KR102381948B1 - 항-lilrb 항체 및 암의 검출 및 치료를 위한 이의 용도 - Google Patents

항-lilrb 항체 및 암의 검출 및 치료를 위한 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본원의 개시내용은 LILRB에 결합하는 항체 및 이것으로 암을 검출하고 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-LILRB 항체 및 암의 검출 및 치료를 위한 이의 용도{ANTI-LILRB ANTIBODIES AND THEIR USE IN DETECTING AND TREATING CANCER}
본 출원은 2015년 3월 6일자로 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/129,572호에 대한 우선권의 이득을 청구하고 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
1. 본 출원의 분야
본원의 개시내용은 일반적으로 의약, 종양학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 출원은 LILRB에 대한 항체 및 백혈병을 포함하는 암을 치료할 수 있는 항체에 관한 것이다.
2. 배경
급성 골수성 백혈병 (AML)은 성인의 가장 통상의 급성 백혈병이다. 연속 치료에도 불구하고, 대부분의 환자들은 5년 이내에 재발한다. 급성 백혈병을 효과적으로 치료하기 위해, 새로운 분자 표적 및 치료학적 방법이 식별되어야만 한다. 최근에, 본원 발명자는 인간 백혈구 면역글로불린형 수용체 B2(LILRB2)를 여러 안지오포이에틴형 단백질(Angptls)에 대한 수용체로서 클로닝하였다(문헌참조: Zheng et al., 2012). LILRB 계열 수용체는 세포외 Ig형 도메인을 함유하는 I형 막투과성 당단백질이고 이는 리간드 및 세포내 면역수용체 티로신-기반 억제성 모티프 (ITIM)에 결합하고 ITIM 모티프는 포스파타제 SHP-1, SHP-2, 또는 SHIP를 동원하여 면역 세포 활성화를 음성적으로 조절하기 때문에 억제성 수용체로서 분류된다(문헌참조: Takai et al., 2011; Daeron et al., 2008; Katz et al., 2006). LILRB는 골수 세포 및 특정 다른 조혈 세포상에서 발현되는 것으로 공지되어 있다(문헌참조: Mori et al., 2008). 놀랍게도, 본원 발명자는 LILRB2의 마우스 오톨로그인 PirB 및 밀접하게 관련된 ITIM-수용체인 LAIR1이 AML 줄기 세포 (AML-SC)에 의해 발현되고 AML의 발병을 지지함을 보여주었다(문헌참조: Zheng et al., 2012; Kang et al., in press). 반직관적이지만 상기 결과는 면역계에서 일반적으로 면역 억제성 및 따라서 억제성 수용체의 종양-촉진 역할과 일치한다(문헌참조: Ma et al., 2011).
최근 연구에서, 본원 발명자는 LILRB 계열의 여러 구성원이 AML 세포상에서 고도로 발현되고 이들의 발현이 인간 AML 환자의 전체 생존율과 음성적으로 서로 관련이 있음을 밝혔다. LILRB는 AML-SC 및 일부 분화된 급성 백혈병 세포 (AML 및 급성 림프아구성 백혈병 또는 ALL을 포함하는) 둘다에 의해 발현된다. 시험된 임의의 개별 LILRB를 발현하지 않는 마우스에서 정상적 조혈 발육에 어떠한 결함이 없다. 흥미롭게도, 그러나, 개별 LILRB의 녹아웃은 다수의 AML 및 급성 림프아구성 백혈병(ALL) 마우스 모델에서 백혈병 발육을 반전시켰고 AML-SC를 폐지시켰다(문헌참조: Zheng et al., 2012; Kang et al., in press; 또한 PCT/US13/43431을 참조한다). 추가로, 배양 중에 상이한 인간 백혈병 세포주에서 개별적으로 여러 LILRB의 발현 억제는 이종이식된 마우스에서 백혈병 발육을 차단하였다(문헌참조: Kang et al., in press; 또한 PCT/US13/43431을 참조한다).
본원 발명자는 일부 백혈병 줄기 세포가 LILRB를 포함하는 고수준의 ITIM-억제성 수용체를 발현함을 계측하였다. 화학요법을 포함하는 급성 백혈병을 갖는 환자에 대한 현재 치료 옵션은 이들 억제성 수용체가, 백혈병 줄기 세포가 궁극적으로 종양 재발을 유도하는 통상의 화학요법으로부터 생존할 수 있게 하기 때문에 암 줄기 세포를 효율적으로 표적화하지 않는다. 본원 발명자는 LILRB 신호 전달이 여러 이유 때문에 AML을 치료하기 위해 이상적인 표적을 제공함을 이론화하였다: 1) 여러 LILRB는 AML-SC를 포함하는 AML 세포의 생존에 필수적이고; 2) 개별 LILRB의 녹아웃은 정상 조혈에서 명시적 결함을 유발하지 않고; 3) LILRB 활성의 억제는 면역성을 자극하고 항종양 효과를 간접적으로 부스팅한다.
요약
따라서, 본원의 개시내용에 따라, (a) 대상체 또는 상기 대상체로부터의 샘플을 도 22로부터의 클론-쌍 형성 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편과 접촉시키고; (b) 상기 대상체 또는 샘플에서 상기 항체의 암 세포 또는 암 줄기 세포로의 결합을 검출함을 포함하는 샘플 또는 대상체에서 암 세포 또는 암 줄기 세포를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 샘플은 생검 또는 체액, 예를 들어, 혈액, 객담, 눈물, 침샘, 점액 또는 혈청, 뇨 또는 대변일 수 있다. 검출은 면역조직화학, ELISA, RIA 또는 웨스턴 블롯을 포함할 수 있다. 상기 방법은 단계 (a) 및 (b)를 2회 수행하고 제1 검정과 비교하여 세포 수준에서의 변화를 계측하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항체는 도 21에 제시된 바와 같이 클론 쌍 형성 가변 서열을 특징으로 할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 도 21로부터의 클론 쌍 형성 서열과 70%, 80% 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 항체 또는 항체 단편은 도 21로부터의 클론 쌍 형성 서열과 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 아미노산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 항체 단편은 재조합 ScFv (단일쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편일 수 있다. 상기 항체는 에볼라 바이러스에 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있다.
또 다른 양태에서, 도 22로부터의 클론 쌍 형성 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 대상체에게 투여함을 포함하는 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 항체는 도 21에 제시된 바와 같은 클론 쌍 형성 중쇄 및 경쇄 가변 핵산 서열을 특징으로 할 수 있다. 상기 항체는 도 21에 제시된 바와 같은 클론 쌍 형성 중쇄 및 경쇄 가변 아미노산 서열을 특징으로 할 수 있다. 상기 항체 또는 항체 단편은 도 21로부터의 클론 쌍 형성 서열과 70%, 80%, 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 항체 또는 항체 단편은 도 21로부터의 클론 쌍 형성 서열과 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 아미노산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 항체 단편은 재조합 ScFv (단일쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편일 수 있다. 상기 항체는 IgG 및/또는 키메라 항체일 수 있다. 상기 암은 급성 골수성 백혈병일 수 있다. 투여는 정맥내, 동맥내 또는 종양내일 수 있다.
여전히 또 다른 양태에서, 단클론성 항체 또는 항체 단편이 제공되고, 여기서, 상기 항체는 도 22로부터의 클론 쌍 형성 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 한다. 상기 단클론성 항체 또는 항체 단편은 도 21로부터의 클론 쌍 형성 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 항체 또는 항체 단편은 도 21로부터의 클론 쌍 형성 서열과 70%, 80%, 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 항체 또는 항체 단편은 도 21로부터의 클론 쌍 형성 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 아미노산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 항체 또는 항체 단편은 도 21로부터의 클론 쌍 형성 서열과 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 항체 단편은 재조합 ScFv (단일쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편일 수 있다. 상기 항체는 키메라 항체, 이특이적 항체 및/또는 IgG일 수 있다. 상기 항체는 인간화되고/되거나 최적화될 수 있다.
또 다른 양태는 하이브리도마 암호화에 관한 것이고, 여기서, 상기 항체는 도 22로부터의 클론 쌍 형성 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 특징으로 한다. 상기 단클론성 항체는 도 21로부터의 클론 쌍 형성 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 항체는 도 21로부터의 클론 쌍 형성 서열과 70%, 80%, 또는 90% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 항체는 도 21로부터의 클론 쌍 형성 서열에 따른 경쇄 및 중쇄 가변 아미노산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 상기 항체는 도 21로부터의 클론 쌍 형성 서열과 95% 동일성을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변 아미노산 서열에 의해 암호화될 수 있다.
특허청구범위 및 명세서에서 용어 "포함하는"과 연계하여 사용되는 경우 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만 또한 "하나 이상," "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다. 용어 "약" 은 진술된 수치의 플러스 또는 마이너스 5%를 의미한다.
본원에 기재된 임의의 방법 및 조성물은 본원에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 함께 수행될 수 있는 것으로 고려된다. 본 출원의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 하기의 상세한 설명 및 특정 예는 본 발명의 특정 양태를 표지하면서 단지 설명을 목적으로 주어지는 것으로 이해되어야하는데 그 이유는 본원의 개시내용의 취지 및 범위내 다양한 변화 및 변형이 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명할것이기 때문이다.
하기의 도면은 본원 명세서의 일부를 형성하고 본원의 개시내용의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본원의 개시내용은 본원에 제공된 특정 양태의 상세한 설명과 조합하여 하나 이상의 도면을 참조로 보다 양호하게 이해될 수 있다.
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도 1A-D - 1차 인간 AML 세포에서 LILRB의 발현. (도 1A1) LILRB4는 약 50% 시험된 인간 AML 발생빈도에서 발현된다. (도 1B) LILRB4는 인간 단핵구 AML 세포 (M5b, 말초 혈액)에 대해 CD14 보다 양호한 마커이고 LILRB4를 포함하는 LILRB는 백혈병 줄기 세포 마커 CD34와 동시 발현될 수 있다.
도 2A-D - 개별 LILRB1, 2, 3, 4의 발현은 AML 환자의 전체 생존율과 역으로 서로 관련된다. 데이터는 TCGA 데이터베이스 (tcga-data.nci.nih.gov/tcga/; accessed November 5, 2012)로부터 기원한다. n = 92, p <0.05.
도 3A-D - LILRB3 또는 LILRB4에 대한 shRNA의 발현은 세포 성장을 강하게 억제하였다. (도 3A) THP-1 및 MV4-11 인간 AML 세포 둘다는 이들의 세포 표면 상에 LILRB4를 발현한다. (도 3B) shRNA는 실시간 RT-PCR에 의해 계측된 바와 같이 개별 LILRB 발현을 특이적으로 녹다운시키도록 설계하였다. (도 3C-D) THP-1 (도 3C) 및 MV4-11 (도 3D) 세포는 각각 개별 LILRB에 표적화된 shRNA를 발현하는 Pll3.7 렌티바이러스 또는 스크램블된 대조군으로 감염시켰다. LILRB3 또는 LILRB4에 대한 shRNA의 발현은 세포 성장을 강하게 억제하였다.　
도 4 - 웨스턴 블롯팅을 위한 LILRB Ab. 표지된 mAb는 웨스턴 블롯팅에서 각각 인간 LILRB 2, 3, 4에 결합한다.
도 5 - LILRB 과발현 293T 세포상의 LILRB Ab' 결합. 표지된 2㎍/ml mAb는 유동 세포측정기에 의해 계측된 바와 같이 인간 LILRB2, 3, 4 과발현 293T 세포에 결합한다.
도 6 - 리포트 세포에 대한 고정화된 (코팅된) LILRB Ab의 효과. 인간 LILRB2, 3, 4를 표적화하도록 개발된 표지된 고정화된 mAb는 각각 LILRB2,3,4의 활성화를 유도한다. 가용성 항-LILRB4가 키메라 수용체 리포터의 활성을 억제함을 보여주는 도 7과 함께, 상기 결과는 이들 항체가 각각 LILRB2, 3, 4에 대해 차단 항체임을 표지한다. 표지된 mAb는 조직 배양 접시 상에 고정화시켰다(10㎍/ml). LILRB2, 3, 4 키메라 수용체 리포터 세포는 이들 접시에서 배양하였다. GFP 유도는 12시간째에 유동 세포측정기에 의해 측정하였다. LILRB 효능제 및 길항제의 활성을 측정할 수 있는 키메라 수용체 리포터 시스템은 문헌[참조: Deng et al., 2014 Blood, 124(6):924-35]에 기재되어 있다.
도 7 - 가용성 항-LILRB4 mAb는 리포터 세포의 GFP 유도를 억제한다. C84, C53, C92, C201을 포함하는 항체는 LILRB4에 대한 키메라 수용체 리포터 시스템에서 코팅된 항체에 의한 GFP 유도를 억제한다.
도 8-9 - THP-1 MV4-11 세포는 유동 세포측정기에 의해 계측된 바와 같이 세포 표면상에서 LILRB4를 발현한다.
도 10-12 - C84 (항-hLILRB4)는 정맥내 이종이식된 NSG 마우스에서 인간 AML 발육을 억제한다. LILRB4+인 4 x 106 인간 AML 세포주 THP-1은 NSG 마우스로 정맥내 이식하였다. 200㎍의 C84는 THP-1 세포가 이식되었을때 제1일 부터 개시하여 3일 마다 (총 8회 동안) 각각의 마우스로 정맥내 주사하였다. PBS 및 마우스 IgG는 대조군으로서 작용하였다. 종양 성장은 수용자 간 (도 10-11) 및 골수(도 12)에서 백혈병 침윤을 조사함에 의해 시간 경과에 따라 모니터링하였다. hCD45를 사용하여 유동 세포측정에 의해 인간 백혈병 세포를 검출하였다.
도 13 - C84는 모든 시험된 LILRB4+ 인간 백혈병 세포의 종양 접목을 억제한다. LILRB4+ 인간 백혈병 세포 (THP-1 및 MV4-11)에 의해 형성된 종양만이 C84에 의해 효과적으로 억제될 수 있다. LILRB4- 세포 (U937)에 의해 형성된 종양은 C84에 의해 억제될 수 없다. THP-1, MV4-11, 및 U937 세포에 의해 이식된 수용자 간, 비장, 골수 및 말초 혈액에서 백형병 침윤을 조사함에 의해 종양 성장 비교를 보여준다. hCD45를 사용하여 유동 세포측정기에 의해 인간 백혈병 세포를 검출하였다. LILRB4는 유동 세포 측정에 의해 THP-1 및 MV4-11 세포의 세포 표면 상에서 검출되었지만 U937 세포 상에서는 검출되지 않았다(하부 좌측 패널).
도 14 - C84 (항-hLILRB4)는 정맥내 이종이식된 NSG 마우스(8개 상이한 환자)에서 1차 환자 AML의 발육을 억제한다. LILRB4+인 4~10 x 106의 1차 인간 AML 세포는 NSG 마우스로 정맥내 이식하였다. 200㎍의 C84는 AML 세포가 이식되었을 때의 첫째날로부터 시작하여 주당 2회 각각의 마우스에 정맥내 주사하였다. 마우스 IgG는 대조군으로서 사용하였다. 종양 성장은 수용자 간, 비장, 골수 및 말초 혈액에서 백혈병 침윤을 조사함에 의해 시간 경과에 따라 모니터링하였다. hCD45 및 hLILRB4를 사용하여 유동 세포측정에 의해 인간 백혈병 세포를 검출하였다.
도 15 - hCB-HSC-유래된 인간화된 NSG 마우스에서 항-hLILRB4의 시험. 3 x 104의 인간 척수 혈액 CD34+ 세포는 준치사량으로 조사된 (250 래드) NSG 마우스로 이식하고 다중 혈통 인간 조혈 재구성은 이식 후 21일째 부터 41일째까지 다양한 시점에서 확인하였다. 42일째에, 1 x 106 인간 THP-1-Luc-GFP (생체내 실시간 트랙킹을 촉진시키기 위해 루시퍼라제 및 GFP를 안정하게 발현하는 THP-1 세포) AML 세포는 NSG 마우스에 정맥내 이식하였다. 200㎍의 C84는 AML 세포가 이식된 후 즉시 각각의 마우스로 정맥내 주사하였다. 마우스 IgG는 대조군으로서 사용하였다. 종양 성장은 형광 이미지화에 의해 시간 경과에 따라 모니터링하였다.
도 16 - 21개의 토끼 항-인간 LILRB4 mAb의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열.
도 17 - C84는 이종이식된 마우스에서 1차 AML 세포에 의해 개시되는 AML 발육을 차단한다. 21개 토끼 항-인간 LILRB4 mAb의 중쇄 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열.
도 18a-u - ELISA에 의해 측정된 바와 같이 LILRB4에 결합하는 이들 항체의 EC50 및 키메라 LILRB4 리포터 시스템을 쪽으로 고정화된 항체의 활성화 능력 (따라서, 가용성 항체의 차단 능력).
도 19 - LILRB1-5에 대한 mAb의 항-백혈병 효능 및 교차-반응성. 항-백혈병 효능은 표지된 항체를 AML 이종이식체 모델로 투여함에 의해 계측하였다.
도 20 - 4개의 개별 항-LILRB4 항체의 Ig 이소형 분류.
도 21-22 - 개별 항-LILRB 항체의 가변 영역의 서열 분석 및 이소형 분류 결과.
도 23 - SDS-PAGE에 의해 계측된 바와 같은 키메라 항-C84 (키메라 ab MHC-C84)의 발현.
도 24 - 키메라 ab MHC-C84는 유동 세포측정기에 의해 계측된 바와 같이 C84와 같이 LILRB4+ THP-1 세포에 결합한다.
도 25 - 유동 세포측정기에 의해 계측된 바와 같이 키메라 ab MHC-C84는 C84와 같이 LILRB4 키메라 수용체 리포터 세포에 결합한다.
도 26 - 키메라 수용체 리포터 검정에 의해 계측된 바와 같이 키메라 ab MHC-C84는 C84와 같이 LILRB4에 대한 차단 항체이다.
도 27 - 키메라 ab MHC-C84는 이종이식체 모델에서 AML 발육을 (본래의 mAb C84와 동일하게 또는 양호하게) 억제한다. 3 x 106 인간 AML 세포주 THP-1-Luc-GFP (생체내 실시간 트랙킹을 촉진시키기 위해 루시퍼라제 및 GFP를 안정하게 발현하는 THP-1 세포)는 NSG 마우스로 정맥내 이식하였다. 200㎍ MHC-C84 또는 C84는 3 x 106 THP-1-Luc-GFP 세포의 이식 직후 30분-1 시간에 단지 1회 각각의 마우스로 정맥내 주사사였다. PBS 또는 마우스 IgG는 대조군으로서 사용하였다. 종양 성장은 1개월 후 수용자 간, 비장, 골수 및 말초 혈액에서 백혈병 침윤을 조사함에 의해 모니터링하였다. hCD45를 사용하여 유동 세포측정기에 의해 인간 백혈병 세포를 검출하였다.
도 28 - 형광 이미지화에 의해 계측된 바와 같이 키메라 ab MHC-C84는 이종이식체 모델에서 AML 발육을 억제한다. 루시퍼라제를 안정하게 발현하는 3 x 106 인간 AML 세포주 THP-1( THP-1-Luc-GFP 세포로서)은 NSG 마우스에 정맥내 이식하였다. 200㎍의 MHC-C84 또는 C84는 3 x 106 THP-1-Luc-GFP 세포의 이식 직후 30분-1hr에 단지 1회 각각의 마우스에 정맥내 주사하였다. 마우스 IgG는 대조군으로서 사용하였다. 종양 성장은 발광 이미지화에 의해 시간 경과에 따라 모니터링하였다. 모든 조건은 0일째 (종양 이식 후 4시간) 동일한 루시퍼라제 강도를 갖고, MHC-C84 또는 C84 처리된 마우스는 시간 경과에 따라 어떠한 루시퍼라제 신호를 나타내지 않았다(이들을 16, 18, 및 21일째에 대조군과 비교한다).
도 29A-G - 항-LILRB4는 AML 세포 이행을 억제하고 이동을 가속화한다. (도 29A) C84는 MV4-11 세포 가소성을 억제하지 않는다. 1 x 105 MV4-11 세포는 트랜스웰의 상부 챔버에서 배양하고 18시간 동안 100 ㎍/ml의 C84 또는 mIgG로 처리하였다. 하부 챔버에서 세포를 계수하였다. (도 29B) C84는 내피 세포를 통한 MV4-11 세포 이행을 억제한다. 3 x 105 HUVEC 세포는 3일 동안 트랜스웰의 막 상에서 배양하였다. 1 x 105 MV4-11 세포는 트랜스웰의 상부 챔버에서 배양하고 18시간동안 100㎍/ml의 C84 또는 mIgG로 처리하였다. 하부 챔버에서 세포를 계수하였다. (도 29C) C84는 MV4-11 세포 귀소성(homing)을 억제한다. 5 x 106 MV4-11 세포는 각각 NSG 마우스로 정맥내 주사하고 상기 마우스는 8시간 또는 20시간 후 희생시켰다. hCD45를 사용하여 유동 세포측정기에 의해 인간 백혈병 세포를 검출하였다. 수용자 간, 비장 및 골수에서 백혈병 세포의 %는 말초 혈액에서의 것에 의해 정규화하였다. (도 29D) C84는 HSC의 귀소성을 억제하지 않는다. 1 x 107 인간 척수 혈액 단핵구 세포는 각각의 NSG 마우스로 정맥내 주사하고 상기 마우스는 20시간 후 희생시켰다. hCD45 및 hCD34를 사용하여 유동 세포측정기에 의해 인간 HSC를 검출하였다. (도 29E-F) C84는 PB로의 MV4-11 이동을 가속화한다. 5 x 106 MV4-11 세포는 각각의 NSG 마우스에 정맥내 주사하였다. 말초 혈액에서 백혈병 세포는 0일째 (MV4-11 세포 이식 후 3일), 1일째 및 4일째에 조사하였다. 200㎍ C84 또는 mIgG는 0일째 및 1일째에 각각의 마우스에 정맥내 주사하였다. 마우스는 4일째에 희생시켰다. hCD45를 사용하여 유동 세포측정기에 의해 인간 백혈병 세포를 검출하였다. (도 29G) 화학약물 시타라비신을 사용한 상승작용적 C84 처리는 AML 발육을 억제한다. 루시퍼라제를 안정하게 발현하는 1 x 106 인간 AML THP-1 세포 (THP-1-Luc-GFP 세포로서)는 NSG 마우스에 정맥내 이식하였다. 10 mg/kg의 시타라비신은 백혈병 세포의 이식 후 6일 또는 14일로부터 시작하여 매일 각각의 마우스에 복강내 주사하였다. 200 ㎍의 C84 또는 mIgG는 백혈병 세포의 이식 후 6일 또는 14일로부터 시작하여 주당 2회 각각의 마우스에 정맥내 주사하였다. 마우스는 백혈병 세포의 이식 후 21일째에 희생시켰다. hCD45를 사용하여 유동 세포측정기에 의해 인간 백혈병 세포를 검출하였다.
도 30A-U - 항-LILRB4는 항암 효과를 위해 T 세포 면역력을 자극한다. (도 30A-C) c84는 CTL LILRB4에 의해 CTL의 억제를 억압한다. 건강한 공여자의 hPBMC로부터 단리된 5 x 104 CD8+ T 세포는 2일 동안 항-CD3/CD28/CD137-코팅된 비드로 자극하거나 자극하지 않았다. 이어서, 5 x 103 THP-1-Luc-GFP 세포는 이들 T 세포와 공동 배양하였고 5일동안 500㎍/ml C84 또는 mIgG로 처리하였다. CD8 및 CD28을 사용하여 유동 세포측정기에 의해 인간 CTL 세포를 검출하고; GFP를 사용하여 인간 백혈병 세포를 검출하였다. (도 30D) c84는 CTL 사이토킨 생산을 증가시킨다. C84 또는 mIgG로 처리된 자극된 CTL 세포 및 THP-1 세포의 공동 배양물로부터의 세포 상청액을 사용하여 인간 사이토킨 어레이에 의해 사이토킨 생산을 조사하였다. (도 30E) THP-1은 PBMC-구동된 인간화된 NSG 마우스로 접목될 수 없다. 1 x 107 인간 PBMC는 각각의 NSG 마우스로 정맥내 주사하였다. hPBMC의 이식후 3주째에, 이들 마우스는 30 내지 50% 인간 T 세포 접목을 가졌다. 이어서, 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 1 x 106 인간 AML THP-1 세포 (THP-1-Luc-GFP 세포로서)는 이들 hPBMC-인간화된 NSG 마우스 또는 연령 일치된 정규 NSG 마우스에 정맥내 이식하였다. 종양 성장은 형광 이미지화에 의해 시간 경과에 따라 모니터링하였다. (도 30F) C84는 PBMC-구동된 인간화된 NSG 마우스에서 THP-1 세포의 피하 이식을 억제한다. 1 x 107 인간 PBMC는 각각의 NSG 마우스로 정맥내 주사하였다. hPBMC의 이식 후 3주째에, 이들 마우스는 30 내지 50% 인간 T 세포 접목을 가졌다. 이어서, 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 1 x 106 인간 AML THP-1 세포 (THP-1-Luc-GFP 세포로서)는 주당 2회 200㎍ C84 또는 mIgG 처리로 이들 hPBMC 인간화된 NSG 마우스에 피하 이식하였다. 종양 성장은 발광 이미지화에 의해 시간 경과에 따라 모니터링하였다. (도 30G-U) C84는 백혈병 발육을 억제하고 인간 척수 혈액-인간화된 NSG 마우스에서 CD8+ T 서프레서 세포를 감소시킨다. hCB-인간화된 마우스는 도 15에 나타낸 바와 동일하게 수득하였다. GFP를 사용하여 인간 백혈병 세포를 검출하였고, CD19 및 CD20을 사용하여 CB-유래된 인간 B 세포를 검출하고, CD11b, CD14 및 LILRB4를 사용하여 CB-유래된 인간 골수 세포를 검출하고, CD4 및 CD8을 사용하여 CB 유래된 인간 T 세포를 검출하고, CD8, CD28 및 CD40L을 사용하여 CB-유래된 인간 CTL 및 T 서프레서 세포를 검출하였다.
도 31 - AML 발육에 대한 항-LILRB4의 Fc-의존성 및 Fc-독립적 효과. 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 1 x 106 인간 AML THP-1 세포(THP-1-Luc-GFP 세포로서)는 NSG 마우스에 정맥내 이식하였다. 200㎍ MHC-C84 또는 MHC-C84-N297A는 동일한 날짜 ("0일"로서) 또는 1 x 106 THP-1-Luc-GFP 세포의 이식 후 3일째 ("3일"로서)에 각각의 마우스에 정맥내 주사하였다. 항-CMV 인간 IgG 항체 (LX-D2-43)는 대조군으로서 사용하였다. 종양 성장은 발광 이미지화에 의해 시간 경과에 따라 모니터링하였고 hCD45를 사용하여 유동 세포측정기에 의해 인간 백혈병 세포를 검출하였다.
도 32A-E - APOE는 잠재적 LILRB4 리간드이다. (도 32A) 인간/마우스 혈청, APOE 및 LFA-1은 LILRB4 활성화를 유도하고; (도 32B) APOE는 인간 LILRB4 및 마우스 PIRB를 활성화시키고; (도 32C) SPR은 APOE가 고친화성 Kd=2.485로 LILRB4에 결합함을 보여주고; (도 32D-E) APOE-녹아웃은 마우스 AML 세포 발육을 지연시키고 전체 생존율을 연장시킨다. GFP를 안정적으로 발현하는 1 x 106 마우스 AML C1498 세포는 C57BL/6 마우스 또는 APOE-녹아웃 마우스에 정맥내 이식하였다. GFP를 사용하여 C1498 세포의 이식 후 20일째에 말초 혈액에서 유동 세포측정기에 의해 마우스 백혈병 세포를 검출하였다.
본원 발명자는 다수의 항-LILRB mAb를 개발하였고, 이의 각각은 다양한 이종이식된 마우스 모델에서 인간 AML 발육을 효율적으로 차단한다. 이들 흥미로운 결과는 LILRB가 백혈병 줄기 세포 및 백혈병 발육의 활성을 지지하지만 정상적인 조혈을 위해 중요하지 않음을 표지한다. 특히, 처음으로, 본원 발명자는 항-LILRB4가 인간 AML(이종이식된 마우스에서 발육된 인간 환자 AML을 포함하는)의 발육을 억제함을 입증한다. 중요하게, 이들은 10개의 항-LILRB mAb의 가변 영역의 서열을 수득하였고 인간 불변 영역을 갖는 키메라 항체를 제조하였다. 본원 발명자는 하나의 상기 키메라 항체(MHC-C84)가 본래의 mAb C84와 동일한 결합 성질을 보유할 뿐만 아니라 이종이식체 모델에서 증진된 항-백혈병 활성을 가짐을 보여주었다. 따라서, 항-LILRB 항체를 사용하여 이들의 세포 표면 상에 관련 LILRB를 발현하는 백혈병 및 다른 암을 치료할 수 있다. 이들을 또한 사용하여 LILRB 성분을 갖는 면역 질환을 치료할 수 있다. 이들 및 개시내용의 다른 측면은 하기에 논의된다.
I. LILR
백혈구 면역글로불린형 수용체 (LILR)는 세포외 면역글로불린 도메인을 갖는 수용체 패밀리이다. 이들은 또한 CD85, ILT 및 LIR로서 공지되어 있고, 광범위한 면역 세포 상에 면역조절 효과를 발휘할 수 있다. 이들 수용체를 암호화하는 인간 유전자는 염색체 영역 19q13.4에서 유전자 클러스터에서 발견된다. 이들은 LILRA1, LILRA2, LILRA3, LILRA4, LILRA5, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3, LILRB4, LILRB5, LILRB6 또는 LILRA6, 및 LILRB7 또는 LILRA5를 포함한다. LILR의 서브세트는 MHC 부류 I 분자 (또한 인간에서 HLA 부류 I로서 공지된)를 인지한다. 이들 중에서, 억제 수용체인 LILRB1 및 LILRB2는 b2m-관련 복합체에 우선적으로 결합하는 전형적 및 비-전형적 MHC 대립형질유전자에 대해 광범위한 특이성을 보여준다. 대조적으로, 활성화 수용체 LILRA1 및 LILRA3은 MHC 부류 I 및 특히 HLA-C 대립형질유전자의 b2m-독립적 유리된 중쇄를 선호한다.
A. LILRB1
백혈구 면역글로불린형 수용체 서브패밀리 B 구성원 1은 인간에서 LILRB1 유전자에 의해 암호화된 단백질이다. 상기 유전자는 백혈구 면역글로불린형 수용체 (LIR) 패밀리의 구성원이고 이는 염색체 영역 19q13.4에서 유전자 클러스터에서 발견된다. 상기 암호화된 단백질은 2개 또는 4개의 세포외 면역글로불린 도메인, 막투과성 도메인 및 2개 내지 4개의 세포질 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프 (ITIM)을 함유하는 LIR 수용체의 서브패밀리 B 부류에 속한다. 상기 수용체는 면역 세포 상에서 발현되고 이는 항원 제시 세포 상의 MHC 부류 I 분자에 결합하고 면역 반응의 자극을 억제하는 음성 신호를 변환시킨다. LILRB1은 또한 인간 위암 세포에서 발현되는 것으로 보고되었고 종양 성장을 증진시킬 수 있다(문헌참조: Zhang et al., 2012). 이것은 염증 반응 및 세포독성을 조절하여 면역 반응에 집중되고 자가반응성을 제한하는 것을 도와주는 것으로 사료된다. 상이한 이소형을 암호화하는 다발성 전사체 변이는 상기 유전자에 대해 발견되었다.
B. LILRB2
백혈구 면역글로불린형 수용체 서브패밀리 B 구성원 2는 인간에서 LILRB2 유전자에 의해 암호화된 단백질이다. 상기 유전자는 백혈구 면역글로불린형 수용체 (LIR) 패밀리의 구성원이고 이는 염색체 영역 19q13.4에서 유전자 클러스터에서 발견된다. 상기 암호화된 단백질은 2개 또는 4개의 세포외 면역글로불린 도메인, 막투과성 도메인 및 2개 내지 4개의 세포질 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프 (ITIM)를 함유하는 LIR 수용체의 서브패밀리 B 부류에 속한다. 상기 수용체는 면역 세포 상에서 발현되고 이는 항원 제시 세포 상의 MHC 부류 I 분자에 결합하고 면역 반응의 자극을 억제하는 음성 신호를 변환시킨다. 이것은 염증 반응 및 세포독성을 조절하여 면역 반응에 집중되고 자가반응성을 제한하는 것을 도와주는 것으로 사료된다. 상기 수용체는 또한 인간 비-소 세포 폐암 세포 상에서 발현된다 (문헌참조: Sun et al., 2008). 상이한 이소형을 암호화하는 다발성 전사체 변이는 상기 유전자에 대해 발견되었다. LILRB2는 PTPN6과 상호작용하는 것으로 나타났다.
C. LILRB3
백혈구 면역글로불린형 수용체 서브패밀리 B 구성원 3은 인간에서 LILRB3 유전자에 의해 암호화된 단백질이다. 상기 유전자는 백혈구 면역글로불린형 수용체 (LIR) 패밀리의 구성원이고 이는 염색체 영역 19q13.4에서 유전자 클러스터에서 발견된다. 상기 암호화된 단백질은 2개 또는 4개의 세포외 면역글로불린 도메인, 막투과성 도메인 및 2개 내지 4개의 세포질 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프 (ITIM)을 함유하는 LIR 수용체의 서브패밀리 B 부류에 속한다. 상기 수용체는 면역 세포 상에서 발현되고 이는 항원 제시 세포 상의 MHC 부류 I 분자에 결합하고 면역 반응의 자극을 억제하는 음성 신호를 변환시킨다. 이것은 염증 반응 및 세포독성을 조절하여 면역 반응에 집중되고 자가반응성을 제한하는 것을 도와주는 것으로 사료된다. 상이한 이소형을 암호화하는 다발성 전사체 변이는 상기 유전자에 대해 발견되었다.
D. LILRB4
백혈구 면역글로불린형 수용체 서브패밀리 B 구성원 4는 인간에서 LILRB4 유전자에 의해 암호화된 단백질이다. 상기 유전자는 백혈구 면역글로불린형 수용체 (LIR) 패밀리의 구성원이고 이는 염색체 영역 19q13.4에서 유전자 클러스터에서 발견된다. 상기 암호화된 단백질은 2개 또는 4개의 세포외 면역글로불린 도메인, 막투과성 도메인 및 2개 내지 4개의 세포질 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프 (ITIM)을 함유하는 LIR 수용체의 서브패밀리 B 부류에 속한다. 상기 수용체는 면역 세포 상에서 발현되고 이는 항원 제시 세포 상의 MHC 부류 I 분자에 결합하고 면역 반응의 자극을 억제하는 음성 신호를 변환시킨다. 수용체는 또한 항원을 포획하고 제공하는 기능을 할 수 있다. 이것은 염증 반응 및 세포독성을 조절하여 면역 반응에 집중되고 자가반응성을 제한하는 것을 도와주는 것으로 사료된다. LILRB4는 또한 인간 위암 세포에서 발현되는 것으로 보고되었고 종양 성장을 증진시킬 수 있다(문헌참조: Zhang et al., 2012).상이한 이소형을 암호화하는 다발성 전사체 변이는 상기 유전자에 대해 발견되었다. LILRB4는 PTPN6와 상호작용하는 것으로 나타났다.
E. LAIR1
백혈구 관련 면역글로불린형 수용체 1은 인간에서 LAIR1 유전자에 의해 암호화된 단백질이다. LAIR1은 또한 CD305(분화 305의 클러스터)로서 지정되었다. LAIR1은 하나의 세포외 Ig형 도메인 및 2개의 세포내 ITIM을 함유하는 I형 막투과성 당단백질이다. LILRB를 암호화하는 유전자 처럼, lair1은 인간 염색체 19q13.4 상의 백혈구 수용체 복합체 (LRC)에 국소화된다. LAIR1은 콜라겐에 결합하고 이의 ITIM은 SHP-1 및 SHP-2를 동원한다. LAIR1은 T 세포, B 세포, 천연 킬러 (NK) 세포, 대식세포 및 수지상 세포, 및 인간 CD34+ 세포를 포함하는 조혈 선조체에서 발현된다. 본원 발명자는 LAIR1이 AML 줄기 세포 및 분화된 AML 및 ALL 세포 상에서 발현되고 이의 억제가 AML-SC 활성 및 백혈병 발육을 차단시킴을 입증하였다 (공개되지 않은 데이터).
II. 암
A. 암
과증식성 질환은 세포가 비조절적으로 번식하기 시작하게 하는 임의의 질환과 관련되지만 전형적인 예는 암이다. 암의 주요 요소 중 하나는 세포의 정상적 아폽토시스 주기가 중단되는 것이고 따라서 세포의 성장을 중단하는 제제는 이들 암을 치료하기 위한 치료학적 제제로서 중요하다. 본원에서, 본원에 기재된 튜불라이신 유사체는 감소된 세포 수를 유도하는데 사용될 수 있고 이와 같이 잠재적으로 다양한 유형의 암 세포주를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 튜불라이신은 실제로 임의의 악성종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 여기서, 단지 요구조건은 암 세포의 표면 상에 특히 암 줄기 세포의 표면 상의 LILRB의 존재이다.
본원의 개시내용에 따라 치료될 수 있는 암 세포는 방광, 암, 골, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 췌장, 고환, 혀, 자궁 경관 또는 자궁으로부터 기원하는 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.　 추가로, 상기 암은 구체적으로 하기의 조직학적 유형일 수 있고 이는 하기로 제한되지 않는다: 신생물, 악성종양; 암종; 암종, 비분화된; 거대 및 스핀들 세포 암종; 소 세포 암종; 유두 암종; 편평 세포 암종; 림프상피성 암종; 기저 세포 암종; 섬모기질 암종; 전이 세포 암종; 유두 전이 세포 암종; 선암종; 가스트린종, 악성종양; 담관암종; 간세포 암종; 조합 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선낭 암종; 선종풀립에서 선암종; 선암종, 가계성 대장 용종증; 고형 암종; 카시노이드 종양, 악성종양; 기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 혐색소성 암종; 호산성 암종; 호산성 선암종; 호염기성 암종; 청명한 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포 선암종; 담관 및 여포 선암종; 비캅셀화 경화증 유발 암종; 부신 외피 암종; 자궁 내막 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점액표피모양 암종; 낭샘암종; 유두 낭샘암종; 유두 장액 낭샘암종; 점액소 낭샘암종; 점액소 선암종; 시그넷 환 세포 암종; 침윤 관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증 암종; 파제트 질환, 유방; 선방 세포 암종; 선편평세포암종; 선암종 w/편평 화생; 흉선종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 포막종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 남성모세포종, 악성; 세르톨리 세포 암종; 레이디그 세포 종양, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방외 신경절종, 악성; 갈색세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무흑색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 자이언트 색소 모반에서 악성 흑색종; 유상피 세포 흑색종; 청색 모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유성 조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 간질 육종; 혼합 종양, 악성; 뮬러리안 혼합 종양; 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 간엽종, 악성; 브레너 종양, 악성; 가엽 종양, 악성; 활막 육종; 중피종, 악성; 배변장애종; 배아 암종; 기형종, 악성; 간유두암종, 악성; 융모막암종; 중신종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관주위세포종, 악성; 림프관 육종; 골육종; 피질주위 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 간엽 연골육종; 골의 자이언트 세포 종양; 어윙 육종; 치원성종양, 악성; 법랑모세포 치원성종양; 법랑모세포종, 악성; 범랑모세포 섬유육종; 송과체부종양, 악성; 척삭종; 신경교종, 악성; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유 성상세포종; 성아세포종; 교모세포종; 핍지교종; 희돌기교아세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절아세포종; 신경모세포종; 망막아세포종; 후신경원성 종양; 뇌수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경집종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨 질환; 파라육아종; 악성 림프종, 소 림프구성; 악성 림프종, 거대 세포, 확산; 악성 림프종, 여포성; 균상식육종; 다른 특정 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 체세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 체세포 백혈병; 거핵아구 백혈병; 골수 육종; 및 모발 세포 백혈병.　특정 측면에서, 종양은 골육종, 혈관육종, 횡문근육종, 평활근육종, 어윙 육종, 교모세포종, 신경모세포종 또는 백혈병을 포함할 수 있다.
B. 급성 골수성 백혈병
또한, 급성 골수성 백혈병 또는 급성 비림프구성 백혈병 (ANLL)으로서 공지된 급성 골수성 백혈병 (AML)은 골수에 축적되고 정상 혈액 세포의 생성을 방해하는 비정상적 백혈구 세포의 신속한 성장을 특징으로 하는 혈액 세포의 골수 세포주의 암이다. AML은 성인에게 영향을 주는 가장 통상의 급성 백혈병이고 이의 발생빈도는 고령화와 함께 증가한다. AML은 미국에서 암 사망의 대략 1.2%를 차지하는 비교적 희귀 질환이지만, 이의 발생빈도는 인구 고령화에 따라 증가하는 것으로 예상된다.
AML의 증상은 정상 골수를 백혈병 세포로 대체하여 유발되고, 이는 적혈구 세포, 혈소판, 및 정상 백혈구 세포의 감소를 유발한다. 이들 증상은 피로, 숨가쁨, 용이한 멍 및 출혈 및 감염의 증가된 위험을 포함한다. 여러 위험 인자들 및 염색체 비정상이 식별되었지만 구체적 원인은 명백하지 않다. 급성 백혈병으로서, AML은 신속하게 진행하고 전형적으로 치료되지 않은 상태로 유지된다면 수주 또는 수개월내 치명적이다.
AML은 여러 서브타입을 갖고; 치료 및 예후는 서브타입 간에 다양하다. 5년 생존율은 15 내지 70%로 다양하고 재발율은 서브타입에 따라 33 내지 78%로 다양하다. AML은 처음에 관해를 유도하는 화학요법으로 처리되고; 환자는 계속 추가의 화학요법 또는 조혈 줄기 세포 이식을 받을 수 있다. AML의 유전학에 대한 최근 연구는 어느 약물 또는 약물들이 특정 환자에 대해 최상으로 작용할 수 있는지 얼마나 오랫동안 환자가 생존할 수 있는지를 예측할 수 있는 시험의 유용성을 유도하였다.
AML의 대부분의 징후 및 증상은 정상 혈액 세포를 백혈구 세포로 대체하여 유발된다. 정상 백혈구 세포 생산의 부재는 환자가 감염에 민감해질 수 있도록 하고; 백혈병 세포 자체는 혈액 세포 전구체로부터 유래되어 이들은 어떠한 감염 퇴치 능력을 갖지 않는다. 적혈구 세포 수에서의 감소 (빈혈)는 피로, 창백함 및 숨가쁨을 유발할 수 있다. 혈소판의 부재는 최소 외상으로 용이한 멍 또는 출혈을 유발할 수 있다.
AML의 조기 징후는 흔히 모호하고 비특이적이고 인플루엔자 또는 다른 통상의 질병의 것들과 유사할 수 있다. 일부 일반화된 증상은 열, 피로, 체중 감소 또는 식욕 상실, 숨가쁨, 빈혈, 용이한 멍 또는 출혈, 일혈점 (편평한, 출혈에 의해 유발된 피부하에 핀의 머리 크기 반점), 골 및 관절 통증, 및 지속적이거나 빈번한 감염을 포함한다.
비장의 비대는 AML에서 발생하지만 전형적으로 온화하고 비증상성이다. 림프절 종창은 AML에서 희귀하고 이는 급성 림프구아성 백혈병과 대조적이다. 피부는 백혈병 진피 형태로 시간 약 10%에 관여한다. 드물게, 피부의 부신생물 염증인 스위트 증후군은 AML과 함께 발생할 수 있다.
AML을 갖는 일부 환자들은 백혈병 세포의 잇몸 조직으로의 침윤 때문에 잇몸의 종창을 경험할 수 있다. 드물게, 백혈병의 제1 징후는 골수의 외부에 고형 백혈병 매쓰 또는 종양의 발달일 수 있고 이는 녹색종으로 불리운다. 때로는, 인간은 무증상을 보여줄 수 있고 백혈병은 통상의 혈액 시험 동안에 우연히 발견될 수 있다.
AML을 발병시키는 다수의 위험 인자들이 식별되었고 이는 다음을 포함한다: 다른 혈액 장애, 화학적 노출, 이온화 방사선 및 유전학.
"전백혈병(Preleukemic)" 혈액 장애, 예를 들어, 골수형성이상증후군 또는 골수이형성 질환이 AML로 진행할 수 있고; 정확한 위험은 MDS/MPS의 유형에 의존한다. 항암 화학요법, 특히 알킬화제로의 노출은 후속적으로 AML을 발병시킬 위험을 증가시킬 수 있다. 상기 위험은 화학요법 후 약 3 내지 6년째에 최고이다. 다른 화학요법 제제, 구체적으로 에피포도필로톡신 및 안트라사이클린은 또한 치료 관련 백혈병과 관련되었다. 이들 치료 관련 백혈병은 흔히 백혈병 세포에서 특이적 염색체 비정상과 관련된다. 벤젠 및 다른 방향족 유기 용매로의 직접적 화학 노출은 AML의 원인으로서 논란이 있다. 벤젠 및 이의 많은 유도체는 시험관내 암성인 것으로 공지되어 있다. 일부 연구는 벤젠으로의 직접적 노출과 AML의 증가된 위험 간의 관련성을 제안하였지만 다른 연구는 기인성 위험을 제안하였고 이는 있더라도 약간이다. 고량의 이온화 방사선 노출은 AML의 위험을 증가시킬 수 있다. AML에 대한 유전적 위험이 존재하는 것으로 나타난다. 단독으로 우연히 예측된 것 보다 높은 비율에서 가계내 AML 발병의 다수의 발생빈도가 보고되었다. 여러 선천적 병태는 백혈병의 위험을 증가시킬 수 있고, 대부분 통상적인 것은 아마도 다운 증후군이고 이는 AML 위험에서 10 내지 18배 증가와 관련된다.
AML의 진단의 제1 단서는 완전한 혈액 수에 대한 비정상적 결과이다. 과량의 비정상적 백혈구 세포 (백혈구 증가증)는 통상의 발견이고 백혈병 모세포는 때때로 나타나며, AML은 또한 혈소판, 적혈구 세퐁서의 단리된 감소 또는 심지어 낮은 백혈구 세포 수(백혈구 감소증)로 존재할 수 있다. AML의 추정 진단은 순환 백혈병 모세포가 존재하는 경우 말초 혈액 자국의 조사를 통해 수행될 수 있고 명확한 진단은 일반적으로 적당한 골수 흡인 및 생검을 요구한다.
골수 또는 혈액은 백혈병의 존재를 진단하고, AML을 다른 유형의 백혈병 (예를 들어, 급성 림프아구성 백혈병-ALL)으로부터 구분하고 질환의 서브타입을 분류하기 위해 광현미경, 및 유동 세포측정기를 통해 조사된다(하기 참조). 골수 또는 혈액 샘플은 전형적으로 또한 통상의 세포유전학 또는 형광성 원위치 하이브리드화에 의해 염색체 비정상을 위해 시험된다. 유전학적 연구는 또한 질환 결과에 영향을 줄 수 있는 FLT3, 뉴클레오포스민, 및 KIT와 같은 유전자내 특정 돌연변이를 모색하기 위해 수행될 수 있다.
혈액 및 골수 스미어에 대한 세포화학적 염색은 ALL로부터 AML의 구분 및 AML의 분류에 도움이 된다. 마이엘로퍼옥시다제 또는 수단 블랙 염색 및 비특이적 에스테라제 염색의 조합은 대부분의 경우에 목적하는 정보를 제공한다. 마이엘로퍼옥시다제 또는 수단 블랙 반응은 대부분 AML의 실체를 확립하고 이를 ALL과 구분하는데 유용하다. 비특이적 에스테라제 염색은 AML에서 단핵구 성분을 식별하고 불량하게 분화된 단아구 백혈병을 ALL과 구분하기 위해 사용된다.
AML의 진단 및 분류는 도전적 과제일 수 있고 자격 있는 혈액병리학자 또는 혈액학자에 의해 수행되어야만 한다. 복잡하지 않은 경우에, 특정 형태학적 특징 (예를 들어, 아우어 라드(Auer rod))의 존재 또는 특정 유동 세포측정 결과는 AML을 다른 백혈병과 구분지울 수 있지만 상기 특징의 부재하에 진단은 보다 어려울 수 있다.
광범위하게 사용되는 WHO 기준에 따라, AML의 진단은 백혈병 골아세포에 의한 혈액 및/또는 골수의 20% 초과의 관여를 입증함에 의해 확립된다. 프렌치-아메리칸-브리티쉬(French-American-British) (FAB) 분류는 약간 더 엄격하여 AML의 진단을 위해서는 골수 (BM) 및 말초 혈액 (PB)에서 적어도 30%의 블라스트 %를 요구한다. AML은 상이하게 시험된 골수형성이상증후군 또는 골수증식 증후군과 같은 "전백혈병" 병태와 주의깊게 구분되어야 한다.
급성 전골수성 백혈병 (APL)은 최고 치유능을 갖고 독특한 형태의 치료를 요구하기 때문에, 상기 백혈병 서브타입의 진단을 신속히 확립하거나 배제하는 것이 중요하다. 혈액 또는 골수에 대해 수행된 형광성 동일계 하이브리드화는 흔히 상기 목적을 위해 사용되고 이는 APL을 특징으로 하는 염색체 전위 [t(15;17)(q22;q12);]를 용이하게 식별한다. 또한 상기 전위의 발암성 생성물인 PML/RARA 융합 단백질의 존재를 분자적으로 검출할 필요가 있다.
AML의 제1선 치료는 주로 화학요법으로 이루어지고 2개의 단계로 나눈다: 유도 및 관해 후 (또는 강화) 치료요법. 유도 치료요법의 목표는 백혈병 세포 수를 검출가능하지 않은 수준까지 감소시킴에 의해 완전한 관해를 성취하는 것이고; 강화 치료요법의 목표는 임의의 잔류 검출가능하지 않은 질환을 제거하고 치유를 성취하는 것이다. 조혈 줄기 세포 이식은 일반적으로 유도 치료요법이 실패한 경우 또는 환자가 재발한 후 고려되지만 이식은 또한 때로는 고위험 질환을 갖는 환자에 대해 제1선 치료요법으로서 사용된다.
M3을 제외한 모든 FAB 서브타입은 일반적으로 시타라빈 (ara-C) 및 안트라사이클린 (대부분 흔히 다우노루비신)을 사용한 유도 화학요법이 주어진다. 상기 유도 화학요법 레지멘은 "7+3" (또는 "3+7")로서 공지되어 있는데 이는 상기 시타라빈이 연속 7일 동안 연속 IV 주입으로 주어지고 상기 안트라사이클린은 연속 3일 동안 IV 푸쉬로서 주어지기 때문이다. 환자의 70%까지는 상기 프로토콜을 사용한 관해를 성취한다. 단독의 고용량의 시타라빈, FLAG형 레지멘 또는 연구 제제를 포함하는 다른 대안적 유도 레지멘이 또한 사용될 수 있다. 골수억제 및 증가된 감염 위험을 포함하는 치료요법의 독성 효과 때문에, 유도 화학요법은 나이 많은 노인에게 제공될 수 없고 옵션은 덜 강한 화학요법 또는 완화 케어를 포함할 수 있다.
또한, 급성 전골수성 백혈병 (APL)로서 공지된 AML의 M3 서브타입은 거의 범용으로서 유도 화학요법, 일반적으로 안트라사이클린 뿐만 아니라 약물의 모든-트랜스-레티노산 (ATRA)으로 치료된다. 파종성 혈관내 응고(DIC)를 예방하는데 주의해야만 하고, 전골수 세포가 이들의 과립의 내용물을 말초 순환계로 방출하는 경우 APL의 치료를 복잡하게 한다. APL은 널리 보고된 치료 프로토콜을 사용하여 탁월하게 치유가능하다.
유도 단계의 목표는 완전한 관해에 도달하는 것이다. 완전한 관해는 질환이 치유되었음을 의미하지 않고; 차라리, 이것은 어떠한 질환이 가용한 진단학적 방법으로 검출될 수 없음을 의미한다. 완전한 관해는 새롭게 진단된 성인의 약 50% 내지 75%에서 수득되지만 이것은 상기된 예후적 인자를 기준으로 다양할 수 있다. 관해 시간은 본래의 백혈병의 예후적 특징에 의존한다. 일반적으로, 모든 관해는 추가의 강화 치료요법 없이 실패한다.
완전한 관해가 성취된 후에도, 백혈병 세포는 현재 진단학적 기술로 검출되기에 너무 적은 수로 또한 잔류한다. 어떠한 추가의 관해 후 또는 강화 치료요법이 주어지지 않는 경우, 거의 모든 환자는 궁극적으로 재발한다. 따라서, 보다 많은 치료요법은 검출가능하지 않은 질환을 제거하고 재발을 예방하는데, 즉, 치유를 성취하는데 필요하다.
특정 유형의 관해 후 치료요법은 환자의 예후적 인자 (상기 참조) 및 일반 건강을 기준으로 개별화된다. 양호한-예후 백혈병(즉, inv(16), t(8;21), 및 t(15;17))에 대해, 환자들은 전형적으로 강화 화학요법으로서 공지된, 추가의 3개 내지 5개 과정의 강한 화학요법을 진행한다. 재발할 고위험에 있는 환자에 대해(예를 들어, MDS 또는 치료요법 관련된 AML의 바탕이 되는 고위험 세포유전학을 갖는 자들), 동종이계 줄기 세포 이식은 일반적으로 환자가 이식을 견딜 수 있고 적합한 공여자를 갖는 경우 추천된다. 중간 위험의 AML (양호한 위험 또는 고위험 그룹에 속하지 않는 정상의 세포유전학 또는 세포유전학 변화)에 대한 최상의 관해 후 치료요법은 명백하지 않고 완자의 연령 및 전체 건강, 환자의 개인 값 및 적합한 줄기 세포 공여자가 가용한지의 여부를 포함하는 특정 상황에 의존한다.
줄기 세포 이식에 적격이 아닌 환자에 대해, 강화 치료요법의 완료 후 히스타민 디하이드로클로라이드 (Ceplene) 및 인터류킨 2 (Proleukin)의 조합을 사용한 면역치료요법은 절대 재발 위험을 14%까지 감소시키는 것으로 나타났고 유지된 관해의 가능성에서 50% 증가로 해석된다.
AML이 재발된 환자에 대해, 유일하게 입증된 잠재적으로 치유적 치료요법은 이미 수행되지 않은 경우 조혈 줄기 세포 이식이다. 2000년도에, 단클론성 항체 결합된 세포 독성제인 겜투주맙 오조가미신 (Mylotarg)은 고용량 화학요법에 대한 후보자가 아닌 재발된 AML을 갖는 60세 초과 연령의 환자에 대해 미국에서 승인되었다. 상기 약물은 2010년에 제조업체(Pfizer)에 의해 시장으로부터 자진 철회되었다. 재발된 AML에 대한 치료 옵션은 너무 제한적이기 때문에, 완화 케어가 제공될 수 있다.
AML이 재발된 줄기 세포 이식에 대한 후보자가 아니거나 줄기 세포 이식 후 재발한 환자는 통상의 치료 옵션이 제한적이기 때문에 임상 시험에서의 치료가 제공될 수 있다. 연구 중에 있는 제제는 파르네실 전달효소 억제제, 데시타빈 및 MDR1 (다중약물-내성 단백질)의 억제제와 같은 표적화된 치료요법 뿐만 아니라 클로파라빈과 같은 세포독성 약물을 포함한다. 재발된 급성 전골수성 백혈병 (APL)에 대해, 삼산화비소는 시험에 시험되었고 미국 FDA에 의해 승인되었다. ATRA와 같이, 삼산화비소는 다른 서브타입의 AML과 작용하지 않는다.
급성 골수성 백혈병은 치유가능한 질환이고 특정 환자에 대한 치유의 기회는 다수의 예수적 인자에 의존한다. AML에서 단일의 가장 중요한 예후적 인자는 세포유전학 또는 백혈병 세포의 염색체 구조이다. 특정 세포유전학적 비정상은 매우 양호한 결과 (예를 들어, 급성 전골수성 백혈병에서의 (15:17) 전위)와 관련된다. AML 환자의 약 절반은 "정상"의 세포유전학을 갖고; 이들은 중간 위험 그룹에 속한다. 다수의 다른 세포유전학적 비정상은 불량한 예후 및 치료 후 재발 고위험과 관련된 것으로 공지되어 있다.
기존의 골수형성이상 증후군(MDS) 또는 골수이형성 질환(소위 2차 AML)로부터 발생하는 AML은 또 다른 이전의 악성종양에 대한 화학요법 후 발생하는 용량 치료-관련 AML로서 안좋은 예후를 갖는다. 이들 실체 둘다는 바람직하지 못한 세포유전학적 비정상과 관련된다.
일부 연구에서, >60세의 연령 및 상승된 락테이트 데하이드로게나제 수준은 또한 보다 불량한 결과와 관련된다. 대부분의 암 형태와 관련하여 수행능 상태 (즉, 환자의 일반 신체 조건 및 활동 수준)는 또한 예후에 주요 역할을 한다.
FLT3 내부 탠덤 중복(ITD)은 AML에서 보다 불량한 예후를 제공하는 것으로 나타났다. 제1 관해에서 줄기 세포 이식과 같은 보다 공격적 치료요법을 사용한 상기 환자들의 치료는 장기 생존율을 증진시키는 것으로 나타나지 않았다. FLT3의 ITD는 백혈구울혈과 관련될 수 있다. 2012년도에, FLT3 억제제인 퀴자르니티브는 FLT3-ITD 돌연변이를 갖는 AML 환자에서 양성 단계 II 시험 결과를 보여주었다.
연구자는 AML에서 c-KIT 돌연변이의 임상적 유의성을 연구하고 있다. 이들은 만연되어 있고 약리학적으로 c-KIT의 활성을 차단시킬 수 있는 이마티니브 및 수니티니브와 같은 티로신 키나제 억제제의 가용성 때문에 임상적으로 적절하다. 예후 인자 또는 치료학적 표적으로서 연구되고 있는 다른 유전자는 CEBPA, BAALC, ERG, 및 NPM1을 포함한다.
B. 급성 림프아구성 백혈병(ALL)
급성 림프아구성 백혈병 (ALL) 또는 급성 림프구 백혈병은 급성 형태의 백혈병 또는 백혈구 세포의 암이고, 이는 림프아구로서 공지된 암성의 미성숙한 백혈구 세포의 과생성을 특징으로 한다. ALL을 갖는 개인에서, 림프아구는 골수에서 과생성되고 계속적으로 증대되어 골수에서 적혈구 및 백혈구 세포와 같은 정상 세포의 생성을 억제하고 다른 기관을 침윤함에 의해 손상 및 사망을 유발한다. ALL은 어린시절에 가장 통상적이고 피크 발생율은 2 내지 5세이고 또 다른 피크는 노인 연령에서이다.
ALL 증상은 기능성 혈액 세포의 감소된 생성을 표지하는데 그 이유는 백혈병이 새롭게 기능하는 혈액 세포를 생성하기 위해 정상적으로 사용되는 골수 자원을 소모하기 때문이다. 이들 증상은 열, 증가된 감염 위험(특히, 백혈구 감소증으로 인해 폐렴과 같은 세균 감염; 상기 감염의 증상은 숨가쁨, 흉통, 감기, 구토, 장 또는 방광 서식지에서의 변화를 포함한다), 증가된 출혈 경향(혈소판감소증으로 인해), 및 창백함을 포함하는 빈혈을 표지하는 징후, 빈맥 (높은 심장 박동율), 피로 및 두통을 포함할 수 있다.
약 6,000개 발생빈도가 매년 미국에서 보고되었고, 다른 나라로부터의 통계는 산출하기 어렵지만 미국, 이탈리아 및 코스타 리카에서 보다 통상적인 것으로 공지되어 있다. 치유는 실제 목표이고 영향을 받은 어린이의 80% 초과에서 성취되지만 성인의 20 내지 40%만이 치유될 수 있다. "급성"은 이것이 많은 해의 잠재적 시간 과정을 갖는 만성 림프구 백혈병으로부터 이를 분간하기 위한 비교적 짧은 과정의 질환을 언급한다.
증상은 ALL에 특이적이지 않지만 의학적 도움이 요구되는 지점까지 악화된다. 이들은 악성 및 미성숙 백혈구(백혈구 세포)에 의해 압도되기 때문에 정상 및 건강한 혈액 세포의 부재로부터 비롯된다. 따라서, ALL을 갖는 사람들은 이들의 적혈구 (적혈구 세포), 백혈구 및 혈소판의 기능부전으로부터의 증상을 경험한다. 비정상을 보여줄 수 있는 연구 시험은 혈액 계수 시험, 신장 기능 시험, 전해질 시험 및 간 효소 시험을 포함한다.
ALL의 징후 및 증상은 다양하지만 골수 대체 및/또는 기관 침윤으로부터 비롯되고 일반화된 나약함 및 피로, 빈혈, 현기증, 빈번하거나 설명되지 않는 열 및 감염, 체중 감소 및/또는 식욕 상실, 과도하고 설명되지 않는 멍, 골 통증, 관절 통증 ("블라스트" 세포의 골 표면으로 또는 골수강으로부터 관절로의 퍼짐에 의해 유발되는), 무호흡, 비대해진 림프절, 간 및/또는 비장, 하지 및/또는 복부에서 함몰수종(종창), 및 낮은 혈소판 수준으로 인한 피부에서 매우 작은 붉은 반점 또는 선인 점상출혈을 포함한다.
일반적으로, 암은 성장을 유발하는 화학적 신호를 증가시키거나 성장을 조절하는 화학적 신호를 차단시킴에 의해, 신체 전반에 걸쳐 비조절된 세포 성장 및 퍼짐을 유도하는 DNA에 대한 손상에 의해 유발된다. 손상은 융합 유전자의 형성 및 또 다른 유전자, 예를 들어, T-세포 리포터 유전자의 프로모터로 이것이 근접함을 통해 원발암유전자의 이상조절을 통해 유발될 수 있다. 이러한 손상은 화학물질, 약물 또는 방사선과 같은 환경 인자에 의해 유발될 수 있고 유사분열 또는 다른 정상 과정 동안에 천연적으로 발생한다(세포는 이것을 감소시키는 것을 도와주는 다수의 DNA 복구 기작을 갖는다).
ALL은 동물 및 인간에서 방사선 및 화학물질로의 노출과 관련된다. 고수준의 방사선 노출은 히로시마 및 나가사키에서 원자 폭탄 노출의 생존자의 연구에 의해 발견된 바와 같이 백혈병의 발병에 대한 공지된 위험 인자이다. 동물에서, 벤젠 및 다른 화학물질로의 노출은 백혈병을 유발할 수 있다. 전염병학적 연구는 화학물질에 대한 업무현장 노출과 관련된 백혈병을 갖지만 이들 연구는 결정적이지 않았다. 일부 증거는 2차 백혈병이 상기 치료 결과로서 방사선 및 화학요법으로 다른 암에 대해 치료받은 개체에서 발병할 수 있음을 시사한다.
ALL의 진단은 의학적 병력, 물리적 검사, 완전한 혈액 계수 및 혈액 스미어로 시작한다. 증상은 이와 같이 일반적이기 때문에, 유사한 증상을 갖는 많은 다른 질환은 배제되어야만 한다. 전형적으로, 백혈구 세포 계수가 높을 수록 예후는 악화된다. 블라스트 세포는 대다수의 경우에 혈액 스미어 상에서 나타난다(블라스트 세포는 모든 면역 세포주에 대한 전구체(줄기 세포)이다). 골수 생검은 ALL의 결정적 증거이다. 요추 천공 (또한 요추 천자로서 공지된)은 척추 및 뇌가 공격받았는지를 표지한다.
병리학적 검사, 세포유전학 (특히, 필라델피아 염색체의 존재), 및 면역표현형분석법은 골아구성 (호중구, 호산구, 또는 호염구) 또는 림프아구성(B 림프구 또는 T 림프구) 세포가 문제인지를 확립한다. RNA 시험은 질환이 어떻게 공격적인지를 확립할 수 있고; 상이한 돌연변이는 보다 짧거나 보다 긴 생존율과 관련되었다. 면역조직화학 시험은 백혈병 세포의 표면상의 TdT 또는 CALLA 항원을 밝힐 수 있다. TdT는 전구-T 및 전구-B 세포의 발육에서 조기 발현되는 단백질인 반면, CALLA는 ALL 발생빈도의 80%에서 및 또한 CML의 "블라스트 위기"에서 발견되는 항원이다. 의학적 이미지화(예를 들어, 초음파 또는 CT 스캐닝)는 다른 기관, 통상적으로, 폐, 간, 비장, 림프절, 뇌, 신장 및 생식 기관의 공격을 발견할 수 있다.
조기 급성 림프구 백혈병이 검출되고 치료가 보다 효과적이다. 상기 목적은 신체에서 검출가능한 암 세포의 부재 (일반적으로 골수에서 5% 미만의 블라스트 세포)로서 정의되는 지속적 관해를 유도하는 것이다. 급성 백혈병에 대한 치료는 화학요법, 스테로이드, 방사선 치료요법, 강한 조합 치료 (골수 또는 줄기 세포 이식을 포함하는) 및 성장 인자를 포함할 수 있다.
화학요법은 선택의 초기 치료이다. 대부분의 ALL 환자는 상이한 조합의 치료를 받는다. 악성 세포의 신체 광범위 분포로 인해 어떠한 수술적 옵션이 없다. 일반적으로, ALL에 대한 세포독성 화학요법은 다양한 조합으로 다수의 항백혈병 약물을 조합한다. ALL에 대한 화학요법은 3개의 단계로 이루어진다: 관해 유도, 강화, 및 유지 치료요법.
화학치료 레지멘은 강하고 지연성 (GMALL UKALL, HyperCVAD 또는 CALGB 프로토콜의 경우에 흔히 약 2년; ALL에 대해 약 3년, COG 프로토콜 상의 남성에 대해 2개월; 여성에 대해 2년, 2개월 - 암성에 대해 보다 긴, 고환은 잠재적 저장소이다)일 수 있기 때문에, 많은 환자들은 대형 정맥으로 삽입된 정맥내 카테터 (중앙 정맥 카테터 또는 힉맨(Hickman) 주로 호칭되는), 또는 포타카트(Portacath), 일반적으로 쇄골 근처의 피부 밑에 수술적으로 이식된 실리콘 코를 갖는 옥수수 형태의 포트 및 낮은 감염 위험 및 포타카트의 장기 생존능으로 인해 가용한 가장 효과적인 생성물을 갖는다.
방사선 치료요법(또는 방사치료요법)은 높은 질환 하중에서 또는 골수 이식체 (총 신체 조사)에 대한 제제의 일부로서 통증 골 영역 상에 사용된다. 전뇌 방사선 형태의 방사선은 또한 뇌에서 백혈병의 재발을 예방하기 위해 중추 신경계 예방용으로 사용된다. 전뇌 예방 방사선은 어린이 ALL의 치료에서 통상적 방법이었다. 최근 연구는 CNS 화학요법이 바람직한 것으로의 결과를 제공하고 덜한 발육적 부작용을 가짐을 보여주었다. 결과로서, 전뇌 방사선의 사용은 보다 제한적이었다. 성인 백혈병에 대한 대부분의 전문가는 척추강내 화학요법을 사용하는 것 대신 CNS 예방을 위한 방사선 치료요법의 사용을 포기했다.
재발된 ALL의 일부 서브타입에 대해, 화학요법과 조합하여, 프로테아좀과 같은 생물학적 표적을 겨냥하는 것은 임상 시험에서 전망있는 결과를 제공하였다. 백혈병 림프아구에 대한 이들의 조합적 효과를 기준으로 생물학적 표적의 선택은 ALL 치료의 효과에서 개선을 위한 임상 시험을 유도할 수 있다. 계속되는 임상 시험에서, CD19-CD3 이중 특이적 단클론성 쥐 항체-블리나투모맙은 큰 전망을 보여준다.
키메라 항원 수용체(CAR)는 ALL에 대한 전망있는 치료요법으로서 개발되었다. 이러한 기술은 ALL을 치료하는 방법으로서 세포 표면 마커 CD19를 인지하도록 설계된 단일쇄 가변 단편 (scFv)을 사용한다. CD19는 모든 B 세포상에 발견되는 분자이고 환자에서 잠재적 악성 B 세포 집단을 구분하는 수단으로서 사용될 수 있다. 이러한 치료요법에서, 마우스는 CD19 항원으로 면역화시키고 항-CD19 항체를 생성한다. 골수종 세포주와 융합된 마우스 비장 세포로부터 개발된 하이브리도마는 CD19 특이적 항체를 암호화하는 cDNA에 대한 공급원으로서 개발될 수 있다. cDNA를 서열분석하고 상기 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 암호화하는 서열은 작은 펩티드 링커를 사용하여 함께 클로닝한다. 상기 수득한 서열은 scFv를 암호화한다. 이것은 CAR의 엔도도메인이 되는 것을 암호화하는 전이유전자로 클로닝될 수 있다. 엔도도메인으로서 사용되는 다양한 정렬의 서브유니트가 있지만 이들은 일반적으로 scFv에 부착된 힌지 영역, 막투과성 영역, CD28과 같은 공동자극 분자의 세포내 영역 및 ITAM 반복체를 함유하는 CD3-제타의 세포내 도메인으로 이루어진다. 흔히 포함되는 다른 서열은 다음과 같다: 4-1bb 및 OX40. scFv 및 엔도도메인 서열을 함유하는 최종 전이유전자 서열은 이어서 환자로부터 수득되고 시험관내에서 증식되는 면역 효과기 세포로 삽입된다. 이전의 시험에서, 이들은 세포독성을 나타낼 수 있는 T-세포 유형이었다. 상기 DNA의 효과기 세포로의 삽입은 여러 방법에 의해 성취될 수 있다. 가장 통상적으로, 이것은 전이유전자를 암호화하는 렌티바이러스를 사용하여 수행된다. 슈도타입의 자가-비활성화 렌티바이러스는 목적하는 전이유전자의 표적 세포 게놈 DNA의 안정한 삽입을 위해 효과적인 방법인 것으로 나타났다. 다른 방법은 전기천공 및 형질감염을 포함하지만 이들은 전이유전자 발현이 시간 경과에 따라 감소함으로 이들의 효능은 제한된다. 유전자 변형된 효과기 세포는 이어서 환자에게 다시 이식시킨다. 전형적으로 상기 공정은 주입된 T 세포의 효과를 강화시키는 것으로 나타난 사이클로포스파미드와 같은 컨디셔닝 레지멘과 연계하여 수행된다. 상기 효과는 면역학적 공간 틈새의 생성에 기인하였다. 전반적으로 상기 공정은 효과기 세포, 전형적으로 주요 조직적합성 복합체와 무관한 방식으로 종양 세포 항원을 인지하여 세포독성 반응을 개시할 수 있는 T 세포를 유도한다.
C. 만성 림프아구성 백혈병 (CLL)
또한 만성 림프구성 백혈병(CLL)으로서 공지된 B-세포 만성 림프구 백혈병 (B-CLL)은 성인에서 가장 통상적인 유형의 백혈병 (백혈구 세포의 암 유형)이다. CLL은 골수에서 기원하고 림프절에서 발달하고 정상적으로 항체를 생산함에 의해 감염을 퇴치시키는 B 세포 림프구에 영향을 미친다. CLL에서, B 세포는 조절 불가능하게 성장하고 골수 및 혈액에 축적하고 여기서, 이들은 건강 혈액 세포를 압도한다. CLL은 주로 림프절에 존재하는 B-세포 림프종 유형인 작은 림프구 백혈병 (SLL)의 단계이다. CLL 및 SLL은 단지 상이한 방법으로 동일한 바탕이 되는 질환인 것으로 고려된다. CLL은 성인 질환이다. CLL로 새롭게 진단된 대부분(>75%)의 사람들은 50세 초과이고 대다수는 남성이다. 그러나, 드문 경우에, 10대에도 일어나고 때로는 어린이에서 나타난다. 이들 중 일부는 유전 소인과 관련된 것일 수 있다.
대부분의 사람들은 높은 백혈구 세포 계수를 복귀시키는 통상의 혈액 시험의 결과로서 증상이 없는 것으로 진단되지만 이것이 진행됨에 따라 CLL은 팽윤된 림프절, 비장 및 간, 및 궁극적으로 빈혈 및 감염을 유도한다. 조기 CLL은 처리되지 않고 후기 CLL은 화학요법 및 단클론성 항체로 처리된다.
DNA 분석은 상이한 생존 시간을 갖는 2개의 주요 유형의 CLL을 구분한다. 마커 ZAP-70에 대해 양성인 CLL은 8년의 평균 생존율을 갖고 ZAP-70에 대해 음성인 CLL은 25년 초과의 평균 생존율을 갖는다. 느리게 진행하는 질환을 갖는 많은 환자들, 특히, 보다 나이든 환자들은 안심시킬 수 있고 이들의 일생에서 임의의 치료를 필요로 하지 않을 수 있다.
대부분의 사람들은 높은 백혈구 세포 계수를 복귀시키는 통상의 혈액 시험 결과로서 증상이 없는 것으로 진단된다. 덜 통상적으로, CLL은 높은 백혈구 세포 계수 없이 또는 혈액내 질환의 증거 없이 비대해진 림프절과 함께 존재할 수 있다. 이것은 작은 림프구성 림프종으로서 언급된다. 일부 개체에서, 상기 질환은 신생물 세포가 피로 또는 약함을 생성하는 빈혈을 유도하는 골수를 압도한 후에만 나타난다.
CLL은 일반적으로 먼저 완전한 백혈구 계수 (CBC) 시험에 대하여 림프구 증가증의 존재, 백혈구 세포 유형에서의 증가에 의해 의심된다. 이것은 흔하게 통상의 담당의 방문시 우연한 발견이다. 대부분의 흔한 림프구 계수는 혈액의 마이크로리터(㎕) 당 4000개 초과의 세포이지만 보다 높을 수 있다. 노년의 개체에서 림프구 증가증의 존재는 CLL에 대한 강한 의심을 불러 일으켜야 하고 확인 진단 시험, 특히 유동 세포측정은 임상적으로 필요하지 않다면 수행되어야만 한다.
CLL의 진단은 혈액, 골수 또는 일반적이지 않지만 특징적인 패턴의 분자를 세포 표면상에 나타나는 조직에서 비정상적 B 림프구 집단의 입증을 기반으로 한다. 이러한 비전형적 분자 패턴은 분화 5(CD5)의 세포 표면 마커 클러스터 및 분화 23 (CD23)의 클러스터의 동시 발현을 포함한다. 추가로, 하나의 개체내 모든 CLL 세포는 클론성, 즉 유전학적으로 동일하다. 실제로, 이것은 비정상적 B 세포의 전체 집단에 대해 상호 배타적인 항체 경쇄인 카파 또는 람다 중 단지 하나의 검출에 의해 추론된다. 정상적 B 림프구는 카파 및 람다 둘다를 발현하는 세포의 혼합물을 유도하는 상이한 항체 생성 세포 스튜로 이루어진다. 카파 및 람다 생성 B 세포의 정상적 분포의 부재는 임의의 B 세포 악성종양 (B 세포 비-호지킨 림프종)의 진단을 확립하기 위한 주요 요소인 클론성을 입증하기 위한 하나의 기반이다.
클론성 및 마커 분자 발현을 확인하기 위해 말초 혈액의 현미경적 검사 및 유동 세포측정에 의한 림프구의 분석의 조합은 CLL의 진단을 확립하기 위해 요구된다. 둘다는 소량의 혈액에 대해 용이하게 성취된다. 유동 세포측정기는 유체 중 개별 세포 상에서 분자의 발현을 조사할 수 있는 장치이다. 이것은 상기 장치에 의해 인지되는 형광 태그와 함께 마커 분자에 대한 특정 항체의 용도를 필요로 한다. CLL에서, 상기 림프구는 유전학적으로 B 세포 계통 (분화 19(CD19)의 마커 분자 클러스터 및 CD20을 발현하는)의 클론성이고 특징적으로 마커 분자 CD5 및 CD23을 발현한다. 이들 B 세포는 현미경하에서 정상의 림프구와 유사하지만 약간 작고 유리 슬라이드상으로 스며드는 경우 약하고 소위 "스머지(smudge)" 또는 "스미어(smear)"로 불리우는 많은 손상된 세포를 유발한다.
마투트(Matutes's)의 CLL 스코어는 5개의 마커 발현 (CD5, CD23, FMC7, CD22 및 면역글로불린 경쇄)에 대해 비전형적/혼합된 CLL과 상이한 전형적 CLL의 동종성 서브그룹의 식별을 가능하게 한다. 마투트의 CLL 스코어링 시스템은 통상적 CLL과 다른 B 세포 만성 림프구증식성 장애 간의 차등적 진단을 위해 매우 도움이 되지만 혼합된/비전형적 CLL과 맨틀 세포 림프종 (MCL 악성 B 세포) 간의 면역학적 구분에 대해서는 도움이 되지 않는다. CLL과 MCL간의 식별은 비-통상적인 마커, 예를 들어, CD54 및 CD200를 첨가함에 의해 개선될 수 있다. 통상적인 마커 중에서, 대부분의 식별 특징은 CD20/CD23 평균 형광 강도 비율이다. 대조적으로, FMC7 발현은 놀랍게도 경계선 발생빈도에 대한 오판일 수 있다.
질환 정도를 단계화하고 계측하는 것은 Rai 단계화 시스템 또는 비넷(staging system or the Binet) 분류 (세부사항을 참조한다)와 함께 수행되고 주로 낮은 혈소판 또는 적혈구 세포 계수의 존재를 기반으로 한다. 조기 단계 질환은 치료될 필요가 없다.
CLL 치료는 완전한 치유 보다는 차라리 질환 및 이의 증상을 조절하는데 집중된다. CLL은 화학요법, 방사선 치료요법, 생물학적 치료요법 또는 골수 이식에 의해 치료된다. 증상은 때로는 수술적으로 (비대된 비장의 비장 절개 제거) 또는 방사선 치료요법 ("디-벌킹 (de-bulking)" 팽윤된 림프절)에 의해 치료된다.
초기 CLL 치료는 질환의 정확한 진단 및 진행에 따라 다양하고 심지어 건강 케어 의사의 선호도 및 경험에 따라 다양하다. 12개의 제제는 CLL의 치료요법을 위해 사용된다. 플루다라빈, 사이클로포스파미드 및 리툭시맙 (FCR로서 공지된)을 함유하는 초기 치료 레지멘은 보다 높은 전체 반응율 및 완전한 반응율을 입증하였다.
펜실베니아 대학의 연구자에 의해 수행된 연구는 유전학적으로 변형된 T 세포를 사용하여 질환을 퇴치하기 위해 CD19 단백질을 발현하는 세포를 공격하였다. 2013년에, 연구자는 59명의 환자 중 26명이 완전한 관해를 성취하였고 본래의 환자가 종양 부재인 상태로 있음을 발표했다.
백혈병은 드물게 임신과 관련되고 10,000명의 임신한 여성중 단지 약 1명에 영향을 미친다. 만성 림프구 백혈병에 대한 치료는 흔히 임신 종료 후 때까지 지연될 수 있다. 치료가 필요한 경우, 제2 또는 제3 삼분기 동안에 화학요법의 적용은 제1 삼분기 동안에 치료 보다 유산 또는 선천적 결손을 유발할 가능성이 적다.
일반적으로 비치유성인 것으로 고려되지만 CLL은 대부분의 경우에 서서히 진행한다. CLL을 갖는 많은 사람들은 많은 해동안, 일부 경우에는 수십년 동안 정상적이고 활동적인 삶을 살아간다. 이의 느린 개시 때문에, 조기 CLL은 일반적으로 이것이 조기 CLL 중재술이 수명 또는 삶의 질을 개선시키지 않는다고 사료되기 때문에 치료받지 않는다. 대신, 병태는 시간 경과에 따라 모니터링하여 질환 패턴에서의 임의의 변화를 검출한다.
CLL 치료를 개시하기 위한 결정은 환자의 임상적 증상 또는 혈액 계수가 질환이 이것이 환자의 삶의 질에 영향을 줄 수 있는 지점까지 진행되었음을 표지하는 경우 내린다. Rai 4-단계 시스템 및 비넷 분류와 같은 임상적 "단계화 시스템"은 환자를 언제 그리고 어떻게 치료할지를 결정하는 것을 도와줄 수 있다. 치료를 언제 개시하고 어떠한 수단으로 수행할지를 결정하는 것은 흔히 어렵고; 연구는 너무 조기에 질환을 치료하는데는 어떠한 생존 이점이 없음을 보여주었다. 국가 암 연구 소 연구 그룹은 이것이 개시되기 전에 충족되어야만 하는 특정 마커를 사용한 치료를 위한 지침서를 발간하였다.
조합 화학치료 레지멘은 새롭게 진단되고 재발된 CLL 둘다에서 효과적이다. 플루다라빈과 알킬화제(사이클로포스파미드)의 조합은 단독의 제제 보다 보다 높은 반응율 및 보다 긴 무진행 생존율을 생성한다:
FC (플루다라빈과 사이클로포스파미드)
FR (플루다라빈과 리툭시맙)
FCR (플루다라빈, 사이클로포스파미드 및 리툭시맙)
CHOP (사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론)
퓨린 유사체 플루다라빈은 주요 치료요법으로서 클로람부실에 보다 우수한 반응율을 부여하는 것으로 나타났고, 플루다라빈의 조기 사용이 전체 생존율을 개선시키고 일부 임상의가 재발된 질환에 대해 플루다라빈을 보유하는 것이 바람직하다는 증거는 없다.
FCR을 사용한 화학면역치료요법은 양호한 신체 피트니스에 대해 선택된 CLL 환자에서 크게 무작위화된 시험에서 반응율, 무진행 생존율 및 전체 생존율을 개선시키는 것으로 나타났다. 이것은 처음 임상 시험이었고 제1 선 치료요법의 선택이 CLL을 갖는 환자들의 전체 생존율을 개선시킬 수 있음을 입증한다. CLL에 대해 승인된 알킬화제는 벤다무스틴 및 사이클로포스파미드를 포함한다.
표적화된 치료요법은 특정 표적에서 암 세포를 공격하고 정상 세포에는 해를 끼치지 않는다. 단클론성 항체, 예를 들어, 알렘투주맙 (CD52에 대해 지시된) 및 리툭시맙 및 오파투무맙 (CD20에 대해 지시된)은 CLL에 사용된다. 티로신 키나제 억제제 치료요법은 또한 CLL에 사용될 수 있다. 2014년 2월에, FDA 승인된 이브루티니브는 만성 림프구 백혈병을 치료하도록 승인되었다. 이브루티니브는 브루톤(Bruton's)의 티로신 키나제(BTK) 억제제이다. 2014년 7월에, FDA 및 EMA 승인된 이델라리시브는 상이한 유형의 백혈병을 치료하도록 승인되었다. 이델라리시브는 PI3Kδ 경로를 표적화하는 PI3K 억제제이다. 이것은 경구로 취한다.
수용자 자신의 세포를 사용한 유사 줄기 세포 이식은 치유적이지 않다. 보다 젊은 개체는 CLL로 인해 사망할 고위험에 있는 경우 동종이계 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)을 고려할 수 있다. 동종이계 줄기 세포 이식의 골수 제거 형태인 건강한 공여자 기원의 혈액 세포를 사용한 고위험 치료는 치유적일 수 있지만 치료 관련 독성은 유의적이다. 소위 감소된 강도 컨디셔닝 동종이계 줄기 세포 이식으로 불리우는 중간 수준은 보다 연로하거나 연약한 환자에서 보다 양호하게 허용될 수 있다.
"난치성" CLL은 치료에 더이상 우호적으로 반응하지 않는 질환이다. 이 경우에, 레날리도미드, 플라보피리돌 및 골수 (줄기 세포) 이식을 포함하는 보다 공경적 치료요법이 고려된다. 단클론성 항체, 알렘투주맙 (CD52에 대해 지시된)은 난치성 골수 기반 질환을 갖는 환자에서 사용될 수 있다.
합병증은 리히터(Richter) 증후군, 재발성 감염을 유발하는 저감마글로불린혈증, 환자의 10 내지 15%에서 가온 자가면역 용혈성 빈혈, 고등급 림프종으로의 전환을 포함한다. 만성 림프구성 백혈병은 리히터 증후군으로 전환될 수 있고 상기 증후군은 만성 림프구성 백혈병을 갖는 신속하게 성장하는 확산 대형 B 세포 림프종, 전림프구 백혈병, 호지킨 림프종 또는 만성 림프구성 백혈병을 갖는 환자에서 급성 백혈병의 발병인 리히터(Richter) 증후군으로 전환될 수 있다. 이의 발생율은 CLL을 갖는 환자에서 약 5%인 것으로 추정된다.
위장 (GI) 개입은 드물게 만성 림프구성 백혈병과 함께 일어날 수 있다. 보고된 증상의 일부는 중적증, 소장 세균 오염, 대장염 등을 포함한다. 일반적으로, CLL을 갖는 GI 합병증은 리히터 전환 후 일어난다. 지금까지 리히터 전환이 없는 만성 림프구성 백혈병에서 GI 개입은 2개의 발생빈도가 보고되었다.
D. 비-소 세포 폐암
비-소-세포 폐 암종(NSCLC)은 소 세포 폐 암종 (SCLC) 이외의 다른 임의의 유형의 상피 폐 암이다. 하나의 부류로서, NSCLC는 소 세포 암종과 비교하여 화학요법에 상대적으로 비민감성이다. 가능한 경우, 이들은 주로 치유성 정도로 수술적 절개로 치료되지만 화학요법은 수술전 (네오아쥬반트 화학요법) 및 수술 후 (아쥬반트 화학요법) 둘다에서 증가 추세로 사용되고 있다.
대부분의 통상의 유형의 NSCLC는 편평 세포 암종, 대형 세포 암종 및 선암종이지만 덜한 빈도로 나타나는 여러 다른 유형이 있고 모든 유형은 통상적이지 않은 조직학적 변이체로서 및 혼합 세포 유형 조합으로서 발생할 수 있다. 때로는, 용어 "비-소-세포 폐암" ("달리 특정되지 않는 경우" 또는 NOS)은 일반적으로 보다 특정 진단을 수행할 수 없는 경우 일반적으로 사용된다. 이것은 가장 흔하게 병리학자가 세포학 또는 생검 표본에서 소량의 악성 세포 또는 조직을 조사할때의 경우이다.
흡연 미경험자에서의 폐암은 거의 일반적으로 NSCLC이고, 상당한 대다수는 선암종이다. 비교적 드문 경우에 악성 폐 종양이 SCLC 및 NSCLC 둘다의 성분을 함유하는 것으로 나타난다. 이들 경우에, 상기 종양은 조합된 소 세포 폐 암종 (c-SCLC)으로 분류되어야만 하고 (일반적으로) "순수" SCLC로 치료된다.
폐의 선암종은 현재 흡연 미경험자 (일생동안 비 흡연자)에서 가장 통상적인 유형의 폐암이다. 선암종은 폐암의 대략 40%를 차지한다. 조직학적으로, 선암종은 보다 흔히 소 세포 폐 암 및 편평 세포 폐 암 (이 둘다는 보다 흔히 중앙에 위치된다) 보다 폐에서 폐에서 주변에서 나타났다. 흥미롭게도, 그러나, 최근 연구는 "중앙에서 대 주변에서 나타나는 비율"이 선암종 및 편평 세포 암종 둘다에 대해 통합쪽으로 합류할 수 있음을 시사한다.
폐의 편평 세포 암종 (SCC)은 여성에서 보다 남성에 보다 통상적이다. 이는 대부분의 다른 유형의 폐 암 보다 더 흡연 연혁과 밀접하게 서로 관련되어 있다. 간호 건강 연구에 따르면, SCC의 상대적 위험성은 미흡연자와 비교하여 1 내지 20년의 이전의 흡연 지속기간을 갖는 자들 및 20년 내지 30년 흡연 지속 기간을 갖는 자들 둘다에서 대략 5.5이다. 상대적 위험은 이전 30년 내지 40년 흡연 지속 기간을 갖는 자들에 대해 대략 16으로 증가하고 40년 초과의 지속 기간을 갖는 자들에 대해 대략 22로 증가한다.
대형 세포 폐 암종(LCLC)은 폐에서 형질전환된 상피 세포로부터 기원하는 이종성 그룹의 미분화된 악성 신생물이다. LCLC는 전형적으로 과거에 모든 NSCLC의 약 10%를 차지했지만, 보다 새로운 진단학적 기술은 보다 불량하게 분화된 편평 세포 암종 및 선암종을 선호하는 "통상적" LCLC의 진단 발생빈도를 감소시킨 것으로 보인다. LCLC는 유효하게 "배제 진단"이고, 여기서, 상기 종양 세포는 신생물을 소-세포 암종, 편평 세포 암종, 선암종 및 다른 보다 특정 조직학적 유형의 폐암으로서 분류할 광현미경 특성이 없다. LCLC는 주로 신생물 세포의 보다 큰 크기, 보다 높은 세포질-대 핵 크기 비율 및 "염-및-후추" 염색질의 부재에 의해 소 세포 폐 암종(SCLC)로부터 분화된다.
하나 초과 종류의 치료가 암의 단계, 개체의 전체 건강, 연령, 화학요법에 대한 반응 및 치료의 가능한 부작용등과 같은 다른 인자에 의존하여 사용된다. NSCLC는 일반적으로 화학요법 및/또는 방사선 매우 민감하지 않고 조기 단계에서 진단된 경우 선택 치료이고, 흔히 시스플라틴을 포함하는 아쥬반트(아쥬반트) 화학요법이다. 다른 치료 선택은 화학요법, 방사선 치료요법 (방사능치료요법) 및 표적화된 치료요법이다.
방사선 치료를 제공하는 새로운 방법은 의사가 폐암을 치료하는데 있어서 더 정확하게 한다. 이것은 건강한 조직 근처에 방사선이 덜 영향을 미침을 의미한다. 새로운 방법은 사이버나이프 및 정위방사선수술 (SRS)를 포함한다. 다른 치료는 고주파 제거 및 화학색전술이다.
다양한 화학요법은 진전된(전이성) NSCLC에 사용된다. EGFR 유전자에 특정 돌연변이를 갖는 일부 환자는 게피티니브와 같은 EGFR 티로신 키나제 억제제에 반응한다. NSCLC의 약 7%는 EML4-ALK 전위를 갖고; 이들은 임상 시험 중에 있는 ALK 억제제로부터 이로울 수 있다. 크리조티니브는 2011년 8월에 FDA 승인을 획득하였다.
E. 위암
위암 또는 위암(gastric cancer)은 위의 내벽으로부터 발병하는 암이다. 조기 증상은 속쓰림, 상부 복통, 구역 및 식욕 상실을 포함할 수 있다. 후기 징후 및 증상은 체중 감소, 황피, 구토, 삼키기 어려움 및 무엇 보다 대변에 혈액을 포함할 수 있다. 암은 위로부터 신체의 다른 신체 부위, 특히, 간, 폐, 골, 복부 내벽 및 림프절로 퍼질 수 있다. 위암의 예후는 일반적으로 종양이 흔히 발견시때 전이되었다는 사실 및 상기 병태를 갖는 대부분의 사람들이 제공시 노년(중앙 나이는 70 내지 75세이다)이라는 사실로 인해 불량하다. 위암에 대한 5년 생존율은 10% 미만인 것으로 보고된다.
대부분의 통상의 원인은 60% 초과의 발생빈도를 차지하는 세균 헬리코박터 파이롤리(Helicobacter pylori)에 의한 감염이다. 특정 유형의 에이취 파이롤리는 다른 것 보다 큰 위험을 갖는다. 다른 통상의 원인은 장아찌 섭취 및 흡연을 포함한다. 발생빈도의 약 10%는 가족력에 있고 1% 내지 3%의 발생빈도는 유전적 확산 위암과 같은 개인의 부모로부터 유전된 유전학적 증후군으로 인한 것이다. 위암의 대부분의 발생빈도는 위 암종이다. 상기 유형은 다수의 서브타입으로 분류될 수 있다. 림프종 및 간엽성 종양은 또한 위내에서 발육할 수 있다. 시간의 대부분, 위암은 수년간 다수의 단계를 통해 발육한다. 진단은 일반적으로 내시경 동안에 수행된 생검에 의한 것이다. 이어서 질환이 신체의 다른 부위로 퍼졌는지를 계측하기 위한 의학적 이미지화를 수행한다. 일본 및 대한민국, 질환율이 높은 2개 국가는 위암에 대해 스크리닝한다.
지중해식 식단은 금연시와 같이 암의 위험을 저하시킨다. 에이취 파이롤리의 치료가 향후 위험을 감소시킨다는 잠정적 증거가 있다. 암이 조기에 치료되면 많은 발생빈도는 치유될 수 있다. 치료는 수술, 화학요법, 방사선 치료요법 및 표적화된 치료요법의 일부 조합을 포함할 수 있다. 늦게 치료되는 경우, 완화적 케어가 권고될 수 있다. 결과는 흔히 전세계적으로 10% 미만의 5년 생존율로 불량하다. 이것은 크게, 병태를 갖는 대부분의 사람들이 진행된 질환을 갖기 때문이다. 미국에서 5년 생존율은 28%이고 대한민국에서는 부분적으로 스크리닝 노력으로 65% 초과이다.
전세계적으로 위암은 암의 5번째 주요 원인이고 발생빈도의 7%를 구성하고 사망의 9%를 구성하는 암으로부터의 사망의 3번째 주요 원인이다. 2012년에, 950,000 명 사람들에서 발생하고 723,000명의 사망을 유발하였다. 미국 및 영국을 포함하는 세계의 대부분에서 1930년 전에, 암으로부터 사망의 가장 통상의 원인이었다. 사망율은 이후 세계의 많은 지역에서 감소하고 있다. 이것은 음식을 신선하게 유지시키는 방법으로서 냉장고 개발의 결과로서 덜 짜고 덜 피클된 음식의 섭취로 인한 것으로 사료된다. 위암은 대부분 통상적으로 동아시아 및 동유럽에서 발생하고 이것은 여성에서 일어나는 것 보다 남성에서 2배 빈번하게 일어난다.
위암은 흔히 무증상 (어떠한 감지할만한 증상을 나타내지 않음)이거나 이것은 이의 조기 단계에서 단지 비특이적 증상 (위암 뿐만 아니라 다른 관련 또는 비관련 장애에 특이적인 증상)을 유발할 수 있다. 증상이 일어났을 때는 상기 암은 흔히 진행된 단계에 도달하였고(하기 참조) 또한 전이(신체의 다른, 아마도 원거리 부위로의 퍼짐)되었을 수 있어 이는 이의 상대적 불량한 예후에 대한 주요 이유 중 하나이다. 조기 암은 소화불량 또는 작열감(속쓰림)과 관련된 것일 수 있다. 그러나, 소화불량으로 인해 내시경을 한 50명의 사람들 중 1명 미만이 암을 갖는다. 복부 불괘감 및 식욕 부진, 특히 고기에 대한 식욕 부진이 발생할 수 있다.
정상 조직을 비대해지게 하고 공격하는 위암은 식사 후 위의 약함, 피로, 팽만, 상부 복부의 복통, 구역 및 가끔씩의 구토, 설사 또는 변비를 유발할 수 있다. 추가의 비대해짐은 체중 감소 또는 혈액을 구토하는 출혈 또는 대변에 혈액을 갖는 출혈을 유발할 수 있고 후자는 검정 탈색 (혈변)으로 명백해지고 때로는 빈혈을 유발한다. 연하곤란은 분문에서 종양 또는 위종양의 식도로의 연장을 시사한다.
위암은 다인성 질환이다. 헬리코박터 파이롤리(Helicobacter pylori) 감염은 위암의 65 내지 80%에서 필수 위험 인자이지만 상기 감염의 단지 2%이다. 에이취 파이롤리가 위암을 유도하는 기작은 만성 염증 또는 CagA와 같은 에이취.파이롤리 독성 인자의 작용을 포함한다. 흡연은 위암이 발병할 위험을 상당히 증가시키고 현재 흡연자에 대한 40% 증가된 위험으로부터 헤비 스모커에 대해 82% 증가하였다. 흡연으로 인한 위암은 댑분 식도 부근의 위 상부에서 발생한다. 일부 연구는 또한 알콜 소비와 함께 증가된 위험을 보여준다.
식이 인자는 입증된 원인이 아니지만 훈제 식품을 포함하는 일부 식품, 염 및 염 풍부 식품, 붉은 고기, 가공 고기, 피클된 야채 및 고사리가 보다 큰 위암 위험과 관련된다. 절인 고기에서 니트레이트 및 니트리트는 에이취 파이롤리를 포함하는 특정 세균에 의해 동물에서 위암을 유할하는 것으로 밝혀진 화합물로 전환될 수 있다. 한편, 신선한 과일 및 야채 섭취, 감귤류 섭취 및 항산화제 섭취는 위암의 보다 낮은 위험과 관련된다. 지중해 식단은 또한 정기적 아스피린 사용시 위암의 낮은 발병율과 관련된다.
요오드 결핍과 위암 간에는 상호 관련이 있다. 위암은 이의 발병율에 있어서 여성 하나에 대해서 2명 이하의 남성이 영향받을 정도로 남성의 우위를 보여준다. 에스트로겐은 상기 암 형태의 발육에 대해 여성을 보호할 수 있다. 대략 발생빈도의 10%는 유전학적 성분을 보여준다.
사람들은 신체적 또는 유전학적인 것들 과 같이 위암에 대한 이들의 민감성을 변화시킬 수 있는 특정 위험 인자들을 가질 수 있다. 비만은 위식도 역류 질환 (GERD)의 발육에 기여함에 의해 위 선암종의 위험을 증가시키는 것으로 밝혀진 하나의 상기 신체 위험 인자이다. 비만이 GERD를 유발하는 정확한 기작은 아직 공지되어 있지 않다. 연구는 과도한 지방 조직으로 인해 위 및 하부 식도 괄약근 상에 증가된 압력을 유발하는 증가된 식이 지방이 역할을 수행할 수 있는 것으로 추정하지만 아직 어떠한 통계학적으로 유의적인 데이터가 수집되지 않았다. 그러나, GERD가 존재하는 위 분문 선암종의 위험은 비만 사람에 대해 2배 초과로 증가하는 것으로 밝혀졌다. 위암에 대한 유전학적 위험 인자는 유전적 확산 위암 (HDGC)으로서 공지된 CDH1 유전자의 유전학적 결함이다. E-캐드헤린을 암호화하는 CDH1 유전자는 16번째 염색체 상에 있다. 유전자가 특정 돌연변이를 경험한 경우, 위암은 완전히 이해되지 않는 기작을 통해 발육한다. 이러한 돌연변이는 상염색체 우성이고 이는 운반자 어린이의 절반이 동일한 돌연변이를 경험할 가능성이 높음을 의미한다. 유전적 확산 위암의 진단은 일반적으로 가족 구성원, 예를 들어, 부모 또는 조부모를 포함하는 적어도 2개의 발생빈도가 진단되고 적어도 1명이 50세 전에 진단된 경우 일어난다. 상기 진단은 또한 가족에서 적어도 3개의 발생빈도가 있는 경우 내려질 수 있고 이 경우에 나이는 고려되지 않는다.
국제 암 게놈 컨소시엄은 위암에 포함된 게놈 변화를 식별하기 위한 주요 노력이다. 매우 작은 %의 확산형 위암(하기 조직병리학을 참조한다)은 유전된 비정상 CDH1 유전자로부터 일어난다. 유전학적 시험 및 치료 옵션은 위험에 처한 가족에 대해서 가용하다.
증가된 위험과 관련된 다른 인자들은 AIDS, 당뇨병, 치명적인 빈혈, 만성 위축성 위염, 메네트리에(Menetrier's) 질환 (과다형성, 과다분비 위병증), 및 장 화생이다.
증상의 원인을 발견하기 위해, 의사들은 환자들의 의학적 병력을 질문하고, 신체 검사를 수행하고 실험실 연구를 주문할 수 있다. 위경 검사는 선택의 진단학적 방법이다. 이것은 섬유 광 카메라를 위로 삽입하여 이를 가시화함을 포함한다. 상부 GI 시리즈(바륨 뢴트겐 사진으로 불리울 수 있다). 복부의 컴퓨터 단층촬영 또는 복부의 CT 스캐닝은 위암을 밝힐 수 있지만 인접한 조직으로의 공격을 계측하거나 국소적 림프절로의 전이의 존재를 계측하기 위해 보다 유용하다. 병소이고, 기이하고 증진된 1cm 초과의 벽의 비후는 악성종양을 선호한다.
위내시경 검사에서 나타난 비정상 조직은 수술자 또는 위장병학자에 의해 생검된다. 상기 조직은 이어서 현미경하의 조직학적 검사를 위해 병리학자에게 보내지고 암성 세포의 존재에 대해 검사한다. 후속적 조직학적 검사와 함께 생검은 암 세포의 존재를 확인하기 위해 유일하게 확실한 방법이다.
다양한 위내시경 양상은 세포 구조를 강조하고 이형성 영역을 식별할 수 있는 염료로 검출된 점막의 산출을 증가시키기 위해 개발되었다. 세포내시경(Endocytoscopy)은 이형성 영역을 보다 양호하게 계측하기 위해 세포 구조를 가시화하는 최고 배율을 포함한다. 광학 단층 촬영과 같은 다른 위내시경 양상은 또한 유사한 응용을 위해 연구적으로 시험되고 있다.
다수의 피부 조건은 위암과 관련된다. 피부의, 흔히 흑색 표피종으로 공지된 겨드랑이 및 사타구니의 어두워진 과다형성증의 병태는 위암과 같은 복부 내부 암과 관련된다. 위암의 다른 피부 징후는 양 손바닥(tripe palms) (손바닥의 피부의 유사한 어두워진 과다형성증) 및 지루성 각질 섬유로서 공지된 피부 병변의 급속한 발육인 레서-트렐랏(Leser-Trelat) 징후를 포함한다. 다양한 혈액 시험이 수행될 수 있고 빈혈을 검사하기 위한 완전한 혈액 계수(CBC) 및 대변내 혈액을 검사하기 위한 대변 잠혈 반응 검사를 포함한다.
감염된 자들에서 에이취. 파이롤리의 제거는 적어도 아시아인에서 위암의 위험을 감소시킨다. 특히 건강한 식이로부터 저용량의 비타민은 위암의 위험을 감소시킨다. 이전의 보충자료의 검토는 지지 증거를 발견하지 못하였고 능히 결과를 악화시킨다.
위암은 이것이 조기 단계 (이것이 전이하기 시작하기 전)에 발현되지 않으면 치유되기 어렵다. 불행하게도, 조기 위암은 거의 증상을 유발하지 않기때문에 상기 질환은 일반적으로 진단이 내려진 경우에는 진행된 상태이다. 위암에 대한 치료는 수술, 화학요법 및/또는 방사선 치료요법을 포함할 수 있다. 생물학적 치료요법과 같은 새로운 치료 방법 및 현재 방법을 사용하는 개선된 방법은 임상 시험에서 연구되고 있다.
수술은 위암에 대한 유일한 치유적 치료요법으로 남아 있다. 상이한 수술적 기술 중에서, 내시경 점막 절개 (EMR)는 일본에서 개발되었지만 또한 일부 센터에서 미국에서 또한 가용한 조기 위암 (종양은 단지 점막을 포함한다)에 대한 치료이다. 상기 과정에서, 위 (점막)의 내부 벽과 함께 종양은 내시경을 통해 전기선 루프를 사용하여 위벽으로부터 제거된다. 상기 이점은 이것이 위를 제거하는 것 보다 작은 수술이라는 것이다. 내시경 점막하 절개 (ESD)는 일본에서 개발된 것과 유사한 기술이고 한 조작으로 점막의 큰 영역을 절개하기 위해 사용된다. 절개된 표본의 병리학적 검사가 불완전한 절개 또는 종양에 의한 깊숙한 공격을 보여주는 경우 환자는 공식적 위 절개를 필요로 한다.
제공 시에 전이성 질환을 갖는 자들은 완화 수술을 받을 수 있고 이것은 수술 자체의 합병증의 가능성 및 이것이 화학요법을 지연시킬 수 있다는 사실로 인해 이것이 논쟁의 여지가 있지만 지금까지의 데이타는 대부분 양성이고 개선된 생존율은 상기 방법으로 처리된 자들에서 나타난다.
위암을 치료하기 위한 화학요법의 사용은 확실히 확립된 표준 케어를 갖지 않는다. 불행하게도, 위암은 이들 약물에 민감하지 않고 사용되는 경우 화학요법은 일반적으로 완화적으로 종양의 크기를 감소시키고 질환의 증상을 경감시키고 생존 시간을 증가시키기는 작용을 하였다. 위암 치료에 사용된 일부 약물은 다음을 포함하였다: 5-FU (플루로우라실) 또는 이의 유사체 카페시타빈, BCNU (카르무스틴), 메틸-CCNU (세무스틴) 및 독소루비신 (아드리아마이신), 및 미토마이신 C, 및 보다 최근에 다양한 합병증에서 흔히 약물을 사용하는 시스플라틴 및 탁소테레. 단독으로 조합적으로 이들 상이한 약물의 상대적 이득은 불명료하다. 임상적 연구자는 종양을 축소?慈? 위해 수술 전 화학요법 또는 나머지 암 세포를 손상하기 위한 수술 후 아쥬반트 치료요법을 제공하는 이득을 개발하였다. 최근에, 트라스투주맙으로 불리우는 표적화된 치료는 이들의 종양 세포에서 HER2 유전자를 과발현하는 것들의 치료를 위한 화학요법과 함께 사용하기 위해 가용화되었다.
방사선 치료요법(또한 방사선 치료요법(radiotherapy)으로 불리우는)은 또한 흔히 화학요법 및/또는 수술에 대한 아쥬반트로서 위암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
III. 단클론성 항체 및 이의 제조
본원에 기재된 단클론성 항체는 표준 방법을 사용하여 이어서 스크리닝, 특징 분석 및 기능적 평가를 사용하여 제조하였다. 가변 영역은 서열분석하고 이어서 인간 발현 벡터에 서브클로닝하여 키메라 항체 유전자를 제조하고 이는 이어서 발현시키고 정제하였다. 이들 키메라 항체는 항원 결합, 신호 차단에 대해 그리고 이종이식체 실험에서 시험되었다.
A. 일반 방법
LILRB에 결합하는 단클론성 항체는 여러 응용을 갖는 것으로 이해된다. 이들은 암 치료요법을 위한 것 뿐만 아니라 암을 검출하고 진단하는데 사용하기 위한 진단학적 키트의 제조를 포함한다. 이와 관련하여, 당업자는 진단학적 또는 치료학적 제제에 상기 항체를 연결시킬 수 있거나 경쟁 검정에서 이들을 포획 제제 또는 경쟁자로서 사용하거나 여기에 부착된 추가의 제제 없이 이들을 개별적으로 사용할 수 있다. 상기 항체는 하기에 추가의 논의된 바와 같이 돌연변이되거나 변형될 수 있다. 항체를 제조하고 특징분석하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: 예를 들어, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; U.S. Patent 4,196,265).
단클론성 항체 (MAb)를 제조하기 위한 방법은 일반적으로 폴리클로날 항체를 제조하기 위한 것들과 동일한 라인을 따라 개시한다. 이들 방법 둘다를 위한 제1 단계는 적당한 숙주의 면역화이다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 면역화를 위한 소정의 조성물은 이의 면역원성에서 다양할 수 있다. 따라서 흔히 펩티드 또는 폴리펩티드 면역원을 담체에 연결시킴에 의해 달성될 수 있는 바와 같이 숙주 면역계를 부스팅할 필요가 있다. 예시적이고 바람직한 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 소 혈청 알부빈 (BSA)이다. 난알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 토끼 혈청 알부민과 같은 다른 알부민은 또한 담체로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 담체 단백질에 콘주게이트시키기 위한 수단은 당업계에 널리 공지되어 있고 글루타르알데하이드, m-말레이미도벤코일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 카르보디이미드 및 비스-비아조티화된 벤지딘을 포함한다. 또한 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 특정 면역원 조성물의 면역원성은 아쥬반트로서 공지된 면역 반응의 비특이적 자극제의 사용에 의해 증진될 수 있다. 예시적이고 바람직한 아쥬반트는 완전 프룬트 아쥬반트 (사멸된 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 함유하는 면역 반응의 비특이적 자극제), 불완전 프룬트 아쥬반트 및 수산화알루미늄 아쥬반트를 포함한다.
폴리클로날 항체의 제조에 사용되는 면역원 조성물의 양은 면역화를 위해 사용되는 동물 뿐만 아니라 면원원의 특성에 따라 다양하다. 다양한 경로를 사용하여 면역원 (피하, 근육내, 피내, 정맥내 및 복강내)을 투여할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조는 면역화 후 다양한 시점에서 면역화된 동물의 혈액을 채취함에 의해 모니터링할 수 있다. 제2 부스터 주사가 또한 주어질 수 있다. 부스팅 및 적정 공정은 적합한 역가가 달성될때까지 반복한다. 목적하는 수준의 면역원성이 수득되는 경우, 면역화된 동물을 육종할 수 있고 혈청을 단리하고 저장하고/하거나 동물을 사용하여 MAb를 제조할 수 있다.
면역화 후, 항체를 생성하기 위한 잠재력을 갖는 체세포, 구체적으로 B 림프구(B 세포)는 MAb 생성 프로토콜에 사용하기 위해 선택한다. 이들 세포는 생검된 비장 또는 림프절로부터 또는 순환계 혈액으로부터 수득될 수 있다. 면역화된 동물로부터 항체 생성 B 림프구는 이어서 불멸의 골수종 세포, 일반적으로 면역화되거나 인간 또는 인간/마우스 키메라 세포인 동물과 동일한 종의 하나와 융합시킨다. 하이브리도마 생성 융합 과정에 사용하기 위해 적합한 골수종 세포주는 바람직하게 비-항체-생성이고, 높은 융합 효율을 갖고 단지 목적하는 융합된 세포(하이브리도마)의 성장을 지지하는 특정 선택적 배지에서 성장할 수 없게 하는 효소 결핍을 갖는다. 다수의 골수종 세포 중 임의의 하나는 당업자에게 공지된 바와 같이 사용될 수 있다(문헌참조: Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984).
항체 생성 비장 또는 림프절 세포 및 골수종 세포의 하이브리드를 제조하기 위한 방법은 일반적으로 체세포를 2:1의 비율로 골수종 세포와 혼합시킴을 포함하지만 상기 비율은 세포막의 융합을 촉진시키는 제제 또는 제제들(화학적 또는 전기적)의 존재하에 각각 약 20:1 내지 약 1:1로 다양할 수 있다. 센다이 바이러스를 사용하는 융합 방법은 문헌[참조: Kohler and Milstein (1975; 1976), and those using polyethylene glycol (PEG), such as 37% (v/v) PEG, by Gefter et al. (1977)]에 기재되어 있다. 전기적으로 유도된 융합 방법의 사용이 또한 적당하다(문헌참조: Goding, pp. 71-74, 1986). 융합 과정은 일반적으로 낮은 빈도, 약 1 x 10-6 to 1 x 10-8으로 생존가능한 하이브리드를 생성한다. 그러나, 이것은 선택적 배지에서 배양함에 의해 생존가능한 융합된 하이브리드가 모계 주입된 세포 (특히 정상적으로 무한적으로 계속 분열하는 주입된 골수종 세포)로부터 분화되기 때문에 문제점을 부과하지 않는다. 상기 선택적 배지는 일반적으로 조직 배양 배지에서 뉴클레오티드의 드 노보 합성을 차단시키는 제제를 함유하는 배지이다. 예시적 및 바람직한 제제는 아미노프테린, 메토트렉세이트, 및 아자세린이다. 아미노프테린 및 메토트렉세이트는 퓨린 및 피리미딘 둘다의 드 노보 합성을 차단하는 반면, 아자세린은 퓨린 합성만을 차단한다. 아미노프테린 또는 메토트렉세이트가 사용되는 경우, 배지에는 뉴클레오티드 공급원으로서 하이포크산틴 및 티미딘이 보충된다(HAT 배지). 아자세린이 사용되는 경우, 상기 배지에는 하이포크산틴이 보충된다. B 세포 공급원이 엡스타인 바르 바이러스(EBV) 형질전환된 인간 B세포주인 경우 골수종으로 융합되지 않은 EBV 형질전환된 세포주를 제거하기 위해 오우아바인이 첨가된다.
바람직한 선택 배지는 HAT 또는 오우아바인을 갖는 HAT이다. 뉴클레오티드 구제 경로를 작동시킬 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 골수종 세포는 구제 경로의 주요 효소, 예를 들어, 하이포크산틴 포스포리보실 전달효소 (HPRT)가 결핍되어 있고 이들은 생존할 수 없다. B 세포는 상기 경로를 작동시킬 수 있지만 이들은 배양 중에서 제한된 수명 기간을 갖고 일반적으로 약 2주 이내에 죽는다. 따라서, 선택 배지에서 생존할 수 있는 유일한 세포는 골수종과 B 세포로부터 형성된 하이브리드이다. 융합을 위해 사용되는 B 세포의 공급원이 본원에서와 같이 EBV-형질전환된 B 세포주인 경우, 오우아바인은 또한 EBV-형질전환된 B 세포가 약물 사멸에 민감할 수 있으므로 하이브리드의 약물 선택을 위해 사용되는 반면에 사용되는 골수종 파트너는 오우아바인에 내성이도록 선택된다.
배양은 이로부터 특정 하이브리도마가 선택되는 하이브리도마 집단을 제공한다. 전형적으로, 하이브리도마의 선택은 세포를 미세역가 플레이트에서 단일 클론 희석에 의해 배양하고 이어서 목적하는 반응성에 대해 개별 클론 상청액 (약 2 내지 3주 후)을 시험함에 의해 수행된다. 상기 검정은 민감하고 단순하고 신속해야만 하고 예를 들어, 방사선면역검정, 효소 면역검정, 세포독성 검정, 플라크 검정 도트 면역결합 검정 등이 있다. 선택된 하이브리도마는 이어서 연속으로 희석하거나 단일 세포를 유동 세포측정 분류에 의해 분류하고 개별 항체 생산 세포주로 클로닝하고, 여기서, 클론은 이어서 무한적으로 증식시켜 mAb를 제공할 수 있다. 상기 세포주는 2개의 기본 방식으로 MAb 생산을 위해 사용될 수 있다. 하이브리도마의 샘플은 (흔히 복강으로) 동물(예를 들어, 마우스)에 주사될 수 있다. 임의로, 동물은 탄화수소, 특히 주사 전 프리스탄 (테트라메틸펜타데칸)과 같은 오일로 프라이밍한다. 인간 하이브리도마가 상기 방식으로 사용되는 경우, SCID 마우스와 같은 면역손상된 마우스에 주사하여 종양 거부를 예방하는 것이 최상이다. 주사된 동물은 융합된 세포 하이브리드에 의해 생성된 특이적 단클론성 항체를 분비하는 종양을 발육시킨다. 혈청 또는 복수액과 같은 동물의 체액을 이어서 탭핑하여 고농도의 MAb를 제공할 수 있다. 개별 세포주는 또한 시험관내에서 배양될 수 있고, 여기서, 상기 MAb는 천연적으로 배양 배지로 분비되고 이로부터 이들은 고농도로 용이하게 수득될 수 있다. 대안적으로, 인간 하이브리도마 세포주는 시험관내에서 사용하여 세포 상청액 중에 면역글로불린을 생성할 수 있다. 세포주는 무혈청 배지에 성장하도록 적응되어 고순도의 인간 단클론성 면역글로불린을 회수하는 능력을 최적화할 수 있다.
어느 한 수단에 의해 생성되는 MAb는 경우에 따라 여과, 원심분리 및 다양한 크로마토그래피 방법, 예를 들어, FPLC 또는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 본원의 단클론성 항체의 단편은 펩신 또는 파파인과 같은 효소를 사용한 분해를 포함하는 방법에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 결합의 절단에 의해 정제된 단클론성 항체로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 본원의 개시내용에 의해 포함되는 단클론성 항체 단편은 자동화된 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
분자 클로닝 방법은 또한 단클론성을 생성하기 위해 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 이를 위해, RNA는 하이브리도마 주로부터 단리될 수 있고 항체 유전자는 RT-PCR에 의해 수득되고 면역글로불린 발현 벡터로 클로닝할 수 있다. 대안적으로, 조합적 면역글로불린 파아지미드 라이브러리는 세포주로부터 단리된 RNA로부터 제조되고 적당한 항체를 발현하는 파아지미드는 바이러스 항원을 사용한 패닝에 의해 선택된다. 통상적인 하이브리도마 기술 보다 상기 방법의 이점은 대략 104 배의 많은 항체가 단일 라운드에서 생성되고 스크리닝될 수 있고 새로운 특이성이 H 및 L쇄 조합에 의해 생성되어 이는 적당한 항체를 발견할 기회를 추가로 증가시킨다는 것이다.
본원에 유용한 항체의 제조를 교시하는, 각각 본원에 참조로 인용된 다른 미국 특허는 조합적 방법을 사용한 키메라 항체의 생성을 기재하는 미국 특허 제5,565,332호; 재조합 면역글로불린 제조를 기재하는 미국 특허 제4,816,567호 및 항체-치료학적 제제 콘주게이트를 기재하는 미국 특허 제4,867,973호를 포함한다.
B. 본원의 항체
본원의 개시내용에 따른 항체는 우선 이경우에 LILRB에 대한 이들의 결합 특이성에 의해 정의될 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용한 주어진 항체의 결합 특이성/친화성을 평가함에 의해 당업자는 상기 항체가 본원의 특허청구범위내에 있는지의 여부를 결정할 수 있다. 하나의 측면에서, 도 22에 도시된 바와 같이 중쇄 및 경쇄로부터 클론 쌍 형성 CDR을 갖는 단클론성 항체가 제공된다. 상기 항체는 본원에 기재된 방법을 사용한 실시예 절편에서 하기의 논의된 클론에 의해 생성될 수 있다.
제2 측면에서, 항체는 이들의 가변 서열에 의해 정의될 수 있고 상기 서열은 추가의 "골격" 영역을 포함한다. 이들은 완전한 가변 영역을 암호화하거나 나타내는 도 21에서의 서열에 의해 제공된다. 추가로, 항체 서열은 이들 서열, 특히 CDR 외부 영역에서 다양할 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 (a) 가변 영역이 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인으로부터 분리될 수 있다는 점에서 상기 설정된 것들로부터 다양할 수 있거나, (b) 핵산은 이에 의해 암호화된 잔기에 영향을 주는 것 없이 상기 설정된 것들로부터 다양할 수 있고, (c) 핵산은 소정의 %, 예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성에 의해 상기 설정된 것들로부터 다양할 수 있고, (d) 핵산은 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.15M NaCl에 의해 제공된 바와 같이 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건에 의해 예시된 바와 같은 높은 엄중 조건하에서 하이브리드화하는 능력을 기준으로 상기 설정된 것들로부터 다양할 수 있고, (e) 아미노산은 예를 들어, 소정의 %, 예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성에 의해 상기 설정된 것들로 부터 다양할 수 있거나 (f) 아미노산은 보존성 치환 (하기 논의된)을 허용함에 의해 상기 설정된 것들로부터 다양할 수 있다. 이전 기재된 것들의 각각은 도 21의 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 적용된다. 또 다른 양태에서, 본원 개시내용의 항체 유도체는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 보존성 또는 비존성 아미노산 치환을 갖지만 여전히 목적하는 결합 및 기능성 성질을 나타내는 VL 및 VH 도메인을 포함한다.
본원의 개시내용의 항체는 IgG로서 생성되지만 불변 영역을 변형시켜 이들의 기능을 변형시키는 것이 유용할 수 있다. 항체의 불변 영역은 전형적으로 항체의 숙주 조직 또는 인자로의 결합을 매개하고, 상기 숙주 조직 또는 인자는 30개 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포) 및 전형적 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)를 포함한다. 따라서, 용어 "항체"는 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (이의 서브타입 뿐만 아니라) 유형의 온전한 면역글로불린을 포함하고, 여기서, 상기 면역글로불린의 경쇄는 카파형 또는 람다형일 수 있다. 경쇄 및 중쇄 내에 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 35 "J" 영역에 의해 연결되고 상기 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로 문헌[Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)]을 참조한다.
본원의 개시내용은 추가로 본원에 기재된 항체를 암호화하는 핵산과 하이브리드화하는 핵산을 포함한다. 일반적으로, 핵산은 중간 또는 높은 엄중 조건하에서 본원에 기재된 항체를 암호화하고 또한 LILRB와 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체를 암호화하는 핵산과 하이브리드화한다. 핵산 분자는 단일 가닥 형태의 제1 핵산 분자가 온도 및 용액 이온 강도의 적당한 조건하에서 제2 핵산 분자와 어닐링할 수 있는 경우 제2 핵산 분자와 "하이브리드화"할 수 있다(문헌참조: Sambrook et al., 상기). 온도 및 이온 강도의 조건은 하이브리드화의 "엄중도"를 계측한다. 전형적인 중간 엄중 하이브리드화 조건은 42℃에서 5X 또는 6X SSC 및 0.1% SDS와 함께 40% 포름아미드이다. 높은 엄중 하이브리드화 조건은 42℃에서 또는 임의로 보다 높은 온도(예를 들어, 57℃, 59℃, 60℃, 62℃, 63℃, 65℃ 또는 68℃)에서 50% 포름아미드, 5X 또는 6X SSC (0.15M NaC1 및 0.015M Na-시트레이트)이다. 하이브리드화는 2개의 핵산이 상보성 서열을 함유할 것으로 요구하지만 하이브리드화의 엄중도에 따라 염기 간의 미스매치가 가능하다. 핵산을 하이브리드화하기 위한 적당한 엄중도는 핵산의 길이 및 상보정 정도, 당업계에 널리 공지된 변수에 의존한다. 2개의 뉴클레오티드 서열 간의 유사성 또는 상동성 정도가 클 수록 핵산이 하이브리드화할 수 있는 엄중도가 높아진다. 길이가 100개 초과인 뉴클레오티드의 하이브리드에 대해 용융 온도를 계산하기 위한 방정식이 유래되었다(문헌참조: Sambrook et al., 상기). 보다 짧은 핵산, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드화를 위해, 미스매치의 위치는 보다 중요해지고 올리고뉴클레오티드의 길이는 이의 특이성을 계측한다(문헌참조: Sambrook et al., 상기).
C. 항체 서열의 가공
다양한 양태에서, 개선된 발현, 개선된 교차 반응성 또는 감소된 오프-표적 결합과 같은 다양한 이유 때문에 식별된 항체의 서열을 가공하는 것을 선택할 수 있다. 하기된 것은 항체 가공을 위한 관련 기술의 일반적 논의이다.
하이브리도마는 배양될 수 있고, 이어서 세포는 용해되고 총 RNA가 추출된다. 무작위 6량체는 RT와 함께 RNA의 cDNA 카피물을 생성하기 위해 사용될 수 있고 이어서, PCR은 모든 인간 가변 유전자 서열을 증폭시키는 것으로 예상된 PCR 프라이머의 복합 혼합물을 사용하여 수행된다. PCR 생성물은 pGEM-T Easy 벡터로 클로닝될 수 있고, 이어서 표준 벡터 프라이머를 사용하는 자동화된 DNA 서열 분석에 의해 서열분석된다. 결합 및 중화 검정은 하이브리도마 상청액으로부터 수거되고 단백질 G 칼럼을 사용한 FPLC에 의해 정제되는 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 재조합 전장 IgG 항체는 클로닝 벡터로부터 293 자유형 세포 또는 CHO 세포로 형질감염된 IgG 플라스미드 벡터로 중쇄 및 경쇄 Fv DNA를 서브클로닝함에 의해 생성될 수 있고 상기 항체는 293 또는 CHO 세포 상청액으로부터 수거되고 정제된다.
모델 항체를 동일한 숙주 세포 및 최종 cGMP 제조 공정과 같은 세포 배양 공정에서 생성된 항체의 신속한 유용성은 공정 개발 시스템의 지속기간을 감소시키는 잠재력을 갖는다. 론자(Lonza)는 CHO 세포에서 소량(50g 이하)의 항체의 신속한 제조를 위해 CDACF 배지에서 성장한 풀링된 형질감염체를 사용한 일반 방법을 개발하였다. 진정한 일시적 시스템 보다 약간 느리지만 이점은 보다 높은 생성물 농도 및 생성 세포주와 동일한 숙주 및 공정의 사용을 포함한다. 1회용 생물반응기, 유가식 방식으로 모델작동되는 1회용 백 생물반응기 배양물 (5L 작용 용적)을 발현하는 GS-CHO 풀의 성장 및 생산성의 예는, 2 g/L의 수거 항체 농도는 9주의 형질감염 내에서 성취되었다.
항체 분자는 예를 들어, mAb 또는 예를 들어, 재조합 수단을 통해 생산 가능한 단일쇄 면역글로불린의 단백질용해 절단에 의해 생성되는 단편 (예를 들어 F(ab'), F(ab')2)를 포함한다. 상기 항체 유도체는 1가이다. 하나의 양태에서, 상기 단편은 서로 조합되거나 "키메라" 결합 분자를 형성하기 위해 다른 항체 단편 또는 수용체 리간드와 조합될 수 있다. 유의적으로, 상기 키메라 분자는 동일한 분자의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 치환체를 함유할 수 있다.
1. 항원 결합 변형
관련 양태에서, 상기 항체는 기재된 항체, 예를 들어, 기재된 항체에서의 것들과 동일한 CDR 서열을 포함하는 항체의 유도체(예를 들어, 키메라 또는 CDR-접목된 항체)이다. 대안적으로, 보존성 변화를 항체 분자로 도입하는 것과 같이 변형시키고 싶을 수 있다. 상기 변화를 만드는데 있어서, 아미노산의 하이드로퍼틱 지수가 고려될 수 있다. 단백질 상에 상호활성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 하이드로퍼틱 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다(문헌참조: Kyte and Doolittle, 1982). 아미노산의 상대적 하이드로퍼틱 특징이 수득한 항체의 2차 구조에 기여하는 것으로 받아들여지고, 이는 이어서 상기 단백질과 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등의 상호작용을 정의한다.
또한, 유사 아미노산의 치환은 친수성을 기준으로 효과적으로 만들어질 수 있는 것으로 이해된다. 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제4,554,101호는 이의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수성이 단백질의 생물학적 성질과 서로 관련됨을 기재한다. 미국 특허 제4,554,101호에 상세히 기재된 바와 같이, 하기의 친수성 값은 아미노산 잔기에 할당되었다: 염기성 아미노산: 아르기닌 (+3.0), 라이신 (+3.0), 및 히스티딘 (-0.5); 산성 아미노산: 아스파르테이트(+3.0 ± 1), 글루타메이트(+3.0 ± 1), 아스파라긴 (+0.2), 및 글루타민 (+0.2); 친수성, 비이온성 아미노산: 세린 (+0.3), 아스파라긴 (+0.2), 글루타민 (+0.2), 및 트레오닌 (-0.4), 황 함유 아미노산: 시스테인(-1.0) 및 메티오닌 (-1.3); 소수성, 비방향족 아미노산: 발린 (-1.5), 류신(-1.8), 이소류신(-1.8), 프롤린(-0.5 ± 1), 알라닌(-0.5), 및 글라이신 (0); 소수성, 방향족 아미노산: 트립토판 (-3.4), 페닐알라닌 (-2.5), 및 티로신 (-2.3).
아미노산은 유사한 친수성을 갖는 또 다른 것으로 치환되어 생물학적으로 또는 면역학적으로 변형된 단백질을 생성할 수 있는 것으로 이해된다. 상기 변화에서, 이의 친수성 값이 ± 2 이내에 있는 아미노산의 치환이 바람직하고, ± 1 이내에 있는 것들이 특히 바람직하고 ± 0.5 이내에 있는 것들이 보다 더 특히 바람직하다.
상기된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 단일쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기준으로 한다. 다양한 이전의 특징을 고려하는 예시적 치환은 당업자에게 널리 공지되어 있고 다음을 포함한다: 아르기닌 및 라이신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신.
본원의 개시내용은 이소형 변형을 고려한다. 상이한 이소형을 갖도록 Fc 영역을 변형시킴에 의해, 상이한 기능성이 성취될 수 있다. 예를 들어, IgG1으로의 변화는 항체 의존성 세포성 세포독성을 증가시킬 수 있고, 부류 A로의 스위칭은 조직 분포를 개선시킬 수 있고 부류 M으로의 스위칭은 결합가를 개선시킬 수 있다.
변형된 항체는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있고 이는 표준 분자 생물학적 기술 또는 폴리펩티드의 화학적 합성을 통한 발현을 포함한다. 재조합 발현을 위한 방법은 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
2. Fc 영역 변형
본원에 기재된 항체는 또한 Fc 영역 내 변형을 포함하도록, 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능성 성질, 예를 들어, 혈청 반감기, 보체 고정화, Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능 (예를 들어, 항원-의존성 세포성 세포독성)을 변형시키기 위해 가공될 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 항체는 화학적으로 변형 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있다)될 수 있거나 이의 당화를 변화시켜 다시 항체의 하나 이상의 기능성 성질을 변화시키기 위해 변형될 수 있다. 이들 양태 각각은 하기에서 추가로 상세히 기재된다. Fc 영역에서 잔기의 넘버링은 캐뱃의 EU 지수의 넘버링이다. 본원에 기재된 항체는 또한 변화된 효과기 기능을 제공하도록 변형된(또는 차단된) Fc 영역을 갖는 항체를 포함한다. 문헌[예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702]을 참조한다. 상기 변형은 진단 및 치료요법에서 가능한 이로운 효과와 함께 면역계의 다양한 반응을 증진시키거나 억제하기 위해 사용될 수 있다. Fc 영역의 변화는 아미노산 변화(치환, 결실 및 삽입), 당화 또는 탈당화를 포함하고 다중 Fc를 첨가함을 포함한다. Fc로의 변화는 또한 치료학적 항체에서 항체의 반감기를 변화시켜 덜 빈번한 투여를 가능하게 하고 따라서 편의성이 증가되고 재료의 사용을 감소시킨다. 상기 돌연변이는 힌지 영역에서 상호 중쇄 디설파이드 브릿지의 이종성을 폐지시키는 것으로 보고되었다.
하나의 양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역내 시스테인 잔기의 수가 증가되거나 감소되도록 변형된다. 상기 방법은 미국 특허 제5,677,425호에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 촉진시키거나 항체 안정성을 증가시키거나 감소시키기 위해 변화된다. 또 다른 양태에서, 상기 항체는 이의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 방법이 가능하다. 예를 들어, 하기의 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F, 미국 특허 제6,277,375호에 기재된 바와 같이. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 상기 항체는 미국 특허 제5,869,046호 및 제6,121,022호에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 구제 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변화될 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 Fc 영역은 항체의 효과기 기능(들)을 변화시키기 위해 적어도 하나의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체함에 의해 변화된다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산은 상이한 아미노산 잔기로 대체되어 항체는 효과기 리간드의 변화된 친화성을 가져 모 항체의 항원 결합 활성을 보유할 수 있다. 친화성이 변화된 효과기 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 상기 방법은 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내 하나 이상의 아미노산 잔기는 항체가 보체에 고정화시키는 능력을 변화시키기 위해 변화된다. 상기 방법은 PCT 공보 WO 94/29351에 추가로 기재되어 있다. 또 다른 예에서, Fc 영역은 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 증가시키거나 감소시키기 위해 및/또는 하기의 위치에서 하나 이상의 아미노산을 변형시킴에 의해 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화성을 증가시키거나 감소시키기 위해 변형된다: 238, 239, 243, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 상기 방법은 PCT 공보 WO 00/42072에 추가로 기재되어 있다. 더욱이, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위는 맵핑되고 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다. 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서 특정 돌연변이는 FcγRIII로의 결합을 개선시키는 것으로 나타났다. 추가로, 하기의 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합을 개선시키는 것으로 나타났다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.
하나의 양태에서, Fc 영역은 잔기 243 및 264를 변형시킴에 의해 효과기 기능을 매개하고/하거나 항-염증 성질을 증가시키는 항체의 능력을 감소시키기 위해 변형된다. 하나의 양태에서, 항체의 Fc 영역은 위치 243 및 264에서의 잔기를 알라닌으로 변화시킴에 의해 변형된다. 하나의 양태에서, Fc 영역은 잔기 243, 264, 267 및 328을 변형시킴에 의해 효과기 기능을 매개하고/하거나 항-염증 성질을 증가시키는 항체의 능력을 감소시키기 위해 변형된다. 여전히 또 다른 양태에서, 항체는 특정 당화 패턴을 포함한다. 예를 들어, 비당화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 당화가 부재이다). 항체의 당화 패턴은 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화성 또는 결합활성을 증가시키도록 변화될 수 있다. 상기 변형은 예를 들어, 항체 서열 내 당화 부위 중 하나 이상의 변화시킴에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환이 만들어질 수 있고 결과로서 가변 영역 골격 당화 부위 중 하나 이상의 제거가 상기 부위에서 당화를 제거한다. 상기 비당화는 항원에 대한 항체의 친화성 또는 결합활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호]을 참조한다.
또한 당화 패턴이 저푸코실화되거나 푸코실화되지 않는 글리칸을 포함하는 항체가 제조될 수 있고, 예를 들어, 저푸코실화된 항체 또는 푸코실화되지 않은 항체가 글리칸 상에 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는다. 상기 항체는 또한 증가된 양의 이등분 GlcNac 구조를 갖는 글리칸을 포함할 수 있다. 상기 변화된 당화 패턴은 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 것으로 입증되었다. 상기 변형은 예를 들어, 당화 경로가 유전학적으로 가공되어 특정 당화 패턴을 갖는 당단백질을 생성하는 숙주 세포에서 항체를 발현함에 의해 성취될 수 있다. 이들 세포는 당업계에 기재되어 있고 본 발명의 재조합 항체를 발현하여 변화된 당화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709는 푸코실전달효소 유전자, FUT8 (α(1,6)-푸코실전달효소)이 부재여서 Ms704, Ms705, 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체는 이들 탄수화물 상에 푸코스가 부재이다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2개의 대체 벡터를 사용하는 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적화된 손상에 의해 생성된다(문헌참조: 미국 특허 공보제20040110704호). 또 다른 예로서, EP 1 176 195는 기능적으로 손상된 푸코실 전달효소를 암호화하는 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하고 있고 상기 세포주에서 발현된 항체는 α-1,6 결합-관련된 효소를 감소시키거나 제거함에 의해 저푸코실화를 나타낸다. EP 1 176 195는 또한 푸코스를 항체의 Fc 영역에 결합하거나 효소 활성을 갖지 않는 푸코실을 N-아세틸글루코사민으로 첨가하기 위해 낮은 효소 활성을 갖는 세포주, 예를 들어, 랫트 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)를 기재하고 있다. PCT 공보 WO 03/035835는 변이체 CHO 세포주인 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물로 부착시키는 감소된 능력을 가져 또한 상기 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 유도하는 Lec13 세포를 기재하고 있다. 변형된 당화 프로필을 갖는 항체는 또한 PCT 공보 WO 06/089231호에 기재된 바와 같은 닭 계란에서 제조될 수 있다. 대안적으로, 변형된 당화 프로필을 갖는 항체는 식물 세포, 예를 들어, 렘나(Lemna) (미국 특허 제7,632,983호)에서 제조될 수 있다. 식물 시스템에서 항체의 제조 방법은 미국 특허 제6,998,267호 및 제7,388,081호에 기재되어 있다. PCT 공보 WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실 전달효소 (예를 들어, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전달효소 III (GnTIII))를 발현하도록 가공된 세포주를 기재하고 있고 상기 가공된 세포주에서 발현된 항체는 항체의 증가된 ADCC 활성을 유발하는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타낸다.
대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단 제거될 수 있고; 예를 들어, 푸코시다제 α-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다. 본원에 기재된 항체는 하등 진핵 숙주 세포, 특히 진균 숙주 세포에서 생성된 것들을 추가로 포함하고, 예를 들어, 효모 및 필라멘트성 진균류는 포유동물 또는 인간형 당화 패턴으 갖는 당단백질을 생성하도록 유전학적으로 가공되었다. 현재 사용된 포유동물 세포주 보다 이들 유전학적으로 변형된 숙주 세포의 특정 이점은 상기 세포에서 생성된 당단백질의 당화 프로필을 조절하는 능력이고 특정 N-글리칸 구조가 우세한 당단백질의 조성물이 제조될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제7,029,872호 및 제7,449,308호). 이들 유전학적으로 변형된 숙주 세포는 우세하게 특정 N-글리칸 구조를 갖는 항체를 제조하기 위해 사용되어 왔다.
추가로, 효모 또는 필라멘트 진균류와 같은 진균류는 푸코실화된 당단백질을 생성하는 능력이 부재이기 때문에, 상기 세포에서 생성된 항체는 세포가 푸코실화된 당단백질을 생산하기 위한 효소적 경로를 포함하도록 추가로 변형되지 않는 다면 푸코스가 부재이다(문헌참조: 예를 들어, PCT 공보 WO2008112092). 특정 양태에서, 본원에 기재된 항체는 하등 진핵 숙주 세포에서 생성된 것들을 추가로 포함하고 이는 푸코실화되고 비푸코실화된 하이브리드 및 복합 N-글리칸을 포함하고 이등분되고 다중안테나 종을 포함하고 이는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: N-글리칸, 예를 들어 GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2. 특정 양태에서, 본원에 제공된 항체 조성물은 GlcNAcMan5GlcNAc2; GalGlcNAcMan5GlcNAc2; 및 NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 하이브리드 N-글리칸을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 하이브리드 N-글리칸은 조성물에서 우성적 N-글리칸 종이다. 추가의 측면에서, 상기 하이브리드 N-글리칸은 특정 N-글리칸 종이고 이는 조성물 중에 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 하이브리드 N-글리칸을 포함한다.
특정 양태에서, 본원에 제공된 항체 조성물은 GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan3GlcNAc2; NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2; GlcNAc2Man3GlcNAc2; GalGlcNAc2Man3GlcNAc2; Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 복합 N-글리칸을 갖는 항체를 포함한다. 특정 측면에서, 복합 N-글리칸은 조성물 중에 우세한 N-글리칸 종이다. 추가의 측면에서, 복합 N-글리칸은 조성물 중에 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 복합 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸 종이다. 특정 양태에서, N-글리칸은 푸코실화되어 있다. 일반적으로, 푸코스는 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc와 α 1,3-연결체로 있거나, N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc와 α1,6-연결체로 있거나, N-글리칸의 비-환원 말단에서 Gal과 α1,2-연결체로 있거나, N-글리칸의 비-환원 말단에서 GlcNAc와 α1,3-연결체로 있거나 N-글리칸의 비환원 말단에서 GlcNAc와 α1,4-연결체로 있다.
따라서, 상기 당단백질 조성물의 특정 측면에서, 당형태는 Man5GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc), Man3GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc), GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 당형태를 생성하기 위해 α1,3-연결체 또는 α1,6-연결체 푸코스로 있거나; GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2, GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2, GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 당형태를 생성하기 위해 α1,3-연결체 또는 α1,4-연결체 푸코스로 있거나; Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 당형태를 생성하기 위해 α1,2-연결체 푸코스로 있다.
추가의 측면에서, 상기 항체는 높은 만노스 N-글리칸을 포함하고, 이는 Man8GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man5GlcNAc2, Man4GlcNAc2, 또는 Man3GlcNAc2 N-글리칸 구조로 이루어진 N-글리칸을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기의 추가의 측면에서, 복합 N-글리칸은 추가로 푸코실화되고 비-푸코실화된 이등분되고 다중안테나 종을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "N-글리칸" 및 "당형태"는 상호교환적으로 사용되고 예를 들어, 아스파라긴-아세틸글루코사민 연결체에 의해 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기에 부착된 것인 N-연결된 올리고사카라이드를 언급한다. N-연결된 당단백질은 단백질 내 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 연결된 N-아세틸글루코사민 잔기를 함유한다.
D. 단일쇄 항체
단일쇄 가변 단편 (scFv)은 짧은 (일반적으로 세린, 글라이신) 링커와 함께 연결된, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합이다. 상기 키메라 분자는 불변 영역의 제거 및 링커 펩티드의 도입에도 불구하고 본래의 면역글로불린의 특이성을 보유한다. 상기 변형은 일반적으로 특이성이 변화되지 않도록 잔류한다. 이들 분자는 역사상 이것이 단일 펩티드로서 항원 결합 도메인을 발현하기에 매우 간편한 경우 상 디스플레이를 촉진하기 위해 작제되었다. 대안적으로, scFv는 하이브리도마로부터 유래된 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄로부터 직접 작제될 수 있다. 단일쇄 가변 단편은 완전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역이 부재이고따라서, 통상의 결합 부위 (예를 들어, 단백질 A/G)는 항체를 정제하기 위해 사용된다. 이들 단편은 흔히 단백질 L이 카파 경쇄의 가변 영역과 상호작용하기 때문에 단백질 L을 사용하여 정제되고/고정화될 수 있다.
유연성 링커는 일반적으로 알라닌, 세린 및 글라이신과 같은 나선- 및 회전 촉진 아미노산 잔기로 구성된다. 그러나, 다른 잔기들이 또한 기능할 수 있다. 문헌[Tang et al. (1996)]은 단백질 링커 라이브러리로부터의 단일쇄 항체 (scFv)에 대한 테일러된 링커를 신속히 선택하는 수단으로서 상 디스플레이를 사용하였다. 무작위 링커 라이브러리를 작제하였고 여기서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 유전자는 가변 조성의 18개 아미노산 폴리펩티드를 암호화하는 절편에 의해 연결된다. scFv 레퍼토리(대략 5　x　106의 상이한 구성원)는 필라멘트 파이지상에 디스플레이하였고 합텐을 사용하여 친화성 선택에 적용하였다. 선택된 변이체 집단은 결합 활성에서 상당한 증가를 나타냈지만 상당한 서열 다양성을 보유하였다. 후속적으로 1054 변이체의 스크리닝은 효율적으로 가용성 형태로 생성되는 촉매적 활성 scFv를 산출하였다. 서열 분석은 선택된 테터의 유일한 공통된 특징으로서 다른 위치에 아르기닌 및 프롤린의 VH C 말단 및 풍부함 후 2개의 잔기인 링커에서 보존된 프롤린을 밝혔다.
본원 개시내용의 재조합 항체는 또한 또한 수용체의 이량체화 또는 다량체화를 허용하는 서열 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 서열은 J쇄와 결합된 다량체의 형성을 허용하는, IgA로부터 유래된 것들을 포함한다. 또 다른 다량체화 도메인 Gal4 이량체화 도메인이다. 다른 양태에서, 상기 쇄는 2개의 항체의 조합을 가능하게 하는 비오틴/아비딘과 같은 제제로 변형시킬 수 있다.
별도의 양태에서, 단일쇄 항체는 비-펩티드 링커 또는 화학적 유니트를 사용하는 수용체 경쇄 및 중쇄를 연결시킴에 의해 작제될 수 있다. 일반적으로 경쇄 및 중쇄는 별개의 세포에서 생성되고, 정제되고 후속적으로 적당한 양상으로 함께 연결된다(즉, 적당한 화학적 브릿지를 통해 경쇄의 C-말단에 부착된 중쇄의 N-말단).
가교-결합 시약은 2개의 상이한 분자들, 예를 들어, 안정화제 및 응고제의 기능성 그룹들을 결속시키는 분자 브릿지를 형성하기 위해 사용된다. 그러나, 상이한 유사체로 구성된 동일한 유사체 또는 이종체 복합체의 이량체 또는 다량체가 작제될 수 있는 것으로 고려된다. 단계적 방식으로 2개의 상이한 화합물을 연결하기 위해 헤테로-이기능성 가교 결합제는 원치않는 단독중합체 형성을 제거하는데 사용될 수 있다.
예시적 헤테로-이기능성 가교 결합제는 2개의 반응성 그룹을 함유한다: 1차 아민 그룹과 반응하는 하나(예를 들어, N-하이드록시 숙신이미드) 및 티올 그룹과 반응하는 다른 하나(예를 들어, 피리딜 디설파이드, 말레이미드, 할로겐 등). 1차 아민 반응성 그룹을 통해, 가교 결합제는 하나의 단백질 (예를 들어, 선택된 항체 또는 단편)의 라이신 잔기(들)과 반응할 수 있고 티올 반응성 그룹을 통해 이미 제1 단백질에 결속된 가교 결합제는 다른 단백질(예를 들어, 선택 제제)의 시스테인 잔기 (유리된 설프하이드릴 그룹)와 반응한다.
혈액에서 합리적인 안정성을 갖는 가교 결합제가 사용되는 것이 바람직하다. 다수 유형의 디설파이드 결합 함유 링커는 공지되어 있고 표적화 및 치료학적/예방적 제제를 콘주게이트시키기 위해 성공적으로 사용될 수 있다. 입체적으로 장애를 받은 디설파이드 결합을 함유하는 링커는 보다 큰 생체내 안정성을 제공하여 작용 부위에 도달하기 전 포적화 펩티드의 방출을 예방하는 것으로 입증될 수 있다. 이들 링커는 따라서 연결 제제의 하나의 그룹이다.
또 다른 가교 결합 시약은 인전합 벤젠 환 및 메틸 그룹에 의해 "입체적으로 장애를 받은" 디설파이드 결합을 함유하는 이기능성 가교 결합제인 SMPT이다. 디설파이드 결합의 입체 장애는 조직 및 혈액에 존재할 수 있는 글루타티온과 같은 티올레이트 음이온에 의한 공격으로 결합을 보호하고 이에 의해 표적 부위로 부착된 제제의 전달 전에 콘주게이트의 탈커플링의 예방을 도와주는 기능을 제공하는 것으로 사료된다.
많은 다른 공지된 가교 결합 시약과 함께 SMPT 교차 결합 시약은 시스테인의 SH 또는 1차 아민 (예를 들어, 라이신의 엡실론 아미노 그룹)과 같은 기능성 그룹을 가교 결합시키는 능력을 부여한다. 또 다른 가능한 유형의 가교 링커는 절단 가능한 디설파이드 결합, 예를 들어, 절단 가능한 디설파이드 결합, 예를 들어, 설포숙신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트를 함유하는 헤테로-이기능성 광반응성 페닐라지드를 포함한다. N-하이드록시-숙신이미딜 그룹은 1차 아미노 그룹과 반응하고 페닐라지드 (광용해시)는 임의의 아미노산 잔기와 비선택적으로 반응한다.
장애를 받은 가교 결합제에 추가로, 비-장애를 받은 링커는 또한 이에 따라 사용될 수 있다. 보호된 디설파이드를 함유하거나 생성하는 것으로 고려되지 않은 다른 유용한 가교 결합제는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란을 포함한다(Wawrzynczak & Thorpe, 1987). 상기 가교 결합제의 사용은 당업계에서 잘 이해된다. 또 다른 양태는 유연성 링커의 사용을 포함한다.
미국 특허 제4,680,338호는 아민-함유 중합체 및/또는 단백질과 리간드의 콘주게이트를 생성하기 위해, 특히, 킬레이터, 약물, 효소, 검출가능한 표지 등을 형성하기 위해 유용한 이기능성 링커를 기재하고 있다. 미국 특허 제5,141,648호 및 제5,563,250호는 다양한 약한 조건하에서 절단가능한 불안정 결합을 함유하는 절단 가능한 콘주게이트를 기재한다. 상기 링커는 특히 목적하는 제제가 링커에 직접적으로 결합될 수 있다는 점에서 유용하고 절단은 활성제를 방출시킨다. 특정 용도는 항체 또는 약물과 같은 단백질에 유리된 아미노 또는 유리된 설프하이드릴 그룹을 첨가함을 포함한다.
미국 특허 제5,856,456호는 융합 단백질, 예를 들어, 단일쇄 항체를 제조하기 위해 폴리펩티드 성분들을 연결시키는데 사용하기 위한 펩티드 링커를 제공한다. 상기 링커는 약 50개 길이 이하의 아미노산이고, 하전된 아미노산 (바람직하게 아르기닌 또는 라이신)의 적어도 하나에 이어서 프롤린을 함유하고 보다 큰 안정성 및 감소된 응집을 특징으로 한다. 미국 특허 제5,880,270호는 다양한 면역진단학적 및 분리학적 기술에서 유용한 아미노옥시-함유 링커를 기재한다.
E. 정제
특정 양태에서, 본원의 개시내용의 항체는 정제될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "정제된"은 다른 성분으로부터 단리될 수 있는 조성물을 언급하는 것으로 의도되고 여기서, 상기 단백질은 이의 천연적으로 수득가능한 상태에 상대적으로 임의의 정도로 정제된다. 따라서 정제된 단백질은 또한 이것이 천연적으로 존재할 수 있는 환경으로부터 격리된 단백질을 언급한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이러한 지정은 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 형성하여, 예를 들어, 상기 조성물내 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상의 단백질을 구성하는 조성물을 언급한다.
단백질 정제 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이들 기술은 하나의 수준에서 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획에 대한 세포 환경의 조 분획을 포함한다. 다른 단백질로부터 폴리펩티드를 분리하면 목적하는 폴리펩티드는 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제하여 부분적 또는 완전한 정제(또는 균질물로의 정제)를 성취할 수 있다. 순수 펩티드의 정제에 적합한 분석적 방법은 특히 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전점 포커싱이다. 단백질 정제를 위한 다른 방법은 황산암모늄, PEG, 항체 등을 사용한 침전 또는 열 변성에 이어서 원심분리; 겔 여과, 역상, 하이드록시애퍼타이트 및 친화성 크로마토그래피 및 상기 및 다른 기술과의 조합을 포함한다.
본원의 개시내용의 항체를 정제하는데 있어서, 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 폴리펩티드를 발현하고 변성 조건을 사용하여 단백질을 추출하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 태그된 부분에 결합하는 친화성 칼럼을 사용하는 다른 성분으로부터 정제될 수 있다. 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변화될 수 있거나 특정 단계가 생략되어도 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드의 제조를 위해 적합한 방법을 여전히 수득할 수 있는 것으로 사료된다.
통상적으로, 완전한 항체는 항체의 Fc 부분에 결합하는 제제(즉, 단백질 A)를 사용하여 분획된다. 대안적으로, 항원을 사용하여 적당한 항체를 동시에 정제하고 선택할 수 있다. 상기 방법은 흔히 칼럼, 여과기 및 비드와 같은 지지체에 결합된 선택 제제를 사용한다. 상기 항체는 지지체에 결합되고 오염물이 제거되고(예를 들어, 세척 제거됨) 항체는 조건(염, 열 등)을 적함에 의해 방출된다.
단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량하기 위한 다양한 방법은 본원 개시내용과 관련하여 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이들은 예를 들어 활성 분획의특이적 활성을 계측하거나 SDS/PAGE 분석에 의해 분획물내 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획물의 순도를 평가하기 위한 또 다른 방법은 분획물의 특이적 활성을 계산하고 이를 초기 추출물의 특이적 활성과 비교하고 따라서 순도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내는데 사용되는 실제 유니트는 물론 정제를 따르도록 선택된 특정 검정 기술 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출가능한 활성을 나타내는지의 여부에 의존할 것이다.
폴리펩티드의 이동은 때로는 상당히 SDS/PAGE의 상이한 조건과 함께 다양할 수 있는 것으로 공지되어 있다(문헌참조: Capaldi et al., 1977). 따라서, 상이한 전기영동 조건하에서 정제된 또는 부분적으로 정제된 발현 생성물의 겉보기 분자량은 다양할 수 있는 것으로 평가된다.
IV. 암 치료
A. 제형 및 투여
본원의 개시내용은 동일한 것을 제조하기 위해 항-LILRB 항체 및 항원을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 예방학적 또는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 단편 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 특정 양태에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 연방 규제 기관 또는 주정부에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물용 및 보다 특히 인간용으로서 일반적으로 인지된 약전에 등록된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 이와 함께 치료제가 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 언급한다. 상기 약제학적 담체는 물, 및 멸균 액체, 예를 들어, 석유 동물성, 식물성 또는 합성 기원을 포함하는 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내로 투여되는 특정 담체이다. 식염 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 액체 담체로서, 특히 주사용액을 위해 사용될 수 있다. 다른 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 겔라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조된 스킴 밀크, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
경우에 따라 조성물은 또한 소량의 습윤화제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용제, 현탁제, 유제, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 지연 방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카라이드, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 제제의 예는 문헌"Remington's Pharmaceutical Sciences."]에 기재되어 있다. 상기 조성물은 예방학적 또는 치료적 유효량의 항체 또는 이의 단편을 바람직하게 정제된 형태로 환자에게 적당한 투여를 위한 형태로 제공하기 위한 적합한 양의 담체와 함께 함유한다. 상기 제형은 경구, 정맥내, 동맥내, 협측내, 비강내, 분무, 기관지 흡입일 수 있거나 기계적 통기에 의해 전달될 수 있는 투여 방식에 적합해야만 한다.
본원의 개시내용의 항체는 본원에 기재된 바와 같이 비경구 투여용으로 제형화될 수 있고, 예를 들어, 피내, 정맥내, 근육내, 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사용으로 제형될 수 있다. 상기 항체는 대안적으로 직접적으로 점막으로의 국소 경로에 의해, 예를 들어, 비강 적가, 흡입 또는 분무기에 의해 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 산 염 및 예를 들어, 염산 또는 인산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 무기산과 형성되는 것들을 포함한다. 유리된 카복실 그룹과 형성된 염은 또한 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 상기 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
인위적 후천성 수동 면역으로서 공지된 항체의 수동적 전달은 일반적으로 정맥내 주사의 용도를 포함한다. 항체 형태는 정맥내(IVIG) 또는 근육내 (IG) 사용을 위한 풀링된 인간 면역글로불린으로서, 면역화되거나 질환으로부터 회수한 공여자로부터의 고역가 인간 IVIG 또는 IG로서 및 단클론성 항체(MAb)로서 인간 또는 동물 혈장 또는 혈청일 수 있다. 상기 면역력은 일반적으로 짧은 기간 동안만 지속하고 특히 비-인간 기원의 감마 글로불린으로부터의 과민성 반응 및 혈청병에 대한 잠재적 위험이 있다. 그러나, 수동 면역력은 즉각적 보호를 제공한다. 상기 항체는 주사용으로 적합한, 즉 멸균 및 주사가능한 담체로 제형화된다.
일반적으로, 본원의 개시내용의 조성물의 성분은 유니트 투여 형태, 예를 들어, 활성제의 양을 표지하는 앰푸울 또는 사쉐트와 같은 밀폐적으로 밀봉된 컨테이너에서 무수 동결건조된 산제 또는 무수 농축물로서 별도로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야만 하는 경우, 멸균 약제학적 등급 물 또는 식염수를 함유하는 주입병과 함께 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰푸울은 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
본원의 개시내용의 조성물은 중성 또는 염 형태로서 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것들과 같이 음이온과 함께 형성된 것들 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것들과 같은 양이온과 형성된 것들을 포함한다.
B. 조합 치료요법
또한, 추가의 항-암 치료요법과 연계하여 본원의 개시내용의 항체를 사용한 조합 치료를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이들 치료요법은 하나 이상의 질환 파라미터의 감소를 성취하기 위한 유효량으로 제공된다. 상기 방법은 세포/대상체 를 동시에 제제/치료요법 둘다와 예를 들어, 2개 제제를 포함하는 단일 조성물 또는 약제학적 제형을 사용하여 접촉시키거나 세포대상체를 동시에 2개의 별도의 조성물 또는 제형(여기서, 하나의 조성물은 항체를 포함하고 다른 하나는 다른 제제를 포함한다)과 접촉시킴을 포함할 수 있다.
대안적으로, 상기 항체는 수분 내지 수주 범위의 간격으로 다른 치료에 선행하거나 이에 후속될 수 있다. 일반적으로 유의적 기간이 각각의 전달 시점 사이에서 종료되지 않도록 하여 치료요법이 여전히 세포/대상체에 대해 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 보장해야 한다. 이러한 경우에, 세포를 서로간에 약 12 내지 24시간 이내에 2개의 양상으로 접촉시키고 서로간에 약 6 내지 12시간 이내 또는 단지 약 12시간의 지연 시간과 함께 2개의 양상으로 접촉시키는 것이 고려된다. 일부 용액에서, 치료 동안 유의적으로 시기를 연장하는 것이 바람직할 수 있지만; 여기서 각각의 투여 사이에는 여러 10일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는8)의 지체 시간이 있다.
또한 항-DC-HIL 항체 또는 다른 치료요법의 1개 초과의 투여가 요구됨을 고려할 수 있다. 하기 예시된 바와 같이 다양한 조합이 사용될 수 있고, 여기서 상기 항체는 "A"이고 다른 치료요법은 B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
다른 조합이 고려된다. 세포를 사멸시키기 위해, 세포 성장을 억제하거나 전이를 억제하거나 혈관형성을 억제하거나, 종양 세포의 악성 표현형을 역행시키거나 감소시키고, 다르게는 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 표적 세포 또는 부위를 항체 또는 적어도 하나의 다른 치료요법과 접촉시킬 수 있다. 이드 치료요법은 암 세포의 증식을 사멸시키거나 억제하는데 효과적인 조합된 양으로 제공된다. 이러한 방법은 세포/부위/대상체를 동시에 제제/치료요법과 접촉시킴을 포함할 수 있다.
본원의 개시내용의 항체와 조합 치료요법을 위해 고려되는 특정 제제는 화학요법 및 조혈 줄기 세포 이식을 포함한다. 화학요법은 시타라빈 (ara-C) 및 안트라사이클린 (대부분 흔히 다우노루비신), 단독의 고용량 시타라빈 치료요법의 완료 후 유도 화학요법, 일반적으로 안트라사이클린, 히스타민 디하이드로클로라이드(Ceplene) 및 인터류킨 2(Proleukin)에 추가로 올-트랜스-레티노산 (ATRA), 고용량 화학요법에 대한 후보물이 아닌 재발된 AML을 갖는 60세 초과의 환자들에 대한 겜투주맙 오조아미신(Mylotarg), 클로파라빈, 및 표적화된 치료요법, 예를 들어, 키나제 억제제, 파르네실 전달효소 억제제, 데시타빈 및 MDR1(다중약물-내성 단백질의 억제제, 또는 삼산화비소 또는 재발된 급성 전골수성 백혈병 (APL)을 포함할 수 있다.
V. 항체 콘주게이트
본원의 개시내용의 항체는 항체 콘주게이트를 형성하기 위해 적어도 하나의 제제와 결합될 수 있다. 진단학적 또는 치료학적 제제로서 항체 분자의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 하나의 목적하는 분자 또는 잔기에 연결하거나 공유적으로 결합하거나 복합체화하는 것은 통상적이다. 상기 분자 또는 잔기는 적어도 하나의 효과기 또는 리포터 분자일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 효과기 분자는 목적하는 활성, 예를 들어, 세포독성 활성을 갖는 분자를 포함한다. 항체에 부착된 효과기 분자의 비제한적인 예는 독소, 항-종양제, 치료학적 효소, 방사능핵종, 항바이러스 제제, 킬레이팅제, 사이토킨, 성장 인자 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대조적으로, 리포터 분자는 검정을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 잔기로서 정의된다. 항체에 콘주게이트된 리포터 분자의 비제한적인 예는 효소, 방사능표지, 합텐, 형광성 표지, 인광성 분자, 화학발광성 분자, 발색단, 광친화성 분자, 발색 입자 또는 리간드, 예를 비오틴을 포함한다.
항체 콘주게이트는 일반적으로 진단학적 제제로서 사용하기 위해 바람직하다. 항체 진단제는 일반적으로 2개의 부류내, 다양한 면역검정에서와 같이 시험관내 진단제에 사용하기 위한 것들, 및 "항체-지시된 이미지화"로서 일반적으로 공지된 생체내 진단적 프로토콜을 사용하기 위한 것들에 속한다. 많은 적당한 이미지화제는 당업계에 공지되어 있고 항체로의 이들의 접착 방법은 기재되어 있다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,021,236호, 제4,938,948호, 및 제4,472,509호). 사용된 이미지화 모이어티는 상자성 이온, 방사능활성 동위원소, 형광색소, NMR-검출가능한 물질 및 X선 이미지화제일 수 있다.
상자성 이온의 경우에, 예를 들어, 크로뮴(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리 (II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및/또는 에르븀 (III)과 같은 이온을 언급할 수 있고, 가돌리늄이 특히 바람직하다. 다른 기술, 예를 들어, X선 이미지화제에 유용한 이온은 란타늄(III), 골드(III), 납(II), 및 특히 비스무스(III)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
치료학적 및/또는 진단학적 적용을 위한 방사능활성 동위원소의 경우에, 아스타틴211, 14탄소, 51크로뮴, 36염소, 57코발트, 58코발트, 구리67, 152Eu, 갈륨67, 3하이드로겐, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐111, 59철, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크니슘99m 및/또는 이트륨90을 언급할 수 있다. 125I는 흔히 특정 양태에서 사용하기 위해 바람직하고 테크니슘99m 및/또는 인듐111은 또한 흔히 긴 범위 검출을 위해 이들의 낮은 에너지 및 적합성으로 인해 바람직하다. 본원의 개시내용의 방사능활성으로 표지된 단클론성 항체는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 단클론성 항체는 요오드화 나트륨 및/또는 요오드화칼륨 및 차아염소산나트륨과 같은 화학적 산화제, 또는 효소적 산화제, 예를 들어, 락토퍼옥시다제와 접촉시킴에 의해 요오드화될 수 있다. 본원의 개시내용에 따른 단클론성 항체는 리간드 교환 방법, 예를 들어, 퍼테크네이트를 주석 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 칼럼 상으로 킬레이팅하고 상기 항체를 상기 칼럼으로 적용함에 의해 테크네튬99m 으로 표지시킬 수 있다. 대안적으로, 직접적인 표지화 기술은 예를 들어, 퍼테크네이트, SNCl2와 같은 환원제, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액과 같은 완충액 및 항체를 항온처리함에 의해 사용될 수 있다. 금속 이온으로서 존재하는 방사능동위원소를 항체에 결합시키기 위해 흔히 사용되는 중개 기능성 그룹은 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산 (EDTA)이다.
콘주게이트로서 사용하기 위해 고려되는 형광성 표지는 Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein Isothiocyanate), HEX, 6-JOE, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 오레곤 그린(Oregon Green) 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), REG, 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 레노그래핀(Renographin), ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 및/또는 텍사스 레드(Texas Red)를 포함한다.
본원의 개시내용에서 고려되는 항체 콘주게이트의 또 다른 유형은 주로 시험관내 사용하기 위한 것들이고, 여기서, 상기 항체는 2차 결합 리간드에 결합되고/되거나 색원성 기질과 접촉시 발색 생성물을 생성하는 효소 (효소 태그)에 결합된다. 적합한 효소의 예는 우레아제, 알칼린 포스파타제, (서양고추냉이) 수소 퍼옥시다제 또는 글루코스 옥시다제를 포함한다. 바람직한 2차 결합 리간드는 비오틴 및 아비딘 및 스트렙타비딘 화합물이다. 상기 표지의 사용은 당업자들에게 널리 공지되어 있고 예를 들어, 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호에 기재되어 있다.
분자의 항체로의 부위-특이적 접착의 또 다른 공지된 방법은 합텐-기반 친화성 표지와 항체의 반응을 포함한다. 필수적으로, 합텐-기반 친화성 표지는 항원 결합 부위에서 아미노산과 반응하여 상기 부위를 손상하고 특정 항원 반응을 차단한다. 그러나, 이것은 항체 콘주게이트에 의한 항원 결합의 상실을 유발하기 때문에 유리할 수 없다.
아지도 그룹을 함유하는 분자는 또한 낮은 강도의 자외선광에 의해 생성되는 반응성 니트렌 중간체를 통해 단백질에 공유 결합을 형성하기 위해 사용될 수 있다(문헌참조: Potter and Haley, 1983). 특히, 퓨린 뉴클레오티드의 2- 및 8-아지도 유사체는 조악한 세포 추출물에서 뉴클레오티드 결합 단백질을 식별하기 위해 부위 지시된 광프로브로서 사용되어왔다(문헌참조: Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985). 2- 및 8-아지도 뉴클레오티드는 또한 정제된 단백질의 뉴클레오티드 결합 도메인을 맵핑하기 위해 사용되어 왔고(문헌참조: Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; Dholakia et al., 1989) 항체 결합 제제로서 사용될 수 있다.
여러 방법이 항체의 이의 콘주게이트 잔기로의 부착 또는 콘주게이트를 위해 당업계에 공지되어 있다. 일부 부착 방법은 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물 (DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아미드; 및/또는 항체에 부착된 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코우라실-3과 같은 유기 킬레이팅 제제를 사용하는 금속 킬레이트 착물의 용도를 포함한다(미국 특허 제4,472,509호 및 제4,938,948호). 단클론성 항체는 또한 글루타르알데하이드 또는 페리오데이트와 같은 커플링 제제의 존재하에 효소와 반응시킬 수 있다. 플루오레신 마커와의 콘주게이트는 이들 커플링 제제의 존재하에 또는 이소티오시아네이트와 반응시켜 제조된다. 미국 특허 제4,938,948호에서, 유방 종양의 이미지화는 단클론성 항체를 사용하여 성취되고 검출가능한 이미지화 모이어티는 메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 또는 N-숙신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트와 같은 링커를 사용하여 항체에 결합된다.
다른 양태에서, 항체 조합 부위를 변화시키지 않는 반응 조건을 사용하여 면역글로불린의 Fc 영역에서 설프하이드릴 그룹을 선택적으로 도입함에 의한 면역글로불린의 유도체화가 고려된다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 항체 콘주게이트는 개선된 수명, 특이성 및 민감성을 나타내도록 하기 위해 기재되어 있다(미국 특허 제5,196,066호, 본원에 참조로 인용됨). 효과기 또는 리포터 분자의 부위 특이적 부착(여기서, 상기 리포터 또는 효과기 분자는 Fc 영역 내 탄수화물 잔기에 콘주게이트되어 있다)은 또한 문헌에 기재되어 있다(문헌참조: O'Shannessy et al., 1987). 상기 방법은 현재 임상 평가중에 있는 진단학적으로 및 치료학적으로 전망있는 항체를 제조하는 것으로 보고되었다.
VI. 면역검출 방법
여전히 추가의 양태에서, 본원의 개시내용은 LILRB 관련 암에 결합하고, 이를 정제하고, 제거하고, 정량하고 다르게는 일반적으로 검출하기 위한 면역검출 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 통상적으로 적용될 수 있지만 또 다른 용도는 품질 관리 및 백신 및 다른 바이러스 스톡의 모니터링에 있고 여기서, 본원의 개시내용에 따른 항체는 바이러스 내 H1 항원의 양 또는 통합성 (즉, 장기 안정성)을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 적당한/목적하는 반응성 프로필을 우해 다양한 항체를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
일부 면역검출 방법은 일부를 거론하자면 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사선면역검정(RIA), 면역방사능측정 검정, 형광면역검정, 화학발광 검정, 생물발광 검정 및 웨스턴 블롯을 포함한다. 특히, LILRB의 검출 및 정량을 위한 경쟁 검정이 또한 제공된다. 다양한 유용한 면역검출 방법의 단계는 과학적 문헌에 기재되어 있고 예를 들어 하기 문헌에 기재되어 있다: Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993), and Nakamura et al. (1987). 일반적으로, 면역결합 방법은 LILRB-관련 암을 함유할 것으로 의심되는 샘플을 수득하고 면역복합체의 형성을 가능하게 하는데 효과적인 조건하에서 상기 샘플을 본원의 개시내용에 따라 제1 항체와 접촉시킴을 포함한다.
이들 방법은 샘플로부터 LILRB 또는 LILRB 관련 암 세포를 검출하거나 정제하기 위한 방법을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 예를 들어, 칼럼 매트릭스 형태로 고형 지지체에 결합되고 LILRB 관련 암 세포를 함유할 것으로 의심되는 샘플은 고정화된 항체에 적용된다. 원치 않는 성분은 칼럼으로부터 세척되고 LILRB-발현 세포는 칼럼으로부터 유기체 또는 항원을 제거함에 의해 수거된 고정화된 항체에 면역복합된 상태로 남아있다.
면역결합 방법은 또한 샘플 중에서 LILRB-관련 암 세포 또는 관련 성분의 양을 검출하고 정량하기 위한 방법 및 결합 과정 동안에 형성된 임의의 면역 복합체의 검출 및 정량을 위한 방법을 포함한다. 여기서, LILRB-관련 암 세포를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하고 상기 샘플을 LILRB 또는 이의 성분에 결합하는 항체와 접촉킴에 이어서 특이적 조건하에서 형성된 면역 복합체의 양을 검출하고 정량한다. 항원 검출 관련하여, 분석된 생물학적 샘플은 조직 절편 또는 표본, 균질화된 조직 추출물, 혈액 및 혈청을 포함하는 생물학적 유체, 또는 대변 또는 뇨와 같은 분비물과 같은 LILRB 관련 암을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플일 수 있다.
면역 복합체 (주요 면역 복합체)의 형성을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 및 효과적인 조건하에서 선택된 생물학적 샘플을 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로 항체 조성물을 샘플에 단순히 첨가하고 상기 혼합물을 항체가 면역 복합체를 형성하기에 충분한, 즉 LILRB와 결합하기에 충분한 시간 동안 항온처리하는 문제이다. 이 시간 후에, 샘플-항체 조성물, 예를 들어, 조직 절편, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 브롯은 일반적으로 임의의 비특이적으로 결합된 항체 종을 제거하기 위해 세척되어 1차 면역 복합체내 특이적으로 결합된 상기 항체들만이 검출되도록 한다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당업계에 널리 공지되어 있고 수많은 방법의 적용을 통해 성취될 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 상기 방사능활성, 형광성, 생물학적 및 효소적 태그 중 임의의 것과 같은 표지 또는 마커의 검출을 기반으로 한다. 상기 표지의 용도에 관한 특허는 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호를 포함한다. 물론, 당업계에 공지된 바와 같이 제2 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 정렬과 같은 2차 결합 리간드의 사용을 통해 추가의 이점을 발견할 수 있다.
검출에 사용되는 항체는 그 자체가 검출가능한 표지에 결합될 수 있고, 여기서, 이후 상기 표지를 단순히 검출하여 조성물내 1차 면역 복합체의 양이 계측될 수 있게 한다. 대안적으로, 1차 면역 복합체내에 결합하게 되는 제1 항체는 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 제2 결합 리간드에 의해 검출될 수 있다. 이들 경우에, 제2 결합 리간드는 검출가능한 표지에 결합될 수 있다. 상기 제2 결합 리간드는 그 자체가 흔히 항체이고 따라서 이는 "2차" 항체로서 호칭될 수 있다. 1차 면역 복합체는 효과적인 조건하에서 및 2차 면역 복합체의 형성을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 2차 면역 복합체는 이어서 일반적으로 임의의 비특이적으로 결합된 표지된 2차 항체 또는 리간드를 제거하기 위해 세척되고 이어서 2차 면역 복합체에 잔류하는 수준이 검출된다.
추가의 방법은 2단계 방법에 의한 1차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 제2 결합 리간드, 예를 들어, 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 항체는 상기된 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성하기 위해 사용된다. 세척 후, 2차 면역 복합체는 다시 면역 복합체 (3차 면역 복합체)의 형성을 가능하게 하는 효과적인 조건 및 충분한 시간 동안 제2 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 제3 결합 리간드와 접촉시킨다. 제3 리간드 또는 항체는 검출 가능한 표지와 결합시켜 따라서 3차 면역 복합체가 검출될 수 있도록 한다. 상기 시스템은 이것이 요구되는 경우 신호 증폭을 제공할 수 있다.
면역검출의 한가지 방법은 2개의 상이한 항체를 사용한다. 제1 비오티닐화된 항체는 표적 항원을 검출하기 위해 사용되고 제2 항체는 이어서 복합체화된 비오틴에 부착된 비오틴을 검출하기 위해 사용된다. 상기 방법에서, 시험될 샘플은 먼저 제1 단계 항체를 함유하는 용액 중에서 항온처리한다. 표적 항원이 존재하는 경우, 항체의 일부는 항원과 결합하여 비오티닐화된 항체/항원 복합체를 형성한다. 항체/항원 복합체는 이어서 스트렙타비딘 (또는 아비딘), 비오티닐화된 DNA 및/또는 상보적 비오티닐화된 DNA의 연속 용액 중에서 항온처리함에 의해 증폭시키고, 각각의 단계는 추가의 비오틴 부위를 항체/항원 복합체에 첨가한다. 증폭 단계들은 적합한 수준의 증폭이 성취될 때까지 반복하고, 상기 수준의 증폭 시점에서 샘플은 비오틴에 대한 제2 단계 항체를 함유하는 용액 중에서 항온처리한다. 상기 제2 단계는 예를 들어, 크로모겐 기질을 사용하는 조직효소학에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 효소로 표지시킨다. 적합한 증폭과 함께 거시적으로 가시화될 수 있는 콘주게이트를 제조할 수 있다.
면역검출의 또 다른 공지된 방법은 면역-PCR (폴리머라제 연쇄 반응) 방법을 이용한다. 상기 PCR 방법은 비오티닐화된 DNA와의 항온처리시 때까지 캔토르(Cantor) 방법과 유사하지만 대신 다중 라운드의 스트렙타비딘 및 비오티닐화된 DNA 항온처리를 사용하는 것 대신 DNA/비오틴/스트렙타비딘/항체 복합체는 항체를 방출시키는 낮은 pH 또는 고염 완충액으로 세척 제거한다. 수득한 세척 용액은 이어서 적당한 대조군과 함께 적합한 프라이머를 사용한 PCR 반응을 수행하기 위해 사용된다. 적어도 이론적으로, PCR의 거대한 증폭 능력 및 특이성은 단일 항원 분자를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
1. ELISA
이들의 가장 단순하고 직접적인 감각에서 면역 검정은 결합 검정이다. 특정 바람직한 면역검정은 당업계에 공지된 다양한 유형의 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 방사능면역검정 (RIA)이다. 조직 절편을 사용하는 면역조직화학적 검출은 또한 특히 유용하다. 그러나, 검출은 상기 기술에 제한되지 않고 웨스턴 블롯팅, 도트 블롯팅, FACS 분석 등이 또한 사용될 수 있는 것으로 인지된다.
하나의 예시적 ELISA에서, 본원의 개시내용의 항체는 폴리스티렌 미세역가 플레이트 중 웰과 같이, 단백질 친화성을 나타내는 선택된 표면 상으로 고정화시킨다. 이어서, LILRB-관련 암 세포를 함유하는 것으로 의심되는 시험 조성물은 웰에 첨가한다. 결합, 및 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 항원은 검출될 수 있다. 검가능한 표지에 결합된 또 다른 항-LILRB 항체의 첨가에 의해 성취될 수 있다. 상기 유형출은 검출의 ELISA는 단순한 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 제2 항-LILRB 항체의 첨가에 이어서 제2 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 제3 항체의 첨가에 의해 성취될 수 있고 상기 제3 항체는 검출가능한 표지에 결합된다.
또 다른 예시적 ELISA에서, LILRB 관련 암 세포를 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 웰 표면상으로 고정화되고 이어서 본원의 개시내용의 항-LILRB 항체와 접촉시킨다. 결합 및 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 항-LILRB 항체가 검출된다. 초기 항-LILRB 항체가 검출가능한 표지에 결합되는 경우, 면역 복합체는 직접 검출될 수 있다. 다시, 면역 복합체는 제1 항-LILRB 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 제2 항체를 사용하여 검출될 수 있고, 제2 항체는 검출가능한 표지로 결합된다.
사용되는 포맷과 상관없이, ELISA는 코팅, 항온처리 및 결합, 비특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척 및 결합된 면역 복합체의 검출과 같은 통상적인 특정 특징을 갖는다. 이들은 하기에 기재되어 있다.
항원 또는 항체를 사용하여 플레이트를 코팅시키는데 있어서, 일반적으로 밤새 또는 특정 기간 동안 항원 또는 항체의 용액으로 플레이트의 웰을 항온처리한다. 상기 플레이트의 웰은 이어서 불완전하게 흡수된 물질을 제거하기 위해 세척한다. 웰의 임의의 남아있는 가용한 표면을 이어서 시험 항혈청과 관련하여 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "코팅"시킨다. 이들은 소 혈청 알부민 (BSA), 카세인 또는 밀크 분말 용액을 포함한다. 상기 코팅은 고정화 표면 상의 비특이적 흡착 부위의 차단을 가능하게 하고 따라서 항혈청의 상기 표면상으로의 비특이적 결합에 의해 유발되는 백그라운드를 감소시킨다.
ELISA에서, 직접적 과정 보다 차라리 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 아마도 보다 통상적이다. 따라서, 단백질 또는 항체의 웰로의 결합, 백그라운드를 감소시키기 위한 비-반응성 물질을 사용한 코팅 및 결합되지 않은 물질을 제거하기 위한 세척 후, 고정화 표면은 면역 복합체(항원/항체) 형성을 가능하게 하기 위해 효과적인 조건하에서 시험될 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 이어서 면역 복합체의 검출은 표지된 3차 항체 또는 제3 결합 리간드와 연계된 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체 및 제2 결합 리간드 또는 항체를 요구한다.
"면역 복합체 (항원/항체) 형성을 가능하게 하는데 효과적인 조건"이란 조건은 바람직하게 항원 및/또는 항체를 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 또는 인산 완충 식염수(PBS)/Tween과 같은 옹액으로 희석함을 포함한다. 이들 첨가된 제제는 또한 비특이적 백그라운드를 감소시키는 것을 도와주는 경향이 있다.
"적합한" 조건은 또한 항온처리가 효과적인 결합을 가능하게 하기에 충분한 온도에서 또는 충분한 기간 동안 수행됨을 의미한다. 항온처리 단계는 전형적으로 바람직하게 25℃ 내지 27℃의 순서의 온도에서 약 1　내지 2 내지 4　시간 등이거나 밤새 약 4℃ 등에서 수행될 수 있다.
ELISA에서 모든 항온 처리 단계 후, 상기 접촉된 표면은 비-복합체화된 물질을 제거하기 위해 세척된다. 바람직한 세척 과정은 PBS/Tween, 또는 보레이트 완충액과 같은 용액으로 세척함을 포함한다. 시험 샘플과 본래에 결합된 물질간의 특이적 면역 복합체의 형성 및 후소적 세척 후, 심지어 최소량의 면역 복합체의 존재가 계측될 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 제2 또는 제3 항체는 검출을 가능하게 하는 관련 표지를 갖는다. 바람직하게, 이것은 적당한 발색 기질과의 항온처리시 발색을 나타내는 효소이다. 따라서, 예를 들어, 추가의 면역 복합체 형성의 전개를 선호하는 조건하에서 및 시간 동안 우레아제, 글루코스 옥시다제, 알칼린 포스파타제 또는 수소 퍼옥시다제 콘주게이트된 항체와 제1 및 제2 면역 복합체를 접촉시키거나 항온처리하는 것이 바람직하다(예를 들어, PBS-Tween과 같은 PBS-함유 용액 중에서 실온에서 2시간동안 항온처리).
표지된 항체와 항온처리하고 이어서 미결합된 물질을 제거하기 위한 세척 후, 표지의 양은 예를 들어, 효소 표지로서 퍼옥시다제의 경우에 우레아, 또는 브로모크레졸 퍼플 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산(ABTS), 또는 H2O2와 같은 발색 기질과 항온처리함에 의해 정량한다. 이어서 정량은 발색 정도를 예를 들어, 가시적 스펙트럼 분광측정기를 사용하여 측정함에 의해 성취된다.
2. 웨스턴 블롯
상기 웨스턴 블롯 (대안적으로 단백질 면역블롯)은 조직 균질물 또는 추출물의 소정의 샘플 내 특정 단백질을 검출하기 위해 사용되는 분석학적 기술이다. 폴리펩티드 길이 (변성 조건)에 의해 또는 단백질의 3-D 구조에 의해 (천연/비-변성 조건) 천연 또는 변성된 단백질을 분리하기 위해 겔 전기영동을 사용한다. 이어서 단백질은 막 (전형적으로 니트로셀룰로스 또는 PVDF)로 이전시키고, 여기서, 이들은 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 프로브된다(검출된다).
샘플은 전체 조직 또는 세포 배양물로부터 취할 수 있다. 대부분의 경우에, 고체 조직은 먼저 블렌더를 사용하거나 (보다 큰 샘플 용적에 대하여), 파쇄기를 사용하거나 (보다 작은 용적) 초음파 처리에 의해 기계적으로 분쇄한다. 세포는 또한 상기 기계적 방법 중 하나에 의해 개방되도록 손상시킬 수 있다. 그러나, 세균, 바이러스 또는 환경적 샘플은 단백질의 공급원일 수 있고 따라 웨스턴 블롯팅은 세포 연구에만 제한되지 않음을 주지해야 한다. 적합한 세제, 염 및 완충제를 사용하여 세포의 용해를 고무시키고 단백질을 가용화시킨다. 프로테아제 및 포스파타제 억제제는 흔히 이 자신의 효소에 의한 샘플의 분해를 차단하기 위해 첨가된다. 조직 제조는 흔히 냉온에서 수행되어 단백질 변성을 회피한다.
샘플의 단백질은 겔 전기영동에 의해 분리된다. 단백질의 분리는 등전점 (pI), 분자량, 전기 하전 또는 이들 인자의 조합에 의한 것일 수 있다. 분리의 특성은 샘플의 처리 및 겔의 특성에 의존한다. 이것은 단백질을 계측하기 위해 매우 유용한 방법이다. 또한, 단백질을 단일 샘플로부터 2차원으로 제거 확산시키는 2차원 (2-D) 겔을 사용할 수 있다. 단백질은 제1 차원에서 등전점 (이 시점의 pH는 중성 총 전하를 갖는다), 및 제2 차원에서 이들의 분자량에 따라 분리된다.
단백질이 항체 검출에 근접 가능하게 하기 위해, 이들은 겔 내에서로부터 니트로셀룰로스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)로 구성된 막 상으로 이동한다. 상기 막은 겔의 상부 상에 위치시키고 여과지 스택을 이의 상부에 위치시킨다. 전체 스택은 모세관 작용에 의해 종이 위를 이동하는 완충 용액 중에 위치시키고 단백질을 여기에 적용한다. 단백질을 이전시키기 위한 또 다른 방법은 전기 블롯팅으로 불리우고 겔로부터 단백질을 PVDF 또는 니트로셀룰로스 막으로 인출하기 위해 전류를 사용한다. 상기 단백질은 겔 내에서로부터 막 상으로 이동하고 이들이 겔내에서 갖는 구성을 유지한다. 상기 블롯팅 과정의 결과로서, 단백질은 검출을 위해 박표면 층상에 노출시킨다(하기 참조). 막의 변수 둘다는 이들의 비-특이적 단백질 결합 성질 (즉, 잘 균등하게 모든 단백질에 결합한다)에 대해 선택된다. 단백질 결합은 소수성 상호작용, 및 막과 단백질 간의 하전된 상호작용을 기반으로 한다. 니트로셀룰로스 막은 PDVF 보다 저렴하지만 훨씬 더 약하고 반복된 프로빙을 견디지 못한다. 단백질의 겔로부터 막으로의 이전(transfer)의 균일성 및 전체 효과는 막을 쿠마시 블리리언트 블루 또는 폰세아우 에스 염료로 염색시킴에 의해 검사할 수 있다. 일단 이전되면, 단백질은 표지된 1차 항체 또는 비표지된 1차 항체를 사용하고 이어서 1차 항체의 Fc 영역에 결합하는 표지된 단백질 A 또는 2차 표지된 항체를 사용한 간접적 검출에 의해 검출된다.
3. 면역조직화학
본원의 개시내용의 항체는 또한 면역조직화학 (IHC)에 의한 연구를 위해 제조되는 새로운 동결되고/되거나 포르말린 고정된, 파라핀 매립된 조직 블록과 연계하여 사용될 수 있다. 이들 미립자 표본으로부터 조직 블록을 제조하는 방법은 성공적으로 다양한 예후 인자의 이전의 IHC 연구에 성공적으로 사용되었고 당업자에게 널리 공지되어 있다(문헌참조: Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).
간략하게, 동결된-절편은 작은 플라스틱 캡슐 내 인산 완충 식염수 (PBS) 중에 실온에서 50ng의 동결된 "가황" 조직을 재수화시킴에 의해; 상기 입자를 원심분리하여 펠렛팅함에 의해; 이들을 점성 매립 배지 (OCT) 중에 재현탁시킴에 의해; 상기 캡슐을 역위시키고/시키거나 다시 원심분리에 의해 펠렛팅하고; -70℃ 이소펜탄에서 순간 동결시킴에 의해; 플라스틱 캡슐을 절단하고/하거나 조직의 동결된 실린더를 제거함에 의해; 크리오스탯 마이크로톰 척 상에 조직 실린더를 확보함에 의해; 및/또는 캡슐로부터 25-50 시리얼 절편을 절단함에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 전체 동결된 조직 샘플은 시리얼 절편 커팅을 위해 사용될 수 있다
영구적-절편은 플라스틱 미세원심분리 튜브에서 50mg 샘플의 재수화; 펠렛화; 4시간 고정화 동안 10% 포르말린 중에 재현탁화; 세척/펠렛화; 가온 2.5% 한천에서 재현탁; 펠렛화; 빙수에서의 냉각으로 한천의 고화; 튜브로부터 조직/한천 블록의 제거; 파라핀 중 블록의 침윤 및/또는 매립 및/또는 50 시리얼 영구적 절편으로의 절단을 포함하는 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 다시, 전체 조직 샘플은 대체될 수 있다.
4. 면역검출 키트
여전히 추가의 양태에서, 본원의 개시내용은 상기된 면역검출 방법과 함께 사용하기 위한 면역검출 키트에 관한 것이다. 항체는 LILRB-관련 암 세포를 검출하기 위해 사용될 수 있으므로, 상기 항체는 상기 키트에 포함될 수 있다. 면역검출 키트는 따라서 적합한 컨테이너 수단에서 LILRB에 결합하는 제1 항체 및 임의로 면역검출 시약을 포함한다.
특정 양태에서, 상기 항체는 고형 지지체, 예를 들어, 미세역가 플레이트의 칼럼 매트릭스 및/또는 웰에 미리 결합될 수 있다. 키트의 면역 검출 시약은 소정의 항체와 연합되거나 결합되는 상기 검출가능한 표지를 포함하는 다양한 형태의 임의의 하나를 취할 수 있다. 2차 결합 리간와 연합되거나 부착된 검출가능한 표지가 또한 고려된다. 예시적 2차 리간드는 제1 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 2차 항체이다.
본원의 키트에 사용하기 위한 추가의 적합한 면역 검출 시약은 제2 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 제3 항체와 함께, 제1 항체에 대해 결합 친화성을 갖는 2차 항체를 포함하는 2개 성분 시약을 포함하고, 상기 제3 항체는 검출가능한 표지에 결합된다. 상기된 바와 같이, 다수의 예시적 표지는 당업계에 공지되어 있고 모든 상기 표지는 본원의 개시내용과 관련하여 사용될 수 있다.
상기 키트는 표지되든 표지되지 않든 상관 없이 LILRB의 적합하게 적정된 조성물을 추가로 포함할 수 있고 검출 검정을 위한 표준 곡선을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 상기 키트는 완전히 콘주게이트된 형태, 중간체 형태 또는 키트의 사용자에 의해 콘주게이트될 별도의 모이어티로서 항체 표지 콘주게이트를 함유할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매질 또는 동결건조된 형태로 팩키징될 수 있다.
키트의 컨테이너 수단은 일반적으로 적어도 하나의 바이러스, 시험 튜브, 플라스크, 병, 시린지 또는 다른 컨테이너 수단을 포함하고, 여기로 상기 항체가 위치될 수 있거나 바람직하게 적합하게 적정될 수 있다. 본원의 개시내용의 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위한 폐쇄된 밀폐 공간에서 항체, 항원 및 임의의 다른 시약 컨테이너를 함유하기 위한 수단을 포함한다. 상기 컨테이너는 목적하는 바이엘이 보유된 주사 또는 블로우 성형 플라스틱 컨테이너를 포함할 수 있다.
VII. 실시예
하기의 실시예는 바람직한 양태를 입증하기 위해 포함된다. 당업자는 후속 실시예에 기재된 기술이 발명자에 의해 양태의 수행에서 잘 기능하는 것으로 발견된 기술을 나타내고 따라서 이의 수행을 위한 바람직한 양상을 구성하기 위해 고려될 수 있는 것으로 인지되어야만 한다. 그러나, 당업자는 본원의 개시내용의 측면에서 많은 변화가 기재된 특정 양태에서 수행될 수 있고 여전히 본원의 개시내용의 취지 및 범위를 벗어나는 것 없이 동일하거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 인지해야만 한다.
실시예 1
LILRB 및 LAIR1은 AML-SC를 포함하는 AML 세포상에서 고도로 발현되고 이들의 발현은 AML 환자의 생존과 역으로 서로 관련된다.
본원 발명자는 인간 AML 환자 상에 LILRB1-4의 표면 발현을 분석하였고 이들이 이들 환자의 상당한 %로 발현됨을 밝혔다(도 1, 상부). LILRB1,2,3,4는 각각 총 37명의 시험된 인간 AML 발생빈도 중 8, 8, 12, 및 18명 상에서 발현된다. LILRB4를 포함하는 LILRB는 백혈병 줄기 세포 마커 CD34와 함께 동시 발현될 수 있다(도 1, 하부 패널). 본원 발명자의 인 실리코 분석은 여러 밀접하게 관련된 LILRB 패밀리 구성원, LILRB 1, 2, 3, 및 4, 및 LAIR1의 발현이 AML 환자의 전체 생존과 역으로 서로 관련됨을 표지했다(도 2). 이들 수용체는 정상 세포 상에서 보다 인간 AML 세포 상에서 보다 고도로 발현된다. 중요하게, LILRB+/LAIR1+ 세포는 AML-SC의 활성에 대해 집적시킨다(문헌참조: Kang et al., in press).
LILRB 및 LAIR1은 인간 백혈병 세포의 성장 및 이종이식체에 필수적이다. 인간 백혈병에서 LILRB 및 LAIR1의 잠재적 기능을 연구하기 위해, 본원 발명자는 MV4-11 (AML), THP-1 (AML), U937 (AML), 697 (B-ALL), Kasumi2 (B-ALL), 및 RCH-ACV (B-ALL)을 포함하는 이들 수용체의 고수준의 표면 발현을 갖는 인간 백혈병 세포주에서 shRNA를 사용하여 개별적으로 LILRB 및 LAIR1의 발현을 녹다운시킨다. 개별 LILRB2, 3, 4 또는 LAIR1의 발현의 사일런싱은 세포 성장을 급격히 억제하였다. THP-1 및 MV4-11로부터 대표적인 데이터, 재배열된 MLL 유전자와 함께 2개의 AML 세포주는 도 3에 나타낸다. 중요하게, 7개의 임의의 1차 인간 AML 샘플에서 LILRB 또는 LAIR1의 발현 억제는 이종이식된 NSG 마우스에서 백혈병 발육을 거의 완전히 폐지시켰다(문헌참조: Kang et al., in press). 이들 결과는 여러 LILRB가 인간 AML 세포의 성장을 위해 필수적임을 표지한다.
LILRB가 AML 발육을 지지하는 기작의 보다 깊은 이해를 수득하기 위해, 본원 발명자는 LILRB3-null, LILRB4-null, 또는 LAIR1-null 마우스에서 급성 백혈병 발육을 연구하였다(문헌참조: Tang et al., 2012; Rojo et al., 2000, Zheng et al., 2012). 이들 마우스는 정상의 조혈 및 HSC 활성을 갖는다(문헌참조: Tang et al., 2012; Rojo et al., 2000, Zheng et al., 2012). 본원 발명자는 상기 연구를 위해 MLL-AF9, AML1-ETO, 또는 N-Myc 이식 AML 또는 급성 림프아구성 백혈병 (ALL) 마우스 모델을 사용하였다(문헌참조: Sugihara et al., 2011; Kristov et al., 2006; Somervaille and Clearly, 2006; Yan et al., 2006). LILRB- 또는 LAIR1-null 백혈병 세포가 이식된 마우스는 대조군 보다 연속 희석시 보다 느리게 질환을 발현하였고 결국 백혈병 부재이다. LILRB- 또는 LAIR1-null 표현형 AML-SC 풍부한 세포의 생존 및 자가 소생은 시간 경과에 따라 감소하는 반면 분화하는 이들의 능력은 증가하였다. 본원 발명자는 추가로 SHP-1 및 CAMKI가 AML-SC에서 LILRB/LAIR1 신호 전달 경로에서 주요 성분임을 발견하였다(문헌참조: Kang et al. in press). 이들 결과는 LILRB 및 LAIR1이 AML-SC의 활성을 지지함을 표지한다.
항-LILRB 단클론성 항체(mAbs)의 식별. 본원 발명자는 웨스턴 블롯팅(도 4) 및 유동 세포측정(도 5)에서 LILRB로의 이들의 결합에 의해 계측된 바와 같이 개별 LILRB에 대한 항체를 개발하였다.
LILRB/LAIR1-매개된 신호 전달에 대한 리포터가 없기 때문에, 본원 발명자는 안정한 키메라 수용체 리포터 세포 시스템을 제조하여 항체가 LILRB 또는 LAIR1의 세포외 도메인 (ECD)에 결합하는 능력을 시험하고 쌍을 이룬 면역글로불린형 수용체 β의 키메라 융합된 세포내 도메인의 활성화 또는 억제를 유발하고 상기 수용체는 어댑터 DAP-12를 통한 신호 전달에 의해 NFAT 프로모터-구동된 GFP 발현을 활성화시킨다(도 6 우측 및 도 7, 좌측). 상기 리포터 시스템은 본원 발명자가 항체를 차단하고 항체를 자극하기 위해 스크리닝하도록 할 수 있는 민감성 대용물로서 작용한다.
상기 시스템을 사용하여, 본원 발명자는 LILRB2-4 신호 전달 활성화를 억제하는 신규한 단클론성 항체(mAb) 그룹을 식별하였다(도 6-7). 예를 들어, C84, C53, C92, C201을 포함하는 가용성 항-LILRB4 mAb는 LILRB4에 대한 키메라 수용체 리포터 시스템에서 GFP 유도를 억제한다(도 7).
항-LILRB mAb는 백혈병 발육을 차단한다. 본원 발명자는 여러 항-LILRB mAb가 이종이식체 모델에서 AML 발육을 효과적으로 차단시킴을 식별하였다. 예를 들어, C84, 항-LILRB4 mAb은 이종이식된 마우스 모델에서 AML 발육을 차단하였다. 이들 모델에서, 인간 백혈병 세포 THP-1 또는 MV4-11 (도 8-9에서 나타낸 바와 같은 LILRB4 표면 발현에 대해 양성) 또는 3개의 개별 환자로부터 1차 인간 AML 세포는 본원 발명자가 피하 (sc) 또는 정맥내(iv)로 면역 결핍 NSG 마우스에 이식하였다 (AML 세포주 이식된 이종이식체 모델에 대해 도 10-13; 환자 AML 이종이식체 모델에 대해 도 14-18). 대조적으로, C84 투여는 LILRB4가 암 세포에 의해 발현되지 않는 경우 암 발육을 억제하지 않았다(도 13). 따라서, 항-LILRB4 mAb C84는 LILRB4를 발현하는 인간 AML의 발육에 대해 현저한 특이적 억제 효과를 나타냈다. 중요하게, 상이한 이종이식된 모델을 사용한 6개의 독립적 실험은 유사한 결과를 나타냈다.
C84에 추가로, 본원 발명자는 LILRB에 대한 추가의 9개의 mAb C201, C53, C92, C39, C3, C193, C290, C102, 및 C287이 이종이식체 모델에서 항-백혈병 효과를 가짐을 식별하였다. 항-백혈병 효능 및 이들 mAb의 교차 반응성은 도 19에 요약한다.
백혈병 발육을 억제하는데 효과적인 mAb의 가변 영역의 이소형분류 및 서열분석. 본원 발명자는 mAb C84, C201, C53, C92, C39, C3, C193, C290, C102, 및 C287의 가변 영역의 이소형 및 서열 분석을 수득하였다 (도 20-22).
키메라 항체의 제조 및 항-백혈병 효능의 입증. 키메라 항체를 발현하기 위해, 본원 발명자는 마우스 mAb의 가변 영역을 인간 불변 영역을 암호화하는 발현 벡터로 서브클로닝하고 293T 세포를 형질감염시켰다. 본원 발명자는 형질감염된 293T 세포로부터 조건화된 배지를 수거하였고 키메라 항체를 정제하였다. 도 23은 SDS-PAGE에 의해 계측된 바와 같이 키메라 항-C84 (키메라 ab MHC-C84)의 발현 및 정제를 보여준다.
본원 발명자는 키메라 항체 및 본래의 mAb의 LILRB 결합, 신호 전달 차단 및 백혈병 억제 활성을 비교하였다. 키메라 ab MHC-C84는 유동 세포측정에 의해 계측된 바와 같이 C84로서 각각 THP-1 세포(도 24)상에 및 LILRB4 키메라 수용체 리포터 세포(도 25)상에 LILRB4에 결합한다. 본원 발명자는 또한 키메라 ab MHC-C84가 키메라 수용체 리포터 검정에 의해 계측된 바와 같이 C84로서 LILRB4에 대한 차단 항체임을 밝혔다(도 26). 가장 중요하게, 키메라 ab MHC-C84는 AML 이종이식된 마우스 (도 27)의 간, 골수, 비장 및 말초 혈액의 유동 세포측정 분석에 의해 또는 시간 경과에 따라 AML 이종이식된 마우스 (도 28)에서 종양의 발육의 발광 이미지화에 의해 계측된 바와 같이 이종이식체 모델(본래의 mAb C84 보다 동일하거나 양호한 효과를 갖는다)에서 AML 발육을 억제한다. 현저하게, 이들 실험에서, 본원 발명자는 전체 실험 기간 동안 단지 MHC-C84 또는 C84를 1회 (총 200㎍ 항체/마우스) 투여하였다. 이들 결과는 키메라 항-LILRB가 본래의 mAb 보다 백혈병 발육을 차단하는 동일하거나 보다 큰 능력을 가짐을 표지한다.
요약컨대, 이들 데이터는 다음을 입증하였다: 1) LILRB/LAIR1은 인간 AML 세포에 의해 고도로 발현되고 LILRB+/LAIR1+ 세포는 AML-SC 활성이 풍부하고; 2) LILRB/LAIR1 발현은 AML 환자의 전체 생존율과 역으로 서로 관련되고; 3) LILRB/LAIR1은 시험관내 및 생체내 1차 및 불멸화된 인간 백혈병 세포의 성장을 위해 필수적이고; 4) 본원 발명자는 환자내 AML 유래된 이종이식체 모델을 포함하는 다양한 이종이식체 모델에서 인간 AML 발육을 필수적으로 차단하는 여러 신규한 항-인간 LILRB4 mAb 및 키메라 항체를 식별하였다. 정상 조혈에 대한 개별 LILRB 유전자 또는 lair1의 녹아웃의 어떠한 겉보기 효과가 없음은 주질할만 하다(문헌참조: Tang et al., 2012; Rojo et al., 2000, Zheng et al., 2012). 추가로, LILRB의 억제는 면역력을 자극하였고 간접적으로 항종양 효과를 부스팅하였다. 따라서, LILRB/LAIR1은 AML을 치료하기 위한 이상적인 표적을 나타낸다.
본원 발명자는 LILRB2에 대한 다수의 잠재적 리간드 결합 부위를 식별함으로써(문헌참조: Deng et al., 2014), 이들은 소분자 화학물질 보다는 차라리 차단 항체와 같은 대형 분자가 보다 적절한 LILRB 차단제임을 고려한다. 실제로, 이들이 입증된 바와 같이, 심지어 항-LILRB mAb 또는 키메라 항체의 1회 투여는 이종이식체 모델에서 인간 AML 발육을 매우 효율적으로 차단할 수 있었다. 이들 결과는 항-LILRB mAb 또는 키메라 항체가 AML을 치료하기 위한 전망있는 약물 후보물임을 입증하는 원리의 증거이다.
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본원에 기재되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본원의 개시내용의 관점에서 과도한 실험 없이 수행되고 실행될 수 있다. 본원의 개시내용의 조성물 및 방법은 바람직한 양태의 측면에서 기재되었지만, 본원의 개시내용의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어나는 것 없이 본원에 기재된 방법의 조성물 및 방법에서 및 단계 또는 일련의 단계에 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 둘다 관련된 특정 제제가 본원에 기재된 제제를 대체할 수 있음은 자명하고 동일하거나 유사한 결과가 성취된다. 당업자에게 자명한 모든 상기 유사한 대용물 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같이 본원의 개시내용의 취지, 범위 및 개념내에 있는 것으로 고려된다.
VIII. 참조문헌
하기의 참조문헌은 이들이 예시적 과정 또는 본원에 제시된 것들에 보충적인 다른 세부 사항을 제공하는 정도로 구체적으로 본원에 참조로 인용된다.
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Synthetic peptide <400> 214 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His 1 5 10 <210> 215 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 215 Gly Ile Asn Thr Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 216 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 216 Asp Lys Arg Ser Arg Gly Glu Leu Asp Ser Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 217 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 217 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 218 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 218 Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 219 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 219 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5

Claims (16)

  1. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 개체에서 암의 효과를 치료 또는 개선하기 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 하기를 포함하고:
    (a) 서열번호: 73을 포함하는 CDR1, 서열번호: 74를 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 75를 포함하는 CDR3을 순서대로 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호: 76을 포함하는 CDR1, TAS를 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 77를 포함하는 CDR3을 순서대로 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (b) 서열번호: 83을 포함하는 CDR1, 서열번호: 84를 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 85를 포함하는 CDR3을 순서대로 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호: 86을 포함하는 CDR1, RAS를 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 87를 포함하는 CDR3을 순서대로 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (c) 서열번호: 98을 포함하는 CDR1, 서열번호: 99를 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 100을 포함하는 CDR3을 순서대로 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호: 101을 포함하는 CDR1, EAS를 포함하는 CDR2, 및 서열번호: 102를 포함하는 CDR3을 순서대로 포함하는 경쇄 가변 영역,
    상기 암이 비소세포폐암, 흑색종, 대장암, 췌장암, 위암, 난소암, 전립선암, 유방암, 림프종, 림프성 백혈병, 호지킨 질환, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 골수형성이상 증후군(MDS) 및 만성 골수단핵구 백혈병(CMML)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 하기를 포함하는, 약제학적 조성물:
    (a) 서열번호: 13과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 14와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(여기서, 상기 중쇄 가변 영역에서 CDR1은 서열번호: 73을 포함하고, CDR2는 서열번호: 74를 포함하고, CDR3은 서열번호: 75를 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역에서 CDR1은 서열번호: 76을 포함하고, CDR2는 TAS를 포함하고, CDR3은 서열번호: 77를 포함함);
    (b) 서열번호: 17과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 18과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(여기서, 상기 중쇄 가변 영역에서 CDR1은 서열번호: 83을 포함하고, CDR2는 서열번호: 84를 포함하고, CDR3은 서열번호: 85를 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역에서 CDR1은 서열번호: 86을 포함하고, CDR2는 RAS를 포함하고, CDR3은 서열번호: 87를 포함함); 또는
    (c) 서열번호: 23과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 24와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(여기서, 상기 중쇄 가변 영역에서 CDR1은 서열번호: 98을 포함하고, CDR2는 서열번호: 99를 포함하고, CDR3은 서열번호: 100을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역에서 CDR1은 서열번호: 101을 포함하고, CDR2는 EAS를 포함하고, CDR3은 서열번호: 102를 포함함).
  3. 제1항에 있어서, 항체가 하기를 포함하는, 약제학적 조성물:
    (a) 서열번호: 13의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 14의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(여기서, 상기 중쇄 가변 영역에서 CDR1은 서열번호: 73을 포함하고, CDR2는 서열번호: 74를 포함하고, CDR3은 서열번호: 75를 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역에서 CDR1은 서열번호: 76을 포함하고, CDR2는 TAS를 포함하고, CDR3은 서열번호: 77를 포함함);
    (b) 서열번호: 17의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 18의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(여기서, 상기 중쇄 가변 영역에서 CDR1은 서열번호: 83을 포함하고, CDR2는 서열번호: 84를 포함하고, CDR3은 서열번호: 85를 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역에서 CDR1은 서열번호: 86을 포함하고, CDR2는 RAS를 포함하고, CDR3은 서열번호: 87를 포함함); 또는
    (c) 서열번호: 23의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 24의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(여기서, 상기 중쇄 가변 영역에서 CDR1은 서열번호: 98을 포함하고, CDR2는 서열번호: 99를 포함하고, CDR3은 서열번호: 100을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역에서 CDR1은 서열번호: 101을 포함하고, CDR2는 EAS를 포함하고, CDR3은 서열번호: 102를 포함함).
  4. 제1항에 있어서, 항체가 LILRB4의 활성을 조절하는, 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 항체가 LILRB4를 활성화시키는, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 항체가 LILRB4의 신호를 차단하는, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 항체가 LILRB4의 활성화를 억제하는, 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 항체가 LILRB4에 대한 ApoE의 결합을 특이적으로 차단하는, 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 항원 결합 단편이 F(ab')2 단편, Fab 단편, Fv 단편, 또는 단일쇄 Fv 단편인, 약제학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 항체가 키메라 항체, 인간화된 항체, 또는 인간 항체인, 약제학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 암이 비소세포폐암, 흑색종, 대장암, 췌장암, 위암, 난소암, 전립선암 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 암이 림프종, 림프성 백혈병, 호지킨 질환, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 골수형성이상 증후군(MDS) 및 만성 골수단핵구 백혈병(CMML)으로 이루어진 군에서 선택되는, 약제학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 개체가 인간인, 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 피 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 복강 내, 동맥 내, 또는 종양 내로 투여되는, 약제학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 안트라사이클린 토포이소머라제 억제제, 다우노루비신, 뉴클레오시드 대사 억제제, 시타라빈, 다우노루비신과 시타라빈의 조합, 주사를 위한 다우노루비신과 시타라빈 리포솜, 바이제오스(Vyxeos), 올-트랜스-레티노산 (ATRA), 비소, 삼산화 비소, 히스타민 디히드로클로라이드, 세플렌(Ceplene), 인터루킨-2, 프로류킨(Proleukin), 겜투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin), 마일로타르그(Mylotarg), 클로파라빈, 파네실 트랜스퍼라제 억제제, 데시타빈, IDH1 억제제, IDH2 억제제, 에나시데닙, 아이드하이파, IDO 억제제, 에파카도스타트, 백금 착물(platinum complex) 유도체, 옥살리플라틴, 키나제 억제제, 티로신 키나제 억제제, PI3 키나제 억제제, BTK 억제제, 이브루티닙, PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, LAG3 항체, ICOS 항체, TIGIT 항체, TIM3 항체, 종양 항원에 결합하는 항체, T-세포 표면 마커에 결합하는 항체, 골수 세포 또는 NK 세포의 표면 마커에 결합하는 항체, 알킬화제, 니트로소우레아제(nitrosourea agent), 항대사제, 항종양 항생제, 식물 유래 알칼로이드, 토포이소머라제 억제제, 호르몬 요법 의약품, 호르몬 길항제, 아로마타제 억제제, 및 P-당단백질 억제제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약물이 개체에 추가로 투여되는, 약제학적 조성물.
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