CN112513095B - Her3抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

公开了HER3抗原结合分子。还公开了编码HER3抗原结合分子的核酸和表达载体，包含HER3抗原结合分子的组合物以及使用HER3抗原结合分子的方法。

Description

HER3抗原结合分子
本申请要求2018年3月29日提交的PCT/EP2018/058259和2018年10月25日提交的US 16/170,370的优先权，其内容和要素出于所有目的通过引用并入本文
发明领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体地涉及抗体技术。本发明还涉及医学治疗和预防方法。
发明背景
HER3表达增加与多种实体瘤的不良预后有关，包括乳腺癌、胃癌、头颈癌、胰腺癌、卵巢癌和肺癌。HER3介导的信号传导对肿瘤进展有不利影响。HER3的上调与抗HER2和抗EGFR治疗的耐药性相关，并且已证明，与抗PD-1治疗的反应者相比，抗PD-1治疗的难治性实体瘤中HER3表达更高。
HER3结合抗体，在例如Zhang等，Acta Biochimica et Biophysica Sinica(2016)48(1)：39–48中述及。抗HER3抗体LJM-716与HER3细胞外结构域的亚结构域II和IV上的表位结合，将HER3锁定为非活性构象(Garner等，癌症研究(2013)73：6024–6035)。MM-121(也称为塞立单抗(seribantumab))已显示可通过阻断调蛋白(HRG)与HER3的结合来抑制HER3介导的信号传导(Schoeberl等，Sci.Signal.(2009)2(77)：ra31)。帕妥珠单抗(也称为U-1287和AMG-888)也阻断调蛋白与HER3的结合(参见例如Shimizu等，癌症化学药剂，(2017)79(3):489–495.)RG7116(也称为鲁妥珠单抗(lumretuzumab)和RO-5479599)识别HER3细胞外结构域的亚结构域I中的表位(参见例如Mirschberger等，癌症研究(2013)73(16)5183-5194)。KTN3379通过与亚结构域III中的氨基酸残基相互作用而与HER3结合(对应于SEQ IDNO：1的以下位置：Gly476，Pro477，Arg481，Gly452，Arg475，Ser450，Gly420，Ala451，Gly419，Arg421，Thr394，Leu423，Arg426，Gly427，Lys356，Leu358，Leu358，Lys356，Ala330，Lys329和Gly337)，以及亚结构域II中的Met310，Glu311和Pro328(参见Lee等，美国科学院院报，2015Oct 27；112(43)：13225)。已显示AV-203(也称为CAN-017)可以阻断NRG1与HER3的结合并促进HER3的降解(参见Meetze等，Eur J Cancer 2012；48：126)。REGN1400还抑制配体与HER3的结合(参见Zhang等，Mol Cancer Ther(2014)13：1345–1355)。RG7597(杜立哥珠单抗(duligotuzumab))是一种双功能Fab(DAF)，能够与HER3和EGFR结合，并与HER3的亚结构域III结合(参见Schaefer等，癌症细胞(2011)20(4)：472-486)。MM-111和MM-141是具有HER3结合臂的双特异性抗体，可抑制HRG配体与HER3的结合(参见McDonagh等，MolCancer Ther(2012)11：582-593和Fitzgerald等，Mol Cancer Ther(2014)13：410-425)。
发明内容
在本发明的第一方面，提供了任选地分离的抗原结合分子，其能够结合细胞外区域亚结构域II中的HER3。
在一些实施方式中，抗原结合分子抑制HER3和HER3的互作伴侣之间的相互作用。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含或由SEQ ID NO：16所示氨基酸序列组成的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：229所示氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：230和231所示氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：230所示氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：231所示氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：23所示氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：21所示氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：43所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：46所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：51所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：94所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：99所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：89所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：90所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：96所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：98所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：93所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：49所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：93所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：50所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：93所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：97所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：42所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：158所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：159所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：160所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：165所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：166所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：167所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合至包含SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：128所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：129所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：130所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：136所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：137所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：138所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：144所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：145所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：146所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：151所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：152所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：153所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在特定的实施方式中，抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：97所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：42所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含：
(i)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(ii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(iii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(iv)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(v)VH区，其包含氨基酸序列与SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(vi)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(vii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(viii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(ix)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(x)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性氨；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xi)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xiii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xiv)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xv)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xvi)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xvii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：87所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xviii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xix)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：143所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：150所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xx)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：157所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：164所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性。
在特定的实施方式中，抗原结合分子包括：
(i)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(ii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(iii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合人HER3，和小鼠HER3、大鼠HER3和食蟹猕猴HER3中的一种或多种。
还提供了任选地分离的抗原结合分子，其包含(i)根据本发明的抗原结合分子，和(ii)能够结合除HER3以外抗原的抗原结合分子。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合在细胞表面表达HER3的细胞。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3介导的信号传导。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含具有以下的多肽：(i)在对应于242位的位置具有C，在对应于334位的位置具有C，以及(ii)一个或多个的：在对应于236位的位置具有A，在对应于239位的位置具有D，在对应于332位的位置具有E，在对应于330位的位置具有L，在对应于345位的位置具有K，以及在对应于430位的位置具有G。在一些实施方式中，Fc区包含多肽，该多肽在对应于242位的位置具有C，在对应于334位的位置具有C，在对应于236位的位置具有A，在对应于239位的位置具有D，在对应于332位的位置具有E，以及在对应于330位的位置具有L。
还提供了包含根据本发明的抗原结合分子的嵌合抗原受体(CAR)。
还提供了编码根据本发明的抗原结合分子或CAR的一种或多种任选分离的核酸。
还提供了一种或多种表达载体，其包含根据本发明的一种或多种核酸。
还提供了一种细胞，其包含抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸，或根据本发明的一种或多种表达载体。
还提供了一种方法，该方法包括在适合于从核酸或表达载体中表达抗原结合分子或CAR的条件下，培养包含本发明中的一种或多种核酸、或一种或多种表达载体的细胞。
还提供了一种包含本发明的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、一种或多种表达载体，或细胞的组合物。
还提供了本发明的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸、一种或多种表达载体，细胞或组合物，用于医疗或预防的方法。
还提供了一种本发明的抗原结合分子、CAR、一种核酸或多种核酸、表达载体或多种表达载体、细胞或组合物，用于治疗或预防癌症。
还提供了一种本发明的抗原结合分子、CAR、一种核酸或多种核酸、表达载体或多种表达载体、细胞或组合物的用途，用于制造用于治疗或预防癌症的药物。
还提供了一种治疗或预防癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的本发明的抗原结合分子、CAR、一种核酸或多种核酸、表达载体或多种表达载体，细胞或组合物。
在本发明的各个方面的一些实施方式中，该方法额外包括施用由EGFR家族成员介导的信号转导的抑制剂，任选地，其中由EGFR家族成员介导的信号转导的抑制剂是由HER2和/或EGFR介导的信号转导的抑制剂。
在一些实施方式中，癌症选自：包含表达EGFR家族细胞的癌症、包含表达HER3细胞的癌症、实体瘤、乳腺癌、乳腺恶性上皮癌、导管癌、胃癌、胃恶性上皮癌、胃腺癌、结直肠癌、结直肠恶性上皮癌、结直肠腺肿瘤、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、肺癌、肺恶性上皮癌、鳞状细胞肺恶性上皮癌、卵巢癌、卵巢恶性上皮癌、卵巢浆液性腺癌、肾癌、肾细胞恶性上皮癌、肾透明细胞癌、肾细胞腺癌、肾乳头状细胞癌、胰腺癌、胰脏腺癌、胰腺导管腺癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、皮肤癌、黑素瘤、食道癌、食管腺癌、肝癌，肝细胞癌、胆管癌、子宫癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、甲状腺恶性上皮癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、前列腺腺癌、肉瘤和胸腺瘤。
还提供了抑制HER3介导的信号传导的方法，该方法包括使表达HER3的细胞与本发明的抗原结合分子接触。
还提供了减少表达HER3的细胞的数量或活性的方法，该方法包括使表达HER3的细胞与本发明的抗原结合分子接触。
还提供了任选分离的体外复合物，其包含与HER3结合的本发明的抗原结合分子。
还提供了一种方法，该方法包括使含有或疑似含有HER3的样品与本发明的抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子与HER3的复合物的形成。
还提供了一种选择或分层使用HER3靶向的药物治疗的受试者的方法，该方法包括将来自受试者的样品与本发明的抗原结合分子体外接触并检测抗原结合分子与HER3复合物的形成。
还提供了本发明的抗原结合分子作为体外或体内诊断或预后剂的用途。
还提供了本发明的抗原结合分子在检测、定位或成像癌症的方法中的用途，任选地，其中所述癌症选自：包含表达EGFR家族细胞的癌症、包含表达HER3细胞的癌症、实体瘤、乳腺癌、乳腺恶性上皮癌、导管癌、胃癌、胃恶性上皮癌、胃腺癌、结直肠癌、结直肠恶性上皮癌、结直肠腺肿瘤、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、肺癌、肺恶性上皮癌、鳞状细胞肺恶性上皮癌、卵巢癌、卵巢恶性上皮癌、卵巢浆液性腺癌、肾癌、肾细胞恶性上皮癌、肾透明细胞癌、肾细胞腺癌、肾乳头状细胞癌、胰腺癌、胰脏腺癌、胰腺导管腺癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、皮肤癌、黑素瘤、食道癌、食管腺癌、肝癌，肝细胞癌、胆管癌、子宫癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、甲状腺恶性上皮癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、前列腺腺癌、肉瘤和胸腺瘤。
描述
与已知的抗HER3抗体相比，本发明涉及性质改进的新型HER3结合分子。
发明人针对性地产生了结合HER3的细胞外区域中感兴趣的特定目标区域的抗原结合分子。与现有技术中公开的抗原结合分子相比，本发明的HER3结合分子具有所需的生物物理和/或功能特性的组合。
在本发明的实施方式中，抗原结合分子能够结合至HER3的细胞外区域的亚结构域II(SEQ ID NO：16)，并抑制HER3分子与互作伴侣的结合。
特别地，本文描述的结合HER3的抗原结合分子被证明与HER3的表位结合，从而有效抑制HER3与互作伴侣的结合，强烈抑制下游信号传导，并针对多种癌症具有优异的抗癌活性。
HER3
HER3(也称为ERBB3 LCCS2，MDA-BF-1)是UniProt P21860鉴定的蛋白质。由人ERBB3基因编码的mRNA的可变剪接产生了5种不同的同种型：同种型1(UniProt：P21860-1，v1；SEQ ID NO：1)；同种型2(UniProt：P21860-2；SEQ ID NO：2)，其包含从141位与SEQ IDNO：1不同的序列，并且缺少对应于SEQ ID NO：1的183至1342位的氨基酸序列；同种型3(UniProt：P21860-3；SEQ ID NO：3)，其包含相对于SEQ ID NO：1的替换C331F，并且缺少对应于SEQ ID NO：1的332至1342位的氨基酸序列；同种型4(UniProt：P21860-4；SEQ ID NO：4)，其缺少对应于SEQ ID NO：1的1至59位的氨基酸序列；和同种型5(UniProt：P21860-5；SEQ ID NO：5)，其缺少对应于SEQ ID NO：1的位置1至643的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1至3的N-末端19个氨基酸构成信号肽，因此HER3同种型1、2和3的成熟形式(即在加工去除信号肽后)分别具有如SEQ ID NO：6、7和8所示的氨基酸序列。
HER3的结构和功能描述于，例如Cho和Leahy科学(2002)297(5585)：1330-1333，Singer等，生物化学杂志(2001)276，44266-44274，Roskoski等，药理研究(2014)79:34-74，Bazley和Gullick内分泌相关癌症(2005)S17-S27和Mujoo等，肿瘤标靶(2014)5(21)：10222-10236，通过引用将其全部内容并入本文。HER3是单通道跨膜ErbB受体酪氨酸激酶，具有N末端胞外区域(SEQ ID NO：9)，其包含两个富含亮氨酸的亚结构域(结构域I和III，分别在SEQ ID NOs：15和17中显示)，和两个富含丝氨酸的亚结构域(结构域II和IV，分别在SEQ ID NOs：16和18中显示)。结构域II包含β发夹二聚环(SEQ ID NO：19)，其参与其他HER受体分子的分子间相互作用。细胞外区域通过跨膜区域(SEQ ID NO：10)连接至细胞质区域(SEQ ID NO：11)。胞质区包含近膜区段(SEQ ID NO：12)、蛋白激酶结构域(SEQ ID NO：13)和C-末端片段(SEQ ID NO：14)。
通过HER3的信号传导包括受体同二聚化(即与其他HER3受体)或异二聚化(与其他HER受体，例如HER2)，以及随后胞质区酪氨酸蛋白激酶结构域所致的自磷酸化作用。磷酸化的酪氨酸残基或募集的衔接子/效应蛋白(例如Grb2和磷脂酶Cγ(PLCγ)，包含
src同源域2(SH2)或磷酸酪氨酸结合(PTB)域。
通过HER3的信号传导可以以依赖配体或不依赖配体的方式被激活。在不存在配体的情况下，HER3受体分子通常作为单体表达在细胞表面，该构象阻止受体二聚化，其中亚结构域II的二聚化环与亚结构域IV上的口袋形成分子内接触。HER3配体,例如神经调节蛋白(NRG)，如NRG1(也称为调节蛋白，HRG)或NRG2与胞外区域的亚结构域I和III的结合引起构象变化，从而导致亚结构域II的二聚化环暴露，促进受体二聚化和信号传导。HER3中一些癌症相关的突变可能会破坏形成非活性“封闭”构象所需的亚结构域II和IV的相互作用，导致二聚环的组成型呈现，以及在没有配体结合的情况下激活HER3介导的信号传递(参见例如Jaiswal等，癌症细胞(2013)23(5)：603-617)。
在本说明书中，“HER3”是指来自任何物种的HER3，并且包括来自任何物种的HER3同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。
如本文所用，蛋白质的“片段”、“变体”或“同源物”可以任选地表征为与参比蛋白(例如，参比同种型)的氨基酸序列具有至少60％，优选地为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性。在一些实施方式中，参比蛋白的片段、变体、同种型和同源物的特征可能是执行由参比蛋白执行的功能的能力。
“片段”通常是指参比蛋白的一部分。“变体”通常是指具有氨基酸序列的蛋白，相对于参比蛋白的氨基酸序列，该氨基酸序列包含一个或多个氨基酸取代、插入、缺失或其它修饰，但相对于参比蛋白的氨基酸序列，保留相当程度的序列相同性(例如，至少60％)。“同种型”通常是指由与参比蛋白的物种相同的物种表达的参比蛋白的变体(例如HER3同种型1至5都是彼此的同种型)。“同源物”通常是指与参比蛋白的物种相比，由不同物种产生的参比蛋白的变体。例如，人HER3同种型1(P21860-1，v1；SEQ ID NO：1)和恒河猴HER3(UniProt：F7HEH3-1，v2；SEQ ID NO：20)是彼此的同源物。同源物包括直向同源物。
尽管可以任选为参比蛋白(即片段所源自的蛋白)的长度的至少25％，参比蛋白的“片段”可以具有任何长度(以氨基酸数计)，最大长度可以为参比蛋白长度的以下之一：50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
HER3的片段的最小长度可以是以下之一：10、20、30、40、50、100、150、200、250或300个氨基酸，最大长度可以是以下之一：20、30、40、50、100、150、200、250或300个氨基酸。
在一些实施方式中，HER3是来自哺乳动物的HER3(例如灵长类(猕猴、食蟹猴、非人灵长类或人)和/或啮齿动物(例如大鼠或鼠)的HER3)。HER3的同种型、片段、变体或同源物可以任选表征为与给定物种，例如人的未成熟或成熟HER3同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性。
正如通过功能特性/活性的合适测定法作分析所确定的，同种型、片段、变体或同源物可以任选地是功能同种型、片段、变体或同源物，例如具有参比HER3(如人HER3同种型1)的功能特性/活性。例如，HER3的同种型、片段、变体或同源物可显示与以下一种或多种结合：HER2、NRG1(I、II、III、IV、V或VI型)或NRG2(α或β)。
在一些实施方式中，HER3包含下述氨基酸序列或由下述氨基酸序列构成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1至8之一具有至少70％，优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性。
在一些实施方式中，HER3的片段包含下述氨基酸序列或由下述氨基酸序列构成：所述氨基酸序列与SEQ ID NO：9至19，例如9、16或19之一具有至少70％，优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性。
靶分子上有特殊兴趣的区域
本发明的抗原结合分子被特别设计成靶向特殊兴趣的HER3区域。在两步法中，通过分析预测的抗原性、功能性和安全性来选择要靶向的HER3区域。随后，HER3靶区域的特异性抗体通过利用对应于靶区域的肽作为免疫原来制备特异性的抗体。随后筛选鉴定出能够结合天然状态下HER3的抗体。该方法提供了对抗体表位的精确控制。
本发明的抗原结合分子可以参考它们结合的HER3区域来定义。本发明的抗原结合分子可以结合至HER3上感兴趣的特定区域。在一些实施方式中，抗原结合分子可以结合由氨基酸的连续序列(即氨基酸一级序列)组成的HER3的线性表位。在一些实施方式中，抗原结合分子可以结合由氨基酸序列上不连续的氨基酸序列组成的HER3的构象表位。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与HER3结合。在一些实施方式中，抗原结合分子结合至HER3的细胞外区域(例如，SEQ ID NO：9所示的区域)。在一些实施方式中，抗原结合分子与HER3的细胞外区域(例如，SEQ ID NO：16所示的区域)的亚结构域II结合。
在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：229所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：229所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：230和231所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：230和231所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：230所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：230所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：231所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：231所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：23所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：23所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：21所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：21所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子结合SEQ ID NO：19所示的HER3区域。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：19所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：22所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：22所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方式中，抗原结合分子不结合对应于SEQ ID NO：1的260至279位置的HER3区域。在一些实施方式中，抗原结合分子不接触对应于SEQ ID NO：1的260至279位置的HER3区域的氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子不结合SEQ ID NO：23所示的HER3区域。在一些实施方式中，抗原结合分子不接触SEQ ID NO：23所示的HER3区域的氨基酸残基。
抗体结合的肽/多肽的区域可以由技术人员使用本领域众所周知的各种方法确定，包括抗体-抗原复合物的X射线共晶体分析、肽扫描、诱变作图、质谱的氢-氘交换分析，噬菌体展示、竞争ELISA和基于蛋白水解的“保护”方法。这样的方法在例如：Gershoni等，生物药，2007，21(3)：145-156中描述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合与包含以下抗体克隆之一的VH和VL序列的抗体结合的HER3区域相同的HER3区域或重叠的HER3区域：10D1、10D1_c75、10D1_c76、10D1_c77、10D1_c78v1、10D1_c78v2、10D1_11B，10D1_c85v1、10D1_c85v2、10D1_c85o1、10D1_c85o2、10D1_c87、10D1_c89、10D1_c-90、10D1_c91、10D1_c92、10D1_c93、10A6、4-35-B2或4-35-B4。在一些实施方式中，所述抗原结合分子能够结合与包含以下抗体克隆之一的VH和VL序列的抗体结合的HER3区域相同的HER3区域或重叠的HER3区域：10D1_c89、10D1_c90或10D1_c91。在一些实施方式中，抗原结合分子能够与包含抗体克隆10D1_c89的VH和VL序列结合至相同的HER3区域，或重叠的HER3区域。
本文所用的“肽”是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸单体的链肽的长度通常在约2至50个氨基酸的范围内。“多肽”是两个或多个肽的聚合物链。多肽的长度通常大于约50个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：1、3、4、6或8之一所示氨基酸序列或由其组成的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或由其组成的多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：16所示氨基酸序列或由其组成的多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：229所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：230和231所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：230所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：231所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：23所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：21所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：22所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子不能够结合由对应于SEQ ID NO：1的260至279位的氨基酸序列组成的肽。在一些实施方式中，抗原结合分子不能结合由SEQ ID NO：23所示氨基酸序列组成的肽。
抗原结合分子结合给定肽/多肽的能力可以通过技术人员熟知的方法来分析，包括通过ELISA、免疫印迹(例如蛋白质印迹)、免疫沉淀、表面等离振子共振(SPR；参见例如Hearty等，分子生物方法(2012)907：411-442)或生物层干涉术(参见例如Lad等，(2015)JBiomol Screen 20(4)：498-507)进行分析。
在抗原结合分子能够结合包含参比氨基酸序列的肽/多肽的实施方式中，该肽/多肽可以在参比氨基酸序列的一个或两个末端包含一个或多个额外的氨基酸。在一些实施方式中，肽/多肽在参比氨基酸序列的一端或两端上，包含例如1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、5-10、5-20、5-30、5-40、5-50、10-20、10-30、10-40、10-50、20-30、20-40或20-50个额外的氨基酸。
在一些实施方式中，就HER3氨基酸序列而言，在参比序列的一端或两端(即，N-末端和C-末端)提供的额外氨基酸对应于参比序列末端的位置。举例来说，当抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：23所示序列和在SEQ ID NO：23的C-末端有两个额外氨基酸的肽时，两个额外氨基酸可以是对应于SEQ ID NO：1的278和279位的苏氨酸和赖氨酸。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合与包含以下任一抗体克隆的VH和VL序列的抗体结合的肽/多肽：10D1、10D1_c75、10D1_c76、10D1_c77、10D1_c78v1、10D1_c78v2、10D1_11B，10D1_c85、10D1_c85v2、10D1_c85o1、10D1_c85o2、10D1_c87、10D1_c89、10D1_c90、10D1_c91、10D1_c92、10D1_c93、10A6、4-35-B2或4-35-B4，如本文所述。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合与包含以下任一抗体克隆的VH和VL序列的抗体结合的肽/多肽：10D1_c89、10D1_c90或10D1_c91。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合与包含10D1-c89抗体克隆的VH和VL序列的抗体结合的肽/多肽。
抗原结合分子
本发明提供了能够结合HER3的抗原结合分子。
“抗原结合分子”是指能够结合靶抗原的分子，包括单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段(例如Fv、scFv、Fab、scFab、F(ab’)2、Fab2、二抗体、三抗体、scFv-Fc、微抗体、单结构域抗体(例如VhH)等)，只要它们显示与相关靶分子的结合即可。
本发明的抗原结合分子包含能够结合靶抗原的部分。在一些实施方式中，能够结合靶抗原的部分包含能够特异性结合该靶抗原的抗体的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，能够结合靶抗原的部分包含能结合靶抗原的适体或由适体组成，例如核酸适体(例如在Zhou和Rossi的Nat Rev Drug Discov.2017 16(3):181-202中综述的)。在一些实施方式中，能够与靶抗原结合的部分包含抗原结合肽/多肽，或由其组成，例如肽适体、硫氧还蛋白、单体、抗运载蛋白(anticalin)、Kunitz结构域、艾薇体(avimer)、结蛋白(knottin)、菲诺体(fynomer)、阿里体(atrimer)、DARPin、亲和体、纳米体(即单域抗体(sdAb))、亲和素、犰狳重复蛋白(ArmRP)、OBody或纤连蛋白-综述于，例如Reverdatto等.,Curr Top Med Chem.2015；15(12):1082-1110，在此通过引用全文纳入(还可参见Boersma等.,J Biol Chem(2011)286:41273-85和Emanuel等.,Mabs(2011)3:38-48)。
本发明的抗原结合分子通常包含抗原结合域，该抗原结合域包含能够特异性结合靶抗原的抗体的VH和VL。由VH和VL形成的抗原结合域在本文中也可以称为Fv区。
抗原结合分子可以是或可以包含抗原结合多肽或抗原结合多肽复合物。抗原结合分子可包含多于一个的多肽，它们一起形成抗原结合域。多肽可以共价或非共价结合。在一些实施方式中，所述多肽形成包含所述多肽的较大多肽的一部分(例如，在包含VH和VL的scFv的情况下，或在包含VH-CH1和VL-CL的scFab的情况下)。
抗原结合分子可以指多于一个的多肽(例如2、3、4、6或8个多肽)的非共价或共价复合物，例如包含两个重链多肽和两个轻链多肽的IgG样抗原结合分子。
可以使用能够结合HER3的单克隆抗体(mAb)的序列设计和制备本发明的抗原结合分子。也可以使用/提供抗体的抗原结合区，例如单链可变片段(scFv)、Fab和F(ab’)2片段。“抗原结合区”是能够结合给定抗体的特异性靶标的抗体的任何片段。
抗体通常包含六个互补决定区CDR；重链可变区(VH)中有三个：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，轻链可变区(VL)中有三个：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。六个CDR共同界定了抗体的互补位，它是抗体与靶抗原结合的部分。
VH区和VL区在每个CDR的两侧包含框架区(FR)，这些框架区为CDR提供支架。从N端到C端，VH区包含以下结构：N末端-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C末端；VL区包含以下结构：N末端-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C末端。
定义抗体CDR和FR有几种不同的约定，例如Kabat等.,《免疫学有意义的蛋白的序列》“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,第5版.公共卫生服务,国立卫生研究院,贝塞斯达,马里兰州(1991),Chothia等.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)所述的那些，和VBASE2，Retter等l.,Nucl.Acids Res.(2005)33(增刊1):D671-D674中所述。本文所述抗体克隆的VH区和VL区的CDR和FR根据国际IMGT(ImMunoGeneTics)信息系统(LeFranc等.,Nucleic Acids Res.(2015)43(数据库专辑):D413-22)定义，其使用如Lefranc等.,Dev.Comp.Immunol.(2003)27:55-77所述的IMGT V-DOMAIN编号规则。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含能够结合HER3的抗原结合分子的CDR。在一些实施方式中，抗原结合分子包含能够结合HER3的抗原结合分子的FR。在一些实施方式中，抗原结合分子包含能够结合HER3的抗原结合分子的CDR和FR。即，在一些实施方式中，抗原结合分子包含能够结合HER3的抗原结合分子的VH区和VL区。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含VH区和VL区，该VL区或VL区是或衍生自本文所述的结合HER3的抗体克隆(即抗HER3抗体克隆10D1_c75、10D1_c76、10D1_c77、10D1_c78v1、10D1_c78v2、10D1_11B、10D1_c85v1、10D1_c85v2、10D1_c85o1、10D1_c85o2、10D1_c87、10D1_c89、10D1_c90、10D1_c91、10D1_c92、10D1_c93、10D1、10A6、4-35-B2或4-35-B4；如10D1_c89、10D1_c90或10D1_c91；例如10D1_c89)。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含以下(1)-(10)之一所述的VH区：
(1)(10D1衍生)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：43所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：46所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：51所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的一个或多个中的1或2或3个氨基酸被另一氨基酸取代。
(2)(10D1、10D1_c75、10D1_c76、10D1_c77、10D1_c78v1、10D1_c78v2、10D1_11B，10D1_c87、10D1_c92、10D1_c93)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的一个或多个中的1或2或3个氨基酸被另一氨基酸取代。
(3)(10D1_c85v1，10D1_c85v2)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的一个或多个中的1或2或3个氨基酸被另一氨基酸取代。
(4)(10D1_c85o1)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：49所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的一个或多个中的1或2或3个氨基酸被另一氨基酸取代。
(5)(10D1_c85o2)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：50所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的一个或多个中的1或2或3个氨基酸被另一氨基酸取代。
(6)(10D1_c89，10D1_c90)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的一个或多个中的1或2或3个氨基酸被另一氨基酸取代。
(7)(10D1_c91)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：42所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的一个或多个中的1或2或3个氨基酸被另一氨基酸取代。
(8)(10A6)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：158所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：159所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：160所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的一个或多个中的1或2或3个氨基酸被另一氨基酸取代。
(9)(4-35-B2)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：128所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：129所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：130所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的一个或多个中的1或2或3个氨基酸被另一氨基酸取代。
(10)(4-35-B4)包含以下CDR的VH区：
具有SEQ ID NO：144所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：145所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：146所示氨基酸序列的HC-CDR3，
或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的一个或多个中的1或2或3个氨基酸被另一氨基酸取代。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含以下(11)-(24)之一所述的VH区：
(11)(10D1)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：55所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：58所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：69所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：73所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(12)(10D1_c75、10D1_c92)包含以下FR的VH区域：
具有SEQ ID NO：52所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：56所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：61所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：70所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(13)(10D1_c76、10D1_c77、10D1_c78v1)包含以下FR的VH区域：
具有SEQ ID NO：52所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：56所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：62所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：70所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(14)(10D1_c78v2)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：52所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：57所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：62所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：70所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(15)(10D1_11B)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：224所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：60所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：63所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：70所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(16)(10D1_c85v1)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：52所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：56所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：64所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：70所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(17)(10D1_c85v2、10D1_c85o1、10D1_c85o2)包含以下FR的VH区域：
具有SEQ ID NO：52所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：57所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：64所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：70所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(18)(10D1_c87、10D1_c93)包含以下FR的VH区域：
具有SEQ ID NO：52所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：56所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：65所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：70所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(19)(10D1_c89)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：53所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：59所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：66所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：71所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(20)(10D1_c90)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：54所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：59所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID No：67所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：71所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(21)(10D1_c91)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：53所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：59所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID No：68所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID No：72所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(22)(10A6)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：161所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：162所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID No：163所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID No：73所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(23)(4-35-B2)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：131所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：132所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID No：133所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID No：134所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(24)(4-35-B4)包含以下FR的VH区：
具有SEQ ID NO：147所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：148所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID No：149所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID No：73所示氨基酸序列的HC-FR4，
或其变体，其中一个或多个HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3或HC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含含有上述(1)至(10)中任一的CDR和上述(11)至(24)中任一的FR的VH区。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含下述(25)至(41)中任一的VH区：
(25)包含(1)所述的CDR和(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)或(21)所述的FR的VH区。
(26)包含(2)所述的CDR和(11)所述的FR的VH区。
(27)包含(2)所述的CDR和(12)所述的FR的VH区。
(28)包含(2)所述的CDR和(13)所述的FR的VH区。
(29)包含(2)所述的CDR和(14)所述的FR的VH区。
(30)包含(2)所述的CDR和(15)所述的FR的VH区。
(31)包含(2)所述的CDR和(18)所述的FR的VH区。
(32)包含(3)所述的CDR和(16)所述的FR的VH区。
(33)包含(3)所述的CDR和(17)所述的FR的VH区。
(34)包含(4)所述的CDR和(17)所述的FR的VH区。
(35)包含(5)所述的CDR和(17)所述的FR的VH区。
(36)包含(6)所述的CDR和(19)所述的FR的VH区。
(37)包含(6)所述的CDR和(20)所述的FR的VH区。
(38)包含(7)所述的CDR和(21)所述的FR的VH区。
(39)包含(8)所述的CDR和(22)所述的FR的VH区。
(40)包含(9)所述的CDR和(23)所述的FR的VH区。
(41)包含(10)所述的CDR和(24)所述的FR的VH区。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含下述(42)至(61)中任一的VH区：
(42)VH区，其包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(43)VH区，其包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(44)VH区，其包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(45)VH区，其包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(46)VH区，其包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(47)VH区，其包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(48)VH区，其包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(49)VH区，包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(50)VH区，其包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(51)VH区，其包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(52)VH区，包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(53)VH区，其包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(54)VH区，其包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(55)VH区，包含与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(56)VH区，其包含与SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(57)VH区，其包含与SEQ ID NO：39的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(58)VH区，其包含与SEQ ID NO：40的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(59)VH区，其包含与SEQ ID NO：127的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(60)VH区，其包含与SEQ ID NO：143的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(61)VH区，其包含与SEQ ID NO：157的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含下述(62)至(71)中任一的VL区：
(62)(衍生的10D1)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：94所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：99所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(63)(10D1、10D1_c75、10D1_c78v1、10D1_c78v2、10D1_11B、10D1_c87、10D1_c89、10D1_c91、10D1_c93)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(64)(10D1_c76)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：89所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(65)(10D1_c77)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：90所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：96所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(66)(10D1_c85v1、10D1_c85v2、10D1_c85o1、10D1_c85o2)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：93所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(67)(10D1_c90)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：97所示氨基酸序列的LC-CDR3；
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(68)(10D1_c92)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：98所示氨基酸序列的LC-CDR3；和
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(69)(10A6)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：165所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：166所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：167所示氨基酸序列的LC-CDR3；和
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(70)(4-35-B2)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：136所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：137所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：138所示氨基酸序列的LC-CDR3；和
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(71)(4-35-B4)包含以下CDR的VL区：
具有SEQ ID NO：151所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：152所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：153所示氨基酸序列的LC-CDR3；和
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含下述(72)至(86)中任一的VL区：
(72)(10D1)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：106所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：113所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：123所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：126所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(73)(10D1_c75)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：100所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：107所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：114所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：124所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(74)(10D1_c76)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：101所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：108所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：115所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：124所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(75)(10D1_c77)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：102所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：108所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：116所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：124所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(76)(10D1_c78v1、10D1_c78v2、10D1_11B)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：103所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：108所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：117所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：124所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(77)(10D1_c85v1、10D1_c85v2、10D1_c85o1、10D1_c85o2)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：103所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：108所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：118所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：124所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(78)(10D1_c87)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：103所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：109所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：119所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：124所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(79)(10D1_c89)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：104所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：110所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：120所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：125所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(80)(10D1_c90)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：105所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：110所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：121所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：124所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(81)(10D1_c91)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：104所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：111所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：122所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：125所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(82)(10D1_c92)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：100所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：112所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：114所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：124所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(83)(10D1_c93)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：103所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：108所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：119所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：124所示氨基酸序列的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(84)(10A6)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：168所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：169所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：170所示氨基酸的LC-FR3
具有SEQ ID NO：142所示氨基酸的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(85)(4-35-B2)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：139所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：140所示氨基酸的LC-FR2
具有SEQ ID NO：141所示氨基酸的LC-FR3
具有SEQ ID NO：142所示氨基酸的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2，LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
(86)(4-35-B4)包含以下FR的VL区：
具有SEQ ID NO：154所示氨基酸的LC-FR1
具有SEQ ID NO：155所示氨基酸的LC-FR2
具有SEQ ID NO：156所示氨基酸的LC-FR3
具有SEQ ID NO：142所示氨基酸的LC-FR4，
或其变体，其中一个或多个LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3或LC-FR4中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含含有(62)至(71)中所述任一的CDR和上述(72)至(86)中所述任一的FR的VL区。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含下述(87)至(102)中任一的VL区：
(87)包含(62)所述的CDR和(72)、(73)、(74)、(75)、(76)、(77)、(78)、(79)、(80)、(81)或(83)所述的FR的VL区。
(88)包含(63)所述的CDR和(72)所述的FR的VL区。
(89)包含(63)所述的CDR和(73)所述的FR的VL区。
(90)包含(63)所述的CDR和(76)所述的FR的VL区。
(91)包含(63)所述的CDR和(78)所述的FR的VL区。
(92)包含(63)所述的CDR和(79)所述的FR的VL区。
(93)包含(63)所述的CDR和(81)所述的FR的VL区。
(94)包含(63)所述的CDR和(83)所述的FR的VL区。
(95)包含(64)所述的CDR和(74)所述的FR的VL区。
(96)包含(65)所述的CDR和(75)所述的FR的VL区。
(97)包含(66)所述的CDR和(77)所述的FR的VL区。
(98)包含(67)所述的CDR和(80)所述的FR的VL区。
(99)包含(68)所述的CDR和(82)所述的FR的VL区。
(100)包含(69)所述的CDR和(84)所述的FR的VL区。
(101)包含(70)所述的CDR和(85)所述的FR的VL区。
(102)包含(71)所述的CDR和(86)所述的FR的VL区。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含下述(103)至(119)中任一的VL区：
(103)VL区，其包含与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(104)VL区，其包含与SEQ ID NO：75的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(105)VL区，其包含与SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(106)VL区，其包含与SEQ ID NO：77的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(107)VL区，其包含与SEQ ID NO：78的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(108)VL区，其包含与SEQ ID NO：79的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(109)VL区，其包含与SEQ ID NO：80的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(110)VL区，其包含与SEQ ID NO：81的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(111)VL区，其包含与SEQ ID NO：82的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(112)VL区，其包含与SEQ ID NO：83的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(113)VL区，其包含与SEQ ID NO：84的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(114)VL区，其包含与SEQ ID NO：85的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(115)VL区，其包含与SEQ ID NO：86的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(116)VL区，其包含与SEQ ID NO：87的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(117)VL区，其包含与SEQ ID NO：135的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(118)VL区，其包含与SEQ ID NO：150的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
(119)VL区，其包含与SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有至少70％序列相同性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含上述(1)至(61)中任一所述的VH区和上述(62)至(119)中任一所述的VL区。
在一个或多个氨基酸被另一氨基酸取代的本发明实施方式中，所述取代可以是保守性取代，例如根据下表所示。在一些实施方式中，中间列中相同区块中的氨基酸被取代。在一些实施方式中，最右边一列中同一行中的氨基酸被取代：
Figure BDA0002803704420000381
在一些实施方式中，取代在功能上可以是保守的。即，在一些实施方式中，与等效的未取代分子相比，取代可能不影响(或可能基本上不影响)包含取代的抗原结合分子的一种或多种功能特性(例如靶标结合)。
抗体的抗原结合区的VH和VL区共同构成Fv区。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含结合HER3的Fv区或由其组成。在一些实施方式中，Fv的VH和VL区作为通过接头区连接的单个多肽，即单链Fv(scFv)提供。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含免疫球蛋白重链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方式中，免疫球蛋白重链恒定序列是或衍生自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM的重链恒定序列。
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定序列是人免疫球蛋白G1恒定(序列)(IGHG1；UniProt:P01857-1,v1；SEQ ID NO:171)。SEQ ID NO：171的1至98位形成CH1区(SEQID NO：172)。SEQ ID NO：171的99至110位形成CH1和CH2区之间的铰链区(SEQ ID NO：173)。SEQ ID NO：171的111至223位形成CH2区(SEQ ID NO：174)。SEQ ID NO：171的224至330位形成CH3区(SEQ ID NO：175)。
使用pFUSE-CHIg-hG1制备示例性抗原结合分子，其在CH3区域中包含取代D356E，L358M(根据EU编号作编号的位置)。pFUSE-CHIg-hG1编码的CH3区的氨基酸序列示于SEQ IDNO：176中。应当理解，按照对本文所述的抗原结合分子的Fc区的修饰，可以为CH3区提供进一步的取代。
在一些实施方式中，CH1区包含或由以下序列构成：SEQ ID NO：172所示序列或与SEQ ID NO：172所示氨基酸序列具有至少60％，优选至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的序列。在一些实施方式中，CH1-CH2铰链区包含或由以下序列构成：SEQID NO：173所示序列或与SEQ ID NO：173的氨基酸序列具有至少60％，优选至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的序列。在一些实施方式中，CH2区包含或由以下序列构成：SEQ ID NO：174所示序列，或与SEQ ID NO：174的氨基酸序列具有至少60％，优选至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的序列。在一些实施方式中，CH3区包含或由以下序列构成：SEQ ID NO：175或176所示序列或与SEQ ID NO：175或176所示氨基酸序列具有至少60％，优选至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的序列。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含免疫球蛋白轻链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方式中，免疫球蛋白轻链恒定序列是人免疫球蛋白κ恒定(IGKC；Cκ；UniProt：P01834-1，v2；SEQ ID NO：177)。在一些实施方式中，免疫球蛋白轻链恒定序列是人免疫球蛋白λ恒定(IGLC；Cλ)，例如IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6或IGLC7。在一些实施方式中，CL区包含或由以下序列构成：SEQ ID NO：177所示序列或与SEQ ID NO：177的氨基酸序列具有至少60％，优选至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的序列。
抗体的抗原结合区的VL和轻链恒定(CL)区，以及VH区和重链恒定1(CH1)区共同构成Fab区。在一些实施方式中，抗原结合分子包含含有VH、CH1、VL和CL(例如Cκ或Cλ)的Fab区。在一些实施方式中，Fab区包含含有VH和CH1的多肽(例如VH-CH1融合多肽)和包含VL和CL的多肽(例如VL-CL融合多肽)。在一些实施方式中，Fab区包含含有VH和CL的多肽(例如VH-CL融合多肽)和包含VL和CH的多肽(例如VL-CH1融合多肽)；即，在一些实施方式中，Fab区是CrossFab区。在一些实施方式中，Fab或CrossFab的VH、CH1、VL和CL区以通过接头区连接的单个多肽的形式提供，即作为单链Fab(scFab)或单链CrossFab(scCrossFab)。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含结合HER3的Fab区或由该Fab区构成。
在一些实施方式中，本文所述的抗原结合分子包含结合HER3的完整抗体或由该抗体构成。本文所用的“完整抗体”是指结构基本上类似于免疫球蛋白(Ig)的结构的抗体。不同类的免疫球蛋白和它们的结构描述于，例如Schroeder和Cavacini J Allergy ClinImmunol.(2010)125(202):S41-S52，该文献通过引用全文纳入本文。
G型免疫球蛋白(即IgG)是～150kDa的糖蛋白，其包含两个重链和两个轻链。从N末端到C末端，重链包含VH，其后是包含三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)的重链恒定区，类似地，轻链包含VL，随后是CL。取决于重链，免疫球蛋白可以分类为IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM。轻链可以是kappa(κ)或lambda(λ)。
在一些实施方式中，本文所述的抗原结合分子包含结合HER3的IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM或由它们构成。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与HER3至少单价结合。结合价是指抗原结合分子中对于给定抗原决定簇的结合位点数。因此，在一些实施方式中，抗原结合分子包含至少一个结合HER3的位点。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含多于一个结合HER3的位点，例如2、3或4个结合位点。结合位点可以相同或不同。在一些实施方式中，抗原结合分子相对于HER3是例如，二价、三价或四价的。
本发明一些方面涉及多特异性抗原结合分子。“多特异性”是指抗原结合分子显示出与一个以上靶标的特异性结合。在一些实施方式中，抗原结合分子是双特异性抗原结合分子。在一些实施方式中，抗原结合分子包含至少两个不同的抗原结合结构域(即，至少两个抗原结合结构域，例如包含不同的VH和VL)。
在一些实施方式中，抗原结合分子与HER3和另一个靶标结合(例如，不同于HER3的抗原)，因此至少是双特异性的。术语“双特异性”是指抗原结合分子能够特异性结合至少两个不同的抗原决定簇。
应当理解，本发明的抗原结合分子(例如，多特异性抗原结合分子)包含能够与抗原结合分子的特异性靶标结合的抗原结合分子。例如，能够结合HER3和HER3以外的抗原的抗原结合分子可包括：(i)能够与HER3结合的抗原结合分子，和(ii)能够结合HER3以外的抗原的抗原结合分子。
还应当理解，本发明的抗原结合分子(例如，多特异性抗原结合分子)可以包含能够结合抗原结合分子的特异性靶标的抗原结合多肽或抗原结合多肽复合物。例如，本发明的抗原结合分子可以包含例如(i)能够结合HER3的抗原结合多肽复合物，其包含轻链多肽(包含VL-CL结构)和重链多肽(包含VH-CH1-CH2-CH3结构)，和(ii)能够结合HER3以外抗原的抗原结合多肽复合物，其包含轻链多肽(包含VL-CL结构)和重链多肽(包含VH-CH1-CH2-CH3结构)。
在一些实施方式中，可以将较大的抗原结合分子(例如，多特异性抗原结合分子)的组分抗原结合分子称为，例如该较大抗原结合分子的“抗原结合结构域”或“抗原结合区”。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含能够结合HER3的抗原结合分子和能够结合HER3以外的抗原的抗原结合分子。在一些实施方式中，除HER3以外的抗原是免疫细胞表面分子。在一些实施方式中，除HER3以外的抗原是癌细胞抗原。在一些实施方式中，除HER3以外的抗原是受体分子，例如细胞表面受体。在一些实施方式中，除HER3以外的抗原是细胞信号分子，例如细胞因子、趋化因子、干扰素、白介素或淋巴因子。在一些实施方式中，除HER3以外的抗原是生长因子或激素。
癌细胞抗原是由癌细胞表达或过表达的抗原。癌细胞抗原可以是任何肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。癌细胞抗原的表达可能与癌症有关。癌细胞抗原可以由癌细胞异常表达(例如，癌细胞表达的抗原的定位异常)，或者可以由癌细胞表达的结构异常。癌细胞抗原可能能够引发免疫反应。在一些实施方式中，抗原在癌细胞的细胞表面表达(即，癌细胞抗原是癌细胞表面抗原)。在一些实施方式中，与本文所述的抗原结合分子结合的抗原部分展示在癌细胞的外表面上(即，是胞外的)。癌细胞抗原可以是癌症相关抗原。在一些实施方式中，癌细胞抗原是其表达与癌症的产生、进展或症状严重性相关的抗原。癌症相关抗原可以与癌症的原因或病理相关，或者可以因癌症而异常表达。在一些实施方式中，与例如相当的非癌细胞(例如，源自相同组织/细胞类型的非癌细胞)的表达水平相比，癌细胞抗原是其表达被癌细胞上调(例如在RNA和/或蛋白质水平上)的抗原。在一些实施方式中，癌症相关抗原可以由癌细胞优先表达，而不由相当的非癌细胞(例如，衍生自相同组织/细胞类型的非癌细胞)表达。在一些实施方式中，癌症相关抗原可以是突变的癌基因或突变的抑癌基因的产物。在一些实施方式中，与癌症相关的抗原可以是过度表达的细胞蛋白的产物、由致癌病毒产生的癌症抗原、癌胚抗原或细胞表面糖脂或糖蛋白。
在一些实施方式中，除HER3以外的抗原是由HER3相关的癌细胞表达的抗原。与HER3相关的癌症可以是表达HER3的癌症(例如在细胞表面表达HER3蛋白)；这样的癌症可以称为“HER3阳性”癌症。HER3相关的癌症包括HER3基因/蛋白的表达是癌症发生、发展、进展或症状的严重性和/或转移的严重危险因子，和/或与之呈正相关的癌症。HER3相关的癌症包括Zhang等，生物化学与生物物理学报(2016)48(1)：39-48和Sithanandam和AndersonCancer Gene Ther(2008)15(7)：413-448中所述的，通过引用将其全部内容合并于此。在一些实施方式中，与HER3相关的癌症可以是肺癌(例如NSCLC)、黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌或口腔癌。
免疫细胞表面分子可以是在免疫细胞的细胞表面处或细胞表面上表达的任何肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。在一些实施方式中，与本发明的抗原结合分子结合的免疫细胞表面分子的部分在免疫细胞的外表面上(即，胞外)。免疫细胞表面分子可以在任何免疫细胞的细胞表面表达。在一些实施方式中，免疫细胞可以是造血来源的细胞，例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞或单核细胞。淋巴细胞可以是，例如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞或先天性淋巴样细胞(ILC)或其前体(例如胸腺细胞或B前细胞)。在一些实施方式中，免疫细胞表面分子可以是共刺激分子(例如，CD28、OX40、4-1BB、ICOS或CD27)或其配体。在一些实施方式中，免疫细胞表面分子可以是检查点分子(例如PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA、TIGIT或BTLA)或其配体。
可以以任何合适的形式提供本发明的多特异性抗原结合分子，例如在Brinkmann和Kontermann MAbs(2017)9(2)：182-212中所述及的那些形式，其通过引用整体并入本文。合适的形式包括Brinkmann和Kontermann MAbs(2017)9(2):182-212的图2中所示那些：抗体偶联物，例如IgG2、F(ab’)2或CovX抗体；IgG或IgG样分子，例如IgG、嵌合IgG、κλ-体通用HC；CH1/CL融合蛋白，例如scFv2-CH1/CL、VHH2-CH1/CL；“仅可变域”双特异性抗原结合分子，例如串联scFv(taFV)、三抗体、双抗体(Db)、dsDb、Db(kih)、DART、scDB、dsFv-dsFv、tandAb、三头抗体(triple heads)、串联dAb/VHH、四价dAb.VHH；非Ig融合蛋白，例如scFv2-白蛋白、scDb-白蛋白、taFv-白蛋白、taFv-毒素、微抗体、DNL-Fab2、DNL-Fab2-scFv、DNL-Fab2-IgG-细胞因子2、ImmTAC(TCR-scFv)；修饰的Fc和CH3融合蛋白，例如scFv-Fc(kih)、scFv-Fc(CH3电荷配对)、scFv-Fc(EW-RVT)、scFv-fc(HA-TF)、scFv-Fc(SEED体)、taFv-Fc(kih)、scFv-Fc(kih)-Fv、Fab-Fc(kih)-scFv、Fab-scFv-Fc(kih)、Fab-scFv-Fc(BEAT)、Fab-scFv-Fc(SEED体)、DART-Fc、scFv-CH3(kih)、TriFabs；Fc融合体，例如双抗体、scDb-Fc、taFv-Fc、scFv-Fc-scFv、HCAb-VHH、Fab-scFv-Fc、scFv4-Ig、scFv2-Fcab；CH3融合体，例如双抗体、scDb-CH3；IgE/IgM CH2融合体，例如scFv-EHD2-scFv、scFvMHD2-scFv；Fab融合蛋白，例如Fab-scFv(双抗体)、Fab-scFv2(三抗体)、Fab-Fv、Fab-dsFv、Fab-VHH、正交Fab-Fab；非Ig融合蛋白，例如DNL-Fab3、DNL-Fab2-scFv、DNL-Fab2-IgG-细胞因子2；不对称IgG或IgG样分子，例如IgG(kih)、IgG(kih)通用LC、ZW1 IgG通用LC、Biclonics通用LC、CrossMab、CrossMab(kih)、scFab-IgG(kih)、Fab-scFab-IgG(kih)、正交Fab IgG(kih)、DuetMab、CH3电荷配对+CH1/CL电荷配对、铰链/CH3电荷配对、SEED抗体、双特异性抗体(Duobody)、四合一CrossMab(kih)、LUZ-Y通用LC；LUZ-Y scFab-IgG、FcFc*；附加的和Fc修饰的IgG，例如IgG(kih)-Fv、IgG HA-TF-Fv、IgG(kih)scFab、scFab-Fc(kih)-scFv2、scFab-Fc(kih)-scFv、半DVD-Ig、DVI-Ig(四合一)、CrossMab-Fab；修饰的Fc和CH3融合蛋白，例如Fab-Fc(kih)-scFv、Fab-scFv-Fc(kih)、Fab-scFv-Fc(BEAT)、Fab-scFv-Fc-SEED抗体、三Fab(TriFab)；附加的IgG-HC融合体，例如IgG-HC、scFv、IgG-dAb、IgG-taFV、IgG-CrossFab、IgG-正交Fab、IgG-(CαCβ)Fab、scFv-HC-IgG、串联Fab-IgG(正交Fab)Fab-IgG(CαCβFab)、Fab-IgG(CR3)、Fab-绞链-IgG(CR3)；附加的IgG-LC融合体，例如IgG-scFv(LC)、scFv(LC)-IgG、dAb-IgG；附加的IgG-HC和LC融合体，例如DVD-Ig、TVD-Ig、CODV-Ig、scFv4-IgG、Zy体(Zybody)；Fc融合体，例如Fab-scFv-Fc、scFv4-Ig；F(ab’)2融合体，例如F(ab’)2-scFv2；CH1/CL融合蛋白，例如scFv2-CH1-铰链/CL；修饰的IgG，例如DAF(二合一IgG)、DutaMab、Mab2；和非Ig融合体，例如DNL-Fab4-IgG。
技术人员能够设计和制备双特异性抗原结合分子。产生双特异性抗原结合分子的方法包括化学交联抗原结合分子或抗体片段与，例如可还原的二硫键或不可还原的硫醚键，例如Segal和Bast,2001.“双特异性抗原结合分子的产生”(Production of BispecificAntigen-binding molecules)，《免疫学最新方法》(Current Protocols in Immunology).14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16中所述，该文献通过引用全文纳入本文。例如，可利用N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)，经由铰链区SH-基团化学交联，例如Fab片段，从而产生二硫键连接的双特异性F(ab)2异二聚体。
产生双特异性抗原结合分子的其它方法包括将产生抗体的杂交瘤与，例如聚乙二醇融合，以制备能够分泌双特异性抗体的四瘤细胞(quadroma cell)，例如D.M.和Bast,B.J.2001.“双特异性抗原结合分子的产生”(Production of Bispecific Antigen-binding molecules)，《免疫学最新方法》(Current Protocols in Immunology).14：IV：2.13：2.13.1–2.13.16。
本发明的双特异性抗原结合分子也可以通过表达，例如编码抗原结合分子的多肽的核酸构建物来重组产生，例如《抗体工程：方法和方案》(Antibody Engineering:Methodsand Protocols),第二版(休氏出版社-Humana Press,2012),第40章:“双特异性抗原结合分子的产生：二抗体和串联scFv”(Production of Bispecific Antigen-bindingmolecules:Diabodies and Tandem scFv)(Hornig和
Figure BDA0002803704420000441
-Schwarz),或French,“如何制备双特异性抗原结合分子”(How to make bispecific antigen-binding molecules),Methods Mol.Med.2000；40:333-339中所述，其全部内容通过引用纳入本文。例如，可以通过分子克隆技术制备编码两个抗原结合片段的轻链和重链可变域(即，能够结合HER3的抗原结合片段的轻链和重链可变域，和能够结合另一靶蛋白的抗原结合片段的轻链和重链可变域)并包括在抗原结合片段之间编码合适的接头或二聚结构域的序列的DNA构建物。然后，可以通过在合适的宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中表达(例如体外)该构建物来产生重组双特异性抗体，然后可以任选纯化表达的重组双特异性抗体。
Fc区
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区。
在IgG、IgA和IgD同种型中，Fc区由一个多肽的CH2和CH3区以及另一个多肽的CH2和CH3区组成。来自两个多肽的CH2和CH3区一起形成Fc区。在IgM和IgE同种型中，Fc区包含三个恒定结构域(CH2、CH3和CH4)，并且来自两个多肽的CH2至CH4一起形成Fc区。
在本公开的各个方面的优选实施方式中，Fc区包含两个多肽，每个多肽包含CH2区和CH3区。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，该Fc区在一个或多个CH2和CH3区中包含促进Fc区结合的修饰。重组共表达抗原结合分子的组成多肽和随后的结合导致了几种可能的组合。为提高重组生产中，抗原结合分子中所需多肽组合的产率，宜在Fc区中引入促进重链多肽的所需组合结合的修饰。修饰可以促进，例如不同多肽链的CH2和/或CH3区域之间的疏水和/或静电相互作用。合适的修饰在例如Ha等.,Front.Immnol(2016)7:394中所述及，其全部内容通过引用纳入本文。
在一些实施方式中，本发明的抗原-抗原结合分子包含Fc区，在Fc区的CH3区中包含以下形式之一的成对取代，如Ha等.,Front.Immnol(2016)7:394的表1中所示：KiH、KiHs-s、HA-TF、ZW1、7.8.60、DD-KK、EW-RVT、EW-RVTs-s、SEED或A107。
在一些实施方式中，Fc区包含“旋钮入孔”或“KiH”修饰，例如US 7,695,936和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中所述。在此类实施方式中，Fc区的CH3区之一包含“旋钮”修饰，而另一个CH3区包含“孔”修饰。“旋钮”和“孔”修饰位于各自的CH3区内，使得“旋钮”可位于“孔”中，从而促进多肽的异二聚化(和抑制同二聚化)和/或稳定异二聚体。通过将具有小(侧)链的氨基酸替换为具有较大侧链的氨基酸(例如酪氨酸或色氨酸)来构建旋钮。通过将具有大侧链的氨基酸替换为具有较小侧链的氨基酸(例如丙氨酸或苏氨酸)来产生孔。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子的Fc区的CH3区之一包含取代(本文中，Fc、CH2和CH3区中的位置/取代的编号根据Kabat等.,《免疫学有意义的蛋白的序列》“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,第5版.公共卫生服务,国立卫生研究院,贝塞斯达,马里兰州,1991所述的EU编号系统)T366W，Fc区的另一CH3区包含取代Y407V。在一些实施方式中，抗原结合分子的Fc区的CH3区之一包含取代T366W，而Fc区的另一CH3区包含取代T366S和L368A。在一些实施方式中，抗原结合分子的Fc区的CH3区之一包含取代T366W，并且Fc区的另一CH3区包含取代Y407V、T366S和L368A。
在一些实施方式中，Fc区包含，例如WO2014/131694A1中所述的“DD-KK”修饰。在一些实施方式中，CH3区之一包含取代K392D和K409D，而Fc区的另一CH3区包含取代E356K和D399K。所述修饰促进CH3区域之间的静电相互作用。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含如Labrijn等.,美国科学学院学报.(2013)110(13):5145-50中所述修饰的Fc区，称为“双特异性抗体(Duobody)”形式。在一些实施方式中，CH3区之一包含取代K409R，而Fc区的另一CH3区包含取代K405L。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含如Strop等.,JMol Biol.(2012)420(3):204-19中所述的“EEE-RRR”修饰。在一些实施方式中，CH3区之一包含取代D221E、P228E和L368E，并且Fc区的另一CH3区包含取代D221R、P228R和K409R。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含如Choi等.,MolCancer Ther(2013)12(12):2748–59中所述的“EW-RVT”修饰。在一些实施方式中，CH3区之一包含取代K360E和K409W，并且Fc区的另一CH3区包含取代Q347R、D399V和F405T。
在一些实施方式中，CH3区之一包含取代S354C，并且Fc区的另一CH3区包含取代Y349C。引入这些半胱氨酸残基导致在Fc区的两个CH3区之间形成二硫桥，从而进一步稳定异二聚体(Carter(2001),J Immunol Methods 248,7-15)。
在一些实施方式中，Fc区包含“KiH S-S”修饰。在一些实施方式中，CH3区之一包含取代T366W和S354C，并且Fc区的另一CH3区包含取代T366S、L368A、Y407V和Y349C。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含如Davis等,Protein Eng Des Sel(2010)23(4):195-202中所述的“SEED”修饰，其中人IgG1CH3和IgACH3的β-区段互换。
在一些实施方式中，CH3区之一包含取代S364H和F405A，并且Fc区的另一CH3区包含取代Y349T和T394F(参见例如Moore等.,MAbs(2011)3(6):546-57)。
在一些实施方式中，CH3区之一包含取代T350V、L351Y、F405A和Y407V，并且Fc区的另一CH3区包含取代T350V、T366L、K392L和T394W(参见例如Von Kreudenstein等.,MAbs(2013)5(5):646-54)。
在一些实施方式中，CH3区之一包含取代K360D、D399M和Y407A，并且Fc区的另一CH3区包含取代E345R、Q347R、T366V和K409V(参见例如Leaver-Fay等.,Structure(2016)24(4):641-51)。
在一些实施方式中，CH3区之一包含取代K370E和K409W，并且Fc区的另一CH3区包含取代E357N、D399V和F405T(参见例如Choi等.,PLoS One(2015)10(12):e0145349)。
Fc介导的功能包括Fc受体结合、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)，膜攻击复合物(MAC)的形成、细胞脱粒、细胞因子和/或趋化因子的产生，以及抗原的加工和呈递。
本领域中，影响Fc介导的功能的抗体Fc区的修饰是已知的，例如在Wang等，蛋白细胞(2018)9(1)：63-73中述及，其通过引用整体并入本文。Wang等，蛋白细胞(2018)9(1)：63-73的表1中总结了已知的影响抗体效应子功能的示例性Fc区修饰。
取代的组合F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L在Stavenhagen等，癌症研究，(2007)中进行了描述，以增加与FcγRIIIa的结合作用，从而增强ADCC作用。在Lazar等，美国化学会志.(2006)103:4005–4010中描述了取代的组合S239D/I332E或S239D/I332E/A330L，以增加与FcγRIIIa的结合作用，从而增加ADCC作用。还描述了取代S239D/I332E/A330L的组合可减少与FcγRIIb的结合作用，从而增加ADCC作用。在Shields等，J BiolChem.(2001)276：6591–6604中描述了取代的组合S298A/E333A/K334A，以增加与FcγRIIIa的结合作用，从而增加ADCC作用。在Mimoto等，MAbs.(2013):5:229–236中描述了一条重链中的取代组合L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A，以及另一条重链中的取代组合D270E/K326D/A330M/K334E，以增加与FcγRIIIa的结合作用，从而增加ADCC作用。取代的组合G236A/S239D/I332E在Richards等，Mol Cancer Ther(2008)7:2517–2527中述及，以增加与FcγRIIa的结合作用并增加与FcγRIIIa的结合作用，从而增加ADCP作用。
取代的组合K326W/E333S在Idusogie等,J Immunol.(2001)166(4):2571-5中述及，以增加与C1q的结合作用，从而增加CDC作用。取代的组合S267E/H268F/S324T在Moore等,MAbs.(2010)2(2):181-9中述及，以增加与C1q的结合作用，从而增加CDC作用。取代组合在Natsume等，癌症研究,(2008)68(10)：3863-72中报道，以增加与C1q的结合作用，从而增加CDC作用。取代的组合E345R/E430G/S440Y在Diebolder等,科学(2014)343(6176)：1260-3中述及，以增加六聚化作用，从而增加CDC作用。
取代的组合M252Y/S254T/T256E在DallAcqua等,J Immunol.(2002)169：5171–5180中述及，以增加在pH 6.0时与FcRn的结合作用，从而延长抗原结合分子的半衰期.替代组合M428L/N434在Zalevsky等,Nat Biotechnol.(2010)28：157-159中述及，以增加在pH6.0时与FcRn的结合作用，从而延长抗原结合分子的半衰期。
当重链恒定区/Fc区/CH2-CH3区/CH2区/CH3区被描述为包含“对应”参考位置/取代的位置/取代时，考虑了在同源重链恒定区/Fc区/CH2-CH3区/CH2区/CH3区中的等同位置/取代。
当Fc区被描述为包含特定位置/取代时，该位置/取代可以存在于一起形成Fc区多肽链的一条或两条中。
除非另有说明，否则本文中的位置是指根据EU编号系统编号的人免疫球蛋白恒定区氨基酸序列的位置，如Kabat等，《免疫学有意义的蛋白的序列》“Sequences of Proteinsof Immunological Interest”,第5版.公共卫生服务,国立卫生研究院,贝塞斯达,马里兰州(1991)。举例说明，人IgG1中L242C和K334C的取代分别对应于如SEQ ID NO：171所示人IgG1恒定区的125位上的L>C取代，和217位上的K>C取代。
同源重链恒定区是这样的重链恒定区，其包含的氨基酸序列与人IgG1的重链恒定区(即，SEQ ID NO：171所示的氨基酸序列)具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性。同源Fc区是多肽构成的Fc区，所述多肽包含的氨基酸序列与人IgG1的CH2-CH3区域(即，SEQ ID NO：174和175所示的氨基酸序列)具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性。同源CH2区是这样的CH2区，其包含的氨基酸序列与人IgG1(即，SEQ ID NO：174中所示的氨基酸序列)具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性。同源CH3区是这样的CH3区，其包含的氨基酸序列与人IgG1(即，SEQ ID NO：175所示的氨基酸序列)的CH3区具有至少60％，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性。
与人类IgG1中识别的相应位置可以通过序列比对来识别，例如使用ClustalOmega等序列比对软件(
Figure BDA0002803704420000481
J.2005，Bioinformatics 21，951-960)。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含修饰以增加Fc介导的功能。在一些实施方式中，Fc区包含修饰以增加ADCC作用。在一些实施方式中，Fc区包含修饰以增加ADCP作用。在一些实施方式中，Fc区包含修饰以增加CDC作用。与包含相应的未修饰Fc区的抗原结合分子相比，包含Fc区修饰的抗原结合分子，以增强Fc介导的功能(例如ADCC，ADCP，CDC)，诱导更高的相关效应子功能水平。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含修饰以增加对一种或多种Fc受体(例如FcγRIIa，FcγRIIIa)的亲和力。增加对Fc受体的亲和力的修饰可以增加Fc介导的效应子功能，例如抗体-依赖的细胞毒性(ADCC)和/或抗体-依赖的细胞吞噬作用(ADCP)。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含降低对C1q亲和力的修饰，这种降低补体-依赖的细胞毒性(CDC)的修饰是理想的。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，其包含增加六聚体形成的修饰。能够增加一个或多个Fc受体亲和力、降低C1q亲和力和/或增加六聚体形成的Fc区修饰，在例如，Saxena和Wu的Front Immunol.(2016)7：580中述及，其全部内容通过引用合并于此。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，其Fc区包含的CH2/CH3包含在Saxena和Wu的FrontImmunol.(2016)7:580的表1中所示的一种或多种取代。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc，该Fc包含增加与Fc受体结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含增加与Fcγ受体结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含增加与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb中的一个或多个的结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含增加与FcγRIIIa的结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含增加与FcγRIIa的结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含增加与FcγRIIb的结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含增加与FcRn的结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含增加与补体蛋白的结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含增加或减少与C1q的结合的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含促进抗原结合分子的六聚化的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含增加抗原结合分子的半衰期的修饰。在一些实施方式中，Fc区包含增加共接合的修饰。
在本说明书中，“Fcγ受体”可以来自任何物种，并且包括来自任何物种的同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。类似地，“FcγRI”、“FcγRIIa”、“FcγRIIb”、“FcγRIIc”、“FcγRIIIa”和“FcγRIIIb”分别指任何物种的FcγRI/FcγRIIa/FcγRIIb/FcγRIIc/FcγRIIIa/FcγRIIIb，包括来自任何物种的同种型、片段、变体(包括突变体)或同源物。人类具有六类不同的Fcγ受体(小鼠直系同源物显示在括号中)：FcγRI(mFcγRI)、FcγRIIa(mFcγRIII)、FcγRIIb(mFcγRIIb)、FcγRIIc、FcγRIIIa(mFcγRIV)和FcγRIIIb。
变体Fcγ受体包括例如：人FcγRIIIa的158V和158F多形体，以及人FcγRIIa的167H和167R多形体。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，所述Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区或包含CH2-CH3区的多肽)下述的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7或8)：C在对应于242位的位置；C在对应于334位的位置；A在对应于236位的位置；D在对应于239位的位置；E在对应于332位的位置；L在对应于330位的位置；K在对应于345位的位置处；G在对应于430位的位置。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含Fc区，所述Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区或包含CH2-CH3区的多肽)下述取代(或相应的取代)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7或8)：L242C、K334C、G236A、S239D、I332E、A330L、E345K和E430G。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，所述Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于242位的位置处的C。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于334位的位置处的C。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于242位的位置处的C和在对应于334位的位置处的C。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，所述Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于236位的位置处的A。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于239位的位置处的D。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于236位的位置处的A，和对应于239位的位置处的D。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，所述Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于332位的位置处的E。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于236位的位置处的A，对应于239位的位置处的D，以及对应于332位的位置处的E。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于330位的位置处的L。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于236位的位置处的A，对应于239位的位置处的E，以及对应于330位的位置处的L。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于345位的位置处的K。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于430位的位置处的G。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于345位的位置处的K，对应于430位的位置处的G。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于242位的位置处的C,对应于334位的位置处的C,对应于236位的位置处的A,对应于239位的位置处的D。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于242位的位置处的C,对应于334位的位置处的C,对应于236位的位置处的A,对应于239位的位置处的D，对应于332位的位置处的E。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区或CH2区的多肽)对应于242位的位置处的C,对应于334位的位置处的C,对应于236位的位置处的A,对应于239位的位置处的D，对应于332位的位置处的E，对应于330位的位置处的L。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，或包含CH2-CH3区的多肽)对应于242位的位置处的C,对应于334位的位置处的C,对应于345位的位置处的K,对应于430位的位置处的G。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH2-CH3区或CH2区的多肽)L242C取代(或等效取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH2-CH3区或CH2区的多肽)K334C取代(或等效取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH2-CH3区或CH2区的多肽)L242C取代(或等效取代)和K334C取代(或等效取代)。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH2-CH3区或CH2区的多肽)G236A取代(或等效取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH2-CH3区或CH2区的多肽)S239D取代(或等效取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH2-CH3区或CH2区的多肽)G236A取代(或等效取代)和S239D取代(或等效取代)。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH2-CH3区或CH2区的多肽)I332E取代(或等效取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH2-CH3区或CH2区的多肽)G236A取代(或等同取代)，S239D取代(或等效取代)和I332E取代(或等效取代)。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH2-CH3区或CH2区的多肽)A330L取代(或等效取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH2-CH3区或CH2区的多肽)G236A取代(或等效取代)，S239D取代(或等效取代)，I332E取代(或等效取代)和A330L取代(或等效取代)。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH3-CH3区或CH3区的多肽)E345K取代(或等效取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH3-CH3区或CH3区的多肽)E430G取代(或等效取代)。在一些实施方式中，Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH3-CH3区或CH2区的多肽)E345K取代(或等效取代)和E430G取代(或等效取代)。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH3-CH3区或CH2区的多肽)L242C取代(或等效取代)、K334C取代(或等效取代)、G236A取代(或等效取代)和S239D取代(或等效取代)。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH3-CH3区或CH2区的多肽)L242C取代(或等效取代)、K334C取代(或等效取代)、G236A取代(或等效取代)、S239D取代(或等效取代)和I332E取代(或等效取代)。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH3-CH3区或CH2区的多肽)L242C取代(或等效取代)，K334C取代(或等效取代)，G236A取代(或等效取代)，S239D取代(或等效取代)，I332E取代(或等效取代)和A330L取代(或等效取代)。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，所述Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH3-CH3区的多肽)L242C取代(或等效取代)，K334C取代(或等效取代)，E345K取代(或等效取代)和E430G取代(或等效取代)。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH3-CH3区的多肽)下述的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)：L在243位对应的位置，P在292位对应的位置，L在300位对应的位置，I在305位对应的位置，L在396位对应的位置；D在239位对应的位置，E在332位对应的位置；D在239位对应的位置，E在332位对应的位置，L在330位对应的位置；A在298位对应的位置，A在333位对应的位置，A在334位对应的位置；Y在234位对应的位置，Q在235位对应的，W在236位对应的位置，M在239位对应的位置，D在268位对应的位置，E在270位对应的位置，A在298位对应的位置；E在270位对应的位置，D在326位对应的位置，M在330位对应的位置，E在334位对应的位置；A在236位对应的位置，D在239位对应的位置，E在332位对应的位置；W在326位对应的位置，S在333位对应的位置；E在267位对应的位置，F在268位对应的位置，T在324位对应的位置；R在345位对应的位置，G在430位对应的位置，Y在440位对应的位置；Y在252位对应的位置，T在254位对应的位置，E在256位对应的位置；L在428位对应的位置，S在434位对应的位置。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含Fc区，该Fc区包含(例如，包含一种或多种包含重链恒定区，CH3-CH3区的多肽)下述一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)取代(或相应的取代)的组合：F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L；S239D/I332E；S239D/I332E/A330L；S298A/E333A/K334A；L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A；D270E/K326D/A330M/K334E；G236A/S239D/I332E；K326W/E333S；S267E/H268F/S324T；E345R/E430G/S440Y；M252Y/S254T/T256E；和M428L/N434S。
多肽
本发明还提供了抗原结合分子的多肽成分。多肽可以以分离或基本上纯化的形式提供。
本发明的抗原结合分子可以是或可以包含多肽的复合物。
在本说明书中，多肽包含一个以上结构域或区域的，应理解，多个结构域/区域优选存在于同一多肽链中。即，包含一个以上结构域或区域的多肽是包含结构域/区域的融合多肽。
在一些实施方式中，根据本发明的多肽包含本文所述的VH或由其组成。在一些实施方式中，根据本发明的多肽包含本文所述的VL或由其组成。
在一些实施方式中，多肽另外包含一个或多个抗体重链恒定区(CH)。在一些实施方式中，该多肽另外包含一个或多个抗体轻链恒定区(CL)。在一些实施方式中，该多肽包含免疫球蛋白(Ig)的CH1、CH2区和/或CH3区。
在一些实施方式中，多肽包含免疫球蛋白重链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方式中，该多肽包含如本文所述的CH1区。在一些实施方式中，该多肽包含如本文所述的CH1-CH2铰链区。在一些实施方式中，多肽包含如本文所述的CH2区。在一些实施方式中，该多肽包含如本文所述的CH3区。在一些实施方式中，该多肽包含如本文所述的CH2-CH3区。
在一些实施方式中，该多肽包含CH3区，该CH3区包含以下任一氨基酸取代/氨基酸取代的组合(例如在Ha等，Front Immnol(2016)7：394的表1中所示，通过引用并入上文)：T366W；T366S、L368A和Y407V；T366W和S354C；T366S、L368A、Y407V和Y349C；S364H和F405A；Y349T和T394F；T350V、L351Y，F405A和Y407V；T350V，T366L，K392L和T394W；K360D、D399M和Y407A；E345R、Q347R、T366V和K409V；K409D和K392D；D399K和E356K；K360E和K409W；Q347R，D399V和F405T；K360E、K409W和Y349C；Q347R、D399V、F405T和S354C；K370E和K409W；以及E357N、D399V和F405T。
在一些实施方式中，多肽的CH2和/或CH3区包含一个或多个氨基酸取代，用于促进多肽与包含CH2和/或CH3区的另一种多肽缔合。
在一些实施方式中，多肽包含免疫球蛋白轻链恒定序列的一个或多个区域。在一些实施方式中，多肽包含本文所述的CL区。
在一些实施方式中，本发明的多肽从N末端到C末端包含以下结构之一：
(i)VH
(ii)VL
(iii)VH-CH1
(iv)VL-CL
(v)VL-CH1
(vi)VH-CL
(vii)VH-CH1-CH2-CH3
(viii)VL-CL-CH2-CH3
(ix)VL-CH1-CH2-CH3
(x)VH-CL-CH2-CH3
本发明还提供了由本发明的多肽组成的抗原结合分子。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含以下多肽组合之一：
(A)VH+VL
(B)VH-CH1+VL-CL
(C)VL-CH1+VH-CL
(D)VH-CH1-CH2-CH3+VL-CL
(E)VH-CL-CH2-CH3+VL-CH1
(F)VL-CH1-CH2-CH3+VH-CL
(G)VL-CL-CH2-CH3+VH-CH1
(H)VH-CH1-CH2-CH3+VL-CL-CH2-CH3
(I)VH-CL-CH2-CH3+VL-CH1-CH2-CH3
在一些实施方式中，抗原结合分子包含以上(A)至(I)中所示的多肽组合中的一种以上。举例来说，参考上文(D)，在一些实施方式中，抗原结合分子包含两个含有结构VH-CH1-CH2-CH3的多肽，和两个含有结构VL-CL的多肽。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子包含以下多肽组合之一：
(J)VH(抗HER3)+VL(抗HER3)
(K)VH(抗HER3)-CH1+VL(抗HER3)-CL
(L)VL(抗-HER3)-CH1+VH(抗-HER3)-CL
(M)VH(抗HER3)-CH1-CH2-CH3+VL(抗HER3)-CL
(N)VH(抗HER3)-CL-CH2-CH3+VL(抗HER3)-CH1
(O)VL(抗-HER3)-CH1-CH2-CH3+VH(抗-HER3)-CL
(P)VL(抗-HER3)-CL-CH2-CH3+VH(抗-HER3)-CH1
(Q)VH(抗-HER3)-CH1-CH2-CH3+VL(抗-HER3)-CL-CH2-CH3
(R)VH(抗-HER3)-CL-CH2-CH3+VL(抗-HER3)-CH1-CH2-CH3
其中：“VH(抗-HER3)”是指如本文所述，能够结合HER3的抗原结合分子的VH，如(1)至(61)之一所定义；“VL(抗HER3)”是指是指如本文所述，能够结合HER3的抗原结合分子的VL，如(62)至(119)之一所定义。
在一些实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO：187至223之一所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列构成。
接头和额外的序列
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子和多肽包含铰链区。在一些实施例中，在CH1区域和CH2区域之间提供铰链区域。在一些实施例中，在CL区域和CH2区域之间提供铰链区域。在一些实施方式中，铰链区包含与SEQ ID NO：173的氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子和多肽在氨基酸序列之间包含一个或多个接头序列。可以在抗原结合分子/多肽的VH、VL、CH1-CH2铰链区、CH2区和CH3区中的一个或多个的一端或两端提供接头序列。
接头序列是技术人员已知的，并且描述于例如Chen等.,Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10):1357-1369，其通过引用全文纳入本文。在一些实施方式中，接头序列可以是柔性接头序列。柔性接头序列使得通过接头序列连接的氨基酸序列相对运动。柔性接头是技术人员已知的，在Chen等.,Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10):1357-1369中鉴定了几种。柔性接头序列通常包含高比例的甘氨酸和/或丝氨酸残基。
在一些实施方式中，接头序列包含至少一个甘氨酸残基和/或至少一个丝氨酸残基。在一些实施方式中，接头序列由甘氨酸和丝氨酸残基组成。在一些实施方式中，接头序列长度为1-2、1-3、1-4、1-5或1-10个氨基酸。
本发明的抗原结合分子和多肽可以额外包含其它氨基酸或氨基酸序列。例如，所述抗原结合分子和多肽可以包含一条或多条氨基酸序列，以促进抗原结合分子/多肽的表达、折叠、运输、加工、纯化或检测。例如，所述抗原结合分子/多肽可以在该抗原结合分子/多肽的N-或C-末端任选包含编码His(例如6Xhis)、Myc、GST、MBP、FLAG、HA、E或生物素标签的序列。在一些实施方式中，所述抗原结合分子/多肽包含可检测部分，例如荧光、发光、可免疫检测、放射、化学、核酸或酶标记物。
本发明的抗原结合分子和多肽可以额外包含信号肽(也称为前导序列或信号序列)。信号肽通常由5-30个疏水性氨基酸的序列组成，形成单个α螺旋。分泌的蛋白质和在细胞表面表达的蛋白质通常包含信号肽。
信号肽可以存在于抗原结合分子/多肽的N末端，并且可以存在于新合成的抗原结合分子/多肽中。信号肽提供了抗原结合分子/多肽的有效运输和分泌。信号肽通常通过切割去除，因此不包含在从表达抗原结合分子/多肽的细胞分泌的成熟抗原结合分子/多肽中。
许多蛋白的信号肽是已知的，并且记录在诸如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白信息资源(Protein Information Resource)、蛋白数据库(Protein DataBank)、Ensembl和InterPro等数据库中，和/或可以被识别/预测，例如采用诸如SignalP(Petersen等.,2011自然方法8:785-786)或Signal-BLAST(Frank和Sippl,2008生物信息学24:2172-2176)等氨基酸序列分析工具。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子/多肽的信号肽包含与SEQ ID NO：178至186之一的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列构成。
标记物和偶联物
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子额外包含可检测标记物。
在一些实施方式中，所述抗原结合分子包含可检测部分，例如荧光标记物、磷光标记物、发光标记物、免疫可检测标记物(例如表位标签)、放射性标记物、化学、核酸或酶标记物。可以用可检测部分共价或非共价标记所述抗原结合分子。
荧光标记物包括，例如荧光素、罗丹明、别藻蓝蛋白、曙红和NDB、稀土的绿色荧光蛋白(GFP)、例如铕(Eu)、铽(Tb)和钐(Sm)螯合物、四甲基罗丹明、德克萨斯红、4-甲基伞形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、Cy3和Cy5。荧光标记物包括，例如荧光素、罗丹明、别藻蓝蛋白、曙红和NDB、稀土的绿色荧光蛋白(GFP)、例如铕(Eu)、铽(Tb)和钐(Sm)螯合物、四甲基罗丹明、德克萨斯红、4-甲基伞形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、Cy3和Cy5。放射性标记物包括放射性同位素、例如碘123、碘125、碘126、碘131、碘133、溴77、锝99m、铟111、铟113m、镓67、镓68、钌95、钌97、钌103、钌105、汞207、汞203、铼99m、铼101、铼105、钪47、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、铜67、氟18、钇90、钯100、铋217和锑211。发光标记物包括放射性发光、化学发光(例如吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺)和生物发光标记物。免疫可检测标记物包括半抗原、肽/多肽、抗体、受体和配体，例如生物素、亲和素、链霉亲和素或洋地黄毒苷。核酸标记包括适体。酶标记物包括例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、beta-半乳糖苷酶和萤光素酶。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与化学部分偶联。化学部分可以是用于提供治疗作用的部分。化学部分可以是用于提供治疗作用的部分。抗体-药物偶联物在Parslow等.,生物医药.2016年9月；4(3):14中综述。在一些实施方式中，化学部分可以是药物部分(例如细胞毒性剂)。在一些实施方式中，药物部分可以是化疗剂。在一些实施方式中，药物部分选自卡奇霉素、DM1、DM4、单甲基奥他汀E(MMAE)、单甲基奥他汀F(MMAF)、SN-38、阿霉素、杜卡霉素(duocarmycin)、D6.5和PBD。
抗原结合分子的具体示范性实施方式
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:187所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:188所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:189所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:190所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:191所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:192所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:193所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:195所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:194所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:195所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:196所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:195所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:197所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:199所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:198所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:199所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:200所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:201所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:202所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:203所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:204所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:205所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:206所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:207所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:208所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:209所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:210所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:211所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:212所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:213所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:214所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:215所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:216所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:217所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:218所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:219所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:220所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:221所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:222所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:223所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:225所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:207所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:226所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:207所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:227所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:217所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
在一些实施方式中，抗原结合分子包含或由以下多肽组成：
(i)两条多肽,包含或由与SEQ ID NO:228所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成；和
(ii)两条多肽，包含或由与SEQ ID NO:217所示氨基酸序列具有至少70％，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列相同性的氨基酸序列构成。
抗原结合分子的功能特性
参考某些功能特性表征本文所述的抗原结合分子。在一些实施方式中，本文所述的抗原结合分子可具有一种或多种以下特性：
与HER3结合(例如人、小鼠、大鼠或食蟹猕猴HER3)；
不与EGFR和/或HER2结合；
与表达HER3的细胞结合；
结合HER3细胞外区域的亚结构域II；
当HER3处于开放和闭合构象时与HER3结合；
独立于NRG与HER3结合；
不与MM-121和/或LJM-716竞争与HER3的结合；
不与M-05-74和/或M-08-11竞争与HER3的结合；
抑制HER3和HER3的互作伴侣之间的相互作用(例如HER3、HER2、EGFR、HER4、HGFR、IGF1R和/或cMet)；
抑制HER3介导的信号传导；
抑制表达HER3的细胞增殖(例如响应NRG刺激)；
抑制表达HER3的细胞的PI3K/AKT/mTOR和/或MAPK信号传导(例如响应NRG刺激)；
与活化的Fcγ受体(例如FcγRIIIa)结合；
与激活性Fcγ受体的结合增加；
与具有由SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，与活化性Fcγ受体的结合增加；
与具有由SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，与抑制性Fcγ受体的结合降低；
与具有由SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，与抑制性Fcγ受体相比，与活化性Fcγ受体的结合增加；
与具有由SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，与补体蛋白(例如C1q)的结合增加或减少；
与具有由SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，六聚合增加；
与具有由SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，ADCC活性增加；
与具有由SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，ADCP活性增加；
与具有由SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，CDC活性增加或降低；
与具有由SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等效抗原结合分子相比，热稳定性相似或增加；
增加表达HER3的细胞的杀伤力；
减少表达HER3的细胞的数量/比例；和
抑制体内癌症的发展和/或进展。
本文所述的抗原结合分子优选显示出对HER3的特异性结合。本文所用的“特异性结合”是指对抗原具有选择性的结合，并且可以与对非靶标抗原的非特异性结合相区分。相比于结合其它非靶标分子，特异性结合靶分子的抗原结合分子优选结合靶标的亲和力更大和/或持续时间更长。
给定多肽特异性结合给定分子的能力可以根据本领域已知的方法，通过分析来确定，例如通过ELISA、表面等离振子共振(SPR；参见例如Hearty等.,Methods Mol Biol(2012)907:411-442)、生物层干涉法(参见例如Lad等.,(2015)J Biomol Screen 20(4):498-507)、流式细胞仪或通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)、酶联免疫吸附测定。通过这种分析，可以测量和定量与给定分子的结合。在一些实施方式中，结合可以是在给定测定中检测到的应答。
在一些实施方式中，抗原结合分子与非靶标分子的结合程度小于抗体与靶标分子的结合程度的约10％，例如通过ELISA、SPR、生物层干涉或RIA所测定的。或者，结合特异性可以反映为结合亲和力，其中抗原结合分子结合解离常数(KD)比抗原结合分子对非靶标分子的KD大至少0.1个数量级(即0.1×10n，其中n为代表数量级的整数)。这可以任选地是至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0之一。
在一些实施方式中，抗原结合分子显示出与人HER3、小鼠HER3、大鼠HER3和/或食蟹猕猴(猕猴)HER3的结合。即，在一些实施方式中，抗原结合分子对人HER3、小鼠HER3、大鼠HER3和/或食蟹猕猴HER3具有交叉反应性。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子显示与非人灵长类动物的HER3的交叉反应性。模型物种中与HER3的交叉反应性允许在体内探索同源模型的有效性，而不依赖替代分子。
在一些实施方式中，抗原结合分子结合人HER3、小鼠HER3、大鼠HER3和/或食蟹猕猴HER3；并且不与HER2和/或EGFR(例如人HER2和/或人EGFR)结合。
在一些实施方式中，抗原结合分子不表现出与EGFR(例如人EGFR)的特异性结合。在一些实施方式中，抗原结合分子不显示与HER2(例如人HER2)的特异性结合。在一些实施方式中，抗原结合分子不显示与除HER3以外的EGFR蛋白家族成员的特异性结合(即不与之交叉反应)。在一些实施方式中，抗原结合分子不显示与EGFR、HER2和/或HER4的特异性结合。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子结合HER3(例如人HER3)的KD为10μM或更低，优选≤5μM、≤2μM、≤1μM、≤500nM、≤400nM、≤300nM、≤200nM、≤100nM、≤95nM、≤90nM、≤85nM、≤80nM、≤75nM、≤70nM、≤65nM、≤60nM、≤55nM、≤50nM、≤45nM、≤40nM、≤35nM、≤30nM、≤25nM、≤20nM、≤15nM、≤12.5nM、≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤4nM≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤900pM、≤800pM、≤700pM、≤600pM、≤500pM、≤400pM、≤300pM、≤200pM、≤100pM、≤90pM、≤80pM、≤70pM、≤60pM、≤50pM、≤40pM、≤30pM、≤20pM、≤10pM、≤9pM、≤8pM、≤7pM、≤6pM、≤5pM、≤4pM、≤3pM、≤2pM、≤1pM之一。
本发明的抗原结合分子可以结合至HER3的特定目的区域。根据本发明的抗原结合分子的抗原结合区可结合HER3的线性表位，所述HER3的线性表位由氨基酸的连续序列(即氨基酸一级序列)组成。在一些实施方式中，抗原结合分子可以结合由氨基酸序列的氨基酸的不连续序列组成的HER3的构象表位。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子结合HER3。在一些实施方式中，抗原结合分子结合至HER3的细胞外区域(例如，SEQ ID NO：9所示的区域)。在一些实施方式中，抗原结合分子与HER3的细胞外区域的亚结构域II(例如，SEQ ID NO：16所示的区域)结合。
在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：229所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：229所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：230和231所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：230和231所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：230所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：230所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：231所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：231所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：23所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：23所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ ID NO：21所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：21所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子结合SEQ ID NO：19所示的HER3区域。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：19所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子与SEQ IDNO：22所示的HER3区域结合。在一些实施方式中，抗原结合分子接触SEQ ID NO：22所示的HER3区域的一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：1、3、4、6或8之一所示氨基酸序列或由其组成的多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或由其组成的多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：16所示氨基酸序列或由其组成的多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：229所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：230和231所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：230所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：231所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：23所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：21所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合包含SEQ ID NO：22所示氨基酸序列或由其组成的肽/多肽。
在一些实施方式中，抗原结合分子不结合对应于SEQ ID NO：1的260至279位的HER3区域。在一些实施方式中，抗原结合分子不接触对应于SEQ ID NO：1的260至279位的HER3区域的氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子不结合SEQ ID NO：23所示的HER3区域。在一些实施方式中，抗原结合分子不接触SEQ ID NO：23所示的HER3区域的氨基酸残基。在一些实施方式中，抗原结合分子不能够结合由对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中260至279位的氨基酸序列组成的肽。在一些实施方式中，抗原结合分子不能结合由SEQID NO：23所示氨基酸序列组成的肽。
本文所用的“肽”是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸单体的链肽的长度通常在约2至50个氨基酸的范围内。“多肽”是两个或多个肽的聚合物链。多肽的长度通常大于约50个氨基酸。
抗原结合分子结合给定肽/多肽的能力可以通过本领域技术人员熟知的方法来分析，包括通过ELISA、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)、免疫沉淀、表面等离振子共振和生物层干涉术进行分析。
配体与HER3的结合会促进构象变化，使HER3变为同型或异型二聚体，从而激活下游途径。HER3展示了“封闭”和“开放”构象。闭合构象是指HER3处于束缚构象，并且不能用于受体同二聚或异二聚。开放构象是指HER3处于延伸构象，可用于受体同二聚或异二聚。
在一些实施方式中，当HER3处于开放构象时，抗原结合分子能够结合HER3。在一些实施方式中，当HER3处于闭合构象时，抗原结合分子能够结合HER3。在一些实施方式中，当HER3处于开放和/或闭合构象时，抗原结合分子能够与HER3结合。在一些实施方式中，当HER3处于开放和/或闭合构象时，抗原结合分子能够结合HER3胞外域。在一些实施方式中，当HER3处于开放和/或闭合构象时，抗原结合分子能够结合HER3二聚臂。与二聚臂的结合使得抗原结合分子能够防止HER3和HER3的互作伴侣之间的相互作用，例如本文所述。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够在有和/或没有HER3配体存在下结合HER3。在一些实施方式中，抗原结合分子能够独立于HER3的配体结合HER3。在一些实施方式中，配体是NRG、NRG-1和/或NRG-2。HER3通过配体与其细胞外结构域的结合而激活，从而促进构象变化，使HER3变为同型或异型二聚体。独立于配体结合的抗原结合分子与HER3的结合使抗原结合分子在缺乏配体和存在配体的构象状态下均能抑制HER3的作用。在一些实施方式中，抗原结合分子不与配体结合HER3竞争。在一些实施方式中，抗原结合分子在配体结合位点不结合HER3。
在某些实施方式中，抗原结合分子能够结合HER3的相同区域，或HER3的重叠区域，与某抗体结合的HER3区域结合，所述抗体包含以下任一克隆的VH和VL序列：10D1_c75、10D1_c76、10D1_c77、10D1_c78v1、10D1_c78v2、10D1_11B，10D1_c85v1、10D1_c85v2、10D1_c85o1、10D1_c85o2、10D1_c87、10D1_c-A9、4D1_c1，a9-A，89D，1D1_c1，a9-A，89D，1D1_c1，c4、10D1_c1，c4、10D1_c92、10D1_c92、10D1_c93、10A6、4-35-B2或4-35-B4。在某些实施方式中，抗原结合分子能够与HER3的相同区域或HER3的重叠区域结合，所述结合HER3的区域被包含选自以下任一克隆的VH和VL序列的抗体结合：10D1_c89、10D1_c90或10D1_c91。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合HER3的相同区域或HER3的重叠区域，所述HER3区域被含有克隆10D1_c89的VH和VL序列的抗体结合。
抗体结合的肽/多肽的区域可以由技术人员使用本领域众所周知的各种方法确定，包括抗体-抗原复合物的X射线共晶体分析、肽扫描、诱变作图、质谱的氢-氘交换分析，噬菌体展示、竞争ELISA和基于蛋白水解的“保护”方法。这样的方法在例如：Gershoni等，生物药，2007，21(3)：145-156中描述，其通过引用整体并入本文。这样的方法也可以用于确定抗原结合分子是否能够结合不同构象的蛋白质。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子在包含抗HER3抗体克隆MM-121的VH和VL序列的抗体中，不与HER3的相同区域或HER3的重叠区域结合(例如在Schoeberl等，Sci.Signal.(2009)2(77)：ra31中述及)和/或LJM-716(在例如Garner等，癌症研究(2013)73：6024-6035中述及)。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与包含抗HER3抗体克隆MM-121和/或LJM-716的VH和VL序列的抗体不竞争结合HER3，例如由SPR分析确定。
在一些实施方式中，当HER3在细胞表面(即在细胞膜或在细胞膜表面)表达时，本发明的抗原结合分子在抗原结合分子(即细胞外抗原结合分子)可接近的区域中与HER3结合。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合在表达HER3细胞的细胞表面表达的HER3。在一些实施方式中，抗原结合分子能够结合表达HER3的细胞(例如HER3+细胞，例如HER3+癌细胞)。
抗原结合分子结合给定细胞类型的能力可以通过使细胞与抗原结合分子接触，并检测结合到细胞上的抗原结合分子来分析，例如在洗涤步骤之后，去除未结合的抗原结合分子。抗原结合分子结合表达免疫细胞表面分子的细胞和/或表达癌细胞抗原的细胞的能力可以通过流式细胞术和免疫荧光显微镜等方法进行分析。
本发明的抗原结合分子可以是HER3的拮抗剂。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制由HER3和/或HER3的结合伴侣(例如HER3(即在同型二聚化的情况下)、HER2、EGFR、HER4、HGFR、IGF1R和/或cMet)介导的功能或过程(例如互作、信号传导或其他活性)。在此，“抑制”是指相对于对照条件的降低、减少或减弱。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够抑制HER3与HER3的互作伴侣之间的相互作用。HER3的互作伴侣可以由与HER3相同的细胞表达。互作伴侣或HER3可以在细胞表面(即在细胞膜中或在细胞膜处)表达。在一些实施方式中，HER3的互作伴侣可以是EGFR蛋白家族的成员，例如HER3、HER2、EGFR、HER4、HGFR、IGF1R和/或cMet。在一些实施方式中，HER3的互作伴侣可以是IGF1R和/或cMet。HER3与HER3的互作伴侣之间的相互作用可能导致多肽复合物的形成。HER3与HER3的互作伴侣之间的相互作用形成多肽复合物可称为多聚化。在多肽单体之间存在多聚的情况下，多聚可称为二聚。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3单体之间的相互作用。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3和HER2之间的相互作用。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3和EGFR之间的相互作用。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3和HER4之间的相互作用。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3和HGFR之间的相互作用。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3和IGF1R之间的相互作用。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3和cMet之间的相互作用。
可以通过使抗原结合分子与HER3和HER3的互作伴侣之间的相互作用所需的HER3区域结合(例如，SEQ ID NO：19所示的HER3的二聚环)来实现相互作用的抑制。在一些实施方式中，抗原结合分子接触HER3和HER3的互作伴侣之间相互作用所必需的HER3的一个或多个残基；以这种方式，抗原结合分子使该区域不可用，从而抑制了相互作用。在一些实施方式中，抗原结合分子以抑制/阻止HER3与HER3的互作伴侣之间的相互作用的方式与HER3结合。在一些实施方式中，抗原结合分子抑制/阻止HER3的互作伴侣进入HER3与HER3的互作伴侣之间相互作用所需的HER3区域；可在抗原结合分子不接触HER3与HER3的互作伴侣之间的相互作用所需的HER3区域的情况下实现，例如，通过空间抑制HER3的互作伴侣进入HER3和互作伴侣之间相互作用所需的HER3区域实现。
在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3单体的同二聚。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3和HER2之间的二聚化。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3和EGFR之间的二聚化。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3和HER4之间的二聚化。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3和HGFR之间的二聚化。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3和IGF1R之间的二聚化。在一些实施方式中，抗原结合分子能够抑制HER3和cMet之间的二聚化。
抗原结合分子抑制两种因子之间相互作用的能力可以通过，例如分析在抗体/片段存在或与其中一个或两个相互作用伴侣孵育后的相互作用来确定。用于确定给定的抗原结合分子是否能够抑制两个相互作用伴侣之间相互作用的测定包括竞争性ELISA测定和SPR分析。在一些实施方式中，抗原结合分子是HER3与HER3的互作伴侣之间相互作用的竞争性抑制剂。
在一些实施方式中，在合适的测定中，，本发明的抗原结合分子能够将HER3与HER3的互作伴侣(例如HER3、HER2、EGFR、HER4、HGFR、IGF1R和/或cMet)之间的相互作用抑制到没有抗原结合分子存在下(或者在有适当的对照抗原结合分子存在下)HER3与HER3的互作伴侣之间的相互作用的至少小于1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
抗原结合分子抑制互作伴侣之间相互作用的能力也可以通过分析这种相互作用的下游功能后果来确定。例如，HER3与HER3的相互作用伴侣之间相互作用的下游功能后果包括PI3K/AKT/mTOR和/或MAPK信号传导。例如，抗原结合分子抑制HER3与HER3的相互作用伴侣的相互作用的能力可以通过在抗原结合存在下用NRG分子处理分析PI3K/AKT/mTOR和/或MAPK信号传导来确定。可以通过，例如能够检测信号转导通路磷酸化成员的抗体检测和量化PI3K/AKT/mTOR和/或MAPK信号。
还可以通过在抗原结合分子存在下用NRG处理后，分析表达HER3的细胞的增殖来确定抗原结合分子抑制HER3和HER3相互作用伴侣的能力。细胞增殖可以通过，例如检测随时间变化的细胞数变化，或通过体外分析3H-胸苷的掺入或通过CFSE稀释测定，例如在Fulcher和Wong，免疫细胞生物(1999)77(6)：559-564中所述，在此全文引入作为参考。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够抑制具有向BRAF V600突变的细胞的增殖，例如包含BRAF V600E或V600K突变的细胞(参见实施例10)。
在一些实施方式中，抗原结合分子抑制HER3介导的信号传导。HER3介导的信号转导可以通过，例如使用HER3介导的信号相关因子的检测进行分析，例如PI3K/AKT/mTOR和/或MAPK信号转导途径的一种或多种信号转导分子的细胞增殖和/或磷酸化。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够抑制表达HER3的细胞的PI3K/AKT/mTOR和/或MAPK信号传导。PI3K/AKT/mTOR和/或MAPK信号传导的水平可以通过检测和定量PI3K/AKT/mTOR和/或MAPK途径的一种或多种组分的磷酸化水平来分析，例如，在NRG刺激后(参见实施例4.3)。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够抑制表达HER3的细胞的增殖，例如响应NRG的刺激。在一些实施方式中，在合适的测定中，本发明的抗原结合分子能够将表达HER3的细胞的增殖作用抑制到在没有抗原结合分子存在下(或者在有适当的对照抗原结合分子存在下)表达HER3的细胞的增殖水平的至少小于1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
在一些实施方式中，在合适的测定中，，本发明的抗原结合分子能够将表达HER3的细胞的PI3K/AKT/mTOR和/或MAPK信号传导抑制到没有抗原结合分子存在下(或者在有适当的对照抗原结合分子存在下)的表达HER3的细胞的信号水平的至少小于1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
HER3介导的信号传导可以在体外进行研究，例如如实施例8.9中所述，或在体内，例如如实施例11中所述。
ADCC活性可以通过，例如根据在Yamashita等，科学报告(2016)6：19772(通过引用全文并入本文)，或通过例如在Jedema等，血液(2004)103：2677–82(在此全文引入作为参考)中描述的方法分析。ADCC活性也可以按照制造商的说明，使用皮尔斯公司LDH细胞毒性测定试剂盒进行分析(如本文实施例5中所述)。
ADCP可以通过，例如根据Kamen等，J Immunol(2017)198(1增刊)157.17(通过引用整体并入本文)中描述的方法分析。
诱导CDC的能力可以通过，例如使用C1q结合测定分析，例如Schlothauer等，蛋白质工程，设计和筛选(2016)，29(10)：457-466(在此全文引入作为参考)中所述的。
抗原结合分子的热稳定性可以通过本领域技术人员众所周知的方法来分析，包括例如在He等，J Pharm Sci.(2010)描述的差示扫描量热法和差示扫描量热法(DSC)，其通过引用整体并入本文。热稳定性可以用熔融温度(Tm)，展开温度或分解温度(例如以℃或F°表示)来反映。
在一些实施方式中，包含如本文所述Fc区的抗原结合分子结合Fcγ受体(例如，hFcγRIIa(例如，hFcγRIIa167H、hFcγRIIa167R)、hFcγRIIIa(例如，hFcγRIIIa158V、hFcγRIIIa158F)、mFcγRIV、mFcγIII的亲和力比含有SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的同等抗原结合分子结合激活Fcγ受体的亲和力大1倍，例如大2、3、4、5、6、7、8、9、10、15倍，或大20倍。在一些实施方式中，包含本文所述的Fc区的抗原结合分子结合活化性Fcγ受体的KD比含有SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等同抗原结合分子结合激活Fcγ受体的KD小1倍，例如小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06倍，或小0.05倍。
在一些实施方式中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子结合活化性Fcγ受体(例如hFcγRIIa(例如hFcγRIIa167H、hFcγRIIa167R)，hFcγRIIIa(例如hFcγRIIIa158V、hFcγRIIIa158F)、mFcγRIV、mFcγRIII)的KD小于或等于1000nM，优选≤500nM、≤100nM、≤75nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM、≤15nM、≤12.5nM、≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM或≤1nM之一。
在一些实施方式中，包含如本文所述Fc区的抗原结合分子结合FcRn(例如，hFcRn、mFcRn)的亲和力比含有SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等同抗原结合分子结合FcRn的亲和力大1倍，例如大2、3、4、5、6、7、8、9、10、15倍，或大20倍。在一些实施方式中，包含如本文所述Fc区的抗原结合分子结合FcRn的KD比含有SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等同抗原结合分子结合FcRn的KD小1倍，例如小0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06倍，或小0.05倍。
在一些实施方式中，包含本文所述的Fc区的抗原结合分子结合FcRn(例如hFcRn，mFcRn)的KD为1000nM，或更小，优选≤500nM、≤100nM、≤75nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM、≤15nM、≤12.5nM、≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM或≤1nM。
在一些实施方式中，包含本文所述的Fc区的抗原结合分子结合抑制性Fcγ受体(例如hFcγRIIb，mFcγRIIb)的亲和力比含有SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等同抗原结合分子结合抑制性Fcγ受体的亲和力小1倍，例如小0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2倍，或小0.1倍。在一些实施方式中，包含本文所述的Fc区结合抑制性Fcγ受体的抗原结合分子的KD比含有SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等同抗原结合分子抑制性Fcγ受体的KD大1倍，例如大2、3、4、5、6、7、8、9倍，或大10倍。
在一些实施方式中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子结合抑制性Fcγ受体(例如hFcγRIIbmFcγRIIb)的KD为1nM或更大，优选≥5nM、≥10nM、≥50nM、≥100nM、≥500nM、≥1000nM、≥2000nM、≥3000nM、≥4000nM或≥5000nM之一。
在一些实施方式中，包含如本文所述Fc区的抗原结合分子，相对于抑制性Fcγ受体(例如hFcγRIIb)，结合活化性Fcγ受体(例如hFcγRIIa)的选择性比含有SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等同抗原结合分子的结合选择性大1倍，例如大2、3、4、5、6、7、8、9、10、15倍，或大20倍。
在一些实施方式中，包含如本文所述的Fc区的抗原结合分子显示出的ADCC比含有SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等同抗原结合分子的ADCC大1倍，例如大2、3、4、5、6、7、8、9、10、15倍，或大20倍。
在一些实施方式中，包含如本文所述Fc区的抗原结合分子，在ADCC活性的测定中确定的EC50(ng/ml)比含有SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等同抗原结合分子的EC50(ng/ml)小1倍，例如小0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2倍，或小0.1倍。
在一些实施方式中，包含如本文所述Fc区的抗原结合分子，在ADCC活性的测定中确定的EC50(ng/ml)小于500ng/ml或更低，优选≤400ng/ml、≤300ng/ml、≤200ng/ml、≤100ng/ml、≤90ng/ml、≤80ng/ml、≤70ng/ml、≤60ng/ml、≤50ng/ml、≤40ng/ml、≤30ng/ml、≤20ng/ml或≤10ng/ml之一。
在一些实施方式中，包含本文所述的Fc区的抗原结合分子的解链温度、伸展温度或分解温度可比含有SEQ ID NO：174-175所示氨基酸序列的CH2-CH3组成的Fc区的等同抗原结合分子的解链温度、伸展温度或分解温度≥0.75倍和≤1.25倍，例如≥0.8倍和≤1.2倍、≥0.85倍和≤1.15倍、≥0.9倍和≤1.1倍、≥0.91倍和≤1.09倍、≥0.92倍和≤1.08倍、≥0.93倍和≤1.07倍、≥0.94倍和≤1.06倍、≥0.95倍和≤1.05倍、≥0.96倍和≤1.04倍、≥0.97倍和≤1.03倍、≥0.98倍和≤1.02倍，或≥0.99倍和≤1.01倍。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够增加对表达HER3的细胞的杀伤作用。表达HER3的细胞的杀伤作用可通过抗原结合分子的效应子功能来增加。在抗原结合分子包含Fc区的实施方式中，抗原结合分子可以通过补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性中的一种或多种来增加对表达HER3的细胞的杀伤细胞吞噬作用(ADCP)。
与在适当的测定中，与无抗原结合分子的情况下(或在存在适当的对照抗原结合分子的情况下)检测到的细胞杀伤水平相比，在抗原结合分子存在或用HER3表达细胞孵育后，可通过观测表达HER3细胞的杀伤水平的提高来鉴定能够增加表达HER3细胞杀伤的抗原结合分子。CDC、ADCC和ADCP的测定是技术人员众所周知的。表达HER3的细胞的杀伤水平也可以通过在暴露于不同处理条件后测量存活和/或无存活的表达HER3的细胞的数目/比例来确定。
在一些实施方式中，与没有抗原结合分子的情况下观察到的杀伤水平(或在适当的对照抗原结合分子存在下)相比，本发明的抗原结合分子能够将表达HER3的细胞(例如表达HER3的癌细胞)的杀伤增加至多于1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥3倍、≥4倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍或≥10倍。
在一些实施方式中，在一个相当的实验中，与没有抗原结合分子的条件下孵育(或在有适当的抗原结合分子控制的条件下孵育)，检测到her3表达细胞(例如her3表达癌细胞)的数量相比，本发明的抗原结合分子能够将表达HER3的细胞(例如表达HER3的癌细胞)的数目减少至低于小于1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子体内抑制癌症的发展和/或进展。
在一些实施方式中，抗原结合分子引起癌细胞杀伤的提高，例如，通过效应免疫细胞。在一些实施方式中，抗原结合分子导致体内癌细胞数目的减少，例如，与适当的控制条件相比。在一些实施方式中，抗原结合分子抑制肿瘤生长，例如通过测量随时间变化的肿瘤大小/体积来确定。
本发明的抗原结合分子可在适当的体内模型中分析其抑制癌症发展和/或进展的能力，例如，细胞系衍生的异种移植模型。源自细胞系的异种移植模型可以源自表达HER3的癌细胞。在一些实施方式中，所述模型是N87细胞衍生的模型、SNU16细胞衍生的模型、FaDu细胞衍生的模型、OvCAR8细胞衍生的模型、HCC95细胞衍生的模型、A549细胞衍生的模型、ACHN细胞衍生的模型或HT29细胞衍生的模型。
癌症可以是本文所述的HER3相关癌症(即HER3基因/蛋白表达是癌症的发生、发展、进展或症状的严重程度和/或转移的危险因素，和/或与之呈正相关的癌症)。癌症可包含表达HER3的细胞。在一些实施方式中，癌症包括HER3+肿瘤。
在一些实施方式中，施用本发明的抗原结合分子可引起以下的一种或多种：抑制癌症的发展/进展、推迟/预防癌症的发作、减少/延迟/预防肿瘤的生长、减少/延迟/预防转移、减少癌症症状的严重程度、减少肿瘤细胞的数量、减少肿瘤大小/体积、和/或增加存活(如无进展存活)，例如，在一个适当表达HER-3的癌细胞系来源的移植瘤模型中测定。
在一些实施方式中，在表达HER-3的癌细胞系来源的移植瘤模型中，与未使用抗原结合分子治疗的情况下观察肿瘤生长(或在使用适当的阴性对照抗原结合分子治疗后)相比，本发明的抗原结合分子能够抑制肿瘤生长至小于1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍、≤0.05倍或≤0.01倍。
嵌合抗原受体(CARs)
本发明还提供了包含本发明的抗原结合分子或多肽的嵌合抗原受体(CARs)。
CAR是提供抗原结合和T细胞激活功能的重组受体。例如，在Dotti等，Immunol Rev(2014)257(1)中综述了CAR的结构和工程，其全部内容通过引用并入本文。CAR包含连接至细胞膜锚定区和信号传导区的抗原结合区。任选的绞链区可以在抗原结合区和细胞膜锚定区之间提供分隔作用，并且可用作柔性接头。
本发明的CAR包含抗原结合区，其包含本发明的抗原结合分子或由本发明的抗原结合分子组成，或包含本发明的多肽或由本发明的多肽组成。
细胞膜锚定区位于CAR的抗原结合区和信号传导区之间，用于将CAR锚定到表达CAR的细胞的细胞膜，其中抗原结合区位于胞外空间，而信号传导区在胞内。在一些实施方式中，CAR包含细胞膜锚定区，该细胞膜锚定区包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含CD3-ζ、CD4、CD8或CD28之一的跨膜区氨基酸序列组成或由其衍生。本文所用的“衍生自”参比氨基酸序列的区域包含与该相比序列具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的序列相同性的氨基酸序列。
CAR的信号传导区域可激活T细胞。CAR信号传导区域可以包含CD3-ζ的细胞内结构域的氨基酸序列，其提供基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，以供磷酸化和激活表达CAR的T细胞。包含其它含ITAM的蛋白，例如FcγRI的序列的信号区域也已用于CAR(Haynes等.,2001J Immunol 166(1):182-187)。CAR的信号传导区域还可包含衍生自共刺激分子的信号传导区域的共刺激序列，以促进表达CAR的T细胞在与靶蛋白结合后的活化。合适的共刺激分子包括CD28、OX40、4-1BB、ICOS和CD27。在某些情况下，将CAR工程改造以便共同刺激不同的胞内信号通路。例如，与CD28共刺激相关的信号传导优先激活磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)途径，而4-1BB介导的信号传导则是通过TNF受体相关因子(TRAF)衔接蛋白。因此，CAR的信号传导区域有时包含源自一个以上共刺激分子的信号传导区域的共刺激序列。在一些实施方式中，本发明的CAR包含一个或多个共刺激序列，所述共刺激序列包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含以下一种或多种的胞内结构域的氨基酸序列，由这种氨基酸序列组成或衍生自这种氨基酸序列：CD28、OX40、4-1BB、ICOS和CD27。
任选的铰链区可以分隔抗原结合域和跨膜域，并且可以充当柔性接头。铰链区可以源自IgG1。在一些实施方式中，本发明的CAR包含的铰链区含有氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列包含IgG1的铰链区的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成，或衍生自这样的氨基酸序列。
还提供了包含本发明的CAR的细胞。本发明的CAR可以用于产生表达CAR的免疫细胞，例如CAR-T或CAR-NK细胞。可以在体外培养过程中将CAR工程改造成免疫细胞。可以在体外培养过程中将CAR工程改造成免疫细胞。
可以提供任何合适形式的本发明的CAR的抗原结合区域，例如scFv、scFab等。
核酸和载体
本发明提供了一种或多种编码本发明的抗原结合分子、多肽或CAR的核酸。
在一些实施方式中，核酸是，例如从其它核酸或天然生物材料中纯化或分离的。在一些实施方式中，一种或多种核酸包含DNA和/或RNA或由其组成。
本发明还提供了一种或多种载体，其包含本发明的一种或多种核酸。
核苷酸序列可以包含在载体，例如表达载体中。本文所用的“载体”是用作将外源核酸转移入细胞的运载体的核酸分子。载体可以是用于在细胞中表达核酸的载体。此类载体可以包括与编码待表达的序列的核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。载体还可以包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用于从本发明的载体表达肽或多肽。
术语“可操作地连接”可以包括这样的情况，其中选择的核酸序列和调节性核酸序列(例如启动子和/或增强子)的共价连接方式将核酸序列的表达置于调节序列的影响或控制下(从而形成表达盒)。因此，如果调控序列能够影响核酸序列的转录，则该调控序列可操作地连接至所选择的核酸序列。然后得到的转录本可以翻译成所需的肽/多肽。
合适的载体包括质粒、二元载体、DNA载体、mRNA载体、病毒载体(例如γ逆转录病毒载体(如鼠白血病病毒(MLV)-来源的载体)、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、痘苗病毒载体和疱疹病毒载体)，基于转座子的载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)。
在一些实施方式中，载体可以是真核载体，例如所述载体包含在真核细胞中从载体表达蛋白所必需的元件。在一些实施方式中，载体可以是哺乳动物载体，例如包含巨细胞病毒(CMV)或SV40启动子以驱动蛋白表达。
本发明的抗原结合分子的组成多肽可以由多种不同核酸编码，或由多种不同载体编码。
包含/表达抗原结合分子和多肽的细胞
本发明还提供了包含或表达根据本发明的抗原结合分子、多肽或CAR的细胞。还提供了包含或表达本发明的核酸、多种核酸、载体或多种载体的细胞。
该细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物可以是灵长类动物(恒河猴、食蟹猴、非人灵长类动物或人)或非人哺乳动物(例如家兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿动物(包括啮齿目中的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括牛，例如奶牛，或牛目的任何动物)、马(包括马目的任何动物)、驴和非人灵长类动物。
本发明还提供了一种产生细胞的方法，所述细胞包含本发明的一种或多种核酸或载体，包括将本发明的核酸、多种核酸，载体或多种载体导入细胞。在一些实施方式中，将本发明的一种或多种分离的核酸或载体引入细胞包括转化、转染、电穿孔或转导(例如逆转录病毒转导)。
本发明还提供了一种生产表达/包含本发明的抗原结合分子、多肽或CAR的细胞的方法，包括将本发明的核酸、多种核酸、载体或多种载体引入细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括在适于细胞表达一种或多种核酸或一种或多种载体的条件下培养细胞。在一些实施方式中，该方法是体外进行的。
本发明还提供通过本发明的方法获得或可获得的细胞。
产生抗原结合分子和多肽
可以根据技术人员已知的多肽生产方法来制备本发明的抗原结合分子和多肽。
可以通过化学合成，例如液相或固相合成来制备多肽。例如，可以采用例如在Chandrudu等.,Molecules(2013),18:4373-4388中描述的方法来合成肽/多肽，该文献通过引用全文纳入本文。
或者，可以通过重组表达产生抗原结合分子和多肽。适用于重组生产多肽的分子生物学技术是本领域熟知的，例如Green和Sambrook,《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)(第4版),冷泉港出版社,2012,和Nat Methods.(2008)5(2):135-146中提出的那些，两篇文献通过引用全文纳入本文。重组生产抗原结合分子的方法也描述于Frenzel等.,Front Immunol.(2013)；4:217以及Kunert和Reinhart,ApplMicrobiol Biotechnol.(2016)100:3451–3461，两者均以引用方式全文并入本文。
在某些情况下，本发明的抗原结合分子由多于一条的多肽链组成。在这种情况下，抗原结合分子的产生可以包括不止一条多肽的转录和翻译，以及随后的多肽链结合以形成抗原结合分子。
对于根据本发明的重组生产，可以使用适合于表达多肽的任何细胞。该细胞可以是原核生物或真核生物。在一些实施方式中，细胞是原核细胞，例如古细菌或细菌的细胞。在一些实施方式中，细菌可以是革兰氏阴性细菌，例如肠杆菌科的细菌，例如大肠杆菌。在一些实施方式中，细胞是真核细胞，例如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，例如CHO、HEK(如HEK293)、HeLa或COS细胞。在一些实施方式中，细胞是瞬时或稳定表达多肽的CHO细胞。
在某些情况下，该细胞不是原核细胞，因为某些原核细胞不允许与真核细胞相同的折叠或翻译后修饰。此外，真核生物中非常高的表达水平是可能的，并且使用适当的标签可以更容易地从真核生物中纯化蛋白。也可以使用增强蛋白向培养基中分泌的特定质粒。
在一些实施方式中，多肽可以通过无细胞蛋白合成(CFPS)，例如采用Zemella等.Chembiochem(2015)16(17)：2420-2431，其通过引用全文纳入本文。
生产可能涉及培养或发酵经过修饰以表达目的多肽的真核细胞。培养或发酵可在配备有适当养分，空气/氧气和/或生长因子的生物反应器中进行。分泌的蛋白可通过分离培养基/发酵液与细胞，提取蛋白内含物并分离各蛋白以分离分泌的多肽来收集。培养、发酵和分离技术是本领域技术人员熟知，并且描述于例如Green和Sambrook,《分子克隆：实验室手册》(第4版；通过引用纳入本文)。
生物反应器包括一个或多个可以在其中培养细胞的容器。生物反应器中的培养可以连续进行，其中反应物连续流入反应器，培养细胞连续流出反应器。或者，培养可以分批进行。生物反应器监测和控制环境条件，例如pH、氧气、进出容器的流速以及容器内的搅拌，从而为培养的细胞提供最佳条件。
培养表达抗原结合分子/多肽的细胞后，可以分离感兴趣的多肽。可以采用本领域已知的从细胞分离蛋白的任何合适方法。为了分离多肽，可能有必要将细胞与营养培养基分离。如果细胞分泌一种或多种多肽，则可通过离心将细胞与含有分泌的一种或多种感兴趣多肽的培养基分离。如果一种或多种感兴趣的多肽聚集在细胞内，则蛋白分离可包括离心以分离细胞与细胞培养基，用裂解缓冲液处理细胞沉淀，以及进行细胞破碎，例如通过超声处理、快速冻融或渗透裂解。
然后可能需要从上清液或培养基中分离一种或多种感兴趣的多肽，所述上清液或培养基可以包含其它蛋白和非蛋白成分。从上清液或培养基中分离蛋白质成分的常用方法是沉淀。不同浓度的沉淀剂，例如硫酸铵沉淀不同溶解度的蛋白。例如，低浓度的沉淀剂提取水溶性蛋白。因此，通过添加不同的浓度增加的沉淀剂，可以区分具有不同溶解度的蛋白。随后可采用透析从分离的蛋白中去除硫酸铵。
区分不同蛋白的其它方法是本领域已知的，例如离子交换层析和尺寸层析。这些可以用作沉淀的替代方法，或者可以在沉淀之后进行。
一旦从培养物中分离出一种或多种感兴趣多肽，就可能需要或必须浓缩所述一种或多种多肽。浓缩蛋白的许多方法是本领域已知的，例如超滤或冻干。
组合物
本发明还提供包含本文所述抗原结合分子、多肽、CAR、核酸、表达载体和细胞的组合物。
可以将本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸、表达载体和细胞配制成临床使用的药物组合物或药物，并且可以包含药学上可接受的运载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。可以将组合物配制成用于局部、肠胃外、全身、腔内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、肿瘤内、皮下、皮内、鞘内、口服或透皮给药途径，包括注射或输注。
合适的制剂可以在无菌或等渗介质中包含抗原结合分子。可以将药物和药物组合物配制成包括凝胶在内的流体形式。可以将流体制剂配制成通过注射或输注(例如通过导管)给予人体或动物体的选定区域。
在一些实施方式中，将组合物配制成用于注射或输注的制剂，如进入血管或肿瘤。
根据本文所述的发明，还提供了用于生产药学上有用的组合物的方法，此类生产方法可以包括选自以下的一个或多个步骤：生产本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多个核酸)、表达载体(或多个表达载体)或细胞；分离本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多个核酸)、表达载体(或多个表达载体)或细胞；和/或将本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多个核酸)、表达载体(或多个表达载体)或细胞与药学上可接受的运载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。
例如，本文描述的本发明的另一方面涉及配制或生产用于治疗疾病/病症(例如癌症)的药物或药物组合物的方法，该方法包括通过混合本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多个核酸)、表达载体(或多个表达载体)或细胞与药学上可接受的运载体、佐剂、赋形剂或稀释剂来配制药物组合物。
治疗和预防应用
本文描述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸、表达载体、细胞和组合物可用于治疗和预防方法。
本发明提供了本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多个核酸)、表达载体(或多个表达载体)、细胞或组合物，用于医学治疗或预防方法。还提供了本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多个核酸)、表达载体(或多个表达载体)、细胞或组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。还提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，包括给予对象治疗或预防有效量的本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多个核酸)、表达载体(或多个表达载体)、细胞或组合物。
该方法可以有效减少疾病/病症的产生或进展，减轻疾病/病症的症状或减轻疾病/病症的病理学特性。所述方法可以有效地预防疾病/病症的进展，例如防止疾病/病症的恶化或减慢其发展速度。在一些实施方式中，所述方法可以导致疾病/病症的改善，例如减轻疾病/病症的症状或减轻疾病/病症的严重性/活性的某些其它相关特性。在一些实施方式中，该方法可以在较晚阶段(例如慢性阶段或转移)中预防疾病/病症的发展。
应当理解，本发明的制品可以用于治疗/预防将从表达HER3的细胞的数量和/或活性减少中获得治疗或预防益处的任何疾病/病症。例如，该疾病/病症可以是表达HER3的细胞在病理学上牵涉其中的疾病/病症，例如其中表达HER3的细胞数量/比例的增加与该疾病/病症的发作、发生或进展和/或该疾病/病症的一种或多种症状的严重程度呈正相关的疾病/病症，或者表达HER3的细胞的数目/比例的增加是该疾病/病症的发作、发生或进展的危险因素的疾病/病症。
在一些实施方式中，本发明待治疗/预防的疾病/病症是特征在于表达HER3的细胞的数量/比例/活性增加的疾病/病症，例如与在没有疾病/病症的情况下，表达HER3的细胞的数量/比例/活性相比。
在一些实施方式中，待治疗/预防的疾病/病症是癌症。
癌症可以是任何不良的细胞增殖(或自身表现出不良细胞增殖的任何疾病)、赘生物或肿瘤。癌症可能是良性或恶性的，可能是原发性或继发性(转移性)。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。癌症可以是源自以下的组织/细胞，例如肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括脑)/小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮)、胆囊、食道、神经胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾脏、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌头、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。
待治疗的肿瘤可以是神经或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可以源自中枢或周围神经系统，例如胶质瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。非神经系统癌症/肿瘤可能起源于任何其他非神经组织、例如黑色素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、慢性粒细胞性白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合症(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、肝癌、表皮样癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、NSCLC、血液癌和肉瘤。
HER3及其与癌症的关系和在癌症中的作用在Karachaliou等，生物药物(2017)31(1)：63-73和Zhang等，Acta Biochimica et Biophysica Sinica(2016)48(1)：39-48中综述，两者均通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，癌症选自：包含表达HER3细胞的癌症、实体瘤、乳腺癌、乳腺恶性上皮癌、导管癌、胃癌、胃恶性上皮癌、胃腺癌、结直肠癌、结直肠恶性上皮癌、结直肠腺肿瘤、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、肺癌、肺恶性上皮癌、鳞状细胞肺恶性上皮癌、卵巢癌、卵巢恶性上皮癌、卵巢浆液性腺癌、肾癌、肾细胞恶性上皮癌、肾透明细胞癌、肾细胞腺癌、肾乳头状细胞癌、胰腺癌、胰脏腺癌、胰腺导管腺癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、皮肤癌、黑素瘤、食道癌、食管腺癌、肝癌，肝细胞癌、胆管癌、子宫癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、甲状腺恶性上皮癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、前列腺腺癌、肉瘤和胸腺瘤。
在一些实施方式中，根据本发明治疗的癌症选自：表达HER3的癌症、胃癌(例如胃癌、胃腺癌、胃肠道腺癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、乳腺癌、卵巢癌(例如卵巢癌)、肺癌(例如NSCLC、肺腺癌、鳞状肺细胞癌)、黑素瘤、前列腺癌、口腔癌(例如口咽癌)、肾癌(例如肾细胞癌)或大肠癌(例如大肠癌)、食道癌、胰腺癌、实体癌和/或液体癌。
治疗/预防可以针对以下一种或多种：延迟/预防癌症症状的发作/进展、降低癌症症状的严重程度、降低癌细胞的存活/生长/侵袭/转移、减少癌细胞的数量和/或增加对象的存活率。
在一些实施方式中，待治疗/预防的癌症包括表达EGFR家族成员的细胞(例如HER3、EGFR、HER2或HER4)，和/或表达EGFR家族成员配体的细胞。在一些实施方式中，要治疗/预防的癌症是EGFR家族成员阳性的癌症。在一些实施方式中，癌症过表达EGFR家族成员和/或EGFR家族成员的配体。可以通过检测表达水平来确定过表达，该表达水平高于等效的非癌细胞/非肿瘤组织的表达水平。
表达可以通过任何合适的方式来确定。表达可以是基因表达或蛋白质表达。可以通过，例如定量实时PCR(qRT-PCR)检测编码HER3的mRNA来测定基因表达。可以通过，例如基于抗体的方法，如蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞仪或ELISA检测HER3来测定蛋白表达。
在一些实施方式中，待治疗/预防的癌症包括表达HER3的细胞。在一些实施方式中，要治疗/预防的癌症是HER3阳性的癌症。在一些实施方式中，癌症过表达HER3。HER3的过表达可以通过检测HER3的表达水平来确定，该表达水平大于等效的非癌细胞/非肿瘤组织的表达水平。
在一些实施方式中，根据检测表达HER3的癌症或过表达HER3的癌症，例如从受试者获得的样品中，来选择患者用于本文所述的治疗。
在一些实施方式中，待治疗/预防的癌症包括表达HER3的配体(例如，NRG1和/或NRG2)的细胞。在一些实施方式中，待治疗/预防的癌症包含表达NRG1和/或NRG2的表达水平高于等效非癌细胞/非肿瘤组织的表达水平的细胞。
给予本发明的制品优选是“治疗有效”或“预防有效”的量，从而足以为对象显示出治疗或预防益处。实际给予的量以及给予的速率和时程将取决于疾病/病症的性质和严重程度以及所给予的具体物品。治疗处方，例如剂量等的决定是由全科医生和其他医生负责的，并且通常考虑待治疗的疾病/病症、个体对象的状况、递送部位、给药方法和从业者已知的其它因素。上述技术和方案的例子可见于《雷明顿药物科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences),第20版,2000,利平科特、威廉姆斯和威尔金斯出版社出版。
给药取决于待治疗的疾病，可以是单独的，也可以是与其它治疗方法联用，可以是同时或顺序地。本文所述的抗原结合分子或组合物和治疗剂可以同时或顺序给予。
在一些实施方式中，所述方法包括额外的治疗或预防性干预，例如用于治疗/预防癌症。在一些实施方式中，治疗或预防性干预选自化疗、免疫疗法、放疗、手术、疫苗接种和/或激素疗法。在一些实施方式中，治疗或预防性干预包括白细胞分离术。在一些实施方式中，治疗或预防性干预包括干细胞移植。
在一些实施方式中，抗原结合分子与能够抑制EGFR家族成员介导的信号传导的试剂联合施用。
因此，本发明提供了包含本发明的制品(例如，根据本发明的抗原结合分子)和另一种能够抑制由EGFR家族成员介导的信号传导的试剂(例如，EGFR、HER2、HER3或HER4)的组合物。还提供了此类组合物在本文所述的医学治疗和预防疾病/状况中的用途。
还提供了用于治疗/预防本文所述的疾病/病症的方法，所述方法包括施用本发明的物品，(例如，本发明的抗原结合分子)和能够抑制由EGFR家庭成员介导信号传导的另一种药剂。
能够抑制EGFR家族成员介导信号转导的药剂是本领域已知的，包括：例如小分子抑制剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、单克隆抗体(及其抗原结合片段)、肽/多肽抑制剂(例如诱饵配体/受体或肽适体)和核酸(例如反义核酸、剪接转换核酸或核酸适体)。EGFR家族成员介导的信号转导的抑制剂包括通过直接作用于EGFR家族成员的试剂、因此互作伴侣，和/或参与由EGFR家族成员介导的信号传导的下游因子的试剂。
在一些实施方式中，由EGFR家族成员介导的信号传导的拮抗剂抑制由EGFR、HER2、HER4和HER3中的一种或多种介导的信号传导。描述了由EGFR家族成员介导的信号传导抑制剂，在Yamaoka等，Int.J.Mol.Sci.(2018)，19，3491，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，拮抗剂是泛ErbB抑制剂。在一些实施方式中、拮抗剂是由EGFR信号介导的抑制剂(例如西妥昔单抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、阿法替尼(afatinib)、布里加替尼(brigatinib)、依替替尼(icotinib)、奥西替尼(osimertinib)、扎鲁妥珠单抗(zalutumumab)、凡德他尼(vandetanib)、妥珠单抗(necitumumab)、尼莫妥珠单抗(nimotuzumab)、达可替尼单抗(dacomitinib)、度戈妥珠单抗(duligotuzumab)或马妥珠单抗(matuzumab))。在一些实施方式中，拮抗剂是由HER2介导的信号的抑制剂(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、拉帕替尼(lapatinib)、那拉替尼(neratinib)、阿法替尼(afatinib)、达可替尼单抗(dacomitinib)、MM-111、MCLA-128或马格妥昔单抗(margetuximab)。在一些实施方式中，拮抗剂是由HER3介导的信号的抑制剂(例如塞立单抗(seribantumab)、鲁美珠单抗(lumretuzumab)、埃格曼图姆单抗(elgemtumab)、KTN3379、AV-203、GSK2849330、REGN1400、MP-RM-1、EV20、度戈妥珠单抗(duligotuzumab)、MM-111、依西拉单抗(istiratumab)、MCLA-128、帕妥珠单抗(Patritumab)、EZN-3920、RB200或U3-1402)。在一些实施方式中，拮抗剂是由HER4介导的信号传导的抑制剂(例如拉帕替尼(lapatinib)、依鲁替尼(ibrutinib)、阿法替尼(afatinib)、达可替尼(dacomitinib)或那拉替尼(neratinib))。
在一些实施方式中，由EGFR家族成员介导的信号传导拮抗剂抑制了EGFR家族成员的下游信号传导效应子。EGFR家族成员信号传导的下游效应子包括：如PI3K、AKT、KRAS、BRAF、MEK/ERK和mTOR。在一些实施方式中，由EGFR家族成员介导的信号传导的拮抗剂是MAPK/ERK途径的抑制剂。在一些实施方式中，由EGFR家族成员介导的信号传导的拮抗剂是PI3K/ATK/mTOR途径的抑制剂。在一些实施方式中，所述拮抗剂是PI3K抑制剂(例如，皮克提利西(Pictilisib)、布帕利西(buparlisib)、艾代拉里西(idelalisib)、库潘尼西(copanlisib)或杜韦利西(duvelisib))。在一些实施方式中，拮抗剂是AKT抑制剂(例如MK-2206、AZD5363、艾他舍替(ipatasertib)、VQD-002、哌立福辛(periposine)或米替福新(miltefosine))。在一些实施方式中，拮抗剂是BRAF抑制剂(例如例如维罗非尼(vemurafenib)、达布拉非尼(dabrafenib)、SB590885、XL281、RAF265)、恩拉非尼(encorafenib)、GDC-0879、PLX-4720、索拉非尼(sorafenib)或LGX818)。在一些实施方式中，拮抗剂是MEK/ERK抑制剂(例如曲美替尼(trametinib)、考比替尼(cobimetinib)、比美替尼(binimetinib)、司美替尼(selumetinib)、PD-325901、CI-1040、PD035901或TAK-733)。在一些实施方式中，拮抗剂是mTOR抑制剂(例如雷帕霉素(rapamycin)、地福莫司(deforolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)或沙潘西提布(sapanisertib))。
在一些实施方式中，本发明一方面的待治疗的癌症(包括单一疗法或联合疗法)对EGFR家族成员(例如EGFR、HER2、HER4和/或HER3)介导的信号传导的拮抗剂(例如前三段所述的拮抗剂)治疗产生耐药性。在一些实施方式中，待治疗的受试者的癌症对由EGFR家族成员介导的信号传导的拮抗剂的治疗具有抗药性。在一些实施方式中，待治疗的受试者的癌症对由EGFR家族成员介导的信号传导的拮抗剂的治疗已发展出抗药性。在一些实施方式中，待治疗的受试者的癌症对由EGFR家族成员介导的信号转导的拮抗剂的治疗先前有反应，并且现在对该拮抗剂的治疗具有抗药性。在一些实施方式中，待治疗的受试者的癌症对由EGFR家族成员介导的信号传导的拮抗剂治疗后复发和/或进展。在一些实施方式中，待治疗的受试者的癌症对由EGFR家族成员介导的信号传导的拮抗剂的治疗起初有反应，但随后在所述治疗上进展。
技术人员很容易能够根据前段确定癌症和受试者。此类癌症和受试者的鉴定可以通过，例如监测癌症在一段时间内，例如在由EGFR家族成员介导的信号传导拮抗剂的治疗过程中的发展/进展(和/或其相关性)。在一些实施方式中，此类受试者/癌症的鉴定可包括样品(例如活检)的分析，例如体外。在一些实施方式中，包含对拮抗剂治疗的敏感性和/或抗性降低的相关突变细胞的癌症可以被确定。在一些实施方式中，包含EGFR家族成员表达上调的细胞的癌症可以被确定。
在特定的实施方式中，待治疗的癌症对使用EGFR和/或HER2介导信号传导的拮抗剂的治疗具有抗性。在一些实施方式中，待治疗的受试者的癌症对EGFR和/或HER2介导信号传导的拮抗剂的治疗具有抗药性。在一些实施方式中，待治疗的受试者的癌症对用EGFR和/或HER2介导的信号传导的拮抗剂治疗的已发展出抗性。在一些实施方式中，待治疗的受试者的癌症对由EGFR和/或HER2介导的信号传导的拮抗剂的治疗先前有反应，并且现在对该拮抗剂的治疗具有抗性。在一些实施方式中，待治疗的受试者的癌症对用EGFR和/或HER2介导的信号传导的拮抗剂治疗后复发和/或进展。在一些实施方式中，待治疗的受试者的癌症对由EGFR和/或HER2介导的信号传导的拮抗剂的治疗起初有反应，但随后在所述治疗上进展。
在特定的实施方式中，待治疗的癌症包括对BRAF抑制剂治疗产生抗性的突变。在一些实施方式中，该突变是BRAF V600的突变。在一些实施方式中，突变是BRAF V600E或V600K。
在特定实施方式中，待治疗的癌症包括对BRAF抑制剂治疗产生抗性的突变(例如，BRAF V600处的突变)，并且所述治疗包括施用维罗非尼(vemurafenib)或达拉菲尼(darafenib)。
在一些实施方式中，抗原结合分子与能够抑制由免疫检查点分子介导的信号传导的试剂联合施用。在一些实施方式中，免疫检查点分子是：例如PD-1、CTLA-4、LAG-3、VISTA、TIM-3、TIGIT或BTLA。在一些实施方式中，抗原结合分子与能够促进由共刺激受体介导的信号传导的试剂联合施用。在一些实施方式中，共刺激受体是：例如CD28、CD80、CD40L、CD86、OX40、4-1BB、CD27或ICOS。
因此，本发明提供了包含本发明的制品(例如，本发明的抗原结合分子)和能够抑制免疫检查点分子介导信号传导的试剂的组合物。还提供了包含本发明制品和能够促进由共刺激受体介导信号传导的试剂的组合物。还提供了此类组合物在本文所述的医学治疗和预防疾病/状况中的用途。
还提供了用于治疗/预防本文所述的疾病/病症的方法，所述方法包括施用本发明的制品(例如，本发明的抗原结合分子)，和能够抑制由免疫检查点分子介导信号传导的一种药剂。还提供了用于治疗/预防本文所述的疾病/病症的方法，所述方法包括施用本发明的制品(例如，本发明的抗原结合分子)，和能够抑制由共刺激受体介导信号传导的一种药剂。
能够抑制由免疫检查点分子介导的信号传导的药剂是本领域已知的，包括：例如能够结合免疫检查点分子或其配体并抑制免疫检查点分子介导的信号传导的抗体。能够抑制由免疫检查点分子介导的信号传导的其他试剂包括能够降低免疫检查点分子或免疫检查点分子的配体的基因/蛋白质表达的试剂(例如，通过抑制编码免疫检查点分子/配体的基因的转录、抑制编码免疫检查点分子/配体的RNA的转录后加工、降低编码免疫检查点分子/配体的RNA的稳定性、促进编码免疫检查点分子/配体的RNA的降解、抑制免疫检查点分子/配体的翻译后加工、降低免疫检查点分子/配体的稳定性，或促进免疫检查点分子/配体的降解)和小分子抑制剂。
能够促进由共刺激受体介导的信号转导的试剂是本领域中已知的，包括例如：能够结合共刺激受体并触发或增加由共刺激受体介导的信号传导的激动剂抗体。能够促进由共刺激受体介导的信号传导的其他试剂包括能够增加共刺激受体或共刺激受体的配体的基因/蛋白质表达的试剂(例如，通过抑制共刺激受体/配体的基因的转录、抑制编码共刺激受体/配体的RNA的转录后加工、降低编码共刺激受体/配体的RNA的稳定性、促进编码共刺激受体/配体的RNA的降解、抑制共刺激受体/配体的翻译后加工、降低共刺激受体/配体的稳定性，或促进共刺激受体/配体的降解)和小分子抑制剂。
在特定的实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制由PD-1介导的信号传导的试剂联合施用。能够抑制由PD-1介导的信号传导的药剂可以是靶向PD-1或PD-L1的药剂。能够抑制由PD-1介导的信号转导的试剂可以是，例如能够与PD-1或PD-L1结合并抑制PD-1介导的信号传导的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制由CTLA-4介导的信号传导的试剂联合施用。能够抑制由CTLA-4介导的信号传导的试剂可以是靶向CTLA-4的试剂，或靶向针对CTLA-4的配体的试剂，例如CD80或CD86。在一些实施方式中，能够抑制由CTLA-4介导的信号转导的试剂可以是，例如能够结合CTLA-4、CD80或CD86并抑制CTLA-4介导的信号传导的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制由LAG-3介导的信号传导的试剂联合施用。能够抑制由LAG-3介导的信号转导的药物可以是LAG-3靶向药物，也可以是靶向LAG-3配体的药物，例如II类MHC。在一些实施方式中，能够抑制由LAG-3介导的信号转导的试剂可以是，例如能够与LAG-3或II类MHC结合并抑制LAG-3介导的信号传导的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制由VISTA介导的信号传导的试剂联合施用。能够抑制由VISTA介导的信号传导的试剂可以是靶向VISTA的试剂，或靶向VISTA配体的试剂，例如VSIG-3或VSIG-8。在一些实施方式中，能够抑制由VISTA介导的信号转导的试剂可以是，例如能够结合VISTA、VSIG-3或VSIG-8并抑制VISTA介导的信号传导的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子能够与抑制由TIM-3介导的信号传导的试剂联合施用。能够抑制由TIM-3介导的信号传导的药物可以是TIM-3靶向药物，也可以是针对TIM-3配体的药物，例如Galectin 9。在一些实施方式中，能够抑制由TIM-3介导的信号转导的试剂可以是，例如能够与TIM-3或Galectin 9结合并抑制TIM-3介导的信号传导的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制TIGIT介导的信号传导的试剂联合施用。能够抑制由TIGIT介导的信号转导的试剂可以是靶向TIGIT的试剂，或者靶向针对TIGIT配体的试剂，例如CD113、CD112或CD155。在一些实施方式中，能够抑制由TIGIT介导的信号转导的试剂可以是，例如能够结合TIGIT、CD113、CD112或CD155并抑制TIGIT介导的信号传导的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与能够抑制由BTLA介导的信号传导的试剂联合施用。能够抑制由BTLA介导的信号传导的试剂可以是靶向BTLA的试剂，或靶向BTLA的配体的试剂，例如HVEM。在一些实施方式中，能够抑制由BTLA介导的信号转导的试剂可以是，例如能够结合BTLA或HVEM并抑制BTLA介导的信号传导的抗体。
在一些实施方式中，与其中一种药物用作单一疗法时观察到的效果相比，本发明的抗原结合分子和能够抑制由免疫检查点分子介导的信号传导的试剂(例如PD-1)的组合使用方法提供了改善的治疗效果。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子和能够抑制由免疫检查点分子(例如PD-1)介导的信号传导的试剂的组合提供了协同的(即，超加性的)治疗效果。
同时给药是指将抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或多种核酸)、表达载体(或多种表达载体)、细胞或组合物与治疗剂一起给予，例如作为包含两种药物的药物组合物(联合制剂)，或紧接彼此并任选通过相同的给药途径，例如同一动脉/静脉或其它血管。顺序给药是指给予抗原结合分子/组合物或治疗剂中的一种，然后在给定的时间间隔之后分别施用另一种药剂。尽管在某些实施方式中是这种情况，但是不需要通过相同的途径来施用两种药剂。该时间间隔可以是任何时间间隔。
化疗和放疗分别是指用药物或电离辐射(例如，使用X射线或γ射线的放疗)治疗癌症。药物可以是化学实体，例如小分子药物、抗生素、DNA嵌入剂、蛋白抑制剂(例如激酶抑制剂)或生物制剂，例如抗体、抗体片段、适体、核酸(例如DNA、RNA)、肽、多肽或蛋白。该药物可以配制成药物组合物或药物。制剂可以包含一种或多种药物(例如一种或多种活性剂)连同一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或运载体。
治疗可能涉及给予一种以上的药物。取决于待治疗的病症，可以单独或与其它治疗组合给予药物，可以同时或顺序给予。例如，化疗可以是涉及给予两种药物的联合疗法，其中的一种或多种可能旨在治疗癌症。
可以通过一种或多种给药途径，例如肠胃外、静脉内注射、口服、皮下、皮内或肿瘤内来给予化疗。
化疗可以根据治疗方案给予。治疗方案可以是预定的化学疗法施用的时间表、计划、方案或行程表，可以由医师或医学从业者准备，并且可以具体定制以适合需要治疗的患者。治疗方案可以指示以下一种或多种：给予患者的化疗类型；每种药物或放射线的剂量；给药之间的时间间隔；每次治疗的时间；任何治疗假期的数量和性质(如果有的话)。对于联合治疗，可以提供单一治疗方案，该方案表明如何给予每种药物。
化疗药物可以选自：阿比昔步、醋酸阿比特龙，阿比特赛(甲氨蝶呤)、阿伯克森(紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、阿卡替尼、AC-T、阿克里斯(维布妥昔单抗注射液)、ADE、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、阿霉素(盐酸阿霉素)、双马来酸阿法替尼、飞尼妥(依维莫司)、阿凯泽(奈妥吡坦和帕洛诺司琼盐酸盐)、艾达乐(咪喹莫特)、阿地白介素、艾乐沙(艾乐替尼)、艾乐替尼、阿仑单抗、力比泰(培美曲塞二钠)、阿利巴(盐酸帕潘立布)、注射用爱克兰(盐酸美法仑)、爱克兰片剂(美法仑)、阿洛西(盐酸帕洛诺司琼)、阿仑里格(布加替尼)、安布洛星(氯胺丁)、氨苄青霉素(氯胺丁)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、阿雷地亚(帕米膦酸二钠)、阿利米得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、阿拉农(奈拉滨)、三氧化二砷、阿泽拉(奥法木单抗)、天冬酰胺酶菊基腐病菌、阿佐里珠单抗、阿瓦斯汀(贝伐单抗)、阿维鲁单抗、耶卡他、阿昔替尼、阿扎胞苷、巴文昔奥(阿维鲁单抗)、BEACOPP、贝森努(亚硝脲氮芥)、贝利达(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、贝彭撒(奥英妥珠单抗)、贝伐单抗、贝沙罗汀、贝克撒(托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(亚硝脲氮芥)、博来霉素、博纳吐单抗、倍林妥(博纳吐单抗)、硼替佐米、博苏利夫(博舒替尼)、博舒替尼,维布妥昔单抗、布里格替尼、BuMel、白消安、白消安注射液(白消安)、卡巴他赛、卡波美(苹果酸卡博替尼)、苹果酸卡博替尼、CAF、卡昆斯(阿卡替尼)、坎帕斯(阿仑单抗)、坎普托萨尔(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、卡拉克(氟尿嘧啶-局部用)、卡铂、卡铂-他克索、卡非佐米、卡莫布雷斯(卡莫斯汀)、卡莫斯汀、卡莫斯汀植入物、康士得(比卡鲁胺)、CEM、色瑞替尼、头孢呋啶(盐酸柔红霉素)、塞瓦里克斯(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、氯丁苯比昔尼松、CHOP、顺铂、克拉屈滨、克拉芬(环磷酰胺)、氯法拉滨、氯法雷克斯(氯法拉滨)、克洛拉(氯法拉滨)、CMF、柯美替尼、可美屈(苹果酸卡博替尼)、盐酸帕潘西伯、COPDAC、COPP、COPP-ABV、更生霉素(放线菌素)、考特里(考比替尼)、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、赛拉萨(雷米单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U(阿糖胞苷)、癌得星(环磷酰胺)、达拉非尼、达卡巴嗪、达根(地西他滨)、放线菌素、达雷木单抗、兆珂(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、得非乐(去纤苷钠)、德加列里克斯、地尼白介素、地诺单抗、得颇赛(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸地雷佐生、地那妥昔单抗、多西他赛、Doxil(盐酸阿霉素脂质体)、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、Dox-SL(盐酸阿霉素脂质体)、DTIC-多姆(达卡巴嗪)、杜鲁伐单抗、Efudex(氟尿嘧啶-局部用药)、埃立特(拉布立酶)、表阿霉素(盐酸表柔比星)、依洛珠单抗、依洛沙汀(奥沙利铂)、艾曲泊帕、意美(阿瑞匹坦)、埃利昔地(依洛珠单抗)、甲磺酸恩西地平、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、EPOCH、乙必妥(西妥昔单抗)、甲磺酸依立普林、瑞利奇(维莫德吉)、盐酸埃洛替尼、欧文泽(天冬酰胺酶菊基腐病菌)、Ethyol(阿米磷汀)、依托磷酸(依托泊苷磷酸酯)、依托泊苷、依托泊苷磷酸酯、依法西酯(盐酸阿霉素脂质体)、依维莫司、依维他命(盐酸雷洛昔芬)、依伏美拉(盐酸麦法仑)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射液)、5-FU(氟尿嘧啶-局部用药)、法乐通(托瑞米芬)、法达克(帕诺比司他)、芙仕得(氟维司汀)、FEC、弗隆(来曲唑)、菲格拉斯汀、氟达拉(氟达拉滨磷酸盐)、氟达拉滨磷酸盐、氟络合物(氟尿嘧啶-局部用)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-局部用药、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、福尔菲里、福尔菲里-贝伐单抗、福尔菲里-西妥昔单抗、福尔菲林、福尔福斯、福洛廷(对乙酰氨基甲酸酯)、FU-LV、氟维司琼、加德西(重组HPV四价疫苗)、加德西9(重组HPV九价疫苗)、加济瓦(奥比努珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-西沙丁胺、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥单抗、吉姆萨尔(盐酸吉西他滨)、吉洛特里夫(阿法替尼二马来酸酯)、格列卫(甲磺酸伊马替尼)、格利亚德尔(卡莫斯汀植入物)、格利亚德尔晶片(卡莫斯汀植入物)、羧肽酶、醋酸戈瑟琳酯、哈文(甲磺酸依立布林)、赫曼戈(盐酸普萘洛尔)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、HPV二价疫苗、重组、HPV九价疫苗、重组、HPV四价疫苗、重组和美新(盐酸托泊替康)、羟基脲(羟脲)、羟基脲、Hyper-CVAD、爱博新(帕博西尼)、伊布利他单抗、依鲁替尼、ICE、伊克鲁西格(盐酸波纳替尼)、伊达霉素(盐酸依达比星)、盐酸依达比星、伊达利西布、伊迪法(甲磺酸依西替尼)、伊菲克斯(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、异环磷酰胺(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、伊马替尼甲磺酸盐、伊布维卡(依鲁替尼)、因芬齐(杜鲁伐单抗)、咪喹莫特、利吉克(溶瘤病毒)、英利它(阿昔替尼)、依托珠单抗、干扰素Alfa-2b、重组白介素2(阿地白介素)、内含子A(重组干扰素Alfa-2b)、碘I 131托西单抗和托西单抗、伊匹单抗、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸依立替康、盐酸依立替康脂质体、伊斯托达克斯(罗米地辛)、伊沙贝比隆、柠檬酸依沙佐米、伊沙普拉(伊沙匹隆)、贾卡菲(磷酸鲁索替尼)、JEB、耶夫塔纳(卡巴他赛)、卡西拉(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、酮咯芬(盐酸雷洛昔芬)、开皮文斯(帕利弗明)、凯特鲁达(派姆单抗)、基斯卡利(瑞博西尼)、金里亚(提香根核)、凯泼利斯(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、二甲苯磺酸拉帕替尼、拉鲁佛(奥拉单抗)、来那度胺、甲磺酸伦伐替尼、伦维玛(甲磺酸伦伐替尼)、来曲唑、白细胞钙、勒克兰(氯丁酸)、醋酸亮丙瑞林、洛伐他汀(克拉屈滨)、勒武兰(氨基乙酰丙酸)、利福林(氯丁酸)、力普多(盐酸阿霉素脂质体)、洛莫司汀、朗瑟夫(三氟吡啶和盐酸提普拉西奇)、卢普龙(醋酸亮丙瑞林)、长效卢普龙(醋酸亮丙瑞林)、长效卢普龙(醋酸亮丙瑞林)、林帕扎(奥拉帕利布)、马其波(硫酸长春新碱脂质体)、曼图兰(盐酸卡巴嗪)、盐酸异丙草胺、醋酸孕甾酮、麦金尼斯特(曲美替尼)、美法仑、盐酸美法仑、巯基嘌呤、梅斯纳、梅斯内克斯(梅斯纳)、甲唑拉酮(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴代甲基纳曲酮、梅克赛特(甲氨蝶呤)、梅克赛特-AQ(甲氨蝶呤)、甲骨膜素、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、线粒体曲霉菌素(丝裂霉素C)、MOPP、莫唑比尔(培来沙福)、芥子碱(盐酸甲氧乙胺)、突变霉素(丝裂霉素C)、米勒兰(白消安)、迈洛萨尔(阿扎胞苷)、米洛塔格(吉妥珠单抗)、纳米粒紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒配方)、纳维滨(酒石酸维诺瑞滨)、尼珠单抗、奈拉拉宾、尼奥萨(环磷酰胺)、马来酸、耐力士(马来酸奈拉替尼)、内匹坦特和帕洛诺司琼盐酸盐、诺拉斯塔(培格非司亭)、纽泼金(菲格拉斯汀)、蕾莎瓦(索拉非尼甲苯磺酸酯)、尼兰德龙(尼鲁米特)、尼洛替尼、尼鲁米特、尼拉罗(柠檬酸依沙米布)、甲苯磺酸尼拉帕布一水合物、尼伏鲁单抗、诺尔维德斯(柠檬酸他莫昔芬)、纳雷特(罗米洛司汀)、奥比努妥珠单抗、奥多佐(索尼得昔)、OEPA、奥他妥单抗、OFF、奥拉帕利布、奥拉单抗、甲磺酸琥珀酸奥马西汀、恩卡斯帕(培加曲霉酶)、盐酸恩丹西酮、奥尼维德(盐酸伊立替康脂质体)、奥塔克(地尼白介素)、奥普达(尼武单抗)、OPPA、奥西替尼、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂、PAD、帕布昔利布、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和内匹坦特、帕米膦酸二钠、帕尼单抗、帕诺比司他、派拉特(卡铂)、顺铂(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、培门冬酶、吡非司亭、聚乙二醇干扰素Alfa-2b、PEG-内含子(聚乙二醇干扰素Alfa-2b)、派姆单抗、培美曲塞二钠、佩列塔(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、铂醇(顺铂)、铂醇-AQ(顺铂)、培来沙福、泊马度胺、波马利斯特(泊马度胺)、盐酸帕那替尼、波特拉扎(尼珠单抗)、普拉曲酸、泼尼松、盐酸丙卡巴嗪、普罗白介素(阿地白介素)、普罗利亚(地诺单抗)、普罗马塔(艾曲波帕)、盐酸普萘洛尔、普列威(西普赛尔)、普里涅特霍尔(巯基嘌呤)、普里克桑(巯基嘌呤)、[无条目]、镭223二氯化物、盐酸雷洛昔芬、雷莫昔单抗、芥酸酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素Alfa-2b、雷戈非尼、口服溴甲纳曲酮(溴化甲基纳曲酮)、R-EPOCH、瑞复美(来那度胺)、瑞马特雷(甲氨蝶呤)、瑞博西尼、R-ICE、瑞妥生(利妥昔单抗)、瑞妥生海拉(利妥昔单抗和人透明质酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉匹坦、罗米地辛、罗米普司汀、柔红霉素(盐酸柔红霉素)、鲁巴拉卡(樟脑磺酸瑞卡帕布)、樟脑磺酸瑞卡帕布、磷酸鲁索替尼、里达普(米哚妥林)、司兰索胸膜内气雾剂(滑石粉)、西妥昔单抗、西普赛尔、长效索马图林(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉、甲苯磺酸索拉非尼、普赖赛尔(达沙替尼)、斯坦福特V、无菌滑石粉(滑石粉)、斯特拉泰克(滑石粉)、斯蒂瓦尔加(雷戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、索坦(苹果酸舒尼替尼)、萨拉特龙(PEG干扰素Alfa-2b)、西尔万特(西妥昔单抗)、三利伯(盐酸奥美他汀)、太伯洛(硫鸟嘌呤)、TAC、塔菲拉尔(达拉非尼)、塔格里索(奥西替尼)、滑石粉、塔利莫金拉帕维克、他莫昔芬柠檬酸盐、他拉滨PFS(阿糖胞苷)、特罗凯(盐酸厄洛替尼)、塔格列汀(贝沙罗汀)、塔西格(尼洛替尼)、紫杉醇(紫杉醇)、泰索帝(多西他赛)、特森特里克(阿佐利珠单抗)、特莫达(替莫唑胺)、替莫唑胺、替莫罗莫司、沙利度胺、沙利度(沙利度胺)、硫鸟嘌呤、蒂奥帕、提香根核、托拉克(氟尿嘧啶-局部用药)、盐酸托泊替康、托瑞米芬、托里赛尔(特罗罗莫司)、托西单抗和碘I 131托西单抗、托泰克(盐酸地雷佐生)、TPF、曲贝丁、曲美替尼、曲妥珠单抗、特雷安达(盐酸苯达莫司汀)、曲氟尿苷盐酸/替吡嘧啶、曲森诺克斯(三氧化二砷)、泰克布(拉帕替尼二甲苯磺酸酯)、由吐新(地昔单抗)、尿苷三乙酸酯、VAC、戊柔比星、缬沙星(戊柔比星)、万得他尼、VAMP、瓦鲁比(盐酸罗拉匹坦)、维克替比(帕尼单抗)、VeIP、维尔斑(硫酸长春碱)、万珂(硼替佐米)、维尔萨(硫酸长春碱)、维拉非尼、维耐托克(威尼托克斯)、威尼托克斯、韦尔泽尼奥(阿贝马西比)、维德尔(醋酸亮丙瑞林)、维达扎(阿扎胞苷)、硫酸长春碱、文卡萨PFS(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、长春新碱硫酸盐脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、维斯托加德(三乙酸尿苷)、伏拉沙泽(葡糖苷酶)、伏立诺他、沃曲恩(盐酸帕唑帕尼)、维克斯(盐酸达柔比星和阿糖胞苷脂质体)、维考弗林(盐酸左索夫林钙)、赛可瑞(克鲁索替尼)、希罗达(卡培他滨)、希莱里、施乐、狄诺赛麦(地诺单抗)、克索菲戈(二氯化镭223)、克斯坦迪(恩杂鲁胺)、耶佛(伊匹单抗)、耶卡他(艾克西)、翁德利斯(特拉贝丁)、扎特拉普(阿柏西普)、扎尔西奥(菲格拉斯汀)、泽朱拉(甲苯磺酸尼泊拉布一水合物)、泽尔博拉夫(维拉非尼)、泽伐林(伊布利他单抗)、新卡德(盐酸地雷佐生)、阿柏西普、佐夫兰(盐酸恩丹西酮)、诺雷德(醋酸戈塞瑞林)、唑来膦酸、佐林扎(伏立诺他)、佐美塔(唑来膦酸)、齐德利格(伊达利西布)、扎卡迪亚(色瑞替尼)和扎迪加(醋酸阿比特龙)。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与曲妥珠单抗、西妥昔单抗、顺铂、5-FU或卡培他滨中的一种或多种联合施用。在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与曲妥珠单抗和顺铂以及5-FU或卡培他滨联合施用。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合分子与西妥昔单抗组合施用。特别考虑与西妥昔单抗联合给药以治疗头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)。
可以提供多剂量的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多个)、表达载体(或其多个)，细胞或组合物。一个或多个剂量或各剂量可以与同时或顺次给予另一治疗剂相伴。
多个剂量可以以预定时间间隔分开，该预定时间间隔可以选择为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天，或1、2、3、4、5或6个月中的一种。举例来说，可以每7、14、21或28天(正负3、2或1天)给予一次剂量。
检测方法
本发明还提供了用于检测、定位或成像HER3或表达HER3的细胞的方法中的本发明制品。
本文所述的抗原结合分子可以用于涉及HER3的抗原结合分子的方法中。这样的方法可能涉及检测抗原结合分子和HER3的结合复合物。
如此，提供了这样的方法，该方法包括接触包含或怀疑包含HER3的样品，并检测抗原结合分子和HER3的复合物的形成。还提供了这样的方法，该方法包括接触包含或怀疑包含表达HER3的细胞的样品，并检测抗原结合分子与表达HER3的细胞的复合物的形成。
合适的方法形式是本领域熟知的，包括免疫测定，例如夹心测定，如ELISA。所述方法可包括用可检测的部分，例如本文所述的荧光标记物、磷光标记物、发光标记物、免疫可检测标记物、放射性标记物、化学、核酸或酶标记物标记抗原结合分子或靶标，或两者。检测技术是本领域技术人员众所周知的，并且可以选择与标记剂相对应的检测技术。
此类方法可以为疾病或病症，例如癌症的诊断或/和预后评估方法提供基础。此类方法可以在体外对患者样品进行，或者在对患者样品进行处理之后进行。一旦收集了样品，就不需要患者出现在有待进行的体外方法中，因此该方法可以是不在人体或动物体上实践的方法。在一些实施方式中，该方法在体内进行。
样品中的检测可用于诊断疾病/病症(例如癌症)、疾病/状况的易感性的目的或提供疾病(病症)，例如本文所述的疾病/病症的预后。诊断或预后可能与现有(先前诊断的)的疾病/病症有关。
此类方法可能涉及检测或定量测定，例如患者样本中的HER3或表达HER3的细胞。如果该方法包括定量测定相关因素，该方法可以进一步包括比较测定的量与标准或参比值，作为诊断或预后评估的一部分。可以将其它诊断/预后测试与本文所述的测试联用，以提高诊断或预后的准确性或确认采用本文所述的测试获得的结果。
样品可以从任何组织或体液中获取。该样品可以包含或可以源自：一定量的血液；源自个体血液的一定量的血清，可能包含去除纤维蛋白凝块和血细胞后获得的血液中的液体部分；组织样品或活检样品；胸水；脑脊液(CSF)；或从所述个体分离的细胞。在一些实施方式中，样品可以获自或衍生自受疾病/病症影响的一种或多种组织(例如，其中表现出疾病症状或涉及疾病/病症的发病机理的一种或多种组织)。
本发明还提供了选择对象/对对象分层次以供HER3靶向剂治疗的方法。一些实施方式中，根据对，例如从个体获得的样品中的HER3或表达HER3的细胞的检测/定量测定，选择对象以供本发明的治疗/预防方法，或者将对象鉴定为将从此类治疗/预防方法中获益的对象。
对象
按照本文描述的本发明的诸方面，对象可以是任何动物或人。对象优选哺乳动物，更优选人。对象可以是非人哺乳动物，但更优选是人。对象可以是男性或女性。对象可以是患者。对象可能已经诊断为患有需要治疗的疾病或病症(例如癌症)，可能怀疑患有此类疾病/病症，或者可能具有产生/患有此类疾病/病症的危险。
在本发明的实施方式中，对象优选人对象。在一些实施方式中，有待本发明的治疗或预防方法治疗的对象是患有癌症或具有患癌风险的对象。在本发明的实施方式中，可以基于此类疾病/病症的某些标志物的表征，根据所述方法选择对象进行治疗。
试剂盒
在本文描述的发明的一些方面，提供了诸多部分组成的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒可具有至少一个容器，该容器具有预定量的本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物。
在一些实施方式中，试剂盒可以包含用于产生本文所述的抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物的材料。
试剂盒可提供抗原结合分子、多肽、CAR、核酸(或其多种)、表达载体(或其多种)、细胞或组合物，以及给予患者以治疗特定疾病/病症的说明书。
在一些实施方式中，试剂盒可进一步包括至少一个容器，该容器具有预定量的另一种治疗剂(例如抗感染剂或化疗剂)。在此类实施方式中，试剂盒还可以包含第二种药物或药物组合物，使得可以同时或分别给予两种药物或药物组合物，从而提供针对特定疾病或病症的联合治疗。还可以配制治疗剂以适合于注射或输注入肿瘤或血液。
序列相同性
本文所用的“序列相同性”是指在比对序列并在必要时引入缺口以实现序列之间最大序列相同性百分比后，主题序列中与参比序列中的核苷酸/氨基酸残基相同的核苷酸/氨基酸残基的百分比。为了确定两个或更多个氨基酸或核酸序列之间的序列相同性百分比，可以采用本领域技术人员已知的多种方式来实现成对和多序列比对，例如利用可公开获得的计算机软件，如ClustalOmega(
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J.2005，Bioinformatics 21，951-960)、T-coffee(Notredame等.2000，J.Mol.Biol.(2000)302,205-217)、Kalign(Lassmann和Sonnhammer 2005,“BMC生物信息学”BMC Bioinformatics,6(298))和MAFFT(Katoh和Standley 2013,“分子生物学和进化”Molecular Biology and Evolution,30(4)772780)软件。使用此类软件时，优选使用默认参数，例如空位罚分和延伸罚分。
序列
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编号段落
以下编号的段落(段落)提供了与本发明有关的特征的进一步陈述和特征的组合：
1.任选分离的抗原结合分子，其能够结合细胞外区域亚结构域II中的HER3。
2.如段落1所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子抑制HER3与HER3的相互作用伴侣之间的相互作用。
3.如第1或第2段所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合包含或由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的多肽。
4.如段落1至3中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够与包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：229的氨基酸序列的多肽结合。
5.如段落1至4中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够与包含SEQID NO：21或SEQ ID NO：229的氨基酸序列的多肽结合。
6.如段落1至5中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：43所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：46所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：51所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：94所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：99所示氨基酸序列的LC-CDR3。
7.如段落1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
8.如段落1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：89所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
9.如段落1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：90所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：96所示氨基酸序列的LC-CDR3。
10.如段落1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：98所示氨基酸序列的LC-CDR3。
11.如段落1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：93所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
12.如段落1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：49所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：93所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
13.如段落1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：50所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：93所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
14.如段落1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
15.如段落1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：97所示氨基酸序列的LC-CDR3。
16.如段落1至6中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：42所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
17.如段落1至5中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：158所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：159所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：160所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：165所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：166所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：167所示氨基酸序列的LC-CDR3。
18.如段落1至4中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子能够与包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的多肽结合。
19.如段落1至4或段落18中任一项的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：128所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：129所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：130所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：136所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：137所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：138所示氨基酸序列的LC-CDR3。
20.如段落1至4或段落18中任一项的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
具有SEQ ID NO：144所示氨基酸序列的HC-CDR1
具有SEQ ID NO：145所示氨基酸序列的HC-CDR2
具有SEQ ID NO：146所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
具有SEQ ID NO：151所示氨基酸序列的LC-CDR1
具有SEQ ID NO：152所示氨基酸序列的LC-CDR2
具有SEQ ID NO：153所示氨基酸序列的LC-CDR3。
21.如段落1至4中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子包括：
(i)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(ii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(iii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(iv)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(v)VH区，其包含氨基酸序列与SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(vi)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(vii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(viii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(ix)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(x)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性氨；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xi)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xiii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xiv)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xv)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xvi)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xvii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：87所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xviii)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：127所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：135所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xix)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：143所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：150所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；
或
(xx)VH区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：157所示的氨基酸序列具有至少70％的序列相同性；和
VL区，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：164所示的氨基酸序列具有至少70％序列相同性。
22.如段落1至21中任一项的抗原结合分子，其中该抗原结合分子能够结合人HER3和小鼠HER3，大鼠HER3和食蟹猕猴HER3中的一种或多种。
23.任选地分离的抗原结合分子，其包含(i)根据第1至22段中任一项的抗原结合分子，和(ii)能够结合除HER3以外的抗原的抗原结合分子。
24.如段落1至23中任一项的抗原结合分子，其中该抗原结合分子能够结合在细胞表面表达HER3的细胞。
25.如段落1至24段中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够抑制HER3介导的信号传导。
26.如段落1至25段中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含Fc区，所述Fc区包含具有以下的多肽：(i)在对应于242位的位置具有C，在对应于334位的位置具有C，以及(ii)以下一个或多个：在对应于236位的位置具有A，在对应于239位的位置具有D，在对应于332位的位置具有E，在对应于330位的位置具有L，在对应于345位的位置具有K，以及在对应于430位的位置具有G。
27.如第26段所述的抗原结合分子，其中，所述Fc区包含在对应于242位的位置具有C，在对应于334位的位置具有C，在对应于236位的位置具有A，在对应于236位的位置具有D，在对应于239位的位置具有D，在对应于332位的位置具有E，在对应于330位的位置具有L的多肽。
28.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含第1至27段中任一项的抗原结合分子。
29.任选分离的一种或多种核酸，其编码根据第1至27段中任一项的抗原结合分子或根据第28段的CAR。
30.一种表达载体或多种表达载体，其包含根据第29段的核酸或多种核酸。
31.一种细胞，其包含根据第1至27段中任一项的抗原结合分子，根据第28段的CAR，根据第29段的核酸或多种核酸，或根据第29段的表达载体或多种表达载体到第30段。
32.一种方法，包括在适合于从一种或多种核酸或一种或多种表达载体表达抗原结合分子或CAR的条件下，培养包含根据第29段的核酸或多种核酸，或根据第30段的表达载体或多种表达载体的细胞。
33.一种组合物，其包含根据第1至27段中任一项的抗原结合分子，根据第28段的CAR，根据第29段的一种核酸或多种核酸，根据第30段的一种表达载体或多种表达载体，或第31段所述的细胞。
34.根据第1到27段中任一项的抗原结合分子，根据第28段的CAR，根据第29段的一种或多种核酸，根据第30段的一种表达载体或多种表达载体，第31段所述的细胞，或第33段所述的组合物，用于医疗或预防方法。
35.根据第1到27段中任一项的抗原结合分子，根据第28段的CAR，根据第29段的一种或多种核酸，根据第30段的一种表达载体或多种表达载体，第31段所述的细胞或第33段所述的组合物，用于治疗或预防癌症的方法。
36.第1至27段中任一项的抗原结合分子，第28段中的CAR，第29段中的一种或多种核酸，第30段中的一种表达载体或多种表达载体，根据第31段的细胞或根据第33段的组合物的用途，用于制造用于治疗或预防癌症的方法的药物。
37.一种治疗或预防癌症的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的根据第1至27段中任一项的抗原结合分子，根据第28段所述的CAR，第29段所述的一种核酸或多种核酸，第30段所述的一种表达载体或多种表达载体，第31段的细胞或第33段的组合物。
38.根据第34段或第35段使用的抗原结合分子、CAR、一种或多种核酸，一种表达载体或多种表达载体、细胞或组合物，根据第36段的用途或根据第37段的方法，其中所述方法还包括施用由EGFR家族成员介导的信号转导的抑制剂，任选地，其中由EGFR家族成员介导的信号转导的抑制剂是由HER2和/或EGFR介导的信号转导的抑制剂。
39.如段落34至段落38中任一项使用的抗原结合分子、CAR、核酸或多种核酸、表达载体或多种表达载体、细胞或组合物，用途或方法，其中所述癌症是选自：包含表达EGFR家族成员的细胞的癌症，包含表达HER3的细胞的癌症，实体瘤、乳腺癌、乳腺恶性上皮癌、导管癌、胃癌、胃恶性上皮癌、胃腺癌、结直肠癌、结直肠恶性上皮癌、结直肠腺肿瘤、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、肺癌、肺恶性上皮癌、鳞状细胞肺恶性上皮癌、卵巢癌、卵巢恶性上皮癌、卵巢浆液性腺癌、肾癌、肾细胞恶性上皮癌、肾透明细胞癌、肾细胞腺癌、肾乳头状细胞癌、胰腺癌、胰脏腺癌、胰腺导管腺癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、皮肤癌、黑素瘤、食道癌、食管腺癌、肝癌，肝细胞癌、胆管癌、子宫癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、甲状腺恶性上皮癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、前列腺腺癌、肉瘤和胸腺瘤。
40.一种抑制HER3介导的信号传导的方法，包括使表达HER3的细胞与根据第1至27段中任一项的抗原结合分子接触。
41.一种减少表达HER3的细胞的数量或活性的方法，该方法包括使表达HER3的细胞与根据第1-27段中任一项的抗原结合分子接触。
42.一种任选分离的体外复合物，其包含与HER3结合的根据段落1至27中任一项的抗原结合分子。
43.一种方法，其包括使含有或怀疑含有HER3的样品与根据段落1至27中任一项的抗原结合分子接触，并检测抗原结合分子与HER3的复合物的形成。
44.一种选择受试者或对受试者分层次以供HER3靶向药物治疗的方法，该方法包括体外使受试者的样品接触如第1至27段中任一项所述的抗原结合分子，并检测抗原结合分子与HER3形成的复合物。
45.如第1至27段中任一项所述的抗原结合分子作为体外或体内诊断或预后剂的用途。
46.如段落1至27中任一项所述的抗原结合分子在用于癌症检测，定位或成像的方法中的用途，任选地其中所述癌症选自：包含表达EGFR家族成员的细胞的癌症，包含细胞的癌症表达HER3的实体瘤、乳腺癌、乳腺恶性上皮癌、导管癌、胃癌、胃恶性上皮癌、胃腺癌、结直肠癌、结直肠恶性上皮癌、结直肠腺肿瘤、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、肺癌、肺恶性上皮癌、鳞状细胞肺恶性上皮癌、卵巢癌、卵巢恶性上皮癌、卵巢浆液性腺癌、肾癌、肾细胞恶性上皮癌、肾透明细胞癌、肾细胞腺癌、肾乳头状细胞癌、胰腺癌、胰脏腺癌、胰腺导管腺癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、皮肤癌、黑素瘤、食道癌、食管腺癌、肝癌，肝细胞癌、胆管癌、子宫癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、甲状腺恶性上皮癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌、前列腺腺癌、肉瘤和胸腺瘤。
本发明包括所描述诸方面和优选特征的组合，除非这种组合是明显不允许或明确避免的。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。。
现在将参考附图，借助实施例示出本发明的诸方面和实施方式。其它方面和实施方式对于本领域技术人员是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用纳入本文。
除非上下文另有要求，否则在整个说明书，包括所附权利要求书中的词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”等变体将理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的组。
必须注意的是，除非上下文另外明确指出，说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达此类范围时，另一实施方式包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当利用先行词“约”将数值表示为近似值时，将理解该特定值形成另一实施方式。
在本文公开了核酸序列的情况下，也明确考虑了其反向互补。
本文描述的方法可以优选地在体外进行。术语“体外”旨在涵盖用培养的细胞进行的程序，而术语“体内”旨在涵盖使用/在完整的多细胞生物上的程序。
附图简述
现就参考附图讨论说明本发明原理的实施方式和实验。
图1A和1B.直方图显示通过流式细胞术测定的抗HER3抗体对细胞的染色。直方图显示了(1A，1B)抗HER3抗体克隆10D1和(1B)抗HER3抗体克隆LJM716对HEK293细胞(不表达HER3)，或HER3过表达的HEK293细胞(HEK293 HER3 O/E)的染色。
图2A和2B.直方图显示通过流式细胞术测定的抗HER3抗体对细胞的染色。直方图显示了(2A，2B)抗-HER3抗体克隆4-35-B2和(2B)抗-HER3抗体克隆LJM716对HEK293细胞(不表达HER3)，或HER3过表达的HEK293细胞(HEK293 HER3 O/E)的染色。
图3A和3B.直方图显示通过流式细胞术测定的抗HER3抗体对细胞的染色。直方图显示了(3A，3B)抗HER3抗体克隆4-35-B4和(3B)抗HER3抗体克隆LJM716对HEK293细胞(不表达HER3)，或HER3过表达的HEK293细胞(HEK293 HER3 O/E)的染色。
图4.直方图显示通过流式细胞术测定的抗HER3抗体对细胞的染色。直方图显示抗HER3抗体克隆10A6对HEK293细胞(不表达HER3)或HER3过表达的HEK293细胞(HEK293 HER3O/E)的染色。
图5A和5B.图显示了抗-HER3抗体克隆10D1与(5A)人、小鼠、大鼠和食蟹猕猴HER3和(5B)人EGFR和人HER2结合的ELISA分析结果。EC50值如图所示。
图6A和6B.图显示了抗-HER3抗体克隆4-35-B2与(6A)人、小鼠、大鼠和食蟹猕猴HER3以及(6B)人EGFR和人HER2结合的ELISA分析结果。
图7A和7B.图显示了抗-HER3抗体克隆4-35-B4与(7A)人HER3、人EGFR和人HER2以及(7B)人、小鼠、大鼠和食蟹猕猴HER3结合的ELISA分析结果。
图8.代表性传感图显示了抗HER3抗体克隆10D1与人HER3结合的亲和力分析结果。Kon，Koff和KD如图所示。
图9.代表性传感图显示了抗HER3抗体克隆4-35-B2与人HER3结合的亲和力分析结果。
图10.代表性传感图显示了抗HER3抗体克隆4-35-B4与人HER3的结合亲和力的分析结果。
图11.图显示了通过差示扫描荧光法分析抗HER3抗体克隆10D1的稳定性的结果。
图12.图显示了通过尺寸排阻色谱法分析重组表达的抗HER3抗体克隆10D1的结果。
图13.图显示了通过SDS-PAGE和Western blot分析抗HER3抗体克隆10D1的表达结果。泳道：M1＝TaKaRa蛋白标记，货号3452号；M2＝GenScript蛋白标记物，货号M00521；1＝还原条件；2＝非还原条件；P＝阳性对照：人IgG1，κ(Sigma货号I5154号)。对于蛋白质印迹，使用的一抗是山羊抗人IgG-HRP(GenScript货号A00166)和山羊抗人κ-HRP(SouterhnBiotech货号2060-05)。
图14A和14B.代表性传感图和表格显示了不同抗HER3抗体克隆之间与HER3竞争结合的竞争结果。
图15.该图显示了通过ELISA确定的抗HER3抗体克隆10D1抑制HER3和HER2之间相互作用的分析结果。
图16A和16B.表和直方图显示了不同癌细胞系的EGFR蛋白家族成员及其配体的基因和蛋白表达。
图17.图像显示了采用磷酸化western印迹分析抗HER3抗体克隆10D1处理对N87和FaDu细胞中HER3介导的信号传导的影响的结果。Un＝未处理；T＝用抗HER3抗体克隆10D1处理。
图18.图像和图形显示了使用磷酸蛋白抗体阵列分析试剂盒分析抗HER3抗体克隆10D1处理对FaDu细胞中HER3介导的信号传导的影响的结果。未处理＝未处理的FaDu细胞；已处理＝用抗HER3抗体克隆10D1处理过的FaDu细胞。
图19A和19B.图像显示了在抗HER3抗体克隆10D1存在下孵育后，通过CCK8分析确定的所示细胞系相对于未处理对照条件(100％)的细胞融合百分比。(19A)显示从N87细胞获得的结果，而(19B)显示从FaDu细胞获得的结果。
图20.该图显示了源自N87细胞系的小鼠胃癌模型中随时间推移的肿瘤体积分析结果。每两周一次腹膜内注射抗HER3抗体克隆10D1，每剂500μg，共10剂。对照治疗组接受等体积的PBS(载体)。
图21.该图显示了源自N87细胞系的小鼠胃癌模型中随时间推移的肿瘤体积分析结果。以11mg/kg每周一次的剂量腹膜内注射抗HER3抗体克隆4-35-B2，共4剂。对照治疗组接受等量的同种型对照抗体(同种型)。
图22.该图显示了在SNU16细胞系衍生的小鼠胃癌模型中随时间推移的肿瘤体积分析结果。腹膜内注射抗HER3抗体克隆10D1，每两周一次，每剂500μg，共9剂。对照治疗组接受等体积的PBS(载体)。
图23.该图显示了在FaDu细胞系衍生的头颈部鳞状细胞癌小鼠模型中随时间推移的肿瘤体积分析结果。腹膜内注射抗HER3抗体克隆10D1，每周一次，每剂500μg，共4剂。对照治疗组接受等体积的PBS(载体)或相同剂量的同型对照抗体(同种型)。
图24.该图显示了在FaDu细胞系衍生的头颈部鳞状细胞癌小鼠模型中随时间推移的肿瘤体积分析结果。腹膜内注射抗HER3抗体克隆10D1，每两周一次，每剂500μg，共8剂。对照治疗组接受等体积的PBS(载体)。
图25.该图显示了在OvCAR8细胞系衍生的卵巢癌小鼠模型中随时间推移的肿瘤体积分析结果。腹膜内注射抗HER3抗体克隆10D1，每两周一次，每剂500μg，共9剂。对照治疗组接受等体积的PBS(载体)。
图26.该图显示了在HCC-95细胞系衍生的鳞状肺细胞癌小鼠模型中随时间推移的肿瘤体积分析结果。腹膜内注射抗HER3抗体克隆10D1，每两周一次，每剂500μg，共4剂。对照治疗组接受等体积的PBS(载体)。
图27.该图显示了在A549细胞系衍生的肺腺癌小鼠模型中随时间推移的肿瘤体积分析结果。腹膜内注射抗HER3抗体克隆10D1，每两周一次，每剂500μg，共10剂。对照治疗组接受等体积的PBS(载体)。
图28.该图显示了在A549细胞系衍生的肺腺癌小鼠模型中随时间推移的肿瘤体积分析结果。腹膜内注射抗HER3抗体克隆4-35-B2，每两周一次，每剂500μg，共4剂。对照治疗组接受等体积的PBS(载体)。
图29.该图显示了在源自ACHN细胞系的肾细胞癌小鼠模型中随时间推移的肿瘤体积分析结果。腹膜内注射抗HER3抗体克隆10D1，每两周一次，每剂500μg，共7剂。对照治疗组接受等体积的PBS(载体)。
图30.直方图显示了通过流式细胞术测定的抗HER3抗体克隆10D1_c89对细胞染色。直方图显示HEK293细胞(不表达HER3)或HEK293 HER3过表达的细胞(HEK293 HER3 O/E)的染色。
图31.直方图显示了通过流式细胞仪测定的抗HER3抗体克隆10D1_c90对细胞染色。直方图显示HEK293细胞(不表达HER3)或HEK293 HER3过表达的细胞(HEK293 HER3 O/E)的染色。
图32.直方图显示了通过流式细胞仪测定的抗HER3抗体克隆10D1_c91对细胞染色。直方图显示HEK293细胞(不表达HER3)或HEK293 HER3过表达的细胞(HEK293 HER3 O/E)的染色。
图33A和33B.图显示了抗-HER3抗体10D1变体克隆与人HER3结合的ELISA分析结果。(33A)显示抗HER3抗体克隆10D1(称为10D1P)、10D1_c75、10D1_c76、10D1_c77、10D1_c78、10D1_11B(称为v11b78L)、10D1_c85、10D1_c85o1、10D1_c85o2、10D1_c87、10D1_c89、10D1_c90、10D1_c91、10D1_c93、LJM716和hIgG(阴性对照)的结合情况。(33B)显示的数据与33A相同，但仅是克隆10D1_c89、10D1_c90、10D1_c91和LJM716。
图34A和34B.图显示了通过大小排阻色谱法分析重组表达的抗HER3抗体10D1变体克隆的结果。(34A)显示抗HER3抗体克隆10D1_c93、10D1_c75、10D1_c76、10D1_c77、10D1_c78、10D1_11B(称为C78 v11b)，10D1_c85、10D1_c85o1、10D1_c85o2、10D1_c89、10D1_c90、10D1_c91和10D1_c93的结果。(34B)显示的数据与33A相同，但仅是克隆10D1_c89、10D1_c90、10D1_c91。
图35A至35C.图显示了通过差示扫描荧光法分析抗HER3抗体10D1变体克隆的稳定性的结果。(35A)显示了抗HER3抗体克隆LJM716(也称为埃格曼图姆单抗)、10D1(称为10D1(亲代))、10D1_c75、10D1_c76、10D1_c77和10D1_c78的结果。(35B)显示了10D1_c85o2、10D1_c87、10D1_c89、10D1_11B(称为c78_V11B)、10D1_c85和10D1_c85o1的结果。(35C)显示了10D1_c90、10D1_c91和10D1_c93的结果。
图36A至36M.代表性传感图显示了抗HER3抗体10D1变体克隆与人HER3的亲和力分析结果。显示了Kon、Koff和KD。(36A)显示克隆10D1_c89的结果，(36B)显示克隆10D1_c90的结果，(36C)显示克隆10D1_c91的结果，(36D)显示克隆10D1_c11B的结果，(36E)显示克隆10D1_c85o2的结果，(36F)显示结果克隆10D1_c87的(36G)显示克隆10D1_c93的结果，(36H)显示克隆10D1_c76的结果，(36I)显示克隆10D1_c77的结果，(36J)显示克隆10D1_c78的结果，(36K)显示克隆10D1_c75的结果，(36L)显示克隆10D1_c85o的结果，而(36M)显示克隆10D1_c85o1的结果。
图37.表格汇总了与安全性和可开发性有关的抗HER3抗体10D1变体克隆的特性。
图38A和38B.在CH2区中包含GASDALIE和LCKC取代的Fc修饰的抗-HER3抗体克隆10D1的生物层干涉法(38A)和热稳定性(38B)分析。(38A)BLI显示了代表性的传感图，显示了通过Fc修饰的抗HER3抗体克隆10D1与FcγRIIIa结合的亲和力的分析结果。显示了Kon、Koff和KD。
图39A和39B.代表性传感图显示了通过(39A)非Fc修饰的抗HER3抗体克隆10D1和(39B)Fc修饰的抗HER3抗体克隆10D1在CH2区中包含GASD取代的与FcγRIIIa结合的亲和力分析结果。显示了Kon、Koff和KD。
图40.该图显示了通过差示扫描荧光分析法分析抗HER3抗体克隆10D1GASD变体的稳定性的结果。
图41A和41B.表显示了与沉默变体N297Q，同种型变体和市售抗体相比，抗HER3抗体克隆10D1F.FcA和10D1F.FcB(GASDALIE-LCKC变体)对小鼠和人Fc受体的结合亲和力。ND＝由于结合亲和力低未确定的KD。
图42A和42B.直方图显示通过流式细胞术测定的抗HER3抗体对细胞染色。直方图显示(42A)抗HER3抗体克隆10D1F.FcA和(42B)抗HER3抗体克隆10D1和LJM-716对HEK293细胞(不表达HER3)或HEK293 HER3过表达细胞(HEK293 HER3 O/E)的染色。
图43.该图显示了抗-HER3抗体克隆10D1F.FcA与人EGFR(HER1)和人HER2结合的ELISA分析结果。EC50值如图显示。
图44.直方图显示通过流式细胞术测定的抗HER3和抗HER4抗体对细胞的染色。直方图显示抗HER3抗体克隆10D1F.FcA，抗HER3抗体LJM-716和MM-121以及市售抗HER4抗体对HEK293 HER4过表达细胞的染色。
图45.该图显示了抗HER3抗体克隆10D1F.FcA与人、小鼠、大鼠和食蟹猕猴HER3结合的ELISA分析结果。EC50值如图显示。
图46A和46B.代表性传感图显示了抗HER3抗体克隆(46A)10D1F.FcA和(46B)10D1F.FcB与人HER3结合的亲和力分析结果。显示了Kon、Koff和KD。
图47A和47B.该图显示了通过差示扫描荧光分析法分析抗-HER3抗体克隆(47A)10D1F.FcA和(47B)10D1F.FcB的稳定性的结果。
图48A和48B.该图显示了通过尺寸排阻色谱法分析抗HER3抗体(48A)10D1F.FcA和(48B)10D1F.FcB的克隆纯度的结果。
图49A和49B.代表性的传感图和表格显示了抗HER3抗体克隆10D1F.FcA与抗HER3抗体M-05-74和M-08-11之间的HER3结合竞争分析结果。
图50.图形和表格显示了在小鼠中抗HER3抗体克隆10D1的药代动力学分析结果。
图51A至51F.图形显示了抗HER3抗体克隆10D1治疗对小鼠血细胞计数(51A)、电解质指数(51B)以及肝毒性、肾毒性和胰腺毒性指数(51C-51F)的影响。左柱代表载体对照，右柱代表10D1治疗。虚线表示查尔斯河基准范围的终点。肝毒性、肾毒性和胰腺毒性的指标包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、碱性磷酸酶(ALP)、葡萄糖(GLU)、钙(CAL)、总胆红素(BIL)、总蛋白(TPR)和白蛋白(ALB)。
图52.图形和表格显示了通过ELISA确定的抗HER3抗体克隆10D1F.FcA和抗体MM-121、LJM-716和罗氏M05抑制HER2和HER3之间相互作用的分析结果。
图53.图形和表格显示了通过ELISA确定的抗HER3抗体克隆10D1F.FcA和抗体MM-121和LJM716抑制EGFR和HER3之间相互作用的分析结果。
图54.图形和表格显示了抗HER3抗体克隆10D1F.FcA(10D1F.A)、10D1F.FcB(10D1F.B)、10D1F-hIgG1(N297Q)和抗HER3抗体LJM-716和塞立单抗(MM-121)，诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的分析结果。EC50值如图显示。
图55A至55C.图像显示了通过磷酸化Western印迹分析，抗HER3抗体处理对(55A)N87、(55B)FaDu和(55C)OvCar8细胞中HER3介导信号转导的影响结果。
图56A和56B.图形和表格显示了抗HER3抗体克隆(56A)10D1F.FcA和(56B)10D1F.FcB在小鼠中的药代动力学分析结果。参数：最大浓度(C最大)，T最大，AUC(0-336hr)，AUC(0-无穷大)，半衰期(t1/2)，间隙(CL)，稳态下的分布体积(Vss)。
图57A至57D.图形和表格显示了在大鼠中抗HER3抗体克隆10D1F.FcA和10D1F.FcB在(57A)10mg/kg、(57B)25mg/kg、(57C)100mg/kg和(57D)250mg/kg时的药代动力学分析结果。参数：最大浓度(C最大)，T最大，AUC(0-336hr)，AUC(0-无穷大)，半衰期(t1/2)，间隙(CL)，稳态下的分布体积(Vss)。
图58A至58F.图形显示了抗HER3抗体克隆10D1F.FcA或10D1F.FcB在200ug(～10mg/kg)、500ug(～25mg/kg)、2mg(～100mg/kg)或5mg(～250mg/kg)的治疗对(58A，58B)红细胞指数、(58C)白细胞指数、(58D)肝毒性、(58E)肾脏和胰腺指数以及(58F)电解质指数的影响。
图59A至59D.图形显示了与(59A和59B)抗HER3抗体塞立单抗，LJM-716和(59C和59D)EGFR家族疗法西妥昔单抗、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗相比，使用抗HER3抗体克隆10D1F.FcA治疗对N87细胞(胃癌)、HCC95细胞(肺癌)、FaDu细胞(头颈癌)、SNU-16细胞(胃癌)、A549细胞(肺癌)、OvCar8细胞(卵巢癌)、ACHN细胞(肾脏癌)和HT29细胞(结肠直肠癌)的体外小鼠癌症模型中肿瘤抑制百分比的影响。
图60.该图显示了在A549细胞系衍生的肺腺癌小鼠模型中，以指示浓度的抗体每两周一次治疗六周后，随时间推移的肿瘤体积分析结果(n＝6，载体对照n＝8)。沿x轴的三角形表示施用抗体。
图61.该图显示了在用FaDu细胞系衍生的头颈部鳞状细胞癌小鼠模型中，按指定浓度的抗体治疗六周后(n＝6)，随时间推移分析肿瘤体积的结果。沿x轴的三角形表示施用抗体。
图62.该图显示了在OvCAR8细胞系衍生的卵巢癌小鼠模型中，在以指定浓度的抗体每周治疗六周后(n＝6)，随着时间的推移对肿瘤体积进行分析的结果。沿x轴的三角形表示施用抗体。
图63A至63D.箱形图显示了在10D1F.FcA、LJM-716或塞立单抗处理的癌细胞系的体外磷酸化分析中，基因组富集分析通路激活的结果。63A显示从N87细胞获得的结果，63B显示从A549细胞获得的结果，63C显示从OvCar8细胞获得的结果，而63D显示从FaDu细胞获得的结果。
图64.图像显示在指定的时间点通过磷酸化印迹分析，抗HER3抗体处理对A549细胞中HER3介导的信号传导的影响的结果。
图65.该图显示了通过PathHunter帕妥珠单抗生物测定确定的10D1F.FcA或帕妥珠单抗抑制HER2：HER3相互作用的结果。IC50(M)值如图显示。
图66A至66C.直方图显示了(66A)BCPAP(66B)BHT101和(66C)SW1736细胞的EGFR、HER2和HER3表达的分析结果。1＝未染色的细胞，2＝同型对照，3＝西妥昔单抗，4＝曲妥珠单抗，5＝10D1F.FcA。
图67A至67C.图表显示了分析不同抗ErbB抗体体外抑制BRAFV600E突变型甲状腺癌细胞系增殖的能力的结果。67A显示从BHT101细胞获得的结果，687显示从BCPAP细胞获得的结果，而67C显示从SW1736细胞获得的结果。
图68A至68C.图形显示了单独的10D1F.FcA或与维拉非尼联合使用在体外抑制BRAFV600E突变型甲状腺癌细胞系增殖的能力的分析结果。68A显示从BHT101细胞获得的结果，68B显示从SW1736细胞获得的结果，而68C显示从BCPAP细胞获得的结果。
图69A至69C.表格显示了在施用10mg/kg、25mg/kg、100mg/kg或250mg/kg的10D1F.FcA或等体积的PBS后，BALB/c小鼠的代表性血液学特征。69A显示分析红细胞的结果，69B显示分析白细胞的结果，69C显示分析肝、肾、胰腺功能以及电解质水平的相关结果。RBC＝红细胞，MVC＝平均红细胞体积，MCH＝平均红细胞血红蛋白，MCHC＝平均红细胞血红蛋白浓度，WBC＝白细胞，ALT＝丙氨酸氨基转移酶，ALP＝碱性磷酸酶，CREA＝肌酐，BUN＝血尿素氮，GLU＝胰高血糖素，AMY＝淀粉酶，NA＝钠，K＝钾，P＝磷，CA＝钙。
图70A至70C.表格显示了在施用250mg/kg 10D1F.FcA或等体积的PBS后，在指定时间点SD大鼠的代表性血液学特征。70A显示分析红细胞的结果，70B显示分析白细胞的结果，70C显示分析肝、肾、胰腺功能以及电解质水平的相关结果。RBC＝红细胞，MVC＝平均红细胞体积，MCH＝平均红细胞血红蛋白，MCHC＝平均红细胞血红蛋白浓度，WBC＝白细胞，ALT＝丙氨酸氨基转移酶，ALP＝碱性磷酸酶，CREA＝肌酐，BUN＝血尿素氮，GLU＝胰高血糖素，AMY＝淀粉酶，NA＝钠，K＝钾，P＝磷，CA＝钙。
图71.图像显示通过磷酸化western印迹测定，10D1F.FcA处理对FaDu或OvCar8细胞来源的肿瘤细胞中HER3介导的体内信号转导的影响的分析结果。
图72.盒式印迹显示了指定细胞系对不同抗ErbB抗体内在化的分析结果。
图73A和73B.直方图和表格显示了通过流式细胞术测定的不同时间点所指示的细胞系对10D1F.FcA或曲妥珠单抗内在化的分析结果。73B显示了从73A中显示的直方图确定的中值荧光强度和PE阳性细胞的百分比。
图74.该图显示了用指示浓度的所示抗ErbB抗体每两周治疗六周(n＝6)后，在N87细胞系衍生的胃癌小鼠模型中随时间推移的肿瘤体积分析结果。沿x轴的三角形表示抗体施用。
图75A和75B.图像显示了使用10D1F.FcA对恶性和正常人体组织进行的免疫组织化学染色情况。75A和75B显示不同组织的染色情况。
图76.图像显示在指定的放大倍数下，10D1F或兔多抗HER3抗体对A549肿瘤异种移植物切片的免疫组织化学染色情况。仅显示了二抗对照染色。
图77A和77B.条形图显示以25mg/kg给小鼠腹腔注射，抗体血清浓度达到Cmax时，所示抗ErbB抗体抑制所示癌细胞系体外增殖的能力的分析结果。77A和77B显示了使用不同细胞系获得的结果。
实施例
在以下实施例中，发明人描述了靶向HER3分子中特定目标区域的新型抗HER3抗体克隆的产生，以及这些抗原结合分子的生物物理和功能表征以及治疗评估。
实施例1：HER3靶标设计和抗HER3抗体杂交瘤生产
发明人在人HER3的细胞外区域(SEQ ID NO：9)中选择了两个区域用于生产结合HER3的单克隆抗体。
1.1杂交瘤的产生
从InVivos(新加坡)获得约6周龄的雌性BALB/c小鼠。将动物在无特定病原体的条件下圈养，并按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南进行培养。
为了产生杂交瘤，用抗原肽、重组靶蛋白或表达靶蛋白的细胞的专有混合物免疫小鼠。
在收获脾脏进行融合之前，小鼠通过抗原混合物进行连续三天或仅一天的加强免疫。在最后一次加强免疫后24小时，按照制造商的说明(干细胞技术，加拿大)，使用ClonaCell-HY杂交瘤克隆试剂盒分离总脾细胞，并与PEG与骨髓瘤细胞系P3X63.Ag8.653(ATCC，美国)融合。
在ClonaCell-HY培养基C(干细胞技术，加拿大)，5％CO2培养箱中，37℃过夜培养融合细胞。次日，将融合细胞离心并重悬于10ml的ClonaCell-HY培养基C中，然后与90ml含HAT成分的半固体甲基纤维素的ClonaCell-HY培养基D(干细胞技术，加拿大)轻轻混合，杂交瘤筛选和克隆结合为一个步骤。
然后将融合的细胞接种到96孔板中，在5％CO2培养箱中，37℃下生长。7-10天后，分离出单个杂交瘤克隆，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光激活细胞分选(FAC)筛选上清液，从而选择产生抗体的杂交瘤。
1.2抗体可变区扩增和测序
按照制造商的实验步骤，使用TRIzol试剂(生命技术有限公司，美国)从杂交瘤细胞中提取总RNA。按照制造商的说明，使用SMARTer RACE 5'/3’试剂盒(ClontechTM，美国)合成双链cDNA。简而言之，使用5'-RACE CDS引物(试剂盒中提供)将1μg总RNA用于生成全长cDNA，然后按照制造商的说明将5'衔接子(SMARTer II A引物)掺入每个cDNA中。cDNA合成反应体系包括：5X第一链缓冲液，DTT(20mM)，dNTP Mix(10mM)，RNase抑制剂(40U/μl)和SMARTScribe逆转录酶(100U/μl)。
使用SeqAmp DNA聚合酶(ClontechTM，美国)扩增种族专用的cDNA。扩增反应体系包含SeqAmp DNA聚合酶，2X Seq AMP缓冲液，5'SMARTer Race试剂盒中提供的5'通用引物(与衔接子序列互补)，以及与相应的重链或轻链恒定区引物退火的3'引物。根据下述先前报道的引物混合物设计5'恒定区：Krebber等，免疫方法杂志1997；201:35-55,Wang等，免疫方法杂志2000,233；167–177或Tiller等，免疫方法杂志2009；350:183–193。使用以下加热方法：变性前循环，94℃，1分钟；94℃，30s，55℃，30s和72℃，45s，35个循环；终延伸，72℃，3分钟。
使用CloneJET PCR克隆试剂盒(赛默飞科技，美国)将所得的大约550bp的VH和VLPCR产物克隆到pJET1.2/钝载体中，用于转化高感受态的大肠杆菌DH5α。使用Miniprep试剂盒(凯杰公司，德国)从所得的转化体中制备质粒DNA，并进行测序。DNA测序由AITbiotech进行。使用国际IMGT(免疫遗传学，ImMunoGeneTics)信息系统(LeFranc等，核酸研究(2015)43(数据库专辑)：D413-22)来分析这些测序数据，以表征各个CDR和框架序列。通过SignalP鉴定VH和VL的5’端的信号肽(v 4.1；Nielsen,刊于Kihara,D(编):“蛋白质功能预测”(Protein Function Prediction)(《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)1611卷)59-73,Springer 2017)。
选择了四个单克隆抗HER3抗体克隆进行进一步开发：10D1、10A6、4-35-B2和4-35-B4。
通过将互补决定区(CDR)移植到包含人抗体框架区的VH和VL中，电脑设计了10D1的人源化版本，并通过酵母展示方法进一步优化了抗原结合。
对于酵母展示，通过聚合酶链反应(PCR)将人源化序列转换为单链片段可变(scFv)格式，并用作模板通过随机诱变生成突变体文库。然后将突变的PCR文库与线性化的pCTcon2载体一起电穿孔到酵母中，以生成酵母文库。文库用人HER3抗原染色，并为最主要的结合物作分类。经过4-5轮排序后，对单个酵母克隆进行测序以鉴定独特的抗体序列。
Figure BDA0002803704420001531
Figure BDA0002803704420001541
Figure BDA0002803704420001551
实施例2：抗体生产与纯化
2.1将VH和VL克隆到表达载体中：
将编码抗-HER3抗体克隆的重链和轻链可变区的DNA序列亚克隆到pmAbDZ_IgG1_CH和pmAbDZ_IgG1_CL(英基公司，美国)真核表达载体中，以构建人-鼠嵌合抗体。
或者，将编码抗-HER3抗体克隆的重链和轻链可变区的DNA序列亚克隆到pFUSE-CHIg-hG1和pFUSE2ss-CLIg-hk(美国，英基公司)真核表达载体中，以构建人-鼠嵌合抗体。相对于人IgG1恒定区(IGHG1；UniProt：P01857-1，v1；SEQ ID NO：176)，由pFUSE-CHIg-hG1编码的人IgG1恒定区在CH3区中包含取代D356E、L358M(位置编号按照EU编号)。pFUSE2ss-CLIg-hk编码人IgG1轻链κ恒定区(IGCK；UniProt：P01834-1，v2)。
按照制造商的实验方法，使用SeqAmp酶(ClontechTM，美国)从克隆载体中扩增出可变区以及信号肽。使用与VH或VL中的适当区域有15-20bp重叠的正向和反向引物，并在5’端加上6bp作为限制位点。用制造商推荐的限制酶消化DNA插入片段和载体，以确保不引入移码，并使用T4连接酶(赛默飞科技，美国)将其插入各自的质粒中。以DNA插入物与载体的摩尔比为3∶1用于连接。
2.2在哺乳动物细胞中表达抗体
按照制造商的说明，使用1)Expi293瞬时表达系统试剂盒(生命技术公司，美国)，或2)HEK293-6E瞬时表达系统(CNRC-NRC，加拿大)来表达抗体。
1)Expi293瞬时表达系统：
细胞系维护：
HEK293F细胞(Expi293F)获自生命技术公司(美国)。37℃下，在补充了50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素(吉可公司，美国)的无血清、无蛋白、化学成分确定的培养基(Expi293表达培养基,赛默飞世尔公司,美国)中，在带有振荡平台的8％CO2和80％加湿培养箱中培养细胞。
转染：
按照制造商的方案，利用ExpiFectamine 293试剂盒(吉可公司，美国)，用表达质粒转染Expi293F细胞。简而言之，在转染前1天，通过离心培养物对维持的细胞进行培养基交换以去除抗生素，将细胞沉淀重悬在没有抗生素的新鲜培养基中。转染当天，每次转染将2.5×106/ml的活细胞接种在摇瓶中。室温下，在减血清培养基Opti-MEM(吉可公司，美国)中形成DNA-ExpiFectamine复合物，25分钟，然后添加入细胞。在转染后16-18小时，将增强剂加入转染的细胞中。在转染后第4天，将等量的培养基添加至转染子，以防止细胞聚集。在第7天通过4000×g离心15分钟收获转染子，并通过0.22μm无菌过滤器过滤。
2)HEK293-6E瞬时表达系统
细胞系维持：
HEK293-6E细胞获自加拿大国家研究委员会。37℃下，在补充了0.1％Kolliphor-P188和4mM L-谷氨酰胺(吉可公司，美国)和25μg/ml G-418的无血清、无蛋白、化学成分确定的Freestyle F17培养基(英杰公司,美国)中，在带有振荡平台的5％CO2和80％加湿培养箱中培养细胞。
转染：
根据其制造商的方案，使用PEIproTM(美国，Polyplus)用表达质粒转染HEK293-6E细胞。简而言之，在转染前1天，通过离心对维持的细胞进行培养基交换以去除抗生素，将细胞沉淀重悬在没有抗生素的新鲜培养基中。转染当天，每次转染均需将1.5-2×106细胞/ml活细胞接种在摇瓶中。将DNA和PEIproTM以1:1的比例混合，然后在室温下，复合物在F17培养基中形成，5分钟，然后添加入细胞。在转染后24-48小时，将0.5％(w/v)的胰蛋白N1加入转染物。在第6-7天通过4000×g离心15分钟收获转染物，并通过0.22μm无菌过滤器过滤上清液。
利用编码以下多肽组合的载体转染细胞：
Figure BDA0002803704420001571
Figure BDA0002803704420001581
Figure BDA0002803704420001591
Figure BDA0002803704420001601
2.3抗体纯化
亲和纯化、缓冲液交换和储存：
使用液相色谱系统AKTA Start(GE保健公司，英国)纯化由转染细胞分泌到培养上清液中的抗体。具体而言，将上清液以5ml/min的结合速率加载到HiTrap G蛋白色谱柱(GE保健公司,英国)上，然后用10柱体积的洗涤缓冲液(20mM磷酸钠，pH 7.0)洗涤。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH 2.7)洗脱结合的单克隆抗体，并将洗脱液分部至收集管中，该管中装有适量的中和缓冲液(1M Tris，pH 9)。使用30K MWCO蛋白浓缩器(赛默飞世尔公司，美国)或3.5K MWCO透析盒(赛默飞世尔公司，美国)将含有纯化mAb的中和洗脱缓冲液交换为PBS。通过0.22μm过滤器对单克隆抗体进行灭菌，将其等分并在-80℃速冻保存。
2.4抗体纯度分析
尺寸排阻色谱法(SEC)：
在AKTA Explorer液相色谱系统(GE保健公司,英国)上使用Superdex 20010/30GL色谱柱(GE保健公司,英国)，在PBS运行缓冲液中，通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析抗体纯度。在室温下，以0.75ml/min的流速，将溶于pH 7.2的500μlPBS中的150μg抗体注入色谱柱。根据蛋白质的分子量洗脱蛋白质。
抗HER3抗体克隆10D1(实施例2.2的[1])的结果如图12所示。
从不同的10D1变体克隆获得的结果如图34所示。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：
还根据标准方法，在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE分析抗体纯度。简而言之，使用Mini-Protean电泳系统(Bio-Rad，美国)，使用4％-20％TGX蛋白凝胶(美国，Bio-Rad)来解析蛋白质。对于非还原条件，通过将蛋白样品与2x Laemmli样品缓冲液(伯乐公司，美国)混合，并在上样至凝胶之前于95℃煮沸5-10分钟使其变性。对于还原条件，使用含有5％β-巯基乙醇(βME)或40mM DTT(二硫苏糖醇)的2x样品缓冲液。在SDS运行缓冲液(25mMTris,192mM甘氨酸,1％SDS,pH 8.3)中，在150V的恒定电压下电泳1h。
蛋白质印迹：
如上所述，通过SDS-PAGE分离蛋白质样品(30μg)，并转移到硝酸纤维素膜上。然后将膜封闭，4℃下用抗体作免疫印迹过夜。在PBS-吐温中洗涤3次后，然后将膜与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗在室温下孵育1小时。通过化学发光的皮尔斯公司ECL底物Western印迹检测系统(美国赛默飞科技)和放射自显影胶片(柯达XAR胶片)对结果进行可视化。
用于检测的一抗是山羊抗人IgG-HRP(GenScript目录号A00166)和山羊抗人kappa-HRP(SouterhnBiotech目录号2060-05)。
抗HER3抗体克隆10D1(实施例2.2的[1])的结果如图13所示。10D1易于在高浓度下表达、纯化和加工。
实施例3：生物物理表征
3.1流式细胞术分析细胞表面抗原结合
4℃下，将野生型HEK293细胞(不表达高水平的HER3)和编码人HER3的运载体转染的HEK293细胞(即HEK293 HER O/E细胞)与20μg/ml抗-HER3抗体或同种型对照抗体孵育1.5小时。分析中包括抗HER3抗体克隆LJM716(例如Garner等，癌症研究(2013)73：6024-6035中所述)作为阳性对照。
2-8℃下，将细胞用FACS缓冲液(含5mM EDTA和0.5％BSA的PBS)洗涤三次，并重悬于FITC偶联的抗FC抗体(英杰公司，美国)中，40分钟。再次洗涤细胞，并重悬于200μLFACS流动缓冲液(含5mM EDTA的PBS)中，使用MACSQuant 10(美天旎生物技术公司，德国)进行流式细胞术分析。采集后，使用Flowlogic软件分析所有原始数据。使用前向和侧面散射曲线对细胞进行门控，确定天然细胞和过表达细胞群体中阳性细胞的百分比。
结果示于图1至4和30至32。显示抗HER3抗体以高特异性结合人HER3。已显示10D1和LJM716与表达人HER3的细胞结合的程度相似。
3.2用于确定抗体特异性和交叉反应性的ELISA
ELISA用于确定抗体的结合特异性。分析了抗体与人HER3多肽以及HER3的小鼠、大鼠和猴子同源物的结合情况(Sino生物股份有限公司，中国)。还分析了抗体结合人EGFR和人HER2的能力(Sino生物股份有限公司，中国)。
根据标准方案进行ELISA。简而言之，用磷酸盐缓冲液(PBS)配制的0.1μg/ml的目标多肽包被96孔板(农克公司，丹麦)，在4℃下孵育16小时。在室温下用含1％BSA的Tris缓冲盐水(TBS)封闭1小时后，将抗HER3抗体进行系列稀释，最高浓度为10μg/ml，并添加到平板中。在室温下孵育1小时后，用含有0.05％吐温20的TBS(TBS-T)洗涤平板3次，然后与HRP偶联的抗His抗体(生命科技有限公司，美国)在室温下孵育1h。洗涤后，用比色检测底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(Turbo-TMB；皮尔斯公司，美国)显影平板10分钟。用2M H2SO4终止反应，在450nM下测定OD。
ELISA的结果如图5至7和图33所示。
结果表明即使在高浓度抗体下，抗HER3抗体克隆10D1也不与人HER2或人EGFR结合(图5A)。还发现抗-HER3抗体克隆10D1与小鼠HER3、大鼠HER3和食蟹猕猴HER3表现出显著的交叉反应性(图5B)。
结果表明抗HER3抗体克隆4-35-B2与人HER2和人EGFR结合(图6A)。抗-HER3抗体克隆4-35-B2也显示出与小鼠HER3、大鼠HER3和食蟹猕猴HER3的显著交叉反应(图6B)。
结果表明抗HER3抗体克隆4-35-B4结合人HER2和人EGFR(图7A)。抗-HER3抗体克隆4-35-B4也显示出与小鼠HER3，大鼠HER3和食蟹猕猴HER3的显著交叉反应(图7B)。
已证明所有10D1变体都与人HER3结合(图33A和33B)。
3.3使用Octet QK384系统进行整体亲和力研究
分析了IgG1形式的抗HER3抗体克隆与人HER3的结合亲和力。
使用Octet QK384系统(佛特生物公司)进行了生物层干涉(BLI)实验。使用抗人IgG捕获(AHC)八隅体传感器探针(颇尔佛特生物公司，美国)捕获抗HER3抗体(25nM)。所有测量均在25℃下以1000rpm的转速进行。通过将不同浓度的带His标签的人HER3抗原加载120s，然后通过将生物传感器转移到含有孔的测定缓冲液中，进行120s解离时间来进行抗原结合的动力学测量。参考缓冲液效果的传感图，然后使用Octet QK384用户软件(颇尔佛特生物公司，美国)进行拟合。使用一个位点结合模型对动力学响应进行整体拟合，以获得缔合值(Kon)、解离率(Koff)速率常数和平衡解离常数(KD)。只有能够可靠地被软件(R2>0.90)拟合的曲线才被纳入分析。
图8显示了用于分析克隆10D1的代表性传感图。发现克隆10D1结合人HER3的亲和力KD＝9.58nM。
人源化/优化的10D1变体以非常高的亲和力结合人HER3。代表性的传感图在图36A至36M中示出。
10D1克隆变体确定的亲和力如下所示：
抗体克隆 亲和力(K<sub>D</sub>)
10D1_c89 72.6pM
10D1_c90 <1pM
10D1_c91 176pM
10D1_11B 0.41nM
10D1_c85o 17.3nM
10D1_c87 <1pM
10D1_c93 <1pM
10D1_c76 <1pM
10D1_c77 1.93nM
10D1_c78 <1pM
10D1_c75 <1pM
10D1_c85 7.58nM
10D1_c85o1 18.2nM
结果发现克隆4-35-B2以KD＝80.9nM的亲和力与人HER3结合(图9)，克隆4-35-B4以KD＝50.3nM的亲和力与人HER3结合(图10)。
3.4通过差示扫描荧光法分析热稳定性
简而言之，在25μLPBS中制备三份0.2mg/mL的抗体和宝石橙染料(赛默飞世尔)的反应混合物，转移到微安光学96孔板(赛默飞世尔)的反应孔中，并用微安光学胶膜(赛默飞世尔)密封。在7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)中运行熔解曲线，选择TAMRA作为报告基因，ROX作为参比荧光。热曲线包括在25℃下2分钟的初始步骤和在99℃下2分钟的最终步骤，其升温速率为1.2％。将原始数据的一阶导数绘制为温度的函数，以获得导数熔解曲线。从导数曲线的峰中提取抗体的解链温度(Tm)。
通过差示扫描荧光法分析抗体克隆10D1的热稳定性获得原始数据的一阶导数如图11所示。分析了抗体的三种不同样品。测定的Tm为70.3℃。
还对10D1变体克隆和LJM716.进行了分析。原始数据的一阶导数和确定的Tm如图35A至35C所示。
3.5抗HER3抗体10D1表位分析
分析抗HER3抗体10D1，以确定其是否与抗HER3抗体MM-121和/或LJM-716竞争结合HER3。MM-121的表位已定位到HER3的结构域I中；它阻断了NRG配体结合位点。LJM-716的表位已定位到结构域II和IV中分布的构象表位，并且将HER3锁定在非活性构象中。
使用Octet QK384系统(佛特生物公司)进行生物层干涉(BLI)实验。使用抗五HIS(HIS1K)涂层的生物传感器探头(佛特生物公司，美国)捕获带有His标记的人HER3(75nM；300s)。检测与饱和抗体的结合情况(400nm；600s)，然后进行解离步骤(120s)，接着检测与竞争抗体结合情况(300nM；300s)，然后进行解离步骤(120s)。将MM-121抗体的可变区克隆到具有人IgG2和IgκFc骨架的PDZ载体中。将LJM-716抗体的可变区克隆到具有人IgG1和IgκFc骨架的PDZ运载体中。
分析结果示于图14A和14B。发现抗HER3抗体不与MM-121和/或LJM-716竞争结合HER3。
发现和MM-121和/或LJM-716相比，10D1结合HER3的一个独特且在拓扑上相距遥远的表位。
使用重叠的15-聚体氨基酸定位10D1的表位，以覆盖整个HER3细胞外结构域。每个独特的15-聚体通过GS接头在C和N端延伸，并与384孔板中的独特孔偶联，然后在0.1、1、10和100ug/ml的10D1抗体中于4℃孵育16小时。洗涤板，然后在20℃下与POD缀合的山羊抗人IgG孵育1小时。最后，将POD底物溶液添加到孔中20分钟。在结合之前，通过在425nm处使用LI-COR Odyssey成像系统测量化学发光来评估，然后使用PepSlide分析软件包进行定量和分析。实验一式两份地进行。
发现10D1表位不是直接在位于结构域II的HER3二聚化臂的β-发夹结构上，而是在β-发夹的N-末端的二聚化界面处。
测定到与10D1和10D1衍生克隆结合的HER3位点对应结合于人HER3的氨基酸序列的218至235位(例如，如SEQ ID NO：1所示)；HER3此区域的氨基酸序列示于SEQ ID NO：229。在该区域内，鉴定了两个共有结合位点基序，并示于SEQ ID NO：230和231中。
结合到HER3的该位置，起到阻碍HER家族异二聚化和随后的下游信号传导途径的作用(参见实施例4)。结合不依赖于配体(NRG)。在开放和封闭的HER3构象中，10D1结合位点都是溶剂可及的，在HER3和其他HER家族成员之间不保守，并且在人、小鼠、大鼠和猴子HER3直系同源物中是100％保守的。
实施例4：功能表征
4.1抑制HER2和HER3的二聚化
分析了抗HER3抗体抑制HER3和HER2异源二聚化的能力。
简而言之，4℃下，用PBS中的0.1μg/ml His标签的HER2蛋白包被96孔板(农克公司，丹麦)16h。在室温下用1％BSA的PBS封闭1小时后，在存在不同浓度的抗HER3抗体克隆10D1的情况下添加重组生物素化的人HER3蛋白，并将板在室温下孵育1小时。随后将板洗涤3次，然后在室温下与缀合有HRP的二抗孵育1小时。洗涤后，用比色检测底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(Turbo-TMB；皮尔斯公司，美国)显影平板10分钟。用2M H2SO4终止反应，在450nM下测定OD。
结果如图15所示。发现抗HER3抗体克隆10D1以剂量依赖性方式抑制HER2和HER3之间的相互作用。
在进一步的实验中，分析了HER2：HER3二聚化的抑制作用
在进一步的实验中，根据制造商的说明书，使用PathHunter帕妥珠单抗生物测定试剂盒(DiscoverX)评估了HER2：HER3二聚化的抑制作用。
简而言之，使用1ml预热的CP5培养基融化HER2和HER3过表达的U2OS细胞，每孔接种5,000个细胞，并在5％CO2气氛中于37℃培养4小时。然后从25μg/ml开始，用10D1F.FcA或帕妥珠单抗的8点系列稀释液处理细胞。
温育4小时后，将30ng/ml的调蛋白-β2添加到每个孔中，并将细胞再温育16小时。将10μLPathHunter生物测定检测试剂1添加到孔中，并在黑暗中于室温孵育15分钟。随后加入40μLPathHunter生物测定检测试剂2，并在黑暗中于室温下孵育60分钟。然后通过Synergy4 Biotek在1秒后读取板。
结果如图65所示。发现10D1F.FcA比帕妥珠单抗具有更高的抑制HER2：HER3二聚作用的能力，如其较低的IC50所反映的。
4.2鉴定癌细胞系以进行分析
发明人表征了癌细胞系中EGFR蛋白家族成员的表达，以鉴定合适的细胞以研究HER3的抑制。
图16A显示了N87、SNU16、HT29、FaDu、A549、HCC95、OvCAR8和AHCN细胞对EGFR家族成员和配体的mRNA表达数据，根据《癌细胞系百科全书》(CCLE；Barretina等，自然(2012)483：603-607。和《癌细胞系百科全书联盟》以及癌症联盟中药物敏感性的基因组学，自然(2015)528：84-87中述及)。图16A还显示了由FlowLogic确定的EGFR、HER2和HER3的蛋白表达数据。
实验中使用的细胞系购自ATCC，并按建议进行培养。简而言之，将细胞系维持在指定的细胞培养基中，并补充有10％FBS和1％Pen/Strep。在37℃，5％CO2培养箱中培养细胞。将培养的细胞以合适的接种密度接种在96孔板中：HT29、HCC95、FADU和OvCar8细胞以2000个细胞/孔接种，NCl-N87细胞以5000个细胞/孔接种，SNU-16、ACHN和细胞以1500细胞/孔接种，A549细胞以1200细胞/孔接种。
图16B显示通过流式细胞术确定的EGFR、HER2和HER3的表面表达。简而言之，4℃下，将500,000个细胞在含有0.5％BSA和2mM EDTA的染色缓冲液中以一抗(20μg/ml)染色1.5h。使用抗人Alexafluor488为二抗，在10μg/ml下，4℃下处理20分钟。
4.3抑制HER3介导的信号传导
分析了抗HER3抗体10D1在体外抑制HER-3介导的信号传导的能力。
简而言之，在37℃，5％CO2下将N87和FaDu细胞接种到含有10％血清的6孔板的孔中。16小时后，在含有1％FBS的细胞培养基中过夜饥饿培养细胞(以减少血清中生长因子引发的信号传导)。在第二天，将细胞用50μg/ml抗HER3抗体10D1处理4小时，然后用NRG(100ng/ml)刺激15分钟。然后提取蛋白质，使用标准Bradford蛋白质测定法定量，通过SDS-PAGE分离，然后转移至硝酸纤维素膜上。然后封闭膜并在4℃下用抗pHER3、抗pAKT、泛抗HER3、泛抗AKT和抗β-肌动蛋白抗体免疫印迹过夜。通过Bio-Rad Clarity Western ECL底物观察印迹，并使用光密度分析法对条带进行定量；将数据根据β肌动蛋白对照标准化。
结果如图17所示。发现抗HER3抗体10D1抑制HER3磷酸化和下游信号传导。
在进一步的实验中，发明人研究了抗HER3抗体介导的HER3抑制作用影响的细胞内信号传导途径。
将FaDu细胞在37℃、5％CO2下接种到6孔板的孔中，其中血清浓度为10％。16小时后，通过在1％FBS细胞培养基中过夜饥饿培养细胞。在第二天，将细胞用50μg/ml抗HER3抗体10D1处理4小时，然后用NRG(100ng/ml)刺激15分钟。然后提取蛋白质，使用标准Bradford蛋白质测定法定量，并与预先封闭的磷酸蛋白抗体阵列膜(雷生物技术公司)在4℃孵育过夜。然后将膜用洗涤缓冲液洗涤，并与检测抗体混合物在室温下孵育2小时，然后洗涤并与HRP缀合的抗IgG一起孵育。2小时后，洗涤膜并使用试剂盒检测缓冲液探测。用SyngeneGbox成像系统捕获图像，测量每个点/磷酸蛋白的强度，并通过与在没有抗体的情况下以相同方式处理的细胞的强度进行比较来计算抑制百分比。
结果如图18所示。发现抗HER3抗体10D1抑制PI3K/AKT/mTOR和MAPK信号传导。
在进一步的实验中，发明人研究了抗HER3抗体10D1处理对表达HER3细胞增殖的影响。
简而言之，从100μg/ml开始，用连续稀释浓度的抗HER3抗体10D1，以9点半对数稀释法处理N87和FaDu细胞。5天后，根据制造商的说明，使用CCK-8增殖测定法(同仁化学，日本)测量细胞增殖。简要地，将1x CCK-8溶液添加到每个孔中，然后在37℃下孵育2小时。然后在450nm下测量OD。
图19A和19B显示了相对于未处理的对照细胞的细胞融合百分数(数据点是三个重复的平均值)。
抗HER3抗体10D1对N87细胞和FaDu细胞显示出剂量依赖性的细胞增殖抑制作用。
实施例5：体内分析
5.1药代动力学分析
将大约6-8周龄的雌性NCr裸鼠饲养在无特定病原体的条件下，并按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南进行处理。
施用500μg抗HER3抗体，并在施用后在基线(-2小时)，0.5小时，6小时，24小时，96小时，168小时和336小时通过心脏穿刺从3只小鼠获得血液。血清中的抗体通过ELISA定量。
结果如图50所示。在NCr裸鼠中发现抗HER3抗体克隆10D1的半衰期为16.3天。
5.2安全免疫毒性
使用IMGT DomainGapAlign(Ehrenmann等，核酸研究，38，D301-307(2010))和IEDB脱免疫工具(Dhanda等，免疫学(2018)153(1)：118-132)，对HER3抗体克隆10D1进行计算机分析，以分析安全性和免疫原性。
抗HER3抗体克隆10D1的潜在免疫原性肽数量很少，不足以被认为是安全的，并且不具有任何其他可能导致潜在的可开发性问题的特性。
图37的表格概述了与安全性和可开发性有关的10D1变体克隆的特性。
监测在实施例5.3中描述的实验中用抗HER3抗体处理的小鼠的体重和大体解剖的变化。与仅用赋形剂处理的小鼠相比，在这些小鼠中未检测到差异。
在一项实验中研究了血液毒性，在该实验中，在6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(20-25g)的腹膜内注射了单剂量的1000μg抗-HER3 10D1抗体或等体积的PBS。在注射后96小时获得血液样品，并通过流式细胞术和NA+、K+和Cl-的电解质指数分析不同类型白细胞的数量。
图51A和51B表明，发现不同细胞类型的数量和电解质指数在查尔斯河参考范围内(3只小鼠)，与PBS处理组(3只小鼠)没有显著差异。左柱代表载体，右柱代表10D1处理，用虚线表示查尔斯河参考范围的终点。在不同组之间没有发现临床体征、大体解剖或体重差异。
还分析了小鼠在注射后96小时的肝毒性、肾毒性和胰腺毒性的相关性。在给予单一剂量的1000μg抗her3抗体后，与PBS处理组相比，发现检测的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、碱性磷酸酶(ALP)、葡萄糖(GLU)、钙(CAL)、总胆红素(BIL)、总蛋白(TPR)和白蛋白(ALB)在查尔斯河参考范围内，这些标志物的水平没有显著差异。这些示于图51C至51F。左柱代表载体，右柱代表10D1处理，用虚线表示查尔斯河参考范围的终点。10D1治疗对肾脏、肝脏或胰腺指数没有影响，因此不会影响正常的肾脏、肝脏或胰腺功能。
5.3体内治疗癌症的疗效分析
从InVivos(新加坡)购买大约6-8周龄的雌性NCr裸鼠。将动物圈养在无特定病原体的条件下，并按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南进行处理。
使用的细胞系包括N87细胞(胃癌)、FaDu细胞(头颈癌)、OvCAR8细胞(卵巢癌)、SNU16细胞(胃癌)、HT29细胞(结肠直肠癌)、A549细胞(肺癌)、HCC95细胞(肺癌)和AHCN细胞(肾脏)。
使用数字卡尺每周测量3次肿瘤体积，并使用公式[L×W2/2]计算。一旦对照臂的肿瘤长度>1.5cm，就认为已经达到研究终点。
5.3.1N87模型
图20显示了在N87细胞系衍生的小鼠胃癌模型中研究抗HER3抗体10D1(实施例2.2的[1])的抗癌作用的实验结果。通过将1×106N87细胞皮下注射到右胁腹(每个治疗组n＝6只小鼠)来建立模型。
每两周一次，每剂500μg(共10剂)，腹腔注射给予10D1；对照治疗组接受等体积的PBS。
发现在此模型中，抗HER3抗体克隆10D1具有很高的效力，并能够将肿瘤的生长抑制约76％。
图21显示了在类似实验中获得的结果，其中每周以11mg/kg的剂量(总共4剂)，腹膜内注射抗HER3抗体克隆4-35-B4。类似地，在该模型中发现抗-HER3抗体克隆4-35-B4具有很高的效力，并且能够将肿瘤的生长抑制约60％。
5.3.2SNU16模型
图22显示了在SNU16细胞系衍生的小鼠胃癌模型中研究抗HER3抗体10D1(实施例2.2的[1])的抗癌作用的实验结果。通过向右胁腹皮下注射1×106SNU16细胞建立模型(每个治疗组n＝6只小鼠)。
每两周一次，每剂500μg(共9剂)，腹腔注射给予10D1；对照治疗组接受等体积的PBS。
发现在此模型中，抗-HER3抗体克隆10D1非常有效，并且能够将肿瘤生长抑制约68％。
5.3.3FaDu模型
图23显示了FaDu细胞系细胞系衍生的头颈部鳞状细胞癌的小鼠模型中研究抗HER3抗体10D1(实施例2.2的[1])的抗癌作用的实验结果。通过将1×106FaDu细胞皮下注射到雌性NPG小鼠的右侧腹中来建立模型(NOD scidγ表型；每个治疗组n＝6只小鼠)。
腹膜内注射10D1，每剂量每周500μg(共4剂)。对照治疗组接受等体积的PBS或相同剂量的同型对照抗体。
发现在此模型中，抗HER3抗体克隆10D1非常有效，并且能够将肿瘤的生长抑制约85％。
图24显示了FaDu细胞系细胞系衍生的头颈部鳞状细胞癌的小鼠模型中研究抗HER3抗体10D1(实施例2.2的[1])的抗癌作用的实验结果。通过将1×106FaDu细胞皮下注射到雌性NCr裸鼠的右侧腹中(每个治疗组n＝6只小鼠)来建立模型。
每两周一次，每剂500μg(共8剂)，腹腔注射给予10D1；对照治疗组接受等体积的PBS。
发现抗HER3抗体克隆10D1在此模型中非常有效，并且能够将肿瘤生长抑制约86％。
5.3.4OvCAR8模型
图25显示了在源自OvCAR8细胞系的卵巢癌小鼠模型中研究抗HER3抗体10D1(实施例2.2的[1])的抗癌作用的实验结果。通过将1×106OvCAR8细胞皮下注射到雌性NCr裸鼠的右侧腹中建立模型(每个治疗组n＝6只小鼠)。
每两周一次，每剂500μg(共9剂)，腹腔注射给予10D1；对照治疗组接受等体积的PBS。
发现抗HER3抗体克隆10D1在此模型中非常有效，并且能够将肿瘤生长抑制约74％。
5.3.5HCC-95模型
图26显示在HCC-95细胞系衍生的鳞状细胞肺癌小鼠模型中研究了抗HER3抗体10D1(实施例2.2的[1])的抗癌作用的实验结果。通过将1×106HCC-95细胞皮下注射到雌性NCr裸鼠的右侧腹中建立模型(每个治疗组n＝6只小鼠)。
每两周一次，每剂500μg(共4剂)，腹腔注射给予10D1；对照治疗组接受等体积的PBS。
发现抗HER3抗体克隆10D1在该模型中具有很高的效力，并且能够将肿瘤的生长抑制约90％。
5.3.6A549型号
图27显示在源自A549细胞系的肺腺癌小鼠模型中研究了抗HER3抗体10D1(实施例2.2的[1])的抗癌作用的实验结果。通过将1×106A549细胞皮下注射到雌性NCr裸鼠的右侧腹中建立模型(每个治疗组n＝6只小鼠)。
每两周一次，每剂500μg(共10剂)，腹腔注射给予10D1；对照治疗组接受等体积的PBS。
发现抗-HER3抗体克隆10D1在此模型中非常有效，并且能够将肿瘤生长抑制约91％。
图28显示了在类似实验中获得的结果，其中在通过向NPG雌性小鼠(NOD scidγ表型)的右腹侧注射1×106A549细胞建立的A549细胞系衍生模型中，研究了抗HER3抗体克隆4-35-B2的抗癌作用。每周通过腹腔注射施用抗HER3抗体克隆4-35-B2，每剂量500μg(共4剂)。对照治疗组接受等体积的PBS(每个治疗组6只小鼠)。
同样，在该模型中发现抗HER3抗体克隆4-35-B2具有很高的效力，并且能够将肿瘤的生长抑制约63％。
5.3.6ACHN模型
图29显示了在ACHN细胞系衍生的肾细胞癌小鼠模型中研究了抗HER3抗体10D1(实施例2.2的[1])的抗癌作用的实验结果。通过将1×106ACHN细胞皮下注射到雌性NCr裸鼠的右侧腹中建立模型(每处理组n＝6只小鼠)。
每两周一次，每剂500μg(共7剂)，腹腔注射给予10D1；对照治疗组接受等体积的PBS。
发现抗HER3抗体克隆10D1在此模型中非常有效，并且能够将肿瘤生长抑制约61％。
5.4胃癌的治疗
第一人
失败或无法接受曲妥珠单抗治疗的HER2+晚期胃癌患者可以通过静脉注射选自以下的抗HER3抗体进行治疗：10D1、10D1_c75、10D1_c76、10D1_c77、10D1_c78v1、10D1_c78v2、10D1_11B、10D1_c85v1、10D1_c85v2、10D1_c85o1、10D1_c85o2、10D1_c87、10D1_c89、10D1_c90、10D1_c91、10D1_c92和10D1_c93，按照安全调整的“预期最低生物效应水平”(MABEL)方法计算的剂量。给药后28天监测患者。
然后，根据不良事件通用术语标准(CTCAE)对患者进行评估，以确定治疗的安全性和耐受性，以及确定分子的药代动力学。
发现用抗HER3抗体治疗是安全且可耐受的。
剂量递增–单一疗法
通过静脉注射选自以下的抗HER3抗体治疗12-48例失败或无法接受曲妥珠单抗的HER2+晚期胃癌患者：10D1、10D1_c75、10D1_c76、10D1_c77、10D1_c78v1、10D1_c78v2、10D1_11B、10D1_c85v1、10D1_c85v2、10D1_c85o1、10D1_c85o2、10D1_c87、10D1_c89、10D1_c90、10D1_c91、10D1_c92和10D1_c93(例如10D1_c89、10D1_c90或10D1_c91；例如10D1_c89)，基于3+3模型的剂量递增设计(EWOC)控制剂量递增。
然后，根据不良事件通用术语标准(CTCAE)对患者进行评估，以确定治疗的安全性和耐受性，并评估分子的药代动力学和治疗功效。还确定了最大耐受剂量(MTD)和最大给药剂量(MAD)。
剂量递增–联合治疗
通过静脉注射选自以下的抗HER3抗体治疗9-18例失败或曲妥珠单抗的HER2+晚期胃癌患者：10D1、10D1_c75、10D1_c76、10D1_c77、10D1_c78v1、10D1_c78v2、10D1_11B、10D1_c85v1、10D1_c85v2、10D1_c85o1、10D1_c85o2、10D1_c87、10D1_c89、10D1_c90、10D1_c91、10D1_c92和10D1_c93(例如10D1_c89、10D1_c90或10D1_c91；例如10D1_c89)与曲妥珠单抗的组合，与抗PD-L1抗体(3mg/kg)符合3+3模型递增。
然后，根据不良事件通用术语标准(CTCAE)对患者进行评估，以确定治疗的安全性和耐受性，并评估分子的药代动力学和治疗功效。
剂量扩大
近期曲妥珠单抗治疗失败的HER2+晚期胃癌患者，其肿瘤在遗传学和组织学上已被很好地表征，可以使用选自以下的抗HER3抗体进行治疗：10D1、10D1_c75、10D1_c76、10D1_c77、10D1_c78v1、10D1_c78v2、10D1_11B、10D1_c85v1、10D1_c85v2、10D1_c85o1、10D1_c85o2、10D1_c87、10D1_c89、10D1_c90、10D1_c91、10D1_c92、10D1_c93(例如10D1_c89，例如10D1_c89、10D1_c90或10D1_c91)，与曲妥珠单抗、顺铂，以及5-FU或卡培他滨(capecitabine)组合。
发现抗HER3抗体是安全和可耐受的，能够减少癌细胞的数量/比例，减少肿瘤细胞标志物的表达，增加无进展生存期并增加总体生存期。
实施例6：亲和力成熟和人源化克隆
亲本小鼠抗体10D1P可变区的人源化是通过CDR嫁接完成的。通过将亲本氨基酸序列与人V结构域数据库进行比对来鉴定用于嫁接的人框架序列，并选择与亲本序列具有最高相同性基因。将小鼠CDR移植到选定的人框架中后，该框架规范位置的残基被重新突变为亲本小鼠序列，以保留抗原结合力。设计了10D1P的9种人源化变体。
使用酵母展示，通过两轮亲和力成熟来提高对人HER3的亲和力。在第一轮中，通过随机诱变构建了9个设计变体的混合文库，并使用生物素化抗原通过流式细胞术进行了筛选。在第二轮中，将在第一轮中分离的一个重链和一个轻链克隆用作模板，以生成和筛选第二个文库。总共分离出10个人源化和亲和力成熟的克隆。
使用计算机模拟预测工具评估了设计和分离的10D1P人源化变体的可变区中的潜在特点(免疫原性、糖基化位点、暴露的反应性残基、聚集潜力)。使用IEDB去免疫工具将序列去免疫。10D1F的最终序列是根据其可开发性特征以及体外理化和功能特性从优化的变体中选择的。
克隆10D1F包含SEQ ID NO：36的VH和SEQ ID NO：83的VL。10D1F与人的重链显示89.9％的同源性，与人的轻链显示85.3％的同源性。
包含10D1F可变区和人IgG1恒定区的抗原结合分子，其由SEQ ID NO:206和207所示的多肽组成，标记为10D1F.FcA(有时在本文中也称为“10D1F.A”或“抗-HER3克隆10D1_c89 IgG1”–例如参见实施例2.2的[16])。
实施例7：Fc工程改造
工程改造10D1和10D1变体以在CH2和/或CH3区域中包含突变以增加抗体的效价，例如优化Fc效应子功能，增强抗体-依赖性的细胞毒性(ADCC)和/或抗体-依赖性的细胞吞噬作用(ADCP)和改善半衰期。
通过修饰克隆10D1和10D1F.FcA的Fc区，使CH2区中包含“GASDALIE”(G236A、S239D、A330L、I332E)和“LCKC”(L242C、K334C)。实验发现通过GASDALIE的取代增加了对FcγRIIa(GA)和FcγRIIIa(SDALIE)受体的亲和力，并增强了ADCP和NK介导的ADCC(参见实施例8.8)，同时降低了对C1q(AL)的亲和力并降低了CDC。实验发现LCKC的取代通过产生新的分子内二硫键而增加了Fc区的热稳定性。
包含GASDALIE和LCKC突变的10D1F.FcA重链多肽改良版如SEQ ID NO：225所示。由SEQ ID NO:225和207所示的多肽组成的抗原结合分子标记为10D1F.FcB(有时在本文中也称为“10D1F.B”)。
制备在CH2区中包含GASDALIE和LCKC取代的10D1改良版，通过生物层干涉分析法分析了其与Fc受体FcγRIIIa的结合能力。10D1 VH-CH1-CH2-CH3的序列如SEQ ID NO：227中所示，其中包含对应于G236A、S239D、A330L、I332E和L242C、K334C的GASDALIE和LCKC取代。
简而言之，使用抗五-HIS(HIS1K)涂层的生物传感器探头(颇尔佛特生物公司，美国)来捕获His标记的FcγRIIIa(V158)(270nM)，持续120s。所有测量均在25℃下以1000rpm的转速进行。通过将抗her3抗体在不同浓度(500nM至15.6nM)孵育60s，然后将生物传感器转移到含pH 7.2的实验缓冲液中，解离时间为120s，对抗原结合的缔合动力学进行测量。传感图参考缓冲液效果，然后使用Octet QK384用户软件(颇尔佛特生物公司，美国)进行拟合。使用一个位点结合模型对动力学响应进行整体拟合，以获得缔合值(Kon)，解离率(Koff)速率常数和平衡解离常数(KD)。分析中仅包含可通过软件可靠拟合的曲线(R2>0.90)。
如实施例3.4中所述，还通过差示扫描荧光法分析来分析变体的热稳定性。
图38A和38B分别显示了BLI分析和热稳定性分析，包含GASDALIE和LCKC Fc取代的10D1的。与非Fc工程改造的10D1(参见图39A)相比，Fc改造的10D1变体与FcγRIIIa的结合表现出显著改善(亲和力增加了9倍)(见图39A)，并且在60℃以上维持热稳定性。
还制备了在CH2区域中包含GASD取代的10D1构建体。包含对应于G236A和S239D的取代的10D1 VH-CH1-CH2-CH3的序列示于SEQ ID NO：228。
通过生物层干涉术分析抗HER3抗体克隆10D1(实施例2.2的[1])及其GASD变体与FcγRIIIa的结合亲和力。如上所述进行BLI。
图39A和39B显示了代表性的传感图，Kon、Koff和KD值。如预期的那样，与10D1(39A)相比，10D1 GASD变体(39B)对FcγRIIIa的亲和力大大提高。
如实施例3.4中所述，还通过差示扫描荧光法分析来分析10D1 GASD变体的热稳定性。结果如图40所示。
其他10D1F Fc变体
创建了另一个抗体变体，其在CH2区域中包含N297Q取代。包含N297Q取代的10D1FVH-CH1-CH2-CH3的代表性序列示于SEQ ID NO：226。这种沉默形式既防止了Fc区的N-联糖基化，又阻止了Fc与Fcγ受体的结合，并被用作阴性对照。
图41A和41B显示了如上所述测定的10D1F hIgG1 Fc变体10D1F.FcA和10D1F.FcB与人和小鼠Fc受体的结合亲和力。与未修饰的10D1F.FcA或市售抗体相比，发现10D1F.FcB与人和小鼠Fcγ和FcRn受体的结合显著改善。ND＝由于低结合亲和力未确定的KD。
实施例8：人源化和修饰克隆的表征
8.1通过流式细胞术分析细胞表面抗原结合
将野生型(WT)HEK293细胞(不表达高水平的HER3)和用编码人HER3的运载体转染的HEK293细胞(即HEK293 HER O/E细胞)与10μg/ml的人源化抗HER3抗体10D1F.FcA(10D1F)、抗HER3抗体10D1(10D1P)，或同种型对照抗体在4℃孵育1.5小时。分析中包括抗HER3抗体克隆LJM716(例如Garner等，癌症研究(2013)73：6024-6035，和实施例3.5)作为阳性对照。
在4℃下，将细胞用缓冲液(含2mM EDTA和0.5％BSA的PBS)洗涤，并在10μg/ml的浓度的FITC偶联的抗FC抗体(英杰公司，美国)中重悬20分钟。再次洗涤细胞，并重悬于200μL的FACS流动缓冲液(含5mM EDTA的PBS)中，使用MACSQuant 10(美天旎生物技术公司，德国)进行流式细胞术分析。分析中包括未染色的WT和转染的HEK293细胞作为阴性对照。采集后，使用Flowlogic软件分析所有原始数据。使用正向和侧向散射曲线对细胞进行门控，确定天然细胞和过表达细胞群体中阳性细胞的百分比。
结果显示在图42A和42B中。抗HER3抗体10D1F.FcA已显示出与人HER3的高特异性结合(42A)。10D1F.FcA，10D1P和LJM716与人HER3表达细胞的结合程度相似(42B)。
8.2用于确定抗体特异性和交叉反应性的ELISA实验
通过ELISA来确认10D1F.FcA抗体的结合特异性。分析了抗体与人HER3多肽以及人HER1(EGFR)和人HER2(Sino生物股份有限公司，中国)结合的能力。人IgG同种型和无关抗原被包括作为阴性对照。
根据标准方案进行ELISA。在4℃下，用磷酸盐缓冲液(PBS)配置的0.1μg/ml的目标多肽包被板16h。在室温下用1％BSA的Tris缓冲盐水(TBS)封闭1小时后，将抗HER3抗体进行系列稀释，最高浓度为10μg/ml，并添加到平板中。在室温下孵育1小时后，将用含有0.05％吐温20的TBS(TBS-T)洗涤平板3次，然后与HRP偶联的抗His抗体(生命科技有限公司，美国)在室温下孵育1h。洗涤后，用比色检测底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(Turbo-TMB；皮尔斯公司，美国)显影平板10分钟。用2M H2SO4终止反应，450nM测定OD。
结果如图43所示。发现即使在高浓度的抗体下，抗HER3抗体10D1F.FcA也不结合人HER2或人HER1(EGFR)。
使用流式细胞术分析了10D1F.FcA结合HER4的能力。将野生型(WT)HEK293细胞(不表达高水平的HER4)和用编码人HER4的运载体转染的HEK293细胞(即HEK293 HER O/E细胞)与10μg/ml的抗HER3抗体10D1F.FcA(10D1F)或同型对照抗体(阴性对照)在4℃孵育1.5小时。抗HER3抗体克隆LJM716(例如Garner等，癌症研究(2013)73：6024-6035中所述)和如实施例3.5中所述的MM-121(塞立单抗)作为分析中的阳性对照。还包括商品化的抗HER4抗体(罗福斯，目录号：FAB11311P)。分析中包括未染色的HEK293细胞作为阴性对照。
将HEK293细胞与10μg/ml的每种抗体在4℃孵育1小时。如上所述进行流式细胞术。在4℃，将细胞接触FITC偶联的抗FC抗体(英杰公司，美国)30分钟。
结果如图44所示。发现抗HER3抗体10D1F.FcA不结合细胞表面表达的HER4。
此外，分析了抗体10D1F.FcA与小鼠，大鼠和猴的HER3多肽同源物结合的能力(中生物股份有限公司，中国)。小鼠(M.musculus)、大鼠(R.norvegicus)和食蟹猴(M.cynomolgus)的HER3同源物分别与人HER3有91.1、91.0和98.9％的序列同一性，而HER3信号通路在这四个物种之间是保守的。
ELISA如上所述进行。
结果如图45所示。发现10D1F.FcA抗体与食蟹猴、小鼠、大鼠HER3和人类直系同源物具有高亲和力结合，因此在物种之间表现出实质性的交叉反应性。
8.3通过Octet QK384系统的全亲和力研究
分析抗HER3抗体克隆10D1F.FcA和10D1F.FcB与人HER3的结合亲和力。
使用Octet QK384系统(佛特生物公司)进行了生物层干涉(BLI)实验。将抗体(25nM)涂在抗人IgG捕获(AHC)八位位点传感器探针上(颇尔佛特生物公司，美国)。通过滴定的有HIS标签的人HER3，在基线(60s)、负载(120s)、基线2(60s)、缔合(120s)、解离(FcA120s，FcB 600s)和再生(15秒)检测结合力。抗原浓度示于图46A和46B的表中。如实施例3.3中所述分析传感图。获得了缔合(Kon)，解离(Koff)速率常数和平衡解离常数(KD)的值。
图46A和46B显示了用于分析克隆10D1F.FcA和10D1F.FcB的代表性传感图。10D1F.FcA以KD＝72.6pM(46A)的高亲和力结合人HER3。10D1F.FcB以KD＝22.2pM(46B)的高亲和力结合人HER3。
8.4通过差示扫描荧光法分析热稳定性
如实施例3.4中所述对抗体10D1F.FcA和10D1F.FcB进行差示扫描荧光法。
通过差示扫描荧光法分析抗体克隆10D1F.FcA的热稳定性而获得的原始数据的一阶导数如图47A所示。分析了抗体的三个不同样品，并将Tm确定为70.0℃。
通过差示扫描荧光法分析抗体克隆10D1F.FcB的热稳定性而获得的原始数据的一阶导数如图47B所示。分析了抗体的三个不同样品，并将Tm确定为62.7℃。
8.5抗体纯度分析
通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析抗体10D1F.FcA和10D1F.FcB的纯度。将溶于500μlPBS pH 7.2的150μg 10D1F.FcA或溶于500μlPBS pH 7.45的150μg10D1F.FcB以0.75min/ml或0.5min/ml的流速分别注入有PBS流动缓冲液的Superdex 200 10/30GL柱中，在室温下记录了A280下的流通量。
结果显示在图48A(10D1F.FcA)和48B(10D1F.FcB)中。
8.6抗HER3抗体10D1F.FcA表位分析
分析抗HER3抗体10D1F.FcA，以确定其是否与抗HER3抗体M-05-74或M-08-11(罗氏)竞争结合HER3。M-05-74和M-08-11的表位都映射到位于结构域II的HER3二聚化臂的β-发夹结构上。M-08-11不与HER4结合，而M-05-74识别HER4二聚臂。M-05-74和M-08-11与HER3的结合是独立于配体(NRG)的。
如实例3.5中所述进行BLI实验，但有一点不同：使用了400nM竞争抗体。将M-05-74和M-08-11抗体的可变区克隆到具有人IgG1和IgκFc骨架的PDZ运载体中。
分析结果示于图49A和49B。发现抗HER3 10D1F.FcA抗体不与M-05-74或M-08-11竞争与HER3的结合。与M-05-74和M-08-11相比，发现10D1F.FcA结合HER3的一个独特且在拓扑上相距遥远的表位。10D1F.FcA与HER3的结合不依赖于配体(NRG)。
结论：
10D1F.FcA与人HER3的结合可以以不依赖配体的方式实现。
10D1F.FcA结合表位与M-05-74和M-08-11的表位不同且在拓扑上相距较远。
8.7抑制HER2-HER3和EGFR-HER3的二聚化
分析了抗HER3抗体10D1F.FcA抑制HER3和HER2异源二聚化的能力。
根据标准方案进行基于板的ELISA二聚化测定。用1μg/ml HER2-Fc蛋白包被平板。封闭并洗涤后，将板与不同浓度的候选抗体10D1F.FcA、MM-121、LJM716、帕妥珠单抗、罗氏M05、罗氏M08或同种型对照以及恒定的HER3 His2μg/ml和NRG 0.1μg/ml孵育1小时。然后洗涤板，并与抗HIS HRP二抗一起孵育1小时。洗涤板，用TMB处理10分钟，并使用2M H2SO4终止溶液终止反应。在450nm读取吸光度。
结果如图52所示。发现抗HER3抗体克隆10D1F.FcA以剂量依赖性方式直接抑制HER2和HER3之间的相互作用。
在另一试验中，使用帕妥珠单抗检测到二聚化抑制
生物测定试剂盒(DiscoverX，美国旧金山)。使用1ml预热的CP5培养基融化HER2和HER3过表达的U20S细胞，并在37℃，5％CO2中分别接种5K细胞4小时。用连续稀释的10D1F.FcA，塞立单抗或帕妥珠单抗浓度从25μg/ml开始，以8点系列稀释液处理细胞。孵育4小时后，将30ng/ml的调蛋白-β2添加至每个孔，并将板进一步温育16小时。孵育后，添加10μL PathHunter生物测定检测试剂1并在黑暗中于室温下孵育15分钟，然后添加40μLPathHunter生物测定检测试剂2，然后将其在室温下于黑暗中孵育60分钟。使用Synergy4Biotek延迟1秒读取板。
发现10D1F.FcA抑制HER2-HER3异二聚化的EC50值为3.715e-11。在同一试验中，发现塞立单抗/MM-121的EC50相对值是6.788e-10，而帕妥珠单抗的EC50相对值是2.481e-10。
分析抗HER3抗体10D1F.FcA抑制EGFR和HER3异源二聚化的能力。
根据标准方案进行基于板的ELISA二聚化测定。用1μg/ml人EGFR-His包被板。封闭并洗涤后，将板与不同浓度的候选抗体10D1F.FcA、MM-121、LJM716、帕妥珠单抗或同种型对照以及恒定的HER3-生物素4μg/ml和NRG 0.1μg/ml孵育1小时。然后洗涤板，并与抗亲和素HRP二抗孵育1小时。洗涤板，用TMB处理10分钟，并使用2M H2SO4终止溶液终止反应。在450nm读取吸光度。
结果如图53所示。发现抗HER3抗体克隆10D1F.FcA以剂量依赖性方式直接抑制EGFR和HER3之间的相互作用。
8.8诱导ADCC的能力分析
分析抗HER3抗体克隆10D1F.FcA和10D1F.FcB诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。
将靶细胞(过表达HER3的HEK293)以20,000个细胞/孔的密度接种在U型底96孔板中。通过下述系列稀释之一(50,000ng/ml–0.18ng/ml)处理细胞：10D1F.FcA、10D1F.FcB、10D1F.FcA_N297Q(沉默形式)、LJM-716、塞立单抗(MM-121)或不经处理，然后在37℃和5％CO2中孵育30分钟。将效应细胞(人类自然杀伤细胞系No-GFP-CD16.NK-92；176V)以60,000细胞/孔的密度添加至含有靶细胞的平板中。
包括以下对照：靶细胞的最大LDH释放量(仅靶细胞)、自发释放(无抗体的靶细胞和效应细胞)、背景(仅培养基)。离心板，并在37℃和5％CO2下温育21小时。
LDH释放测定法(皮尔斯公司LDH细胞毒性测定试剂盒)：在测定之前，将10μl裂解缓冲液(10X)加入目标细胞的最大LDH释放对照中，并在37℃和5％CO2中孵育20分钟。孵育后，将板离心，并将50μL上清液转移至透明的平底96孔板中。通过向上清液中加入50μl含底物的LDH分析混合物开始反应，并在37℃下孵育30分钟。加入50μl终止液终止反应，并用BioTeKSynergy HT酶标仪记录490nm和680nm的吸光度。
为了进行数据分析，将测试样品的吸光度校正为背景，并自靶细胞和效应细胞自发释放。计算相对于靶细胞最大LDH释放对照的测试样品的细胞毒性百分比，并作为抗体浓度的函数作图。
结果如图54所示。发现抗HER3抗体10D1F.FcB以剂量依赖性方式诱导针对过表达HER3的细胞的有效ADCC活性。
8.9抑制HER3介导的信号传导
分析了抗HER3抗体10D1F.FcA在癌细胞系中体外抑制HER-3介导信号的能力。
将N87、FaDu或OvCAR8细胞接种在6％孔板中的孔中，在10％血清中于37℃用5％CO2过夜。用0.2％FBS培养基使细胞饥饿16小时，然后在对应于细胞系IC50，用不同抗体处理0.5小时。测试的抗体是：10D1F.FcA(10D1)、塞立单抗(SBT)、埃格曼图姆单抗(LJM)、帕妥珠单抗(PTM)、西妥昔单抗(CTX)和曲妥珠单抗(TZ)。
收获前，用100ng/ml NRG1刺激细胞。使用标准的Bradford蛋白质测定法对从细胞系提取的蛋白质进行定量。通过SDS-PAGE分离蛋白质样品(50μg)，并转移到硝酸纤维素膜上。然后将膜封闭，并用所示抗体进行免疫印迹。结果通过Bio-Rad Clarity Western ECL底物可视化。使用密度分析对印迹进行定量，并且将数据标准化为β肌动蛋白。
结果显示在图55A至55C中。发现抗HER3抗体10D1F.FcA在N87(55A)、FaDu(55B)、OvCar8(55C)和A549(55D)细胞系中抑制HER3磷酸化和下游信号传导。
对于使用N87细胞、A549细胞、OvCar8细胞和FaDu细胞的实验，分析了抗体处理后16小时的总RNA，并通过基因集富集分析基于关键信号转导途径蛋白的表达水平来确定途径激活。
分析结果示于图63A至63D中。10D1F.FcA是下游信号传导的最有效抑制剂。
在使用A549细胞的进一步实验中，按上述方法进行体外磷酸化测定，不同的是，将细胞用不同的抗体处理0.5小时或4小时。结果如图64所示。
实施例9：人源化和经修饰克隆的体外和体内分析
9.1药代动力学分析
小鼠
将大约6-8周龄的雌性NCr裸鼠饲养在无特定病原体的条件下，并按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南进行处理。
施用500μg抗HER3抗体10D1F.FcA或10D1F.FcB，并在施用后在基线(-2小时)、6小时、24小时、96小时、168小时和336小时通过心脏穿刺从4只小鼠获得血液。血清中的抗体通过ELISA定量。
药代动力学分析的参数来源于非房室模型：最大浓度(Cmax)、AUC(0-336hr)、AUC(0-无穷大)、半衰期(t1/2)、清除率(CL)、稳态下的分配量(Vss)。
结果显示在图56A和56B中。在NCr裸鼠中发现抗HER3抗体克隆10D1F.FcA的半衰期为253小时(56A)，发现抗HER3抗体克隆10D1F.FcB的半衰期为273小时(56B)。
大鼠
分析10D1F变体以确定雌性Sprague Dawley大鼠的单剂量药代动力学特征，平均体重为320g。
通过尾静脉缓慢静脉注射，抗体克隆10D1F.FcA和10D1F.FcB以4mg(～10mg/kg)、10mg(～25mg/kg)、40mg(～100mg/kg)或100mg(～250mg/kg)的单剂量给药。载体作为阴性对照。给药后在基线(-24小时)，6小时，24小时，96小时，168小时和336小时从每个处理中获得2只大鼠的血液。血清中的抗体通过ELISA定量。
药代动力学分析的参数来源于非房室模型：最大浓度(C max)、AUC(0-336hr)、AUC(0-无穷大)、半衰期(t1/2)、清除率(CL)、稳态下的分配量(Vss)。
结果显示在图57A(10mg/kg)、57B(25mg/kg)、57C(100mg/kg)和57D(250mg/kg)中。
9.2安全性免疫毒性
分析了10D1F.FcA和10D1F.FcB的毒理作用。
小鼠
向6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(20-25g)腹膜内注射以下剂量之一的单剂量10D1F.FcA和10D1F.FcB：200ug(～10mg/kg)、500ug(～25mg/kg)、2mg(～100mg/kg)或5mg(～250mg/kg)或等体积的PBS。每种处理注射3只小鼠，注射PBS对照4只小鼠。注射后96小时采集血样并分析RBC指数(RBC总数、血细胞比容、血红蛋白、血小板计数、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度)和WBC指数(WBC总数、淋巴细胞总数、中性粒细胞计数、单核细胞计数)。使用HM5血液分析仪进行分析。
结果显示在图58A、58B(RBC指数)和58C(WBC指数)中。抗HER3抗体10D1F.FcA和10D1F.FcB对RBC指数无影响，但发现在较高剂量下(10D1F.FcA 250mg/kg、10D1F.FcB100mg/kg、10D1F.FcB 250mg/kg)对WBC指数有影响。
注射后96小时后，还分析了肝毒性、肾毒性和胰腺毒性。10D1F.FcA和10D1F.FcB对丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、白蛋白、总蛋白(肝指数；图58D)、肌酸、血尿素氮、葡萄糖或淀粉酶(肾脏和胰腺指数；图58E)的水平没有影响。10D1F.FcA和10D1F.FcB也不会对电解质指数钠、钾、钙或磷酸盐产生影响(图58F)。
用10D1F.FcA或10D1F.FcB处理的小鼠在体重、行为、皮肤状况、口腔检查、粪便和尿液检查或眼睛检查96小时后未显示异常。在用较高剂量治疗的小鼠中，脾脏增大(脾肿大)约为正常大小的1.5倍：10D1F.FcA 250mg/kg，10D1F.FcB 100mg/kg，10D1F.FcB 250mg/kg。
在BALB/c小鼠中进行了进一步的研究，以评估重复剂量500μg(～25mg/kg)10D1F.FcA或10D1F.FcB的毒理作用。抗体每周施用一次，持续4周。第一次给药后28天获得血液。没有观察到任何一种抗体对RBC、肝、肾、胰或电解质指数的影响，没有临床异常的迹象，在总的肾镜检查中没有发现差异。在用10D1F.FcA或10D1F.FcB处理的小鼠中，观察到总的WBC计数，淋巴细胞计数和中性粒细胞计数降低，但这被认为没有毒性。
在另一项研究中，给予BALB/c小鼠单剂量的10D1F.FcA或等体积的PBS(载体对照)，并在336小时后进行分析。代表性结果示于图69A至69C。
大鼠
向6-8周龄的Sprague Dawley雌性大鼠(400-450g)腹膜内注射以下剂量之一的单剂量10D1F.FcA或10D1F.FcB抗体：4mg(～10mg/kg)、10mg(～25mg/kg)、40mg(～100mg/kg)、100mg(～250mg/kg)。在-24小时、6小时、24小时、96小时、168小时和336小时获得血液。注射后长达366小时，对RBC指数无影响，对WBC指数无毒性作用，对肝、肾、胰腺或电解质指数无影响。没有临床异常的迹象，整体解剖检查(gross necroscopy)也没有发现差异。
从给予250mg/kg 10D1F.FcA的大鼠获得的代表性结果显示在图70A至70C中。
啮齿动物毒理学模型中没有毒性信号表明10D1及其变体具有优越的临床安全性。
9.3体外治疗癌症的疗效分析
在多种肿瘤模型中分析了抗HER3抗体10D1F.FcA在体外抑制肿瘤生长的能力：N87细胞(胃癌)、HCC95细胞(肺癌)、FaDu细胞(头颈癌)、SNU-16细胞(胃癌)、A549细胞(肺癌)、OvCar8细胞(卵巢癌)、ACHN细胞(肾脏)癌症)和HT29细胞(大肠癌)。将10D1F.FcA的功效与其他抗HER3抗体的塞立单抗(MM-121)和LJM-716以及其他EGFR家族疗法西妥昔单抗、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗进行了比较。
通过起始浓度为1500ug/ml的9点稀释，以连续稀释浓度的治疗性抗体处理细胞。在处理后3-5天，使用CCK-8细胞增殖测定法测量细胞活力。显示的细胞抑制百分比是相对于仅用缓冲液(PBS)处理的细胞而言的。数据点表示三个重复的平均值。
结果示于图59A至59D。与其他HER3抗体(59A和59B)和EGFR家族疗法(59C和59D)相比，抗HER3抗体10D1F.FcA在多种肿瘤模型中显示出优异的体外肿瘤抑制作用。
图77A和77B显示了不同的抗ErbB抗体在体外以25mg/kg相关抗体腹膜内给药的小鼠达到的C最大浓度抑制不同癌细胞系增殖的能力。10D1F.FcA显示出抑制多种不同癌细胞类型生长的出色能力。
9.4体内治疗癌症的疗效分析
在体内癌症模型中评估了抗HER3抗体克隆10D1F.FcA和10D1F.FcB对肿瘤生长的影响。
9.4.1A549模型
将肿瘤细胞皮下注入雌性NCr裸鼠的右侧腹。每两周一次给予抗体(25mg/kg10D1F.FcA、10D1F.FcB、西妥昔单抗、LJM-716或MM-121；每种治疗n＝6)或赋形剂(n＝8)，每六周一次。
结果如图60所示。抗HER3抗体克隆10D1F.FcA和10D1F.FcB在肺癌A549模型中均显示出有效的功效。发现10D1F.FcB特别有效并且使肿瘤消退。
9.4.2FaDu模型
用基质胶将肿瘤细胞皮下插入雌性NCr裸鼠的右侧腹中。抗体(10和25mg/kg10D1F.FcA和10D1F.FcB、或25mg/kg西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、LJM-716或MM-121；每种治疗方法n＝6)或载体(n＝6)每周给予一次，共六周。
结果如图61所示。在头颈癌的FaDu模型中，发现抗HER3抗体克隆10D1F.FcA和10D1F.FcB均有效预防肿瘤生长。
9.4.3OvCar8模型
用基质胶将肿瘤细胞皮下插入雌性NCr裸鼠的右侧腹中。每周一次给予抗体(10和25mg/kg 10D1F.FcA、或25mg/kg西妥昔单抗、LJM-716或MM-121；n＝6)或赋形剂(n＝6)，连续六周。
结果如图62所示。发现抗HER3抗体克隆10D1F.FcA在高剂量下可有效减少肿瘤体积。
9.4.4N87模型
用基质胶将肿瘤细胞皮下插入雌性NCr裸鼠的右侧腹中。每两周一次给予抗体(25mg/kg 10D1F.FcA或50mg/kg曲妥珠单抗、LJM-716或MM-121；每种治疗方法n＝6)或赋形剂(n＝6)，共六周。
结果如图74所示。抗HER3抗体10D1F.FcA在胃癌N87模型中被发现可有效预防肿瘤生长。
实施例10：抑制BRAFV600E突变型甲状腺癌细胞系增殖的分析
研究了以下细胞系：
细胞系 癌症类型 突变
SW1736 间变性甲状腺癌 BRAF V600E
BHT101 间变性甲状腺癌 BRAF V600E
BCPAP 甲状腺乳头状癌 BRAF V600E和p53突变
通过流式细胞术研究细胞中EGFR家族成员的表面表达。简而言之，将300,000个细胞与20μg/ml的10D1F.FcA，西妥昔单抗或曲妥珠单抗在4℃下孵育1小时。使用浓度为10μg/ml的Alexafluor 488偶联抗人抗体，作为二抗(4℃下40分钟)。
结果显示在图66A至66C中。显示SW1736、BHT101和BCPAP细胞表达EGFR、HER2和HER3。
发明人研究了不同的HER3结合抗体抑制具有V600E BRAF突变的不同甲状腺癌细胞系体外增殖的能力。
简而言之，将不同细胞系的细胞以1.5×105细胞/孔的密度接种，并在第二天以10D1F.FcA、塞立单抗、LJM-716、帕妥珠单抗或同型对照抗体从1000μg/ml起始的10点系列稀释液处理细胞。3天后，使用CCK-8细胞增殖测定法测量增殖。相对于用等体积的PBS代替抗体处理的细胞，计算了增殖抑制百分比。
结果显示在图67A至67C中。发现10D1F.FcA在抑制携带BRAF V600E突变的细胞系的增殖方面比分析的任何其他抗HER3抗体更有效。
在进一步的实验中，研究了10D1F.FcA和维罗非尼的组合抑制具有V600E BRAF突变的不同甲状腺癌细胞系体外增殖的能力。
将细胞以1.5×105细胞/孔的密度接种，并在第二天，在存在或不存在200nM维罗非尼时，以10D1F.FcA或同种型对照抗体从1000μg/ml开始的10点系列稀释液的处理细胞。3天后，使用CCK-8细胞增殖测定法测量增殖。相对于用等体积的PBS代替抗体处理的细胞，计算了增殖抑制百分比。
结果显示在图68A至68C中。发现10D1F.FcA增强了维拉非尼抑制易受维拉非尼影响的SW1736和BHT101细胞增殖的能力。还发现10D1F.FcA是抗维拉非尼BCPAP细胞增殖的有效抑制剂。
实施例11：抑制her3介导的信号传导的体内分析
发明人研究了10D1F.FcA体内抑制HER3介导的信号传导的能力。
将1×106FaDu或OvCar8细胞皮下注入NCr裸鼠中，以建立异位异种移植肿瘤。
一旦肿瘤的体积超过100mm3，就每两周一次腹膜内注射剂量为25mg/kg的10D1F.FcA或等体积的载体(对照)治疗小鼠。4周后，收获肿瘤。从肿瘤制备蛋白提取物，并通过Bradford测定法定量，通过SDS-PAGE分离50μg样品，并使用抗体通过western印迹分析，以测定HER3和AKT的体内磷酸化，如实施例4.3中所述。
结果如图71所示。发现10D1F.FcA在体内抑制肿瘤细胞中HER3和AKT的磷酸化。
实施例12：抗HER3抗体内在化分析
发明人研究了表达HER3的细胞对抗HER3抗体的内在化。
简而言之，将100,000个经工程改造表达HER3、HCC95、N87或OVCAR8细胞的HEK293细胞接种到96孔组织培养板的孔中，并在37℃，5％CO2中培养过夜。然后将细胞用120nM的10D1F.FcA、LJM-716、塞立单抗或曲妥珠单抗和360nM的pHrodo iFL绿色试剂处理，并在37℃，5％CO2中孵育。每30分钟将培养的细胞在每个孔的4个不同视野中成像24小时。在24小时内量化每个场的FITC通道中的最大信号强度。
结果如图72所示。在OvCar8细胞中观察到LJM-716和塞立单抗的中度内化，而在N87细胞中观察到曲妥珠单抗中度内化。
在HCC95，N87或OvCar8细胞中未观察到10D1F.FcA的明显内在化。
如预期的那样，在过表达HER3的HEK293细胞中观察到10D1F.FcA、LJM-716和塞立单抗的明显内在化。
在进一步的实验中，通过流式细胞术研究了抗体的内在化。
将N87细胞以50,000个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板的孔中，并使其粘附过夜(37℃，5％CO2)。将10D1F.FcA或曲妥珠单抗与标记试剂混合，然后将标记的复合物添加到细胞中。通过抽吸细胞培养基，用PBS洗涤并用细胞消化液(Accutase)处理，在0分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时和4.5小时的时间点收集样品。中和Accutase的活性，并将细胞重悬于FACs缓冲液中，并通过流式细胞术分析。
结果显示在图73A和73B中。细胞显示出10D1F.FcA的内在化最小。相比之下，观察到抗HER2抗体曲妥珠单抗的大量内在化。
实施例13：HER3结合抗体在免疫组化中的应用
评估了mIgG2a形式的抗HER3抗体10D1F在免疫组织化学中用于检测人HER3蛋白的能力。
使用邦德试剂(徕卡生物系统)进行切片处理。获得了市场上可买到的冷冻组织切片数组。将载玻片在干燥器中干燥10分钟，然后进行以下处理，并在步骤之间进行水洗和/或TBS-T漂洗：(i)通过在室温下用100％丙酮处理10分钟进行固定；(ii)通过在室温下用3％(v/v)H2O2处理15分钟来阻断内源性过氧化物酶；(iii)在室温下用10％山羊血清处理30分钟来封闭，(iv)在6.2mg/ml溶液的1：250稀释下与10D1F-mIgG2a在4℃下孵育过夜，(v)与HRP孵育-聚合物缀合的山羊抗小鼠抗体在室温下放置30分钟，(vi)在室温下用邦德MixedDAB Refine显影5分钟，然后用去离子水和1x邦德洗脱液冲洗以终止反应。
然后将玻片脱水，在合成固定介质中固定，并进行高分辨率扫描。
结果显示在图75A和75B中。10D1F优先染色恶性人体组织切片，与正常组织的交叉反应性低。
在进一步的实验中，在冷PBS中收获A549异种移植肿瘤，将其包埋在OCT冷冻嵌入培养基中，在干冰中冷冻并保存在-80℃中。使用低温恒温器获得10μm切片。
将载玻片在干燥器中干燥10分钟，然后进行以下处理，并在步骤之间进行水洗和/或TBS-T漂洗：(i)通过在室温下用100％丙酮处理10分钟进行固定；(ii)通过在室温下用3％(v/v)H2O2处理15分钟来阻断内源性过氧化物酶；(iii)在室温下用10％山羊血清处理30分钟来封闭；(iv)4℃下，与1:50稀释到8.8mg/ml溶液的10D1F.FcA孵育，或与1：200稀释的Sino生物的兔抗HER3(货号.10201-T24)孵育过夜，(v)与英杰公司的F(ab')2-山羊抗人IgG(H+L)HRP(A24470)(1：500)或HRP-聚合物缀合的山羊抗兔抗体在室温下一起孵育30分钟，(vi)用邦德Mixed DAB Refine在室温下放置5分钟，然后用去离子水和1x邦德洗脱液冲洗以终止反应。
然后将玻片用苏木精复染色，脱水，在合成固定介质中固定，并进行高分辨率扫描。
结果在图76中示出。10D1F.FcA显示出A549肿瘤异种移植冰冻切片的特异性膜和细胞质染色。
序列表
<110> 蜂鸟生物科技控股私人有限公司 (所有指定国)
R·克莱格 （仅针对卢森堡）
<120> HER3抗原结合分子
<130> 007450844
<150> PCT/EP2018/058259
<151> 2018-03-29
<150> US 16/170,370
<151> 2018-10-25
<160> 231
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1342
<212> PRT
<213> 智人 HER3 同种型 1
<400> 1
Met Arg Ala Asn Asp Ala Leu Gln Val Leu Gly Leu Leu Phe Ser Leu
1 5 10 15
Ala Arg Gly Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr
20 25 30
Leu Asn Gly Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr
35 40 45
Leu Tyr Lys Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu
50 55 60
Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile
65 70 75 80
Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr
85 90 95
Leu Pro Leu Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp
100 105 110
Gly Lys Phe Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser
115 120 125
His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser
130 135 140
Gly Gly Val Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr
145 150 155 160
Ile Asp Trp Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val
165 170 175
Lys Asp Asn Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly
180 185 190
Arg Cys Trp Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr
195 200 205
Ile Cys Ala Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn
210 215 220
Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp
225 230 235 240
Thr Asp Cys Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val
245 250 255
Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu
260 265 270
Glu Pro Asn Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala
275 280 285
Ser Cys Pro His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala
290 295 300
Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys
305 310 315 320
Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser
325 330 335
Gly Ser Arg Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val
340 345 350
Asn Cys Thr Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu
355 360 365
Asn Gly Asp Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu
370 375 380
Asn Val Phe Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln
385 390 395 400
Ser Trp Pro Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr
405 410 415
Thr Ile Gly Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile
420 425 430
Met Lys Asn Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu
435 440 445
Ile Ser Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr
450 455 460
His His Ser Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu
465 470 475 480
Arg Leu Asp Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu
485 490 495
Gly Lys Val Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro
500 505 510
Gly Pro Gly Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val
515 520 525
Cys Val Thr His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala
530 535 540
His Glu Ala Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met Glu
545 550 555 560
Gly Thr Ala Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys
565 570 575
Ala His Phe Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
His Leu Thr Met Ala Leu Thr Val Ile Ala Gly Leu Val Val Ile Phe
645 650 655
Met Met Leu Gly Gly Thr Phe Leu Tyr Trp Arg Gly Arg Arg Ile Gln
660 665 670
Asn Lys Arg Ala Met Arg Arg Tyr Leu Glu Arg Gly Glu Ser Ile Glu
675 680 685
Pro Leu Asp Pro Ser Glu Lys Ala Asn Lys Val Leu Ala Arg Ile Phe
690 695 700
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Gly Thr Val His Lys Gly Val Trp Ile Pro Glu Gly Glu Ser Ile Lys
725 730 735
Ile Pro Val Cys Ile Lys Val Ile Glu Asp Lys Ser Gly Arg Gln Ser
740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
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850 855 860
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Glu Asn Ile Arg Pro Thr Phe Lys Glu
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Leu Ala Asn Glu Phe Thr Arg Met Ala Arg Asp Pro Pro Arg Tyr Leu
965 970 975
Val Ile Lys Arg Glu Ser Gly Pro Gly Ile Ala Pro Gly Pro Glu Pro
980 985 990
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Leu Asp Leu Asp Leu Asp Leu Glu Ala Glu Glu Asp Asn Leu Ala
1010 1015 1020
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Asn Arg Pro Arg Gly Ser Gln Ser Leu Leu Ser Pro Ser Ser Gly
1040 1045 1050
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Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser Glu Arg Cys Pro Arg Pro Val Ser
1070 1075 1080
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Gly His Val Thr Gly Ser Glu Ala Glu Leu Gln Glu Lys Val Ser
1100 1105 1110
Met Cys Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Arg Pro Arg Gly
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1130 1135 1140
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<210> 2
<211> 183
<212> PRT
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His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Gly Gln Phe Pro
130 135 140
Met Val Pro Ser Gly Leu Thr Pro Gln Pro Ala Gln Asp Trp Tyr Leu
145 150 155 160
Leu Asp Asp Asp Pro Arg Leu Leu Thr Leu Ser Ala Ser Ser Lys Val
165 170 175
Pro Val Thr Leu Ala Ala Val
180
<210> 3
<211> 331
<212> PRT
<213> 智人 HER3 同种型 3
<400> 3
Met Arg Ala Asn Asp Ala Leu Gln Val Leu Gly Leu Leu Phe Ser Leu
1 5 10 15
Ala Arg Gly Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr
20 25 30
Leu Asn Gly Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr
35 40 45
Leu Tyr Lys Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu
50 55 60
Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile
65 70 75 80
Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr
85 90 95
Leu Pro Leu Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp
100 105 110
Gly Lys Phe Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser
115 120 125
His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser
130 135 140
Gly Gly Val Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr
145 150 155 160
Ile Asp Trp Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val
165 170 175
Lys Asp Asn Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly
180 185 190
Arg Cys Trp Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr
195 200 205
Ile Cys Ala Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn
210 215 220
Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp
225 230 235 240
Thr Asp Cys Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val
245 250 255
Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu
260 265 270
Glu Pro Asn Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala
275 280 285
Ser Cys Pro His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala
290 295 300
Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys
305 310 315 320
Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Phe
325 330
<210> 4
<211> 1283
<212> PRT
<213> 智人 HER3 同种型 4
<400> 4
Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser
1 5 10 15
Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met
20 25 30
Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly
35 40 45
Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr
50 55 60
Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu
65 70 75 80
Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu
85 90 95
Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp
100 105 110
Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His
115 120 125
Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln
130 135 140
Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe
145 150 155 160
Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys
165 170 175
Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp
180 185 190
Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys
195 200 205
Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly
210 215 220
Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr
225 230 235 240
Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn
245 250 255
Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys
260 265 270
Glu Gly Thr Gly Ser Gly Ser Arg Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn
275 280 285
Ile Asp Gly Phe Val Asn Cys Thr Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe
290 295 300
Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu
305 310 315 320
Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly
325 330 335
Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro Pro His Met His Asn Phe Ser Val
340 345 350
Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly
355 360 365
Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe
370 375 380
Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn
385 390 395 400
Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg
405 410 415
Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg
420 425 430
Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly
435 440 445
Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr
450 455 460
Ser Arg Gly Gly Val Cys Val Thr His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu
465 470 475 480
Pro Arg Glu Phe Ala His Glu Ala Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu
485 490 495
Cys Gln Pro Met Glu Gly Thr Ala Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp
500 505 510
Thr Cys Ala Gln Cys Ala His Phe Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser
515 520 525
Ser Cys Pro His Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr
530 535 540
Pro Asp Val Gln Asn Glu Cys Arg Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln
545 550 555 560
Gly Cys Lys Gly Pro Glu Leu Gln Asp Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val
565 570 575
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Leu Val Val Ile Phe Met Met Leu Gly Gly Thr Phe Leu Tyr Trp Arg
595 600 605
Gly Arg Arg Ile Gln Asn Lys Arg Ala Met Arg Arg Tyr Leu Glu Arg
610 615 620
Gly Glu Ser Ile Glu Pro Leu Asp Pro Ser Glu Lys Ala Asn Lys Val
625 630 635 640
Leu Ala Arg Ile Phe Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Leu Lys Val Leu
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Gly Ser Gly Val Phe Gly Thr Val His Lys Gly Val Trp Ile Pro Glu
660 665 670
Gly Glu Ser Ile Lys Ile Pro Val Cys Ile Lys Val Ile Glu Asp Lys
675 680 685
Ser Gly Arg Gln Ser Phe Gln Ala Val Thr Asp His Met Leu Ala Ile
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Gly Ser Leu Asp His Ala His Ile Val Arg Leu Leu Gly Leu Cys Pro
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Leu Asp His Val Arg Gln His Arg Gly Ala Leu Gly Pro Gln Leu Leu
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Ser Pro Ser Gln Val Gln Val Ala Asp Phe Gly Val Ala Asp Leu Leu
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Pro Pro Asp Asp Lys Gln Leu Leu Tyr Ser Glu Ala Lys Thr Pro Ile
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Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe
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850 855 860
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Pro Gly Pro Glu Pro His Gly Leu Thr Asn Lys Lys Leu Glu Glu Val
930 935 940
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Gly Thr Leu Asn Arg Pro Arg Gly Ser Gln Ser Leu Leu Ser Pro Ser
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1010 1015 1020
Ser Leu His Pro Met Pro Arg Gly Cys Leu Ala Ser Glu Ser Ser
1025 1030 1035
Glu Gly His Val Thr Gly Ser Glu Ala Glu Leu Gln Glu Lys Val
1040 1045 1050
Ser Met Cys Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Arg Pro Arg
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1070 1075 1080
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1220 1225 1230
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Ala Arg Leu Lys Thr Leu Arg Ser Leu Glu Ala Thr Asp Ser Ala
1250 1255 1260
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Asn Ala Gln Arg Thr
1280
<210> 5
<211> 699
<212> PRT
<213> 智人 HER3 同种型 5
<400> 5
Met Ala Leu Thr Val Ile Ala Gly Leu Val Val Ile Phe Met Met Leu
1 5 10 15
Gly Gly Thr Phe Leu Tyr Trp Arg Gly Arg Arg Ile Gln Asn Lys Arg
20 25 30
Ala Met Arg Arg Tyr Leu Glu Arg Gly Glu Ser Ile Glu Pro Leu Asp
35 40 45
Pro Ser Glu Lys Ala Asn Lys Val Leu Ala Arg Ile Phe Lys Glu Thr
50 55 60
Glu Leu Arg Lys Leu Lys Val Leu Gly Ser Gly Val Phe Gly Thr Val
65 70 75 80
His Lys Gly Val Trp Ile Pro Glu Gly Glu Ser Ile Lys Ile Pro Val
85 90 95
Cys Ile Lys Val Ile Glu Asp Lys Ser Gly Arg Gln Ser Phe Gln Ala
100 105 110
Val Thr Asp His Met Leu Ala Ile Gly Ser Leu Asp His Ala His Ile
115 120 125
Val Arg Leu Leu Gly Leu Cys Pro Gly Ser Ser Leu Gln Leu Val Thr
130 135 140
Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Val Arg Gln His Arg
145 150 155 160
Gly Ala Leu Gly Pro Gln Leu Leu Leu Asn Trp Gly Val Gln Ile Ala
165 170 175
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180 185 190
Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Lys Ser Pro Ser Gln Val Gln Val Ala
195 200 205
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210 215 220
Tyr Ser Glu Ala Lys Thr Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile
225 230 235 240
His Phe Gly Lys Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val
245 250 255
Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Glu Pro Tyr Ala Gly Leu
260 265 270
Arg Leu Ala Glu Val Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Ala
275 280 285
Gln Pro Gln Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Val Met Val Lys Cys
290 295 300
Trp Met Ile Asp Glu Asn Ile Arg Pro Thr Phe Lys Glu Leu Ala Asn
305 310 315 320
Glu Phe Thr Arg Met Ala Arg Asp Pro Pro Arg Tyr Leu Val Ile Lys
325 330 335
Arg Glu Ser Gly Pro Gly Ile Ala Pro Gly Pro Glu Pro His Gly Leu
340 345 350
Thr Asn Lys Lys Leu Glu Glu Val Glu Leu Glu Pro Glu Leu Asp Leu
355 360 365
Asp Leu Asp Leu Glu Ala Glu Glu Asp Asn Leu Ala Thr Thr Thr Leu
370 375 380
Gly Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Gly Thr Leu Asn Arg Pro Arg Gly
385 390 395 400
Ser Gln Ser Leu Leu Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Met Pro Met Asn Gln
405 410 415
Gly Asn Leu Gly Glu Ser Cys Gln Glu Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser
420 425 430
Glu Arg Cys Pro Arg Pro Val Ser Leu His Pro Met Pro Arg Gly Cys
435 440 445
Leu Ala Ser Glu Ser Ser Glu Gly His Val Thr Gly Ser Glu Ala Glu
450 455 460
Leu Gln Glu Lys Val Ser Met Cys Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser
465 470 475 480
Pro Arg Pro Arg Gly Asp Ser Ala Tyr His Ser Gln Arg His Ser Leu
485 490 495
Leu Thr Pro Val Thr Pro Leu Ser Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Asp
500 505 510
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515 520 525
Ser Arg Glu Gly Thr Leu Ser Ser Val Gly Leu Ser Ser Val Leu Gly
530 535 540
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545 550 555 560
Arg Arg His Ser Pro Pro His Pro Pro Arg Pro Ser Ser Leu Glu Glu
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Asp Gly Gly Gly Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Ala Met Gly Ala Cys Pro
625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
Arg Leu Phe Pro Lys Ala Asn Ala Gln Arg Thr
690 695
<210> 6
<211> 1323
<212> PRT
<213> 智人 HER3 同种型 1
<400> 6
Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly
1 5 10 15
Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu
35 40 45
Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val
50 55 60
Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu
65 70 75 80
Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe
85 90 95
Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu
100 105 110
Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val
115 120 125
Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp
130 135 140
Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn
145 150 155 160
Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp
165 170 175
Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala
180 185 190
Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys
195 200 205
His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys
210 215 220
Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys
225 230 235 240
Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn
245 250 255
Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro
260 265 270
His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro
275 280 285
Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys
290 295 300
Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser Gly Ser Arg
305 310 315 320
Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val Asn Cys Thr
325 330 335
Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp
340 345 350
Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe
355 360 365
Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro
370 375 380
Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly
385 390 395 400
Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn
405 410 415
Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala
420 425 430
Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser
435 440 445
Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp
450 455 460
Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val
465 470 475 480
Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly
485 490 495
Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val Cys Val Thr
500 505 510
His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala His Glu Ala
515 520 525
Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met Glu Gly Thr Ala
530 535 540
Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys Ala His Phe
545 550 555 560
Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly Val Leu Gly
565 570 575
Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln Asn Glu Cys Arg
580 585 590
Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly Pro Glu Leu Gln
595 600 605
Asp Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val Leu Ile Gly Lys Thr His Leu Thr
610 615 620
Met Ala Leu Thr Val Ile Ala Gly Leu Val Val Ile Phe Met Met Leu
625 630 635 640
Gly Gly Thr Phe Leu Tyr Trp Arg Gly Arg Arg Ile Gln Asn Lys Arg
645 650 655
Ala Met Arg Arg Tyr Leu Glu Arg Gly Glu Ser Ile Glu Pro Leu Asp
660 665 670
Pro Ser Glu Lys Ala Asn Lys Val Leu Ala Arg Ile Phe Lys Glu Thr
675 680 685
Glu Leu Arg Lys Leu Lys Val Leu Gly Ser Gly Val Phe Gly Thr Val
690 695 700
His Lys Gly Val Trp Ile Pro Glu Gly Glu Ser Ile Lys Ile Pro Val
705 710 715 720
Cys Ile Lys Val Ile Glu Asp Lys Ser Gly Arg Gln Ser Phe Gln Ala
725 730 735
Val Thr Asp His Met Leu Ala Ile Gly Ser Leu Asp His Ala His Ile
740 745 750
Val Arg Leu Leu Gly Leu Cys Pro Gly Ser Ser Leu Gln Leu Val Thr
755 760 765
Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Val Arg Gln His Arg
770 775 780
Gly Ala Leu Gly Pro Gln Leu Leu Leu Asn Trp Gly Val Gln Ile Ala
785 790 795 800
Lys Gly Met Tyr Tyr Leu Glu Glu His Gly Met Val His Arg Asn Leu
805 810 815
Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Lys Ser Pro Ser Gln Val Gln Val Ala
820 825 830
Asp Phe Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Pro Asp Asp Lys Gln Leu Leu
835 840 845
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850 855 860
His Phe Gly Lys Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val
865 870 875 880
Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Glu Pro Tyr Ala Gly Leu
885 890 895
Arg Leu Ala Glu Val Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Ala
900 905 910
Gln Pro Gln Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Val Met Val Lys Cys
915 920 925
Trp Met Ile Asp Glu Asn Ile Arg Pro Thr Phe Lys Glu Leu Ala Asn
930 935 940
Glu Phe Thr Arg Met Ala Arg Asp Pro Pro Arg Tyr Leu Val Ile Lys
945 950 955 960
Arg Glu Ser Gly Pro Gly Ile Ala Pro Gly Pro Glu Pro His Gly Leu
965 970 975
Thr Asn Lys Lys Leu Glu Glu Val Glu Leu Glu Pro Glu Leu Asp Leu
980 985 990
Asp Leu Asp Leu Glu Ala Glu Glu Asp Asn Leu Ala Thr Thr Thr Leu
995 1000 1005
Gly Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Gly Thr Leu Asn Arg Pro Arg
1010 1015 1020
Gly Ser Gln Ser Leu Leu Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Met Pro Met
1025 1030 1035
Asn Gln Gly Asn Leu Gly Glu Ser Cys Gln Glu Ser Ala Val Ser
1040 1045 1050
Gly Ser Ser Glu Arg Cys Pro Arg Pro Val Ser Leu His Pro Met
1055 1060 1065
Pro Arg Gly Cys Leu Ala Ser Glu Ser Ser Glu Gly His Val Thr
1070 1075 1080
Gly Ser Glu Ala Glu Leu Gln Glu Lys Val Ser Met Cys Arg Ser
1085 1090 1095
Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Arg Pro Arg Gly Asp Ser Ala Tyr
1100 1105 1110
His Ser Gln Arg His Ser Leu Leu Thr Pro Val Thr Pro Leu Ser
1115 1120 1125
Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Asp Val Asn Gly Tyr Val Met Pro
1130 1135 1140
Asp Thr His Leu Lys Gly Thr Pro Ser Ser Arg Glu Gly Thr Leu
1145 1150 1155
Ser Ser Val Gly Leu Ser Ser Val Leu Gly Thr Glu Glu Glu Asp
1160 1165 1170
Glu Asp Glu Glu Tyr Glu Tyr Met Asn Arg Arg Arg Arg His Ser
1175 1180 1185
Pro Pro His Pro Pro Arg Pro Ser Ser Leu Glu Glu Leu Gly Tyr
1190 1195 1200
Glu Tyr Met Asp Val Gly Ser Asp Leu Ser Ala Ser Leu Gly Ser
1205 1210 1215
Thr Gln Ser Cys Pro Leu His Pro Val Pro Ile Met Pro Thr Ala
1220 1225 1230
Gly Thr Thr Pro Asp Glu Asp Tyr Glu Tyr Met Asn Arg Gln Arg
1235 1240 1245
Asp Gly Gly Gly Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Ala Met Gly Ala Cys
1250 1255 1260
Pro Ala Ser Glu Gln Gly Tyr Glu Glu Met Arg Ala Phe Gln Gly
1265 1270 1275
Pro Gly His Gln Ala Pro His Val His Tyr Ala Arg Leu Lys Thr
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Leu Arg Ser Leu Glu Ala Thr Asp Ser Ala Phe Asp Asn Pro Asp
1295 1300 1305
Tyr Trp His Ser Arg Leu Phe Pro Lys Ala Asn Ala Gln Arg Thr
1310 1315 1320
<210> 7
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人 HER3 同种型 2
<400> 7
Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly
1 5 10 15
Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu
35 40 45
Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ser Gly Leu Thr Pro Gln Pro Ala Gln Asp Trp Tyr Leu Leu Asp Asp
130 135 140
Asp Pro Arg Leu Leu Thr Leu Ser Ala Ser Ser Lys Val Pro Val Thr
145 150 155 160
Leu Ala Ala Val
<210> 8
<211> 312
<212> PRT
<213> 智人 HER3 同种型 3
<400> 8
Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly
1 5 10 15
Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu
35 40 45
Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val
50 55 60
Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu
65 70 75 80
Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe
85 90 95
Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu
100 105 110
Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val
115 120 125
Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp
130 135 140
Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn
145 150 155 160
Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp
165 170 175
Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala
180 185 190
Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys
195 200 205
His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys
210 215 220
Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys
225 230 235 240
Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn
245 250 255
Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro
260 265 270
His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro
275 280 285
Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys
290 295 300
Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Phe
305 310
<210> 9
<211> 624
<212> PRT
<213> 智人 HER3 同种型 1 extracellular region
<400> 9
Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly
1 5 10 15
Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu
35 40 45
Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val
50 55 60
Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu
65 70 75 80
Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe
85 90 95
Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu
100 105 110
Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val
115 120 125
Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp
130 135 140
Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn
145 150 155 160
Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp
165 170 175
Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala
180 185 190
Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys
195 200 205
His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys
210 215 220
Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys
225 230 235 240
Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn
245 250 255
Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro
260 265 270
His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro
275 280 285
Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys
290 295 300
Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser Gly Ser Arg
305 310 315 320
Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val Asn Cys Thr
325 330 335
Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp
340 345 350
Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe
355 360 365
Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro
370 375 380
Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly
385 390 395 400
Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn
405 410 415
Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala
420 425 430
Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser
435 440 445
Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp
450 455 460
Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val
465 470 475 480
Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly
485 490 495
Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val Cys Val Thr
500 505 510
His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala His Glu Ala
515 520 525
Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met Glu Gly Thr Ala
530 535 540
Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys Ala His Phe
545 550 555 560
Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly Val Leu Gly
565 570 575
Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln Asn Glu Cys Arg
580 585 590
Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly Pro Glu Leu Gln
595 600 605
Asp Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val Leu Ile Gly Lys Thr His Leu Thr
610 615 620
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人 HER3 同种型 1 跨膜域
<400> 10
Met Ala Leu Thr Val Ile Ala Gly Leu Val Val Ile Phe Met Met Leu
1 5 10 15
Gly Gly Thr Phe Leu
20
<210> 11
<211> 678
<212> PRT
<213> 智人 人 HER3 同种型 1 胞质域
<400> 11
Tyr Trp Arg Gly Arg Arg Ile Gln Asn Lys Arg Ala Met Arg Arg Tyr
1 5 10 15
Leu Glu Arg Gly Glu Ser Ile Glu Pro Leu Asp Pro Ser Glu Lys Ala
20 25 30
Asn Lys Val Leu Ala Arg Ile Phe Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Leu
35 40 45
Lys Val Leu Gly Ser Gly Val Phe Gly Thr Val His Lys Gly Val Trp
50 55 60
Ile Pro Glu Gly Glu Ser Ile Lys Ile Pro Val Cys Ile Lys Val Ile
65 70 75 80
Glu Asp Lys Ser Gly Arg Gln Ser Phe Gln Ala Val Thr Asp His Met
85 90 95
Leu Ala Ile Gly Ser Leu Asp His Ala His Ile Val Arg Leu Leu Gly
100 105 110
Leu Cys Pro Gly Ser Ser Leu Gln Leu Val Thr Gln Tyr Leu Pro Leu
115 120 125
Gly Ser Leu Leu Asp His Val Arg Gln His Arg Gly Ala Leu Gly Pro
130 135 140
Gln Leu Leu Leu Asn Trp Gly Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Tyr Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Glu His Gly Met Val His Arg Asn Leu Ala Ala Arg Asn Val
165 170 175
Leu Leu Lys Ser Pro Ser Gln Val Gln Val Ala Asp Phe Gly Val Ala
180 185 190
Asp Leu Leu Pro Pro Asp Asp Lys Gln Leu Leu Tyr Ser Glu Ala Lys
195 200 205
Thr Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile His Phe Gly Lys Tyr
210 215 220
Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu
225 230 235 240
Met Thr Phe Gly Ala Glu Pro Tyr Ala Gly Leu Arg Leu Ala Glu Val
245 250 255
Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Ala Gln Pro Gln Ile Cys
260 265 270
Thr Ile Asp Val Tyr Met Val Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Glu
275 280 285
Asn Ile Arg Pro Thr Phe Lys Glu Leu Ala Asn Glu Phe Thr Arg Met
290 295 300
Ala Arg Asp Pro Pro Arg Tyr Leu Val Ile Lys Arg Glu Ser Gly Pro
305 310 315 320
Gly Ile Ala Pro Gly Pro Glu Pro His Gly Leu Thr Asn Lys Lys Leu
325 330 335
Glu Glu Val Glu Leu Glu Pro Glu Leu Asp Leu Asp Leu Asp Leu Glu
340 345 350
Ala Glu Glu Asp Asn Leu Ala Thr Thr Thr Leu Gly Ser Ala Leu Ser
355 360 365
Leu Pro Val Gly Thr Leu Asn Arg Pro Arg Gly Ser Gln Ser Leu Leu
370 375 380
Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Met Pro Met Asn Gln Gly Asn Leu Gly Glu
385 390 395 400
Ser Cys Gln Glu Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser Glu Arg Cys Pro Arg
405 410 415
Pro Val Ser Leu His Pro Met Pro Arg Gly Cys Leu Ala Ser Glu Ser
420 425 430
Ser Glu Gly His Val Thr Gly Ser Glu Ala Glu Leu Gln Glu Lys Val
435 440 445
Ser Met Cys Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Arg Pro Arg Gly
450 455 460
Asp Ser Ala Tyr His Ser Gln Arg His Ser Leu Leu Thr Pro Val Thr
465 470 475 480
Pro Leu Ser Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Asp Val Asn Gly Tyr Val
485 490 495
Met Pro Asp Thr His Leu Lys Gly Thr Pro Ser Ser Arg Glu Gly Thr
500 505 510
Leu Ser Ser Val Gly Leu Ser Ser Val Leu Gly Thr Glu Glu Glu Asp
515 520 525
Glu Asp Glu Glu Tyr Glu Tyr Met Asn Arg Arg Arg Arg His Ser Pro
530 535 540
Pro His Pro Pro Arg Pro Ser Ser Leu Glu Glu Leu Gly Tyr Glu Tyr
545 550 555 560
Met Asp Val Gly Ser Asp Leu Ser Ala Ser Leu Gly Ser Thr Gln Ser
565 570 575
Cys Pro Leu His Pro Val Pro Ile Met Pro Thr Ala Gly Thr Thr Pro
580 585 590
Asp Glu Asp Tyr Glu Tyr Met Asn Arg Gln Arg Asp Gly Gly Gly Pro
595 600 605
Gly Gly Asp Tyr Ala Ala Met Gly Ala Cys Pro Ala Ser Glu Gln Gly
610 615 620
Tyr Glu Glu Met Arg Ala Phe Gln Gly Pro Gly His Gln Ala Pro His
625 630 635 640
Val His Tyr Ala Arg Leu Lys Thr Leu Arg Ser Leu Glu Ala Thr Asp
645 650 655
Ser Ala Phe Asp Asn Pro Asp Tyr Trp His Ser Arg Leu Phe Pro Lys
660 665 670
Ala Asn Ala Gln Arg Thr
675
<210> 12
<211> 44
<212> PRT
<213> 智人 HER3 同种型 1 juxtamembrane segment
<400> 12
Tyr Trp Arg Gly Arg Arg Ile Gln Asn Lys Arg Ala Met Arg Arg Tyr
1 5 10 15
Leu Glu Arg Gly Glu Ser Ile Glu Pro Leu Asp Pro Ser Glu Lys Ala
20 25 30
Asn Lys Val Leu Ala Arg Ile Phe Lys Glu Thr Glu
35 40
<210> 13
<211> 258
<212> PRT
<213> 智人HER3 同种型 1 蛋白激酶结构域
<400> 13
Leu Arg Lys Leu Lys Val Leu Gly Ser Gly Val Phe Gly Thr Val His
1 5 10 15
Lys Gly Val Trp Ile Pro Glu Gly Glu Ser Ile Lys Ile Pro Val Cys
20 25 30
Ile Lys Val Ile Glu Asp Lys Ser Gly Arg Gln Ser Phe Gln Ala Val
35 40 45
Thr Asp His Met Leu Ala Ile Gly Ser Leu Asp His Ala His Ile Val
50 55 60
Arg Leu Leu Gly Leu Cys Pro Gly Ser Ser Leu Gln Leu Val Thr Gln
65 70 75 80
Tyr Leu Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp His Val Arg Gln His Arg Gly
85 90 95
Ala Leu Gly Pro Gln Leu Leu Leu Asn Trp Gly Val Gln Ile Ala Lys
100 105 110
Gly Met Tyr Tyr Leu Glu Glu His Gly Met Val His Arg Asn Leu Ala
115 120 125
Ala Arg Asn Val Leu Leu Lys Ser Pro Ser Gln Val Gln Val Ala Asp
130 135 140
Phe Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Pro Asp Asp Lys Gln Leu Leu Tyr
145 150 155 160
Ser Glu Ala Lys Thr Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile His
165 170 175
Phe Gly Lys Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr
180 185 190
Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Glu Pro Tyr Ala Gly Leu Arg
195 200 205
Leu Ala Glu Val Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Ala Gln
210 215 220
Pro Gln Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Val Met Val Lys Cys Trp
225 230 235 240
Met Ile Asp Glu Asn Ile Arg Pro Thr Phe Lys Glu Leu Ala Asn Glu
245 250 255
Phe Thr
<210> 14
<211> 376
<212> PRT
<213> 智人 HER3 同种型 1 C 终末段
<400> 14
Arg Met Ala Arg Asp Pro Pro Arg Tyr Leu Val Ile Lys Arg Glu Ser
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Pro Gly Pro Glu Pro His Gly Leu Thr Asn Lys
20 25 30
Lys Leu Glu Glu Val Glu Leu Glu Pro Glu Leu Asp Leu Asp Leu Asp
35 40 45
Leu Glu Ala Glu Glu Asp Asn Leu Ala Thr Thr Thr Leu Gly Ser Ala
50 55 60
Leu Ser Leu Pro Val Gly Thr Leu Asn Arg Pro Arg Gly Ser Gln Ser
65 70 75 80
Leu Leu Ser Pro Ser Ser Gly Tyr Met Pro Met Asn Gln Gly Asn Leu
85 90 95
Gly Glu Ser Cys Gln Glu Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser Glu Arg Cys
100 105 110
Pro Arg Pro Val Ser Leu His Pro Met Pro Arg Gly Cys Leu Ala Ser
115 120 125
Glu Ser Ser Glu Gly His Val Thr Gly Ser Glu Ala Glu Leu Gln Glu
130 135 140
Lys Val Ser Met Cys Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Arg Pro
145 150 155 160
Arg Gly Asp Ser Ala Tyr His Ser Gln Arg His Ser Leu Leu Thr Pro
165 170 175
Val Thr Pro Leu Ser Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Asp Val Asn Gly
180 185 190
Tyr Val Met Pro Asp Thr His Leu Lys Gly Thr Pro Ser Ser Arg Glu
195 200 205
Gly Thr Leu Ser Ser Val Gly Leu Ser Ser Val Leu Gly Thr Glu Glu
210 215 220
Glu Asp Glu Asp Glu Glu Tyr Glu Tyr Met Asn Arg Arg Arg Arg His
225 230 235 240
Ser Pro Pro His Pro Pro Arg Pro Ser Ser Leu Glu Glu Leu Gly Tyr
245 250 255
Glu Tyr Met Asp Val Gly Ser Asp Leu Ser Ala Ser Leu Gly Ser Thr
260 265 270
Gln Ser Cys Pro Leu His Pro Val Pro Ile Met Pro Thr Ala Gly Thr
275 280 285
Thr Pro Asp Glu Asp Tyr Glu Tyr Met Asn Arg Gln Arg Asp Gly Gly
290 295 300
Gly Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Ala Met Gly Ala Cys Pro Ala Ser Glu
305 310 315 320
Gln Gly Tyr Glu Glu Met Arg Ala Phe Gln Gly Pro Gly His Gln Ala
325 330 335
Pro His Val His Tyr Ala Arg Leu Lys Thr Leu Arg Ser Leu Glu Ala
340 345 350
Thr Asp Ser Ala Phe Asp Asn Pro Asp Tyr Trp His Ser Arg Leu Phe
355 360 365
Pro Lys Ala Asn Ala Gln Arg Thr
370 375
<210> 15
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人 HER3 胞外区亚结构域 I
<400> 15
Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly
1 5 10 15
Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu
35 40 45
Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val
50 55 60
Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu
65 70 75 80
Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe
85 90 95
Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu
100 105 110
Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val
115 120 125
Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp
130 135 140
Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn
145 150 155 160
Gly Arg Ser Cys
<210> 16
<211> 146
<212> PRT
<213> 智人 HER3 胞外区亚结构域 II
<400> 16
Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp Gly Pro Gly Ser
1 5 10 15
Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala Pro Gln Cys Asn
20 25 30
Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys His Asp Glu Cys
35 40 45
Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys Phe Ala Cys Arg
50 55 60
His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu
65 70 75 80
Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn Pro His Thr Lys
85 90 95
Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro His Asn Phe Val
100 105 110
Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu
115 120 125
Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys
130 135 140
Pro Lys
145
<210> 17
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人 HER3 胞外区亚结构域 III
<400> 17
Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser Gly Ser Arg Phe Gln Thr Val Asp Ser
1 5 10 15
Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val Asn Cys Thr Lys Ile Leu Gly Asn Leu
20 25 30
Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp Pro Trp His Lys Ile Pro
35 40 45
Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe Arg Thr Val Arg Glu Ile
50 55 60
Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro Pro His Met His Asn Phe
65 70 75 80
Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly Gly Arg Ser Leu Tyr Asn
85 90 95
Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn Leu Asn Val Thr Ser Leu
100 105 110
Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser
115 120 125
Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser Leu Asn Trp Thr Lys Val
130 135 140
Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp Ile Lys His Asn Arg Pro
145 150 155 160
Arg Arg Asp Cys Val Ala
165
<210> 18
<211> 148
<212> PRT
<213> 智人 HER3 胞外区亚结构域 IV
<400> 18
Glu Gly Lys Val Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly
1 5 10 15
Pro Gly Pro Gly Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly
20 25 30
Val Cys Val Thr His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe
35 40 45
Ala His Glu Ala Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met
50 55 60
Glu Gly Thr Ala Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln
65 70 75 80
Cys Ala His Phe Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His
85 90 95
Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln
100 105 110
Asn Glu Cys Arg Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly
115 120 125
Pro Glu Leu Gln Asp Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val Leu Ile Gly Lys
130 135 140
Thr His Leu Thr
145
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人 HER3 胞外区亚结构域 II 二聚环
<400> 19
Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn Pro
1 5 10 15
His
<210> 20
<211> 1283
<212> PRT
<213> 人属猕猴HER3
<400> 20
Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser
1 5 10 15
Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met
20 25 30
Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly
35 40 45
Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr
50 55 60
Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu
65 70 75 80
Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu
85 90 95
Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp Lys Asp Ile Val Arg Asp Gln Asp
100 105 110
Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn Gly Arg Ser Cys Pro Leu Cys His
115 120 125
Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp Gly Pro Gly Pro Glu Asp Cys Gln
130 135 140
Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe
145 150 155 160
Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys
165 170 175
Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp
180 185 190
Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys
195 200 205
Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly
210 215 220
Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr
225 230 235 240
Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn
245 250 255
Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys
260 265 270
Glu Gly Thr Gly Ser Gly Ser Arg Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn
275 280 285
Ile Asp Gly Phe Val Asn Cys Thr Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe
290 295 300
Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu
305 310 315 320
Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly
325 330 335
Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro Pro His Met Tyr Asn Phe Ser Val
340 345 350
Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly
355 360 365
Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe
370 375 380
Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn
385 390 395 400
Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg
405 410 415
Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg
420 425 430
Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly
435 440 445
Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr
450 455 460
Ser Arg Gly Gly Val Cys Val Thr His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu
465 470 475 480
Pro Arg Glu Phe Ala His Glu Ala Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu
485 490 495
Cys Gln Pro Met Glu Gly Thr Ala Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp
500 505 510
Thr Cys Ala Gln Cys Ala His Phe Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser
515 520 525
Ser Cys Pro His Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr
530 535 540
Pro Asp Val Gln Asn Glu Cys Arg Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln
545 550 555 560
Gly Cys Lys Gly Pro Glu Leu Gln Asp Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val
565 570 575
Leu Ile Gly Lys Thr His Leu Thr Met Ala Leu Thr Val Ile Ala Gly
580 585 590
Leu Val Val Ile Phe Met Met Leu Gly Gly Thr Phe Leu Tyr Trp Arg
595 600 605
Gly Arg Arg Ile Gln Asn Lys Arg Ala Met Arg Arg Tyr Leu Glu Arg
610 615 620
Gly Glu Ser Ile Glu Pro Leu Asp Pro Ser Glu Lys Ala Asn Lys Val
625 630 635 640
Leu Ala Arg Ile Phe Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Leu Lys Val Leu
645 650 655
Gly Ser Gly Val Phe Gly Thr Val His Lys Gly Val Trp Ile Pro Glu
660 665 670
Gly Glu Ser Ile Lys Ile Pro Val Cys Ile Lys Ile Ile Glu Asp Lys
675 680 685
Ser Gly Arg Gln Ser Phe Gln Ala Val Thr Asp His Met Leu Ala Ile
690 695 700
Gly Ser Leu Asp His Ala His Ile Val Arg Leu Leu Gly Leu Cys Pro
705 710 715 720
Gly Ser Ser Leu Gln Leu Val Thr Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Ser Leu
725 730 735
Leu Asp His Val Arg Gln His Arg Gly Ala Leu Gly Pro Gln Leu Leu
740 745 750
Leu Asn Trp Gly Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Tyr Tyr Leu Glu Glu
755 760 765
His Gly Met Val His Arg Asn Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Lys
770 775 780
Ser Pro Ser Gln Val Gln Val Ala Asp Phe Gly Val Ala Asp Leu Leu
785 790 795 800
Pro Pro Asp Asp Lys Gln Leu Leu Tyr Ser Glu Ala Lys Thr Pro Ile
805 810 815
Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile His Phe Gly Lys Tyr Thr His Gln
820 825 830
Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe
835 840 845
Gly Ala Glu Pro Tyr Ala Gly Leu Arg Leu Ala Glu Val Pro Asp Leu
850 855 860
Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Ala Gln Pro Gln Ile Cys Thr Ile Asp
865 870 875 880
Val Tyr Met Val Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Glu Asn Ile Arg
885 890 895
Pro Thr Phe Lys Glu Leu Ala Asn Glu Phe Thr Arg Met Ala Arg Asp
900 905 910
Pro Pro Arg Tyr Leu Val Ile Lys Arg Glu Ser Gly Pro Gly Ile Ala
915 920 925
Pro Gly Pro Glu Pro His Gly Leu Thr Asn Lys Lys Leu Glu Glu Val
930 935 940
Glu Leu Glu Pro Glu Leu Asp Leu Asp Leu Asp Leu Glu Ala Glu Glu
945 950 955 960
Asp Asn Leu Ala Thr Thr Thr Leu Gly Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val
965 970 975
Gly Thr Leu Asn Arg Pro Arg Gly Ser Gln Ser Leu Leu Ser Pro Ser
980 985 990
Ser Gly Tyr Met Pro Met Asn Gln Gly Asn Leu Gly Glu Ala Phe Gln
995 1000 1005
Glu Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser Glu Trp Cys Pro Arg Pro Val
1010 1015 1020
Ser Leu His Pro Met Pro Arg Gly Cys Leu Ala Ser Glu Ser Ser
1025 1030 1035
Glu Gly His Val Thr Gly Ser Glu Ala Glu Leu Gln Glu Lys Val
1040 1045 1050
Ser Thr Cys Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Pro Arg Pro Arg
1055 1060 1065
Gly Asp Ser Ala Tyr His Ser Gln Arg His Ser Leu Leu Thr Pro
1070 1075 1080
Val Thr Pro Leu Ser Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Asp Val Asn
1085 1090 1095
Gly Tyr Val Met Pro Asp Thr His Leu Lys Gly Thr Pro Ser Ser
1100 1105 1110
Arg Glu Gly Thr Leu Ser Ser Val Gly Leu Ser Ser Val Leu Gly
1115 1120 1125
Thr Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Tyr Glu Tyr Met Asn Arg
1130 1135 1140
Arg Arg Arg His Ser Pro Pro Arg Pro Pro Arg Pro Ser Ser Leu
1145 1150 1155
Glu Glu Leu Gly Tyr Glu Tyr Met Asp Val Gly Ser Asp Leu Ser
1160 1165 1170
Ala Ser Leu Gly Ser Thr Gln Ser Cys Pro Leu His Pro Val Pro
1175 1180 1185
Val Met Pro Thr Ala Gly Thr Thr Pro Asp Glu Asp Tyr Glu Tyr
1190 1195 1200
Met Asn Arg Gln Arg Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Asp Tyr Ala
1205 1210 1215
Ala Met Gly Ala Cys Pro Ala Ser Glu Gln Gly Tyr Glu Glu Met
1220 1225 1230
Arg Ala Phe Gln Gly Pro Gly His Gln Ala Pro His Val His Tyr
1235 1240 1245
Ala His Leu Lys Thr Leu Arg Ser Leu Glu Ala Thr Asp Ser Ala
1250 1255 1260
Phe Asp Asn Pro Asp Tyr Trp His Ser Arg Leu Phe Pro Lys Ala
1265 1270 1275
Asn Ala Gln Arg Thr
1280
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗her3抗体克隆10A6识别表位
<400> 21
Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn Pro His
1 5 10
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗her3抗体克隆4-35-B2和4-35-B4识别表位
<400> 22
Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗her3抗体克隆4-35-B2、4-35-B4和10A6识别的表位复合序列
<400> 23
Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu
1 5 10 15
Glu Pro Asn Pro His
20
<210> 24
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 重链可变区
<400> 24
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75 重链可变区
<400> 25
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Thr Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c76 重链可变区
<400> 26
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c77 重链可变区
<400> 27
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c78v1 重链可变区
<400> 28
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c78v2 重链可变区
<400> 29
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_11B 重链可变区
<400> 30
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85v1 重链可变区
<400> 31
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Gly Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85v2 重链可变区
<400> 32
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Gly Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85o1 重链可变区
<400> 33
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Gly Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85o2 重链可变区
<400> 34
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Gly Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c87 重链可变区
<400> 35
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c89 重链可变区
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Leu Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Trp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c90 重链可变区
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Phe Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Leu Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Trp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c91 重链可变区
<400> 38
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Tyr Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Leu Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Trp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c92 重链可变区
<400> 39
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Thr Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c93 重链可变区
<400> 40
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1,10D1_c75,0D1_c76,0D1_c77,10D1_c78v1,10D1_c78v2,10D1_11B,10D1
_c85v1,10D1_c85v2,10D1_c85o1,0D1_c85o2,10D1_c87, 10D1_c89,
0D1_c90,10D1_c92, 10D1_c93 重链 CDR1
<400> 41
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c91 重链 CDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X = S or Y
<400> 42
Gly Tyr Tyr Ile Thr Ser Gly Tyr Ser
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 衍生共识重链 CDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X = S or Y
<400> 43
Gly Tyr Xaa Ile Thr Ser Gly Tyr Ser
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1,10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1,10D1_c78v2,
10D1_11B, 10D1_c87, 10D1_c92, 10D1_c93 重链 CDR2
<400> 44
Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85v1,10D1_c85v2,10D1_c85o1,10D1_c85o2,
10D1_c89,10D1_c90,10D1_c91 重链 CDR2
<400> 45
Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 衍生共识重链 CDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X = H or R
<400> 46
Ile Xaa Tyr Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 47
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1,10D1_c75,10D1_c76,10D1_c77,10D1_c78v1,10D1_c78v2,10D1_11B,10
D1_c85v1,10D1_c85v2,10D1_c87, 10D1_c92, 10D1_c93 重链 CDR3
<400> 47
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 48
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c89, 10D1_c90,10D1_c91 重链 CDR3
<400> 48
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Trp Tyr Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85o1 重链 CDR3
<400> 49
Ala Arg Glu Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85o2 重链 CDR3
<400> 50
Ala Arg Gly Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 51
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 衍生共识重链 CDR3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X = M, E or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X = R or W
<400> 51
Ala Arg Xaa Thr Thr Ala Pro Xaa Tyr Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2,10D1_c85v1,
10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2,10D1_c87, 10D1_c92, 10D1_c93
重链 FR1
<400> 52
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr
20 25
<210> 53
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 110D1_c89, 10D1_c91 重链 FR1
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 54
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c90 重链 FR1
<400> 54
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Phe Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 55
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 重链 FR1
<400> 55
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr
20 25
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c85v1, 10D1_c87,
10D1_c92, 10D1_c93 重链 FR2
<400> 56
Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ser
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c78v2, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2 重链 FR2
<400> 57
Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ser
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 重链 FR2
<400> 58
Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Ser
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91 重链 FR2
<400> 59
Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ser
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_11B 重链 FR2
<400> 60
Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ser
<210> 61
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75, 10D1_c92 重链 FR3
<400> 61
Asn Tyr Asn Pro Thr Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 62
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2 重链 FR3
<400> 62
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 63
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_11B 重链 FR3
<400> 63
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 64
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85v1,10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2 重链 FR3
<400> 64
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Gly Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 65
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c87, 10D1_c93 重链 FR3
<400> 65
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 66
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c89 重链 FR3
<400> 66
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Leu Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 67
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c90 重链 FR3
<400> 67
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Leu Val Thr Ile Ser Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 68
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c91 重链 FR3
<400> 68
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Leu Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 69
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 重链 FR3
<400> 69
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75,10D1_c76,10D1_c77,10D1_c78v1,10D1_c78v2,10D1_11B,10D1_c8
5v1,10D1_c85v2,10D1_c85o1,10D1_c85o2,10D1_c87,10D1_c92, 10D1_c93
重链 FR4
<400> 70
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c89, 10D1_c90 重链 FR4
<400> 71
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c91 重链 FR4
<400> 72
Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1, 4-35-B4, 10A6 重链 FR4
<400> 73
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 轻链可变区
<400> 74
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 75
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75 轻链可变区
<400> 75
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Leu Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Met Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 76
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c76 轻链可变区
<400> 76
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Gly Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Tyr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c77 轻链可变区
<400> 77
Val Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Pro Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Gly Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B 轻链可变区
<400> 78
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Gly Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Arg Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 79
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85v1, 10D1_c85v2 轻链可变区
<400> 79
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Arg Tyr Gln Tyr Ser Gly Val Pro Phe Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 80
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85o1 轻链可变区
<400> 80
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Arg Tyr Gln Tyr Ser Gly Val Pro Phe Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 81
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85o2 轻链可变区
<400> 81
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Arg Tyr Gln Tyr Ser Gly Val Pro Phe Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c87 轻链可变区
<400> 82
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Met Pro Gly Lys Ser Pro Glu Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Met Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 83
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c89 轻链可变区
<400> 83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c90 轻链可变区
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Met Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Thr His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c91 轻链可变区
<400> 85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Met Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Gly Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c92 轻链可变区
<400> 86
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Leu Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Met Lys Leu Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Phe Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c93 轻链可变区
<400> 87
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Met Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 88
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1,10D1_c75,10D1_c78v1,10D1_c78v2,10D1_11B,10D1_c85v1,10D1_c85v
2,10D1_c85o1,10D1_c85o2,10D1_c87,10D1_c89,10D1_c90,10D1_c91,10D1_
c92,10D1_c93 轻链CDR1
<400> 88
Gln Ile Val Gly Ser Asn
1 5
<210> 89
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c76 轻链CDR1
<400> 89
Gln Ile Val Gly Tyr Asn
1 5
<210> 90
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c77 轻链CDR1
<400> 90
Gln Ile Val Gly Pro Asn
1 5
<210> 91
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 衍生共识轻链CDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X = S, Y or P
<400> 91
Gln Ile Val Gly Xaa Asn
1 5
<210> 92
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1,10D1_c75,10D1_c76,10D1_c77,10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B,
10D1_c87, 10D1_c89, 10D1_c90,10D1_c91, 10D1_c92, 10D1_c93 light
chain CDR2
<400> 92
Ser Ala Ser
1
<210> 93
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85v1,10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2 轻链CDR2
<400> 93
Ser Ala Arg
1
<210> 94
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 衍生共识轻链CDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X = S or R
<400> 94
Ser Ala Xaa
1
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1, 10D1_c75, 10D1_c76, 0D1_c78v1, 10D1_c78v2, 0D1_11B,
10D1_c85v1,10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 0D1_c85o2, 10D1_c87, 10D1_c89,
10D1_c91, 10D1_c93 轻链CDR3
<400> 95
Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu Thr
1 5
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c77 轻链CDR3
<400> 96
Gln Gln Tyr Ser Thr His Pro Leu Thr
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c90 轻链CDR3
<400> 97
Gln Gln Tyr Thr Thr His Pro Leu Thr
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c92 轻链CDR3
<400> 98
Gln Gln Tyr Phe Ser His Pro Leu Thr
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 衍生共识轻链CDR3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X = S, T or F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X = S or T
<400> 99
Gln Gln Tyr Xaa Xaa His Pro Leu Thr
1 5
<210> 100
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75,10D1_c92 轻链FR1
<400> 100
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Leu Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 101
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c76 轻链FR1
<400> 101
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Gly Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 102
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c77 轻链FR1
<400> 102
Val Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 103
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c78v1, 10D1_c78v2,10D1_11B,10D1_c85v1, 10D1_c85v2,
10D1_c85o1,10D1_c85o2,10D1_c87,10D1_c93 轻链FR1
<400> 103
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 104
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c89, 10D1_c91 轻链FR1
<400> 104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 105
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c90 轻链FR1
<400> 105
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 106
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 轻链FR1
<400> 106
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75 轻链FR2
<400> 107
Val Ala Trp Tyr Gln Met Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B,
10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c93轻链FR2
<400> 108
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c87 轻链FR2
<400> 109
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Met Pro Gly Lys Ser Pro Glu Pro Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c89, 10D1_c90 轻链FR2
<400> 110
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Pro Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 111
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c91 轻链FR2
<400> 111
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Met Pro Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 112
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c92 轻链FR2
<400> 112
Val Ala Trp Tyr Gln Met Lys Leu Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 轻链FR2
<400> 113
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 114
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75, 10D1_c92 轻链FR3
<400> 114
Tyr Leu Tyr Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Glu Tyr Phe Cys
35
<210> 115
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c76 轻链FR3
<400> 115
Tyr Leu Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Glu Tyr Phe Cys
35
<210> 116
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c77 轻链FR3
<400> 116
Tyr Gly Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Glu Tyr Phe Cys
35
<210> 117
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B 轻链FR3
<400> 117
Tyr Gly Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 118
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2 轻链FR3
<400> 118
Tyr Gln Tyr Ser Gly Val Pro Phe Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 119
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c87, 10D1_c93 轻链FR3
<400> 119
Tyr Leu Tyr Ser Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Met Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 120
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c89 轻链FR3
<400> 120
Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 121
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c90 轻链FR3
<400> 121
Tyr Leu Tyr Ser Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Glu Phe Thr Met Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 122
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c91 轻链FR3
<400> 122
Tyr Gly Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 123
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 轻链FR3
<400> 123
Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Ala Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Glu Tyr Phe Cys
35
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B,
10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87,
10D1_c90, 10D1_c92, 10D1_c93 轻链FR4
<400> 124
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c89, 10D1_c91 轻链FR4
<400> 125
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 126
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 轻链FR4
<400> 126
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 127
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 重链可变区
<400> 127
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Ser Leu Arg Trp Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 重链 CDR1
<400> 128
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn
1 5
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 重链 CDR2
<400> 129
Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr
1 5
<210> 130
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 重链 CDR3
<400> 130
Val Ser Leu Arg Trp Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 131
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 重链 FR1
<400> 131
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 重链 FR2
<400> 132
Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
His
<210> 133
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 重链 FR3
<400> 133
Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 重链 FR4
<400> 134
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 135
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 轻链可变区
<400> 135
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 轻链CDR1
<400> 136
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 137
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 轻链CDR2
<400> 137
Leu Thr Ser
1
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 轻链CDR3
<400> 138
Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 139
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 轻链FR1
<400> 139
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
20 25
<210> 140
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 轻链FR2
<400> 140
Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 141
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 轻链FR3
<400> 141
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2, 4-35-B4, 10A6 轻链FR4
<400> 142
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 143
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 重链可变区
<400> 143
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Pro Lys
50 55 60
Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Leu His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 144
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 重链 CDR1
<400> 144
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1 5
<210> 145
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 重链 CDR2
<400> 145
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 146
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 重链 CDR3
<400> 146
Ala Arg Gly Leu His
1 5
<210> 147
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 重链 FR1
<400> 147
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 148
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 重链 FR2
<400> 148
Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Lys
<210> 149
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 重链 FR3
<400> 149
Asn Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 150
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 轻链可变区
<400> 150
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 轻链CDR1
<400> 151
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 152
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 轻链CDR2
<400> 152
Leu Ala Ser
1
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 轻链CDR3
<400> 153
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 154
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 轻链FR1
<400> 154
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 155
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 轻链FR2
<400> 155
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 156
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 轻链FR3
<400> 156
Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 157
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 重链可变区
<400> 157
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asn Phe Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Phe Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Phe Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 重链 CDR1
<400> 158
Gly Asn Phe Ile Thr Ser Gly Tyr Phe
1 5
<210> 159
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 重链 CDR2
<400> 159
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn
1 5
<210> 160
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 重链 CDR3
<400> 160
Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Phe Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 161
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 重链 FR1
<400> 161
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr
20 25
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 重链 FR2
<400> 162
Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Phe
<210> 163
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 重链 FR3
<400> 163
Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 164
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 轻链可变区
<400> 164
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser Ile Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Trp Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Phe Thr Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 165
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 轻链CDR1
<400> 165
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 166
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 轻链CDR2
<400> 166
Trp Ala Ser
1
<210> 167
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 轻链CDR3
<400> 167
Gln Gln Tyr Phe Thr Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 168
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 轻链FR1
<400> 168
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser Ile Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser
20 25
<210> 169
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 轻链FR2
<400> 169
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 170
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 轻链FR3
<400> 170
Thr Trp Lys Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 171
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人 IgG1恒定区(IGHG1; UniProt:P01857-1, v1)
<400> 171
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 172
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH1 IgG1 (P01857-1的位置 1-98, v1)
<400> 172
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 173
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链 IgG1 (P01857-1的位置99-110, v1)
<400> 173
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10
<210> 174
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH2 IgG1 (P01857-1的位置111-223 , v1)
<400> 174
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 175
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH3 IgG1 (P01857-1的位置224-330, v1)
<400> 175
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 176
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CH3 (D356E, L358M; 按欧盟编号编号的位置)
<400> 176
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 177
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Ckappa CL (IGCK; UniProt: P01834-1, v2)
<400> 177
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 178
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 重链信号肽
<400> 178
Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile
1 5 10 15
Leu Ser
<210> 179
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 重链信号肽
<400> 179
Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Cys Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile
1 5 10 15
Leu Ser
<210> 180
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 轻链信号肽
<400> 180
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser
1 5 10 15
Gly Val Asp Gly
20
<210> 181
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 重链信号肽
<400> 181
Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 182
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 轻链信号肽
<400> 182
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Met Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Met Met Ser Arg Gly
20
<210> 183
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 重链信号肽
<400> 183
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
1 5 10 15
Val Asn Ser
<210> 184
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 轻链信号肽
<400> 184
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 185
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B,
10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87,
10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91, 10D1_c92, 10D1_c93 重链
信号肽
<400> 185
Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Ile Ala Thr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Ala Arg Cys
<210> 186
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75, 10D1_c76, 10D1_c77, 10D1_c78v1, 10D1_c78v2, 10D1_11B,
10D1_c85v1, 10D1_c85v2, 10D1_c85o1, 10D1_c85o2, 10D1_c87,
10D1_c89, 10D1_c90, 10D1_c91, 10D1_c92, 10D1_c93 轻链
信号肽
<400> 186
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys
20
<210> 187
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75 VH-CH1-CH2-CH3
<400> 187
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Thr Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 188
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c75 VL-Ckappa
<400> 188
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Leu Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Met Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Phe Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Arg Pro
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Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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275 280 285
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
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385 390 395 400
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
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Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
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450
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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65 70 75 80
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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355 360 365
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 205
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Met Pro Gly Lys Ser Pro Glu Pro Leu Ile
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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<220>
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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355 360 365
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 207
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c89 VL-Ckappa
<400> 207
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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<210> 208
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c90 VH-CH1-CH2-CH3
<400> 208
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Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Trp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 209
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_c90 VL-Ckappa
<400> 209
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Met Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Thr His Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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210
<210> 210
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Tyr Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Leu Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Trp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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355 360 365
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Gly Lys
450
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Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Leu Ile
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Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
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Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ile Val Gly Ser Asn
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
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385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B2 VL-Ckappa
<400> 219
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100 105 110
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115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 220
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 VH-CH1-CH2-CH3
<400> 220
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180 185 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
340 345 350
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 221
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-35-B4 VL-Ckappa
<400> 221
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 222
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 VH-CH1-CH2-CH3
<400> 222
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asn Phe Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Phe Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Phe Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 223
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10A6 VL-Ckappa
<400> 223
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser Ile Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Trp Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Phe Thr Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 224
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1_11B 重链 FR1
<400> 224
Asp Val Gln Leu Gln Glu Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr
20 25
<210> 225
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1F.FcA VH-CH1-CH2-CH3 (GASDALIE; LCKC) (10D1F.FcB)
<400> 225
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Leu Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Trp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly
225 230 235 240
Pro Asp Val Phe Cys Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu
325 330 335
Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 226
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1F.FcA VH-CH1-CH2-CH3 (N297Q)
<400> 226
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Arg Tyr Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Leu Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Trp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 227
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 VH-CH1-CH2-CH3 (GASDALIE; LCKC)
<400> 227
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly
225 230 235 240
Pro Asp Val Phe Cys Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu
325 330 335
Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 228
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1 VH-CH1-CH2-CH3 (GASD)
<400> 228
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Met Thr Thr Ala Pro Arg Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly
225 230 235 240
Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 229
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HER3对10D1衍生克隆的结合位点
<400> 229
Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly
1 5 10 15
Gly Cys
<210> 230
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1结合位点基序1
<400> 230
Pro Asn Pro Asn Gln
1 5
<210> 231
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 10D1结合位点基序2
<400> 231
Asp Glu Cys Ala Gly
1 5

Claims (13)

1.一种能够与HER3结合的，分离的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包括：
(i)包含以下CDR的重链可变区(VH)：
如SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的HC-CDR1
如SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的HC-CDR2
如SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的HC-CDR3；和
(ii)包含以下CDR的轻链可变区(VL)：
如SEQ ID NO：88所示氨基酸序列的LC-CDR1
如SEQ ID NO：92所示氨基酸序列的LC-CDR2
如SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的LC-CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
VH区，其包含如SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列；和
VL区，其包含如SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
VH区，其包含以下的框架区(FR)：
具有SEQ ID NO：53所示氨基酸序列的HC-FR1
具有SEQ ID NO：59所示氨基酸序列的HC-FR2
具有SEQ ID NO：66所示氨基酸序列的HC-FR3
具有SEQ ID NO：71所示氨基酸序列的HC-FR4。
4.根据权利要求1或权利要求2中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括：
VL区，其包含以下的框架区(FR)：
具有SEQ ID NO：104所示氨基酸序列的LC-FR1
具有SEQ ID NO：110所示氨基酸序列的LC-FR2
具有SEQ ID NO：120所示氨基酸序列的LC-FR3
具有SEQ ID NO：125所示氨基酸序列的LC-FR4。
5.根据权利要求1或权利要求2中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括如SEQ ID NO：171所示序列的重链恒定区。
6.根据权利要求1或权利要求2中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包括如SEQ ID NO：177所示序列的轻链恒定区。
7.一种分离的核酸或多种核酸，其编码根据权利要求1至6中任一项的抗原结合分子。
8.一种表达载体或多种表达载体，其包含权利要求7的一种核酸或多种核酸。
9.一种细胞，其包含根据权利要求1至6中任一项的抗原结合分子，根据权利要求7的一种核酸或多种核酸，或根据权利要求8的一种表达载体或多种表达载体。
10.一种方法，包括在适合从一种或多种核酸或一种或多种表达载体表达抗原结合分子的条件下，培养包含权利要求7所述的一种核酸或多种核酸或权利要求8所述的一种表达载体或多种表达载体的细胞。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的抗原结合分子、权利要求7所述的一种核酸或多种核酸、权利要求8所述的一种表达载体或多种表达载体、或权利要求9所述的细胞，在制备用于癌症的治疗或预防的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中癌症选自：表达HER3的癌症、胃癌、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、口腔癌、肾癌、结直肠癌、食道癌、胰腺癌、实体癌和血液癌。
13.一种非治疗和非诊断的检测HER3的方法，其包括在体外使含有或疑似含有HER3的样品与如权利要求1至6中任一项所述的抗原结合分子接触，并检测所述抗原结合分子与HER3的复合物的形成。
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