KR20150123811A - 항-mcsp 항체 - Google Patents

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토마스 호퍼
랄프 호세
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로슈 글리카트 아게
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Abstract

본 발명은 항-MCSP 항체 및 이의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-MCSP 항체{ANTI-MCSP ANTIBODIES}
본 발명은 항-MCSP 항체, 및 질병의 치료 및 진단에서 이의 사용 방법에 관한 것이다.
MCSP
흑색종 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP: melanoma chondroitin sulfate proteoglycan)은 대부분의 흑색종 암에서 발현되는 거대한 막간 프로테오글리칸이다. 또한, MCSP는 교모 세포종, 골육종, 연골육종, ALL 및 AML의 일부 유형을 비롯한 다른 암 상에서, 및 기저 세포 암종에서 발현된다. 이는 초기 세포 표면 흑색종 진행 마커로서 작용하고, 종양 세포 증식, 전이, 이동, 침입 및 혈관신생을 자극하는 데 관여된다(문헌[Staube, E. et al., FEBS Letters, 527: 114-118 (2002)]; [Campoli, M. et al., Crit. Rev. Immun. 24:267-296 (2004)]; [Vergilis, I. J., J Invest Dermatol, 125: 526-531 (2005)]; [Yang, J., JCB, 165: 881-891 (2004)]; 및 [Luo, W., J. Immuno., 176: 6046-6054 (2006)]).
항체 글리코실화
올리고당 성분은 물리적 안정성, 프로테아제 공격에 대한 내성, 면역계와의 상호작용, 약물동력학 및 특이적 생물학적 활성을 비롯한 치료학적 당단백질의 효능에 관한 특성에 크게 영향을 줄 수 있다. 이러한 특성은 올리고당의 존재 또는 부재뿐만 아니라 이의 특이적 구조에 좌우된다. 올리고당 구조 및 당단백질 기능 사이에 일부 일반화가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 특정 올리고당 구조는 특정 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통해 혈류로부터 당단백질의 신속한 소거를 중재하는 반면에, 다른 구조는 항체에 의해 결합될 수 있고 목적하지 않은 면역 반응을 개시할 수 있다(문헌[Jenkins et al., Nat Biotechnol 14, 975-81 (1996)]).
암 면역요법에서 가장 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는, 각각의 CH2 도메인에서 Asn297에 보존된 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 복합 바이안테나(biantennary) 올리고당이 CH2 도메인 사이에 매립되어, 폴리펩티드 주쇄와의 광범위한 접촉부를 형성하고, 이들의 존재는 항체가 효과자 기능, 예컨대, 항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)을 중재하는 데 있어서 필수적이다(문헌[Lifely et al., Glycobiology 5, 813-822 (1995)]; [Jefferis et al., Immunol Rev 163, 59-76 (1998)]; 및 [Wright and Morrison, Trends Biotechnol 15, 26-32 (1997)]).
단일클론성 항체의 세포-중재된 효과자 기능은 문헌[Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)] 및 미국특허 제6,602,684호(WO 99/54342)에 기재된 바와 같이 이들의 올리고당 성분을 조작함으로써 증진될 수 있다. 우마나(Umana) 등은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 이등분된 올리고당의 형성을 촉매화하는 글리코실전달효소인 .베타.(1,4)-N-아세틸글루코사민일전달효소 III(GnTIII)의 과발현이 이들 세포에서 생산된 항체의 생체내 ADCC 활성을 크게 증가시킴을 보여준다. 또한, Asn297 탄수화물의 조성의 변경 또는 이의 제거는 Fc.감마.R 및 Clq 단백질에 대한 항체 Fc-도메인의 결합에 영향을 준다(문헌[Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)]; [Davies et al., Biotechnol Bioeng 74, 288-294 (2001)]; [Mimura et al., J Biol Chem 276, 45539-45547 (2001)]; [Radaev et al., J Biol Chem 276, 16478-16483 (2001)]; [Shields et al., J Biol Chem 276, 6591-6604 (2001)]; [Shields et al., J Biol Chem 277, 26733-26740 (2002)]; 및 [Simmons et al., J Immunol Methods 263, 133-147 (2002)]).
본 발명은 항-MCSP 항체 및 이의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 한 양상은 반복부-함유 도메인을 포함하는 인간 MCSP의 막 근위 에피토프에 결합하는 단리된 항체를 제공하되, 상기 항체는 5x10-9 M 이하의 Kd로 MCSP에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체는 2x10-9 M 이하의 Kd로 MCSP에 결합한다.
본 발명의 또다른 양상은 CSPG 반복부-함유 도메인을 포함하는 인간 MCSP의 막 근위 에피토프에 결합하는 단리된 항체를 제공하되, 상기 항체는 항-MCSP 항체 M4-3/ML2에 비하여 2배 이상의 증가된 친화도를 갖는 MCSP에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체는 항-MCSP 항체 M4-3/ML2에 비하여 4배 이상의 증가된 친화도를 갖는 MCSP에 결합한다.
한 실시양태에서, CSPG 반복부-함유 도메인은 CSPG 반복부 14(서열 번호 3)를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 scFv 단편, Fv 단편 또는 F(ab')2 단편이다. 한 실시양태에서, 항체는 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라성 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 전장 IgG 부류 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 글리코 조작되어 Fc 영역에서 올리고당을 개질한다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 글리코 조작되지 않은 항체에 비하여 감소된 수의 푸코스 잔기를 갖는다. 한 실시양태에서, 항체는 글리코 조작되지 않은 항체에 비하여 Fc 영역에서 증가된 GlcNAc 잔기 대 푸코스 잔기의 비를 갖는다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 글리코 조작되지 않은 항체에 비하여 증가된 비율의 이등분된 올리고당을 갖는다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 글리코 조작되지 않은 항체에 배해 증가된 비율의 이등분된 올리고당을 갖는다. 한 실시양태에서, 항체는 글리코 조작되지 않은 항체에 비하여 증가된 효과자 기능을 갖는다. 한 실시양태에서, 효과자 기능은 증가된 항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC) 활성이다. 한 실시양태에서, 효과자 기능은 Fc 수용체에 대한 증가된 결합 친화도이다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 48 및 서열 번호 58로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 49, 서열 번호 56, 서열 번호 59 및 서열 번호 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 52, 서열 번호 64 및 서열 번호 68로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 53 및 서열 번호 69로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; (f) 서열 번호 54, 서열 번호 65 및 서열 번호 70으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 47의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 번호 51의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 47의 VH 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 51의 VL 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 47의 VH 서열 및 서열 번호 51의 VL 서열을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 상기에 기재된 항-MCSP 항체를 암호화하는 단리된 헥산을 제공한다. 본 발명의 또다른 양상은 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 또다른 양상은 이러한 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은 상기에 기재된 항-MCSP 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체(immunoconjugate)를 제공한다. 본 발명의 또다른 양상은 상기에 기재된 항-MCSP 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은 약제로서 사용하기 위한 상기에 기재된 항-MCSP 항체 또는 이의 면역접합체를 제공한다. 본 발명의 또다른 양상은 암, 특히 피부암(흑색종 및 기저 세포 암종 포함), 신경교종(교모 세포종 포함), 골암(예컨대 골육종) 및 백혈병(ALL 및 AML 포함)을 비롯한 MCSP를 발현하는 암을 치료하기 위한 상기에 기재된 항-MCSP 항체 또는 이의 면역접합체를 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은 세포 용해를 유도하기 위한 상기에 기재된 항-MCSP 항체의 용도를 제공한다. 본 발명의 또다른 양상은 약제, 예컨대 암의 치료를 위한 약제 또는 세포 용해를 유도하기 위한 약제의 제조에서 상기에 기재된 항-MCSP 항체 또는 이의 면역접합체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은 상기에 기재된 항-MCSP 항체 또는 이의 면역접합체의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 잃는 개체의 치료 방법을 제공한다. 암은 예를 들어 MCSP를 발현하는 암, 에컨대 피부암(흑색종 및 기저 세포 암종 포함), 신경교종(교모 세포종 포함), 골암(예컨대 골육종) 및 백혈병(ALL 및 AML 포함)이다.
본 발명의 또다른 양상은 상기에 기재된 항-MCSP 항체 및 이의 면역접합체를 개체에게 투여하여 세포 용해를 유도하는 단계를 포함하는 개체에서 세포 용해의 유도 방법을 제공한다.
도 1은 Colo38 세포에서 표면 MCSP에 대한 키메라성 항체 LC007의 결합 친화도를 보여주는 FAC 검정의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 2는 A2058 및 A375 암 세포에서 표면 MCSP에 대한 키메라성 항체 LC007의 결합 친화도를 보여주는 FAC 검정의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 3은 MCSP의 구조를 함유하는 CSPG 반복부의 개략도이다.
도 4는 MCSP CSPG 반복 구축물에 대한 LC007의 결합 특이성를 보여주는 그래프이다.
도 5는 항체 LC007이 상응하는 인간 발현 구축물에 대해서와 유사한 친화도로 사이노몰구스(cyomolgus) 구축물에 결합함을 보여주는 FAC 검정의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 6은 글리코 조작되지 않은 LC007 항체 및 글리코 조작된 LC007 항체 둘 다의 ADCC 효과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 글리코 조작된 LC007 항체의 ADCC 효과가 인간 U86MG 교모 세포종 세포주에서 관찰됨을 보여주는 그래프이다.
도 8은 LC007 항체의 몇몇 인간화된 변형체의 결합 특성을 보여주는 그래프이다.
도 9는 LC007의 인간화된 변형체가 모 글리코 조작된 LC007 항체의 ADCC 활성을 보유함을 보여주는 그래프이다.
도 10은 LC007의 인간화된 변형체가 모 글리코 조작된 LC007 항체의 ADCC 활성을 보유함을 보여주는 그래프이다.
도 11은 인간화된 글리코 조작된 항-MCSP 항체가 비히클 대조군에 비하여 MV3 종양 세포주를 갖는 FcgR3A 형질감염 SCID 마우스에서 생존 기간을 크게 증가시킴을 보여주는 생존 곡선을 도시한다.
도 12는 키메라성 글리코 조작된 항-MCSP 항체가 비히클 대조군에 비하여 MDA-MB-435 종양 세포주를 갖는 FcgR3A 형질감염 SCID 마우스에서 생존 기간을 크게 증가시킴을 보여주는 생존 곡선을 도시한다.
도 13은 키메라성 글리코 조작된 항-MCSP 항체 및 이의 인간화된 변형체 M4-3 ML2가 비히클 대조군에 비하여 MDA-MB-435 종양 세포주를 갖는 FcgR3A 형질감염 SCID 마우스에서 생존 기간을 크게 증가시킴을 보여주는 생존 곡선을 도시한다.
도 14는 성숙되지 않은 모 클론(M4-3 ML2)과 비교한 친화도 성숙된 항-MCSP 클론의 정렬을 도시한다.
I. 정의
본원에서의 목적을 위해 "수용체 인간 골격구조"는, 하기에 정의되는 바와 같이, 인간 면역글로불린 골격구조 또는 인간 컨센서스(consensus) 골격구조로부터 유도된, 경쇄 가변성 도메인(VL) 골격구조 또는 중쇄 가변성 도메인(VH) 골격구조의 아미노산 서열을 포함하는 골격구조이다. 인간 면역글로불린 골격구조 또는 인간 컨센서스 골격구조"로부터 유도된" 수용체 인간 골격구조는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하 또는 2 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용체 인간 골격구조는 서열에 있어서 VL 인간 면역글로불린 골격구조 서열 또는 인간 컨센서스 골격구조 서열과 동일하다.
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 그의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 별도로 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 비롯하여, 당분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적 실례 및 예시적인 실시양태가 하기에 기재되어 있다.
"친화도 성숙된" 항체는 변경되지 않는 모 항체에 비하여 하나 이상의 과가변성 영역(HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하고, 이러한 변경으로 인하여 항원에 대한 항체의 친화도가 개선된다.
"혈관신생성 질환"은 비종양성 및 종양성 증상을 비롯한 혈관신생의 임의의 조절 장애를 지칭한다. 종양성 증상은 비제한적으로 이후 기재된 증상을 포함된다. 비종양성 증상은 비제한적으로 바람직하지 않거나 비정상적인 비대증, 관절염, 류마티스 관절염(RA), 건선, 판상 건선, 유육종증, 아테롬성 동맥경화증, 동맥경화반, 당뇨병 및 다른 증식성 당뇨망막병증, 예컨대, 조산아의 당뇨망막병증, 후수정체 섬유증식, 출혈성 녹내장, 노인성 황반 변성, 당뇨성 황반 부종, 각막 신혈관 형성, 각막 이식 신혈관 형성, 각막 이식 거부, 망막/맥락막 신혈관 형성, 앞방각(angle)의 신혈관 형성(피부조홍), 눈의 신혈관 형성 질환, 혈관 재협착증, 동정맥 기형(AVM), 뇌수막종, 혈관종, 맥관섬유종, 갑상선 비후(그레이브(Grave)병 포함), 각막 및 다른 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐고혈압, 악성 폐 유출, 뇌 부종(예를 들어, 급성 뇌졸중/폐쇄된 두부 손상/트라우마와 연관됨), 활액 염증, RA에서의 파누스(pannus) 형성, 골화근육염, 비대성 골 형성, 퇴행성관절염(OA), 난치성 복수병, 다낭성 난소증, 자궁내막증, 체액의 제3공간 질환(3rd spacing of fluid disease)(췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 섬유증, 조산, 만성 염증, 예컨대, IBD(크론(Crohn)병 및 궤양성 대장염), 신장 이형이식 거부, 염증성 장 질환, 신증후군, 바람직하지 않거나 비정상적인 조직체 성장(비-암), 혈우병성 관절, 비대흉터, 모발 성장의 저해, 오시에르-웨버(Osier-Weber) 증후군, 화농성 육아종, 섬유 증식증, 강피증, 트라코마(trachoma), 혈관 유착, 활막염, 피부염, 임신중독증, 복수병, 심낭 삼출증(예컨대, 심낭염과 연관된 질환), 및 흉막 삼출증을 포함한다.
용어 "항-MCSP 항체" 및 "MCSP에 결합하는 항체"는 항체가 MCSP를 표적화하는 데 있어서 진단학적 및/또는 치료학적 제제로서 유용하기에 충분한 친화도로 MCSP에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-MCSP 단백질에 대한 항-MCSP 항체의 결합 정도는 예를 들어 방사성면역검정(RIA)에 의해 측정시 MCSP에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 5 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.5 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.05 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)로 MCSP에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 상이한 종으로부터의 MCSP에서 보존된 MCSP의 에피토프에 결합한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 비제한적으로 이들이 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 비롯한 다양한 항체 구조물을 포괄한다.
"항체 단편"은 손상되지 않은 항체가 결합하는 항원에 결합하는 손상되지 않은 항체의 일부를 포함하는 손상되지 않은 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 ; 다이아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
기준 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 기준 항체의 항원에 대한 기준 항체의 결합을 경쟁 검정에서 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 역으로 기준 항체는 항체의 그의 항원에 대한 결합을 경쟁 검정에서 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 검정법은 본원에 제공된다.
용어 "암" 및 "암을 앓는"은 조절되지 않은 세포 성장/증식에 의해 전형적으로 특성화되는 포유동물에서의 생리학적 증상을 지칭하거나 설명한다. 암의 예는 비제한적으로 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨(Hodgkin)성 및 비호지킨성 림프종), 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함한다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평상피 세포 암, 소세포 폐암, 비-소 세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피 암종, 복막암, 간세포 암, 골암(예를 들어, 골육종, 연골육종, 에윙(Ewing)의 육종), 위장암, 췌장암, 신경교종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 피부암(예를 들어, 흑색종 및 기저 세포 암종), 음문암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 기타 림프증식성 질환, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
용어 "세포 증식성 질환" 및 "증식성 질환"은 비정상적 세포 증식 정도와 연관된 질환을 지칭된다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 질환은 암이다.
용어 "키메라성" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원 또는 종으로부터 유도되고 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 근원 또는 종으로부터 유도되는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄에 의해 소유되는 불변성 도메인 또는 불변성 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들중 몇몇은 추가로 하위부류(이소유형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 나눠진다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변성 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 일으키는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 비제한적으로 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드(빈스크린, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입 제제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대, 핵용해(nucleolytic) 효소; 항생제; 독소, 예컨대, 소분자 독소, 또는 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소(이의 단편 및/또한 변형물 포함); 및 이후 기재되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함한다.
"효과자 기능"은 항체 이소유형에 따라 상이한, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 지칭한다. 항체 효과자 기능의 예는 Clq 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
제제, 예를 들어, 약학 제형의 "유효량"은 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하기 위해 필요한 시간의 기간 동안 및 투여량에서의 효과적인 양을 지칭한다.
용어 "Fc 영역"은 본원에서 불변성 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 규정하기 위해 사용된다. 이 용어는 고유의 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복시-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시하지 않는 한, Fc 영역 또는 불변성 영역에서 아미노산 잔기의 번호매김은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이, EU 색인으로도 지칭되는 EU 번호매김 체제에 따른다.
"골격구조" 또는 "FR"은 과가변성 영역(HVR) 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기를 지칭한다. 가변성 도메인의 FR은 일반적으로 다음의 4가지 FR 도메인으로 구성된다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "손상되지 않은 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 고유의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체 또는 본원에 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하는 데 상호교환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양액"은 상호교환적으로 사용되고, 이러한 세포의 자손체를 비롯하여 외래성 핵산이 도입되된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하고, 이는 계대 배양의 수와 무관하게 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유도된 자손체를 포함한다. 자손체는 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 고유적으로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택될 때 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손체가 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 인간 항체 레파토리(repertoiry) 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비-인간 근원으로부터 유도된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 항체이다. 이러한 인간 항체의 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 구체적으로 배제한다.
"인간 컨센서스 골격구조"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격구조 서열의 선택시 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격구조이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변성 도메인 서열의 하위군으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우, 하위군은 상기 카밧(Kabat) 등의 문헌에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우, 하위군은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라성 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화된 항체는 하나 이상의 가변성 도메인 및 전형적으로 2개의 가변성 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 HVR에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 FR에 상응한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변성 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화된 형태", 예를 들어, 비-인간 항체는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "과가변성 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 과가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프(loop)("과가변성 루프")를 형성하는 항체 가변성 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 고유의 4-쇄 항체는 6개의 HVR을 포함한다; VH에 3개(H1, H2, H3), VL에 3개(L1, L2, L3). HVR은 일반적으로 과가변성 루프로부터 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 가장 높은 서열 가변성이고/이거나 항원 인식에 연관된다. 예시적인 과가변성 루프는 아미노산 잔기 26 내지 32(L1), 50 내지 52(L2), 91 내지 96(L3), 26 내지 32(H1), 53 내지 55(H2) 및 96 내지 101(H3)에서 초래된다(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). 예시적인 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24 내지 34, L2의 50 내지 56, L3의 89 내지 97, H1의 31 내지 35B, H2의 50 내지 65, 및 H3의 95 내지 102에서 초래된다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). VH에서의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 과가변성 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, CDR은 항원에 접촉하는 잔기인 "특이적 결정 잔기(specificity determining residue)" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 CDR의 영역내에 함유되고, 약자화된-CDR 또는 a-CDR로 불린다. 예시적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31 내지 34, L2의 50 내지 55, L3의 89 내지 96, H1의 31 내지 35B, H2의 50 내지 58, 및 H3의 95 내지 102에서 초래된다(문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조). 달리 지시되지 않는 한, 가변성 도메인중 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 상기 카밧 등의 문헌에 따라 번호매김된다.
"면역접합체"는 하나 이상의 비제한적으로 세포독성제를 비롯한 이종성 분자에 접합되는 항체이다.
"개체" 또는 "피험체"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축 동물(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 피험체는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF: isoelectric focusing), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정시 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법을 검토하기 위해, 예를 들어, 문헌[Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 정상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 그의 천연 염색체 자리로부터 상이한 염색체 자리에 또는 염색체 밖에 존재한다.
"항-MCSP 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하고, 예컨대, 단일 벡터 또는 별도의 벡터중의 핵산 분자, 및 숙주 세포의 하나 이상의 자리에 존재하는 핵산 분자가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "단일클론성 항체"는 실질적으로 동종성인 항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 모집단을 포함하는 개별 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하지만, 예를 들어, 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 단일클론성 항체 제제의 생산 동안 야기된 가능한 변형 항체는 제외하고, 이러한 변형체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정자(에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체를 포함하는 다중클론성 항체 제제와 대조적으로, 단일클론성 항체 제제의 각각의 단일클론성 항체는 항원 상의 단일한 결정자에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단일클론성"은, 항체의 실질적으로 동종성인 모집단으로부터 수득된 항체의 특성을 지시하고, 이는 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론성 항체는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있고, 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지 디스플레이(phage display) 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함하는 형질감염 동물을 이용하는 방법이 포함되고, 이러한 방법 및 단일클론성 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법은 본원에 기재되어 있다.
"네이키드(naked) 항체"는 이종성 부분체(moiety)(예를 들어, 세포독성 부분체) 또는 방사능표지에 접합되지 않는 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 약학 제형에 존재할 수 있다.
"고유의 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린을 지칭한다. 예를 들어, 고유의 IgG 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종성사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 3개의 불변성 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)이 뒤따르는 가변성 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변성 도메인으로도 지칭되는 가변성 영역(VH)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 불변성 경쇄(CL) 도메인이 뒤따르는 가변성 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변성 도메인으로도 지칭되 가변성 영역(VL)을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변성 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2가지 유형중 하나로 할당된다.
용어 "패키지 삽입물"은, 지시사항, 용법, 투여량, 투여법, 복합 치료법, 사용금지사유에 관한 정보, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고문 등을 포함하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 관례상 포함되는 설명서를 지칭한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은, 필요에 따라, 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열중의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 당분야의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 대하여 최대 정렬을 달성하기 위해 요구되는 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 백분율(%) 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 제조되고, 원시 코드(source code)는 사용자 기록문서와 함께 미국 워싱턴 디.씨. 20559 소재의 미국 저작권 사무소(Copyright Office)에 보관되어 있고, 여기서 이는 미국 저작권 등록 번호 제TXU510087호하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수가능하거나, 또는 원시 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯하여, UNIX 작동 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 달라지지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 이용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, B와의, 또는 B와 비교되는 소정의 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 백분율(%)(이는 다르게는 소정의 아미노산 서열 B에 대한, B와의 또는 B와 비교되는 특정한 아미노산 서열 동일성 백분율(%)을 갖거나 포함한 소정의 아미노산 서열 A로서도 표현됨)은 하기와 같이 계산된다:
X/Y 분율×100
이때, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2와의 동일한 부합성으로서 획득된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 백분율(%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 백분율(%)과 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 백분율(%) 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 문단에서 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은 이에 포함된 활성 구성성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여되는 피험체에 허용되지 않도록 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 피험체에 무독성인 활성 구성성분 이외의 약학 제형중의 활성 구성성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능함 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "MCSP"는, 달리 지시되지 않는 한, 포유동물, 예컨대, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 비롯한 임의의 척추동물 근원으로부터의 임의의 고유의 MCSP(흑색종 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸)를 지칭한다. 이 용어는 "전장"의 가공되지 않은 MCSP 뿐만 아니라 세포에서 가공으로부터 생성된 임의의 MCSP 형태를 내포한다. 또한, 이 용어는 MCSP의 천연 발생 변형체, 예를 들어, 스플라이스(splice) 변형체 또는 대립형질(allelic) 변형체를 내포한다. 또한, MCSP는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 NG2, 고분자량-흑색종 회합된 항원(HMW-MAA), 및 흑색종 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸으로도 공지되어 있다. 예시적인 인간 MCSP의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 제시되어 있다. 또한, 문헌[Pluschke G., et al., Molecular cloning of a human melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:9710-9715(1996)], [Staub E., et al., A novel repeat in the melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan defines a new protein family, FEBS Lett. 527:114-118(2002)]; [Genbank AccessionNo: NP_001888]을 참조하십시오.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료"(및 이의 문법적인 변형어, 예컨대, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료받을 개체의 자연적 과정을 변경시키는 시도에 있어서의 임상적 개입을 지칭하고, 임상적 병리 과정 동안 또는 예방을 위해 수행될 수 있다. 요망되는 치료 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증후의 경감, 질병의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 방지, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 억제, 및 경감 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질병의 전개를 지연시키거나 질병의 진행을 둔화시키기 위해 사용된다.
용어 "가변성 영역" 또는 "가변성 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유의 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변성 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격구조 영역(FR) 및 3개의 과가변성 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 이것이 연결되는 또다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자가-복제 핵산 구조물, 뿐만 아니라 이것이 도입되는 숙주 세포의 게놈내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 "발현 벡터"로서 본원에 지칭된다.
II . 조성물 및 방법
본 발명은 세포 증식 질환, 예컨대 암을 치료 및/또는 진단하는 데 유용한 항-MCSP 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, MCSP의 막 근위 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, MCSP에 결합하는, 증진된 효과자 기능을 갖는 항체가 제공된다.
A. 예시적 항- MCSP 항체
한 양상에서, 본 발명은 MCSP에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특히, 본 발명에 제공된 항-MCSP 항체는 인간 MCSP의 막 근위 에피토프에 결합한다. 문헌[Staub E., et al., FEBS Lett. 527:114-118(2002)]에서 논의된 바와 같이, MCSP의 막 근위 영역은 CSPG 반복부 도메인으로 지칭되는 신규한 다중 반복 도메인으로 구성된다(도 3). 본 발명의 항-MCSP 항체는 CSPG 반복부-함유 도메인을 포함하는 인간 MCSP의 막 근위 도메인에 존재하는 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, CSPG 반복부-함유 도메인은 인간 MCSP의 아미노산 1937 내지 2043에 상응하는 CSPG 반복부 14를 포함한다. 한 실시양태에서, CSPG 반복부 14 도메인은 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 또다른 실시양태에서, CSPG 반복부-함유 도메인은 CSPG 반복부 14 및 CSPG 반복부 15의 적어도 일부를 포함한다. CSPG 반복부 15 도메인은 인간 MCSP의 아미노산 2044 내지 2246에 상응한다. 한 실시양태에서, CSPG 반복부-15 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, CSPG 반복부-함유 도메인은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CSPG 반복부-함유 도메인 고유의 막간 도메인이 없는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CSPG 반복부-함유 도메인은 CSPG 반복부 13 내지 15를 포함한다. 한 실시양태에서, CSPG 반복부-함유 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CSPG 반복부-함유 도메인은 고유의 막간 도메인이 없는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CSPG 반복부-함유 도메인은 CSPG 반복부 12 내지 15를 포함한다. 한 실시양태에서, CSPG 반복부-함유 도메인은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CSPG 반복부-함유 도메인은 고유의 막간 도메인이 없는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 고유의 막간 도메인은 VIIPMC LVLLLLALIL PLLFY(유니프로트 엔트리(UniProt entry) Q6UVK1)(서열 번호 44)이다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 MCSP를 발현하는 세포의 용해를 유도한다. 용해는 임의의 기작에 의해, 예컨대, 효과자 기능, 예컨대, Clq 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 중재함으로써, 또는 세포의 아포토시스를 직접 유도함으로써 유도될 수 있다.
한 실시양태에서, 글리코 조작되지 않은 모 항-MCSP 항체에 비하여 항-MCSP 항체는 글리코 조작되어 효과자 기능의 하나 이상의 증가를 갖는다. 효과자 기능의 증가는 Fc 수용체에 대한 증가된 결합 친화도, 증가된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC); NK 세포에 대한 증가된 결합; 대식 세포에 대한 증가된 결합; 다형핵 세포에 대한 증가된 결합; 단핵 세포에 대한 증가된 결합; 아포토시스를 유도하는 직접적인 신호화; 증가된 수지상(dendritic) 세포 돌연변이; 또는 증가된 T 세포 프라이밍(priming)이다. 글리코 조작된 항-MCSP 항체는 MCSP를 발현하는 암을 앓는 피험체에서 MCSP의 동일한 에피토프로 유도되는 글리코 조작되지 않은 항체에 비하여 생존 이점을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR를 포함하는 항-MCSP 항체를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 항-MCSP 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 항-MCSP 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명의 항-MCSP 항체는 (a) (i) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 번호 16으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 12로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-MCSP 항체를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-MCSP 항체를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 항-MCSP 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 항-MCSP 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명의 항-MCSP 항체는 (a) (i) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 번호 16으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 12로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-MCSP 항체를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 12로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-MCSP 항체를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 12로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-MCSP 항체를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 12로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-MCSP 항체를 포함한다.
한 양상에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 27에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 27의 VH 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또다른 양상에서, 서열 번호 26의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변성 도메인(VL)을 포함하는 항-MCSP 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 26에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 26의 VL 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR를 포함한다.
또다른 양상에서, 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-MCSP 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 26의 VL 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
또다른 양상에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 32의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 32에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 32의 VH 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또다른 양상에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 31에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 31의 VL 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또다른 양상에서, 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-MCSP 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
또다른 양상에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 29에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 29의 VH 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또다른 양상에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 28에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 28의 VL 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또다른 양상에서, 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-MCSP 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
또다른 양상에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 중쇄 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 35에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 35의 중쇄 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
또다른 양상에서, 서열 번호 34의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 항-MCSP 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 경쇄 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 34에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 34의 경쇄 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
또다른 양상에서, 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 중쇄 및 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 경쇄를 포함하는 항-MCSP 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
또다른 양상에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 중쇄 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 37에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 37의 중쇄 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
또다른 양상에서, 항체는 서열 번호 36의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 항-MCSP 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 경쇄 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 36에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 36의 경쇄 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
또다른 양상에서, 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 중쇄 및 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 경쇄를 포함하는 항-MCSP 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-MCSP 항체와 동일한 에피토프 또는 에피토프에 결합하는 항체가 제공한다.
한 실시양태에서, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 항-MCSP 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 또다른 실시양태에서, 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 갖는 항-MCSP 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 또다른 양상은 MCSP 표적에 대해 증가된 친화도를 갖는 항-MCSP 항체, 예를 들어 실시예 10에 기재된 친화도 성숙된 항-MCSP 항체를 제공한다. 이러한 ≤ 5 x 10-9 M, ≤ 2 x 10-9 M, ≤ 1 x 10-9 M, ≤ 5 x 10-10 M, ≤ 2 x 10-9 M, ≤ 1 x 10-10 M, ≤ 5 x 10-11 M, ≤ 1 x 10-11 M, ≤ 5 x 10-12 M, ≤ 1 x 10-12 M 또는 그 이하의 Kd로 MCSP에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 항-MCSP 항체 M4-3/ML2 (서열 번호 37 및 36/ 서열 번호 32 및 31)에 비하여 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배 또는 그 이상의 증가된 친화도를 갖는 항-MCSP 항체를 제공한다.
이러한 양상의 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 48 및 서열 번호 58로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 49, 서열 번호 56, 서열 번호 59 및 서열 번호 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 52, 서열 번호 64 및 서열 번호 68로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 53 및 서열 번호 69로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 54, 서열 번호 65 및 서열 번호 70으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-MCSP 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) (i) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 번호 50으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 54로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 47에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 47의 VH 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 51의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변성 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 51에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 51의 VL 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 45의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 중쇄 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 45에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 45의 중쇄 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 경쇄 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 46에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 46의 경쇄 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 중쇄 및 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 55의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 55에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 55의 VH 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 57의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 57에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 57의 VH 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 60의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 60에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 60의 VH 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VH HVR 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 62의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 62에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 62의 VH 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 63의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 63에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 63의 VL 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 67의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 67에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 67의 VL 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 66의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 66에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 66의 VL 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 (a) 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 모두의 VL HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 71의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하나, 이러한 서열을 포함하는 항-MCSP 항체는 MCSP에 대한 결합 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 71에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역(즉, FR)에서 발생한다. 임의적으로, 항-MCSP 항체는 서열 번호 71의 VL 서열을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기에 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 57 의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 이는 이러한 서열의 번역후 개질을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-MCSP 항체와 동일한 에피토프에 결합하기 위해 경쟁하는 항제가 제공된다.
한 실시양태에서, 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 항-MCSP 항체와 동일한 에피토프에 결합하기 위해 경쟁하는 항체는 효과자 기능 활성, 예컨대 ADCC 활성을 비롯한 Fc-중재된 세포 세포독성을 나타낸다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 인간 MCSP의 막 근위 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 CSPG 반복부-함유 도메인을 포함하는 인간 MCSP의 막 근위 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 5의 아미노산 서열로부터, 서열내에서 또는 서열을 중첩시키는 인간 MCSP의 막 근위 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 4의 아미노산 서열로부터, 서열내에 또는 서열을 중첩시키는 인간 MCSP의 막 근위 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 서열 번호 3의 아미노산 서열로부터, 서열내에 또는 서열을 중첩시키는 인간 MCSP의 막 근위 에피토프에 결합한다.
본 발명의 추가의 양상에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-MCSP 항체는 키메라성 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체를 비롯한 단일클론성 항체이다. 한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어, 손상되지 않은 IgG1 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소유형이다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 마우스 단일클론성 항체 LC007이다. 이러한 항체의 중쇄 및 경쇄를 위한 핵산 서열은 각각 서열 번호 37 및 36에 제시된다. 한 실시양태에서, 항-MSCP 항체는 마우스 단일클론성 항체 LC007로부터 유도된 키메라성 항체이다. 한 실시양태에서, 항-MSCP 항체는 마우스 단일클론성 항체 LC007로부터 유도된 인간화된 항체이다. 한 실시양태에서, 항-MSCP 항체는 마우스 단일클론성 항체 LC007로부터 유도된 인간 항체이다.
추가의 양상에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-MCSP 항체는 하기 섹션 1 내지 7에 기재된 바와 같이, 임의의 특징부를 단독으로 또는 조합하여 혼입할 수 있다:
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 5 nM, ≤ 2 nM , ≤ 1 nM, ≤ 0.5 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.05 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에 의해 기재되는 바와 같이 흥미로운 항체의 Fab 형태 및 그의 항원에 의해 수행되는 방사능표지된 항원 결합 검정(RIA: radiolabeled antigen binding assay)에 의해 결정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 표지되지 않은 항원의 일련의 적정의 존재하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화한 후에, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 결합된 항원을 포획함으로써 측정된다(예를 들어, 문헌[Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정을 위한 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER, 등록상표) 멀티-웰 플레이트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))가 50 mM 탄산 나트륨(pH 9.6)중 5 ㎍/㎖의 포획 항-Fab 항체(카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅된 후에, PBS 중 2%(중량/부피) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온(대략 23℃)에서 차단된다. 비-흡착성 플레이트(Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 흥미로운 Fab의 계대 희석물과 혼합된다(예를 들어, 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함; 문헌[Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]). 이어서, 흥미로운 Fab는 밤새 항온처리되나; 평형 도달을 확보하기 위해 더 오랜 기간 동안(예를 들어, 약 65시간) 항온처리가 지속될 수 있다. 이후, 혼합물은 항온처리 동안(예를 들어, 1시간 동안) 실온에서 포획 플레이트로 전달된다. 이어서, 용액은 제거되고 플레이트는 PBS중 0.1% 폴리소르베이트 20(트윈(TWEEN)-20(등록상표))으로 8회 세척된다. 플레이트가 건조되면, 150 ㎕/웰의 신틸런트(scintillant)(마이크로신트(MICROSCINT)-20(등록상표); 패커드(Packard))가 첨가되고, 플레이트는 10분 동안 탑카운트(TOPCOUNT, 상표) 감마 계수기(패커드) 상에서 계수된다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 Fab 각각의 농도가 경쟁 결합 검정에 사용하기 위해 선택된다.
또다른 실시양태에 따라, Kd는 약 10 반응 단위(RU: response unit)에서 고정화된 항원 CM5 칩을 갖는 비아코어(BIACORE, 등록상표)-2000 또는 비아코어(등록상표)-3000(비아코어 인코포레이티드(BIAcore, Inc.), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용하는 표면 플라스몬 공명 검정을 25℃에서 사용하여 결정된다. 간략히, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)은 공급업체의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화된다. 항원은 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.8)으로 5 ㎍/㎖(약 0.2 μΜ)로 희석된 후, 대략 10 반응 단위(RU)의 커플링된 단백질을 달성하기 위해 5 ㎕/분의 유속으로 주입된다. 항원을 주입한 후, 1 M 에탄올아민이 주입되어 미반응된 기를 차단한다. 동역학 측정을 위하여, Fab의 2배의 계대 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)이 PBS중에서 0.05 % 폴리소르베이트 20(트윈-20(상표)) 계면활성제(PBST)와 함께 25℃에서 대략 25 ㎕/분의 유속으로 주입된다. 회합 속도(k회합) 및 해리 속도(k해리)는, 회합 및 해리 센서그램을 동시에 정합시킴으로써 단순 일-대-일 랑뮤 결합 모델(simple one-to-one Langmuir binding model)(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산된다. 평형 해리 상수(Kd)는 k해리/k회합 비로 계산된다(예를 들어, 문헌[Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)] 참조). 회합 속도가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 회합 속도는 분광기, 예컨대, 정지-유동(stop-flow)이 구비된 분광광도기(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments))또는 교반 큐벳(stirred cuvette)이 장착된 8000-시리즈 SLM-AMINCO(등록상표) 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정시 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS(pH 7.2)중에서 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 25℃에서의 형광 발광 강도(여기 = 295 nm; 발광 = 340 nm, 16 nm 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광(fluorescent quenching) 기법을 사용하여 결정될 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 비제한적으로 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 , Fv 및 scFv 단편, 및 이후 기재된 다른 단편을 포함한다. 특정 항체 단편에 대한 고찰을 위해, 문헌[Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편에 대한 고찰을 위해, 예를 들어 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조한다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의를 위해 미국특허 제5,869,046호를 참조한다.
다이아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 또한, 트라이아바디(triabody) 및 테트라아바디(tetrabody)는 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변성 도메인의 전체 또는 일부, 또는 경쇄 가변성 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 왈탐 소재; 예를 들어, 미국특허 제6,248,516 B1호 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이 비제한적으로 손상되지 않은 항체의 단백질분해적 분해, 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어, 이 콜라이(E. coli) 또는 파아지)에 의한 생산을 비롯한 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라성 항체 및 인간화된 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라성 항체이다. 특정 키메라성 항체는 예를 들어, 미국특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라성 항체는 비-인간 가변성 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유도된 가변성 영역) 및 인간 불변성 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라성 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 부류 또는 하위부류로부터 변화된 "부류-전환된(class switched)" 항체이다. 키메라성 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라성 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 비-인간 모 항체의 친화도 및 특이성을 보유하면서 인간에 대한 면역원성이 감소되도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상의 가변성 도메인을 포함하고, 여기서 HVR, 예를 들어, CDR(또는 이의 일부분)은 비-인간 항체로부터 유도되고, FR(또는 이의 일부분)은 인간 항체 서열로부터 유도된다. 또한, 인간화된 항체는 임의적으로 인간 불변성 영역의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화된 항체중 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 회복하거나 개선시키기 위해, 비-인간 항체(예를 들어, HVR 잔기가 유도되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 이의 생산 방법은, 예를 들어 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에 검토되어 있고, 추가로, 예를 들어, 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 문헌[Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호 및 제7,087,409호; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)](SDR (a-CDR) 그라프팅에 대해 기재); 문헌[Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)]("재보수(resurfacing)"에 대해 기재)"; 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)]("FR 셔플링(shuffling)"에 대해 기재); 문헌[Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)] 및 [Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "안내된 선택" 접근에 대해 기재)에 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 골격구조 영역은 비제한적으로 "최적-정합(best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 골격구조 영역(예를 들어 문헌[Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변성 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유도된 골격구조 영역(예를 들어 문헌[Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; 및 [Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙(체세포적으로 성숙된) 골격구조 영역 또는 인간 생식계열 골격구조 영역(예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리를 스크리닝하여 유도된 골격구조 영역(예를 들어 문헌[Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)] 및 [Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함한다.
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)] 및 [Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 손상되지 않은 인간 항체, 또는 항원 챌린지(challenge)에 대한 반응으로 인간 가변성 영역을 갖는 손상되지 않은 항체를 생산하도록 개질된 형질감염 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내생성 면역글로불린 유전자자리를 대체하거나, 염색체 밖에 존재하거나 동물의 염색체내로 무작위로 조립된 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함한다. 이러한 형질감염 마우스에서, 내생성 면역글로불린 유전자자리는 일반적으로 비활성화되었다. 형질감염 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법을 검토하기 위해, 문헌[Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE, 상표) 기술을 기재하는 미국특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; 후맵(HUMAB, 등록상표) 기술을 기재하는 미국특허 제5,770,429호; 케이-엠 마우스(K-M MOUSE, 등록상표) 기술을 기재하는 미국특허 제7,041,870호, 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE, 등록상표) 기술을 기재하는 미국특허출원 공개공보 제2007/0061900호를 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 손상되지 않은 항체로부터의 인간 가변성 영역은 예를 들어, 상이한 인간 불변성 영역과 조합함으로써 추가로 개질될 수 있다.
또한, 인간 항체는 하이브리도마에 기초한 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단일클론성 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다(예를 들어 문헌[Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조). 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은 예를 들어, 미국특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터의 단일클론성 인간 IgM 항체의 생산을 기재함) 및 문헌[Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)](인간-인간 하이브리도마를 기재함)에 기재된 방법을 포함한다. 또한, 인간 하이브리도마 기술(트리오마(Trioma) 기술)은 문헌[Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)] 및 [Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
또한, 인간 항체는 인간-유도된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변성 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변성 도메인 서열은 원하는 인간 불변성 도메인과 조합될 수 있다. 인간 항체를 항체 라이브러리로부터 선택하는 기법은 하기에 기재되어 있다.
5. 라이브러리-유도된 항체
본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성을 갖는 항체를 위해 조합적 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특징을 갖는 항체를 위해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 검토되어 있고, 예를 들어 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554]; [Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고, 파아지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 이는 이어서 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파아지를 위해 스크리닝될 수 있다. 파아지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 표시한다. 면역화된 근원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요없이 면역원에 대해 높은 친화성을 갖는 항체를 제공한다. 또는, 문헌[Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 임의의 면역화없이 비-자가 항원 내지 자가 항원에 이르는 넓은 범위로 항체의 단일 근원을 제공하기 위해 순수한(naive) 레퍼토리가 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝될 수 있다. 최종적으로, 순수한 라이브러리는 또한 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 구획을 클로닝하고, 무작위 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 고 가변성 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파아지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는 예를 들어 미국특허 제5,750,373호, 및 미국특허출원 공개공보 제2005/0079574호, 제2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호 및 제2009/0002360호를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
6. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단일클론성 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성중 하나는 MCSP에 대한 것이고, 나머지는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 MCSP의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 또한, 이중특이적 항체는 MCSP를 발현하는 세포에 세포독성제를 편재화시키기 위해 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하는 기법은 비제한적으로 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현(문헌[Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들어, 미국특허 제5,731,168호 참조)이 포함된다. 또한, 다중특이적 항체는 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기적 조정 효과를 조작함으로써(WO 2009/089004A1); 둘 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시킴으로써(예를 들어, 미국특허 제4,676,980호, 및 문헌[Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조]); 이중특이적 항체를 생산하기 위해 로이신 지퍼(zipper)를 사용함으로써(예를 들어, 문헌[Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위해 "다이아바디" 기술을 사용함으로써(예를 들어, 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 단일-쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함으로써(예를 들어, 문헌[Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)) 참조); 예를 들어, 문헌[Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.
또한, "옥토퍼스(Octopus) 항체"를 비롯한 3개 이상의 작용성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 본원에 포함된다(예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
또한, 항체 또는 단편은 본원에서 MCSP에 결합하는 항원 결합 부위, 뿐만 아니라 또다른 상이한 항원을 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어, US 2008/0069820 참조).
7. 항체 변형체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변형체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 항체의 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변형체는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열내로 적절히 개질을 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 개질로는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 서열내로의 삽입 및/또는 서열의 치환이 포함된다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합은 최종 구축물에 도달되도록 이루어지지만, 단 최종 구축물은 원하는 특징, 예를 들어, 항원-결합 특징을 소유해야 한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변형체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변형체가 제공된다. 치환적 돌연변이생성에 흥미로운 부위로는 HVR 및 FR이 포함된다. 보존적 치환은 "보존적 치환"이라는 표제하에 표 1에 제시되어 있다. 보다 실질적인 변화는 "예시적인 치환"이라는 표제하에 표 1에 제공되고, 참고로 아미노산 측쇄 부류에 대해서는 하기 추가로 기재된 바와 같다. 아미노산 치환은 흥미로운 항체에 도입되고 생성물은 원하는 활성, 예를 들어, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝된다.
[표 1]
Figure pct00001

아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류중 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환함을 수반할 것이다.
치환적 변형체의 한가지 유형은 모 항체(예를 들어, 인간화된 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 과가변성 영역 잔기를 치환함을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변형체는 모 항체에 비하여 특정 생물학적 특성(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에 있어서 개질(예를 들어, 개선)될 수 있고/있거나, 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환적 변형체는 친화도 성숙된 항체이고, 이는 편리하게 예를 들어, 파아지 디스플레이에 기초한 친화도 성숙 기법, 예컨대, 본원에 기재된 기법에 의해 생성될 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기는 돌연변이되고 변형 항체는 파아지 상에 디스플레이되고 특정 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경(예를 들어, 치환)은 HVR에서 이루어져서, 예를 들어, 항체 친화도를 개선시킬 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스폿(hotspot)", 즉 체세포 돌연변이 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화되는 잔기(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어지고, 생성된 변형체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 돌연변이는, 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 돌연변이의 일부 실시양태에서, 돌연변이를 위해 채택된 변형가능한 유전자내로 임의의 다양한 방법(예를 들어, 오류-발생 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이생성)에 의해 변형이 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서, 라이브러리는 스크리닝되어 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변형체를 식별한다. 변형을 도입하는 또다른 방법은 HVR-유도된 접근법과 관련되고, 여기서 수 개의 HVR 잔기(예를 들어, 한 시점에 4 내지 6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여된 HVR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 또는 모델링(modeling)을 사용하여 특이적으로 식별될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 초래될 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에 만들어 진다. 이러한 변경은 HVR "핫스폿" 또는 SDR의 바깥쪽일 수 있다. 상기 제공된 변형체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이생성을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하는 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이생성"으로 지칭된다. 이러한 방법에서, 표적 잔기의 잔기 또는 기(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대, arg, asp, his, lys, 및 glu)는 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는지의 여부를 결정하기 위해 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 식별되거나 대체된다. 초기 치환에 작용적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 다르게 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조는 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 식별한다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃한 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변형체는 이들이 원하는 특성을 포함하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복시 말단 축합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변형으로는 효소(예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드로의 항체의 N- 또는 C-말단의 축합이 포함된다.
b) 글리코실화 변형체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 변경되어 항체가 글리코실화되는 정도가 증가 또는 감소된다. 항체에 글리코실화 부위의 첨가 또는 이의 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유의 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-결합에 의해 일반적으로 결합된 분지화된 바이안테나 올리고당을 전형적으로 포함한다. 예를 들어, 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산, 뿐만 아니라 바이안테나 올리고당 구조의 "줄기"에 있는 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체중 올리고당의 개질은 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변형체를 생성하기 위해 이루어진다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 결합된 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변형체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체중 푸코스의 양은 1 내지 80%, 1 내지 65%, 5 내지 65% 또는 20 내지 40%이다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정시, Asn297에 결합된 모든 당구조물(예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합에 대한, Asn297에서의 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 297 위치(Fc 영역 잔기의 Eu 번호매김)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 항체중 작은 서열 변형에 기인하여 297 위치의 약 ± 3의 아미노산 상류 또는 하류, 즉 294 내지 300 위치에 위치될 수도 있다. 이러한 푸코실화 변형체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, US 2003/0157108(Presta, L.); US 2004/0093621(교와 하꼬 고교 코포레이션 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코스된" 또는 "푸코스-부족" 항체 변형체에 관한 문헌의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌[Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]을 포함한다. 탈푸코스된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; US 2003/0157108 A1(Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1(Adams et al.), 특히 실시예 11), 및 넉아웃(knockout) 세포주, 예컨대, 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포(예를 들어, 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]; [Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO 2003/085107)를 포함한다.
이등분된 올리고당을 갖는 항체 변형체가 추가로 제공되고, 예를 들어, 여기서 항체의 Fc 영역에 결합된 바이안테나 올리고당은 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변형체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변형체의 예는 예를 들어, WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.); 미국특허 제6,602,684호(Umana et al.); 및 US 2005/0123546(Umana et al.)에 기재되어 있다. 또한, Fc 영역에 결합된 올리고당에서 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변형체가 제공된다. 이러한 항체 변형체는 CDC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변형체는 예를 들어 WO 1997/30087(Patel et al.); WO 1998/58964(Raju, S.); 및 WO 1999/22764(Raju, S.)에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 숙주 세포에서 본 발명의 항-MCSP 항체를 암호화하는 핵산 및 글리코실전달효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 이러한 핵산을 포함하는 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는, 숙주 세포에 의해 생산된 본 발명의 항-MCSP 항체의 글리코실화 프로파일의 변경 방법에 관한 것이다. 글리코실전달효소 활성을 갖는 유전자는 β(1,4)-N-아세틸글루코사민일전달효소 III(GnTII), α-만노시다제 II(ManII), β(1,4)-갈락토실전달효소(GalT), β(1,2)-N-아세틸글루코사민일전달효소 I(GnTI), 및 β(1,2)-Ν-아세틸글루코사민일전달효소 II(GnTII)를 포함한다. 한 실시양태에서, 글리코실전달효소 활성을 갖는 유전자의 조합물이 숙주 세포에서 발현된다(예를 들어, GnTIII 및 Man II). 이와 같이, 또한, 방법은 항-MCSP 항체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 글리코실전달효소 유전자가 파열되거나 달리는 실활된 숙주 세포(예를 들어, α1-6 코어 푸코실전달효소를 암호화하는 유전자의 활성이 넉 아웃된 숙주 세포)에서 발현시킴을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-MCSP 항체는 글리코실화 패턴을 바꾸기 위해 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 발현하는 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 골지(Golgi) 거주 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 용어 골지 편재화 도메인은 골지 복합체내의 위치에 폴리펩티드를 고정시키는데 책임이 있는 골지 거주 폴리펩티드의 아미노산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 편재화 도메인은 효소의 아미노 말단 "테일(tail)"을 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 숙주 세포에서 본 발명의 항-MCSP 항체를 발현시키면 증가된 Fc 수용체 결합 친화도 및 증가된 효과자 기능을 갖는 항-MCSP 항체가 생성된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산; 및 (b) 본 발명의 항-MCSP 항체, 예컨대, 인간 MCSP에 결합하는 키메라성 항체, 영장류화된 항체 또는 인간화된 항체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 GnTIII의 촉매 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이고, 골지 편재화 도메인은 만노시다제 II의 편재화 도메인이다. 이러한 융합 폴리펩티드를 생성하고 이들을 이용하여 효과자 기능이 증가된 항체를 생산하기 위한 방법은 미국가특허출원 제60/495,142호 및 미국특허출원 공개공보 제2004/0241817호에 개시되어 있고, 이의 전체 내용은 분명히 본원에 참고로 인용되어 있다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포에 의해 생산된 개질된 항-MCSP 항체는 Fc 영역을 포함하는 IgG 불변성 영역 또는 이의 단편을 갖는다. 또다른 특정 실시양태에서 항-MCSP 항체는 Fc 영역을 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 단편이다.
본 발명의 숙주 세포에 의해 생산된 변경된 글리코실화를 갖는 항-MCSP 항체는 전형적으로 숙주 세포의 개질 결과로서(예를 들어, 글리코실전달효소 유전자의 발현에 의해) 증가된 Fc 수용체 결합 친화도 및/또는 증가된 효과자 기능을 나타낸다. 바람직하게, 증가된 Fc 수용체 결합 친화도는 Fcγ 활성화 수용체, 예컨대, FcγRIIIa 수용체에 대한 증가된 결합이다. 증가된 효과자 기능은 바람직하게 하기 특성중 하나 이상에서의 증가이다: 증가된 항체-의존성 세포 세포독성, 증가된 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP), 증가된 사이토킨 분비, 항원-제공 세포에 의한 증가된 면역-복합체-중재된 항원 수득, 증가된 Fc-중재된 세포 세포독성, NK 세포에 대한 증가된 결합, 대식 세포에 대한 증가된 결합, 다형핵 세포(PMN)에 대한 증가된 결합, 단핵 세포에 대한 증가된 결합, 표적-결합된 항체의 증가된 가교결합, 아포토시스를 유도하는 증가된 직접 신호전달, 증가된 수지상 세포 돌연변이, 및 증가된 T 세포 프라이밍.
한 양상에서, 본 발명은 글리코 조작되지 않은 항-MCSP 항체와 비교하여 증가된 효과자 기능, 예컨대, 항체-의존성 세포 세포독성을 갖는 항-MCSP 항체(예를 들어, 변형 항체)의 글리코형(glycoform)을 제공한다. 항체의 글리코실화 조작은 이전에 기재되어 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 전체가 인용된 미국특허 제6,602,684호를 참조한다. 또한, 글리코실화에 관여된 유전자의 활성이 변경된 숙주 세포로부터 항-MCSP 항체를 제조하는 방법이 본원에 상세히 기재되어 있다(예를 들어, "발현 벡터 및 숙주 세포"란 명칭의 앞선 단락을 참조한다). 본 발명의 항-MCSP 항체의 ADCC에서의 증가는 MCSP에 대한 항체의 친화도를 증가시키으로써, 예를 들어 친화도 돌연변이 또는 친화도를 개선시키는 다른 방법들에 의해 또한 달성된다(문헌[Tang et al., J. Immunol. 2007, 179:2815-2823] 참조). 또한, 이들 접근법의 조합이 본 발명에 내포된다.
일부 유형의 암의 치료를 위해 미접합된 단일클론성 항체(mAb)의 임상적 시험은 최근에 고무된 결과를 낳았다(문헌[Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997)]; [Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997)] 참조). 키메라성의 미접합 IgG1은 저-등급 또는 소낭성 B-세포 비-호지킨의 림프종에 대해 승인된 반면에(문헌[Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997)] 참조), 또다른 미접합된 mAb인, 고형 유방 종양을 표적화하는 인간화된 IgG1은 또한 III 상 임상적 시험에서 보장된 결과를 보여주었다(문헌[Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997)] 참조). 이들 2개의 mAb의 항원은 이들 각각의 종양 세포에서 고도로 발현되고 항체는 시험관내 및 생체내에서 효과자 세포에 의해 강력한 종양 파괴를 중재한다. 대조적으로, 미세한 종양 특이성을 갖는 많은 다른 미접합된 mAb는 임상적으로 유용하기에 충분한 효능의 효과자 기능을 개시할 수 없다(문헌[Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997)]; [Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996)] 참조). 이러한 일부 더 약한 mAb를 위해, 부수적인 사이토킨 치료법이 현재 시험되고 있다. 사이토킨의 첨가는 순환 림프구의 활성 및 수를 증가시킴으로써 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 자극할 수 있다(문헌[Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997)]; [Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996)] 참조). 표적화된 세포 상의 용해성 공격인 ADCC는 항체의 불변성 영역(Fc)에 백혈구 수용체가 결합될 때 개시된다(문헌[Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997)] 참조).
미접합된 IgG1의 ADCC 활성을 증가시키기 위한 상이하지만 상보적인 접근법은 항체의 Fc 영역을 조작하는 것이다. 단백질 조작 연구로부터, FcγR이 IgG CH2 도메인의 더 아래 힌지 영역과 상호작용함을 알 수 있었다(문헌[Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996)] 참조). 그러나, FcγR 결합은 또한 CH2 영역내에서 보존된 Asn297에서 공유적으로 결합된 올리고당의 존재를 필요로 한다. 문헌[Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996)]; 및 [Wright and Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997)]은 올리고당 및 폴리펩티드 둘다가 상호작용 부위에 직접적으로 기여하거나, 올리고당이 활성 CH2 폴리펩티드 배좌를 유지하기 위해 요구된다고 제안한다. 올리고당 구조의 개질은 따라서 상호작용의 친화도를 증가시키는 수단으로서 연구될 수 있다.
IgG 분자는 2개의 N-연결된 올리고당을 그의 Fc 영역내에 수반하고, 하나씩 각 중쇄에 존재한다. 임의의 당단백질로서, 항체는 글리코형의 모집단으로서 생산되고, 이는 동일한 폴리펩티드 주쇄를 공유하지만 글리코실화 부위에 결합된 상이한 올리고당을 갖는다. 혈청 IgG의 Fc 영역에서 일반적으로 발견되는 올리고당은 말단 시알산이 수준이 낮고 이등분 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 가지며, 말단 갈락토실화 및 코어 푸코실화가 다양한 복합체 이촉각성 유형이다(문헌[Wormald et al., Biochemistry 36:130-38 (1997)]). 일부 연구에 따르면, FcγR 결합에 필요한 최소 탄수화물 구조는 올리고당 코어에 놓이는 것으로 제안된다(문헌[Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996)]).
미접합된 치료적 mAb의 생산을 위해 산업 및 학계에서 사용되는 마우스- 또는 햄스터-유도된 세포주는 필요한 올리고당 결정자를 Fc 부위에 결합시킨다. 그러나 이들 세포주에서 발현된 IgG는 혈청 IgG에서 소량으로 발견되는 이등분 GlcNAc가 결핍된다(문헌[Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995)]). 대조적으로, 래트 골수종-생산된, 인간화된 IgG1(CAMPATH-1H)이 이의 일부 글리코형에서 이등분 GlcNAc를 수반하는 것으로 최근에 관찰되었다(문헌[Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995)]). 래트 세포-유도된 항체는 표준 세포주에서 생산된 CAMPATH-1H 항체와 유사하지만 상당히 더 낮은 항체 농도로 최대 시험관내 ADCC 활성에 도달하였다.
CAMPATH 항원은 정상적으로 림프종 세포 상에 높은 수준으로 존재하고, 이러한 키메라성 mAb는 이등분 GlcNAc의 부재하에 높은 ADCC 활성을 갖는다(문헌[Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995)]). N-연결된 글리코실화 경로에서, 이등분 GlcNAc는 GnTIII에 의해 첨가된다(문헌[Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986)]).
이전 연구는 상이한 수준의 클로닝된 GnTIII 효소 유전자를 외부적으로 조절된 방식으로 발현하도록 미리 조작된 단일한 항체-생산 CHO 세포주를 사용하였다(문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)]). 이러한 접근법은 글리코실전달효소(예를 들어, GnTIII)의 발현 및 개질된 항체의 ADCC 활성 사이의 엄격한 상관관계를 최초로 확립하였다. 따라서, 본 발명은 항체-생산 숙주 세포에서 글리코실전달효소 유전자의 발현 수준을 변화시킴으로써 생성된 변경된 글리코실화를 갖는 Fc 영역 또는 Fc 영역에 상응하는 영역을 포함하는 항-MCSP 항체를 고려한다. 구체적인 실시양태에서, 유전자 발현 수준에서의 변화는 GnTIII 활성의 증가이다. 증가된 GnTIII 활성은 항체의 Fc 영역에서 이등분된 올리고당의 백분율의 증가, 뿐만 아니라 푸코스 잔기의 백분율의 감소를 초래한다. 이러한 항체, 또는 이의 단편은 증가된 Fc 수용체 결합 친화도 및 증가된 효과자 기능을 갖는다.
또한, 본 발명은 (a) 글리코실전달효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 발현하도록 조작된 숙주 세포를 본 발명에 따른 항-MCSP 항체가 생산되도록 허용하는 조건하에 배양하는 단계(여기서, 글리코실전달효소 활성을 갖는 상기 폴리펩티드는 상기 숙주 세포에 의해 생산된 상기 항-MCSP 항체의 Fc 영역에서 올리고당을 개질하기에 충분한 양으로 발현된다); 및 (b) 상기 항-MCSP 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 개질된 올리고당을 갖는 본 발명의 항-MCSP 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 글리코실전달효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 GnTIII이다. 또다른 실시양태에서, 글리코실절달효소 활성을 갖는 2개의 폴리펩티드가 존재한다. 특정 실시양태에서, 글리코실전달효소 활성을 갖는 2개의 폴리펩티드는 GnTIII 및 ManII이다. 또다른 실시양태에서, 글리코실전달효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 GnTIII의 촉매적 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 골지 거주 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 추가로 포함한다. 바람직하게, 골지 편재화 도메인은 만노시다제 II 또는 GnTI의 편재화 도메인이다. 또는, 골지 편재화 도메인은 만노시다제 I의 편재화 도메인, GnTII의 편재화 도메인, 및 α1-6 코어 푸코실전달효소의 편재화 도메인으로 구성된 군에서 선택된다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 항-MCSP 항체는 증가된 Fc 수용체 결합 친화도 및/또는 증가된 효과자 기능을 갖는다. 일반적으로, 증가된 효과자 기능은 다음중 하나 이상의 기능이다: 증가된 Fc-중재된 세포 세포독성(증가된 항체-의존성 세포 세포독성 포함), 증가된 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP), 증가된 사이토킨 분비, 항원-제공 세포에 의한 증가된 면역-복합체-중재된 항원 수득, NK 세포에 대한 증가된 결합, 대식 세포에 대한 증가된 결합, 단핵 세포에 대한 증가된 결합, 다형핵 세포에 대한 증가된 결합, 아포토시스를 유도하는 증가된 직접 신호전달, 표적-결합된 항체의 증가된 가교결합, 증가된 수지상 세포 돌연변이 또는 증가된 T 세포 프라이밍. 증가된 Fc 수용체 결합 친화도는 바람직하게는 Fc 활성화 수용체, 예컨대, FcγRIIIa에 대한 증가된 결합이다. 특히 바람직한 실시양태에서, ABM은 인간화된 항체 또는 이의 단편이다.
한 실시양태에서, 항-MCSP 항체의 Fc 영역에서 이등분된 N-연결된 올리고당의 백분율은 총 올리고당의 약 10% 이상 내지 약 100%, 구체적으로 약 50% 이상, 더 구체적으로, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상 내지 95%이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 항체는 본 발명의 방법에 의한 그의 올리고당의 개질 결과로서 Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖는다. 한 실시양태에서, 푸코실화되지 않은 올리고당의 백분율은 약 20% 이상 내지 약 100%이고, 구체적으로 약 50% 이상, 약 60% 이상 내지 약 70%, 더 구체적으로, 약 75% 이상이다. 푸코실화되지 않은 올리고당은 하이브리드 또는 복합체 유형일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 항체는 본 발명의 방법에 의한 그의 올리고당의 개질의 결과로서 Fc 영역에서 이등분된 올리고당의 증가된 비율을 갖는다. 한 실시양태에서, 이등분된 올리고당의 백분율은 약 20% 이상 내지 약 100%, 구체적으로 약 50% 이상, 약 60% 이상 내지 약 70%, 더 구체적으로, 약 75% 이상이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포 및 본 발명의 방법에 의해 제조된 항-MCSP 항체는 Fc 영역에서 이등분된 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖는다. 이등분된, 푸코실화되지 않은 올리고당은 하이브리드 또는 복합체일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 항체의 Fc 영역중의 올리고당의 약 10% 이상 내지 약 100%, 구체적으로 약 15% 이상, 더 구체적으로 약 20% 이상 내지 약 50%, 더 구체적으로 약 20% 이상 내지 약 25%, 더 구체적으로 약 30% 이상 내지 약 35%가 이등분되고 푸코실화되지 않은 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 항-MCSP 항체는 또한 항-MCSP 항체의 Fc 영역중의 올리고당의 약 10% 이상 내지 약 100%, 구체적으로 약 15% 이상, 더 구체적으로 약 20% 이상 내지 약 25%, 더 구체적으로 약 30% 이상 내지 약 35%가 푸코실화되지 않은 이등분된 하이브리드인 Fc 영역을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된, 증가된 효과자 기능 및/또는 증가된 Fc 수용체 결합 친화도를 갖도록 조작된 항-MCSP 항체에 관한 것이다. 증가된 효과자 기능은 비제한적으로 다음중 하나 이상의 기능을 포함할 수 있다: 증가된 Fc-중재된 세포 세포독성(증가된 항체-의존성 세포 세포독성 포함), 증가된 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP), 증가된 사이토킨 분비, 항원-제공 세포에 의한 증가된 면역-복합체-중재된 항원 수득, NK 세포에 대한 증가된 결합, 대식 세포에 대한 증가된 결합, 단핵 세포에 대한 증가된 결합, 다형핵 세포에 대한 증가된 결합, 아포토시스를 유도하는 증가된 직접 신호전달, 표적-결합된 항체의 증가된 가교결합, 증가된 수지상 세포 돌연변이, 및 증가된 T 세포 프라이밍. 한 바람직한 실시양태에서, 증가된 Fc 수용체 결합 친화도는 Fc 활성화 수용체, 가장 바람직하게 FcγRIIIa에 대한 증가된 결합이다. 한 실시양태에서, 항체는 손상되지 않은 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 Fc 영역, 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 동등한 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 항체 단편이다.
본 발명은 추가로 증가된 Fc 수용체 결합 친화도, 바람직하게 증가된 Fc 활성화 수용체에 대한 증가된 결합, 및/또는 증가된 효과자 기능, 예컨대, 항체-의존성 세포 세포독성을 갖는 본 발명의 항체의 글리코형의 생산을 위한 숙주 세포 시스템을 생성하기 위한 방법 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명의 항체에 사용될 수 있는 글리코 조작 방법은 미국특허 제6,602,684호, 미국특허출원 공개공보 제2004/0241817 A1호, 미국특허출원 공개공보 제2003/0175884 A1호, 미국가특허출원 제60/441,307호 및 WO 2004/065540에 더 상세히 기재되어 있고, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 그의 전체가 인용되어 있다. 또는, 본 발명의 항체는 미국특허출원 공개공보 제2003/0157108호(제넨테크), 또는 EP 1 176 195 A1, WO 03/084570, WO 03/085119 및 미국특허출원 공개공보 제2003/0115614호, 제2004/093621호, 제2004/110282호, 제2004/110704호, 제2004/132140호(교와)에 개시된 기법에 따라 Fc 영역에서 푸코스 잔기가 감소하도록 글리코 조작될 수 있다. 이들 문헌 각각의 내용은 본원에 참고로 전체가 인용되어 있다. 또한, 본 발명의 글리코 조작된 항체는 개질된 당단백질을 생산하는 발현 시스템, 예컨대, 미국특허출원 공개공보 제60/344,169호 및 WO 03/056914(글리코파이 인코포레이티드(GlycoFi, Inc.)) 또는 WO 2004/057002 및 WO 2004/024927(그리노베이션(Greenovation))에 교시된 시스템에서 생산될 수 있고, 이들 각각의 내용은 본원에 참고로 전체가 인용되어 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 개질된 글리코실화 패턴을 갖는 본 발명의 항체의 생산을 위한 숙주 세포 발현 시스템을 제공한다. 특히, 본 발명은 개선된 치료 가치를 갖는 본 발명의 항체의 글리코형의 생성을 위한 숙주 세포 시스템을 제공한다. 따라서, 본 발명은 글리코실전달효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 선택되거나 조작된 숙주 세포 발현 시스템을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 글리코실전달효소 활성은 GnTIII 활성이다. 한 실시양태에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 이종성 골지 거주 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 구체적으로, 이러한 숙주 세포 발현 시스템은 구성 촉진자 또는 조절된 촉진자 시스템에 작동적으로 연결된, GnTIII를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산 분자를 포함하도록 조작될 수 있다.
한 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 이종성 골지 거주 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하고 GnTIII 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 발현하도록 조작된 숙주 세포를 제공한다. 한 양상에서, 숙주 세포는 이종성 골지 거주 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하고 GnTIII 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 핵산 분자로 조작된다.
일반적으로, 상기 논의된 세포주를 비롯하여 임의의 유형의 배양된 세포주는 본 발명의 숙주 세포주를 조작하는 배경으로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 다른 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포가 본 발명의 조작된 숙주 세포를 생성하기 위한 배경 세포주로서 사용된다.
본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 이종성 골지 거주 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 비롯하여, 글리코실전달효소 활성, 예를 들어, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 임의의 숙주 세포를 내포하는 것으로 고려된다.
글리코실전달효소 활성, 예를 들어, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 1개 또는 수 개의 핵산은 구성 촉진자, 또는 조절된 발현 시스템의 제어하에 발현될 수 있다. 이러한 시스템은 당분야에 잘 공지되어 있고, 상기 논의된 시스템을 포함한다. 글리코실전달효소 활성, 예를 들어, GnTIII 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 암호화하고 이종성 골지 거주 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하는 수 개의 상이한 핵산이 숙주 세포 시스템에 포함된다면, 이들중 일부는 구성 촉진자의 제어하에 발현될 수 있는 한편, 다른 것은 조절된 촉진자의 제어하에 발현된다. 글리코실전달효소 활성, 예를 들어, GnTIII 활성을 갖는 융합 폴리펩티드의 발현 수준은, 웨스턴 블롯 분석, 노던 블롯 분석, 리포터(reporter) 유전자 발현 분석 또는 글리코실전달효소 활성, 예를 들어, GnTIII 활성의 측정을 비롯하여, 당분야에 일반적으로 공지된 방법에 의해 결정된다. 또는, GnTIII의 생합성 생성물에 결합하는 렉틴, 예를 들어, E4-PHA 렉틴이 이용될 수 있다. 또는, 글리코실전달효소 활성, 예를 들어, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 조작된 세포에 의해 생산된 항체에 의해 중재된 증가된 효과자 기능 또는 증가된 Fc 수용체 결합을 측정하는 기능적 검정이 사용될 수 있다.
본 발명의 항체의 암호화 서열을 포함하고 생물학적으로 활성인 유전자 생성물을 발현하는 숙주 세포는 적어도 4가지 일반적 접근법에 의해 식별될 수 있다: (a) DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화; (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재; (c) 숙주 세포에서 개개의 mRNA 전사물의 발현에 의해 측정되는 경우 전사 수준의 평가; 및 (d) 유전자 생성물의 생물학적 활성 또는 면역검정에 의해 측정되는 경우 유전자 생성물의 검출.
제1접근법에서, 항-MCSP 항체의 암호화 서열 및/또는 글리코실전달효소(예를 들어, GnTIII) 활성을 갖는 폴리펩티드의 암호화 서열의 존재는 개개 암호화 서열에 동종성인 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 일부분 또는 유도체를 포함하는 프로브를 사용하는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화에 의해 검출될 수 있다.
제2접근법에서, 재조합 발현 벡터/숙주 시스템은 특정 "마커" 유전자 기능(예를 들어, 티미딘 키나제 활성, 항생물질에 대한 내성, 메토트렉세이트(methotrexate)에 대한 내성, 형질전환 표현형, 바큘로바이러스(baculovirus)에서의 폐색체(occlusion body) 형성 등)의 존재 또는 부재에 기초하여 식별되고 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체, 또는 이의 단편의 암호화 서열, 및/또는 글리코실전달효소(예를 들어, GnTIII) 활성을 갖는 폴리펩티드의 암호화 서열이 벡터의 마커 유전자 서열내에 삽입된다면, 개개의 암호화 서열을 포함하는 재조합체는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 식별될 수 있다. 또는, 마커 유전자는 암호화 서열의 발현을 조절하기 위해 사용되는 동일하거나 상이한 촉진자의 제어하에 암호화 서열과 나란히 위치될 수 있다. 유도 또는 선택에 반응하는 마커의 발현은 본 발명의 항체의 암호화 서열 및/또는 글리코실전달효소(예를 들어, GnTIII) 활성을 갖는 폴리펩티드의 암호화 서열의 발현을 지시한다.
제3접근법에서, 본 발명의 항체, 또는 이의 단편의 암호화 영역, 및/또는 글리코실전달효소(예를 들어, GnTIII) 활성을 갖는 폴리펩티드의 암호화 서열에 대한 전사 활성은 하이브리드화 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, RNA는 본 발명의 항체, 또는 이의 단편의 암호화 서열, 및/또는 글리코실전달효소(예를 들어, GnTIII) 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 특정 부분의 암호화 서열에 동종성인 프로브를 사용하여 노던 블롯에 의해 단리되고 분석될 수 있다. 또는, 숙주 세포의 총 핵산은 추출되고 이러한 프로브로의 하이브리드화에 대해 분석된다.
제4접근법에서, 단백질 생성물의 발현은 면역학적으로, 예를 들어 웨스턴 블롯, 면역검정, 예컨대, 방사성면역-침전, 효소-연결된 면역검정 등에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 발현 시스템의 성공에 대한 궁극적 시험은 생물학적 활성 유전자 생성물의 검출과 관련된다.
c) Fc 영역 변형체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 개질이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역내로 도입될 수 있고, 이로써 Fc 영역 변형체를 생성한다. Fc 영역 변형체는 아미노산 개질(예를 들어, 치환)을 하나 이상의 아미노산 위치에 갖는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 생체내 항체 반감기가 중요하지만 특정 효과자 기능(예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 적용분야를 위해 그 자체를 바람직한 후보로 만드는, 일부(그러나 전부는 아님) 효과자 기능을 갖는 항체 변형체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합이 결핍되었지만(이에 따라 유사하게 ADCC 활성이 결핍됨), FcRn 결합 능력을 보유함을 보장하도록 수행될 수 있다. ADCC를 중재하기 위한 1차 세포, NK 세포는 FcRIII만을 발현하지만, 단핵백혈구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 흥미로운 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국특허 제5,500,362호(예를 들어, 문헌[Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 및 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 제5,821,337호(문헌[Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 또는, 비-방사성 검정 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, 유세포분석을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 검정(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 검정(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)). 이러한 검정에 유용한 효과자 세포로는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 킬러(NK) 세포가 포함된다. 다르게 또는 추가로, 흥미로운 분자의 ADCC 활성은 생체내, 예를 들어, 동물 모델, 예컨대, 문헌[Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. Clq 결합 검정은 또한 항체가 Clq에 결합할 수 없고 이에 따라 CDC 활성이 결핍됨을 확인하기 위해 실행될 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서의 Clq 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; [Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 [Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). 또한, FcRn 결합 및 생체내 소거/반감기 결정은 당분야에 공지된 방법을 사용하여 실행될 수 있다(예를 들어 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
하나의 허용된 시험관내 ADCC 검정은 다음과 같다:
1) 검정은 항체의 항원-결합 영역에 의해 인식된 표적 항원을 발현하는 것으로 공지된 표적 세포를 사용한다;
2) 검정은 무작위로 선택된 건강한 공여자의 혈액으로부터 단리된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 효과자 세포로서 사용한다;
3) 검정은 하기 프로토콜에 따라 수행된다:
i) PBMC는 표준 밀도 원심분리 절차에 의해 단리되고 RPMI 세포 배양 배지중 5 × 106 세포/㎖로 현탁된다;
ii) 표적 세포는 표준 조직 배양 방법에 의해 성장되고, 90% 초과의 생존력을 갖는 대수증식기로부터 수확되고, RPMI 세포 배양 배지에서 세척되고, 100 마이크로퀴리의 51Cr로 표지되고, 세포 배양 배지로 2회 세척되고, 105 세포/㎖의 밀도로 세포 배양 배지에 재현탁된다;
iii) 100 ㎕의 상기 최종 표적 세포 현탁액은 96-웰 미세적정 플레이트의 각각의 웰에 전달된다;
iv) 항체는 세포 배양 배지에서 4000 ng/㎖에서 0.04 ng/㎖로 계대 희석되고 50 ㎕의 생성된 항체 용액은 96-웰 미세적정 플레이트중의 표적 세포에 첨가되어, 상기 전체 농도 범위를 포함하는 다양한 항체 농도가 3중으로 시험된다.
v) 최대 방출(MR) 조절을 위하여, 표지된 표적 세포를 포함하는 플레이트에서 3개의 추가의 웰에 50 ㎕의 2%(V/V) 비이온성 세정제 수용액(노니데트(Nonidet), 시그마(Sigma), 미국 세인트 루이스 소재)이 항체 용액 대신 공급된다(상기 (iv) 시점);
vi) 자발적 방출(SR) 제어를 위하여, 표지된 표적 세포를 포함하는 플레이트에서 3개의 추가의 웰에 50 ㎕의 RPMI 세포 배양 배지가 항체 용액 대신 공급된다(상기 (iv) 시점);
vii) 이어서 96-웰 미세적정 플레이트는 1분 동안 50 × g으로 원심분리되고, 1시간 동안 4℃에서 항온처리된다;
viii) 50 ㎕의 PBMC 현탁액(상기 (i) 시점)이 각각의 웰에 첨가되어 25:1의 효과자:표적 세포 비를 산출하고 플레이트는 5% CO2 분위기하에 37℃에서 4시간 동안 항온처리기에 위치된다;
ix) 각각의 웰로부터의 세포-미함유 상청액이 수거되고 실험적으로 방출된 방사능(ER)은 감마 계수기를 사용하여 정량화된다;
x) 특이적 용해의 백분율은 식 (ER-MR)/(MR-SR) × 100에 따라 각각의 항체 농도에 대해 계산되고, 여기서 ER은 항체 농도에 대해 정량화된 평균 방사능이고(상기 (ix) 시점 참조), MR은 MR 대조군(상기 (v) 시점 참조)에 대해 정량화된 평균 방사능이고(상기 (ix) 시점 참조), SR은 SR 대조군(상기 (vi) 시점 참조)에 대해 정량화된 평균 방사능이다(상기 (ix) 시점 참조).
4) "증가된 ADCC"는 상기 시험된 항체 농도 범위내에서 관찰된 특정 용해의 최대 백분율에서의 증가, 및/또는 상기 시험된 항체 농도 범위내에서 관찰된 특정 용해의 최대 백분율의 반을 달성하기 위해 필요한 항체의 농도에서의 감소로서 정의된다. ADCC에서의 증가는 당분야의 숙련가에게 공지된 동일한 표준 생산, 정제, 제형화 및 저장 방법을 사용하여, 상기 검정에 의해 측정되고, 동일한 항체에 의해 중재되고, 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생산되지만, GnTIII을 과발현하도록 조작된 숙주 세포에 의해서는 생산되지 않는 ADCC에 관련된다.
효과자 기능이 감소된 항체로는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329중 하나 이상이 치환된 항체가 포함된다(미국특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체로는 2개 이상의 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327에서 치환된 Fc 돌연변이체가 포함되고, 예로서 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체가 있다(미국특허 제7,332,581호).
FcR에 대한 결합이 향상되거나 감소된 특정 항체 변형체가 기재되어 있다(미국특허 제6,737,056호; WO 2004/056312; 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조).
특정 실시양태에서, 항체 변형체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 298, 333 및/또는 334 위치에서의 치환(잔기의 EU 번호매김)을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 미국특허 제6,194,551호, WO 99/51642호, 및 문헌[Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된(즉, 향상되거나 감소된) Clq 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 일으키는 변경이 Fc 영역에서 이루어진다.
모 IgG의 태아로의 전달에 책임이 있는, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합이 개선되고 반감기가 증가된 항체(문헌[Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])는 US 2005/0014934 A1(Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 내부에 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변형체로는, 다음의 하나 이상의 Fc 영역 잔기에서 치환된 변형체가 포함되고 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434; 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는다(미국특허 제7,371,826호).
또한 Fc 영역 변형체의 다른 예에 관한 문헌[Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국특허 제5,648,260호; 미국특허 제5,624,821호; 및 WO 94/29351을 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변형체
특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 허용가능한 부위에서 초래된다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 항체의 허용가능한 부위에 위치되고, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 다른 부분체, 예컨대, 약물 부분체 또는 연결기-약물 부분체에 항체를 접합하여 면역접합체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기들중 임의의 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 번호매김); 중쇄의 A118(EU 번호매김); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 번호매김). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 미국특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당분야에 공지되고 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 부분체를 함유하도록 추가로 개질될 수 있다. 항체의 유도에 적합한 부분체는 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수중 안정성에 기인하여 제작시 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지화되거나 분지화되지 않을 수 있다. 항체에 결합된 중합체의 수는 다양할 수 있고, 하나 보다 많은 중합체가 결합된다면, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 전반적으로, 유도를 위해 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 비제한적으로 개선될 항체의 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건하에서 치료에 사용될 것인지의 여부 등을 비롯한 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 부분체 및 항체의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 부분체는 탄소 나노튜브(nanotube)이다(문헌[Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 비제한적으로 통상적인 세포에 해를 주지 않지만 항체-비단백질성 부분체에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 부분체를 가열하는 파장이 포함된다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들어, 미국특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-MCSP 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄). 추가의 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2벡터를 포함한다(예를 들어, 이들로 형질전환된다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프조직 세포(예를 들어, Y0, NSO, Sp2/0 세포)이다. 한 실시양태에서, 항-MCSP 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 여기서 이 방법은, 상기 제공된 바와 같이, 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 임의적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항-MCSP 항체의 재조합 생산을 위해, 항체, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산은 단리되고 숙주세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내로 삽입된다. 이러한 핵산은 쉽게 단리될 수 있고, 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 서열화된다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 효과자 기능이 필요하지 않는 경우 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해, 예를 들어, 미국특허 제5,648,237호, 제5,789,199호, 및 제5,840,523호를 참조한다(또한, 이 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기재하는 문헌[Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254]을 참조한다). 발현 후, 항체는 가용성 분별물에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵세포에 더하여, 진핵세포 미생물, 예컨대, 필라멘트형 진균류 또는 효모는 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이고, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성하는 진균류 및 효모 균주가 포함된다(문헌[Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)] 및 [Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)] 참조).
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 식별되었다.
식물 세포 배양액이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호 및 제6,417,429호(형질감염 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES, 상표) 기술을 기재함)를 참조한다.
또한, 척추동물 세포가 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(예를 들어, 문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들어, 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 뇌 암종 세포(HELA); 개과 동물 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대, DHFR-CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대, Y0, NSO 및 Sp2/0이 포함된다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주를 고찰하기 위해, 예를 들어, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
C. 검정
본원에 제공된 항-MCSP 항체는 당분야에 공지된 다양한 검정에 의해 이들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 식별되거나, 스크리닝되거나 특징화될 수 있다.
1. 결합 검정 및 기타 검정
한 양상에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 공지된 방법, 예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 그의 항원 결합에 대해 시험된다.
또다른 양상에서, 경쟁 검정은 MCSP에 결합하는데 대하여 본원에 기재된 항-MCSP 항체와 경쟁하는 항체를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 본원에 기재된 항-MCSP 항체에 의해 결합된 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 배좌 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑(mapping)하기 위한 상세화된 예시적인 방법은 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정화된 MCSP는 MCSP에 결합하는 제1의 표지된 항체, 및 MCSP에 결합하는데 대하여 제1항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험되는 제2의 표지되지 않은 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 제2항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 MCSP는 제1의 표지된 항체를 포함하지만 제2의 표지되지 않은 항체를 포함하지 않는 용액에서 항온처리된다. MCSP에 대한 제1항체의 결합에 대해 허용되는 조건하에 항온처리된 후, 과량의 결합되지 않은 항체는 제거되고, 고정화된 MCSP와 회합된 표지의 양이 측정된다. 고정화된 MCSP와 회합된 표지의 양이 대조 샘플에 비하여 시험 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 이는 제2항체가 MCSP에 대한 결합에 대해 제1항체와 경쟁함을 지시한다. 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
2. 활성 검정
한 양상에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 항-MCSP 항체를 식별하기 위해 제공된다. 또한, 생체내 및/또는 시험관내에서의 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 이러한 생물학적 활성에 대해 시험된다.
D. 면역접합체
또한, 본 발명은 하나 이상의 세포독성제, 예컨대, 화학치료제 또는 약물, 성장 저해제, 독소(예를 들어, 박테리아, 진균류, 식물 또는 독물 기원의 단백질 독소, 효소적으로 활성인 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 항-MCSP 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 항체-약물접합체(ADC)이고, 여기서 항체는 하나 이상의 약물, 예컨대, 비제한적으로 메이탄시노이드(미국특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽특허 제EP 0 425 235 B1호 참조); 아우리스타틴, 예컨대, 모노메틸아우리스타틴 약물 부분체 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호 및 제7,498,298호 참조); 돌라스타틴; 칼리헤아미신 또는 이들의 유도체(미국특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호 및 제5,877,296호; 문헌[Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)]; 및 [Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)]); 안트라사이클린, 예컨대, 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)]; [Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)]; [Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)]; [Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)]; [Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)]; [King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국특허 제6,630,579호); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065에 접합된다.
또다른 실시양태에서, 면역접합체는 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편, 예컨대, 비제한적으로 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테세네스에 접합된 본원에 상기 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산에 이용가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 방사성접합체가 검출을 위해 사용될 경우, 이는 신티그래프(scintigraphic) 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(또한 자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예컨대, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대, N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복시레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HC1), 활성 에스터(예컨대, 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이이소시아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-다이이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. W0 94/11026을 참조한다. 연결기는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시키는 "분할가능한 연결기"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 연결기, 펩티다제-민감성 연결기, 광불안정성 연결기, 다이메틸 연결기 또는 다이설파이드-함유 연결기(문헌[Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
면역접합체 또는 ADC는 본원에서 비제한적으로 (예를 들어, 미국 일리노이주 락포드 소재의 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.)로부터) 상업적으로 입수가능한 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 비롯한 가교-결합제에 의해 제조된 이러한 접합체를 명백히 고려한다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-MCSP 항체는 생물학적 샘플에서 MCSP의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출의 방법에서 사용하기 위한 항-MCSP 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플에서 MCSP의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 이 방법은 항-MCSP 항체가 MCSP에 결합하는 것을 허용하는 조건하에 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항-MCSP 항체와 접촉시키는 단계, 및 항-MCSP 항체 및 MCSP 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-MCSP 항체는 항-MCSP 항체에 의한 치료에 대해 적합한 피험체를 선택하기 위해 사용되고, 예를 들어, MCSP는 환자의 선택을 위한 바이오마커이다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 질환으로는 세포 증식성 질환 또는 혈관신생성 질환을 비롯하여 MCSP의 발현에 의해 특징지워 지는 질환이 포함된다. 한 실시양태에서, 질환은 암, 예컨대, 피부암(흑색종 및 기저 세포 암종 포함), 신경교종(교모 세포종 포함), 골암(예컨대, 골육종), 및 백혈병(ALL 및 AML 포함)이다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-MCSP 항체가 제공된다. 표지로는 비제한적으로 직접적으로 검출되는 표지 또는 부분체(예컨대, 형광물질, 발색단, 고전자밀도, 화학발광체, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 부분체, 예컨대, 효소 또는 리간드가 포함된다. 예시적인 표지로는 비제한적으로 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인(fluorescein) 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어, 반딧불 루시페라제 및 박테리아 루시페라제(미국특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 서양고추냉이 과산화효소(HRP: horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 당류 산화효소, 예를 들어, 글루코스 산화효소, 갈락토스 산화효소, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 헤테로환식 산화효소, 예컨대, 유리카제 및 잔틴 산화효소(염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대, HRP, 락토과산화효소, 또는 마이크로과산화효소와 커플링됨), 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파아지 표지, 안정한 유리 라디칼 등이 포함된다.
F. 약학 제형
본원에 기재된 바와 같은 항-MCSP 항체의 약학 제형은 원하는 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]), 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에 무독성이고, 비제한적으로 완충액, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐 피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 일당류, 이당류 및 기타 탄화수소, 예로서 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대, EDTA; 당류, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다. 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 본원에서 추가로 간질성(interstitial) 약물 분산제, 예컨대, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대, rhuPH20(하이레넥스(HYLENEX, 등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드)을 포함한다. 특정한 예시적인 sHASEGP 및 이의 사용 방법(rhuPH20 포함)은 미국특허출원 공개공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대, 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 미국특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국특허 제6,171,586호 및 WO 2006/044908에 기재된 제형을 포함하고, 후자의 제형으로는 히스티딘-아세테이트 완충액이 포함된다.
또한, 제형은 본원에서 치료될 특정 증상에 필수적인 하나 보다 많은 활성 구성성분, 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 구성성분을 포함할 수 있다. 이러한 활성 구성성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합물에 적절히 존재한다.
활성 구성성분은, 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에 트래핑될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지효성 제제가 제조될 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예로는 항체를 포함한 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이러한 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은, 예를 들어, 멸균 여과막에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-MCSP 항체가 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 양상에서, 약제로서 사용하기 위한 항-MCSP 항체가 제공된다. 추가의 양상에서, 암을 치료하는 데 사용하기 위한 항-MCSP 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-MCSP 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-MCSP 항체를 투여함을 포함하는, 암을 앓는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-MCSP 항체를 제공한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 흑색종의 치료에 사용하기 위한 항-MCSP 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서의 항-MCSP 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 약제는 암 치료를 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 약제는 암을 앓는 개체에게 유효량의 약제를 투여함을 포함하는 암 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 이러한 암을 앓는 개체에게 유효량의 항-MCSP 항체를 투여함을 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 양태에서의 암은 그의 구성 세포의 표면 상에 MCSP를 발현한다. 한 실시양태에서, 상기 양태에서의 암은 피부암(흑색종 및 기저 세포 암종 포함), 신경교종(교모 세포종 포함), 골암(예컨대, 골육종), 및 백혈병(ALL 및 AML 포함) 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, 상기 양태에서의 암은 흑색종이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된, 예를 들어, 상기 임의의 치료 방법에서 사용하기 위한 임의의 항-MCSP 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 항-MCSP 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 항-MCSP 항체 및 적어도 하나의 추가의 치료제, 예를 들어, 하기 기재된 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 치료법에서 다른 제제와 함께 또는 단독으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 1종 이상의 추가의 치료제와 공동 투여될 수 있다.
상기 주지된 이러한 조합 치료법은 조합된 투여(여기서 2종 이상의 치료제는 동일하거나 별도의 제형에 포함됨), 및 별도의 투여를 내포하고, 이 경우 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 이전에, 동시에, 및/또는 이후에 초래될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 방사선 요법과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가의 치료제)는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 예컨대, 비경구적, 폐내, 및 비강내, 필요에 따라 국소적 치료를 위해 병변내 투여가 포함된다. 비경구적 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은, 부분적으로는 투여가 단기인지 장기인지에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어, 주사에 의해, 예컨대, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 수행될 수 있다. 비제한적으로 다양한 시점에 걸친 다중 투여 또는 단일 투여, 거환 투여 및 맥동 주입 등을 비롯한 다양한 투약 계획이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 양호한 의료행위와 일치하는 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 본원과 관련하여 고려되는 인자로는 치료될 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 증상, 질환의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 의료진에게 공지된 다른 인자가 포함된다. 항체는, 필수적이지는 않지만, 임의적으로 해당 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 제형화된다. 이러한 다른 제제의 효과적인 양은 제형에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료의 유형 및 상기 언급된 다른 인자들에 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로에 의해, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%의 양으로, 또는 실험적/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량(단독으로 사용될 경우, 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용될 경우)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 위중성 및 과정, 항체가 예방을 목적으로 투여되는지 치료를 목적으로 투여되는지의 여부, 이전 치료법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 반응, 및 참여 의사의 견해에 좌우될 것이다. 항체는 적합하게는 환자에게 1회 또는 일련의 치료로 투여된다. 질환의 유형 및 위중성에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어, 0.1 내지 10 mg/kg)의 항체는, 예를 들어 하나 이상의 별도의 투여에 의해서인지 연속적인 주입에 의해서인지와 무관하게, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자들에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 증상에 따라서, 치료는 질환 증후의 원하는 억제가 초래될 때까지 유지될 것이다. 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 내지 약 10 mg/kg의 범위내일 수 있다. 이와 같이, 약 0.5, 2.0, 4.0 또는 10 mg/kg(또는 이의 임의의 조합)중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 1주마다 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들어, 환자가 항체를 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어, 약 6회 용량으로 수여받도록). 초기에 더 높은 적재 용량이 투여된 후 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 종래의 기법 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법이 항-MCSP 항체 대신 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있음을 알아야 한다.
H. 제품
본 발명의 또다른 양상에서, 상기 기재된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 포함하는 제품이 제공된다. 제품은 용기 및 이의 위에 또는 이와 연결된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 그 자체의, 또는 증상을 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 피하내 주사 바늘에 의해 침투가능한 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물중 하나 이상의 활성화제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 증상을 치료하기 위해 사용됨을 지시한다. 게다가, 제품은 (a) 조성물이 포함된 제1용기(여기서 조성물은 본 발명의 항체를 포함함); 및 (b) 조성물이 포함된 제2용기(여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 달리는 치료제를 포함함)를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서 제품은 조성물이 특정 증상을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 다르게 또는 추가로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충액, 예컨대, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거의 용액 및 덱스트로즈 용액을 포함하는 제2(또는 제3)용액을 추가로 포함할 수 있다. 추가로 다른 완충액, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제품이 항-MCSP 항체 대신에 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있음을 알아야 한다.
실시예
본 발명의 방법 및 조성물의 예는 다음과 같다. 상기에 일반적 설명이 제공되었지만 다양한 다른 실시양태가 실행될 수 있음을 알아야 한다.
실시예 1: 항- MCSP 항체의 생성
면역화 및 하이브리도마 생성
Balb/c 마우스를 KLH(SVPE AARTEAGKPE SSTPTGEPGPMASSPEPAVA KGGFLSFLEAN (서열 번호 2))에 커플링된 인간 MCSP 서열의 아미노산 2177 내지 2221에 상응하는 합성 펩티드로 4주마다 4회 복강내로 면역화한 후에, MCSP를 발현하는 Colo38 세포(문헌[Giacomini P, Natali P, Ferrone S J Immunol. 1985 Jul;135(1):696-702])로 2회 면역화하였다. 초기 면역화를 CFA에서 수행하고, 모두를 IFA에서 부스팅(boosting)하였다.
혈청 시험 채혈을 수행하고, 최대 혈청 역가 반값을 비오틴에 커플링되고 스트렙타비딘(Streptavidin) ELISA 미세적정 플레이트 상에 코팅된 MCSP 펩티드 아미노산 2177 내지 2221에 의해 결정하였다. 1:50,000의 최대 역가 반값을 갖는 마우스를 정맥내 부스트에 대해 선택하였다. 제4일에 정맥내 부스트를 수행한 후에, MCSP 펩티드(20 ㎍) 및 Colo38 세포를 사용하여 융합하였다. 정맥내 부스트를 수행한 후 3일 째, 지라세포를 수확하고, Ag8 골수종 세포와 융합하였다.
스크리닝 및 하이브리도마 특징
스트렙타비딘 미세적정 플레이트 상에 코팅된 MCSP-비오틴 펩티드 아미노산 2177 내지 2221(서열 번호 2)에 결합하는 항체를 식별함으로써 MCSP 특이적 항체를 위한 스크리닝을 개시하였다. 이어서, 고정화된 MCSP 펩티드에 결합하는 양성 클론을 혈청-미함유 배지(하이클론(Hyclone) ADCF-Mab; 써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 SH30349.02)에서 팽창시켰다.
높은 수준의 인간 MCSP를 천연적으로 과발현하는 Colo38 세포 상에서의 FACS 검정에 의하여 MCSP의 고유의 형태로의 결합을 수행하였다. 검출가능한 수준의 MCSP를 발현하지 않는 전립선 암종 세포주 PC3을 음성 대조군으로서 사용하였다. 리드(lead) 항체의 특이성을 추가로 특성화하기 위해, 키메라성 리드 항체(인간 Fc 발현)와 조합된 2중 염색에 대하여 확립된 상업용 항-MCSP 항체(인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.), 카탈로그 넘버 41-2000호, 클론 LHM2)를 사용하여 Colo38 세포 상에서 이중 면역세포화학 분석을 수행하였다. 면역형광 표지에 의해 알 수 있듯이, 하나의 항체, LC007은 Colo38 세포에서 MCSP 표면을 강하게 염색하였지만, 이는 PC3 세포 상에서 음성이었다.
실시예 2: 키메라화
항체 클론 LC007을 발현하는 하이브리도마 세포주로부터 mRNA를 단리하고, 상업적으로 입수가능한 키트를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 중쇄(서열 번호 39) 및 경쇄(서열 번호 38)를 위한 cDNA 단리물을 서열화하고, 각각의 구획을 카파 및 인간 IgG1의 불변성 영역에 융합시켰다.
HEK-EBNA 세포에서 인간 면역글로불린으로부터의 신호 펩티드를 사용하여 서열을 발현시키고, 종래의 단백질 A 및 크기 배재 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 정제하였다.
결합 활성을 하기 방법에 의해 결정하였다. 표적 세포를 세포 해리 완충액이 포함된 배양 플라스크로부터 분리하고, 계수하고, 생존력에 대해 검사하였다. 세포를 재현탁하고, PBS-0.1% BSA중 1.111 × lO6(생존가능함) 세포/㎖로 조정하였다. 이러한 현탁액(180 ㎕)을 환저 96-웰 플레이트에서 각각의 웰(웰당 200,000 세포)에 옮기고, 4분 동안 400 g에서 원심분리하고, 재현탁하였다. PBS-0.1% BSA(10 ㎍/㎖ 내지 0.002 ㎍/㎖)중 항체 희석액(20 ㎕)을 각각의 웰에 첨가하였다. 샘플을 4분 동안 400 g에서 원심분리하고, 재현탁하였다. 2차 항체인 FITC-접합된 어피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 프래그먼트 스페시픽(Fragment Specific)(잭슨 이뮤노 리써치 랩(Jackson Immuno Research Lab) # 109-096-098))을 첨가하고, 샘플을 4분 동안 400 g에서 원심분리하고, 재현탁하였다. 형광을 유세포분석기(예를 들어, FACS 칸토(Canto) II)에서 측정하였다. 적정 결과를 도 1 및 2에 제시하였다. 문헌[Morgan AC Jr, Galloway DR, Reisfeld RA. Hybridoma. 1981;1(1):27-36]에 기재된 항체 9.2.27(경쇄 및 중쇄 각각에 대한 유전자은행 수탁 번호: GI:20797193 및 GI:20797189)을 기준 항체로서 사용하였다(도 2). 인간 흑색종 세포주 Colo38, A2058, 및 A375를 사용하였다(문헌[Giacomini et al. 1985](Colo38에 대해); 문헌[Marquardt H, Todaro GJ. J Biol Chem. 1982 May 10;257(9):5220-5](A2058에 대해); 문헌[Geiser M, Schultz D, Le Cardinal A, Voshol H, Garcia-Echeverria C. Cancer Res. 1999 Feb 15;59(4):905-10](A375에 대해)).
실시예 3: MCSP 항원 상에서의 LC007 항체의 결합 에피토프의 결정
LC007 항체는 흑색종 세포 상에서 양호한 결합을 나타내었지만, 고유의 면역원 상에서 단지 약한 결합을 나타내었다. 따라서, 항원 상에서의 정확한 결합 부위를 결정하기 위해 항체 LC007의 에피토프 매핑을 실행하였다. 이를 위하여 MCSP 항원의 몇몇 개의 끝이 절단된 형태를 생성하였고, 각각은 CSPG 반복부로서 지칭되는 다양한 수의 인간 MCSP의 막 근위 반복 영역을 포함하였다(문헌[Staub E., et al., FEBS Lett. 527:114-118(2002)]).
구축물 1은 CSPG 반복부 15(서열 번호 4)를 포함하고, 구축물 2는 CSPG 반복부 14 및 15(서열 번호 5)를 포함하고, 구축물 3은 CSPG 반복부 13 내지 15(서열 번호 6)를 포함하고, 구축물 4는 CSPG 반복부 12 내지 15(서열 번호 7)를 포함하였다. 도 3은 MCSP의 CSPG 반복부-함유 구조물의 개략도를 제공한다. 이들 구축물은 고유의 막간 영역을 포함하고, FACS에 의한 LC007의 검출을 위한 HEK-EBNA 세포 상에서 발현하였다. 도 4는 이러한 실험의 결과를 도시한다. MCSP 반복부 15 및 천연 막간 도메인을 포함하는 구축물은 상당한 결합을 나타내지 않았다. 대조적으로, 도메인 14 및 15를 포함하는 모든 구축물은 상당한 결합을 나타내었다. 이로부터, 결합 에피토프는 반복부 14 내에 있거나, 단지 반복부 14가 존재할 경우 재구성되고, 또한 CSPG 반복부 및 막간 도메인 사이에 구조화되지 않은 영역 또는 반복부 15의 일부를 잠재적으로 포함함을 알 수 있었다.
실시예 4: 인간 및 사이노몰구스 항원과의 교차반응성에 대한 결정
사이노몰구스 항원에 대한 교차반응성을 시험하기 위해 사이노몰구스 MCSP 단백질의 C-말단 부분, 분비를 위한 신호 펩티드 및 N-말단 FLAG-태그(서열 번호 8)를 포함하는 발현 구축물을 생성하였다. 이러한 도메인을 D3 도메인으로 지칭하였다(문헌[Tillet, F. et. Al, J. Biol. Chem. 272: 10769-10776 (1997)]). 유사한 구축을 인간 대응물(서열 번호 9)을 위해 실행하였다. 이들 2가지 구축물을 암호화하는 발현 플라스미드를 HEK-EBNA 세포내로 전기천공하고, 발현을 항-FLAG 항체로 확인하였다. 이어서 LC007 항체의 결합을 유세포분석에 의해 시험하였다. 도 5는 상응하는 인간 발현 구축물에 대해서와 유사한 친화도로 사이노몰구스 구축물에 결합함을 보여준다.
실시예 5: 글리코 조작된 LC007 항체
GnT-III 글리코실전달효소 발현 벡터, 또는 GnT-III 발현 벡터 + 골지 만노시다제 II 발현 벡터와 함께 항체 발현 벡터의 공동-형질감염에 의해 LC007 항체의 글리코 조작된 변형체를 생산하였다.
실시예 6: 글리코 조작된 LC007 항체의 ADCC
ADCC 검정
상이한 농도의 글리코 조작된 LC007 항체 및 대조 항체 샘플의 존재하에 1:19의 표적:효과자 비로 37℃에서 16시간의 항온처리 동안 인간 림프구(효과자)에 의한 Colo38 인간 악성 흑색종 세포(표적)의 용해를 형광 염색의 보유를 통해 측정하였다(문헌[Kolber et al, 1988, J. Immunol. Methods 108: 255-264]). IMR-32 세포를 형광 염료 칼세린(Calcein) AM으로 20분 동안 표지하였다(최종 농도: 3.3 μM). 표지된 세포(80,000 세포/웰)를 1시간 동안 상이한 농도의 글리코 조작된 LC007 항체 및 대조 항체 샘플과 함께 항온처리하였다. 이어서, 단핵백혈구 결핍 단핵 세포를 첨가하고(1,500,000 세포/웰), 세포 혼합물을 16시간 동안 37℃에서 5% CO2 분위기하에 항온처리하였다. 상청액을 따라 버리고 세포를 HBSS로 1회 세척하고 트리톤(Triton) X-100(0.1%)에서 용해시켰다. Colo38 세포에서의 형광 염료의 보유를 형광강도 측정기(퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 루미네센스 스펙트로미터(Luminscence Spectrometer) LS 50B(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재))로 측정하고, 항체로의 노출 대신 세정제에 표적을 노출시켜 생성된 총 용해 대조군에 대하여 비용해(specific lysis)를 계산하였다. 항체의 부재하에서의 신호를 0% 세포독성으로 설정하였다. 각각의 항체 농도를 3중으로 분석하고, 검정을 3회의 별도의 시간에 반복하였다. 도 6에서 알 수 있듯이, 글리코 조작되지 않은 LC007 항체(LC007 wt)는 ADCC 효과를 나타내었다. 글리코 조작된 LC007 항체(LC007 g2)는 글리코 조작되지 않은 LC007에 비하여 증가된 ADCC를 나타내었다. 이와 같이, 글리코 조작되지 않은 LC007 항체 자체는 일부 ADCC 활성을 나타내는데, 이는 글리코 조작에 의해 추가로 증진될 수 있다. 대조적으로, 문헌[Buraggi G, et al. Int J Biol Markers. 1986 Jan-Apr;1(1):47-54)]에 기재된 항체 225.28S의 인간화된 형태인 항-MCSP 항체 MHLG KV9 G2는 이러한 검정에서 어떠한 상당한 ADCC 유도도 나타내지 않았다. 225.28 항체의 결합 에피토프는 MCSP 항원의 막 원위 부분 또는 N-말단 부분에 존재하는 것으로 결정되었다. Colo38 세포 상에 존재하지 않는, EGF 수용체에 결합하는 글리코 조작된 GA201 항체를 대조군으로서 포함하였다. 이러한 항체에 의한 ADCC의 부재는 NK 세포의 활성화가 종양 세포 상에 존재하는 표적을 통해 초래되어야 함을 보여주었다.
도 7은 글리코 조작된 LC007 항체의 ADCC가 인간 U86MG 교모 세포종 세포주에 대해 또한 관찰됨을 보여준다.
실시예 7: 글리코 조작된 LC007 항체의 인간화
인간화 절차를 고전적인 루프-그라프팅(loop-grafting) 절차에 따라 실행하였다(문헌[Jones PT, Dear PH, Foote J, Neuberger MS, Winter G. Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5]; [P. Carter et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; Vol. 89, pp. 4285-4289, May 1992]). 간략하게, 뮤린 항체의 CDR(서열 번호 10, 11, 12, 14, 15 및 16)을 인간 골격구조 서열 상으로 그라프팅하여(경쇄의 경우 IMGT 수탁 번호는 IGKV1D-39*01 및 IGKJ1이고, 중쇄의 경우 IMGT 수탁 번호는 IGHV4-31*02 및 IGHJ4임), 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 항체를 생성하였다.
표적 MCSP 항원에 대한 결합 친화도를 보유하도록 항체 구축물을 최적화하였다. 도 8은 상이한 인간화된 변형체의 결합 특성을 도시한다. 인간 잔기 Val71 및 Arg94를 각각 이들의 상응하는 뮤린 대응물, 아르기닌 및 아스파르트산으로 대체하였고, 이때 인간 잔기를 갖는 항체 구축물이 항원에 감소된 결합을 나타내는 것으로 결정되었다. 도 8에서 알 수 있듯이, 중쇄의 94 위치에서(카밧 번호매김)(서열 번호 30(이러한 서열에서 D98R에 상응함)) Arg을 갖는 구축물 M4-2 ML1, 및 중쇄의 위치 74에서(카밧 번호매김)(서열 번호 33(이러한 서열에서 R72V에 상응함)) Val을 갖는 구축물 M4-6 ML1은 MCSP 항원에 대해 감소된 결합을 보여주었고, 이는 항체의 결합 특이성에 대한 이들 잔기가 관련됨을 나타내었다. 이들 위치에서 각각 상응하는 뮤린 대응물, 아르기닌 및 아스파르트산을 갖는 구축물은 결합 활성을 보유하였고, 예를 들어 M4-1(서열 번호 29) 및 M4-3(서열 번호 32)의 중쇄 구축물을 갖는 항체이었다.
CDR-H1 잔기 Asn35를 상응하는 인간 생식-계열 세린 잔기에 대해 치환하였다. 도 8에서 알 수 있듯이, 이러한 치환을 갖는 구축물 M4-7 ML1(서열 번호 25)은 표적 MCSP 항원에 대한 결합이 감소되었고, 이는 이러한 잔기가 항원 결합 강도를 보유하는 것에 관여됨을 나타내었다.
추가의 구축물은 항-MCSP 항체의 결합 특성에 있어서의 다른 잔기들의 관련성을 나타내었다. HVR-L1(서열 번호 21)의 위치 7에서 아르기닌 잔기를 세린으로 대체한 결과 MCSP 항원에 대해 감소된 결합 활성을 나타내었다. HVR-L2(서열 번호 21)의 위치 1에서 아스파르트산 티로신을 아스파르트산으로 대체하고 위치 2에서 알라닌을 트레오닌으로 대체한 결과 MCSP 항원에 대한 결합 활성이 감소하였다.
실시예 8: 글리코 조작된 LC007 항체의 인간화된 변형체의 ADCC
Colo38 세포를 표적 세포로 사용하여 락테이트 탈수소효소에 의해 글리코 조작된 LC007 항체의 인간화된 변형체에 관한 ADCC 활성을 측정하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 효과자 세포로서 사용하였고, 이는 히스토파크(Histopaque)-1077(시그마 디애그노스틱스 인코포레이티드(Sigma Diagnostics Inc.), 미국 미주리주 63178 세인트 루이스 소재)을 사용하여 본질적으로 제조업체의 지시에 따라 제조하였다. 간략히, 헤파린화된 주사기에 의해 건강한 지원자로부터 정맥혈을 채취하였다. 혈액을 1:0.75 내지 1.3으로 PBS(Ca++ 또는 Mg++를 포함하지 않음)에 의해 희석시키고, 히스토파크-1077 상에서 적층시켰다. 구배물을 400 × g에서 30분 동안 실온(RT)에서 휴식없이 원심분리하였다. PBMC를 포함하는 내부상(interphase)을 수집하고 PBS로 세척하고(2회의 구배물로부터 세포당 50 ㎖), 300 × g에서 10분 동안 RT에서 원심분리하여 수거하였다. PBS에 의해 펠릿을 재현탁한 후, PBMC를 계수하고, 200 × g에서 10분 동안 RT에서 원심분리하여 2회 세척하였다. 이어서 세포를 후속적인 절차를 위해 적절한 배지에 재현탁하였다.
ADCC 검정을 위해 사용된 표적에 대한 효과자의 비율은 PBMC 및 NK 세포의 경우 각각 25:1 및 10:1이었다. 환저 96-웰 플레이트의 웰당 50 ㎕를 첨가하도록 효과자 세포를 AIM-V 배지에서 적절한 농도로 제조하였다. 표적 세포는 Colo30 세포였다. 표적 세포를 PBS에서 세척하고, 계수하고, 마이크로웰당 100 ㎕중 30,000 세포가 첨가되도록 AIM-V에 0.3 밀리온/㎖로 재현탁하였다. 항체를 AIM-V에 희석시키고, 미리-도말된 표적 세포에 50 ㎕로 첨가하고, 표적에 결합하도록 10분 동안 실온에 두었다. 이어서 효과자 세포를 첨가하고, 플레이트를 4시간 동안 37℃에서 5% CO2를 포함하는 습윤화된 분위기중에서 항온처리하였다. 세포 독성 검출 키트(로슈 디애그노스틱스(Roche Diagnostics), 스위스 로트크레우츠 소재)를 사용하여 손상된 세포로부터의 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출을 측정함으로써 표적 세포의 사멸을 평가하였다. 4시간 동안 항온처리한 후, 플레이트를 800 × g에서 원심분리하였다. 각각의 웰로부터의 상청액(100 ㎕)을 새로운 투명한 평저 96-웰 플레이트로 옮겼다. 키트로부터의 색 기질 완충액(100 ㎕)을 웰마다 첨가하였다. ELISA 판독기에서 490 nm에서 10분 이상 동안 SOFTmax PRO 소프트웨어(몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 94089 서니베일 소재)를 사용하여 색 반응의 V최대값을 결정하였다. 표적 및 효과자 세포를 포함하지만 항체를 포함하지 않는 웰로부터 자발적 LDH 방출을 측정하였다. 단지 표적 세포 및 1% 트리톤 X-100을 포함한 웰로부터 최대 방출을 결정하였다. 특이적 항체-중재된 사멸의 백분율을 다음과 같이 계산하였다: ((x-SR)/(MR-SR))×100, 여기서 x는 특이적 항체 농도에서의 V최대값의 평균이고, SR은 자발적 방출의 V최대값의 평균이고, MR은 최대 방출의 V최대값의 평균이다.
도 9는 이러한 검정의 결과를 도시하고, 인간화된 변형체가 모 글리코 조작된 LC007 항체의 ADCC 활성을 보유하였음을 확인한다.
실시예 6에 기재된 바와 같은 검정에 의해, 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 5 mM 보레이트 완충액을 사용하여 세척하고 세포 용해한 후, 칼세인 측정(왈락 빅터(Wallac Victor) 3 1420 멀티라벨 카운터(Multilabel Counter))에 의해 생존 표적 세포를 추가로 정량화하였다. 이러한 검정의 결과는 도 10에 제시되어 있다.
실시예 9: 마우스 이종이식 검정
9.1 FcgR3 형질감염 SCID 마우스에서의 MV3 세포
20 마리 FcgR3A tg SCID 마우스(프랑스 리옹 소재의 찰스 리버(Charles River)로부터 구매함)를 협정된 지침서(GV-솔라스(GV-Solas); 페라사(Felasa); 티에르쉬쥐(TierschG))에 따라 매일 12시간씩의 명암 주기를 갖는 단리된 통풍 케이지(IVC: Isolated Ventilated Cages) 조건하에 유지시켰다. 실험적 연구 프로토콜은 지방 정부에 의해 검토되고 승인되었다(P 2005086). 도착된 동물을 1주일 동안 새로운 환경 및 관찰에 익숙해지도록 유지시켰다. 연속적인 건강 모니터링을 정기적으로 실행하였다.
MV3 종양 세포주(문헌[van Muijen GN, et al., Int J Cancer. 48(1):85-91 (1991)])를 10% 태내 소 혈청(인비트로겐(Invitrogen), 스위스 소재)으로 보충된 DMEM 배지(깁코(GIBCO), 스위스 소재)에서 37℃에서 수-포화 분위기하에 5% CO2에서 통상적으로 배양하였다. 계대 배양을 3일마다 분할하여 트립신/ EDTA 1×(깁코, 스위스 소재)에 의해 수행하였다. 주사일에, 트립신-EDTA(깁코, 스위스 소재)를 사용하여 배양 플라스크(그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One))로부터 종양 세포를 수확하고, 배양 배지(50 ㎖)로 전달하고, AIM V(깁코, 스위스 소재)로 1회 세척하고 재현탁하였다. AIM V로 추가로 세척한 후, 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 결정하였다. AIM V 배지(200 ㎕)중 0.2 × 106 세포를 각각의 FcgR3A tg SCID 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다.
치료법
이종이식 마우스를 치료군 또는 비히클 대조군으로 나누었고, 각각의 군은 9마리의 마우스로 구성되었다. 치료군에게 25 mg/kg의 인간화된 글리코 조작된 항-MCSP mAb M4-3 ML2를 정맥내로 투여하였다. 비히클 대조군에게는 비히클만을 정맥내로 투여하였다. 양쪽 군 모두 제7일, 제14일 및 제21일에 3회 투약되었다.
로그-랭크(만텔-콕스(Mantel-Cox)) 시험(p=0.0033) 및 게한-브레스로우-윌콕손(Gehan-Breslow-Wilcoxon) 시험(p=0.0039)을 사용하여 치료로부터 수득된 데이터에 대해 통계적 분석을 수행하였다.
결과
도 11에 도시된 바와 같이, 인간화된 글리코 조작된 항-MCSP 항체는 비히클 대조군에 비하여 상기 모델에서 생존 시간을 상당히 증가시킨다.
9.2 FcgR3 형질감염 SCID 마우스에서의 MDA - MB -435 세포
MDA-MB435 세포를 근원적으로 ATCC로부터 수득하고, 팽창후 글리카트 내부 세포 은행에 기탁하였다. MDA-MB435 종양 세포주를 10% 태내 소 혈청(인비트로겐, 스위스 소재) 및 1% 글루타맥스(Glutamax)가 보충된 RPMI 배지(깁코, 스위스 소재) 중에서 37℃에서 수-포화 분위기하에 5% CO2에서 통상적으로 배양하였다. 계대 배양을 3일마다 분할하여 트립신/ EDTA 1×(깁코, 스위스 소재)에 의해 수행하였다.
FcgR3A tg SCID 마우스(프랑스 리옹 소재의 찰스 리버로부터 구매함)를 협정된 지침서(GV-솔라스; 페라사; 티에르쉬쥐)에 따라 매일 12시간씩의 명암 주기를 갖는 단리된 통풍 케이지(IVC) 조건하에 유지시켰다. 실험적 연구 프로토콜은 지방 정부에 의해 검토되고 승인되었다(P 2005086). 도착된 동물을 1주일 동안 새로운 환경 및 관찰에 익숙해지도록 유지시켰다. 연속적인 건강 모니터링을 정기적으로 실행하였다.
주사일에, 트립신-EDTA(깁코, 스위스 소재)를 사용하여 배양 플라스크(그라이너 바이오-원)로부터 종양 세포를 수확하고, 배양 배지(50 ㎖)로 전달하고, AIM V(깁코, 스위스 소재)로 1회 세척하고 재현탁하였다. AIM V로 추가로 세척한 후, 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 결정하였다. AIM V 배지(200 ㎕)중 0.2 × 106 세포를 각각의 FcgR3A tg SCID 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다.
치료법
이종이식 마우스를 치료군 또는 비히클 대조군으로 나누었다. 치료군에게 25 mg/kg의 키메라성 글리코 조작된 항-MCSP mAb를 정맥내로 투여하였다. 비히클 대조군에게는 비히클만을 정맥내로 투여하였다. 양쪽 군 모두 제7일, 제14일 및 제21일에 3회 투약되었다.
결과
도 12에 도시된 바와 같이, 키메라성 글리코 조작된 항-MCSP 항체는 비히클 대조군에 비하여 상기 모델에서 생존 시간을 상당히 증가시킨다.
9.3 FcgR3 형질감염 SCID 마우스에서의 MDA - MB -435 세포
인간화된 항체 M4-3 ML2(서열 번호 32의 VH 및 서열 번호 31의 VL을 포함함)를 그의 모, 키메라성 항체 LC007과 비교함을 제외하고 실시예 9.2에서와 동일한 프로토콜을 수행하였다. 이들 항체 둘다 글리코 조작되었다.
결과
도 13에 도시된 바와 같이, 모 키메라성 항체 LC007 및 이의 인간화된 글리코 조작된 변형체는 비히클 대조군에 비하여 상기 모델에서 생존 시간을 상당히 증가시킨다.
실시예 10: 항- MCSP 항체 M4 -3/ ML2 의 친화도 성숙
친화도 성숙을 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이생성 절차를 통해 수행하였다. 이 절차를 위해, 중쇄 변형체 M4-3 및 경쇄 변형체 ML2를 후겐붐(Hoogenboom)에 의해 기재된 것(문헌[Hoogenboom et al., Nucleo Acids Res. 1991, 19, 4133-4137])과 유사하게 파아지미드 벡터에 클로닝하였다. 무작위화될 잔기를, 먼저 종래의 상동성 모델링을 통한 항체의 3D 모델의 생성, 이어서 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR)의 용매 접근가능 잔기의 식별에 의해 식별하였다. 트라이뉴클레오티드 합성을 기초로 한 무작위화된 올리고뉴클레오티드를 엘라-바이오테크(Ella-biotech, 독일 뮌헨 소재)로부터 구매하였다. 3개의 독립적 하위라이브러리를 종래의 PCR을 통해 생성하고 CDR-H1 및 CDR-H2를 함께, 또는 CDR-L1 및 CDR-L2를 함께 무작위화함을 포함하고, CDR-L3을 별개의 접근법으로 무작위화하였다. 이들 라이브러리의 DNA 단편을 제한 분해 및 결찰을 통해 파아지미드에 클로닝한 후에, TG1 박테리아에 전기천공하였다.
라이브러리 선택
이에 따라 생성된 항체 변형체를 각각의 입자내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합으로서 사상 파아지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이하였다. 이어서, 파아지-디스플레이된 변형체를 그의 생물학적 활성(본 예에서 결합 친화도)에 대해 스크리닝하고, 개선된 활성을 갖는 후보자를 추가의 개발에 사용하였다. 파아지 디스플레이 라이브러리의 생산 방법은 문헌[Lee et al., J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093]에서 찾아볼 수 있다.
모든 친화도 성숙 라이브러리의선택을하기 절차에 따라 수행하였다: 1. 각각의 친화도 성숙 라이브러리의 약 1012개의 파아지미드 입자를 100 nM의 바이오틴일화된 hu-MCSP(D3 도메인)-avi-his에 0.5시간 동안 1 ml의 총부피로 결합하였다; 2. 5.4 × 107 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드를 10분 동안 첨가함으로써 바이오틴일화된 hu-MCSP(D3 도메인)-avi-his 및 특이적으로 결합된 파아지 입자를 포획하였다; 3. 5-10x PBS/트윈 20(1 ml) 및 5-10x PBS(1 ml)를 사용하여 비드를 세척하였다; 4. 100 mM TEA(트라이에틸아민)(1 ml)를 10분 동안 첨가함으로써 파아지 입자를 용리하고 1 M Tris/HCl(pH 7.4, 500 μl)을 첨가함으로써 중화시켰다; 5. 기하급수적으로 성장하는 이 콜라이 TG1 박테리아의 재감염을 수행하고, 보조 파아지 VCSM13으로 감염시킨 후에, 후속적 선택 라운드에 사용될 파아지미드 입자의 PEG/NaCl 침전을 수행하였다. 일정하거나 감소하는(10-7 M에서 2x10-9 M로) 항원 농도를 사용하여 선택을 3 내지 5 라운드에 걸쳐 수행하였다. 라운드 2에서, 스트렙타비딘 비드 대신에 뉴트라비딘 플레이트를 사용하여 항원:파아지 복합체의 포획을 수행하였다. 특이적 결합제를 ELISA에 의해 하기와 같이 식별하였다: 1개의 웰 당 100 μl의 10 nM 바이오틴일화된 hu-MCSP(D3 도메인)-avi-his를 뉴트라비딘 플리이트 상에 코팅하였다. Fab-함유 박테리아 상청액을 첨가하고, 결합 Fab를 그의 플래그-태그를 통해 항-Flag/HRP 2차 항체를 사용하여 검출하였다. ELISA-양성 클론은 96-웰 포맷에서 가용성 Fab 단편으로서 박테리아 발현되고, 상청액을 프로테온(ProteOn) XPR36(바이로라드(BioRad))을 사용하는 SPR 검정에 의한 운동 스크리닝 실험을 수행시켰다. 가장 높은 친화도 상수를 갖는 Fab 발현 클론을 식별하고, 상응하는 파아지미드를 서열화하였다.
도 14는 성숙되지 않은 모 클론(M4-3 ML2)과 비교한 친화도 성숙된 항-MCSP 클론의 정렬을 도시한다. 중쇄 무작위화를 CDR1 및 2에서만 수행하였다. 경쇄 무작위화를 CDR1 및 2, 및 독립적으로 CDR3에서 수행하였다. 선택 동안, 클론 G3의 F71Y 또는 클론 E10의 Y87H에서와 같이 골격구조에서 조금의 돌연변이가 발생하였다.
인간 IgG 1 의 제조 및 정제
친화도 성숙된 변형체의 중쇄 및 경쇄 DNA 서열의 가변성 영역을 각각의 수용자 포유동물 발현 백터에 사전 삽입된 불변성 중쇄 또는 불변성 경쇄를 골격으로 아클로닝하였다. 항체 발현은 MPSV 촉진자에 의해 분할되고 CDS의 3' 말단에서 합성 폴리A 신호 서열을 전달하였다. 또한, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 함유하였다.
폴리에틸렌이민을 사용하여 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공동-형질감염시켜 분자를 제조하였다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 1:1 비로 형질감염시켰다. 형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를 현탁액 혈청 미함유 CD CHO 배양 배지에서 배양하였다. 제조를 위해, 500 ml의 진탕 플라스크에서, 4억개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5분 동안 210 x g에 의해 원심분리하고, 상청액을 사전 가온된 CD CHO 배지(20 ml)로 대체하였다. 발현 백터를 CD CHO 배지(20 ml)에서 DNA(200 μg의 최종양)와 혼합하였다. PEI(540 μl)의 첨가 후에, 용액을 15초 동안 와류시키고, 이어서 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합한 후에, 500 ml 진탕 플라스크에 옮기고 3시간 동안 37℃에서 5 % CO2 분위기를 갖는 항온기에서 항온처리하였다. 항온처리 기간 후에, F17 배지(160 ml)를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 1 mM의 발포르산 및 7 % 공급물 1을 첨가하였다. 7일의 배양 후에, 상청액을 수집하여 15분 동안 210 x g에서 원심분리에 의해 정제하고, 용액을 멸균 여과(0.22 μm 필터)하고, 0.01 % w/v의 최종 농도의 나트륨 아지드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.
분비 단백질을 세포 배양 상청액으로부터 단백질A를 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상청액을 20 mM 인산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨 및 0.5 M 염화 나트륨(pH 7.5, 40 ml)과 평형을 이루는 하이트랩(HiTrap) 단백질A HP 컬럼(CV=5 mL, 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)) 상에 적재하였다. 미결합된 단백질을 10 이상의 컬럼 부피의 20 mM 인산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨 및 0.5 M 염화 나트륨(pH 7.5)으로 세척함으로써 제거하였다. 표적 단백질을 20의 컬럼 부피에 걸쳐 20 mM 시트르산 나트륨 및 0.5 M 염화 나트륨(pH 7.5)에서 20 mM 시트르산 나트륨 및 0.5 M 염화 나트륨(pH 2.5)으로 구배동안 용리하였다. 단백질 용액을 1/10의 0.5 M 인산 나트륨(pH 8)의 첨가에 의해 중화시켰다. 표적 단백질을 농축하고 여과한 후에 20 mM 히스티딘 및 140 mM 염화 나트륨의 용액(pH 6.0)과 평형을 이루는 하이로드 슈퍼덱스(HiLoad Superdex) 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하였다.
정제된 단백질 샘플의 단밸질 농도를 아미노산 서열을 기반으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 결정하였다. 분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 및 부재하에 CE-SDS 검정에 의해 검정하였다. 캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII 시스템(캘리퍼 라이프사이언스(Caliper lifescience))을 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 샘플(2 μg)을 검정에 사용하였다. 항체 샘플의 집합체 함유량을 25℃에서 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 일염산염, 0.02 %(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충제에서 TSKgel G3000 SW XL 분석적 크기 배재 컬럼(토소(Tosoh))을 사용하여 검정하였다. 데이터를 하기 표 2에 나타냈다.
[표 2]
친화도 성숙된 항-MCSP IgG의 제조 및 정제
Figure pct00002

비아코어 T200 를 사용하는 표면 플라스몬 공명( SPR )에 의한 친화도 결정
친화도 성숙된 IgG의 친화도를 결정하기 위한 표면 플라스몬 공명(SPR) 실험을 25℃에서 러닝 완충제로서 HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 비아코어 T200 상에서 수행하였다.
IgG를 고정된 항-인간 Fab를 갖는 CM5 센서칩 표면 상에 포획하였다. 포획 IgG를 표준 아민 커플링 키트(비아코어, 독일 프라이부르크 소재)를 사용하여 pH 5.0에서 약 10,000의 공명 단위(RU)의 직접 고정화에 의해 센서칩 표면에 커플링하였다. IgG를 60초 동안 30 nM에서 10 μl/분으로 포획하였다. 인간 및 사이노몰구스 MCSP D3을 180초에 걸쳐 유동 셀을 통하여 30 μl/분의 유속으로 0.49 내지 1000 nM의 농도로 통과시켰다. 해리를 210초 동안 모니터링하였다. 벌크 굴절율 차이를 기준 유동 셀에 대해 수득된 응답을 뺌으로써 정정하였다. 이때, 항원은 고정된 항-인간 Fab 항체를 갖는 표면에서 유동하였으나, 이 위에 항-MCSP IgG 대신에 HBS-EP를 주입하였다.
속도 상수를 수치 적분법에 의해 1:1 랑뮤 결합에 대한 반응 속도식을 정합하는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(vAA, 비아코어 AB, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용하여 유도하였다.
하기 표 3에 나타낸 데이터로 친화도 성숙된 변형체에 의한 인간 및 사이노몰구스 MCSP D3에 대한 더 높은 친화도를 확인하였다.
[표 3]
인간 MCSP-D3 및 사이노몰구스 MCSP D3에 대한 항-MCSP IgG의 친화도
Figure pct00003

[표 A]
서열 목록 설명
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006

상기 발명이 이해를 분명히 할 목적으로 예시 및 실시예에 의해 상세히 설명되었지만, 설명 및 실시예는 본 발명의 범주를 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 언급된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 이들의 전체가 참고로 명백히 인용되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Roche Glycart AG <120> Anti-MCSP Antibodies <130> 31483 <140> PCT/EP2014/053495 <141> 2014-02-24 <150> EP 13156675.4 <151> 2013-02-26 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2322 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ser Gly Pro Arg Pro Pro Leu Pro Ala Pro Gly Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Leu Thr Leu Thr Met Leu Ala Arg Leu Ala Ser Ala Ala Ser Phe 20 25 30 Phe Gly Glu Asn His Leu Glu Val Pro Val Ala Thr Ala Leu Thr Asp 35 40 45 Ile Asp Leu Gln Leu Gln Phe Ser Thr Ser Gln Pro Glu Ala Leu Leu 50 55 60 Leu Leu Ala Ala Gly Pro Ala Asp His Leu Leu Leu Gln Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Gly Arg Leu Gln Val Arg Leu Val Leu Gly Gln Glu Glu Leu Arg Leu 85 90 95 Gln Thr Pro Ala Glu Thr Leu Leu Ser Asp Ser Ile Pro His Thr Val 100 105 110 Val Leu Thr Val Val Glu Gly Trp Ala Thr Leu Ser Val Asp Gly Phe 115 120 125 Leu Asn Ala Ser Ser Ala Val Pro Gly Ala Pro Leu Glu Val Pro Tyr 130 135 140 Gly Leu Phe Val Gly Gly Thr Gly Thr Leu Gly Leu Pro Tyr Leu Arg 145 150 155 160 Gly Thr Ser Arg Pro Leu Arg Gly Cys Leu His Ala Ala Thr Leu Asn 165 170 175 Gly Arg Ser Leu Leu Arg Pro Leu Thr Pro Asp Val His Glu Gly Cys 180 185 190 Ala Glu Glu Phe Ser Ala Ser Asp Asp Val Ala Leu Gly Phe Ser Gly 195 200 205 Pro His Ser Leu Ala Ala Phe Pro Ala Trp Gly Thr Gln Asp Glu Gly 210 215 220 Thr Leu Glu Phe Thr Leu Thr Thr Gln Ser Arg Gln Ala Pro Leu Ala 225 230 235 240 Phe Gln Ala Gly Gly Arg Arg Gly Asp Phe Ile Tyr Val Asp Ile Phe 245 250 255 Glu Gly His Leu Arg Ala Val Val Glu Lys Gly Gln Gly Thr Val Leu 260 265 270 Leu His Asn Ser Val Pro Val Ala Asp Gly Gln Pro His Glu Val Ser 275 280 285 Val His Ile Asn Ala His Arg Leu Glu Ile Ser Val Asp Gln Tyr Pro 290 295 300 Thr His Thr Ser Asn Arg Gly Val Leu Ser Tyr Leu Glu Pro Arg Gly 305 310 315 320 Ser Leu Leu Leu Gly Gly Leu Asp Ala Glu Ala Ser Arg His Leu Gln 325 330 335 Glu His Arg Leu Gly Leu Thr Pro Glu Ala Thr Asn Ala Ser Leu Leu 340 345 350 Gly Cys Met Glu Asp Leu Ser Val Asn Gly Gln Arg Arg Gly Leu Arg 355 360 365 Glu Ala Leu Leu Thr Arg Asn Met Ala Ala Gly Cys Arg Leu Glu Glu 370 375 380 Glu Glu Tyr Glu Asp Asp Ala Tyr Gly His Tyr Glu Ala Phe Ser Thr 385 390 395 400 Leu Ala Pro Glu Ala Trp Pro Ala Met Glu Leu Pro Glu Pro Cys Val 405 410 415 Pro Glu Pro Gly Leu Pro Pro Val Phe Ala Asn Phe Thr Gln Leu Leu 420 425 430 Thr Ile Ser Pro Leu Val Val Ala Glu Gly Gly Thr Ala Trp Leu Glu 435 440 445 Trp Arg His Val Gln Pro Thr Leu Asp Leu Met Glu Ala Glu Leu Arg 450 455 460 Lys Ser Gln Val Leu Phe Ser Val Thr Arg Gly Ala Arg His Gly Glu 465 470 475 480 Leu Glu Leu Asp Ile Pro Gly Ala Gln Ala Arg Lys Met Phe Thr Leu 485 490 495 Leu Asp Val Val Asn Arg Lys Ala Arg Phe Ile His Asp Gly Ser Glu 500 505 510 Asp Thr Ser Asp Gln Leu Val Leu Glu Val Ser Val Thr Ala Arg Val 515 520 525 Pro Met Pro Ser Cys Leu Arg Arg Gly Gln Thr Tyr Leu Leu Pro Ile 530 535 540 Gln Val Asn Pro Val Asn Asp Pro Pro His Ile Ile Phe Pro His Gly 545 550 555 560 Ser Leu Met Val Ile Leu Glu His Thr Gln Lys Pro Leu Gly Pro Glu 565 570 575 Val 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ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcattaga aattatttaa actggtatca gcagagacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccttggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324 <210> 39 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LC007 Murine Antibody Heavy Chain <400> 39 gaggtccagc tgcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60 acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaagctgga atggatgggc tacataacct acgacggtag caataactac 180 aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240 ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagctacat attactgtgc ggactttgac 300 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctcagcc 339 <210> 40 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LC007 Chimeric Antibody Light Chain <400> 40 gatattgtgc tcacacagtc tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcattaga aattatttaa actggtatca gcagagacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccttggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 41 <211> 1329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LC007 Chimeric Antibody Heavy Chain <400> 41 gaggtccagc tgcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60 acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaagctgga atggatgggc tacataacct acgacggtag caataactac 180 aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240 ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagctacat attactgtgc ggactttgac 300 tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc 360 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 420 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 480 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 540 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 600 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 660 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 720 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 780 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 840 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 900 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 960 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1020 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1080 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1140 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1200 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1260 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1320 ggtaaatga 1329 <210> 42 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LC007 Humanized Antibody ML2 Light Chain <400> 42 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgcc gggccagcca gggcatccgg aactacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accagcagcc tgcacagcgg cgtgcctagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccattagctc cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcaagc tgccctggac cttcggccag 300 ggaacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 43 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LC007 Humanized Antibody M4-3 Heavy Chain <400> 43 caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtcaagc ccagccagac cctgagcctg 60 acctgcaccg tgtccggcgg cagcatcacc agcggctact actggaactg gatccggcag 120 caccccggca agggcctgga atggatcggc tacatcacct acgacggcag caacaactac 180 aaccccagcc tgaagtccag agtgaccatc agccgggaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctgt ccagcgtgac agccgccgac accgccgtgt actactgcgc cgacttcgac 300 tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtg tccagc 336 <210> 44 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Val Ile Ile Pro Met Cys Leu Val Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Leu 1 5 10 15 Pro Leu Leu Phe Tyr 20 <210> 45 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M4-3 (C1) Heavy chain <400> 45 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn 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Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 46 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ML2 (G3) Light chain <400> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 47 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M4-3 (C1) VH <400> 47 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H1 <400> 48 Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H2 <400> 49 Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 50 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H3 <400> 50 Phe Asp Tyr 1 <210> 51 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ML2 (G3) VL <400> 51 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L1 <400> 52 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L2 <400> 53 Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L3 <400> 54 Gln Gln Tyr Ser Ala Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 55 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M4-3 (D6) VH <400> 55 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Lys Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H2 <400> 56 Ile Thr Phe Asp Gly Lys Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 57 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M4-3 (A7) VH <400> 57 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Asp Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H1 <400> 58 Asp Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H2 <400> 59 Ile Thr Phe Asp Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 60 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M4-3 (B7) VH <400> 60 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Ile Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H2 <400> 61 Ile Thr Phe Asp Gly Ile Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 62 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M4-3 (B8) VH <400> 62 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 63 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ML2 (E10) VL <400> 63 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Tyr Gly Ile Arg Gly Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L1 <400> 64 Arg Ala Ser Tyr Gly Ile Arg Gly Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L3 <400> 65 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 66 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ML2 (E10-G3) VL <400> 66 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Tyr Gly Ile Arg Gly Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 67 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ML2 (C5) VL <400> 67 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Gly Ile Arg Glu Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Glu Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L1 <400> 68 Arg Ala Ser Arg Gly Ile Arg Glu Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L2 <400> 69 Tyr Thr Gly Ser Leu His Ser 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L3 <400> 70 Gln Gln Tyr Ser Glu Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 71 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ML2 (C5-G3) VL <400> 71 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Gly Ile Arg Glu Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (41)

  1. CSPG 반복부-함유 도메인을 포함하는 인간 MCSP의 막 근위 에피토프에 결합하되, 5x10-9 M 이하의 Kd로 MCSP에 결합하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    2x10-9 M 이하의 Kd로 MCSP에 결합하는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    CSPG 반복부-함유 도메인이 CSPG 반복부 14(서열 번호 3)를 포함하는, 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이적인 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    scFv 단편, Fv 단편 또는 F(ab')2 단편인 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라성 항체인 항체.
  7. 제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역을 포함하는 항체.
  8. 제7항에 있어서,
    전장 IgG 부류 항체인 항체.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    글리코 조작되어 Fc 영역의 올리고당을 개질하는 항체.
  10. 제9항에 있어서,
    Fc 영역이 글리코 조작되지 않은 항체에 비하여 감소된 수의 푸코스 잔기를 갖는 항체.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    글리코 조작되지 않은 항체에 비하여 Fc 영역에서 증가된 GlcNAc 잔기 대 푸코스 잔기의 비를 갖는 항체.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역이 글리코 조작되지 않은 항체에 비하여 증가된 비율의 이등분된 올리고당을 갖는, 항체.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역이 글리코 조작되지 않은 항체에 비하여 증가된 비율의 이등분된 올리고당을 갖는, 항체.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    글리코 조작되지 않은 항체에 비하여 증가된 효과자 기능을 갖는 항체.
  15. 제14항에 있어서,
    효과자 기능이 증가된 항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC) 활성인, 항체.
  16. 제14항에 있어서,
    효과자 기능이 Fc 수용체에 대한 증가된 결합 친화도인, 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열 번호 48 및 서열 번호 58로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 49, 서열 번호 56, 서열 번호 59 및 서열 번호 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 52, 서열 번호 64 및 서열 번호 68로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 53 및 서열 번호 69로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 54, 서열 번호 65 및 서열 번호 70으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
  18. 제17항에 있어서,
    (a) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    (a) 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열 번호 47의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 번호 51의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함하는 항체.
  21. 제20항에 있어서,
    서열 번호 47의 VH 서열을 포함하는 항체.
  22. 제20항에 있어서,
    서열 번호 51의 VL 서열을 포함하는 항체.
  23. 제20항에 있어서,
    서열 번호 47의 VH 서열 및 서열 번호 51의 VL 서열을 포함하는 항체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
  25. 제24항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  26. 제25항의 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법.
  27. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제27항에 따른 면역접합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형.
  29. 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제27항에 따른 면역접합체 또는 제28항에 따른 약학 제형.
  30. 암을 치료하기 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제27항에 따른 면역접합체 또는 제28항에 따른 약학 제형의 용도.
  31. 제30항에 있어서,
    암이 MCSP를 발현하는 암인, 용도.
  32. 제31항에 있어서,
    암이 피부암(흑색종 및 기저 세포 암종 포함), 신경교종(교모 세포종 포함), 골암(예컨대 골육종) 및 백혈병(ALL 및 AML 포함)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
  33. 세포 용해를 유도하기 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제27항에 따른 면역접합체 또는 제28항에 따른 약학 제형의 용도.
  34. 약제의 제조에서 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제27항에 따른 면역접합체 또는 제28항에 따른 약학 제형의 용도.
  35. 제34항에 있어서,
    약제가 암의 치료를 위한 것인, 용도.
  36. 제34항에 있어서,
    약제가 세포 용해의 유도를 위한 것인, 용도.
  37. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제27항에 따른 면역접합체 또는 제28항에 따른 약학 제형의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓고 있는 개체의 치료 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    암이 MCSP를 발현하는 암인, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    암이 피부암(흑색종 및 기저 세포 암종 포함), 신경교종(교모 세포종 포함), 골암(예컨대 골육종) 및 백혈병(ALL 및 AML 포함)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  40. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제27항에 따른 면역접합체 또는 제28항에 따른 약학 제형의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 세포 용해의 유도 방법.
  41. 상기에 기재된 바와 같은 발명.
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