JP4559358B2 - コケ細胞における異種グリコシル化タンパク質の産生 - Google Patents
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Description
i)内因性フコース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第1の核酸配列を含んでなる第1の単離された核酸を前記細胞に導入すること;および
ii)内因性キシロース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第2の核酸配列を前記細胞に導入すること;および
iii)コケ細胞において発現を駆動する外因性プロモーターに操作可能に連結された核酸を含んでなる第3の単離された核酸配列を前記細胞に導入することであって、ここで、前記核酸は少なくとも1つの哺乳動物ガラクトース転移酵素ポリペプチドをコードする、
を含んでなる上記方法が提供される。
方法および材料
植物材料
レスキ(Reski)ら(1994)Genome analysis of the moss Physcomitrella patens(Hedw.)B.S.G..Mol Gen Genet 244,352−359によって特徴付けられたヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens) (Hedw.) B.S.G.の野生型株を使用した。該株は、英国、ハンティンドンシャー、グランスデン・ウッド(Gransden Wood,Huntingdonshire,UK)のH.L.K.ホワイトハウス(H.L.K.Whitehouse)によって回収され、エンゲル(Engel)(1968)Am J Bot55,438−446によって、増殖された株16/14の継代培養物であった。
リーダー配列を伴わないヒト血管内皮増殖因子121(VEGF121)cDNAを、pCYTEXP−VEGF121(GBF、独国ブラウンシュバイク(Braunschweig,Germany)より入手可能)からNdeI−SalIフラグメントとして切り出した。このフラグメントを、クレノウ(Klenow)反応により平滑末端化し、SmaI制限部位でpRT101(トファー(Toepfer)ら(1987)NAR 15,589)に導入して、プラスミドpRT101VEGF C3を形成した。この構築物では、リーダー配列を伴わないVEGF121cDNAをCaMV35Sプロモーターの下流に配置し、CaMVターミネーター(ゴル(Gorr)(1999)Biotechnologische Nutzung von Physcomitrella patens (Hedw.)B.S.G..Ph.D.thesis,Hamburg University)で終結させた。
VEGFシグナルペプチド(分泌のためのソーティングシグナル)の配列を、pRT101VEGF C3にクローニングした。XhoI制限部位含有する5'プライマーMoB323 5'−ATA CTC GAG GAA GAT GAA CTT TTC TGC CTG TCT TGG−3'(配列番号1)およびNcoI制限部位を含有する3'プライマーMoB349 5'−CTG CCA TGG GTG CAG CCT GGG ACC AC−3'(配列番号 2)を使用して、プラスミドpRT101P21(ゴル(Gorr)(1999)、上掲)からシグナルペプチドcDNAを増幅した。増幅されたDNAをXhoIおよびNcoIで消化し、pRT101VEGF C3(XhoI/NcoI消化)に連結して、pRT101TPVEGF C3を得た。得られたプラスミドは、VEGFシグナルペプチドおよびCaMV35Sプロモーターの制御下でフレーム内にVEGF121のコーディング配列を含有した。
植物は、植物用無機液体改変クノップ(Knop)培地(1000mg/l Ca(NO3)2×4H2O 250mg/l KCl、250mg/l KH2PO4、250mg/l MgSO4×7H2Oおよび12.5mg/l FeSO4×7H2O;pH5.8(レスキ(Reski)およびアベル(Abel)(1985)Planta 165,354−358)において、滅菌条件下で、無菌的に培養した。植物を、200mlの培養培地を含有する500mlの三角フラスコ中で増殖させ、フラスコを、120rpmに設定したセルトマット(Certomat)Rシェーカー(B.ブラウン(B.Braun)Biotech International、独国(Germany))上で振盪させた。増殖チャンバの条件25+/−3℃および16:8の明暗リズムであった。フラスコは、35micromols−1m−2を提供する2本の蛍光管(オスラム(Osram)L 58W/25)で上方から光照射した。培養物を、ウルトラ−ツラックス(Ultra−Turrax)ホモジナイザー(IKA、独国スタウフェン(Staufen,Germany))を使用する破壊および100 mlの新鮮クノップ(Knop)培地を含有する2つの新たな500mlの三角フラスコへの播種により、1週間に1回継代培養した。
ろ過後、コケ糸状体を0.5Mマンニトール中でプレインキュベートした。30分後、4%ドリセラーゼ(Driselase)(シグマ(Sigma)、独国ディゼンフォフェン(Deisenhofen,Germany))を懸濁液に添加した。0.5Mマンニトール(pH5.6〜5.8)中にドリセラーゼ(Driselase)を溶解し、3600rpmで10分間、遠心分離し、0.22ミクロンフィルター(ミレックス(Millex)GP、ミリポア・コーポレーション(Millipore Corporation)、米国(USA))への通過によって滅菌した。1%ドリセラーゼ(Driselase)(最終濃度)を含有する懸濁液を、暗所、RTでインキュベートし、緩徐に撹拌した(2時間のインキュベーション後、最良の収率のプロトプラストが達成される)(スケファー(Schaefer)、「Principles and protocols for the moss Physcomitrella patens」(2001年5月)インスティテュート・オブ・エコロジー(Institute of Ecology)、ラボラトリー・オブ・プラント・セル・ジェネティクス(Laboratory of Plant Cell Genetics)、ユニバーシティー・オブ・ローザンヌ(University of Lausanne)Didier.Schaefer@ie−pc.unil.ch)。懸濁液を、100ミクロンおよび50ミクロンのポアサイズの篩(ウィルソン(Wilson)、CLF、独国(Germany))に通過させた。懸濁液を滅菌遠心管中で遠心分離し、プロトプラストを、RT、10分間、55gで沈殿させた(3の加速;3で減速;マルチヒュージ(Multifuge)3S−R、独国ケンドロ(Kendro,Germany))(スケファー(Schaefer)、上掲)。プロトプラストをW5培地(125mM CaCl2×2H2O;137mM NaCl;5.5mMグルコース;10mM KCl;pH5.6;660〜680mOsm;滅菌ろ過)に緩徐に再懸濁した。懸濁液を、再度、RT、10分間、55gで遠心分離した(3の加速;3で減速;マルチヒュージ(Multifuge)3S−R、独国ケンドロ(Kendro,Germany))。プロトプラストをW5培地に緩徐に再懸濁した(ロザラ(Rother)ら(1994)J Plant Physiol 143,72−77)。プロトプラストを計数し、小容積の懸濁液をフックスローゼンタール(Fuchs−Rosenthal)チャンバに移した。
形質転換のために、プロトプラストを、氷上、暗所で30分間、インキュベートした。続いて、RT、10分間、55gの遠心分離によって、プロトプラストを沈殿させた(3の加速;3で減速;マルチヒュージ(Multifuge)3S−R、ケンドロ(Kendro))。プロトプラストを、3M培地(15mM CaCl2×2H2O;0.1%MES;0.48Mマンニトール;pH5.6;540mOsm;滅菌ろ過、スケファー(Schaefer)ら(1991)Mol Gen Genet 226,418−424)に、1.2×106プロトプラスト/mlの濃度で再懸濁した(ロイター(Reutter)およびレスキ(Reski)(1996)Production of a heterologous protein in bioreactor cultures of fully differentiated moss plants,Pl.Tissue culture and Biotech.,2,142〜147頁)。このプロトプラスト懸濁液の250マイクロリットルを新しい滅菌遠心管に分配し、50マイクロリットルのDNA溶液(H2O中カラム精製DNA(キアゲン(Qiagen)、独国ヒルデン(Hilden,Germany);10〜100マイクロリットル;60マイクログラムの至適DNA量)を添加し、最後に、250マイクロリットルのPEG−溶液(40%PEG4000;0.4Mマンニトール;0.1MCa(NO3)2;オートクレイブ後pH6)を添加した。懸濁液を直ちに、しかし緩徐に混合し、次いで、6分間RTで、時々緩徐にかき混ぜながらインキュベートした。1、2、3および4mlの3M培地を添加することによって、懸濁液を漸次希釈した。懸濁液を、20℃、10分間、55gで遠心分離した(3の加速;3で減速;マルチヒュージ(Multifuge)3S−R、ケンドロ(Kendro))。
a)300マイクロリットルまたは400マイクロリットル3M培地における一過性形質転換実験のため。形質転換されたプロトプラストの培養を96ウェルプレート(300マイクロリットル、ヌンクロン(Nunclon)、ヌンク(Nunc)GmbH、独国ビースバーデン(Wiesbaden,Germany))または48ウェルプレート(400マイクロリットル、セルスター(Cellstar)、greiner bio−one、独国フリッケンハオゼン(Frickenhausen,Germany))で実施した;
b)3mlの再生培地(改変クノップ(Knop)培地;5%グルコース;3%マンニトール;540mOsm;pH5.6〜5.8)における安定形質転換のため。再生および選択は、ストレップ(Strepp)ら(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95,4368−4373により記載の通りに実施した。選択のために、クノップ(Knop)培地を、50マイクログラム/mlのG418または30マイクログラム/mlのハイグロマイシンBで補充した。
植物材料を液体培養中で培養し、ろ過によって単離し、液体窒素中で凍結し、−80℃で保存した。タンパク質のバンドを、クマシー染色SDSポリアクリルアミドゲルから切り出した。材料をドライアイス下で搬送した。Prof.Dr.F.アルトマン(F.Altmann)、Glycobiology Division,Institut fuer Chemie,Universitaet fuer Bodenkultur、オーストリア、ウィーン(Vienna,Austria)の研究所において、MALDI−TOF MS解析を行った。
合成オリゴヌクレオチドの設計のために、ヌクレオチドに対する標準的なコードを使用した。変性プライマーの設計のために、標準的なコードを使用した:
R=A、G;Y=T、C;W=A、T;S=C、G;M=A、C;K=G、T;H=A、T、C;B=G、C、T;V=G、A、C;D=G、A、T;N=G、A、C、T
1.1 GNTIのcDNAおよびゲノムDNAのクローニング
ヒメツリガネゴケ(P.patens)WT由来のcDNAに対して変性プライマーによる2ラウンドのPCRを実施することによって、GNTIに対するcDNAのフラグメントを得た。これらのプライマーは、植物由来の既知のGNTIのタンパク質アラインメントに基づいて作製した。第1ラウンドでは、プライマーGNT(d)1(5'−GTNGCNGCNGTNGTNGTNATGGC−3'、配列番号3)およびGTN(d)3(5'−CCYTTRTANGCNGCNC(TG)NGGNACNCC−3'、配列番号4)を使用し、次いで、このPCRからの産物を、プライマーGTN(d)2(5'−TAYAARATN(CA)GN−CAYTAYAARTGG−3'、配列番号5)およびGTN(d)4(5'−ARRTAYTGYTTRAARAA−YTGNCC−3'、配列番号6)による以後のPCRに供した。PCRは、500bpの産物を生じ、これをpCR4TOPOにクローニングして、両末端から配列決定した。
ノックアウト構築物を作製するために、構築物の5'末端に対するプライマー:GNTHT7(5'−GAGCATCCAAGCTTGACCTGG−3'、配列番号19)およびGNTET7(5'−GCACCGTGAATTCTTCTAGCTT−3'、配列番号20)ならびに対応する3'末端に対するプライマーGNTHT3(5'−GGAAGAACAAGCTTCAAAGTGGC−3'、配列番号21)およびGNTPT3(5'−GATCCCTGCAGATCTCAAACG−3'、配列番号22)によるゲノムDNAに対するPCRによって、2つのフラグメントを合成した。このようにして得られたゲノムDNAの469bpおよび835bpのフラグメントを、まず、TOPO−pCRプラスミド(インビトロゲン(Invitrogen)、米国(USA))にクローニングした。次いで、それぞれEcoRI/HindIIIおよびPstI/HindIIIによって、このベクターからフラグメントを切り出し、EcoRIおよびPstIで消化したpCRIIベクターにクローニングした。得られたプラスミドを、HindIIIで消化し、同じ制限酵素での消化によってベクターpRT101neo(ギルケ(Girke)ら、1998)から得たnptII選択カセットを導入した。
耐性植物のプレスクリーニングのために、茎葉体の小片(1〜5mg)を30分間、45℃、20mM(NH4)2SO4および0.1%ツイーン(Tween)20を含有する75mM Tris−HCl、pH8中で処理し、3マイクロリットルのこの抽出物を、以下の4対のプライマーによるPCRに使用した:本来のgntI遺伝子の破壊を検出するためのGNT7F(5'−GTTCSATGGTTTGAGCAGG−3'、配列番号23)およびGNT8R(5'−GCGACCTTTCCTATTCTCC−3'、配列番号24)、nptIIカセットの存在を検出するためのN1(5'−TACCGACAGTGGTCCCAAAG−3'、配列番号25)およびN2(5'−CCACCATGATATTCGGCAAG−3'、配列番号26)、5'末端での導入遺伝子の組み込みを制御するためのGNT5F(5'−TGGGCTTTAACACAACTTTT−3'、配列番号27)およびN3(5'−TGTCGTGCTCCACCATGTT−3'、配列番号28)、ならびに3'末端での組み込みを制御するためのN4(5'−GTTGAGCATATAAGAAAC−3'、配列番号29)およびGNT10R(5'−CACATTGTTCAATTTGATAGAC−3'、配列番号30)。すべての4つのPCR反応において予想されるフラグメントを付与する植物は推定ノックアウトとみなし、さらなる解析のために選択した。
RNeasyキット(キアゲン(Qiagen)、独国(Germany))により、コケ組織から全RNAを単離した。ノーザン解析のために、5マイクログラムの全RNAを、120Vでホルムアルデヒド−アガロース上での電気泳動に供し、ハイボンドN(Hybond−N)ナイロンメンブレン(アメルシャム・バイオサイエンシズ(Amersham Biosciences))に移し、ノックアウトに使用される相同領域の部分およびノックアウト構築物上には存在しないcDNAの部分を含む3'gntIcDNAに対応する32P標識cDNAとハイブリダイズさせた。メンブレンを、異なる濃度のSSCで4回洗浄(最終洗浄工程は、65℃での0.5×SSC、0.1%SDSである)し、X線フィルム(コダック・バイオ−マックス(Kodak Bio−Max)MS)に−80℃で2〜3日間、暴露した。
サザンブロット解析のために、5マイクログラムのゲノムDNAを使用した。nptIIカセットの組み込み部位の数を検出するために、nptIIカセットを2つのフラグメントに切断するPvuIIでゲノムDNAを消化し、プローブとしてのnptIIカセットにハイブリダイズさせた。この解析は、いくつかの植物が極めて多数の組み組まれた選択カセットを有する一方、植物番号6は単一の組み込み事象を有することを示した。植物番号4および8はまた、少数の組み込み:植物あたり4〜5を有する。
ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)WTのN−グリカンは、例えば、ウィルソン(Wilson)ら(2001)Glycobiology 11,261−274)において記載のような植物N−グリカン、即ち、Asn−結合GlcNAcに対するα1,3−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ1,2−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス(Lewis)Aエピトープ(GlcNAcに連結したα1,4−フコシルおよびβ1,3−ガラクトシル残基)の典型的な構造的特徴を示す(表1)。3つのGNTiノックアウト植物について解析した。GNTIノックアウト植物のN−グリカンは、WTと比較して同じ構造を示し(表1)、ノックアウトは分子レベルでのみ成功し、生化学的レベルでは成功しなかったことが確認された。従って、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)にはもう1つのGNTIが存在すると想定される。
2.1.α1,3−フコース転移酵素(α1,3−FT)のcDNAおよびゲノムDNAのクローニング
ヒメツリガネゴケ(P.patens)WT由来のcDNAに対して変性プライマーによる2ラウンドのPCRを実施することによって、α1,3−FTに対するcDNAの部分を得た。これらのプライマーは、リョクトウ(Vigna radiata)およびシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来の既知のα1,3−FTのタンパク質アラインメントに基づいて作製した。第1ラウンドでは、プライマーFD4F(5'−TGGGCNGARTAYGAYATGATG−3'、配列番号31)およびFDR1(5'−TGNGTNA−RNCCNADNGGRTADAT−3'、配列番号32)を使用し、次いで、このPCRからの産物を、プライマーFD4FおよびFD5R(5'−TGNACNGCNGCCATRTC−3'、配列番号33)による以後のPCRに供した。第2のPCRにより、510bpの産物を生じ、これをpCR4TOPOにクローニングして、両末端から配列決定した。
ノックアウト構築物を作製するために、プライマー:FT15F(5'−AATGTTCTGTGCCATGCG−3'、配列番号48)およびFT16R(5'−TGCTTCAAATGGGCTAGGG−3'、配列番号49)によって、ゲノムDNAに対するPCRを実施した。このようにして得られた2156bpのフラグメントをpCR4TOPO(インビトロゲン(Invitrogen)、米国(USA))ベクターにクローニングした。プライマー:NdeI制限部位を作製するためのnptII/NdeI−F(5'−ATGCCATATGGCATGCCTGCAGGTCAAC−3'、配列番号50)およびBstZ17I部位を作製するためのnptII/BstZ17I−R(5'−GCATGTATACGCAT−GCCTGCAGGTCACTG−3'、配列番号51)によるpRT101neoベクター(ギルケ(Girke)ら、1998)に対するプルーフリーディングポリメラーゼでのPCRにより、NptIIカセットを合成した。また、PCR産物をpCR4TOPO(インビトロゲン(Invitrogen)、米国(USA))にクローニングした。両方のプラスミドをNdeIおよびBstZ17I制限酵素で消化した。この制限化によって、第4のイントロンの部分および第5のエキソンの部分を含有する195bpフラグメントを、α1,3−FTゲノムフラグメントから切り出し、nptIIカセットによって置き換えた。
耐性植物のプレスクリーニングのために、茎葉体の小片(1〜5mg)を30分間、45℃、20mM(NH4)2SO4および0.1%ツイーン(Tween)20を含有する75mM Tris−HCl、pH8中で処理し、3マイクロリットルのこの抽出物を、以下の4対のプライマーによるPCRに使用した:本来のft遺伝子の破壊を検出するためのFT14F(5'−ACAAAGTTACATACTCGCG−3'、配列番号52)およびFTA12R(5'−TACTTCCAATTGAAGACAAGG−3'、配列番号47)、nptIIカセットの存在を検出するためのN1(5'−TACCGACAGTGGTCCCAAAG−3'、配列番号25)およびN2(5'−CCACCATGATATTCGGCAAG−3'、配列番号26)、5'末端での導入遺伝子の組み込みを制御するためのFT14F(5'−ACAAAGTTACATACTCGCG−3'、配列番号52)およびN3(5'−TGTCGTGCTCCACCATGTT−3'、配列番号28)、3'末端での組み込みを制御するためのFTA12R(5'−TACTTCCAATTGAA−GACAAGG−3'、配列番号47)およびN4(5'−GTTGAGCATATAAGAAAC−3'、配列番号29)。すべての4つのPCR反応において予想されるフラグメントを付与する植物は推定ノックアウトとみなし、さらなる解析のために選択した。
RNeasyキット(キアゲン(Qiagen)、独国(Germany))により、コケ組織から全RNAを単離した。標準的なプロトコルに従って、逆転写PCRを実施した。RT−PCRプライマーでは、α1,3−FTのcDNAの中央領域に位置するFTA9F(5'−ATGCTCCC−AGCCCAAGAC−3'、配列番号44)およびFTA10R(5'−TGTCTACTAGAGCTAGA−AACG−3'、配列番号45)を使用した。これらのプライマーを使用して、475bp転写物はWTのみに検出されたが、すべてのトランスジェニック植物は、いずれのPCRも生じなかった。組み込まれたnptIIカセットの両方の部位に位置するプライマーでは検出可能な転写物が認められないことから、解析したすべての植物はノックアウトであることが確認される。
ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)WTのN−グリカンは、例えば、ウィルソン(Wilson)ら(2001)、上掲において記載のような植物N−グリカン、即ち、Asn−結合GlcNAcに対するα1,3−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ1,2−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス(Lewis)Aエピトープ(GlcNAcに連結したα1,4−フコシルおよびβ1,3−ガラクトシル残基)の典型的な構造的特徴を示す(表1)。3つのα 1,3FTノックアウト植物について解析した。α1,3FTノックアウト植物のN−グリカン上では、Asn−結合GlcNAcに連結したα1,3フコース残基を検出することができなかったことから、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)のα1,3フコース転移酵素のノックアウトは完全に成功したことが確認された。
2A.1.α1,3−フコース転移酵素(α1,3−FT)遺伝子に対応するフランキングDNAのクローニング
SacII制限部位を含有するプライマーMoB558(5'−GTTCCGCGGTGATCCCGTTTTCATATCA−GTGTATT−3'、配列番号84)およびSnaBIおよびSacI部位を含有するプライマーMoB557(5'−TTTGAGCTCTACGTAACAATAACATAAAATATCACA−3'、配列番号85)を使用して、ゲノムDNAからPCRによって、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)のα1,3−フコース転移酵素遺伝子に対応する3'−フランキングDNAを増幅した。PCR産物(5'−GTTCCGCGGTGATCCCGTTTTCATATCAGTGTATTATCATCAGTGACTGC−ATATTGACACCCAATTCTGATGATTTTTTATTTTTTATTTTTTATTTTTTTTGGTATGGTTACATGCTTTTCAGAGGTTTCTATGCCGCTGAGTATTTTCCTGAATCGCGAGGTGTGACAGGTTATCTGCGCCGTCCACCCAATATTTTATGATGAGTCGATGATTCGTGAGACTAATCTAGCTTAACCTTTTTCTTACTGGCAAGTCAAAATTGAGTTTAAAATATTTCAGTATCCTGTTAGTAATTTCAGACACATGTATTCTATGTCTCATACTCTTTACGTGAAAGTTCAACTGACTTATATTTTGTCGTTTTTCTGTAGATCACTGTTTTAGCGCATACAAAGACAATTGTCTAAATATTTTTAAAGAAGGTGATATTTTATTATAAGATAGAAGTCAATATGTTTTTTTGTTATGCACATGACTTGAATAAAATAAATTTTTTTGTTAGATTTAAATACTTTTTGAATTATAGCTTTGTTGAAATTAAGGAATTTATATTCATAAGAAGCTACTCGAACAAATTTACAAAGAGAACATTTGATAAGTAAAAGTAATTAAAAGTTTTTTTTAATTTAAAAAGATTAATTTTTATTAATAAGAAGAACTTGGAAAGTTAGAAAAATATTTAACTTTAAAAATTAAGAAAACAAGGCAAAACTTTAATTTACAAATACTTAATGTAGATTAATTTTCTTATTATATATTAGCACAAATTATCATTATGTGATATTTTATGTTATTGTTACGTAGAGCTCAAA−3'、配列番号86)を、SacIおよびSacIIで消化し、プラスミドpBS(SacI/SacII消化)にクローニングした。
ノックアウト構築物を作製するために、35Sプロモーター、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)のFtsZ1クロロプラストトランジットペプチドをコードする297bpのftsZ1 cDNAフラグメント、GFPのコーディング配列およびnosターミネーターを含有する発現カセット(キースリング(Kiessling)ら(2000)J.Cell Biol.151,945−950)を使用した。HindIIIおよびEcoRIによるpFtsZ1(1−93)−GFPの消化ならびにHindIII/EcoRI消化pZEROへのクローニングによって、発現カセットをpZEROにサブクローニングし、プラスミドpZEROftszGFPを生じた。HindIIIによる消化、クレノウ(Klenow)フラグメントによる平滑化、続いてEcoRIによる消化によってpZEROftszGFPから発現カセットを切り出した。ノックアウト構築物を作製するために、消化した発現カセットを2A.1に記載のベクターにクローニングし、SmaIおよびEcoRIで消化した。
α1,3−フコシルおよびβ1,2−キシロシル残基を伴わない植物を作製するために、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)糸状体由来のプロトプラストを、第2Aおよび3章に記載の構築物で形質転換した。続けて、形質転換を実施することが可能であり、ならびに両構築物による共形質転換も可能である。この場合、α1,3−フコース転移酵素遺伝子のノックアウトは、遺伝子破壊だけではなく、遺伝子置換によっても実施した。以後の形質転換手順におけるさらなる選択マーカーとして、ハイグロマイシン耐性を担う遺伝子を含有するプラスミド(pCambia1305)を、共形質転換に使用した。
ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)WTのN−グリカンは、例えば、ウィルソン(Wilson)ら(2001)、上掲において記載のような植物N−グリカン、即ち、Asn−結合GlcNAcに対するα1,3−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ1,2−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス(Lewis)Aエピトープ(GlcNAcに連結したα1,4−フコシルおよびβ1,3−ガラクトシル残基)の典型的な構造的特徴を示す(表1)。1つのトランスジェニック植物を解析した。これらの植物のN−グリカン上では、Asn−結合GlcNAcに連結したα1,3フコース残基も、またβ1,2−キシロシル残基も検出することができなかった。
3.1.β1,2−キシロース−転移酵素(β1,2XT)のcDNAおよびゲノムDNAのクローニング
ヒメツリガネゴケ(P.patens)WT由来のcDNAに対して変性プライマーによる2ラウンドのPCRを実施することによって、β1,2−XTに対するcDNAの部分を得た。これらのプライマーは、植物由来の既知のβ1,2−XTのタンパク質アラインメントに基づいて作製した。第1ラウンドでは、プライマーXDF1(5'−TGYGARGSNTAYTTYGGNAAYGG−3'、配列番号55)およびXDR1(5'−GCNCKNAYCATYTCNCCRAAYTC−3'、配列番号56)を使用し、次いで、このPCRからの産物を、プライマーXDF2(5'−GGNGGNGARAARYTNGARRANGT−3'、配列番号57)およびXDR1による以後のPCRに供した。第2のPCRにより、610bpの産物を生じ、これをpCR4TOPO(インビトロゲン(Invitrogen)、米国(USA))にクローニングして、両末端から配列決定した。
ノックアウト構築物を作製するために、プライマー:XT12F(5'−TGTGAGGCGTTCTTTGGC−3'、配列番号68)およびXT11R(5'−ATCCCAGAAATATCTGATCC−3'、配列番号67)によって、ゲノムDNAに対するPCRを実施した。このようにして得られた2066bpのフラグメントをpCR4TOPOベクター(インビトロゲン(Invitrogen)、米国(USA))にクローニングした。プライマー:SalI制限部位を作製するためのnptII/SalI−F(5'−ATGCGTCGACGTCAACATGGTGGAGCACG−3'.配列番号69)およびNdeI部位を作製するためのnptII/NdeI−R(5'−GCATCATATGTCACTGGAT−TTTGGTTTTAGG−3'、配列番号70)でのプルーフリーディングポリメラーゼによるpRT101neoプラスミド(ギルケ(Girke)ら、1998)に対するPCRにより、nptIIカセットを合成した。また、PCR産物をpCR4TOPO(インビトロゲン(Invitrogen)、米国(USA))にクローニングした。両方のプラスミドをNdeIおよびSalI制限酵素で消化した。ゲノムDNAを伴うプラスミドから、第2のエキソンの部分および第2のイントロンの部分を含有する380bpのフラグメントを切り出し、nptIIカセットによって置き換え、導入した。
耐性植物のプレスクリーニングのために、茎葉体の小片(1〜5mg)を30分間、45℃、20mM(NH4)2SO4および0.1%ツイーン(Tween)20を含有する75mM Tris−HCl、pH8中で処理し、3マイクロリットルのこの抽出物を、以下の4対のプライマーによるPCRに使用した:本来のxt遺伝子の破壊を検出するためのXT−M1F(5'−AGGTTGAGCAATCATATGGC−3'、配列番号66)およびXT13R(5'−ACGATCCAAAATCTGGACGC−3'、配列番号71)、nptIIカセットの存在を検出するためのN1(5'−TACCGACAGTGGTCCCAAAG−3'、配列番号25)およびN2(5'−CCACCATGATATTCGGCAAG−3'、配列番号26)、5'末端での導入遺伝子の組み込みを制御するためのXT−M1F(5'−AGGTTGAGCAATCATATGGC−3'、配列番号66)およびN3(5'−TGTCGTGCTCCACCATGTT−3'、配列番号28)、3'末端での組み込みを制御するためのXT13R(5'−ACGATCCAAAATCTGGACGC−3'、配列番号71)およびN4(5'−GTTGAGCATA−TAAGAAAC−3'、配列番号29)。すべての4つのPCR反応において予想されるフラグメントを付与する植物は推定ノックアウトとみなし、さらなる解析のために選択した。
RNeasyキット(キアゲン(Qiagen)、独国(Germany))により、コケ組織から全RNAを単離した。標準的なプロトコルに従って、逆転写PCRを実施した。RT−PCRプライマーでは、β1,2−XTのcDNAの中央領域およびnptIIカセットの両方の部位に位置するXT14F(5'−TTACGAA−GCACACCATGC−3'、配列番号82)およびXT15R(5'−GTCCTGTTAAATGCCTGC−3'、配列番号65)を使用した。これらのプライマーを使用して、290bp転写物はWTのみに検出されたが、すべてのトランスジェニック植物は、いずれのPCRも生じなかった。組み込まれたnptIIカセットの両方の部位に位置するプライマーでは転写物が認められないことから、解析したすべての植物はノックアウトであることが確認される。
ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)WTのN−グリカンは、例えば、ウィルソン(Wilson)ら(2001)、上掲において記載のような植物N−グリカン、即ち、Asn−結合GlcNAcに対するα1,3−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ1,2−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス(Lewis)Aエピトープ(GlcNAcに連結したα1,4−フコシルおよびβ1,3−ガラクトシル残基)の典型的な構造的特徴を示す(表1)。3つのβ1,2XTノックアウト植物について解析した。β1,2XTノックアウト植物のN−グリカン上では、β−マンノシル残基に連結したβ1,2キシロシル残基を検出することができなかった(表1)ことから、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)のβ1,2キシロース転移酵素のノックアウトは完全に成功したことが確認された。
ヒト肝臓由来のcDNA(インビトロゲン(Invitrogen)、米国(USA))を、β1,4−ガラクトース転移酵素(GalT、ジェンバンク(GenBank):X55415)cDNAの単離のために使用した。エロンガーゼ(Elongase)酵素(インビトロゲン(Invitrogen)、米国(USA))を伴うPCRのためにXhoI制限部位を含有する5'プライマーGalTXh−F(5'−TTCTCGAGACAATGAGGCTTCGGGAGCCGCTC −3'、配列番号72)およびXbaI制限部位を含有する3'プライマーGalTXb−R(5'−GGTCTAGACTAGCTCGGTGTCCCGATGTCC−3'、配列番号73)を使用することによって、1.2kbDNAフラグメントを増幅した。1.2kbフラグメントをpCR4−TOPO(インビトロゲン(Invitrogen)、米国(USA))にクローニングした。フラグメントを、XhoIおよびXbaIでこのベクターから切り出し、XhoIおよびXbaIで消化したpRT101(トファー(Toepfer)ら(1987)NAR 15,5890)にクローニングした。得られたプラスミドpRT101−GalTは、CaMV35SプロモーターおよびCaMVターミネーターの制御下のヒトβ1,4−ガラクトース転移酵素のcDNAを含有した。
プライマーXTB−F(5'−TTGGATCCTCAATTACGAAGCACACCATGC−3'、配列番号74)およびプライマーXTB−R(5'−TTGGATCCTCCTCCCAGAAACATCTGATCCAG−3'、配列番号75)(両プライマーともBamHI制限部位を導入した)を使用することによって、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)のゲノムDNAから、β1,2−キシロース転移酵素遺伝子の1.56kbフラグメントを増幅した。増幅産物をpCR4−TOPO(インビトロゲン(Invitrogen)、米国(USA))にクローニングした。クローニングしたβ1,2−キシロース転移酵素遺伝子フラグメントは、単一のHindIII制限部位を含有した。このHindIII制限部位には、連結によって、CaMV35SプロモーターおよびCaMVターミネーターの制御下にあるβ1,4−ガラクトース転移酵素のcDNAが導入され、プラスミドpCR4−XTko−GalTkiが生じる。pCR4−XTko−GalTkiをBamHIで消化すると、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)のβ1,2−キシロース転移酵素遺伝子に相同な配列によって5'および3'に隣接されたCaMV35SプロモーターおよびCaMVターミネーターの制御下にあるβ1,4−ガラクトース転移酵素のcDNAを含有するフラグメントを生じた。このフラグメントは、ノックアウト実験のために使用した。
PCR解析のために、推定ノックアウト植物から単離されたゲノムDNAを使用した。プライマーMoB521(5'−TTGCCGCTATCTACTTGTATGCTAACGT−3'、配列番号76)およびMoB575(5'−TGCCGTGGATGTGCTAGATAATCTT−3'、配列番号77)を、β1,4−ガラクトース転移酵素カセットの両方の部位上にあるβ1,2−キシロース転移酵素に相同な配列上に配置した。予想されるβ1,2−キシロース転移酵素配列に対応する339bpのフラグメントをWTから増幅した。ノックアウト植物から、導入されたβ1,4−ガラクトース転移酵素カセットに対応する2.1kbpのフラグメントを増幅したところ、339bpのフラグメントを検出することができなかったことから、β1,2−キシロース転移酵素のノックアウトならびにβ1,4−ガラクトース転移酵素カセットの組み込みを確認した。
ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)WTのN−グリカンは、例えば、ウィルソン(Wilson)ら(2001)、上掲において記載のような植物N−グリカン、即ち、Asn−結合GlcNAcに対するα1,3−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ1,2−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス(Lewis)Aエピトープ(GlcNAcに連結したα1,4−フコシルおよびβ1,3−ガラクトシル残基)の典型的な構造的特徴を示す(表1)。3つのβ1,2XTノックアウト、β1,4GT組み込み植物について解析した。これらの植物のN−グリカン上では、β−マンノシル残基に連結したβ1,2キシロシル残基を検出することができなかった。WTにおいて、2235でのピークが認められたことから、トランスジェニック植物のN−グリカンパターンにおいて(GF)(GF)XF構造が移動したことが説明され、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)においてヒトβ1,4ガラクトース転移酵素の活性が確認された。
プライマーFTB−F(5'−TAGGATCCAGATGATGTCTGCTCGGCAGAATGG−3',配列番号78)およびプライマーFTB−R(5'−CTGGATCCTTGTAGATCCGAAGGTCTGAGTTCC−3',配列番号79)(両プライマーともBamHI制限部位を導入した)を使用することによって、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)のゲノムDNAから、α1,3−フコース転移酵素の2.66kbフラグメントを増幅した。増幅産物をpCR4−TOPO(インビトロゲン(Invitrogen)、米国(USA))にクローニングした。クローニングしたα1,3−フコース転移酵素遺伝子フラグメントは、2つのHindIII制限部位を含有した。これらのHindIII制限部位には、連結によって、CaMV35SプロモーターおよびCaMVターミネーターの制御下にあるβ1,4−ガラクトース転移酵素のcDNAが導入され、プラスミドpCR4−FTko−GalTkiが生じる。pCR4−FTko−GalTkiをBamHIで消化すると、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)のβ1,3−フコース転移酵素遺伝子に相同な配列によって5'および3'に隣接されたCaMV35SプロモーターおよびCaMVターミネーターの制御下にあるβ1,4−ガラクトース転移酵素のcDNAを含有するフラグメントを生じた。このフラグメントは、ノックアウト実験のために使用した。
PCR解析のために、推定ノックアウト植物から単離されたゲノムDNAを使用した。プライマーMoB435(5'−TCCTACCTGCGGAGCAACAGATATTG−3'、配列番号80)およびMoB495(5'−GTGGACCCAGATTTGCTGGTGCACTTG−3'、配列番号81)を、β1,4−ガラクトース転移酵素カセットの両方の部位上にあるα1,3−フコース転移酵素に相同な配列上に配置した。予想されるα1,3−フコース転移酵素配列に対応する2kbpのフラグメントをWTから増幅した。ノックアウト植物から、導入されたβ1,4−ガラクトース転移酵素カセットに対応する2.8kbpのフラグメントを増幅したところ、2kbpのフラグメントを検出することができなかったことから、α1,3−フコース転移酵素のノックアウトならびにβ1,4−ガラクトース転移酵素カセットの組み込みを確認した。
ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)WTのN−グリカンは、例えば、ウィルソン(Wilson)ら(2001)、上掲において記載のような植物N−グリカン、即ち、Asn−結合GlcNAcに対するα1,3−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ1,2−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス(Lewis)Aエピトープ(GlcNAcに連結したα1,4−フコシルおよびβ1,3−ガラクトシル残基)の典型的な構造的特徴を示す(表1)。3つのα1,3FTノックアウト、β1,4GT組み込み植物について解析した。これらの植物のN−グリカン上では、Asn−結合GlcNAcに連結したα1,3フコシル残基を検出することができなかった。WTにおいて、2235でのピークが認められたことから、トランスジェニック植物のN−グリカンパターンにおいて(GF)(GF)XF構造が移動したことが説明され、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)においてヒトβ1,4ガラクトース転移酵素の活性が確認された。
α1,3−フコシルおよびβ1,2−キシロシル残基を伴わない植物を作製するために、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)糸状体由来のプロトプラストを、第5および6章に記載の構築物で形質転換した。続けて、形質転換を実施することが可能であり、ならびに両構築物による共形質転換も可能である。
PCR解析については、5.1および6.1に記載の手順と同じ手順を実施した。
ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)WTのN−グリカンは、例えば、ウィルソン(Wilson)ら(2001)、上掲において記載のような植物N−グリカン、即ち、Asn−結合GlcNAcに対するα1,3−連結におけるフコース、βマンノシル残基に対するβ1,2−連結におけるキシロース、非還元末端エレメントとしてのルイス(Lewis)Aエピトープ(GlcNAcに連結したα1,4−フコシルおよびβ1,3−ガラクトシル残基)の典型的な構造的特徴を示す(表1)。3つのトランスジェニック植物について解析した。これらの植物のN−グリカン上では、Asn−結合GlcNAcにに連結したα1,3フコシル残基も、またβ1,2−キシロシル残基も検出することができなかった。WTにおいて、2235でのピークが認められたことから、トランスジェニック植物のN−グリカンパターンにおいて(GF)(GF)XF構造が移動したことが説明され、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)においてヒトβ1,4ガラクトース転移酵素の活性ならびに1,3連結フコシルおよび1,2連結キシロシル残基の消失が確認された。
ヒトβ1,4ガラクトース転移酵素を含有し、かつα1,3フコース転移酵素も、またβ1,2キシロース転移酵素(7.2)も含有しないトランスジェニックフィスコミトレラ(Physcomitrella)植物の糸状体から誘導されたプロトプラストを、pRT101TPVEGF C3で形質転換した。発現したVEGF121を培地に分泌させた。2、3および4日後、培養培地を回収し、新鮮培地に置き換えた。サンプルを、0.22ミクロンミッレックス(Millex)GPフィルターユニット(ミリポア(Millipore))を介してろ過した。SP−セファロース(SP−Sepharose)カラムを使用するFPLC(アクタエクスポーラー(Aektaexplorer)100、アマシャム・バイオサイエンシズ(Amersham Biosciences)、独国(Germany))によって、組換えVEGF121を精製した。25mM酢酸Na、pH5.0中塩化ナトリウムで溶出を実施した。アミコン・ウルトラ(Amicon Ultra)フィルターデバイス(カットオフ値:10.000)(ミリポア(Millipore))を使用する遠心分離によって、溶出した画分を濃縮した。
Claims (42)
- 検出可能な1,3−連結フコシルおよび1,2−連結キシロシル残基を伴わない修飾されたN−連結グリカンをもたらすフコシルトランスフェラーゼおよびキシロシルトランスフェラーゼのダブルノックアウトからなる形質転換されたコケ細胞。
- 前記細胞は前記コケ細胞において発現を駆動する外因性プロモーターに操作可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含んでなり、ここで、前記ヌクレオチド配列は、コケ細胞において発現されるグリコシル化ポリペプチドをコードする、請求項1に記載の形質転換されたコケ細胞。
- 前記グリコシル化ポリペプチドは動物のグリコシル化パターンを含んでなる、請求項2に記載の形質転換されたコケ細胞。
- 前記グリコシル化ポリペプチドは哺乳動物のグリコシル化パターンを含んでなる、請求項3に記載の形質転換されたコケ細胞。
- 前記コケ細胞において発現を駆動する外因性プロモーターに操作可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含んでなり、ここで、前記ヌクレオチド配列は、コケ細胞において発現される機能的哺乳動物ガラクトース転移酵素をコードする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の形質転換されたコケ細胞。
- 発現される哺乳動物ガラクトース転移酵素はβ−1,4galTである、請求項5に記載の形質転換されたコケ細胞。
- 発現される哺乳動物ガラクトース転移酵素はヒトβ−1,4galTである、請求項6に記載の形質転換されたコケ細胞。
- コケ細胞はフィスコミトレラ(Physcomitrella)、フナリア(Funaria)、スファグヌム(Sphagnum)、セラトドン(Ceratodon)、マーチャンティア(Marchantia)およびスファエロカルポス(Sphaerocarpos)属の種から選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載のコケ細胞。
- コケ細胞はフィスコミトレラ(Physcomitrella)から選択される、請求項8に記載のコケ細胞。
- コケ細胞はヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)由来である、請求項9に記載のコケ細胞。
- グリコシル化ポリペプチドは、ヒトグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列、非ヒト哺乳動物グリコシル化タンパク質の一次アミノ酸配列、抗体またはその活性なフラグメントの一次アミノ酸配列、ならびに/あるいは非哺乳動物グリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる群から選択される、請求項2〜10のいずれか1項に記載のコケ細胞。
- グリコシル化ポリペプチドはヒトポリペプチドである、請求項11に記載のコケ細胞。
- グリコシル化ポリペプチドは、ヒトインスリン、プレプロインスリン、VEGF、プロインスリン、グルカゴン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンなどのインターフェロン、第VII、第VIII、第IX、第X、第XI、および第XII因子から選択される血液凝固因子、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンを含む生殖ホルモン、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子を含む増殖因子、プロラクチン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、エリスロポエチン(EPO)、およびβ−グルコセレブロシダーゼなどの酵素、ヘモグロビン、血清アルブミン、ならびにコラーゲンよりなる群から選択される、請求項11または12に記載のコケ細胞。
- 検出可能な1,3−連結フコシルおよび1,2−連結キシロシル残基を伴わない修飾されたN−連結グリカンをもたらすフコシルトランスフェラーゼおよびキシロシルトランスフェラーゼのダブルノックアウトからなるコケ細胞を生成する方法であって、i)内因性フコース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第1の核酸配列を前記細胞に導入することおよびii)内因性キシロース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第2の核酸配列を前記細胞に導入することを含んでなる、上記方法。
- 前記形質転換されたコケ細胞は、前記コケ細胞において発現を駆動する外因性プロモーターに操作可能に連結されたヌクレオチド配列をさらに含んでなり、ここで、前記ヌクレオチド配列は、コケ細胞において発現されるグリコシル化ポリペプチドをコードする、請求項14に記載の方法。
- 前記グリコシル化ポリペプチドは動物のグリコシル化パターンを含んでなる、請求項15に記載の方法。
- 前記グリコシル化ポリペプチドは哺乳動物のグリコシル化パターンを含んでなる、請求項16に記載の方法。
- コケ細胞において発現を駆動する外因性プロモーターに操作可能に連結された核酸を含んでなる単離された核酸配列を、前記細胞に導入することをさらに含んでなり、ここで、前記核酸は機能的哺乳動物ガラクトース転移酵素ポリペプチドをコードする、請求項14〜17のいずれか1項に記載の方法。
- ガラクトース転移酵素ヌクレオチド配列はβ−1,4ガラクトース転移酵素(β−1,4galT)ヌクレオチド配列である、請求項18に記載の方法。
- ガラクトース転移酵素ヌクレオチド配列はヒトβ−1,4ガラクトース転移酵素(β−1,4galT)ヌクレオチド配列である、請求項19に記載の方法。
- グリコシル化ポリペプチドは、ヒトタンパク質の一次アミノ酸配列、非ヒト哺乳動物タンパク質の一次アミノ酸配列、抗体またはその活性なフラグメントの一次アミノ酸配列、ならびに/あるいは非哺乳動物タンパク質の一次アミノ酸配列を有するタンパク質を含んでなる群から選択される、請求項15〜20のいずれか1項に記載の方法。
- グリコシル化ポリペプチドは、ヒトインスリン、プレプロインスリン、プロインスリン、グルカゴン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンなどのインターフェロン、第VII、第VIII、第IX、第X、第XI、および第XII因子から選択される血液凝固因子、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンを含む生殖ホルモン、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子を含む増殖因子、プロラクチン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、エリスロポエチン(EPO)、およびβ−グルコセレブロシダーゼなどの酵素、ヘモグロビン、血清アルブミン、コラーゲン、ならびにアミダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、ペプシン、ペプチダーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、カゼイン、乳清タンパク質、大豆タンパク質、グルテンならびに卵アルブミンよりなる群から選択される、請求項15〜21のいずれか1項に記載の方法。
- コケ細胞はフィスコミトレラ(Physcomitrella)、フナリア(Funaria)、スファグヌム(Sphagnum)、セラトドン(Ceratodon)、マーチャンティア(Marchantia)およびスファエロカルポス(Sphaerocarpos)属の種から選択される、請求項14〜22のいずれか1項に記載の方法。
- コケ細胞はフィスコミトレラ(Physcomitrella)から選択される、請求項23に記載の方法。
- コケ細胞はヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)由来である、請求項24に記載の方法。
- グリコシル化ポリペプチドは、ヒトグリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列、非ヒト哺乳動物グリコシル化タンパク質の一次アミノ酸配列、抗体またはその活性なフラグメントの一次アミノ酸配列、ならびに/あるいは非哺乳動物グリコシル化ポリペプチドの一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる群から選択される、請求項15〜25のいずれか1項に記載の方法。
- グリコシル化ポリペプチドはヒトポリペプチドである、請求項26に記載の方法。
- グリコシル化ポリペプチドは、ヒトインスリン、プレプロインスリン、VEGF、プロインスリン、グルカゴン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンなどのインターフェロン、第VII、第VIII、第IX、第X、第XI、および第XII因子から選択される血液凝固因子、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンを含む生殖ホルモン、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子を含む増殖因子、プロラクチン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、エリスロポエチン(EPO)、およびβ−グルコセレブロシダーゼなどの酵素、ヘモグロビン、血清アルブミン、ならびにコラーゲンよりなる群から選択される、請求項26または27に記載の方法。
- 外因性プロモーターは、誘導性、化学調節型、構成性または細胞特異的プロモーターから選択される、請求項15〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 検出可能な1,3−連結フコシルおよび1,2−連結キシロシル残基を伴わない修飾されたN−連結グリカンをもたらすフコシルトランスフェラーゼおよびキシロシルトランスフェラーゼのダブルノックアウトからなる形質転換されたコケ細胞を生成するのに適切な核酸ベクターの組であって、i)内因性フコース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第1の核酸配列およびii)内因性キシロース転移酵素ヌクレオチド配列に特異的に標的化される第2の核酸配列を含んでなる、上記核酸ベクターの組。
- グリコシル化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでなる、請求項30に記載の核酸ベクターの組。
- 請求項15〜29のいずれか1項に記載の方法における使用のための機能的哺乳動物糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項30または31に記載の核酸ベクターの組。
- 前記ポリヌクレオチドは哺乳動物ガラクトース転移酵素をコードする、請求項32に記載の核酸ベクターの組。
- 前記ポリヌクレオチドはヒトβ−1,4ガラクトース転移酵素をコードする、請求項33に記載の核酸ベクターの組。
- 請求項30〜34のいずれか1項に記載の核酸ベクターの組を含有する宿主細胞。
- コケ細胞である、請求項35に記載の宿主細胞。
- 原核細胞である、請求項35に記載の宿主細胞。
- 請求項35〜37のいずれか1項に記載の宿主細胞を生成する方法であって、形質転換により前記核酸ベクターの組を細胞に組み入れることを含む、上記方法。
- トランスジェニックコケ細胞の生成における請求項30〜34のいずれか1項に記載の核酸ベクターの組の使用。
- コケ、またはコケ部、またはコケの抽出物または誘導体あるいはコケ細胞培養物に含まれる請求項35または36に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜13、36および40のいずれか1項に記載のコケ細胞を含んでなるコケ植物またはコケ組織。
- コケ植物を生成する方法であって、請求項30〜34のいずれか1項に記載の核酸ベクターの組をコケ細胞に組み入れることおよび前記細胞からコケを再生することを含む上記方法。
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