JP2020122798A - 抗lilrb抗体ならびにがんの検出及び処置におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】LILRBに結合する抗体、ならびにそれを用いてがんを検出する方法及び処置する方法に関する。【解決手段】(a)対象または該対象由来のサンプルを、クローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を有する抗体または抗体フラグメントと接触させる段階、ならびに(b)該抗体の、該対象またはサンプル中のがん細胞またはがん幹細胞への結合を検出する段階、を含む。また、がんを有する対象を処置する方法が提供され、クローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を有する抗体または抗体フラグメントを、該対象に投与する段階を含む。【選択図】図1
Description
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、2015年3月6日に出願された米国仮特許出願第62/129,572号の優先権の恩典を主張する。
1.開示の分野
本開示は概して、医学、腫瘍学、及び免疫学の分野に関する。より詳細には、本開示は、LILRBに結合し、かつ白血病を含むがんを処置することができる抗体に関する。
本開示は概して、医学、腫瘍学、及び免疫学の分野に関する。より詳細には、本開示は、LILRBに結合し、かつ白血病を含むがんを処置することができる抗体に関する。
2.背景
急性骨髄性白血病(AML)は、最も一般的な成人急性白血病である。継続的処置にも関わらず、ほとんどの患者は5年以内に再発する。急性白血病を効果的に処置するためには、新たな分子標的及び治療アプローチが特定されなければならない。最近、本発明者らは、いくつかのアンジオポエチン様タンパク質(Angptl)の受容体としてのヒト白血球免疫グロブリン様受容体B2(LILRB2)をクローニングした(Zhengら、2012)。LILRBファミリー受容体は、リガンド及び細胞内免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を結合する細胞外Ig様ドメインを含有するI型膜貫通糖タンパク質であり、ITIMモチーフがホスファターゼSHP−1、SHP−2、またはSHIPをリクルートして、免疫細胞の活性化を負に制御することができるので、抑制性受容体として分類される(Takaiら、2011;Daeronら、2008;Katzら、2006)。LILRBは、骨髄細胞及び特定の他の造血細胞上で発現されることが知られている(Moriら、2008)。驚くべきことに、本発明者らは、LILRB2のマウスオルソログであるPirB、及び密接に関連するITIM受容体であるLAIR1がAML幹細胞(AML−SC)により発現され、AMLの発症をサポートすることを示している(Zhengら、2012;Kangら、近刊)。直観に反するが、この結果は、免疫系における抑制性受容体の一般的な免疫抑制及びそれによる腫瘍促進の役割と一致する(Maら、2011)。
急性骨髄性白血病(AML)は、最も一般的な成人急性白血病である。継続的処置にも関わらず、ほとんどの患者は5年以内に再発する。急性白血病を効果的に処置するためには、新たな分子標的及び治療アプローチが特定されなければならない。最近、本発明者らは、いくつかのアンジオポエチン様タンパク質(Angptl)の受容体としてのヒト白血球免疫グロブリン様受容体B2(LILRB2)をクローニングした(Zhengら、2012)。LILRBファミリー受容体は、リガンド及び細胞内免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を結合する細胞外Ig様ドメインを含有するI型膜貫通糖タンパク質であり、ITIMモチーフがホスファターゼSHP−1、SHP−2、またはSHIPをリクルートして、免疫細胞の活性化を負に制御することができるので、抑制性受容体として分類される(Takaiら、2011;Daeronら、2008;Katzら、2006)。LILRBは、骨髄細胞及び特定の他の造血細胞上で発現されることが知られている(Moriら、2008)。驚くべきことに、本発明者らは、LILRB2のマウスオルソログであるPirB、及び密接に関連するITIM受容体であるLAIR1がAML幹細胞(AML−SC)により発現され、AMLの発症をサポートすることを示している(Zhengら、2012;Kangら、近刊)。直観に反するが、この結果は、免疫系における抑制性受容体の一般的な免疫抑制及びそれによる腫瘍促進の役割と一致する(Maら、2011)。
最近の研究では、本発明者らは、LILRBファミリーのいくつかのメンバーが、AML細胞上で高度に発現され、それらの発現が、ヒトAML患者の全生存期間と負の相関があることを見出した。LILRBは、AML−SC及びいくつかの分化した急性白血病細胞(AML及び急性リンパ芽球性白血病またはALLを含む)の両方により発現される。試験される個々のLILRBを発現していないマウスの正常な造血発生には欠陥がない。しかし、興味深いことに、個々のLILRBのノックアウトは、いくつかのAML及び急性リンパ芽球性白血病(ALL)マウスモデルにおける白血病の発症を好転させ、AML−SCを排除した(Zhengら、2012;Kangら、近刊;PCT/US13/43431も参照のこと)。加えて、培養物中の異なるヒト白血病細胞株におけるいくつかのLILRBの発現の個別の阻害、及び異種移植マウスにおける白血病の発症を遮断した(Kangら、近刊;PCT/US13/43431も参照のこと)。
本発明者らは、一部の白血病幹細胞が、LILRBを含む高レベルのITIM抑制性受容体を発現すると結論付けた。化学療法を含む急性白血病患者に対する現在の処置選択肢は、がん幹細胞を効率的に標的にしない。なぜならば、これらの抑制性受容体により、白血病幹細胞は従来の治療法を生き延びることができ、最終的に腫瘍の再発をもたらすからである。本発明者らは、LILRBシグナル伝達が、いくつかの理由で、AMLを処置するための理想的な標的であることを理論づける。いくつかの理由とは、1)いくつかのLILRBは、AML−SCを含むAML細胞の生存に必須であること;2)個々のLILRBのノックアウトは、正常な造血に明白な欠陥をもたらさないこと;及び3)LILRB活性の阻害は免疫を刺激し、間接的に抗腫瘍効果をブーストすること、である。
概要
従って、本開示によれば、サンプルまたは対象のがん細胞またはがん幹細胞を検出する方法が提供され、この方法は、(a)対象または該対象由来のサンプルを、図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を有する抗体または抗体フラグメントと接触させる段階、ならびに(b)該抗体の、該対象またはサンプル中のがん細胞またはがん幹細胞への結合を検出する段階、を含む。サンプルは、血液、痰、涙、唾液、粘液若しくは血清、尿、または糞便などの生検材料または体液であってよい。検出は、免疫組織化学、ELISA、RIA、またはウェスタンブロットを含んでもよい。方法は、段階(a)及び段階(b)を二度目に実施する段階、ならびに、最初のアッセイと比較した細胞レベルの変化を決定する段階、をさらに含んでもよい。抗体は、図21に示されるクローン対可変配列を特徴としてもよい。抗体または抗体フラグメントは、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされてもよい。抗体または抗体フラグメントは、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされてもよい。抗体フラグメントは、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、またはFvフラグメントであってよい。抗体は、エボラウイルスに結合しても結合しなくてもよい。
従って、本開示によれば、サンプルまたは対象のがん細胞またはがん幹細胞を検出する方法が提供され、この方法は、(a)対象または該対象由来のサンプルを、図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を有する抗体または抗体フラグメントと接触させる段階、ならびに(b)該抗体の、該対象またはサンプル中のがん細胞またはがん幹細胞への結合を検出する段階、を含む。サンプルは、血液、痰、涙、唾液、粘液若しくは血清、尿、または糞便などの生検材料または体液であってよい。検出は、免疫組織化学、ELISA、RIA、またはウェスタンブロットを含んでもよい。方法は、段階(a)及び段階(b)を二度目に実施する段階、ならびに、最初のアッセイと比較した細胞レベルの変化を決定する段階、をさらに含んでもよい。抗体は、図21に示されるクローン対可変配列を特徴としてもよい。抗体または抗体フラグメントは、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされてもよい。抗体または抗体フラグメントは、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされてもよい。抗体フラグメントは、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、またはFvフラグメントであってよい。抗体は、エボラウイルスに結合しても結合しなくてもよい。
別の実施形態では、がんを有する対象を処置する方法が提供され、この方法は、図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を有する抗体または抗体フラグメントを、該対象に投与する段階を含む。抗体は、図21に示されるクローン対重鎖及び軽鎖可変核酸配列を特徴としてもよい。抗体は、図21に示されるクローン対重鎖及び軽鎖可変アミノ酸配列を特徴としてもよい。抗体または抗体フラグメントは、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされてもよい。抗体または抗体フラグメントは、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされてもよい。抗体フラグメントは、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、またはFvフラグメントであってよい。抗体は、IgG及び/またはキメラ抗体であってよい。がんは、急性骨髄性白血病であってよい。投与は、静脈内、動脈内、または腫瘍内投与であってよい。
さらに別の実施形態では、抗体が図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を特徴とするモノクローナル抗体または抗体フラグメントが提供される。モノクローナル抗体または抗体フラグメントは、図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされてもよい。抗体または抗体フラグメントは、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされてもよい。抗体または抗体フラグメントは、図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされてもよい。抗体または抗体フラグメントは、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされてもよい。抗体フラグメントは、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、またはFvフラグメントであってよい。抗体は、キメラ抗体であってもよく、または二重特異性抗体及び/若しくはIgGである。抗体は、ヒト化及び/または最適化されていてもよい。
別の実施形態は、抗体が図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を特徴とするハイブリドーマのコード化に関する。モノクローナル抗体は、図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされてもよい。抗体は、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされてもよい。抗体は、図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされてもよい。抗体は、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされてもよい。
単語「1つの(a)」または「1つの(an)」の使用は、特許請求の範囲及び/または明細書中で用語「含む(comprising)」と共に使用される場合、「1つ」を意味することがあるが、「1つ以上(one or more)」、「少なくとも1つ」、及び「1つ以上(one or more than one)」の意味とも一致している。単語「約」は、記載された数のプラスまたはマイナス5%を意味する。
本明細書に記載される任意の方法または組成物は、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して実行することができると考えられる。本開示の他の目的、特徴、及び利点は、下記の詳述される記載から明らかになるであろう。しかし、詳述される記載及び具体的な実施例は、本発明の具体的な実施形態を示しているが、単に実例として与えられると理解すべきである。その理由は、本開示の趣旨及び範囲内の種々の変更及び改変が、この詳述される記載から当業者には明らかになるからである。
下記の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書で提示される具体的な実施形態の詳述される記載と組み合わせて、これらの図面のうち1つ以上を参照することにより、より良く理解されることがある。
下記の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書で提示される具体的な実施形態の詳述される記載と組み合わせて、これらの図面のうち1つ以上を参照することにより、より良く理解されることがある。
例示的態様の説明
本発明者らは、いくつかの抗LILRB mAbを開発し、これらのそれぞれは、種々の異種移植マウスモデルにおけるヒトAMLの発症を効率的に遮断する。これらの刺激的な結果は、LILRBが、白血病幹細胞の活性及び白血病の発症をサポートするが、正常な造血には重要ではないことを示している。特に、本発明者らは、抗LILRB4が、(異種移植マウスで発症したヒト患者AMLを含む)ヒトAMLの発症を阻害することを初めて実証した。重要なことに、本発明者らは、10個の抗LILRB mAbの可変領域の配列を得、ヒト定常領域とのキメラ抗体を生成した。本発明者らは、1つのこのようなキメラ抗体(MHC−C84)が、元のmAb C84と同じ結合特性を保持するだけでなく、異種移植モデルの抗白血病活性を増強したことを示した。従って、抗LILRB抗体を使用して、白血病及び細胞表面上に関連LILRBを発現する他のがんを処置することができる。それらは、LILRB構成要素を有する免疫疾患を処置するために使用することもできる。本開示のこれらの態様及び他の態様は、以下で考察される。
本発明者らは、いくつかの抗LILRB mAbを開発し、これらのそれぞれは、種々の異種移植マウスモデルにおけるヒトAMLの発症を効率的に遮断する。これらの刺激的な結果は、LILRBが、白血病幹細胞の活性及び白血病の発症をサポートするが、正常な造血には重要ではないことを示している。特に、本発明者らは、抗LILRB4が、(異種移植マウスで発症したヒト患者AMLを含む)ヒトAMLの発症を阻害することを初めて実証した。重要なことに、本発明者らは、10個の抗LILRB mAbの可変領域の配列を得、ヒト定常領域とのキメラ抗体を生成した。本発明者らは、1つのこのようなキメラ抗体(MHC−C84)が、元のmAb C84と同じ結合特性を保持するだけでなく、異種移植モデルの抗白血病活性を増強したことを示した。従って、抗LILRB抗体を使用して、白血病及び細胞表面上に関連LILRBを発現する他のがんを処置することができる。それらは、LILRB構成要素を有する免疫疾患を処置するために使用することもできる。本開示のこれらの態様及び他の態様は、以下で考察される。
I.LILR
白血球免疫グロブリン様受容体(LILR)は、細胞外免疫グロブリンドメインを有する受容体のファミリーである。それらは、CD85、ILT、及びLIRとしても知られており、広範囲の免疫細胞に免疫調節効果を発揮することができる。これらの受容体をコードするヒト遺伝子は、染色体領域19q13.4の遺伝子クラスターに見出される。それらは、LILRA1、LILRA2、LILRA3、LILRA4、LILRA5、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LILRB6またはLILRA6、及びLILRB7またはLILRA5を含む。LILRのサブセットは、MHCクラスI分子(ヒトのHLAクラスIとしても知られている)を認識する。これらのうち、抑制性受容体LILRB1及びLILRB2は、b2m関連複合体への優先的結合を伴う古典的及び非古典的MHC対立遺伝子に対する幅広い特異性を示す。対照的に、活性化受容体LILRA1及びLILRA3は、MHCクラスI、特にHLA−C対立遺伝子のb2m非依存性遊離重鎖を好む。
白血球免疫グロブリン様受容体(LILR)は、細胞外免疫グロブリンドメインを有する受容体のファミリーである。それらは、CD85、ILT、及びLIRとしても知られており、広範囲の免疫細胞に免疫調節効果を発揮することができる。これらの受容体をコードするヒト遺伝子は、染色体領域19q13.4の遺伝子クラスターに見出される。それらは、LILRA1、LILRA2、LILRA3、LILRA4、LILRA5、LILRA6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、LILRB6またはLILRA6、及びLILRB7またはLILRA5を含む。LILRのサブセットは、MHCクラスI分子(ヒトのHLAクラスIとしても知られている)を認識する。これらのうち、抑制性受容体LILRB1及びLILRB2は、b2m関連複合体への優先的結合を伴う古典的及び非古典的MHC対立遺伝子に対する幅広い特異性を示す。対照的に、活性化受容体LILRA1及びLILRA3は、MHCクラスI、特にHLA−C対立遺伝子のb2m非依存性遊離重鎖を好む。
A.LILRB1
白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーBメンバー1は、ヒトでは、LILRB1遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子は、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)ファミリーのメンバーであり、染色体領域19q13.4の遺伝子クラスターに見出される。コードされたタンパク質は、2つまたは4つの細胞外免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び2〜4つの細胞質免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含有する、LIR受容体のサブファミリーBクラスに属する。受容体は、免疫細胞上に発現され、抗原提示細胞上のMHCクラスI分子に結合し、免疫応答の刺激を阻害する負のシグナルを伝達する。LILRB1は、ヒト胃がん細胞に発現することも報告された。これは、腫瘍成長を増強することがある(Zhangら、2012を参照のこと)。炎症応答及び細胞毒性をコントロールして、免疫応答に集中しかつ自己反応性を制限することを助けると考えられている。異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントがこの遺伝子について見出されている。
白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーBメンバー1は、ヒトでは、LILRB1遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子は、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)ファミリーのメンバーであり、染色体領域19q13.4の遺伝子クラスターに見出される。コードされたタンパク質は、2つまたは4つの細胞外免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び2〜4つの細胞質免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含有する、LIR受容体のサブファミリーBクラスに属する。受容体は、免疫細胞上に発現され、抗原提示細胞上のMHCクラスI分子に結合し、免疫応答の刺激を阻害する負のシグナルを伝達する。LILRB1は、ヒト胃がん細胞に発現することも報告された。これは、腫瘍成長を増強することがある(Zhangら、2012を参照のこと)。炎症応答及び細胞毒性をコントロールして、免疫応答に集中しかつ自己反応性を制限することを助けると考えられている。異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントがこの遺伝子について見出されている。
B.LILRB2
白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーBメンバー2は、ヒトでは、LILRB2遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子は、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)ファミリーのメンバーであり、染色体領域19q13.4の遺伝子クラスターに見出される。コードされたタンパク質は、2つまたは4つの細胞外免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び2〜4つの細胞質免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含有する、LIR受容体のサブファミリーBクラスに属する。受容体は、免疫細胞上に発現され、抗原提示細胞上のMHCクラスI分子に結合し、免疫応答の刺激を阻害する負のシグナルを伝達する。炎症応答及び細胞毒性をコントロールして、免疫応答に集中しかつ自己反応性を制限することを助けると考えられている。受容体は、ヒト非小細胞肺がん細胞上にも発現される(Sunら、2008を参照のこと)。異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントがこの遺伝子について見出されている。LILRB2は、PTPN6と相互作用することが明らかになっている。
白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーBメンバー2は、ヒトでは、LILRB2遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子は、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)ファミリーのメンバーであり、染色体領域19q13.4の遺伝子クラスターに見出される。コードされたタンパク質は、2つまたは4つの細胞外免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び2〜4つの細胞質免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含有する、LIR受容体のサブファミリーBクラスに属する。受容体は、免疫細胞上に発現され、抗原提示細胞上のMHCクラスI分子に結合し、免疫応答の刺激を阻害する負のシグナルを伝達する。炎症応答及び細胞毒性をコントロールして、免疫応答に集中しかつ自己反応性を制限することを助けると考えられている。受容体は、ヒト非小細胞肺がん細胞上にも発現される(Sunら、2008を参照のこと)。異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントがこの遺伝子について見出されている。LILRB2は、PTPN6と相互作用することが明らかになっている。
C.LILRB3
白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーBメンバー3は、ヒトでは、LILRB3遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子は、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)ファミリーのメンバーであり、染色体領域19q13.4の遺伝子クラスターに見出される。コードされたタンパク質は、2つまたは4つの細胞外免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び2〜4つの細胞質免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含有する、LIR受容体のサブファミリーBクラスに属する。受容体は、免疫細胞上に発現され、抗原提示細胞上のMHCクラスI分子に結合し、免疫応答の刺激を阻害する負のシグナルを伝達する。炎症応答及び細胞毒性をコントロールして、免疫応答に集中しかつ自己反応性を制限することを助けると考えられている。異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントがこの遺伝子について見出されている。
白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーBメンバー3は、ヒトでは、LILRB3遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子は、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)ファミリーのメンバーであり、染色体領域19q13.4の遺伝子クラスターに見出される。コードされたタンパク質は、2つまたは4つの細胞外免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び2〜4つの細胞質免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含有する、LIR受容体のサブファミリーBクラスに属する。受容体は、免疫細胞上に発現され、抗原提示細胞上のMHCクラスI分子に結合し、免疫応答の刺激を阻害する負のシグナルを伝達する。炎症応答及び細胞毒性をコントロールして、免疫応答に集中しかつ自己反応性を制限することを助けると考えられている。異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントがこの遺伝子について見出されている。
D.LILRB4
白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーBメンバー4は、ヒトでは、LILRB4遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子は、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)ファミリーのメンバーであり、染色体領域19q13.4の遺伝子クラスターに見出される。コードされたタンパク質は、2つまたは4つの細胞外免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び2〜4つの細胞質免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含有する、LIR受容体のサブファミリーBクラスに属する。受容体は、免疫細胞上に発現され、抗原提示細胞上のMHCクラスI分子に結合し、免疫応答の刺激を阻害する負のシグナルを伝達する。受容体は、抗原捕捉及び提示において機能することもできる。炎症応答及び細胞毒性をコントロールして、免疫応答に集中しかつ自己反応性を制限することを助けると考えられている。LILRB4は、ヒト胃がん細胞でも発現され、腫瘍成長を増強することがある(Zhangら、2012)。異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントがこの遺伝子について見出されている。LILRB4は、PTPN6と相互作用することが明らかになっている。
白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーBメンバー4は、ヒトでは、LILRB4遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子は、白血球免疫グロブリン様受容体(LIR)ファミリーのメンバーであり、染色体領域19q13.4の遺伝子クラスターに見出される。コードされたタンパク質は、2つまたは4つの細胞外免疫グロブリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び2〜4つの細胞質免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含有する、LIR受容体のサブファミリーBクラスに属する。受容体は、免疫細胞上に発現され、抗原提示細胞上のMHCクラスI分子に結合し、免疫応答の刺激を阻害する負のシグナルを伝達する。受容体は、抗原捕捉及び提示において機能することもできる。炎症応答及び細胞毒性をコントロールして、免疫応答に集中しかつ自己反応性を制限することを助けると考えられている。LILRB4は、ヒト胃がん細胞でも発現され、腫瘍成長を増強することがある(Zhangら、2012)。異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントがこの遺伝子について見出されている。LILRB4は、PTPN6と相互作用することが明らかになっている。
E.LAIR1
白血球関連免疫グロブリン様受容体1は、ヒトでは、LAIR1遺伝子にコードされるタンパク質である。LAIR1は、CD305(分化クラスター305)とも表記される。LAIR1は、1つの細胞外Ig様ドメイン及び2つの細胞内ITIMを含有する、I型膜貫通糖タンパク質である。LILRBをコードする遺伝子と同様に、LAIR1は、ヒト染色体19q13.4上の白血球受容体複合体(LRC)に局在する。LAIR1は、コラーゲンに結合し、ITIMは、SHP−1及びSHP−2をリクルートする。LAIR1は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、及び樹状細胞、ならびに、ヒトCD34+細胞を含む造血前駆細胞において発現される。LAIR1が、AML幹細胞ならびに分化AML及びALL細胞に発現され、その阻害がAML−SC活性及び白血病の発症を遮断することを、本発明者らは実証した(未公開データ)。
白血球関連免疫グロブリン様受容体1は、ヒトでは、LAIR1遺伝子にコードされるタンパク質である。LAIR1は、CD305(分化クラスター305)とも表記される。LAIR1は、1つの細胞外Ig様ドメイン及び2つの細胞内ITIMを含有する、I型膜貫通糖タンパク質である。LILRBをコードする遺伝子と同様に、LAIR1は、ヒト染色体19q13.4上の白血球受容体複合体(LRC)に局在する。LAIR1は、コラーゲンに結合し、ITIMは、SHP−1及びSHP−2をリクルートする。LAIR1は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、及び樹状細胞、ならびに、ヒトCD34+細胞を含む造血前駆細胞において発現される。LAIR1が、AML幹細胞ならびに分化AML及びALL細胞に発現され、その阻害がAML−SC活性及び白血病の発症を遮断することを、本発明者らは実証した(未公開データ)。
II.がん
A.がん
過剰増殖性疾患は、コントロール不能な再生を細胞に開始させる任意の疾患と関連し得るが、プロトタイプの例はがんである。がんの重要な要素の1つは、細胞の正常なアポトーシスサイクルが中断されることであり、従って、細胞の増殖を中断させる剤が、これらの疾患を処置するための治療薬として重要である。本開示では、本明細書に記載のチューブリシンアナログは、細胞数の減少をもたらすために使用されてもよく、そのようなものであるから、様々なタイプのがん細胞株の処理に潜在的に使用することができる。一部の態様では、本明細書に記載のチューブリシンアナログは、任意の悪性腫瘍を実質的に処置するために使用され得ることが予想される。ここで、唯一の必要条件は、がん細胞の表面上の、特に、がん幹細胞の表面上のLILRBの存在である。
A.がん
過剰増殖性疾患は、コントロール不能な再生を細胞に開始させる任意の疾患と関連し得るが、プロトタイプの例はがんである。がんの重要な要素の1つは、細胞の正常なアポトーシスサイクルが中断されることであり、従って、細胞の増殖を中断させる剤が、これらの疾患を処置するための治療薬として重要である。本開示では、本明細書に記載のチューブリシンアナログは、細胞数の減少をもたらすために使用されてもよく、そのようなものであるから、様々なタイプのがん細胞株の処理に潜在的に使用することができる。一部の態様では、本明細書に記載のチューブリシンアナログは、任意の悪性腫瘍を実質的に処置するために使用され得ることが予想される。ここで、唯一の必要条件は、がん細胞の表面上の、特に、がん幹細胞の表面上のLILRBの存在である。
本開示に従って処置され得るがん細胞は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、膵臓、精巣、舌、子宮頸部、または子宮からの細胞を含むが、これらに限定されない。加えて、がんは、具体的には下記の組織学的タイプのものであってよいが、これらに限定されない:新生物、悪性;がん腫;がん腫、未分化;大細胞がん及び紡錘細胞がん;小細胞がん;乳頭がん;扁平上皮がん;リンパ上皮がん;基底細胞がん;毛母がん;移行上皮がん;乳頭状移行上皮がん;腺がん;ガストリノーマ、悪性;胆管がん;肝細胞がん;混合型肝がん;索状腺がん;腺様嚢胞がん;腺腫様ポリープの腺がん;腺がん、家族性大腸ポリポーシス;固形がん;カルチノイド腫瘍、悪性;細気管支−肺胞腺がん;乳頭状腺がん;嫌色素性がん;好酸性がん;好酸性腺がん;塩基好性がん;明細胞腺がん;顆粒細胞がん;濾胞状腺がん;乳頭状濾胞性腺がん;非被包性硬化性がん;副腎皮質がん;子宮内膜がん;皮膚付属器がん;アポクリン腺がん;皮脂腺がん;耳垢腺がん;粘膜表皮がん;嚢胞腺がん;乳頭状嚢胞腺腫;乳頭状漿液性嚢胞腺腫;粘液性嚢胞腺腫;粘液腺がん;印環細胞がん;浸潤性管がん;髄様がん;小葉がん;炎症性がん;パジェット病、乳房;腺房細胞がん;腺扁平上皮がん;扁平上皮化生を伴う腺がん;胸腺腫、悪性;卵巣間質腫瘍、悪性;卵巣卵胞膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫、悪性;男性胚細胞腫、悪性;セルトリ細胞がん;ライディッヒ細胞腫、悪性;脂質細胞腫、悪性;傍神経節腫、悪性;乳房外の傍神経節腫、悪性;褐色細胞腫;血管球血管肉腫;悪性黒色腫;無色素性黒色腫;表在性拡大型黒色腫;巨大色素性母斑の悪性黒色腫;類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児性横紋筋肉腫;胞巣型横紋筋肉腫;間質肉腫;混合腫瘍、悪性;ミュラー管混合腫瘍;腎芽細胞腫;肝芽腫;がん肉腫;間葉細胞腫、悪性;ブレンネル腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胎児性がん;奇形腫、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛がん;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周囲細胞腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;傍骨性骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨巨細胞腫瘍;ユーイング肉腫;歯性腫瘍、悪性;エナメル芽細胞歯牙肉腫;エナメル芽細胞腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星細胞腫;原形質性星状細胞腫;線維性星細胞腫;星状芽細胞腫;神経膠芽腫;乏突起神経膠腫;乏突起神経膠芽細胞腫;原始神経外胚葉腫瘍;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽細胞腫;網膜芽細胞腫;嗅神経腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞腫、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;傍肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、大細胞、びまん性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉腫;他の特定の非ホジキンリンパ腫;悪性組織球増殖症;多発性骨髄腫;肥満細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;形質細胞性白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞性白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;肥満細胞性白血病;巨核芽球性白血病;骨髄肉腫;及び毛様細胞性白血病。特定の態様では、腫瘍は、骨肉腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、ユーイング肉腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、または白血病を含んでもよい。
B.急性骨髄性白血病
急性骨髄性(myelogenous)白血病または急性非リンパ性白血病(ANLL)としても知られている急性骨髄性(myeloid)白血病(AML)は、骨髄に蓄積し、かつ正常な血液細胞の産生を妨げる、異常な白血球の急速な増殖を特徴とする、骨髄系統の血液細胞のがんである。AMLは成人が罹患する最も一般的な急性白血病であり、その発生率は年齢と共に増加する。AMLは比較的まれな疾患であり、米国におけるがんによる死亡の約1.2%を占めるが、その発生率は、人口の高齢化に伴い増加すると予想される。
急性骨髄性(myelogenous)白血病または急性非リンパ性白血病(ANLL)としても知られている急性骨髄性(myeloid)白血病(AML)は、骨髄に蓄積し、かつ正常な血液細胞の産生を妨げる、異常な白血球の急速な増殖を特徴とする、骨髄系統の血液細胞のがんである。AMLは成人が罹患する最も一般的な急性白血病であり、その発生率は年齢と共に増加する。AMLは比較的まれな疾患であり、米国におけるがんによる死亡の約1.2%を占めるが、その発生率は、人口の高齢化に伴い増加すると予想される。
AMLの症状は、正常な骨髄が白血病細胞で置換されることにより引き起こされ、赤血球、血小板、及び正常な白血球を低下させる。これらの症状は、疲労、息切れ、挫傷及び出血しやすさ、ならびに感染リスクの増加を含む。いくつかのリスク因子及び染色体異常が確認されているが、具体的な原因は明らかではない。急性白血病として、AMLは、急速に進行し、未処置のまま放置した場合、通常数週間または数ヶ月以内に死に至る。
AMLにはいくつかの亜型があり、処置及び予後は亜型により異なる。5年生存率は、15〜70%まで幅があり、再発率は、亜型に応じて33〜78%まで幅がある。AMLは、寛解を誘導することを目的とした化学療法で最初に処置される:患者は、追加的な化学療法または造血幹細胞移植を続いて受けてもよい。AMLの遺伝学に関する最近の研究により、特定の患者に対してどの剤(複数可)が最も作用し得るか、及び患者がどれだけ長く生存する可能性が高いか、を予測することができる試験の可能性がもたらされている。
AMLのほとんどの徴候及び症状は、正常な血液細胞が白血病細胞で置換されることにより引き起こされる。正常な白血球産生が不足すると、患者は感染症にかかりやすくなる。白血病細胞自体は白血球前駆体に由来するが、感染防御能力はない。赤血球数の低下(貧血)は、疲労、蒼白、及び息切れを引き起こす可能性がある。血小板が不足すると、軽度の外傷で挫傷または出血しやすくなる可能性がある。
AMLの初期の徴候は多くの場合、曖昧で非特異的であり、インフルエンザまたは他の一般的な病気のものと類似していることがある。一部の全身症状としては、発熱、疲労、体重減少または食欲不振、息切れ、貧血、挫傷または出血しやすさ、点状出血(出血により引き起こされる皮膚下の扁平帽針頭大の斑点)、骨及び関節痛、ならびに持続的または頻繁な感染、が挙げられる。
脾臓の肥大は、AMLで起こることがあるが、通常、軽度で無症状である。リンパ節腫脹は、急性リンパ芽球性白血病とは対照的に、AMLではまれである。皮膚白血病の形態の時は、皮膚の約10%が病変化している。まれに、皮膚の腫瘍随伴炎症であるスイート症候群が、AMLに伴い起こる可能性がある。
白血病細胞は歯肉組織に浸潤するので、一部のAML患者は、歯肉の腫れを経験することがある。まれに、白血病の最初の徴候は、緑色腫と呼ばれる固形白血病腫瘤または骨髄以外の腫瘍の発症であることがある。場合によっては症状を示さないことがあり、白血病は、慣例的な血液検査中に偶発的に発見されることがある。
他の血液障害、化学曝露、電離放射線、及び遺伝学を含む、AMLを発症させるいくつかのリスク因子が確認されている。
骨髄異形成症候群または骨髄増殖性疾患などの「前骨髄性白血病」血液障害は、AMLに移行する可能性がある。正確なリスクは、MDS/MPSのタイプに依存する。抗がん化学療法、特に、アルキル化剤への曝露は、その後AMLを発症するリスクを増加させる可能性がある。リスクは、化学療法の約3〜5年後で最も高い。他の化学療法剤、特に、エピポドフィロトキシン及びアントラサイクリンは、処置関連白血病とも関連する。これらの処置関連白血病は多くの場合、白血病細胞の特異的な染色体異常を伴う。ベンゼン及び他の芳香族有機溶媒への職業性の化学曝露は、AMLの原因として議論の余地がある。ベンゼン及びその誘導体の多くは、インビトロで発がん性があることが知られている。一部の研究が、ベンゼンへの職業性曝露とAMLのリスクの増加との間の関連を示唆しているが、他の研究は、寄与リスクが、たとえあったとしても軽微であることを示唆している。大量の電離放射線曝露は、AMLのリスクを増加させる可能性がある。AMLには遺伝的リスクが存在するようである。偶然のみにより予測されるよりも高い確率で家族内でAMLが発症している複数の症例が報告されている。いくつかの先天性条件は、白血病のリスクを増加させることがある。最も一般的なのは、おそらくダウン症候群であり、これはAMLのリスクを10〜18倍増加させる。
AMLの診断への最初の手がかりは通常、全血算の異常な結果である。異常な白血球の過剰(白血球増加症)は一般的な所見であり、白血病性芽球が見られる場合があるが、AMLは、血小板、赤血球の単独の減少、またはさらに低白血球数(白血球減少症)を呈する可能性もある。循環白血病性芽球が存在する場合、AMLの推定診断は、末梢血塗抹標本の検査を介して行うことができるが、確定診断は通常、適切な骨髄穿刺及び生検を必要とする。
骨髄または血液は、白血病の存在を診断するために、AMLを他のタイプの白血病(例えば、急性リンパ芽球性白血病−ALL)から区別するために、及び疾患の亜型を分類するために、光学顕微鏡検査及びフローサイトメトリーにより検査される(下記参照のこと)。骨髄または血液のサンプルは通常、所定の細胞遺伝学的検査または蛍光インサイチューハイブリダイゼーションにより、染色体異常についても試験される。遺伝学的研究は、疾患の転帰に影響を与え得るFLT3、ヌクレオフォスミン、及びKITなどの遺伝子の特定の変異を探すために実施されることもある。
血液及び骨髄塗抹標本の細胞化学的染色は、AMLとALLとの区別及びAMLの亜分類において役立つ。ミエロペルオキシダーゼまたはスーダンブラック染色及び非特異的エステラーゼ染色の組み合わせは、ほとんどの場合、所望の情報を提供するであろう。ミエロペルオキシダーゼまたはスーダンブラック反応は、AMLの同一性を確立し、AMLをALLと区別するのに最も有用である。非特異的エステラーゼ染色は、AMLの単球成分を同定するために、及び低分化単芽球性白血病をALLと識別するために、使用される。
AMLの診断及び分類は、困難である可能性があり、資格のある血液病理学者または血液学者により実施されるべきである。明白な場合は、特定の形態学的特徴(例えば、アウエル小体)の存在または特異的なフローサイトメトリーの結果により、AMLを他の白血病と区別することができる。しかし、このような特徴がない状態では、診断はより困難になることがある。
広く使用されるWHO基準によると、AMLの診断は、血液及び/または骨髄の20%以上における白血病性骨髄芽球による関与を実証することにより確定される。仏国−米国−英国(FAB)の分類は、より厳格であり、AMLと診断されるのは、骨髄(BM)または末梢血(PB)中、芽細胞が少なくとも30%である必要がある。AMLは、異なった処置をされる骨髄異形成症候群または骨髄増殖性症候群などの「前白血病」状態と慎重に区別しなければならない。
急性前骨髄球性白血病(APL)は、治療可能性が最も高く、独特の処置形態を必要とするので、この亜型の白血病の診断を迅速に確定または除外することが重要である。血液または骨髄で実施される蛍光インサイチューハイブリダイゼーションは多くの場合、APLの特徴を示す染色体転座[t(15;17)(q22;q12);]を容易に同定するので、この目的に使用される。その転座の発がん産物であるPML/RARA融合タンパク質の存在を分子的に検出する必要もある。
AMLの第一選択の処置は、主に化学療法からなり、2つの段階:導入療法及び寛解後療法(または地固め療法)に分けられる。導入療法の目標は、白血病細胞の数を検出不可能なレベルまで低減させることにより、完全寛解を達成することである。地固め療法の目標は、残存する検出不可能な疾患を排除し、治癒を達成することである。造血幹細胞移植は通常、導入化学療法が失敗した場合に、または患者の再発後に、考慮される。但し、移植は、高リスク疾患患者に対する第一選択の治療として使用される場合もある。
M3を除く全てのFAB亜型は通常、シタラビン(ara−C)及びアントラサイクリン(ほとんどの場合、ダウノルビシン)による導入化学療法を受ける。この導入化学療法レジメンは、シタラビンが、連続7日間、連続IV注入として与えられ、そして、アントラサイクリンが、連続3日間、IVプッシュ法として与えられるので、「7+3」(または「3+7」)として知られている。70%までの患者が、このプロトコールで寛解を達成するであろう。高用量のシタラビン単独、FLAG様レジメン、または治験薬を含む、他の代替導入レジメンが使用されてもよい。骨髄抑制及び感染リスクの増加を含む、療法の毒性作用のために、導入化学療法は超高齢者には提供されないことがあり、その選択肢は、強度の弱い化学療法または緩和ケアを含んでもよい。
急性前骨髄球性白血病(APL)としても知られているM3亜型のAMLはほぼ例外なく、導入化学療法(通常はアントラサイクリン)に加えて、オールトランスレチノイン酸(ATRA)で処置される。前骨髄球が顆粒の内容物を末梢循環中に放出する場合、APLの処置を複雑にする播種性血管内凝固(DIC)を予防するように注意しなければならない。APLは、十分に裏付けられた処置プロトコールにより、極めて治癒可能である。
導入段階の目標は、完全寛解に達することである。完全寛解は、疾患が治癒されていることを意味せず、むしろ、利用可能な診断方法で疾患を検出することができないことを意味する。新たに診断された成人の約50%〜75%において、完全寛解が得られる。但し、これは上記予後因子に基づいて変わることがある。寛解期間は、元の白血病の予後特徴に依存する。一般に、追加の地固め療法がなければ、寛解は失敗するであろう。
完全寛解が達成された後でさえ、白血病細胞は依然として、現在の診断技術で検出できないほど少ない数で存在する可能性が高い。さらなる寛解後療法または地固め療法が行われない場合、ほぼ全ての患者が、最終的に再発するであろう。それ故、検出できない疾患をなくし、再発を予防するために、つまり、治癒を達成するために、さらなる治療が必要である。
特定のタイプの寛解後療法は、患者の予後因子(上記を参照のこと)及び全体的な健康状態に基づいて個別化される。予後良好な白血病(すなわち、inv(16)、t(8;21)、及びt(15;17))の場合、患者は通常、3〜5コースの強化化学療法(地固め化学療法として知られている)を受けることになる。再発のリスクが高い患者(例えば、細胞遺伝学的にリスクが高い患者、潜在的MDS患者、または治療関連AML患者)の場合、同種幹細胞移植は通常、患者が移植に耐えることができ、かつ適切なドナーを有する時に推奨される。中間リスクAML(予後良好(good−risk)群または高リスク群に分類されない正常な細胞遺伝または細胞遺伝学的変化)に対する最良の寛解後療法は明確ではなく、患者の年齢及び全体的な健康状態、患者の個人的価値観、ならびに適切な幹細胞ドナーが利用可能かどうかを含む具体的な状況に依存する。
幹細胞移植に適格でない患者の場合、地固め完了後のヒスタミン二塩酸塩(Ceplene)及びインターロイキン2(Proleukin)の併用による免疫療法は、絶対再発リスクを14%低減させ、寛解の維持の可能性の50%増加につながることが明らかになっている。
再発性AML患者の場合、唯一証明されている治癒の可能性のある療法は、まだ実施されていなければ、造血幹細胞移植である。2000年に、モノクローナル抗体結合細胞傷害剤であるゲムツズマブオゾガマイシン(Mylotarg)が、高用量化学療法の対象とならない60歳を超える再発性AML患者のために米国で承認された。この薬物は、2010年に、メーカーであるファイザー社により市場から自主回収された。再発性AMLの処置の選択肢は非常に限られているので、緩和ケアが提供されることがある。
従来の処置の選択肢が限られているため、幹細胞移植の対象とならないまたは幹細胞移植後に再発した再発性AML患者は、臨床試験中の処置を提供されることがある。研究中の剤は、クロファラビンなどの細胞傷害性薬物、ならびにファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、及びMDR1(多剤耐性タンパク質)の阻害剤などの標的療法を含む。再発性急性前骨髄球性白血病(APL)の場合、三酸化ヒ素は治験で試験されており、米国FDAにより承認されている。ATRAと同様に、三酸化ヒ素は、他の亜型のAMLには作用しない。
急性骨髄性白血病は治癒可能な疾患であるが、特定の患者の治癒の可能性はいくつかの予後因子に依存する。AMLにおける一つの最も重要な予後因子は、細胞遺伝、または白血病細胞の染色体構造である。特定の細胞遺伝学的異常は、非常に良好な転帰と関連する(例えば、急性前骨髄球性白血病における転座(15:17))。AML患者の約半数は、「正常な」細胞遺伝を有する;彼らは、中間リスク群に分類される。他のいくつかの細胞遺伝学的異常は、予後不良と関連し、処置後の再発リスクが高いことが知られている。
既存の骨髄異形成症候群(MDS)または骨髄増殖性疾患から生じるAML(いわゆる二次性AML)は、過去の別の悪性腫瘍の化学療法後に生じる処置関連AMLと同様に、予後が悪い。これらの実体の両方は、好ましくない細胞遺伝学的異常の割合の高さと関連する。
一部の研究では、60歳を超える年齢、及び乳酸デヒドロゲナーゼレベルの上昇はまた、より不良な転帰と関連していた。ほとんどの形態のがんと同様に、パフォーマンスステータス(すなわち、患者の全身的身体状態及び活動レベル)は、予後においても重要な役割を果たす。
FLT3の遺伝子内縦列重複(ITD)は、AMLの予後不良をもたらすことが示されている。最初の寛解時の幹細胞移植などのより積極的な治療でこれらの患者を処置することにより、長期生存を高めることは示されていない。FLT3のITDは白血球停滞と関連することがある。2012年に、FLT3阻害剤キザルチニブは、FLT3−ITD変異を有するAML患者において肯定的な第II相治験結果を示した。
研究者らは、AMLにおけるc−KIT変異の臨床的意義を研究している。これらは、c−KITの活性を薬理学的に遮断することができるイマチニブ及びスニチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤の利用可能性のために、一般的であり、臨床的に重要である。予後因子または治療標的として研究されている他の遺伝子は、CEBPA、BAALC、ERG、NPM1を含む。
B.急性リンパ芽球性白血病(ALL)
急性リンパ芽球性白血病(ALL)または急性リンパ性白血病は、急性形態の白血病または白血球のがんであり、がん性の未成熟白血球(リンパ芽球として知られている)の過剰産生を特徴とする。ALLに罹患した者において、リンパ芽球は、骨髄で過剰産生され、連続的に増殖して、正常細胞(赤血球及び白血球ならびに血小板など)の産生を阻害することにより、かつ他の器官に浸潤することにより、損傷及び死亡を引き起こす。ALLは、小児期に最も一般的であり、2〜5歳で発生率のピークがあり、老年期に別のピークがある。
急性リンパ芽球性白血病(ALL)または急性リンパ性白血病は、急性形態の白血病または白血球のがんであり、がん性の未成熟白血球(リンパ芽球として知られている)の過剰産生を特徴とする。ALLに罹患した者において、リンパ芽球は、骨髄で過剰産生され、連続的に増殖して、正常細胞(赤血球及び白血球ならびに血小板など)の産生を阻害することにより、かつ他の器官に浸潤することにより、損傷及び死亡を引き起こす。ALLは、小児期に最も一般的であり、2〜5歳で発生率のピークがあり、老年期に別のピークがある。
白血病は骨髄の資源を浪費するので、ALLの症状は、機能的な血液細胞の産生の低減を示す。この資源は通常、新しく機能する血液細胞を産生するために使用される。これらの症状は、発熱、感染リスクの増加(特に、好中球減少症に起因する肺炎などの細菌感染;このような感染症の症状は、息切れ、胸部痛、咳、嘔吐、排便または排尿の変化)、出血しやすい傾向の増加(血小板減少症に起因する)、ならびに蒼白、頻脈(高心拍数)、疲労、及び頭痛を含む貧血を示す徴候、を含むことがある。
毎年、米国で約6,000症例が報告されている。他の国からの統計は入手困難である。但し、米国、イタリア、及びコスタリカではより一般的であることが知られている。治癒は、現実的な目標であり、患児の80%以上で達成される。但し、成人の20〜40%しか治癒することができない。「急性」とは、長年の潜在的な経時変化を有する慢性リンパ性白血病と区別するために、比較的短い時間経過の疾患を指す。
症状は、ALLに特有のものではないが、医療援助が求められる程度まで悪化する。それらは、正常かつ健康な血液細胞が、悪性かつ未成熟な白血球(白血球)により追いやられて欠如した結果である。それ故、ALLに罹患した者は、赤血球(赤血球)、白血球、及び血小板の機能不全による症状を経験する。異常を示し得る臨床検査は、血球数検査、腎機能検査、電解質検査、及び肝臓酵素検査を含む。
ALLの徴候及び症状は、様々であるが、骨髄置換及び/または器官浸潤に続き、汎発性衰弱及び疲労、貧血、めまい、頻繁なまたは原因不明の発熱及び感染、体重減少及び/または食欲不振、過度のかつ原因不明の挫傷、骨痛、関節痛(「芽」細胞の髄腔からの骨の表面へのまたは関節への拡散により引き起こされる)、呼吸困難、リンパ節、肝臓、及び/または脾臓の肥大、下肢及び/または腹部の圧痕浮腫(腫れ)、ならびに、低血小板レベルに起因する皮膚の小さな赤い斑点または線である点状出血を含む。
一般には、がんは、コントロール不能な細胞増殖をもたらすDNAへの損傷により引き起こされ、増殖を引き起こす化学シグナルを増加させることにより、または増殖をコントロールする化学シグナルを遮断することにより、体全体に広がる。損傷は、融合遺伝子の形成、ならびに、T細胞受容体遺伝子などの別の遺伝子のプロモーターにがん原遺伝子が並置されることによるがん原遺伝子の調節異常により引き起こされる可能性がある。この損傷は、化学物質、薬物、または放射線などの環境要因により引き起こされることがあり、また、有糸分裂または他の正常なプロセス中に自然発生する(但し、細胞はこれを低減するのに役立つDNA修復の多数の機序を有する)。
ALLは、動物及びヒトにおける放射線及び化学物質への曝露と関連する。広島及び長崎の原爆被爆者の研究で見られるように、高レベルの放射線曝露は、白血病を発症させる既知のリスク因子である。動物では、ベンゼン及び他の化学物質への曝露は、白血病を引き起こす可能性がある。疫学調査では、白血病と化学物質の職場での曝露とを関連づけているが、これらの研究は、決定的なものではない。一部の証拠は、二次性白血病は、放射線及び化学療法を用いて他のがんが処置された個体において、その処置の結果として、発症する可能性があることを示唆する。
ALLの診断は、病歴、身体検査、全血算、及び血液塗抹標本から始まる。症状は非常に一般的であるので、同様の症状を有する他の多くの疾患が除外されなければならない。通常、白血球数が高いほど、予後は悪くなる。芽細胞は、大部分の場合、血液塗抹標本に見られる(芽細胞は、全ての免疫細胞株の前駆細胞(幹細胞)である)。骨髄生検は、ALLの決定的な証拠である。腰椎穿刺(脊椎穿刺としても知られている)は、脊椎及び脳が浸潤されているかどうかを示すであろう。
病理検査、細胞遺伝学的検査(特に、フィラデルフィア染色体の存在)、及び免疫表現型検査により、骨髄芽球(好中球、好酸球、若しくは好塩基球)またはリンパ芽球(Bリンパ球若しくはTリンパ球)細胞が問題であるかどうかを確認する。RNA検査は、疾患がどの程度侵攻性であるかを確認することができる;種々の変異は、より短いまたはより長い生存と関連している。免疫組織化学的検査は、白血病細胞の表面上のTdTまたはCALLA抗原を明らかにすることがある。TdTは、プレT及びプレB細胞の発症の早期に発現するタンパク質である。これに対して、CALLAは、ALL症例の80%に見出される抗原であり、CMLの「急性転化期」にも見出される。医用画像(例えば、超音波またはCTスキャン)は、他の器官、一般には、肺、肝臓、脾臓、リンパ節、脳、腎臓、及び生殖器の浸潤を見つけることができる。
急性リンパ性白血病が早く検出されればされる程、処置がより効果的になる。目的は、体内に検出可能ながん細胞が存在しないこと(通常、骨髄中の芽球が5%未満)と定義される持続的な寛解を誘導することである。急性白血病の処置は、化学療法、ステロイド、放射線療法、集中的な併用処置(骨髄または幹細胞移植を含む)、及び成長因子を含み得る。
化学療法は、最良の初期処置である。ほとんどのALL患者は、異なる処置の組み合わせを受けることになる。悪性細胞が全身に分布するため、手術という選択肢はない。一般に、ALLに対する細胞傷害性化学療法は、複数の抗白血病薬を種々の組み合わせで組み合わせている。ALLに対する化学療法は、寛解誘導、強化、及び維持療法の3つの段階からなる。
化学療法レジメンは強烈かつ長期化する可能性がある(多くの場合、GMALL UKALL、HyperCVAD、またはCALGBプロトコールの場合約2年、ALLに対し、COGプロトコールで男性の場合約3年2ヶ月;女性の場合2年2ヶ月−睾丸が潜在的な貯留層であるので、男性の方が長い)ので、多くの患者は、静脈内カテーテル(中心静脈カテーテル若しくはヒックマンラインと称される)またはPortacath(通常は鎖骨近くの皮膚の下に外科的に埋め込まれる、シリコンノーズを備える円錐型のポート。感染のリスクが低く、かつPortacathの長期間の実行可能性のため、最も効果的な利用可能な製品である)を、大静脈に挿入されている。
放射線療法(radiation therapy)(または放射線治療(radiotherapy))は、疾患負荷の高い、痛みのある骨領域に、または骨髄移植(全身照射)の準備の一部として、使用される。全脳照射形態の放射線は、脳における白血病の再発を防止するために、中枢神経系予防にも使用される。全脳予防照射は、子供のALLの処置における一般的な方法であった。最近の研究によれば、CNS化学療法は、同じくらい有利であるが発育上の副作用がより少ない結果を提供したことが示された。その結果、全脳照射の使用は、より制限されている。成人白血病の専門家の大部分は、CNS予防のために放射線療法を使用することを断念し、代わりに髄腔内化学療法を使用している。
再発性ALLの一部の亜型の場合、化学療法と併用して、プロテアソームなどの生物学的標的に狙いを定めることにより、臨床試験において有望な結果が得られている。白血病性リンパ芽球と生物学的標的との組み合わせ効果に基づく生物学的標的の選択は、ALL処置の効果の改善のための臨床試験につながる可能性がある。進行中の臨床試験では、CD19−CD3二重特異性モノクローナルマウス抗体ブリナツモマブ(blinatumomab)が大きな将来性を示している。
キメラ抗原受容体(CAR)は、ALLに対する有望な治療法として開発されている。この技術は、ALLを処置するための方法として、細胞表面マーカーCD19を認識するように設計された一本鎖可変フラグメント(scFv)を使用する。CD19は、全てのB細胞上に見出される分子であり、患者の潜在的に悪性のB細胞集団を識別する手段として使用することができる。この療法では、マウスは、CD19抗原で免疫化され、抗CD19抗体を産生する。骨髄腫細胞株に融合したマウス脾臓細胞から発生したハイブリドーマは、CD19特異的抗体をコードするcDNAの供給源として開発することができる。cDNAは、配列決定され、これらの抗体の可変重鎖及び可変軽鎖をコードする配列は、小さなペプチドリンカーを使用して、共にクローニングされる。この結果得られる配列は、scFvをコードする。これは、CARのエンドドメインになるべきものをコードする導入遺伝子にクローニングすることができる。エンドドメインとして使用されるサブユニットの様々な配置が存在するが、それらは一般に、scFvに結合するヒンジ領域、膜貫通領域、CD28などの共刺激分子の細胞内領域、及びCD3−ゼータ含有ITAMリピートの細胞内ドメインで構成される。頻繁に含まれる他の配列は:4−1bb及びOX40である。次に、scFv及びエンドドメイン配列を含有する最終導入遺伝子配列は、患者から得られかつインビトロで拡大された免疫エフェクター細胞に挿入される。以前の治験では、これらは、細胞傷害性の能力があるT細胞の一種であった。DNAをエフェクター細胞に挿入することは、いくつかの方法により達成することができる。最も一般には、これは、導入遺伝子をコードするレンチウイルスを使用して行われる。偽型自己不活性化レンチウイルスは、所望の導入遺伝子を標的細胞ゲノムDNAに安定して挿入するための有効な方法であることがわかっている。他の方法は、エレクトロポレーション及びトランスフェクションを含むが、これらは導入遺伝子発現が経時的に減少することになるので、それらの有効性が限定される。次に、遺伝子改変されたエフェクター細胞は、また患者に移植される。通常、このプロセスは、注入されたT細胞の効果を増強することがわかっているシクロホスファミドなどのコンディショニングレジメンと組み合わせて行われる。この効果は、免疫学的空間ニッチの創出に起因している。プロセスは全体として、エフェクター細胞、通常はT細胞をもたらす。これは、主要組織適合性複合体に依存しない形で、腫瘍細胞抗原を認識して、細胞傷害性応答を開始することができる。
C.慢性リンパ芽球性白血病(CLL)
慢性リンパ性白血病(CLL)としても知られているB細胞慢性リンパ性白血病(B−CLL)は、成人の白血病(白血球のがんの一種)の最も一般的なタイプである。CLLは、骨髄から生じ、リンパ節に展開し、通常は抗体を産生することにより感染症と戦うB細胞リンパ球に影響を及ぼす。CLLでは、B細胞は、コントロール不能に増殖して骨髄及び血液に蓄積し、健康な血液細胞を追いやる。CLLは、主にリンパ節に現れるB細胞リンパ腫の一種である小リンパ球性リンパ腫(SLL)の一病期である。CLL及びSLLは、見かけが違うだけで、同じ潜在的疾患と考えられている。CLLは、成人の疾患である。新たにCLLと診断された者のほとんど(75%を超える)が50歳以上で、大部分が男性である。しかしまれに、ティーンエイジャーに、場合により子供に、起こる可能性がある。これらの一部は、遺伝性の素因に関連することがある。
慢性リンパ性白血病(CLL)としても知られているB細胞慢性リンパ性白血病(B−CLL)は、成人の白血病(白血球のがんの一種)の最も一般的なタイプである。CLLは、骨髄から生じ、リンパ節に展開し、通常は抗体を産生することにより感染症と戦うB細胞リンパ球に影響を及ぼす。CLLでは、B細胞は、コントロール不能に増殖して骨髄及び血液に蓄積し、健康な血液細胞を追いやる。CLLは、主にリンパ節に現れるB細胞リンパ腫の一種である小リンパ球性リンパ腫(SLL)の一病期である。CLL及びSLLは、見かけが違うだけで、同じ潜在的疾患と考えられている。CLLは、成人の疾患である。新たにCLLと診断された者のほとんど(75%を超える)が50歳以上で、大部分が男性である。しかしまれに、ティーンエイジャーに、場合により子供に、起こる可能性がある。これらの一部は、遺伝性の素因に関連することがある。
ほとんどの者は症状がなく、慣例的な血液検査の結果、白血球数が高いことで診断されるが、進行するにつれて、CLLは、リンパ節、脾臓、及び肝臓の腫脹、最終的には、貧血及び感染症を生じる。早期CLLは処置されず、後期CLLは化学療法及びモノクローナル抗体で処置される。
DNA分析は、生存期間の異なる2つの主要なタイプのCLLを識別している。マーカーZAP−70に対して陽性であるCLLは、平均生存期間が8年間である一方、ZAP−70に対して陰性であるCLLは、平均生存期間が25年を超える。多くの患者、特に高齢の患者は疾患の進行が遅く、安心することができ、生涯にわたっていかなる処置も必要としないことがある。
ほとんどの者は症状がなく、慣例的な血液検査の結果、白血球数が高いことで診断される。あまり一般的ではないが、CLLは、白血球数が高くなくても、または血液中に疾患の徴候がなくても、リンパ節の肥大を呈することがある。これは、小リンパ球性リンパ腫と称される。一部の個体では、新生物細胞が骨髄を圧倒して、疲労または衰弱を引き起こす貧血を生じて初めて、疾患が明らかになる。
CLLは通常、全血算(CBC)検査における、白血球の一種であるリンパ球増加の存在により最初に疑われる。これは多くの場合、慣例的な診察時の偶発的発見である。ほとんどの場合、リンパ球数は、血液1マイクロリットル(μl)当たり4000細胞を超えるが、はるかに高いこともある。高齢の個体におけるリンパ球増加の存在には、CLLの強い疑いが提起されるべきであり、確証的な診断検査、特に、フローサイトメトリーは、臨床的に不必要でない限り、実施されるべきである。
CLLの診断は、血液、骨髄、または組織中のBリンパ球の異常な集団の実証に基づいており、これは、細胞表面上に異常であるが特徴的な分子パターンを示す。この非定型分子パターンは、細胞表面マーカー分化抗原群5(CD5)及び分化抗原群23(CD23)の同時発現を含む。加えて、1つの個体内の全てのCLL細胞は、クローンであり、つまり、遺伝的に同一である。実際には、これは、異常なB細胞の全集団に対して、互いに排他的な抗体軽鎖であるκまたはλのうちの1つのみを検出することにより推測される。正常なBリンパ球は、異なる抗体産生細胞の混合物から構成され、κ及びλ発現細胞の両方の混合物を生じる。κ及びλ産生B細胞の正常な分布がないことは、任意のB細胞悪性腫瘍(B細胞非ホジキンリンパ腫)の診断を確定するための重要な要素であるクローン性を実証するための1つの根拠である。
クローン性及びマーカー分子発現を確認するための末梢血の顕微鏡検査及びフローサイトメトリーによるリンパ球の分析の組み合わせが、CLLの診断を確定するために必要である。両方とも、少量の血液で容易に達成される。フローサイトメーターは、液体中の個々の細胞上の分子の発現を検査することができる機器である。これは、機器により認識される蛍光タグを有するマーカー分子に対する特異的抗体の使用を必要とする。CLLにおいて、リンパ球は、(マーカー分子分化抗原群19(CD19)及びCD20を発現する)B細胞系統の遺伝的クローンであり、マーカー分子CD5及びCD23を特徴的に発現する。これらのB細胞は顕微鏡下では正常なリンパ球に似ており(但し、わずかに小さい)、スライドガラスに塗布された時に壊れやすく、多くの壊れた細胞を生じさせる。これは、「破損」細胞または「よごれ」細胞と呼ばれる。
MatutesのCLLスコアは、5つのマーカーの発現(CD5、CD23、FMC7、CD22、及び免疫グロブリン軽鎖)の非定型/混合CLLとは異なる、古典的なCLLの均質なサブグループの同定を可能にする。MatutesのCLLスコアリングシステムは、古典的なCLLと他のB細胞の慢性リンパ増殖性疾患との間の鑑別診断に非常に役立つが、混合/非定型CLLとマントル細胞リンパ腫(MCL悪性B細胞)との間の免疫学的な区別には役立たない。CLLとMCLとの区別は、CD54及びCD200などの非定型マーカーを加えることにより改善することができる。所定のマーカーの中で最も識別力のある特徴は、CD20/CD23平均蛍光強度比である。対照的に、FMC7の発現は、驚くべきことに、境界例の場合、誤った方向に導かれる可能性がある。
疾患の範囲を決定する病期分類は、Rai病期分類システムまたはBinet分類(詳細を参照のこと)により行われ、主に低血小板数または低赤血球数の存在に基づいている。初期の疾患は、処置する必要はない。
CLL処置は、完全な治癒よりはむしろ、疾患及びその症状をコントロールすることに焦点を当てている。CLLは、化学療法、放射線療法、生物学的療法、または骨髄移植で処置される。症状は、外科的に(肥大した脾臓の脾摘除)または放射線療法(リンパ節腫脹を「縮小」する)により、処置される場合がある。
初期のCLL処置は、疾患の厳密な診断及び進行に応じて、さらに医療従事者の裁量及び経験によって異なる。多数の剤が、CLL治療に使用される。フルダラビン、シクロホスファミド、及びリツキシマブ(FCRとして知られている)を含有する初期の処置レジメンは、より高い全奏効率及び完全奏効率を実証している。
ペンシルベニア大学の研究者により実施された研究では、疾患と戦うために、遺伝子改変T細胞を使用してCD19タンパク質を発現した細胞を攻撃した。2013年には、研究者らは、59人の患者のうち26人が完全寛解を達成したこと、及び元患者は腫瘍が残っていないことを発表した。
白血病は妊娠とほとんど関連がなく、10,000人の妊婦のうち約1人にしか影響しない。慢性リンパ性白血病の処置は多くの場合、妊娠の終了後まで延期することができる。処置が必要な場合は、第2または第3三半期に化学療法を行うと、妊娠損失または先天性欠損症が、第1三半期に処置するよりも少なくなる可能性が高い。
一般に不治と考えられているが、CLLはほとんどの場合、緩徐に進行する。CLLに罹患した多くの者は、長年にわたり−一部の場合では数十年間、通常の活発な生活をしている。発症が遅いため、早期のCLL介入は、生存期間または生活の質を改善しないと考えられており、従って初期CLLは一般に処置されない。代わりに、疾患パターンのあらゆる変化を検出するために状態が経時的にモニターされる。
疾患が患者の生活の質に影響を及ぼし得る程度まで進行していることを、患者の臨床症状または血球数が示す場合、CLL処置を開始する決定が行われる。Rai 4病期分類システム及びBinet分類などの臨床的「病期分類システム」は、患者の処置時期及び方法を決定するのに役立ち得る。処置を開始する時期及びどのような手段によるかを決定することは多くの場合、難しい;研究により、極めて早期に疾患を処置する生存上の利点はないことが示されている。アメリカ国立がん研究所のワーキンググループは、処置開始前に満たされるべき具体的なマーカーを含む、処置のためのガイドラインを発行している。
併用化学療法レジメンは、新たに診断されたCLL及び再発性CLLの両方において有効である。フルダラビンをアルキル化剤(シクロホスファミド)と組み合わせると、単剤よりも高い奏効率及び長い無増悪生存期間をもたらす:
FC(フルダラビンとシクロホスファミド)
FR(フルダラビンとリツキシマブ)
FCR(フルダラビン、シクロホスファミド、及びリツキシマブ)
CHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロン)。
プリンアナログフルダラビンが、一次療法として、クロラムブシルより優れた奏効率をもたらすことが示されたが、フルダラビンの早期使用が全生存期間を改善するという証拠はなく、一部の臨床医は、再発性疾患用にフルダラビンを取っておくことを選ぶ。
FC(フルダラビンとシクロホスファミド)
FR(フルダラビンとリツキシマブ)
FCR(フルダラビン、シクロホスファミド、及びリツキシマブ)
CHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロン)。
プリンアナログフルダラビンが、一次療法として、クロラムブシルより優れた奏効率をもたらすことが示されたが、フルダラビンの早期使用が全生存期間を改善するという証拠はなく、一部の臨床医は、再発性疾患用にフルダラビンを取っておくことを選ぶ。
FCRを用いた化学免疫療法は、体力が良好なために選択されたCLL患者の大規模な無作為化試験において、奏効率、無増悪生存期間、及び全生存期間を改善することを示している。これは、第1選択療法の選択が、CLL患者の全生存期間を改善することができることを実証する最初の臨床試験であった。CLLに対し承認されたアルキル化剤は、ベンダムスチン及びシクロホスファミドを含む。
標的療法は、正常細胞に害を与えないことを目的として、特定の標的においてがん細胞を攻撃する。(CD52に対する)アレムツズマブ、及びリツキシマブ、及び(CD20対する)オファツムマブなどのモノクローナル抗体は、CLLに使用される。チロシンキナーゼ阻害剤療法は、CLLに使用することもできる。2014年2月に、FDAは、イブルチニブに、慢性リンパ性白血病を処置する承認を与えた。イブルチニブは、ブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)阻害剤である。2014年7月に、FDA及びEMAは、イデラリシブに、異なるタイプの白血病を処置する承認を与えた。イデラリシブは、PI3Kδ経路を標的とするPI3K阻害剤であり、経口摂取される。
レシピエント自身の細胞を使用する自己由来の幹細胞移植は、治癒をもたらさない。若年の個体は、CLLで死亡するリスクが高い場合、同種造血幹細胞移植(HSCT)を考慮してもよい。健康なドナー由来の血液細胞を使用した高リスク処置である、骨髄破壊的(骨髄死滅)形態の同種幹細胞移植は、治癒効果があることがあるが、処置関連毒性が大きい。低強度コンディショニング同種幹細胞移植と呼ばれている中間レベルは、高齢患者または虚弱患者に、より良く許容されることがある。
「難治性」CLLは、もはや処置が順調に奏効しない疾患である。この場合、レナリドマイド、フラボピリドール、及び骨髄(幹細胞)移植を含むより積極的な療法が考慮される。モノクローナル抗体である(CD52に対する)アレムツズマブは、難治性骨髄系疾患の患者に使用されてもよい。
合併症は、リヒター症候群、再発性感染症をもたらす低ガンマグロブリン血症、10〜15%の患者における温式自己免疫性溶血性貧血、高悪性度リンパ腫への転換を含む。慢性リンパ性白血病は、慢性リンパ性白血病を有する患者において、リヒター症候群、急速に増殖するびまん性大B細胞リンパ腫、前リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、または急性白血病に転換することがある。その発生率は、CLL患者の約5%であると推定されている。
胃腸(GI)病変は、慢性リンパ性白血病では、ほとんど起こる可能性がない。報告された症状の一部は、腸重積、小腸の細菌汚染、大腸炎、及び他のものを含む。通常、CLLとのGI合併症は、リヒタートランスフォーメンション後に起こる。現在までに、リヒタートランスフォーメーションのない慢性リンパ性白血病のGI病変の症例報告は2件存在している。
D.非小細胞肺がん
非小細胞肺がん(NSCLC)は、小細胞肺がん(SCLC)以外のあらゆるタイプの上皮性肺がんである。クラスとして、NSCLCは、小細胞がんと比較して、化学療法に比較的感受性がない。可能であれば、それらは、主に治癒目的での外科的切除により処置される。但し、化学療法は、術前(ネオアジュバント化学療法)及び術後(アジュバント化学療法)の両方でますます使用されている。
非小細胞肺がん(NSCLC)は、小細胞肺がん(SCLC)以外のあらゆるタイプの上皮性肺がんである。クラスとして、NSCLCは、小細胞がんと比較して、化学療法に比較的感受性がない。可能であれば、それらは、主に治癒目的での外科的切除により処置される。但し、化学療法は、術前(ネオアジュバント化学療法)及び術後(アジュバント化学療法)の両方でますます使用されている。
最も一般的なタイプのNSCLCは、扁平上皮がん、大細胞がん、及び腺がんであるが、より少ない頻度で発生する他のいくつかのタイプがあり、全てのタイプは、異常な組織学的バリアントで、及び混合細胞型の組み合わせとして、発生する可能性がある。語句「非小細胞肺がん」は、(「特記されない限り」すなわちNOS)、より詳細な診断ができない場合に通常、総称的に使用される場合がある。これはほとんどの場合、病理医が細胞学的標本または生検標本において少量の悪性細胞または組織を検査する場合に当てはまる。
喫煙未経験の肺がんは、ほぼ例外なくNSCLCであり、大多数は腺がんである。比較的まれな場合では、悪性肺腫瘍は、SCLC及びNSCLCの両方の構成要素を含有することが判明している。これらの症例では、腫瘍は混合型小細胞肺がん(c−SCLC)として分類されるべきであり、(通常)「純粋な」SCLCと同様に処置される。
肺の腺がんは、現在では、「喫煙未経験者」(生涯非喫煙者)において、最も一般的なタイプの肺がんである。腺がんは、肺がんの約40%を占める。歴史的に、腺がんは、小細胞肺がん及び扁平上皮細胞肺がんよりも肺の末梢でより頻繁に見られた。小細胞肺がん及び扁平上皮細胞肺がんの双方は多くの場合、中枢に位置する傾向があった。しかし、興味深いことに、最近の研究は、腺がん及び扁平上皮がんの両方における「中枢に発生する病変対末梢に発生する病変の比」が、統一に向かって収束している可能性があることを示唆している。
肺の扁平上皮がん(SCC)は、女性よりも男性において一般的である。それは、喫煙歴と密接に関連しており、他のほとんどの肺がんより密接に関連する。看護師健康調査(Nurse’s Health Study)によると、SCCの相対リスクは、喫煙未経験と比較して、過去の喫煙期間が1〜20年の者及び20〜30年の者の両方において約5.5である。相対リスクは、過去の喫煙期間が30〜40年で約16に、40年を超えると約22まで増加する。
大細胞肺がん(LCLC)は、がん化した肺上皮細胞に由来する未分化悪性新生物の異種群である。典型的にLCLCは、これまで全NSCLCの約10%を占めてきた。しかし、新しい診断技術は、より低分化の扁平上皮がん及び腺がんに有利であり、「古典的」LCLCの診断の発生率を低減させるようである。事実上LCLCは、小細胞がん、扁平上皮がん、腺がん、または他のより特異的な組織学的タイプの肺がんとして新生物を分類すべき光学顕微鏡特性を腫瘍細胞が有していないという点で、「除外診断」である。LCLCは、主に未分化細胞のサイズの大きさ、細胞質対核サイズ比の高さ、ならびに「ごま塩状」のクロマチンの欠如により、小細胞肺がん(SCLC)と区別される。
多くの場合、がんの病期、個体の全体的な健康状態、年齢、化学療法の奏効、及び処置により起こり得る副作用などの他の要因に応じて、複数種類の処置が使用される。NSCLCは通常、化学療法及び/または放射線にあまり感受性がないので、初期に診断された場合、手術が最良の処置であり、多くの場合、シスプラチンを含むアジュバント(補助的な)化学療法を伴う。他の処置選択肢は、化学療法、放射線療法(放射線治療)、及び標的療法である。
放射線処置を施す新しい方法により、医師による肺がん処置がより的確であることが可能になる。これは、近くの健康な組織に影響する放射線の量が少ないことを意味する。新しい方法は、サイバーナイフ及び定位手術的照射(SRS)を含む。他の処置は、高周波アブレーション及び化学塞栓術である。
広範な化学療法が、進行した(転移性)NSCLCに使用されている。EGFR遺伝子に特定の変異を有する一部の患者は、ゲフィチニブなどのEGFRチロシンキナーゼ阻害剤が奏効する。NSCLCの約7%がEML4−ALK転座を有し、これらは、臨床試験中のALK阻害剤から恩恵を受けることがある。クリゾチニブは、2011年8月にFDAの承認を取得した。
E.胃がん
胃がん(stomach cancer)または胃がん(gastric cancer)は、胃の内壁から発症するがんである。早期症状は、胸やけ、上腹部痛、悪心、及び食欲不振を含むことがある。後の徴候及び症状は、とりわけ、体重減少、黄色皮膚、嘔吐、嚥下困難、及び血便を含むことがある。がんは、胃から身体の他の部分、特に、肝臓、肺、骨、腹部の内壁、及びリンパ節に広がることがある。多くの場合発見時までに腫瘍が転移しているという事実、及び状態を有するほとんどの者が老齢である(年齢中央値は70及び75歳の間である)ことから、胃がんの予後は一般に不良である。胃がんの5年生存率は、10%未満であると報告されている。
胃がん(stomach cancer)または胃がん(gastric cancer)は、胃の内壁から発症するがんである。早期症状は、胸やけ、上腹部痛、悪心、及び食欲不振を含むことがある。後の徴候及び症状は、とりわけ、体重減少、黄色皮膚、嘔吐、嚥下困難、及び血便を含むことがある。がんは、胃から身体の他の部分、特に、肝臓、肺、骨、腹部の内壁、及びリンパ節に広がることがある。多くの場合発見時までに腫瘍が転移しているという事実、及び状態を有するほとんどの者が老齢である(年齢中央値は70及び75歳の間である)ことから、胃がんの予後は一般に不良である。胃がんの5年生存率は、10%未満であると報告されている。
最も一般的な原因は、ピロリ菌(Helicobacter pylori)による感染であり、これは症例の60%超を占める。特定のタイプのピロリ菌は、他のものよりもリスクが高い。一般的な他の原因は、野菜の漬物を食べること及び喫煙を含む。約10%の症例は、家族内で発症し、1%〜3%の症例は、遺伝性びまん性胃がんなどの、個人の両親から遺伝する遺伝的症候群に起因するものである。胃がん(stomach cancers)の大部分は、胃癌(gastric carcinoma)である。このタイプは、いくつかの亜型に分けることができる。リンパ腫及び間葉性腫瘍もまた、胃内で発症することがある。ほとんどの場合、胃がんは何年にもわたっていくつかの病期を経て発症する。診断は通常、内視鏡検査中に行われる生検による。続いて、この疾患が身体の他の部分に広がっているかどうかを判定するために、医学画像が行われる。疾患の割合が高い2カ国である日本及び韓国では、胃がんのスクリーニングを行っている。
地中海食は、禁煙と同様にがんのリスクを低下させる。ピロリ菌の処置が将来のリスクを減少させるという暫定的な証拠がある。がんが早期に処置されれば、多くの症例は治癒可能である。処置は、手術、化学療法、放射線療法、及び標的療法のいくつかの組み合わせを含んでもよい。処置が遅れた場合、緩和ケアが勧められることがある。転帰は多くの場合、不良であり、世界的には5年生存率が10%未満である。これは主に、状態を有するほとんどの者が進行した疾患を呈するためである。米国では、5年生存率は28%である一方、韓国では、部分的にはスクリーニングの努力により、65%を上回っている。
世界的には、胃がんはがんの主な原因の第5位、がんによる主な死因の第3位であり、症例の7%及び死亡の9%を占める。2012年には、950,000人に発生し、723,000人が死亡した。1930年代まで、米国及び英国を含む世界の大部分では、がんによる死亡の最も一般的な原因であった。それ以来、世界の多くの地域で死亡率が減少している。これは、食品を新鮮に保つ方法としての冷蔵庫が開発された結果として、塩漬け食品及び漬物を食べることが少なくなったためと考えられている。胃がんは、東アジア及び東ヨーロッパで最も一般的であり、男性では、女性の2倍の頻度で発生する。
胃がんは多くの場合、無症状(顕著な症状を呈しない)であるか、または初期段階において非特異的症状(胃がんだけでなく他の関連障害若しくは関連のない障害にも特異的な症状)のみを引き起こすことがある。症状が出現するまでに、がんは多くの場合、進行期に達し(以下を参照のこと)、転移する(身体の他の部分、ことによると遠方の部分に広がる)こともあり、これらは、予後が比較的不良な主な理由の1つである。早期がんは、消化不良または灼熱感(胸やけ)を伴うことがある。しかし、消化不良のために内視鏡検査を勧められた人のうちがんに罹患しているのは50人に1人未満である。腹部不快感及び特に肉に対する食欲不振が起こる可能性がある。
肥大して正常な組織を浸潤した胃がんは、衰弱、疲労、食事後の胃の膨満、上腹部の腹痛、悪心、時折の嘔吐、下痢、または便秘を引き起こす可能性がある。さらに肥大すると、体重減少または吐血を伴う出血若しくは血便を引き起こすことがあり、後者は黒色変色(下血)として現れ、貧血に至る場合がある。嚥下障害は、噴門の腫瘍または胃腫瘍の食道への拡張を示唆している。
胃がんは、多因子性疾患である。ピロリ菌感染は、胃がんの65〜80%における重要なリスク因子であるが、このような感染のわずか2%である。ピロリ菌が胃がんを誘導する機序は、慢性炎症、またはCagAなどのピロリ菌毒性因子の作用を潜在的に含む。喫煙は胃がんを発症するリスクを有意に増加させ、習慣的喫煙者でのリスクの40%増加から重度喫煙者での82%増加に及ぶ。喫煙に起因する胃がんはほとんどの場合は、主に食道の近くの胃の上部で起こる。一部の研究により、アルコール消費によるリスクの増加もまた示されている。
食事因子は証明された原因ではないが、燻製食品、塩及び塩分豊富な食品、赤身肉、加工肉、漬物、ならびにワラビを含む一部の食品が、胃がんの高リスクと関連する。保存肉の硝酸塩及び亜硝酸塩は、ピロリ菌を含む特定の細菌により、動物の胃がんを引き起こすことが判明している化合物に変換され得る。一方、新鮮な果物及び野菜の摂取、柑橘果物の摂取、ならびに抗酸化物の摂取は、胃がんリスクの低下と関連する。地中海食は、定期的なアスピリン使用と同様に、胃がんの発生率の低さとも関連する。
ヨード欠乏と胃がんとの間には相関がある。胃がんは、女性1人毎に多くとも2人の男性が罹患しているので、発生率における男性優位を示す。エストロゲンは、このがん形態の発症から女性を保護しているかもしれない。症例の約10%が、遺伝要素を示す。
人は、胃がんに対する罹患しやすさを変更し得る物理的または遺伝的な特定のリスク因子を有することがある。肥満は、胃食道逆流症(GERD)の発症に寄与することにより胃腺がんのリスクを増加させることが判明しているこのような物理的リスク因子の1つである。肥満がGERDを引き起こす正確な機序は完全には知られていない。食物脂肪の増加により、過剰な脂肪組織が胃及び下部食道括約筋への圧力増加をもたらすことが関与している可能性があると研究は仮定しているが、統計的に有意なデータは収集されていない。しかし、GERDの存在に伴う胃噴門部腺がんのリスクは、肥満者の場合、2倍を超えて増加することが判明している。胃がんの遺伝的リスク因子は、遺伝性びまん性胃がん(HDGC)として知られるCDH1遺伝子の遺伝的欠陥である。E−カドヘリンをコードするCDH1遺伝子は、16番目の染色体上にある。遺伝子が特定の変異を経験すると、十分には理解されていない機序により胃がんが発生する。この変異は、常染色体優性と考えられており、キャリアの子供の半分が同じ変異を経験する可能性が高くなることを意味する。遺伝性びまん性胃がんは通常、親または祖父母などの家族を含む少なくとも2つの症例が診断され、少なくとも1つが50歳前に診断される場合に、診断される。家族に少なくとも3つの症例がある場合に診断されることもあり、この場合、年齢は考慮されない。
国際がんゲノムコンソーシアム(The International Cancer Genome Consortium)は、胃がんに関連するゲノム変化を同定する主要な取り組みである。びまん性胃がん(以下の組織病理学を参照のこと)の非常に小さな割合は、遺伝的に異常なCDH1遺伝子から生じる。遺伝的検査及び処置の選択肢は、リスクのある家族に利用可能である。
リスク増加と関連する他の要因は、AIDS、糖尿病、悪性貧血、慢性萎縮性胃炎、メネトリエ病(肥厚性高分泌胃病)、及び腸上皮化生である。
症状の原因を見つけるために、医師は患者の病歴を尋ね、診察を行い、検査を指示することがある。胃鏡検査は、最良の診断方法である。これは、視覚化するために光ファイバーカメラを胃の中に挿入することを含む。上部GIシリーズ(バリウムX線写真と呼ばれることがある)。腹部のコンピュータ断層撮影またはCTスキャンは、胃がんを明らかにすることがあるが、隣接する組織への浸潤または局所リンパ節への広がりの存在の判定においてより有用である。限局性、偏心性、及び促進性のある1cmを超える壁の肥厚は、悪性腫瘍に好都合である。
胃鏡検査で見られる異常な組織は、外科医また消化器病医により生検されるであろう。次に、この組織は、がん性細胞の存在をチェックする顕微鏡での組織学的検査のために病理医に送られる。生検とその後の組織学的分析は、がん細胞の存在を裏付ける唯一の確実な手段である。
種々の胃鏡様式が、細胞構造を強調しかつ異形成の領域を同定することができる色素で検出される粘膜の収量を増加させるために開発されている。超拡大内視鏡は、細胞構造を視覚化して異形成の領域をより正確に決定する超高倍率法で行う。光干渉断層画像診断法などの他の胃鏡様式も、類似の用途のために試験的に試されている。
いくつかの皮膚状態は、胃がんと関連する。多くの場合、腋窩及び鼠径部の皮膚の黒ずんだ肥厚の状態は、黒色表皮腫として知られているが、胃がんなどの腹腔内がんと関連する。胃がんの他の皮膚症状は、トライプパーム(tripe palm)(手のひらの皮膚の類似の黒ずむ肥厚)及び脂漏性角化症として知られる皮膚病変の急速な発症であるレーザー・トレラー徴候を含む。貧血をチェックするための全血算(CBC)、及び血便をチェックするための潜血検査を含む種々の血液検査が実施されてもよい。
感染者のピロリ菌を除去することは、少なくともアジア人においては、胃がんのリスクを減少させる。特に健康食からの低用量のビタミンは、胃がんのリスクを減少させる。これまでのサプリメントの検討では、裏付けとなる証拠、及び潜在的に悪い転帰は見つからなかった。
胃のがんは、早期に発見されない限り(広がり始める前に)治癒するのが難しい。残念ながら、早期の胃がんはほとんど症状を生じないので、疾患は通常、診断される時には、進行している。胃がんの処置は、手術、化学療法、及び/または放射線療法を含んでもよい。生物学的療法及び現在の方法を使用する改良された手段などの新しい処置アプローチが、臨床試験において研究されている。
外科手術は、胃がんの唯一の治癒的療法である。様々な外科手術技術のうち、内視鏡的粘膜切除術(EMR)は、日本で開拓された早期胃がん(腫瘍が粘膜のみを含む)の処置であるが、米国の一部の施設でも利用可能である。この手順では、腫瘍は、内視鏡を通る電気ワイヤーループを使用して、胃(粘膜)の内壁と共に、胃壁から除去される。利点は、それが胃を除去するよりはるかに小さい手術であるということである。内視鏡的粘膜下層剥離術(ESD)は、日本で開拓された類似の技術であり、広範囲の粘膜を1つの部分として切除するために使用される。切除された標本の病理学的検査が不完全な切除または腫瘍による深い浸潤を示す場合、患者は本式の胃切除を必要とすることになる。
発症時に転移性疾患を有する者は緩和手術を受けることがある。それは依然として、手術自体の合併症の可能性及びそれが化学療法を遅らせ得るという事実から議論の余地があるが、これまでのところ、データはほとんど肯定的であり、このアプローチで処置された者に生存率の改善が見られる。
胃がんを処置する化学療法の使用には、十分確立されたケア基準がない。残念ながら、胃がんはこれらの薬物及び化学療法に対して特に感受性はなく、使用される場合、通常、腫瘍のサイズを一時的に低減させ、疾患の症状を軽減し、かつ生存時間を増加させるのに役立っている。胃がん処置に使用される一部の薬物は、5−FU(フルオロウラシル)またはそのアナログカペシタビン、BCNU(カルムスチン)、メチル−CCNU(セムスチン)、及びドキソルビシン(アドリアマイシン)、ならびにマイトマイシンC、さらに最近ではシスプラチン及びタキソテールを含んでおり、多くの場合、種々の組み合わせの薬物が使用されている。単独の及び組み合わせたこれらの様々な薬物の相対的利益は不明である。臨床研究者は、腫瘍を縮小させる手術の前に化学療法を施す利点、または手術後に残りのがん細胞を破壊するアジュバント療法としての利点を探求している。最近、トラスツズマブと呼ばれる標的処置が、腫瘍細胞にHER2遺伝子を過剰発現するがんを処置するための化学療法で使用可能になっている。
放射線療法(放射線治療とも呼ばれる)は多くの場合、化学療法及び/または外科手術のアジュバントとして、胃がんを処置するために使用されることもある。
III.モノクローナル抗体及びその産生
本明細書に記載のモノクローナル抗体を、標準的な方法を使用して調製し、続いて、スクリーニング、特性決定、及び機能評価を行った。可変領域を配列決定し、次に、ヒト発現ベクターにサブクローニングして、キメラ抗体遺伝子を生成し、次に、これを発現させ、精製した。これらのキメラ抗体を、抗原結合、シグナル伝達遮断、及び異種移植実験について試験した。
本明細書に記載のモノクローナル抗体を、標準的な方法を使用して調製し、続いて、スクリーニング、特性決定、及び機能評価を行った。可変領域を配列決定し、次に、ヒト発現ベクターにサブクローニングして、キメラ抗体遺伝子を生成し、次に、これを発現させ、精製した。これらのキメラ抗体を、抗原結合、シグナル伝達遮断、及び異種移植実験について試験した。
A.一般的な方法
LILRBに結合するモノクローナル抗体はいくつかの用途を有することが理解されるであろう。これらは、がんの検出及び診断に使用される、ならびにがん治療のための、診断キットの製造を含む。これらの状況では、このような抗体を診断剤若しくは治療剤に結合させ、それらを競合アッセイの捕捉剤若しくは競合剤として使用するか、またはそれらを、さらなる剤と結合させることなく個々に使用してもよい。抗体は、以下でさらに考察されるように、変異または修飾されてもよい。抗体の調製及び特性決定の方法は、当技術分野で周知である(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988;米国特許第4,196,265号を参照のこと)。
LILRBに結合するモノクローナル抗体はいくつかの用途を有することが理解されるであろう。これらは、がんの検出及び診断に使用される、ならびにがん治療のための、診断キットの製造を含む。これらの状況では、このような抗体を診断剤若しくは治療剤に結合させ、それらを競合アッセイの捕捉剤若しくは競合剤として使用するか、またはそれらを、さらなる剤と結合させることなく個々に使用してもよい。抗体は、以下でさらに考察されるように、変異または修飾されてもよい。抗体の調製及び特性決定の方法は、当技術分野で周知である(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988;米国特許第4,196,265号を参照のこと)。
モノクローナル抗体(mAb)を生成する方法は一般に、ポリクローナル抗体を調製するためのものと同じ方針に沿って開始する。これら両方の方法の第1段階は、適切な宿主の免疫である。当技術分野で周知のように、免疫化のための所与の組成物は、その免疫原性が異なっていてもよい。それ故、ペプチドまたはポリペプチド免疫原を担体に結合させることにより達成され得るように、多くの場合、宿主免疫系をブーストすることが必要である。例示的かつ好ましい担体は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)及びウシ血清アルブミン(BSA)である。卵白アルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンは、担体として使用することもできる。ポリペプチドを担体タンパク質にコンジュゲートさせる手段は、当該技術分野において周知であり、グルタルアルデヒド、m−マレイミドベンコイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、及びビス−ビアゾ化ベンジジンを含む。当該技術分野において周知でもあるように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られている免疫応答の非特異的刺激因子の使用により増強することができる。例示的かつ好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント(死菌結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を含有する免疫応答の非特異的刺激因子)、不完全フロイントアジュバント、及び水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原組成物の量は、免疫原の性質及び免疫化に使用される動物により異なる。免疫原を投与するための様々な経路(皮下、筋肉内、皮内、静脈内、及び腹腔内)を使用することができる。ポリクローナル抗体の産生は、免疫化後の種々の時点で、免疫された動物の血液をサンプリングすることによりモニターされてもよい。2回目のブースター注射が行われることもある。適切な力価が達成されるまで、ブースト及び力価測定のプロセスを繰り返す。所望のレベルの免疫原性が得られたら、免疫された動物を採血して、血清を単離して保存し、かつ/または動物を、mAbを生成させるために使用することができる。
免疫化の後、抗体を産生する可能性を有する体細胞、特に、Bリンパ球(B細胞)が、mAb生成プロトコールに使用するために選択される。これらの細胞は、生検した脾臓若しくはリンパ節から、または循環血液から得られてもよい。次に、免疫された動物由来の抗体産生Bリンパ球は、不死化骨髄腫細胞の細胞、一般に、免疫された動物と同じ種の1つ、またはヒト若しくはヒト/マウスのキメラ細胞と融合させる。ハイブリドーマ産生融合手順の使用に適している骨髄腫細胞株は、好ましくは非抗体産生であり、融合効率が高く、かつ、その上、所望の融合細胞(ハイブリドーマ)のみの増殖をサポートする特定の選択培地での増殖を不可能にする酵素欠損を有する。当業者に知られているように、いくつかの骨髄腫細胞の任意の1つが使用されてもよい(Goding, pp. 65−66, 1986; Campbell, pp. 75−83, 1984)。
抗体産生脾臓またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを生成するための方法は通常、体細胞を骨髄腫細胞と2:1の割合で混合することを含むが、その割合はそれぞれ、細胞膜の融合を促進する作用物質(複数可)(化学的または電気的)の存在下で、約20:1〜約1:1まで変化してもよい。センダイウイルスを使用した融合法は、Kohler及びMilsteinにより記載されており(1975;1976)、37%(v/v)PEGなどのポリエチレングリコール(PEG)を使用したものは、Gefterらにより記載されている(1977)。電気的に誘導された融合法の使用も適切である(Goding、pp.71−74,1986)。融合手順は通常、約1×10−6〜1×10−8の低頻度で生存可能なハイブリッドを産生する。しかし、選択的培地中で培養することにより、生存可能な融合ハイブリッドが親の注入細胞(特に、通常無制限に分裂し続けることになる注入骨髄腫細胞)から分化されるので、これは問題を提起しない。選択培地は一般に、組織培養培地中のヌクレオチドのデノボ合成を遮断する剤を含有するものである。例示的かつ好ましい剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、及びアザセリンである。アミノプリン及びメトトレキサートは、プリン及びピリミジンの両方のデノボ合成を遮断するが、アザセリンはプリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、培地は、ヒポキサンチン及びチミジンがヌクレオチド源として補充される(HAT培地)。アザセリンが使用される場合、培地は、ヒポキサンチンが補充される。B細胞供給源がエプスタインバーウイルス(EBV)で形質転換されたヒトB細胞株である場合、骨髄腫に融合していないEBV形質転換株を排除するために、ウワバインが添加される。
好ましい選択培地は、HATまたはウアバインを含むHATである。ヌクレオチドのサルベージ経路を機能させることができる細胞のみが、HAT培地中で生存することができる。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の重要な酵素、例えばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)に欠陥があり、それらは生き残ることができない。B細胞は、この経路を機能させることができるが、それらは培養において限られた寿命を有し、一般に約2週間以内に死亡する。それ故、選択培地で生存することができる唯一の細胞は、骨髄腫及びB細胞から形成されたこれらのハイブリッドである。融合のために使用されるB細胞の供給源が、EBV形質転換B細胞株である場合、EBV形質転換B細胞が薬物殺傷を受けやすいことから、ウアバインはハイブリッドの薬物選択にも使用され、一方、使用される骨髄腫パートナーは、ウアバイン耐性があるように選択される。
培養は、特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。通常、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中で単一クローン希釈により細胞を培養し、続いて、個々のクローン上清(約2〜3週間後)を所望の反応性について試験することにより実施される。ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドットイムノバインディングアッセイなどのように、アッセイは、感度が高く、単純で迅速であるべきである。次に、選択されたハイブリドーマは、フローサイトメトリー選別により、連続希釈または単一細胞選別され、個々の抗体産生細胞株にクローニングされ、次に、このクローンは、mAbを提供するために、無制限に増殖させることができる。細胞株は、2つの基本的な手段で、mAb産生のために利用されてもよい。ハイブリドーマのサンプルは、動物(例えば、マウス)に(多くの場合、腹腔に)注入することができる。必要に応じて、動物は、注射前に、炭化水素、特に、プリスタン(テトラメチルペンタデカン)などの油でプライミングされる。ヒトハイブリドーマが、このように使用される場合、腫瘍拒絶を防止するために、SCIDマウスなどの免疫不全マウスに注射することが最適である。注射された動物は、融合細胞ハイブリッドにより産生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。次に、血清または腹水液などの動物の体液は、高濃度のmAbを提供するために穿刺することができる。個々の細胞株は、インビトロで培養することもでき、mAbは、培地に自然に分泌され、ここから、高濃度で容易に得ることができる。あるいは、ヒトハイブリドーマ細胞株は、細胞上清中で免疫グロブリンを産生するためにインビトロで使用することができる。細胞株は、高純度のヒトモノクローナル免疫グロブリンを回収する能力を最適化するために、無血清培地中での増殖に適合させることができる。
いずれかの手段により産生されたmAbは、必要に応じて、濾過、遠心分離、及びFPLCまたはアフィニティークロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフィー法を使用して、さらに精製されてもよい。本開示のモノクローナル抗体のフラグメントは、ペプシン若しくはパパインなどの酵素による消化を含む方法により、かつ/または化学還元によるジスルフィド結合の切断により、精製モノクローナル抗体から得ることができる。あるいは、本開示に包含されるモノクローナル抗体フラグメントは、自動ペプチド合成装置を使用して合成することができる。
分子クローニングアプローチが、モノクローナルを生成するために使用され得ることも考えられる。このために、ハイブリドーマ株及びRT−PCRにより得られた抗体遺伝子からRNAを単離し、免疫グロブリン発現ベクターにクローニングすることができる。あるいは、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーは、細胞株から単離されたRNAから調製され、適切な抗体を発現するファージミドは、ウイルス抗原を使用してパンニングすることにより選択される。従来のハイブリドーマ技術に対する本アプローチの利点は、約104倍も多くの抗体を一回で産生しスクリーニングすることができること、ならびにH鎖及びL鎖の組み合わせにより、適切な抗体を見出す機会をさらに増加させる新たな特異性が生じること、である。
本開示に有用な抗体の産生を教示する、本明細書に参考として援用される他の米国特許は、コンビナトリアルアプローチを使用したキメラ抗体の産生について記載している米国特許第5,565,332号;組換え免疫グロブリン調製物について記載している米国特許第4,816,567号;抗体−治療薬コンジュゲートについて記載している米国特許第4,867,973号を含む。
B.本開示の抗体
本開示による抗体は、まず第1に、結合特異性により定義されてもよく、この場合、LILRBに対するものである。当業者に周知の技術を使用して所与の抗体の結合特異性/親和性を評価することにより、当業者は、このような抗体が本願の範囲内に含まれるかどうかを決定することができる。一態様では、図22に示される重鎖及び軽鎖由来のクローン対CDRを有するモノクローナル抗体が提供される。このような抗体は、本明細書に記載の方法を使用して、下記の実施例のセクションで考察されるクローンにより産生されてもよい。
本開示による抗体は、まず第1に、結合特異性により定義されてもよく、この場合、LILRBに対するものである。当業者に周知の技術を使用して所与の抗体の結合特異性/親和性を評価することにより、当業者は、このような抗体が本願の範囲内に含まれるかどうかを決定することができる。一態様では、図22に示される重鎖及び軽鎖由来のクローン対CDRを有するモノクローナル抗体が提供される。このような抗体は、本明細書に記載の方法を使用して、下記の実施例のセクションで考察されるクローンにより産生されてもよい。
第2の局面では、抗体は、さらなる「フレームワーク」領域を含む可変配列により定義されてもよい。これらは、完全な可変領域をコードするかまたは表す図21の配列により提供される。さらに、抗体配列は、特にCDRの外の領域において、これらの配列と異なることがある。例えば、核酸配列は、(a)可変領域が、軽鎖及び重鎖の定常ドメインから離れていることがある、(b)核酸が、それによりコードされる残基に影響を与えずに、上述されたものと異なることがある、(c)核酸が、所与の割合、例えば、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の相同性だけ、上述されたものと異なることがある、(d)核酸が、約50℃〜約70℃の温度で約0.02M〜約0.15MのNaClにより提供される低塩及び/若しくは高温条件により例示される高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイゼーションする能力により、上述されたものと異なることがある、(e)アミノ酸が、所与の割合、例えば、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の相同性だけ、上述されたものと異なることがある、または(f)アミノ酸が、(以下に考察される)保存的置換を可能にすることにより、上述されたものと異なることがある、という点で、上述されたものと異なることがある。上述のそれぞれは、図21の核酸配列またはアミノ酸配列に当てはまる。別の実施形態では、本開示の抗体誘導体は、所望の結合及び機能的特性を依然として示しながら、多くとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換を有するVL及びVHドメインを含む。
本開示の抗体はIgGとして生成されたが、機能を変えるために定常領域を修飾することは有用であることがある。抗体の定常領域は通常、30の免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)及び古典的補体系の第1の成分(C1q)を含む、抗体の宿主組織または因子への結合を媒介する。従って、用語「抗体」は、IgA型、IgG型、IgE型、IgD型、IgM型(及びそれらの亜型)のインタクトな免疫グロブリンを含み、免疫グロブリンの軽鎖は、κ型またはλ型であってよい。軽鎖及び重鎖内では、可変領域と定常領域とは、約12個以上のアミノ酸の35個の「J」領域により連結し、重鎖は、約10個以上のアミノ酸の「D」領域も含む。一般に、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)を参照のこと。
本開示は、本明細書に開示の抗体をコードする核酸にハイブリダイゼーションする核酸をさらに含む。一般に、この核酸は、中または高ストリンジェンシー条件下で、本明細書に開示される抗体をコードする核酸にハイブリダイゼーションし、LILRBに特異的に結合する能力を維持する抗体もコードする。第1の核酸分子は、温度及び溶液イオン強度の適切な条件下で、一本鎖形態の第1の核酸分子が、第2の核酸分子にアニールすることができる場合に、第2の核酸分子に「ハイブリダイゼーション可能」である(前掲のSambrookらを参照のこと)。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。代表的な中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、42℃で、5×または6×のSSC及び0.1%のSDSを含む40%のホルムアミドである。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、42℃で、または必要に応じてより高い温度(例えば、57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃、若しくは68℃)で、50%のホルムアミド、5×または6×のSSC(0.15MのNaCl及び0.015Mのクエン酸ナトリウム)である。ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的配列を含有することを必要とする。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが起こり得る。ハイブリダイゼーションする核酸の適切なストリンジェンシーは、当技術分野で周知の変数である、核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、核酸がハイブリダイゼーションし得るストリンジェンシーは高くなる。長さが100ヌクレオチドを超えるハイブリッドの場合、融解温度を計算するための式が導出されている(前掲のSambrookらを参照のこと)。より短い核酸、例えば、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(前掲のSambrookらを参照のこと)。
C.抗体配列の操作
種々の実施形態において、発現の改善、交差反応性の改善、またはオフターゲット結合の減少などの様々な理由で、同定された抗体の配列を操作することを選択してもよい。下記は、抗体操作のための関連技術の一般的考察である。
種々の実施形態において、発現の改善、交差反応性の改善、またはオフターゲット結合の減少などの様々な理由で、同定された抗体の配列を操作することを選択してもよい。下記は、抗体操作のための関連技術の一般的考察である。
ハイブリドーマを培養し、次に、細胞を溶解し、全RNAを抽出してもよい。RNAのcDNAコピーを生成するためにランダムヘキサマーをRTで使用し、次に、全てのヒト可変遺伝子配列を増幅することが予想されるPCRプライマーの多重混合物を使用して、PCRを実施してもよい。PCR産物をpGEM−T Easy vectorへクローニングし、次に、標準的なベクタープライマーを使用して、自動DNA塩基配列決定法により配列決定することができる。ハイブリドーマ上清から収集し、プロテインGカラムを使用したFPLCで精製した抗体を使用して、結合及び中和アッセイを行ってもよい。クローニングベクター由来の重鎖及び軽鎖Fv DNAをIgGプラスミドベクターにサブクローニングすることにより、組換え完全長IgG抗体を生成し、293Freestyle細胞またはCHO細胞にトランスフェクトし、293またはCHO細胞上清から抗体を収集及び精製してもよい。
最終cGMP製造プロセスと同じ宿主細胞及び細胞培養プロセスで産生される抗体の迅速な利用可能性は、プロセス開発プログラムの期間を低減する可能性を有する。Lonzaは、CHO細胞中の少量(多くとも50g)の抗体を迅速に産生するための、CDACF培地で増殖してプールされたトランスフェクタントを使用した一般的な方法を開発している。典型的な一過性系よりもわずかに遅いが、利点としては、生成物濃度が高いこと、ならびに産生宿主細胞株と同じ宿主及びプロセスを使用することが挙げられる。使い捨てバイオリアクターでモデル抗体を発現するGS−CHOプールの増殖及び産生能の例:流加モードで操作される使い捨てバッグバイオリアクター培養液(5Lの作業容量)では、トランスフェクションの9週間以内に2g/Lの収集抗体濃度が達成された。
抗体分子は、例えば、mAbまたは産生可能な一本鎖免疫グロブリンのタンパク質分解切断により、例えば組換え手段を介して産生されるフラグメント(例えば、F(ab’)、F(ab’)2)を含むであろう。このような抗体誘導体は、一価である。一実施形態では、このようなフラグメントは、「キメラ」結合分子を形成するために、互いに、または他の抗体フラグメント若しくは受容体リガンドと、組み合わせることができる。有意に、このようなキメラ分子は、同じ分子の異なるエピトープに結合することができる置換基を含有してもよい。
1.抗原結合改変
関連する実施形態では、抗体は、開示される抗体の誘導体、例えば、開示される抗体のものと同一のCDR配列を含む抗体(例えば、キメラまたはCDR移植抗体)である。あるいは、抗体分子に保存的変化を導入するなどの改変が望まれることがある。このような変更を行う際に、アミノ酸の疎水性指標が考慮され得る。相互作用的な生物学的機能をタンパク質に付与する際の疎水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野で一般に理解されている(Kyte及びDoolittle、1982)。アミノ酸の相対的な疎水性の特徴は、得られたタンパク質の二次構造に寄与し、それにより、タンパク質の他の分子、例えば酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を決定することが認められている。
関連する実施形態では、抗体は、開示される抗体の誘導体、例えば、開示される抗体のものと同一のCDR配列を含む抗体(例えば、キメラまたはCDR移植抗体)である。あるいは、抗体分子に保存的変化を導入するなどの改変が望まれることがある。このような変更を行う際に、アミノ酸の疎水性指標が考慮され得る。相互作用的な生物学的機能をタンパク質に付与する際の疎水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野で一般に理解されている(Kyte及びDoolittle、1982)。アミノ酸の相対的な疎水性の特徴は、得られたタンパク質の二次構造に寄与し、それにより、タンパク質の他の分子、例えば酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を決定することが認められている。
類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができることも当該技術分野で理解されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,554,101号は、隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関することを述べている。米国特許第4,554,101号に記載されるように、下記の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている。塩基性アミノ酸:アルギニン(+3.0)、リシン(+3.0)、及びヒスチジン(−0.5);酸性アミノ酸:アスパルテート(+3.0±1)、グルタメート(+3.0±1)、アスパラギン(+0.2)、及びグルタミン(+0.2);親水性非イオン性アミノ酸:セリン(+0.3)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、及びスレオニン(−0.4);硫黄含有アミノ酸:システイン(−1.0)、及びメチオニン(−1.3);疎水性非芳香族アミノ酸:バリン(−1.5)、ロイシン(−1.8)、イソロイシン(−1.8)、プロリン(−0.5±1)、アラニン(−0.5)、及びグリシン(0);疎水性芳香族アミノ酸:トリプトファン(−3.4)、フェニルアラニン(−2.5)、及びチロシン(−2.3)。
アミノ酸は、類似した親水性を有する別のものに置き換えられて、生物学的または免疫学的に改変されたタンパク質を産生することができると理解されている。このような変化では、親水性値が±2以内のアミノ酸の置換が好ましく、±1以内のものが特に好ましく、±0.5以内のものがさらに好ましい。
上で概説したように、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。種々の上述の特徴を考慮に入れた例示的な置換は、当業者に周知であり、アルギニン及びリシン;グルタメート及びアスパルテート;セリン及びスレオニン;グルタミン及びアスパラギン;ならびにバリン、ロイシン、及びイソロイシンを含む。
本開示は、アイソタイプ改変も意図する。異なるアイソタイプを有するようにFc領域を改変することにより、異なる機能性を達成することができる。例えば、IgG1への変化は、抗体依存性細胞傷害性を増加させることができ、クラスAへのスイッチングは、組織分布を改善することができ、クラスMへのスイッチングは結合価を改善することができる。
改変された抗体は、標準的な分子生物学的技術による発現またはポリペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技術により作製されてもよい。組換え発現のための方法は、本明細書の他の場所で言及される。
2.Fc領域の改変
本明細書に開示の抗体は、通常は、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、及び/またはエフェクター機能(例えば、抗原依存性細胞傷害性)などの、抗体の1つ以上の機能的特性を変更するように、Fc領域内に改変を含むよう操作することもできる。さらに、本明細書に開示の抗体は、ここでもまた抗体の1つ以上の機能的特性を変更するように、化学的に改変することができ(例えば、1つ以上の化学的部分が抗体に結合することができ)、またはグリコシル化を変更するよう改変することができる。これらの実施形態のそれぞれは、以下でさらに詳細に記載されている。Fc領域の残基の番号付けは、KabatのEUインデックスのものである。本明細書に開示の抗体は、変更されたエフェクター機能を提供するための改変(または遮断)Fc領域を有する抗体も含む。例えば、米国特許第5,624,821号;WO2003/086310;WO2005/120571;WO2006/0057702を参照のこと。このような改変は、可能な診断及び治療に有益な効果のある免疫系の種々の反応を増強または抑制するために使用することができる。Fc領域の改変は、アミノ酸変化(置換、欠失、及び挿入)、グリコシル化または脱グリコシル化、及び複数のFcの付加を含む。Fcに対する変化は、治療抗体の抗体半減期を変更して、低頻度の投与、それによる利便性の増加、及び材料の使用の減少を可能にすることもできる。この変異は、ヒンジ領域の重鎖間ジスルフィド架橋の不均一性を消滅させることが報告されている。
本明細書に開示の抗体は、通常は、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、及び/またはエフェクター機能(例えば、抗原依存性細胞傷害性)などの、抗体の1つ以上の機能的特性を変更するように、Fc領域内に改変を含むよう操作することもできる。さらに、本明細書に開示の抗体は、ここでもまた抗体の1つ以上の機能的特性を変更するように、化学的に改変することができ(例えば、1つ以上の化学的部分が抗体に結合することができ)、またはグリコシル化を変更するよう改変することができる。これらの実施形態のそれぞれは、以下でさらに詳細に記載されている。Fc領域の残基の番号付けは、KabatのEUインデックスのものである。本明細書に開示の抗体は、変更されたエフェクター機能を提供するための改変(または遮断)Fc領域を有する抗体も含む。例えば、米国特許第5,624,821号;WO2003/086310;WO2005/120571;WO2006/0057702を参照のこと。このような改変は、可能な診断及び治療に有益な効果のある免疫系の種々の反応を増強または抑制するために使用することができる。Fc領域の改変は、アミノ酸変化(置換、欠失、及び挿入)、グリコシル化または脱グリコシル化、及び複数のFcの付加を含む。Fcに対する変化は、治療抗体の抗体半減期を変更して、低頻度の投与、それによる利便性の増加、及び材料の使用の減少を可能にすることもできる。この変異は、ヒンジ領域の重鎖間ジスルフィド架橋の不均一性を消滅させることが報告されている。
一実施形態では、CH1のヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基数が増加または減少するように改変される。このアプローチは、米国特許第5,677,425号にさらに記載されている。CH1のヒンジ領域のシステイン残基数は、例えば、軽鎖及び重鎖のアセンブリを容易にするように、または抗体の安定性を増加若しくは減少させるように変更される。別の実施形態では、抗体は、生物学的半減期を増加させるように改変される。種々のアプローチが可能である。例えば、米国特許第6,277,375号に記載されているような下記の変異:T252L、T254S、T256Fのうち1つ以上を導入することができる。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、米国特許第5,869,046号及び同第6,121,022号に記載されているように、CH1またはCL領域内に、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから取り込まれたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように変更することができる。さらに他の実施形態では、Fc領域は、抗体のエフェクター機能(複数可)を変更するために、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより変更される。例えば、アミノ酸残基234、235、236、237、297、318,、320、及び322から選択される1つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する親和性の変更を有するように、異なるアミノ酸残基で置換することができるが、親抗体の抗原結合能力を保持する。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1構成要素とすることができる。このアプローチは、米国特許第5,624,821号及び同第5,648,260号にさらに詳細に記載されている。
別の例では、アミノ酸231位及び239位のうちの1つ以上のアミノ酸残基が改変され、それにより、抗体が補体を結合する能力を変更する。このアプローチは、PCT国際公開特許WO94/29351にさらに記載されている。さらに別の例において、Fc領域は、以下:238位、239位、243位、248位、249位、252位、254位、255位、256位、258位、264位、265位、267位、268位、269位、270位、272位、276位、278位、280位、283位、285位、286位、289位、290位、292位、293位、294位、295位、296位、298位、301位、303位、305位、307位、309位、312位、315位、320位、322位、324位、326位、327位、329位、330位、331位、333位、334位、335位、337位、338位、340位、360位、373位、376位、378位、382位、388位、389位、398位、414位、416位、419位、430位、434位、435位、437位、438位、または439位での1つ以上のアミノ酸を改変することにより、抗体が抗体依存性細胞傷害能力(ADCC)を媒介する能力を増加若しくは減少させるように、かつ/または抗体のFcγ受容体に対する親和性を増加若しくは減少させるように、改変されている。このアプローチは、PCT国際公開特許WO00/42072にさらに記載されている。さらに、FcγR1、FcγRII、FcγRIII、及びFcRnについてのヒトIgG1上の結合部位がマッピングされており、改善された結合を有するバリアントが記載されている。256位、290位、298位、333位、334位、及び339位における特定の変異は、FcγRIIIへの結合を改善することが示された。さらに、以下の組み合わせ変異体は、FcγRIII結合を改善することが示された:T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A、及びS298A/E333A/K334A。
一実施形態では、Fc領域は、残基243及び264を改変することにより、抗体のエフェクター機能を媒介する能力を減少させるように、かつ/または抗炎症特性を増加させるように、改変される。一実施形態では、抗体のFc領域は、243位及び264位の残基をアラニンに変えることにより改変される。一実施形態では、Fc領域は、残基243、264、267、及び328を改変することにより、抗体のエフェクター機能を媒介する能力を減少させるように、かつ/または抗炎症特性を増加させるように、改変される。さらに別の実施形態では、抗体は、特定のグリコシル化パターンを含む。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる(すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く)。抗体のグリコシル化パターンは、例えば、抗体の抗原に対する親和性または結合活性を増加させるように変更されてもよい。このような改変は、例えば、抗体配列内の1つ以上のグリコシル化部位を変更することにより達成することができる。例えば、可変領域フレームワークグリコシル化部位の1つ以上の除去をもたらし、それによりその部位でのグリコシル化を排除する1つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化は、抗体の抗原に対する親和性または結合活性を増加させ得る。例えば、米国特許第5,714,350号及び同第6,350,861号を参照のこと。
低フコシル化されたまたはアフコシル化されたグリカンがグリコシル化パターンに含まれる抗体が作製されてもよく、例えば、低フコシル化抗体またはアフコシル化抗体は、グリカン上のフコシル残基の量を低減させている。抗体は、バイセクティングGlcNAc構造の量が増加したグリカンを含んでもよい。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を増加させることが実証されている。このような改変は、例えば、特定のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するようグリコシル化経路が遺伝子操作された宿主細胞中で抗体を発現させることにより、達成することができる。これらの細胞は、当技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現しそれにより変更されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞株Ms704、Ms705、及びMs709は、Ms704、Ms705、及びMs709細胞株で発現される抗体がその糖質上にフコースを欠くように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8(α(1,6)−フコシルトランスフェラーゼ)を欠損している。Ms704、Ms705、及びMs709 FUT8−/−細胞株は、2つの置換ベクターを使用して、CHO/DG44細胞におけるFUT8遺伝子の標的化破壊により作製された(米国特許公開第20040110704号を参照のこと)。別の例として、EP1176195は、フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が機能的に破壊された細胞株について記載しており、このような細胞株に発現された抗体は、α−1,6結合関連酵素を低減または排除することにより低フコシル化を示す。EP1176195は、抗体のFc領域に結合するN−アセチルグルコサミンにフコースを付加するための酵素活性が低いかまたは当該酵素活性を有さない細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)も記載している。PCT国際公開特許WO03/035835は、フコースをAsn(297)結合糖質に結合させる能力が低減したバリアントCHO細胞株であるLec13細胞について記載しており、その宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化をもたらすことについても記載している。改変されたグリコシル化プロフィールを有する抗体は、PCT国際公開特許WO06/089231に記載されているように、ニワトリ卵で産生することもできる。あるいは、改変されたグリコシル化プロフィールを有する抗体は、ウキクサなどの植物細胞で産生することができる(米国特許第7,632,983号)。植物系で抗体を産生するための方法は、米国特許第6,998,267号及び同第7,388,081号に開示されている。PCT国際公開特許WO99/54342は、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ(例えばβ(1,4)−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))を発現するように操作された細胞株について記載しており、操作された細胞株で発現された抗体は、抗体のADCC活性の増加をもたらすバイセクティングGlcNac構造を示す。
あるいは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断することができる:例えば、フコシダーゼであるα−L−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する。本明細書に開示の抗体は、哺乳動物様またはヒト様グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている下等真核生物宿主細胞、特に、酵母及び糸状菌などの真菌宿主細胞、で産生されたものをさらに含む。現在使用されている哺乳動物細胞株を超えるこれらの遺伝子改変宿主細胞の特別な利点は、細胞内で産生される糖タンパク質のグリコシル化プロフィールをコントロールする能力であり、特定のN−グリカン構造が優勢である糖タンパク質の組成物を産生することができる(例えば、米国特許第7,029,872号及び同第7,449,308号を参照のこと)。これらの遺伝子改変宿主細胞は、特定のN−グリカン構造を優勢に有する抗体を産生するために使用されている。
加えて、酵母または糸状菌などの真菌はフコシル化糖タンパク質を産生する能力を欠損しているので、このような細胞で産生される抗体は、細胞がフコシル化糖タンパク質を産生するための酵素経路を含むようにさらに改変されない限り、フコースを欠くであろう(例えば、PCT公開WO2008112092を参照のこと)。特定の実施形態では、本明細書に開示の抗体は、下等真核生物宿主細胞中で産生され、かつフコシル化及び非フコシル化ハイブリッド及び複合型N−グリカンを含むものをさらに含み、これらは、GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2;Gal(1−4)GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2;NANA(1−4)Gal(1−4)GlcNAc(1−4)Man3GlcNAc2などのN−グリカンを含むがこれらに限定されないバイセクティング及びマルチアンテナ種を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体組成物は、GlcNAcMan5GlcNAc2;GalGlcNAcMan5GlcNAc2;及びNANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2からなる群から選択される少なくとも1つのハイブリッド型N−グリカンを有する抗体を含んでもよい。特定の態様では、ハイブリッド型N−グリカンは、組成物中で優勢なN−グリカン種である。さらなる態様では、ハイブリッド型N−グリカンは、組成物中に約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%のハイブリッド型N−グリカンを含有する特定のN−グリカン種である。
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体組成物は、GlcNAcMan3GlcNAc2;GalGlcNAcMan3GlcNAc2;NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2;GlcNAc2Man3GlcNAc2;GalGlcNAc2Man3GlcNAc2;Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2;NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2;及びNANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2からなる群から選択される少なくとも1つの複合型N−グリカンを有する抗体を含む。特定の態様では、複合型N−グリカンは、組成物中で優勢なN−グリカン種である。さらなる態様では、複合型N−グリカンは、組成物中に約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%の複合型N−グリカンを含有する特定のN−グリカン種である。特定の実施形態では、N−グリカンは、フコシル化される。一般に、フコースは、N−グリカンの還元末端のGlcNAcとα1,3−結合しており、N−グリカンの還元末端のGlcNAcとα1,6−結合しており、N−グリカンの非還元末端のGalとα1,2−結合しており、N−グリカンの非還元末端のGlcNacとα1,3−結合しており、またはN−グリカンの非還元末端のGlcNAcとα1,4−結合している。
それ故、上記糖タンパク質組成物の特定の態様では、グリコフォームは、Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、及びNANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)からなる群から選択されるグリコフォームを生成するα1,3−結合若しくはα1,6−結合フコースであり、GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1−2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1−2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1−2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1−2)Man3GlcNAc2、及びNANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1−2)Man3GlcNAc2からなる群から選択されるグリコフォームを生成するα1,3−結合若しくはα1,4−結合フコースであり、またはGal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1−2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1−2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、及びNANA2Gal2(Fuc1−2)GlcNAc2Man3GlcNAc2からなる群から選択されるグリコフォームを生成するα1,2結合フコースである。
さらなる態様では、抗体は、Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2、またはMan3GlcNAc2 N−グリカン構造からなるN−グリカンを含むがこれらに限定されない高マンノースN−グリカンを含む。さらなる態様では、複合型N−グリカンは、フコシル化及び非フコシル化バイセクティング及びマルチアンテナ種をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「N−グリカン」及び「グリコフォーム」は、同じ意味で使用され、N−結合型オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Nアセチルグルコサミン結合により結合するものを指す。N−結合型糖タンパク質は、タンパク質のアスパラギン残基のアミド窒素と結合したN−アセチルグルコサミン残基を含有する。
D.一本鎖抗体
一本鎖可変フラグメント(scFv)は、短い(通常は、セリン、グリシン)リンカーにより結合した免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の融合体である。このキメラ分子は、定常領域の除去及びリンカーペプチドの導入にも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。この改変は通常、特異性を変更しないまま維持する。これらの分子は、単一のペプチドとして抗原結合ドメインを発現することが非常に好都合であるファージディスプレイを容易にするために、歴史上作製された。あるいは、scFvは、ハイブリドーマに由来するサブクローニングされた重鎖及び軽鎖から直接作製することができる。一本鎖可変フラグメントは、完全抗体分子に見られる定常Fc領域、及び従って、抗体を精製するために使用される共通の結合部位(例えばプロテインA/G)がない。プロテインLが、κ軽鎖の可変領域と相互作用するので、これらのフラグメントは多くの場合、プロテインLを使用して精製/固定化することができる。
一本鎖可変フラグメント(scFv)は、短い(通常は、セリン、グリシン)リンカーにより結合した免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の融合体である。このキメラ分子は、定常領域の除去及びリンカーペプチドの導入にも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。この改変は通常、特異性を変更しないまま維持する。これらの分子は、単一のペプチドとして抗原結合ドメインを発現することが非常に好都合であるファージディスプレイを容易にするために、歴史上作製された。あるいは、scFvは、ハイブリドーマに由来するサブクローニングされた重鎖及び軽鎖から直接作製することができる。一本鎖可変フラグメントは、完全抗体分子に見られる定常Fc領域、及び従って、抗体を精製するために使用される共通の結合部位(例えばプロテインA/G)がない。プロテインLが、κ軽鎖の可変領域と相互作用するので、これらのフラグメントは多くの場合、プロテインLを使用して精製/固定化することができる。
フレキシブルリンカーは一般に、アライン、セリン、及びグリシンなどのヘリックスを形成しやすいアミノ酸残基及びターンを形成しやすいアミノ酸残基からなる。しかし、他の残基も同様に機能することができる。一本鎖抗体(scFv)に適合したリンカーをタンパク質リンカーライブラリーから迅速に選択する手段として、Tangら(1996)は、ファージディスプレイを使用した。重鎖及び軽鎖可変ドメインの遺伝子が様々な組成の18アミノ酸ポリペプチドをコードするセグメントにより結合したランダムリンカーライブラリーが構築された。scFvのレパートリー(約5×106の異なるメンバー)は、繊維状ファージ上に提示され、ハプテンによる親和性選択を受けた。選択されたバリアントの集団は、結合活性の有意な増加を示したが、かなりの配列多様性を保持した。その後、1054個の個々のバリアントをスクリーニングすることにより、可溶性形態で効率的に産生された、触媒的に活性なscFvを得た。選択された範囲の唯一の共通の特徴として、VHのC末端の2残基後のリンカーの保存されたプロリン及び他の位置のアルギニン及びプロリンが豊富であることが、配列解析により明らかになった。
本開示の組換え抗体は、受容体の二量体化または多量体化を可能にする配列または部分を含んでもよい。このような配列は、J鎖と共に多量体の形成を可能にするIgAに由来するものを含む。別の多量体化ドメインは、Gal4二量体化ドメインである。他の実施形態では、鎖は、2つの抗体の組み合わせを可能にするビオチン/アビジンなどの作用物質で修飾されてもよい。
別の実施形態では、一本鎖抗体は、非ペプチドリンカーまたは化学単位を使用して受容体軽鎖及び重鎖を連結させることにより作製することができる。一般に、軽鎖及び重鎖は、異なる細胞で産生され、精製され、続いて、適切な様式で一緒に結合する(すなわち、重鎖のN末端は、適切な化学架橋を介して軽鎖のC末端に結合する)であろう。
架橋試薬は、2つの異なる分子、例えば、安定化剤及び凝固剤、の官能基を連結する分子架橋を形成するために使用される。しかし、同じアナログまたは異なるアナログからなるヘテロマー複合体の二量体または多量体を作製することができると考えられる。2つの異なる化合物を段階的に結合するために、望ましくないホモポリマーの形成を排除するヘテロ二官能性クロスリンカーを使用することができる。
例示的なヘテロ二官能性クロスリンカーは、2つの反応性基:一級アミン基(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミド)と反応するものと、チオール基(例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど)と反応するもう1つのもの、を含有する。一級アミン反応性基を介して、クロスリンカーは、1つのタンパク質(例えば、選択された抗体またはフラグメント)のリシン残基(複数可)と反応してもよく、チオール反応性基を介して、第1のタンパク質に既に連結しているクロスリンカーは、もう1つのタンパク質(例えば、選択剤)のシステイン残基(遊離スルフヒドリル基)と反応する。
血液中で妥当な安定性を有するクロスリンカーが用いられることが好ましい。多数のタイプのジスルフィド結合含有リンカーが知られており、これは標的化剤及び治療/予防剤をコンジュゲートするために効率よく用いることができる。立体障害のあるジスルフィド結合を含有するリンカーは、インビボでより大きな安定性を与え、作用部位に到達する前に標的ペプチドの放出を防止することが証明されていてもよい。従って、これらのリンカーは、一群の連結剤である。
別の架橋試薬は、隣接するベンゼン環及びメチル基により「立体障害のある」ジスルフィド結合を含有する二官能性クロスリンカーであるSMPTである。ジスルフィド結合の立体障害は、組織及び血液中に存在することができるグルタチオンなどのチオレートアニオンによる攻撃から結合を保護する機能を果たし、それにより、結合した剤を標的部位に送達する前に、コンジュゲートがデカップリングするのを防止するのに役立つと考えられている。
他の多くの既知の架橋試薬と同様に、SMPT架橋試薬は、システインまたは一級アミンのSHなどの官能基(例えば、リシンのイプシロンアミノ基)を架橋する能力を付与する。別の可能なタイプのクロスリンカーは、スルホスクシンイミジル−2−(p−アジドサリチルアミド)エチル−1,3’−ジチオプロピオナートなどの切断可能なジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドを含む。N−ヒドロキシスクシニミジル基は、一級アミノ基と反応し、(光分解時の)フェニルアジドは、任意のアミノ酸残基と非選択的に反応する。
障害のあるクロスリンカーに加えて、障害のないリンカーも本明細書に従って用いることができる。保護されたジスルフィドを含有または生成すると考えられていない他の有用なクロスリンカーとしては、SATA、SPDP、及び2−イミノチオランが挙げられる(Wawrzynczak&Thorpe、1987)。このようなクロスリンカーの使用は、当技術分野において十分に理解されている。別の実施形態は、フレキシブルなリンカーの使用を含む。
米国特許第4,680,338号は、特に、キレート化剤、薬物、酵素、検出可能な標識との抗体コンジュゲートを形成するための、アミン含有ポリマー及び/またはタンパク質とのリガンドのコンジュゲートの製造に有用な二官能性リンカーについて記載する。米国特許第5,141,648号及び同第5,563,250号は、様々な温和な条件下で切断可能な不安定な結合を含有する切断可能なコンジュゲートについて開示している。このリンカーは、目的の剤がリンカーに直接結合し、切断が活性薬剤の放出をもたらし得る点で、特に有用である。特定の使用は、遊離アミノまたは遊離スルフヒドリル基を、抗体などのタンパク質または薬物に添加することを含む。
米国特許第5,856,456号は、融合タンパク質、例えば一本鎖抗体、を作製するためにポリペプチド成分を連結させることに使用されるペプチドリンカーを提供する。リンカーは、長さが多くとも約50個のアミノ酸であり、荷電アミノ酸(好ましくはアルギニンまたはリシン)の少なくとも1つの存在とそれに続くプロリンを含有し、高い安定性及び凝集の低減を特徴とする。米国特許第5,880,270号は、様々な免疫診断及び分離技術に有用なアミノオキシ含有リンカーについて開示している。
E.精製
特定の実施形態では、本開示の抗体は精製されてもよい。本明細書で使用される用語「精製された」は、他の構成成分から単離可能な組成物を指すものであり、タンパク質は、その自然に得られる状態と比較して任意の程度まで精製される。それ故、精製されたタンパク質は、天然に存在し得る環境がないタンパク質も指す。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この指定は、タンパク質またはペプチドが、組成物の主要構成成分を形成する、例えば組成物中のタンパク質の約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%またはそれ以上を構成する、組成物を指すであろう。
特定の実施形態では、本開示の抗体は精製されてもよい。本明細書で使用される用語「精製された」は、他の構成成分から単離可能な組成物を指すものであり、タンパク質は、その自然に得られる状態と比較して任意の程度まで精製される。それ故、精製されたタンパク質は、天然に存在し得る環境がないタンパク質も指す。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この指定は、タンパク質またはペプチドが、組成物の主要構成成分を形成する、例えば組成物中のタンパク質の約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%またはそれ以上を構成する、組成物を指すであろう。
タンパク質精製技術は、当業者に周知である。これらの技術は、あるレベルでは、細胞環境からポリペプチド及び非ポリペプチド画分への粗分画を含む。ポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、目的のポリペプチドを、部分的または完全な精製(若しくは均一になるまでの精製)を達成するために、クロマトグラフィー及び電気泳動技術を使用してさらに精製してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適する分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動;等電点電気泳動である。タンパク質精製のための他の方法は、硫酸アンモニウム、PEG、抗体などによるまたは熱変性による沈殿と、それに続く遠心分離;ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィー;ならびにこのような技術及び他の技術の組み合わせを含む。
本開示の抗体を精製する際に、原核または真核発現系にポリペプチドを発現させ、変性条件を使用してタンパク質を抽出することは、望ましいことがある。ポリペプチドは、ポリペプチドのタグ付き部分に結合するアフィニティーカラムを使用して、他の細胞成分から精製されてもよい。当技術分野で一般に知られているように、種々の精製段階を行う順序は変更されてもよく、または特定の段階が省略されてもよいと考えられており、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製するための好適な方法を依然としてもたらす。
一般に、完全抗体は、抗体のFc部分に結合する作用物質(すなわち、プロテインA)を利用して分画される。あるいは、抗原は、適切な抗体を同時に精製及び選択するために使用されてもよい。このような方法は多くの場合、カラム、フィルター、またはビーズなどの支持体に結合した選択剤を利用する。抗体は、支持体に結合し、不純物は除去され(例えば洗い流され)、抗体は、条件(塩、熱など)を適用することにより放出される。
タンパク質またはペプチドの精製度を定量化するための種々の方法は、本開示に照らして当業者に知られているであろう。これらは、例えば、活性画分の比活性度を測定すること、またはSDS/PAGE分析により画分中のポリペプチドの量を評価することを含む。画分の純度を評価するための別の方法は、画分の比活性度を計算すること、それを最初の画分の比活性度と比較すること、及びそれにより純度を計算することである。活性の量を表すために使用される実際の単位は当然、精製に引き続いて選択された具体的なアッセイ技術、及び発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに依存するであろう。
ポリペプチドの移動は、SDS/PAGEの異なる条件により、場合によっては著しく、変動する可能性があることが知られている(Capaldiら、1977)。それ故、異なる電気泳動条件下では、精製されたまたは部分的に精製された発現産物の見かけの分子量は、変動することがあると理解されるであろう。
IV.がんの処置
A.製剤化及び投与
本開示は、抗LILRB抗体及びそれを生成するための抗原を含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、予防的または治療的有効量の抗体またはそのフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む。具体的な実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の規制機関により承認されており、または米国薬局方若しくは動物、より詳細には、ヒトに使用されるための他に一般に認められている薬局方において記載されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬が共に投与される希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような薬学的担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油由来のもの、動物由来のもの、植物由来のもの、または合成由来のものを含む水及び油などの滅菌液体とすることができる。医薬組成物が静脈内投与される場合、水は特定の担体である。生理食塩水ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液も、特に注射用溶液のための液体担体として、用いることができる。他の好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
A.製剤化及び投与
本開示は、抗LILRB抗体及びそれを生成するための抗原を含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、予防的または治療的有効量の抗体またはそのフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む。具体的な実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の規制機関により承認されており、または米国薬局方若しくは動物、より詳細には、ヒトに使用されるための他に一般に認められている薬局方において記載されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬が共に投与される希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような薬学的担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油由来のもの、動物由来のもの、植物由来のもの、または合成由来のものを含む水及び油などの滅菌液体とすることができる。医薬組成物が静脈内投与される場合、水は特定の担体である。生理食塩水ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液も、特に注射用溶液のための液体担体として、用いることができる。他の好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、またはpH緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。好適な医薬品の例は、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、適量の担体と共に、好ましくは、精製された形態の、予防的または治療的有効量の抗体またはそのフラグメントを含有するであろう。製剤は、経口投与、静脈内投与、動脈内投与、口腔内投与、鼻腔内投与、噴霧投与、気管支吸入、または人工呼吸器による送達とすることができる投与方式に適合すべきである。
本明細書に記載される本開示の抗体は、非経口投与のために製剤化することができ、例えば、皮内、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、またはさらに腹腔内経路を介する注射用に製剤化することができる。あるいは、抗体は、粘膜への局所経路により、例えば、点鼻薬、吸入剤により、またはネブライザーにより、投与することができる。薬学的に許容される塩は、酸性塩、及び例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導されることもある。
人工的に獲得された受動免疫として知られる抗体の受身伝達は、一般に、静脈内注射の使用を含むであろう。抗体の形態は、静脈内(IVIG)または筋肉内(IG)使用のためのプールされたヒト免疫グロブリンとしての、免疫化されたドナーまたは疾患から回復したドナー由来の高力価のヒトIVIGまたはIGとしての、及びモノクローナル抗体(mAb)としての、ヒトまたは動物の血漿または血清であることができる。このような免疫は一般に、短期間しか持続せず、過敏反応、及び血清病、特に、非ヒト由来のガンマグロブリンによるもの、に対する潜在的なリスクもある。しかし、受動免疫は、迅速な防御を提供する。抗体は、注射に適する担体、すなわち滅菌され注射可能な担体、の中に製剤化される。
一般には、本開示の組成物の成分は、別個にまたは単位剤形中に共に混合されるかのいずれかで、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中の乾燥した凍結乾燥散剤または水不含濃縮物として、供給される。組成物が注入により投与されることになる場合、それは滅菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する点滴ボトルで投薬することができる。組成物が注射により投与される場合、投与前に成分を混合できるように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
本開示の組成物は、中性または塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される、アニオンと形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される、カチオンと形成される塩、を含む。
B.併用療法
本開示の抗体をさらなる抗がん療法と共に使用する併用処置を提供することが望ましいこともある。これらの療法は、1つ以上の疾患パラメータの低減を達成するのに有効な合計量で提供されるであろう。このプロセスは、例えば、両方の剤を含む単一の組成物若しくは薬理学的製剤を使用して、または細胞/対象を2つの異なる組成物若しくは製剤に同時に接触させることにより、細胞/対象を両方の剤/療法に同時に接触させることを含んでもよく、ここで、1つの組成物は抗体を含み、残りの組成物は他の剤を含む。
本開示の抗体をさらなる抗がん療法と共に使用する併用処置を提供することが望ましいこともある。これらの療法は、1つ以上の疾患パラメータの低減を達成するのに有効な合計量で提供されるであろう。このプロセスは、例えば、両方の剤を含む単一の組成物若しくは薬理学的製剤を使用して、または細胞/対象を2つの異なる組成物若しくは製剤に同時に接触させることにより、細胞/対象を両方の剤/療法に同時に接触させることを含んでもよく、ここで、1つの組成物は抗体を含み、残りの組成物は他の剤を含む。
あるいは、抗体は、数分から数週間の範囲の間隔で他の処置に先行するか、またはそれに後続してもよい。一般に、治療が細胞/対象に有利な複合効果を発揮し続けることができるように、各送達時の間に長い時間が過ぎないようにするであろう。このような場合、互いに約12〜24時間以内に、互いに約6〜12時間以内に、または遅延時間わずか約12時間で、細胞を両方のモダリティに接触させることになると考えられる。一部の状況では、処置期間を大幅に延ばすことが望ましいことがあるが、それぞれの投与の間に、数十日(2、3、4、5、6、または7)〜数週間(1、2、3、4、5、6、7または8)が経過する。
他の組み合わせが企図される。本発明の方法及び組成物を使用して、細胞を死滅させ、細胞増殖を阻害し、転移を阻害し、血管形成を阻害し、あるいは腫瘍細胞の悪性表現型を好転若しくは低減させるために、標的細胞または部位を抗体及び他の少なくとも1つの療法と接触させてもよい。これらの療法は、がん細胞を死滅させ、またはそれらの増殖を阻害するのに有効な合計量で提供されるであろう。このプロセスは、細胞/部位/対象を、複数の剤/療法と同時に接触させることを含むことがある。
本開示の抗体との併用療法のために企図される特定の剤は、化学療法及び造血幹細胞移植を含む。化学療法は、シタラビン(ara−C)及びアントラサイクリン(ほとんどの場合、ダウノルビシン)、高用量シタラビン単独、導入化学療法に加えたオールトランスレチノイン酸(ATRA)、通常は地固め療法の完了後のアントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩(Ceplene)、及びインターロイキン2(Proleukin)、高用量化学療法の候補者ではない再発性AMLを有する60歳を超える年齢の患者に対するゲムツズマブオゾガマイシン(Mylotarg)、クロファラビン、ならびにキナーゼ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、及びMDR1(多剤耐性タンパク質)の阻害剤などの標的療法、または再発性急性前骨髄球性白血病(APL)に対する三酸化ヒ素を含んでもよい。
V.抗体コンジュゲート
本開示の抗体は、抗体コンジュゲートを形成するために少なくとも1つの剤に結合させてもよい。診断剤または治療剤としての抗体分子の有効性を増加させるために、少なくとも1つの所望の分子または部分を結合させ、または共有結合させ、または複合体を形成させることが通常である。このような分子または部分は、少なくとも1つのエフェクター分子またはレポーター分子であってよいが、これに限定されない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に結合しているエフェクター分子の非限定的な例としては、毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、放射性核種、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、成長因子、及びオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが挙げられる。一方、レポーター分子は、アッセイを使用して検出され得る任意の部分として定義される。抗体にコンジュゲートされているレポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、燐光分子、化学発光分子、発色団、光親和性分子、着色粒子またはリガンド、例えばビオチンが挙げられる。
本開示の抗体は、抗体コンジュゲートを形成するために少なくとも1つの剤に結合させてもよい。診断剤または治療剤としての抗体分子の有効性を増加させるために、少なくとも1つの所望の分子または部分を結合させ、または共有結合させ、または複合体を形成させることが通常である。このような分子または部分は、少なくとも1つのエフェクター分子またはレポーター分子であってよいが、これに限定されない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に結合しているエフェクター分子の非限定的な例としては、毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、放射性核種、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、成長因子、及びオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが挙げられる。一方、レポーター分子は、アッセイを使用して検出され得る任意の部分として定義される。抗体にコンジュゲートされているレポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、燐光分子、化学発光分子、発色団、光親和性分子、着色粒子またはリガンド、例えばビオチンが挙げられる。
抗体コンジュゲートは、診断剤としての使用が一般には好ましい。抗体診断は一般に、様々なイムノアッセイのようなインビトロ診断で使用されるもの、及び「抗体指向性イメージング」として一般に知られているインビボ診断プロトコールに使用されるものの2つのクラスに含まれる。抗体への結合のための方法(例えば、米国特許第5,021,236号、同第4,938,948号、及び同第4,472,509号を参照のこと)のように、多くの適切な造影剤が当該分野で既知である。使用されるイメージング部分は、常磁性イオン、放射性同位体、蛍光色素、NMR検出可能物質、及びX線造影剤とすることができる。
常磁性イオンの場合、例として、クロム(III)、マンガン(II)、鉄(III)、鉄(II)、コバルト(II)、ニッケル(II)、銅(II)、ネオジム(III)、サマリウム(III)、イッテルビウム(III)、ガドリニウム(III)、バナジウム(II)、テルビウム(III)、ジスプロシウム(III)、ホルミウム(III)、及び/またはエルビウム(III)などのイオンを挙げてもよく、ガドリニウムが特に好ましい。X線イメージングなどの他の状況で有用なイオンとしては、ランタニウム(III)、金(III)、鉛(II)、及び特にビスマス(III)が挙げられるが、これらに限定されない。
治療及び/または診断用途のための放射性同位体の場合には、アスタチン211、14炭素、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、銅67、152Eu、ガリウム67、3水素、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、59鉄、32リン、レニウム186、レニウム188、75セレニウム、35硫黄、テクネチウム99m及び/またはイットリウム90を挙げてもよい。多くの場合、特定の実施形態での使用において125Iが好まれ、長期検出のための低エネルギー及び適合性のために、テクネチウム99m及び/またはインジウム111も多くの場合好まれる。本開示の放射性標識モノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法に従って、製造されてもよい。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウム及び/またはヨウ化カリウムならびに次亜塩素酸ナトリウムなどの化学的酸化剤またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素的酸化剤と接触させることにより、ヨウ素化することができる。本開示によるモノクローナル抗体は、リガンド交換プロセスにより、例えば、パーテクネテートをスズ溶液で還元し、還元テクネチウムをセファデックスカラム上にキレート化し、抗体をこのカラムに加えることにより、テクネチウム99mで標識されてもよい。あるいは、直接標識技術は、例えば、パーテクネテート、SNCl2などの還元剤、ナトリウム−カリウムフタレート溶液などの緩衝液、及び抗体をインキュベーションすることにより、使用されてもよい。金属イオンとして抗体に存在する放射性同位体を結合するために多くの場合使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)である。
コンジュゲートとしての使用が企図される蛍光標識には、Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY−FL、BODIPY−R6G、BODIPY−TMR、BODIPY−TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5、6−FAM、フルオレセインイソチオシアネート、HEX、6−JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、REG、Rhodamine Green、Rhodamine Red、Renographin、ROX、TAMRA、TET、テトラメチルローダミン、及び/またはTexas Redが含まれる。
本開示で企図される別のタイプの抗体コンジュゲートは、主にインビトロでの使用が意図されているものであり、抗体は、二次結合リガンド及び/または発色基質との接触時に有色生成物を生成することになる酵素(酵素タグ)に結合する。好適な酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ(西洋ワサビ)、水素ペルオキシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい二次結合リガンドは、ビオチン及びアビジン及びストレプトアビジン化合物である。このような標識の使用は、当業者に周知であり、例えば、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437号、同第4,275,149号、及び同第4,366,241号に記載されている。
分子の抗体への部位特異的結合のさらに別の既知の方法は、抗体のハプテン系親和性標識との反応を含む。実質的に、ハプテン系親和性標識は、抗原結合部位のアミノ酸と反応し、それによりこの部位を破壊し、特異的抗原反応を遮断する。しかし、これは、抗体コンジュゲートによる抗原結合の喪失をもたらすので、有利ではないことがある。
アジド基を含有する分子が、低強度の紫外線により生成される反応性ナイトレン中間体を介してタンパク質に共有結合を形成するために使用されることもある(Potter及びHaley、1983)。特に、プリンヌクレオチドの2−アジドアナログ及び8−アジドアナログは、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を同定するための部位特異的フォトプローブとして使用されている(Owens及びHaley、1987;Athertonら、1985)。2−アジドヌクレオチド及び8−アジドヌクレオチドは、精製されたタンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするためにも使用され(Khatoonら、1989;Kingら、1989;Dholakiaら、1989)、抗体結合剤として使用されてもよい。
抗体のコンジュゲート部分への結合またはコンジュゲーションのためのいくつかの方法が、当該分野で既知である。一部の結合方法は、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸無水物(DTPA);エチレントリアミン四酢酸;N−クロロ−p−トルエンスルホンアミド;及び/または抗体に結合したテトラクロロ−3α−6α−ジフェニルグルコイル−3などの有機キレート剤を用いる金属キレート錯体の使用を含む(米国特許第4,472,509号及び同第4,938,948号)。モノクローナル抗体も、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応させることがある。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応により調製される。米国特許第4,938,948号では、乳房腫瘍のイメージングが、モノクローナル抗体を使用して達成され、検出可能なイメージング部分が、メチル−p−ヒドロキシベンズイミデートまたはN−スクシンイミジル−3−(4−ヒドロキシフェニル)プロピオネートなどのリンカーを使用して抗体に結合する。
他の実施形態では、抗体結合部位を変更しない反応条件を使用して免疫グロブリンのFc領域にスルフヒドリル基を選択的に導入することによる、免疫グロブリンの誘導体化が企図されている。この方法論に従って製造された抗体コンジュゲートは、改善された寿命、特異性、及び感度を示すことが開示されている(参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,196,066号)。エフェクター分子またはレポーター分子の部位特異的結合は、文献(O’Shannessyら、1987)にも開示されており、レポーターまたはエフェクター分子は、Fc領域の糖質残基にコンジュゲートされている。このアプローチは、現在臨床評価中の診断上及び治療上有望な抗体を産生することが報告されている。
VI.免疫検出法
さらに別の実施形態では、本開示は、LILRB関連がんを結合し、精製し、除去し、定量化し、及びその他一般に検出するための免疫検出方法に関する。このような方法は、従来の意味で適用することができるが、別の使用は、品質管理ならびにワクチン及び他のウイルスストックのモニタリングでの使用であり、本開示による抗体は、ウイルス中のH1抗原の数または完全性(すなわち、長期安定性)を評価するために使用することができる。あるいは、方法は、適切な/所望の反応性プロフィールについて種々の抗体をスクリーニングするために使用されてもよい。
さらに別の実施形態では、本開示は、LILRB関連がんを結合し、精製し、除去し、定量化し、及びその他一般に検出するための免疫検出方法に関する。このような方法は、従来の意味で適用することができるが、別の使用は、品質管理ならびにワクチン及び他のウイルスストックのモニタリングでの使用であり、本開示による抗体は、ウイルス中のH1抗原の数または完全性(すなわち、長期安定性)を評価するために使用することができる。あるいは、方法は、適切な/所望の反応性プロフィールについて種々の抗体をスクリーニングするために使用されてもよい。
一部の免疫検出法は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫放射定量アッセイ、フルオロ免疫アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、及びウェスタンブロットを含む。特に、LILRBの検出及び定量のための競合アッセイも提供される。種々の有用な免疫検出方法の段階は、例えば、Doolittle及びBen−Zeev(1999), Gulbis及びGaland(1993), De Jagerら(1993),ならびにNakamuraら(1987)などの科学文献に記載されている。一般に、免疫結合方法は、本開示に従って、LILRB関連がんを含有すると疑われるサンプルを得ること、及び、場合によっては免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、サンプルを第1の抗体と接触させることを含む。
これらの方法は、LILRBまたはLILRB関連がん細胞をサンプルから検出または精製するための方法を含む。抗体は、好ましくは、カラムマトリックスの形態のような固体支持体に結合することになり、LILRB関連がん細胞を含有すると疑われるサンプルは、固定化された抗体に適用されるであろう。LILRB発現細胞を固定化された抗体と免疫複合体を形成したままにしながら、望ましくない構成成分はカラムから洗浄され、次に、免疫複合体は、生体または抗原をカラムから除去することにより収集される。
免疫結合方法は、サンプル中のLILRB関連がん細胞または関連成分の量の検出及び定量するための方法、ならびに結合プロセス中に形成された任意の免疫複合体の検出及び定量化も含む。ここで、LILRB関連がん細胞を含有すると疑われるサンプルを得、サンプルを、LILRBまたはその構成成分を結合する抗体と接触させ、続いて、その特定の条件下で形成された免疫複合体の量を検出及び定量するであろう。抗原検出に関して、分析される生物学的サンプルは、LILRB関連がんを含有すると疑われる任意のサンプル、例えば、組織切片若しくは標本、均質化された組織抽出物、血液及び血清を含む生物学的液体、または糞便若しくは尿などの分泌物、であってよい。
選択された生物学的サンプルを、有効な条件下で、かつ免疫複合体(初代免疫複合体)の形成を可能にするのに十分な一定の時間、抗体と接触させることは、一般に、抗体組成物をサンプルに単に添加すること、及び抗体がLILRBと免疫複合体を形成するのに、すなわち、LILRBに結合するのに十分長い一定の時間、混合物をインキュベーションするだけのことである。この後、組織切片、ELISAプレート、ドットブロット、またはウェスタンブロットなどのサンプル-抗体複合物は一般に、任意の特異的に結合していない抗体種を除去するために洗浄されて、一次免疫複合体に特異的に結合した抗体のみを検出することが可能になるであろう。
一般に、免疫複合体形成の検出は、当該分野で周知であり、多数のアプローチの適用により達成され得る。これらの方法は一般に、放射性タグ、蛍光性タグ、生物学的タグ、及び酵素的タグのいずれかのような標識またはマーカーの検出に基づく。このような標識の使用に関する特許は、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437号、同第4,275,149号、及び同第4,366,241号を含む。当然のことながら、当技術分野で知られているように、二次抗体などの二次結合リガンドの使用、及び/またはビオチン/アビジンリガンド結合機構により、さらなる利点を見出し得る。
検出に用いられる抗体は、それ自体、検出可能な標識に結合してもよく、次に、この標識を単に検出し、それにより、組成物中の一次免疫複合体の量を決定することが可能になるであろう。あるいは、一次免疫複合体内の結合するようになる第1の抗体が、抗体に対する結合親和性を有する第2の結合リガンドにより検出されてもよい。これらの場合、第2の結合リガンドは、検出可能な標識に結合させてもよい。第2の結合リガンド自体は多くの場合、抗体であり、従って「二次」抗体と称されることがある。一次免疫複合体は、有効な条件下で、二次免疫複合体の形成を可能にするのに十分な時間、標識された二次結合リガンドまたは抗体と接触させる。次に、二次免疫複合体は一般に、特異的に結合していない標識された二次抗体またはリガンドを除去するために洗浄され、次に、二次免疫複合体中の残った標識が検出される。
さらなる方法は、二段階アプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。抗体に対する結合親和性を有する抗体などの第2の結合リガンドは、上記のように、二次免疫複合体を形成するために使用される。洗浄後、二次免疫複合体は、ここでもまた、有効な条件下でかつ免疫複合体(三次免疫複合体)の形成を可能にするのに十分な時間、第2の抗体に対する結合親和性を有する第3の結合リガンドまたは抗体と接触させる。第3のリガンドまたは抗体は、検出可能な標識に結合しており、こうして形成された第3の免疫複合体の検出を可能にする。このシステムは、これが望ましい場合には、シグナル増幅を提供してもよい。
免疫検出の1つの方法は、2つの異なる抗体を使用する。第1のビオチン化抗体は、標的抗原を検出するために使用され、次に、第2の抗体は、複合体化ビオチンに結合したビオチンを検出するために使用される。この方法では、試験されるべきサンプルは最初に、第1段階の抗体を含有する溶液中でインキュベーションされる。標的抗原が存在する場合、抗体の一部は、ビオチン化抗体/抗原複合体を形成するために抗原に結合する。次に、抗体/抗原複合体は、ストレプトアビジン(若しくはアビジン)、ビオチン化DNA、及び/または相補的ビオチン化DNAの連続溶液中でのインキュベーションにより増幅され、各段階は、さらなるビオチン部位を、抗体/抗原複合体に付加する。増幅段階は、適切なレベルの増幅が達成されるまで繰り返され、その時点で、サンプルは、ビオチンに対する第2段階の抗体を含有する溶液中でインキュベーションされる。この第2段階の抗体は、例えば、酵素で標識され、これは、色素原基質を使用した組織化学で抗体/抗原複合体の存在を検出するために、使用することができる。好適な増幅により、肉眼で見えるコンジュゲートを生成することができる。
免疫検出の別の既知の方法は、免疫−PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法を利用する。PCR法は、ビオチン化DNAとのインキュベーションまでは、Cantor法と類似しているが、複数ラウンドのストレプトアビジン及びビオチン化DNAインキュベーションを使用する代わりに、DNA/ビオチン/ストレプトアビジン/抗体複合体は、抗体を放出させる低pHまたは高塩緩衝液で洗い流される。次に、得られた洗浄溶液は、適切な対照と共に、適切なプライマーを用いたPCR反応を実施するために使用される。少なくとも理論的には、PCRの莫大な増幅能力及び特異性は、単一の抗原分子を検出するために、利用することができる。
1.ELISA
イムノアッセイは、最も単純かつ直接的な意味で、結合アッセイである。特定の好ましいイムノアッセイは、当該分野で公知の種々のタイプの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)及びラジオイムノアッセイ(RIA)である。組織切片を使用した免疫組織化学的検出も特に有用である。しかし、検出がこのような技術に限定されず、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、FACS分析なども使用され得ることは容易に理解されるであろう。
イムノアッセイは、最も単純かつ直接的な意味で、結合アッセイである。特定の好ましいイムノアッセイは、当該分野で公知の種々のタイプの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)及びラジオイムノアッセイ(RIA)である。組織切片を使用した免疫組織化学的検出も特に有用である。しかし、検出がこのような技術に限定されず、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、FACS分析なども使用され得ることは容易に理解されるであろう。
1つの例示的なELISAでは、本開示の抗体は、ポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェルなどの、タンパク質親和性を示す選択された表面上に固定化される。次に、LILRB関連がん細胞を含有すると疑われる試験組成物が、ウェルに添加される。結合させ、特異的に結合していない免疫複合体を除去するために洗浄した後に、結合した抗原が検出され得る。検出は、検出可能な標識に結合した別の抗LILRB抗体の添加により達成されてもよい。このタイプのELISAは、単純な「サンドイッチELISA」である。検出は、第2の抗LILRB抗体の添加、続いて、第2の抗体に対する結合親和性を有する第3の抗体の添加により達成されてもよく、第3の抗体は、検出可能な標識に結合している。
別の例示的なELISAでは、LILRB関連がん細胞を含有すると疑われるサンプルは、ウェル表面上に固定化され、次に、本開示の抗LILRB抗体と接触される。結合させ、特異的に結合していない免疫複合体を除去するために洗浄した後に、結合した抗LILRB抗体が検出される。最初の抗LILRB抗体が検出可能な標識に結合している場合、免疫複合体は、直接検出されてもよい。ここでもまた、免疫複合体は、第1の抗LILRB抗体に対する結合親和性を有する第2の抗体を使用して検出されてもよく、第2の抗体は、検出可能な標識に結合している。
用いられた形式に関わらず、ELISAは、コーティング、インキュベーション及び結合、特異的に結合していない種を除去するための洗浄、ならびに結合した免疫複合体の検出などの共通の特定の特徴を有する。これらは、以下に記載される。
プレートを、抗原または抗体のいずれかでコーティングする場合、一般に、プレートのウェルを、抗原または抗体の溶液と、一晩または特定の時間のいずれかでインキュベーションすることになる。次に、プレートのウェルは、不完全に吸着された物質を除去するために、洗浄されることになる。次に、ウェルの残りの利用可能な表面は全て、試験抗血清に関して抗原的に中性である非特異的タンパク質で「コーティング」される。これらには、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、または粉乳溶液を含む。コーティングは、固定化表面上の非特異的吸着部位のブロッキングを可能にし、従って、抗血清の表面への非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドを低減させる。
ELISAでは、おそらく、直接的な手順よりはむしろ、二次的または三次的な検出手段を使用することがより一般的である。従って、タンパク質または抗体をウェルに結合させ、バックグラウンドを低減させるために非反応性物質でコーティングし、未結合物質を除去するために洗浄した後、固定化表面は、免疫複合体(抗原/抗体)の形成を可能にするのに有効な条件下で、試験されるべき生体サンプルと接触させる。次に、免疫複合体の検出は、標識された三次抗体または三次結合リガンドと連結した標識された二次結合リガンドまたは抗体、及び二次結合リガンドまたは抗体を必要とする。
「免疫複合体(抗原/抗体)形成を可能にするのに有効な条件下で」は、BSA、ウシガンマグロブリン(BGG)、またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)/Tweenなどの溶液で、抗原及び/または抗体を希釈することを含むことを意味する。これらの添加剤は、非特異的バックグラウンドの低減を助ける傾向もある。
「適切な」条件は、インキュベーションが、有効な結合を可能にするのに十分な温度または時間であることも意味する。インキュベーション段階は通常、好ましくは25〜27℃のオーダーの温度で、約1〜2〜4時間程度、または約4℃程度で一晩としてもよい。
ELISAにおける全てのインキュベーション段階の後、接触表面は、非複合体材料を除去するために洗浄される。好ましい洗浄手順は、PBS/Tweenまたはホウ酸緩衝液などの溶液で洗浄することを含む。試験サンプルと元々結合していた物質との間の特異的免疫複合体の形成、ならびに後続の洗浄後に、微量の免疫複合体の発生さえ測定され得る。
検出手段を提供するために、第2または第3の抗体は、検出を可能にする関連標識を有することになる。好ましくは、これは、適切な発色基質と共にインキュベーションすると発色を生じる酵素となるであろう。従って、例えば、第1及び第2の免疫複合体を、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または水素ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体と、さらなる免疫複合体形成の進行に好都合な一定時間及び条件下で接触させ、またはインキュベーションすることが望まれるであろう(例えば、PBS−TweenなどのPBS含有溶液中、室温で2時間のインキュベーション)。
標識された抗体とのインキュベーション後に、かつ結合していない物質を除去するために洗浄した後に、標識の量は、尿素、若しくはブロモクレゾールパープル、または酵素標識としてペルオキシダーゼの場合には、2,2’−アジノ−ジ−(3−エチル−ベンズチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS)、若しくはH2O2などの発色基質とのインキュベーションにより定量化される。次に、定量化は、例えば、可視スペクトル分光光度計を使用して、生じる色の程度を測定することにより達成される。
2.ウェスタンブロット
ウェスタンブロット(あるいは、タンパク質イムノブロット)は、組織ホモジネートまたは抽出物の所与のサンプル中の特定のタンパク質を検出するために使用される分析技術である。それは、ポリペプチドの長さ(変性条件)またはタンパク質の3−D構造(天然/非変性条件)により、天然または変性タンパク質を分離するために、ゲル電気泳動を使用する。次に、タンパク質は、メンブレン(通常ニトロセルロースまたはPVDF)に転写され、標的タンパク質に特異的な抗体を使用して、探索(検出)される。
ウェスタンブロット(あるいは、タンパク質イムノブロット)は、組織ホモジネートまたは抽出物の所与のサンプル中の特定のタンパク質を検出するために使用される分析技術である。それは、ポリペプチドの長さ(変性条件)またはタンパク質の3−D構造(天然/非変性条件)により、天然または変性タンパク質を分離するために、ゲル電気泳動を使用する。次に、タンパク質は、メンブレン(通常ニトロセルロースまたはPVDF)に転写され、標的タンパク質に特異的な抗体を使用して、探索(検出)される。
サンプルは、組織全体または細胞培養物から採取されてもよい。ほとんどの場合、固体組織は最初に、(より大きなサンプル容積に対し)ブレンダーを使用して、(より小さい容積に対し)ホモジナイザーを使用して、または超音波処理により、機械的に破壊される。細胞は、上記の機械的方法の1つにより破壊されることもある。しかし、細菌、ウイルス、または環境サンプルが、タンパク質の供給源となることがあり、従って、ウェスタンブロッティングは、細胞研究のみに限定されないことに留意すべきである。細胞の溶解を促進するため、かつタンパク質を可溶化するために、種々の界面活性剤、塩、及び緩衝液が用いられてもよい。それ自体の酵素によるサンプルの消化を防止するために、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤が往々にして添加される。組織の調製は多くの場合、タンパク質の変性を回避するために低温で行われる。
サンプルのタンパク質は、ゲル電気泳動を使用して分離される。タンパク質の分離は、等電点(pI)、分子量、電荷、またはこれらの因子の組み合わせによるものであってよい。分離の性質は、サンプルの処理及びゲルの性質に依存する。これは、タンパク質を決定する非常に有用な手段である。また、単一のサンプルからのタンパク質を2次元で広げる2次元(2−D)ゲルを使用することも可能である。タンパク質は、等電点(それらが中性の正味電荷を有するpH)に従って第一の次元で、そして、分子量に従って第二の次元で、分離される。
タンパク質を抗体検出に使用できるようにするために、それらは、ゲル内からニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオリド(PVDF)製のメンブレン上に移動される。メンブレンをゲルの上部に置き、濾紙の束をその上に置く。束全体は、バッファー溶液中に置かれ、バッファー溶液は、毛管作用により紙の上方へ移動して、タンパク質がそれと共に運ばれる。タンパク質を転写するための別の方法は、エレクトロブロッティングと呼ばれ、タンパク質をゲルからPVDFまたはニトロセルロースメンブレンに引き込むために電流を使用する。タンパク質は、ゲル内にあった構成を維持しながら、ゲル内からメンブレン上に移動する。このブロッティングプロセスの結果として、タンパク質は、検出用の薄い表面層に露出される(下記参照のこと)。両方の種類のメンブレンは、それらの非特異的なタンパク質結合特性により選択される(すなわち、全てのタンパク質に等しく良好に結合する)。タンパク質結合は、疎水性相互作用、ならびにメンブレン及びタンパク質の間の荷電相互作用に基づく。ニトロセルロースメンブレンは、PVDFよりも安価であるが、はるかに脆弱であり、繰り返しプロービングに耐えられない。ゲルからメンブレンへのタンパク質の転写の均一性及び全体的な有効性は、メンブレンをクマシーブリリアントブルーまたはポンソーS色素で染色することにより確認することができる。一旦転写されると、タンパク質は、標識一次抗体、または非標識一次抗体、続いて、一次抗体のFc領域に結合する標識プロテインAまたは二次標識抗体を使用した間接的検出を使用して検出される。
3.免疫組織化学
本開示の抗体は、免疫組織化学(IHC)による研究のために調製された、新鮮凍結及び/またはホルマリンで固定されたパラフィン包埋組織ブロックの両方と併用されることもある。組織ブロックをこれらの微粒子標本から調製する方法は、種々の予後因子の以前のIHC研究で首尾よく使用されており、当業者に周知である(Brownら、1990;Abbondanzoら、1990;Allredら、1990)。
本開示の抗体は、免疫組織化学(IHC)による研究のために調製された、新鮮凍結及び/またはホルマリンで固定されたパラフィン包埋組織ブロックの両方と併用されることもある。組織ブロックをこれらの微粒子標本から調製する方法は、種々の予後因子の以前のIHC研究で首尾よく使用されており、当業者に周知である(Brownら、1990;Abbondanzoら、1990;Allredら、1990)。
要約すると、凍結切片は、50ngの凍結された「粉砕された」組織を、室温で、小さなプラスチックカプセル中のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で再水和する段階;遠心分離により粒子をペレット化する段階;それらを粘性包埋剤(OCT)に再懸濁する段階;カプセルを反転させ、かつ/若しくは遠心分離により再度ペレット化する段階;−70℃のイソペンタン中で急速冷凍する段階;プラスチックカプセルを切削し、かつ/若しくは組織の凍結したシリンダーを取り出す段階;組織シリンダーを、クリオスタットミクロトームチャックに取付ける段階;及び/またはカプセルから25〜50の連続切片を切削する段階、により調製されてもよい。あるいは、凍結組織サンプル全体を、連続切片の切削に使用してもよい。
永久切片は、プラスチック微量遠心チューブ中の50mgのサンプルの再水和;ペレット化する段階;4時間の固定のために10%のホルマリン中で再懸濁する段階;洗浄/ペレット化する段階;温かい2.5%のアガーに再懸濁する段階;ペレット化する段階;アガーを硬化させるために氷水中で冷却する段階;組織/アガーブロックを、チューブから取り出す段階;ブロックをパラフィンに浸潤させ、かつ/若しくは包埋する段階;及び/または多くとも50個の連続した永久切片を切削する段階、を含む同様の方法により調製されてもよい。ここでもまた、全組織サンプルで置き換えてもよい。
4.免疫検出キット
さらに別の実施形態では、本開示は、上記の免疫検出方法において使用される免疫検出キットに関する。LILRB関連がん細胞を検出するために抗体が使用されることがあるので、抗体がキットに含まれてもよい。従って、免疫検出キットは、適切な容器手段で、LILRBに結合する第1の抗体、及び必要に応じて、免疫検出試薬を含むことになる。
さらに別の実施形態では、本開示は、上記の免疫検出方法において使用される免疫検出キットに関する。LILRB関連がん細胞を検出するために抗体が使用されることがあるので、抗体がキットに含まれてもよい。従って、免疫検出キットは、適切な容器手段で、LILRBに結合する第1の抗体、及び必要に応じて、免疫検出試薬を含むことになる。
特定の実施形態では、抗体は、固体支持体、例えば、カラムマトリックス及び/またはマイクロタイタープレートのウェルに予め結合させてもよい。キットの免疫検出試薬は、所与の抗体と会合するかまたはそれに結合する検出可能な標識を含む様々な形態のいずれか1つであってもよい。二次結合リガンドと会合するかまたはそれに結合する検出可能な標識も企図される。例示的な二次リガンドは、第1の抗体に対する結合親和性を有する二次抗体である。
本キットで使用されるさらに好適な免疫検出試薬は、第1の抗体に対する結合親和性を有する二次抗体と、第2の抗体に対する結合親和性を有する第3の抗体とを含む二構成成分試薬が含まれ、第3の抗体は、検出可能な標識に結合している。前述したように、多くの例示的な標識は、当技術分野で既知であり、このような標識は全て、本開示と関連して利用されてもよい。
キットは、検出アッセイのための標準曲線を作成するために使用され得るように、標識または非標識に関わらず、LILRBの適切に等分された組成物をさらに含んでもよい。キットは、完全にコンジュゲートされた形態、中間体の形態、またはキットの使用者によりコンジュゲートされるべき別々の部分のいずれかの、抗体−標識コンジュゲートを含有してもよい。キットのコンポーネントは、水性媒体中、または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージ化されてもよい。
キットの容器手段は一般に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含み、その中に抗体が配置され、または好ましくは、適切に等分されてもよい。本開示のキットは通常、商業的販売のために密閉した状態で、抗体、抗原を入れる手段、及び他の任意の試薬容器も含むことになる。このような容器は、注射液または所望のバイアルが保持されるブロー成形されたプラスチック容器を含んでもよい。
VII.実施例
下記の実施例は、好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示された技術は、実施形態の実施において良好に機能するために本発明者らが発見した技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることは、当業者により理解されるはずである。しかし、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、依然として、同様のまたは類似の結果を得ることを、当業者は本開示に照らして理解するはずである。
下記の実施例は、好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示された技術は、実施形態の実施において良好に機能するために本発明者らが発見した技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることは、当業者により理解されるはずである。しかし、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、依然として、同様のまたは類似の結果を得ることを、当業者は本開示に照らして理解するはずである。
実施例1
LILRB及びLAIR1は、AML−SCを含むAML細胞上に高度に発現され、その発現は、AML患者の生存と逆相関する
本発明者らは、ヒトAML患者におけるLILRB1〜4の表面発現を分析し、それらが、これらの患者の有意な割合により発現されることを見出した(図1、上)。LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4は、試験した合計37人のヒトAML症例のうちそれぞれ8、8、12、及び18人で発現される。LILRB4を含むLILRBは、白血病幹細胞マーカーCD34と同時発現し得る(図1、下パネル)。本発明者らのインシリコ分析は、いくつかの密接に関連するLILRBファミリーメンバーであるLILRB1、LILRB2、LILRB3、及びLILRB4、ならびにLAIR1の発現が、AML患者の全生存期間と逆相関することを示した(図2)。これらの受容体は、正常な対応物よりも、ヒトAML細胞上でより高度に発現される。重要なことに、LILRB+/LAIR1+細胞は、AML−SCの活性について富化されている(Kangら、近刊)。
LILRB及びLAIR1は、AML−SCを含むAML細胞上に高度に発現され、その発現は、AML患者の生存と逆相関する
本発明者らは、ヒトAML患者におけるLILRB1〜4の表面発現を分析し、それらが、これらの患者の有意な割合により発現されることを見出した(図1、上)。LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4は、試験した合計37人のヒトAML症例のうちそれぞれ8、8、12、及び18人で発現される。LILRB4を含むLILRBは、白血病幹細胞マーカーCD34と同時発現し得る(図1、下パネル)。本発明者らのインシリコ分析は、いくつかの密接に関連するLILRBファミリーメンバーであるLILRB1、LILRB2、LILRB3、及びLILRB4、ならびにLAIR1の発現が、AML患者の全生存期間と逆相関することを示した(図2)。これらの受容体は、正常な対応物よりも、ヒトAML細胞上でより高度に発現される。重要なことに、LILRB+/LAIR1+細胞は、AML−SCの活性について富化されている(Kangら、近刊)。
LILRB及びLAIR1は、ヒト白血病細胞の増殖及び異種移植に必須である。ヒト白血病のLILRB及びLAIR1の潜在的機能を研究するために、本発明者らは、これらの受容体の表面発現のレベルが高い、MV4−11(AML)、THP−1(AML)、U937(AML)、697(B−ALL)、Kasumi2(B−ALL)、及びRCH−ACV(B−ALL)を含むヒト白血病株のshRNAを使用して、LILRB及びLAIR1の発現を個別にノックダウンする。個々のLILRB2、LILRB3、LILRB4、またはLAIR1の発現のサイレンシングは、細胞増殖を劇的に阻害した。再構成されたMLL遺伝子を有する2つのAML株であるTHP−1及びMV4−11からの代表的なデータは、図3に示される。重要なことに、7つの初代ヒトAMLサンプルのいずれかにおけるLILRBまたはLAIR1の発現の阻害は、異種移植されたNSGマウスにおける白血病発生をほぼ完全になくした(Kangら、近刊)。これらの結果は、いくつかのLILRBが、ヒトAML細胞の増殖に必須であることを示す。
LILRBがAMLの発症をサポートする機序のより深い理解を得るために、本発明者らは、LILRB3−nullマウス、LILRB4−nullマウス、またはLAIR1−nullマウスにおける急性白血病の発症を研究した(Tangら、2012;Rojoら、2000、Zhengら、2012)。これらのマウスは、正常な造血及びHSC活性を有する(Tangら、2012;Rojoら、2000、Zhengら、2012)。本発明者らは、この研究のために、MLL−AF9、AML1−ETO、またはN−Myc移植AMLまたは急性リンパ芽球性白血病(ALL)マウスモデル(Sugiharaら、2011;Kristovら、2006;Somervaille及びClearly、2006;Yanら、2006)を使用した。LILRB−nullまたはLAIR1−null白血病細胞が移植されたマウスは、連続移植時に対照よりもゆっくりと疾患を発症し、最終的には白血病を有していなかった。LILRB−nullまたはLAIR1−null表現型AML−SC富化細胞の生存及び自己再生は経時的に減少したが、その分化能力は増加した。本発明者らは、SHP−1及びCAMKIが、AML−SCにおけるLILRB/LAIR1シグナル伝達経路の主要コンポーネントであることをさらに発見した(Kangら、近刊)。これらの結果は、LILRB及びLAIR1が、AML−SCの活性をサポートすることを示している。
抗LILRBモノクローナル抗体(mAb)の同定
本発明者らは、ウェスタンブロッティング(図4)及びフローサイトメトリー(図5)においてLILRBとの結合により測定される、個々のLILRBに対する抗体を明らかにした。
本発明者らは、ウェスタンブロッティング(図4)及びフローサイトメトリー(図5)においてLILRBとの結合により測定される、個々のLILRBに対する抗体を明らかにした。
LILRB/LAIR1媒介性シグナル伝達のためのレポーターがなかったので、本発明者らは、抗体がLILRBまたはLAIR1の細胞外ドメイン(ECD)に結合して、対になった免疫グロブリン様受容体βのキメラ融合された細胞内ドメイン(アダプターDAP−12を介してシグナル伝達し、NFATプロモーター駆動型GFP発現を活性化する)の活性化または阻害を引き起こす能力を試験するために、安定なキメラ受容体レポーター細胞系を作製した(図6右及び図7左)。このレポーターシステムは、抗体の遮断及び抗体の刺激についてスクリーニングすることを可能にする感度の高い代用物として役立つ。
この系を使用して、本発明者らは、LILRB2〜4シグナル伝達活性化を阻害する新規モノクローナル抗体(mAb)のグループを同定した(図6〜7)。例えば、C84、C53、C92、C201を含む可溶性抗LILRB4 mAbは、LILRB4のキメラ受容体レポーター系においてGFP導入を阻害する(図7)。
抗LILRB mAbは、白血病の発症を遮断する
本発明者らは、いくつかの抗LILRB mAbが、異種移植モデルにおけるAMLの発症を効果的に遮断することを確認した。例えば、抗LILRB4 mAbであるC84は、異種移植されたマウスモデルにおいてAMLの発症を遮断した。これらのモデルでは、発明者らは、(図8〜9に示されるようにLILRB4表面発現に関し陽性である)ヒト白血病細胞THP−1若しくはMV4−11、または3人の個々の患者由来の初代ヒトAML細胞を、免疫欠損NSGマウスに皮下(sc)または静脈内(iv)移植した(AML細胞株を移植された異種移植モデル:図10〜13、患者AML異種移植モデル:図14〜18)。対照的に、C84投与は、LILRB4ががん細胞により発現されない場合、がんの発症を阻害しなかった(図13)。それ故、抗LILRB4 mAb C84は、LILRB4を発現するヒトAMLの発症に顕著な特異的阻害効果を有していた。重要なことに、異なる異種移植モデルを使用した6つの独立した実験により、同様の結果が得られた。
本発明者らは、いくつかの抗LILRB mAbが、異種移植モデルにおけるAMLの発症を効果的に遮断することを確認した。例えば、抗LILRB4 mAbであるC84は、異種移植されたマウスモデルにおいてAMLの発症を遮断した。これらのモデルでは、発明者らは、(図8〜9に示されるようにLILRB4表面発現に関し陽性である)ヒト白血病細胞THP−1若しくはMV4−11、または3人の個々の患者由来の初代ヒトAML細胞を、免疫欠損NSGマウスに皮下(sc)または静脈内(iv)移植した(AML細胞株を移植された異種移植モデル:図10〜13、患者AML異種移植モデル:図14〜18)。対照的に、C84投与は、LILRB4ががん細胞により発現されない場合、がんの発症を阻害しなかった(図13)。それ故、抗LILRB4 mAb C84は、LILRB4を発現するヒトAMLの発症に顕著な特異的阻害効果を有していた。重要なことに、異なる異種移植モデルを使用した6つの独立した実験により、同様の結果が得られた。
C84に加えて、本発明者らは、LILRBに対するさらなる9つのmAbであるC201、C53、C92、C39、C3、C193、C290、C102、及びC287が、異種移植モデルにおいて抗白血病効果を有することを確認した。これらのmAbの抗白血病作用及び交差反応性を、図19にまとめる。
白血病の発症を阻害するのに有効なmAbの可変領域のアイソタイピング及び配列決定
本発明者らは、mAbであるC84、C201、C53、C92、C39、C3、C193、C290、C102、及びC287の可変領域のアイソタイプ及び配列決定を得た(図20〜22)。
本発明者らは、mAbであるC84、C201、C53、C92、C39、C3、C193、C290、C102、及びC287の可変領域のアイソタイプ及び配列決定を得た(図20〜22)。
キメラ抗体の産生及び抗白血病作用の実証
キメラ抗体を発現させるために、本発明者らは、ヒト定常領域をコードする発現ベクターに、マウスmAbの可変領域をサブクローニングし、293T細胞にトランスフェクションした。本発明者らは、トランスフェクションされた293T細胞から馴化培地を収集し、キメラ抗体を精製した。図23は、SDS−PAGEで測定されるキメラ抗C84(キメラ抗体MHC−C84)の発現及び精製を示す。
キメラ抗体を発現させるために、本発明者らは、ヒト定常領域をコードする発現ベクターに、マウスmAbの可変領域をサブクローニングし、293T細胞にトランスフェクションした。本発明者らは、トランスフェクションされた293T細胞から馴化培地を収集し、キメラ抗体を精製した。図23は、SDS−PAGEで測定されるキメラ抗C84(キメラ抗体MHC−C84)の発現及び精製を示す。
本発明者らは、キメラ抗体及び元のmAbの、LILRB結合、シグナル伝達遮断、及び白血病阻害活性を比較した。キメラ抗体MHC−C84は、フローサイトメトリーで測定されるように、C84として、それぞれTHP−1細胞上のLILRB4(図24)及びLILRB4キメラ受容体レポーター細胞上のLILRB4(図25)に結合する。キメラ抗体MHC−C84が、キメラ受容体レポーターアッセイで測定されるように、C84としてLILRB4の遮断抗体であることも、本発明者らは見出した(図26)。最も重要なことに、キメラ抗体MHC−C84は、AML異種移植マウスの肝臓、骨髄、脾臓、及び末梢血のフローサイトメトリー分析(図27)または経時的なAML異種移植マウスにおける腫瘍の発症の発光イメージング(図28)で測定されるように、異種移植モデルにおけるAMLの発症を阻害する(元のmAb C84と同じまたはより良い効果を有する)。驚くべきことに、これらの実験では、本発明者らは、全実験期間中にMHC−C84またはC84を1回投与したにすぎない(合計200μgの抗体/マウス)。これらの結果は、キメラ抗LILRBが、元のmAbよりも白血病の発症を阻止するのと同じまたはそれ以上の能力を有することを示している。
要約すれば、これらのデータは、1)LILRB/LAIR1が、ヒトAML細胞により高度に発現され、LILRB+/LAIR1+細胞が、AML−SC活性について富化されていること;2)LILRB/LAIR1発現が、AML患者の全生存期間と逆相関すること;3)LILRB/LAIR1が、インビトロ及びインビボで初代及び不死化ヒト白血病細胞の増殖に必須であること;ならびに4)本発明者らが、患者AML由来異種移植モデルを含む種々の異種移植モデルにおいてヒトAMLの発症を実質的に遮断するいくつかの新規抗ヒトLILRB4 mAb及びキメラ抗体を同定したこと、を実証している。個々のLILRB遺伝子またはLAIR1のノックアウトが、正常な造血に対して明らかな影響を有しないことは注目に値する(Tangら、2012;Rojoら、2000、Zhengら、2012)。加えて、LILRBの阻害は、免疫を刺激し、間接的に抗腫瘍効果を増強した。それ故、LILRB/LAIR1は、AMLを処置するための理想的な標的である。
LILRB2に対する複数の潜在的リガンド結合部位を同定した(Dengら、2014)ように、本発明者らは、小分子化学物質よりはむしろ遮断抗体などの大きな分子がより適切なLILRBブロッカーとなることを想定している。実際に、発明者らが実証したように、抗LILRB mAbまたはキメラ抗体は、単回投与でさえ、異種移植モデルにおけるヒトAMLの発症を非常に効率的に遮断することができた。これらの結果は、抗LILRB mAbまたはキメラ抗体が、AMLを処置するための有望な薬物候補であるという原理の証明を提供する。
本明細書に開示及び特許請求された組成物及び方法の全ては、本開示に照らして過度の実験をすることなく作製及び実行することができる。本開示の組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点から記載されているが、本開示の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、組成物及び方法ならびに本明細書に記載の方法の段階または段階の順序に変更が加えられてもよいことは、当業者には明らかであろう。より具体的には、同じまたは類似の結果を達成しながら、本明細書に記載の剤を、化学的及び生理学的に関連する特定の剤で置き換えてもよいことは明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似の置換及び改変は全て、添付の特許請求の範囲により規定されるように、本開示の趣旨、範囲、及び概念の範囲内であるとみなされる。
[本発明1001]
サンプルまたは対象中のがん細胞またはがん幹細胞を検出する方法であって、
(a)対象または前記対象由来のサンプルを、図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を有する抗体または抗体フラグメントと接触させる段階、ならびに
(b)前記抗体の、前記対象またはサンプル中のがん細胞またはがん幹細胞への結合を検出する段階
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記サンプルが、体液または生検材料である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記サンプルが、血液、痰、涙、唾液、粘液若しくは血清、尿、または糞便である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
検出が、免疫組織化学、ELISA、RIA、またはウェスタンブロットを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
段階(a)及び段階(b)を二度目に実施する段階、ならびに
最初のアッセイと比較した細胞レベルの変化を決定する段階
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記抗体が、図21に示されるクローン対可変配列を特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記抗体または抗体フラグメントが、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記抗体または抗体フラグメントが、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記抗体フラグメントが、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’) 2 フラグメント、またはFvフラグメントである、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記抗体が、エボラウイルスに結合しない、本発明1001の方法。
[本発明1011]
がんを有する対象を処置する方法であって、図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を有する抗体または抗体フラグメントを、前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1012]
前記抗体が、図21に示されるクローン対重鎖及び軽鎖可変核酸配列を特徴とする、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記抗体が、図21に示されるクローン対重鎖及び軽鎖可変アミノ酸配列を特徴とする、本発明1011の方法。
[本発明1014]
前記抗体または抗体フラグメントが、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、本発明1012の方法。
[本発明1015]
前記抗体または抗体フラグメントが、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記抗体フラグメントが、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’) 2 フラグメント、またはFvフラグメントである、本発明1011の方法。
[本発明1017]
前記抗体が、IgGである、本発明1011の方法。
[本発明1018]
前記抗体が、キメラ抗体である、本発明1011の方法。
[本発明1019]
前記がんが、急性骨髄性白血病である、本発明1011の方法。
[本発明1020]
投与が、静脈内、動脈内、または腫瘍内投与である、本発明1011の方法。
[本発明1021]
抗体が、図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を特徴とする、モノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1022]
図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1023]
図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、本発明1022のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1024]
図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1025]
図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、本発明1024のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1026]
前記抗体フラグメントが、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’) 2 フラグメント、またはFvフラグメントである、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1027]
前記抗体が、キメラ抗体であるかまたは二重特異性抗体である、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1028]
前記抗体が、IgGである、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1029]
前記抗体が、ヒト化されている、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1030]
前記抗体が、最適化されている、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1031]
抗体が、図22のクローン対重鎖及び軽鎖のCDR配列を特徴とする、ハイブリドーマのコード化。
[本発明1032]
前記抗体が、図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、本発明1031のハイブリドーマ。
[本発明1033]
前記抗体が、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、本発明1032のハイブリドーマ。
[本発明1034]
前記抗体が、図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、本発明1031のハイブリドーマ。
[本発明1035]
前記抗体が、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、本発明1034のハイブリドーマ。
単語「1つの(a)」または「1つの(an)」の使用は、特許請求の範囲及び/または明細書中で用語「含む(comprising)」と共に使用される場合、「1つ」を意味することがあるが、「1つ以上(one or more)」、「少なくとも1つ」、及び「1つ以上(one or more than one)」の意味とも一致している。単語「約」は、記載された数のプラスまたはマイナス5%を意味する。
サンプルまたは対象中のがん細胞またはがん幹細胞を検出する方法であって、
(a)対象または前記対象由来のサンプルを、図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を有する抗体または抗体フラグメントと接触させる段階、ならびに
(b)前記抗体の、前記対象またはサンプル中のがん細胞またはがん幹細胞への結合を検出する段階
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記サンプルが、体液または生検材料である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記サンプルが、血液、痰、涙、唾液、粘液若しくは血清、尿、または糞便である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
検出が、免疫組織化学、ELISA、RIA、またはウェスタンブロットを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
段階(a)及び段階(b)を二度目に実施する段階、ならびに
最初のアッセイと比較した細胞レベルの変化を決定する段階
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記抗体が、図21に示されるクローン対可変配列を特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記抗体または抗体フラグメントが、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記抗体または抗体フラグメントが、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記抗体フラグメントが、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’) 2 フラグメント、またはFvフラグメントである、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記抗体が、エボラウイルスに結合しない、本発明1001の方法。
[本発明1011]
がんを有する対象を処置する方法であって、図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を有する抗体または抗体フラグメントを、前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1012]
前記抗体が、図21に示されるクローン対重鎖及び軽鎖可変核酸配列を特徴とする、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記抗体が、図21に示されるクローン対重鎖及び軽鎖可変アミノ酸配列を特徴とする、本発明1011の方法。
[本発明1014]
前記抗体または抗体フラグメントが、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、本発明1012の方法。
[本発明1015]
前記抗体または抗体フラグメントが、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記抗体フラグメントが、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’) 2 フラグメント、またはFvフラグメントである、本発明1011の方法。
[本発明1017]
前記抗体が、IgGである、本発明1011の方法。
[本発明1018]
前記抗体が、キメラ抗体である、本発明1011の方法。
[本発明1019]
前記がんが、急性骨髄性白血病である、本発明1011の方法。
[本発明1020]
投与が、静脈内、動脈内、または腫瘍内投与である、本発明1011の方法。
[本発明1021]
抗体が、図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を特徴とする、モノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1022]
図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1023]
図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、本発明1022のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1024]
図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1025]
図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、本発明1024のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1026]
前記抗体フラグメントが、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’) 2 フラグメント、またはFvフラグメントである、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1027]
前記抗体が、キメラ抗体であるかまたは二重特異性抗体である、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1028]
前記抗体が、IgGである、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1029]
前記抗体が、ヒト化されている、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1030]
前記抗体が、最適化されている、本発明1021のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
[本発明1031]
抗体が、図22のクローン対重鎖及び軽鎖のCDR配列を特徴とする、ハイブリドーマのコード化。
[本発明1032]
前記抗体が、図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、本発明1031のハイブリドーマ。
[本発明1033]
前記抗体が、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、本発明1032のハイブリドーマ。
[本発明1034]
前記抗体が、図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、本発明1031のハイブリドーマ。
[本発明1035]
前記抗体が、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、本発明1034のハイブリドーマ。
単語「1つの(a)」または「1つの(an)」の使用は、特許請求の範囲及び/または明細書中で用語「含む(comprising)」と共に使用される場合、「1つ」を意味することがあるが、「1つ以上(one or more)」、「少なくとも1つ」、及び「1つ以上(one or more than one)」の意味とも一致している。単語「約」は、記載された数のプラスまたはマイナス5%を意味する。
Claims (35)
- サンプルまたは対象中のがん細胞またはがん幹細胞を検出する方法であって、
(a)対象または前記対象由来のサンプルを、図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を有する抗体または抗体フラグメントと接触させる段階、ならびに
(b)前記抗体の、前記対象またはサンプル中のがん細胞またはがん幹細胞への結合を検出する段階
を含む、前記方法。 - 前記サンプルが、体液または生検材料である、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが、血液、痰、涙、唾液、粘液若しくは血清、尿、または糞便である、請求項1に記載の方法。
- 検出が、免疫組織化学、ELISA、RIA、またはウェスタンブロットを含む、請求項1に記載の方法。
- 段階(a)及び段階(b)を二度目に実施する段階、ならびに
最初のアッセイと比較した細胞レベルの変化を決定する段階
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記抗体が、図21に示されるクローン対可変配列を特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体または抗体フラグメントが、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体または抗体フラグメントが、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体フラグメントが、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、またはFvフラグメントである、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体が、エボラウイルスに結合しない、請求項1に記載の方法。
- がんを有する対象を処置する方法であって、図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を有する抗体または抗体フラグメントを、前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
- 前記抗体が、図21に示されるクローン対重鎖及び軽鎖可変核酸配列を特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 前記抗体が、図21に示されるクローン対重鎖及び軽鎖可変アミノ酸配列を特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 前記抗体または抗体フラグメントが、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、請求項12に記載の方法。
- 前記抗体または抗体フラグメントが、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、請求項13に記載の方法。
- 前記抗体フラグメントが、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、またはFvフラグメントである、請求項11に記載の方法。
- 前記抗体が、IgGである、請求項11に記載の方法。
- 前記抗体が、キメラ抗体である、請求項11に記載の方法。
- 前記がんが、急性骨髄性白血病である、請求項11に記載の方法。
- 投与が、静脈内、動脈内、または腫瘍内投与である、請求項11に記載の方法。
- 抗体が、図22のクローン対重鎖及び軽鎖CDR配列を特徴とする、モノクローナル抗体または抗体フラグメント。
- 図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、請求項21に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
- 図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、請求項22に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
- 図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、請求項21に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
- 図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、請求項24に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
- 前記抗体フラグメントが、組換えScFv(一本鎖可変部)抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、またはFvフラグメントである、請求項21に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
- 前記抗体が、キメラ抗体であるかまたは二重特異性抗体である、請求項21に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
- 前記抗体が、IgGである、請求項21に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
- 前記抗体が、ヒト化されている、請求項21に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
- 前記抗体が、最適化されている、請求項21に記載のモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
- 抗体が、図22のクローン対重鎖及び軽鎖のCDR配列を特徴とする、ハイブリドーマのコード化。
- 前記抗体が、図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、請求項31に記載のハイブリドーマ。
- 前記抗体が、図21のクローン対配列と70%、80%、または90%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変核酸配列によりコードされる、請求項32に記載のハイブリドーマ。
- 前記抗体が、図21のクローン対配列に従う軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、請求項31に記載のハイブリドーマ。
- 前記抗体が、図21のクローン対配列と95%の同一性を有する軽鎖及び重鎖可変アミノ酸配列によりコードされる、請求項34に記載のハイブリドーマ。
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