CN112566938A - 针对ceacam5和cd47的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与人癌胚抗原CEACAM5和人CD47相结合的双特异性抗体、编码此类双特异性抗体的多核苷酸以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还提供了用于选择和产生此类抗体的方法和在以单一疗法以及以组合方式治疗疾病中使用此类抗体的方法。

Description

针对CEACAM5和CD47的双特异性抗体
序列表的参考
与本申请一起提交的以电子形式呈送的序列表("4130_002PC08_SeqListing_ST25.txt",122,709个字节，创建于2019年5月31日)的内容通过提及而以其整体合并入本文中。
发明领域
本发明涉及与人癌胚抗原CEACAM5(CEA)和人CD47相结合的双特异性抗体(CEAxCD47双特异性抗体)。另外，本发明涉及编码此类双特异性抗体的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于选择和产生此类抗体的方法，以及在疾病治疗中使用此类抗体的方法。本发明还涉及所述CEAxCD47双特异性抗体在单一疗法和组合疗法(尤其是与CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体(TCB)和/或PD-1或PD-L1的抑制剂)中的治疗性用途。
发明背景
人CEA家族包括29个基因，其中18个得到表达：7个属于CEA亚组，和11个属于妊娠特异性糖蛋白亚组。几个CEA亚组成员被认为具有细胞粘附特性。CEA被认为在先天免疫中具有作用(
Figure BDA0002928449420000011
S.,Semin Cancer Biol.9(2):67-81(1999))。癌胚抗原(CEA，CEACAM5或CD66e；UniProtKB-P06731)是癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM)家族的成员，并且是肿瘤相关抗原(Gold和Freedman,J Exp.Med.,121:439-462,1965；BerinsteinN.L.,J Clin Oncol.,20:2197-2207,2002)。CEACAM6(CD66c；UniProtKB-P40199)也属于癌胚抗原(CEA)家族。已针对CEA产生了多种单克隆抗体，为了研究目的、作为诊断工具和为了治疗目的(参见例如WO2012117002(其通过提及而以其整体合并)，还可参见实施例8f))。可溶性CEA(在本申请中也称为脱落的CEA或sCEA)是一种已建立的肿瘤标志物。在癌症患者的血浆中的水平在一些情况下可以越过1000ng/ml，而在健康个体中的血浆浓度低于10ng/ml(例如，Sandler B.等人,Anticancer Res 1999,19(5B),4229-33)。Hao C.,Zhang G.和L.在Progress in Molecular Biology and Translational Science(2019)中报道了，在胰腺癌、结肠和直肠癌、肺癌和胃癌中在重大％的患者中可以发现100至250ng/mL的CEA血浆浓度。尤其是在当这些癌症是局部晚期的和/或转移性的之时观察到这样的高水平。根据Wanebo等人,New Eng.J.Med.(1978)，21％的复发性/转移性结肠癌具有高于100ng/ml的sCEA。Hohenberger等人,Annals Surgery(1994)在结肠直肠患者(阶段Duke 4和肝转移)中报道了，26％的患者具有超过50ng/mL的sCEA。Jurgensmerier等人,Br.J.Cancer(2013)在具有几百名罹患转移性结肠直肠癌的患者的相当大范围的研究中报道了，在24％或25％的这些患者中具有超过225ng/mL的sCEA。可溶性CEA可以与治疗性抗-CEA抗体竞争与在肿瘤细胞上的CEA的结合，从而潜在地引起所述抗-CEA抗体的效力降低。在大多数癌症患者(例如结肠直肠癌症患者)中，这可以通过使用具有有限的与可溶性CEA的交叉反应性(直至100至250ng/ml的sCEA血浆浓度)的抗-CEA抗体来避免。
通过将NS1(P3/NS l/I-Ag-4-l)骨髓瘤细胞与来自用正常结肠直肠上皮进行免疫接种的小鼠的脾细胞相融合，产生了小鼠单克隆抗体PR1A3。Richman P.I.和Bodmer W.F.,Int.J.Cancer,39:317-328,1987描述了小鼠单克隆抗体PR1A3。PRl A3的表位作图显示，该抗体靶向该CEA分子的B3结构域和GPI锚(Durbin H.等人,Proc.Natl.Scad.Sci.USA,91:4313-4317,1994)。因此，PR1A3抗体主要与膜结合型CEA相结合，而不与可以在癌症患者的血流中发现的可溶性CEA形式相结合。被PRl A3所结合的表位是构象表位，而不是线性表位(Stewart等人,Cancer Immunol Immunother,47(1999)299-06)。人源化的PRl A3(hPRlA3)抗体例如由Conaghhan P.J.等人,Br.J.Cancer,98(2008)1217-1225和WO2012117002(其通过提及而以其整体合并)进行了描述。
在US20140242079和WO2017118657(它们中的每一个通过提及而以其整体合并)中提及了一种用于通过人PD-1轴拮抗剂与抗-CEA/抗-CD3双特异性抗体的组合来治疗癌症的方法，并且已经在ASCO会议2017上发表了临床结果(Tabernero等人,J Clin Oncol 35,2017(suppl；abstr 3002))。在WO2015112534中提及了一种通过施用结合免疫检查点途径的两个或更多个不同靶标的免疫检查点拮抗剂以及与CEA和T细胞表面抗原相结合的T细胞重定向试剂来治疗肿瘤的方法。一种由单结构域抗-CEACAM6抗体和脲酶组成的缀合物目前正处于临床试验中(NCT02309892；WO2016116907)。在US20110064653中提及了与CEACAM5、CEACAM6和粒细胞相结合的I类抗体。
在现有技术中所描述的一种抗CD3ε抗体为SP34(Yang SJ,The Journal ofImmunology(1986)137,1097-1100)。SP34与灵长类动物和人的CD3都反应。SP34从BDBiosciences可得到。在现有技术中所描述的一种进一步的抗CD3抗体为UCHT-1(参见WO2000041474)。在现有技术中所描述的一种进一步的抗CD3抗体为BC-3(Fred HutchinsonCancer Research Institute；用在GvHD的I/II期试验中，Anasetti等人,Transplantation54:844(1992))。SP34与UCHT-1和BC-3的不同之处在于，SP-34识别仅仅存在于CD3的ε链上的表位(参见Salmeron等人,(1991)J.Immunol.147:3047)，而UCHT-1和BC-3识别由ε和γ链两者所贡献的表位。在WO2007042261、WO2008119565、WO2008119566、WO2008119567、WO2010037836、WO2010037837、WO2010037838和US8236308(它们中的每一个通过提及而以其整体合并)中也描述了抗CD3抗体。在US20140242079A1(其通过提及而以其整体合并)中描述了包含特异于CEA的结合部分和特异于CD3ε的结合部分的双特异性抗体。
人CD47(UniProtKB-Q08722(CD47_HUMAN；IAP)是一种跨膜蛋白质，其结合血小板反应蛋白-1(TSP-1)和信号调节蛋白α(SIRPα；CD172a；UniProtKB P78324)这些配体，并且可以作为对于免疫系统，尤其是对于巨噬细胞的“莫吃我”信号而起作用。CD47参与一系列的细胞过程，包括凋亡、增殖、粘附和迁移。此外，它在免疫应答和血管发生应答中发挥关键作用。CD47在不同的肿瘤细胞中过表达。在现有技术中描述了针对CD47的抗体，并且一些作为用于肿瘤治疗的治疗性试剂正处于临床试验中(Weiskopf K.European Journal ofCancer 76(2017)100-109；Huang Y等人,J Thorac Dis2017,9(2):E168-E174。结合CD47的IgG1亚类的抗体可以以Fc依赖性方式导致血小板的耗竭和血红蛋白的红细胞RBC的减少(参见例如US20140140989)。为了避免该不利效应，在WO2017196793中描述了抗-CD47抗体的IgG4亚类的一种突变体形式(IgG4PE，具有S228P突变以及L235E突变以减少FcyR结合)。具有极大地减小的FcyR结合和效应子功能的此类抗-CD47抗体不导致这样的血小板耗竭。由Bommel PE等人,Oncoimmunol.7(2018)e386361和Piccione EC等人,mAbs 7(2015)946-956描述了针对CD47和CD20的单结构域双特异性抗体。Dheilly E.等人,Mol.Thera.25(2017)523-533(还可参见WO2014087248)描述了针对CD19和CD47的双特异性抗体。在WO2014087248(其通过提及而以其整体合并)中描述了一种针对CD19和CD47的双特异性抗体，其包含SEQ ID NO:5的共同重链和SEQ ID NO:10的可变轻结构域VL。
人FcRI(CD64)被限制于单核细胞/巨噬细胞和树突细胞(DC)，并且诱导性地表达在嗜中性粒细胞和肥大细胞上；hFc RIIA(CD32A)表达在所有髓样细胞上，但不在淋巴细胞上表达；hFc RIIB(CD32B)仅高度地表达在循环B细胞和嗜碱性粒细胞上(L.Cassard,F.Joensson,S.Arnaud,M.Daeron,J.Immunol.189(2012)2995-3006)，差地表达在20％的单核细胞和4％的嗜中性粒细胞上，和表达在组织巨噬细胞和DC上，但是在肥大细胞上不表达；hFc RIIC(CD32C)表达在NK细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞上。hFc RIIIA(CD16A)表达在NK细胞和单核细胞/巨噬细胞上；hFc RIIIB(CD16B)表达在嗜中性粒细胞上，和如最近所证明的，表达在嗜碱性粒细胞的亚组上。这些表达模式强调了，hFc RIIA是由肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞组成性地表达的唯一的激活性IgG受体(BruhnsP.,Blood 119(2012)5640)。对于IgG的每个亚类的生物学活性知之甚少。IgG受体(FcγR)在人中惊人地众多。它们包括高亲和力和低亲和力受体。高亲和力和低亲和力FcγR两者都以高的亲和性结合IgG-免疫复合物，但是仅高亲和力FcγR结合单体IgG。在人中存在一种高亲和力IgG受体，hFcγRI(CD64)，以及两个低亲和力IgG受体家族，hFcγRIIA、IIB、和IIC(CD32)，和hFcγRIIIA和IIIB(CD16)。hFcγRI和hFcγRIIIA是FcγR相关激活受体，hFcγRIIA和hFcγRIIC是单结构域激活受体，hFcγRIIB是单结构域抑制性受体，和hFcγRIIIB是GPI-锚固受体，其功能是不确定的(Bruhns P.Blood 113(2009)3716)。几个研究小组已证明，在其重链糖基化方面缺乏1,6-岩藻糖的抗体具有增强的与FcγRIII受体的结合亲和力和增加的ADCC活性(Shields,R.L.等人,(2002)J Biol.Chem.277,26733-26740.；(2002)J Biol.Chem.8,8)。另外，已建立了在与FcγRIII受体的结合亲和力和ADCC活性之间的相关性(Okazaki,A.等人,(2004)J Mol.Biol.336,1239-1249；Dall'Ozzo,2004)。一个IgG分子在其Fc区中携带两个N-联寡糖，在每条重链上携带一个。如任何糖蛋白那样，抗体作为共享相同的多肽主链但具有不同的附着至糖基化位点的寡糖的糖形群体而产生。在血清IgG的Fc区中通常发现的寡糖是复杂的二天线类型的(Wormald等人,Biochemistry 36:130-38(1997))，具有低水平的末端唾液酸和平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，和可变程度的末端半乳糖基化和核心岩藻糖基化。一些研究暗示，对于FcyR结合所需要的最小碳水化合物结构位于寡糖核心内。Lund等人,J.Immunol.157:4963-69(1996)。在聚糖部分中具有减少的岩藻糖含量的抗体展示出相比于正常地岩藻糖基化的抗体而言更高的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性(Niwa R等人,Cancer Res,64,2127-33,2004)。在低/无岩藻糖抗体的增强的ADCC背后的机制是其增加的与FcγRIIIa(CD16)的亲和力。在US6946292、US7425446、US8067232(它们中的每一个通过提及而以其整体合并)中和在http://www.potelligent.com下描述了敲除了关于负责岩藻糖添加的基因(α1,6-岩藻糖基转移酶；FUT8)的两个等位基因的细胞系。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)(一种催化平分型寡糖的形成的糖基转移酶)的过表达显著地增加由经改造的CHO细胞所产生的抗体的体外ADCC活性(
Figure BDA0002928449420000061
P.等人,Nature Biotechnol.17:176-180(1999)；WO199954342；US20030175884(它们中的每一个通过提及而以其整体合并))。在Fc结构域内的突变还可以改变Fc结构域与不同Fc受体的结合特性(WO2004063351、WO2004099249、WO2005018669、WO2005063815、WO2005110474、WO2005056759、WO2005092925、WO2005018572、WO2006019447、WO2006116260、WO2006023420-、WO2006047350、WO2006085967、WO2006105338、WO2007021841、WO2007008943、WO2007024249、WO2007041635、WO2007048077、WO2007044616、WO2007106707、WO2008022152、WO2008140603、WO2008036688、WO2008091798、WO2008091954、WO2008092117、WO2008098115、WO2008121160、WO2008150494、WO2010033736、WO2014113510(它们中的每一个通过提及而以其整体合并))。
在血液学恶性疾病的治疗中已取得了相当的进展。这与在几种类型的晚期实体肿瘤的治疗中所取得的进展形成了对比。那些晚期肿瘤类型(其中许多相当常见)的无进展存活(progression free survival；PFS)和总存活(overall survival；OS)通过新的化学疗法方案(其具有和没有针对例如VEGFR或ERGFR的单克隆抗体作为对于化学疗法的组合伙伴)在一定程度上得到改善。但是在过去一些年中，对于许多晚期/转移性实体肿瘤，药物疗法的进展是有限的。已将很大的希望投入癌症免疫疗法并且取得了某些但有限的成功。肿瘤发展出措施以保护其细胞免于被T-效应细胞和其他免疫细胞如巨噬细胞破坏。在过去数十年中，癌症免疫疗法无疑获得了相当一些的关注，并且成功使T-细胞再次适合并将它们重定向至针对癌细胞。最突出的例子是某些免疫检查点的抑制剂/激活剂。例如，检查点抑制剂如PD-1轴拮抗剂已显示出再激活T-效应细胞以对抗某些实体癌。但是并非所有实体肿瘤类型都是应答性的，并且即使在那些是应答性的之中，经常远远少于50％的患者从例如用抗-PD-1或PD-L1抗体的治疗中获得相关的益处。
用CAR T-细胞的过继T-细胞疗法和还有用T-细胞双特异性抗体的疗法在血液学恶性疾病中传递出了有希望的临床结果。但是用过继T-细胞疗法(例如CAR T-细胞)的临床研究在各种实体肿瘤中大多数未显示出或仅显示出很小的应答比率(例如，Xu等人,ExpertReview of Anticancer Therapy 2017,17,1099-1106)。
US20140242079和WO2017055389(它们中的每一个通过提及而以其整体合并)描述了CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体。来自US20140242079的一种抗体和来自WO2017055389的一种抗体都处于临床开发中(参见clinicaltrials.gov；在NCT3866239中的RO6958688和在NCT03539484中的RO7172508)。这些T-细胞双特异性抗体与CEAxCD3的不同表位相结合并且具有不同的肿瘤细胞杀伤效能。关于在用人T-细胞的体外测定法中的肿瘤细胞杀伤，大多数在WO201705389中所描述的强有力的CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体比RO6958688/cibisatamab(CEA-TCB)强10至100倍或更多倍。
直至最近，在具有晚期实体肿瘤的患者中用T-细胞双特异性抗体TAA x CD3(TAA＝肿瘤相关抗原)的临床试验的结果仍是令人失望的。但是在ASCO 2017上已发表了关于CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体CEA-TCB的初步I期结果(RO6958688/cibisatamab，参见例如Bacac等人,Clin.Cancer Res.,22(13),3286-97(2016)；和US20140242079)，其在以单一疗法的晚期结肠直肠癌患者中显示出部分的应答和稳定的疾病(J.Tabernero等人,J.Clin.Oncol.35,2017(suppl.Abstr.3002))。以在临床上有活性的剂量，对于cibisatamab已达到例如300Nm的血浆浓度。当将CEA-TCB与PD-L1抑制性抗体相组合时，出现更多的部分的应答和稳定的疾病。这些数据显示，在晚期实体肿瘤中用CEA-TCB可以取得效力。但是在单一疗法中和还有与PD-L1抑制剂相组合时，大多数患者仍然在进展中并且有反应的那些最多显示出部分的应答和稳定的疾病。但是还没有取得完全的应答。一种用于获得更好结果的方法可以是向T-细胞双特异性抗体不仅添加PD-1检查点轴的抑制剂，而且还添加进一步的检查点抑制剂或激动剂。但是迄今为止，就我们所知，对于这样的可得的组合方法还不存在有希望的临床数据。在晚期实体肿瘤内T-细胞的有限的可得性无疑是限制用T-细胞双特异性抗体加上PD-1轴抑制剂和/或其他对于T-细胞的检查点抑制剂或激动剂可取得的效力的重要机制。
代替向T-细胞双特异性抗体和PD-1轴抑制剂的组合添加另一种旨在将T-细胞重定向至针对晚期实体肿瘤的肿瘤细胞的治疗性试剂，添加将其他免疫细胞，尤其是巨噬细胞或巨噬细胞和天然杀伤NK-细胞重定向至肿瘤细胞的治疗性试剂可能是更成功的。本发明涉及将巨噬细胞和还有NK-细胞重定向至针对表达CEA的实体肿瘤的双特异性抗体，作为单一疗法或者与例如T-细胞双特异性抗体和/或PD-1/PD-L1抑制性抗体相组合
在实体肿瘤中用CAR T-细胞的令人失望的结果可以具有一个简单的解释，即穿透实体肿瘤并且分布在其中的CAR T-细胞的数目还不足够。这无疑在大多数的血液学恶性疾病中是不同的；CAR T-细胞可以很好地接近肿瘤细胞，从而解释了相比于在实体肿瘤中的令人失望的效力而言在这些恶性疾病中的高效力的该差别。另外，CAR T-细胞可以受到肿瘤微环境(TME)的重大抑制，所述肿瘤微环境大多数是强免疫抑制性的。
在疗法中所使用的单克隆抗体和还有双特异性抗体可以引起各种各样的不利效应。一个重要的毒性问题是细胞因子释放综合征(CRS)，其例如被发现于用阿仑珠单抗、莫罗单抗-CD3、利妥昔单抗和CD19 x CD3双特异性抗体博纳吐单抗(blinatumomab)的疗法中。还发现，用抗-CD47抗体的治疗在由抗-CD47抗体介导的吞噬作用之后诱导增加的量的促炎细胞因子(参见例如，US20160144009)。具有wt IgG1Fc的抗-CD47单克隆抗体的已知的不利事件为增加的红细胞RBC吞噬/裂解和血小板激活(参见例如，在图8和10中，由携带wtIgG1 Fc的抗-CD47抗体B6H12.2所诱导的RBC吞噬和血小板激活)。
本发明提供了与人CEACAM5和人CD47特异性地结合的双特异性抗体，其被指定用于治疗实体肿瘤。这些双特异性抗体将高效力与低毒性、低免疫原性和有利的药物代谢动力学特性相组合。根据本发明的双特异性抗体由于免疫细胞尤其是巨噬细胞和NK-细胞的参与，主要经由经优化的ADCP(抗体依赖性细胞吞噬)和ADCC(抗体依赖性细胞毒性)而诱导其抗肿瘤细胞效应。本发明还提供了与人CEACAM5和人CD47特异性地结合的双特异性抗体，其被指定用于与CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体如RO6958688、RO7172508和其他CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体(例如，如下面所描述的)的组合治疗，并且显示出在人巨噬细胞存在下肿瘤细胞如MKN-45的强吞噬作用。
发明概述
在一个实施方案中，本发明涉及双特异性抗体(进一步地也被称为“MabCEAxCD47”或“CEAxCD47双特异性抗体”)，其包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分(进一步地也被称为“CEA”)和与人CD47特异性地结合的第二结合部分(进一步地也被称为“CD47”)。
在一个实施方案中，本发明涉及与人CEACAM5和人CD47特异性地结合的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc区已经进行了糖改造从而具有相比于相同但非糖改造的双特异性抗体而言减少的数目的岩藻糖残基。
在一个实施方案中，本发明提供了双特异性抗体，其特征在于，在所述第一结合部分中与人CEACAM5和CEACAM6特异性地结合和在所述第二结合部分中与人CD47特异性地结合。在一个实施方案中，本发明涉及双特异性抗体CEAxCD47，其以平衡的方式与人CEACAM5和人CEACAM6特异性地结合。在一个实施方案中，所述双特异性抗体以与人重组CEACAM5和CEACAM6相结合为特征，其特征在于，与CEACAM5和CEACAM6的结合的EC50值相差小于3倍(平衡的结合，以平衡的方式结合，参见表5)。在基于链霉抗生物素蛋白/生物素的ELISA中测量结合(参见实施例8f)。
在一个实施方案中，本发明提供了在所述第一结合部分中与人CEACAM5和CEACAM6特异性地结合和在所述第二结合部分中与人CD47特异性地结合的双特异性抗体，其特征在于：
a)所述第一结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ IDNO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:112的CDRL1、SEQ ID NO:113的CDRL2和SEQ ID NO:114的CDRL3作为CDR，和
b)所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ IDNO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:28的CDRL1、SEQ ID NO:29的CDRL2和SEQ ID NO:30的CDRL3作为CDR。
在一个实施方案中，本发明涉及与人CEACAM5和人CD47特异性地结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，其特征在于，所述第一结合部分与氨基酸35-144的CEACAM5的Ig-样V-型结构域相结合。
在一个实施方案中，本发明涉及与人CEACAM5和人CD47特异性地结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，其特征在于，所述双特异性抗体与抗-CEA抗体SM3E竞争与CEACAM5的结合，所述抗-CEA抗体SM3E包含序列SEQ ID NO:100和101的VK和VH作为VK和VH结构域。
在一个实施方案中，本发明涉及与人CEACAM5和人CD47特异性地结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，其特征在于，所述双特异性抗体不与下列抗-CEA抗体竞争与CEACAM5的结合：SM3E；MEDI，其包含序列SEQ ID NO:102和103的VL和VH作为VL和VH结构域；拉贝珠单抗(Lab)，其包含序列SEQ ID NO:110和111的VK和VH作为VK和VH结构域；SAR，其包含序列SEQ ID NO:104和105的VK和VH作为VK和VH结构域；T86.66，其包含序列SEQ ID NO:108和109的VK和VH作为VK和VH结构域；CH1A1A，其包含序列SEQ ID NO:106和107的VK和VH作为VK和VH结构域。
在一个实施方案中，本发明涉及与人CEACAM5和人CD47特异性地结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，其特征在于，在相同实验条件下和在1mg/ml人IgG存在或不存在下，所述双特异性抗体的MKN45细胞的吞噬作用的EC50值在参考抗体K2AC22的E50值的0.1至3倍的范围内。在进一步的实施方案中，所述范围为0.2至3.0，0.3至3.0，0.5至2.5，或1.0至2.5。吞噬作用的EC50值作为吞噬指数曲线的EC50值进行测量(基于成像的吞噬作用测定法，参见实施例9和图12和表3)。
在一个实施方案中，本发明涉及与人CEACAM5和人CD47特异性地结合的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，其特征在于，在1mg/ml人IgG存在下，所述双特异性抗体的最大吞噬指数(参见实施例9.2；基于CellInsightTM的测定法)相比于在相同实验条件下但没有添加人IgG时所测量的最大吞噬指数而言没有降低30％或更多(参见例如图17)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体以包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分为特征，其特征在于：
a)所述第一结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQ ID NO:3的CDRH3，和SEQ ID NO:13的人λ类型的轻链恒定结构域；并且所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQID NO:3的CDRH3，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:7的CDRL1、包括在SEQ ID NO:8中的AlaAla Ser的CDRL2和SEQ ID NO:9的CDRL3；或者
b)所述第一结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ IDNO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和SEQ ID NO:13的人λ类型的轻链恒定结构域；并且所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:28的CDRL1、SEQ ID NO:29的CDRL2和SEQ ID NO:30的CDRL3。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体以包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分为特征，其特征在于：
a)所述第一结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ IDNO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含从由下列各项组成的组中选择的CDRL1、CDRL2和CDRL3的组合：
SEQ ID NO:31、32和33；SEQ ID NO:34、35和36；SEQ ID NO:37、38和39；SEQ IDNO:40、41和42；SEQ ID NO:43、44和45；SEQ ID NO:46、47和48；SEQ ID NO:49、50和51；SEQID NO:52、53和54；SEQ ID NO:55、56和57；SEQ ID NO:58、59和60；SEQ ID NO:61、62和63；SEQ ID NO:112、113和114，并且
b)所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ IDNO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:28的CDRL1、SEQ ID NO:29的CDRL2和SEQ ID NO:30的CDRL3作为CDR。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，在所述第一结合部分中包含SEQ ID NO:13的人λ类型结构域作为轻链恒定结构域。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体以包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分为特征，其特征在于，
a)所述第一结合部分包含SEQ ID NO:4的重链可变区(VH)和从由下列各项组成的包括在VLCL区中的VL的组中选择的轻链可变区：SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:115，并且
b)所述第二结合部分包含SEQ ID NO:4的重链可变区和SEQ ID NO:10的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体以包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分为特征，其特征在于，
a)所述第一结合部分包含SEQ ID NO:5的重链和从由下列各项组成的组中选择的轻链：SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQID NO:115，
b)所述第二结合部分包含SEQ ID NO:5的重链可变区和SEQ ID NO:11的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于对于所述第一结合部分来说是单价的和对于所述第二结合部分来说是单价的。
在一个实施方案中，所述恒定区和可变构架区序列是人的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，所述第一和第二结合部分中的每一个包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于是人IgG1类型的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体为全长抗体。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，包含与CEA特异性地结合的第一结合部分，其包含κ轻链可变结构域和λ轻链恒定结构域；和与CD47特异性地结合的第二结合部分，其包含κ轻链可变结构域和κ轻链恒定结构域(κλ双特异性抗体，κλ体，类型1)。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，包含特异于CEA的第一结合部分，其包含λ轻链可变结构域和λ轻链恒定结构域；和特异于CD47的第二结合部分，其包含κ轻链可变结构域和κ轻链恒定结构域(κλ双特异性抗体，κλ体，类型2)。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体是完全人的双特异性IgG(尤其是IgG1)形式，和另外是类型1或类型2的κλ双特异性抗体。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于为类型1或类型2的κλ双特异性抗体并且包含共同重链(cHC)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，以100nM至600nM的结合亲和力，在一个实施方案中以100nM至500nM的结合亲和力与人CD47相结合。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，以1至200nM的EC50值与MKN-45细胞相结合。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，以1至50nM的EC50值与MKN-45细胞相结合。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，以50至100nM的EC50值与MKN-45细胞相结合。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，以100至200nM的EC50值与MKN-45细胞相结合。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在5000ng/ml可溶性CEA存在下关于通过所述双特异性抗体的在人巨噬细胞存在下MKN-45细胞的吞噬作用的最大可取得的吞噬指数相比于在没有可溶性CEA的情况下所测量的吞噬指数而言没有减少超过20％。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在200ng/ml可溶性CEA存在下关于通过所述双特异性抗体的在人巨噬细胞存在下MKN-45细胞的吞噬指数曲线的EC50相比于在没有可溶性CEA的情况下所测量的EC50而言没有向更高浓度位移超过4倍，和/或通过添加200ng/mL sCEA没有使吞噬指数曲线的最大值减少10％或更多，15％或更多，或者20％或更多(参见例如图20B)。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在200ng/ml可溶性CEA存在下关于所述双特异性抗体的与MKN-45细胞的结合曲线的EC50相比于在没有可溶性CEA的情况下所测量的EC50而言没有向更高浓度位移超过2倍(参见例如图20A)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，它不与人CEACAM1交叉反应。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，以1至50nM的EC50值与在重组CHO细胞CHO-K1(
Figure BDA0002928449420000151
CCL-61TM)上表达的人CEACAM6相结合(用包含人CEACAM6的cDNA的载体转染CEACAM6阴性CHO细胞以得到表达出CEACAM6蛋白)。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在300nM的浓度下，包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区的与人CEACAM5特异性地结合的单克隆抗体(进一步地也被称为MAB CEA)没有使对于MKN-45细胞的本发明的双特异性抗体的结合曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在300nM的浓度下，包含SEQ ID NO:97和98的重链作为重链和SEQ ID NO:96和99的轻链作为轻链的与人CEACAM5和CD3ε特异性地结合的双特异性抗体(进一步地也被称为CEA-TCB)没有使对于MKN-45细胞的本发明的双特异性抗体的结合曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。在这样的情况下，根据本发明的双特异性抗体和CEA-TCB被定义为“不是竞争性的”并且被认为能够同时与CEA相结合而不显著地干扰与所述CEA的结合。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在30nM的浓度下，包含氨基酸序列SEQ ID NO:92至95的链作为重链和轻链的与人CEACAM5和CD3ε特异性地结合的双特异性抗体(进一步地也被称为CEA-TCB1)没有使对于MKN-45细胞的本发明的双特异性抗体的结合曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。在这样的情况下，根据本发明的双特异性抗体和CEA-TCB1被定义为“不是竞争性的”并且被认为能够同时与CEA相结合而不显著地干扰与所述CEA的结合。在这样的情况下，根据本发明的双特异性抗体和MAB CEA、CEA-TCB和/或CEA-TCB1被定义为“不是竞争性的”并且被认为能够同时与CEA相结合而不显著地干扰它们与所述CEA的结合。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在30nM的浓度下，包含氨基酸序列SEQ ID NO:92至95的链作为重链和轻链的与人CEACAM5和CD3ε特异性地结合的双特异性抗体(进一步地也被称为CEA-TCB1)没有使对于MKN-45细胞的本发明的双特异性抗体的吞噬指数曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。在这样的情况下，根据本发明的双特异性抗体和CEA-TCB1被定义为“不是竞争性的”并且被认为能够同时与CEA相结合而不显著地干扰它们与所述CEA的结合，并且因此可以显现出不受打扰的其对于吞噬作用的效应(CEAxCD47)和还有不受打扰的其对于T-细胞激活的效应(CEAxTCB1)，即使治疗性水平的这两种药物同时存在于肿瘤组织中(参见图18)。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在300nM的浓度下，包含氨基酸序列SEQ ID NO:96至99的链作为重链和轻链的与人CEACAM5和CD3ε特异性地结合的双特异性抗体(进一步地也被称为CEA-TCB)没有使对于MKN-45细胞的本发明的双特异性抗体的吞噬指数曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。在这样的情况下，根据本发明的双特异性抗体和CEA-TCB被定义为“不是竞争性的”并且被认为能够同时与CEA相结合而不显著地干扰它们与所述CEA的结合，并且因此可以显现出不受打扰的其对于吞噬作用的效应(CEAxCD47)和还有不受打扰的其对于T-细胞激活的效应(CEA-TCB)，即使治疗性水平的这两种药物同时存在于肿瘤组织中(参见图18)。这有助于CEA-TCB/TCB1与本发明的CEAxCD47的组合治疗(参见图18)。
SEQ ID NO:88至99的序列分别是根据US20140242079和WO2017055389的。
在一个实施方案中，与CEAxCD3双特异性抗体如CEA-TCB和CEA-TCB1相组合的本发明的CEAxCD47双特异性抗体在包含MKN-45肿瘤细胞和源自相同志愿者人供者的人巨噬细胞和T-细胞的测定法中显示出至少累加的或甚至协同的肿瘤细胞的％杀伤(参见图19A和B)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，包含共同重链(cHC)作为所述第一结合部分的重链和作为所述第二结合部分的重链。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，每个结合部分的所述共同重链包含SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQ ID NO:3的CDRH3，或者SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ IDNO:27的CDRH3作为CDR。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，每个结合部分的所述共同重链包含SEQ ID NO:4作为共同可变重链结构域(cVH)。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，包含从由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成的组中选择的共同重链(cHC)。在一个实施方案中，SEQ ID NO:5的共同重链由SEQID NO:6中所显示的核酸序列编码。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，作为特异于CD47的第二结合部分，包含：共同重链，其包含SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQID NO:3的CDRH3作为CDR，和轻链(LC)，其包含SEQ ID NO:7的CDRL1、包括在SEQ ID NO:8中的Ala Ala Ser的CDRL2和SEQ ID NO:9的CDRL3作为CDR；或者共同重链，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链(LC)，其包含SEQ ID NO:28的CDRL1、SEQ ID NO:29的CDRL2和SEQ ID NO:30的CDRL3作为CDR。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，作为第二结合部分，包含：包含SEQ ID NO:4作为可变重链结构域(cVH)的重链，和SEQ ID NO:10的可变轻链结构域(VL)。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，作为第二结合部分，包含SEQ ID NO:5的重链(cHC)和SEQ ID NO:11的轻链(CL)。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，作为第二结合部分，包含SEQ ID NO:23的重链(cHC)和SEQID NO:11的轻链(CL)。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，作为第二结合部分，包含SEQ ID NO:24的重链(cHC)和SEQ ID NO:11的轻链(CL)。在一个实施方案中，SEQ ID NO:11的轻链(LC)由SEQ ID NO:12中所显示的核酸序列编码。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，与CEA特异性地结合并且包含SEQ ID NO:13的轻链恒定结构域。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，以0.1至10nM的IC50抑制与在MKN-45细胞上的CD47之间的相互作用。以200ng/ml的浓度(带有His标签的可溶性SIRPα)使用SIRPα(SIRPα，CD172a；UniProtKB P78324)。该测定法的细节描述在实施例8中(CD47抗体的SIRPα阻断活性)，和结果显示在表2中。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于在低于10nM的所述双特异性抗体的EC50下通过人巨噬细胞的对于表达CEA的肿瘤细胞系如MKN-45细胞的浓度依赖性吞噬作用(ADCP)。根据本发明，将ADCP测量为吞噬指数(EC50或最大值)，这通过成像来进行，其通常采用1:3的E:T比率(人巨噬细胞；靶细胞(肿瘤细胞)；参见例如图12、15和16)。在图3B中的结果用1:1的E:T来获得。该测定法的细节描述在实施例9.2中。
对于进一步的信息，在低于10nM的所述双特异性抗体的EC50下通过人巨噬细胞的对于表达CEA的肿瘤细胞系如MKN-45细胞的吞噬作用(ADCP)。ADCP也可以通过流式细胞术来进行测量，采用例如3:1的E:T比率(人巨噬细胞；靶细胞(肿瘤细胞)；参见图3A)。该测定法的细节描述在实施例9中(1.基于流式细胞术的ADCP测定法)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，与CEACAM5特异性地结合，但是不与MAB CEA、CEA-TCB和/或CEA-TCB1竞争与在肿瘤细胞如MKN-45上的CEACAM5的结合。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，通过添加以300nM的浓度的MAB CEA或CEA-TCB或者通过添加以30nM的浓度的CEA-TCB1，关于与MKN-45的结合的EC50值(1至200nM的EC50)增加小于三倍(无竞争)。
在一个实施方案中，本发明的CEAxCD47抗体显示出相比于用B6H12.2在相同测定法(实施例15)中所测量的EC50而言100倍或更多倍更高的关于RBC吞噬作用的EC50。
在一个实施方案中，本发明的CEAxCD47抗体(携带wtIgG1 Fc，其没有或具有无岩藻糖基化)在直至200μg/mL的浓度下不显示出显著的血小板激活(参见实施例15和在实施例15中对于CEAxCD47双特异性抗体K2AC5和K2AC22所提及的结果)。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的双特异性抗体，其已经进行了糖改造从而具有有着经修饰的寡糖的Fc区。令人惊奇地发现，根据本发明的此类经糖改造的双特异性抗体的特征在于比相同的未糖改造的(亲本)双特异性抗体至少3倍更低的通过基于成像的测定法所测量的关于吞噬指数曲线的EC50值，如果在相同实验条件下测量。在一个实施方案中，关于吞噬指数的EC50为5至10倍更低，或者10至30倍更低。在一个实施方案中，所述Fc区已被修饰从而具有相比于相同但非糖改造的双特异性抗体而言减少的数目的岩藻糖残基。在另一个实施方案中，所述Fc区具有相比于非糖改造的双特异性抗体而言增加的比例的平分型寡糖。在另外一个实施方案中，所述平分型寡糖是大部分地平分型的复合物。在另一个实施方案中，本发明的经糖改造的抗原结合分子在所述双特异性抗体的Fc区中具有相比于非糖改造的双特异性抗体而言增加的比例的平分型的、非岩藻糖基化的寡糖。备选地，本发明的双特异性抗体可以在所述Fc区中具有相比于非糖改造的双特异性抗体而言增加的GIcNAc残基与岩藻糖残基的比率。在一个实施方案中，所述平分型的、非岩藻糖基化的寡糖大部分地是以杂合形式的。备选地，所述平分型的、非岩藻糖基化的寡糖大部分地是复合物类型。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在所述Fc区中50％至100％的N-联寡糖是非岩藻糖基化的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，在所述Fc区中50％至100％的N-联寡糖是平分型的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，在所述Fc区中80％至100％的N-联寡糖是平分型的且非岩藻糖基化的。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，由所述经糖改造的抗体所诱导的浓度/ADCC曲线(EC50的降低或ADCC的最大值的增加(参见图13和14))相比于由相同但非糖改造的双特异性抗体所诱导的ADCC而言增加至少1.2倍。在一个实施方案中，ADCC增加1.2至2.0倍。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于相比于相同但未糖改造的(亲本)双特异性抗体而言至少3倍更低的通过基于成像的测定法所测量的关于吞噬指数曲线的EC50值，如果在相同实验条件下测量。在一个实施方案中，关于吞噬指数的EC50为5至10倍更低，或者10至30倍更低。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，由所述经糖改造的抗体所诱导的并且通过流式细胞术所测量的最大吞噬指数相比于由相同但非糖改造的双特异性抗体所诱导的最大吞噬指数而言增加至少1.2倍。在一个实施方案中，最大吞噬指数增加1.2至2.0倍。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，由所述经糖改造的抗体所诱导的并且通过成像所测量的最大吞噬指数相比于由相同但非糖改造的双特异性抗体所诱导的最大吞噬指数而言增加至少1.2倍。在一个实施方案中，最大吞噬指数增加1.2至2.0倍。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在所述Fc区中包含一个、两个或三个从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换(“Fc氨基酸置换”)：单置换S239D、I332E、G236A；双置换I332E和G236A、S239D和I332E、S239D和G236A；以及三重置换S329D和I332E和G236A。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在所述Fc区中包含一个、两个或三个从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换：单置换S239D、I332E、G236A；双置换I332E和G236A、S239D和I332E、S239D和G236A；以及三重置换S329D和I332E和G236A；以及已经进行了糖改造从而具有相比于相同但非糖改造的双特异性抗体而言减少的数目的岩藻糖残基的Fc区。
在一个实施方案中，在所述Fc区中包含所述置换的双特异性抗体的特征在于，由所述经氨基酸置换的抗体所诱导的浓度/ADCC曲线(EC50的降低或ADCC的最大值的增加)相比于由在所述Fc区中不包含任一个所述氨基酸置换的所述抗体所诱导的ADCC而言增加至少1.2倍。在一个实施方案中，ADCC增加1.2至2.0倍。
在一个实施方案中，在所述Fc区中包含所述置换的双特异性抗体的特征在于相比于在所述Fc区中不包含任一个所述氨基酸置换的相同(亲本)双特异性抗体而言至少3倍更低的通过基于成像的测定法所测量的关于吞噬指数曲线的EC50值，如果在相同实验条件下测量。在一个实施方案中，关于吞噬指数的EC50为5至10倍更低，或者10至30倍更低。
在一个实施方案中，在所述Fc区中包含所述置换的双特异性抗体的特征在于，以流式细胞术测定的由所述经氨基酸置换的抗体所诱导的最大吞噬作用(ADCP)相比于由所述在所述Fc区中不包含任一个所述氨基酸置换的抗体所诱导的ADCP而言增加至少1.2倍。在一个实施方案中，ADCP增加1.2至2.0倍。在一个实施方案中，在所述Fc区中包含所述置换的双特异性抗体的特征在于，通过成像测定的由所述经氨基酸置换的抗体所诱导的最大吞噬指数相比于由所述在所述Fc区中不包含任一个所述氨基酸置换的抗体所诱导的ADCP而言增加至少1.2倍。在一个实施方案中，ADCP增加1.2至2.0倍。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在所述Fc区中50％至100％、60％至100％、70％至100％或80％至100％的N-联寡糖是非岩藻糖基化的。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在所述Fc区中50％至100％、60％至100％、70％至100％或80％至100％的N-联寡糖是平分型的。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，在所述Fc区中50％至100％、60％至100％、70％至100％或80％至100％的N-联寡糖是平分型的、非岩藻糖基化的。
在一个实施方案中，所述经糖改造的双特异性抗体包含相比于包含SEQ ID NO:5作为共同重链的非糖改造的双特异性抗体(亲本双特异性抗体，在如下面所定义的标准条件下在CHO K1细胞系CHO-K1(
Figure BDA0002928449420000221
CCL-61TM)中产生)而言增加的效应子功能。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的特征在于，所述经糖改造的双特异性抗体包含一个或多个增加的效应子功能，例如从由下列各项组成的组中选择的那些：增加的与FcγR的结合亲和力，增加的巨噬细胞的结合(增加的抗体依赖性细胞吞噬；ADCP)，增加的NK细胞的结合(增加的抗体介导的细胞毒性；ADCC)，和增加的与单核细胞的结合。
对于抗-CD47单克隆抗体hu5F9-G4所测量的浓度/吞噬指数曲线(在自2014年开始的临床试验中进行测试，参见例如clintrial.gov)通过向该测定法添加以1mg/mL的生理浓度添加的huIgG而强烈地减小(在基于成像的测定法中所测量的EC50的增加和吞噬曲线的最大值的降低，参见例如图17)。
令人惊讶地，本发明的CEAxCD47抗体仅显示出EC50的低于3倍的小位移，并且没有显示出浓度/吞噬指数曲线的最大值的显著降低，如果添加人IgG(参见表4)。
在一个实施方案中，本发明的CEAxCD47抗体的特征在于，向基于成像的吞噬作用测定法添加1mg/mL的hu IgG引起浓度/吞噬指数曲线的最大值的小于0.9倍的减少和/或EC50向更高浓度的小于3倍的位移(参见表4)。
本发明的一个进一步的实施方案为分离的多核苷酸，其特征在于编码根据本发明的双特异性抗体。
本发明的一个进一步的实施方案为表达载体，其包含根据本发明的多核苷酸。
本发明的一个进一步的实施方案为宿主细胞，其包含根据本发明的表达载体。
本发明的一个进一步的实施方案为用于产生根据本发明的双特异性抗体的方法，其特征在于包括：
a)在允许产生所述本发明的抗体的条件下培养包含编码所述双特异性抗体的表达载体的宿主细胞，和
b)分离所述抗体，其中所述抗体能够与CEA和CD47特异性地结合。
在一个实施方案中，本发明的特征在于，包括用于在宿主细胞中产生根据本发明的经糖改造的双特异性抗体的方法，所述方法包括：
a)在允许产生所述本发明的双特异性抗体并且允许修饰在所述双特异性抗体的Fc区上存在的寡糖的条件下培养经糖改造从而表达至少一种编码具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽的核酸的宿主细胞；和
b)分离所述经糖改造的双特异性抗体，其中所述经糖改造的双特异性抗体能够与CEA和CD47特异性地结合。
在一个实施方案中，本发明的特征在于，包括用于在宿主细胞中产生经糖改造的双特异性抗体的方法，所述方法包括：
a)在允许产生所述本发明的双特异性抗体并且允许修饰在所述双特异性抗体的Fc区上存在的寡糖的条件下培养通过靶向破坏FUT8基因而经糖改造的宿主细胞，和
b)分离所述经糖改造的双特异性抗体，其中所述经糖改造的双特异性抗体能够与CEA和CD47特异性地结合。
在一个实施方案中，本发明的特征在于，包括用于在宿主细胞中产生根据本发明的Fc经置换的双特异性抗体的方法，所述方法包括：
a)在允许产生所述双特异性抗体的条件下培养包含编码本发明的Fc经置换的双特异性抗体的表达载体的宿主细胞，和
b)分离所述Fc经置换的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体能够与CEA和CD47特异性地结合。
本发明的一个进一步的实施方案为诱导肿瘤细胞的细胞裂解的方法，其包括使所述肿瘤细胞与根据本发明的双特异性抗体相接触。所述肿瘤细胞为人肿瘤细胞，其优选地在患者中。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为结肠直肠癌细胞、NSCLC(非小细胞肺癌)细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞或另一种表达CEA的肿瘤细胞。
本发明的一个进一步的实施方案为治疗具有表达CEA的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明的双特异性抗体。
本发明的一个进一步的实施方案为在具有表达CEA的癌症的受试者中增加存活时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明的双特异性抗体。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的方法，其特征在于，所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的方法，其特征在于，根据本发明的双特异性抗体与化学疗法或放射疗法相组合地施用给人受试者。
本发明的一个进一步的实施方案为治疗具有表达CEA的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明的双特异性抗体，其特征在于，在相同实验条件下和在1mg/ml人IgG存在和/或不存在下，所述双特异性抗体的吞噬作用的EC50值在参考抗体K2AC22的E50值的0.1至3倍的范围内。在进一步的实施方案中，所述范围为0.2至3.0、0.3至3.0、0.5至2.5或1.0至2.5。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，以100nM至600nM的结合亲和力，在一个实施方案中以100nM至500nM的结合亲和力与人CD47相结合。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的双特异性抗体在治疗具有表达CEA的癌症的受试者的方法中的用途，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明的双特异性抗体，其特征在于，在相同实验条件下和在1mg/ml人IgG存在和/或不存在下，所述双特异性抗体的吞噬作用的EC50值在参考抗体K2AC22的E50值的0.1至3倍的范围内。在进一步的实施方案中，所述范围为0.2至3.0、0.3至3.0、0.5至2.5或1.0至2.5。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于，以100nM至600nM的结合亲和力，在一个实施方案中以100nM至500nM的结合亲和力与人CD47相结合。
如从图13至17中可以看出的，根据本发明的抗体的ADCC和ADCP/吞噬指数值不受或仅以低程度受到处于1mg/ml(在大多数患者中存在1mg/ml或甚至更高的人IgG)的浓度下的人IgG的影响，而对于现有技术的抗-CD47抗体(hu5F9-G4)，在1mg/mL人IgG存在下ADCC和ADCP值强烈地减小。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗具有表达CEA的癌症的受试者。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的双特异性抗体在制备根据本发明的药物中的用途，其特征在于，所述癌症选自由结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌组成的组。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分和与人CD3ε特异性地结合的第四结合部分。本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的双特异性抗体，其用于与CEA-TCB和/或CEA-TCB1以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述第三结合部分包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的双特异性抗体，其特征在于不与所述第二双特异性抗体竞争，并且其用于与所述第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的双特异性抗体，其特征在于不与CEA-TCB或CEA-TCB1竞争，并且其用于与所述CEA-TCB或CEA-TCB1以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的双特异性抗体，其特征在于与CEA-TCB或CEA-TCB1竞争，并且其用于与所述CEA-TCB或CEA-TCB1以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地进行使用，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:88的重链可变区和SEQ IDNO:89的轻链可变区；和与人CD3ε特异性地结合的第四结合部分，其包含SEQ ID NO:90的重链可变区和SEQ ID NO:91的轻链可变区。
本发明的一个进一步的实施方案为用于根据本发明的用途的根据本发明的双特异性抗体，其特征在于，以6至15天的间隔向所述受试者交替地施用根据本发明的双特异性抗体和所述第二双特异性抗体。
本发明的一个进一步的实施方案为用于根据本发明的用途的根据本发明的双特异性抗体，其特征在于，以6至15天的间隔向所述受试者同时地施用根据本发明的双特异性抗体和所述第二双特异性抗体。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的第一双特异性抗体，其包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区；和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，由此在300nM的浓度下所述第二双特异性抗体不使根据本发明的双特异性抗体的对于MKN-45细胞的吞噬指数曲线的EC50值位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的第一双特异性抗体，其包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:88的重链可变区和SEQ ID NO:89的轻链可变区；和与人CD3ε特异性地结合的第四结合部分，其包含SEQ ID NO:90的重链可变区和SEQ ID NO:91的轻链可变区，由此在30nM的浓度下所述第二双特异性抗体不使根据本发明的双特异性抗体的对于MKN-45细胞的结合曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的第一双特异性抗体，其用于与CEA-TCB或CEA-TCB1以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用，由此在300nM的浓度下所述CEA-TCB或者在30nM的浓度下所述CEA-TCB1不使根据本发明的双特异性抗体的对于MKN-45细胞的结合曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。
本发明的一个进一步的实施方案为用于根据本发明的用途的根据本发明的第一双特异性抗体，其包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分(根据本发明)，其特征在于，所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
本发明的一个进一步的实施方案为包含根据本发明的双特异性抗体的组合物，其特征在于不与上面所定义的所述第二双特异性抗体竞争，并且其用于在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用。
本发明的一个进一步的实施方案为包含根据本发明的双特异性抗体的组合物，其特征在于不与第二双特异性抗体竞争，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区；和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，并且其用于在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用。
本发明的一个进一步的实施方案为包含根据本发明的双特异性抗体的组合物，其特征在于不与第二双特异性抗体竞争，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:88的重链可变区和SEQ ID NO:89的轻链可变区；和与人CD3ε特异性地结合的第四结合部分，其包含SEQ ID NO:90的重链可变区和SEQ IDNO:91的轻链可变区，并且其用于在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用。本发明的一个进一步的实施方案为包含根据本发明的双特异性抗体的组合物，其特征在于不与CEA-TCB和/或CEA-TCB1竞争。
本发明的一个进一步的实施方案为用于治疗被诊断为具有肿瘤(癌症)，尤其是实体肿瘤，尤其是表达CEA的实体癌，尤其是结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌的人患者的方法，其包括向所述人患者施用有效量的根据本发明的双特异性抗体和针对CEA和CD3的上面所描述的第二双特异性抗体(在一个实施方案中，CEA-TCB或CEA-TCB1)，所述方法随后包括：
向所述患者施用0.1至10mg/kg，在一个进一步的实施方案中0.5至10mg/kg，在一个进一步的实施方案中1至2mg/kg的所述第二抗CEAxCD3抗体的剂量，例如在4至12周内每周一次，
向所述患者施用所述第二抗体，q1、q2w、q3w或任选地q4w，
在这些4至12周之后和在所述抗CEAxCD3抗体的另外2或3或4个消除半寿期之后，向所述患者施用0.1至20mg/kg的根据本发明的抗体的剂量，
向所述患者施用所述根据本发明的抗体，q1、q2w、q3w或任选地q4w，
等待所述根据本发明的抗体的2或3或4个消除半寿期，和然后
任选地重复CEA x CD3双特异性抗体施用和随后的CEA x CD47双特异性抗体施用的所述循环，和任选地再次重复那个循环。
如果本发明的抗体和所述第二双特异性抗体是竞争性的，那么应用该“交替的”方法。
在所述CEA x CD3双特异性抗体和根据本发明的CEA x CD47双特异性抗体不是竞争性的情况下，也可以以这样的方式(“同时的方式”)施用这两种双特异性抗体，即患者平行地经历这两种双特异性抗体的在治疗上有效的血浆和组织浓度，例如通过在大约相同的时间向所述患者施用0.1至10mg/kg，在一个进一步的实施方案中0.5至10mg/kg，在一个进一步的实施方案中1至2mg/kg的所述CEA x CD3双特异性抗体，和1至20mg/kg的本发明的CEA x CD47双特异性抗体的剂量，随后为一次或多次这些组合施用，以q1w或q2w或q3w或任选地q4w的频率。
术语“q1w”意味着一周一次施用；q2w意味着每两周一次施用，等等。
本发明的一个进一步的实施方案为药用组合物，其包含根据本发明的抗体和在药学上可接受的赋形剂或运载体。
本发明的一个进一步的优选实施方案为包含根据本发明的抗体的药用组合物，其用于作为药物进行使用。
本发明的一个进一步的优选实施方案为包含根据本发明的抗体的药用组合物，其用于在治疗实体肿瘤病症中作为药物进行使用。
本发明的一个进一步的优选实施方案为包含根据本发明的抗体的药用组合物，其用于在治疗结肠直肠癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌中作为药物进行使用。
本发明的一个进一步的实施方案为包含根据本发明的双特异性抗体的组合物，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区；和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，由此在300nM的浓度下所述第二双特异性抗体不使根据本发明的双特异性抗体的对于MKN-45细胞的结合曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。
本发明的一个进一步的实施方案为包含根据本发明的双特异性抗体的组合物，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:88的重链可变区和SEQ ID NO:89的轻链可变区；和与人CD3ε特异性地结合的第四结合部分，其包含SEQ ID NO:90的重链可变区和SEQ ID NO:91的轻链可变区，由此在30nM的浓度下所述第二双特异性抗体不使根据本发明的双特异性抗体的对于MKN-45细胞的结合曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的组合物，其特征在于，所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的抗体在制备药用组合物中的用途。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的抗体和在药学上可接受的赋形剂或运载体在制备药用组合物中的用途。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的抗体在制备用于治疗实体肿瘤病症的药物中的用途。
本发明的一个进一步的实施方案为根据本发明的抗体在治疗结肠直肠癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌中的用途。
本发明的另一个方面提供了诱导肿瘤细胞的细胞裂解的方法，其包括使所述肿瘤细胞与上面所描述的实施方案中任一个的双特异性抗体相接触。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞为结肠直肠癌细胞、NSCLC(非小细胞肺癌)细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞或乳腺癌细胞。
在一个实施方案中，所述细胞裂解通过所述双特异性抗体的抗体依赖性细胞吞噬和/或抗体依赖性细胞毒性来诱导。
本发明的另一个方面提供了治疗具有异常地表达CEA的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的上面所描述的实施方案中任一个的双特异性抗体。
本发明的另一个方面提供了治疗具有异常地表达CEA的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的上面所描述的实施方案中任一个的双特异性抗体以及与之相组合的与人CEA和人CD3相结合的双特异性抗体。如果所述CEAxCD47抗体和所述CEAxCD3抗体是竞争型的，那么它们将会竞争在肿瘤细胞表面上的CEA受体，并且关于每个组合伙伴的受体占有和效力取决于其结合亲和力和其血浆浓度并且因此是难以预测的和也是随时间可变的，如果这两种药物的浓度具有不同的消除半寿期或者从身体中的清除。因此，竞争型的CEAxCD3和CEAxCD47双特异性抗体应当顺次地(交替地)给予。如果所述CEAxCD3和CEAxCD47双特异性抗体不是或仅最小程度地是竞争型的，那么它们不仅可以顺次地而且可以平行地(同时地)给予，这可能是一种优势，因为经由通过所述CEAxCD3双特异性抗体使T-细胞参加和同时经由通过所述CEAxCD47双特异性抗体使巨噬细胞参加的肿瘤细胞杀伤是累加的或者可以甚至是协同的，这意味着如果平行地给予这两种药物，效力增加。
本发明的另一个方面提供了在具有异常地表达CEA的癌症的受试者中提高无进展存活和/或总存活时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的上面所描述的实施方案中任一个的双特异性抗体。在一个实施方案中，所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌或者另一种表达CEA的癌症。
在这些方法的某些实施方案中，所述双特异性抗体与化学疗法或放射疗法相组合地进行施用。在一个实施方案中，所述受试者为罹患结肠直肠癌或肺癌或胃癌或胰腺癌或乳腺癌或另一种表达CEA的癌症的患者。
本发明的另一个方面提供了治疗具有异常地表达CEA的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的上面所描述的实施方案中任一个的双特异性抗体以及与之相组合的针对人CEA和人CD3ε的双特异性抗体。
本发明的另一个方面提供了在具有异常地表达CEA的癌症的受试者中提高无进展存活时间和/或总存活时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的上面所描述的实施方案中任一个的双特异性抗体。在一个实施方案中，所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
在这些方法的某些实施方案中，所述双特异性抗体与化学疗法或放射疗法相组合地进行施用。在一个实施方案中，所述受试者为具有结肠直肠癌或肺癌或胃癌或胰腺癌或乳腺癌或另一种表达CEA的癌症的癌症患者。
本发明的另一个实施方案提供了根据本发明的双特异性抗体用于上面所描述的治疗方法中任一种治疗方法的用途。在一个实施方案中，所述癌症选自由结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌组成的组。
附图简述
图1显示了本发明的CEAxCD47双特异性抗体的一般分子形式；与IgG单克隆抗体无法区分且不具有aa桥以使免疫原性和抗药物抗体ADA形成最小化的完全人的IgG1结构；共同重链(参见序列表)；在CD47结合部分中的κ轻链(CL和VL)(参见序列表)；在CEA结合部分中的λCL(参见序列表)和在CEA结合部分中的λ或κVL(A)；Fc的糖改造(低岩藻糖)或aa突变或两者以增加ADCP和ADCC(B)。
图2显示了TAAxCD47双特异性抗体与在表面上携带TAA以及CD47的肿瘤细胞的结合。所述TAAxCD47以1至50nM的EC50的结合(实线，关于本发明的各种CEAxCD47抗体的结合曲线，还可参见图11)；虚线示例性地和示意性地显示了通过例如可溶性CEA的结合曲线的潜在位移，对于具体数据，参见图20A，其显示了例如200ng/mL可溶性CEA对于本发明的CEAxCD47双特异性抗体如K2AC5和22的对于MKN-45细胞的结合曲线的影响。
图3A显示了用本发明的携带CD47结合臂的TAAxCD47双特异性抗体、相应的CD47和TAA单价抗体以及高亲和力抗-TAA(MSLN)单克隆抗体Amatuximab，人胰腺癌细胞系HPAC(其表达CEA和其他TAA如间皮素(mesothelin)MSLN)的吞噬作用(通过流式细胞术来进行评估并且表示为吞噬作用的％)的浓度依赖性增加。所有抗体都携带有野生型IgG1 Fc部分。所述双特异性抗体显示出最高的吞噬作用。
图3B显示了由各种抗体所诱导的吞噬作用(用CellInsight测定法来进行评估并且表示为吞噬指数)的浓度依赖性增加；曲线1：不与TAA或CD47相结合的对照hIgG1；曲线2：具有野生型hIgG1 Fc的TAAxCD47双特异性抗体；曲线3：具有野生型hIgG1的抗CD47抗体B6H12.2；曲线4：在hIgG1 Fc部分中具有DEA aa置换(S329D、I332E和G236A)的TAAxCD47双特异性抗体。用具有DEA经突变的Fc的TAAxCD47取得了最强的吞噬作用。
图4显示了对于各种TAA x CD47双特异性抗体(TAA为间皮素MSLN)的ADCC剂量应答曲线(用Cr51+测定法来进行评估并且表示为％特异性杀伤)的例子，所有双特异性抗体都携带相同的本发明的CD47结合臂，其中使用肺癌NCI-H226癌细胞作为靶细胞(hu志愿者PBMC:肿瘤细胞50:1)。所有双特异性抗体显示出比高亲和力抗-TAA单克隆抗体Amatuximab(一种抗-MSLN mAb)更强的ADCC。
图5显示了对于具有野生型Fc的TAAxCD47双特异性抗体、具有携带DEA突变的Fc的相应的TAAxCD47双特异性抗体、高亲和力抗-TAA单克隆抗体(在该图中的TAA不是CEA)和人IgG1对照抗体的ADCC剂量应答曲线(使用Cr51+测定法来进行评估并且表示为％特异性杀伤)；使用肺癌NCI-H226癌细胞作为靶细胞(效应细胞:肿瘤细胞50:1)。用携带DEA突变的双特异性抗体观察到最强的ADCC。
图6显示了通过TAAxCD47双特异性抗体(实线)和相应的抗-CD47单价抗体(虚线)对于可溶性SIRPα与在共表达CEA(所述TAA)的MKN-45细胞上表达的CD47的结合的浓度依赖性阻断。所述双特异性抗体的更高的阻断效能是由于更强有力的与靶细胞的结合和CD47的TAA共参加依赖性阻断。
图7A显示了在与200μg/mL的下列抗体一起进行温育的人全血中细胞因子IFNγ和TNFα的释放：作为阴性对照的爱必妥(Erbitux)，作为阳性对照的抗-CD52抗体Campath，和三种具有相同的抗原结合区域但不同的Fc区(从左至右：野生型人IgG1 Fc、具有DEA突变(S329D和I332E)的IgG1 Fc、具有DE突变的IgG1 Fc)的双特异性抗体。biAb CD47lo和CD47lo是指相同的CD47xTAA双特异性抗体。用携带DEA突变的双特异性抗体所观察到的IFNγ和TNFα释放不比用具有野生型Fc的双特异性抗体的更高。
图7B显示了在与200μg/mL的下列抗体一起进行温育的人全血中细胞因子IL-6和IL-8的释放：作为阴性对照的爱必妥(Erbitux)，作为阳性对照的抗-CD52抗体Campath，和三种具有相同的抗原结合区域但不同的Fc区(从左至右：野生型人IgG1 Fc、具有DEA突变的IgG1 Fc、具有DE突变的IgG1 Fc)的双特异性抗体。biAb CD47lo和CD47lo是指相同的CD47xTAA双特异性抗体。用携带DE或DEA突变的双特异性抗体所观察到的IL-6和IL-8释放不比用具有野生型Fc的双特异性抗体的更高。
图8显示了由各种抗体所诱导的红细胞(RBC)的浓度依赖性吞噬作用，关于单克隆抗-CD47抗体的主要“抗原沉没(antigen sink)”(每个RBC在细胞表面上表达20,000至25,000个CD47分子)：具有野生型Fc的抗-CD47 huIgG1抗体B6H12.12、具有野生型Fc的CD47xTAA双特异性抗体和具有携带DEA突变的Fc的相同CD47xTAA双特异性抗体。B6H12在10至100ng/ml(大约0.07至0.7nM)的浓度下显示出RBC吞噬作用，而具有野生型huIgG1 Fc的TAAxCD47双特异性抗体在直至200 000ng/ml(大约1350nM)的浓度下都不显示RBC吞噬作用。相同但具有携带DEA突变的Fc部分的双特异性抗体在1000ng/ml(大约7nM)以上的浓度下显示出相比于野生型Fc而言增加的RBC吞噬作用，这比用抗CD47 huIgG1抗体B6H12还高2-2.5logs。
图9显示了在接受了要么对照hIgG1抗体要么TAAxCD47双特异性抗体的四次每周一次的静脉内输注(对于前两周30mg/kg，和对于后两周100mg/kg)的非人灵长类动物(NHP；食蟹猴)中的红细胞计数和血小板计数。用TAAxCD47双特异性抗体未观察到血液学计数的显著降低，尽管是高度暴露(在以30mg/kg的第二次按剂量给药结束时TAAxCD47双特异性抗体血浆浓度为大约500nM)。
图10显示了通过将人全血与在不同浓度(从0至200μg/mL)下的所示抗体进行温育所诱导的体外血小板激活(通过流式细胞术来进行评估并且表示为％CD62P表达)。与在2μg/ml和更高下诱导血小板激活的B6H12-hIgG1相反，具有野生型IgG1 Fc的TAAxCD47双特异性抗体甚至在所测试的最高浓度(200μg/mL)下也不诱导血小板激活。还测试了CEAxCD47双特异性抗体K2AC5和K2AC22(具有wtIgG1 Fc的形式以及无岩藻糖基化的形式)在直至20μg/mL下也没有显示出显著的血小板激活(参见实施例15)。
图11A和B显示了本发明的CD47xCEA双特异性抗体的浓度依赖性结合，相比于相应的抗-CD47单价抗体而言。通过FACS评估了与表达CD47和CEA的靶细胞(MKN-45)的结合。图11A显示，与MKN-45细胞相结合的归类入Bin 1的抗体被SM3E抗体抑制超过80％；图11B显示，与MKN-45细胞相结合的归类入Bin 2的抗体不被抗-CEA抗体SM3E、MEDI、T84.66、SAR、Lab和CH1A1A抑制(少于20％)。
图12显示了由在不同浓度下的不同CD47xCEA双特异性抗体(K2AC5、K2AC22、K2AC23、K2AC25、K2AC26、K2AC27、K2AC28和K2AC29)所诱导的MKN-45细胞的吞噬作用(通过CellInsight测定法来进行评估并且表示为吞噬指数)的浓度依赖性增加，相比于相应的抗-CD47单价抗体而言。在该实验中对于每种所测试的抗体添加1mg/mL的hIgG(人免疫球蛋白)。在该实验中所建立的EC50值在0.2和20μg/ml之间，和最大吞噬指数(在10μg/mL下)在32.5％和69％之间变动(参见在实施例章节中关于对于所测试的每种独个CD47xCEA双特异性抗体的数据汇总的表3)。
图13和14显示了由两种所选择的本发明的CD47xCEA双特异性抗体(K2AC5和K2AC22)和相应的CD47单价抗体(携带野生型人IgG1 Fc部分或无岩藻糖基化的Fc部分)所诱导的ADCC(通过使用LDH释放测定法来进行评估并且表示为MKN45癌细胞的％特异性裂解)的浓度依赖性增加。运行了抗-CD47抗体Hu5F9-G4(携带人IgG4Fc部分的5F9，描述在US20160333093中)的序列同一的类似物以用于比较。所述实验在1mg/ml人IgG不存在(图13)或存在(图14)下进行。在这两种实验条件下，具有无岩藻糖基化的Fc的抗体形式均诱导相比于相应的携带野生型Fc的形式而言更高的裂解/杀伤活性(相比于wt形式而言5-9倍更低的对于无岩藻糖基化的K2AC5和K2AC22双特异性抗体的EC50)。
图15和图16显示了由携带野生型人IgG1 Fc部分或无岩藻糖基化的Fc部分的K2AC5和K2AC22 CD47xCEA双特异性抗体所诱导的吞噬作用(用基于成像的CellInsight测定法来进行评估并且表示为吞噬指数)的浓度依赖性增加。运行了相应的CD47单价抗体(具有野生型hIgG1 Fc)和抗-CD47抗体Hu5F9-G4(5F9)的序列同一的类似物以用于比较。所述实验在1mg/ml人IgG不存在(图15)或存在(图16)下进行。在这两种实验条件下，具有无岩藻糖基化的Fc的双特异性抗体形式均显示出相比于相应的携带野生型Fc的形式而言更高的吞噬效能(相比于wt形式而言3-10倍更低的对于无岩藻糖基化的K2AC5和K2AC22双特异性抗体的EC50)。
图17显示了在1mg/ml的人IgG存在或不存在下，由两种所选择的CD47xCEA双特异性抗体(即K2AC5和K2AC22)所诱导的吞噬作用(用基于成像的测定法(CellInsight)来进行评估并且表示为吞噬指数)的浓度依赖性增加。运行了抗-CD47抗体Hu5F9-G4(携带人IgG4Fc部分的5F9，描述在US20160333093中)的序列同一的类似物以用于比较。添加1mg/mL人IgG(这甚至低于在人中IgG的生理血浆浓度)轻微地影响CD47xCEA双特异性抗体的效能(即EC50)，而由mAb 5F9驱动的活性则剧烈地受到损害(EC50和最大吞噬作用)。
图18显示了T-细胞重靶向性CEA-TCB1(30nM)和CEA-TCB(300nM)双特异性抗体(CEAxCD3双特异性抗体CEA-TCB：RO6958688/cibisatamab，参见例如Bacac等人,Clin.Cancer Res.,22(13),3286-97(2016)和US20140242079；CEA-TCB1：来自WO2017055389)对于由K2AC22 CEAxCD47双特异性抗体所诱导的吞噬作用(用基于成像的测定法(CellInsight)来进行评估并且表示为吞噬指数)的效应。单独地测试了T细胞重靶向性双特异性抗体、CD47xCEA双特异性抗体和相应的CD47单价抗体以用于比较。CEA-TCB或CEA-TCB1都没有损害K2AC22的吞噬作用的浓度依赖性活性。
图19显示了通过以两种剂量(即0.37μg/mL或1.1μg/mL)的2种所选择的本发明的CD47xCEA双特异性抗体(K2AC5(图19A)和K2AC22(图19B))，单独地或者与以0.16nM或0.8nM的CEA-TCB相组合地，并且相比于单独的CEA-TCB或无关的hIgG1对照而言，在混合型测定法(添加了PBMC和巨噬细胞，其获得自相同的人志愿者供者)中MKN45癌细胞的杀伤(通过发光来进行评估并且表示为杀伤的％)。(A)CEAxCD3双特异性抗体CEA-TCB(SEQ ID NO:96至99)和CEAxCD47双特异性抗体K2AC5的组合的至少累加的效应；(B)对于CEA-TCB+K2AC22也有至少累加的效应。
图20显示了在200ng/mL的脱落的CEA存在或不存在下CEAxCD47抗体K2AC5和22对于结合(20A)和吞噬作用(20B)(用基于成像的测定法(CellInsight)来进行评估并且表示为吞噬指数)的浓度依赖性效应。200ng/mL可溶性CEA对于这两种CEAxCD47抗体的结合曲线都没有显著影响。可溶性CEA对于最大吞噬作用没有显著效应，EC50位移小于4倍。
图21A显示了本发明的CD47xCEA双特异性抗体与MKN-45细胞的浓度依赖性结合，相比于相应的抗-CD47单价抗体和无关的hIgG1对照而言。K2AC39是一种与人CEACAM5和人CEACAM6交叉反应的CD47xCEA双特异性抗体候选物；而K2AC22不与CEACAM6交叉反应。通过FACS评估了与表达CD47、CEACAM5和CEACAM6的靶细胞(MKN-45)的结合。
图21B显示了由2种不同的CD47xCEA双特异性抗体(K2AC22和K2AC39)所诱导的MKN-45细胞的吞噬作用(通过基于成像的测定法(CellInsight)来进行评估并且表示为吞噬指数)的浓度依赖性增加，相比于相应的抗-CD47单价抗体和无关的hIgG1对照而言。K2AC39是一种与人CEACAM5和人CEACAM6交叉反应的CD47xCEA双特异性抗体候选物；而K2AC22不与CEACAM6交叉反应。在该实验中添加1mg/mL的人IgG。K2AC39展示出相比于K2AC22而言更高的MKN45细胞的吞噬作用。
发明详述
在本文中如通常在本领域中所使用的那样来使用术语，除非如下面那样另外定义。
如在本文中所使用的，术语“抗原结合部分”、“结合部分”在其最广的意义上是指与抗原决定簇例如CEA、CD47和CD3特异性地结合的抗体的部分。
更特别地，如在本文中所使用的，结合膜结合型人癌胚抗原(CEA，与CEACAM5相同)或CD47的结合部分与CEA或CD47，更特别地与细胞表面或膜结合型CEA或CD47特异性地结合。因此，每个结合部分要么与CEA要么与CD47相结合。“特异性地结合”、“特异于”、“与…相结合”意指，所述结合对于所述抗原来说是选择性的，并且可以与不想要的或非特异性的相互作用相区别。在一些实施方案中，抗靶标抗体与不相关的非靶蛋白质的结合的程度比所述抗体与所述靶标的结合小大约10倍，优选地>100倍，如例如通过表面等离子体共振(SPR)，例如
Figure BDA0002928449420000401
酶联免疫吸附(ELISA)或流式细胞术(FACS)所测量的。靶标是在本文中所讨论的蛋白质，例如CEA、CD47和CD3ε。在一个实施方案中，所述CEA结合部分另外还与CEACAM6相结合。
“与CEA、CD47特异性地结合”、“与CEA、CD47相结合”、“特异于CEA、CD47”在一个实施方案中是指这样的抗体，例如双特异性抗体，其能够以足够的亲和力与靶标CEA和CD47相结合，从而所述抗体在靶向表达CEA和CD47的肿瘤细胞中可用作治疗性试剂。术语“以…的EC50值与MKN-45细胞相结合”是指这样的测定法条件，由此所测试的双特异性抗体浓度为0.1至1000nM，在以300nM的浓度的抗-CD47抗体B6H12.2(
Figure BDA0002928449420000402
HB-9771TM，在本文中也称为B6H12)存在下。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与食蟹猴CEACAM5以及人CEACAM5相结合。
如在本文中所使用的，术语“抗体”是指包含两条重链和两条轻链的抗体。在一个实施方案中，所述抗体为全长抗体。如在本文中所使用的，术语“抗体重链”是指由可变区和恒定区(如对于全长抗体所定义的)组成的抗体重链。如在本文中所使用的，术语“抗体轻链”是指由可变区和恒定区(如对于全长抗体所定义的)组成的抗体轻链。
术语“全长抗体”表示由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体。“全长抗体重链”为在N-末端至C-末端方向上由抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定结构域2(CH2)和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成的多肽，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3。“全长抗体轻链”为在N-末端至C-末端方向上由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ或λ。所述两条全长抗体结构域经由在CL结构域和CH1结构域之间和在全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键而连接在一起。典型的全长抗体的例子为天然抗体，如IgG(例如，IgG1和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE。根据本发明的全长抗体在一个实施方案中是人IgG1类型的，在一个进一步的实施例中在Fc部分中包含一个或多个氨基酸置换(如下面所定义的)和/或在Asn297处经糖改造。根据本发明的全长抗体包含两个结合部分，每一个由一对VH和VL形成，其中一个与CEA相结合和另一个与CD47相结合。
如在本文中所使用的，“互补性决定区”(“CDR”)描述了在重链和轻链多肽两者的可变区内发现的非邻接的抗原结合位点(也称为抗原结合区域)。CDR也被称为“高可变区”，并且该术语在本文中与术语“CDR”可互换使用以是指形成抗原结合区域的可变区的部分。该特别的区域已经由Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequencesof Proteins of Immunological Interest"(1983)和由Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)(其通过提及而合并入本文)进行了描述，其中所述定义包括当相互比较时氨基酸残基的重叠或亚组。IG和TR的FR-IMGT和CDR-IMGT区域的定义基于“IMGT uniquenumbering for all IG and TR V-REGIONs of all species:interest for structureand evolution”(Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))，和对于经重排的CDR3-IMGT和对于FR4-IMGT，基于“IMGT unique numbering for V-DOMAIN and V-LIKE-DOMAIN”(Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))。然而，将任一定义应用于指抗体或其变体的CDR是旨在在所定义的和在本文中所使用的术语的范围内。包括由IMGT和Kabat所定义的CDR的合适的氨基酸残基在下面在序列列表表格中示出。包括特定CDR的确切残基数目将会取决于该CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定的CDR。如在本文中所使用的，“包含SEQ ID NO:x的CDRL1”是指，所提及的可变轻链的CDRL1部分是SEQ ID NO:x的(包含SEQID NO:x的CDRL1作为CDRL1)。这对于其他CDR也是适用的。
如在本文中所使用的，术语“Fc区”、“Fc结构域”是指IgG重链的C-末端区域；在IgG1抗体的情况下，所述C-末端区域包含-CH2-CH3(参见上面)。虽然IgG重链的Fc区的界限可能稍有变化，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从在位置Cys226处的氨基酸残基伸展至羧基末端。
恒定区是现有技术中众所周知的，并且例如由Kabat,E.A.进行了描述(参见例如Johnson,G.和Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat,E.A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788)。
术语“表位”包括任何能够与抗体特异性地结合的多肽决定簇。在某些实施方案中，“表位”包括分子的在化学上有活性的表面集团例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，和在某些实施方案中，可以具有特别的三维结构特征，和/或特别的电荷特征。表位是被抗体所结合的靶标的区域。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体与CEACAM5的N-末端结构域(氨基酸35-144的Ig-样V-型结构域，UniProtKB-P06731)相结合。CEAxCD47双特异性抗体与CEACAM5的结合定位经由表位分箱(epitope binning)来实现。在表位分箱中，以成对组合方式来测试抗体，并且将竞争相同结合区域的抗体归并在一起成为Bin。竞争测试在本文中根据现有技术并且如在本文中所描述的那样用抗-CEA抗体来进行。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体与参考抗体SM3E竞争与CEACAM5的结合(Bin 1)。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体不与参考抗体SM3E、MEDI、T84.66、SAR、Lab和CH1A1A竞争与CEACAM5的结合(Bin 2)。竞争通过这样的测定法来进行测量，在所述测定法中将以0.5μg/ml浓度的经生物素化的人CEACAM5固定化并且与10μg/ml的参考一起进行温育。以0.2μg/ml添加包含本发明的CEAxCD47双特异性抗体的CEACAM5结合部分的CEACAM5抗体，在室温下1小时。洗涤平板并且检测经结合的CEACAM5 mAb。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体与CEACAM5的B3结构域和GPI锚相结合。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体结合与包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区的抗-CEA抗体(MAB CEA)相同的表位。
如在本文中所使用的，术语“共同重链(cHC)”是指在N-末端至C-末端方向上由抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定结构域2(CH2)和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成的多肽，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3。适合于根据本发明的双特异性抗体的共同重链为在WO2012023053、WO2013088259、WO2014087248和WO2016156537(它们中的每一个通过提及而以其整体合并)中所描述的抗-CD47抗体的重链。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的cHC包含SEQ ID NO:1的CDRL1、SEQID NO:2的CDRL2和SEQ ID NO:3的CDRL3作为轻链CDR，和SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ IDNO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为重链CDR。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的cHC包含SEQ ID NO:4的VH区作为重链可变区VH。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体的cHC是SEQ ID NO:5的。在一个实施方案中，根据本发明的抗体为包含cHC的κλ双特异性抗体(κλ体)。
所述κλ体形式允许与标准IgG分子无法区分并且具有与标准单克隆抗体无法区分的特征的双特异性抗体的亲和纯化(参见例如WO2013088259、WO2012023053)，这保证了在患者中没有或低的免疫原性。
包含共同重链的本发明的双特异性抗体可以例如按照WO2012023053(通过提及而以其整体合并)来制备。在WO2012023053中所描述的方法产生在结构上与人免疫球蛋白相同的双特异性抗体。该分子类型由两个拷贝的独特的重链多肽、与恒定κ结构域相融合的第一轻链可变区和与恒定λ结构域相融合的第二轻链可变区组成。一个结合位点展示出对于CEA的特异性，和另一个位点展示出对于CD47的特异性，其中重链和各自的轻链对于每一个做出贡献。所述轻链可变区可以是λ或κ家族的，并且优选地分别与λ或κ恒定结构域相融合。为了避免非天然多肽连接的产生，这是优选的。但是，也可能的是，通过对于第一特异性将κ轻链可变结构域与恒定λ结构域相融合或者对于第二特异性将λ轻链可变结构域与恒定κ结构域相融合来获得本发明的双特异性抗体。那么，另一个轻链总是完全κ的(VL和CL)或完全λ的。在WO 2012023053中所描述的双特异性抗体为“κλ体”。该κλ-体形式允许与标准IgG分子无法区分并且具有与标准单克隆抗体无法区分的特征的双特异性抗体的亲和纯化，并且因此相比于包括例如氨基酸桥或其他非天然元件的先前形式而言是有利的。
所述方法的一个基本步骤是鉴定共享相同重链可变结构域的两个具有不同抗原特异性的抗体Fv区(每个由可变轻链结构域和可变重链结构域组成)。对于单克隆抗体及其片段的产生已经描述了许多方法(参见例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E和Lane D,1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。完全人的抗体为其中轻链和重链两者的序列(包括CDR 1和2)都来自人基因的抗体分子。CDR3区可以是人来源的或者是通过合成手段来设计的。此类抗体被称为“人抗体”或“完全人的抗体”。人单克隆抗体可以通过使用下列技术来制备：三源杂交瘤技术(trioma)；人B-细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人,1983Immunol Today 4:72)；和用于产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole等人,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,AlanR.Liss,Inc.,第77-96页)。人单克隆抗体可以被利用，并且可以通过使用人杂交瘤(参见Cote等人,1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030)或者通过在体外用EB病毒转化人B-细胞(参见Cole等人,同上)来产生。
如在本文中所使用的，术语“CEA”、“CEACAM5”是指人癌胚抗原(CEA，CEACAM-5或CD66e；UniProtKB-P06731)，其是细胞表面糖蛋白和肿瘤相关抗原(Gold和Freedman,JExp.Med.,121:439-462,1965；Berinstein NL,J Clin Oncol.,20:2197-2207,2002)。如在本文中所使用的，术语“CEACAM6”是指人CEACAM6(CD66c；UniProtKB-P40199)，其也是癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM)家族的成员。如在本文中所使用的，术语“CEACAM1”是指人CEACAM1(UniProtKB-P13688(CEAM1_HUMAN))，其也是癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM)家族的成员。进一步的信息和关于CEA家族的其他成员的信息可以在http://www.uniprot.org下找到。
如在本文中所使用的，术语“MAB CEA”是指与人CEACAM5特异性地结合的单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区。如在本文中所使用的，术语“MAB CEA1”是指与人CEACAM5特异性地结合的单克隆抗体，其包含SEQ ID NO:88的重链可变区和SEQ ID NO:89的轻链可变区。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与MAB CEA、MAB CEA1、CEA-TCB或CEA-TCB1是竞争性的；在一个进一步的实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与MAB CEA、MAB CEA1、CEA-TCB或CEA-TCB1不是竞争性的。MABCEA和所述可变链描述在US20140242079中(US20140242079(其通过提及而以其整体合并)的SEQ ID NO:21和27)。包含MAB CEA的VH和VL的双特异性抗-CEA x抗-CD3ε抗体(CEA-TCB)描述在Bacac等人,Clin.Cancer Res.,22(13),3286-97(2016)中。包含MAB CEA1的VH和VL的另一种双特异性CEAxCD3 Mab(CEA-TCB1)描述在WO2017055389中，作为具有电荷修饰的分子B“2+1IgG CrossFab,颠倒的”(在CD3结合剂中的VH/VL交换，在CEA结合剂中的电荷修饰，经人源化的CEA结合剂)(参见WO2017055389(其通过提及而以其整体合并)的图3B和SEQID NO:34、36-38)。如在本文中所使用的，在一个实施方案中，“双特异性CEA x CD3抗体”是指抗体CEA-TCB或抗体CEA-TCB1。
如在本文中所使用的，术语“与CD47特异性地结合”、“与CD47相结合”、“CD47结合部分”在根据本发明的双特异性抗体的情形下是指对于CD47的特异性。CD47是多次穿膜蛋白质并且包含三个细胞外结构域(氨基酸19-141、198-207和257-268；参见UniProtKB-Q08722)。如在本文中所使用的，术语“与CD47的结合亲和力”通过SPR来进行测量。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与CD47的结合经由所述细胞外结构域中的一个或多个而发生。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体抑制人CD47和人SIRPα之间的相互作用。
如在本文中所使用的，术语“与CEA特异性地结合”、“与CEA相结合”、“CEA结合部分”在根据本发明的双特异性抗体的情形下是指对于在细胞表面上的CEACAM5的特异性。与在细胞上的CEA(CEACAM5)的结合优选地用包含200,000至600,000个CEA拷贝/细胞的胃腺癌MKN-45细胞来进行测量。关于所得的对于与MKN-45细胞的结合的EC50值(如上面所定义的)，根据本发明的抗体的浓度在合适的范围内变化。根据本发明的双特异性抗体与此类细胞膜结合型CEACAM5特异性地结合，并且在一个进一步的实施方案中不与或仅最小程度地与以如在患者的血液/血浆中所发现的浓度的可溶性CEACAM5相结合，即以这样的浓度的可溶性CEA不影响或仅最小程度地影响本发明的双特异性抗体的效力。这通过可溶性CEA对于通过本发明的双特异性抗体的MKN-45细胞的吞噬作用的影响(如所描述的那样)来进行测量。
如在本文中所使用的，术语“膜结合型人CEA”是指结合至细胞的膜部分或细胞的表面(特别地，肿瘤细胞的表面)的人癌胚抗原(CEA)。术语“膜结合型人CEA”在某些情况下可以是指这样的CEA，其不结合至细胞的膜，但是已被构建以便保留根据本发明的抗体所与之结合的膜结合型CEA表位。
如在本文中所使用的，术语“没有实质性的针对可溶性CEACAM5的交叉反应性”、“与可溶性CEACAM5不结合”在根据本发明的双特异性抗体的情形下是指，此类抗体不显示与可溶性CEACAM5的相关结合，特别是当与膜结合型CEACAM5相比较时。这样的不结合可以通过在如下面所描述的用MKN-45细胞的吞噬作用测定法，优选地基于成像的吞噬指数的测量(参见实施例9)中可溶性CEA对于所述双特异性抗体的吞噬活性的低影响来间接地测定。因此，没有实质性的针对可溶性CEACAM5的交叉反应意味着，关于通过所述双特异性抗体的在人巨噬细胞存在下MKN-45细胞的吞噬作用的最大可取得的吞噬指数(双特异性抗体CEAxCD47的典型的浓度-吞噬指数曲线和最大可取得的吞噬指数显示在例如图12、15、16、17、20A中，在实施例9.2中对该测定法进行了解释)没有减少超过20％，如果向所述吞噬作用测定法添加200ng/ml可溶性CEA。备选地，可以测定关于浓度-吞噬指数曲线的EC50的位移。添加200ng/ml可溶性CEA将不会使该EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。备选地，通过可溶性CEA对于通过流式细胞术所测量的结合曲线(这样的结合曲线显示在图20B中)的影响来预期可溶性CEA对于本发明的双特异性抗体与在细胞上的CEA的结合没有影响或有最小的影响。向该流式细胞术测定法添加200ng/ml可溶性CEA将不会使结合曲线或EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。
术语“可溶性CEA”、“脱落的CEA”、“sCEA”是指不结合至细胞膜或细胞表面(例如肿瘤细胞表面)或者从细胞膜或细胞表面(例如肿瘤细胞表面)上切裂出的CEACAM5。可溶性CEA可以例如被发现在具有癌症的受试者的血流中。当CEA从细胞膜上脱落时，假定GPI锚被破坏，并且CEACAM5经历构象变化，其可以阻止或至少削弱可溶性CEA与根据本发明的抗体的结合。
如在本文中所使用的，术语“针对CEACAM6的交叉反应性”、“与CEACAM6特异性地结合”、“与CEACAM6相结合”、“CEACAM6结合部分”在根据本发明的双特异性抗体的情形下是指，根据本发明的双特异性抗体特异地识别在细胞表面(膜)上的CEACAM5和CEACAM6。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与膜结合型CEACAM6特异性地结合，当相比于与膜结合型CEA相结合而言时。通过给定的本发明的双特异性抗体的在细胞表面上CEACAM5与CEACAM6受体的占有比取决于分别与CEACAM5和CEACAM6的结合亲和力，并且可以容易地进行计算，如果这些结合亲和力已经例如通过SPR进行了测量。
在某些实施方案中，与CEACAM5特异性地结合的抗体不与癌胚抗原相关细胞粘附蛋白例如CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM6、CEACAM7和CEACAM8相结合。在某些实施方案中，与CEACAM5特异性地结合的抗体也以相似的EC50与CEACAM6相结合。
如在本文中所使用的，术语“没有实质性的针对可溶性CEACAM1和/或CEACAM3、CEACAM4、CEACAM6、CEACAM7和CEACAM8的交叉反应性”、“与所述CEACAM不结合”在根据本发明的双特异性抗体的情形下是指，此类抗体在治疗性血浆浓度(1至1000nM)下不显示任何与所述膜结合型CEACAM的相关结合，当与膜结合型CEACAM5时相比较时。与CEACAM1和/或CEACAM5、CEACAM6和CEACAM8不结合可以以下述方式来测定：通过基于流式细胞术测量与表达所述CEACAM的重组CHO细胞和与CEACAM3和/或CEACAM4和CEACAM7的结合曲线，通过测量与表达所述CEACAM的重组PEAK细胞的结合曲线，或者通过测量与重组CEACAM蛋白的结合的ELISA测定法。如在本文中所使用的，术语“不结合”在本文中所提及的化合物(例如，人IgG)、与在本文中所提及的化合物(例如，人IgG)“不结合”还是指这样的不相关结合或无交叉反应性。例如，在ELISA中，对于这样的无关化合物的OD值将会大约等于检测极限的OD值。
如在本文中所使用的，术语“与人CEA和人CD3相结合的双特异性抗体”、“CEAxCD3Mab”意指与人CEACAM5和CD3ε相结合的双特异性抗体。此类抗体为例如“CEA-TCB”和“CEA-TCB1”。如在本文中所使用的，“CEA-TCB”是指在US20140242079(其通过提及而以其整体合并)中以SEQ ID NO:1、2、21和22进行了描述的与CEA和CD3相结合的双特异性抗体。CEA-TCB的氨基酸序列还以本发明的SEQ ID NO:96至99进行了描述。如在本文中所使用的，“CEA-TCB1”是指以具有电荷修饰(在CD3结合剂中的VH/VL交换，在CEA结合剂中的电荷修饰，经人源化的CEA结合剂)的“2+1IgG CrossFab,颠倒的”形式的分子B；WO2017055389(其通过提及而以其整体合并)的图3B，SEQ ID NO:34、36-38)。CEA-TCB1的氨基酸序列以本发明的SEQID NO:92至95进行了描述。在WO2007071426、WO2013012414、WO2015112534、WO2017118675、US20140242079和WO2017055389(它们中的每一个通过提及而以其整体合并)中描述了另外的CEAxCD3 Mab。另一种CEAxCD3 Mab为RO6958688(参见例如Bacac等人,Clin.CancerRes.,22(13),3286-97(2016)。在一个实施方案中，所述CEAxCD3 Mab是竞争性的和/或结合与MAB CEA相同的人CEACAM5的表位。在一个实施方案中，所述CEAxCD3 Mab是竞争性的和/或结合与MAB CEA1相同的人CEACAM5的表位。
如在本文中所使用的，“CD3 Mab”、“针对CD3的抗体”是指人CD3ε(UniProtKB-P07766(CD3E_HUMAN))。术语“针对CD3ε的抗体”、“抗CD3ε抗体”涉及与CD3ε特异性地结合的抗体。在一个实施方案中，针对CD3ε的抗体特异性地结合至与抗-CD3抗体SP34(BDBiosciences，目录号565983)相同的表位。在一个实施方案中，针对CD3ε的抗体与人CD3ε的表位(其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列)特异性地结合。在一个实施方案中，针对CD3ε的抗体与人CD3ε特异性地结合，并且包含SEQ ID NO:90的重链可变区和SEQ ID NO:91的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体不与CEA-TCB和/或CEA-TCB1竞争与存在于MKN-45细胞上的CEA的结合。因此，在300nM(CEA-TCB)或30nM(CEA-TCB1)的浓度下CEA-TCB不使所述本发明的双特异性抗体的对于MKN-45细胞的吞噬指数曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。
300nM是在治疗有效剂量的CEA-TCB的情况下在患者血浆中测量到的浓度(J.Tabernero等人,J.Clin.Oncol.35,2017(suppl.Abstr.3002))。在临床前调查中，CEA-TCB1的效能是CEA-TCB的大约10至100倍(结合亲和力、肿瘤细胞裂解，WO2017055389)，因此在30nM下测试EC50的位移。
结合的竞争可以通过基于流式细胞术测量与MKN-45细胞的结合曲线和测定该结合曲线(对于这样的结合曲线，参见例如图2和图11)的EC50来进行测定。无竞争意指，EC50位移小于3倍，在一个实施方案中向更高浓度，如果向该测定法添加300nM的MAB CEA或CEA-TCB。300nM是在CEA x CD3双特异性抗体(CEA-TCB)的在治疗上有活性的剂量和/或血浆浓度范围内的浓度(J.Tabernero等人,J.Clin.Oncol.35,2017(suppl.Abstr.3002))。不被MAB CEA1或CEA-TCB1竞争意指，EC50位移小于3倍，如果向该测定法添加分别30nM的MABCEA1和CEA-TCB1。
结合的竞争可以通过基于流式细胞术测量与MKN-45细胞的结合曲线和测定该结合曲线(对于这样的结合曲线，参见图2和图11)的EC50来进行测定。无竞争意指，EC50改变小于3倍，如果向该测定法添加300nM的MAB CEA或CEA-TCB。300nM是在CEA x CD3双特异性抗体(CEA-TCB)的在治疗上有活性的剂量和/或血浆浓度范围内的浓度(J.Tabernero等人,J.Clin.Oncol.35,2017(suppl.Abstr.3002))。
不被MAB CEA1或CEA-TCB1竞争意指，EC50改变小于3倍，如果向该测定法添加分别30nM的MAB CEA1和CEA-TCB1。
如在本文中所使用的，术语“非竞争性的”意指，在300nM(MAB-CEA、CEA-TCB)或30nM(MAB CEA1、CEA-TCB1)的浓度下第二抗体(MAB CEA，MAB CEA1，或针对CEAxCD3ε的双特异性抗体，如CEA-TCB或CEA-TCB1)不使本发明的双特异性抗体对于MKN-45细胞的结合曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。如在本文中所使用的，术语“竞争性的”意指，在分别300nM和30nM(MAB CEA1或CEA-TCB1)的浓度下第二抗体(MAB CEA，MABCEA1，或针对CEAxCD3ε的双特异性抗体，如CEA-TCB或CEA-TCB1)使本发明的双特异性抗体对于MKN-45细胞的结合曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍，优选地超过5倍。
如在本文中所使用的，术语“互补性决定区”(“CDR”)描述了在重链和轻链多肽两者的可变区内发现的非邻接的抗原结合位点(也称为抗原结合区域)。CDR也被称为“高可变区”，并且该术语在本文中与术语“CDR”可互换使用以是指形成抗原结合区域的可变区的部分。该特别的区域已经由Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Proteins of Immunological Interest"(1983)和由Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)进行了描述。Kabat等人也定义了关于可变结构域序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域技术人员可以明确地将该“Kabat编号”系统分派给任何可变结构域序列，而无需依靠序列本身以外的任何实验数据。如在本文中所使用的，“Kabat编号”是指由Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence ofProteins of Immunological Interest"(1983)所阐述的编号系统。除非另外说明，提及在根据本发明的双特异性抗体中的特定氨基酸残基位置的编号是按照Kabat编号系统的。
如在本文中所使用的，术语“ADCP”是指抗体依赖性的细胞介导的吞噬。
如在本文中所使用的，根据本发明，“吞噬作用”、“吞噬作用的EC50值”、“吞噬作用的最大值”、“吞噬指数”是指通过“成像”用MKN-45细胞所测量的吞噬作用。在实施例9中描述了合适的成像方法，其中以例如1:1或1:3的效应细胞(巨噬细胞):靶(肿瘤)细胞比率进行温育和用“吞噬指数”作为读出(经成像测定的ADCP)。图3B显示了在0.1或甚至更低至大约500nM的双特异性TAA x CD47抗体的所测试的浓度范围中所测定的最大可取得的吞噬指数。图12、15和16显示了关于根据本发明的双特异性抗体K2AC5和K2AC22的ADCP结果。如在本文中所使用的，“所述双特异性抗体的吞噬作用”意指由所述抗体所引起/诱导的吞噬作用。抗体K2AC22包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，由此所述第一结合部分包含SEQ ID NO:5的重链和SEQ ID NO:65的轻链，和所述第二结合部分包含SEQ ID NO:5的重链和SEQ ID NO:11的轻链。抗体K2AC5包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，由此所述第一结合部分包含SEQ ID NO:5的重链和SEQ ID NO:64的轻链，和所述第二结合部分包含SEQ ID NO:5的重链和SEQ ID NO:11的轻链。抗体K2AC10、K2AC13、K2AC18、K2AC23、K2AC25、K2AC26、K2AC27、K2AC28、K2AC29包含相同的重链和第二结合部分轻链，但在第一结合部分轻链方面不同(参见表1，序列列表)。
对于在本领域中关于吞噬作用的进一步信息，吞噬作用也可以通过下述方式来进行测量：基于流式细胞术的方法，作为％吞噬作用(关于％吞噬作用对于单价TAA和CD47抗体以及TAA x CD47双特异性抗体的浓度的依赖性，参见实施例9和图3A)并且以例如3个人吞噬细胞:1个靶/肿瘤细胞的比率(“经流式细胞术测定的ADCP”)。
术语“人IgG”、“hIgG”是指不与CD47和CEACAM5特异性地结合的人免疫球蛋白IgG的商购可得的临床级的均质制备物(来自Bio-rad.com公司)。
典型地，在CHO细胞中产生的抗体具有复杂的二天线结构，其具有非常低的或没有平分型N-乙酰葡糖胺(平分型GlcNAc)和具有高水平的核心岩藻糖基化。N-乙酰葡糖胺转移酶III的过表达已经用于增加位于抗体上的平分型GlcNAc的份额，以改善抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。RNAi和基因删除技术已经用于减少或消除在抗体上的岩藻糖以大大增加ADCC活性(Davis J.等人,Biotechnol.Bioeng.2001,74:288-294；Saba JA等人,Anal.Biochem.2002,305:16-31；Kanda Y等人,J.Biotechnol.2007,130:300-310；Mori K等人,Biotechnol.Bioeng.2004,88:901-908)。
在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体进行了糖改造。在一个实施方案中，经糖改造的根据本发明的双特异性抗体具有相比于包含包括在SEQ ID NO:5中的Fc部分的双特异性抗体(亲本抗体)而言增加的ADCC和/或ADCP活性(降低的EC50和/或更高的吞噬指数的最大值)，所述亲本抗体包含按照在标准条件(1000ml容器，温度37℃，pH 7.0，叶轮速度80rpm，最小溶解氧30％；培养时间14天)下在CHO K1细胞系(
Figure BDA0002928449420000531
CCL-61TM)中的产生的糖基化。
在一个更特别的实施方案中，ADCC的增加(EC50的降低和/或最大值的增加)相比于所述亲本抗体而言为1.2至2.0倍，或甚至至少2.0倍(参见例如图13和14)。
在一个更特别的实施方案中，ADCP的增加(吞噬指数曲线的EC50的降低)相比于所述亲本抗体而言为至少3倍或甚至5倍或更多倍(参见例如图15和16)。
如在本文中所使用的，术语“具有GnTIII活性的多肽”、“GnTIII”是指能够催化N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基以β-1-4连接添加至N-联寡糖的三甘露糖基核心的β-连接的甘露糖苷的多肽，例如β-1,4-甘露糖基-糖蛋白-4-β-N-乙酰葡糖胺转移酶(EC 2.4.1.144)。
如在本文中所使用的，术语“FUT8”是指α1,6-岩藻糖基转移酶(EC:2.4.1.68)。
如在本文中所使用的，术语“效应子功能”、“Fc-介导的细胞毒性”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括但不限于，Fc受体结合亲和力、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、细胞因子分泌、由免疫复合物介导的通过抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体的下调等。这样的免疫机制导致通过“人免疫效应细胞”的“所靶向的细胞”的裂解。
如在本文中所使用的，术语“经糖改造的抗体”是指根据本发明的双特异性抗体，其包含相比于亲本抗体而言减少的量的附着至所述抗体的Fc区(通常在氨基酸Asn297处)的经岩藻糖基化和/或平分型的寡糖。
如在本文中所使用的，术语“亲本抗体”、“亲本双特异性抗体”在糖改造的情形下是指包含与经糖改造的抗体相同的氨基酸组成但非糖改造的根据本发明的双特异性抗体。为了这样的比较，在标准条件(参见上面)下在相同的宿主细胞中产生亲本抗体和经糖改造的抗体，但是在第一种情况下在没有糖改造的宿主细胞中，和在第二种情况下在相同但通过FUT8基因的靶向破坏而进行改造或通过表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸而进行改造的宿主细胞中。
如在本文中所使用的，术语“人免疫效应细胞”是指在其表面上展示出Fc受体的白细胞群体，通过所述受体它们与抗原结合分子或Fc-融合蛋白的Fc区相结合并且执行效应子功能。这样的群体可以包括但不限于，外周血单核细胞(PBMC)和/或天然杀伤(NK)细胞和/或巨噬细胞。
如在本文中所使用的，术语“增加的Fc-介导的细胞毒性”被定义为：在围绕靶细胞的培养基中本发明的双特异性抗体的给定浓度下，在给定时间内，通过上面所定义的Fc-介导的细胞毒性的机制而被裂解的“所靶向的细胞”的数目的增加；和/或为了实现在给定时间内通过Fc-介导的细胞毒性的机制裂解给定数目的“所靶向的细胞”所需要的在围绕靶细胞的培养基中本发明的双特异性抗体的浓度的减少。Fc-介导的细胞毒性的增加是相对于由相同的本发明的双特异性抗体所介导的细胞毒性而言的，所述相同的本发明的双特异性抗体由相同类型的宿主细胞(使用相同的标准条件)产生，而不是由通过在本文中所描述的方法进行改造以具有经改变的糖基化模式(例如，以表达糖基转移酶，GnTIII，或其他糖基转移酶，或者FUT8破坏)的宿主细胞产生。
如在本文中所使用的，术语“表达载体”是指一种或多种以从现有技术中知晓的合适方式包含根据本发明的重链和轻链的载体。
如在本文中所使用的，“通过FUT8基因的靶向破坏进行改造的宿主细胞”是指这样的宿主细胞，其能够表达根据本发明的抗体，并且另外通过FUT8基因的靶向破坏进行糖改造，如例如在US8067232、US7425446、US6946292(它们中的每一个通过提及而以其整体合并)和Yamane-Ohnuki N.等人,Biotech.Bioeng.,87(2004)614-622中所描述的。在这样的宿主细胞中表达的根据本发明的抗体包含这样的Fc区，其包含结合至该Fc区的复杂的N-糖苷-连接的糖链，它们包含含有N-乙酰葡糖胺的还原末端，其中所述糖链不包含结合至在所述糖链的还原末端中的N-乙酰葡糖胺的6位的岩藻糖。
进一步地，本发明旨在用于产生由宿主细胞产生的根据本发明的双特异性抗体(其特征在于包含50％至100％，60％至100％，70％至100％，80％至100％，或90％至100％的非岩藻糖基化)的方法，所述方法包括在所述宿主细胞中表达编码本发明的双特异性抗体的核酸和编码具有糖基转移酶活性的多肽的核酸，或者包含此类核酸的载体。具有糖基转移酶活性的基因包括(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)、α-甘露糖苷酶II(ManII)、(1,4)-半乳糖基转移酶(GalT)、(1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶I(GnTI)和β(1,2)-N-乙酰葡糖胺转移酶II(GnTII)。在一个实施方案中，在宿主细胞中表达具有糖基转移酶活性的基因的组合(例如，GnTIII和ManII)。同样地，所述方法还包含在其中糖基转移酶基因已被破坏或者失活的宿主细胞(例如，其中编码α1-6核心岩藻糖基转移酶的基因的活性已被敲除的宿主细胞)中表达一种或多种编码所述双特异性抗体的多核苷酸。在另一个实施方案中，可以在进一步表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸宿主细胞中产生本发明的双特异性抗体，以修饰糖基化模式。在一个特别的实施方案中，所述具有GnTIII活性的多肽为包含高尔基体驻留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。在另一个优选的实施方案中，在表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸的宿主细胞中表达本发明的双特异性抗体导致具有增加的Fc受体结合亲和力和增加的效应子功能的双特异性抗体。
进一步地，本发明旨在用于产生由宿主细胞产生的根据本发明的双特异性抗体(其特征在于包含50％至100％，60％至100％，70％至100％，80％至100％，或90％至100％的非岩藻糖基化)的方法，所述方法包括在所述宿主细胞中表达编码本发明的双特异性抗体的核酸和被破坏的FUT8基因。
在一个实施方案中，本发明的由宿主细胞产生的具有经改变的糖基化的双特异性抗体由于所述宿主细胞的修饰(例如，通过表达糖基转移酶基因)而展示出增加的Fc受体结合亲和力和/或增加的效应子功能。优选地，所述增加的Fc受体结合亲和力为增加的与Fcγ激活受体，例如FcγRIIIa受体的结合。
在一个实施方案中，非岩藻糖基化的寡糖的百分比为50％至100％，特别地60％至100％，70％至100％，和更特别地80％至100％。非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合或复合类型的。在另外一个实施方案中，通过本发明的方法而产生的双特异性抗体由于其寡糖通过本发明的方法被修饰而在Fc区中具有增加的比例的平分型寡糖。在一个实施方案中，平分型寡糖的百分比为50％至100％，特别地50％、60％至70％，和更特别地80％。在一个特别优选的实施方案中，通过宿主细胞和本发明的方法而产生的双特异性抗体在Fc区中具有增加的比例的平分型的、非岩藻糖基化的寡糖。所述平分型的、非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合的或复合的。
如在本文中所使用的，术语“宿主细胞”涵盖可以被改造以产生本发明的双特异性抗体的任何种类的细胞系统。在一个实施方案中，所述宿主细胞被改造以允许产生具有经修饰的糖形的抗原结合分子。在某些实施方案中，所述宿主细胞进一步进行了操作以表达增加的水平的一种或多种具有GnTIII活性的多肽。宿主细胞包括经培养的细胞，例如哺乳动物经培养的细胞，例如CHO细胞(参见上面)、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞，酵母细胞，昆虫细胞，和植物细胞(仅列举几个)，但还包括在转基因动物、转基因植物或者经培养的植物或动物组织内所包含的细胞。用于产生本发明的经糖改造的双特异性抗体的宿主细胞已描述在例如US6602684、US20040241817、US20030175884和WO 2004065540中。备选地，可以按照在US2003/0157108、EP1176195、WO2003084570、WO2003085119和US2003/0115614、US2004/093621、US2004/110282、US2004/110704、US2004/132140(它们中的每一个通过提及而以其整体合并)中所公开的技术，对本发明的双特异性抗体进行糖改造以在Fc区中具有减少的岩藻糖残基。也可以在产生经修饰的糖蛋白的表达系统(例如，在WO2003/056914、WO2004/057002和WO2004/024927(它们中的每一个通过提及而以其整体合并)中所描述的那些)中产生本发明的经糖改造的双特异性抗体。
在本发明的一个进一步的实施方案中，根据本发明的抗体在所述Fc区中包含一个或两个或三个从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换(“Fc氨基酸置换”)：单置换S239D、I332E、G236A，双置换I332E和G236A、S239D和I332E(“DE置换”)、S239D和G236A，以及三置换S329D和I332E和G236A(“DEA置换”)(Richards JO等人,Mol.Cancer Ther.7(2008)2517-2527)。由于不同的重链计数，这些氨基酸号码可以相差对于+/-一个、两个或三个氨基酸，但是对于所有三个具有相同的位移。在SEQ ID NO:5的重链的情况下，存在一个氨基酸位移，并且S329D和I332E和G236A因此表示S328D和I331E和G235A。具有DE置换的SEQ IDNO:5显示在SEQ ID NO:23中，和具有DEA置换的SEQ ID NO:5显示在SEQ ID NO:24中。所述双特异性抗体的ADCC和/或ADCP活性可以通过Fc部分的此类氨基酸修饰来增加。
如在本文中所使用的，术语“亲本抗体”、“亲本双特异性抗体”在Fc置换的情形下是指包含与Fc经置换的抗体相同的氨基酸组成但没有所述置换的根据本发明的双特异性抗体。为了这样的比较，在相同的条件下，在相同的宿主细胞中，如在经糖改造的抗体的情况下那样产生亲本抗体和Fc经置换的抗体，但是在第一种情况下在没有Fc置换的宿主细胞中，和在第二种情况下在相同但具有此类Fc置换的宿主细胞中。一种有用的宿主细胞系为例如CHO-K1。
如在本文中所使用的，在包含Fc置换并且进行了糖改造的根据本发明的双特异性抗体的情形下使用术语“亲本抗体”、“亲本双特异性抗体”，此类亲本抗体因此是包含与Fc经置换的抗体相同的氨基酸组成但没有所述置换并且未进行糖改造的各自的双特异性抗体。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述双特异性抗体的ADCC和/或ADCP活性通过Fc部分的氨基酸置换以及与之相组合的Fc部分的糖改造而增加，相比于各自亲本抗体的ADCC和/或ADCP活性而言。
因此，在一个实施方案中，本发明包括与人CEACAM5和人CD47特异性地结合的双特异性抗体，其特征在于，在所述Fc区中包含一个或两个或三个从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换(“Fc氨基酸置换”)：单置换S239D、I332E、G236A，双置换I332E和G236A、S239D和I332E，以及三重置换S329D和I332E和G236A；并且包含50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％或90％至100％的Fc部分的非岩藻糖基化。
实施例9描述了用于测定ADCC活性和还有ADCP活性的测定法。
ADCC可以通过如下的体外ADCC测定法来进行测量：
1)该测定法使用已知表达被所述双特异性抗体的CEA结合区识别的CEA的靶细胞；
2)该测定法使用从随机选择的健康供者的血液中分离的人外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞；
3)该测定法按照下面的实验方案来进行：
i)PBMC通过使用标准的密度离心程序来进行分离并且以6.25×106个细胞/ml悬浮在RPMI细胞培养基中；
ii)靶细胞通过标准的组织培养方法来进行生长，以高于90％的生存力从指数生长期中收获，在RPMI细胞培养基中进行洗涤，以对于1×106个细胞用100微居里的51Cr进行标记，用细胞培养基洗涤两次，并且以0.25×106个细胞/ml的密度重悬浮在细胞培养基中；
iii)将20微升的上面的最终靶细胞悬浮液转移至96-孔微量滴定板的每个孔中；
iv)将所述双特异性抗体在细胞培养基中从4000ng/ml系列稀释至0.12ng/ml，并且向在96-孔微量滴定板中的靶细胞添加20微升的所得的抗体溶液，以三次重复测试涵盖上面的整个浓度范围的各种抗体浓度；
v)对于最大释放(MR)对照，在包含经标记的靶细胞的平板中的3个额外的孔接受50微升的非离子型去污剂(Triton,Sigma,St.Louis)的5％(V/V)水溶液，而不是双特异性抗体溶液(上面的第iv点)；
vi)对于自发释放(SR)对照，在包含经标记的靶细胞的平板中的3个额外的孔接受20微升的RPMI细胞培养基，而不是双特异性抗体溶液(上面的第iv点)；
vii)然后，将该96-孔微量滴定板以50x g离心1分钟并且在4℃下温育1小时；
viii)向每个孔添加40微升的PBMC悬浮液(上面的第i点)以产生50:1的效应细胞:靶细胞(E:T)比率，并且将所述平板放置在处于5％CO2气氛和37℃下的培养箱中4小时；
ix)收获来自每个孔的无细胞上清液，并且通过使用γ计数器来定量在实验中释放出的放射性(ER)；
x)按照公式(ER-MR)/(MR-SR)x 100来对于每个双特异性抗体浓度计算特异性裂解的百分比，其中ER为对于那个抗体浓度所定量的平均放射性(参见上面的第ix点)，MR为对于MR对照(参见上面的第v点)所定量的平均放射性(参见上面的第ix点)，和SR为对于SR对照(参见上面的第vi点)所定量的平均放射性(参见上面的第ix点)；
如在本文中所使用的，“增加的ADCC”被定义为在上面所测试的双特异性抗体浓度范围内所观察到的特异性裂解的最大百分比的增加，和/或为了达到在上面所测试的双特异性抗体浓度范围内所观察到的特异性裂解的最大百分比的一半所需要的双特异性抗体浓度(EC50)的减少。ADCC的增加是相对于用上面的测定法所测量的由相同的双特异性抗体所介导的ADCC而言的，所述相同的双特异性抗体通过使用相同的标准的产生、纯化、配制和储存方法由相同类型的宿主细胞产生，而不是由经改造以过表达GnTIII的宿主细胞或者由通过FUT8基因的靶向破坏进行改造的宿主细胞产生(“亲本抗体”)。在Fc中的氨基酸置换的情况下，ADCC的增加是相对于用不携带所述置换的亲本双特异性抗体所测量的ADCC而言的。在Fc部分中包含氨基酸置换且经糖改造的双特异性抗体的情况下，ADCC的增加是相对于用不携带所述置换的非糖改造的亲本双特异性抗体所测量的ADCC而言的。
使用抗-CEA抗原结合分子的治疗性应用和方法
优化根据本发明的CEACAM x CD47双特异性抗体以用于主要通过由巨噬细胞介导的肿瘤细胞的吞噬作用来治疗实体肿瘤，要么以单一疗法，要么以组合疗法，尤其是与CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体如CEA-TCB或CEA-TCB1和/或PD-1轴拮抗剂一起。根据本发明的抗体和CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体可以如下面所描述的那样进行施用。
在一个特别的实施方案中，所述疾病或实体肿瘤为表达或甚至过表达CEA的癌症，包括但不限于结肠直肠肿瘤、非小细胞肺肿瘤、胃肿瘤、胰腺肿瘤和乳腺肿瘤的组。在一个特别的实施方案中，所述肿瘤为结肠直肠肿瘤。特别地，在本文中所描述的所有治疗性应用、使用方法、用途、组合等都尤其是用于治疗这些肿瘤/疾病的实施方案。
发明人认识到，由于中和性ADA或效力丧失，根据本发明的抗体显示出低或无ADA形成潜力或暴露丧失。
在一个实施方案中，本发明提供了在体内治疗癌(癌症、肿瘤，例如人的癌)，尤其是表达CEA的肿瘤的方法。该方法包括向受试者施用药学有效量的包含本发明的双特异性抗体的组合物。“受试者”意指人受试者，在一个实施方案中，罹患癌症/肿瘤/癌的患者。
在各种肿瘤实体中CEA表达通常是非常高的，尤其是在结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、子宫癌和膀胱癌中。在胃肠道中的健康的、正常的腺上皮之中，CEA主要以极化的模式表达在细胞的顶端表面上。该极化表达模式限制了全身施用并因此具有潜在毒性的抗-CEA单和双特异性抗体的可接近性。与本发明的抗体的低亲和力CD47结合一起，这导致没有或有限的通过本发明的抗体的此类正常细胞的吞噬作用。该极化表达模式在胃肠道和其他恶性肿瘤的细胞中丢失了。CEA在癌细胞的整个细胞表面上均等地表达，这意味着癌细胞对于本发明的抗体来说比对于正常的、健康的细胞来说容易接近得多，并且可以被本发明的CEAxCD47双特异性抗体或被上面所提及的组合选择性地杀伤。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可以在单一疗法中进行使用以用于治疗晚期实体肿瘤，在一个实施方案中表达CEA的肿瘤。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与CEAxCD3 Mab相组合地进行使用，以同时、分开或顺次的组合。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与CEAxCD3 Mab和/或PD-1轴拮抗剂相组合地进行使用，以同时、分开或顺次的组合。在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体与PD-1轴拮抗剂相组合地进行使用，以同时、分开或顺次的组合。此类PD-1轴拮抗剂描述在例如WO2017118675中。此类组合通过巨噬细胞和T-细胞来攻击实体癌。两种CEAxCD3 Mab正处于临床开发中(CEA-TCB和CEA-TCB1；参见clinicaltrials.gov；在NCT3866239中的RO6958688和在NCT03539484中的RO7172508)。MEDI-565处于临床开发中，但在clinicaltrials.gov中无法辨认出正在进行中的临床试验。在一个实施方案中，作为针对CEA和CD3的双特异性抗体，使用抗体CEA-TCB或CEA-TCB1。
在CEA-TCB中所使用的对于CEA的结合剂源自抗-CEA抗体PR1A3(参见例如EP2681244B1)。该抗体与CEA的所谓的B3结构域相结合。CEA-TCB具有低nM的与CEA的结合亲和力，并且在高剂量(40-600mg/剂/患者)下显示出效力(参见例如J.Tabernero等人,J.Clin.Oncol.35,2017(suppl.Abstr.3002))。在这些剂量下，在细胞表面上的几乎所有CEA靶标都被CEA-TCB占有。CEA-TCB或CEA-TCB1和CEAxCD47的组合同时产生这两种药物的治疗性血浆水平并且取得最好的结果(累加的或甚至协同的)，如果这两种药物对于CEA抗原来说是非竞争性的。
如在本文中所使用的，术语根据本发明的抗体和与人CEA和人CD3ε相结合的第二双特异性抗体的“组合”、“同时、分开或顺次的组合”是指这两种抗体(或三种抗体，在本发明的抗体、CEAxCD3Mab和PD-1轴拮抗剂的组合的情况下)的任何施用，要么分开地要么一起地，其中将所述两种或三种抗体作为被设计用于获得组合疗法的益处的合适剂量制度的一部分进行施用，例如以分开的、顺次的、同时的、并行的、在时间上错开的或交替的施用。因此，所述两种或三种抗体可以作为相同药用组合物的一部分或者在分开的药用组合物中进行施用。根据本发明的抗体可以在施用所述第二双特异性抗体之前、同时或之后，或者以其一些组合来进行施用。当以重复间隔向患者施用根据本发明的抗体(例如在标准的治疗过程期间)时，所述第二双特异性抗体可以在本发明的抗体的每次施用之前、同时或之后或者以其一些组合，或者以相关于用本发明的抗体进行的治疗而言不同的间隔，或者在用本发明的抗体进行的治疗过程之前、期间任何时间或之后以单剂量进行施用。在一个实施方案中，根据本发明的抗体和所述第二双特异性抗体以交替施用来进行施用，在一个实施方案中以在本发明的抗体和所述第二抗体的施用之间6至15天的间隔。在这样的交替施用中，第一个剂量可以是本发明的抗体或所述第二抗体。
术语“PD-1轴拮抗剂”是指抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体。抗-PD-1抗体为例如帕博利珠单抗(pembrolizumab)(
Figure BDA0002928449420000631
MK-3475)、纳武单抗(nivolumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、兰布利珠单抗(lambrolizumab)、MEDI-0680、PDR001和REGN2810。抗-PD-1抗体描述在例如WO200815671、WO2013173223、WO2015026634、US7521051、US8008449、US8354509、WO2009114335、WO2015026634、WO2008156712、WO2015026634、WO2003099196、WO2009101611、WO2010/027423、WO2010/027827、WO2010/027828、WO2008/156712和WO2008/156712(它们中的每一个通过提及而以其整体合并)中。
抗-PD-L1抗体为例如阿特利珠单抗(atezolizumab)、MDX-1 105、德瓦鲁单抗(durvalumab)和阿维鲁单抗(avelumab)。抗-PD-L1抗体例如描述在WO2015026634、WO2013/019906、W02010077634、US8383796、WO2010077634、WO2007005874和WO2016007235(它们中的每一个通过提及而以其整体合并)中。
关于根据本发明的抗体和所述第二双特异性抗体的组合施用，这两种化合物可以存在于一个单一剂型或分开的剂型中，例如在两个不同的或相同的剂型中。
如果本发明的抗体和所述第二抗体关于CEACAM5不是竞争性的，那么在一个实施方案中这两种抗体可以同时施用，如果医生希望。如果本发明的抗体和所述第二抗体关于CEACAM5是竞争性的，那么在一个实施方案中这两种抗体以交替施用来进行施用。
典型地，本发明的抗体将会以提供患者正在为此而进行治疗的那种癌症的最有效治疗的剂量制度(从效力和安全性角度两者)向患者施用，如本领域中已知的。优选地，由T-细胞和巨噬细胞同时攻击肿瘤细胞以实现该方法的完全治疗潜力，CEA-CD3和CEAxCD47双特异性抗体关于与在细胞表面上的CEA的结合必须是非竞争性的。
如上面所讨论的，所施用的抗体的量和本发明的抗体的施用时机可以取决于正在进行治疗的患者的类型(例如，性别、年龄、体重)和状况，正在进行治疗的疾病或状况的严重度，和施用途径。可以以每天或每周0.1至100mg/kg体重的剂量向患者施用本发明的抗体和所述第二抗体，以单一或分开的剂量或者通过连续输注。在一个实施方案中，以0.1至20mg/kg的剂量向患者施用本发明的抗体和所述第二抗体中的每一种。在一些情况下，低于上述范围的下限的剂量水平可能是足够的，而在其他情况下仍然还可以采用更大的剂量而不引起任何有害的副作用。
如在本文中所使用的，术语“抗体的半寿期”是指如在通常的药物代谢动力学测定法中所测量的所述抗体的半寿期，例如如在实施例17中所描述的。根据本发明的抗体和针对CEA和CD3的第二双特异性抗体具有3-14天的消除半寿期。
在另一个方面，本发明还旨在根据本发明的双特异性抗体在治疗疾病，特别是其中表达CEA，特别地其中相对于相同细胞类型的正常组织而言异常表达(例如，在细胞表面上过表达或以不同模式表达)CEA的细胞增殖病症中的用途。此类病症包括但不限于，结肠直肠癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。CEA表达水平可以通过本领域中已知的方法(例如，经由免疫组织化学测定法、免疫荧光测定法、免疫酶测定法、ELISA、流式细胞术、放射免疫测定法等)来测定。
在一个方面，本发明的双特异性抗体可以用于在体内或在体外靶向表达CEA的细胞。本发明的双特异性抗体在经由诱导肿瘤细胞的ADCP和ADCC来防止肿瘤形成、根除肿瘤和抑制肿瘤生长或转移中是特别有用的。本发明的双特异性抗体可以用于治疗任何表达CEA的肿瘤。可以用本发明的双特异性抗体进行治疗的特别的恶性疾病包括但不限于，结肠直肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。
向哺乳动物(优选地，人)施用本发明的双特异性抗体，以在药学上可接受的剂型，例如下面所讨论的那些，包括可以在一段时间内作为推注或通过连续输注以静脉内方式，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径向人施用的那些。本发明的双特异性抗体也通过肿瘤内、肿瘤周围、损伤内或损伤周围途径合适地进行施用，以发挥局部以及全身治疗效应。
对于疾病的治疗，本发明的双特异性抗体的合适的剂量将会取决于待治疗的疾病的类型，疾病的严重度和过程，先前的疗法，患者的临床史和对该抗体的应答，和主治医师的判断。在一个时间或在一系列治疗中向患者合适地施用本发明的双特异性抗体。本发明提供了用于选择性地杀伤表达CEA的肿瘤细胞的方法。
本方法包括本发明的双特异性抗体与所述肿瘤细胞的相互作用。这些肿瘤细胞可以来自人的癌，包括结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。
在另一个方面，本发明旨在本发明的双特异性抗体在制备用于治疗与异常的CEA表达相关的疾病的药物中的用途。在一个特别的实施方案中，所述疾病为表达或甚至过表达CEA的癌症，包括但不限于结肠直肠肿瘤、非小细胞肺肿瘤、胃肿瘤、胰腺肿瘤和乳腺肿瘤。在一个特别的实施方案中，所述肿瘤为结肠直肠肿瘤。
组合物、制剂、剂量和施用途径
在一个方面，本发明旨在药用组合物，其包含本发明的双特异性抗体和在药学上可接受的运载体。本发明进一步地旨在此类药用组合物在治疗疾病例如癌症的方法中的用途，或者在制备用于治疗疾病例如癌症的药物中的用途。特别地，本发明旨在用于治疗疾病，和更特别地用于治疗癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本发明的药用组合物。
在一个方面，本发明包括用于治疗上面所定义的人的癌、肿瘤的药用组合物、组合和方法。例如，本发明包括用于在治疗人的癌中使用的药用组合物，其包含药学有效量的本发明的抗体和在药学上可接受的运载体。
本发明的双特异性抗体组合物可以通过使用常规施用方式来进行施用，包括但不限于静脉内、腹膜内、口服、淋巴管内或直接肿瘤内施用。静脉内施用或皮下施用是优选的。
在本发明的一个方面，通过将具有所希望的程度的纯度的抗体与任选的在药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980))相混合，以冻干制剂或液体制剂的形式，制备包含本发明的双特异性抗体的治疗性制剂以用于储存。可接受的运载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对于接受者来说是无毒性的。待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过经过无菌过滤膜的过滤来容易地完成。用于本发明的药用组合物的最有效的施用方式和剂量制度取决于疾病的严重度和过程，患者的状况和对治疗的应答，和治疗医生的判断。因此，所述组合物的剂量可以是固定剂量(flat dose)，或者可以适应于个体患者，例如体重。然而，本发明的组合物的有效剂量通常将会在0.1至20mg/kg的范围内。
本发明的双特异性抗体具有在150kD/Mol的大小程度中的分子量。在一个实施方案中，它们携带Fc部分。在患者中的消除半寿期在3至14天的范围内。该半寿期允许但不限制于，一天一次、一周一次或每两周一次施用。
本发明的双特异性抗体及其各自的组合物可以以各种各样的剂型，其包括但不限于液体溶液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、栓剂、聚合物微胶囊或微泡、脂质体和可注射或可输注溶液。优选的形式取决于施用方式和治疗应用。
本发明的包含双特异性抗体的组合物将会以符合良好医学实践的方式进行配制、按剂量给药和施用。关于在该背景下的考虑的因素包括特定的正在进行治疗的疾病或病症，特定的正在进行治疗的哺乳动物，个体患者的临床状况，疾病或病症的原因，试剂的递送部位，施用方法，施用计划安排，和医学从业者已知的其他因素。
制品
在本发明的另一个方面，提供了包含对于治疗、预防和/或诊断上面所描述的病症来说有用的材料的制品。所述制品包含容器以及在容器上或与容器相连的标签或包装附页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以从各种各样的材料例如玻璃或塑料制成。所述容器容纳独自地或与另一种组合物相组合地对于治疗、预防和/或诊断所述状况来说有效的组合物，并且可以具有无菌的进入孔(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或者具有用皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。在所述组合物中的至少一种活性试剂为本发明的双特异性抗体。所述标签或包装附页指示，所述组合物用于治疗所选择的状况。而且，所述制品可以包含：(a)具有包含于其中的组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的双特异性抗体；和(b)具有包含于其中的组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性试剂或者治疗性试剂。在本发明的该实施方案中，所述制品可以进一步包含包装附页，其指示所述组合物可以用于治疗特定状况。备选地或另外地，所述制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含在药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和使用者观点来看希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
本发明的进一步的实施方案
下面描述了与人CEACAM5和人CD47特异性地结合的双特异性抗体的实施方案。
1.双特异性抗体，其包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分。
2.根据实施方案1的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc区已经进行了糖改造从而具有相比于相同但非糖改造的双特异性抗体而言减少的数目的岩藻糖残基。
3.根据实施方案1或2的双特异性抗体，其特征在于，所述第一结合部分与氨基酸35-144的CEACAM5的Ig-样V-型结构域相结合。
4.根据实施方案1至3中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体与抗体SM3E竞争与CEACAM5的结合。
5.根据实施方案1至3中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体不与抗体SM3E、MEDI、LAB、SAR、T86.66、CH1A1A竞争。
6.根据实施方案1至5中任一项的双特异性抗体，其特征在于，在相同实验条件下和在1mg/ml人IgG存在或不存在下，所述双特异性抗体的吞噬作用的EC50值在参考抗体K2AC22的E50值的0.1至10倍的范围内。
7.根据实施方案1至6中任一项的双特异性抗体，其特征在于，在1mg/ml人IgG存在下，在基于成像的测定法中所测量的吞噬指数的最大值相比于在相同实验条件下没有人IgG的吞噬作用而言没有降低超过30％。
8.根据实施方案1至7中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体对于所述第一结合部分来说是单价的，和对于所述第二结合部分来说是单价的。
9.根据实施方案1至8中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述第一和第二结合部分中的每一个包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。
10.根据实施方案1至9中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体是人IgG1类型的。
11.根据实施方案1至10中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述恒定和可变构架区序列是人的或人来源的。
12.根据实施方案1至11中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体为全长抗体。
13.根据实施方案1至12中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分，其包含κ轻链可变结构域和λ轻链恒定结构域；和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，其包含κ轻链可变结构域和κ轻链恒定结构域。
14.根据实施方案1至12中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分，其包含λ轻链可变结构域和λ轻链恒定结构域；和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，其包含κ轻链可变结构域和κ轻链恒定结构域。
15.根据实施方案13或14中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含共同重链。
16.根据实施方案1至15中任一项的双特异性抗体，其特征在于，
a)所述第一结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQ ID NO:3的CDRH3，和SEQ ID NO:13的人λ类型的轻链恒定结构域；并且所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQID NO:3的CDRH3，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:7的CDRL1、包括在SEQ ID NO:8中的AlaAla Ser的CDRL2和SEQ ID NO:9的CDRL3；或者
b)所述第一结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ IDNO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和SEQ ID NO:13的人λ类型的轻链恒定结构域；并且所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:28的CDRL1、SEQ ID NO:29的CDRL2和SEQ ID NO:30的CDRL3作为CDR。
17.根据实施方案1至16中任一项的双特异性抗体，其以包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分为特征，其特征在于，
a)所述第一结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ IDNO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含从由下列各项组成的组中选择的CDRL1、CDRL2和CDRL3的组合：
SEQ ID NO:31、32和33；SEQ ID NO:34、35和36；SEQ ID NO:37、38和39；SEQ IDNO:40、41和42；SEQ ID NO:43、44和45；SEQ ID NO:46、47和48；SEQ ID NO:49、50和51；SEQID NO:52、53和54；SEQ ID NO:55、56和57；SEQ ID NO:58、59和60；SEQ ID NO:61、62和63；和SEQ ID NO:112、113和114，并且
b)所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQ ID NO:3的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:7的CDRL1、包括在SEQ ID NO:8中的Ala Ala Ser的CDRL2和SEQ ID NO:9的CDRL3作为CDR，或者
所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:28的CDRL1、SEQ ID NO:29的CDRL2和SEQ ID NO:30的CDRL3作为CDR，和任选地人λ类型的且SEQ ID NO:13的轻链恒定结构域。
18.根据实施方案1至17中任一项的双特异性抗体，其以包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分为特征，其特征在于，
a)所述第一结合部分包含SEQ ID NO:4的重链可变区和选自包括在从由下列各项组成的组中选择的VLCL区中的VL的轻链可变区：SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:115，并且
b)所述第二结合部分包含SEQ ID NO:4的重链可变区和SEQ ID NO:10的轻链可变区。
19.根据实施方案1至18中任一项的双特异性抗体，其以包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分为特征，其特征在于，
a)所述第一结合部分包含SEQ ID NO:5的重链和从由下列各项组成的组中选择的轻链：SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQID NO:115，并且
b)所述第二结合部分包含SEQ ID NO:5的重链可变区和SEQ ID NO:11的轻链可变区。
20.根据实施方案1至19中任一项的双特异性抗体，其特征在于，
所述双特异性抗体是人IgG1类型的全长双特异性抗体，并且
所述双特异性抗体对于所述第一结合部分来说是单价的和对于所述第二结合部分来说是单价的，并且
所述双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分，其包含κ轻链可变结构域和λ轻链恒定结构域，和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，其包含κ轻链可变结构域和κ轻链恒定结构域，或者
包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分，其包含λ轻链可变结构域和λ轻链恒定结构域，和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，其包含κ轻链可变结构域和κ轻链恒定结构域。
21.根据实施方案1至20中任一项的双特异性抗体，其特征在于，以100nM至600nM，优选地100nM至500nM的结合亲和力与人CD47相结合。
22.根据实施方案1至21中任一项的双特异性抗体，其特征在于，以1至200nM的EC50值与MKN-45细胞相结合。
23.根据实施方案1至22中任一项的双特异性抗体，其特征在于，以100至500nM的结合亲和力与人CD47相结合，和以1至200nM的EC50值与MKN-45细胞相结合。
24.根据实施方案1至23中任一项的双特异性抗体，其特征在于，
a)在200ng/ml可溶性CEA存在下关于通过所述双特异性抗体的在人巨噬细胞存在下MKN-45细胞的吞噬指数曲线的EC50相比于在没有可溶性CEA的情况下所测量的EC50而言没有向更高浓度位移超过4倍，和/或通过添加200ng/mL可溶性CEA没有使吞噬指数曲线的最大值减少10％或更多，15％或更多，或者20％或更多，和/或
b)在200ng/ml可溶性CEA存在下关于所述双特异性抗体的与MKN-45细胞的结合曲线的EC50相比于在没有可溶性CEA的情况下所测量的EC50而言没有向更高浓度位移超过2倍。
25.根据实施方案1至24中任一项的双特异性抗体，其特征在于，与人重组CEACAM5和CEACAM6相结合，由此与重组CEACAM5和CEACAM6的结合的EC50值相差小于3倍。
26.根据实施方案25的双特异性抗体，其特征在于，
a)所述第一结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ IDNO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:112的CDRL1、SEQ ID NO:113的CDRL2和SEQ ID NO:114的CDRL3作为CDR，和
b)所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ IDNO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:28的CDRL1、SEQ ID NO:29的CDRL2和SEQ ID NO:30的CDRL3作为CDR。
27.根据实施方案1至26中任一项的双特异性抗体，其特征在于，在300nM的浓度下，包含SEQ ID NO:97和98的重链作为重链和SEQ ID NO:96和99的轻链作为轻链的与人CEACAM5和CD3ε特异性地结合的双特异性抗体没有使对于MKN-45细胞的本发明的双特异性抗体的结合曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。
28.根据实施方案1至27中任一项的双特异性抗体，其特征在于，在30nM的浓度下，包含氨基酸序列SEQ ID NO:92至95的链作为重链和轻链的与人CEACAM5和CD3ε特异性地结合的双特异性抗体(进一步地也称为CEA-TCB1)没有使对于MKN-45细胞的本发明的双特异性抗体的结合曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。
29.根据实施方案1至28中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc区已经进行了糖改造从而具有相比于各自亲本双特异性抗体而言减少的数目的岩藻糖残基。
30.根据实施方案29的双特异性抗体，其特征在于，在所述Fc区中50％至100％的N-联寡糖是非岩藻糖基化的。
31.根据实施方案29或30中任一项的双特异性抗体，其特征在于，在所述Fc区中50％至100％的N-联寡糖是平分型的。
32.根据实施方案29至31中任一项的双特异性抗体，其特征在于，在所述Fc区中80％至100％的N-联寡糖是平分型的且非岩藻糖基化的。
33.根据实施方案29至32中任一项的双特异性抗体，其特征在于，由所述抗体所诱导的ADCC的EC50值和/或ADCC最大值增加1.2至2.0倍或至少2.0倍，和/或吞噬指数曲线的EC50值降低至少1.2至2.0倍或至少2.0倍，相比于由各自的亲本双特异性抗体所诱导的ADCC的最大值和/或EC50值而言。
34.根据实施方案29至33中任一项的双特异性抗体，其特征在于，通过成像测定的由所述抗体所诱导的吞噬指数的最大值增加至少3倍，和/或吞噬指数曲线的EC50值降低至少3倍或至少5倍，分别相比于由各自的亲本双特异性抗体所诱导的吞噬指数的最大值和EC50值而言。
35.用于产生根据实施方案29至34和30中任一项的双特异性抗体的方法，其特征在于，包括：
a)在允许产生所述双特异性抗体并且允许对在所述双特异性抗体的Fc区上存在的寡糖进行所述糖改造修饰的条件下培养经改造从而表达至少一种编码具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽的核酸的宿主细胞；和
b)分离所述经糖改造的双特异性抗体，其中所述抗体能够与人CEACAM5和人CD47特异性地结合。
36.用于产生根据实施方案29至30和33至34中任一项的双特异性抗体的方法，其特征在于，包括：
a)在允许产生所述本发明的经糖改造的双特异性抗体并且允许对在所述双特异性抗体的Fc区上存在的寡糖进行所述糖改造修饰的条件下培养通过靶向破坏FUT8基因而经糖改造的宿主细胞，和
b)分离所述经糖改造的双特异性抗体，其中所述抗体能够与人CEACAM5和人CD47特异性地结合。
37.分离的多核苷酸，其特征在于，编码根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体。
38.载体，其包含根据实施方案37的多核苷酸。
39.宿主细胞，其包含根据实施方案38的载体。
40.组合物，其包含根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体和在药学上可接受的运载体。
41.诱导肿瘤细胞的细胞裂解的方法，其包括使所述肿瘤细胞与根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体相接触。
42.根据实施方案41的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为结肠直肠癌细胞、NSCLC(非小细胞肺癌)细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞或另一种表达人CEACAM5的肿瘤细胞。
43.治疗具有表达CEA的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体。
44.在具有表达CEA的癌症的受试者中增加存活时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体。
45.根据实施方案43或44的方法，其特征在于，所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
46.根据实施方案43至45中任一项的方法，其特征在于，根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体与化学疗法或放射疗法相组合地施用给人受试者。
47.根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体，其用于在制备药物中使用，所述药物用于治疗具有表达CEA的癌症的受试者。
48.根据实施方案47的用于所述用途的双特异性抗体，其特征在于，所述癌症选自由结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌组成的组。
49.根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体，其用于在治疗具有表达CEA的癌症的受试者的方法中使用，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述双特异性抗体，其特征在于，在相同实验条件下和在1mg/ml人IgG存在和/或不存在下，所述双特异性抗体的吞噬作用的EC50值在参考抗体K2AC22的E50值的0.1至10倍的范围内，所述参考抗体K2AC22包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分，由此所述第一结合部分包含SEQ ID NO:5的重链和SEQ ID NO:65的轻链，并且所述第二结合部分包含SEQ ID NO:5的重链和SEQ ID NO:11的轻链。
50.包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分的第一双特异性抗体，其用于与包含与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分和与人CD3ε特异性地结合的第四结合部分的第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的人受试者中进行使用。
51.根据实施方案50的用于所述用途的第一双特异性抗体，其特征在于，所述第二双特异性抗体的所述第四结合部分与包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的人CD3ε的表位相结合。
52.根据实施方案50或51的用于所述用途的第一双特异性抗体，其特征在于，所述第二抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:96至99的链作为重链和轻链或者包含氨基酸序列SEQID NO:92至95的链作为重链和轻链，并且在300nM或30nM的浓度下所述第二抗体没有使对于MKN-45细胞的所述第一双特异性抗体的结合曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。
53.根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEA的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含SEQ ID NO:96至99的链作为重链和轻链或者包含氨基酸序列SEQ IDNO:92至95的链作为重链和轻链。
54.根据实施方案1至34和50至53中任一项的双特异性抗体，其特征在于，其不与包含SEQ ID NO:96至99的链作为重链和轻链或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:92至95的链作为重链和轻链的第二双特异性抗体竞争，其用于与所述第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达人CEACAM5的癌症的受试者中进行使用。
55.根据实施方案1至34和50至53中任一项的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达人CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体：a)包含与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区，和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或者b)分别地包含SEQID NO:96至99的链作为重链和轻链或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:92至95的链作为重链和轻链，由此在300nM(SEQ ID NO:96至99)或30nM(SEQ ID NO:92至95)的浓度下所述第二双特异性抗体没有使根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体的对于MKN-45细胞的吞噬指数曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
56.根据实施方案50至55中任一项的用于所述用途的双特异性抗体，其特征在于，所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。
57.根据实施方案50至56中任一项的用于所述用途的双特异性抗体，其特征在于，以6至15天的间隔向所述受试者交替地或同时地施用根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体和所述第二双特异性抗体。
58.包含根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体的组合物，其特征在于不与第二双特异性抗体交叉反应，其用于在治疗具有表达人CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体：a)包含与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区，和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或者b)包含SEQ ID NO:96至99的链作为重链和轻链或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:92至95的链作为重链和轻链。
59.包含根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体的组合物，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达人CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体：a)包含与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区，和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；或者b)包含SEQID NO:96至99的链作为重链和轻链或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:92至95的链作为重链和轻链，由此在300nM或者30nM(SEQ ID NO:92至95)的浓度下所述第二双特异性抗体没有使根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体的对于MKN-45细胞的吞噬指数曲线的EC50位移超过3倍，在一个实施方案中向更高浓度。
60.根据实施方案58或59的组合物，其特征在于，所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。
61.根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体，其用于在治疗具有表达CEA的癌症的受试者的方法中进行使用，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述双特异性抗体。
62.根据实施方案1至34中任一项的双特异性抗体，其用于在用以在具有表达CEA的癌症的受试者中增加存活时间的方法中进行使用，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述双特异性抗体。
63.根据实施方案61或62中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体与化学疗法或放射疗法相组合地施用给人受试者。
64.根据实施方案60或62中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
表1：序列列表
Figure BDA0002928449420000781
Figure BDA0002928449420000791
Figure BDA0002928449420000801
Figure BDA0002928449420000811
Figure BDA0002928449420000821
SEQ ID NO:92至95是指CEA-TCB1，和SEQ ID NO:96至99是指CEA-TCB。
Ala：丙氨酸；Ser：丝氨酸
实施例
实施例1：人CD47的克隆、表达和纯化
克隆
使用特异性寡核苷酸，通过聚合酶链反应(PCR)从人cDNA中扩增相应于人CD47(hCD47)的细胞外结构域的序列。将扩增产物进行凝胶纯化，并且克隆入pEAK8哺乳动物表达载体(Edge Biosystems,Gaithersburg,Md.)中。进一步修饰该载体以引入AvitagTM(Avidity,Denver Colo.)和六组氨酸标签(在C-末端处)，以分别允许蛋白质的单一位点生物素化和通过IMAC(固定化金属离子亲和层析)的纯化。所述构建体通过DNA测序来进行验证。
表达
然后，通过使用基于脂质体的转染试剂例如Lipofectamine2000(ThermofisherScientific)将质粒转染入哺乳动物细胞中。转染步骤仅需要少量的DNA和细胞，典型地每个孔2×105个和2μg的质粒DNA，并且在6-孔平板中进行所述转染。虽然可以使用不同的哺乳动物细胞系，但是在下面给出的实例中，转染经转化的人胚肾单层上皮细胞(PEAK细胞)。这些细胞稳定表达EBNA-1基因(其进一步地支持附加型复制过程)，是半粘附性的，并且可以在标准的细胞培养条件(5％CO2，37℃，在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中)下生长。在24小时后，通过添加包含0.5-2μg/mL嘌呤霉素的培养基来将细胞放置在选择性条件下：具有附加型载体的细胞对于该抗生素具有抗性。
在转染后两至三周，将经扩增和经选择的细胞注射入一次性CELLineTM生物反应器中以用于产生步骤。CELLineTM是一种两隔室生物反应器，其可以在标准的细胞培养培养箱中进行使用。较小的隔室(15ml)包含细胞，并且与较大(一升)的包含培养基的隔室通过具有10kDa的截止大小的半渗透膜而分隔开(Bruce等人,2002；McDonald等人,2005)。该系统允许营养物、气体和代谢废弃产物的扩散，同时将细胞和所分泌的蛋白质保留在较小的隔室中。在收获上清液之前将培养物维持7-10天。由于该培养基包含血清，因此细胞保持良好的生存力，并且通过使用相同的细胞和容器可以进行数个产生轮次。
纯化
在收获后，通过离心来澄清细胞培养物上清液。然后，给上清液补充以100mM咪唑，并且加载到Ni-NTA亲和层析树脂(Qiagen)上。相对高的咪唑浓度使污染物与树脂的结合最小化。在洗涤柱子后，在AKTA Prime层析系统(Amersham Pharmacia Biotech)上使用30mL咪唑梯度(20-400mM咪唑)以2mL/分钟的流速来洗脱蛋白质。该洗脱梯度进一步改善了重组蛋白质的纯度，但是如果层析系统不可得，可以用一步洗脱方法来代替。可以通过SDS-PAGE或ELISA来分析洗脱出的级分，以测定其重组蛋白质含量。汇集目的级分，并且在用磷酸盐缓冲盐水和另一种合适的缓冲液进行平衡的Amicon10KD柱(Millipore)上脱盐。然后，可以通过使用各种技术来定量经脱盐的蛋白质，并且通过SDS-PAGE来分析其纯度。按照制造商的说明书，在体外通过使用生物素连接酶(Avidity,Denver Colo.)来使重组CD47生物素化。在脱盐后，通过使用链霉抗生物素蛋白磁珠的拉下(pull-down)测定法和SDS-PAGE分析来评价生物素化水平。实施例2：人CEACAM家族成员的表达和纯化
克隆
由Eurofins和Twist Bioscience合成相应于CEACAM5的完全细胞外结构域(ECD)和A3-B3结构域的序列。将这些合成的基因亚克隆入pEAK8哺乳动物表达载体(EdgeBiosystems,Gaithersburg,Md.)中。修饰所述载体以引入AvitagTM(Avidity,DenverColo.)以及六组氨酸标签、人FC区或小鼠FC区(在C-末端处)。所述构建体通过DNA测序来进行验证。重组的可溶性蛋白质的纯化通过IMAC(固定化金属离子亲和层析)、FcXL或CaptureSelectTM IgG-Fc(ms)亲和基质(Thermofisher Scientific)来进行。
还产生了编码人CEACAM 1、3、4、5、6、7、8、18、19、20、21和食蟹猴CEACAM5的全长形式的载体，以用于在PEAK和/或CHO细胞的细胞表面上表达。类似地，还克隆了可溶的全长人CEACAM16。
表达和纯化
如在实施例1中所详述的，进行上面提及的重组蛋白质的表达、纯化和生物素化。
实施例3：使用包含固定可变重链结构域的人scFv文库来进行CEACAM5 Fv的噬菌体展示选择
用于构建和操作在M13噬菌体上展示的人scFv文库的一般程序描述在Vaughan等人(Nat.Biotech.1996,14:309-314)中，其通过提及而以其整体合并入本文。用于选择和筛选的文库编码全都共享相同的VH结构域并且仅在VL结构域中多样化的scFv。用于产生固定VH文库的方法以及其用于鉴定和装配双特异性抗体的用途描述在US 2012/0184716和WO2012/023053中，它们中的每一个通过提及而以其整体合并入本文。下面描述了用于鉴定与人CEACAM5相结合的scFv的程序。
蛋白质选择
在室温下在旋转混合器上用包含3％(w/v)脱脂乳的PBS封闭scFv噬菌体文库的等分试样(1012Pfu)一小时。在室温下在旋转混合器上在链霉抗生物素蛋白磁珠(DynabeadsTMM-280)上使经封闭的噬菌体去选择一小时。将去选择的噬菌体与100nM的被捕获在链霉抗生物素蛋白磁珠上的经生物素化的人CEACAM5或A3-B3结构域一起在室温下在旋转混合器上温育两小时。通过使用磁力架(magnetic stand)来捕获珠粒，随后为用PBS/0.1％Tween20洗涤五次和用PBS洗涤两次。在室温下在旋转混合器上用100nM TEA洗脱噬菌体30分钟。用Tris-HCl 1M pH 7.4中和经洗脱的噬菌体和珠粒，并且直接添加至10ml的指数生长的TG1细胞并在37℃下在缓慢摇动(90rpm)下温育一小时。将经感染的TG1的等分试样进行系列稀释以滴定选择产出量。将剩余的经感染的TG1以3800rpm旋转10分钟并重悬浮在2ml2xTY中，并且铺在2xTYAG(包含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2xTY培养基)琼脂Bioassay平板上。在30℃下过夜温育后，向所述平板添加10ml的2xTY，并且从表面刮取细胞并转移至50ml聚丙烯管。向细胞悬浮液添加50％甘油溶液以获得17％甘油的最终浓度。将选择回合的等分试样保持在-80℃下。
噬菌体拯救
向50ml的2xTYAG添加50μl的从前次选择回合获得的细胞悬浮液，并且使其在37℃下在搅动(240rpm)下进行生长直至达到0.3至0.5的OD600。然后，将培养物用1.2×1011个M13K07辅助噬菌体进行超感染并且在37℃(90rpm)下温育一小时。通过下述方式来更换培养基：以3800rpm离心细胞10分钟，去除培养基，并且将粒状沉淀重悬浮在50ml的2xTYAK(包含100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素的2xTY培养基)中。然后，使培养物在30℃(240rpm)下生长过夜。次日，将包含噬菌体的上清液用于下一回合的选择。
细胞表面选择
在室温下在旋转混合器上用包含3％(w/v)脱脂乳的PBS封闭包含噬菌体的上清液一小时。然后，在不表达人CEACAM5的MKN45CEACAM5KO上使经封闭的噬菌体去选择一小时。在室温下在温和摇动下将去选择的噬菌体与2×107个表达CEACAM5的MKN45细胞(在PBS 3％BSA 0.1％NaN3中进行封闭)一起温育两小时。使细胞形成粒状沉淀并且用PBS洗涤六次。用76mM柠檬酸洗脱经结合的噬菌体并且摇动10分钟。在用Tris-HCl 1M pH 8进行中和后，将细胞直接添加至10ml的指数生长的TG1，并且在37℃下在缓慢摇动下温育一小时。将经感染的TG1的等分试样进行系列稀释以滴定选择产出量。将经感染的TG1以3800rpm旋转10分钟并重悬浮在2ml 2xTY培养基中，并且铺在2xTYAG琼脂Bioassay平板上。在30℃下过夜温育后，向所述平板添加10ml的2xTY，并且从表面刮取细胞并转移至50ml聚丙烯管。向细胞悬浮液添加50％甘油溶液以获得17％甘油的最终浓度。将选择回合的等分试样保持在-80℃下。
实施例4：筛选与可溶性CEACAM5、CEACAM6和CEACAM1结合/不结合的scFv
用于结合和功能测试的scFv周质制备物
将独个克隆接种入包含0.9ml/孔的2xTYAG培养基(包含100μg/ml氨苄青霉素、0.1％葡萄糖的2xTY培养基)的深孔微量滴定板中，并且使其在37℃(240rpm)下生长5-6小时。然后，添加100μl/孔的在2xTY培养基中的0.2mM IPTG以给出0.02mM IPTG的最终浓度。将所述平板在30℃下在以240rpm进行摇动下温育过夜。将所述深孔平板在4℃下以3200rpm离心10分钟并且小心地去除上清液。将粒状沉淀重悬浮在150μl TES缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8)、1mM EDTA(pH 8)、20％蔗糖，补充有完全蛋白酶抑制剂，Roche)中。通过添加150μl的经稀释的TES缓冲液(1:5TES:水稀释)并在冰上温育30分钟来产生低渗休克。将所述平板在4℃下以4000rpm离心10分钟以使细胞和碎片形成粒状沉淀。将上清液小心地转移到另一个微量滴定板中并且保持在冰上以用于立即在功能测定法或结合测定法中进行测试。
结合
使用CellInsightTM技术在均质测定法中测试关于与CEACAM5的结合的scFv的筛选。在384透明底孔平板(Corning)的每一个孔中混合下列试剂：30μl的包被有经生物素化的CEACAM5、经生物素化的A3-B3结构域或经生物素化的NusA(作为对照蛋白质)的链霉抗生物素蛋白聚苯乙烯珠粒悬浮液(Polysciences；3000个珠粒/孔)；60μl的经封闭的scFv周质制备物；10μl的检测缓冲液(PBS，其包含5μg/ml的小鼠抗-c-myc抗体；经1:200稀释的抗小鼠Fc
Figure BDA0002928449420000871
647)。在以600rpm混合5分钟后，将该384-孔平板在室温下进行温育并且在2小时后在CellInsightTM CX5高含量筛选平台(ThermoFisher Scientific)上进行读取。选择表达给出关于CEACAM5而不是NusA的特异性信号的scFv的克隆以用于进一步分析或测序。
可以以相同的方式测量与CEACAM1、CEACAM6和其他CEACAM的结合。
噬菌体克隆测序
将单个克隆接种入包含1ml LBAG培养基(具有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的LB培养基)/孔的96-深孔微量滴定板中，并且使其在37℃、240rpm下生长过夜。使用Zyppy-96 Plamis Miniprep试剂盒(Zymo Research)提取DNA并且进行测序。
实施例5：重整成IgG的固定VH候选物和在哺乳动物细胞中的瞬时表达
在筛选和测序后，使具有所希望的结合特性的scFv候选物重整成IgG并且通过瞬时转染入PEAK细胞来进行表达。用特异性的寡核苷酸来扩增所选择的scFv的VH和VL序列并将其克隆入包含重链和轻链恒定区的表达载体中，并且通过测序来验证所述构建物。按照制造商的说明书，使用Lipofectamine 2000(Thermofisher Scientific)来将表达载体转染入哺乳动物细胞中。简而言之，在T75瓶中在25ml包含胎牛血清的培养基中培养3.5×106个PEAK细胞。将经转染的细胞在37℃下培养5-6天，通过OctetRED96仪器来定量IgG产生。收获上清液以用于按照制造商的说明书在FcXL亲和树脂(Thermofisher Scientific)上进行IgG纯化。简而言之，将来自经转染的细胞的上清液与合适量的FcXL树脂一起在4℃下温育过夜。在用PBS洗涤树脂后，将样品加载到Amicon Pro柱上并且因此在50mM甘氨酸pH3.5中洗脱出IgG。然后，通过Amicon 50kDa将洗脱出的IgG级分逆组氨酸NaCl pH6.0缓冲液进行透析，并且通过在280nm下的吸光度来定量IgG含量。由Agilent Bioanalyzer制造商(Agilent Technologies,Santa Clara,Calif.,USA)来验证纯度和IgG完整性。
实施例6：CEACAM5抗体的表征
a)CEACAM5抗体与用CEACAM家族的不同成员转染的细胞的结合
根据发明人的知识，CEACAM5单克隆抗体(mAb)的特异性可以通过流式细胞术来显示，其中使用用CEACAM家族的不同成员转染的PEAK和/或CHO细胞。将编码人CEACAM 1、3、4、5、6、7、8、18、19、20和21和20的全长形式的载体用于在PEAK和/或CHO细胞的表面上表达这些蛋白质，如在实施例2中所描述的。使用未转染的PEAK和/或CHO细胞作为阴性对照。收获细胞，计数，就生存力进行检查，并且以3×106个细胞/ml重悬浮在FACS缓冲液(PBS 2％BSA,0.1％NaN3)中。将100μl的细胞悬浮液分配在V-底96-孔平板中(3×105个细胞/孔)。通过在4℃、1300rpm下离心3分钟来去除上清液，并且将细胞与浓度渐增的根据本发明的抗体一起在4℃下温育15分钟。在FACS缓冲液中稀释抗体，并且浓度范围为30pM-500nM。用冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次，并且与缀合有PE(R-藻红蛋白)的小鼠抗人IgG Fc二抗(SouthernBiotech，在FACS缓冲液中经1:100预稀释的)一起在4℃下重新温育另外的15分钟。用冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次，并且重悬浮在300μl具有经1:1500稀释的TOPRO-3(Invitrogen)的FACS缓冲液中。使用FACSCaliburTM(BD Biosciences)来测量荧光。使用GraphPad Prism7软件来拟合剂量-应答结合曲线。以相同的方式，可以表征CEACAM1、CEACAM6和其他CEACAM。简而言之，将经纯化的Mab与表达CEACAM家族蛋白质之一的细胞一起(以10μg/ml的最终浓度)温育30分钟。在两次洗涤后，通过使用缀合有Cy-5的抗人Fc二抗(BD biosciences)来检测经结合的抗体。
如果通过缀合有PE的抗人IgG Fc二抗没有检测到经结合的抗体，那么发现根据本发明的抗体是不与所述CEACAM相结合的。
b)CEACAM5抗体与食蟹猴CEACAM5的交叉反应性
根据发明人的知识，本发明的CEACAM5单克隆抗体与食蟹猴CEACAM5交叉反应的能力可以通过流式细胞术来测试，其中使用用表达全长食蟹猴CEACAM5的载体转染的PEAKCHO细胞。流式细胞术允许检测所述抗体是否与表达cynoCEACAM5的PEAK CHO细胞相结合，或者所述抗体是否不与PEAK CHO细胞相结合或者说与所述CEACAM是非结合性的。
实施例7：携带λ和κ轻链的双特异性抗体的表达和纯化
在相同细胞中一条重链和两条轻链的同时表达可以导致三种不同抗体的装配。同时表达可以以不同方式来实现，例如表达待共表达的链之一的多种载体的转染，或者通过使用驱动多个基因表达的载体。将编码不同的抗-CEACAM5抗体的载体与表达抗-CD47抗体Ka3(携带相同的共同重链并且描述在US 2014/0303354中的抗-CD47抗体)的重链和轻链(SEQ ID NO:5和11)的另一种载体一起共转染。备选地，将两条轻链克隆入先前产生的pNoviκHλ载体中以允许一条重链、一条κ轻链和一条λ轻链的共表达，如在US 2012/0184716和WO 2012/023053(它们中的每一个通过提及而以其整体合并入本文)中所描述的。这三个基因的表达由人巨细胞病毒启动子(hCMV)驱动，并且所述载体还包含谷氨酰胺合成酶基因(GS)，其使得能够进行稳定细胞系的选择和建立。将抗-CEACAM5 IgG和抗-CD47 IgG的共同VH和VL基因克隆入载体pNoviκHλ中，以用于在哺乳动物细胞中的瞬时表达。以合适的细胞数目和培养基体积(包含胎牛血清)在适当的瓶中培养Peak细胞。按照制造商的说明书，使用Lipofectamine 2000来将质粒DNA转染入细胞中。在产生期间使用OctetRED96来测量在经转染的细胞的上清液中的抗体浓度。根据抗体浓度，在转染后5至7天收获上清液并且通过以1300g离心10分钟来进行澄清。纯化过程由三个亲和步骤组成。首先，用PBS洗涤FcXL亲和基质(Thermofisher Scientific)，然后添加到经澄清的上清液中。在+4℃下温育过夜后，以2000g离心上清液10分钟，储存流过物，并且用PBS洗涤树脂两次。然后，将树脂转移到Amicon Pro柱上，并且将包含50mM甘氨酸(pH 3.0)的溶液用于洗脱。产生几个洗脱级分，将它们汇集，并且使用50kDa AmiconTM Ultra Centrifugal过滤单元(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)逆PBS进行脱盐。通过使用Nanodrop分光光度计(NanoDropTechnologies,Wilmington,Del.)来定量包含来自上清液的总人IgG的洗脱出的产物，并且将其与适当体积的κ选择亲和基质(GE Healthcare)一起在RT和20rpm下温育15分钟。温育、树脂回收、洗脱和脱盐步骤如前面所描述的那样来进行。最后的亲和纯化步骤通过使用λFab选择亲和基质(GE Healthcare)来进行，其中应用与用于两个前面的纯化的过程相同的过程。使用Nanodrop来定量最终产物。通过在变性和还原条件下的电泳来分析经纯化的双特异性抗体。将Agilent 2100Bioanalyzer与Protein 80试剂盒一起进行使用，如由制造商所描述的(Agilent Technologies,Santa Clara,Calif.,USA)。将4μL的经纯化的样品与补充有二硫苏糖醇(DTT；Sigma Aldrich,St.Louis,Mo.)的样品缓冲液相混合。将样品在95℃下加热5分钟，然后加载在芯片上。通过使用鲎变形细胞裂解物测试(LAL；Charles RiverLaboratories,Wilmington,Mass.)就内毒素污染来测试所有样品。
实施例8：单价和双特异性抗体的表征
a)双重靶向性双特异性抗体与在相同细胞的表面上的两种不同的抗原相结合
根据发明人的知识，两个抗体臂与在细胞表面上的两种抗原的同时结合(称为共参加(co-engagement))可以由于亲和性机制而导致亲和力的累加性或协同性的增加。因此，相比于仅表达一种单一抗原的细胞而言，共参加将高选择性赋予表达这两种抗原的细胞。另外，双特异性抗体的两个臂对于其各自靶标的亲和力可以以下述方式来建立：与靶细胞的结合主要由抗体臂之一来驱动。例如，由以高亲和力与CEACAM5或与CEACAM5和CEACAM6相结合的一个臂和以较低亲和力与CD47相结合的第二臂(但在与CD47的CEACAM5或CEACAM5和CEACAM6共参加时足以抑制CD47/SIRPα)组成的双重靶向性κλ抗体应当允许相对于正常细胞而言优先抑制癌细胞中的CD47。
b)与人CD47的亲和力测量
根据发明人的知识，可以使用Biacore T200仪器通过表面等离子体共振技术来评价根据本发明的抗体与人CD47的结合亲和力。可以将经生物素化的人CD47可溶性重组蛋白质捕获在包被有链霉抗生物素蛋白的传感器芯片(S系列传感器芯片SA)上。然后，可以将一系列浓度的受试蛋白质注射在表面上，其中在每次注射之间使表面再生。
此类测量用CD19xCD47κλ双特异性抗体来进行。在重复测定中所测量的结合亲和力在400和500nM之间。该抗体的CD47结合臂与本发明的CEAxCD47双特异性抗体的CD47结合臂相同。根据发明人的知识，用本发明的CEAxCD47双特异性抗体进行的相同实验将会提供在此类实验的标准偏差之内的相似结果。
c)单价和双特异性抗体的SIRPα阻断活性证明在靶肿瘤细胞表面上CEACAM5和CD47的共参加
根据发明人的知识，可以进行提供在靶细胞表面上TAA(如CEACAM5)和CD47的共参加的证据的另一系列的实验，其为这样的实验，其显示通过CD47xCEACAM5κλ抗体的CD47-SIRPα相互作用的中和是CEACAM5依赖性的。在此类实验中，可以在CD47-SIRPα抑制测定法中测试CD47xCEACAM5κλ抗体和相应的单价抗体的活性。图6显示了相比于相应的单价抗-CD47抗体而言，用包含与本发明的双特异性抗体相同的CD47结合臂的TAAxCD47双特异性抗体(TAA不是CEA)的结果。
d)CD47抗体的SIRPα阻断活性
用于测量对于本发明的双特异性抗体所显示的SIRPα抑制效能数据的实验设置(结果参见表2)：
经结合的SIRPα的检测。将监测可溶性SIRPα与在MKN45的表面上表达的人CD47的相互作用的基于细胞的测定法用于检测阻断活性。用根据本发明的双特异性抗体的剂量-应答实验允许测定IC50值。
用CFSE紫对表达CD47和CEACAM5两者的MKN45癌细胞进行染色以允许成像系统(CX5)检测细胞。简而言之，将3000个经染色的MKN45细胞/孔接种在384光学孔平板(Costar)中并且与浓度增加的本发明的双特异性抗体(1.9pM至333nM，以一式四份)一起温育50分钟。然后，以最终50ng/mL添加与抗小鼠IgG-Fc AF647偶联抗体(JacksonImmunoresearch，经1:2000稀释的)预混合的固定浓度的SIRPα-小鼠Fc。在3小时30分钟的温育后，用成像系统(CX5，Thermofisher)获取平板，并且通过该成像系统专用的软件来记录由所检测的经结合的SIRPα发射的荧光信号。按照所测试的剂量范围将荧光信号进行绘图，并且通过软件(Prism,Graphpad)来计算IC50。
表2显示了在抑制CD47/SIRPα结合方面几种CEAxCD47双特异性抗体的效能，其中展示出从0.22nM至7nM的IC50范围。
e)通过与参考抗体的竞争的CEACAM5抗体的表位分箱
表位分箱是一种用于表征根据本发明的抗体的结合或者例如第一结合部分的相关抗-CEA(靶蛋白质)抗体的结合的竞争性免疫测定法。与靶蛋白质相结合的抗体的竞争性阻断特性曲线针对也与该靶蛋白质相结合并且已经对其建立/发表了结合表位的抗体来创建。与这些参考抗体之一的竞争表明所述抗体具有相同的或接近地定位的表位，并且将它们“分箱”在一起。采用下列携带小鼠Fc区的参考抗体，在重组人CEACAM5上通过ELISA来测试作为本发明的双特异性抗体的一部分的CEACAM5 mAb与CEACAM5参考抗体竞争的能力：SM3E，源自描述在专利US20050147614A1中的SM3E的mAb的序列，通过使用标准方法产生的mAb；MEDI，源自描述在专利WO2016036678A1中的MEDI-565的mAb；SAR，源自描述在专利EP3199552A1中的Mab2_VLg5VHg2的mAb；CH1A1A，源自在专利US20120251529中和由Klein等人在Oncoimmunology,2017年1月11日,6(3)中所描述的CH1A1A-2F1的mAb；人源化的T84.66，源自描述在专利WO2017055389中的变体1的mAb；LAB，源自描述在专利US2002/0165360A1中的hMN14的mAb。SM3E例如更多地与CEA的N-末端的细胞膜远端的部分相结合，MEDI与中间部分相结合，和CH1A1A结合接近膜的部分。
在包被有链霉抗生物素蛋白的96-孔平板中以0.5μg/ml包被经生物素化的人CEACAM5，并且与10μg/ml的参考mAb或无关mAb(其携带小鼠Fc区)一起温育1小时。在室温下以0.2μg/ml添加CEACAM5 mAb(作为二价单克隆抗-CEA抗体而不是作为各自的CEAxCD47双特异性抗体)1小时。洗涤所述平板并且用抗人IgG(Fc)-HRP(Jackson ImmunoResearch)来检测经结合的CEACAM5 mAb。在洗涤后，将所述平板用Amplex Red试剂来进行揭示。在Synergy HT平板阅读器(Biotek)上测量荧光信号。
结果显示在表2中。Bin 1意味着，各自的抗体与SM3E竞争与CEACAM5的结合。Bin 2意味着，各自的抗体不与上面提及的工具抗体中的任一个竞争。对于所有在表2中所列出的CEAxCD47双特异性抗体用各自的抗-CEA二价单克隆抗体来进行竞争实验。在这样的单克隆抗体与CEACAM5的结合由于各自工具抗体而减少80％或更多的情况下，得出以下结论，将所述CEAxCD47双特异性抗体归类于与工具抗体竞争性地进行结合。在各自的抗-CEA二价mAb与CEACAM5的结合减少20％或更少(如果比较具有和没有添加工具抗体的结果)的情况下，将CEAxCD47抗体鉴定为与工具抗体是非竞争性的。
Bin 1：K2AC13、K2AC18、K2AC23、K2AC27、K2AC29
Bin 2：K2AC10、K2AC25、K2AC28、K2AC26
关于Bin表征、与CEA的结合的EC50值、SIRPα抑制效能和吞噬作用的EC50以及最大指数(对于根据本发明的双特异性抗体)的结果显示在表2、3和4中。
表2：CEAxCD47双特异性抗体的体外表征
Figure BDA0002928449420000941
Figure BDA0002928449420000951
#使用MKN45 CEA+癌细胞
表3：CEAxCD47双特异性抗体的体外功能活性*
抗体名称 EC50(μg/mL) 最大吞噬指数
K2AC5 0.44 59(±4.2)
K2AC22 0.19 69
K2AC23 0.68 67.5(±2.1)
K2AC25 1.54 48(±1.4)
K2AC26 >9.9 46(±9.9)
K2AC27 >11.7 47(±1.4)
K2AC28 >19.8 32.5(±0.7)
K2AC29 >4.4 42(±5.6)
表4：使用细胞MKN45，在1mg/mL的hIgG1存在或不存在下对于两种CD47xCEA双特异性抗体的吞噬作用的EC50和最大指数
Figure BDA0002928449420000952
最大＝最大值；在10μg/ml下评估的最大吞噬指数；#使用MKN45 CEA+癌细胞
表5：使用重组蛋白质，通过ELISA，对于人CEACAM5或人CEACAM6的结合的EC50
Figure BDA0002928449420000961
f)抗-CEA抗体与人CEACAM5和人CEACAM6的结合
在包被有链霉抗生物素蛋白的96-孔微量培养板中以0.5μg/mL捕获经生物素化的重组人CEACAM5或CEACAM6蛋白。洗涤所述平板，并且以宽的浓度范围(例如，5×10-4至1μg/mL)添加本发明的单克隆抗-CEA二价抗体并温育1小时。洗涤所述平板并且用抗人IgG(Fc)-HRP(Jackson ImmunoResearch)来检测经结合的抗体。在洗涤后，将所述平板用Amplex Red试剂(Molecular Probes)来进行揭示。在Synergy HT平板阅读器(Biotek)上测量荧光信号。
对于单克隆抗体AC39所获得的结果包含在表5中；该抗体显示出平衡的CEACAM5和CEACAM6结合，这意味着关于与CEACAM5和CEACAM6的结合的EC50是相似的(平衡型抗体的关于CEACAM5结合与CEACAM6结合的EC50之比的范围为0.33至3)。具有在该范围之外的比率的抗体被认为不是平衡型的。
实施例9：由双特异性抗体介导的ADCC和ADCP
a)由TAAxCD47双特异性抗体所介导的ADCP和ADCC是TAA依赖性的
双重靶向性TAAxCD47κλ抗体使CD47和TAA共参加的能力导致相比于TAA-阴性细胞而言与TAA-阳性细胞的结合亲和力的显著增加和CD47-SIRPα相互作用的TAA-依赖性中和。这反过来可以转化为由CEAxCD47κλ抗体所介导的有效且选择性的癌细胞杀伤。
在图3A中所显示的从ADCP实验(基于流式细胞术的测定法)所示出的结果证明更高的双特异性TAAxCD47抗体的ADCP，相比于相应的单价TAA以及单价CD47抗体而言。图4显示了更高的四种双特异性TAAxCD47抗体(TAA为间皮素MSLN)的ADCC(基于Cr51的测定法)，相比于高亲和力抗-TAA单克隆抗体Amatuximab(TAA为MSLN)而言(使用携带MSLN的肺癌NCI-H226肿瘤细胞)。
b)用TAAxCD47抗体进行测量的Cr51+释放测定法
用补充有10ng/mL的重组hIL-2的RPMI/10％经热灭活的FCS在37℃下将健康的PBMC激活过夜。次日，将靶细胞(即，表达TAA的癌细胞)与100μCi Cr51(Perkin Elmer，37℃，1小时)一起进行温育。在洗涤后，将细胞用受试抗体进行调理(30分钟，37℃)。然后，将加载了Cr51的癌细胞与PBMC细胞相混合，以获得效应细胞(PBMC)和靶细胞(表达TAA的细胞)之间的最终80:1或50:1比率。将细胞混合物在37℃下温育4小时，之后以1500rpm离心10分钟。将上清液转移入LumaPlate(包被有闪烁体)中并且在γ-计数器中进行计数。阴性对照(自发Cr51释放)由在效应细胞不存在下与培养基一起进行温育的加载了Cr51的靶细胞组成。总裂解对照由与5μL的细胞裂解溶液(Triton X-100)一起进行温育的加载了Cr51的靶细胞组成。非特异性裂解对照(基线)由在没有Ab的情况下与效应细胞一起进行温育的加载了Cr51的靶细胞组成。使用下面的公式来计算ADCC百分比：
％特异性ADCC＝((样品每分钟计数(cpm)–非特异性裂解对照cpm)/(总裂解对照cpm–阴性对照cpm))x100％。
图5显示了在携带与本发明的CEAxCD47抗体相同的CD47臂的CD47xTAA双特异性抗体(TAA不是CEA)的wt IgG1 Fc形式和另外经DEA突变的Fc形式之间的比较实验的关于ADCC(基于Cr 51的测定法)的结果。此外，显示了关于高亲和力抗-TAA二价mAb的结果。携带具有DEA突变的IgG1 Fc的TAAxCD47双特异性抗体具有最高的ADCC，随后为具有IgG1 Fc的CEAxCD47 biAb和具有wt IgG1 Fc的二价mAb。
c)通过LDH释放测定法来测量的ADCC
在下面的测定法中测试了CEAxCD47双特异性抗体的ADCC：
用补充有10ng/mL的重组hIL-2的RPMI/10％经热灭活的FCS在37℃下将健康的PBMC激活过夜。次日，将靶细胞(例如MKN45癌细胞)用不用浓度的受试抗体进行调理。在细胞培养培养箱中在37℃下在圆底平板中将PBMC和经调理的靶细胞以50/1的效应细胞/靶细胞的比率共温育6小时。在该温育后，将上清液转移入光学平底平板中，并且用来自Roche的商业试剂盒通过用微量培养板阅读器测量OD来定量LDH释放。用下面的公式来计算特异性裂解的％：
Figure BDA0002928449420000981
图13显示了在本发明的双特异性抗体与其经糖改造的形式和与抗体5F9之间的比较实验的结果。图14显示了在1mg/ml人免疫球蛋白(IgG)存在下在本发明的双特异性抗体与其经糖改造的形式和与抗体5F9之间的比较实验的结果。
d)ADCP测定法
使用了两种方法。在基于FACS的方法中，测定了吞噬百分比(表示已吞食了至少一个肿瘤细胞的巨噬细胞的百分比)。图3A显示了用该基于FACS的测定法对于携带也在CEAxCD47抗体中使用的CD47结合臂的TAAxCD47抗体所获得的结果。用利用CellInsightCX5高含量筛选平台的基于成像的方法测定了吞噬指数，其被定义为被100个巨噬细胞所吞食的靶细胞的平均数目。图3B显示了用携带CEAxCD47抗体的CD47结合臂的TAAxCD47双特异性抗体(TAA不是CEA)所获得的结果。图12、15、16、17、18、20B和21B显示了用本发明的CEAxCD47双特异性抗体所获得的结果。图15显示了在本发明的双特异性抗体与其经糖改造的形式和与抗-CD47抗体5F9之间的比较实验的结果。图16显示了在通常存在于患者中的1mg/ml人免疫球蛋白(IgG)存在下在本发明的双特异性抗体与其经糖改造的形式和与抗体5F9之间的比较实验的结果。图17显示了在1mg/ml人免疫球蛋白(huIgG，以1mg/mL或甚至更高存在于患者中)存在或不存在下在本发明的双特异性抗体之间的比较实验的结果。图18显示了在30nM CEA-TCB1或300nM CEA-TCB存在或不存在下K2AC22的浓度/吞噬指数曲线。
e)吞噬作用测定法：1.基于CellInsight CX5高含量筛选平台的成像测定法，和2.基于流式细胞术的测定法
巨噬细胞的制备：通过Ficoll梯度从暗黄覆盖层中分离人外周血单核细胞(PBMC)。通过在完全培养基(RPMI 1640，10％经热灭活的胎牛血清[Invitrogen])、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES缓冲液、25mg/mL庆大霉素(均来自Sigma-Aldrich)和50mM 2-巯基乙醇(Thermo Fisher Scientific)中，在20ng/mL的人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(PeproTech)存在下培养PBMC7天来产生巨噬细胞。随后，在分化期(第+1天)中通过更换细胞培养基来消除非粘附细胞，和通过使用细胞解离缓冲液(Sigma-Aldrich)来使代表巨噬细胞的粘附细胞脱离并在用于基于流式细胞术的ADCP实验的那一天(第8天或第9天)在完全培养基中进行洗涤。关于基于细胞成像的ADCP，在第6天通过使用细胞解离缓冲液来使巨噬细胞脱离，并且以30,000/孔接种在96光学平板(costar)中。
1.基于CellInsightTM的测定法
在不同浓度的待测试抗体存在下在37摄氏度下将粘附至微量培养板孔的巨噬细胞(用钙荧光素红橙染色的)与经钙荧光素AM标记的靶肿瘤细胞一起以1:3的效应细胞:靶细胞比率共温育2.5小时。在温育期结束时，用完全培养基替代上清液并且用CellInsightTMCX5高含量筛选平台对微量培养板进行成像。每个孔获取和分析1500个巨噬细胞。以双阳性事件(巨噬细胞+靶肿瘤细胞)来证明吞噬作用，并且用CellInsightTM制造商的软件来计算吞噬指数。
在图12、15、16、17、18、20B和21B中的结果以及在表3和4中所显示的EC50和最大吞噬指数值都是用表达CEA的MKN-45细胞和用1:3的效应细胞/靶肿瘤细胞比率来获得的。在图3B中的数据是用携带TAA(其不是CEA)的NCI-N87细胞和用1:1的效应细胞/靶肿瘤细胞比率来获得的。每个巨噬细胞所提供的肿瘤细胞越多，所期望的吞噬指数就越高，这可能是相比于证明了关于根据本发明的双特异性抗体的结果的其他图而言对于TAAxCD47双特异性抗体(TAA不是CEA)在图3B中所显示的总体更低的吞噬指数和还有背景信号的主要原因。
在本发明中的所有ADCP(吞噬作用)值、范围等都是在基于成像的测定法的基础上的，如果不另外明确说明(在图3A中的数据是用基于流式细胞术的测定法来获得的)。
2.基于流式细胞术的ADCP测定法
根据发明人的知识，ADCP也可以通过如下所描述的方法来进行测量：在不同浓度的待测试抗体存在下在37摄氏度下将巨噬细胞与经CSFE标记的靶肿瘤细胞(例如，MKN-45、LS174T或HPAC肿瘤细胞)一起以例如3:1的效应细胞:靶细胞比率共温育2.5小时。在温育期结束时，添加经生物素化的抗人CD14抗体和Strep-Cy5以标记巨噬细胞。然后，洗涤细胞并且使其经历流式细胞术分析。通过双阳性事件CD14+和CFSE+来证明吞噬作用。吞噬百分比以在CD14+/CSFE+双阳性事件和总靶细胞之间的比率乘以100来呈现。在图3A中的数据是用携带TAA(其不是CEA)的HPAC细胞和用1:1的效应细胞/靶肿瘤细胞比率来获得的。使用了基于流式细胞术的测定法。在图3B中的数据是用携带TAA(其不是CEA)的NCI-N87细胞和用1:1的效应细胞/靶肿瘤细胞比率来获得的。使用了基于成像的测定法。
实施例10：CEAxCD47和CEAxCD3与MNK-45细胞的结合；与CEAxCD3的结合竞争
a)在例如表达CEA的人胃腺癌细胞(MKN-45，DSMZ ACC 409)上测试CD47xCEACAM5双特异性抗体的结合
收获细胞，计数，就生存力进行检查，并且以3×106个细胞/ml重悬浮在FACS缓冲液(PBS 2％BSA,0.1％NaN3)中。将100μl的细胞悬浮液分配在V-底96-孔平板中(3×105个细胞/孔)。通过在4℃、1300rpm下离心3分钟来去除上清液。然后，将浓度渐增的根据本发明的抗体添加到孔中并且在4℃下温育15分钟。用冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次，并且与缀合有PE(R-藻红蛋白)的小鼠抗人IgG Fc二抗(SouthernBiotech，在FACS缓冲液中经1:100预稀释的)一起在4℃下重新温育另外的15分钟。用冷的FACS缓冲液洗涤细胞两次，并且重悬浮在300μl具有经1:15000稀释的SytoxBlue(Life Technologies)的FACS缓冲液中。使用Cytoflex(Millipore)来测量荧光。通过使用GraphPad Prism7软件来获得和计算结合曲线和EC50值。以相同的方式，可以测试MAB CEA或MAB CEA1与MKN-45细胞的结合。图11显示了几种CEAxCD47双特异性抗体与MKN-45细胞的结合曲线。
b)通过添加CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体使CEAxCD47抗体与CEA阳性肿瘤细胞系(MKN-45)的结合曲线发生位移
根据发明人的对于根据本发明的CD47xCEACAM5双特异性抗体和CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体如CEA-TCB或CEA-TCB1的竞争实验的知识，可以如上面所描述的那样来测定CEACAM5xCD47与MKN-45细胞的结合，但是具有和没有CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体的添加，以研究CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体作为对于本发明的CEAxCD47双特异性抗体的组合伙伴对于与CEA的结合来说是否是竞争性的。
实施例11：经岩藻糖基化的和无岩藻糖基化的K2AC5和K2AC22双特异性抗体的产生和纯化
经岩藻糖基化的和无岩藻糖基化的K2AC5和K2AC22双特异性抗体的产生：
将CHO汇集物(一个用于K2AC5和一个用于K2AC22)以0.3×106个细胞/mL的活细胞浓度接种在具有700mL或100mL的工作容积的Thomson erlen装置中，以分别产生经岩藻糖基化的和无岩藻糖基化的抗体。所有汇集物都通过使用CDACF培养基CDCHO和适合的进料制度以15天持续时间补料分批模式来进行操作。对于无岩藻糖基化的抗体的产生，基于由Rillahan等人,Nature Chem.Biol.2012Jul,8(7):661-8所描述的无岩藻糖基化策略和基于EP2282773，在补料分批过程期间在第0、5、8和11天添加200μM岩藻糖抑制剂(1,3,4-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖)的大丸剂。在15天的补料分批培养后进行包含经岩藻糖基化的和无岩藻糖基化的抗体的K2AC5和K2AC22汇集物上清液的收获。通过使用Sartoclear
Figure BDA0002928449420001021
Lab V Cell Harvesting Sartorius系统(参见供应商的说明书)来澄清CHO汇集物上清液的收获物。
经岩藻糖基化的和无岩藻糖基化的K2AC5和K2AC22双特异性抗体的纯化
经岩藻糖基化的和无岩藻糖基化的K2AC5和K2AC22双特异性抗体的纯化是一个三亲和步骤纯化过程。在开始纯化之前，通过使用OctetRED96来测量在K2AC5和K2AC22汇集物的上清液中的抗体浓度，以便使用具有合适的亲和基质体积的柱子。无需事先调整，将每个经澄清的包含经岩藻糖基化的或无岩藻糖基化的双特异性抗体的CHO汇集物上清液加载到MabSelect SuRe(MSS)柱(GE Healthcare)上，以去除大部分的细胞培养污染物。然后，通过低pH保持来处理MSS洗出液以灭活病毒，并且在pH6下用Tris 1M pH9进行中和。然后，将MSS洗出液加载到LambdaFabSelect(LFS)柱(GE Healthcare)上，以去除单特异性κ(单κ)。然后，在pH6下对LFS洗出液进行pH调节。将LFS加载到Capto L(CL)柱(GE Healthcare)上，以去除单特异性λ(单λ)。在储存之前对CL洗出液进行pH调节。然后，将最终材料进行浓缩并且渗滤入最终的配制缓冲液中，其浓度通过使用Nanodrop来进行调节。将经岩藻糖基化的和无岩藻糖基化的K2AC5和K2AC22双特异性抗体分成等分试样并且储存于-80℃直至递送。如由制造商(Agilent Technologies,Santa Clara,Calif.,USA)所描述的，使用Protein 80试剂盒用Agilent 2100 Bioanalyzer通过在变性和还原条件下的电泳就大小来分析经纯化的双特异性抗体。使用ACQUITY UPLC H-Class Bio System(Waters)通过大小排阻层析(SEC-UPLC)来评估聚集水平。使用Multiphor II电泳系统(GE Healthcare)通过等电聚焦技术(IEF)来实现经纯化的双特异性抗体的电荷变体分析。在LabChip GXII Touch(PerkinElmer)上通过使用通量微芯片-CE方法来测定经岩藻糖基化的和无岩藻糖基化的K2AC5和K2AC22抗体的N-联复杂二天线糖形的相对分布。通过使用鲎变形细胞裂解物测试(LAL；Charles River Laboratories,Wilmington,Mass)就内毒素污染来测试所有抗体。经糖改造的K2AC5显示出79.68％的无岩藻糖基化，和经糖改造的K2AC22显示出89.13％的无岩藻糖基化。
这些无岩藻糖基化的CEAxCD47双特异性抗体已经用于获得在图13、14、15和16中所显示的结果。
实施例12：在FUT8(-)细胞系中的表达和纯化
备选地和根据发明人的知识，也可以按照如下的方法来产生根据本发明的无岩藻糖基化的双特异性抗体：
材料和方法按照Naoko Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.,87(2004)614-622。
中国仓鼠FUT8 cDNA的分离
通过使用
Figure BDA0002928449420001031
Mini试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从CHO/DG44细胞中分离总RNA，并且通过使用用于逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的Superscript第一链合成系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)用寡-dT来进行逆转录。通过PCR从单链CHO/DG44细胞cDNA中扩增中国仓鼠FUT8 cDNA，其中使用下列引物：5V-GTCTGAAGCATTATGTGTTGAAGC-3V(SEQID NO:14)和5V-GTGAGTACATTCATTGTACTGTG-3V(SEQ ID NO:15)，其是从鼠类FUT8 cDNA设计的(Hayashi,2000,DNA Seq 11:91-96)。
FUT8基因座的靶向性构建体
在CHO/DG44细胞中FUT8基因的靶向破坏通过使用两个替代载体(pKOFUT8Neo和pKOFUT8Puro)来进行。通过用中国仓鼠FUT8cDNA作为探针筛选CHO-K1细胞E-基因组文库(Stratagene,La Jolla,CA)来分离包括第一编码外显子的FUT8基因的9.0-kb片段，以建立靶向性构建体。用侧翼为loxP位点的分别来自质粒pKOSelectNeo或pKOSelectPuro(Lexicon,TX)的新霉素抗性基因(Neor)盒或嘌呤霉素抗性基因(Puror)盒来替代包含翻译起始位点的234-bp区段。在5V同源区域处插入来自质粒pKOSelectDT(Lexicon)的白喉毒素基因(DT)盒。所得的靶向性构建体，pKOFUT8Neo和pKOFUT8Puro，包括1.5-kb 5V同源序列和5.3-kb 3V同源序列。在转染前，在唯一的SalI位点处使所述靶向性构建体线性化。
转染和筛选同源重组体
通过使用Bio-Rad
Figure BDA0002928449420001041
II在350V和250AF下用4Ag的经线性化的pKOFUT8Neo对亚汇合的CHO/DG44细胞(1.6×106)进行电穿孔。在电穿孔后，用600Ag/mLG418(Nacalai Tesque,Kyoto,Japan)来选择转染子。基因组PCR在96-孔平板中通过以前所报道的经改进的微量提取方法(Ramirez-Solis等人,1992,Anal Biochem201:331-335)来进行，其中使用下列引物：
5V-TTGTGTGACTCTTAACTCTCAGAG-3V(SEQ ID NO:16)，和5V-GAGGCCACTTGTGTAGCGCCAAGTG-3V(SEQ ID NO:17)。
通过经由使用基因组PCR而获得的1.7-kb片段来鉴定同源重组体，并且使用用下列引物扩增出的221-bp片段通过Southern印迹分析来进行确证：
5V-GTGAGTCCATGGCTGTCACTG-3V(SEQ ID NO:218)，和5V-CCTGACTTGGCTATTCTCAG-3V(SEQ ID NO:19)。
使半合克隆经历第二轮的使用经线性化的pKOFUT8Puro的同源重组和用15Ag/mL嘌呤霉素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的药物选择，如早先所描述的。将鉴定出的纯合破坏体用Cre-重组酶表达载体pBS185(Invitrogen)进行电穿孔，以从两个FUT8等位基因中去除药物抗性基因盒。
通过FUT8(-)细胞的单克隆抗体产生
将FUT8(-)细胞系用编码根据本发明的双特异性抗体的表达载体进行电穿孔并且在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中进行选择。将汇合的转染子在
Figure BDA0002928449420001051
301培养基(JRH Biosciences,Lenexa,KS)中培养1周。使用MabSelectTM(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)从培养物上清液中纯化抗体。进一步的纯化步骤可以为阴离子/阳离子交换层析，大小排阻层析，和尤其是使用上面所描述的κ或λ选择性树脂的纯化。
实施例13：双特异性抗体的体内抗肿瘤活性
根据发明人的知识，根据本发明的双特异性抗体的抗肿瘤活性可以在异种移植物模型中进行评价，例如通过下列模型：在NOD/SCID小鼠中皮下植入1或2×106个CEA阳性肿瘤细胞如MKN-45或LS174T细胞。每周测量肿瘤体积3次。在肿瘤移植物达到大约0.1cm3后，将小鼠随机分组(例如，每组4至6只小鼠)并且开始抗体治疗。该实验能够例如比较根据本发明的双特异性抗体和阳性对照Mab(例如CD47 Mab B6H12.2)的效应。每周例如静脉内注射抗体，直至实验结束(第25天)。以例如50-1200μg/小鼠/注射来施用抗体。
可以在合适的模型中测试本发明的双特异性抗体与CEAxCD3双特异性抗体的组合。在其中可以测试根据本发明的抗体与MAB CEA、MAB CEA1或CEA-TCB、CEA-TCB1一起的组合的模型例如由Bacac等人(Clin.Cancer Res.,22(13),3286-97,2016)进行了描述，并且还尤其用于CEACAM5xCD47和CEA-TCB或CEA-TCB1的组合研究。
实施例14：在来自健康人供者人血液的全血和PBMC中测试的细胞因子释放
根据发明人的知识，体外细胞因子释放测定法可以通过使用全血(WB CRA)来进行，其中以水性呈现形式通过受试抗体进行最小稀释(95％v/v血液)。该测定法形式被认为更接近地模拟了体内环境，其包含可以影响细胞因子释放机制的处于生理浓度的因子。但是，该形式被认为对于由T细胞所介导的细胞因子释放具有差的预测性(例如，抗-CD28)。
所述测定法也可以通过使用来自健康人供者的外周血单核细胞(PBMC)和用经固定化的mAb(Solid Phase,SP)呈现形式来进行，以评估由T细胞所介导的细胞因子释放(PBMC SP CRA)。该测定法形式模仿mAb的交联和高密度呈现，其可以在体内发生(例如，经由抗体的Fc部分与在其他免疫细胞上的Fcγ受体的相互作用的靶标的簇集或者通过抗药物抗体的mAb的交联)。该形式对于由T细胞所介导的细胞因子释放具有预测性。
与TAAxCD47抗体如CD47xCEA双特异性抗体相平行地，可以对于每种测定法形式测试阴性对照以及特定的阳性对照。参见图7A和B。
实施例15：与红细胞的抗体结合，红细胞的吞噬作用，和血小板激活和聚集
全血结合
根据发明人的知识，可以将在柠檬酸盐中的从健康供者收集的人全血样品与3μg/mL的偶联有AF488的本发明的CEA x CD47双特异性抗体、B6H12.2或同种型对照和表面染色抗体(PE-Cy7抗-hCD45和PE抗-hCD41a，仅对于血小板)在4℃下混合30分钟。在温育后，将全血分为两个样品：将5μL在PBS中进行稀释和洗涤以用于红细胞分析，而将150μL与红细胞裂解溶液一起进行温育并且进行洗涤以用于血小板分析。在CytoFLEX仪器上获取样品并且用FlowJo软件进行分析以测定MFI值。
吞噬红细胞作用
根据发明人的知识，可以通过以300xg进行离心来从人全血中分离人红细胞(RBC)，在PBS中洗涤两次，用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)进行标记，和在添加巨噬细胞之前与受试抗体一起在37℃下预温育1小时。可以将经标记的RBC与人巨噬细胞一起以200:1的靶标:效应子比率在根据本发明的抗体或对照(非结合性IgG1抗体)存在下培养一小时。在培养后，将细胞用抗-CD14-APC进行染色并且通过流式细胞术来进行分析。将吞噬作用定量为CD14+事件(巨噬细胞)的百分比，所述CD14+事件也是CFSE+的并因此已吞食至少一个RBC(在单重态上对事件进行门控)。吞噬作用和FACS分析如在实施例9中所描述的那样来进行，除了在巨噬细胞染色后用FACS裂解溶液裂解红细胞外。
图8显示，关于IgG1抗-CD47单克隆抗体B6H12.2的RBC吞噬作用比关于包含本发明的CEA x CD47双特异性抗体的CD47结合臂的IgG1 TAA x CD47(不是CEAxCD47)κλ双特异性抗体的要强有力得多。具有野生型Fc的TAA x CD47双特异性抗体在所测试的浓度范围内没有显示出吞噬作用，如果Fc携带aa突变DEA(S329D和I332E和G236A)，那么检测到吞噬作用，但是以比对于B6H12.2抗体更高的浓度。
体外血小板激活和聚集
在标准流式细胞术实验中，通过表面标志物CD62P的上调来测量TAAxCD47和CEAxCD47双特异性抗体在七名人健康供者的全血中诱导人血小板激活的能力。简而言之，将5μL的全血与10μL的每个样品(以2X制备的)一起在室温下温育15分钟。以不同的浓度(0、0.02、0.2、2、20和200μg/mL)添加每种受试抗体。分别以10μM和10μg/mL的浓度添加腺苷二磷酸(ADP)和抗-CD9(ALB6)，其被包括作为已知诱导血小板激活的阳性对照试剂。然后，添加10μL的抗-CD41a-PE和10μL的抗-CD62P-APC并且在室温下在黑暗中温育15分钟。最后，添加500μL的CellFix(BD Biosciences，在水中1/10稀释的)，并且将200μL的每个样品转移到适合于CytoFLEX获取的U-底96-孔平板中。通过CD41a-PE阳性染色来鉴定血小板。通过CD62P标志物的表达来评估血小板激活。
图10显示了在来自七名志愿者供者的血液中获得的结果。发现抗-TAA单克隆抗体和TAAxCD47双特异性抗体都不诱导有关的血小板激活(两者都具有wt IgG1 Fc)。与之相反，具有wt IgG1 Fc的抗-CD47抗体B6H12.2诱导血小板激活，并且具有携带DEA突变的Fc的TAAxCD47 biAb也显示出血小板激活。
还在图10中对于在全血中的血小板激活所显示的浓度范围内研究了CEAxCD47抗体K2AC5和K2AC22(具有和没有无岩藻糖基化)。在来自7名供者的6名的血液中，未看见显著的血小板激活，如在图10中对于TAAxCD47所显示的。一名供者已经用阳性对照试剂显示出不寻常的血小板激活，和然后用K2AC5和22还显示出一些血小板激活。由于不寻常的血小板激活，不理会这一名供者的结果。
根据发明人的知识，可以在富含血小板的血浆(PRP)上评估关于在CD47/CEA双特异性抗体存在下进行聚集的潜力。用10μM和5μM的ADP或者用200、100、20、25和12.5μg/mL的受试物品，以及用盐水或同种型对照攻击PRP。血小板聚集可以在恒定搅拌下用Thrombo-aggregometer TA 4V通过血小板刺激(即，10分钟)来进行评价。Thrombosoft 1.6软件(SDInnovation,Frouard,France)可以用于数据的分析。
实施例16：在食蟹猴实例中的血液学评估
根据发明人的知识，可以就任何对于血液学参数(包括RBC和血小板)的影响在食蟹猴中在体内测试食蟹猴交叉反应性抗体。例如通过静脉内途径以直至100mg/kg的剂量每周一次向食蟹猴给予根据本发明的抗体。随时间监测血液学参数(包括红细胞和血小板计数)，并且将其与在猴中的对照值(剂量前值)进行比较。血液学参数通过常规方法来进行测定。
用包含根据本发明的CEA x CD47双特异性抗体的CD47结合臂的IgG1 TAA x CD47(不是CEAxCD47)κλ双特异性抗体来获得在图9中的结果。尽管以高剂量进行重复的按剂量给药，但是关于RBC计数和血小板计数在对照动物和经治疗的动物之间没有显著差异。这与所发表的用IgG4抗-CD47抗体hu5F9-G4的结果(Jie Liu等人,(开放获取文章,PLOS ONE 10(9)2015年9月))相反，后者显示在以大约1mg/kg的单剂量下已经开始的血红蛋白的剂量依赖性降低。将IgG4形式用于使对于红细胞和血小板的影响最小化，相比于IgG1形式而言。尽管甚至在已经相当低的1mg/kg和更低的剂量下存在该测量结果，但是在食蟹猴中观察到例如血红蛋白的剂量依赖性减少。
实施例17：在食蟹猴中测定药物代谢动力学特性
根据发明人的知识，在单剂量药物代谢动力学研究中，可以将动物随机分为2至5个治疗组，其中每组n＝2-4只猴(包括雄性和雌性)。给动物施用本发明的双特异性抗体的单IV剂量(在15至30分钟内输注)。在治疗组中的剂量从0.01mg/kg至100mg/kg变动。施用体积为直至5mL/kg。根据实验操作方案，在多个时间点，例如在静脉内施用所述双特异性抗体后0.25、1、4、8、24、48、72、96、120、168、240、336、504(第22天)、672(第29天)、840(第36天)、1008(第43天)、1176(第50天)和1344小时(第57天)，排定血液抽取。每只动物和每个时间点收集大约2mL的血液样品。在血清中或在血浆中测量抗体的浓度。开展并且验证ELISA测试以测量浓度。每个样品以一式两份进行测量。
可以通过使用工业标准软件(Phoenix WinNonlin；非房室分析(non-compartmental analysis))从浓度时间曲线测定PK参数，如Cmax、清除率、消除半寿期、曲线下面积等。
预期CEA x CD47κλ双特异性抗体的消除半寿期在3至14天的范围内，这暗示了向患者的q1w或q2w或q3w或q4w施用。
实施例18：在脱落的CEA存在下由双特异性抗体所介导的ADCP
用钙荧光素AM对用作靶细胞的MKN45细胞进行染色。平行地，将受试抗体的浓度与或不与固定剂量(200ng/mL)的商业的脱落的CEA(BioRad)一起进行温育。在该温育后，将经染色的MKN-45用事先与脱落的CEA相混合的抗体在室温下调理20分钟。然后，将粘附至微量培养板孔的巨噬细胞(用钙荧光素红橙染色的)与经调理的经标记的靶肿瘤细胞一起以1:3的效应细胞:靶细胞比率在37℃下共温育2.5小时。在1mg/mL的人IgG存在下进行ADCP。在温育期结束时，用完全培养基替代上清液并且用CellInsightTM CX5高含量筛选平台对微量培养板进行成像。每个孔获取和分析1500个巨噬细胞。以双阳性事件(巨噬细胞+所吞食的靶肿瘤细胞)来证明吞噬作用，并且用CellInsightTM制造商的软件来计算吞噬指数。结果显示在图20B中。
实施例19：在CEA-TCB和CEA-TCB1存在下由双特异性抗体所介导的ADCP
将用作靶细胞的经钙荧光素AM标记的MKN45细胞与或不与固定剂量的CEA-TCB(300nM)或CEA-TCB1(30nM)一起在室温下预温育20分钟。在该温育后，在合适的孔中添加不同浓度的受试抗体20分钟。然后，将粘附至微量培养板孔的巨噬细胞(用钙荧光素红橙染色的)与经调理的经标记的靶肿瘤细胞一起以1:3的效应细胞:靶细胞比率在37℃下共温育2.5小时。在1mg/mL的人hIgG存在下进行ADCP。在温育期结束时，用完全培养基替代上清液并且用CellInsightTM CX5高含量筛选平台对微量培养板进行成像。每个孔获取和分析1500个巨噬细胞。以双阳性事件(巨噬细胞+所吞食的靶肿瘤细胞)来证明吞噬作用，并且用CellInsightTM制造商的软件来计算吞噬指数。
图18显示，所添加的CEA-TCB和CEA-TCB1都没有降低由K2AC22所诱导的吞噬作用。令人惊奇地，通过添加30nM CEA-TCB1甚至轻微地增加K2AC22的吞噬作用。
实施例20：通过CD47xCEA和CEAxCD3的组合的杀伤测定法
从暗黄覆盖层中分离人外周血单核细胞(PBMC)。将这些PBMC的一部分在冷冻培养基(90％FCS 10％DMSO)中进行冷冻(以便用作T细胞的来源)，而将一部分用于制备巨噬细胞(如在“吞噬作用”那一节中所解释的)。在6天的巨噬细胞分化后，将细胞在96-孔平板中进行铺板并且在37℃下进行温育。在进行测定法的那一天(巨噬细胞铺板后2天)，将经冷冻的来自相应巨噬细胞供者的PBMC解冻并且添加至巨噬细胞平板。用抗体的组合，即用在某些浓度下的CEAxCD3 T-细胞双特异性抗体与某些浓度的CEAxCD47双特异性抗体一起，来调理靶细胞(经改造以表达萤光素酶的MKN45)。将经调理的靶细胞添加至包含巨噬细胞和自体PBMC的平板；并且将平板在37℃下温育48小时。在48小时后，去除一半的孔中培养基并且向平板添加2X萤光素的溶液以获得150μg/mL的最终浓度。在室温下温育5分钟后，使用Synergy NEO来读取平板。通过将发光值(减去背景)除以仅包含靶细胞的对照并且乘以100来计算生存力百分比。然后，通过从100中减去生存力百分比来推知杀伤百分比。
图19A和B显示了用在各种浓度下的CEA-TCB和K2AC5和K2AC22的组合而获得的结果。
在本文中所引用的所有出版物、专利、专利申请、互联网站点和登录号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列)通过提及而以其整体合并入本文用于所有目的，以如同每个独个出版物、专利、专利申请、互联网站点或登录号/数据库序列被明确地和单独地指明如此通过提及而合并的程度。
序列表
<110> LamKap Bio beta Ltd.
<120> 针对CEACAM5和CD47的双特异性抗体
<130> 4130.002PC08
<150> EP18175655.2
<151> 2018-06-03
<150> EP18175656.0
<151> 2018-06-03
<150> EP18175657.8
<151> 2018-06-03
<150> EP18175658.6
<151> 2018-06-03
<150> EP18188788.6
<151> 2018-08-13
<150> EP18188790.2
<151> 2018-08-13
<150> EP18188792.8
<151> 2018-08-13
<150> EP18190983.9
<151> 2018-08-27
<160> 116
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 CDRH1
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 CDRH2
<400> 2
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 CDRH3
<400> 3
Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 VH
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 HC
<400> 5
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 6
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 HC
<400> 6
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaagttat 300
ggtgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcacag tctcgagcgc ctccaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cagtctcgtg gaactcagga 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgactgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtataccctg cccccatctc gggaggagat gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgacttgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaacg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaagt ccaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtctc cgggttaa 1338
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 CDRL1
<400> 7
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MabCd47 CDRL2
<400> 8
Ala Ala Ser Ser
1
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 CDRL3
<400> 9
Gln Gln Met His Pro Arg Ala Pro Lys Thr
1 5 10
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 VL
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Met His Pro Arg Ala Pro
85 90 95
Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 LC
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Met His Pro Arg Ala Pro
85 90 95
Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 12
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 LC
<400> 12
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcagcag atgcacccgc gcgccccgaa gaccttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttaa 648
<210> 13
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CL
<400> 13
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn
20 25 30
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val
35 40 45
Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu
50 55 60
Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser
85 90 95
Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro
100 105 110
Thr Glu Cys Ser
115
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
gtctgaagca ttatgtgttg aagc 24
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
gtgagtacat tcattgtact gtg 23
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
ttgtgtgact cttaactctc agag 24
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
gaggccactt gtgtagcgcc aagtg 25
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
gtgagtccat ggctgtcact g 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
cctgacttgg ctattctcag 20
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA可变重链
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA可变轻链
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ε的表位
<400> 22
Gln Asp Gly Asn Glu
1 5
<210> 23
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 HC-DE
<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 24
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 HC-DEA
<400> 24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 CDRH1
<400> 25
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 CHRH2
<400> 26
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 CDRH3
<400> 27
Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 CDRL1; KA3
<400> 28
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 CDRL2; KA3
<400> 29
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CD47 CDRL3; KA3
<400> 30
Gln Gln Met His Pro Arg Ala Pro Lys Thr
1 5 10
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL1; 1D9 (AC5)
<400> 31
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Gly Leu Val Ser
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL2; 1D9 (AC5)
<400> 32
Ala Gly Asn Leu Arg Pro Ser
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL3; 1D9 (AC5)
<400> 33
Gly Thr Trp Asp Phe Asn Tyr Gly Val Val
1 5 10
<210> 34
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL1; 1G6 (AC22)
<400> 34
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Ala Asn Gly Ile Val Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL2; 1G6 (AC22)
<400> 35
Phe Asp Asn Leu Arg Pro Ser
1 5
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL3; 1G6 (AC22)
<400> 36
Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr Gly Ile Val
1 5 10
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL1; 1D5 (AC10)
<400> 37
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Tyr Ala Asn Ser Asn Val His
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL2; 1D5 (AC10)
<400> 38
Ser Gly Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 39
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL3; 1D5 (AC10)
<400> 39
Gln Ser Tyr Asp Pro Ala His Asn Leu Leu Thr Ala Val
1 5 10
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL1, 2B8 (AC13)
<400> 40
Thr Gly Thr Ser Ser Asn Val Arg Tyr Ala Ala Gly Val Ser
1 5 10
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL2; 2B8 (AC13)
<400> 41
Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL3; 2B8 (AC13)
<400> 42
Ser Ser Trp Asp Phe Glu His Gly Pro Ala Ala Lys Val
1 5 10
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL1; 1A2 (AC18)
<400> 43
Gly Gly Asn Gly Ile Gly Asp Ala Ser Val His
1 5 10
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL2; 1A2 (AC18)
<400> 44
Ser Thr Thr Thr Arg Pro Ser
1 5
<210> 45
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL3; 1A2 (AC18)
<400> 45
Gln Val Trp Asp Gly Phe Gly Pro Arg His Arg Ala Val
1 5 10
<210> 46
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL1; 1A8 (AC23)
<400> 46
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Gly Leu Val Asn
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL2; 1A8 (AC23)
<400> 47
Ala Thr Asn Thr Arg Pro Ser
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL3; 1A8 (AC23)
<400> 48
Ala Ala Trp Asp Phe Ser Tyr Lys Val Val
1 5 10
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL1; 2F4 (AC25)
<400> 49
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Thr Pro Val Ser
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL2; 2F4 (AC25)
<400> 50
Ser Asn Asn Phe Arg Pro Ser
1 5
<210> 51
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL3; 2F4 (AC25)
<400> 51
Gly Thr Trp Asp Arg Thr Gly His Glu Ile Arg Pro Val
1 5 10
<210> 52
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL1; 2F7 (AC26)
<400> 52
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Lys Tyr Ala Asn Ala Val Ser
1 5 10
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL2; 2F7 (AC26)
<400> 53
Ser Asn Ser Ile Arg Pro Ser
1 5
<210> 54
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL3; 2F7 (AC26)
<400> 54
Ser Ser Tyr Asp Pro Arg Gly Asn Leu Leu Ile Arg Val
1 5 10
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL1; 2C11 (AC27)
<400> 55
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Ala Asp Lys Val His
1 5 10
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL2; 2C11 (AC27)
<400> 56
Asn Asn Ser Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL3; 2C11 (AC27)
<400> 57
Gln Ser Tyr Asp Gly Tyr Asn Met Leu Thr Ala Val
1 5 10
<210> 58
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL1; C11 (AC28)
<400> 58
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asn Asp Ile Thr Val His
1 5 10
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL2; C11 (AC28)
<400> 59
Gly Tyr Asn Ala Arg Pro Ser
1 5
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL3; C11 (AC28)
<400> 60
Gln Ser Trp Asp Gly His Gly Ser Ala Tyr Val
1 5 10
<210> 61
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL1; 2B5 (AC29)
<400> 61
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Glu Phe Thr Asn Gly Val Ser
1 5 10
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL2; 2B5 (AC29)
<400> 62
Gly Phe Ser Ser Arg Pro Ser
1 5
<210> 63
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA CDRL3; 2B5 (AC29)
<400> 63
Ser Ser Tyr Asp Pro Pro Trp His Leu Leu Ala Arg Val
1 5 10
<210> 64
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 1D9 VLCL2 CEA (AC5)
<400> 64
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Gly
20 25 30
Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Gly Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Phe Asn Tyr
85 90 95
Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 65
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 1G6 VLCL2 CEA (AC22)
<400> 65
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Ala Asn Gly
20 25 30
Ile Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Phe Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Phe Ser Tyr
85 90 95
Gly Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 66
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 1D5 VLCL2 CEA (AC10)
<400> 66
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Tyr Ala Asn
20 25 30
Ser Asn Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Pro Ala
85 90 95
His Asn Leu Leu Thr Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 67
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 2B8 VLCL2 CEA (AC13)
<400> 67
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Val Arg Tyr Ala
20 25 30
Ala Gly Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp Phe Glu
85 90 95
His Gly Pro Ala Ala Lys Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 68
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 1A2 VLCL2 CEA (AC18)
<400> 68
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Gly Ile Gly Asp Ala Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Thr Thr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Phe Gly Pro Arg
85 90 95
His Arg Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 69
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 1A8 VLCL2 CEA (AC23)
<400> 69
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Gly
20 25 30
Leu Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Thr Asn Thr Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Phe Ser Tyr
85 90 95
Lys Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 70
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 2F4 VLCL2 CEA (AC25)
<400> 70
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Thr
20 25 30
Pro Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Phe Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Arg Thr Gly
85 90 95
His Glu Ile Arg Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
130 135 140
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
165 170 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
180 185 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
195 200 205
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 71
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 2F4 VLCL2 CEA (AC25)
<400> 71
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Lys Tyr Ala
20 25 30
Asn Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Ser Asn Ser Ile Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Asp Pro Arg
85 90 95
Gly Asn Leu Leu Ile Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 72
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 2C11 VLCL2 CEA
<400> 72
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Ala
20 25 30
Asp Lys Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asn Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Gly Tyr
85 90 95
Asn Met Leu Thr Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
130 135 140
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
165 170 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
180 185 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
195 200 205
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 73
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA C11 VLCL2 CEA (AC28)
<400> 73
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Asn Asp Ile
20 25 30
Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Gly Tyr Asn Ala Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Gly
85 90 95
His Gly Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
130 135 140
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
165 170 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
180 185 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
195 200 205
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 74
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 2B5 VLCL2 CEA (AC29)
<400> 74
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Glu Phe Thr
20 25 30
Asn Gly Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Gly Phe Ser Ser Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Asp Pro Pro
85 90 95
Trp His Leu Leu Ala Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 75
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸 1D9 VLCL2 CEA (AC5)
<400> 75
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacattggt tatgggcttg tatcctggta ccagcagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gctggtaatc ttcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggatt ttaattatgg ggttgtgttc 300
ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt cagcccaagg ctgccccctc ggtcactctg 360
ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 420
gacttctacc cgggagccgt gacagtggct tggaaagcag atagcagccc cgtcaaggcg 480
ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctat 540
ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 600
gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttcataa 648
<210> 76
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸 1G6 VLCL2 CEA (AC22)
<400> 76
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacattgct aatgggattg tatcctggta ccagcagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat tttgataatc ttcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggatt ttagttatgg tattgtgttc 300
ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt cagcccaagg ctgccccctc ggtcactctg 360
ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 420
gacttctacc cgggagccgt gacagtggct tggaaagcag atagcagccc cgtcaaggcg 480
ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctat 540
ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 600
gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttcataa 648
<210> 77
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸 1D5 VLCL2 CEA (AC10)
<400> 77
cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacatctat gcgaatagta atgtacactg gtaccagcag 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tattctggta gcaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg atcccgcgca caacttgctc 300
actgctgtgt tcggcggagg gaccaagctg accgtcctag gtcagcccaa ggctgccccc 360
tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag ccaacaaggc cacactggtg 420
tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg cttggaaagc agatagcagc 480
cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcg 540
gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt cccacagaag ctacagctgc 600
caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg cccctacaga atgttcataa 660
<210> 78
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸 2B8 VLCL2 CEA (AC13)
<400> 78
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag taatgttagg tatgctgctg gtgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatggg attttgagca tggtcctgct 300
gctaaggtgt tcggcggagg gaccaagctg accgtcctag gtcagcccaa ggctgccccc 360
tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag ccaacaaggc cacactggtg 420
tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg cttggaaagc agatagcagc 480
cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcg 540
gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt cccacagaag ctacagctgc 600
caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg cccctacaga atgttcataa 660
<210> 79
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸 1A2 VLCL2 CEA
<400> 79
tcctatgtgc tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60
acctgtgggg gaaacggtat tggagatgcg tctgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120
caggcccctg tgctggtcat ctattctact actacgcggc cctcagggat tcctgagcga 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240
gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatgggtttg gtcctaggca tagggctgtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360
ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420
agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcttggaaag cagatagcag ccccgtcaag 480
gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540
tatctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600
catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aatgttcata a 651
<210> 80
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸 1A8 VLCL2 CEA (AC23)
<400> 80
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcggg tatgggcttg taaactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctactaata cgcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatt ttagttataa ggttgtgttc 300
ggcggaggga ccaagctgac cgtcctaggt cagcccaagg ctgccccctc ggtcactctg 360
ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 420
gacttctacc cgggagccgt gacagtggct tggaaagcag atagcagccc cgtcaaggcg 480
ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctat 540
ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 600
gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttcataa 648
<210> 81
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸 2F4 VLCL2 CEA (AC25)
<400> 81
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacattggt attacgcctg tatcctggta ccagcagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat tctaataatt ttcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata ggactggtca tgagattagg 300
cctgtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360
gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag cttcaagcca acaaggccac actggtgtgt 420
ctcataagtg acttctaccc gggagccgtg acagtggctt ggaaagcaga tagcagcccc 480
gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 540
agcagctatc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcta cagctgccag 600
gtcacgcatg aagggagcac cgtggagaag acagtggccc ctacagaatg ttcataa 657
<210> 82
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸 2F7 VLCL2 CEA
<400> 82
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttaag tatgcgaatg cggtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tattctaata gtattcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatatg atccccgggg caacctcctg 300
atcagggtgt tcggcggagg gaccaagctg accgtcctag gtcagcccaa ggctgccccc 360
tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag ccaacaaggc cacactggtg 420
tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg cttggaaagc agatagcagc 480
cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcg 540
gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt cccacagaag ctacagctgc 600
caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg cccctacaga atgttcataa 660
<210> 83
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸 2C11 VLCL2 CEA (AC27)
<400> 83
cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggt tatgctgata aggtacactg gtaccagcag 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tataataata gcgatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg atggctacaa catgctgact 300
gctgtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360
gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag cttcaagcca acaaggccac actggtgtgt 420
ctcataagtg acttctaccc gggagccgtg acagtggctt ggaaagcaga tagcagcccc 480
gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 540
agcagctatc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcta cagctgccag 600
gtcacgcatg aagggagcac cgtggagaag acagtggccc ctacagaatg ttcataa 657
<210> 84
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸 C11 VLCL2 CEA (AC28)
<400> 84
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcatcaat gatattacgg tgcattggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gggtataacg cgagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtcct gggatgggca tggttctgcg 300
tatgtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggtc agcccaaggc tgccccctcg 360
gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag cttcaagcca acaaggccac actggtgtgt 420
ctcataagtg acttctaccc gggagccgtg acagtggctt ggaaagcaga tagcagcccc 480
gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 540
agcagctatc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcta cagctgccag 600
gtcacgcatg aagggagcac cgtggagaag acagtggccc ctacagaatg ttcataa 657
<210> 85
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸 2B5 VLCL2 CEA (AC29)
<400> 85
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttgag tttacgaatg gtgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatggtttta gtagtcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatatg atcccccctg gcacctgctg 300
gctagggtgt tcggcggagg gaccaagctg accgtcctag gtcagcccaa ggctgccccc 360
tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag ccaacaaggc cacactggtg 420
tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg cttggaaagc agatagcagc 480
cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcg 540
gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt cccacagaag ctacagctgc 600
caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg cccctacaga atgttcataa 660
<210> 86
<211> 2109
<212> DNA
<213> 智人
<400> 86
atggagtctc cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgctc 60
acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120
acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgccccag 180
catctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata 240
ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg catacagtgg tcgagagata 300
atatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac 360
accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta 420
tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaacccgt ggaggacaag 480
gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggacg caacctacct gtggtgggta 540
aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600
actctattca atgtcacaag aaatgacaca gcaagctaca aatgtgaaac ccagaaccca 660
gtgagtgcca ggcgcagtga ttcagtcatc ctgaatgtcc tctatggccc ggatgccccc 720
accatttccc ctctaaacac atcttacaga tcaggggaaa atctgaacct ctcctgccac 780
gcagcctcta acccacctgc acagtactct tggtttgtca atgggacttt ccagcaatcc 840
acccaagagc tctttatccc caacatcact gtgaataata gtggatccta tacgtgccaa 900
gcccataact cagacactgg cctcaatagg accacagtca cgacgatcac agtctatgca 960
gagccaccca aacccttcat caccagcaac aactccaacc ccgtggagga tgaggatgct 1020
gtagccttaa cctgtgaacc tgagattcag aacacaacct acctgtggtg ggtaaataat 1080
cagagcctcc cggtcagtcc caggctgcag ctgtccaatg acaacaggac cctcactcta 1140
ctcagtgtca caaggaatga tgtaggaccc tatgagtgtg gaatccagaa caaattaagt 1200
gttgaccaca gcgacccagt catcctgaat gtcctctatg gcccagacga ccccaccatt 1260
tccccctcat acacctatta ccgtccaggg gtgaacctca gcctctcctg ccatgcagcc 1320
tctaacccac ctgcacagta ttcttggctg attgatggga acatccagca acacacacaa 1380
gagctcttta tctccaacat cactgagaag aacagcggac tctatacctg ccaggccaat 1440
aactcagcca gtggccacag caggactaca gtcaagacaa tcacagtctc tgcggagctg 1500
cccaagccct ccatctccag caacaactcc aaacccgtgg aggacaagga tgctgtggcc 1560
ttcacctgtg aacctgaggc tcagaacaca acctacctgt ggtgggtaaa tggtcagagc 1620
ctcccagtca gtcccaggct gcagctgtcc aatggcaaca ggaccctcac tctattcaat 1680
gtcacaagaa atgacgcaag agcctatgta tgtggaatcc agaactcagt gagtgcaaac 1740
cgcagtgacc cagtcaccct ggatgtcctc tatgggccgg acacccccat catttccccc 1800
ccagactcgt cttacctttc gggagcgaac ctcaacctct cctgccactc ggcctctaac 1860
ccatccccgc agtattcttg gcgtatcaat gggataccgc agcaacacac acaagttctc 1920
tttatcgcca aaatcacgcc aaataataac gggacctatg cctgttttgt ctctaacttg 1980
gctactggcc gcaataattc catagtcaag agcatcacag tctctgcatc tggaacttct 2040
cctggtctct cagctggggc cactgtcggc atcatgattg gagtgctggt tggggttgct 2100
ctgatataa 2109
<210> 87
<211> 702
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr
20 25 30
Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly
35 40 45
Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly
50 55 60
Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile
65 70 75 80
Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser
85 90 95
Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile
100 105 110
Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp
115 120 125
Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu
130 135 140
Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys
145 150 155 160
Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr
165 170 175
Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln
180 185 190
Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn
195 200 205
Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg
210 215 220
Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro
225 230 235 240
Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn
245 250 255
Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn
275 280 285
Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser
290 295 300
Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu
325 330 335
Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr
340 345 350
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg
355 360 365
Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr
370 375 380
Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser
385 390 395 400
Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp
405 410 415
Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser
435 440 445
Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile
450 455 460
Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn
465 470 475 480
Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val
485 490 495
Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro
500 505 510
Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln
515 520 525
Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser
530 535 540
Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn
545 550 555 560
Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser
565 570 575
Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly
580 585 590
Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly
595 600 605
Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln
610 615 620
Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu
625 630 635 640
Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe
645 650 655
Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile
660 665 670
Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr
675 680 685
Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile
690 695 700
<210> 88
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAB CEA1 VH
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 89
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAB CEA1 VL
<400> 89
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 90
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAB CD3 VH
<400> 90
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 91
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAB CD3 VL
<400> 91
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 92
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 VH-CL(CK)
<400> 92
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 93
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA VH-CH1(EE)-Fc (孔洞, P329G LALA)
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro
<210> 94
<211> 614
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (纽结, P329G LALA)
<400> 94
Val Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met
35 40 45
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
50 55 60
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
65 70 75 80
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu
85 90 95
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
100 105 110
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
115 120 125
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
130 135 140
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu
145 150 155 160
Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
165 170 175
Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr
180 185 190
Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn
195 200 205
Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu
210 215 220
Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser
225 230 235 240
Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln
245 250 255
Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu
260 265 270
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser
275 280 285
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
290 295 300
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
305 310 315 320
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
325 330 335
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
340 345 350
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
355 360 365
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
370 375 380
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
385 390 395 400
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
405 410 415
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
420 425 430
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
435 440 445
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
450 455 460
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
465 470 475 480
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
485 490 495
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
500 505 510
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
515 520 525
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
530 535 540
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
545 550 555 560
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
565 570 575
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
580 585 590
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
595 600 605
Ser Leu Ser Leu Ser Pro
610
<210> 95
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA VL-CL(RK)
<400> 95
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 96
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC CD3 CH2527 Cross Fab VL-CH1
<400> 96
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 97
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA CH1A10 VH CH1 FC 孔洞 P329G LALA
<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 98
<211> 694
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA CH1A1A CD3 CH2527 Cross Fab VH-CK FC 纽结 P329G LALA
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu
225 230 235 240
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val
260 265 270
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser
275 280 285
Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
290 295 300
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
305 310 315 320
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His
325 330 335
Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
340 345 350
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
355 360 365
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
370 375 380
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
385 390 395 400
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
405 410 415
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
420 425 430
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
435 440 445
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
450 455 460
Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
465 470 475 480
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
485 490 495
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
500 505 510
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
515 520 525
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
530 535 540
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
545 550 555 560
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
565 570 575
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
580 585 590
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
595 600 605
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
610 615 620
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
625 630 635 640
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
645 650 655
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
660 665 670
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
675 680 685
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690
<210> 99
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC CEA 2F1 84
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 100
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK_SM3E
<400> 100
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Asn Ile Ala Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20 25 30
His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 101
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_SM3E
<400> 101
Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 102
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL_MEDI
<400> 102
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala
20 25 30
Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr
35 40 45
Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
100 105 110
Leu Thr Val Leu
115
<210> 103
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_MEDI
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 104
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK_SAR
<400> 104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Phe Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Arg Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 105
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_SAR
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 106
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK_CH1A1A
<400> 106
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 107
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_ CH1A1A
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 108
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK_T84.66
<400> 108
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 109
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_T84.66
<400> 109
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 110
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VK_拉贝珠单抗
<400> 110
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 111
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH_拉贝珠单抗
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 112
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 1B2 (AC39) CDRL1
<400> 112
Ser Gly Ser Ser Ser Glu Ile Thr Ala Ser Gly Val Ser
1 5 10
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 1B2 (AC39) CDRL2
<400> 113
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 114
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 1B2 (AC39) CDRL3
<400> 114
Gly Thr Trp Asp Phe Pro Pro Ser Arg Phe Val
1 5 10
<210> 115
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 1B2 (AC39) VLCL2
<400> 115
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Glu Ile Thr Ala Ser
20 25 30
Gly Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Phe Pro Pro
85 90 95
Ser Arg Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 116
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mab CEA 1B2 (AC39) VLCL2, 核酸
<400> 116
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc cgagattact gcgtctggtg tatcctggta ccagcagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240
actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggatt tcccgccgtc caggttcgtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360
ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420
agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcttggaaag cagatagcag ccccgtcaag 480
gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540
tatctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600
catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aatgttcata a 651

Claims (199)

1.双特异性抗体，其包含与人CEACAM5特异性地结合的第一结合部分和与人CD47特异性地结合的第二结合部分。
2.权利要求1的双特异性抗体，其中所述抗体包含已经进行了糖改造从而具有相比于未进行糖改造的相同双特异性抗体而言减少的数目的岩藻糖残基的Fc区。
3.权利要求1或权利要求2的双特异性抗体，其中所述第一结合部分与人CEACAM5和CEACAM6特异性地结合。
4.权利要求3的双特异性抗体，其中所述第一结合部分以平衡的方式与人CEACAM5和人CEACAM6特异性地结合。
5.权利要求4的双特异性抗体，其中与人CEACAM5和人CEACAM6的结合的EC50值相差小于3倍(平衡的结合)。
6.根据前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中
a)所述第一结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:112的CDRL1、SEQ ID NO:113的CDRL2和SEQ ID NO:114的CDRL3作为CDR，和
b)所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:28的CDRL1、SEQ ID NO:29的CDRL2和SEQ ID NO:30的CDRL3作为CDR。
7.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述第一结合部分与氨基酸35-144的CEACAM5的Ig-样V-型结构域相结合。
8.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体与抗-CEACAM5抗体SM3E竞争与CEACAM5的结合，所述抗-CEACAM5抗体SM3E包含序列SEQ ID NO:100和101的VK和VH作为VK和VH结构域。
9.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体不与下列抗-CEACAM5抗体中的任一个竞争与CEACAM5的结合：SM3E；MEDI，其包含序列SEQ ID NO:102和103的VL和VH作为VL和VH结构域；拉贝珠单抗(Lab)，其包含序列SEQ ID NO:110和111的VK和VH作为VK和VH结构域；SAR，其包含序列SEQ ID NO:104和105的VK和VH作为VK和VH结构域；T86.66，其包含序列SEQ ID NO:108和109的VK和VH作为VK和VH结构域；CH1A1A，其包含序列SEQ ID NO:106和107的VK和VH作为VK和VH结构域。
10.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中在相同实验条件下和在1mg/ml人IgG存在下，所述双特异性抗体的吞噬指数曲线的EC50值在参考抗体K2AC22的E50值的0.1至3倍的范围内。
11.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其特征在于，在相同实验条件下和在1mg/ml人IgG存在下，所述双特异性抗体的MKN45细胞的吞噬作用的EC50值在参考抗体K2AC22的E50值的0.1至10倍的范围内。
12.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其特征在于，在1mg/ml人IgG存在下，在基于成像的测定法中所测量的吞噬指数的最大值相比于在相同实验条件下没有人IgG的吞噬作用而言没有降低超过0.7倍。
13.权利要求10的双特异性抗体，其中所述EC50范围为0.2至3.0，0.3至3.0，0.5至2.5，或1.0至2.5。
14.权利要求10或权利要求11的双特异性抗体，其中所述吞噬作用的EC50值作为吞噬指数曲线的EC50值进行测量。
15.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中在1mg/ml人IgG存在下，所述双特异性抗体的最大吞噬指数相比于在相同实验条件下且在没有添加人IgG的情况下所测量的最大吞噬指数而言没有降低超过7倍。
16.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中
a)所述第一结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQ ID NO:3的CDRH3，和SEQ ID NO:13的人λ类型的轻链恒定结构域；并且所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQ IDNO:3的CDRH3，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:7的CDRL1、包括在SEQ ID NO:8中的AlaAla Ser的CDRL2和SEQ ID NO:9的CDRL3；或者
b)所述第一结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和SEQ ID NO:13的人λ类型的轻链恒定结构域；并且所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:28的CDRL1、SEQID NO:29的CDRL2和SEQ ID NO:30的CDRL3。
17.权利要求1-15中任一项的双特异性抗体，其中
a)所述第一结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含从由下列各项组成的组中选择的CDRL1、CDRL2和CDRL3的组合：
SEQ ID NO:31、32和33；SEQ ID NO:34、35和36；SEQ ID NO:37、38和39；SEQ ID NO:40、41和42；SEQ ID NO:43、44和45；SEQ ID NO:46、47和48；SEQ ID NO:49、50和51；SEQ ID NO:52、53和54；SEQ ID NO:55、56和57；SEQ ID NO:58、59和60；SEQ ID NO:61、62和63；SEQ IDNO:112、113和114，并且
b)所述第二结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链可变区，其包含SEQ ID NO:28的CDRL1、SEQ ID NO:29的CDRL2和SEQ ID NO:30的CDRL3作为CDR。
18.权利要求1-15中任一项的双特异性抗体，其特征在于，在所述第一结合部分中包含SEQ ID NO:13的人λ类型结构域作为轻链恒定结构域。
19.权利要求1-15中任一项的双特异性抗体，其中
a)所述第一结合部分包含SEQ ID NO:4的重链可变区(VH)和选自包括在从由下列各项组成的组中选择的VLCL区中的VL的轻链可变区：SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:115，并且
b)所述第二结合部分包含SEQ ID NO:4的重链可变区和SEQ ID NO:10的轻链可变区。
20.权利要求1-15中任一项的双特异性抗体，其中
a)所述第一结合部分包含SEQ ID NO:5的重链和从由下列各项组成的组中选择的轻链：SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74和SEQID NO:115，
b)所述第二结合部分包含SEQ ID NO:5的重链可变区和SEQ ID NO:11的轻链可变区。
21.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述抗体对于所述第一结合部分来说是单价的，和对于所述第二结合部分来说是单价的。
22.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述恒定区和可变构架区序列是人的。
23.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述第一和第二结合部分中的每一个包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。
24.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述抗体是人IgG1类型的。
25.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体为全长抗体。
26.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中与CEACAM5特异性地结合的所述第一结合部分包含κ轻链可变结构域和λ轻链恒定结构域，并且其中与CD47特异性地结合的所述第二结合部分包含κ轻链可变结构域和κ轻链恒定结构域。
27.权利要求1-25中任一项的双特异性抗体，其中特异于CEACAM5的所述第一结合部分包含λ轻链可变结构域和λ轻链恒定结构域，并且其中特异于CD47的所述第二结合部分包含κ轻链可变结构域和κ轻链恒定结构域。
28.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体为完全人的双特异性IgG1形式。
29.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体为类型1或类型2的κλ双特异性抗体并且包含共同重链(cHC)。
30.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其特征在于，以100nM至600nM的结合亲和力与人CD47相结合。
31.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以1至200nM的EC50值与MKN-45细胞相结合。
32.权利要求31的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以1至50nM的EC50值与MKN-45细胞相结合。
33.权利要求31的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以50至100nM的EC50值与MKN-45细胞相结合。
34.权利要求31的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以100至200nM的EC50值与MKN-45细胞相结合。
35.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中在200ng/ml可溶性CEACAM5存在下关于通过所述双特异性抗体的在人巨噬细胞存在下MKN-45细胞的吞噬指数曲线的EC50相比于在没有可溶性CEACAM5的情况下所测量的EC50而言没有向更高浓度位移超过4倍，和/或通过添加200ng/mL CEACAM5没有使吞噬指数曲线的最大值减少10％或更多，15％或更多，或者20％或更多。
36.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中在200ng/ml可溶性CEACAM5存在下关于所述双特异性抗体的与MKN-45细胞的结合曲线的EC50相比于在没有可溶性CEACAM5的情况下所测量的EC50而言没有向更高浓度位移超过2倍。
37.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体不与人CEACAM1交叉反应。
38.权利要求3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以1至50nM的EC50值与在重组CHO细胞CHO-K1(
Figure FDA0002928449410000061
CCL-61TM)上表达的人CEACAM6相结合。
39.权利要求38的双特异性抗体，其中用包含人CEACAM6的cDNA的载体转染CEACAM6阴性的CHO细胞。
40.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中在300nM的浓度下，包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区的与人CEACAM5特异性地结合的单克隆抗体没有使对于MKN-45细胞的该CEACAM5xCD47双特异性抗体的结合曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
41.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中在300nM的浓度下，包含SEQ ID NO:97和98的重链作为重链和SEQ ID NO:96和99的轻链作为轻链的与人CEACAM5和CD3ε特异性地结合的双特异性抗体没有使对于MKN-45细胞的该CEACAM5xCD47双特异性抗体的结合曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
42.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中在30nM的浓度下，包含氨基酸序列SEQ ID NO:92至95作为重链和轻链的与人CEACAM5和CD3ε特异性地结合的双特异性抗体没有使对于MKN-45细胞的该CEACAM5xCD47双特异性抗体的结合曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
43.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中在30nM的浓度下，包含氨基酸序列SEQ ID NO:92至95的链作为重链和轻链的与人CEACAM5和CD3ε特异性地结合的双特异性抗体没有使对于MKN-45细胞的该CEAxCD47双特异性抗体的吞噬指数曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
44.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中在300nM的浓度下，包含氨基酸序列SEQ ID NO:96至99作为重链和轻链的与人CEACAM5和CD3ε特异性地结合的双特异性抗体没有使对于MKN-45细胞的该CEACAM5xCD47双特异性抗体的吞噬指数曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
45.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其包含共同重链(cHC)作为所述第一结合部分的重链和作为所述第二结合部分的重链。
46.权利要求45的双特异性抗体，其特征在于，每个结合部分的所述共同重链包含SEQID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQ ID NO:3的CDRH3，或者SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR。
47.权利要求45的双特异性抗体，其特征在于，每个结合部分的所述共同重链包含SEQID NO:4作为共同可变重链结构域(cVH)。
48.权利要求45的双特异性抗体，其特征在于，其包含从由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成的组中选择的共同重链(cHC)。
49.权利要求48的双特异性抗体，其中SEQ ID NO:5的共同重链由SEQ ID NO:6中所显示的核酸序列编码。
50.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述第二结合部分包含：共同重链，其包含SEQ ID NO:1的CDRH1、SEQ ID NO:2的CDRH2和SEQ ID NO:3的CDRH3作为CDR，和轻链(LC)，其包含SEQ ID NO:7的CDRL1、包括在SEQ ID NO:8中的Ala Ala Ser的CDRL2和SEQ IDNO:9的CDRL3作为CDR；或者共同重链，其包含SEQ ID NO:25的CDRH1、SEQ ID NO:26的CDRH2和SEQ ID NO:27的CDRH3作为CDR，和轻链(LC)，其包含SEQ ID NO:28的CDRL1、SEQ ID NO:29的CDRL2和SEQ ID NO:30的CDRL3作为CDR。
51.权利要求1-48中任一项的双特异性抗体，其中所述第二结合部分包含：包含SEQ IDNO:4作为可变重链结构域(cVH)的重链，和SEQ ID NO:10的可变轻链结构域(VL)。
52.权利要求1-48中任一项的双特异性抗体，其中所述第二结合部分包含SEQ ID NO:5的重链(cHC)和SEQ ID NO:11的轻链(CL)。
53.权利要求1-48中任一项的双特异性抗体，其中所述第二结合部分包含SEQ ID NO:23的重链(cHC)和SEQ ID NO:11的轻链(CL)。
54.权利要求1-48中任一项的双特异性抗体，其中所述第二结合部分包含SEQ ID NO:24的重链(cHC)和SEQ ID NO:11的轻链(CL)。
55.权利要求52-54中任一项的双特异性抗体，其中SEQ ID NO:11的轻链(CL)由SEQ IDNO:12中所显示的核酸序列编码。
56.权利要求1-48中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与CEACAM5特异性地结合并且包含SEQ ID NO:13的轻链恒定结构域。
57.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以0.1至10nM的IC50抑制与在MKN-45细胞上的CD47之间的相互作用(SIRPα，CD172a；UniProtKB P78324)。
58.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其特征在于低于10nM的通过人巨噬细胞的表达CEACAM5的肿瘤细胞系MKN-45的吞噬指数曲线(基于成像的测定法)的EC50值。
59.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与CEACAM5特异性地结合，但是不与MAB CEA、CEA-TCB或CEA-TCB1竞争与在MKN-45肿瘤细胞上的CEACAM5的结合。
60.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中在以300nM的浓度的MAB CEA或CEA-TCB存在下或者在以30nM的浓度的CEA-TCB1存在下，关于与MKN-45的结合的EC50值(1至200nM的EC50)增加小于三倍。
61.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有相比于用B6H12.2在相同测定法中所测量的EC50而言100倍或更多倍更高的关于RBC吞噬作用的EC50。
62.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在直至200μg/mL的浓度下不显示出显著的血小板激活。
63.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体已经进行了糖改造从而具有有着经修饰的寡糖的Fc区。
64.权利要求63的双特异性抗体，其中所述经糖改造的双特异性抗体具有相比于未进行糖改造的相同双特异性抗体而言至少3倍更低的通过基于成像的测定法所测量的关于吞噬指数曲线的EC50值，如果在相同实验条件下测量。
65.权利要求64的双特异性抗体，其中所述关于吞噬指数的EC50为5至10倍更低，或者10至30倍更低。
66.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有已被修饰从而具有相比于未进行糖改造的双特异性抗体而言减少的数目的岩藻糖残基的Fc区。
67.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有已经进行了糖改造从而具有相比于未进行糖改造的双特异性抗体而言增加的比例的平分型寡糖的Fc区。
68.权利要求69的双特异性抗体，其中所述平分型寡糖是大部分地平分型的复合物。
69.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体已经进行了糖改造从而在所述双特异性抗体的Fc区中具有相比于未进行糖改造的双特异性抗体而言增加的比例的平分型的、非岩藻糖基化的寡糖。
70.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体已经进行了糖改造从而在所述Fc区中具有相比于未进行糖改造的双特异性抗体而言增加的GIcNAc残基与岩藻糖残基的比率。
71.权利要求70的双特异性抗体，其中所述平分型的、非岩藻糖基化的寡糖大部分地是以杂合形式的。
72.权利要求70的双特异性抗体，其中所述平分型的、非岩藻糖基化的寡糖大部分地是复合类型。
73.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有其中50％至100％的N-联寡糖是非岩藻糖基化的Fc区。
74.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有其中50％至100％的N-联寡糖是平分型的Fc区。
75.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有其中80％至100％的N-联寡糖是平分型的且非岩藻糖基化的Fc区。
76.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体已经进行了糖改造，并且由所述经糖改造的抗体所诱导的浓度/ADCC曲线(最大值和/或EC50)相比于由未进行糖改造的相同双特异性抗体所诱导的ADCC而言增加至少1.2倍。
77.权利要求76的双特异性抗体，其中ADCC曲线的ADCC最大值和/或EC50值增加1.2至2.0倍。
78.权利要求2-77中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有相比于未进行糖改造的相同双特异性抗体而言至少3倍更低的通过基于成像的测定法所测量的关于吞噬指数曲线的EC50值，如果在相同实验条件下测量。
79.权利要求78的双特异性抗体，其中所述关于吞噬指数的EC50为5至10倍更低。
80.权利要求78的双特异性抗体，其中所述关于吞噬指数的EC50为10至30倍更低。
81.权利要求2-80中任一项的双特异性抗体，其中以流式细胞术测定的由所述经糖改造的抗体所诱导的最大ADCP功能相比于由未进行糖改造的相同双特异性抗体所诱导的ADCP而言增加至少1.2倍。
82.权利要求80的双特异性抗体，其中所述ADCP增加1.2至2.0倍。
83.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其特征在于，在所述Fc区中包含一个、两个或三个从由下列各项组成的组中选择的氨基酸置换：单置换S239D、I332E、G236A；双置换I332E和G236A、S239D和I332E、S239D和G236A；以及三重置换S329D和I332E和G236A。
84.权利要求83的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有已经进行了糖改造从而具有相比于未进行糖改造的相同双特异性抗体而言减少的数目的岩藻糖残基的Fc区。
85.权利要求83或84的双特异性抗体，其中由所述经氨基酸置换的抗体所诱导的ADCC曲线的最大值和/或EC50值相比于由在所述Fc区中不包含任一个所述氨基酸置换的双特异性抗体所诱导的ADCC而言增加至少1.2倍。
86.权利要求85的双特异性抗体，其中ADCC增加1.2至2.0倍。
87.权利要求83-86中任一项的双特异性抗体，其中在所述Fc区中包含所述置换的双特异性抗体具有相比于在所述Fc区中不包含任一个所述氨基酸置换的相同双特异性抗体而言至少3倍更低的通过基于成像的测定法所测量的关于吞噬指数曲线的EC50值，当在相同实验条件下测量时。
88.权利要求87的双特异性抗体，其中所述关于吞噬指数的EC50为5至10倍更低。
89.权利要求87的双特异性抗体，其中所述关于吞噬指数的EC50为10至30倍更低。
90.权利要求83-89中任一项的双特异性抗体，其中在所述Fc区中包含所述置换的双特异性抗体的特征在于，以流式细胞术测定的由所述经氨基酸置换的抗体所诱导的最大吞噬作用相比于由所述在所述Fc区中不包含任一个所述氨基酸置换的抗体所诱导的最大吞噬作用而言增加至少1.2倍。
91.权利要求90的双特异性抗体，其中所述ADCP增加1.2至2.0倍。
92.权利要求83-91中任一项的双特异性抗体，其中在所述Fc区中包含所述置换的双特异性抗体具有相比于在所述Fc区中不包含任一个所述氨基酸置换的相同双特异性抗体而言至少3倍更低的通过基于成像的测定法所测量的关于吞噬指数曲线的EC50值，当在相同实验条件下测量时。
93.权利要求92的双特异性抗体，其中所述关于吞噬指数的EC50为5至10倍更低。
94.权利要求2-93中任一项的双特异性抗体，其中在所述Fc区中50％至100％、60％至100％、70％至100％或80％至100％的N-联寡糖是非岩藻糖基化的。
95.权利要求2-94中任一项的双特异性抗体，其中在所述Fc区中50％至100％、60％至100％、70％至100％或80％至100％的N-联寡糖是平分型的。
96.权利要求2-95中任一项的双特异性抗体，其中在所述Fc区中50％至100％、60％至100％、70％至100％或80％至100％的N-联寡糖是平分型的、非岩藻糖基化的。
97.权利要求2-96中任一项的双特异性抗体，其中所述经糖改造的双特异性抗体包含相比于包含SEQ ID NO:5作为共同重链的未进行糖改造的双特异性抗体而言增加的效应子功能。
98.权利要求97的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体显示出在一个或多个下列效应子功能方面的增加：
a.增加的与FcγR的结合亲和力，
b.增加的巨噬细胞的结合，包括增加的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)，
c.增加的NK细胞的结合，包括增加的抗体介导的细胞毒性(ADCC)，和
d.增加的与单核细胞的结合。
99.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中向基于成像的吞噬作用测定法添加1mg/mL的huIgG引起浓度/吞噬指数曲线的最大值的小于0.9倍的减少和/或EC50向更高浓度的小于3倍的位移。
100.前述权利要求中任一项的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体与食蟹猴CEACAM5交叉反应。
101.分离的多核苷酸，其编码根据前述权利要求中任一项的双特异性抗体。
102.表达载体，其包含权利要求101的多核苷酸。
103.宿主细胞，其包含权利要求102的表达载体。
104.用于产生根据本发明的双特异性抗体的方法，其包括：
a)在允许产生所述双特异性抗体的条件下培养权利要求103的宿主细胞，和
b)分离所述抗体。
105.权利要求104的方法，其中所述抗体能够与CEACAM5和CD47特异性地结合。
106.用于产生权利要求2-100中任一项的经糖改造的双特异性抗体的方法，所述方法包括：
a)在允许产生所述双特异性抗体并且允许修饰在所述双特异性抗体的Fc区上存在的寡糖的条件下培养经糖改造从而表达至少一种编码具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III活性的多肽的核酸的宿主细胞；和
b)分离所述经糖改造的双特异性抗体，其中所述经糖改造的双特异性抗体能够与CEACAM5和CD47特异性地结合。
107.用于在宿主细胞中产生权利要求2-100中任一项的经糖改造的双特异性抗体的方法，所述方法包括：
a)在允许产生所述双特异性抗体并且允许修饰在所述双特异性抗体的Fc区上存在的寡糖的条件下培养通过靶向破坏FUT8基因而经糖改造的宿主细胞，和
b)分离所述经糖改造的双特异性抗体，其中所述经糖改造的双特异性抗体能够与CEACAM5和CD47特异性地结合。
108.用于在宿主细胞中产生权利要求83-93中任一项的Fc经置换的双特异性抗体的方法，所述方法包括：
a)在允许产生所述双特异性抗体的条件下培养包含编码所述Fc经置换的双特异性抗体的表达载体的宿主细胞，和
b)分离所述Fc经置换的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体能够与CEACAM5和CD47特异性地结合。
109.诱导肿瘤细胞的细胞裂解的方法，其包括使所述肿瘤细胞与权利要求1-100中任一项的双特异性抗体相接触。
110.权利要求109的方法，其中所述肿瘤细胞为人肿瘤细胞。
111.权利要求109或权利要求110的方法，其中所述肿瘤细胞在患者中。
112.权利要求109-111中任一项的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为结肠直肠癌细胞、NSCLC(非小细胞肺癌)细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞或另一种表达CEACAM5的肿瘤细胞。
113.治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-100中任一项的双特异性抗体。
114.在具有表达CEACAM5的癌症的受试者中增加存活时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-100中任一项的双特异性抗体。
115.权利要求113或权利要求114的方法，其特征在于，所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
116.权利要求109-115中任一项的方法，其中所述双特异性抗体与化学疗法和/或放射疗法相组合地施用给人受试者。
117.用于治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其特征在于，在相同实验条件下和在1mg/ml人IgG存在下，所述双特异性抗体的吞噬作用的EC50值在参考抗体K2AC22的E50值的0.1至3倍的范围内。
118.权利要求117的方法，其中所述EC50范围为0.2至3.0、0.3至3.0、0.5至2.5或1.0至2.5。
119.权利要求109-118中任一项的方法，其中所述双特异性抗体的特征在于，以100nM至600nM的结合亲和力与人CD47相结合。
120.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其用于在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者的方法中使用，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明的双特异性抗体，其特征在于，在相同实验条件下和在1mg/ml人IgG存在下，所述双特异性抗体的吞噬作用的EC50值在参考抗体K2AC22的E50值的0.1至3倍的范围内。
121.权利要求120的用于所述用途的双特异性抗体，其中所述EC50范围为0.2至3.0、0.3至3.0、0.5至2.5或1.0至2.5。
122.权利要求120或权利要求121的用于所述用途的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的特征在于，以100nM至600nM的结合亲和力与人CD47相结合。
123.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者。
124.根据权利要求123的双特异性抗体的用途，其中所述癌症选自由结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌组成的组。
125.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分和与人CD3ε特异性地结合的第四结合部分。
126.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地用于治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者，所述第二双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
127.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其用于与CEA-TCB和/或CEA-TCB1以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用。
128.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地用于治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者，所述第二双特异性抗体包含与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述第三结合部分包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
129.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，其中本发明的所述双特异性抗体不与所述第二双特异性抗体竞争。
130.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其用于与CEA-TCB或CEA-TCB1以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，其中所述双特异性抗体的特征在于不与CEA-TCB或CEA-TCB1竞争。
131.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其用于与CEA-TCB或CEA-TCB1以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，其中所述双特异性抗体与CEA-TCB或CEA-TCB1竞争。
132.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地进行使用，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:88的重链可变区和SEQ ID NO:89的轻链可变区；和与人CD3ε特异性地结合的第四结合部分，其包含SEQ ID NO:90的重链可变区和SEQ ID NO:91的轻链可变区。
133.权利要求125-132中任一项的用于所述用途的双特异性抗体，其特征在于，以6至15天的间隔向所述受试者交替地施用根据本发明的双特异性抗体和所述第二双特异性抗体。
134.权利要求125-132中任一项的用于所述用途的双特异性抗体，其特征在于，以6至15天的间隔向所述受试者同时地施用根据本发明的双特异性抗体和所述第二双特异性抗体。
135.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区；和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，由此在300nM的浓度下所述第二双特异性抗体不使根据本发明的双特异性抗体的对于MKN-45细胞的吞噬指数曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
136.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:88的重链可变区和SEQ ID NO:89的轻链可变区；和与人CD3ε特异性地结合的第四结合部分，其包含SEQ ID NO:90的重链可变区和SEQ ID NO:91的轻链可变区，由此在300nM的浓度下所述第二双特异性抗体不使根据本发明的双特异性抗体的对于MKN-45细胞的结合曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
137.权利要求1-100中任一项的双特异性抗体，其用于与CEA-TCB或CEA-TCB1以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，由此在300nM的浓度下所述CEA-TCB或者在30nM的浓度下所述CEA-TCB1不使根据本发明的双特异性抗体的对于MKN-45细胞的结合曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
138.权利要求125-137中任一项的用于所述用途的双特异性抗体，其中所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。
139.权利要求125-138中任一项的用于所述用途的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体和所述第二双特异性抗体在包含例如MKN-45肿瘤细胞以及源自相同人供者的人巨噬细胞和T-细胞的测定法中显示出累加的肿瘤细胞的％杀伤。
140.权利要求125-138中任一项的用于所述用途的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体和所述第二双特异性抗体在包含例如MKN-45肿瘤细胞以及源自相同人供者的人巨噬细胞和T-细胞的测定法中显示出协同的肿瘤细胞的％杀伤。
141.包含权利要求1-100中任一项的双特异性抗体的组合物，其用于在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，其中所述双特异性抗体的特征在于不与第二双特异性抗体竞争。
142.包含权利要求1-100中任一项的双特异性抗体的组合物，其中所述双特异性抗体的特征在于不与第二双特异性抗体竞争，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区；和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，其中所述组合物用于在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用。
143.包含权利要求1-100中任一项的双特异性抗体的组合物，其中所述双特异性抗体的特征在于不与第二双特异性抗体竞争，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:88的重链可变区和SEQ ID NO:89的轻链可变区；和与人CD3ε特异性地结合的第四结合部分，其包含SEQ ID NO:90的重链可变区和SEQID NO:91的轻链可变区，其中所述组合物用于在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用。
144.权利要求141-143中任一项的组合物，其中所述双特异性抗体的特征在于不与CEA-TCB和/或CEA-TCB1竞争。
145.用于治疗具有肿瘤的人患者的方法，其包括向所述人患者施用有效量的权利要求1-100中任一项的CEACAM5 x CD47双特异性抗体和针对CEACAM5和CD3的第二双特异性抗体，所述方法随后包括：
(i)向所述患者施用0.1至10mg/kg，在一个进一步的实施方案中1.0至20.0mg/kg的所述第二抗CEACAM5xCD3抗体的剂量，例如在4至12周内每周一次，
(ii)向所述患者施用所述第二抗体，q1、q2w、q3w或任选地q4w，
(iii)在这些4至12周之后和在所述抗CEACAM5xCD3抗体的另外2或3或4个消除半寿期之后，向所述患者施用1至20mg/kg的根据本发明的抗体的剂量，
(iv)向所述患者施用所述根据本发明的抗体，q1、q2w、q3w或任选地q4w，等待所述CEACAM5 x CD47双特异性抗体的2或3或4个消除半寿期，和然后任选地重复CEACAM5 x CD3双特异性抗体施用和随后的CEACAM5 x CD47双特异性抗体施用的所述循环，和任选地再次重复那个循环。
146.权利要求145的方法，其中所述肿瘤为癌症。
147.权利要求145的方法，其中所述肿瘤为实体肿瘤。
148.权利要求146的方法，其中所述癌症为表达CEACAM5的实体癌。
149.权利要求146或权利要求148的方法，其中所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
150.权利要求145-149中任一项的方法，其中所述第二抗体为CEA-TCB。
151.权利要求145-149中任一项的方法，其中所述第二抗体为CEA-TCB1。
152.权利要求145-151中任一项的方法，其中所述CEACAM5 x CD47双特异性抗体和所述第二双特异性抗体是竞争性的。
153.用于通过施用有效量的权利要求1-100中任一项的CEACAM5 x CD47双特异性抗体和针对CEACAM5和CD3的第二双特异性抗体来治疗具有肿瘤的人患者的方法。
154.权利要求153的方法，其中所述CEACAM5 x CD47双特异性抗体和所述CEACAM5和CD3抗体不是竞争性的。
155.权利要求153或权利要求154的方法，其中同时施用所述抗体。
156.权利要求153-155中任一项的方法，其中在大约相同的时间以0.01至10mg/kg的所述CEACAM5 x CD3双特异性抗体和1至20mg/kg的所述CEACAM5 x CD47双特异性抗体的剂量给患者施用，随后为一次或多次这些组合施用，以q1w或q2w或q3w或任选地q4w的频率。
157.权利要求156的方法，其中所述CEACAM5 x CD3双特异性抗体以0.5至10mg/kg进行施用。
158.权利要求153-157中任一项的方法，其中所述肿瘤为癌症。
159.权利要求153-158中任一项的方法，其中所述肿瘤为实体肿瘤。
160.权利要求158的方法，其中所述癌症为表达CEACAM5的实体癌。
161.权利要求158或权利要求160的方法，其中所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
162.权利要求153-161中任一项的方法，其中所述第二抗体为CEA-TCB。
163.权利要求153-161中任一项的方法，其中所述第二抗体为CEA-TCB1。
164.权利要求145-163中任一项的方法，其中所述双特异性抗体和所述第二双特异性抗体显示出累加的效力。
165.权利要求145-163中任一项的方法，其中所述双特异性抗体和所述第二双特异性抗体显示出协同的效力。
166.药用组合物，其包含权利要求1-100中任一项的双特异性抗体和在药学上可接受的赋形剂或运载体。
167.权利要求166的药用组合物，其用于作为药物进行使用。
168.权利要求166或权利要求167的药用组合物，其用于在治疗实体肿瘤病症中作为药物进行使用。
169.权利要求166或权利要求167的药用组合物，其用于在治疗结肠直肠癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌中作为药物进行使用。
170.包含权利要求1-100中任一项的第一双特异性抗体的药用组合物，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:20的重链可变区和SEQ ID NO:21的轻链可变区；和与人CD3ε的表位特异性地结合的第四结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，其中在300nM的浓度下所述第二双特异性抗体不使所述第一双特异性抗体的对于MKN-45细胞的结合曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
171.包含权利要求1-100中任一项的第一双特异性抗体的药用组合物，其用于与第二双特异性抗体以同时、分开或顺次的方式相组合地在治疗具有表达CEACAM5的癌症的受试者中进行使用，所述第二双特异性抗体包含：与人CEACAM5特异性地结合的第三结合部分，其包含SEQ ID NO:88的重链可变区和SEQ ID NO:89的轻链可变区；和与人CD3ε特异性地结合的第四结合部分，其包含SEQ ID NO:90的重链可变区和SEQ ID NO:91的轻链可变区，由此在30nM的浓度下所述第二双特异性抗体不使所述第一双特异性抗体的对于MKN-45细胞的结合曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
172.权利要求171的药用组合物，其中所述第二双特异性抗体不使所述结合曲线的EC50向更高浓度位移超过3倍。
173.权利要求166-172中任一项的药用组合物，其中所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
174.权利要求1-100中任一项的抗体在制备药用组合物中的用途。
175.权利要求1-100中任一项的抗体和在药学上可接受的赋形剂或运载体在制备药用组合物中的用途。
176.权利要求1-100中任一项的抗体在制备用于治疗实体肿瘤病症的药物中的用途。
177.权利要求1-100中任一项的抗体在治疗结肠直肠癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌中的用途。
178.诱导肿瘤细胞的细胞裂解的方法，其包括使所述肿瘤细胞与权利要求1-100中任一项的双特异性抗体相接触。
179.权利要求178的方法，其中所述肿瘤细胞为结肠直肠癌细胞、NSCLC(非小细胞肺癌)细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞或乳腺癌细胞。
180.权利要求178和179的方法，其中所述细胞裂解通过所述双特异性抗体的抗体依赖性细胞吞噬和/或抗体依赖性细胞毒性来诱导。
181.治疗具有异常地表达CEACAM5的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-100中任一项的双特异性抗体。
182.治疗具有异常地表达CEACAM5的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-100中任一项的双特异性抗体以及与之相组合的与人CEACAM5和人CD3相结合的第二双特异性抗体。
183.权利要求182的方法，其中顺次地/交替地施用竞争型的CEACAM5xCD3和CEACAM5xCD47双特异性抗体。
184.权利要求182的方法，其中如果所述CEACAM5xCD3和CEACAM5xCD47双特异性抗体不是竞争型的或仅是最小程度地竞争型的，那么就顺次地或平行地/同时地施用这两种双特异性抗体。
185.权利要求182-184中任一项的方法，其中所述双特异性抗体和所述第二双特异性抗体显示出累加的效力。
186.权利要求182-184中任一项的方法，其中所述双特异性抗体和所述第二双特异性抗体显示出协同的效力。
187.在具有异常地表达CEACAM5的癌症的受试者中提高无进展存活和/或总存活时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-100中任一项的双特异性抗体。
188.权利要求187的方法，其中所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌或者另一种表达CEACAM5的癌症。
189.权利要求178-188中任一项的方法，其中所述双特异性抗体与化学疗法和/或放射疗法相组合地进行施用。
190.权利要求178-189中任一项的方法，其中所述受试者为罹患结肠直肠癌或肺癌或胃癌或胰腺癌或乳腺癌或另一种表达CEACAM5的癌症的患者。
191.治疗具有异常地表达CEACAM5的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-100中任一项的双特异性抗体以及与之相组合的针对人CEACAM5和人CD3ε的第二双特异性抗体。
192.权利要求191的方法，其中所述双特异性抗体和所述第二双特异性抗体显示出累加的效力。
193.权利要求191的方法，其中所述双特异性抗体和所述第二双特异性抗体显示出协同的效力。
194.在具有异常地表达CEACAM5的癌症的受试者中提高无进展存活时间和/或总存活时间的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-100中任一项的双特异性抗体。
195.权利要求191-194中任一项的方法，其中所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
196.权利要求191-195中任一项的方法，其中所述双特异性抗体与化学疗法或放射疗法相组合地进行施用。
197.权利要求191-196中任一项的方法，其中所述受试者为具有结肠直肠癌或肺癌或胃癌或胰腺癌或乳腺癌或另一种表达CEACAM5的癌症的癌症患者。
198.根据权利要求1-99中任一项的双特异性抗体在权利要求178-197中任一项的治疗方法中的用途。
199.权利要求198的用途，其中所述癌症选自由结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌组成的组。
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