고/거나 환자의 재발을 방지하는 것으로 예상된다. 이에 따라, 본 발명의 접합체는 원칙적으로 또한 관해시의 MGUS/MM의 공고(consolidation)를 위해 사용될 수 있다; 즉 형질 세포를 생산하는 파라단백질의 수가 현저히 감소되고 본 발명의 접합체가 파라단백질을 생산하는 악성 형질 세포에 도달하지 않으면서 분비된 "디코이" 파라단백질에 의해 결합 및 포획되는 경향이 적다.
그러나, (MM/MGUS에서의 경우와 같이) 항체 또는 항체 단편을 분비하는 형질 B-세포가 아닌, 그 표면 상에 기능성 BCR을 보유하는 클론성 악성 B-세포의 증식에 의해 유발되고 그리고 이와 관련한 B 세포 악성종양을 치료하는 것이 본원에서 특히 고려된다. 이는 접합된 BCR 항원이 바람직하게는, 분비된 항체 또는 이의 단편 (예를 들어, 파라단백질)에 결합함으로써 "소실" 및 고갈되는 대신에 클론성 악성 B 세포상의 표면 발현된 BCR에 의해 결합되는 것으로 예상되기 때문이다. 특히 치료를 위해 고려되는 B-세포 악성종양은 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBL), 외투 세포 림프종(MTL), 원발성 중추신경계 림프종(PCNSL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 여포성 림프종을 포함하며, 상기 질환이 클론성 악성 형질 세포 또는 이들의 항체 생산 전구체에 의해 야기되지 않거나 이와 관련되지 않을 것을 조건으로 한다. 다시 말해, BCR 항원 접합체를 이용한 치료를 위해 고려되는 앞서 언급된 질환은 바람직하게는 감마글로불린병증/(비-기능성) 면역글로불린의 과잉 생산과 관련이 없다.
본원에 명시된 바와 같이, 본 발명의 접합된 BCR 항원을 이용하여 치료될 B-세포 악성종양은 바람직하게는 BCR, 특히 세포 표면 상의 기능성 BCR을 발현하는 클론성 악성 B-세포의 존재를 특징으로 한다. BCR의 세포 표면 발현은 당업계의 통상적인 방법을 사용하여, 예컨대 표면 면역글로불린의 불변 영역에 특이적인 표지된 항체를 이용한 유세포 분석을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. BCR은 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다면 본원에서 "기능성"인 것으로 명명된다: i) 항원의 특이적 인식, 및, 항원을 인식하거나 이에 결합한 후, ii) BCR-BCR 항원 접합체 복합체의 내재화. 기능성 BCR은 이의 특이적 항원성 표적에 결합한 후 하기 능력 중 하나 이상을 추가로 나타낼 수 있다: iii) Igα/β에서 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)의 인산화, iv) 하류 신호전달 성분 Syk, 브루톤 티로신 키나제(Btk), 및/또는 포스포리파제 Cγ2(PLCγ2)의 인산화, v) 제2 메신저 DAG 및/또는 IP3의 생산, vi) 세포내 스토어로부터 Ca2 +의 방출.
BCR-BCR 항원 접합체 복합체의 내재화는 본원에 기재된 바와 같은 형광 현미경법 및 표지된 접합체를 사용하여 가시화될 수 있다. Igα/β ITAM, Syk, Brk 또는 PLCγ2의 인산화는 통상적인 기법을 사용하여, 예컨대 상업적으로 입수가능한 항체를 이용한 면역침강 및 면역블롯팅을 사용하여 용이하게 확인가능하다. 세포내 Ca2+ 또는 DAG 방출을 검출하기 위한 키트 또한 상업적으로 입수가능하다.
따라서, 접합된 BCR 항원이 악성 B-세포의 BCR에 결합한 후 악성 B-세포에 의해 내재화될 수 있는 것으로 예상된다. BCR-BCR 항원 접합체 복합체의 내재화(또는 엔도시토시스)는 당업계에 공지되고 실시예에 제시된 바와 같이 통상적인 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 내재화는 특히 BCR 항원-접합체가 내재화되고 바람직하게는 세포 내의 BCR 항원 접합체로부터 방출될 때 그 기능(즉, 악성 B-세포의 억제 또는 사멸)을 발휘할 수 있는 독소를 포함하는 경우 중요한 것으로 생각된다.
BCR 항원
본원에 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 상기 악성 B-세포에 의해 특이적으로 인식될 "독성 미끼", 즉 BCR 항원-접합체를 사용하여 환자에서 악성 B-세포를 표적화하여, 결국 상기 세포의 억제 및 사멸을 초래한다는 사상에 기초한다. 일반적으로, 임의의 항원이 악성 B-세포의 BCR에 결합할 수 있는 한 (즉, 이에 의해 인식될 수 있는 한) 본 발명의 BCR 항원 접합체의 일부로서 사용될 수 있다. 본 발명의 BCR-항원 접합체의 내재화가 BCR 항원의 유리한 능력(즉, 악성 B-세포의 억제 또는 사멸)을 발휘하는데 요구되는 경우, 항원은 바람직하게는 상기 접합체의 내재화를 허용해야 한다. 환자에서 악성 B-세포의 BCR에 의해 인식되는 항원성 표적은 단백질 어레이를 사용하여 확인될 수 있다. 예컨대, B-세포는 표준 프로토콜을 사용하여 샘플(예컨대, 환자의 혈액, 골수, 림프절 또는 림프외 조직의 샘플)에서 수득될 수 있고, 파파인 소화처리되어, BCR의 Fab 단편을 생성한다. 그 후에, Fab 단편은 (상업적으로 입수가능한) 단백질 어레이, 예컨대 유니펙스(Unipex) 1 및 유니펙스 2(Source Biosciences)를 사용하여 항원 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. Fab 단편의 스크리닝은 항원성 표적이 발견될 때까지 상이한 단백질 어레이를 사용하여 반복될 수 있다. 전형적으로 B-세포 신생물을 앓고 있는 환자에 존재하는 악성 B-세포의 풍부함으로 인해, 악성 B-세포의 항원성 표적은 (형광성으로) 표지된 이차 (항-Fab) 항체를 이용한 결합된 Fab 단편의 검출에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 놀랍게도, B-세포 악성종양에서 발견되는 악성 B-세포의 BCR에 의해 이론적으로 인식될 수 있는 엄청나게 많은 항원에도 불구하고, 본 발명자들은 동일한 B-세포 악성종양을 앓고 있는 다수의 환자에서 공유되는 우성 항원, 즉 항원성 표적이 각종 B-세포 신생물에 존재하는 것을 발견했다.
본 발명자들에 의해 확인된 예시적인 우성 항원이 표 1에 제시된다:
Figure pct00001
(*) 서브세트는 준유사 또는 동일한 BCR("BCR 상동증")을 갖는 CLL 환자를 지칭한다.
특히, 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, BCR-항원 접합체는 항원성 표적(예컨대, 단백질)으로서 동정된 완전한 분자를 포함할 필요는 없지만, 상기 단편이 악성 B-세포의 BCR에 결합할 수 있는 한, 즉 바람직하게는 상기 BCR에 의해 인식되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 한, 동정된 항원성 표적(예컨대, 펩티드)의 단편만을 포함할 수 있다.
펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 지질 및 다당류는 항원성 표적으로서, 즉 본 발명의 접합체의 항원성 부분으로서 특히 고려된다. 용어 "펩티드"는 각각의 카복실 기와 아미노 기 사이의 화학 결합(즉, 펩티드 결합)에 의해 연결된 2개 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 화합물을 지칭하는 반면에, "폴리펩티드"는 10개 초과의 아미노산으로 이루어지고 "단백질"은 100개 초과의 아미노산으로 이루어진다. 용어 "펩티드"는 네이티브 펩티드(예컨대 분해 산물 또는 재조합 펩티드), 및 펩토이드 및 세미펩토이드를 포함한 펩티도미메틱(합성적으로 합성된 펩티드)를 포괄한다. 마찬가지로, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 네이티브, 합성적으로 합성된 및 재조합 폴리펩티드 또는 단백질 각각을 포함한다.
예컨대, 개선된 또는 추가적인 기능성, 예컨대 감소된 면역원성, 증가된 또는 감소된 유체역학적 크기 (용액 중의 크기), 용해도 및/또는 안정성 및/또는 연장된 혈청 반감기를 포함하도록 변경되어진 변형된 BCR 항원을 사용하는 것도 구상될 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 예시적인 기능성 모이어티는 인체의 다른 단백질에 결합하는 펩티드 또는 단백질 도메인을 포함한다 (예컨대 혈청 알부민, 면역글로불린 Fc 영역 또는 신생아 Fc 수용체(FcRn), 다양한 길이의 폴리펩티드 쇄 (예컨대, XTEN 기술 또는 PASylation®), 비-단백질성 폴리머, 비제한적으로 하기를 포함함, 다양한 폴리올 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEGylation), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의, 또는 탄수화물들, 예컨대 히드록시에틸 전분(예컨대, HESylation®) 또는 폴리시알산(예컨대, PolyXen® 기술)의 코폴리머).
용어 "지질"은 트리글리세리드, 지방산, 중성 지방, 인지질, 글리코리피드, 왁스, 및 스테로이드를 포함한 지방 및 지방 유사물을 포함한다. 용어 "다당류"는 단당류의 3개 이상의 분자로부터 형성되는 탄수화물 폴리머를 지칭한다. 반복되는 탄수화물 에피토프를 포함한 다당류가 다당류 항원성 표적으로서 특히 적합한 것으로 고려된다.
항원은 내생성 항원, 특히 자가항원, 또는 외생성 항원일 수 있다. "내생성 항원"은 정상적인 세포 대사의 일부로서 숙주 세포 내로부터 생성되거나 또는 세포가 (세포내) 박테리아 또는 바이러스에 의해 감염된 경우에 생성된다. "자가항원"(자기-항원)은 이에 의해 면역 반응을 일으킬 수 있는 숙주의 내생성 성분이다. 상기 자가항원은, 특히 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질인 경우, 번역후 변형되거나 비변형될 수 있는 것이 고려된다. "번역후 변형"은 리보솜에 의한 번역이 완료된 후 단백질 상에서 일어나는 변형이다. "번역후 변형"은 단백질에 작용기의 (공유적) 첨가를 포함하지만, 또한 단백질이 기능적으로 성숙하는데 필요한 단백질분해 프로세싱 및 폴딩 프로세스를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서 구상될 수 있는 번역후 변형은 인산화, 팔미토일화, 글리코실화, 유비퀴틴화, 수모화(SUMOylation), 메틸화, 아세틸화, 및 탈카복실화 또는 각각의 역 프로세스(탈-인산화, 탈-아세틸화, 탈-메틸화 등)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
항원은 또한 외생성 항원, 즉 예컨대 흡입, 섭취 또는 주입을 통해, 외부로부터 숙주의 바디에 진입하는 항원일 수 있다. 외생성 항원은 숙주 내에서 이물질로 간주되는 입자를 포함한다. 상기 용어는 또한 "이종성 항원" 또는 "이종항원", 즉 숙주에 대해 이질적인 종으로부터 유래하는 항원을 포함한다. 예시적인 외생성 항원은 알레르겐(예컨대 화분), 또는 미생물의 일부(예컨대 박테리아, 바이러스, 등의 코트, 캡슐, 세포벽, 편모, 핌브리아, 또는 독소)를 포함한다.
항원이 동종항원, 즉 동일 종(예컨대, 인간)의 멤버에서 유래한 외래 항원일 수 있음이 추가로 고려된다.
본 발명의 BCR 항원 접합체의 항원이 클론성 악성 B-세포의 BCR에 의해 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 것이 추가로 고려된다. 용어 "에피토프"는 면역글로불린, 예컨대 BCR에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정인자, 특히 항원 영역을 포함한다. 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 기들을 포함하며, 특이적 삼차원 구조 특성, 및/또는 특이적 전하 특성을 가질 수 있다. 특히, BCR-항원 접합체가, 바람직하게는 악성 B-세포의 BCR에 의해 인식되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원의 단편(즉, 항원성 단편)만을 포함할 수 있는 것이 고려된다.
면역학적 결합은 일반적으로 면역글로불린 분자(BCR에서와 같이)와 면역글로불린에 대해 특이적인 항원 간에, 예를 들면 예시적이며 비제한적으로, 정전기적, 이온성, 친수성 및/또는 소수성 인력 또는 척력, 입체력, 수소 결합, 반 데르 발스력, 및 다른 상호작용의 결과로서 일어나는 타입의 비-공유적 상호작용을 지칭한다. 일반적으로, 분자, 예컨대 면역글로불린 분자는 대체 물질보다 더 빈번하게, 더 신속하게, 더 긴 기간 및/또는 더 큰 친화성으로 특정 물질과 반응 또는 회합한다면 "특이적 결합"을 나타내는 것으로 간주된다. 이에 따라, 본원에서 BCR은 분자의 복합체 혼합물 중의 표적 항원을 선호적으로 인식한다면, 즉 다른 물질보다 더 큰 친화성, 아비디티로, 더 신속하게, 및/또는 더 긴 기간 동안 항원과 반응한다면 BCR-항원 접합체(또는, 더 구체적으로는, 접합체의 항원 부위)에 "특이적으로" 결합하는 것으로 간주된다. 이러한 특이적 결합을 확인하는 방법이 또한 당업계에 익히 알려져 있다.
면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화성은 상호작용의 해리 상수(Kd)의 관점에서 표현될 수 있으며, 여기서 보다 작은 Kd는 보다 큰 친화성을 나타낸다. 선정된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당업계에 익히 알려진 방법을 사용하여 정량화될 수 있다. 한가지 이러한 방법은 항원 결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리 속도를 측정하는 것을 수반하며, 여기서 그러한 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화성, 및 양 방향으로 속도에 대등하게 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 의존한다. 이에 따라, "온 속도 상수"(Kon) 및 "오프 속도 상수"(Koff) 둘 모두는 회합 및 해리의 실제 속도 및 농도의 계산에 의해 결정될 수 있다. Koff/Kon 비는 친화성과 관련이 없는 모든 파라미터의 배제를 가능하게 하며, 이에 따라 해리 상수 Kd에 상응한다. BCR은 특히 평형 해리 상수가 ≤10-7 이하, 바람직하게는 10-8 M 이하, 또는 더 바람직하게는 ≤10-9 M 이하인 경우에 BCR 항원 접합체(또는, 보다 구체적으로는, 접합체의 항원성 부위)에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 접합된 BCR 항원은 각종 유리한 능력을 갖는 것으로 예상된다. 이는 환자에서 악성 B-세포의 활성화 및/또는 증식을 억제하는 것으로 생각된다(본원에서 또한 간단히 "억제" 또는 "억제하는"으로 명명됨). 이는 예컨대, 세포정지제에 근접함으로써, 또는 활성화 및/또는 증식을 억제하는 다른 세포를 동원함으로써 달성될 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로, 본 발명의 접합체는 환자에서 악성 B-세포를 사멸시키는 것으로 생각된다. 사멸은 몇몇 메카니즘 중 하나에 의해, 예컨대 아폽토시스의 유도, 독소에의 근접화, 또는 표적화된 B-세포를 사멸시킬 수 있는 세포독성 T 림프구 또는 대식세포와 같은 다른 세포를 유인함으로써 달성될 수 있다. 악성 B-세포의 사멸은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여, 예컨대 실시예에 제시된 바와 같이 확인 가능하다.
바람직하게는 악성 B-세포의 억제 및/또는 사멸에 의해, 본 발명의 접합된 BCR 항원은 또한 결국에 환자에서 악성 B-세포의 수를 감소시킬 것으로 예상된다.
접합된 작용 물질
본원에 제시된 바와 같이, 본 발명은 치료제 또는 진단제에 접합된 BCR 항원을 고려한다. 본 발명에 따른 B-세포 악성종양의 치료에 특히 유용한 예시적인 치료제는 방사성 핵종, 결합제, CAR T-세포, 및 독소를 포함한다.
방사성 핵종
방사성 핵종은 방사성인 핵종이며 또한 방사성동위원소 또는 방사성 동위원소로서 지칭된다. 적합한 방사성 핵종은 예컨대, 알파-방출 동위원소 예컨대 225Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 224Ra 또는 223Ra로부터 선택될 수 있다. 대안으로, 세포독성 방사성 핵종은 베타-방출 동위원소 예컨대 186Rh, 188Rh, 177Lu, 90Y, 131I, 67Cu, 64Cu, 153Sm 또는 166Ho일 수 있다. 독소로서 사용하기 위해 고려될 수 있는 다른 세포독성 방사성 핵종은 오거(Auger) 및 저 에너지 전자를 방출하며 125I, 123I 또는 77Br로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 방사성 핵종은 바람직하게는 알파-방출 동위원소 예컨대 225Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 224Ra 또는 223Ra이다. 대안으로, 방사성 핵종은 베타-방출 동위원소 예컨대 186Rh, 188Rh, 177Lu, 90Y, 131I, 67Cu, 64Cu, 153Sm 또는 166Ho일 수 있다. 추가로, 방사성 핵종은 오거 및 저 에너지 전자를 방출할 수 있고 동위원소 125I, 123I 또는 77Br 중 하나일 수 있다.
결합제
본 발명의 BCR 항원에 "결합제"를 커플링하는 것도 고려된다. 결합제는 예컨대 악성 B-세포에 면역 이펙터 세포를 동원하는데 사용될 수 있다. 면역 이펙터 세포는 바람직하게는 비-B 세포, 예컨대 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호중구 또는 (세포독성) T 세포이다. 예를 들면, BCR 항원 접합체의 항원성 부위가 악성 B-세포를 표적화하는 동안, 접합된 CD16 결합제가 자연 살해(NK) 세포를 악성 B-세포에 동원시킬 수 있어, 결국에 B-세포를 살해할 것으로 생각된다. 악성 B-세포를 살해하거나 억제할 수 있는 NK 세포 또는 다른 면역 이펙터 세포를 동원할 수 있는 다른 결합제, 예컨대 CD3 결합제, 및 CD38 결합제도 본원에서 고려된다. 바람직한 결합제는 단리된 폴리펩티드, 특히 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 당업자는 본 발명의 BCR 항원 접합체의 일부로서 선택된 결합제가 바람직하게는 접합체의 항원성 부위에 악성 B-세포의 BCR의 결합을 (예컨대, 입체적으로) 간섭하지 않아, 악성 세포와 동원된 면역 이펙터 세포 간에 "어답터"로서 작용하는 BCR 항원 접합체의 능력을 유지하며, 이에 의해 바람직하게는 본원에 기재된 것과 동일한 유리한 특성(즉, 악성 B-세포의 BCR에의 결합 및 상기 세포의 사멸 또는 억제)을 갖는 BCR-항원 접합체를 생산하는 것을 용이하게 이해할 것이다.
용어 "항체"는 항원성 표적, 또는 결합 특이성을 유지하거나 실질적으로 유지하는 상기 항체의 유도체에 결합하는 단일클론 또는 다중클론 항체를 지칭한다. 이러한 항체의 예시적인 유도체는 예를 들면, 마우스 또는 래트 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체, 및 인간화 항체, 즉 가변 영역의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 예컨대 CDR3 및 바람직하게는 모든 6개의 CDR이 원하는 특이성을 갖는 인간 기원의 항체의 CDR로 대체되고, 경우에 따라, 항체의 비-인간 불변 영역(들)이 인간 항체의 (하나의) 불변 영역(들)으로 대체된, 비-인간 기원의 항체이다.
용어 "항체"는 또한 기능성 항체 단편, 즉 분리된 경쇄 및 중쇄, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2와 같은 항체의 결합 특이성을 보유하거나 실질적으로 보유하는 항체의 단편을 포함한다. 용어 "항체"는 또한 이작용성 (이중특이성) 항체 및 항체 구축물, 예컨대 단일쇄 Fv(scFv), 탠덤-scFv, 비스-scFv, 또는 항체-융합 단백질, 중쇄 항체 및 이의 가변 도메인, 전통적인 4 쇄 항체 분자의 중쇄 가변 도메인(VH) 또는 경쇄 가변 도메인(VL)에 기초하거나 이에서 유래하는 도메인 항체 ("dAb's"), 디아바디, 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이성 항체를 포함한다.
항원 및 결합제를 포함하는 이중특이성 B-세포 항원 접합체는 본원에서 또한 "Bi-BAR"로서 명명된다.
독소
본 발명의 접합체의 항원에 커플링된 치료제는 독소일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "독소"는 화학 독소, 화학치료제 및 단백질 독소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본원에 기재된 바와 같은 BCR 항원에 접합되어, 바람직하게는 본원에 기재된 것과 동일한 유리한 능력(즉, 악성 B-세포의 BCR에 결합하고 상기 세포를 살해하거나 억제하는 능력)을 갖는 BCR 접합체를 생성할 수 있다면 임의의 여타의 화합물이 또한 고려될 수 있다.
본 발명에서의 사용을 위해 고려될 수 있는 "화학치료제"는 B-세포 악성종양의 치료에 유용한 임의의 항신생물제 및/또는 세포정지제를 포함하며, 작은 사이즈의 유기 분자, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 등이 포함된다. 화학치료제의 정의에 포함되는 작용 물질은 알킬화제, 예컨대 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 이포스파미드, 부설판, N-니트로소-N-메틸우레아(MNU), 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 세무스틴(MeCCNU), 포테무스틴, 스트렙토조토신, 다카바진, 미토졸로마이드, 테모졸로마이드, 티오테파, 미토마이신, 디아지쿠온(AZQ), 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 프로카바진 및 헥사메틸멜라민; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트, 페메트렉시드, 플루오로우라실, 카페시타빈, 시타라빈, 젬시타빈, 데시타빈, 비다자(Vidaza), 플루다라빈, 넬라라빈, 클라드리빈, 클로파라빈, 펜토스타틴, 티오구아닌, 머캅토퓨린; 항-미소관제 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 빈플루닌, 파클리탁셀, 도세탁셀, 포도필로톡신; 토포이소머라제 억제제, 예컨대 이리노테칸, 토포테칸, 에토포시드, 독소루비신, 미톡산트론, 테니포시드, 노보비오신, 메르바론, 아클라루비신; 세포독성 항생제, 예컨대 액티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신, 미토마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 피라루비신, 아클라루비신, 미톡산트론; 유독 렉틴; 식물 독소, 예컨대 리신, 아브린, 모데신; 보툴리나 독소, 디프테리아 독소; 에니다이엔, 듀오카마이신, 칼리케아미신, 에스페라미신, 독소루비신, ARA-C, 시스-플래티넘, 5-플루오로우라실, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 베도틴, 엠탄신; 티로신 키나제 억제제, 또는 본원에 기재된 바와 같은 B-세포 악성종양의 치료를 위해 당업계에 공지된 임의의 다른 소분자 약물이 있지만 이에 한정되지 않는다. 이들의 유도체 및 조합이 또한 본 발명의 BCR 접합체에 사용하기 위해 고려된다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 독소는 에니다이엔, 듀오카마이신, 메토트렉세이트, 독소루비신, 멜팔란, 클로람부실, ARA-C, 빈데신, 미토마이신 C, 시스플라틴, 에토포시드, 블레오마이신, 베도틴, 엠탄신, 5-플루오로우라실 및 티로신 키나제 억제제(예컨대 이마티닙)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
CAR T 세포
CAR T 세포는 인공의 키메라 T 세포 수용체(또는 키메라 항원 수용체(CAR))를 운반하는 T-세포이다. 전형적으로, 이들 수용체는 T 세포 상에 단일클론 항체의 특이성을 접목시키는데 사용된다. 이들 분자의 가장 흔한 형태는 CD3-ξ 막관통- 및 엔도도메인에 융합된, 단일클론 항체 유래의 단일쇄 가변 단편(scFv)의 융합체이다. 항원성 표적의 scFv의 인식 시에, 이러한 CAR은 CAR-T 세포의 활성화, 증식, 사이토카인 생성 및/또는 이펙터 기능을 유도하는 신호의 전달을 도모한다.
본 발명의 BCR 접합체에서 치료제로서 사용되는 CAR T-세포는 BCR에 결합하는 접합체의 항원성 부위에 의해 악성 B-세포에 표적화되는 것으로 예상되며, 여기서 CAR T 세포는 결국에 활성화되어 악성 B-세포를 억제 또는 사멸시킬 것이다.
CAR-T 세포를 치료제로서 포함하는 BCR 항원 접합체는 본원에서 "BAR-CAR"로도 명명된다.
화학적 변형
접합된 BCR 항원은 화학적으로 변형될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 접합된 BCR 항원의 유리한 성질을 무효화하지 않는 한, 즉 화학적으로 변형된 BCR 항원 접합체가 바람직하게는 실시예에서 평가된 화합물의 능력에 필적하는 능력을 가진다면, 모든 종류의 변형이 고려될 수 있다. 특히, 변형된 BCR 항원 접합체는 바람직하게는 악성 B-세포의 BCR에 결합하여, 상기 B-세포를 억제 또는 사멸시키는 능력을 보유해야 한다. 내재화하는 능력이 추가적으로 원해질 수 있다.
진단제
(검출 가능한) 표지가 진단 목적을 위해 BCR 항원에 부착될 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위해 고려될 수 있는 표지는 형광성 분자, 또는 자성 물질, 예컨대 자성 입자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이에 의해, 샘플 중의 표적의 존재 및/또는 농도는 검출 가능한 표지에 의해 생성되는 신호를 검출함으로써 검출될 수 있다.
검출 가능한 표지는 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있고, 상이한 특이적 항체에 접합된 몇몇 상이한 검출 가능한 표지가 조합 사용되어 하나 이상의 표지를 검출할 수 있다.
직접적으로 검출될 수 있는 검출 가능한 표지의 예는 형광성 표지, 효소 표지, 방사성동위원소, 화학발광 표지, 전기화학발광 표지, 생물발광 표지, 폴리머, 폴리머 입자, 금속 입자, 합텐, 및 염료를 포함한다. 형광성 표지의 예는 5-(및 6)-카복시플루오레세인, 5- 또는 6-카복시플루오레세인, 6-(플루오레세인)-5-(및 6)-카복사미도 헥산산, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 테트라메틸로다민, 및 염료 예컨대 Cy2, Cy3, 및 Cy5, 경우에 따라 치환된 쿠마린, AMCA, PerCP 포함, 피코빌리단백질, R-피코에리트린(RPE) 및 알로피코에리트린(APC) 포함, 텍사스 레드, 프린스턴 레드, 녹색 형광성 단백질(GFP) 및 이들의 유사체, 및 R-피코에리트린 또는 알로피코에리트린의 접합체, 무기 형광성 표지 예컨대 코팅된 CdSe 나노크리스탈라이트와 같은 반도체 재료에 기초한 입자를 포함한다. 폴리머 입자 표지의 예는 형광성 염료가 박힐 수 있는 폴리스티렌, PMMA 또는 실리카의 마이크로 입자 또는 라텍스 입자, 또는 염료, 효소 또는 기질을 함유하는 폴리머 마이셀 또는 캡슐을 포함한다. 금속 입자 표지의 예는 금 입자 및 코팅된 금 입자를 포함하며, 이는 실버 스테인에 의해 변환될 수 있다. 합텐의 예는 DNP, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 비오틴, 및 디곡시게닌을 포함한다. 효소 표지의 예는 호스래디시 퍼옥시다제(HRP), 알칼라인 포스파타제 (ALP 또는 AP), β-갈락토시다제(GAL), 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, β-N-아세틸글루코사미미다제, β-글루쿠로니다제, 인버타제, 크산틴 옥시다제, 파이어플라이 루시퍼라제 및 글루코스 옥시다제(GO)를 포함한다. 호스래디시 퍼옥시다제를 위해 흔히 사용되는 기질의 예는 3,3'-디아미노벤지딘(DAB), 니켈 강화된 디아미노벤지딘, 3-아미노-9-에틸카바졸(AEC), 벤지딘 디히드로클로라이드(BDHC), 한커-예이츠(Hanker-Yates) 시약(HYR), 인도판 블루(IB), 테트라메틸벤지딘(TMB), 4-클로로-1-나프톨(CN), .알파.-나프톨 피로닌(.알파.-NP), o-디아니시딘(OD), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸륨(NBT), 2-(p-이오도페닐)-3-p-니트로페닐-5-페닐 테트라졸륨 클로라이드(INT), 테트라니트로 블루 테트라졸륨(TNBT), 5-브로모-4-클로로-3-인도실-베타-D-갈락토시드/페로-페리시아니드(BCIG/FF)를 포함한다.알칼라인 포스파타제를 위해 흔히 사용되는 기질의 예는 나프톨-AS-B1-포스페이트/패스트 레드 TR (NABP/FR), 나프톨-AS-MX-포스페이트/패스트 레드 TR (NAMP/FR), 나프톨-AS-B1-포스페이트/패스트 레드 TR (NABP/FR), 나프톨-AS-MX-포스페이트/패스트 레드 TR (NAMP/FR), 나프톨-AS-B1-포스페이트/신규 푹신(NABP/NF), 브로모클로로인돌릴 포스페이트/니트로블루 테트라졸륨 (BCIP/NBT), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-- d-갈락토피라노시드(BCIG)를 포함한다. 발광 표지의 예는 루미놀, 이소루미놀, 아크리디늄 에스테르, 1,2-디옥세탄 및 피리도피리다진을 포함한다. 전기화학발광 표지의 예는 루테늄 유도체를 포함한다. 방사성 표지의 예는 요오드화물, 코발트, 셀레늄, 트리튬, 탄소, 황 및 인의 방사성 동위원소를 포함한다.
치료제 및 진단제 둘 모두에 접합된 BCR 항원이 또한 본원에서 고려되며 예컨대 악성 B-세포를 표적화함과 동시에 환자에서 접합체의 분포 및 내재화를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
링커
치료제 또는 진단제는 전형적으로 링커를 통해 BCR 항원에 부착된다. 고려 가능한 링커는 예를 들어 일반적으로, 가요성, 절단성 및 강성의 링커를 포함하며 접합체의 타입 및 의도된 용도/적용에 따라 선택될 것이다. 예를 들면 치료적 적용의 경우, 면역원성 부반응의 위험을 감소시키면서 도메인들 간의 특정 정도의 가요성 또는 상호작용을 보장하기 위해 비-면역원성, 가요성 링커가 종종 바람직하다. 이러한 링커는 일반적으로 작은, 비-극성(예컨대 Gly) 또는 극성(예컨대 Ser 또는 Thr) 아미노산으로 구성되며 Gly 및 Ser 잔기의 스트레치로 이루어진 "GS" 링커를 포함한다. 본 발명의 접합체를 위해 또한 고려되는 가장 널리 사용되는 가요성 링커의 일례는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n의 서열을 갖는다.
치료
용어 "치료"는 이의 모든 문법적 형태에서 B-세포 악성종양의 치료적 또는 예방적 처치를 포함한다. "치료적 또는 예방적 처치"는 임상적 및/또는 병리학적 징후의 완전한 예방을 목적으로 하는 예방적 치료 또는 임상적 및/또는 병리학적 증상의 개선 또는 관해를 목적으로 하는 치료적 처치를 포함한다. 이에 따라 "치료"는 또한 B-세포 악성종양의 완화 또는 예방을 포함한다.
바람직하게는, 치료는 치료 유효량의 BCR 항원 접합체의 투여를 수반한다. "치료 유효량"이란 본원에 기재된 바와 같은 치료 효과를 이끌어 내는 BCR 항원 접합체의 양을 의미한다. BCR 항원 접합체의 정확한 용량은 치료 목적(예컨대 질환의 관해 유지 대 급성 악화기(acute flare) 또는 전이성 전파)에 따라 달라질 것이고, 공지된 기법을 사용하여 당업자에 의해 확인 가능할 것이다. 투여 경로, 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용 및 병태의 중증도에 대한 조정이 필요할 수 있으며, 당업자에 의해 통상적인 실험을 통해 확인 가능할 것이다.
본 발명의 맥락에서 용어 "치료 효과"는 일반적으로 질환 발현의 완화 또는 관해와 같은 치료의 원하는 또는 유익한 영향을 지칭한다. 질환의 "발현"이란 용어는 본원에서 이의 지각 가능한 발현을 기술하기 위해 사용되며, 이하에서 건강 검진 동안 검출될 수 있고/거나 환자에 의해 자각 가능한 질환의 징후(즉, 증상)로서 정의되는 임상적 발현과 세포 및 분자 수준의 질환의 발현을 의미하는 병리학적 발현 둘 모두를 포함한다. 예컨대, 치료 효과가 야기되는지 여부를 숙련된 의사가 평가하는 것을 돕는 각각의 환자의 일반적인 겉모습(예컨대, 피트니스, 웰빙)이 평가될 수 있다. 당업자는 본 발명의 BCR 항원 접합체의 치료 효과를 관찰하는데 적합한 다수의 다른 방법을 숙지하고 있다.
본원에서 "피험체"로서도 지칭되는 "환자"라는 용어는 인간 질환(즉, B-세포 악성종양)의 모델 시스템으로서 사용될 수 있는 임의의 포유류 또는 임의의 척추동물을 포함하는 것으로 의도된다. 피험체의 예는 인간, 원숭이, 유인원, 개, 고양이, 마우스, 래트, 말, 돼지, 소, 양, 염소, 토끼, 기니피그, 햄스터 및 이들의 트랜스제닉 종을 포함한다. 본 발명의 맥락에서는 인간 환자가 바람직하다.
본 발명의 접합체의 투여를 위해 각종 경로가 적용 가능하며, 경구, 국소, 경피, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내 또는 안내를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 그러나, 원한다면 임의의 다른 경로가 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
병용 요법
본 발명의 BCR-항원 접합체는 또한 B-세포 악성종양의 치료를 위해 사용되는 흔한 치료 접근법과 함께 병용 요법이 고려된다. 병용 요법을 위해 고려 가능한 치료적 접근법은 예컨대, CHOP(시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니손), 경우에 따라 리툭시맙(R-CHOP), BR(벤다무스틴 및 리툭시맙), R-CVP(리툭시맙, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손), 및 플루다라빈계 조합들에 의해 완전해진다. 방사선 요법(전형적으로 외부-빔 방사선 요법)이 리툭시맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 또는 항체-약물 접합체 브렌툭시맙 베도틴과 같은 단일클론 항체를 이용한 치료로서 또한 고려된다. 줄기 세포 이식이 또한 요구될 수 있다. 통증, 구역, 헐떡임, 불면증, 및 B-세포 악성종양 또는 이의 치료에 의해 야기되는 다른 신체 증상을 포함한 B-세포 악성종양 치료의 부작용 및 증상을 감소시키거나 제어하기 위한 완화제의 추가 투여가 또한 고려된다.
당업자는 치료 옵션이 치료될 특정 B-세포 악성종양에 따라 달라지는 것을 인지할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 BCR 항원 접합체를 이용한 치료는 통상의 치료 접근법에 선행하고/거나 후행할 수 있거나, 또는 동시에 수행될 수 있다. 본 발명의 접합체를 통상의 치료 옵션과 조합하는 것이 본원에서 고려되지만, B-세포 악성종양을 치료하는데 흔히 사용되는 화학치료 계획의 구성분을 대체하는데도 사용될 수 있다. 예를 들면, 이의 우수한 특이성과, 이로 인한, 예상되는 부작용 감소로 인해, 본 발명의 접합체가 리툭시맙 또는 빈크리스틴 치료(예컨대 R-CHOP에서)를 대체하는데 사용될 수 있을 것으로 또한 예상된다.
진단 방법
진단 방법에서 BCR 항원 접합체의 사용이 또한 고려된다. 상기 진단 방법은 피험체에서 BCR 항원 접합체를 인식하는 BCR 발현 악성 B-세포의 동정 및 특징규명에 기초하며, 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 수행될 수 있다. 생체내 방법은 피험체에 표지된 BCR 항원 접합체를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 생체외 또는 시험관내 방법의 경우, 본 발명의 접합된 BCR 항원에 결합하는 악성 B-세포를 함유하는 것으로 의심되는 체액, 조직 또는 세포 샘플, 특히 혈액 샘플이 상기 세포의 BCR에 결합할 수 있는 표지된 BCR 항원 접합체와 접촉될 수 있다. 표지된 접합체의 결합은 샘플 중의 접합체의 항원성 부위를 특이적으로 인식하는 BCR을 갖는 BCR 발현 세포의 존재를 나타내며, 당업자에게 익히 알려진 방법에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 일부 양태는 접합된 BCR 항원을 인식하는 악성 B-세포의 존재 또는 양 또는 수준을 확인함으로써 피험체에서 B-세포 악성종양을 진단하거나 모니터링하는 것에 관한 것이다. 이러한 B-세포의 존재 또는 수준은 당업자에게 알려진 통상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 특히, (표지된) BCR 항원 접합체는 종래의 진단 방법에 기초하여 이전에 진단된 특정 B-세포 악성종양의 의심을 지지하는데 도움을 줄 수 있다.
계층화
본원에서는 또한 본원에 기재된 바와 같은 B-세포 악성종양을 앓고 있는 환자를 확인하는 비침습적 방법이 제공되며, 상기 환자는 본 발명의 접합된 BCR 항원에 선호적으로 반응하는 경향이 있다. 상기 방법은 (i) 표지된 BCR 항원 접합체를 제공하는 단계, (ii) 악성 B-세포를 포함하는 각 환자의 샘플에 표지된 BCR 항원 접합체를 첨가하는 단계; (iii) 본원에 기재된 바와 같은 상기 악성 B-세포에 표지된 BCR 항원 접합체의 결합 및/또는 내재화를 평가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 접합된 BCR 항원에 선호적으로 반응하는 경향이 있는 환자를 확인하는 단계에서 "확인"이란 용어는 환자를 계층화하는 것을 포함한다. 용어 "계층화"는 환자들을 상기 접합체를 이용한 요법으로부터 이득을 볼 수 있거나 보지 않을 수 있는 환자로 분류하는 것을 지칭한다. 특히, 환자를 계층화하는 것은 본 발명의 접합체에 결합하고/거나 상기 접합체를 내재화하는 환자의 악성 B-세포의 능력을 결정하는 것을 수반한다. 표지된 BCR 항원 접합체에 결합하고/거나 상기 접합체를 내재화하는 악성 B-세포의 환자는 본원에서 접합된 BCR 항원을 이용한 치료에 선호적으로 반응하는 경향이 있는 것으로 정의되는 반면에, 표지된 BCR 항원 접합체에 결합하지 않고/거나 상기 접합체를 내재화하지 않는 악성 B-세포의 환자는 그렇지 않은 것으로 정의된다.
"선호적으로 반응하는 경향이 있는"은 환자가 본 발명의 접합된 BCR 항원으로 치료받을 때 유익한 효과를 경험할 가능성이 있는 것을 의미한다. 유익한 효과는 악성 B-세포의 억제 및/또는 사멸, 악성 B-세포 수의 감소, 및/또는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 확인 가능한 치료 효과를 포함한다. 바람직하게는, 상기 환자는 이전에 B-세포 악성종양이 있는 것으로 진단을 받은 상태이다.
조성물
BCR 항원 접합체를 약학 조성물의 형태로 투여하는 것이 고려된다. 바람직하게는, 상기 BCR 항원 접합체는 치료 유효량으로 약학 조성물에 존재한다. "약학 조성물"이란 용어는 특히 인간에 투여하기 적합한 조성물, 즉, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 성분들을 함유하는 무균 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 약학 조성물은 BCR 항원 접합체를 하나 이상의 약학적 부형제와 함께 포함한다. "부형제"라는 용어는 충전제, 바인더, 붕해제, 코팅, 흡착제, 부착방지제, 유동촉진제, 방부제, 항산화제, 향료, 착색제, 감미제, 용매, 공용매, 완충제, 킬레이팅제, 점도 부여제, 표면 활성제, 희석제, 보습제, 담체, 희석제, 방부제, 유화제, 안정제 또는 긴장성 변경제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 치료 유효량의 BCR 항원 접합체를 포함하고 각종 형태, 예컨대 고체, 액체, 기체 또는 동결건조 형태로 제제화될 수 있고, 그 중에서도, 연고, 크림, 경피용 패치, 겔, 파우더, 타블렛, 용액, 에어로졸, 과립, 알약, 서스펜션, 에멀젼, 캡슐, 시럽, 액제, 엘릭시르, 추출물, 팅크제 또는 유체 추출물의 형태 또는 원하는 투여 방법에 특히 적합한 임의의 다른 형태일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 추가 작용 물질을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 작용 물질은 B-세포 악성종양의 치료를 위해 치료적으로 유효한 것이다. 본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 특정의 추가 작용 물질은 화학치료제 또는 완화제를 포함한, 본원에 기재된 바와 같은 독소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
BCR 항원 접합체 또는 이를 포함하는 키트 및 치료 방법과 관련하여 기술된 모든 양태가 본 발명의 약학 조성물에도 적용 가능하며, 준용이 되는 것을 주목하기 바란다.
상기의 관점에서, 본 발명은 또한 B-세포 악성종양의 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 본원에 정의된 B-세포 항원 접합체의 용도를 제공한다.
키트
BCR 항원 접합체는 키트의 일부로서 사용될 수 있음이 또한 고려된다. 따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 또한 특히 본원에 정의된 바와 같은 B-세포 악성종양의 치료 방법에 사용하도록 의도된, BCR 항원 접합체를 포함하는 키트에 관한 것이다.
키트는 2 이상의 부분의 키트일 수 있으며, BCR 항원 접합체, 또는 상기 BCR 항원 접합체 및 약학 조성물과 관련하여 정의된 하나 이상의 추가 작용 물질을 포함한 약학 조성물을 포함한다. 키트의 성분들은 용기 또는 바이알에 포함될 수 있다. BCR 항원 접합체 또는 이를 포함하는 약학 조성물 및 치료 방법과 관련하여 기술된 모든 양태가 본 발명의 키트에도 적용 가능하고, 준용이 되는 것을 주목하기 바란다.
키트에 포함되는 추가 작용 물질은 BCR 항원 접합체의 투여와 관련하여 동시에, 또는 순차적으로, 또는 별도로 적용될 수 있음이 고려된다. 본 발명은 상이한 투여 경로를 통한 작용 물질의 투여를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 B-세포 악성종양의 치료가 필요한 피험체에서 B-세포 악성종양의 치료 방법으로서, 상기 피험체에게 본원에서 정의된 바와 같은 B-세포 항원 접합체의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이다. 당업자라면 BCR 항원 접합체, 이를 포함하는 약학 조성물 및 키트와 관련하여 본원에 기재된 모든 양태가 치료 방법에도 적용 가능하고, 준용이 되는 것을 인지할 것이다.
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본원에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리 명시하지 않는 한 복수 언급을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 이에 따라, 예를 들면, "시약"에 대한 언급은 이러한 상이한 시약 중 하나 이상을 포함하고, "방법"에 대한 언급은 본원에 기술된 방법에 대해 변형되거나 대체될 수 있는 당업자에게 공지된 등가의 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 일련의 구성 요소에 선행하는 "적어도"라는 용어는 상기 일련의 구성 요소 각각을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 일상적인 실험만을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 균등 물을 인식할 수 있거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어로 연결된 요소들 모두 또는 이의 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 그러나, 이는 또한 구체적인 숫자를 포함하며, 예컨대, 약 20은 20을 포함한다.
용어 "미만" 또는 "초과"는 구체적인 숫자를 포함한다. 예를 들어 20 미만은 20보다 작거나 같음을 의미한다. 마찬가지로, 더 많은 또는 더 크다는 것은 각각 그보다 더 많거나 같음, 또는 그보다 더 크거나 같음을 의미한다.
본 명세서 및 이하의 청구 범위 전체에서, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함한다"라는 단어 및 "포함" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지 않는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용시 "포함하는"이란 용어는 "함유하는" 또는 "내포하는"이란 용어로 대체될 수 있거나 종종 본원에서 사용시 "갖는"이란 용어로 대체될 수 있다.
본원에서 사용시 "~로 이루어지는"은 청구항 요소에 특정되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 제외한다. 본원에서 사용시 "~로 필수적으로 이루어지는"은 청구항의 기본적인 새로운 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜, 재료, 시약 및 물질 등에 한정되지 않고 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 설명하기 위한 것이며, 청구 범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도는 아니다.
본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 공보 및 특허(모든 특허, 특허 출원, 과학 출판물, 제조자의 명세서, 지시서 등 포함)는, 상기 또는 하기의 여부와 상관없이, 그 전문이 본원에 참고로 인용된다. 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시보다 시기 적절할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 참고로 인용된 내용이 본 명세서와 모순되거나 불일치하는 경우, 본 명세서가 그러한 내용보다 우선할 것이다.
본 발명 및 그 이점에 대한 더 나은 이해는 단지 예시적인 목적으로 제공되는 하기의 실시예로부터 얻어질 것이다. 실시예는 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1:
본 발명자들은 이하에 제시된 바와 같은 각종 B-세포 악성종양에 대한 BAR의 임상적 용도를 위한 접근법을 개발하였다:
만성 림프구성 백혈병 ( CLL ):
CLL 발병률은 연간 100,000 명당 신규 4건으로 추산된다. 미국에서 CLL은 매년 14,620건의 신규 사례가 있으며 CLL로 인한 4650건의 사망 사례가 있고 (미국 암 협회 2014: Cancer Facts and Figures 2014; http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/ acspc-042151.pdf로부터 검색), 매년 유럽 전역에서 10,000명의 사망자가 발생한다 7.
BAR에 대한 임상적 적응증: CLL은 서서히 진화하는 질병으로 증상이 나타날 때 치료된다. 현대의 1차 치료법을 사용하면 반응이 빈번해져 대부분의 환자에게 무치료 기간이 연장된다. 재치료를 필요로 하는 환자에게는 많은 다른 처방이 선택될 수 있으며 많은 환자들은 질병에 걸리기 전에 최대 12가지 치료법을 접하게 된다. 그러나, 다발성 골수종과 마찬가지로, CLL은 이러한 주된 고령자에서 거의 불가능한 동종 이식이 없이는 치료가 불가능한 것으로 여겨진다. 여러 가지 가능한 처방의 순서 선택은 효능 및 내약성에 기반을 두고 있으며 BAR에 대해 가정할 수 있는 특질인 높은 효능과 낮은 독성을 갖는 신약을 위한 여지가 여전히 있다. 현재까지 BAR은 전체 CLL 케이스의 약 30%에 이용가능하며, CLL에 대해 BAR이 갖는 문제점은 항원성 BCR 표적이 매우 다양하다는 것이며, 이들 중 대부분은 공지된 BAR을 갖는 경우에 주어진 BAR 내에 상이한 에피토프를 가지고 있다. BAR 생산에 예상되는 낮은 비용에도 불구하고, 사용 가능한 CLL BAR 중 임의의 것에 개별 라이센스 절차가 필요한 경우 BAR의 광범위한 임상 적용이 있을지는 의문이다. CLL-BAR에 대한 그룹 차원의 라이센스를 추구해야 한다.
후보 환자의 확인:
알려진 항원을 코트(coat)로 사용하여 잘 확립된 전혈 용해물 ELISA에 의해 BCR 특이성에 대한 말초 혈액(CLL 세포)을 시험한다.
구현 전략:
(다중) 재발성 CLL 환자에서 CLL-BAR의 단일 약물 활성을 입증한다 (이론상 서양에서 연간 15,000 CLL 사망, 이 중 30%는 이러한 제I상/제II상 연구를 위한 잠재적인 후보임).
액티브한 경우, 다음 단계에서, 1차 치료에 응답하는 CLL 환자를 유지 BAR 또는 관찰로 무작위화한다.
제3의 단계로서 (대안으로 단계 1 이후에): BAR의 존재 및 부재 하에 1차 치료(유도 + 유지)를 위해 환자를 무작위화한다.
외투 세포 림프종( MCL )
MCL은 비호지킨 림프종의 모든 케이스의 약 3%를 구성한다. 미국의 전체 발생률은 연간 100,000 명당 0.55이며 연령이 증가함에 따라 증가한다: 50세 미만의 환자에서 0.07, 70-79세의 환자에서 2.97, 그리고 80세 이상에서 2.78. MCL 발병률은 남성(100,000명 중 0.84명)이 여성(100,000명 중 0.34명; P < .05)보다 높고, 아프리카계 미국인(100,000명 중 0.32 명)보다 백인 계급(10,000명 중 0.61 명)이 높다. 후기 단계 (III-IV) MCL은 환자의 74.6%에서 진단된다 8. 미국에서는 MCL의 신규 케이스가 연간 약 4200건, 유럽에서는 6000건으로 추산된다. 현재, MCL은 병용 화학요법 또는 화학요법 + 면역요법에 이어, 줄기 세포 이식을 사용하여 치료된다. 그러나, 보르테조밉, 이브루티닙 및 레날리도마이드와 같은 작용 물질은 B-세포 수용체 신호전달을 목적으로 하여 무진행 생존(PFS) 및 전체 생존(OS)을 개선하는 능력을 최근에 증명했으며, 이는 이전의 3-년 생존율로부터 7년의 중앙치까지의 유의미한 개선을 시사한다. 초기 병용 화학요법 계획에 대한 반응률은 종종 MCL 환자에서 매우 좋다; 그러나, 재발이 매우 흔하며, 환자가 가능한 치료 옵션으로 치유될 수 있는지 여부는, 아마도 70세의 중앙 진단 연령을 가진 대부분의 고령 환자 중 소수만이 적용 가능한 동종 이식을 제외하고는 아직 명확하지 않다 9. 따라서, 새로운 접근법이 절실히 요구된다.
BAR에 대한 임상적 적응증: 최근 몇 년간 신약으로 인한 치료 성과의 상당한 개선에도 불구하고, MCL의 치료율은 낮고, 1차 치료에 의해 치유되는 환자는 거의 없다. 따라서, MCL은 아직 의학적으로 충족되지 못하고 있다. BAR(LRPAP1)은 MCL 환자의 4/9(44%)에서 확인되었다. BAR 치료의 잠재적 후보자인 MCL 환자의 비율이 높으면 MCL-BAR의 임상 개발이 가속화된다.
후보 환자의 확인:
LRPAP-1에의 결합을 위한 MCL-BCR을 체크한다. 발달중인 말초 혈액을 사용하여 시험한다.
구현 전략:
제I상/제II상 시험에서 재발 MCL 환자에서의 MCL-BAR의 단일 약물 활성을 입증한다. MCL-BAR의 예상되는 높은 활성 및 낮은 독성으로 인해, 이것은 고령자의 최초의 재발 및 젊은 MCL 환자의 2회째 재발에서 이루어질 수 있다. 서양에서 매년 추산되는 약 10,000명의 새로운 MCL 사례 중에서 4400명이 LRPAP1에 특이적인 BCR을 갖는 것으로 예상된다. 이들 중, 1/4은 매년 재발할 것으로 예상될 수 있고; 따라서 추산되는 1000명의 환자가 1년에 제I상/제II상 시험의 잠재적 후보가 된다.
액티브한 경우, 다음 단계에서, 1차 치료에 응답하는 MLL 환자를 유지 BAR 또는 관찰에 무작위화한다.
제3 단계로서 (대안으로 단계 1 이후에): BAR의 존재 및 부재 하에 1차 치료(유도 + 유지)를 위해 환자를 무작위화한다.
원발성 중추신경계 림프종 ( PCNSL )
PCNSL은 모든 원발성 뇌종양의 3.1%와 NHL의 2-3%를 차지한다. 20년 전에 관찰된 세 배 상승 후, PCNSL의 발생률은 60세 이상의 개인의 경우 지난 10 년간 약간 증가했지만, 현재 연간 100,000명 환자 당 0.46이다. 미국의 경우 연간 1000명의 새로운 환자가 추산된다. 진단시 중앙 연령은 60-65세이고, 중앙 생존 기간은 10-20개월이며 5년 생존율은 <20-30%이다 10. 60세보다 나이가 많은 환자는 5년 생존율이 19%인 반면에, 보다 젊은 환자의 경우 75%와 비교하여 현저히 낮다. 자가 줄기 세포 이식을 이용한 고용량 화학요법은 결과를 향상시킬 수 있으나, 모든 환자에게 실현 가능하지는 않다 11,12. 특히 림프종이 고용량 화학요법에 내성이면 재발시 예후는 음성이다.
BAR에 대한 임상적 적응증: 모든 PCNSL 환자의 3분의 2는, CNS에서 우선적으로 발현되는 단백질인 뉴라빈-1의 SAMD14 도메인에 특이성이 있는 BCR을 가지고 있다. 흥미롭게도, 이들 환자에서 뉴라빈-1/SAMD14는 건강한 대조군에 비해 고글리코실화되어 있다. 이러한 고글리코실화에 대한 이유는 알려져 있지 않지만, 이러한 변형된 단백질이 뉴라빈-1에 대해 특이성을 갖는 B-세포의 만성 항원성 반응을 유도하여, 결국에 악성 클론의 클론성 진화를 야기한다는 가설을 지지한다. PCNSL의 예후가 좋지 않기 때문에, 특히 재발성 PCNSL의 경우, 보다 효과적인 치료법에 대한 필요성이 충족되지 못하고 있다. 따라서, PCNSL의 희소성에도 불구하고, PCNSL-BAR의 임상 개발은 PCNSL을 가진 모든 환자의 2/3가 PCNSL-BAR 치료의 잠재적인 후보이기 때문에 신속히 진행되어야 한다. 매년 서양에서 추산되는 PCNSL의 새로운 2000 건의 사례 중, 적어도 1/4이 제I상/제II상 연구를 위해 매년 이용 가능하다. PCNSL-BAR의 전제조건은 이들이 혈뇌 장벽을 통과하는 것이다. BCR 결합 에피토프만을 나타내는 BAR과 같은 소분자는 혈뇌 장벽을 통과할 것으로 예상할 수 있고, 작은 크기의 BCR 결합 에피토프는 혈뇌 장벽의 파괴를 목표로 하는 몇 가지 약리학적 변형을 위한 여지를 남긴다.
후보 환자의 확인:
확립된 ELISA에 의해 고글리코실화된 뉴라빈에 대한 말초 혈액을 검사한다.
구현 전략:
제I상/제II상 시험에서 재발 PCNSL 환자에서의 PCNSL-BAR의 단일 약물 활성을 입증한다. 재발 환자의 음성 예후로 인해 50명의 환자를 대상으로 한 제I상/제II상 연구는 1년 이내에 누가 동원가능한지에 대한 강력한 신호를 보여주기에 충분할 것이다.
액티브한 경우, 다음 단계에서, PCNSL-BAR은 무작위화 제II상 연구에서 표준 구조 요법과 조합되어야 한다.
제3 단계로서 (또는 단계 #2와 나란히) PCNSL-BAR의 존재 및 부재하에 표준 치료에 대한 무작위화 제III상 연구가 수행된다. 목표는 6개월까지 무진행 생존의 개선이다.
미만성 거대 B-세포 림프종 ( DLBCL )
미만성 거대 B-세포 비호지킨 림프종(DLBCL)은 가장 흔한 비호지킨 림프종이며 지역에 따라서는 비호지킨 림프종 시리즈의 30%-58%를 차지한다. 유럽 연합의 원발 발생율은 3-4/100,000/년이다. 발병률은 연령과 함께 0.3/100,000/년(35-39세)에서 26.6/100,000/년(80-84세)으로 증가한다. NHL의 발병률은 1970년대부터 1990년대 중반까지 극적으로 증가하여 2010년 미국에서 65,540 건의 새로운 사례가 예상되어 NHL이 7번째로 흔한 암(기저 세포 및 편평 세포 피부암 제외)이 되었다 13. 이 기간 동안, 림프종 및 DLBCL의 발생 사례의 연간 3%에서 4%까지의 꾸준한 증가가 남녀 모두에서, 인종 범주를 넘어서서, 그리고 매우 어린 연령을 제외한 모든 연령대에서 발생했다. 발병률은 1990년대 말과 1992년에서 2006년 사이에 정체되었고 DLBCL의 연령 조정 발병률은 인구 100,000명당 8.07에서 8.98로 매년 대략 1% 증가했다. 1970년대부터의 DLBCL 발병률의 증가는 피부암의 상승에 필적하는 전례없는 증가를 나타낸다.
DLBCL 환자의 예후는 단일클론 항체 리툭시맙의 도입 이후 상당히 개선되었으며, 환자의 75%가 리툭시맙과 CHOP(시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손)으로 이루어진 병용 면역화학요법에 의해 치유될 것으로 기대될 수 있다. 치료율은 국제 예후 지수(International Prognostic Index, IPI)에 따른 위험 인자의 수에 따라 달라진다: 60세 초과 나이, 전처치 LDH의 상승된 혈청 농도, 고급 단계(Ann Arbor 병기 결정 체계에 따라 III/IV) 및 1 초과의 림프외 관여 부위. IPI 외에도, 다른 독립적인 위험 인자가 확인되었으며, 가장 널리 받아들여지는 것 중 하나가 기원 세포(cell of origin, COO)이다. COO에 따르면, 배 중심(GC 타입)에서 유래한 DLBCL은 활성화된 B-세포(ABC 타입)에서 유래한 DLBCL과 구별되며, COO가 할당될 수 없는 소 그룹의 케이스를 남긴다. ABC 타입은 모든 DLBCL의 대략 40%를 나타내는 것으로 추산되며 이의 빈도는 연령에 따라 증가하고 있으며, 대부분의 시리즈에서는 60세 초과의 환자가 적어도 GC-DLBCL만큼의 ABC-DLBCL이 관찰되고 있다. 유전자 발현 프로파일링에 의해 결정된 GC-DLBCL의 치료 또는 5년 생존율은 75%인 것으로 보고되었지만, ABC-DLBCL의 경우는 40%에 불과했다 14. 열악한 결과가 보고된 다른 서브타입은 MYC 브레이크(break)를 갖는 DLBCL, BCL2 브레이크, 이중 히트 DLBCL 및 MYC 및 BCL2 단백질 모두를 발현하는 DLBCL이다.
BAR에 대한 임상적 적응증: ABC-타입의 3/5 DLBCL 세포주는 ARS2 단백질에 대한 특이성을 갖는 BCR 수용체를 발현했지만, GC 타입의 4개의 DLBCL 세포주는 모두 발현하지 않았다. 흥미롭게도, 이들 환자에서 ARS2(DLBCL 세포주에서와 같이)는 저인산화되었다. 이러한 저인산화에 대한 이유는 알려져 있지 않지만, 이러한 변형된 단백질이 ARS2에 대해 특이성을 갖는 B-세포의 만성 (자가-)항원성 자극을 유발하며, 결국에 악성 클론의 클론성 진화를 초래한다는 가설을 뒷받침한다. DLBCL의 생체외 또는 생검 데이터가 여전히 제한적이지만, ABC 서브타입의 DLBCL은 ARS2에 대한 특이성을 갖는 BCR을 각각의 세포주만큼 빈번하게 발현하지 않는 것으로 보인다. 그러나, 매년 미국과 유럽에서 100,000건을 초과하는 새로운 DLBCL 사례가 거의 모두 치료되고 있으며 그 중 3분의 1이 반응을 달성하지 않거나 반응을 달성한 후에 재발하지 않을 것이고, 이들 중 대략 33,000명이 구제 처치가 필요하다고 추산될 수 있다. 1차 치료 결과와는 대조적으로, 재발 DLBCL의 치료 결과는 리툭시맙 도입 이후 상당히 악화되었다. 고용량 화학요법 및 자가 줄기-세포 이식을 포함한 구제 처치에도 불구하고 젊은 환자의 20%만이 영속적인 2차 관해를 달성하며, 고용량 화학요법에 적합하지 않은 재발 환자(고령 환자)의 경우 영속적인 관해의 비율이 훨씬 낮다. ABC-DLBCL의 새로운 생검의 최신 연구는 8/31이 저인산화된 ARS2를 발현했음을 보여주었다. 재발 DLBCL이 DLBCL의 ABC 서브타입에 대해 풍부하기 때문에 모든 재발 DLBCL의 10 내지 20%의 유병률은 저인산화된 ARS2를 발현하는 것으로 추정될 수 있으며, 이에 따라 연간 3000명 초과의 환자가 DLBCL-BAR이 선택될 수 있을 것으로 예상될 수 있다.
후보 환자의 확인:
확립된 ELISA에 의해 저인산화된 ARS2에 대해 말초 혈액을 시험한다.
구현 전략:
제I상/제II상 시험에서 재발 DLBCL에서 DLBCL-BAR의 단일-약물 활성을 입증한다. 이들 환자의 높은 유병률에도 불구하고, 제I상/제II상으로의 50명의 환자의 동원이 1년 이내에 실현가능하다.
액티브한 경우, 다음 단계에서, DLBCL-BAR은 무작위화 제II상 연구에서 표준 구제 요법과 조합된다. 목표는 6개월까지 PFS의 연장이다.
제3 단계로서 (또는 단계 #2와 나란히) DLBCL-BAR의 존재 또는 부재 하에 표준 처치의 무작위화 제III상 연구가 수행된다. 목표는 무진행 생존율을 7.5 내지 10% 개선하는데 있다.
여포성 림프종 (FL)
여포성 림프종(FL)은 미국에서 두번째로 가장 흔한 림프종이며, 매년 거의 14,000명의 환자가 진단되며 13, 연간 100,000명당 3건의 발생율을 나타낸다. 유럽에서의 추정 발생율은 연간 100,000명당 2.18건이며 15, 비슷한 수의 새로운 사례가 미국 및 유럽에서 예상될 수 있다. 발병률은 시간이 지남에 따라 안정적이지만 인종에 따라 다르며, 흑인 및 아시아인보다 백인의 발병률이 두 배 이상 더 높다 16-18.
진행된 단계에도 불구하고, 중앙 생존 기간은 8 내지 15년의 범위이며, 진행이 느린 것으로 지정된다. 조심스럽게 기다리는 것, 즉 환자가 증상이 나타날 때까지 치료를 연기하는 것은, 진행된 단계의 여포성 림프종 환자에게는 선택 사항이며, 진행된 단계의 여포성 림프종은 현재의 치료 옵션으로 치료되지 않는다. 환자의 >90%가 1차 계획(CHOP, 벤다무스틴)에 반응하더라도, 재발률은 치료에 대한 완전한 반응을 달성한 환자조차도 시간 경과에 따라 상당히 일정하며 19, 5-년 무진행 생존율은 대략 50%이다 20.
BAR에 대한 임상적 적응증: 체계적으로 그리고 결과적으로 조사되지는 않았지만, 현재까지 확인된 유일한 BAR은 옵티뉴린이며, 이는 여포성 림프종을 갖는 4/40 환자의 BCR의 표적인 것으로 밝혀졌다. 비록 환자의 50%가 5년간의 재치료가 필요하지만, 다수의 치료 옵션이 존재하고 환자는 통상 복수의 구제 처치에 반응한다. FL 환자의 10%만이 FL-BAR 치료의 잠재적인 후보자가 되며, 이 림프종 타입의 BAR에 대한 적응증을 찾는 것이 어려울 수 있다.
후보 환자의 확인:
확립될 시험.
구현 전략:
제I상/제II상 시험에서 다수의 재발 FL 환자에서 FL-BAR의 단일-약물 활성을 입증한다. 현재까지 이용 가능한 FL-Bar의 비율이 낮기 때문에 50명의 환자를 제I상/제II상으로 동원하는 데 몇 년이 걸릴 수 있다. 30%의 반응률은 임상적으로 중요한 목표이다.
액티브한 경우, 재발 환자에서 FL-BAR을 일반적인 구제 치료와 조합한 무작위화 제III상 연구는 선택사항이다.
또 다른 옵션은 1차 치료에 반응하는 환자의 공고/유지를 위한 FL-BAR의 무작위화 연구이며, 모든 응답 환자에서 또는 응답 환자에서만 검출될 수 있는 최소의 잔존 질환이 모니터링될 수 있다.
실시예 2: U2932 세포에서 ARS2의 내재화
FLAG-태그된 ARS2(Uniprot 등록 번호 Q9BXP5, 2016년 4월 13일자 최종 수정된 버젼 127) 단백질(10 ㎍/ml, 30 min, 4℃)과 함께 인큐베이션 후에 세포의 양을 2개의 풀(pool)로 나눴으며, 첫번째 풀은 4℃에서 유지되었고 즉시 염색되었으며, 나머지 풀은 염색 이전에 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트되었다. 두 풀을 4℃에서 하기 절차에 의해 염색했다: 각 풀을 2개 파트로 다시 나눠 한 파트는 비처리 상태로 유지하고 다른 한 파트는 2% PFA/0.2% 사포닌을 처리했다. 이후 마우스 항-FLAG mAb를 첨가하고(30 min) 이후에 강한 세척(PBS) 및 항-마우스-FITC mAb를 이용한 인큐베이션(30 min)을 실시했다. 이후에, 세포를 다시 세척하고 (PBS 4℃) FACS로 분석했다.
FACS 분석은 4℃에서 ARS2가 단지 세포의 표면에서 검출된 반면, ARS2는 37℃에서 1시간 후에 내재화 후에 세포질에서 풍부한 것을 명확히 보여준다. X-축: FSC; Y-축: FITC 신호 (도 1)
실시예 3: 면역독소-처리된 ABC-타입 DLBCL 세포의 증식 억제.
면역독소-처리된 ABC-타입 DLBCL 세포의 증식 억제. ARS2 양성(U293, OCI-Ly3) 및 ARS2 음성 세포주(HBL-1, TMD8)를 ARS2(ARS2-ETA) 또는 대조군으로서 뉴라빈(NRB1-ETA)에 커플링된 슈도모나스 외독소의 존재하에 배양했다 (37℃, 24h). 세포 증식은 EZ4U 키트(Biomedica, 오스트리아 비엔나)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정했다 (도 2).
실시예 4: ARS2 -면역독소 구축물에 의한 OCI - Ly3 세포의 사멸.
OCI-Ly3 세포를 ARS2-ETA 또는 NRB1-ETA의 존재하에 배양했다 (2.5x104 세포/1 ug 독소/웰). 생존 세포에 대해 트리판 블루를 이용한 염색 및 카운팅에 의해 배양물을 분석했다 (도 3).
실시예 5: 독소-접합된 ARS2에 의한 ABC 타입의 이종이식된 ARS2-양성 인간 DBLC 세포의 SCID 마우스에서의 특이적인 성장 억제.
5-7 주령의 암컷 SCID-베이지 마우스를 Charles River Laboratories(독일 쾰른)로부터 입수했다. 100 ㎕ PBS/마트리겔 각각의 5 x 106 ARS2-양성 OCI-LY3 세포를 5-7 주령의 암컷 SCID-베이지 마우스의 옆구리에 0일째 피하 주사했다. ARS2-ETA 또는 대조군으로서 NRB1-ETA 각각 200㎕를, PBS 중 75 ㎍ 독소/ml의 용량으로, 종양 접종의 6일후 꼬리 정맥 내에 6일째 1회 주사했다. 종양 직경은 슬라이딩 캘리퍼를 사용하여 2개의 수직 방향으로 매일 측정했다. 종양 체적은 V = (π/6) x 최소 직경 x 최대 직경에 따라 계산되었다. 3 ARS2-ETA (녹색 라인) 및 ARB1-ETA 처리 마우스의 결과를 도 4에 도시한다.
실시예 6: DLBCL 세포주에 CD3-ARS2의 결합
배경
자가항원은 다른 타입의 B 세포 신생물의 발생에 중대한 역할을 하는 것으로 사료된다. 이 가설이 시사하는 것은, CLL, MCL 및 가장 최근에 발견된 DLBCL에서 스테레오타입의 IgHv 레퍼토리의 제한된 사용이다. ARS2는 최근 DLBCL의 상당 부분의 B 세포 수용체(BCR)에 높은 친화성으로 결합하는 ARS2 반응성 림프종으로 불리는 DLBCL의 약 5%에 대한 증식 자극성 자가항원으로 확인되었다. 본 발명자들은 ARS2에 연결된 CD3(CD3-ARS2)에 대한 재조합 단일쇄 단편(scFv)을 함유하는 이중특이성 생성물을 설계했다. 한 부위는 인간 T 세포의 T 세포 보조-수용체 CD3을 관여시키고, 다른 부위는 ARS2 반응성 림프종의 B 세포 수용체를 높은 특이성으로 인식하여 T 세포를 림프종 세포로 지향시킨다. 본 발명자들은 ARS2 반응성 림프종 세포주의 선택적 세포독성을 위한 이러한 이중특이성 구축물을 시험했다.
재료 및 방법
OKT3 하이브리도마의 VL 및 VH 유전자 및 ARS2의 에피토프를 함유하는 33개의 아미노산의 DNA 서열을 표준 클로닝 기술에 의해 pcDNA 3.1 벡터에 클로닝하였다. VH 및 VL은 VH-GlySer-VL-GlySer-ARS2 펩티드 쇄를 생성하는 ARS2 에피토프에 대해 VL과 마찬가지로 글리신-세린 링커에 의해 연결되었다. 이후의 검출 및 정제를 위해 히스티딘 테일이 포함되었다.
최종 클로닝 생성물을, 이중특이성 구축물의 제조를 위해 HEK 세포에 형질감염시켰다. 림프종 세포주(OCI-Ly 3, U2932, HBL-1) 및 PBMC에의 결합능은 유세포 분석에 의해 평가되었다. 단일클론 항-His 태그 항체와의 인큐베이션 후에 CD3-ARS2의 검출을 위해 웨스턴 블롯 분석이 사용되었다. 세포독성은 LDH 방출 분석에 의해 평가되었다.
HEK 293 세포에서의 형질감염은 Sigma-Aldrich의 X-tremeGENE™ HP DNA 형질감염 시약을 사용하여 수행되었다. 림프종 세포주(OCI-Ly 3, U2932, HBL-1) 및 PBMC에의 결합능은 유세포 분석에 의해 평가되었다. 단일클론 항-His 태그 항체와의 인큐베이션 후에 CD3-ARS2의 검출을 위해 웨스턴 블롯 분석이 사용되었다. 단백질의 정제는 코발트계 "고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)"를 이용하여 수행되었다. 이 기법은 히스티딘-태그된 단백질, 예컨대 CD3-ARS2에 결합하는 자기 비드를 사용한다. 세포독성은 LDH 방출 분석에 의해 평가되었다 (Roche의 "세포독성 검출 키트").
사용된 프라이머는 하기와 같다:
CD3-VH-HindIII (5' - 3'):
AAGCTTGCCACCATGCAGGTCCAGCTGCAGCAG
CD3-VH-BamHI (5' - 3'):
GGATCCACCACCACCGGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTGTTGTTTTGGCTGAGGA
CD3-VK-BamHI (5' - 3'):
GGATCCCAAATTGTTCTCACCCAGTC
CD3-VK-EcoRI (5' - 3'):
GAATTCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCAGTTGGTGCAGTATCAGCC
ARS2 AA342-EcoRV (5' - 3'):
GATATCATGAAGGAAGCCAAAAAGAGTAGC
ARS2 AA375-His-SmaI (5' - 3'):
CCCGGGTTAATGGTGGTGGTGATGATGAGCGCTCTCTGACTCCGACTCAGAC
결과
본 발명의 CD3 - ARS2 이중특이성 구축물은 ARS2 반응성 림프종 세포주 및 T 세포 상의 CD3과 그들의 B 세포 수용체를 통해 동시에 결합한다. 이는 이펙터 - 표적 비 10:1에서 250 ng/ml의 낮은 농도의 ARS2 반응성 림프종 세포주에서 독점적으로 빠른 세포독성을 유도한다 (도 5, 6). 4시간 후에 특이적인 세포 매개 세포독성이 40%에 이르렀다. 다른 특이성의 BCR을 갖는 림프종 세포주는 영향을 받지 않는다 (도 7).
SEQUENCE LISTING <110> Universit? des Saarlandes <120> Means and Methods for Treatment of B Cell malignancies <130> SAR15379PCT <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 1 aagcttgcca ccatgcaggt ccagctgcag cag 33 <210> 2 <211> 78 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 2 ggatccacca ccaccggagc cgccgccgcc agaaccacca ccaccagaac caccaccacc 60 tgttgttttg gctgagga 78 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 3 ggatcccaaa ttgttctcac ccagtc 26 <210> 4 <211> 69 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 4 gaattcgatc cgccaccgcc agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc agttggtgca 60 gtatcagcc 69 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 5 gatatcatga aggaagccaa aaagagtagc 30 <210> 6 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 6 cccgggttaa tggtggtggt gatgatgagc gctctctgac tccgactcag ac 52

Claims (25)

  1. 환자에서 B-세포 악성종양의 진단 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 진단제 및/또는 치료제에 접합된 B-세포 수용체(BCR) 항원.
  2. 제1항에 있어서, B-세포 악성종양이 BCR을 발현하는 클론성 악성 B-세포의 존재를 특징으로 하는 것인 접합된 BCR 항원.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 클론성 악성 B-세포가 세포 표면 상에서 기능성 BCR을 발현하는 것인 접합된 BCR 항원.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, B-세포 악성종양이 만성 림프구성 백혈병(CLL), B-세포 전림프구성 백혈병, 외투 세포 림프종(MCL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 비장 변연부 림프종(SMZL), 버킷 림프종, B-세포 비호지킨 림프종, 여포성 림프종, 원발성 중추신경계 림프종(PCNSL), 또는 결절성 림프구 우성 호지킨 림프종(NLPHL), 털세포 백혈병, 비장 림프종, 림프형질세포성 림프종, 점막 관련 림프 조직의 결절외 변연부 림프종(MALT 림프종), 결절성 변연부 림프종, 소아 결절성 변연부 림프종, 원발성 피부 여포 중심 림프종, T-세포/조직구 과다 거대 B-세포 림프종, 림프종모양 육아종증, 원발성 종격 (흉선) 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, ALK-양성 거대 B-세포 림프종, 형질모세포 림프종, 또는 원발성 삼출액 림프종으로부터 선택되는 것인 접합된 BCR 항원.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 지질 또는 다당류를 포함하는 것인 접합된 BCR 항원.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 자가항원, 외생성 항원, 동종항원 또는 이종항원으로부터 선택되는 것인 접합된 BCR 항원.
  7. 제6항에 있어서, 상기 자가항원이 번역후 변형되거나 비변형되는 것인 접합된 BCR 항원.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 클론성 악성 B-세포의 BCR에 의해 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 것인 접합된 BCR 항원.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BCR 항원이 악성 B-세포의 BCR에 결합할 수 있는 것인 접합된 BCR 항원.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 ≤10-7 이하, 바람직하게는 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 ≤10-9 M 이하의 평형 해리 상수로 악성 B-세포의 BCR에 특이적으로 결합하는 것인 접합된 BCR 항원.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이, 악성 B-세포 상의 BCR에 결합한 후 악성 B-세포에 의해 내재화되는 것인 접합된 BCR 항원.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BCR 항원이 환자에서 악성 B-세포의 수를 감소시킬 수 있는 것인 접합된 BCR 항원.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BCR 항원이 환자에서 악성 B-세포의 활성화 및/또는 증식을 억제할 수 있는 것인 접합된 BCR 항원.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BCR 항원이 환자에서 악성 B-세포를 사멸시킬 수 있는 것인 접합된 BCR 항원.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제가 방사성 핵종, 결합제, CAR T 세포, 또는 독소로부터 선택되는 것인 접합된 BCR 항원.
  16. 제15항에 있어서, 상기 결합제가 면역 이펙터 세포에 결합할 수 있는 것인 접합된 BCR 항원.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 결합제가 CD3 결합제, CD16 결합제 또는 CD38 결합제로부터 선택되는 것인 접합된 BCR 항원.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제가 단일클론 항체, 다중클론 항체, 단일쇄 항체, ScFv, 미니바디, Fv, Fab, Fab', 또는 F(ab')2 단편으로부터 선택되는 것인 접합된 BCR 항원.
  19. 제15항에 있어서, 상기 독소가 에니다이엔(enidyene), 듀오카마이신, 메토트렉세이트, 독소루비신, 멜팔란, 클로람부실, ARA-C, 빈데신, 미토마이신 C, 시스플라틴, 에토포시드, 블레오마이신, 베도틴, 엠탄신, 5-플루오로우라실, 또는 티로신 키나제 억제제로부터 선택되는 것인 접합된 BCR 항원.
  20. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 B-세포 악성종양의 진단 및/또는 치료 방법에서 진단제 및/또는 치료제에 접합된 BCR 항원의 용도.
  21. i. 바람직하게는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에서 정의된 진단제 또는 치료제에 접합된 BCR 항원을 제공하는 단계;
    ii. 상기 접합된 BCR 항원을 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 환자의 B-세포 악성종양을 진단 또는 치료하는 방법.
  22. i) 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 B-세포 악성종양을 앓고 있는 환자에서 악성 B-세포의 BCR에 결합할 수 있는,
    바람직하게는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에서 정의된 치료제에 접합된 BCR 항원.
  23. 제22항에 있어서, 추가적으로
    i) 접합된 BCR 항원에 BCR의 결합 후 내재화될 수 있는
    접합된 BCR 항원.
  24. 바람직하게는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에서 정의된 치료제에 접합되어진 접합된 BCR 항원; 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  25. 제21항 또는 제22항에서 정의된 접합된 BCR 항원에 선호적으로 반응하는 경향이 있는, 바람직하게는 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의된 B-세포 악성종양을 앓고 있는 환자를 확인하기 위한 비침습적 방법으로서,
    i) 표지된 BCR 항원 접합체를 제공하는 단계,
    ii) 표지된 BCR 항원 접합체를 악성 B-세포를 포함하는 각 환자의 샘플에 첨가하는 단계
    iii) 표지된 BCR 항원 접합체의 상기 악성 B-세포에의 결합 및/또는 내재화를 평가하는 단계
    를 포함하고, 표지된 BCR 항원 접합체에 결합하고/거나 상기 접합체를 내재화하는 악성 B-세포의 환자는 접합된 BCR 항원을 이용한 치료에 선호적으로 반응하는 경향이 있는 반면에, 표지된 BCR 항원 접합체에 결합하지 않고/거나 상기 접합체를 내재화하지 않는 악성 B-세포의 환자는 그렇지 않은 것인, 비침습적 방법.
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