CN102906118B - 与her3相关的生物材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对(如本文中定义的)HER3的氨基酸序列，以及涉及化合物或构建体，具体地蛋白质和多肽，其包含一个或多个此类氨基酸序列或基本上由所述序列组成(在本文中也分别称为“本发明的氨基酸序列”、“本发明的化合物”和“本发明的多肽”)。本发明还涉及编码此类氨基酸序列和多肽的核酸(在本文中也称为“本发明的核酸”或“本发明的核苷酸序列”)；涉及用于制备此类氨基酸序列和多肽的方法；涉及表达或能够表达此类氨基酸序列或多肽的宿主细胞；涉及组合物，具体地涉及药物组合物，所述组合物包含此类氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主细胞；以及涉及此类氨基酸序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的用途，具体地用于预防、治疗或诊断目的例如本文中提及的预防、治疗或诊断目的用途。

Description

与HER3相关的生物材料
本发明涉及针对(如本文中定义的)HER3的氨基酸序列以及涉及化合物或构建体，具体地蛋白质和多肽，所述蛋白质和多肽包含一个或多个这样的氨基酸序列(在本文中也分别称为“本发明的氨基酸序列”、“本发明的化合物”和“本发明的多肽”)或基本上由其组成。
在一些具体但非限定性方面(本文中更详细描述的)，本发明提供了：
-针对(如本文中定义的)HER3并且能够抑制或阻断(完全或部分地，如本文中进一步描述的)HRG对HER3的结合(如本文中进一步描述的)的氨基酸序列；
-针对(如本文中定义的)HER3并且能够抑制或阻断(完全或部分地，如本文中进一步描述的)HER3的异二聚化(如本文中进一步描述的)的氨基酸序列；
-针对(如本文中定义的)HER3并且能够结合HER3的结构域II的氨基酸序列；和/或
-针对(如本文中定义的)HER3并且能够抑制或阻断(完全或部分地，如本文中进一步描述的)HER3磷酸化(如本文中进一步描述的)的氨基酸序列。
如本文中进一步描述的，在特别优选的但非限定性的方面，本文中描述的针对HER3的各种氨基酸序列(包括根据特定方面的氨基酸序列)优选地为免疫球蛋白单可变结构域(在本文也称为“ISV”)。免疫球蛋白单可变结构域为这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列：
-包含免疫球蛋白折叠或在适当的条件(例如生理条件)下能够形成免疫球蛋白折叠(即通过折叠)，即，以便形成免疫球蛋白可变结构域(例如，VH、VL或VHH结构域)；
以及
-形成(或在适当的条件下能够形成)免疫球蛋白可变结构域，所述免疫球蛋白可变结构域包含功能性抗原结合活性(在下列意义上：其不需要与另一个免疫球蛋白可变结构域相互作用(例如VH-VL相互作用)以形成功能性抗原结合位点)。
作为ISV的本发明的氨基酸序列在本文中也称为“本发明的ISV”。适用于本发明的免疫球蛋白单可变结构域的一些优选实例将根据本文中的进一步描述变得清楚，并且例如包括VHH和/或(其它)纳米抗体(优选的)例如人源化VHH或骆驼源化VH例如骆驼源化人VH、dAb和(单)结构域抗体。
如本文中还进一步描述的，本文中描述的针对HER3的各种氨基酸序列(包括根据特定方面的氨基酸序列)可有利地用作构建块，以提供本发明的多价(如本文中所描述的，例如二价或三价)、多特异性(如本文中所描述的，例如双或三特异性)或多互补位(multiparatopic)(如本文中所描述的，例如双互补位)多肽，以及用于本发明的其它优选但非限定性方面的本发明的此类多肽。再次地，还在本发明的这些方面，存在于这类序列中的本发明的氨基酸序列优选为ISV(和优选地本文中描述的纳米抗体)。
例如但非限制性的，在本发明的一个特定方面，这样的多肽可包含至少一个(例如1个或2个)ISV(和优选地纳米抗体)，所述ISV或纳米抗体是针对(如本文中定义的)HER3的，并且能够抑制或阻断(完全或部分地，如本文中进一步描述的)HRG对HER3的结合(如本文中进一步描述的)；和至少一个(例如1个或2个)ISV(和优选地纳米抗体)，所述ISV或纳米抗体是针对(如本文中定义的)HER3的并且能够抑制或阻断(完全或部分地，如本文中进一步描述的)HER3的异二聚化(如本文中进一步描述的)。还可提供具有增加的体内半衰期的本发明的此类和其它氨基酸序列和多肽，如本文中进一步描述的。
根据本文中进一步描述，本发明的各种氨基酸序列和多肽的一些优选但非限定性实例将变得清楚。
本发明还涉及编码此类氨基酸序列和多肽的核酸(在本文中也称为“本发明的核酸”或“本发明的核苷酸序列”)；涉及用于制备此类氨基酸序列和多肽的方法；涉及表达或能够表达此类氨基酸序列或多肽的宿主细胞；涉及组合物，具体地涉及药物组合物，所述组合物包含此类氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主细胞；以及涉及此类氨基酸序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的用途，具体地用于预防、治疗或诊断目的，例如本文中提及的预防、治疗或诊断目的用途。
根据本文中的进一步描述本发明的其它方面、实施方案、有利方面和应用将变得清楚。
发明背景
HER3(人表皮生长因子受体3)属于多肽生长因子受体的ErbB/HER超家族，其包括表皮生长因子(EGF)受体(EGFR、ErbBl、HERl)、neu癌基因产物(ErbB2、HER2)和最近鉴定的ErbB3、HER3和ErbB4、HER4受体蛋白(参见，例如，Plowman等人(1990),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,4905-4909；Hynes等人(1994)Biochim.Biophys.ActaRev.Cancer 1198,165-184)。已知HER3可结合多种配体例如heregulin和神经调节蛋白(neuregulin)1和2；但其缺乏固有的酪氨酸激酶活性(并且因为其不具激酶活性，因此当与另一个HER家族成员例如HER1、HER2或HER4二聚化时，受体仅可起始信号转导)。
更具体地，HER3为膜结合蛋白并且具有神经调节蛋白结合结构域但不具有活性激酶结构域。因此其可结合该配体但不能将信号通过蛋白质磷酸化传入细胞。然而，其与确实具有激酶活性的其它EGF受体家族成员形成异二聚体。异二聚化导致引起细胞分裂、增殖、分化、迁移和其它细胞过程的途径激活。复杂的多层次信号传导产生受体交联并且侧向信号传导在EGFR家族内和其它受体酪氨酸激酶样MET中逐渐变得明显(Engelmann等人(2007),Science 316,1039-1043)。因活性自分泌环的突变、扩增和存在而引起的脱调控、异常的信号转导可参与癌症和其它疾病的发展。在许多癌症包括前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌中已报道了该基因的扩增和/或其蛋白质的过表达(参见例如WO2008100624,WO2007077028,Horst等人(2005)Int J Cancer,115,519-527；Xue等人(2006)CancerRes.66,1418-1426)。HER3也称为LCCS2；ErbB-3；c-erbB3；erbB3-S；MDA-BF-1；MGC88033；c-erbB-3；p180-ErbB3；p45-sErbB3；p85-sErbB3；ERBB3。
就HER3在癌症中的作用而言，已有人提出HER3可能是HER2-介导的肿瘤发生所必需的：HER2可能需要HER3来将正常细胞转化成癌细胞。例如，已发现HER3的增加的表达增强了HER2的信号转导效力，然而减少的HER3表达导致HER2活性的丢失。这已产生下列假说：HER3可通过与HER2二聚化参与HER2-介导的肿瘤发生。
还有人提出：HER3可使得能够逃脱其它HER受体的抑制。例如，临床前研究已显示HER3活性的上调可以是肿瘤可籍以逃脱HER家族受体的酪氨酸激酶抑制的机制，并且肿瘤细胞可通过增加HER3的表达(其不具有激酶活性)来补偿其它HER受体的酪氨酸激酶抑制。还已发现在HER2:HER3异二聚体中，HER2转磷酸化(transphosphorylate)HER3。
还已发现HER3在几种类型的癌症(包括但不限于乳腺癌和前列腺癌)中过表达，并且已发现HER2/HER3的表达与从非侵袭性至侵袭性阶段的进展之间可存在关联(Baselga等人,2009Nature Reviews Cancer 9,463-475)。
虽然已经指出了HER3在癌症和致癌基因信号转导中的作用(上文)，但其在抗癌治疗中的重要性仍然还不清楚，这是因为其中HER3为其组分的复杂ErbB网络。目前的免疫疗法主要集中在抑制HER2的作用，具体地HER2/HER3复合物的异二聚化(参见，例如，Sliwkowski等人(1994)J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665)。
本发明的目的是提供有效地抑制HER3信号转导并且可用于治疗和诊断多种癌症的改进的免疫疗法。
发明概述
在本发明中，已鉴定和表征了许多免疫球蛋白单可变结构域(如本文中进一步描述的)(并且其中适当地人源化的和/或序列优化的)，所述结构域可结合HER3(具体地特异性结合HER3，如本文中进一步定义的)并且可(用于)调节(如本文中定义的)HER3介导的信号转导和/或调节(一部分或全部)HER3的生物效应和/或调节(一部分或全部)其中涉及HER3和/或HER3个导的信号转导的生物机制/途径。还已发现本发明提供的免疫球蛋白单可变结构域不仅本身能够用于这样的调节，而且还可有利地彼此连接/组合(即，以便提供多价、多特异性和/或双互补位构建体，如本文中进一步定义的)和/或与其它部分、结合结构域或结合单元连接/组合以提供可用于这样的调节的蛋白质、多肽或(其它)化合物或构建体。
因此，由本发明提供的免疫球蛋白单可变结构域(或“ISV”)作为用于提供这样的蛋白质、多肽或(其它)化合物或构建体的“构建块”的用途形成本发明的重要有优点和方面。
例如，有利地但非限定性地，已发现由本发明提供的各种免疫球蛋白单可变结构域或“ISV”可以不同方式结合HER3，从而以它们与HER3相互作用和/或调节HER3介导的信号转导的方式提供不同的作用模式。例如，由本发明提供的一些ISV能够抑制HRG对HER3的结合，然而其它ISV可结合HER3的结构域II和/或阻断HER3转磷酸化。其它ISV还可阻断HER3与其本身或与HER家族的其它成员(例如HER1、HER2或HER3)的二聚化。因此，本发明的氨基酸(或ISV)被当作构建块。
因此，本发明提供了许多不同的ISV，所述ISV可影响HER3、HER3介导的信号转导和/或与HER3和/或与HER3介导的信号转导相关的生物效应。
此外，当将本发明提供的ISV适当地用作或组合为构建块以提供其它蛋白质、多肽或(其它)化合物或构建体时，本发明例如使得可能有利地将不同的与HER3的相互作用和/或将不同的作用模式组合入单个分子、化合物、构建体、蛋白质或多肽。其实例通过本文中的进一步描述将得清楚。
由本发明提供的各种ISV、蛋白质、多肽、化合物和/或构建体具有的对HER3和HER3介导的信号转导(包括它们的作用模式)的作用或影响可使用多种适当的测定法和体内模型来测定，所述测定法或模型为例如HER3内化测定(例如测量适当的细胞例如MCF7和MALME-3M细胞上HER3表面表达的减少)；配体阻断测定(例如HRG竞争性Alphascreen或FACS测定)；HRG诱导的HER3信号转导阻断测定(例如测量HER3-配体刺激的MCF7、CHO-HER2-HER3、BT474和MDA-MB468细胞中pHER3的抑制的测定)；测量异二聚化阻断的测定(例如TGF-α-刺激的CHO-EGFR-HER3、β-cellulin-刺激的MDA-MB468细胞的pHER3阻断)；测量下游信号转导的抑制的测定(例如测量HER3-配体刺激的MCF7、A549和BT474细胞中pAKT和/或pMAPK信号转导的测定)；或细胞迁移测定(例如测量HRG诱导的A431细胞的迁移的测定)。参考例如本文中所示的实施例部分和结果。
因此，本发明的ISV、多肽和组合物通常可用于调节，具体地抑制和/或阻止HER3对Heregulin的结合和/或阻断与MET、EGFR或HER2的异二聚化(参见例如Hsieh和Moasser,2007,British Journal of Cancer)，从而调节，具体地抑制或阻止由HER3和/或Heregulin介导的信号转导，调节HER3和/或Heregulin所参与的生物途径，和/或调节与这样的信号转导或这些途径相关的生物机制、应答和效应。
这样，本发明的多肽和组合物可用于诊断和治疗(如本文中定义的)多种癌症。一般地，“多种癌症”可定义为可分别通过适当地给有此需要的受试者(即，具有疾病或障碍或其至少一个症状和/或处于诱发或发生疾病或障碍的风险中)施用本发明的多肽或组合物(具体地，其药学活性量的)和/或已知具有抗HER3或HER3所参与的生物途径或机制的活性的成分(具体地，其药学活性量的)来预防和/或治疗的疾病和障碍。基于本文中的公开内容，这样多样的癌症的实例对于本领域技术人员来说是清楚明了的，例如包括下列疾病和障碍：
癌症(Sithanandam和Anderson的综述(2008)Cancer Gene Therapy 15(7),413-448；乳腺癌(Lemoine等人(1992)Br J Cancer 66,1116-1121；Witton等人(2003)J Pathol200(3)：290-297；Koutras等人(2010)Crit Rev Oncol Hematol.74(2)：73-78)；肺癌(Müller-Tidow(2005)Cancer Res 65(5)：1778-1782；Timotheadou等人,(2007)AnticancerRes.27(6C)：4481-4489)；卵巢癌(Tanner等人(2006)J Clin Oncol 24(26)：4317-4323)；前列腺癌(Lozano等人(2005)BMC Genomics 6：109；Soler等人,2009.Int J Cancer125(11)：2565-2575)、膀胱癌(Rajkumar等人(1996)J Pathol,179(4)：381-385)；脑癌(Addo-Yobo等人(2006)J Neuropathol Exp Neurol65(8)：769-775,Andersson等人(2004)ActaNeuropathol,108(2)：135-142)；视网膜母细胞瘤(Chakraborty等人(2007)Genomics 90(3)：344-353)；黑色素瘤(Segal等人(2003)J Clin Oncol.2003May 1；21(9)：1775-1781；Schaefer等人(2004)Cancer Res 64：3395-3405；Reschke等人,2008Clin Cancer Res.14(16)：5188-97)；结肠直肠癌(Grivas等人(2007)Eur J Cancer 43(17)：2602-2611；Ciardiello等人(1991)Proc Natl Acad Sci U S A.88(17)：7792-7796)；胰腺癌(Friess等人(1995)Clin Cancer Res 1(11)：1413-20)；Lemoine等人,1992J.Pathol.168：269-273)；胃癌(Sanidas(1993),Int J Cancer 54(6)：935-40,Hayashi等人(2008)ClinCancer Res 14(23)：7843-7849；Hayashi等人,(2008)Clin Cancer Res.14(23)：7843-9)；头颈癌(Funayama(1998)Oncology 55(2)：161-167,Erjala(2006)Clin Cancer Res 12(13)：4103-4111)；子宫颈癌(Fuchs等人,2007Anticancer Res.27(2)：959-63)；食道癌(Wei等人,2007Int J Oncol.31(3)：493-9.)；和/或神经再生(Lindholm等人(2002)ExpBrain Res)2002Jan；142(1)：81-90。
具体地，本发明的多肽和组合物可用于诊断和治疗多种癌症，所述癌症的特征在于由蛋白质的ErbB网络或一般地由其中HER3所参与的任何途径介导的过度的和/或不期望的信号转导。基于本说明书，这样多样的癌症的实例再次对于本领域技术人员来说是清楚明了的。
因此，然而不限于此，还预期本发明的多肽可用于预防和/或治疗所有这样的疾病和障碍，针对所述疾病和障碍目前正在开发，已提出或将来将提出或开发利用此类活性成分的治疗。此外，由于它们的有利性质(如本文中进一步描述的)，预期本发明的多肽可用于预防和治疗除对其正在使用或将提出或开发此类已知的活性成分的疾病和障碍外的其它疾病和障碍；和/或本发明的多肽可提供用于治疗本文中描述的疾病和障碍的新方法和方案。
根据本文中的进一步公开内容，本发明的氨基酸序列和多肽的其它应用和用途对于本领域技术人员将变得清楚。
一般地，本发明的目的是提供可用于诊断、预防和/或治疗多种癌症和本文中提及的其它疾病和障碍的药理学活性剂以及包含所述药理学活性剂的组合物；和提供用于诊断、预防和/或治疗此类疾病和障碍的方法，所述方法包括施用和/或使用此类试剂和组合物。
具体地，本发明的目的是提供与目前使用的和/或本领域已知的试剂、组合物和/或方法相比较具有某些有利方面的这样的药理学活性剂、组合物和/或方法。根据下面进一步描述这些有利方面将变得清楚。
更具体地，本发明的目的是提供可用作药理学活性剂的治疗性蛋白质以及包含所述蛋白质的组合物，用于诊断、预防和/或治疗多种癌症和本文中提及的其它疾病和障碍；和提供用于诊断、预防和/或治疗此类疾病和障碍的方法，包括施用和/或使用此类治疗性蛋白质和组合物。
因此，本发明的具体目的是提供针对(如本文中定义的)HER3，具体针对来自温血动物的HER3，更具体地针对来自哺乳动物的HER3，具体地针对人HER3(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列；和提供包含至少一个这样的氨基酸序列或基本上由其组成的蛋白质和多肽。
具体地，本发明的具体目的是提供适用于预防性、治疗性和/或诊断性用于温血动物，具体地用于哺乳动物，更具体地用于人类的此类氨基酸序列和此类蛋白质和/或多肽。
更具体地，本发明的具体目的是提供可用于预防、治疗、缓解和/或诊断温血动物的、具体地哺乳动物的，更具体地人类的与HER3相关的和/或由HER3介导的一种或多种疾病、障碍或病况(例如本文中提及的疾病、障碍和病况)的此类氨基酸序列和此类蛋白质和/或多肽。
本发明的具体目的还包括提供可用于制备药物或兽医用组合物的此类氨基酸序列和此类蛋白质和/或多肽，所述组合物用于预防和/或治疗温血动物的、具体地哺乳动物的，更具体地人类的与HER3相关的和/或由HER3介导的一种或多种疾病、障碍或病况(例如本文中提及的疾病、障碍和病况)。
在本发明中，一般地，这些目的通过使用本文中描述的氨基酸序列、蛋白质、多肽和组合物来实现。
一般地，本发明提供了针对(如本文中定义的)和/或可特异性结合(如本文中定义的)HER3的氨基酸序列；以及包含至少一个这样的氨基酸序列的化合物和构建体，具体地蛋白质和多肽。
如已提及的，在一些具体的但非限定性的方面(在本文中更详细地描述的)，本发明提供了：
针对(如本文中定义的)HER3并且能够抑制或阻断(完全或部分地，如本文中进一步描述的)配体结合，具体地抑制或阻断(完全或部分地，如本文中进一步描述的)HRG对HER3的结合(如本文中进一步描述的)的氨基酸序列。此类氨基酸序列在本文中也称为“HRG-阻断性氨基酸序列”或“HRG-阻断性构建块”。优选地，此类HRG-阻断性氨基酸序列为ISV(如本文中所描述的)，在该情况下它们也称为“HRG-阻断性ISV”。优选地，任何HRG-阻断性氨基酸序列、HRG-阻断性构建块或HRG-阻断性ISV是这样的序列：它们具有阻断活性，即部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，这可利用本领域技术人员已知的任何适当的测定，例如，利用Alphascreen测定或利用FACS竞争性测定(例如，本文中描述的)来确定。优选地，阻断活性利用实施例9中描述的FACS竞争性测定来测定。优选地，ISV在CHO细胞中具有阻断或竞争HRG1-β1对HER3的结合的阻断活性或竞争能力，IC50低于600nM，优选为500nM、400nM、300nM、200nM、100nM或甚至更低。
-例如，04C07-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，其IC50低于100nM，更优选低于75nM、50nM或甚至更低，例如低于20nM或15nM、10nM、9nM、8nM、7nM或6nM或更优选低于5nM。
-例如，17B05-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，其IC50低于150nM，更优选低于100nM、90nM、80nM或甚至更低，例如低于70nM或60nM、50nM或40nM或更优选低于35nM。
-例如，21F06-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，其IC50低于100nM，更优选，低于80nM、70nM或甚至更低，例如低于60nM或50nM、40nM、30nM、20nM、15nM或13nM或更优选低于11nM。
在一个具体的但非限定性的方面，(一些)“HRG-阻断性氨基酸序列”或“HRG-阻断性构建块”可以是(和优选地是)这样的序列，它们能够抑制或阻断HER3信号转导(参见实施例9和10)，例如在实施例10中使用的磷酸化测定中。优选地，任何HRG-阻断性氨基酸序列、HRG-阻断性构建块或HRG-阻断性ISV是这样的序列，它们具有阻断活性，即部分或完全阻断或抑制HRG介导的HER3磷酸化，这可利用本领域技术人员已知的任何适当的测定，例如利用任何适当的磷酸化测定，例如HER3磷酸化测定、AKT磷酸化测定或ERK1/2磷酸化测定(如本文中描述的)来确定。
优选地，磷酸化的阻断活性或抑制能力通过实施例10中描述的HER3磷酸化测定来测定。优选地，ISV具有阻断活性或抑制MCF-7细胞中配体(例如HRG1-β1)诱导的pHER3磷酸化的能力，IC50低于600nM，但优选为500nM、400nM、300nM、200nM、100nM或甚至更低。
-例如，04C07-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于100nM，更优选，低于75nM,50nM或甚至更低，例如低于20nM或15nM、10nM、9nM、8nM、7nM或6nM或更优选低于5、4、3或2nM。
-例如，17B05-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于150nM，更优选，低于100nM、90nM、80nM或甚至更低，例如低于70nM或60nM、50nM或40nM或更优选低于35nM，例如低于20nM或15nM、10nM、9nM、8nM或7nM或更优选低于6nM。
-例如，21F06-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于150nM，更优选，低于100nM、90nM、80nM或甚至更低，例如低于70nM或60nM、50nM或40nM或更优选低于35nM，例如低于20nM或15nM、10nM、9nM、8nM或更优选低于7nM。
优选地，信号转导的阻断活性或抑制能力利用实施例10.1中描述的AKT磷酸化测定来测定。优选地，ISV具有阻断活性或抑制MCF-7细胞中配体(例如HRG1-β1)诱导的Akt磷酸化的能力，IC50低于600nM，但优选地为500nM,400nM,300nM,200nM,100nM或甚至更低。
-例如，04C07-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于100nM，更优选，低于80nM、70nM或甚至更低，例如低于60nM或50nM、45nM、40nM、35nM、30nM或更优选低于20nM。
-例如，17B05-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于150nM，更优选，低于100nM、90nM、80nM或甚至更低，例如低于70nM或60nM、50nM或40nM或更优选低于35nM，例如低于20nM或15nM、12nM、11nM、10nM或9nM或更优选低于8nM。
-例如，21F06-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于150nM，更优选，低于100nM、90nM、80nM或甚至更低，例如低于70nM或60nM、55nM或50nM或更优选低于45nM，例如低于40nM或35nM、30nM、27.5nM、25nM或更优选低于24nM。
优选地，信号转导的阻断活性或抑制能力利用实施例10.2中描述的ERK1/2磷酸化测定来测定。优选地，ISV具有阻断活性或抑制MCF-7细胞中配体(例如HRG1-β1)诱导的ERK1/2-磷酸化的能力，IC50低于600nM，但优选地为500nM、400nM、300nM、200nM、150nM或甚至更低。
-例如，04C07-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于150nM，更优选，低于100nM、90nM、80nM或甚至更低，例如低于80nM、70nM或60nM、55nM或50nM或更优选低于45nM，例如低于40nM或35nM或更优选低于30nM。
-例如，17B05-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于150nM，更优选，低于100nM、90nM、80nM或甚至更低，例如低于70nM或60nM、50nM或40nM或更优选低于35nM，例如低于20nM或15nM、10nM、7.5nM、5nM或4nM或更优选低于3nM。
-例如，21F06-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于150nM，例如优选低于120nM。
在另一个具体的但非限定性方面，HRG-阻断性氨基酸序列(或HRG-阻断性ISV)为氨基酸序列(或ISV)，所述氨基酸序列例如和具体地在实施例2中描述的测定(部分2.9)中与氨基酸序列21F06(SEQ ID NO：22)和/或氨基酸序列04C07(SEQ ID NO：15)竞争对HER3的结合和/或能够交叉阻断(如本文中定义的)21F06和/或04C07对HER3的结合。此类HRG-阻断性ISV的一些优选但非限定性实例为“21F06-样序列”和“04C07-样序列”(如本文中进一步描述的)。一些21F06-样序列可以为能够阻断/抑制配体结合以及抑制/阻断信号转导的本发明的ISV的非限定性实例。类似地，本文中描述的17B05-样序列为能够阻断/抑制(转)磷酸化以及配体/HRG结合的本发明的ISV的实例。
本发明提供了氨基酸序列，所述氨基酸序列是针对(如本文中定义的)HER3的并且能够抑制或阻断(完全或部分地，如本文中进一步描述的)HER3的(异)二聚化(如本文中进一步描述的)，例如EGFR/HER1-HER3(异)二聚化(参见例如实施例13和16)和/或HER-2/HER3(异)二聚化)，例如在实施例13中使用的HER-1/HER3(异)二聚化测定中。此类氨基酸序列在本文中也称为“二聚化-阻断性氨基酸序列”或“二聚化-阻断性构建块”。优选地，此类二聚化-阻断性氨基酸序列为ISV(如本文中所描述的)，在该情况下它们也称为“二聚化-阻断性ISV”。优选地，任何二聚化-阻断性氨基酸序列、二聚化-阻断性构建块或二聚化-阻断性ISV是这样的序列，它们阻断或抑制(异)二聚化，即完全或部分地阻断或抑制HER3与MET、EGFR和/或HER2的二聚化，这可利用本领域技术人员已知的任何适当的测定，例如，利用转磷酸化测定(例如，如本文中所描述折)来测定。优选地，阻断或抑制能力利用实施例10或13中描述的转磷酸化测定，例如，通过测定EGFR配体(例如TGF-α)诱导的HER3转磷酸化(如在MDAMB468细胞或CHO EGFR/HER3细胞的细胞测定中测量的)来测定。
-优选地，ISV在CHO EGFR/HER3细胞中具有阻断或抑制HER3与EGFR的二聚化的(异)二聚化的阻断或抑制活性，IC50低于600nM，但优选地为500nM、400nM、300nM、200nM、100nM或甚至更低。
-例如，17B05-样ISV在该测定中具有阻断活性或抑制能力，IC50低于100nM，更优选低于75nM、50nM或甚至更低，例如低于20nM或15nM、10nM、5nM、4nM、3nM或2nM或更优选低于1nM。
在一个具体的但非限定性的方面，(一些)二聚化-阻断性氨基酸序列或二聚化-阻断性构建块可以是(和优选地也是)这样的序列：它们能够抑制或阻断(完全或部分地，如本文中进一步描述的)配体结合，具体地能够抑制或阻断(完全或部分地，如本文中进一步描述的)HRG对HER3的结合。在一个具体但非限定性方面，二聚化-阻断性氨基酸序列(或二聚化-阻断性ISV)为氨基酸序列(或ISV)，所述氨基酸序列例如和具体地在实施例2(部分2.9)和实施例8中描述的测定中与氨基酸序列17B05(SEQ ID NO：13)竞争对HER3的结合和/或能够交叉阻断(如本文中定义的)17B05对HER3的结合。此类二聚化-阻断性ISV的一些优选但非限定性实例为本文中进一步描述的“17B05-样序列”。此类17B05-样序列中的至少一些也是能够阻断/抑制(转)磷酸化以及配体/HRG结合的本发明的ISV的非限定性实例。本发明提供了氨基酸序列，所述氨基酸序列是针对(如本文中定义的)HER3的并且能够结合HER3的结构域II。此类氨基酸序列在本文中也称为“结构域II-结合氨基酸序列”或“结构域II-结合构建块”。优选地，此类结构域II-结合氨基酸序列为ISV(如本文中所描述的)，在该情况下它们也称为“结构域II-结合ISV”。优选地，任何结构域II-结合氨基酸序列、结构域II-结合构建块或结构域II-结合ISV是这样的序列：它们结合HER3的结构域II，其可利用本领域技术人员已知的任何适当的测定，例如，利用表位竞争或结构域交换测定(例如如本文中所描述的)来测定。优选地，对结构域II的结合能力可通过如实施例8中描述的对嵌合HER3蛋白的结合来测定，例如通过用鸡HER3结构域交换人HER3结构域来测定。
由本发明提供的结构域II-结合氨基酸序列/ISV或结构域II-结合构建块/ISV还可具有对配体/HRG结合(具体地，它们可在有限/部分的程度上能够抑制或阻断配体/HRG对HER3的结合)和/或对HER3的(异)二聚化的作用(所述作用可以是有限的/部分的或更显著的)。
在一个具体的但非限定性的方面，(一些)“结构域II-结合氨基酸序列”或“结构域II-结合构建块”可以是(和优选也是)这样的序列，它们能够例抑制或阻断HER3磷酸化(参见实施例10)，如在实施例10中使用的磷酸化测定中。优选地，任何结构域II-结合氨基酸序列或结构域II-结合构建块或结构域II-结合ISV是这样的序列：它们具有阻断活性，即部分或完全地阻断或抑制HRG介导的HER3磷酸化，这可利用本领域技术人员已知的任何适当的测定，例如利用任何适当的磷酸化测定，例如本文中所描述的HER3磷酸化测定、AKT磷酸化测定或ERK1/2磷酸化测定来测定。
优选地，磷酸化的阻断活性或抑制能力利用如实施例10中描述的HER3磷酸化测定来测定。优选地，ISV具有阻断活性或抑制MCF-7细胞中配体(例如HRG1-β1)诱导的pHER3磷酸化的能力，IC50低于600nM,但优选地低于500nM、400nM、300nM、200nM、100nM或甚至更低。
-例如，18G11-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于150nM，更优选，低于100nM、90nM、80nM或甚至更低，例如低于70nM或60nM、50nM或40nM或更优选低于35nM，例如低于20nM或15nM、14nM、13nM、12nM或更优选低于11nM.
-例如，34C07-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于150nM，更优选，低于100nM、90nM、80nM或甚至更低，例如低于70nM或60nM、50nM或40nM或更优选低于35nM，例如低于20nM或16nM、15nM、14nM、13nM或更优选低于12nM。
优选地，磷酸化的阻断活性或抑制能力利用如实施例10.1中描述的AKT磷酸化测定来测定。优选地，ISV具有阻断活性或抑制MCF-7细胞中配体(例如HRG1-β1)诱导的Akt-磷酸化的能力，IC50低于600nM，但优选地为500nM,400nM,300nM,200nM,150nM或甚至更低。
-例如，18G11-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于150nM，更优选低于140nM。
-例如，34C07-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于150nM，更优选，低于100nM或90nM、80nM、70nM、60nM或更优选低于50nM。
优选地，磷酸化的阻断活性或抑制能力利用实施例10.2中描述的ERK1/2磷酸化测定来测定。优选地，ISV具有阻断活性或抑制MCF-7细胞中配体(例如HRG1-β1)诱导的ERK1/2-磷酸化的能力，IC50M低于600nM，但优选地为500nM、400nM、300nM、200nM、150nM或甚至更低。
-例如，34C07-样ISV在该测定中具有阻断活性或竞争能力，IC50低于150nM，例如低于120nM。
在一个具体但非限定性方面，结构域II-结合氨基酸序列(或结构域II-结合ISV)为氨基酸序列(或ISV)，所述氨基酸序列例如和具体地在实施例2(部分2.9)中描述的测定中与氨基酸序列18G11(SEQ ID NO：16)和/或与氨基酸序列34C07(SEQ ID NO：18)竞争对HER3的结合和/或能够交叉阻断(如本文中定义的)18G11和/或34C07对HER3的结合。同样地，在一个具体但非限定性方面，结构域II-结合氨基酸序列能够抑制或阻断HER3磷酸化(参见实施例9和10)，例如在实施例10中使用的磷酸化测定中，优选基本上不阻断或显著抑制配体结合。此类结构域II-结合ISV的一些优选但非限定性实例为如本文中进一步描述的“18G11-样序列”和“34C07-样序列”。在这些之中，一些34C07-样序列为不仅结合结构域II而且还在有限/部分程度上能够抑制配体/HER3结合的本发明的ISV的实例。
同样地，在本说明书和权利要求中，如下定义下列术语：
A)21F06-样序列：“21F06-样序列”、“21F06-样ISV”或“21F06-样构建块”被定义为ISV(如本文中所描述的)，其包含：
a)CDR1，其包含如下氨基酸序列或基本上由其组成：(i)氨基酸序列LNAMG(SEQ IDNO：67)或(ii)与氨基酸序列LNAMG仅具有3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
b)CDR2，其包含如下氨基酸序列或基本上由其组成：(i)氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG(SEQ ID NO：97)或(ii)与氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
c)CDR3，其包含如下氨基酸序列或基本上由其组成：(i)氨基酸序列DTPPWGPMIYIESYDS(SEQ ID NO：127)或(ii)与氨基酸序列DTPPWGPMIYIESYDS具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DTPPWGPMIYIESYDS仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于这样的ISV中的构架序列是如本文中进一步描述的，并且其中CDR1、CDR2和CDR3优选使得21F06-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
如本文中还提及的，(一些)21F06-样序列可以是(和优选地也是)这样的序列：它们能够例抑制或阻断HER3磷酸化(参见实施例9和10)，如在实施例10中使用的磷酸化测定中。优选地，在这样的21F06-样序列中，CDR1和CDR2分别如在a)和b)下所定义的；或CDR1和CDR3分别如在a)和c)下所定义的；或CDR2和CDR3分别如在b)和c)所定义的。更优选地，在这样的21F06-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3全都分别如在a)、b)和c)下所定义的。再次地，在这样的21F06-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得21F06-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化(全都如上文中所描述的)测定中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
例如，在这样的21F06-样序列中：CDR1可包含氨基酸序列LNAMG或基本上由所述序列组成(CDR2和CDR3分别如在b)和c)下所定义的)；和/或CDR2可包含氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG或基本上由所述序列组成(CDR1和CDR3分别如在a)和c)下所定义的)；和/或CDR3可包含氨基酸序列DTPPWGPMIYIESYDS或基本上由所述序列组成(CDR1和CDR2分别如在a)和b)下所定义的)。具体地，当21F06-样序列是根据该方面时：CDR1可包含氨基酸序列LNAMG或基本上由所述序列组成并且CDR2可包含氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG或基本上由所述序列组成(CDR3如上文中在c)下所定义的)；和/或CDR1可包含氨基酸序列LNAMG或基本上由所述序列组成并且CDR3可包含氨基酸序列DTPPWGPMIYIESYDS或基本上由所述序列组成(CDR2如上文中在b)下所定义的)；和/或CDR2可包含氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG或基本上由所述序列组成，并且CDR3可包含氨基酸序列DTPPWGPMIYIESYDS或基本上由所述序列组成(CDR1如上文中在a)下所定义的)。再次地，在这样的21F06-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得21F06-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。在特别优选的方面，“21F06-样序列”、“21F06-样ISV”或“21F06-样构建块”为ISV，其包含：
d)CDR1，其为(i)氨基酸序列LNAMG或(ii)与氨基酸序列LNAMG仅具有3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
e)CDR2，其为(i)氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG或(ii)与氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
f)CDR3，其为(i)氨基酸序列DTPPWGPMIYIESYDS或(ii)与氨基酸序列DTPPWGPMIYIESYDS具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DTPPWGPMIYIESYDS仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于这样的ISV中的构架序列是如本文中进一步描述的，并且其中CDR1、CDR2和CDR3优选地使得21F06-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。优选地，在根据该特别优选方面的21F06-样序列中，CDR1和CDR2分别如d)和e)下所定义的；或CDR1和CDR3分别如在d)和f)下所定义的；或CDR2和CDR3分别如在e)和f)下所定义的。更优选地，在这样的21F06-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3全都分别如在d)、e)和f)下所定义的。再次地，在这样的21F06-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得21F06-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
例如，在根据该特别优选方面的21F06-样序列中：CDR1为氨基酸序列LNAMG(CDR2和CDR3分别如在e)和f)下所定义的)；和/或CDR2为氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG(CDR1和CDR3分别如在d)和f)下所定义的)；和/或CDR3为氨基酸序列DTPPWGPMIYIESYDS(CDR1和CDR2分别如在d)和e)下所定义的)。具体地，当21F06-样序列根据该方面时：CDR1为氨基酸序列LNAMG并且CDR2为氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG(CDR3如上文中在f)下所定义的)；和/或CDR1为氨基酸序列LNAMG并且CDR3为氨基酸序列DTPPWGPMIYIESYDS(CDR2如上文中在e)下所定义的)；和/或CDR2为氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG并且CDR3为DTPPWGPMIYIESYDS(CDR1如上文中在d)下所定义的)。再次地，在这样的21F06-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选地使得21F06-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
在特别优选的21F06-样序列中：CDR1为氨基酸序列LNAMG，CDR2为氨基酸序列AIDWSDGNKDYADSVKG；以及CDR3为氨基酸序列DTPPWGPMIYIESYDS。
在该段落A)中描述的所有21F06-样序列中，构架序列可以如本文中进一步描述的。优选地，构架序列是这样的序列：构架序列与21F06的构架序列具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%的序列同一性(这例如可通过在不考虑CDR的情况下，测定给定的序列与21F06的序列的序列同一性的总体程度来测定)。再次地，存在于给定的序列中的CDR与构架的组合优选地使得所得的21F06-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。在一个具体方面，21F06-样序列为与21F06的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)具有至少70%、例如至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的ISV。例如，在根据该方面的21F06-样序列中，CDR可根据上述特别优选的方面，并且可以具体地(但非限制性地)为LNAMG(CDR1)；AIDWSDGNKDYADSVKG(CDR2)；和DTPPWGPMIYIESYDS(CDR3)。再次地，优选地，存在于这样的21F06-样ISV中的CDR与构架的组合使得所得的21F06-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
在一个具体方面，任何21F06-样序列可以是人源化和/或经序列优化的序列，如本文中进一步描述的。
B)04C07-样序列：“04C07-样序列”、“04C07-样ISV”或“04C07-样构建块”被定义为ISV(如本文中所描述的)，其包含：
a)CDR1，其包含如下氨基酸序列或基本上由所述序列组成：(i)氨基酸序列氨基酸序列SYPMS(SEQ ID NO：60)或(ii)与氨基酸序列SYPMS仅具有3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
b)CDR2，其包含如下氨基酸序列或基本上由所述序列组成：(i)氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG(SEQ ID NO：90)或(ii)与氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
c)CDR3，其包含如下氨基酸序列或基本上由所述序列组成：(i)氨基酸序列DLNN(SEQ ID NO：120)或(ii)与氨基酸序列DLNN具有至少50%，例如至少75%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DLNN仅具有2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于这样的ISV中的构架序列是如本文中进一步描述的，并且其中CDR1、CDR2和CDR3优选使得04C07-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
优选地，在这样的04C07-样序列中,CDR1和CDR2分别如在a)和b)下所定义的；或CDR1和CDR3分别如在a)和c)下所定义的；或CDR2和CDR3分别如在b)和c)下所定义的。更优选地，在这样的04C07-样序列中,CDR1、CDR2和CDR3全都分别如在a)、b)和c)下所定义的。再次地，在这样的04C07-样序列中,CDR1、CDR2和CDR3优选使得04C07-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
例如，在这样的04C07-样序列中：CDR1可包含氨基酸序列SYPMS或基本上由所述序列组成(CDR2和CDR3分别如在b)和c)下所定义的)；和/或CDR2可包含氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG或基本上由所述序列组成(CDR1和CDR3分别如在a)和c)下所定义的)；和/或CDR3可包含氨基酸序列DLNN或基本上由所述序列组成(CDR1和CDR2分别如在a)和b)下所定义的)。具体地，当04C07-样序列根据该方面时：CDR1可包含氨基酸序列SYPMS或基本上由所述序列组成并且CDR2可包含氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG或基本上由所述序列组成(CDR3如上文中在c)下所定义的)；和/或CDR1可包含氨基酸序列SYPMS或基本上由所述序列组成并且CDR3可包含氨基酸序列DLNN或基本上由所述序列组成(CDR2如上文中在b)下所定义的)；和/或CDR2可包含氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG或基本上由所述序列组成，并且CDR3可包含氨基酸序列DLNN或基本上由所述序列组成(CDR1如上文中在a)下所定义的)。再次地，在这样的04C07-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得04C07-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
在特别优选的方面，“04C07-样序列”、“04C07-样ISV”或“04C07-样构建块”为ISV，其包含：
d)CDR1，其为(i)氨基酸序列SYPMS或(ii)与氨基酸序列SYPMS仅具有3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
e)CDR2，其为(i)氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG或(ii)与氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
f)CDR3，其为(i)氨基酸序列DLNN或(ii)与氨基酸序列DLNN具有至少50%，例如至少75%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DLNN仅具有2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于这样的ISV中的构架序列是如本文中进一步描述的，并且其中CDR1、CDR2和CDR3优选地使得04C07-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
优选地，在根据该特别优选方面的04C07-样序列中，CDR1和CDR2分别如d)和e)下所定义的；或CDR1和CDR3分别如在d)和f)下所定义的；或CDR2和CDR3分别如在e)和f)下所定义的。更优选地，在这样的04C07-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3全都分别如在d)、e)和f)下所定义的。再次地，在这样的04C07-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得04C07-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
例如，在根据该特别优选方面的04C07-样序列中：CDR1为氨基酸序列SYPMS(CDR2和CDR3分别如在e)和f)下所定义的)；和/或CDR2为氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG(CDR1和CDR3分别如在d)和f)下所定义的)；和/或CDR3为氨基酸序列DLNN(CDR1和CDR2分别如在d)和e)下所定义的)。具体地，当04C07-样序列根据该方面时：CDR1为氨基酸序列SYPMS并且CDR2为氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG(CDR3如上文中在f)下所定义的)；和/或CDR1为氨基酸序列SYPMS并且CDR3为氨基酸序列DLNN(CDR2如上文中在e)下所定义的)；和/或CDR2为氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG并且CDR3为DLNN(CDR1如上文中在d)下所定义的)。再次地，在这样的04C07-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选地使得04C07-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
在特别优选的04C07-样序列中：CDR1为氨基酸序列SYPMS，CDR2为氨基酸序列TVSPGGITTSYADSVKG；以及CDR3为氨基酸序列DLNN。
在该段落B)中描述的所有04C07-样序列中，构架序列可以如本文中进一步描述的。优选地，构架序列是这样的序列：构架序列与04C07的构架序列具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%的序列同一性(这例如可通过在不考虑CDR的情况下，测定给定的序列与04C07的序列的序列同一性的总体程度来测定)。再次地，存在于给定的序列中的CDR与构架的组合优选地使得所得的04C07-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
在一个具体方面，04C07-样序列为与氨基酸序列04C07(SEQ ID NO：15)具有至少70%、例如至少80%、例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的ISV。例如，在根据该方面的04C07-样序列中，CDR可根据上述特别优选方面，并且可以具体地(但非限制性地)为SYPMS(CDR1)；TVSPGGITTSYADSVKG(CDR2)和DLNN(CDR3)。再次地，优选地，存在于这样的04C07-样ISV中的CDR和构架的组合优选使得所得的04C07-样ISV具有阻断活性，例如如上文中所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有阻断活性或抑制磷酸化的能力。
在一个具体方面，任何04C07-样序列可以是人源化和/或序列优化的序列，如本文中进一步描述的。
C)17B05-样序列：“17B05-样序列”、“17B05-样ISV”或“17B05-样构建块”被定义为ISV(如本文中所描述的)，其包含：
a)CDR1，其包含如下氨基酸序列或基本上由所述序列组成：(i)氨基酸序列LNAMA(SEQ ID NO：58)或(ii)与氨基酸序列LNAMA仅具有3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
b)CDR2，包含如下氨基酸序列或基本上由所述序列组成：(i)氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG(SEQ ID NO：88)或(ii)与氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
c)CDR3，包含如下氨基酸序列或基本上由所述序列组成：(i)氨基酸序列SSVTRGSSDY(SEQ ID NO：118)或(ii)与氨基酸序列SSVTRGSSDY具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列SSVTRGSSDY仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于这样的ISV中的构架序列是如本文中进一步描述的，并且其中CDR1、CDR2和CDR3优选使得17B05-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定中具有阻断活性或抑制(转)磷酸化的能力和/或具有阻断或抑制(异)二聚化的活性(如通过EGFR配体(EGF)诱导的HER3磷酸化测定所测定的)，全都如上文中所描述的。
如本文中提及的，(一些)17B05-样序列可以是(和优选地是)这样的序列：它们能够例抑制或阻断(完全或部分地，如本文中进一步描述的)配体结合，具体地能够抑制或阻断(完全或部分地，如本文中进一步描述的)HGR对HER3的结合。
优选地，在这样的17B05-样序列中，CDR1和CDR2分别如在a)和b)下所定义的；或CDR1和CDR3分别如在a)和c)下所定义的；或CDR2和CDR3分别如在b)和c)所定义的。更优选地，在这样的17B05-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3全都分别如在a)、b)和c)下所定义的。再次地，在这样的17B05-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得17B05-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定中具有阻断活性或抑制(转)磷酸化的能力和/或具有阻断或抑制(异)二聚化的活性(如通过EGFR配体(EGF)诱导的HER3磷酸化测定所测定的)，全都如上文中所描述的。
例如，在这样的17B05-样序列中：CDR1可包含氨基酸序列LNAMA或基本上由所述序列组成(CDR2和CDR3分别如在b)和c)下所定义的)；和/或CDR2可包含氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG或基本上由所述序列组成(CDR1和CDR3分别如在a)和c)下所定义的)；和/或CDR3可包含氨基酸序列SSVTRGSSDY或基本上由所述序列组成(CDR1和CDR2分别如在a)和b)下所定义的)。具体地，当17B05-样序列是根据该方面时：CDR1可包含氨基酸序列LNAMA或基本上由所述序列组成并且CDR2可包含氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG或基本上由所述序列组成(CDR3如上文中在c)下所定义的)；和/或CDR1可包含氨基酸序列LNAMA或基本上由所述序列组成并且CDR3可包含氨基酸序列SSVTRGSSDY或基本上由所述序列组成(CDR2如上文中在b)下所定义的)；和/或CDR2可包含氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG或基本上由所述序列组成，并且CDR3可包含氨基酸序列SSVTRGSSDY或基本上由所述序列组成(CDR1如上文中在a)下所定义的)。再次地，在这样的17B05-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得17B05-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定中具有阻断活性或抑制(转)磷酸化的能力和/或具有阻断或抑制(异)二聚化的活性(如通过EGFR配体(EGF)诱导的HER3磷酸化测定所测定的)，全都如上文中所描述的。
在特别优选的方面，“17B05-样序列”、“17B05-样ISV”或“17B05-样构建块”为ISV，其包含：
d)CDR1，其为(i)氨基酸序列LNAMA或(ii)与氨基酸序列LNAMA仅具有3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
e)CDR2，其为(i)氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG或(ii)与氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
f)CDR3，其为(i)氨基酸序列SSVTRGSSDY或(ii)与氨基酸序列SSVTRGSSDY具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列SSVTRGSSDY仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于这样的ISV中的构架序列是如本文中进一步描述的，并且其中CDR1、CDR2和CDR3优选地使得17B05-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定中具有阻断活性或抑制(转)磷酸化的能力和/或具有阻断或抑制(异)二聚化的活性(如通过EGFR配体(EGF)诱导的HER3磷酸化测定所测定的)，全都如上文中所描述的。
优选地，在根据该特别优选方面的17B05-样序列中，CDR1和CDR2分别如d)和e)下所定义的；或CDR1和CDR3分别如在d)和f)下所定义的；或CDR2和CDR3分别如在e)和f)下所定义的。更优选地，在这样的17B05-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3全都分别如在d)、e)和f)下所定义的。再次地，在这样的17B05-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得17B05-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定中具有阻断活性或抑制(转)磷酸化的能力和/或具有阻断或抑制(异)二聚化的活性(如通过EGFR配体(EGF)诱导的HER3磷酸化测定所测定的)，全都如上文中所描述的。
例如，在根据该特别优选方面的17B05-样序列中：CDR1为氨基酸序列LNAMA(CDR2和CDR3分别如在e)和f)下所定义的)；和/或CDR2为氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG(CDR1和CDR3分别如在d)和f)下所定义的)；和/或CDR3为氨基酸序列SSVTRGSSDY(CDR1和CDR2分别如在d)和e)下所定义的)。具体地，当17B05-样序列根据该方面时：CDR1为氨基酸序列LNAMA并且CDR2为氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG(CDR3如上文中在f)下所定义的)；和/或CDR1为氨基酸序列LNAMA并且CDR3为氨基酸序列SSVTRGSSDY(CDR2如上文中在e)下所定义的)；和/或CDR2为氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG并且CDR3为SSVTRGSSDY(CDR1如上文中在d)下所定义的)。再次地，在这样的17B05-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选地使得17B05-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定中具有阻断活性或抑制(转)磷酸化的能力和/或具有阻断或抑制(异)二聚化的活性(如通过EGFR配体(EGF)诱导的HER3磷酸化测定所测定的)，全都如上文中所描述的。
在特别优选的17B05-样序列中：CDR1为氨基酸序列LNAMA，CDR2为氨基酸序列GIFGVGSTRYADSVKG；以及CDR3为氨基酸序列SSVTRGSSDY。
在该段落C)中描述的所有17B05-样序列中，构架序列可以如本文中进一步描述的。优选地，构架序列是这样的序列：构架序列与17B05的构架序列具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%的序列同一性(这例如可通过在不考虑CDR的情况下，测定给定的序列与17B05的序列的序列同一性的总体程度来测定)。再次地，存在于给定的序列中的CDR与构架的组合优选地使得所得的17B05-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定中具有阻断活性或抑制(转)磷酸化的能力和/或具有阻断或抑制(异)二聚化的活性(如通过EGFR配体(EGF)诱导的HER3磷酸化测定所测定的)，全都如上文中所描述的。
在一个具体方面，17B05-样序列为与17B05的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)具有至少70%、例如至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的ISV。例如，在根据该方面的17B05-样序列中，CDR可根据上述特别优选的方面，并且可以具体地(但非限制性地)为LNAMA(CDR1)；GIFGVGSTRYADSVKG(CDR2)；和SSVTRGSSDY(CDR3)。再次地，优选地，存在于这样的17B05-样ISV中的CDR与构架的组合使得所得的17B05-样ISV具有阻断活性，例如如上所述，部分或完全地阻断HRG对HER3的结合，和/或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定中具有阻断活性或抑制(转)磷酸化的能力和/或具有阻断或抑制(异)二聚化的活性(如通过EGFR配体(EGF)诱导的HER3磷酸化测定所测定的)，全都如上文中所描述的。
在一个具体方面，任何17B05-样序列可以是人源化和/或经序列优化的序列，如本文中进一步描述的。
D)18G11-样序列：“18G11-样序列”、“18G11-样ISV”或“18G11-样构建块”被定义为ISV(如本文中所描述的)，其包含：
a)CDR1，其包含如下氨基酸序列或基本上由所述序列组成：(i)氨基酸序列氨基酸序列INAMG(SEQ ID NO：61)或(ii)与氨基酸序列INAMG仅具有3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
b)CDR2，其包含如下氨基酸序列或基本上由所述序列组成：(i)氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG(SEQ ID NO：91)或(ii)与氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
c)CDR3，其包含如下氨基酸序列或基本上由所述序列组成：(i)氨基酸序列DHYSMGVPEKRVIM(SEQ ID NO：121)或(ii)与氨基酸序列DHYSMGVPEKRVIM具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DHYSMGVPEKRVIM仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于这样的ISV中的构架序列是如本文中进一步描述的，并且其中CDR1、CDR2和CDR3优选使得18G11-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
如本文中提及的，(一些)18G11-样序列可对配体/HRG结合(具体地，它们可在有限/部分的程度上能够抑制或阻断配体/HRG对HER3的结合)和/或对HER3的(异)二聚化具有作用(所述作用可以是有限的/部分的或更显著的)。
优选地，在这样的18G11-样序列中,CDR1和CDR2分别如在a)和b)下所定义的；或CDR1和CDR3分别如在a)和c)下所定义的；或CDR2和CDR3分别如在b)和c)下所定义的。更优选地，在这样的18G11-样序列中,CDR1、CDR2和CDR3全都分别如在a)、b)和c)下所定义的。再次地，在这样的18G11-样序列中,CDR1、CDR2和CDR3优选使得18G11-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
例如，在这样的18G11-样序列中：CDR1可包含氨基酸序列INAMG或基本上由所述序列组成(CDR2和CDR3分别如在b)和c)下所定义的)；和/或CDR2可包含氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG或基本上由所述序列组成(CDR1和CDR3分别如在a)和c)下所定义的)；和/或CDR3可包含氨基酸序列DHYSMGVPEKRVIM或基本上由所述序列组成(CDR1和CDR2分别如在a)和b)下所定义的)。具体地，当18G11-样序列根据该方面时：CDR1可包含氨基酸序列INAMG或基本上由所述序列组成并且CDR2可包含氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG或基本上由所述序列组成(CDR3如上文中在c)下所定义的)；和/或CDR1可包含氨基酸序列INAMG或基本上由所述序列组成并且CDR3可包含氨基酸序列DHYSMGVPEKRVIM或基本上由所述序列组成(CDR2如上文中在b)下所定义的)；和/或CDR2可包含氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG或基本上由所述序列组成，并且CDR3可包含氨基酸序列DHYSMGVPEKRVIM或基本上由所述序列组成(CDR1如上文中在a)下所定义的)。再次地，在这样的18G11-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得18G11-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
在特别优选的方面，“18G11-样序列”、“18G11-样ISV”或“18G11-样构建块”为ISV，其包含：
d)CDR1，其为(i)氨基酸序列INAMG或(ii)与氨基酸序列INAMG仅具有3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
e)CDR2，其为(i)氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG或(ii)与氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
f)CDR3，其为(i)氨基酸序列DHYSMGVPEKRVIM或(ii)与氨基酸序列DHYSMGVPEKRVIM具有至少80%，例如至少85%、例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DHYSMGVPEKRVIM仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于这样的ISV中的构架序列是如本文中进一步描述的，并且其中CDR1、CDR2和CDR3优选地使得18G11-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
优选地，在根据该特别优选方面的18G11-样序列中，CDR1和CDR2分别如在d)和e)下所定义的；或CDR1和CDR3分别如在d)和f)下所定义的；或CDR2和CDR3分别如在e)和f)下所定义的。更优选地，在这样的18G11-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3全都分别如在d)、e)和f)下所定义的。再次地，在这样的18G11-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得18G11-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。例如，在根据该特别优选方面的18G11-样序列中：CDR1为氨基酸序列INAMG(CDR2和CDR3分别如在e)和f)下所定义的)；和/或CDR2为氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG(CDR1和CDR3分别如在d)和f)下所定义的)；和/或CDR3为氨基酸序列DHYSMGVPEKRVIM(CDR1和CDR2分别如在d)和e)下所定义的)。具体地，当18G11-样序列根据该方面时：CDR1为氨基酸序列INAMG并且CDR2为氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG(CDR3如上文中在f)下所定义的)；和/或CDR1为氨基酸序列INAMG并且CDR3为氨基酸序列DHYSMGVPEKRVIM(CDR2如上文中在e)下所定义的)；和/或CDR2为氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG并且CDR3为DHYSMGVPEKRVIM(CDR1如上文中在d)下所定义的)。再次地，在这样的18G11-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选地使得18G11-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
在特别优选的18G11-样序列中：CDR1为氨基酸序列INAMG，CDR2为氨基酸序列LITSSDTTDYAESVEG；以及CDR3为氨基酸序列DHYSMGVPEKRVIM。
在该段落D)中描述的所有18G11-样序列中，构架序列可以如本文中进一步描述的。优选地，构架序列是这样的序列：构架序列与18G11的构架序列具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%的序列同一性(这例如可通过在不考虑CDR的情况下，测定给定的序列与18G11的序列的序列同一性的总体程度来测定)。再次地，存在于给定的序列中的CDR与构架的组合优选地使得所得的18G11-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
在一个具体方面，18G11-样序列为与氨基酸序列18G11(SEQ ID NO：16)具有至少70%、例如至少80%、例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的ISV。例如，在根据该方面的18G11-样序列中，CDR可根据上述特别优选方面，并且可以具体地(但非限制性地)为INAMG(CDR1)；LITSSDTTDYAESVEG(CDR2)和DHYSMGVPEKRVIM(CDR3)。再次地，优选地，存在于这样的18G11-样ISV中的CDR和构架的组合优选使得所得的18G11-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
在一个具体方面，任何18G11-样序列可以是人源化和/或经序列优化的序列，如本文中进一步描述的。
E)34C07-样序列：“34C07-样序列”、“34C07-样ISV”或“34C07-样构建块”被定义为ISV(如本文中所描述的)，其包含：
a)CDR1，其包含如下氨基酸序列或基本上由所述序列组成：(i)氨基酸序列氨基酸序列INAMA(SEQ ID NO：63)或(ii)与氨基酸序列INAMA仅具有3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
b)CDR2，其包含如下氨基酸序列或基本上由所述序列组成：(i)氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：93)或(ii)与氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
c)CDR3，其包含如下氨基酸序列或基本上由所述序列组成：(i)氨基酸序列DHYTTWDRRSAY(SEQ ID NO：123)或(ii)与氨基酸序列DHYTTWDRRSAY具有至少80%，例如至少85%、例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DHYTTWDRRSAY仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于这样的ISV中的构架序列是如本文中进一步描述的，并且其中CDR1、CDR2和CDR3优选使得34C07-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
如本文中提及的，(一些)34C07-样序列可具有对配体/HRG结合(具体地，它们可在有限/部分的程度上能够抑制或阻断配体/HRG对HER3的结合)和/或对HER3的(异)二聚化的作用(所述作用可以是有限的/部分的或更显著的)。具体地，它们可在有限的程度上能够抑制配体/HRG结合HER3。
优选地，在这样的34C07-样序列中,CDR1和CDR2分别如在a)和b)下所定义的；或CDR1和CDR3分别如在a)和c)下所定义的；或CDR2和CDR3分别如在b)和c)下所定义的。更优选地，在这样的34C07-样序列中,CDR1、CDR2和CDR3全都分别如在a)、b)和c)下所定义的。再次地，在这样的34C07-样序列中,CDR1、CDR2和CDR3优选使得34C07-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
例如，在这样的34C07-样序列中：CDR1可包含氨基酸序列INAMA或基本上由所述序列组成(CDR2和CDR3分别如在b)和c)下所定义的)；和/或CDR2可包含氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG或基本上由所述序列组成(CDR1和CDR3分别如在a)和c)下所定义的)；和/或CDR3可包含氨基酸序列DHYTTWDRRSAY或基本上由所述序列组成(CDR1和CDR2分别如在a)和b)下所定义的)。具体地，当34C07-样序列根据该方面时：CDR1可包含氨基酸序列INAMA或基本上由所述序列组成并且CDR2可包含氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG或基本上由所述序列组成(CDR3如上文中在c)下所定义的)；和/或CDR1可包含氨基酸序列INAMA或基本上由所述序列组成并且CDR3可包含氨基酸序列DHYTTWDRRSAY或基本上由所述序列组成(CDR2如上文中在b)下所定义的)；和/或CDR2可包含氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG或基本上由所述序列组成，并且CDR3可包含氨基酸序列DHYTTWDRRSAY或基本上由所述序列组成(CDR1如上文中在a)下所定义的)。再次地，在这样的34C07-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得34C07-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
在特别优选的方面，“34C07-样序列”、“34C07-样ISV”或“34C07-样构建块”为ISV，其包含：
d)CDR1，其为(i)氨基酸序列INAMA或(ii)与氨基酸序列INAMA仅具有3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
e)CDR2，其为(i)氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG或(ii)与氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；和/或
f)CDR3，其为(i)氨基酸序列DHYTTWDRRSAY或(ii)与氨基酸序列DHYTTWDRRSAY具有至少80%，例如至少85%、例如至少90%或超过95%的序列同一性的氨基酸序列；或(iii)与氨基酸序列DHYTTWDRRSAY仅具有7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异(如本文中定义的)的氨基酸序列；
其中存在于这样的ISV中的构架序列是如本文中进一步描述的，并且其中CDR1、CDR2和CDR3优选地使得34C07-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
优选地，在根据该特别优选方面的34C07-样序列中，CDR1和CDR2分别如在d)和e)下所定义的；或CDR1和CDR3分别如在d)和f)下所定义的；或CDR2和CDR3分别如在e)和f)下所定义的。更优选地，在这样的34C07-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3全都分别如在d)、e)和f)下所定义的。再次地，在这样的34C07-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选使得34C07-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
例如，在根据该特别优选方面的34C07-样序列中：CDR1为氨基酸序列INAMA(CDR2和CDR3分别如在e)和f)下所定义的)；和/或CDR2为氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG(CDR1和CDR3分别如在d)和f)下所定义的)；和/或CDR3为氨基酸序列DHYTTWDRRSAY(CDR1和CDR2分别如在d)和e)下所定义的)。具体地，当34C07-样序列根据该方面时：CDR1为氨基酸序列INAMA并且CDR2为氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG(CDR3如上文中在f)下所定义的)；和/或CDR1为氨基酸序列INAMA并且CDR3为氨基酸序列DHYTTWDRRSAY(CDR2如上文中在e)下所定义的)；和/或CDR2为氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG并且CDR3为DHYTTWDRRSAY(CDR1如上文中在d)下所定义的)。再次地，在这样的34C07-样序列中，CDR1、CDR2和CDR3优选地使得34C07-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
在特别优选的34C07-样序列中：CDR1为氨基酸序列INAMA，CDR2为氨基酸序列EITAGGSTNYADSVKG；以及CDR3为氨基酸序列DHYTTWDRRSAY。
在该段落E)中描述的所有34C07-样序列中，构架序列可以如本文中进一步描述的。优选地，构架序列是这样的序列：构架序列与34C07的构架序列具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%的序列同一性(这例如可通过在不考虑CDR的情况下，测定给定的序列与34C07的序列的序列同一性的总体程度来测定)。再次地，存在于给定的序列中的CDR与构架的组合优选地使得所得的34C07-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
在一个具体方面，34C07-样序列为与氨基酸序列34C07(SEQ ID NO：18)具有至少70%、例如至少80%、例如至少85%，例如至少90%或超过95%的序列同一性的ISV。例如，在根据该方面的34C07-样序列中，CDR可根据上述特别优选方面，并且可以具体地(但非限制性地)为INAMA(CDR1)；EITAGGSTNYADSVKG(CDR2)和DHYTTWDRRSAY(CDR3)。再次地，优选地，存在于这样的34C07-样ISV中的CDR和构架的组合优选使得所得的34C07-样ISV具有结构域II结合活性、阻断活性或在HER3磷酸化测定和/或pAKT磷酸化测定和/或ERK1/2磷酸化测定(全都如上文中所描述的)中具有抑制磷酸化的能力。
在一个具体方面，任何34C07-样序列可以是人源化和/或经序列优化的序列，如本文中进一步描述的。
在一个具体方面，任何34C07-样序列可以是人源化和/或经序列优化的序列，如本文中进一步描述的。
所有本文中描述的本发明的氨基酸序列(包括根据本文中提及的具体方面(例如上述段落中提及的方面)的那些氨基酸序列)，所述氨基酸序列可以以如本文中定义的亲和力(适当地测量和/或表示为KD-值(实际或表观)、KA-值(实际或表观)、kon-率和/或koff-率或可选择地测量和/或表示为IC50值，如本文中进一步描述的)结合HER3；以及包含至少一种这样的氨基酸序列的化合物和构建体，具体地蛋白质和多肽。
具体地，本发明的氨基酸序列和多肽优选地使得它们能够：
-以10-5至10-12摩尔/升或更低，优选10-7至10-12摩尔/升或更低以及更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即以105至1012升/摩尔或更高，优选107至1012升/摩尔或更高以及更优选108至1012升/摩尔的缔合常数(KA))结合HER3；
和/或以使它们能够：
-以102M-1s-1至约107M-1s-1，优选103M-1s-1至107M-1s-1，更优选地104M-1s-1至107M-1s-1，例如105M-1s-1至107M-1s-1的kon-率结合HER3；
和/或以使它们能够：
-以1s-1(t1/2=0.69s)至10-6s-1(提供具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选地10-2s-1至10-6s-1，更优选地10-3s-1至10-6s-1，例如10-4s-1至10-6s-1的koff率结合HER3。
优选地，本发明的单价氨基酸序列(或仅包含一个本发明的氨基酸序列的多肽)使得其将以低于500nM，优选低于200nM，更优选地低于10nM，例如低于500pM的亲和力结合HER3。
根据本文中的进一步描述和实施例，本发明的氨基酸序列或多肽对HER3的结合的一些优选IC50值将变得清楚明了。
关于对HER3的结合，本发明的氨基酸序列通常在其氨基酸序列内包含一个或多个氨基酸残基或一个或多个氨基酸残基区段(即每一个“区段”包含两个或更多个彼此相邻或彼此靠近(即在氨基酸序列的一级或三级结构上)的氨基酸残基)，通过所述氨基酸残基或氨基酸残基区段本发明的氨基酸序列可结合HER3，所述氨基酸残基或氨基酸残基区段从而可形成用于结合HER3的“位点”(在本文中也称为“抗原结合位点”)。
由本发明提供的氨基酸序列优选以基本上分离的形式(如本文中定义的)存在，或形成本发明的蛋白质或多肽的部分(如本文中定义的)，其可包含一个或多个本发明的氨基酸序列或基本上由所述序列组成并且其还可任选地包含一个或多个其它氨基酸序列(所有序列任选地通过一个或多个适当的接头连接)。例如，但非限制性地，一个或多个本发明的氨基酸序列在这样的蛋白质或多肽中可用作结合单元，所述蛋白质或多肽可以任选地包含一个或多个可用作结合单元的其它氨基酸序列(即针对除HER3外的一个或多个其它靶)，以分别提供本发明的单价、多价或多特异性多肽，全都如上文中所描述的。这样的蛋白质或多肽也可以以基本上分离的形式(如本文中定义的)存在。
这样的本发明的氨基酸序列和多肽优选地基本上由不通过二硫键连接于任何其它氨基酸序列或链的单个氨基酸链组成(但可以包含或可以不包含一个或多个分子内二硫桥。例如，已知免疫球蛋白单可变结构域和/或纳米抗体–如本文中所描述的-有时可在CDR3与CDR1或FR2之间包含二硫键)。然而，应当指出，一个或多个本发明的氨基酸序列可彼此连接或连接于其它氨基酸序列(例如通过二硫桥)以提供还可用于本发明中的肽构建体(例如Fab’片段、F(ab’)2片段、ScFv构建体、“双链抗体”和其它多特异性构建体。参考例如Holliger和Hudson的综述,Nat Biotechnol.2005Sep；23(9)：1126-36)。
一般地，当本发明的氨基酸序列(或包含所述氨基酸序列的化合物、构建体或多肽)意欲用于给受试者施用(例如为了本文中描述的治疗和/或诊断目的)时，优选地是非天然存在于所述受试者中的氨基酸序列；或，当其非天然存在于所述受试者时，以基本上分离的形式(如本文中定义的)存在。
本领域技术人员也很清楚，对于药物用途，本发明的氨基酸序列(以及包含氨基酸序列的化合物、构建体和多肽)优选地针对人HER3；然而对于兽医目的，本发明的氨基酸序列和多肽优选针对来自待治疗的物种的HER3，或至少与来自待治疗的物种的HER3交叉反应。
此外，本发明的氨基酸序列可任选地，除至少一个用于结合HER3的结合位点外，包含一个或多个用于结合其它抗原、蛋白质或靶的其它结合位点。
本发明的氨基酸序列和多肽，以及包含所述序列或多肽的组合物的功效可使用任何适当的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本身公知的动物模型或其任意组合来测试，这取决于牵涉的具体疾病或障碍。适当的测定和动物模型对于本领域技术人员来说是很清楚明了的，例如包括[配体依赖性HER3磷酸化(Wallasch等人(1995)EMBO J 14(17)：4267-4275)和异种移植物肿瘤模型(Schoeberl等人(2009)Sci.Signal.2(77)：ra 31)]以及用于下面实验部分和本文中引用的现有技术中的测定和动物模型。
同样地，根据本发明，针对来自温血动物的第一物种的HER3的氨基酸序列和多肽可以显示或可以不显示与来自温血动物的一个或多个其它物种的HER3的交叉反应性。例如，针对人HER3的氨基酸序列和多肽可以显示或可以不显示与来自灵长类动物的一个或多个其它物种(例如，但非限制性地，来自猕猴属的猴子(例如，具体地食蟹猴(成束猴(Macacafascicularis))和/或恒河猴(Macaca mulatta))和狒狒(豚尾狒狒))的HER3和/或与来自通常用于疾病的动物模型(例如小鼠、大鼠、兔、猪或狗)，具体地与HER3相关的疾病和障碍的动物模型(例如本文中提及的物种和动物模型)中的动物的一个或多个物种的HER3的交叉反应性。在这方面，本领域技术人员清楚这样的交叉反应性，当存在时，从药物开发的观察来看具有有利方面，因为其使得能够在这样的疾病模型中测试针对人HER3的氨基酸序列和多肽。
更一般地，与来自哺乳动物的多个物种的HER3交叉反应的本发明的氨基酸序列和多肽通常有利地用于兽医应用，因为其使得能够跨多个物种测试相同的氨基酸序列或多肽。因此，也包括在本发明的范围内的是针对来自动物的一个物种的HER3的氨基酸序列和多肽(例如针对人HER3的氨基酸序列和多肽)可用于治疗动物的另一个物种，只要氨基酸序列和/或多肽的使用在待治疗的物种中提供期望的作用。
本发明在其最广义上也不特别地限定于本发明的氨基酸和多肽所针对的HER3的特定抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(适用时)或由上述所界定。例如，氨基酸序列和多肽可以针对或不针对“相互作用位点”(如本文中定义的)。然而，一般假定和希望本发明的氨基酸序列和多肽优选针对相互作用位点(如本文中定义的)，具体地针对Heregulin结合位点和/或异二聚化位点(参见Hsieh和Moasser,同上)。因此，如本文中进一步描述的，在一个优选但非限定性方面，本发明的氨基酸序列和多肽针对HER3配体结合位点和/或针对HER3的异二聚化位点，并且如本文中进一步定义的。应指出，除了Heregulin外，还已描述了其它HER3配体(Sithanandam和Anderson(2008)Cancer Gene Therapy,同上)。因此，在另一个优选但非限定性方面，本发明的氨基酸序列和多肽针对Heregulin(在本文中也称为“HRG”)结合位点和/或针对HER3的异二聚化位点。如上文中提及的，针对HRG结合位点的本发明的氨基酸序列在本文中也称为“HRG-阻断性氨基酸序列”、“HRG-阻断性构建块”，或，当它们为ISV时，“HRG-阻断性ISV”。针对HRG结合位点(以及最优选地也能够抑制或阻断HER3异二聚化，如本文中进一步描述的)的本发明的氨基酸序列在本文中也称为“二聚化-阻断性氨基酸序列”、“二聚化-阻断性构建块”，或，当当它们为ISV时，也称为“二聚化-阻断性ISV”。
如本文中进一步描述的，本发明的多肽可包含两个或更多个针对HER3的本发明的氨基酸序列并且在优选方面包含两个不同的氨基酸序列例如针对HER3的免疫球蛋白单可变结构域。通常，这样的多肽将以与本发明的单个氨基酸序列相比较增加的亲合力结合HER3。这样的多肽可以例如包含两个针对HER3的相同抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(适用时)(其可以是或可以不是相互作用位点)的本发明的氨基酸序列；或包含至少一个本发明的“第一”氨基酸序列，该序列针对HER3的第一相同抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(适用时)(其可以例如为Heregulin相互作用位点)；和至少一个本发明的“第二”氨基酸序列，该序列针对与所述第一抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象不同的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(适用时)(并且其可以例如针对异二聚化位点)。优选地，在这样的“双互补位”的本发明的多肽中，至少一个本发明的氨基酸序列针对相互作用位点(如本文中定义的)，虽然本发明在其最广义上不限于此。
因此，如本文中进一步描述的，在一个特别有利但非限定性方面，本发明使得可能提供针对HRG结合位点并且还能够阻断或抑制HER3异二聚化的本发明的多肽，例如通过将一个或多个(例如1个或2个)HRG-阻断性构建块与一个或多个(例如1个或2个)二聚化-阻断性构建块组合在本发明的单个多肽(其可以是如本文中进一步描述的)中。
同样地，当靶(即HER3)为结合对(例如，受体-配体结合对)的部分时，氨基酸序列和多肽可以使得它们能够与同源结合伴侣(根据情况，例如配体、受体或其它结合伴侣)竞争对靶的结合，和/或使得它们能够(完全或部分地)中和结合伴侣对靶的结合。在这方面，应当再次地指出，如上文中提及的，除了Heregulin以外，还描述了其它HER3配体(Sithanandam和Anderson(2008)Cancer Gene Therapy,同上)，并且本发明的氨基酸序列可以(还)竞争和/或(完全或部分地)中和此类配体对HER3的结合。
也在本发明的范围内的是，当适用时，本发明的氨基酸序列可结合HER3的两个或更多个抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象。在这样的情况下，本发明的氨基酸序列和/或多肽所结合的HER3的抗原决定簇、表位、部分、结构域或亚基可以是基本相同的(例如，当HER3包含重复的结构基序或以多聚体存在时)或可以是不同的(并且在后一种情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以相同或不同的亲和力和/或特异性结合HER3的这样的不同的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基)。同样地，例如，当HER3以激活的构象和无活性的构象存在时，本发明的氨基酸序列和多肽还可结合这两种构象之一，或可结合这两种构象(即以相同或不同的亲和力和/或特异性)。同样地，例如，本发明的氨基酸序列和多肽可结合其中其结合至相关配体的HER3的构象，可结合其中其未结合相关配体的HER3的构象，或可结合这两种构象(再次地以相同或不同的亲和力和/或特异性)。
还预期，本发明的氨基酸序列和多肽通常可结合HER3的所有天然在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段；或至少结合包含一个或多个抗原决定簇或表位的HER3的类似物、变体、突变体、等位基、部分和片段，所述抗原决定簇或表位基本上与本发明的氨基酸序列和多肽所结合的HER3中(例如在野生型HER3中)的抗原决定簇或表位相同。再次地，在这样的情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以与本发明的氨基酸序列结合(野生型)HER3的亲和力和特异性相同或不同(即高于或低于)的亲和力和/或特异性结合此类类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。还应当在本发明的范围内的是本发明的氨基酸序列和多肽结合HER3的一些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段，但不结合HER3的其它类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。
当HER3以单体形式和以一种或多种多聚体形式存在时，本发明的氨基酸序列和多肽只结合以单体形式存在的HER3，只结合以多聚体形式存在的HER3，或结合单体和多聚体形式，这都在本发明的范围内。再次地，在这样的情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以与本发明的氨基酸序列结合多聚体形式的亲和力和特异性相同或不同(即高于或低于)的亲和力和/或特异性结合单体形式。
同样地，当HER3可与其它蛋白质或多肽缔合以形成蛋白质复合物(例如与MET、HER1、HER2或HER4)时，本发明的氨基酸序列和多肽结合以其非缔合状态存在的HER3，结合以其缔合状态存在的HER3，或结合两者，优选地只结合或优先结合其非缔合状态并且在任何情况下至少部分地阻止异二聚化，这些在本发明的范围内。在所有这些情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以以与本发明的氨基酸序列和多肽结合以其单体和非缔合状态存在的HER3的亲和力和/或特异性相同或不同(即高于或低于)的亲和力和/或特异性结合此类多聚体或缔合的蛋白质复合物。
同样地，如对于本领域技术人员将是很清楚明了的，包含两个或更多个针对HER3的氨基酸序列的蛋白质或多肽可以以比相应的单体氨基酸序列更高的亲合力结合HER3。例如，并且非限制性地，包含两个或更多个针对HER3的不同表位的氨基酸序列的蛋白质或多肽可以(和通常将)以比每一个不同单体更高的亲合力结合，并且包含两个或更多个针对HER3的氨基酸序列的蛋白质或多肽可以(和通常将)也以更高的亲合力结合HER3的多聚体。
一般地，本发明的氨基酸序列和多肽将至少结合从生物学和/或治疗的观点来看最相关的HER3的那些形式(包括单体、多聚体和缔合形式)，这对于本领域技术人员来说是清楚明了的并且在本文中描述的优选方面中。
也在本发明的范围内的是：使用本发明的氨基酸序列和多肽的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物，和/或使用包含这样的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物的一个或多个或基本上由其组成的蛋白质或多肽，只要这类物质适用于本文中预期的用途。这样的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物通常可包含(至少部分)用于结合HER3的功能性抗原-结合位点；以及更优选能够特异性结合HER3，更优选能够以如本文中定义的亲和力(适当地测量和/或表示为KD-值(实际或表观)、KA-值(实际或表观)、kon-率和/或koff-率或可选择地测量和/或表示为IC50值，如本文中进一步描述的)结合HER3。这样的部分,片段,类似物,突变体,变体,等位基因,衍生物,蛋白质和/或多肽的一些非限定性实例根据本文中的进一步描述将变得清楚。还通过适当地组合(即通过连接或基因融合)本文中描述的一个或多个(更小的)部分或片段来提供本文中描述的本发明的其它片段或多肽。
在本发明的一个具体但非限定性方面(该方面将在本文中进一步描述)，此类类似物、突变体、变体、等位基因、衍生物与它们所源自的氨基酸序列相比较具有增加的血清半衰期(如本文中进一步描述的)。例如，本发明的氨基酸序列可连接于(化学地或通过另外的方法)延长半衰期的一个或多个基团或部分(例如PEG)，以提供具有增加的半衰期的本发明的氨基酸序列的衍生物。
在一个具体的但非限定性的方面，本发明的氨基酸序列可以是包含免疫球蛋白折叠的氨基酸序列或可以是在适当的条件(例如生理条件)下能够形成免疫球蛋白折叠(即通过折叠)的氨基酸序列。除其他以外参考Halaby等人的综述,J.(1999)Protein Eng.12,563-71。优选地，当正确折叠以形成免疫球蛋白折叠时，这样的氨基酸序列能够特异性结合(如本文中定义的)HER3；以及更优选地能够以如本文中定义的亲和力(适当地测量和/或表示为KD-值(实际或表观)、KA-值(实际或表观)、kon-率和/或koff-率或可选择地表示为IC50值，如本文中进一步描述的)结合HER3。同样地，这样的氨基酸序列的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物优选是这样的序列：它们包含免疫球蛋白折叠或能够在适当的条件下形成免疫球蛋白折叠。
具体地，但非限制性地，本发明的氨基酸序列可以为基本上由4个构架区(分别地FR1至FR4)和3个互补决定区(分别地CDR1至CDR3)组成的氨基酸序列；或这样的氨基酸序列的任何适当的片段(其因而通常包含至少一些形成CDR的至少一个的氨基酸残基，如本文中进一步描述的)。
本发明的氨基酸序列具体地可以为免疫球蛋白序列或其适当的片段，更具体地可以为免疫球蛋白单可变结构域序列或其适当的片段，例如轻链可变结构域序列(例如VL-序列)或其适当的片段；或重链可变结构域序列(例如VH-序列)或其适当的片段。当本发明的氨基酸序列为重链可变结构域序列时，其可以为来源于常规4链抗体的重链可变结构域(例如，非限制性地，来源于人抗体的VH序列)或可以为来源于骆驼科的动物例如骆驼(如本文中定义的)的所谓的“重链抗体”的所谓的VHH-序列(如本文中定义的)。
然而，应当指出，本发明不限定于本发明的氨基酸序列的(或用于表达其的本发明的核苷酸序列的)来源，也不限定于产生或获得(或已产生或获得)本发明的氨基酸序列或核苷酸序列的方式。因此，本发明的氨基酸序列可以是天然存在的氨基酸序列(来自任何适当的物种)或合成或半合成的氨基酸序列。在本发明的具体但非限定性方面，氨基酸序列是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适当的物种)或合成或半合成的免疫球蛋白序列，包括但不限于”人源化的”(如本文中定义的)免疫球蛋白序列(例如部分或完全地人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，具体地部分或完全人源化的VHH序列或纳米抗体)、“骆驼源化的”(如本文中定义的)免疫球蛋白序列，以及已针对最佳表达和/或稳定性和/或溶解度进行了序列优化的免疫球蛋白序列，以及已利用技术(例如亲和力成熟(例如，始于合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列)、CDR移植、镶嵌(veneering)、组合来源于不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR装配以及本领域技术人员公知的用于工程化免疫球蛋白序列的相似技术；或任何上述序列的任何适当组合)获得的免疫球蛋白序列。参考例如标准手册，以及本文中的进一步描述和提及的现有技术。
类似地，本发明的核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成或半合成的序列，以及可以例如为通过PCR从适当的天然存在的模板(例如从细胞分离的DNA或RNA)分离的序列，已从文库(具体地，表达文库)分离的核苷酸序列，已通过将突变引入天然存在的核苷酸序列(使用任何本身公知的适当的技术，例如错配PCR)制备的核苷酸序列，使用重叠引物通过PCR制备的核苷酸序列，或已使用本身公知的用于DNA合成的技术制备的核苷酸序列。
本发明的氨基酸序列具体地可以为免疫球蛋白单可变结构域(或适合用作免疫球蛋白单可变结构域的免疫球蛋白单可变结构域)、结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)、单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)、"dAb"(或适合用作dAb的氨基酸序列)或纳米抗体(如本文中定义的，并且包括但不限于VHH序列)；其它单可变结构域，或其任一个的任何适当的片段。关于(单)结构域抗体的一般描述，也参考上文引用的现有技术，以及参考EP 0368684。关于术语“dAb”，参考例如Ward等人(Nature,1989Oct12；341(6242)：544-6)，参考Holt等人,Trends Biotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及参考例如WO 06/030220、WO 06/003388和DomantisLtd的其它公布的专利申请。还应当指出，尽管因为它们不是哺乳动物来源而在本发明的情景中是不太优选的，但单结构域抗体或单可变结构域可来源于鲨鱼的某些物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO 05/18629)。
具体地，本发明的氨基酸序列可以为免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体(如本文中定义的)或其适当的片段。这样的针对HER3的纳米抗体在本文中也称为“本发明的纳米抗体”。
关于免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体(注释：术语“免疫球蛋白单可变结构域”与“纳米抗体”在本申请中可互换使用)的一般描述，参考下面进一步描述，以及本文中引述的现有技术。具体地，术语纳米抗体是如WO 08/020079或WO 09/068627中所定义的，并且如本文中所描述的，通常是指具有VHH结构域(例如来自存在于骆驼中的“只有重链的”抗体的VH结构域)的功能和/或结构特征的免疫球蛋白重链可变结构域，这样可以具体地为(天然)VHH、人源化VHH或骆驼源化的VH，例如骆驼源化的人VH。
然而，在这方面，应当指出，该描述和现有技术主要描述所谓的“VH3种类”的纳米抗体(即与VH3种类的人种系序列例如DP-47、DP-51或DP-29具有高度序列同源性的纳米抗体)，所述纳米抗体形成本发明的优选方面。然而应当指出，本发明在其最广的意义上通常包括任何类型的针对HER3的纳米抗体，并且例如还包括属于所谓的“VH4种类”的纳米抗体(即与VH4种类的人种系序列例如DP-78具有高度的序列同源性的纳米抗体)，如例如WO 07/118670中描述的。
一般地，纳米抗体(具体地VHH序列和部分人源化的纳米抗体)的具体特征在于一个或多个“标志残基(Hallmark residues)”(如本文中所描述的)在一个或多个构架序列(再次的如本文中进一步描述的)中的存在。
因此，一般地，纳米抗体可被定义为具有如下(一般)结构的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其中一个或多个标志残基是如本文中进一步定义的。
具体地，纳米抗体可以为具有如下(一般)结构的氨基酸序列
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其中构架是如本文中进一步定义的。
更具体地，纳米抗体可以是具有如下(一般)结构的氨基酸序列
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其中：
i)优选地根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108上的一个或多个氨基酸残基选自下面表B-2中提及的标志残基。在此类纳米抗体中，CDR序列通常如下文中进一步定义的。
表B-2：纳米抗体中的标志残基
如本文中进一步描述的，当ISV为纳米抗体时，它们可包含通常如WO 09/068627(通过引用并入本文)的第258至297页上描述的构架序列。一些特别优选的但非限定性的构架序列(和所述构架序列的优选组合)，基于本文中的公开内容，对于本领域技术人员来说是很清楚明了的，并且例如包括存在于表A-1(也参见表B-1)中所列的纳米抗体中的FR1、FR2、FR3和FR4序列(及其组合)，或其仅具有有限数目(例如对于每一FR1、FR2、FR3或FR4，少于5个，例如4、3、2或只有1个)的氨基酸差异(如WO 09/068627和WO 08/020079中定义的)的变体，所述氨基酸差异可以例如是人源化置换和/或为了序列优化而已被引入的其它氨基酸差异(前者和后者的一些非限定性实例，基于本文中以及WO 09/068627和WO 08/020079中的公开内容，对于本领域技术人员来说是清楚明了的)。
因此，本发明还涉及可结合(如本文中定义的)和/或针对HER3的这样的纳米抗体，涉及其适当的片段以及包含一个或多个这样的纳米抗体和/或适当的片段或基本上由其组成的多肽。
SEQ ID NO：12至26(参见表A-1)提供了许多已针对HER3产生的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列。
表A-1：优选的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体序列(在本文中也称为具有具体名称或SEQ ID NO：X的序列，其中X为指称相关氨基酸序列的号码)：
具体地，本发明在一些具体的方面提供了：
-氨基酸序列，所述序列针对(如本文中定义的)HER3并且与SEQID NO：12至26的氨基酸序列(参见表A-1)的至少一个具有至少80%，优选至少85%，例如90%或95%或更高的序列同一性。这些氨基酸序列还可以是这样的序列：它们中和同源配体对HER3的结合；和/或与同源配体竞争对HER3的结合；和/或针对HER3上的异二聚化位点(如本文中定义的)；
-氨基酸序列，所述序列交叉阻断(如本文中定义的)SEQ ID NO：12至26的氨基酸序列(参见表A-1)的至少一个对HER3的结合和/或与SEQ ID NO：12至26的氨基酸序列(参见表A-1)的至少一个竞争对HER3的结合。再次地，这些氨基酸序列还可以是这样的序列：它们中和同源配体对HER3的结合；和/或与同源配体竞争对HER3的结合；和/或针对HER3上的异二聚化位点(如本文中定义的)；
所述氨基酸序列可以是如本文中进一步描述的(以及可以例如为纳米抗体)；以及包含一个或多个这样的氨基酸序列的本发明的多肽(其可以是如本文中进一步描述的，并且可以例如是本文中公开的双特异性和/或双互补位多肽)，和编码这样的氨基酸序列和多肽的核苷酸序列。这样的氨基酸序列和多肽不包括任何天然存在的配体。
在一些其它具体方面，本发明提供了：
-相对于HER1、HER2和/或HER4特异于HER3的本发明的氨基酸序列；
本发明的该氨基酸序列可以是如本文中进一步描述的(以及可例如为纳米抗体)；以及包含一个或多个这样的氨基酸序列的本发明的多肽(其可以是如本文中进一步描述的，并且可以例如是本文中公开的双特异性和/或双互补位多肽)，和编码这样的氨基酸序列和多肽的核苷酸序列。这样的氨基酸序列和多肽不包括任何天然存在的配体。
因此，本发明的一些特别优选的纳米抗体为可结合(例如本文中进一步描述的)和/或针对HER3的纳米抗体，并且所述纳米抗体：
i)与SEQ ID NO：12至26的氨基酸序列(参见表A-1)的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了测定氨基酸同一性的程度，不考虑形成CDR序列的氨基酸残基。在这方面，也参考表B-1，其列出了SEQ ID NO：12至26(参见表A-1)的纳米抗体的构架1序列(SEQID NO：42至56)、构架2序列(SEQ ID NO：72至86)、构架3序列(SEQ ID NO：102至116)和构架4序列(SEQ ID NO：132至146)(关于构架1序列的位置1至4和27至30的氨基酸残基，参考下文中进行的注释。因此，为了测定氨基酸同一性的程度，优选不考虑这些残基)；
以及其中：
ii)优选根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108上的一个或多个氨基酸残基选自表B-2(见上)提及的标志残基。
在此类纳米抗体中，CDR序列通常如如本文中进一步描述的。
再次地，此类纳米抗体可以以任何适当的方式衍生自任何适当的来源，并且可以例如为天然存在的VHH序列(即来自骆驼的适当物种)或合成或半合成的氨基酸序列，包括但不限于”人源化的”(如本文中定义的)纳米抗体，“骆驼源化的”(如本文中定义的)免疫球蛋白序列(具体地骆驼源化重链可变结构域序列)，以及已通过技术获得的纳米抗体(例如亲和力成熟(例如，始于合成、随机或天然存在的免疫球蛋白序列),CDR移植,镶嵌,组合来源于不同免疫球蛋白序列的片段，使用重叠引物的PCR装配以及本领域技术人员公知的用于工程化免疫球蛋白序列的类似技术)；或本文中进一步描述的任何上述项的任意适当的组合。同样地，当纳米抗体包含VHH序列时，所述纳米抗体可适当地进行人源化，如本文中进一步描述的，以提供一种或多种进一步(部分或完全)人源化的本发明的纳米抗体。类似地，当纳米抗体包含合成或半合成的序列(例如部分人源化的序列)时，可任选地进一步人源化所述纳米抗体，再次如本文中所描述的，再次地提供一种或多种进一步(部分或完全)人源化的本发明的纳米抗体。
具体地，人源化的纳米抗体可以为氨基酸序列，所述氨基序列通常如在先前段落中针对纳米抗体所定义的，但其中存在(具体地，在构架残基的至少一个残基上)至少一个为或相应于人源化置换(如本文中定义的)的氨基酸残基。一些优选但非限定性人源化置换(及其适当的组合)，基于本文中的公开内容，对于本领域技术人员将变得清楚。此外或可选择地，其它潜在有用的人源化置换可通过比较天然存在的VHH序列的构架区的序列与一个或多个密切相关的人VH序列的相应构架序列进行来确定，之后可将一个或多个所确定的潜在有用的人源化置换(或其组合)引入所述VHH序列(以任何本身公知的方式，如本文中进一步描述的)，然后测试所得的人源化VHH序列的对于靶的亲和力、稳定性、表达的容易性和水平和/或其它期望的性质。这样，通过有限程度的试错法，可由本领域技术人员基于本文中的公开内容确定其它适当的人源化置换(或其适当的组合)。同样的，基于上述内容，可部分人源化或完全人源化纳米抗体(其构架区)。
本发明的一些特别优选的序列优化的纳米抗体为SEQ ID NO：12至26的纳米抗体(参见表A-1)的序列优化变体，其为一些特别优选的实例。
因此，本发明的一些其它优选纳米抗体为可结合(例如本文中进一步描述的)HER3的纳米抗体，并且所述纳米抗体：
i)为SEQ ID NO：12至26的氨基酸序列(参见表A-1)的至少一个的人源化变体；和/或
ii)与SEQ ID NO：12至26的氨基酸序列(参见表A-1)的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了测定氨基酸同一性的程度，不考虑形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
i)优选地根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108上的一个或多个氨基酸残基选自表B-2(见上)提及的标志残基。
根据本发明的另一个具体方面，本发明提供了许多特别适合于结合HER3的氨基酸残基区段(即小肽)。这些氨基酸残基区段可存在于和/或可被整合入本发明的氨基酸序列，具体地以使它们形成本发明的氨基酸序列的抗原结合位点(的部分)的方式来进行。由于这些氨基酸残基区段首先被产生为针对HER3产生的重链抗体或VHH序列的CDR序列(或可基于和/或衍生自这样的CDR序列，如本文中进一步描述的),它们在本文中通常也称为“CDR序列”(即分别称为CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列)。然而应当指出，本发明在其最广的意义上不限定于这些氨基酸残基区段可在本发明的氨基酸序列中具有的特定的结构作用或功能，只要这些氨基酸残基区段使得本发明的氨基酸序列能够结合HER3。因此，一般地，本发明在其最广的意义上包含能够结合HER3并且包含一个或多个如本文中所描述的CDR序列(具体地两个或更多个这样的CDR序列的适当的组合)的任何氨基酸序列，所述氨基酸序列适当地通过一个或多个其它氨基酸序列彼此连接,以便整个氨基酸序列形成能够结合HER3的结合结构域和/或结合单元。然而还应当指出，仅一个这样的CDR序列在本发明的氨基酸序列中的存在本身已可以足以提供能够结合HER3的本发明的氨基酸序列；再次参考例如WO03/050531或WO2009/127691中描述的所谓的“促进片段(Expedite fragment)”。
因此，在另一个具体的但非限定性方面，本发明的氨基酸序列可以为包含至少一个选自本文中描述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列(或其任何适当的组合)的氨基酸序列的氨基酸序列。具体地，本发明的氨基酸序列可以为包含至少一个抗原结合位点的氨基酸序列，其中所述抗原结合位点包含至少一个选自本文中描述的CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列(或其任何适当的组合)的氨基酸序列。
通常，在本发明的该方面，本发明的氨基酸序列可以是包含至少一个氨基酸残基区段的任何氨基酸序列，其中所述氨基酸残基区段具有相应于本文中描述的CDR序列的至少一个的序列的氨基酸序列。这样的氨基酸序列可以包含或可以不包含免疫球蛋白折叠。例如，但非限制性地，这样的氨基酸序列可以是包含至少一个这样的CDR序列，但不足以大到形成(完全)免疫球蛋白折叠的免疫球蛋白序列的适当的片段(再次地参考例如WO 03/050531或WO2009/127691中描述的“促进片段”)。或者，这样的氨基酸序列可以是适当的“蛋白质支架”，所述支架包含至少一个相应于这样的CDR序列的氨基酸残基区段(即作为其抗原结合位点的部分)。用于呈现氨基酸序列的适当的支架对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且例如包括但不限于基于或衍生自免疫球蛋白的结合支架(即除本文中已描述的免疫球蛋白序列外)、衍生自蛋白A结构域的蛋白质支架(例如AffibodiesTM)、淀粉酶抑肽、纤连蛋白、CTLA-4、T细胞受体、设计的锚蛋白重复序列、avimer和PDZ结构域(Binz等人,Nat.Biotech 2005,第23卷：1257)，以及基于DNA或RNA的结合部分，包括但不限于DNA或RNA适体(Ulrich等人,Comb Chem High Throughput Screen 20069(8)：619-32)。
再次地，包含此类CDR序列的一个或多个序列的本发明的任何氨基酸序列优选是这样的序列：其可特异性结合(如本文中定义的)HER3，更具体地是这样的序列：其可以以如本文中定义的亲和力(适当地测量和/或表示为KD-值(实际或表观)、KA-值(实际或表观)、kon-率和/或koff-率或可选择地测量或表示为IC50值，如本文中进一步描述的)结合HER3。
更具体地，根据本发明的该方面的氨基酸序列可以是包含至少一个抗原结合位点的任何氨基酸序列，其中所述抗原结合位点包含至少2个选自本文中描述的CDR1序列、本文中描述的CDR2序列和本文中描述的CDR3序列的氨基酸序列，以便(i)当第一氨基酸序列选自本文中描述的CDR1序列时，第二氨基酸序列选自本文中描述的CDR2序列或本文中描述的CDR3序列；(ii)当第一氨基酸序列选自本文中描述的CDR2序列时，第二氨基酸序列选自本文中描述的CDR1序列或本文中描述的CDR3序列；或(iii)当第一氨基酸序列选自本文中描述的CDR3序列时，第二氨基酸序列选自本文中描述的CDR1序列或本文中描述的CDR3序列。
更具体地，本发明的氨基酸序列可以为包含至少一个抗原结合位点的氨基酸序列，其中所述抗原结合位点包含至少3个选自本文中描述的CDR1序列、本文中描述的CDR2序列和本文中描述的CDR3序列的氨基酸序列，以便第一氨基酸序列选自本文中描述的CDR1序列，第二氨基酸序列选自本文中描述的CDR2序列以及第三氨基酸序列选自本文中描述的CDR3序列。CDR1、CDR2和CDR3序列的优选组合根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。这对于本领域技术人员来说是清楚明了的，这样的氨基酸序列优选为免疫球蛋白序列(如本文中进一步描述的)，但其还可以例如为包含用于呈现所述CDR序列的适当的支架的任何其它氨基酸序列。
因此，在一个具体的但非限定性的方面，本发明涉及针对HER3的氨基酸序列，该序列包含选自下列的一个或多个氨基酸残基区段：
a)SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g)SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或其任何适当的组合。
当本发明的氨基酸序列包含一个或多个根据b)和/或c)的氨基酸序列时：
i)根据b)和/或c)的这样的氨基酸序列中的任何氨基酸置换优选地，与根据a)的相应氨基酸序列相比较，为保守氨基酸置换，(如本文中定义的)；
和/或
ii)根据b)和/或c)的氨基酸序列与根据a)的相应氨基酸序列相比较，优选仅包含氨基酸置换，并且无氨基酸缺失或插入；
和/或
iii)根据b)和/或c)的氨基酸序列可以为使用一个或多个本身公知的亲和力成熟的技术通过亲和力成熟从根据a)的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
类似地，当本发明的氨基酸序列包含一个或多个根据e)和/或f)的氨基酸序列时：
i)根据e)和/或f)的这样的氨基酸序列中的任何氨基酸置换优选地，与根据d)的相应氨基酸序列相比较，为保守氨基酸置换，(如本文中定义的)；
和/或
ii)根据e)和/或f)的氨基酸序列与根据d)的相应氨基酸序列相比较，优选仅包含氨基酸置换，并且无氨基酸缺失或插入；
和/或
iii)根据e)和/或f)的氨基酸序列可以为使用一个或多个本身公知的亲和力成熟的技术通过亲和力成熟从根据d)的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
同样地，类似地，当本发明的氨基酸序列包含一个或多个根据h)和/或i)的氨基酸序列时：
i)根据h)和/或i)的这样的氨基酸序列中的任何氨基酸置换优选 地，与根据g)的相应氨基酸序列相比较，为保守氨基酸置换，(如本文中定义的)；
和/或
ii)根据h)和/或i)的氨基酸序列与根据g)的相应氨基酸序列相比较，优选仅包含氨基酸置换，并且无氨基酸缺失或插入；
和/或
iii)根据h)和/或i)的氨基酸序列可以为使用一个或多个本身公知的亲和力成熟的技术通过亲和力成熟从根据g)的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
应理解，上述最后一段通常还适用于包含一个或多个分别根据b)、c)、e)、f)、h)或i)的氨基酸序列的本发明的任何氨基酸序列。
在该具体方面，氨基酸序列优选包含选自下列的一个或多个氨基酸残基区段：
i)SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；
ii)SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；和
iii)SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列；
或其任何适当的组合。
同样地，优选地，在这样的氨基酸序列中，所述氨基酸残基区段的至少一个形成用于结合HER3的抗原结合位点的部分。
在更具体地但再次非限定性的方面，本发明涉及针对HER3的氨基酸序列，所述序列包含两个或更多个氨基酸残基区段，所述区段选自：
a)SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g)SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
使得(i)当第一氨基酸残基区段相应于根据a)、b)或c)的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基区段相应于根据d)、e)、f)、g)、h)或i)的氨基酸序列之一；(ii)当第一氨基酸残基区段相应于根据d)、e)或f)的氨基酸序列时，第二氨基酸残基区段相应于根据a)、b)、c)、g)、h)或i)的氨基酸序列时；或(iii)当第一氨基酸残基区段相应于根据g)、h)或i)的氨基酸序列时，第二氨基酸残基区段相应于根据a)、b)、c)、d)、e)或f)的氨基酸序列。
在该具体的方面，氨基酸序列优选包含选自如下序列的两个或更多个氨基酸残基区段：
i)SEQ ID NO：至的氨基酸序列；
ii)SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；和
iii)SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列；
使得，(i)当第一氨基酸残基区段相应于SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基区段相应于SEQ ID NO：87至101或SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列之一；(ii)当第一氨基酸残基区段相应于SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列之一时，第二氨基酸残基区段相应于SEQ ID NO：57至71或SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列之一；或(iii)当第一氨基酸残基区段相应于SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列之一时,第二氨基酸残基区段相应于SEQ ID NO：57至71或SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列之一。
同样地，在这样的氨基酸序列中，至少两个氨基酸残基区段再次优选形成用于结合HER3的抗原结合位点的部分。
在更具体但非限定性的方面，本发明涉及针对HER3的氨基酸序列，其包含3个或更多个氨基酸残基区段，其中第一氨基酸残基区段选自：
a)SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
第二氨基酸残基区段选自：
d)SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及第三氨基酸残基区段选自：
g)SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
优选地，在该具体的方面，第一氨基酸残基区段选自SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；第二氨基酸残基区段选自SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；以及第三氨基酸残基区段选自SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列。
再次地，优选地，在这样的氨基酸序列中，至少三个氨基酸残基区段形成用于结合HER3的抗原结合位点的部分。
根据本文中的进一步公开内容，此类氨基酸序列的区段的优选组合将将变得清楚明了。
优选地，在这样的氨基酸序列中，CDR序列与SEQ ID NO：12至26的氨基酸序列(参见表A-1)的至少一个的CDR序列具有至少70%的氨基酸同一性，优选至少80%的氨基酸同一性，更优选至少90%的氨基酸同一性，例如95%的氨基酸同一性或更多或甚至基本上100%的氨基酸同一性。该氨基酸同一性程度可以例如通过测定所述氨基酸序列与SEQ ID NO：12至26(参见表A-1)的一个或多个序列之间的氨基酸同一性的程度(以本文中描述的方式)来测定，其中不考虑形成构架区的氨基酸残基。同样地，本发明的此类氨基酸序列可以是如本文中进一步描述的。
同样地，此类氨基酸序列优选地是这样的序列，它们可特异性结合(如本文中定义的)HER3；以及更具体地以如本文中定义的亲和力(适当地测量和/或表示为KD-值(实际或表观)、KA-值(实际或表观)、kon-率和/或koff-率或可选择地测量和/或表示为IC50值，如本文中进一步描述的)结合HER3。
当本发明的氨基酸序列基本上由4个构架区(分别地FR1至FR4)和3个互补决定区(分别地CDR1至CDR3)组成时，本发明的氨基酸序列优选是这样的序列：
-CDR1选自：
a)SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自：
d)SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自：
g)SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
具体地，本发明的这样的氨基酸序列可使得CDR1选自SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；和/或CDR2选自SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；和/或CDR3选自SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列。
具体地，当本发明的氨基酸序列基本上由4个构架区(分别地FR1至FR4)和3个互补决定区(分别地CDR1至CDR3)组成时，本发明的氨基酸序列优选是这样的序列：
-CDR1选自：
a)SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自：
d)SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自：
g)SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；或这样的氨基酸序列的任何适当的片段
具体地，本发明的这样的氨基酸序列可使得CDR1选自SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；以及CDR2选自SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；以及CDR3选自SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列。
再次地，根据本文中进一步描述，CDR序列的优选组合将变得清楚明了。
同样地，此类氨基酸序列优选是这样的序列，它们可特异性结合(如本文中定义的)HER3；以及更具体地以如本文中定义的亲和力(适当地测量和/或表示为KD-值(实际或表观)、KA-值(实际或表观)、kon-率和/或koff-率或可选择地测量和/或表示为IC50值，如本文中进一步描述的)结合HER3。
在一个优选但非限定性方面，本发明涉及基本上由4个构架区(分别地FR1至FR4)和3个互补决定区(分别地CDR1至CDR3)组成的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的CDR序列与SEQ ID NO：12至26的氨基酸序列(参见表A-1)的至少一个的CDR序列具有至少70%的氨基酸同一性，优选至少80%的氨基酸同一性，更优选至少90%的氨基酸同一性，例如95%的氨基酸同一性或更高或甚至基本上100%的氨基酸同一性。该氨基酸同一性程度可以例如通过测定所述氨基酸序列与SEQ ID NO：12至26(参见表A-1)的一个或多个序列之间的氨基酸同一性的程度(以本文中描述的方式)来测定，其中不考虑形成构架区的氨基酸残基。本发明的此类氨基酸序列可以是如本文中进一步描述的。
在本发明的这样的氨基酸序列中，构架序列可以是任何适当的构架序列，并且例如基于标准手册以及本文中提及的进一步的公开内容和现有技术，适当的构架序列的实例对于本领域技术人员来说是清楚明了的。
构架序列优选为免疫球蛋白的构架序列或已从免疫球蛋白的构架序列衍生(例如，通过人源化或骆驼源化)的构架序列(其适当的组合)。例如，构架序列可以为衍生自轻链可变结构域(例如VL-序列)和/或重链可变结构域(例如VH-序列)的构架序列。在一个特别优选方面，构架序列为已从VHH-序列衍生的构架序列(其中所述构架序列可任选地已被部分或完全人源化)或为已被骆驼源化的(如本文中定义的)常规VH序列。
构架序列优选使得本发明的氨基酸序列为结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)；为单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)；为"dAb"(或适合用作dAb的氨基酸序列)；或为纳米抗体(包括但不限于VHH序列)。再次地，例如基于标准手册以及本文中提及的进一步的公开内容和现有技术，适当的构架序列对于本领域技术人员来说是清楚明了的。
具体地，存在于本发明的氨基酸序列中的构架序列可包含一个或多个标志残基(如本文中定义的)，以便本发明的氨基酸序列为纳米抗体。这样的构架序列的一些优选但非限定性实例(其适当的组合)根据本文中的进一步的公开内容将变得清楚明了。
具体地，当本发明的ISV为纳米抗体(如本文中所描述的)时，本文中所示的构架序列可以是如WO 09/068627(通过引用并入本文)的第258至297页上通常所描述的。例如，它们可包含一个或多个WO09/068627的表A-5所示的标志残基的组合；以及FR1、FR2、FR3和FR4可分别包含WO 09/068627的表A-6、表A-7、表A-8和表A-9所示的氨基酸残基。同样地，当本发明的ISV为纳米抗体时，它们可属于KERE-组(参见WO 09/068627的第281至284页，该组的一些代表性FR1、FR2、FR3和FR4序列示于WO 09/068627的表A-11/A-15、A-12、A-13和A-14中)；属于GLEW-组(参见WO 09/068627的第285至287页，该组的一些代表性FR1、FR2、FR3和FR4序列示于WO09/068627的表A-16/A-20、A-17、A-18和A-19中)；或属于P、R、S103组(参见WO 09/068627的第287至291页，该组的一些代表性FR1、FR2、FR3和FR4序列示于WO 09/068627的表A-21/A-25、A-22、A-23和A-24中)，这全都如WO 09/068627中所描述的，这些组的每一个组的一些代表性序列示于09/068627的表A-10中。也如WO09/068627中所描述的，此类构架序列可包含一个或多个适当的人源化置换或(其它)置换以优化序列(也参见本文中的进一步的公开内容)。
再次地，一些特别优选但非限定性FR1、FR2、FR3和FR4序列(及其组合)为表B-1中描述的所述序列，或分别为仍然基本上保持纳米抗体的期望的性质的此类FR1、FR2、FR3和FR4序列的适当的变体(例如，与表B-1提及的构架序列相比较在这样的FR1、FR2、FR3或FR4中具有少于6个，例如1、2、3、4或5个适当的氨基酸差异，其中氨基酸差异可以如WO 09/068627中所描述的)。
再次地，如本文中对于本发明的氨基酸序列通常所描述的，还可能使用上述序列的任何序列的适当的片段(或片段的组合)，例如包含一个或多个CDR序列片段(适当地侧翼连接的和/或通过一个或多个构架序列连接的(例如，以与此类CDR相同的顺序，并且构架序列可存在于所述片段所衍生自的全长尺寸的免疫球蛋白序列)。此类片段还可再次地为这样的片段：它们包含免疫球蛋白折叠或可形成免疫球蛋白折叠，或可选择地为这样的片段：它们不包含免疫球蛋白折叠或不能形成免疫球蛋白折叠。
在一个具体方面，这样的片段包含本文中描述的单个CDR序列(具体地CDR3序列)，在所述CDR序列的每一侧连接有构架序列(的部分)(具体地，在所述片段所衍生自的免疫球蛋白序列中与所述CDR序列邻接的构架序列的部分。例如，CDR3序列可前接FR3序列(的部分)和后接FR4序列(的部分))。这样的片段还可包含二硫桥，具体地连接2个分别在CDR序列之前和之后的两个构架区的二硫桥(为了形成这样的二硫桥，可使用天然存在于所述构架区中的半胱氨酸残基，或可选择地将半胱氨酸残基通过合成添加至或引入所述构架区)。
在另一个方面，本发明涉及化合物或构建体，具体地蛋白质或多肽(在本文中也分别称为“本发明的化合物”或“本发明的多肽”)，其包含本发明的一个或多个氨基酸序列(或其适当的片段)或基本上由所述序列组成，和任选地还包含一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元。如根据本文中的进一步的公开内容对于本领域技术人员来说是清楚明了的，此类其它基团、残基、部分、结合单元或氨基酸序列可以为或可以不为本发明的氨基酸序列(和/或为其所存在的化合物或构建体)提供其它功能性以及可以修饰或可以不修饰本发明的氨基酸序列的性质。
例如，此类其它基团、残基、部分或结合单元可以为一个或多个其它氨基酸序列，以便化合物或构建体为(融合)蛋白或(融合)多肽。在优选但非限定性方面，所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元为免疫球蛋白序列，具体地ISV。更优选地，所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元选自结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、"dAb"、适合用作dAb的氨基酸序列或纳米抗体。
例如，这样一个或多个(例如1个或2个)存在于本发明的多肽中的其它ISV(即除了一个或多个针对HER3的ISV外)可针对除HER3外的另一个靶，以提供本发明的“双特异性”蛋白质或多肽(即包含至少一个-例如一个或两个-针对HER3的免疫球蛋白单可变结构域和至少一个-例如一个或两个-针对另一个靶的免疫球蛋白单可变结构域的本发明的多肽)。
例如，根据具体的但非限定性方面，可以例如通过适当的功能化(例如PEG化)和/或通过在构建体中包含增加构建物的半衰期的部分或结合单元提供具有增加的半衰期(如本文中所定义的，以及与相同但不具有产生来提供增加的半衰期的修饰，例如不具有功能化/PEG化或不具有血清白蛋白结合肽或结合结构域/ISV的构建体相比较)的本发明的氨基酸序列、构建体、蛋白质或多肽。这样的功能化、部分或结合单元的实例对于本领域技术人员来说是清楚明了的并且可以例如包括PEG化、至血清白蛋白的融合或至可结合血清蛋白例如血清白蛋白的肽或结合单元的融合。
在后一种构建体(即包含至少一个-例如一个或两个-本发明的氨基酸序列和至少一个-例如一个或两个-可结合血清蛋白例如血清白蛋白的肽或结合单元的构建体)中，血清-白蛋白结合肽或结合结构域可以是能够增加构建体的半衰期(与相同但不具有血清白蛋白结合肽或结合结构域的构建体相比较)的任何适当的血清-白蛋白结合肽或结合结构域，具体地可以为血清白蛋白结合肽，如属于本申请人的WO2008/068280中(和具体地在WO2009/127691及未预公布的美国申请61/301,819中，两者都属于本申请人)所描述的，或血清-白蛋白结合免疫球蛋白单可变结构域(例如血清-白蛋白结合纳米抗体，例如Alb-1或Alb-1的人源化形式，例如Alb-8(在本文中也称为Alb-11或ALB11)，关于其，参考例如WO06/122787)。
关于半衰期，应当指出，在本发明中，通过使用本文中描述的各种半衰期延长技术(例如，通过适当地选择根据WO 2008/068280、WO2009/127691和/或非预公布的美国申请61/301,819的血清-白蛋白结合肽)，可(和优选地)适当地“调节”本发明的构建体或多肽的半衰期以用于期望的(治疗性和/或诊断性)应用和/或获得期望的治疗和/或药物作用与可能的不期望的副作用之间的最佳平衡。
因此，例如，并且非限制性地，本发明的优选方面提供了“双特异性多肽”，其基本上由一个针对人HER3的免疫球蛋白单可变结构域(或，可选择地，两个针对人HER3的免疫球蛋白单可变结构域，所述两个免疫球蛋白单可变结构域可以是相同的或不同的，即以提供-当它们相同或不同时-本发明的“二价”多肽，或-当它们不同时-本发明的“双互补位”多肽)和一个通过肽接头(如本文中定义的)连接的针对人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域(以提供本发明的双特异性多肽)组成，全都如本文中所描述的。这样的蛋白质或多肽还可以以基本上分离的形式(如本文中定义的)存在。
在另一个具体但非限定性方面，本发明的氨基酸序列(例如纳米抗体)或本发明的多肽(例如本发明的二价、双互补位或双特异性多肽)可被适当地连接于(再次地，通过化学或通过一个或多个适当的接头或间隔子)毒素或(细胞)毒性残基、部分或有效负载(payload)。可连接于本发明的氨基酸序列或多肽以提供-例如-细胞毒性化合物(即基于本发明的氨基酸序列或多肽的抗体-药物缀合物或“ADC”)的适当的(细胞)毒性部分、化合物、有效负载或残基的实例对于本领域技术人员来说是清楚明了。参考例如Ducry和Stump的综述，Bioconjugate Chem.,2010,21(1),pp 5–13。本发明的此类细胞毒性氨基酸序列或多肽可以具体地用于/适用于其中期望杀死细胞(所述细胞表达本发明的氨基酸序列或多肽所针对的靶标)(例如在癌症的治疗中)或减少或减缓这样的细胞生长和/或增殖的那些应用。通常，但非限定性地，本发明的(细胞)毒性多肽不具有延长的半衰期或仅具有有限的和/或严格受控的半衰期延长。
或者，可存在于本发明的多肽中的这样的一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元可以例如为化学基团、残基、部分，其本身可具有或可不具有生物学和/或药理学活性。例如，并且非限制性地，此类基团可连接于本发明的一个或多个氨基酸序列以提供本发明的氨基酸序列或多肽的“衍生物”，如本文中进一步描述的。
包含一种或多种如本文中所描述的衍生物或基本上由一种或多种所述衍生物组成，并且任选还包含一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元(任选地通过一个或多个接头连接)的化合物或构建体也在本发明的范围内。优选地，所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元为氨基酸序列。
在上述化合物或构建体中，本发明的一个或多个氨基酸序列以及一个或多个基团、残基、部分或结合单元可彼此直接连接和/或通过一个或多个适当的接头或间隔子彼此连接。例如，当一个或多个基团、残基、部分或结合单元为氨基酸序列时，接头也可以为氨基酸序列，以便所得的化合物或构建体为融合(蛋白质)或融合(多肽)。
根据上述和本文中的进一步描述，这是清楚明了的，这意味着本发明的氨基酸序列可用作形成本发明的多肽的“构建块”，即通过适当地将它们与其它基团、残基、部分或结合单元组合以形成本文中描述的化合物或构建体(例如，但非限制性地，本文中描述的本发明的双互补位、二/多价和双/多特异性多肽)，所述化合物或构建体将一个或多个期望的性质或生物学功能组合在一个分子内。
本发明的多肽的一些具体实例为多肽，所述多肽包含如下序列或基本上由所述序列组成：
-两个针对HER3的氨基酸序列(具体地且优选地为ISV)，所述两个序列可以相同或不同，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个HRG-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，并且所述序列可以不同但优选地其相同)，具体地且优选地为两个HRG-阻断性ISV(如本文中所定义的，再次地所述序列可以不同但优选地其相同)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个二聚化-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，并且所述序列可以不同但优选地其相同)，具体地且优选地为两个二聚化-阻断性ISV(如本文中所定义的，再次地所述序列可以不同但优选地其相同)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个结构域II-结合氨基酸序列(如本文中所定义的，并且所述序列可以不同但优选地其相同)，具体地且优选地为两个结构域II-结合ISV(如本文中所定义的，再次地所述序列可以不同但优选地其相同)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个HRG-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个HRG-阻断性ISV，也如本文中所定义的)和一个针对HER3(如本文中定义的)并且不为HRG-阻断性氨基酸序列(或ISV)的其它氨基酸序列(具体地且优选地一个其它ISV)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个二聚化-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个二聚化-阻断性ISV，也如本文中所定义的)和一个针对HER3(如本文中定义的)并且不为二聚化-阻断性氨基酸序列(或ISV)的其它氨基酸序列(具体地且优选地一个其它ISV)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个结构域II-结合氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个结构域II-结合ISV，也如本文中所定义的)和一个针对HER3(如本文中定义的)并且不为结构域II-结合氨基酸序列(或ISV)的其它氨基酸序列(具体地且优选地一个其它ISV)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个HRG-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个HRG-阻断性ISV，也如本文中所定义的)和一个二聚化-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个二聚化-阻断性ISV，也如本文中所定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个HRG-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个HRG-阻断性ISV，也如本文中所定义的)和一个结构域II-结合氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个结构域II-结合ISV，也如本文中所定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个二聚化-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个二聚化-阻断性ISV，也如本文中所定义的)和一个结构域II-结合氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个结构域II-结合ISV，也如本文中所定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
并且此类多肽(基于本文中的公开内容，其一些非限定性实例对于本领域技术人员来说是清楚明了)形成本发明的其它方面。
同样地，如所提及的，可以例如通过适当地功能化和/或通过将增加构建体的半衰期的部分或结合单元包含在构建体中来延长本发明的氨基酸序列和多肽(例如上述多肽)的半衰期。当通过融合至可结合血清蛋白例如血清白蛋白的肽或结合单元来延长氨基酸序列或多肽的半衰期时，所得的本发明的构建体/多肽可以例如并且非限定性地包含如下序列或基本上由所述序列组成：
-一个针对HER3的氨基酸序列(具体地且优选地ISV)和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个HRG-阻断性氨基酸序列(如本文中定义的)，具体地且优选地一个HRG-阻断性ISV(如本文中定义的)，和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个二聚化-阻断性氨基酸序列(如本文中定义的)，具体地且优选地一个二聚化-阻断性ISV(如本文中定义的)，和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个结构域II-结合氨基酸序列(如本文中定义的)，具体地且优选地一个结构域II-结合ISV(如本文中定义的)，和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个可以相同或不同的针对HER3的氨基酸序列(具体地且优选地ISV)和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个HRG-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，并且所述序列可以不同但优选地其相同)，具体地且优选地为两个HRG-阻断性ISV(如本文中所定义的，再次地所述序列可以不同但优选地其相同)，和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个二聚化-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，并且所述序列可以不同但优选地其相同)，具体地且优选地为两个二聚化-阻断性ISV(如本文中所定义的，再次地所述序列可以不同但优选地其相同)，和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个结构域II-结合氨基酸序列(如本文中所定义的，并且所述序列可以不同但优选地其相同)，具体地且优选地为两个结构域II-结合ISV(如本文中所定义的，再次地所述序列可以不同但优选地其相同)和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个HRG-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个HRG-阻断性ISV，也如本文中所定义的)和一个针对HER3(如本文中定义的)并且不为HRG-阻断性氨基酸序列(或ISV)的其它氨基酸序列(具体地且优选地一个其它ISV)，以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个二聚化-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个二聚化-阻断性ISV，也如本文中所定义的)和一个针对HER3(如本文中定义的)并且不为二聚化-阻断性氨基酸序列(或ISV)的其它氨基酸序列(具体地且优选地一个其它ISV)，以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个结构域II-结合氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个结构域II-结合ISV，也如本文中所定义的)和一个针对HER3(如本文中定义的)并且不为结构域II-结合氨基酸序列(或ISV)的其它氨基酸序列(具体地且优选地一个其它ISV)，以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个HRG-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个HRG-阻断性ISV，也如本文中所定义的)和二聚化-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个二聚化-阻断性ISV，也如本文中所定义的)，以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个HRG-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个HRG-阻断性ISV，也如本文中所定义的)和一个结构域II-结合氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个结构域II-结合ISV，也如本文中所定义的)，以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个二聚化-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个二聚化-阻断性ISV，也如本文中所定义的)和一个结构域II-结合氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个结构域II-结合ISV，也如本文中所定义的)，以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
并且此类多肽(其的一些非限定性实例，基于本文的公开内容，对于本领域技术人员来说是清楚明了的-例如，一些实例列于下面的表A-2中)也形成本发明的其它方面。
在这类序列中，特别优选的是这样的本发明的多肽，所述多肽：
a)包含一个HRG-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个HRG-阻断性ISV，也如本文中所定义的)和一个二聚化-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个二聚化-阻断性ISV，也如本文中所定义的)或基本上由其组成，并且任选地还包含增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和任选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白例如Alb-8/Alb-11的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)。此类多肽可以，例如并且非限制性地，包含一个17B05-样序列、一个21F06-样序列和血清白蛋白结合ISV例如Alb-8，任选地通过一个或多个适当的间隔子或接头适当地彼此连接的。此类多肽的具体的优选的但非限定性实例是HER3MS00135(SEQ IDNO：282)；或其
b)包含一个二聚化-阻断性氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个二聚化-阻断性ISV，也如本文中所定义的)和一个结构域II-结合氨基酸序列(如本文中所定义的，具体地且优选地一个结构域II-结合ISV，也如本文中所定义的)，以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白例如Alb-8/Alb-11的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的多肽)或基本由其组成，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)。这样的多肽可以，例如并且非限制性地，包含一个17B05-样序列、一个18G11-样序列和血清白蛋白结合ISV例如Alb-8，任选地适当地通过一个或多个适当的间隔子或接并没有彼此连接的。这样的多肽的两个具体的优选的但非限定性的实例为HER3MS00212(SEQID NO：319)和HER3MS00215(SEQ ID NO：322)。
如还已在本文中提及的，当上述多肽之一：(i)包含HRG-阻断性氨基酸序列时，其优选为21F06-样序列(如本文中定义的)或04C07-样序列(也如本文中所定义的)；和/或(ii)包含二聚化-阻断序列时，其优选为17B05-样序列(如本文中定义的)；和/或(iii)包含结构域II-结合序列时，其优选为18G11-样序列或34C07-样序列。本发明的这样的多肽的一些具体实例为包含如下序列或基本上由所述序列组成的多肽：
-两个21F06-样序列(如本文中所定义的，并且其可以相同或不同),适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个04C07-样序列(如本文中所定义的，并且其可以相同或不同)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个17B05-样序列(如本文中所定义的，并且其可以相同或不同)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个18G11-样序列(如本文中所定义的，并且其可以相同或不同)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个34C07-样序列(如本文中所定义的，并且其可以相同或不同)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个21F06-样序列(如本文中定义的)和一个04C07-样序列(如本文中定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个21F06-样序列(如本文中定义的)和一个17B05-样序列(如本文中定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个21F06-样序列(如本文中定义的)和一个18G11-样序列(如本文中定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个21F06-样序列(如本文中定义的)和一个34C07-样序列(如本文中定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个04C07-样序列(如本文中定义的)和一个17B05-样序列(如本文中定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个04C07-样序列(如本文中定义的)和一个18G11-样序列(如本文中定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个04C07-样序列(如本文中定义的)和一个34C07-样序列(如本文中定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个17B05-样序列(如本文中定义的)和一个18G11-样序列(如本文中定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个17B05-样序列(如本文中定义的)和一个34C07-样序列(如本文中定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个18G11-样序列(如本文中定义的)和一个34C07-样序列(如本文中定义的)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
并且此类多肽(其的一些非限定性实例，基于本文中的公开内容，对于本领域技术人员来说是清楚明了的–例如，一些实例列于下面表A-2中)再次地形成本发明的其它方面。
同样地，再次地，此类多肽的半衰期可被延长，即例如通过适当的功能化和/或将增加构建体的半衰期的部分或结合单元包含在构建体中来延长。当通过融合至可结合血清蛋白例如血清白蛋白的肽或结合单元来延长氨基酸序列或多肽的半衰期时，所得的本发明的构建体/多肽可以例如并且非限制性地包含如下序列或基本上由所述序列组成：
-两个21F06-样序列(如本文中所定义的，并且其可以相同或不同)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个04C07-样序列(如本文中所定义的，并且其可以相同或不同)和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个17B05-样序列(如本文中所定义的，并且其可以相同或不同)和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个18G11-样序列(如本文中所定义的，并且其可以相同或不同)和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-两个34C07-样序列(如本文中所定义的，并且其可以相同或不同)和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个21F06-样序列(如本文中定义的)和一个04C07-样序列(如本文中定义的)以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个21F06-样序列(如本文中定义的)和一个17B05-样序列(如本文中定义的)以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个21F06-样序列(如本文中定义的)和一个18G11-样序列(如本文中定义的)以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个21F06-样序列(如本文中定义的)和一个34C07-样序列(如本文中定义的)以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个04C07-样序列(如本文中定义的)和一个17B05-样序列(如本文中定义的)以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个04C07-样序列(如本文中定义的)和一个18G11-样序列(如本文中定义的)以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个04C07-样序列(如本文中定义的)和一个34C07-样序列(如本文中定义的)以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个17B05-样序列(如本文中定义的)和一个18G11-样序列(如本文中定义的)以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个17B05-样序列(如本文中定义的)和一个34C07-样序列(如本文中定义的)以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
-一个18G11-样序列(如本文中定义的)和一个34C07-样序列(如本文中定义的)以及增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)；
并且再次此类多肽(其的一些非限定性实例，基于本文中的公开内容，对于本领域技术人员来说是清楚明了的-例如，一些实例列于下面表A-2中)再次地形成本发明的其它方面。
本发明的一些特别优选但非限定性的多肽包含如下序列或基本上由其组成：
a)一个21F06-样序列(如本文中定义的)和一个17B05-样序列(如本文中定义的)，和增加所述氨基酸序列的半请期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白例如Alb-8的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)。这样的多肽的特别优选但非限定性的实例为HER3MS00135(SEQ ID NO：282)；或
b)一个17B05-样序列(如本文中定义的)和一个18G11-样序列(如本文中定义的)，和增加所述氨基酸序列的半衰期的基团、残基、部分或结合单元(和优选地针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白例如Alb-8的ISV，或针对血清蛋白，具体地针对血清白蛋白的肽)，适当地直接连接的或使用一个或多个适当的接头或间隔子连接的(如本文中所描述的)。这样的多肽的两个特别优选但非限定性的实例为HER3MS00212(SEQ ID NO：319)和HER3MS00215(SEQ ID NO：322)。
本发明的多肽的一些特别优选但非限定性的实例为HER3MS00135(SEQ ID NO：282)、HER3MS00212(SEQ ID NO：319)和HER3MS00212(SEQ ID NO：322)。因此本发明还涉及：
a)多肽HER3MS00135(SEQ ID NO：282)，以及与HER3MS00135(SEQ ID NO：282)具有至少80%，例如至少85%、例如至少90%以及达到95%或更高(例如98%、99%或更高)的序列同一性的多肽，其中存在于此类序列中的21F06-样序列和17B05-样序列优选地如本文中所描述的；
b)多肽HER3MS00212(SEQ ID NO：319)，以及与HER3MS00212(SEQ ID NO：319)具有至少80%，例如至少85%、例如至少90%以及达到95%或更高(例如98%、99%或更高)的序列同一性的多肽，其中存在于此类序列中的18G11-样序列和17B05-样序列优选地如本文中所描述的；
c)多肽HER3MS00215(SEQ ID NO：322)，以及与HER3MS00215(SEQ ID NO：322)具有至少80%，例如至少85%、例如至少90%以及达到95%或更高(例如98%、99%或更高)的序列同一性的多肽，其中存在于此类序列中的18G11-样序列和17B05-样序列优选地如本文中所描述的；
还已发现由本发明提供的一些多肽可对HER3内化具有作用，具体地可增加HER3受体的内化。这可以例如具有下列效应：减少存在于细胞表面上的HER3受体的数目，从而减小细胞的配体敏感性和/或减小所述细胞中由HER3介导的信号传导/通过所述细胞的由HER3介导的信号传导和/或调节所述细胞的其它HER3相关生物效应。参考例如下面的实施例17。由本发明的多肽显示的对HER3内化的该作用特别令人惊讶，因为到目前为止，还未曾发现存在于所述内化促进多肽中的相应单价构建块对HER3内化具有类似的影响。
本领域技术人员很清楚，对于本发明的多肽的一些应用，可以有利地使用可促进或增加暴露于这样的多肽或与所述多肽接触的表达HER3的细胞的HER3内化(例如，在给患者或其它受试者施用所述多肽后)的本发明的多肽。因此，在一个方面，本文中所述的多肽(其可包含本文中描述的任何构建块/ISV并且可以例如为先前页面上描述的任何多肽)优选是这样的多肽：其能够促进或增加细胞的HER3内化，例如增加至少5%，例如至少10%、例如至少25%，例如50%或甚至90%或更多，如使用适当的测定例如实施例17和20的测定测量的。
本领域技术人员还清楚，对于本发明的多肽的其它应用，可以有利地使用基本上不改变、促进或增加暴露于这样的多肽或与所述多肽接触的表达HER3的细胞的HER3内化(例如，在给患者或其它受试者施用所述多肽后)的本发明的多肽。因此，在一个方面，本文中所述的多肽(其可包含本文中描述的任何构建块/ISV并且可以例如为先前页面上描述的任何多肽)优选是这样的多肽：其不改变或影响细胞的HER3内化，如使用适当的测定例如实施例17和20的测定测量的。
本发明的化合物或多肽通常可利用这样的方法来制备，所述方法包括至少一个任选地通过一个或多个适当的接头适当地将本发明的一个或多个氨基酸序列连接于一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元以提供本发明的化合物或多肽的步骤。本发明的多肽还可通过通常包括至少如下步骤的方法来制备：提供编码本发明的多肽的核酸，以适当的方式表达所述核酸，和回收本发明的表达的多肽。此类方法可以以本身公知的方式来进行，所述方式，例如基于本文中进一步描述的方法和技术，对于本领域技术人员来说是清楚明了的。
始于本发明的氨基酸序列，设计/选择和/或制备本发明的化合物或多肽的方法在本文中也称为“形式化(formatting)”本发明的所述氨基酸序列；部分由本发明的化合物或多肽组成的本发明的氨基酸被认为被“形式化”或以所述本发明的化合物或多肽的形式存在。其中本发明的氨基酸序列可被形式化的方式的实例和此类形式的实例，基于本文中的公开内容，对于本领域技术人员来说是清楚明了的；并且此类形式化的氨基酸序列形成本发明的其它方面。
在本发明的一个具体方面，本发明的化合物或本发明的多肽与本发明的相应的氨基酸序列相比较可具有增加的半衰期。此类化合物和多肽的一些优选但非限定性实例，基于本文中的进一步的公开内容，对于本领域技术人员来说将变得清楚明了，并且例如包含已被化学修饰以增加其半衰期(例如，通过PEG化)的本发明的氨基酸序列或多肽；包含至少一个另外的用于结合血清蛋白(例如血清白蛋白)的结合位点的本发明的氨基酸序列；或包含至少一个连接于至少一个增加本发明的氨基酸序列的半衰期的部分(具体地至少一个氨基酸序列)的本发明的氨基酸序列的本发明的多肽。包含此类半衰期延长部分或氨基酸序列的本发明的多肽的实例，基于本文中进一步的公开内容，对于本领域技术人员将变得清楚明了；并且例如包括，但非限制性地，这样的多肽：其中本发明的一个或多个氨基酸序列适当地连接于一个或多个血清蛋白或其片段(例如(人)血清白蛋白或其适当的片段)，或连接于一个或多个可结合血清蛋白的结合单元(例如，结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、“dAb”、适用用作dAb的氨基酸序列或可结合血清蛋白(例如人血清白蛋白)的纳米抗体、血清免疫球蛋白例如IgG、或转铁蛋白；参考本文中提及其它描述和参考资料)；这样的多肽：其中本发明的氨基酸序列连接于Fc部分(例如人Fc)或其适当的部分或片段；或这样的多肽：其中本发明的一个或多个氨基酸序列适当地连接于一个或多个可结合血清蛋白的小蛋白质或肽(例如，非限制性地，于WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489和属于Ablynx N.V.的2006年12月5日提交的Ablynx N.V.的标题为"Peptides capable of binding to serum proteins"的美国临时申请(也参见PCT/EP2007/063348)中描述的蛋白质和肽)。
通常，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽优选具有为本发明的相应氨基酸序列本身的半衰期的至少1.5倍，优选至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。例如，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽可具有与本发明的相应氨基酸序列本身相比较增加超过1小时，优选超过2小时，更优选地超过6小时，例如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。在本发明的优选非限定性方面，在哺乳动物例如人中，即优选在人中实现半衰期的上述增加。
在本发明的优选但非限定性方面，本发明的此类化合物或多肽具有与本发明的相应氨基酸序列本身相比较增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，例如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。在本发明的优选但非限定性方面，在哺乳动物例如人中即优选在人中实现了半衰期的上述增加。
在本发明的另一个优选但非限定性方面，本发明的此类化合物或多肽在人中显示至少约12小时，优选至少24小时，更优选至少48小时，更优选至少72小时或更长的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可具有至少5天(例如约5至10天)，优选至少9天(例如约9至14天)，更优选至少约10天(例如约10至15天)，或至少约11天(例如约11至16天)，更优选至少约12天(例如约12至18天或更长)，或超过14天(例如约14至19天)的半衰期。在本发明的优选但非限定性方面，在哺乳动物例如人中，即优选在人中获得上述血清半衰期。
在另一个方面，本发明涉及编码本发明的氨基酸序列或本发明的多肽(或其适当的片段)的核酸。这样的核酸在本文中也称为“本发明的核酸”并且可以例如以遗传构建体的形式存在，如本文中进一步描述的。
在另一个方面，本发明涉及宿主或宿主细胞，所述宿主或宿主细胞表达(或在适当的情况下能够表达)本发明的氨基酸序列和/或本发明的多肽；和/或包含本发明的核酸。此类宿主或宿主细胞的一些优选但非限定性实例根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。
本发明还涉及制品或组合物，所述制品或组合物，例如取决于组合物的期望的用途，包含或包括至少一种本发明的氨基酸序列，至少一种本发明的多肽(或其适当的片段)和/或至少一种本发明的核酸，和任选地本身公知的此类组合物的一个或多个其它组分。这样的制品或组合物可以例如为药物组合物(如本文中所描述的)、兽医学用组合物或用于诊断用途的制品或组合物(也如本文中所描述的)。此类制品或组合物的一些优选但非限定性实例根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽或包含其的组合物在体外(例如在体外或细胞测定中)或体内(例如在单细胞中或在多细胞生物体中，具体地在哺乳动物中，更具体地在人中，例如在处于发生多种癌症的风险中或患有多种癌症的人中)调节HER3(用于调节的方法或组合物)中的用途。
本发明还涉及用于体外(例如在体外或细胞测定中)或体内(例如在单细胞中或在多细胞生物体中，具体地在哺乳动物中，更具体地在人中，例如在处于发生多种癌症的风险中或患有多种癌症的人中)调节HER3的方法，所述方法包括至少如下步骤：以适合于用本发明的至少一种氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽调节HER3的方式和量将HER3与至少一种本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽，或与包含所述氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽的组合物接触。
本发明还涉及一种本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽在制备组合物(例如，非限制性地，本文中进一步描述的药物组合物或制剂)中的用途，所述组合物用于体外(例如在体外或细胞测定中)或体内(例如在单细胞或多细胞生物体中，具体地在哺乳动物中，更具体地在人中，例如在处于发生多种癌症的风险中或患有多种癌症的人中)调节HER3。
在本发明的说明书中，“调节”通常意指减小或抑制HER3的活性，或增加HER3的活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定(例如本文中提及的测定)所测量的。具体地，“调节”可以意指，与在相同的条件下但在本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽不存在的情况下相同测定中的HER3的活性相比较，减小或抑制HER3的活性或增加其活性至少1%，优选至少5%，例如至少10%或至少25%，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或90%或更多，如使用适当的体外、细胞或体内测定(例如本文中提及的测定)所测量的。
这对于本领域技术人员来说是清楚明了的，“调节”还可包括实现HER3对于其靶、异二聚化伴侣、配体或底物的一种或多种的亲和力、亲合性、特异性和/或选择性的改变(其可以是增强或减小)；和/或实现HER3对于其中存在HER3的培养基或环境中的一个或多个条件(例如pH、离子强度、辅因子的存在等)的敏感性的改变(其可以是增强或减小)(与相同条件但在本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽不存在的情况下相比较)。如对于本领域技术人员来说是清楚明了的，这可再次地以任何适当的方式或使用任何本身公知的适当的测定，例如本文中或本文中引用的现有技术中的测定来测定。
“调节”还可指实现关于一个或多个其中牵涉HER3(或其中牵涉其底物、配体或途径，例如其信号转导途径或代谢途径以及它们的相关生物学或生理学效应)的生物学或生理学机制、效应、反应、功能、途径或活性的改变(即分别地作为激动剂或作为拮抗剂的活性)。再次地，如对于本领域技术人员来说是清楚明了的，这样的作为激动剂或拮抗剂的作用可以以任何适当的方式和/或使用任何本身公知的适当(体外和通常细胞或在体内测定中)测定(例如本文中或本文中引用的现有技术中描述的测定)来测定。具体地，作为激动剂或拮抗剂的作用可以使得期望的生物学或生理学活性，与在相同条件下但在本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽不存在的情况下相同测定中的生物学或生理学活性相比较，分别增强或减小至少1%，优选至少5%，例如至少10%或至少25%，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或90%或更多。
调节可以例如包括减少或抑制HER3对其底物或配体之一的结合和/或与天然配体、底物竞争对HER3的结合。调节还可包括激活HER3或其中牵涉其的机制或途径。调节可以是可逆的或不可逆的，但为了药学和药理学目的，调节将通常以可逆方式存在。
本发明还涉及用于制备或产生本文中描述的氨基酸序列、多肽、核酸、宿主细胞、制品和组合物的方法。此类方法的一些优选但非限定性实例根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。
通常地，此类方法可包括如下步骤：
a)提供氨基酸序列的组、集合或文库；和
b)筛选氨基酸序列的所述组、集合或文库以选择可结合HER3和/或具有对于HER3的亲和力的氨基酸序列；
和
c)分离可结合HER3和/或具有对于HER3的亲和力的氨基酸序列。
在这样的方法中，氨基酸序列的组、集合或文库可以是氨基酸序列的任何适当的组、集合或文库。例如，氨基酸序列的组、集合或文库可以是免疫球蛋白序列的组、集合或文库(如本文中所描述的)，例如免疫球蛋白序列的天然组、集合或文库；免疫球蛋白序列的合成或半合成的组、集合或文库；和/或已经历亲和力成熟的免疫球蛋白序列的组、集合或文库。
同样地，在这样的方法中，氨基酸序列的组、集合或文库可以为重链可变结构域(例如VH结构域或VHH结构域)或轻链可变结构域的组、集合或文库。例如，氨基酸序列的组、集合或文库可以为结构域抗体或单结构域抗体的组、集合或文库，或可以为能够作为结构域抗体或单结构域抗体发挥作用的氨基酸序列的组、集合或文库。
在该方法的优选方面，氨基酸序列的组、集合或文库可以为免疫球蛋白序列的免疫组、集合或文库，例如来源于已用HER3或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(例如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当地免疫的哺乳动物。在一个具体方面，所述抗原决定簇可以为细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
在上述方法中，氨基酸序列的组、集合或文库可展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物(例如酵母)上，例如以帮助筛选。用于展示和筛选氨基酸序列(其组、集合或文库)的适当方法、技术和宿主生物，基于本文中的进一步的公开内容，对于本领域技术人员来说是清楚明了的。参考Hoogenboom在Nature Biotechnology,23,9,1105-1116(2005)中的综述。
在另一个方面，用于产生氨基酸序列的方法包括至少如下步骤：：
a)提供表达氨基酸序列的细胞的集合或样品；
b)筛选所述细胞的集合或样品以选择表达可结合HER3和/或具有对于HER3的亲和力的氨基酸序列的细胞；
和
c)(i)分离所述氨基酸序列；或(ii)从所述细胞分离编码所述氨基酸序列的核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
例如，当期望的氨基酸序列为免疫球蛋白序列时，细胞的集合或样品可以例如为B细胞的集合或样品。同样地，在该方法中，细胞的样品可来源于已用HER3或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(例如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当地免疫的哺乳动物。在一个具体方面，所述抗原决定簇可以为细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
可以以任何适当的方式进行上述方法，这对于本领域技术人员来说是清楚明了的。参考例如EP 0 542 810、WO 05/19824、WO04/051268和WO 04/106377。优选使用流式细胞术技术例如FACS进行步骤b)的筛选。关于该技术，参考例如Lieby等人,Blood,第97卷,No.12,3820(2001)。
在另一个方面，用于产生针对HER3的氨基酸序列的方法包括至少如下步骤：
a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；
b)筛选核酸序列的所述组、集合或文库以选择编码可结合HER3和/或具有对HER3的亲和力的氨基酸序列的核酸分子序列；和
c)分离所述核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
在这样的方法中，编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库可以例如为编码免疫球蛋白序列的天然组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；编码免疫球蛋白序列的合成或半合成的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；和/或编码已经历亲和力成熟的免疫球蛋白序列的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库。
同样的，在这样的方法中，核酸序列的组、集合或文库可编码重链可变结构域(例如VH结构域或VHH结构域)或轻链可变结构域的组、集合或文库。例如，核酸序列的组、集合或文库可编码结构域抗体或单结构域抗体的组、集合或文库，或能够作为结构域抗体或单结构域抗体发挥作用的氨基酸序列的组、集合或文库。
在该方法的优选方面，核酸序列的组、集合或文库可以为核酸序列的免疫组、集合或文库，例如来源于已用HER3或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(例如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当地免疫的哺乳动物。在一个具体方面，所述抗原决定簇可以为细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
核酸序列的组、集合或文库可以例如编码重链可变结构域或轻链可变结构域的免疫组、集合或文库。在一个具体方面，核苷酸序列的组、集合或文库可编码VHH序列的组、集合或文库。
在上述方法中，核苷酸序列的组、集合或文库可展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物(例如酵母)上，例如以帮助筛选。用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列(其组、集合或文库)的适当方法、技术和宿主生物，基于本文中的进一步的公开内容，对于本领域技术人员来说是清楚明了的。参考Hoogenboom在Nature Biotechnology,23,9,1105-1116(2005)中的综述。
在另一个方面，用于产生针对HER3的氨基酸序列的方法可包括至少如下步骤：
a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；
b)筛选所述核酸序列的组、集合或文库以选择编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列可结合HER3和/或具有对于HER3的亲和力并且被本发明的ISV或纳米抗体交叉阻断或交叉阻断所述ISV或纳米抗体，例如SEQ ID NO：12至26(表A-1)或本发明的人源化ISV或纳米抗体；和
c)分离所述核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。
本发明还涉及氨基酸序列，所述氨基酸序列通过上述方法，或可选择地通过包括上述方法之一和此外至少如下步骤的方法获得：测定所述免疫球蛋白的核苷酸或氨基酸序列；和以本身公知的方式，例如通过在适当的宿主细胞或宿主生物体中表达或通过化学合成来表达或合成所述氨基酸序列。
同样地，在上述步骤之后，可适当地人源化(或可选择地骆驼源化)本发明的一个或多个氨基酸序列；和/或可将所述获得的氨基酸序列彼此连接或连接于一个或多个其它适当的氨基酸序列(任选地通过一个或多个适当的接头)以提供本发明的多肽。同样的，可适当地人源化(或可选择地骆驼源化)编码本发明的氨基酸序列的核酸序列，并且进行适当地表达；和/或可将一个或多个编码本发明的氨基酸序列的核酸序列彼此连接或连接于一个或多个编码其它适当的氨基酸序列的核酸序列(任选地通过编码一个或多个适当的接头的核苷酸序列)，随后可适当地表达所获得的核苷酸序列以提供本发明的多肽。
本发明还涉及本文中描述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、制品和组合物的应用和用途，以及涉及用于预防和/或治疗与HER3相关的疾病和障碍的方法。一些优选但非限定性应用和用途根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。
本发明还涉及用于治疗的本文中描述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、制品和组合物。
具体地，本发明还涉及用于疾病或障碍的治疗的本文中描述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、制品和组合物，所述疾病或障碍可通过给有此需要的受试者施用(药学有效量的)本文中描述的氨基酸序列、化合物、构建体或多肽来预防或治疗。
更具体地，本发明涉及用于治疗多种癌症的本文中描述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、制品和组合物。
本发明的其它方面、实施方案、有利方面和应用(这形成了本发明的一些优选方面)根据本文中的进一步描述也将变得清楚明了，在所述描述中参考本发明的纳米抗体和包含所述纳米抗体的本发明的多肽本更详细地描述和讨论了本发明。
如根据本文中的进一步描述将变得清楚明了的，纳米抗体通常提供与“dAb”或类似(单)结构域抗体或免疫球蛋白序列相比较的某些有利方面(本文中概述的)，所述有利方面也由本发明的纳米抗体提供。然而，本领域技术人员将很清楚，还可将下面教导的更一般方面用于(直接或类似地)本发明的其它氨基酸序列。
发明详述
在本说明、实施例和权利要求中：
a)除非另外指出或定义，否则所使用的全部术语具有它们在本领域的通常含义，这对于本领域技术人员来说是清楚明了的。参考例如WO 08/020079的第46页的段落a)中提及的标准手册。
b)除非另外指出，否则术语“免疫球蛋白单可变结构域”用作一般术语，包括但不限于抗原结合结构域或片段，例如分别如本文中所描述的VHH结构域或VH或VL结构域。术语抗原结合分子或抗原结合蛋白可互换使用并且也包括术语纳米抗体。免疫球蛋白单可变结构域还可以为轻链可变结构域序列(例如VL-序列)，或重链可变结构域序列(例如VH-序列)；更具体地，它们可以为来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列或来源于重链抗体的重链可变结构域序列。因此，免疫球蛋白单可变结构域可以为结构域抗体，或适合用作结构域抗体的免疫球蛋白序列,单结构域抗体，或适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列，"dAb”，或适合用作dAb的免疫球蛋白序列，或纳米抗体，或适合用作纳米抗体的免疫球蛋白序列，包括但不限于VHH序列。本发明包括不同来源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驴、鲨鱼、人和骆驼免疫球蛋白序列。免疫球蛋白单可变结构域包括完全人免疫球蛋白序列、人源化免疫球蛋白序列、另外地序列优化的免疫球蛋白序列或嵌合免疫球蛋白序列。免疫球蛋白单可变结构域和免疫球蛋白单可变结构域的结构可被认为-然而不限定于其-包含4个构架区或“FR”，所述4个构架区在本领域和本文中分别称为“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3”或“FR3”；和“构架区4”或“FR4”，所述构架区之间插入了3个互补决定区或“CDR”，在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；和“互补决定区3”或“CDR3”。应指出，术语纳米抗体为Ablynx N.V.的注册商标，从而也可以称为和/或)。
c)除非另外指出，否则术语“免疫球蛋白序列”、“序列”、“核苷酸序列”和“核酸”如WO 08/020079的第46页的段落b)中所描述的。
d)除非另外指出，否则可进行并且已以本身公知的方式进行了未被专门详细描述的所有方法、步骤、技术和操作，这对于本领域技术人员来说是清楚明了的。再次参考标准手册和本文中提及的一般背景领域以及本文中引用的其它参考资料；以及例如下列综述Presta,Adv.Drug Deliv.Rev.2006,58(5-6)：640-56；Levin和Weiss,Mol.Biosyst.2006,2(1)：49-57；Irving等人,J.Immunol.Methods,2001,248(1-2),31-45；Schmitz等人,Placenta,2000,21Suppl.A,S106-12,Gonzales等人,Tumour Biol.,2005,26(1),31-43，所述文献描述了用于蛋白质工程的技术，例如亲和力成熟和其它用于增强蛋白质例如免疫球蛋白的特异性和其它期望的性质的技术。
e)氨基酸残基将根据标准三字母或一字母氨基酸代码显示。参考Ablynx N.V的标题为“Amino acid sequence directed against IL-6R and polypeptides comprisingthe same for tbe treatment of diseases and disorders associated with Il-6mediated signalling”的国际申请WO08/020079的第48页的表A-2。
f)为了比较两个或更多个核苷酸序列，可如WO 08/020079(通过引用并入本文)的第49页的段落e)中所描述的，计算或测定第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分比，例如通过将[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置上的核苷酸相同的核苷酸的数目]除以[第一核苷酸序列的核苷酸的总数]，然后乘以[100%]来进行，其中与第一核苷酸序列相比较，第二核苷酸序列中的核苷酸的每一个缺失、插入、置换或添加被当作单个核苷酸(位置)上的差异；或使用适当的计算机算法或技术来进行，再次地如WO 08/020079(通过引用并入本文)的第49页的段落e)中所描述的。
g)为了比较两个或更多个氨基酸序列，可如WO 08/020079(通过引用并入本文)的第49和50页的段落f)中所述，计算或测定第一氨基酸与第二氨基酸之间的“序列同一性”(在本文中也称为“氨基酸同一性”的百分比，例如通过将[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列的相应位置上的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数目]除以[第一氨基酸序列中氨基酸残基的总数]，然后再乘以[100%]来进行，其中与第一氨基酸序列相比较，第二氨基酸序列中的氨基酸残基的每一个缺失、插入、置换或添加-被当作单个氨基酸残基(位置)上的差异，即作为如本文中定义的“氨基酸差异”；或使用适当的计算机算法或技术来进行，再次地如WO 08/020079(通过引用并入本文)的第49和50页的段落f)中所描述的。
同样地，在测定两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度时，本领域技术人员可考虑所谓的“保守”氨基酸置换，如WO 08/020079的第50页所描述的。
用于本文中描述的多肽的任何氨基酸置换还可基于由Schulz等人,Principlesof Protein Structure,Springer-Verlag,1978开发的不同物种的同源蛋白质之间的氨基酸变异的频率的分析，基于由Chou和Fasman,Biochemistry 13：211,1974和Adv.Enzymol.,47：45-149,1978等人开发的结构形成潜能的分析，和基于Eisenberg等人,Proc.Nad.AcadSci.USA 81：140-144,1984；Kyte&Doolittle；J Molec.Biol.157：105-132,1981和Goldman等人,Ann.Rev.Biophys.Chem.15：321-353,1986开发的蛋白质的疏水性模式的分析，将所述所有文献通过引用整体并入本文。关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息示于本文中的描述中和上文引用的一般背景领域中。同样地，为了该目的，骆驼的VHH结构域的晶体结构例如由Desmyter等人,Nature Structural Biology,第3卷,9,803(1996)；Spinelli等人,Natural Structural Biology(1996)；3,752-757；和Decanniere等人,Structure,第7卷,4,361(1999)提供。关于一些在常规VH结构域中形成VH/VL界面的氨基酸残基和这些位置上的潜在骆驼源化置换的其它信息可见于上文中引用的现有技术中。
h)氨基酸序列和核苷酸序列被认为是“完全相同的”，如果它们在其全长范围上具有100%序列同一性(如本文中定义的)的话。
i)当包含两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比较，第一序列的位置上单个氨基酸残基的插入、缺失或置换；应理解，两个氨基酸序列可包含一个、二个或更多个这样的氨基酸差异。
j)当核酸序列或氨基酸序列被认为分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或被认为“基本上由另一个核苷酸序列或氨基酸序列组成”时，这具有WO 08/020079的第51-52页的段落i)中给出的含义。
k)术语“以基本上分离的形式存在”具有WO 08/020079的第52和53页上在段落j)中赋予其的含意。
l)术语“结构域”和“结合结构域”具有在WO 08/020079的第53页的段落k)中赋予其的含意。
m)术语“抗原决定簇”和“表位”，其还可在本文中互换使用，具有WO 08/020079的第53页的段落I)中赋予其的含意。
n)如在WO 08/020079的第53页的段落m)中进一步描述的，可(特异性地)结合特定抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质(或至少其部分、片段或表位)，具有对于其的亲和力和/或具有对于其的特异性的氨基酸序列(例如本发明的纳米抗体、抗体、多肽，或通常抗原结合蛋白或多肽或其片段)被称为是“针对”或“指向”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质。
o)术语“特异性”具有WO 08/020079的第53-56页的段落n)中赋予其的含义；并且如本文中提及的，是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的纳米抗体或多肽)分子可结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。抗原结合蛋白的特异性可基于亲和力和/或亲合性来测定，如WO 08/020079(通过引用并入本文)的第53-56页所描述的，其还描述了一些用于测量抗原结合分子(例如本发明的纳米抗体或多肽)与相关抗原之间的结合的优选技术。通常，抗原结合蛋白(例如本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽)可以以10-5至10-12摩尔/升或更低，优选地10-7至10-12摩尔/升或更低以及更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105至1012升/摩尔或更高，优选107至1012升/摩尔或更高以及更优选108至1012升/摩尔的缔合常数(KA))结合其抗原。大于104摩尔/升的任何KD值(或低于104M-1升/摩尔的任何KA值)通常被认为表示非特异性结合。优选地，本发明的单价免疫球蛋白序列可以以低于500nM，优选低于200nM，更优选地低于10nM，例如低于500pM的亲和力结合期望的抗原。抗原结合蛋白对抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以任何本身公知的方式来测定，包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定，例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争性测定，以及在本领域本身公知的其不同变型；以及本文中提及的其它技术。如对于本领域技术人员将清楚明了的，并且如WO 08/020079的第53-56页所描述的，解离常数可以是实际或表观解离常数。用于测定解离常数的方法对于本领域技术人员来说是清楚明了的，例如包括WO 08/020079的第53-56页提及的技术。
p)本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通常可如WO08/020079的第57页的段落o)中所描述的那样定义并且本文中所提及的，是指氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内减少50%(例如因序列或化合物的降解和/或序列或化合物通过天然机制的清除或隔离(sequestration)而)所花的时间。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以以任何本身公知的方式来测定，例如通过药代动力分析来进行。适当的技术对于本领域技术人员来说是清楚明了的，可以例如通常是如WO 08/020079的第57页的段落o)中所描述的。也如WO 08/020079的第57页上的段落o)中所提及的，半衰期可使用参数例如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)来表示。参考例如下面的实验部分，以及标准手册，例如Kenneth,A等人：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook forPharmacists和Peters等人,Pharmacokinete analysis：A Practical Approach(1996)。也参考"Pharmacokinetics",M Gibaldi&D Perron,由Marcel Dekker出版的,第2版(1982)。术语“半衰期的增加”或“增加的半衰期”也如WO08/020079的第57页的段落o)中所定义的，并且具体地是指t1/2-β的增加，具有或不具有t1/2-α和/或AUC或两者的增加。
q)在本发明的说明书中，“调节”通常意指减小或抑制靶或抗原的活性，或增强靶或抗原的活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定测量的。具体地，“调节”可意指减小或抑制靶或抗原的生物学活性或增强靶或抗原的(相关或预期的)生物活性至少1%，优选至少5%，例如至少10%或至少25%，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或90%或更多(与在相同条件下但在本发明的构建体不存在的情况下相同测定中的靶或抗原的活性相比较)，如使用适当的体外、细胞或体内测定(这通常取决于牵涉的靶或抗原)测量的。
如对于本领域技术人员来说是清楚明了的，“调节”还可包括实现靶或抗原对于其配体、结合伴侣、用于缔合成同多聚体或异多聚体形式的伴侣或底物的一种或多种的亲和力、亲合性、特异性和/或选择性的改变(其可以是增强或减小)；和/或实现靶或抗原对于其中存在靶或抗原的培养基或环境中的一个或多个条件(例如pH、离子强度、辅因子的存在等)的敏感性的改变(其可以是增强或减小)(与相同条件但在本发明的构建体不存在的情况下相比较)。如对于本领域技术人员来说是清楚明了的，取决于牵涉的靶或抗原，这可再次地以任何适当的方式和/或使用任何本身公知的适当的测定。
“调节”还可指实现关于一个或多个其中牵涉靶或抗原(或其中牵涉其底物、配体或途径，例如其信号转导途径或代谢途径以及它们的相关生物学或生理学效应)的生物学或生理学机制、效应、反应、功能、途径或活性的改变(即，取决于靶或抗原以及期望的生物学或生理学效应，分别地作为激动剂，作为拮抗剂或作为反向激动剂的活性)。再次地，如对于本领域技术人员来说是清楚明了的，取决于牵涉的靶或抗原，这样的作为激动剂或拮抗剂的作用可以以任何适当的方式和/或使用本身公知的任何适当的(体外和通常细胞或体内测定)测定来测定。具体地，作为激动剂或拮抗剂的作用可以使得期望的生物学或生理学活性，与在相同条件下但在本发明的构建体不存在的情况下相同测定中的生物学或生理学活性相比较，分别增强或减小至少1%，优选至少5%，例如至少10%或至少25%，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或90%或更多。
调节可以例如包括靶或抗原的别构调节(allosteric modulation)；和/或减少或抑制靶或抗原对其底物或配体之一的结合和/或与天然配体、底物竞争对靶或抗原的结合。调节还可包括激活靶或抗原或其中牵涉其的机制或途径。调节可以例如还包括实现关于靶或抗原的折叠或构象的改变，或关于靶或抗原折叠、改变其构象(例如，在配体结合后)、与其它(亚)单元缔合或解离的能力的改变。调节可以例如还包括实现靶或抗原转运其它化合物或用作其它化合物(例如离子)的通道的能力的改变。
调节可以是可逆的或不可逆的，但为了制药和药理学目的，调节将通常以可逆方式存在。
r)关于靶或抗原，术语靶或抗原上的“相互作用位点”是指靶或抗原上的位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或区段，其为用于结合配体、受体或其它结合伴侣的位点、催化位点、切割位点、用于别构相互作用的位点、参与靶或抗原的多聚化(例如同多聚化或异二聚化，具体地为异二聚化)的位点；或靶或抗原上的氨基酸残基的任何其它位置、表位、抗原决定簇、部分、结构域或区段，其参与靶或抗原的生物学作用或机制。更一般地，“相互作用位点”可以是靶或抗原上的氨基酸残基的任何位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或区段，本发明的氨基酸序列或多肽可与其结合以便靶或抗原(和/或其中牵涉靶或抗原的任何途径、相互作用、信号转导、生物学机制或生物学效应)被调节(如本文中定义的)。
s)氨基酸序列或多肽，当以等于所述氨基酸序列或多肽结合第二靶或多肽的亲和力的至少10倍，例如至少100倍，优选至少1000倍以及达到10,000倍或更高倍的亲和力(如上所述的，并且适当地表示为KD值、KA值、Koff率和/或Kon率)结合第一抗原时，被认为相对于第二靶或抗原对于第一靶或抗原是“特异性的”。例如，第一抗原可以以等于所述氨基酸序列或多肽结合第二靶或多肽的KD的至多1/10，例如至多1/100，优选至多1/1000，例如1/10,000或甚至更低的KD值结合靶或抗原。优选地，当氨基酸序列或多肽对于第一靶或抗原相对于第二靶或抗原是“特异性的”时，其针对(如本文中定义的)所述第一靶或抗原，但不针对所述第二靶或抗原。
t)术语“交叉阻断”、“交叉阻断的”和“进行交叉阻断”在本文中可互换使用，意指免疫球蛋白单可变结构域或多肽直接或通过别构调节间接干扰本发明的其它免疫球蛋白单可变结构域或多肽对给定的靶的结合。本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽能够干扰另一种结构域或多肽对靶的结合的程度，以及因此其是否根据本发明被称作交叉阻断，可使用竞争性结合测定来确定。一个特别适合的定量交叉阻断测定使用基于FACS或AlphaScreen的方法测量根据本发明的标记的(例如His标记的、生物素化的或放射性标记的)免疫球蛋白单可变结构域或多肽与其它结合剂之间在它们对靶的结合上的竞争。实验部分一般性地描述了适用于确定结合分子是否交叉阻断或能够交叉阻断根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽的基于FACS的测定。应理解，可将所述测定与任何本文中描述的免疫球蛋白单可变结构域或其它结合剂组合。因此，一般地，根据本发明的交叉阻断性氨基酸序列或其它结合剂为例如这样：其在上述交叉阻断测定中结合靶，使得在测定过程中和在本发明的第二氨基酸序列或其它结合剂存在的情况下，记录的根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽的置换达到待测的潜在的交叉阻断性试剂的最大理论置换(例如被需要交叉阻断的冷(例如未标记的)免疫球蛋白单可变结构域或多肽置换)的100%(例如在基于FACS的竞争性测定中)，所述待测的潜在的交叉阻断性试剂以0.4mM或更少的量存在(交叉阻断剂可以为另一种常规单克隆抗体例如IgG、经典单价抗体片段(Fab、scFv))和/或变体(包括但不限于野生型或工程化双链抗体、三链抗体、微小抗体、VHH、dAb、VH、VL)。优选地，在非限定性方面，优选本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽具有等于10%至100%，更优选地50%至100%的记录的置换(如上文中所述的)。
u)氨基酸序列被认为对于两种不同抗原或抗原决定簇(例如来自两个不同哺乳动物的物种的血清白蛋白，例如人血清白蛋白和猕猴血清白蛋白)是“交叉反应性的”，如果其对于这两种不同的抗原或抗原决定簇都是特异性(如本文中定义的)的话。
v)如本文中进一步描述的，纳米抗体的氨基酸残基的总数可在110-130的范围内。然而应当指出，纳米抗体的部分、片段、类似物或衍生物(如本文中进一步描述的)在它们的长度和/或尺寸上不受特别限制，只要此类部分、片段、类似物或衍生物满足本文中概述的其它要求，并且也优选适合于本文中描述的目的即可；
w)如WO 08/020079(通过引用并入本文)的第58和59页的段落q)中进一步描述的，纳米抗体的氨基酸残基按照由Kabat等人(“Sequence of proteins of immunologicalinterest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,Publication No.91)给出的用于VH结构域的一般编号进行编号，如Riechmann和Muyldermans的论文,J.Immunol.Methods 2000Jun 23；240(1-2)：185-195(参见例如该出版物的图2)中对于骆驼的VHH结构域所使用的，因此纳米抗体的FR1包含位置1-30上的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包含位置31-35上的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包含位置36-49上的氨基酸，纳米抗体的CDR2包含位置50-65上的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包含位置66-94上的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包含位置95-102上的氨基酸残基，以及纳米抗体的FR4包含位置103-113上的氨基酸残基。
x)除非在本文中另外明确地指出，否则附图、序列表和实验部分/实施例仅用于进一步举例说明本发明并且不应当理解或解释为以任何方式限定本发明和/或所附权利要求的范围。
关于重链抗体及其可变结构域的一般描述，除其他以外参考本文中引用的现有技术，以及WO 08/020079的第59页提及的现有技术和国际申请WO 06/040153的第41-43页提及的参考资料列表，将所述现有技术和参考资料通过引用并入本文。
根据本领域使用的术语(参见上述参考资料)，存在于天然存在的重链抗体中的可变结构域也称为“VHH结构域”，以将它们与存在于常规四链抗体中的重链可变结构域(其在下文中称为“VH结构域”)和与存在于常规四链抗体中的轻链可变结构域(其在下文中称为“VL结构域”)相区别。
如上文中提及的现有技术中所述，VHH结构域具有许多独特的结构特征和功能性质，所述结构特征和功能性质使得分离的VHH结构域(以及基于其的纳米抗体，所述纳米抗体与天然存在的VHH结构域共有这些结构特征和功能性质)和包含其的蛋白质高度有利于用作功能性抗原结合结构域或蛋白质。具体地，并且不限于此，VHH结构域(其已被天然地“设计”来功能性结合抗原而无需轻链可变结构域的存在，以及无需与轻链可变结构域的任何相互作用)和纳米抗体可用作单个相对小的功能性抗原结合结构单元、结构域或蛋白质。这可将VHH结构域与常规四链抗体的VH和VL结构域相区别，所述VH和VL结构域本身通常不适合用作单抗原-结合蛋白或结构域，而是需要与一些形式或另一个结构域组合以提供功能性抗原结合单元(如在例如常规抗体片段例如Fab片段中；在ScFv片段中，其由与VL结构域共价连接的VH结构域组成)。
由于这些独特性质，因此VHH结构域和ISV或纳米抗体作为单抗原结合蛋白或作为抗原结合结构域(即作为更大的蛋白质或多肽的部分)的用途提供了优于常规VH和VL结构域、scFv或常规抗体片段(例如Fab-或F(ab’)2-片段)的用途的显著有利方面，包括WO 08/020079的第60和61页所列的有利方面。
在具体的和优选的方面，本发明提供了针对HER3的ISV或纳米抗体，具体地针对温血动物的HER3的ISV或纳米抗体，更具体地针对哺乳动物的HER3的ISV或纳米抗体，具体地针对人HER3的ISV或纳米抗体；以及包含至少一个这样的ISV或纳米抗体的蛋白质和/或多肽。
具体地，本发明提供了针对HER3的ISV或纳米抗体，和包含所述ISV或纳米抗体的蛋白质和/或多肽，其具有与针对HER3或其片段的常规抗体相比较，与可基于此类常规抗体或抗体片段(例如Fab’片段、F(ab’)2片段、ScFv构建体、“双链抗体”和其它多特异性构建体(参见例如Holliger和Hudson的综述,Nat Biotechnol.2005Sep；23(9)：1126-36))的常规抗体相比较，还与包含可来源于常规抗体的可变结构域的所谓的“dAb”或类似(单)结构域抗体相比较，改善的治疗和/或药理学性质和/或其它有利的性质(例如，改善的制备容易性和/或降低的商品成本)。这些改善的和有利的性质根据本文中的进一步描述将变得清楚明了，并且例如包括但不限于如下方面的一个或多个方面：
-增强的对于HER3的亲和力和/或亲合性，在单价形式中，在多价形式中(例如在二价形式中)和/或在多特异性形式中(例如下文中描述的多特异性形式之一)；
-用于形成多价形式(例如在二价形式中)的更好的适合性；
-用于形成多特异性形式(例如下文中描述的多特异性之一)的更好的适合性；
-对于“人源化”置换(如本文中定义的)的改善的适合性或易感性；
-较弱的免疫原性，在单价形式中，在多价形式中(例如在二价形式中)和/或在多特异性形式中(例如下文中描述的多特异性形式之一)；
-增强的稳定性，在单价形式中，在多价形式中(例如在二价形式中)和/或在多特异性形式中(例如下文中描述的多特异性形式之一)；
-增加的对HER3的特异性，在单价形式中，在多价形式中(例如在二价形式中)和/或在多特异性形式中(例如下文中描述的多特异性形式之一)；
-减弱的或需要时增加的与不同物种的HER3的交叉反应性；
和/或
-期望用于药物用途(包括预防性用途和/或治疗性用途)和/或用于诊断用途(包括但不限于用于成像目的)的一个或多个其它改善的性质，在单价形式中，在多价形式中(例如在二价形式中)和/或在多特异性形式中(例如下文中描述的多特异性形式之一)。
如本文中通常对于本发明的氨基酸序列所描述的，本发明的ISV或纳米抗体优选以基本上分离的形式(如本文中定义的)存在，或形成本发明的蛋白质或多肽的部分(如本文中定义的)，其可包含本发明的一个或多个ISV或纳米抗体或基本上由其组成，并且其可任选地还包含一个或多个其它氨基酸序列(全部任选地通过一个或多个适当的接头连接)。例如，并且非限制性地，本发明的一个或多个氨基酸序列可在这样的蛋白质或多肽中用作结合单元，其可任选地包含一个或多个可用作结合单元(即针对一个或多个除HER3之外的其它靶)的其它氨基酸序列，以分别提供本发明的单价、多价或多特异性多肽，全都如本文中所描述的。具体地，这样的蛋白质或多肽可包含一个或多个本发明的ISV或纳米抗体和任选地一个或多个(其它)ISV或纳米抗体(即针对除HER3之外的其它靶)或基本上由其组成，全都任选地通过一个或多个适当的接头连接，以分别提供单价、多价或多特异性ISV或纳米抗体构建体，如本文中进一步描述的。此类蛋白质或多肽还可以以基本上分离的形式(如本文中定义的)存在。
在本发明的ISV或纳米抗体中，用于结合HER3的结合位点优选由CDR序列形成。任选地，本发明的ISV或纳米抗体，除至少一个用于结合HER3的结合位点外，还可包含一个或多个用于结合其它抗原、蛋白质或靶的其它结合位点。关于用于引入此类第二结合位点的方法和位置，参考例如Keck和Huston,Biophysical Journal,71,October 1996,2002-2011；EP 0 640 130；和WO 06/07260。
如通常对于本发明的氨基酸序列所描述的，本发明的氨基酸序列，当意欲将本发明的ISV或纳米抗体(或包含其的本发明的多肽)给受试者施用(例如为了如本文中所描述的治疗性和/或诊断性用途)时，其优选针对人HER3；然而对于兽医目的，其优选针对待治疗的物种的HER3。同样地，与本发明的氨基酸序列一样，本发明的ISV或纳米抗体可以具有或可以不具有交叉反应性(即针对两个或更多个哺乳动物的物种的HER3，例如针对人HER3和本文中提及的哺乳动物的物种的至少一个的HER3)。
同样地，再次如本文中对于本发明的氨基酸序列通常所描述的，本发明的ISV或纳米抗体可通常针对HER3的任何抗原抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象(如适用)。然而，通常假定和优选地本发明的ISV或纳米抗体(和包含所述ISV或纳米抗体的多肽)针对heregulin(或“HRG”)结合位点和异二聚化相互作用位点。
如本文中已描述的，ISV或纳米抗体的氨基酸序列和结构可被认为–然而不限于其–包含4个构架区或“FR”(或有时也称为“FW”)，这在本领域和本文中分别称为“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3”或“FR3”；以及“构架区4”或“FR4”；所述构架区之间间插3个互补决定区或“CDR”，其在本领分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；和“互补决定区3”或“CDR3”。存在于本发明的ISV或纳米抗体中的一些优选构架序列和CDR(及其组合)如本文中所描述的。其它适当的CDR序列可由本文中描述的方法获得。
根据本发明的非限定性但优选的方面，本发明的ISV或纳米抗体(其中存在CDR序列)是这样的抗体：
-所述ISV或纳米抗体可以以10-5至10-12摩尔/升或更低，优选10-7至10-12摩尔/升或更低以及更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即以105至1012升/摩尔或更高，优选107至1012升/摩尔或更高以及更优选108至1012升/摩尔的缔合常数(KA))结合HER3；
和/或是这样的抗体：
-所述ISV或纳米抗体可以以102M-1s-1至约107M-1s-1，优选103M-1s-1至107M-1s-1，更优选地104M-1s-1至107M-1s-1，例如105M-1s-1至107M-1s-1的kon-率结合HER3；
和/或这样的抗体：它们：
-所述ISV或纳米抗体可以以1s-1(t1/2=0.69s)至10-6s-1(提供具有多日的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选10-2s-1至10-6s-1，更优选地10-3s-1至10-6s-1，例如10-4s-1至10-6s-1的koff率结合HER3。
优选地，本发明的ISV或纳米抗体(其中存在CDR序列)是这样的序列：本发明的单价ISV或纳米抗体(或仅包含一个本发明的ISV或纳米抗体的多肽)优选使其可以以低于500nM，优选低于100nM，更优选地低于10nM，例如低于5nM的亲和力结合HER3。
本发明的ISV或纳米抗体对HER3的亲和力可以以本身公知的方式来测定，例如使用用于测量本文中提及的KD、KA、koff或kon的一般技术，以及本文中描述的一些专门测定。
本发明的ISV或纳米抗体(和包含所述ISV或纳米抗体的多肽)对HER3的结合的一些优选IC50值根据本文中的进一步描述和实施例将变得清楚明了。
在优选但非限制性方面，本发明涉及针对HER3的ISV或纳米抗体(如本文中定义的)，其由4个构架区(分别地FR1至FR4)和3个互补决定区(分别地CDR1至CDR3)组成，其中：
-CDR1选自：
a)SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR2选自：
d)SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和/或
-CDR3选自：
g)SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或这样的氨基酸序列的任何适当的片段。
具体地，根据该优选但非限定性方面，本发明涉及针对HER3的ISV或纳米抗体(如本文中定义的)，其由4个构架区(分别地FR1至FR4)和3个互补决定区(分别地CDR1至CDR3)，其中：
-CDR1选自：
a)SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR2选自：
d)SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
和
-CDR3选自：
g)SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或这样的氨基酸序列的任何适当的片段。
如本文中通常对于本发明的氨基酸序列所提及的，当本发明的ISV或纳米抗体包含根据b)和/或c)的一个或多个CDR1序列时：
i)这样的根据b)和/或c)的CDR中的任何氨基酸置换，与根据a)的相应CDR相比较，优选地为保守氨基酸置换(如本文中定义的)；
和/或
ii)与根据a)的相应CDR相比较，根据b)和/或c)的CDR优选仅包含氨基酸置换，并且无氨基酸缺失或插入；
和/或
iii)根据b)和/或c)的CDR可以为通过使用一个或多个本身公知的亲和力成熟的技术通过亲和力成熟从根据a)的CDR衍生的CDR。
类似地，当本发明的ISV或纳米抗体包含根据e)和/或f)的一个或多个CDR2序列时：
i)这样的根据e)和/或f)的CDR中的任何氨基酸置换，与根据d)的相应CDR相比较，优选地为保守氨基酸置换(如本文中定义的)；
和/或
ii)与根据d)的相应CDR相比较，根据e)和/或f)的CDR优选仅包含氨基酸置换，并且无氨基酸缺失或插入；
和/或
iii)根据e)和/或f)的CDR可以为通过使用一个或多个本身公知的亲和力成熟的技术通过亲和力成熟从根据d)的CDR衍生的CDR。
同样地，类似地，当本发明的ISV或纳米抗体包含一个或多个根据h)和/或i)的CDR3序列时：
i)这样的根据h)和/或i)的CDR中的任何氨基酸置换，与根据g)的相应CDR相比较，优选地为保守氨基酸置换(如本文中定义的)；
和/或
ii)与根据g)的相应CDR相比较，根据h)和/或i)的CDR优选仅包含氨基酸置换，并且无氨基酸缺失或插入；
和/或
iii)根据h)和/或i)的CDR可以为通过使用一个或多个本身公知的亲和力成熟的技术通过亲和力成熟从根据g)的CDR衍生的CDR。
应当理解，最后三段一般适用于本发明的任何ISV或纳米抗体，所述ISV或纳米抗体包含一个或多个分别根据b)、c)、e)、f)、h)或i)的CDR1序列、CDR2序列和/或CDR3序列。
在本发明的ISV或纳米抗体当中，包含一个或多个上文中明确列出的CDR的ISV或纳米抗体是特别优选的；包含两个或更多个上文中明确列出的CDR的ISV或纳米抗体是特别优选的；以及包含三个上文中明确列出的CDR的ISV或纳米抗体是最特别优选的。
CDR的一些特别优选但非限定性组合以及CDR序列与构架序列的优选组合示于下面表B-1中，其列出存在于许多优选(但非限定性)的本发明的ISV或纳米抗体中的CDR序列和构架序列。如对于本领域技术人员来说是清楚明了的，存在于相同克隆中的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合(即在表B-1中相同行中提及的CDR1、CDR2和CDR3序列)通常是优选的(虽然本发明在其最广的意义上不限定于其，并且还包括表B-1中提及的CDR序列的其它适当的组合)。同样地，存在于相同克隆中的CDR序列与构架序列的组合(即在表B-1中相同行中提及的CDR序列和构架序列)通常是优选的(虽然本发明在其最广的意义上不限定于其，并且还包括表B-1中提及的CDR序列与构架序列的其它适当的组合，以及此类CDR序列与其它适当的构架序列的组合，例如如本文中进一步描述的)。
同样的，在包括表B-1中提及的CDR的组合的本发明的ISV或纳米抗体中，每一个CDR可被选自与提及的CDR具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%的序列同一性(如本文中定义的)的氨基酸序列的CDR替代；其中：
i)这样的CDR中的任何氨基酸置换，与表B-1中提及的相应CDR相比较，优选地为保守氨基酸置换(如本文中定义的)；
和/或
ii)与表B-1中提及的相应CDR相比较，任何这样的CDR优选仅包含氨基酸置换，并且无氨基酸缺失或插入；
和/或
iii)任何这样的CDR为通过本身公知的用于亲和力成熟的技术，具体地始于表B-1中提及的相应CDR序列衍生的CDR。
然而，如对于本领域技术人员来说是清楚明了的，表B-1中提及的CDR序列(其组合)以及CDR序列与构架序列(其组合)通常是优选的。
因此，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一个适当地分别选自表B-1中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列；或分别选自分别与表B-1中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一个具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%的“序列同一性”(如本文中定义的)的CDR1、CDR2和CDR3序列；和/或分别选自分别与表B-1所列的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一个具有3、2或仅1个“氨基酸差异”(如本文中定义的)的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在该情况下，“适当地选择的”意指如适用，分别地CDR1序列选自适当的CDR1序列(即如本文中定义的，CDR2序列选自适当的CDR2序列(即如本文中定义的)以及CDR3序列选自适当的CDR3序列(即如本文中定义的)。更具体地，优选这样选择CDR序列以便本发明的纳米抗体以如本文中定义的亲和力(适当地测量和/或表示为KD-值(实际或表观)、KA-值(实际或表观)、kon-率和/或koff-率或可选择地测量和/或表示为IC50值，如本文中进一步描述的)结合HER3。
具体地，在本发明的纳米抗体中，至少存在的CDR3序列适当地选自表B-1中所列的CDR3序列或选自与表B-1中所列的CDR3序列的至少一个具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%的序列同一性的CDR3序列；和/或选自与表B-1中所列的CDR3序列的至少一个具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR3序列。
优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少两个适当地分别选自表B-1中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列或分别选自分别与表B-1中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一个具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%的序列同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列；和/或分别选自分别与表B-1中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一个具有3、2和仅1个“氨基酸差异”的CDR1、CDR2和CDR3序列。
具体地，在本发明的纳米抗体中，至少存在的CDR3序列适当地选自表B-1中所列的CDR3序列或选自与表B-1中所列的CDR3序列的至少一个具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%的序列同一性的CDR3序列；和存在的CDR1和CDR2序列的至少一个适当地分别选自表B-1中所列的CDR1和CDR2序列或分别选自分别与表B-1中所列的CDR1和CDR2序列的至少一个具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%序列同一性的CDR1和CDR2序列；和/或分别选自分别与表B-1所列的CDR1和CDR2序列的至少一个具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列。
最优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的所有3个CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自表B-1中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列或分别选自分别与表B-1中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一个具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%的序列同一性的CDR1、CDR2和CDR3序列；和/或分别选自分别与表B-1中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一个具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR1、CDR2和CDR3序列。
甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少一个适当地分别选自表B-1中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列。优选地，在这方面，存在的另外两个CDR中的至少一个或优选两个适当地分别选自与表B-1中所列的相应的CDR序列的至少一个具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%的序列同一性的CDR序列；和/或分别选自与表B-1中所列的相应序列的至少一个具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR序列。
具体地，在本发明的纳米抗体中，至少存在的CDR3序列适当地选自表B-1中所列的CDR3。优选地，在这方面，至少存在的CDR1和CDR2序列的至少一个和优选两个适当地分别选自分别与表B-1中所列的CDR1和CDR2序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%的序列同一性的CDR1和CDR2序列；和/或分别选自分别与表B-1中所列的CDR1和CDR2序列的至少一个具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR1和CDR2序列。
甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列的至少两个适当地分别选自表B-1中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列。优选地，在这方面，存在的剩余CDR序列适当地选自与表B-1中所列的相应CDR序列的至少一个具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%的序列同一性的CDR序列；和/或选自与表B-1中所列的相应序列的至少一个具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR序列。
具体地，在本发明的纳米抗体中，至少CDR3序列适当地选自表B-1中所列的CDR3序列，并且CDR1序列或CDR2序列适当地分别选自表B-1中所列的CDR1和CDR2序列。优选地，在这方面，存在的剩余CDR序列适当地选自与表B-1中所列的相应CDR序列的至少一个具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%序列同一性的CDR序列；和/或选自与表B-1中所列的相应CDR序列具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR序列。
甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，所有三个存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自表B-1中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列。
同样地，一般地，表B-1中所列的CDR的组合(即表B-1中相同行中提及的那些)是优选的。因此，当本发明的纳米抗体中的CDR是表B-1中提及的CDR序列或适当地选自与表B-1中所列的CDR序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%序列同一性的CDR序列；和/或选自与表B-1中所列的CDR序列具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR序列时,通常优选地其它CDR的至少一个和优选两个适当地选自属于表B-1中的相同组合的CDR序列(即表B-1中相同行中提及的)或适当地选自与属于相同组合的CDR序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，甚至更优选至少99%的序列同一性的CDR序列和/或选自与属于相同组合的CDR序列具有3、2或仅1个氨基酸差异的CDR序列。上述段落中显示的其它优选选择也用于表B-1中提及的CDR的组合。
因此，作为非限定性实例，本发明的纳米抗体可以例如包含与表B-1中提及的CDR1序列之一具有超过80%的序列同一性的CDR1序列、与表B-1中提及的CDR2序列(但属于不同的组合)之一具有3、2或1个氨基酸差异的CDR2序列，和CDR3序列。
本发明的一些优选纳米抗体可以例如包含：(1)与表B-1中提及的CDR1序列之一具有超过80%的序列同一性的CDR1序列；与表B-1中提及的CDR2序列(但属于不同的组合)之一具有3、2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表B-1中提及的CDR3序列(但属于不同的组合)之一具有超过80%的序列同一性的CDR3序列；或(2)与表B-1中提及的CDR1序列之一具有超过80%的序列同一性的CDR1序列；CDR2，和表B-1中所列的CDR3序列之一；或(3)CDR1序列；与表B-1中提及的CDR2序列之一具有超过80%的序列同一性的CDR2序列；和与表B-1中提及的属于与CDR2序列相同的组合的CDR3序列具有3、2或1个氨基酸差异的CDR3序列。
本发明的一些特别优选纳米抗体可以例如包含：(1)与表B-1中提及的CDR1序列之一具有超过80%的序列同一性的CDR1序列；与表B-1中提及的属于相同组合的CDR2序列具有3、2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表B-1中提及的属于相同组合的CDR3序列具有超过80%的序列同一性的CDR3序列；(2)CDR1序列；表B-1中所列的CDR2和与表B-1中所列的CDR3序列(其中CDR2序列和CDR3序列可属于不同的组合)。
本发明的一些甚至更优选纳米抗体可以例如包含：(1)与表B-1中提及的CDR1序列之一具有超过80%的序列同一性的CDR1序列；表B-1中提及的属于相同组合的CDR2序列；和表B-1中提及的属于不同组合的CDR3序列；或(2)表B-1中提及的CDR1序列；与表B-1中所列的属于相同组合的CDR2序列具有3、2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与表B-1中所列的属于相同或不同组合的CDR3序列具有超过80%的序列同一性的CDR3序列。
本发明的特别优选纳米抗体可以例如包含表B-1中提及的CDR1序列、与表B-1中提及的属于相同组合的CDR2序列具有超过80%的序列同一性的CDR2序列；和表B-1中提及的属于相同组合的CDR3序列。
在本发明的最优选纳米抗体中，存在的CDR1、CDR2和CDR3序列适当地分别选自表B-1中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列。
根据本发明的另一个优选但非限定性方面(a)CDR1具有1至12个氨基酸残基，通常2至9个氨基酸残基，例如5、6或7个氨基酸残基的长度；和/或(b)CDR2具有13至24个氨基酸残基，通常15至21个氨基酸残基的长度，例如16至17个氨基酸残基；和/或(c)CDR3具有2至35个氨基酸残基，通常3至30个氨基酸残基，例如6至23个氨基酸残基的长度。
在另一个优选但非限定性方面，本发明涉及纳米抗体，其中CDR序列(如本文中定义的)与SEQ ID NO：12至26的氨基酸序列(参见表A-1)的至少一个的CDR序列具有超过80%、优选超过90%，更优选地超过95%，例如99%或更高的序列同一性(如本文中定义的)。
通常，具有上述CDR序列的纳米抗体可以如本文中进一步描述的，优选具有也如本文中进一步描述的构架序列。
例如，如已提及的，存在于纳米抗体中的构架序列可如WO09/068627(通过引用并入本文)的第258至297页上一般性描述的。例如，它们可包含WO 09/068627的表A-5中所示的标志残基的一个或多个组合；并且FR1、FR2、FR3和FR4可分别包含WO 09/068627的表A-6、表A-7、表A-8和表A-9中所示的氨基酸残基。同样的，当本发明的ISV为纳米抗体时，它们可以属于KERE组(参见WO09/068627的第281至284页，该组的一些代表性FR1、FR2、FR3和FR4序列示于WO 09/068627的中表A-11/A-15、A-12、A-13和A-14)；属于GLEW组(参见WO 09/068627的第285至287页，该组的一些代表性FR1、FR2、FR3和FR4序列示于WO 09/068627的表A-16/A-20、A-17、A-18和A-19中)；或属于P、R、S 103组(参见WO 09/068627的第287至291页，该组的一些代表性FR1、FR2、FR3和FR4序列示于WO 09/068627的表A-21/A-25、A-22、A-23和A-24中)，其全都如WO 09/068627中所描述的，这些组的每一个的一些代表性序列示于WO 09/068627的表A-10中。也如WO 09/068627中所描述的，这些构架序列可包含一个或多个适当的人源化置换或(其它)置换以优化序列(也参见本文中的进一步的公开内容)。
再次地，一些特别优选但非限定性FR1、FR2、FR3和FR4序列(及其组合)分别为表B-1中描述的所述序列，或此类FR1、FR2、FR3和FR4序列的适当的变体(例如，与表B-1中提及的构架序列相比较在这样的FR1、FR2、FR3或FR4中存在少于5个，例如1、2、3、4或5个适当的氨基酸差异，其中氨基酸差异可如WO 09/068627中所描述的)，所述变体仍然基本上保持纳米抗体的期望的性质。
因此，例如并且如本文中所提及的，此类纳米抗体可以是天然存在的纳米抗体(来自任何适当的物种)、天然存在的VHH序列(即来自骆驼的适当的物种)或合成或半合成的氨基酸序列或纳米抗体，包括但不限于部分人源化的纳米抗体或VHH序列、完全人源化的纳米抗体或VHH序列、骆驼源化重链可变结构域序列以及已通过本文中提及的技术获得的纳米抗体。
因此，在一个具体的但非限定性的方面，本发明涉及人源化纳米抗体，其由4个构架区(分别地FR1至FR4)和3个互补决定区(分别地CDR1至CDR3)组成，其中CDR1至CDR3如本文中所定义的并且其中人源化纳米抗体包含至少一个人源化置换(如本文中定义的)，具体地在其构架序列(如本文中定义的)的至少一个中包含至少一个人源化置换。
同样地，除了如本文中所描述的人源化置换外，本发明的ISV和具体地纳米抗体还可包含一个或多个其它/另外的置换。再次地，此类其它/另外的置换的一些优选但非限定性实例根据本文中的进一步描述将变得清楚明了，并且例如可包含一个或多个下列置换(和优选地基本上由所述置换组成)：
(a)一个或多个保守氨基酸置换；和/或
(b)一个或多个置换，其中某些位置上的“骆驼”氨基酸残基被存在于所述位置上的不同“骆驼”氨基酸残基替代，关于此可参考例如PCT/EP2008/066365(于2009年6月4日公布为WO 09/068627)的表A-6至A-9，所述表提及了存在于野生型VHH的每一个氨基酸位置上的各种骆驼源化残基。此类置换甚至可以包括利用存在于野生型VHH的标志位置上的另一个氨基酸残基对存在于标志位置上的氨基酸残基的适当置换(关于此可参考例如PCT/EP2008/066365的表A-6至A-9)；和/或
(c)一个或多个改善蛋白质的(其它)性质的置换，例如增强蛋白质贮存条件下的长期稳定性和/或性质的置换。此类置换可以例如但不限于为防止或减少氧化事件(例如，甲硫氨酸残基的)的置换；防止或减少焦谷氨酸盐形成的置换；和/或防止或减少天冬氨酸或天冬酰胺(例如，DG、DS、NG或NS基序的)的异构化或脱酰胺的置换。关于此类置换，参考例如国际申请WO 09/095235，该申请总体上涉及通过此类置换稳定单免疫球蛋白可变结构域的方法，并且还给出适当的置换的一些具体实例(参见例如第4和5页以及第10至15页)。这样的置换的一个实例可以是用NN基序替代位置82a和82b上的NS基序。
在另一个优选但非限定性方面，本发明涉及其中CDR序列与SEQ ID NO：12至26的氨基酸序列(参见表A-1)的至少一个的CDR序列具有70%的氨基酸同一性，优选至少80%的氨基酸同一性，更优选至少90%的氨基酸同一性，例如95%或更高的氨基酸同一性或甚至基本上100%的氨基酸同一性的纳米抗体。该氨基酸同一性程度可以例如通过测定所述纳米抗体与SEQ ID NO：12至26(参见表A-1)的一个或多个序列之间的氨基酸同一性的程度(以本文中描述的方式)来测定，其中不考虑形成构架区的氨基酸残基。此类纳米抗体可如本文中进一步描述的。
在另一个优选但非限定性方面，本发明涉及具有这样的氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：12至26(参见表A-1)或选自与SEQ ID NO：12至26的氨基酸序列(参见表A-1)的至少一个具有超过80%，优选超过90%，更优选地超过95%，例如99%或更高的序列同一性(如本文中定义的)的氨基酸序列。
本发明的另一个优选但非限定性方面涉及SEQ ID NO：12至26的纳米抗体(参见表A-1)的人源化变体，该变体与相应的天然VHH序列相比较，包含至少一个人源化置换(如本文中定义的)，具体地在其构架序列(如本文中定义的)的至少一个中包含一个人源化置换。
本发明的多肽包含至少一个本发明的纳米抗体或基本上由其组成。本发明的多肽一些优选但非限定性实例示于SEQ ID NO：147至327，更优选地HER3MS00135(SEQ ID NO：282)、HER3MS00212(SEQ ID NO：319)或HER3MS00215(SEQ ID NO：322)(参见表A-2)。应当指出，下表中所列的序列中的一些序列(SEQ ID NO：224-231,241-281,318和SEQ ID NO：323-327)包含C-末端标记物(例如6个H的His-标记物)。实际上，也可使用无(C末端)标记物的此类多肽(并且例如对于治疗目的，优选使用)，并且为了测定与此类序列的每一个的序列同一性的程度，还应当不考虑(C末端)标记物。
表A-2：优选多肽或化合物序列(在本文中也称为具有特定名称或SEQ ID NO：X的序列，其中X为指称相关氨基酸序列的编号)
本领域技术人员很清楚，在本文中提及为“优选的”(或“更优选的”、“甚至更优选的”等)的纳米抗体在用于本文中描述的多肽中也是优选的(或更优选的，或甚至更优选的，等等)。因此，包含本发明的一个或多个“优选的”纳米抗体或基本上由其组成的多肽通常是优选的，并且包含本发明的一个或多个“更优选的”纳米抗体或基本上由其组成的多肽通常是更优选的，等等。
一般地，包含单个纳米抗体(例如单个本发明的纳米抗体)或基本上由其组成的蛋白质或多肽在本文中称为“单价”蛋白质或多肽或称为“单价构建体”。包含两个或更多个纳米抗体(例如至少两个本发明的纳米抗体或至少一个本发明的纳米抗体和至少一个其它纳米抗体)或基本上由其组成的蛋白质和多肽在本文中称为“多价”蛋白质或多肽或称为“多价构建体”，并且此类蛋白质或多肽与相应的本发明的单价纳米抗体相比较提供了某些有利方面。此类多价构建体的一些非限定性实例根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。
根据一个具体但非限定性方面，本发明的多肽包含至少两个本发明的纳米抗体，例如两个或三个本发明的纳米抗体或基本上由其组成。如本文中进一步描述的，此类多价构建体与包含单个本发明的纳米抗体或基本上由其组成的蛋白质或多肽相比较提供了某些有利方面，例如大大增强的对于HER3的亲合力。基于本文的公开内容此类多介构建体对于本领域技术人员来说是清楚明了；此类多价纳米抗体构建体的一些优选但非限定性实例为SEQ ID NO：147至327的构建体，更优选地HER3MS00135(SEQ ID NO：282)、HER3MS00212(SEQ ID NO：319)或HER3MS00215(SEQ ID NO：322)。根据另一个具体但非限定性方面，本发明的多肽包含至少一个本发明的纳米抗体和至少一个其它结合单元(即针对另一种表位、抗原、靶、蛋白质或多肽)其优选也为纳米抗体，或基本上由其组成，。此类蛋白质或多肽在本文中也称为“多特异性”蛋白质或多肽或称为“多特异性构建体”，并且此类蛋白质或多肽与本发明的相应的单价纳米抗体相比较可提供某些有利方面(根据一些优选但非限定性的多特异性构建体在本文中的进一步论述，这将变得清楚明了)。此类多特异性构建体，基于本文中的公开内容，对于本领域技术人员来说是清楚明了的；此类多特异性纳米抗体构建体的非限定性实例为SEQ ID NO：147至327的构建体，更优选地HER3MS00135(SEQ ID NO：282)、HER3MS00212(SEQ ID NO：319)或HER3MS00215(SEQ ID NO：322)。
根据另一个具体的但非限定性方面，本发明的多肽包含至少一个本发明的纳米抗体、任选地一个或多个其它纳米抗体和至少一个其它氨基酸序列(例如蛋白质或多肽)(所述氨基酸序列赋予本发明的纳米抗体和/或所得的融合蛋白至少一个期望的性质)，或基本上由其组成。再次地，此类融合蛋白与本发明的对应单价价纳米抗体相比较可提供某些有利方面。此类氨基酸序列和此类融合构建体的一些非限定性实例根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。
也可能组合上述方面的两个或更多个方面，例如以提供包含两个本发明的纳米抗体和一个其它纳米抗体，和任选地一个或多个其它氨基酸序列的三价双特异性构建体。此类构建体的其它非限定性实例以及在本发明的说明书中是特别优选的一些构建体根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。
在上述构建体中，可将一个或多个纳米抗体和/或其它氨基酸序列彼此直接连接和/或适当地通过一个或多个接头序列彼此连接。此类接头的一些适当的但非限定性的实例根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。
在本发明的一个具体方面，本发明的纳米抗体或包含至少一个本发明的纳米抗体的本发明的化合物、构建体或多肽，与本发明的相应氨基酸序列相比较，可具有增加的半衰期。此类纳米抗体、化合物和多肽的一些优选但非限定性实例，基于本文中的进一步的公开内容，对于本领域技术人员来说将变得清楚明了，并且例如包含已被化学修饰以增加其半衰期(例如，通过PEG化)的本发明的纳米抗体序列或多肽；包含至少一个用于结合血清蛋白(例如血清白蛋白，参见例如EP 0368684B1,第4页)的另外的结合位点的本发明的氨基酸序列；或包含至少一个本发明的纳米抗体的本发明的多肽，所述纳米抗体连接于至少一个增加本发明的纳米抗体的半衰期的部分(和具体地至少一个氨基酸序列)。包含此类半衰期延长部分或氨基酸序列的本发明的多肽的实例，基于本文中的进一步的公开内容，对于本领域技术人员来说将变得清楚明了；并且例如包括，非限制性地，这样的多肽：其中本发明的一个或多个纳米抗体适当地连接于一个或多个血清蛋白或其片段(例如血清白蛋白或其适当的片段)或一个或多个可结合血清蛋白的结合单元(例如，可结合血清蛋白例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白例如IgG，或转铁蛋白的纳米抗体或(单)结构域抗体)；这样的多肽：其中本发明的纳米抗体连接于Fc部分(例如人Fc)或其适当的部分或片段；或这样的多肽：其中一个或多个本发明的纳米抗体适当地连接于一个或多个可结合血清蛋白的小蛋白质或肽。
再次地，如对于本领域技术人员来说是清楚明了的，此类纳米抗体、化合物、构建体或多肽可包含一个或多个另外的基团、残基、部分或结合单元，例如一个或多个其它氨基酸序列，具体地一个或多个另外的纳米抗体(即不针对HER3的)，以提供三价多特异性纳米抗体构建体。
通常地，具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体(或包含所述纳米抗体的化合物、构建体或多肽)优选具有为本发明的相应氨基酸序列本身的半衰期的至少1.5倍，优选至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。例如，具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体、化合物、构建体或多肽可具有与本发明的相应氨基酸序列本身相比较增加了超过1小时，优选超过2小时，更优选地超过6小时，例如超过12小时或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
在本发明的优选但非限定性方面，本发明的此类纳米抗体、化合物、构建体或多肽在人中显示至少约12小时，优选至少24小时，更优选至少48小时，甚至更优选至少72小时或更长的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可具有至少5天(例如约5至10天)，优选至少9天(例如约9至14天)，更优选至少约10天(例如约10至15天)，或至少约11天(例如约11至16天)，更优选至少约12天(例如约12至18天或更多天)，或超过14天(例如约14至19天)的半衰期。此类半衰期延长的构建体，基于本文中的公开内容，对于本领域技术人员来说是清楚明了的；此类多特异性纳米抗体构建体的一些优选但非限定性实例为SEQ ID NO：147至327的构建体，更优选为HER3MS00135(SEQ ID NO：282)、HER3MS00212(SEQ ID NO：319)或HER3MS00215(SEQ ID NO：322)。
具体地，包含一个或多个本发明的纳米抗体的多肽优选地是这样的多肽：它们：
-以10-5至10-12摩尔/升或更低，优选10-7至10-12摩尔/升或更低以及更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即以105至1012升/摩尔或更高，优选107至1012升/摩尔或更高以及更优选108至1012升/摩尔的缔合常数(KA))结合HER3；
和/或是这样的多肽：它们：
-以102M-1s-1至约107M-1s-1，优选103M-1s-1至107M-1s-1，更优选地104M-1s-1至107M-1s-1，例如105M-1s-1至107M-1s-1的kon-率结合HER3；
和/或是这样的多肽：它们：
-以1s-1(t1/2=0.69s)至10-6s-1(提供具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合物)，优选地10-2s-1至10-6s-1，更优选地10-3s-1至10-6s-1，例如10-4s-1至10-6s-1的koff率结合HER3。
优选地，仅包含一个本发明的氨基酸序列的多肽优选是这样的多肽：其将以低于500nM，优选低于200nM，更优选地低于10nM，例如低于1nM的亲和力结合HER3。在这方面，本领域技术人员来说将清楚：包含两个或更多个本发明的纳米抗体的多肽可以以与仅包含一个本发明的所宽大酸序列的多肽相比较增强的亲合力结合HER3。
根据本文中的进一步描述和实施例，本发明的氨基酸序列或多肽对HER3的结合的一些优选IC50值将变得清楚明了明了。
根据本发明的该优选方面的其它多肽可以例如选自与SEQ IDNO：147至327的一个或多个氨基酸序列具有超过80%，优选超过90%，更优选地超过95%，例如99%或更高的“序列同一性”(如本文中定义的)的氨基酸序列，更优选地HER3MS00135(SEQ ID NO：282)、HER3MS00212(SEQ ID NO：319)或HER3MS00215(SEQ ID NO：322)(参见表A-2)，其中所述氨基酸序列内包含的纳米抗体优选如本文中进一步描述的。
本发明的另一个方面涉及编码本发明的氨基酸序列(例如本发明的ISV或纳米抗体)或包含所述氨基酸序列的本发明的多肽的核酸。再次地，如本文中通常对于本发明的核酸所描述的，这样的核酸可以以遗传构建体(如本文中定义的)的形式存在。
根据本发明的优选方面的其它核酸可以例如选自与SEQ ID NO：27至41的一个或多个核酸序列(参见图1)具有超过80%，优选超过90%，更优选地超过95%，例如99%或更高的“序列同一性”(如本文中定义的)的核酸序列。
在另一个方面，本发明涉及宿主或宿主细胞，所述宿主或宿主细胞表达或能够表达本发明的氨基酸序列(例如纳米抗体)和/或包含所述氨基酸序列的本发明的多肽；和/或包含本发明的核酸。此类宿主或宿主细胞的一些优选但非限定性实例根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。
本发明的另一个方面涉及制品或组合物，所述制品或组合物，即取决于组合物的期望的用途，包含或包括至少一种本发明的氨基酸序列，至少一种本发明的多肽和/或至少一种本发明的核酸，和任选地本身公知的此类组合物的一个或多个其它组分。这样的制品或组合物可以例如为药物组合物(如本文中所描述的)、兽医用组合物或用于诊断用途的制品或组合物(也如本文中所描述的)。此类制品或组合物的一些优选但非限定性实例根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。
本发明还涉及用于制备或产生本文中描述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、制品和组合物的方法。此类方法的一些优选但非限定性实例根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。
本发明还涉及本文中描述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、宿主细胞、制品和组合物的应用和用途，以及用于预防和/或治疗与HER3相关的疾病和病况的方法。一些优选但非限定性应用和用途根据本文中的进一步描述将变得清楚明了。
本发明的其它方面、实施方案、有利方面和应用根据下文中的进一步描述也将变得清楚明了。
通常，应当指出，本文中使用的术语纳米抗体在其最广意义上不限于特定生物学来源或特定制备方法。例如，如在下文中将更详细地论述的，本发明的纳米抗体通常可利用WO 08/020079的第61和62页提及的技术(1)至(8)的任何技术，或任何其它本身公知的适当的技术来获得。纳米抗体的一个优选种类相应于天然存在的针对HER3的重链抗体的VHH结构域。如本文中进一步描述的，此类VHH序列通常可通过如下步骤来产生或获得：用HER3适当地免疫骆驼的物种(即以产生针对HER3的免疫反应和/或重链抗体)，通过获得所述骆驼的适当的生物样品(例如血液样品、血清样品或B细胞的样品)，和通过使用任何适当的本身公知的技术，始于所述样品，产生针对HER3的VHH结构域。此类技术对于本领域技术人员来说是清楚明了的和/或在本文中进行一步描述。
或者，此类天然存在的针对HER3的VHH结构域，可以例如通过使用一个或多个本身公知的筛选技术，使用HER3，或至少一个其部分、片段、抗原决定簇或表位，通过筛选骆驼VHH序列的天然文库来从这样的文库获得。此类文库和技术例如描述于WO 99/37681、WO01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694。或者，可使用来源于天然VHH文库的改进的合成或半合成的文库，例如利用技术例如随机诱变和/或CDR改组(如例如WO 00/43507中描述的)从天然VHH文库获得VHH文库。
因此，在另一个方面，本发明涉及用于产生针对HER3的纳米抗体的方法。在一个方面，所述方法至少包括步骤：
a)提供纳米抗体序列的组、集合或文库；和
b)筛选纳米抗体的所述组、集合或文库以选择可结合HER3和/或具有对于HER3的亲和力的纳米抗体序列；
和
c)分离可结合HER3和/或具有对于HER3的亲和力的纳米抗体或纳米抗体。
在这样的方法中，纳米抗体序列的组、集合或文库可以是纳米抗体序列的天然组、集合或文库；纳米抗体序列的合成或半合成的组、集合或文库；和/或已经历亲和力成熟的纳米抗体序列的组、集合或文库。
在本方法的优选方面，纳米抗体序列的组、集合或文库可以为纳米抗体序列的免疫组、集合或文库，具体地VHH序列的免疫组、集合或文库，其来源于已用HER3或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇例如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其它表位适当地免疫的骆驼的物种。在一个具体方面，所述抗原决定簇可以为细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
在上述方法中，可将纳米抗体或VHH序列的组、集合或文库展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物(例如酵母)，例如以帮助筛选。用于展示和筛选纳米抗体序列(其组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体，例如基于本文中的进一步的公开内容，对于本领域技术人员来说是清楚明了。也参考Hoogenboom的综述Nature Biotechnology,23,9,1105-1116(2005)。
在另一个方面，产生纳米抗体序列的方法包括至少如下步骤：
a)提供来源于表达免疫球蛋白序列的骆驼的物种的细胞的集合或样品；
b)筛选细胞的所述集合或样品以选择(i)表达可结合HER3和/或具有对于HER3的亲和力的免疫球蛋白序列的细胞；和(ii)表达重链抗体的细胞，其中步骤(i)和(ii)可基本上作为单个筛选步骤或作为两个独立的筛选步骤以任何适当的顺序来进行，以提供至少一个表达可结合HER3和/或具有对于HER3的亲和力的重链抗体的细胞；
和
c)(i)从所述细胞分离存在于所述重链抗体中的VHH序列；或(ii)从所述细胞分离编码存在于所述重链抗体中的VHH序列的核酸序列，然后表达所述VHH结构域。
在根据该方面的方法中，细胞的集合或样品可以例如为B细胞的集合或样品。同样地，在该方法中，细胞的样品可以来源于已用HER3或基于其或来源于其的适当的抗原决定簇例如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其它表位适当免疫的骆驼。在一个具体方面，所述抗原决定簇可以为细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
上述方法可以以任何适当的方式来进行，这对于本领域技术人员来说是清楚明了的。参考例如EP 0542810、WO 05/19824、WO04/051268和WO 04/106377。优选使用流式细胞术例如FACS进行步骤b)的筛选。为此，参考例如Lieby等人,Blood,第97卷,No.12,3820。具体参考Ablynx N.V的国际申请WO 06/079372中描述的所谓的技术。
在另一个方面，用于产生针对HER3的氨基酸序列的方法可包括至少如下步骤：
a)提供编码重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列的组、集合或文库；
b)筛选核酸序列的所述组、集合或文库以选择编码可结合HER3和/或具有对于HER3的亲和力的重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列；
和
c)分离所述核酸序列，然后分别表达存在于所述重链抗体中的VHH序列或表达所述纳米抗体序列。
在这样的方法中，编码重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列的组、集合或文库可以例如为编码重链抗体或VHH序列的天然组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；编码纳米抗体序列的合成或半合成的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；和/或编码已经历亲和力成熟的纳米抗体序列的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库。
在该方法的优选方面，核酸序列的组、集合或文库可以为编码来源于已用HER3或用基于其或来源于其的适当抗原决定簇例如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其它表位适当地免疫的骆驼的重链抗体或VHH序列的核酸序列的免疫组、集合或文库。在一个具体方面，所述抗原决定簇可以为细胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。
在上述方法中，核苷酸序列的组、集合或文库可展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物(例如酵母)上，例如以帮助筛选。用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列(其组、集合或文库)的适当方法、技术和宿主生物体，例如基于本文中的进一步的公开内容，对于本领域技术人员来说是清楚明了的。也参考WO03054016和参考Hoogenboom在Nature Biotechnology,23,9,1105-1116(2005)中的综述。
如对于本领域技术人员来说将清楚明了的，本文中描述的方法的筛选步骤还可作为选择步骤来进行。因此，如本说明书中所用，术语“筛选”可包括选择、筛选或选择和/或筛选技术的任何适当的组合。同样地，当使用序列的组、集合或文库时，其可包含任何适当数目的序列，例如1、2、3或约5、10、50、100、500、1000、5000、104、105、106、107、108或更多个序列。
同样地，氨基酸序列的上述组、集合或文库中的一个或多个或所有序列可通过合理的或半经验方法例如计算机建模技术或生物统计学或数据挖掘技术来获得或定义。
此外，这样的组、集合或文库可包括一个、二个或更多个彼此互为变体的序列(例如具有设计的点突变或具有随机化的位置)、包含从多组天然多样化序列(例如免疫文库)或多样化序列的任何其它来源衍生的多个序列(如例如Hoogenboom等人,Nat Biotechnol23：1105,2005和Binz等人,Nat Biotechnol 2005,23：1247中描述的)。可将这样的序列的组、集合或文库展示在噬菌体颗粒、核糖体、细菌、酵母细胞、哺乳动物细胞的表面，以及在这些载体内连接于编码氨基酸序列的核苷酸序列。这使得这样的组、集合或文库易于进行分离本发明的期望的氨基酸序列的选择法。更常见，当将序列展示在适当的宿主或宿主细胞上时，也可能(和惯常地)首先从所述宿主或宿主细胞分离编码期望的序列的核苷酸序列，随后通过适当地在适当的宿主生物体中表达所述核苷酸序列来获得期望的序列。再次地，这可以任何适当的本身公知的方式来进行，这对于本领域技术人员来说是清楚明了的。
本发明还涉及VHH序列或纳米抗体序列，所述序列通过上述方法或可选择地通过包括上述方法之一和另外地至少测定所述VHH序列或纳米抗体序列的核苷酸序列或氨基酸序列的步骤；和以本身公知的方式(例如通过在适当的宿主细胞或宿主生物体中表达或通过化学合成)表达或合成所述VHH序列或纳米抗体序列的步骤的方法获得。
如本文中所提及的，本发明的纳米抗体的特别优选种类包括具有这样的氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列相应于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列，但考虑到更好的产率或更的稳定性，已例如被“人源化”或另外地序列优化，即通过使用WO 08/020079的第63页提及的技术用一个或多个存在于来自人的常规四链抗体的VH结构域中的相应位置上的氨基酸残基(例如上文中显示的)替代所述天然存在的VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基(具体地在构架序列内)，如在WO 08/020079的第63页上进一步描述的。本发明的纳米抗体的另一个特别优选的种类包括具有这样的氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列相应于天然存在的VH结构的氨基酸序列，但已被“骆驼源化的”，即通过使用WO08/020079的第63页提及的技术，用一个或多个存在于重链抗体的VHH结构域中的相应位置上的氨基酸残基替代来自常规四链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，如在WO 08/020079的第63页上进一步描述的。
用于始于天然存在的VH序列或优选VHH序列获得本发明的纳米抗体和/或编码所述抗体的核酸的其它适当的方法和技术对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且可以例如包括WO 08/00279的第64页提及的技术。如本文中提及的，纳米抗体的具体特征可在于一个或多个“标志残基”(如本文中所描述的)在一个或多个构架序列中的存在。
本发明的在其最广意义上还包括本发明的纳米抗体的衍生物。此类衍生物通常可通过本发明的纳米抗体和/或一个或多个形成本发明的纳米抗体的氨基酸残基的修饰(具体地通过化学和/或生物(例如酶促)修饰)来获得。
此类修饰的实例，以及纳米抗体序列内可以以这样的方式(即在蛋白质主链上但优选在侧链上)修饰的氨基酸残基的实例，可用于引入类修饰和的方法和技术以及此类修饰的潜在用途和有利方面对于本领域技术人员来说是清楚明了的。
例如，这样的修饰可包括一个或多个官能团、残基或部分，具体地一个或多个赋予本发明的纳米抗体一个或多个期望的性质或功能性的官能团、残基或部分，至本发明的纳米抗体内或上的引入(例如通过共价连接或以其它适当的方式)。此类官能团的实例对于本领域技术人员来说是清楚明了的。
例如，这样的修饰可包括一个或多个官能团的引入(例如通过共价结合或以任何其它适当的方式)，所述官能团增加本发明的纳米抗体的半衰期、溶解度和/或吸收，减小本发明的纳米抗体的免疫原性和/或毒性，消除或减弱本发明的纳米抗体的任何不期望的副作用和/或赋予本发明的纳米抗体和/或多肽其它有利性质和/或减少其不期望的性质；或两个或更多个上述方面的任意组合。此类官能团和用于引入其的技术的实例对于本领域技术人员来说将清楚明了的，并且通常可包括上文中引用的一般背景中提及的所有官能团和技术以及用于修饰药物蛋白质，具体地用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv和单结构域抗体)的本身公知的官能团和技术，关于其参考例如Remington's PharmaceuticalSciences,第16版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1980)。可将此类官能团例如直接(例如共价地)或任选地通过适当的接头或间隔子连接于本发明的纳米抗体，这再次地对于本领域技术人员来说是清楚明了的。
用于增加药物蛋白质的半衰期和/或减小其免疫原性的最广泛使用的技术之一包括连接适当的药学上可接受的聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般地，可使用PEG化的任何适当形式，例如本领域使用的用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv)的PEG化；参考例如Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；by Veronese和Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456(2003),by Harris和Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.,2,(2003)和WO 04/060965。用于蛋白质的PEG化的各种试剂也是商购可得的，例如来自Nektar Therapeutics,USA。
优选地，使用定点PEG化，具体地通过半胱氨酸残基(参见例如Yang等人,ProteinEngineering,16,10,761-770(2003)。例如，为此目的，可将PEG连接于天然存在于本发明的纳米抗体中的半胱氨酸残基，可修饰本发明的纳米抗体以适当地引入一个或多个半胱氨酸残基以连接PEG，或可将包含一个或多个用于PEG的连接的半胱氨酸残基的氨基酸序列融合于本发明的纳米抗体的N端和/或C端，全都使用对于本领域技术人员来说本身公知的蛋白质工程的技术。
优选地，对于本发明的纳米抗体和蛋白质，使用分子量超过5000，例如超过10,000和小于200,000，例如小于100,000；例如在20,000-80,000的范围内的PEG。
另一个通常不太优选的修饰包括N-连接的或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的部分，这取决于用于表达本发明的纳米抗体或多肽的宿主细胞。
另一种修饰可包括一个或多个可检测的标记物或其它信号产生性基团或部分的引入，这取决于标记纳米抗体的期望用途。用于连接、使用和检测它们的适当标记物和技术对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且例如包括但不限于荧光标记物、发磷光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物、放射性同位素、金属、金属螯合剂、金属阳离子、发色团和酶，例如WO 08/020079的第109页提及的。其它适当的标记物对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且例如包括可使用NMR或ESR光谱法检测的部分。
本发明的此类标记纳米抗体和多肽可以例如用于体外、体内或原位测定(包括本身公知的免疫测定例如ELISA、RIA、EIA和其它“夹心测定”等)以及体内诊断和成像目的，这取决于具体标记物的选择。
如对于本领域技术人员来说是清楚明了的，另一种修饰可包括螯合基团的引入，例如以螯合上文中提及的金属或金属阳离子之一。适当的螯合基团例如包括，非限制性地，二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
另一种修饰可包括作为特定结合对例如生物素-(链霉)抗生物素蛋白结合对的一个部分的官能团的引入。这样的官能团可用于将本发明的纳米抗体连接于与结合对的另一半结合的另一个蛋白质、多肽或化合物(即通过结合对的形成)。例如，可将本发明的纳米抗体缀合于生物素，和连接于缀合于抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的另一种蛋白、多肽、化合物或载体。例如，这样的缀合的纳米抗体可用作报道分子，例如这样的诊断系统：其中将可检测的信号产生性试剂缀合于抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。此类结合对可以例如还用于将本发明的纳米抗体结合于载体，包括适用于药用目的载体。一个非限定性实例为由Cao和Suresh,Journal of Drug Targetting,8,4,257(2000)描述的脂质体制剂。此类结合对还可用于将治疗活性剂连接于本发明的纳米抗体。
对于一些应用，具体地对于其中期望杀伤表达本发明的纳米抗体所针对的靶的细胞(例如在癌症的治疗中)，或期望减少或减缓这样的细胞的生长和/或增殖的那些应用中，还可将本发明的纳米抗体连接于毒素或毒性残基或部分。可连接于本发明的纳米抗体以提供-例如-细胞毒性化合物的毒性部分、化合物或残基的实例对于本领域技术人员来说是清楚明了的并且可以例如见于上文中和/或本文中的进一步描述中引用的现有技术中。一个实例为WO 03/055527中描述的所谓的ADEPTTM技术。
其它潜在化学和酶促修饰对于本领域技术人员来说是清楚明了的。还可引入此类修饰以进行研究目的(例如以研究功能-活性关系)。参考例如Lundblad和Bradshaw,Biotechnol.Appl.Biochem.,26,143-151(1997)。
优选地，衍生物是这样的衍生物：它们以如本文中定义的对于本发明的纳米抗体的亲和力(适当地测量和/或表示为KD-值(实际或表观)、KA-值(实际或表观)、kon-率和/或koff-率或可选择地测量和/或表示为IC50值，如本文中进一步描述的)结合HER3。
如上所述，本发明还涉及基本上由至少一种本发明的纳米抗体组成或包含其的蛋白质或多肽。“基本上由……组成”意指本发明的多肽的氨基酸序列与本发明的纳米抗体的氨基酸序列完全相同或相应于本发明的纳米抗体的氨基酸序列，所述本发明的纳米抗体的氨基酸序列在纳米抗体的氨基酸序列的氨基末端、在羧基末端或在氨基末端和羧基末端上添加了有限数目的氨基酸钱基，例如1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基和优选1-6个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5或6个氨基酸残基。
所述氨基酸残基可以变动、改变或另外地影响或可以不变动、改变或另外地影响纳米抗体的(生物学)性质以及可以将或可以不将其它功能性添加至纳米抗体。例如，此类氨基酸残基：
-可包含N末端Met残基，例如作为在异源宿主细胞或宿主生物体中表达的结果。
-可形成指导纳米抗体在合成后从宿主细胞分泌的信号序列或前导序列。适当的分泌前导肽对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且可如本文中进一步描述的。通常，这样的前导序列连接于纳米抗体的N端，尽管本发明在其最广意义上不限于此；
-可形成允许纳米抗体被导向和/或渗入或进入特定器官、组织、细胞或细胞的部分或区室，和/或允许纳米抗体渗入或穿过生物屏障碍例如细胞膜、细胞层例如上皮细胞层、肿瘤包括实体瘤、或血脑屏障的序列或信号。此类氨基酸序列的实例对于本领域技术人员来说将清楚明了的并且包括WO 08/020079的第112页上的段落c)中提及的那些氨基酸序列。
-可形成“标记物”，例如允许或帮助纳米抗体的纯化的氨基酸序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术。之后，可除去(例如通过化学或酶促切割)所述序列或残基以提供纳米抗体序列(为此目的，标记物可任选地通过可切割的接头序列连接于纳米抗体序列或包含可切割的基序)。此类残基的一些优选但非限定性实例为多个组氨酸残基、谷胱甘肽残基和myc-标记物(参见例如WO 06/12282的SEQ ID NO：31)。
-可以为一个或多个已被官能化和/或可用作官能团的连接位点的氨基酸残基。适当的氨基酸残基和官能团对于本领域技术人员来说是清楚明了的并且包括但不限于本文中提及的用于本发明的纳米抗体的衍生物的氨基酸残基和官能团。
根据另一个方面，本发明的多肽包含在其氨基末端、在其羧基末端或在其氨基末端和羧基末端上融合至至少一个其它氨基酸序列的本发明的纳米抗体(即以提供包含本发明的所述纳米抗体和一个或多个其它氨基酸序列的融合蛋白)。这样的融合蛋白在本文中也称为“纳米抗体融合蛋白”。
一个或多个其它氨基酸序列可以是任何适当的和/或期望的氨基酸序列。其它氨基酸序列可以变动、改变或另外地影响或可以不变动、改变或另外地影响纳米抗体的(生物学)性质以及可以将或可以不将其它功能性添加至本发明的纳米抗体或多肽。优选地，其它氨基酸序列是这样的氨基酸序列：其赋予本发明的纳米抗体或多肽一个或多个期望的性质或功能性。
例如，其它氨基酸序列还可提供第二结合位点，所述结合位点可针对任何期望的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位(包括但不限于相同的本发明的纳米抗体所针对的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位，或不同的蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇或表位)。
此类氨基酸序列的实例对于本领域技术人员来说将清楚明了的，并且通常可包含用于基于常规抗体及其片段(包括但不限于ScFv和单结构域抗体)的肽融合物的所有氨基酸序列。参考例如Holliger和Hudson的综述,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136(2005)。
例如，这样的氨基酸序列可以为增加本发明的多肽的半衰期、溶解度或吸收，减小其免疫原性或毒性，消除或减弱其不期望的副作用和/或赋予其其它有利性质和/或减少其不期望的性质(与本发明的纳米抗体本身相比较)的氨基酸。此类氨基酸序列的一些非限定性实例为血清蛋白，例如人血清白蛋白(参见例如WO 00/27435)或半抗原分子(例如被循环抗体识别的抗原，参见例如WO 98/22141)。
具体地，本领域中已描述了将免疫球蛋白的片段(例如VH结构域)连接于血清白蛋白或其片段可用于增加半衰期。参考例如WO00/27435和WO 01/077137。根据本发明，本发明的纳米抗体优选直接连接于或通过适当的接头，具体地通过适当的肽接头连接于血清白蛋白(或其适当的片段)，以便本发明的多肽可表达为基因融合物(蛋白质)。根据一个具体的方面，本发明的纳米抗体可连接于至少包含血清白蛋白的结构域III或其部分的血清白蛋白的片段。参考例如AblynxN.V的WO 07/112940。
或者，其它氨基酸序列可提供针对血清蛋白(例如，人血清白蛋白或另一种血清蛋白例如IgG)的第二结合位点或结合单元，以便提供增加的血清半衰期。此类氨基酸序列例如包括下文中描述的纳米抗体，以及WO 91/01743、WO 01/45746和WO 02/076489中描述的小肽和结合蛋白，以及WO 03/002609和WO 04/003019中描述的dAb。也参考Harmsen等人,Vaccine,23(41)；4926-42,2005以及EP 0368684，以及WO 08/028977、WO 08/043821、WO08/043822、WO2008/068280和WO 2009/127691)。
此类氨基酸序列可以具体地针对血清白蛋白(更具体地人血清白蛋白)和/或针对IgG(更具体地人IgG)。例如，此类氨基酸序列可以为针对(人)血清白蛋白的氨基酸序列和可结合(人)血清白蛋白上未参与血清白蛋白对FcRn的结合的氨基酸残基的氨基酸序列(参见例如WO 06/0122787)和/或能够结合血清白蛋白上不形成血清白蛋白的结构域III的部分的氨基酸残基的氨基酸序列(再次参见例如WO06/0122787)；具有或可提供增加的半衰期的氨基酸序列(参见例如Ablynx N.V.的WO 08/028977)；与来自至少一个哺乳动物物种，具体地至少一个灵长类动物物种(例如，但不限于，来自猕猴属的猴子(例如，具体地，食蟹猴(成束猴)和/或恒河猴(Macaca mulatta))和狒狒(豚尾狒狒))的血清白蛋白交叉反应的针对人血清白蛋白的氨基酸序列，再次参考WO 08/028977；可以以不依赖于pH的方式结合血清白蛋白的氨基酸序列(参见例如Ablynx N.V.的标题为“Amino acid sequences thatbind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH，compounds comprising the same，and uses thereof”的WO 08/043821)和/或为条件化粘合剂的氨基酸序列(参见例如Ablynx N.V.的标题为“Amino acid sequences that bindto a desired molecule in a conditional manner”的WO 08/043822)。
根据另一个方面，一个或多个其它氨基酸序列可包含常规四链抗体(具体地人抗体)和/或重链抗体的一个或多个部分、片段和/或结构域。例如，尽管通常不太优选，但本发明的纳米抗体可连接于(再次地任选地通过接头序列)常规(优选人)VH或VL结构域，或VH或VL结构域的天然或合成类似物(包括但不限于其它(单)结构域抗体，例如由Ward等人(同上)描述的dAb)。
还可将至少一个纳米抗体连接于(任选地通过接头序列一个或多个(优选人)CH1、CH2和/或CH3结构域。例如，可以将连接于适当的CH1结构域的纳米抗体例如与适当的轻链一起使用以产生与常规Fab片段或F(ab’)2片段类似的抗体片段/结构，但其中常规VH结构域的一个或(在F(ab’)2片段的情况下)一个或两个已被本发明的纳米抗体替代。同样地，可将两个纳米抗体连接于(任选地通过接头)CH3结构域以提供具有增加的体内半衰期的构建体。
根据本发明的多肽的一个具体方面，可将本发明的一个或多个纳米抗体连接于(任选通过适当的接头或铰链区)一个或多个恒定结构域(例如，2或3个可用作Fc部分的部分/用于形成Fc部分的恒定结构域)，连接于Fc部分和/或连接于一个或多个可赋予本发明的多肽一个或多个效应子功能和/或可赋予结合一个或多个Fc受体的能力的抗体部分、片段或结构域。例如，为此目的并且不限于此，一个或多个其它氨基酸序列可包含抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域，例如来自重链抗体(如本文中所描述的)和更优选来自常规人四链抗体；和/或可形成Fc区域和(其部分)，例如来自IgG(例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，来自IgE或来自另一个人Ig例如IgA、IgD或IgM。例如，WO 94/04678描述了包含骆驼VHH结构域或其人源化衍生物的重链抗体(即纳米抗体)，其中骆驼科CH2和/或CH3结构域已被人CH2和CH3结构域替代，以提供由2个重链(每一个包含纳米抗体以及CH2和CH3结构域(但无CH1结构域))组成的免疫球蛋白，该免疫球蛋白具有由CH2和CH3结构域提供的效应子功能并且该免疫球蛋白可在任何轻链不存在的情况下起作用。可适当地连接于本发明的纳米抗体以提供效应子功能的其它氨基酸序列对于本领域技术人员来说将清楚明了的，并且可基于期望的效应子功能来选择。参考例如WO 04/058820、WO99/42077、WO 02/056910和WO 05/017148，以及Holliger和Hudson的综述(同上)；以及参考Ablynx N.V.的标题为“Constructs comprising single variable domains and an Fc portion derived fromIgE”的非预公布的美国临时申请，其提交于2007年12月4日。将本发明的纳米抗体偶联至Fc部分也可导致与本发明的相应纳米抗体相比较增加的半衰期。对于一些应用，赋予增加的半衰期而无任何生物学上显著的效应子功能的Fc蛋白和/或恒定结构域(即CH2和/或CH3结构域)的使用也可以是适当的或甚至是优选的。其它适当的包含一个或多个纳米抗体或一和一个或多个恒定结构域的具有增加的体内半衰期的其它适当的构建体对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且可以例如包含两个连接于(任选地通过接头序列)CH3结构域的纳米抗体。一般地，任何具有增加的半衰期的融合蛋白或衍生物优选具有超过50kD(肾吸收的截留值)的分子量。
在另一个具体的但非限定性方面，为了形成本发明的多肽，可将本发明的一个或多个氨基酸序列连接于(任选地通过接并没有或铰链区)天然存在的、合成或半合成的恒定结构域(或其类似物、变体、突变体、部分或片段)，该恒定结构域具有减小的(或基本上无)自身缔合成二聚体的倾向(即与天然存在于常规四链抗体中的恒定结构域相比较)。此类单体(即非自身缔合)Fc链变体或其片段对于本领域技术人员来说是清楚明了的。例如，Helm等人,J Biol Chem 19962717494,描述了可用于本发明的多肽链的单体Fcε链变体。
同样地，此类单体Fc链变体优选是这样的变体：它们仍然能够结合补体或相关Fc受体(取决于它们所源自的Fc部分)，和/或是这样的变体：它们仍然具有它们所源自的Fc部分的一些或全部效应子功能(或在下降的水平上仍然适用于期望的用途)。或者，在这样的本发明的多肽链中，单体Fc链可用于赋予多肽链增加的半衰期，在该情况下单体Fc链也可不具有或基本上不具有效应子功能。
还可将本发明的二价/多价、双特异性/多特异性或双互补位/多互补位多肽连接于Fc部分，以提供在2007年12月4提交的标题为“immunoglobulin constructs”的非预公布的美国临时申请US61/005,331中描述的类型的多肽构建体。
其它氨基酸序列也可形成指导本发明的纳米抗体或多肽在合成后从宿主分泌的信号序列或前导序列(例如以提供本发明的多肽的pre-、pro-或prepro-形式，取决于用于表达本发明的多肽的宿主细胞)。
其它氨基酸序列还可形序列或信号，所述序列或信号允许本发明的纳米抗体或多肽导向和/或渗入或进入特定器官、组织、细胞或细胞的部分或区室，和/或允许本发明的纳米抗体或多肽渗入或穿过生物学屏障例如细胞膜、细胞层例如上皮细胞层、肿瘤包括实体瘤或血脑屏障。此类氨基酸序列的适当实例对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且例如包括但不限于WO 08/020079的第118页提及的所述序列。对于一些应用，具体地对于其中期望杀伤表达本发明的纳米抗体所针对的靶的细胞(例如在癌症的治疗中)，或期望减少或减缓这样的细胞的生长和/或增殖的那些应用中，还可将本发明的纳米抗体连接于(细胞)毒性蛋白或多肽。可连接于本发明的纳米抗体以提供-例如-本发明的细胞毒性多肽的这样的毒性蛋白和多肽的实例对于本领域技术人员来说是清楚明了的并且可以例如见于上文中和/或本文中的进一步描述中引用的现有技术中。一个实例为WO 03/055527中描述的所谓的ADEPTTM技术。
根据一个优选但非限定性方面，所述一个或多个其它氨基酸序列包含至少一个其它纳米抗体，以提供包含至少2个，例如3、4、5或更多个纳米抗体的本发明的多肽，其中所述纳米抗体可任选地通过一个或多个接头序列(如本文中定义的)连接。如WO 08/020079的第119和120页所描述的，包含两个或更多个纳米抗体(其中至少一个是本发明的纳米抗体)的本发明的多肽在本文中也称为本发明的“多价”多肽，并且存在于这样的多肽中的纳米抗体在本文中也称为以“多价形式”存在。例如，本发明的“二价”和“三价”多肽可如WO 08/020079的第119和120页上进一步描述的。
包含至少2个纳米抗体(其中至少一个纳米抗体针对第一抗原(即针对HER3)，并且至少一个纳米抗体针对第二抗原(即与HER3不同))的本发明的多肽也称为本发明的“多特异性”多肽，并且存在于此类多肽中的纳米抗体在本文中也被称为以“多特异性形式”存在。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽为包含至少一个针对第一抗原(即HER3)的纳米抗体和至少一个针对第二抗原(即与HER3不同的)的其它纳米抗体，而本发明的“三特异性”多肽为包含至少一个针对第一抗原(即HER3)的纳米抗体、至少一个针对第二抗原(即与HER3不同的)的其它纳米抗体和至少一个针对第三抗原(即与HER3和所述第二抗原都不同的)的其它纳米抗体的多肽；等等。
因此，以其最简单形式，本发明的双特异性多肽为本发明的二价多肽(如本文中定义的)，其包含针对HER3的第一纳米抗体和针对第二抗原的第二纳米抗体，其中所述第一和第二纳米抗体可任选地通过接头序列(如本文中定义的)连接；而本发明的三特异性多肽以其最简单形式为本发明的三价多肽(如本文中定义的)，其包含针对HER3的第一纳米抗体、针对第二抗原的第二纳米抗体和针对第三抗原的第三纳米抗体，其中所述第一、第二和第三纳米抗体可任选地通过一个或多个，具体地一个和多个，具体地两个接头序列连接。
然而，如根据上文中的描述将清楚明了的，在本发明的多特异性多肽可包含至少一个针对HER3的纳米抗体和任意数目的针对一个或多个与HER3不同的抗原的纳米抗体的意义上，本发明不限于此。
此外，虽然各种纳米抗体在本发明的多肽中的具体顺序或排列可能对本发明的最终多肽的性质(包括但不限于对于HER3或针对一个或多个其它抗原的亲和力、特异性或亲合力)具有一定影响包括在本发明的范围内，但所述顺序或排列通常不是至关重要的并且可由本领域技术人员基于本文中的公开内容，任选地在一些有限的常规实验之后来适当地选择。因此，当参考本发明的具体多价或多特异性多肽时，应当指出，除非另外明确地指出，否则这包括相关纳米抗体的任何顺序或排列。
最后，本发明的多肽包含两个或更多个纳米抗体和一个或多个其它氨基酸序列(如本文中提及的)也在本发明的范围内。
关于包含一个或多VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，也参考Conrath等人,J.Biol.Chem.,第276卷,10.7346-7350,2001；Muyldermans,Reviews in MolecularBiotechnology 74(2001),277-302；以及参考例如WO 96/34103和WO 99/23221。本发明的一些具体的多特异性和/或多价多肽的一些其它实例可见于本文中提及的Ablynx N.V.的申请中。
本发明的多特异性多肽的一个优选但非限定性实例包含至少一个本发明的纳米抗体和至少一个提供增加的半衰期的纳米抗体。此类纳米抗体可以例如为针对血清蛋白，具体人血清蛋白，例如人血清白蛋白、甲状腺素结合蛋白、(人)转铁蛋白、血纤蛋白原、免疫球蛋白例如IgG、IgE或IgM，或针对WO 04/003019中所列的血清蛋白之一的纳米抗体。在这些之中，可结合血清白蛋白(具体地人血清白蛋白)或IgG(具体地人IgG，参见例如Muyldermans的综述(同上)中描述的纳米抗体VH-1)的纳米抗体是特别优选的(虽然例如，对于小鼠或灵长类动物中的实验，可使用分别针对小鼠血清白蛋白(MSA)或来自所述灵长类动物的血清白蛋白或分别与其交叉反应的纳米抗体。然而，对于药物用途，针对人血清白蛋白或人IgG的纳米抗体通常是优选的)。提供增加的半衰期并且可用于本发明的多肽的纳米抗体包括针对WO04/041865、WO 06/122787及Ablynx N.V.的其它专利申请(例如上文中提及的那些专利申请)中描述的血清白蛋白的纳米抗体。
例如，用于本发明的提供增加的半衰期的一些优选纳米抗体包括可结合(人)血清白蛋白上不参与血清白蛋白对FcRn的结合的氨基酸残基的纳米抗体(参见例如WO 06/0122787)；能够结合血清白蛋白上不形成血清白蛋白的结构域III的部分的氨基酸残基的纳米抗体(参见例如WO 06/0122787)；具有或可提供增加的半衰期的纳米抗体(参见例如本文中提及的Ablynx N.V的WO 08/028977)；与来自至少一个哺乳动物的物种的血清白蛋白，具体地与至少一个灵长类动物的物种(例如，但不限于，来自猕猴属的猴子(例如，具体地，食蟹猴(成束猴)和/或恒河猴)和狒狒(豚尾狒狒))的血清白蛋白交叉反应的针对人血清白蛋白的氨基酸序列(参见例如Ablynx N.V.的WO 08/028977)；可以以不依赖于pH的方式结合血清白蛋白的纳米抗体(参见例如本文中提及的Ablynx N.V.的WO 2008/028977)和/或可以为条件化粘合剂的纳米抗体(参见例如Ablynx N.V.的WO 08/043822)。
提供增加的半衰期并且可用于本发明的多肽的一些特别优选纳米抗体包括WO06/122787中公开的纳米抗体ALB-1至ALB-10(参见表II和III)，其中ALB-8(WO 06/122787中的SEQ ID NO：62，也参见该申请的SEQ ID NO：11)是特别优选的。
包含至少一个本发明的纳米抗体和至少一个提供增加的半衰期的纳米抗体的本发明的多肽的一些优选但非限定性实例示于SEQ IDNO 147至327，更优选地HER3MS00135(SEQ ID NO：282)、HER3MS00212(SEQ ID NO：319)或HER3MS00215(SEQ ID NO：322)。
根据本发明的具体但非限定性方面，除了一个或多个本发明的纳米抗体外，本发明的多肽还包含至少一个针对人血清白蛋白的纳米抗体。
一般地，具有增加的半衰期的任何本发明的多肽(所述多肽包含一个或多个本发明的纳米抗体)和本发明的纳米抗体的或具有增加的半衰期的此类多肽的任何衍生物，优选具有为本发明的相应纳米抗体本身的半衰期的至少1.5倍，优选至少2倍，例如至少5倍、例如至少10倍或超过20倍的半衰期。例如，这样的具有增加的半衰期的衍生物或多肽可具有与本发明的相应纳米抗体本身相比较增加了超过1小时，优选超过2小时，更优选地超过6小时，例如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
在本发明的优选但非限定性方面，此类衍生物或多肽可在人中显示至少约12小时，优选至少24小时，更优选至少48小时，甚至更优选至少72小时或更长时间的血清半衰期。例如，此类衍生物或多肽可具有至少5天(例如约5至10天)，优选至少9天(例如约9至14天)，更优选至少约10天(例如约10至15天)，或至少约11天(例如约11至16天)，更优选至少约12天(例如约12至18天或更多天)或超过14天(例如约14至19天)的半衰期。
根据本发明的一个方面，多肽能够结合一个或多个可增加多肽的体内半衰期的分子。
本发明的多肽，通过结合抗降解和/或清除或隔离的分子，稳定性在体内得到增强，并且它们的半衰期得到增加。通常，一些分子为其本身具有长体内半衰期的天然存在的蛋白质。
在本发明的多肽中，可将一个或多个纳米抗体和一个或多个多肽直接彼此连接(如例如WO 99/23221中描述的)和/或可通过一个或多个适当的接头或间隔子彼此连接，或其任意组合。
用于多价和多特异性多肽的适当的间隔子或接头对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且通常可以为在本领域中用于连接氨基酸序列的任何接头或间隔子。优选地，所述接头或间隔子适合用于构建意欲用于药用的蛋白质或多肽。
一些特别优选的间隔子包括在本领域中用于连接抗体片段或抗体结构域的间隔子和接头。这类接头或间隔子包括上文引用的一般背景中提及的接头，以及例如在本领域中用于构建双链抗体或ScFv片段的接头(然而，在这方面，应当指出，虽然在双链抗体和ScFv片段中，所使用的接头序列应当具有使得相关VH和VL结构域能够结合在一起以形成完整抗原结合位点的长度、柔性程度和其它性质，但对本发明的多肽中使用的接头的长度或柔性没有特别的限制，因为每一个纳米抗体本身形成完整的抗原结合位点)。
例如，接头可以是适当的氨基酸序列，具体地具有1至50，优选1至30，例如1至10个氨基酸残基的氨基酸序列。此类氨基酸序列的一些优选实例包括gly-ser接头，例如(glyxsery)z类型的接头，例如(例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如WO 99/42077中描述的，以及本文中提及的Ablynx的申请中描述的GS30、GS15、GS9和GS7接头(参见例如WO 06/040153和WO 06/122825)，以及铰链-样区域，例如天然存在的重链抗体或类似序列中的铰链区(例如WO 94/04678中描述的)。
一些其它特别优选接头为聚丙氨酸(例如AAA)，以及接头GS30(WO 06/122825中的SEQ ID NO：85)和GS9(WO 06/122825中的SEQ ID NO：84)。
其它适当的接头通常包含有机化合物或聚合物，具体地适用于用于药用的蛋白质的所述有机化合物或聚合物。例如，聚(乙二醇)部分已被用于连接抗体结构域，参见例如WO04/081026。
使用的接头的长度、柔性程度和/或其它性质(虽然不是至关重要的，如其通常对于ScFv片段中使用的接头那样)可对本发明的最终多肽的性质(包括但不限于对于HER3或对于一种或多种其它抗原的亲和力、特异性或亲合力)具有一定的影响。基于本文中的公开内容，本领域技术人员能够任选地在一些有限的常规实验后确定用于本发明的特定多肽的最佳接头。
例如，在包含针对多聚体抗原(例如多聚体受体或其它蛋白质)的纳米抗体的本发明的多价多肽中，接头的长度和柔性优选使得其允许每一个存在于多肽中的本发明的多肽中的纳米抗体结合多聚体的每一个亚单元上的抗原决定簇。类似地，在包含针对相同抗原上的两个或更多个不同抗原决定簇(例如针对抗原的不同表位和/或针对多聚体受体、通道或蛋白质的不同亚单元)的纳米抗体的本发明的多特异性多肽中，接头的长度和柔性优选使得其允许每一个纳米抗体结合其期望的抗原决定簇。再次地，基于本文中的公开内容，本领域技术人员将能够任选地在一些有限的常规实验后决定用于本发明的特定多肽的最佳接头。
也在本发明的范围内的是：使用的接头赋予本发明的多肽一个或多个其它有利性质或功能性和/或提供一个或多个用于形成衍生物和/或用于连接官能团(例如如本文中针对本发明的纳米抗体的衍生物所描述的)的位点。例如，包含一个或多个带电荷的氨基酸残基(参见国际申请WO 08/020079的第48页上的表A-2)的接头提供了改善的亲水性质，而形成或包含小的表位或标记物的接头可用于检测、鉴定和/或纯化目的。再次地，基于本文中的公开内容，本领域技术人员将能够任选地在一些有限的常规实验后决定用于本发明的特定多肽的最佳接头。
最后，当两个或更多个接头用于本发明的多肽时，这些接头可以相同或不同。再次地，基于本文中的公开内容，本领域技术人员将能够任选地在一些有限的常规实验后决定用于本发明的特定多肽的最佳接头。
通常，为了使表达和生产容易，本发明的多肽为线性多肽。然而，本发明在其最广意义上不限于此。例如，当发明的多肽包含3个或更多个纳米抗体，可通过使用具有3个或更多个“臂”的接头来连接它们，所述每一个“臂”连接于纳米抗体，以提供“星状”构建体。还可能，虽然通常不太优选，使用环状构建体。
本发明还包括本发明的多肽的衍生物，其可基本上类似于本发明的纳米抗体的衍生物，即如本文中所描述的。
本发明还包括“基本上由本发明的多肽组成”(其中词语“基本上由……组成”具有与上文中指出的含义基本上相同的含义)的蛋白质或多肽。
根据本发明的一个方面，本发明的多肽以基本上分离的形式存在，如本文中所定义的。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸可以以本身公知的方式来制备，根据本文中的进一步描述这对于本领域技术人员来说将是清楚明了的。例如，本发明的纳米抗体和多肽可以以用于制备抗体，具体地用于制备抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的本身公知的任何方式来制备。用于制备本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体、多肽和核酸的一些优选但非限定性方法包括本文中描述的方法和技术。
如对于本领域技术人员来说将是清楚明了的，用于制备本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和/或多肽的一个特别有用的方法通常包括如下步骤：
i)在适当的宿主细胞或宿主生物体(在本文中也称为“本发明的宿主”)中或在另一种适当的表达系统中表达编码本发明的所述氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽的核酸(在本文中也称为“本发明的核酸”)，任选地随后：
ii)分离和/或纯化所获得的本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽。
具体地，这样的方法可包括如下步骤：
i)在使本发明的所述宿主表达和/或产生至少一种本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和/或多肽的条件下培养和/或维持本发明的宿主；任选地随后：
ii)分离和/或纯化所获得的本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽。
本发明的核酸可以以单链或双链DNA或RNA的形式存在，优选以双链DNA的形式存在。例如，本发明的核苷酸序列可以为基因组DNA、cDNA或合成DNA(例如具有已被专门改造以用于在期望的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子选择的DNA)。
根据本发明的一个方面，本发明的核酸以基本上分离的形式存在，如本文中定义的。
本发明的核酸还可以以载体的形式(例如质粒、粘粒或YAC)存在，存在于所述载体中和/或为所述载体的一部分，所述载体再次地以基本上分离的形式存在。
本发明的核酸，基于关于本文中给定的本发明的多肽的氨基酸序列的信息，可以以本身公知的方式制备或获得，和/或可从适当的天然来源分离。为了提供类似物，可将编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列经历定点诱变，以提供编码所述类似物的本发明的核酸。同样地，如对于本领域技术人员来说是清楚明了的，为了制备本发明的核酸，还可以以适当的方式将几个核苷酸序列例如至少一个编码纳米抗体的核苷酸序列和例如编码一个或多个接头的核酸连接在一起。
用于产生本发明的核酸的技术对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且可以例如包括但不限于自动化DNA合成；定点诱变；组合两个或更多个天然存在的和/或合成的序列(或两个或更多个其部分)、导致截短的表达产物表达的突变的引入；一个或多个限制酶切位点的引入(例如以产生可使用适当的限制性内切酶容易地降解和/或连接的盒和/或区域)，和/或使用一个或多个“错配”引物，使用例如HER3的天然存在形式的序列作为模板通过PCR反应进行的突变的引入。此类和其它技术对于本领域技术人员来说是清楚明了的，再次地参考标准手册，例如Sambrook等人和Ausubel等人,上文中提及的，以及下面实施例中提及的。
本发明的核酸还可以以遗传构建体的形式存在，存在于所述遗传构建体中和/或为其的部分，这对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且如WO 08/020079的第131-134页所描述的(通过引用并入本文)。此类遗传构建体通常包含至少一个本发明的核酸，所述核酸有效地连接于本身公知的遗传构建体的一个或多个元件，例如一个或多个适当的调控元件(例如适当的启动子、增强子、终止子等)和本文中提及的遗传构建体的其它元件。此类包含至少一个本发明的核酸的遗传构建体在本文中也称为“本发明的遗传构建体”。
本发明的遗传构建体可以为DNA或RNA，优选为双链DNA。本发明的遗传构建体还可以以适合用于转化期望的宿主细胞或宿主生物体的形式存在，以适合整合入期望的宿主细胞的基因组DNA的形式存在或以适合在期望的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式存在。例如，本发明的遗传构建体可以以载体的形式存在，例如质粒、粘粒、YAC、病毒载体或转座子。具体地，载体可以是表达载体，即可提供体外和/或体内表达(例如在适当的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)的载体。
在优选但非限定性方面，本发明的遗传构建体包含
i)至少一个本发明的核酸；有效地连接于
ii)一个或多个调控元件，例如启动子和任选地适当的终止子：
和任选地还有
iii)本身公知的遗传构建体的一个或多个其它元件；
其中术语“有效连接”和“有效连接的”具有WO 08/020079的第131-134页上给出的意义；并且其中“调控元件”、“启动子”、“终止子”和“其它元件”如WO 08/020079的第131-134页上描述的；并且其中遗传构建体还可如WO 08/020079的第131-134页上描述的。
本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可用于转化宿主细胞或宿主生物，即用于表达和/或产生本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽。适当的宿主或宿主细胞对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且可以例如为任何适当的真菌、原核细胞或真核细胞或任何适当的真菌、原核生物或真核生物，例如WO 08/020079的第134和135页上描述的那些；以及用于表达和产生抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的本身公知的其它宿主或宿主细胞，其对于本领域技术人员来说是清楚明了的。也参考上文中引用的一般背景领域，以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等人,(1998),同上；Riechmann和Muyldermans,(1999),同上；van der Linden,(2000),同上；Thomassen等人,(2002),同上；Joosten等人,(2003),同上；Joosten等人,(2005),同上；和本文中引用的其它参考资料。
还可将本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽引入多细胞生物体的一个或多个细胞、组织或器官并且在其中表达，例如用于预防和/或治疗目的(例如作为基因疗法)，如在WO 08/020079的第135和136页和WO 08/020079中引用的其它参考资料中进一步描述的。
为了在细胞中表达ISV或纳米抗体，还可将它们表达为所谓的“细胞内抗体(intrabody)”，如例如在WO 94/02610、WO 95/22618和US-A-7004940；WO 03/014960；Cattaneo,A.&Biocca,S.(1997)Intracellular Antibodies：Development andApplications.Landes and Springer-Verlag；和Kontermann,Methods 34,(2004),163-170中所描述的。
还可例如在转基因哺乳动物的乳液中，例如兔、牛、山羊或绵羊的乳液中(关于用于将转基因引入哺乳动物的一般技术，参见例如US-A-6,741,957、US-A-6,304,489和US-A-6,849,992)、植物或植物的部分(包括但不限于其叶、花、果实、种子、根或块茎(例如在烟草、玉米、大豆或紫花苜蓿中))或在例如蚕家蚕(Bombix mori)的蛹中产生本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽。
此外，还可在无细胞表达系统中表达和/或产生本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽，此类系统的适当实例对于本领域技术人员来说是清楚明了的。一些优选但非限定性实例包括在麦胚系统中；在兔网织红细胞裂解物中；或在大肠杆菌(E.coli)Zubay系统中的表达。
如上文中提及的，ISV或纳米抗体的使用的有利方面之一是基于其的多肽可通过在适当的细菌系统中表达来制备，适当的细菌表达系统、载体、宿主细胞、调控元件等对于本领域技术人员来说是清楚明了的，例如根据上文中引用的参考资料。然而，应当指出本发明在其最广的意义上不限定于在细胞系统中的表达。
优选地，在本发明中，使用(体内或体外)表达系统，例如细菌表达系统，所述表达系统以适合于药用的形式提供本发明的多肽，并且此类表达系统再次地对于本领域技术人员来说是清楚明了的。如对于本领域技术人员来说也是清楚明了的，适合药用的本发明的多肽可使用用于肽合成的技术来制备。
为了在工业规模上进行生产，用于ISV、纳米抗体或含纳米抗体的蛋白质治疗剂的(工业)生产的优选异源宿主包括适用于大规模表达/生产/发酵，具体地适用于大规模药用(即GMP级)表达/生产/发酵的大肠杆菌、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae)的菌株。此类菌株的适当实例对于本领域技术人员来说是清楚明了的。此类菌株和生产/表达系统也可通过公司例如Biovitrum(Uppsala,Sweden)获得。
或者，哺乳动物细胞系，具体地中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可用于大规模表达/生产/发酵，具体地用于大规模药用表达/生产/发酵。再次地，此类表达/生产系统也可通过上文中提及的一些公司获得。
特定表达系统的选择部分取决于对某些翻译后修饰，更具体地糖基化的需要。期望或需要对其糖基化的含ISV或纳米抗体的重组蛋白的生产使得必须使用具有糖基化表达的蛋白质的能力的哺乳动物表达宿主。在这方面，本领域技术人员很清楚所获得的糖基化模式(即连接的残基的种类、数目和位置)将取决于用于表达的细胞或细胞系。优选地，使用人细胞或细胞系(即产生基本上具有人糖基化模式的蛋白质)或使用另一种哺乳动物细胞系，所述细胞系可提供本质上和/或功能性与人糖基化相同或至少模拟人糖基化的糖基化模式。一般地，原核宿主例如大肠杆菌不具有糖基化蛋白质的能力，低等真核生物例如酵母的使用通常导致与人糖基化不同的糖基化模式。然而，应当理解，取决于待获得的期望的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽，可在本发明的中使用所有上述宿主细胞和表达系统。
因此根据本发明的一个非限定性实例，本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽是糖基化的。根据本发明的另一个非限定性方面，本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽是非糖基化的。
根据本发明的一个优选但非限定性方面，在细菌细胞，具体地适用于大规模药用生产的细菌细胞，例如上述菌株的细胞中生产本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽。
根据本发明的另一个优选但非限定性方面，在酵母细胞，具体地适用于大规模药用生产的酵母细胞，例如上述种类的细胞中生产本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽。
根据本发明的另一个优选但非限定性方面，在哺乳动物细胞中，具体地在人细胞中或在人细胞系的细胞中，更具体地在适用于大规模药用生产的人细胞中或人细胞系的细胞中，例如上述细胞系的细胞中生产本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽。
如在WO 08/020079的第138和139页上进一步描述的，当在宿主细胞中的表达用于产生本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽时，本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽可在细胞内(例如在细胞质中，在周质中或在包涵体中)产生，随后从宿主细胞分离，任选地进一步纯化；或可在细胞外(例如在其中培养宿主细胞的培养基中)产生，随后从培养基分离，任选地进一步纯化。因此，根据本发明的一个非限定性方面，本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽为已在细胞内产生并且已从宿主细胞分离，具体地从细菌细胞或从细菌细胞的包涵体分离的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽。根据本发明的另一个非限定性方面，本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽为已在细胞外产生的，并且已从其中培养宿主细胞的培养基分离的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽。
与此类宿主细胞一起使用的一些优选但非限定性启动子包括WO08/020079的第139和140页提及的那些启动子。
与此类宿主细胞一起使用的一些优选但非限定性分泌序列包括WO 08/020079的第140页提及的那些分泌序列。
用于转化本发明的宿主或宿主细胞的适当的技术对于本领域技术人员来说是清楚明了的，可以取决于期望的宿主细胞/宿主生物体以及待使用的遗传构建体。再次地参考上述手册和专利申请。
转化后，可进行用于检测和选择已被本发明的核苷酸序列/遗传构建体成功地转化的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。这可以例如为基于存在于本发明的遗传构建体中的可选择标记的选择步骤或包括例如使用特异性抗体检测本发明的氨基酸序列的步骤。
转化的宿主细胞(其可以以稳定的细胞系的形式存在)或宿主生物体(其可以以稳定的突变品系或菌株的形式存在)形成了本发明的其它方面。
优选地，此类宿主细胞或宿主生物体是这样的细胞或生物体：它们表达或(至少)能够表达(例如在适当的条件下)本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽(并且在宿主生物体的情况下：在至少一个其细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其它世代、后代和/或子代，所述后代可以例如通过细胞分裂或通过有性或无性生殖来获得。
为了产生/获得本发明的氨基酸序列的表达，通常在使(期望的)本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽表达/产生的条件下保持、维持和/或培养转化的宿主细胞或转化的宿主生物体。适当的条件对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且通常取决于使用的宿主细胞/宿主生物，以及取决于控制本发明的(相关)核苷酸序列表达的调控元件。再次地，参考上文中关于本发明的遗传构建体的段落中提及的手册和专利申请。
一般地，适当的条件可包括适当的培养基的使用、适当的食物来源和/或适当的营养物的存在、适当的温度的使用和任选地适当的诱导剂或化合物的存在(例如当在本发明的核苷酸序列处于诱导型启动子的控制之下时)；全部所述条件可由本领域技术人员选择。再次地，在此类条件下，本发明的氨基酸序列可以以组成型方式表达、以瞬时方式表达或仅当被适当地诱导时才表达。
本领域技术人员来说很清楚，本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽可以(首先)以未成熟形式(如上文中提及的)产生，随后其可经历翻译后修饰，这取决于使用的宿主细胞/宿主生物体。同样的，还可糖基化本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽，这再次取决于使用的宿主细胞/宿主生物体。
随后可使用本身公知的蛋白质分离和/或纯化技术，例如(制备型)层析和/或电泳技术、差异沉淀技术、亲和技术(例如使用与本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽融合的特异性可切割的氨基酸序列)和/或制备型免疫技术(即使用针对待分离的氨基酸序列的抗体)，从宿主细胞/宿主生物体和/或从其中培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基分离本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽。
一般地，对于药物用途，可将本发明的多肽配制为药物制剂或组合物，所述制剂或组合物包含至少一种本发明的多肽和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，和任选地一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。通过非限定性实例，这样的制剂可以以适合于口服施用，适合于胃肠外施用(例如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)、适合于局部施用、适合于通过吸入的施用、适合于通过皮肤贴剂、适合于通过植入、适合于通过栓剂等施用的形式存在。此类适当的施用形式-其可以为固体、半固体或液体(取决于施用的形式)-以及用于其制备的方法和载体，对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且在本文中进一步描述。
因此，在其它方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种本发明的氨基酸、至少一种本发明的ISV、至少一种本发明的纳米抗体或至少一种本发明的多肽以及至少一种适当的载体、稀释剂或赋形剂(即适用于药物使用)，和任选地一种或多种其它活性物质。
一般地，可以以任何适当的本身公知的方式配制和施用本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和肽，关于其参考例如上文中引用的一般背景领域(具体地参考WO 04/041862、WO 04/041863、WO04/041865、WO 04/041867和WO 08/020079)以及标准手册，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Company,USA(1990),Remington,the Science and Practice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams andWilkins(2005)；或the Handbook of Therapeutic Antibodies(S.Dubel,Ed.),Wiley,Weinheim,2007(参见例如第252-255页)。
例如，可以以用于常规抗体和抗体片段(包括ScFv和双链抗体)以及其它药物活性蛋白质的任何适当的本身公知的方式配制和施用本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽。此类制剂和用于制备其的方法对于本领域技术人员来说是清楚明了的，并且例如包括适用于胃肠外施用(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、管腔内、动脉内或鞘内施用)或适用于局部(即经皮肤或真皮内)施用的制剂。
用于胃肠外施用的制剂可以例如为适用于输注或注射的无菌溶液、悬液、分散体或乳剂。用于此类制剂的适当的载体或稀释剂例如包括但不限于WO 08/020079的第143页提及的那些载体或稀释剂。通常，含水溶液或悬液是优选的。
还可使用基因疗法递送法来施用本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽。参见例如，美国专利No.5,399,346，将其通过引用整体并入本文。通过使用基因疗法递送法，可用靶向特定器官、组织、移植物、肿瘤或细胞的组织特异性启动子额外地转染以编码本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽的基因转染的原代细胞，并且可用用于亚细胞定位表达的信号和稳定化序列额外地转染所述细胞。
因此，可以例如通过口服，将本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽与药学上可接受的媒介物例如惰性稀释剂或可同化食用的载体组合进行全身性施用。它们可被密封在硬壳或软壳明胶胶囊，可被压制成片剂，或可直接掺入患者饮食的食物中。为了进行口服治疗施用，可将本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽与一种或多种赋形剂组合并且以可摄取片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆剂、wafer等形式使用。此类组合物和制剂应当包含至少0.1%的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。它们在组合物和制剂中的百分比当然可以变化并且可方便地为约2至约60%的给定的单位剂量形式的重量。本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽在此类治疗上有用的组合物中的量是使得可获得有效剂量水平的量。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可包含粘合剂、赋形剂、分散剂、润滑剂和甜味剂或调味剂，例如WO 08/020079的第143-144页提及的那些。当单位剂量形式为胶囊时，除上述类型的材料外，其还可包含液体载体，例如植物油或聚乙二醇。多种其它材料可作为包衣存在或以另外的方式修饰固体单位剂量形式的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用明胶、蜡、虫胶(shellac)或糖等包被。糖浆剂或酏剂可包含本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽，蔗糖或果糖用作甜味剂，尼泊金甲酯和尼泊金丙酯用作防腐剂，染料和调味剂例如樱桃或橙子风味剂。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应当是药学上可接受的并且在所用的量上实质上无毒。此外，可将本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽掺入持续释放制剂和装置。
还可给用于口服施用的药剂和制剂提供肠溶衣，该肠溶衣可使本发明的构建体能够抗胃环境并且通过肠。更一般地，可适当地配制用于口服施用的药剂和制剂以递送至胃肠道的任何期望的部分。此外，可将适当的栓剂用于递送入胃肠道。
还可通过输注或注射静脉内或腹膜内施用本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽，如WO 08/020079的第144和145页上进一步描述的。
为了进行局部施用，可以以纯净形式使用本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽，即当它们为液体时。然而，通常期望将它们作为与皮肤学上可接受的载体组合的组合物或制剂(其可以是固体或液体)给皮肤施用，如WO 08/020079的第145页上进一步描述的。
一般地，本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽的在液体组合物例如洗剂中的浓度为约0.1-25wt-%，优选约0.5-10wt-%。在半固体或固体组合物例如凝胶或粉剂中的浓度为约0.1-5wt-%，优选约0.5-2.5wt-%。
用于治疗所需的本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽的量不仅可随选择的具体氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽而变化而且还随施用途径、待治疗的病况的性质和患者的年龄和病况而变化，并且最终由巡诊医生或临床医生判定。同样地，本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽的剂量还视靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官而变化。
期望的剂量可方便地以单次剂量或作为以适当的间隔(例如以每天2、3、4或更多份亚剂量)施用的分份剂量表示。亚剂量本身还可被细分成例如许多离散疏松间隔的施用；例如来自吹入器的多次吸入或通过将多个滴剂施用至眼中。
施用方案可包括长期的每日治疗。“长期”意指至少2周，优选地，数周、数月、数年的持续时间。该剂量范围的必要的变通可由本领域技术人员在本文的教导下仅使用常规实验来确定。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.,第4版),MackPublishing Co.,Easton,PA。在发生任何并发症的情况下，剂量还可由个体医生调整。
在另一个方面，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种癌症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的ISV、本发明的纳米抗体、本发明的多肽和/或包含所述物质的药物组合物。
在本发明的说明书中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，而且通常还包括预防疾病的发作，减缓或逆转疾病的进程，预防或减缓与疾病相关的一个或多个症状的发作，减轻和/或缓解与疾病相关的一个或多个症状，减轻疾病和/或与其相关的任何症状的严重度和/或持续时间，和/或防止疾病和/或与其相关的任何症状的严重度的进一步增加，防止、减轻或逆转由疾病引起的任何生理损伤，以及通常地对于待治疗的患者有益的任何药理作用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但具体地为哺乳动物，更具体地为人。如对于本领域技术人员来说是清楚明了的，待治疗的受试者具体地为患有本文中提及的疾病和病况的人或处于发生所述疾病和病况的风险中的人。
本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种与HER3，与其生物学和药理学活性和/或与其中牵涉HER3的生物学途径或信号转导相关的疾病或病况的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的ISV、本发明的纳米抗体、本发明的多肽和/或包含所述物质的药物组合物。具体地，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种可通过调节HER3、其生物学或生理学活性，和/或其中牵涉HER3的生物学途径或信号转导而治疗的疾病或病况的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的ISV、本发明的纳米抗体、本发明的多肽和/或包含所述物质的药物组合物。具体地，所述药物有效量可以为足以调节HER3、其生物学或药理学活性和/或其中牵涉HER3的生物学途径或信号转导的量；和/或在循环中提供足以调节HER3、其生物学或药理学活性和/或其中牵涉HER3的生物学途径或信号转导的水平的本发明的氨基酸序列、本发明的ISV、本发明的纳米抗体、本发明的多肽。
本发明此外还涉及用于预防和/或治疗至少一种可通过给患者施用本发明的氨基酸序列、本发明的ISV、本发明的纳米抗体、本发明的多肽来预防和/或治疗的疾病或病况的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物有效量的本发明的氨基酸序列、本发明的ISV、本发明的纳米抗体、本发明的多肽和/或包含所述物质的药物组合物。
更具体地，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种选自本文中所列的疾病和病况的疾病或病况的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的ISV、本发明的纳米抗体、本发明的多肽和/或包含所述物质的药物组合物。
在另一个方面，本发明涉及用于免疫疗法，具体地用于被动免疫疗法的方法，所述方法包括给患有本文中提及的疾病和病况或处于发生所述疾病和病况的风险中的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的ISV、本发明的纳米抗体、本发明的多肽和/或包含所述物质的药物组合物。
在上述方法中，取决于待使用的具体的药物制剂或组合物，可以以任何适当的方式本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和/或本发明的多肽和/或包含所述物质的组合物。因此，再次地取决于待使用的具体药物制剂或组合物，本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和/或多肽和/或包含所述物质的组合物可以例如通过口服、通过胃肠外途径(例如静脉内、皮下、肌内，或通过避开胃肠道的任何其它施用途径)、鼻内、经皮肤、局部、通过栓剂、通过吸入来施用。取决于待预防或治疗的疾病或障碍和临床医生公知的其它因素，临床医生能够选择适当的施用途径和适当的待用于这样施用的药物制剂或组合物。
按照适用于预防和/或治疗待预防和/或治疗的疾病或病况的治疗方案施用本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和/或多肽和/或包含所述物质的组合物。取决于因素例如待预防或治疗的疾病或病况、待治疗的疾病的严重度和/或其症状的严重度、待使用的本发明的具体氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽、具体施用途径和待使用的药物制剂或组合物、患者的年龄、性别、体重、饮食、一般状况以及临床医生公知的类似因素，临床医生通常能够确定适当的治疗方案。
一般地，治疗方案包括以一个或多个药物有效量或剂量施用一种或多种本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和/或多肽，或一种或多种包含所述物质的组合物。要施用的具体量或剂量可由临床医生再次地基于上述因素来确定。
一般地，为了预防和/或治疗本文中提及的疾病和障碍并且取决于待治疗的具体疾病或障碍、待使用的本发明的具体氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽的效力、具体施用途径和使用的具体药剂或组合物，通常以每天每千克体重1克至0.01毫克，优选每天第千克体重0.1克至0.01毫克，例如每天每千克体重约0.1、1、10、100或1000毫克的量连续(例如通过输注)、作为单次日剂量或在一天中以多个分份剂量施用本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽。取决于本文中提及的因素，临床医生通常能够确定适当的日剂量。也很清楚，在特定情况下，临床医生可选择偏离这些量，例如基于上述因素和他的经验判断。通常，关于待施用的量的一些指导可获自通过基本上相同的途径施用的针对相同靶的可比较的常规抗体或抗体片段的通常施用的量，考虑进去亲和力/亲合力、功效、生物分布、半衰期和对于本领域技术人员来说公知的类似因素的差异。
通常，在上述方法中，可使用单个本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽。然而在本发明的范围内的是使用两个或更多个本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和/或多肽。
还可将本发明的ISV、纳米抗体、氨基酸序列和多肽与一种或多种其它药物活性化合物或有效成分组合使用，即作为联合治疗方案，这可以导致或可以不导致协同作用。再次地，基于上述因素和他的经验判断，临床医生将能够选择这样的其它化合物或有效成分，以及适当的联合治疗方案。
具体地，可将本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体和多肽与用于或可用于预防和/或治疗本文中引用的疾病和障碍的其它药物活性化合物或有效成分组合使用，作为其结果，可以获得或可以不获得协同作用。此类化合物和有效成分的实例以及用于施用的途径、方法和药物制剂或组合物对于临床医生来说是很清楚明了的。
当将两种或更多种物质或有效成分用作联合治疗方案的部分时，可通过相同的施用途径或通过不同的施用途径在基本上相同的时间或在不同的时间(例如基本上同时、连续地或按照交替方案)施用它们。当通过相同施用途径同时施用物质或有效成分时，可将它们作为不同的药物制剂或组合物或组合药物制剂或组合物的部分施用，这对于本领域技术人员来说来说是清楚明了的。
同样地，当将两种或更多种活性物质或成分作为联合治疗方案的部分使用时，可以以相同的量并且按照与当化合物或有效成分单独使用时所使用的方案相同的方案使用每一种物质或有效成分，这样的组合使用可导致或可以不导致协同作用。然而，当两种或更多种活性物质或有效成分的组合使用导致协同作用时，也就可能减少一种、多种或全部待施用的物质或有效成分的量，同时仍然达到期望的治疗作用。这可以例如用于避免、限制或减少任何不想要的副作用，同时仍然获得期望的药物或治疗作用，所述副作用与一种或多种物质或有效成分的使用(当它们以它们通常的量使用时)相关。
按照本发明使用的治疗方案的功效可以以用于牵涉的疾病或障碍的本身公知的任何方式来测定和/或推断，这对于临床医生来说是清楚明了的。临床医生，适当时并且视情况而定，还能够改变或变动特定治疗方案，以达到期望的治疗作用，以避免、限制或减少不想要的副作用，和/或达到一方面获得期望的治疗作用与另一方面避免、限制或减少不想要的副作用之间的适当平衡。
通常，治疗方案会进行直至达到治疗作用和/或一直进行，只要期望的治疗作用将得到维持。再次地，这可由临床医生来决定。
在另一个方面，本发明涉及本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗至少一种癌症；和/或用于本文中提及的治疗方法的一种或多种的用途。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但具体地是哺乳动物，更具体地是人。如对于本领域技术人员来说是清楚明了的，待治疗的受试者具体地是患有本文中提及的疾病和障碍或处于发生所述疾病和障碍的风险中的人。
本发明还涉及本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗至少一种可通过给患者施用本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽来预防和/或治疗的疾病或障碍。
更具体地，本发明涉及本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗多种癌症，具体地用于预防和治疗本文中所列的疾病和障碍的一种或多种。
再次地，在这样的药物组合物中，还可将本发明的一个或多个氨基酸序列、ISV、纳米抗体或多肽与一种或多种其它活性有效成分例如本文中提及的活性有效成分适当地组合。
最后，虽然本发明的ISV或纳米抗体(如本文中定义的)和本发明的多肽的用途是非常优选的，但应当清楚基于本文中的描述，本领域技术人员能够以类似的方式设计和/或产生其它氨基酸序列，具体地针对HER3的(单)结构域抗体，以及包含此类(单)结构域抗体的多肽。
例如，对于本领域技术人员来说清楚明了的是可能将上文中提及的本发明的纳米抗体的CDR的一个或多个“移植”至此类(单)结构域抗体或其它蛋白质支架上，包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架。用于这样的CDR移植的适当的支架和技术对于对于本领域技术人员来说是清楚明了的并且在本领域是公知的，参见例如WO 08/020079中提及的所述支架和技术。例如，可以以类似方式将本身公知的用于将小鼠或大鼠CDR移植至人构架和支架上的技术用于提供包含本发明的纳米抗体的CDR的一个或多个以及一个或多个人构架区或序列的嵌合蛋白质。
还应当指出，当本发明的纳米抗体包含除上述优选CDR序列外的一个或多个其它CDR序列时，可以以任何本身公知的方式，例如使用WO 08/020079中描述的一个或多个技术获得这些CDR序列。
本发明的氨基酸序列、ISV、纳米抗体、多肽、核酸、遗传构建体以及宿主和宿主细胞的用途，基于本文中的公开内容，对于本领域技术人员来说是清楚明了的。例如，并且非限制性地，可将本发明的氨基酸序列连接于适当的载体或固体支持物以提供介质，随后可以以本身公知的方式用于从包含HER3的组合物和制剂纯化HER3。还可将包含适当的可检测标记物的本发明的氨基酸序列的衍生物用作标记来确定(定性或定量地)HER3在组合物或制剂中的存在或用作标记来选择性检测HER3在细胞或组织表面上的存在(例如，在与适当的细胞分行技术组合中)。
现通过下列非限定性优选方面、实施例和附图进一步描述本发明：优选方面：
方面A-1:一种针对HER3和/或可特异性结合HER3的免疫球蛋白单可变结构域。
方面A-2:根据方面A-1的免疫球蛋白单可变结构域，其以基本上分离的形式存在。
方面A-3:根据方面A-1或A-2的用于给受试者施用的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域非天然地存在于所述受试者中。
方面A-4:免疫球蛋白单可变结构域，其可以以10-5至10-12摩尔/升或更低，优选地10-7至10-12摩尔/升或更低以及更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合HER3。这样的免疫球蛋白单可变结构域可具体地为根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
方面A-5:一种免疫球蛋白单可变结构域，其可以以102M-1s-1至约107M-1s-1，优选103M-1s-1至107M-1s-1，更优选地104M-1s-1至107M-1s-1，例如105M-1s-1至107M-1s-1的缔合率(kon-率)特异性结合HER3。这样的免疫球蛋白单可变结构域可以具体地为根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
方面A-6:一种免疫球蛋白单可变结构域，其可以以1s-1至10-6s-1，优选10-2s-1至10-6s-1，更优选地10-3s-1至10-6s-1，例如10-4s-1至10-6s-1的解离率(koff率)特异性结合HER3。这样的免疫球蛋白单可变结构域可以具体为根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
方面A-7:一种免疫球蛋白单可变结构域，其可以以低于500nM，优选低于200nM，更优选地低于10nM，例如低于1nM的亲和力特异性结合HER3。这样的免疫球蛋白单可变结构域可以具体地为根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
方面A-8:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其为天然存在的免疫球蛋白单可变结构域(来自任何适当的物种)或合成或半合成的免疫球蛋白单可变结构域。
方面A-9:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其包含免疫球蛋白折叠或在适当的条件下能够形成免疫球蛋白折叠。
方面A-10:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由4个构架区(分别地FR1至FR4)和3个互补决定区(分别地CDR1至CDR3)组成。
方面A-11:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其为免疫球蛋白序列。
方面A-12:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其为天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适当的物种)或合成或半合成的免疫球蛋白序列。
方面A-13:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其为人源化免疫球蛋白序列、骆驼源化免疫球蛋白序列或已利用技术例如亲和力成熟获得的免疫球蛋白序列。
方面A-14:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由轻链可变结构域序列(例如VL-序列)组成；或基本上由重链可变结构域序列(例如VH-序列)组成。
方面A-15:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列组成或基本上由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。
方面A-16:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域)组成，基本上由单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域)组成，基本上由"dAb"(或适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域)组成或基本上免疫球蛋白单可变结构域(包括但不限于VHH序列)组成。
方面A-17:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由免疫球蛋白单可变结构域组成。
方面A-18:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由优选在根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104至108上具有的一个或多个氨基酸残基是选自表B-2中提及的标志残基的免疫球蛋白单可变结构域组成。
方面A-19:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由多肽组成，所述多肽
i)与SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了测定氨基酸同一性的程度，不考虑形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)优选根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104至108上的氨基酸残基的一个或多个选自表B-2中提及的标志残基。
方面A-20:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由这样的免疫球蛋白单可变结构域组成，所述疫球蛋白单可变结构域
i)与SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了测定氨基酸同一性的程度，不考虑形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)优选根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104至108上的氨基酸残基的一个或多个选自表B-2中提及的标志残基。
方面A-21:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由人源化或另外的序列优化的免疫球蛋白单可变结构域组成。
方面A-22:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，除了至少一个用于结合HER3的结合位点外，还包含一个或多个用于结合其它抗原、蛋白质或靶的其它结合位点。
方面B-1:一种免疫球蛋白单可变结构域，其针对HER3和/或可特异性结合HER3，并且包含一个或多个选自如下的氨基酸残基区段：
a)SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；；
f)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g)SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
或其任何适当的组合。
这样的免疫球蛋白单可变结构域可具体地为根据方面A-1至A-22的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
方面B-2:根据方面B-1的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述氨基酸残基区段的至少一个形成用于结合HER3的抗原结合位点的部分。
方面B-3:一种免疫球蛋白单可变结构域序列，其针对HER3和/或可特异性结合HER3，并且包含两个或更多个选自如下序列的氨基酸残基区段：
a)SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
d)SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；；
f)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
g)SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以便(i)当第一氨基酸残基区段相应于根据a)、b)或c)的氨基酸序列之一时,第二氨基酸残基区段相应于根据d)、e)、f)、g)、h)或i)的氨基酸序列；(ii)当第一氨基酸残基区段相应根据d)、e)或f)的氨基酸序列之一时,第二氨基酸残基区段相应于根据a)、b)、c)、g)、h)或i)的氨基酸序列之一；或(iii)当第一氨基酸残基区段相应于根据g)、h)或i)的氨基酸序列之一时,第二氨基酸残基区段相应于根据a)、b)、
c)、d)、e)或f)的氨基酸序列之一。
这样的免疫球蛋白单可变结构域可以具体地为根据方面A-1至A-22、B-1或B-2的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
方面B-4:根据方面B-3的免疫球蛋白单可变结构域，其中至少两个氨基酸残基的区段形成用于结合HER3的抗原结合位点的部分。
方面B-5:一种免疫球蛋白单可变结构域序列，其针对HER3和/或可特异性结合HER3并且包含三个或更多个氨基酸残基区段，其中第一氨基酸残基区段选自：
a)SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO：57至71的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
第二氨基酸残基区段选自：
d)SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；；
f)与SEQ ID NO：87至101的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列；
以及第三氨基酸残基区段选自：
g)SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列；
h)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的氨基酸序列；
i)与SEQ ID NO：117至131的氨基酸序列的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
这样的免疫球蛋白单可变结构域可以具体地为根据方面A-1至A-22和/或B-1至B-4的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
方面B-6:根据方面B-5的免疫球蛋白单可变结构域，其中至少三个氨基酸残基区段形成用于结合HER3的抗原结合位点的部分。
方面B-7:一种免疫球蛋白单可变结构域，其针对HER3和/或可特异性结合HER3，其中所述免疫球蛋白单可变结构域的CDR序列与SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个的CDR序列具有至少70%的氨基酸同一性，优选至少80%的氨基酸同一性，更优选至少90%的氨基酸同一性，例如95%的氨基酸同一性或更高或甚至基本上100%的氨基酸同一性。这样的免疫球蛋白单可变结构域可以具体地为根据方面A-1至A-22和/或B-1至B-6的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
方面C-1:一种免疫球蛋白单可变结构域，其针对HER3并且交叉阻断SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个对HER3的结合。这样的免疫球蛋白单可变结构域可具体地为根据方面A-1至A-22和/或根据方面B-1至B-7的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。同样地，优选地，这样的免疫球蛋白单可变结构域也能够特异性结合HER3。
方面C-2:一种免疫球蛋白单可变结构域，其针对HER3并且被SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个阻断对HER3的结合。这样的免疫球蛋白单可变结构域可以具体地为根据方面A-1至A-22和/或根据方面B-1至B-7的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。同样地，优选地，这样的免疫球蛋白单可变结构域能够特异性结合HER3。
方面C-3:根据方面C-1或C-2的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中在FACS竞争性测定中检测所述免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断或被交叉阻断的能力，如例如实验部分所描述的。
方面C-4:根据方面C-1至C-3的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中在ELISA测定中检测所述免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断或被交叉阻断的能力。
方面D-1：根据方面B-1至B-7或C-1至C-4的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其以基本上分离的形式存在。
方面D-2:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4和/或D1的任一项的用于给受试者施用的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域非天然地存在于所述受试者。
方面D-3:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4和/或D1至D-2的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其可以以10-5至10-12摩尔/升或更低，和优选地10-7至10-12摩尔/升或更低以及更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合HER3。
方面D-4:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4，和/或D-1至D-3的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其可以以102M-1s-1至约107M-1s-1，优选103M-1s-1至107M-1s-1，更优选地104M-1s-1至107M-1s-1，例如105M-1s-1至107M-1s-1的缔合率(kon-率)特异性结合HER3。
方面D-5:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4，和/或D-1至D-4的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其可以以1s-1至10-6s-1，优选10-2s-1至10-6s-1，更优选地10-3s-1至10-6s-1，例如10-4s-1至10-6s-1的解离率(koff率)特异性结合HER3。
方面D-6:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4，和/或D-1至D-5的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其可以以低于500nM，优选低于100nM，更优选地低于10nM，例如低于1nM的亲和力特异性结合HER3。
根据方面D-1至D-6的免疫球蛋白单可变结构域可具体地为根据方面A-1至A-22的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
方面E-1:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4和/或D1至D-6的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其为天然存在的免疫球蛋白单可变结构域(来自任何适当的物种)或合成或半合成的免疫球蛋白单可变结构域。
方面E-2:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其包含免疫球蛋白折叠或在适当的条件下能够形成免疫球蛋白折叠。
方面E-3:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4、D1至D-6和/或D-1或D-2的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其为免疫球蛋白序列.
方面E-4:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-3的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其为天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适当的物种)或合成或半合成的免疫球蛋白序列。
方面E-5:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-4的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其为人源化免疫球蛋白序列、骆驼源化免疫球蛋白序列或已利用技术例如亲和力成熟获得的免疫球蛋白序列。
方面E-6:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-5的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由轻链可变结构域序列(例如VL-序列)组成；或基本上由重链可变结构域序列(例如VH-序列)组成。
方面E-7:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-6的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列组成或基本上由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。
方面E-8:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-7的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域)组成，基本上由单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域)组成，基本上由"dAb"(或适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域)组成或基本上由免疫球蛋白单可变结构域(包括但不限于VHH序列)组成。
方面E-9:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-8的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由VHH或工程化的VHH组成。
方面E-10:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-9的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由VHH或工程化的VHH组成，所述VHH或工程化的VHH优选在根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104至108上具有的一个或多个氨基酸残基是选自表B-2中提及的标志残基。
方面E-11:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-10的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由VHH 或工程化的VHH组成，所述VHH或工程化的VHH
i)与SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了测定氨基酸同一性的程度，不考虑形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)优选根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104至108上的氨基酸残基的一个或多个选自表B-2中提及的标志残基。
方面E-12:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-11的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由VHH或工程化的VHH组成。
方面E-13:根据方面B-1至B-7、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-11的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，除了至少一个由CDR序列形成的氨基酸残基区段或用于结合的结合位点外，还包含一个或多个用于结合其它抗原、蛋白质或靶的其它结合位点。
根据方面E-1至E-13的免疫球蛋白单可变结构域可具体地为根据方面A-1至A-22的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
方面F-1:免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由4个构架区(分别地FR1至FR4)和3个互补决定区(分别地CDR1至CDR3)，其中：-CDR1选自：
a)SEQ ID NO：57至71的免疫球蛋白单可变结构域；
b)与SEQ ID NO：57至71的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域；
c)与SEQ ID NO：57至71的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域；
和/或
-CDR2选自：
d)SEQ ID NO：87至101的免疫球蛋白单可变结构域；
e)与SEQ ID NO：87至101的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域；
f)与SEQ ID NO：87至101的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域；
和/或
-CDR3选自：
g)SEQ ID NO：117至131的免疫球蛋白单可变结构域；
h)与SEQ ID NO：117至131的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域；
i)与SEQ ID NO：117至131的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域。
这样的免疫球蛋白单可变结构域优选针对HER3和/或可特异性结合HER3的免疫球蛋白单可变结构域。同样地，这样的免疫球蛋白单可变结构域优选为根据方面A-1至A-22、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-13的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
方面F-2:免疫球蛋白单可变结构域，其中基本上由4个构架区(分别地FR1至FR4)和3个互补决定区(分别地CDR1至CDR3)组成，
其中：
-CDR1选自：
a)SEQ ID NO：57至71的免疫球蛋白单可变结构域；
b)与SEQ ID NO：57至71的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域；
c)与SEQ ID NO：57至71的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域；
和
-CDR2选自：
d)SEQ ID NO：87至101的免疫球蛋白单可变结构域；
e)与SEQ ID NO：87至101的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域；
f)与SEQ ID NO：87至101的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域；
和
-CDR3选自：
g)SEQ ID NO：117至131的免疫球蛋白单可变结构域；
h)与SEQ ID NO：117至131的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域；
i)与SEQ ID NO：117至131的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域。
这样的免疫球蛋白单可变结构域优选针对和/或可特异性结合HER3的免疫球蛋白单可变结构域。同样地，这样的免疫球蛋白单可变结构域优选为根据方面A-1至A-22、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-13的任一项的免疫球蛋白单可变结构域。
方面F-3:根据方面F-1和F-2的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域的CDR序列与SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个的CDR序列具有至少70%的氨基酸同一性，优选至少80%的氨基酸同一性，更优选至少90%的氨基酸同一性，例如95%的氨基酸同一性或更高或甚至基本上100%的氨基酸同一性。
这样的免疫球蛋白单可变结构域优选针对HER3和/或可特异性结合HER3的免疫球蛋白单可变结构域。同样地，这样的免疫球蛋白单可变结构域优选为根据方面A-1至A-22、C-1至C-4、D1至D-6和/或E-1至E-13的免疫球蛋白单可变结构域。
方面F-4:根据方面F-1至F-3的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其针对HER3的并且交叉阻断根据任一方面的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个对SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的结合。
方面F-5:根据方面F-1至F-3的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其是针对HER3的并且并且被SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个阻断对HER3的结合。
方面F-6:根据方面F-4或F-5的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中在FACS竞争性测定中检测所述免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断或被交叉阻断的能力，如例如实施例部分中显示的。
方面F-7:根据方面F-4或F-5的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其中在ELISA竞争测定中检测所述免疫球蛋白单可变结构域交叉阻断或被交叉阻断的能力。
方面F-8:根据方面F-1或F-7的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其以基本上分离的形式存在。
方面F-9:根据方面F-1至F-8的任一项的用于给受试者施用的免疫球蛋白单可变结构域，其中所述免疫球蛋白单可变结构域非天然存在于所述受试者中。
方面F-10:根据方面F-1至F-9的任一贡的免疫球蛋白单可变结构域，其可以以10-5至10-12摩尔/升或更低，优选地10-7至10-12摩尔/升或更低以及更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合HER3。
方面F-11:根据方面F-1至F-10的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其可以以102M-1s-1至约107M-1s-1，优选103M-1s-1至107M-1s-1，更优选地104M-1s-1至107M-1s-1，例如105M- 1s-1至107M-1s-1的缔合率(kon-率)特异性结合HER3。
方面F-12:根据方面F-1至F-11的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其可以以1s-1至10-6s-1，优选10-2s-1至10-6s-1，更优选地10-3s-1至10-6s-1，例如10-4s-1至10-6s-1的解离率(koff率)特异性结合HER3。
方面F-13:根据方面F-1至F-12的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其可以以低于500nM，优选低于200nM，更优选地低于10nM，例如低于1nM的亲和力特异性结合HER3。
方面F-14:根据方面F-1至F-13的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其为天然存在的免疫球蛋白单可变结构域(来自任何适当的物种)或合成或半合成的免疫球蛋白单可变结构域。
方面F-15:根据方面F-1至F-14的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其包含免疫球蛋白折叠或在适当的条件下能够形成免疫球蛋白折叠。
方面F-16:根据方面F-1至F-15的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其为免疫球蛋白序列。
方面F-17:根据方面F-1至F-16的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其为天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适当的物种)或合成或半合成的免疫球蛋白序列。
方面F-18:根据方面F-1至F-17的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其为人源化免疫球蛋白序列、骆驼源化免疫球蛋白序列或已利用技术例如亲和力成熟获得的免疫球蛋白序列。
方面F-19:根据方面F-1至F-19的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由轻链可变结构域序列(例如VL-序列)组成；或基本上由重链可变结构域序列(例如VH-序列)组成。
方面F-20:根据方面F-1至F-19的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列组成或基本上由来源于重链抗体的重链可变结构域序列组成。
方面F-21:根据方面F-1至F-20的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域)组成，基本上由单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域)组成，基本上由"dAb"(或适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域)组成或基本上由VHH或工程化的VHH组成。
方面F-22:根据方面F-1至F-21的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由VHH或工程化的VHH组成。
方面F-23:根据方面F-1至F-22的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由VHH或工程化的VHH组成，所述VHH或工程化的VHH优选在根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104至108上具有的氨基酸残基的一个或多个选自表B-2中提及的标志残基。
方面F-24:根据方面F-1至F-23的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由这样的免疫球蛋白单可变结构域组成，所述免疫球蛋白单可变结构域
i)与SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了测定氨基酸同一性的程度，不考虑形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)优选根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104至108上的氨基酸残基的一个或多个选自表B-2中提及的标志残基。
方面F-25:根据方面F-1至F-24的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，其基本上由序列优化的VHH组成。
方面G-1:根据前述方面的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，除了至少一个由CDR序列形成的用于结合的结合位点外，还包含一个或多个用于结合另一种抗原、蛋白质或靶的其它结合位点。
方面H-1:针对HER3和/或可特异性结合HER3的VHH。
方面H-2:根据方面H-1的VHH，其以基本上分离的形式存在。
方面H-3:根据方面H-1至H-2的任一项的VHH，其可以以10-5至10-12摩尔/升或更低，和优选地10-7至10-12摩尔/升或更低以及更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)特异性结合HER3。
方面H-4:根据方面H-1至H-3的任一项的VHH，其可以以102M-1s-1至约107M-1s-1，优选103M-1s-1至107M-1s-1，更优选地104M-1s-1至107M-1s-1，例如105M-1s-1至107M-1s-1的缔合率(kon-率)特异性结合HER3。
方面H-5:根据方面H-1至H-4的任一项的VHH，其可以以1s-1至10-6s-1，优选10-2s-1至10-6s-1，更优选地10-3s-1至10-6s-1，例如10-4s-1至10-6s-1的解离率(koff率)特异性结合HER3。
方面H-6:根据方面H-1至H-5的任一项的VHH，其可以以低于500nM，优选低于200nM，更优选地低于10nM，例如低于500pM的亲和力特异性结合HER3。
方面H-7:根据方面H-1至H-6的任一项的VHH，其为天然存在的VHH(来自例如骆驼)或合成或半合成的VHH。
方面H-8:根据方面至H-1至H-7的任一项的VHH，其为VHH序列、部分人源化VHH序列、完全人源化VHH序列、骆驼源化重链可变结构域或已利用技术例如亲和力成熟获得的VHH。
方面H-9:根据方面H-1至H-8的任一项的VHH，其优选在根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104至108上具有一个或多个选自表B-2提及的标志残基的氨基酸残基。
方面H-10:根据方面H-1至H-9的任一项的VHH，其
i)与SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性，其中为了测定氨基酸同一性的程度，不考虑形成CDR序列的氨基酸残基；
并且其中：
ii)优选根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104至108上的氨基酸残基的一个或多个选自表B-2中提及的标志残基。
方面H-11:根据方面H-1至H-10的任一项的VHH，其中：
-CDR1选自：
a)SEQ ID NO：57至71的免疫球蛋白单可变结构域；
b)与SEQ ID NO：57至71的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域；
c)与SEQ ID NO：57至71的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域；
和/或
-CDR2选自：
d)SEQ ID NO：87至101的免疫球蛋白单可变结构域；
e)与SEQ ID NO：87至101的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域；
f)与SEQ ID NO：87至101的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域；
和/或
-CDR3选自：
g)SEQ ID NO：117至131的免疫球蛋白单可变结构域；
h)与SEQ ID NO：117至131的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域；
i)与SEQ ID NO：117至131的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域.
方面H-12:根据方面H-1至H-11的任一项的VHH，其中：
-CDR1选自：
a)SEQ ID NO：57至71的免疫球蛋白单可变结构域；
b)与SEQ ID NO：57至71的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域；
c)与SEQ ID NO：57至71的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域；
和
-CDR2选自：
d)SEQ ID NO：87至101的免疫球蛋白单可变结构域；
e)与SEQ ID NO：87至101的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域；
f)与SEQ ID NO：87至101的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域；
和
-CDR3选自：
g)SEQ ID NO：117至131的免疫球蛋白单可变结构域；
h)与SEQ ID NO：117至131的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有至少80%的氨基酸同一性的免疫球蛋白单可变结构域；
i)与SEQ ID NO：117至131的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有3、2或1个氨基酸差异的免疫球蛋白单可变结构域.
方面H-13:根据方面H-1至H-12的任一项的VHH，其中CDR序列与SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个的CDR序列具有至少70%的氨基酸同一性，优选至少80%的氨基酸同一性，更优选至少90%的氨基酸同一性，例如95%的氨基酸同一性或更高或甚至基本上100%的氨基酸同一性。
方面H-14:根据方面H-1至H-13的任一项的VHH，其为部分人源化VHH。
方面H-15:根据方面H-1至H-14的任一项的VHH，其为完全人源化VHH。
方面H-16:根据方面H-1至H-15的任一项的VHH，其选自SEQ ID NO：12至26或选自与SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个具有超过80%，优选超过90%，更优选地超过95%，例如99%或更高的序列同一性(如本文中定义的)的免疫球蛋白单可变结构域。
方面H-17:根据方面H-1至H-16的任一项的VHH，其为人源化VHH。
方面H-18:根据方面H-1至H-17的任一项的VHH，其选自SEQ ID NO：12至26。
方面H-19:针对HER3的VHH，其交叉阻断SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个对HER3的结合。
方面H-20:针对HER3的VHH，其被SEQ ID NO：12至26的免疫球蛋白单可变结构域的至少一个交叉阻断对HER3的结合。
方面H-21:根据方面H-19或H-20的任一项的VHH，其中在FACS竞争性测定中检测所述VHH交叉阻断或被交叉阻断的能力，例如如实验部分描述的。
方面H-22:根据方面H-19至H-21的任一项的VHH，其中在ELISA测定中检测所述VHH交叉阻断或被交叉阻断的能力。
方面K-1:一种多肽，其包含一个或多个根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25、G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域和/或一个或多个根据方面H-1至H-22的任一项的VHH，以及任选地还包含一个或多个肽接头和/或一个或多个其它基团、残基部分或结合单元，或基本上由其组成。
方面K-2:根据方面K-1的多肽，其中所述一个或多个结合单元为免疫球蛋白序列，具体地ISV。
方面K-3:根据方面K-1或K-2的任一项的多肽，其中所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元选自结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、"dAb"、适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域或VHH。
方面K-4:根据方面K-1至K-3的任一项的多肽，其中所述一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域为免疫球蛋白序列。
方面K-5:根据方面K-1至K-4的任一项的多肽，其中所述一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域选自结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、"dAb"、适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域或VHH。
方面K-6:根据方面K-1至K-5的任一项的多肽，其包含一个或多个根据方面H-1至H-22的任一项的纳米抗体或基本上由其组成，并且其中所述一个或多个其它结合单元为纳米抗体。
方面K-7:根据方面K-1至K-6的任一项的多肽，其中至少一个结合单元为多价构建体。
方面K-8:根据方面K-1至K-7的任一项的多肽，其中至少一个结合单元为多互补位构建体。
方面K-9:根据方面K-1至K-8的任一项的多肽，其中至少一个结合单元为多特异性构建体。
方面K-10:根据方面K-1至K-9的任一项的多肽，与根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的相应免疫球蛋白单可变结构域本身或根据方面H-1至H-22的任一项的VHH本身相比较，分别具有增加的半衰期。
方面K-11:根据方面K-10的多肽，其中所述一个或多个其它结合单元提供了多肽增加的半衰期，其是与根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的相应免疫球蛋白单可变结构域本身或根据方面H-1至H-22的任一项的VHH本身相比较。
方面K-12:根据方面K-10或K-11的多肽，其中所述一个或多个提供多肽增加的半衰期的其它结合单元选自血清白蛋白或其片段、可结合血清蛋白的结合单元、Fc部分和可结合血清蛋白的小蛋白或肽。
方面K-13:根据方面K-10至K-12的任一项的多肽，其中所述一个或多个提供多肽增加的半衰期的其它结合单元选自人血清白蛋白或其片段。
方面K-14:方面K-10至K-13的任一项的多肽，其中所述一个或多个提供多肽增加的半衰期的其它结合单元选自可结合血清白蛋白(例如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(例如IgG)的结合单元。
方面K-15:根据方面K-10至K-14的任一项的多肽，其所述一个或多个提供多肽增加的半衰期的其它结合单元选自结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、"dAb"、适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域或可结合血清白蛋白(例如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(例如IgG)的VHH。
方面K-16:根据方面K-10至K-15的多肽，其中所述一个或多个提供多肽增加的半衰期的其它结合单元为可结合为可结合血清白蛋白(例如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(例如IgG)的VHH。
方面K-17:根据方面K-10至K-16的任一项的多肽，其具有分别为根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的相应的免疫球蛋白单可变结构域本身或根据方面H-1至H-22的任一项的相应的VHH本身的半衰期的至少1.5倍，优选至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。
方面K-18:根据方面K-10至K-17的任一项的多肽，其具有分别与根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的相应免疫球蛋白单可变结构域本身或根据方面H-1至H-22的任一项的相应VHH本身相比较增加超过1小时，优选超过2小时，更优选地超过6小时，例如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。
方面K-19:根据方面K-1至K-18的任一项的多肽，其在人中具有至少约12小时，优选至少24小时，更优选至少48小时，甚至更优选至少72小时或更长的血清半衰期；例如，至少5天(例如约5至10天)，优选至少9天(例如约9至14天)，更优选至少约10天(例如约10至15天)，或至少约11天(例如约11至16天)，更优选至少约12天(例如约12至18天或更长)，或超过14天(例如约14至19天)的半衰期。
方面L-1:一种化合物或构建体，其包含一个或多个根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域和/或一个或多个根据方面H-1至H-22的任一项的VHH，和任选地还包含一个或多个通过一个或多个接头连接的一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元，或基本上由其组成。
方面L-2:根据方面L-1的化合物或构建体，其中所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元为免疫球蛋白单可变结构域。
方面L-3:根据方面L-1或L-2的化合物或构建体，其中所述一个或多个接头，如果存在的话，为一个或多个免疫球蛋白单可变结构域。
方面L-4:根据方面L-1至L-3的任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元为免疫球蛋白序列。
方面L-5:根据方面L-1至L-4的任一项的化合物或构建体,其中所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元为选自结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、”dAb”、适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域或VHH。
方面L-6:根据方面L-1至L-5的任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域为免疫球蛋白序列。
方面L-7:根据方面L-1至L-6的任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域选自结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、"dAb"、适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域或VHH。
方面L-8:一种化合物或构建体,其包含一个或多个根据方面H-1至H-22的任一项的VHH或纳米抗体或基本由其组成，并且其中所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元为VHH。
方面L-9:根据方面L-1至L-8的任一项的化合物或构建体，其为多价构建体。
方面L-10:根据方面L-1至L-9的任一项的化合物或构建体，其为多特异性构建体。
方面L-11:根据方面L-1至L-10的任一项的化合物或构建体，其具有分别与根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域本身或根据方面H-1至H-22的任一项的VHH本身相比较增加的半衰期。
方面L-12:根据方面L-1至L-11的化合物或构建体，其中所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单元提供分别与根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域本身或根据方面H-1至H-22的任一项的VHH本身相比较具有增加的半衰期的化合物或构建体。
方面L-13:根据方面L-12的化合物或构建体，其中所述一个或多个提供具有增加的半衰期的化合物或构建体的其它基团、残基、部分或结合单元选自血清白蛋白或其片段、可结合血清蛋白的结合单元、Fc部分和可结合血清蛋白的小蛋白或肽。
方面L-14:根据方面L-12或L-13的化合物或构建体，其中所述一个或多个提供具有增加的半衰期的化合物或构建体的其它基团、残基、部分或结合单元选自人血清白蛋白或其片段。
方面L-15:根据方面L-12至L-14的任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个提供具有增加的半衰期的化合物或构建体的其它基团、残基、部分或结合单元选自可结合血清白蛋白(例如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(例如IgG)的结合单元。
方面L-16:根据方面L-12至L-14的任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个提供具有增加的半衰期的化合物或构建体的其它基团、残基、部分或结合单元选自结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、“dAb”、适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域或可结合血清白蛋白(例如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(例如IgG)的VHH。
方面L-17:根据方面L-12至L-14的任一项的化合物或构建体，其中所述一个或多个提供具有增加的半衰期的化合物或构建体的其它基团、残基、部分或结合单元为可结合血清白蛋白(例如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(例如IgG)的VHH。
方面L-18:根据方面L-12至L-17的任一项的化合物或构建体，其具有分别为根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域本身或根据方面H-1至H-22的任一项的VHH本身的半衰期的至少1.5倍，优选至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。
方面L-19:根据方面L-12至L-18的任一项的化合物或构建体,其具有分别与根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的相应免疫球蛋白单可变结构域本身或根据方面H-1至H-22的任一项的VHH本身相比较增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，例如超过12小时，或甚至超过24、48或72小时的血清半衰期。
方面L-20:根据方面L-12至L-19的任一项的化合物或构建体，在人中具有至少约12小时，优选至少24小时，更优选至少48小时，更优选至少72小时或更长的血清半衰期；例如，至少5天(例如约5至10天)，优选至少9天(例如约9至14天)，更优选至少约10天(例如约10至15天)，或至少约11天(例如约11至16天)，更优选至少约12天(例如约12至18天或更长)，或超过14天(例如约14至19天)的半衰期。
方面L-21:一种单价构建体，其包含一个根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域和/或一个根据方面H-1至H-22的任一项的VHH。
方面L-22:根据方面L-21的单价构建体，其中本发明的所述免疫球蛋白单可变结构域选自结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、”dAb”、适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域或VHH。
方面L-23:一种单价构建体，其包含一个根据方面H-1至H-22的任一项的VHH或基本上由其组成。
方面M-1:核酸或核苷酸序列，其编码根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据任一方面的化合物或构建体，其可这样获得：通过表达编码其的核酸或核苷酸序列来获得；例如与SEQ ID NO：27至41的核酸或核苷酸序列的至少一个的序列具有至少70%的序列同一性，优选至少80%的序列同一性，更优选至少90%的序列同一性，例如95%的序列同一性或更高或甚至基本上100%的序列同一性的核酸或核苷酸序列。
方面M-2:根据方面M-1的核酸或核苷酸序列，其以遗传构建体的形式存在。
方面N-1:一种宿主或宿主细胞，其表达或在适当的环境下能够表达根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽、根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体，其可这样获得：通过表达编码其、或根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体；和/或包含根据方面M-1的核酸或核苷酸序列或根据方面M-2的遗传构建体的核酸或核苷酸序列来获得。
方面O-1:一种组合物，其包含至少一种根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽、根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体、根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体或根据方面M-1或M-2的核酸或核苷酸序列。
方面O-2:根据方面O-1的组合物，其为药物组合物。
方面O-3:根据方面O-2的组合物，其为药物组合物，其还包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，和任选地包含一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。
方面P-1:一种方法，其用于产生根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽、根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体，其可这样获得：通过表达编码其、或根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体的核酸或核苷酸序列来获得，所述方法至少包括步骤：
a)在适当的宿主细胞或宿主生物或在另一种适当的表达系统中表达根据方面M-1的核酸或核苷酸序列或根据方面M-2的遗传构建体；
任选地随后：
b)分离和/或纯化所获得的根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽、根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体、根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体。
方面P-2:一种方法，其用于产生根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽、根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体，其可这样获得：通过表达编码其、或根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体的核酸或核苷酸序列来获得，所述方法至少包括步骤：
a)在这样的条件下培养和/或维持根据方面N1的宿主或宿主细胞，所述条件使得所述宿主或宿主细胞表达和/或产生至少一种根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽、根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体或根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体；
任选地随后：
b)分离和/或纯化所获得的根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽、根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体、根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体。
方面Q-1:一种用于筛选针对HER3的免疫球蛋白单可变结构域的方法，包括至少如下步骤：
a)提供编码免疫球蛋白单可变结构域的核酸序列的组、集合或文库；
b)筛选核酸序列的所述组、集合或文库以选择编码免疫球蛋白单可变结构域的核酸序列，所述免疫球蛋白单可变结构域可结合HER3和/或具有对其的亲和力，并且被本发明的免疫球蛋白单可变结构域，例如SEQ ID NO：12至26(表-A-1)，或本发明的人源化免疫球蛋白单可变结构域，或本发明的多肽或构建体，例如SEQ ID NO：147至327，更优选地HER3MS00135(SEQ ID NO：282)、HER3MS00212(SEQ ID NO：319)或HER3MS00215(SEQ ID NO：322)(参见表A-2)交叉阻断或交叉阻断其；和
c)分离所述核酸序列，随后表达所述免疫球蛋白单可变结构域。
方面R-1:一种用于预防和/或治疗至少一种癌症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的至少一种根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽、根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体、根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体；或根据方面O-2或O-3的组合物。
方面R-2:一种用于预防和/或治疗至少一种疾病或障碍的方法，所述疾病或障碍与HER3、与其生物学或药理学活性，和/或与其中牵涉HER3的生物学途径或信号转导相关，所述方法包括给有此需要的受试者施用药物活性量的至少一种根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽、根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体、根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体；或根据方面O-2或O-3的组合物。
方面R-3:一种用于预防和/或治疗至少一种疾病或障碍的方法，所述疾病或障碍可通过给有些需要的受试者施用至少一种根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽、根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体、根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体；或根据方面O-2或O-3的组合物来预防和/或治疗，所述方法包括包括给有此需要的受试者施用药物活性量的至少一种根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽、根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体、根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体；或根据方面O-2或O-3的组合物。
方面R-4:一种用于免疫疗法的方法，所述方法包括给有些需要的受试者施用药物有效量的至少一种根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽、根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体、根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体；或根据方面O-2或O-3的组合物。
方面R-5:根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域、根据方面H-1至H-22的任一项的VHH、根据方面K-1至K-19的任一项的多肽，根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体，或根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体用于制备用于预防和/或治疗至少一种癌症的药物组合物的用途；和/或用于根据方面R-1至R-3的一个或多个方法的用途。
方面R-6:根据方面A-1至A-22、B-1至B-7、C-1至C-4、D-1至D-6、E-1至E-13、F-1至F-25或G-1的任一项的免疫球蛋白单可变结构域，根据方面H-1至H-22的任一项的VHH，根据方面K-1至K-19的任一项的多肽，根据方面L-1至L-21的任一项的化合物或构建体，根据方面L-22或L-23的任一项的单价构建体；或根据方面O-2或O-3的组合物，用于预防和/或治疗至少一种癌症。
附图
图1：编码一些本发明的氨基酸序列和多肽的核苷酸序列。
图2：HER3-特异性纳米抗体和对照多克隆(PC)和单克隆(MC)抗体以及无关纳米抗体(irr nb)对全长细胞外鸡HER3或嵌合鸡-人HER3的FACS结合数据。
图3A至3D显示显示多价序列优化的纳米抗体结合HER3但不结合其它HER蛋白的结合曲线(参见实施例25)。
图4给出在本说明书和权利要求中提及的一些蛋白质的氨基酸序列。
图5A和5B显示形式化的序列优化的纳米抗体对BT-474乳腺癌细胞中的pHER3和下游信号转导的抑制的Western印迹(实施例28)。
图6A至6C显示：显示形式化的序列优化的纳米抗体对BxPC3胰腺癌细胞中的pHER3和下游信号转导的抑制的Western印迹(实施例28)。
图7A至7C显示分别利用纳米抗体HER3MS00135(图7A)、HER3MS00212(图7B)和HER3MS00215(图7C)处理的A549异种移植物肿瘤的肿瘤生长(随时间的中值肿瘤体积)的抑制。
实验部分
实施例1：材料
1.1hHER3 ECD(＝人HER3细胞外结构域）–SEQ ID NO：4.
编码人HER3细胞外结构域的基因通过体外合成产生。开放阅读框架包含HER3基因的同源信号肽的编码序列，紧接着是624个氨基酸的细胞外结构域(ECD)，和C末端6His标记物(参见SEQ ID NO：4)。将基因克隆入pEAK12d表达载体(Edge Biosystems)。通过瞬时转染HEK293-EBNA细胞(Invitrogen)产生HER3ECD。简而言之，将适于在含有4ml/L胰岛素-转铁蛋白-硒-X补充剂和1%胎牛血清(全都来自Invitrogen)DMEM:F12培养基中悬浮生长的细胞与质粒DNA和聚-乙烯亚胺(PEI,PolySciences)的混合物一起温育。90分钟后，将转染的细胞以1:1稀释于Freestyle培养基(Invitrogen)中，然后在37°C，160rpm的搅拌的条件下将其于5%CO2培养箱中置于定轨摇床上。6天后收获上清液，将其通过0.22μm膜盒(membranecartridge)(Millipore)无菌过滤。在载有Ni离子的Poros 20MC金属螯合亲和层析柱(Applied Biosystems)上纯化重组蛋白，然后在来自GEHealthcare的HiLoad Superdex75prepgrade 16/60柱上于PBS中进行尺寸排阻层析。
1.2cHER3ECD(＝食蟹猴HER3细胞外结构域＝猕猴HER3ECD)–SEQ ID NO：3
利用RT-PCR和cDNA测序测定猕猴HER3序列。开放阅读框包含cHER3基因的同源信号肽的编码序列，紧接着是624个氨基酸的细胞外结构域(ECD)，和C末端6His标记物(参见SEQ ID NO：3)。将基因克隆入pEAK12d表达载体(Edge Biosystems)。
通过瞬时转染HEK293-EBNA细胞(Invitrogen)产生HER3ECD。简而言之，将适于在包含4ml/L胰岛素-转铁蛋白-硒-X补充剂(全都来自Invitrogen)的DMEM:F12培养基中的细胞与未预混合的质粒DNA和聚-乙烯亚胺(PEI,PolySciences)一起温育。150分钟后，将转染的细胞以1:3稀释于Freestyle培养基(Invitrogen)中，然后在37°C，80rpm(直径2.5cm)的搅拌的条件下将其于5%CO2培养箱中置于定轨摇床上。在24小时温育后，使温度降低至34°C。5天后收获上清液，将其通过0.22μm膜盒(membrane cartridge)(Millipore)无菌过滤。在载有Ni离子的HisTrap HP金属螯合亲和层析柱(GE Healthcare)上纯化重组蛋白，然后针对PBS进行透析。
1.3hHER3全长序列–SEQ ID NO ：1
合成产生人HER3序列(SEQ ID No：1)，然后将其分别克隆入pcDNA3.1和pcDNA5/FRT(Invitrogen)。将终表达质粒pcDNA3.1-hHER3用于产生表达HER3的转染的细胞系。
1.4产生表达HER3的转染子
使用Fugene HD(Roche)作为转染剂，利用pcDNA3.1-hHER3瞬时转染HEK 293T细胞(DSMZ)。将转染的细胞用于免疫骆驼。
用pcDNA3.1-hHER3转染中国仓鼠卵巢细胞(ATCC)，通过使用HER3-特异性单克隆抗体(R&D Systems)染色细胞和FACS分析分选单细胞，并且选择单细胞用以进行HER3的高度且匀质的表达。选择一个克隆，用编码人HER2(SEQ ID NO：9)的pcDNA3.1-hygro转染其以获得HER2/HER3双转染细胞。细胞是单细胞分选的，通过使用HER2-特异性单克隆抗体(R&DSystems)染色细胞和FACS分析选择具有HER2的高度且匀质的表达的克隆。将此类细胞用于结合和竞争性实验。
用pcDNA5/FRT-hHER3质粒转染FlpIn CHO细胞(Invitrogen,#R-758-7)，然后在潮霉素选择下生长。
用pcDNA3.1-hHER3(SEQ ID NO：1)转染骆驼细胞系(CAKI；Nguyen等人2001.Adv.Immunol.79：261-296)，选择单细胞分选的克隆，将其用于选择实验。
实施例2：HER3-特异性纳米抗体的鉴定
2.1免疫
在兽医学院的伦理委员会(University Ghent,Belgium)批准后，按照标准方案免疫8只骆驼。3只骆驼(340、342、345)以两周间隔接受内部制备的HER3-ECD(ECD：细胞外结构域)SEQ ID NO：4的4次肌内注射，剂量为100、50、25和25微克。5只骆驼(419、420、421、429、430)以两周的间隔接受2x107个瞬时转染的HEK293-HER3细胞的4次皮下注射。
2.2在骆驼中诱导的反应的评估
在免疫过程结束时，从所有动物收集血清样品以通过ELISA评估针对HER3的免疫反应的诱导。简而言之，将重组人HER3/Fc嵌合体固定在96孔Maxisorp板(Nunc,Wiesbaden,Germany)上。在封闭和添加血清稀释物后，使用特异于骆驼IgG1、IgG2或IgG3的单克隆抗体和兔抗-小鼠辣根过氧化物酶缀合物检测特异性结合的免疫球蛋白。在所有动物中观察到显著的HER3特异性免疫反应。常规和只有重链的抗体的B细胞库都增强抗体反应，因为可用特异性识别常规骆驼IgG1抗体或只有重链的骆驼IgG2和IgG3抗体的抗体检测到特异性结合的免疫球蛋白。
表C-1：HER3-特异性血清效价的概述。血清效价被定义为导致信噪比1≥2的最高血清稀释度。
骆驼ID IgG1 IgG2 IgG3
340–第50天 1.09E+06 3.65E+05 3.65E+05
342–第50天 1.09E+06 1.22E+05 3.65E+05
345–第50天 1.09E+06 4.05E+04 4.05E+04
419–第64天 4.05E+04 1.50E+03 5.00E+02
420–第64天 1.50E+03 <500 <500
421–第64天 1.35E+04 <500 <500
429–第49天 1.35E+04 <500 <500
430–第49天 4.05E+04 <500 <500
1信噪比被定义为免疫后(第49、50或64天)收集的血液OD450nm吸光度对免疫前(第0天)血清样品的OD450nm吸光度的比率。
2.3文库构建
按照制造商的说明书使用Ficoll-Hypaque从血液样品制备外周血单核细胞。将从此类细胞和从淋巴结提取的总RNA用作RT-PCR的起始材料以扩增纳米抗体编码基因片段。将此类片段克隆入噬菌粒载体pAX50。按照标准方案(Phage Display of Peptides andProteins：A Laboratory Manual,Academic Press；第1版(1996年10月28日))制备噬菌体，在过滤灭菌后于4°C下贮存直至进一步使用。总共构建8个噬菌体文库(340、342、345、419、420、421、429和430)，文库大小为3x108至8.5x108，插入物的百分比范围为91至100%。
2.4HER3-特异性纳米抗体的搜索选择
为了鉴定识别人HER3的纳米抗体，用可溶性生物素化的HER3-ECD(SEQ ID NO：4)接种噬菌体文库。如实施例1中所述产生蛋白质，使用硫-NHS-LC-生物素(Pierce)进行生物素化。在链霉抗生物素蛋白涂覆的磁性珠粒上从溶液捕获生物素化的HER3与噬菌体的复合物。在用PBS/0.05%Tween20充分洗涤后，通过添加1mg/ml胰蛋白酶或1μM HRG(R&Dsystems)洗脱结合的噬菌体。将噬菌体文库340、342和345与可溶性生物素化的人HER3-ECD(0.1-100nM)一起温育；连续两轮将噬菌体文库419、420、421、429和430与可溶性生物素化的人HER3-ECD(1-10-100-1000nM)一起温育。就富集因子(enrichment factor)分析这些选择的输出(相对于对照的存在于洗脱物中的噬菌体的数目)，挑出来自这些第一轮输出的单个克隆。也连续两轮将所有噬菌体文库与用hHER3(hHER3=人HER3=SEQ ID NO：1)或用hHER2和hHER3(hHER2=人HER2=SEQ ID NO：9)(5x106个细胞)转染的中国仓鼠卵巢(ATCC)或骆驼细胞系(CAKI细胞；Nguyen等人2001.Adv.Immunol.79：261-296))一起温育。第三选择策略由如下部分组成：用HER3-特异性纳米抗体(04C07和21F06；10μg/ml)包被板，捕获HER3-ECD(5–100nM)，添加噬菌体文库以富集结合不同表位的噬菌体。将胰蛋白酶用于洗脱噬菌体，将输出用作在用相同抗体或备选的纳米抗体涂覆的板上进行的第二轮选择的输入。从不同选择条件挑选单个克隆。
将所有单个克隆生长在96深孔板(1ml体积)中。通过添加IPTG至1mM的终浓度诱导纳米抗体表达。通过将细胞沉淀冷冻，然后将其溶解于100μl PBS中来制备周质提取物。通过离心除去细胞碎片。
2.5筛选结合hHER3的纳米抗体
为了测定纳米抗体对hHER3的结合能力，在基于细胞的结合FACS测定(FACS阵列,BectonDickinson)中筛选周质提取物。将样品与利用hHER3或hHER2/hHER3转染的中国仓鼠卵巢细胞一起温育，用FACS缓冲液洗涤，使用抗-c-myc-特异性抗体(Serotec)检测纳米抗体的结合。鉴定纳米抗体对hHER3的结合。
2.6筛选与HRG1-β1竞争的纳米抗体
为了测定纳米抗体的HRG1-β1(hHRG=人Heregulin)阻断能力，使用FMAT技术(Applied Biosystems,Foster City,CA)在基于细胞的竞争性测定中筛选周质提取物。用A647标记HRG1-β1-EGF(R&D Systems,#396-HB,登录号NP_039250)，在纳米抗体存在的情况下将其与用hHER2/hHER3转染的中国仓鼠卵巢细胞一起温育。总FL1信号的减少表明标记的HRG1-β1的结合被存在于周质提取物中的纳米抗体阻断。根据阻断配体-受体相互作用的不同水平(范围从100%阻断至无阻断)鉴定纳米抗体。基于HER3结合和HRG1-β1竞争性筛选，选择了一组HER3纳米抗体并且对其进行了测序。序列分析显示了204个不同的HER3特异性纳米抗体家族。
2.7通过表面等离子体共振在hHER3上分析周质提取物
使用Biacore T100仪通过表面等离子体共振(SPR)测量包含抗-HER3纳米抗体的周质提取物的解离率。通过胺偶联(对于激活，使用EDC/NHS；对于灭活，使用盐酸乙醇胺)将人HER3-ECD(SEQ ID NO：4)共价结合于CM传感器芯片表面。以45μl/分钟的流速注射包含HER3-特异性纳米抗体的周质提取物，进行2分钟，以允许进行对芯片结合的抗原的结合。随后，以相同的流速将无周质提取物的结合缓冲液传送至芯片上以允许结合的纳米抗体自发解离。根据从不同周质提取物获得的传感图计算koff-值(kd)。
2.8筛选抑制配体依赖性HER3磷酸化的纳米抗体
为了鉴定具有阻断HER3磷酸化的能力的HER3-特异性纳米抗体，将周质提取物与血清饥饿的MCF-7细胞一起温育，然后用5nM HRG1-β1–EGF刺激15分钟。制备细胞裂解物，使用DuoSet IC人磷酸-HER3ELISA(R&D systems,DYC1769-2)测量HER3的磷酸化。根据抑制配体-诱导的pHER3的不同水平(范围从100%阻断至无抑制)鉴定纳米抗体。
2.9纳米抗体的表位淘选
将6种HER3-特异性纳米抗体生物素化并且用于alphascreen和/或FACS竞争性测定以将纳米抗体家族分类于不同的表位箱(epitope bin)中。在FACS测定中，在6种生物素化纳米抗体之一(表C-2中指定了使用的浓度)存在的情况下温育包含HER3-特异性纳米抗体的周质提取物。随后将温育混合物添加至HER2/HER3转染的CHO细胞。在90分钟的温育后，洗涤细胞，使用链霉抗生物素-PE检测生物素化的纳米抗体的结合。将获得的荧光信号与从其中在无周质提取物纳米抗体存在的情况下将生物素化的纳米抗体添加至细胞的条件下获得的信号相比较。
关于alphascreen竞争性测定，将人HER3-Fc(R&D Systems,348-RB)捕获在按照制造商的说明书(PerkinElmer)制备的缀合有抗-人Fc纳米抗体的受体珠粒上。为了评估抗-HER3纳米抗体的阻断能力，将周质提取物的稀释物添加至生物素化的纳米抗体(参见表C-2)之一。向该混合物中添加人HER3-Fc-受体珠粒，在室温下温育1小时。随后，加入链霉抗生物素偶联的供体珠粒，进一步于室温下温育1小时。使用680nm的激发波长和520nm的发射波长，利用EnVision Multilabel板读数器(PerkinElmer)测量荧光。
表C-2：用于表位竞争性FACS中的生物素化的纳米抗体浓度和用于alphascreen的人HER3-Fc的浓度。NA：不适用的
将非竞争性纳米抗体分类在不同的表位组中。基于alphascreen和FACS竞争结果鉴定了5个不同的组。
实施例3：hHER3-特异性纳米抗体的表达和纯化
基于描述的筛选测定，选择15种纳米抗体进行进一步的表征。此类纳米抗体属于13个不同的家族和5个不同的表位箱。序列示于表A-1(SEQ ID NO：12至26)。
将纳米抗体在500mL的培养体积中于大肠杆菌TG1细胞中表达为c-myc(His6-标记的蛋白质)。通过添加1mM IPTG，然后使其在37°C下继续3小时来诱导表达。在离心细胞培养物后，通过冻融沉淀和在dPBS中重悬浮来制备周质提取物。使用Histrap FF粗制柱(GEHealthcare)，将此类提取物用作用于固定金属亲和层析(IMAC)的起始材料。使用250mM咪唑从柱子洗脱纳米抗体，随后针对dPBS(杜伯科磷酸盐缓冲溶液)进行脱盐。
实施例4：ELISA中测定纯化的纳米抗体对hHER3的结合能力
在ELISA中测定14种纯化的纳米抗体(属于5个不同的表位箱)的结合能力。用hHER3-ECD(1μg/ml)涂覆96-孔板。使用小鼠抗c-myc(Roche)和抗-小鼠-HRP(Dakocytomation)测试和检测每一种纳米抗体的系列稀释物(从500nM降至6pM)。所有纳米抗体结合hHER3-ECD并且获得的EC50值示于表C-3中。
表C-3：通过ELISA测定的各种抗-HER3纳米抗体对hHER3-ECD的EC50值以及它们的95%置信区间(CI)
SEQ ID NO EC50(nM) CI95
04C07 15 0.86 0.5-1.6
05A09 19 1.45 0.92-2.3
17B05 13 0.63 0.35-1.13
17C08 20 0.62 0.4-0.96
17E08 25 1.02 0.48-2.15
18B05 14 0.4 0.2-0.83
18E08 17 4.7 3.3-6.8
18F05 12 0.29 0.15-0.55
18G11 16 0.72 0.39-1.33
21B02 21 1.1 0.7-1.6
21F06 22 0.3 0.14-0.65
23F05 23 0.46 0.28-0.77
34A04 24 0.57 0.35-0.92
34C07 18 0.46 0.26-0.8
实施例5：纯化的纳米抗体的亲和力
使用Biacore T100仪，通过胺偶联(对于激活，使用EDC/NHS；对于灭活，使用盐酸乙醇胺)将抗-人Fc抗体(GE Healthcare)涂覆至CM传感器芯片表面来进行亲和力测量。注射HER3-Fc(R&D systems,348-RB 5μg/ml；120秒；10μl/分钟)以允许利用涂覆的抗-Fc抗体进行捕获。随后，以10μl/分钟的流速注射纯化的纳米抗体，进行2分钟，以允许结合芯片结合的抗原。随后，以相同流速将无纳米抗体的结合缓冲液送至芯片上，以允许结合的纳米抗体自发解离。根据获得的不同纳米抗体的传感图计算动力学参数kon-值(ka)、koff-值(kd)和KD(表C-4)。
表C-4：纯化的HER3-特异性纳米抗体的动力学参数
ka(1/Ms) kd(1/Ms) KD(nM)
04C07 1.20E+06 2.60E-04 0.22
17B05 3.90E+05 4.30E-05 0.11
17C08* 8.40E+03 4.10E-04 48
17E08 3.63E+05 4.10E-05 0.11
18B05 4.90E+05 1.42E-04 0.29
18E08 1.04E+04 5.61E-04 53.8
18F05 4.27E+05 1.04E-04 0.24
18G11 2.60E+04 2.70E-04 10
21B02 2.20E+06 2.60E-03 1.22
21F06 1.80E+07 2.20E-03 0.12
23F05 3.10E+06 3.10E-03 0.99
34A04 2.63E+06 7.06E-03 2.7
34C07** 1.80E+04 2.50E-04 14
对照Fab1 7.03E+05 3.98E-04 0.57
对照Fab2 9.34E+04 2.59E-04 2.77
*异质曲线：呈现的主要相互作用的结果(89%)
＊＊异质曲线：呈现的主要相互作用的结果(84%)
实施例6：ELISA中测定纯化的纳米抗体对猕猴HER3的结合能力
在ELISA中测定选择的纯化的纳米抗体的结合能力。用cHER3-ECD(1μg/ml)(SEQID NO：4)涂覆96孔板。使用小鼠抗c-myc(Roche)和抗-小鼠-HRP(Dako cytomation)测试和检测每一种纳米抗体的系列稀释物(从500nM降至6pM的)。所有纳米抗体结合猕猴HER3-ECD并且获得的EC50值示于表C-5中。
表C-5：通过ELISA测定的各种抗-HER3纳米抗体对猕猴HER3-ECD的EC50值和它们的95%置信区间
EC50(nM) CI95
04C07 0.93 0.5-1.6
05A09 1.3 0.83-2.03
17B05 0.66 0.4-1.08
17C08 0.59 0.39-0.89
17E08 1.15 0.65-2.05
18B05 0.45 0.26-0.78
18E08 4.4 3.4-5.7
18F05 0.29 0.16-0.55
18G11 0.64 0.36-1.13
21B02 0.9 0.6-1.3
21F06 0.32 0.15-0.68
23F05 0.44 0.26-0.74
34A04 0.49 0.31-0.78
34C07 0.43 0.24-0.76
实施例7：纯化的纳米抗体的HER3-特异性
通过利用FACS测量纯化的HER3纳米抗体对用人HER1(SEQ ID NO：8)、人HER2(SEQID NO：9)或人HER4(SEQ ID NO：10)转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的结合能力来评估所述纳米抗体的脱靶结合。将非转染的细胞用于检查对细胞背景的结合。将纯化的HER3-特异性纳米抗体(2000-666-222nM)添加至2x105个细胞中，在4°C下温育30分钟后，使用小鼠抗-c-myc(Serotec)和山羊抗-小鼠-PE(Jackson Immuno-Research Laboratories)进行检测。将多克隆抗体(抗-HER1,R&D Systems AF231；抗-HER2,R&D Systems AF1129；抗-HER4,R&DSystems AF1131)的结合用作阳性对照。观察到纳米抗体21B02对HER2的低结合水平，然而其它纯化的纳米抗体不结合HER1、HER2和HER4转染的细胞(表C-6)。
实施例8：纯化的纳米抗体小组的表位作图
纳米抗体在不同表位箱中的分类是选择用于纯化和进一步表征的纳米抗体的重要标准(参见实施例2.9和3)。利用3个不同浓度的14种选择的纯化的纳米抗体(400、100和25nM)重复使用生物素化的纳米抗体04C07(也称为4C07)、21B02、23F05、18E08、17C08和04F10(也称为4F10)的FACS竞争性测定。属于组1和组2的纳米抗体非常相似但它们与纳米抗体04F10竞争的能力是不同的(表C-7)。组3和组4的纳米抗体也非常相似但它们与04F10和17C08竞争的能力是不同的。分类在一个表位组中的纳米抗体被认为结合相同表位，而不同表位组的纳米抗体被认为结合部分重叠(组1-2和组3-4)或非重叠表位。
表C-7：14种选择的纯化的纳米抗体相对于生物素化的纳米抗体的表位竞争性FACS。数据表示在400nM浓度的非生物素化的纳米抗体的百分比竞争。ND：未测定的
为了获得更多的关于被选择的纯化的纳米抗体识别的表位的知识，基于HER3细胞外结构域至4种不同结构域的分类，对各种人-鸡HER3嵌合蛋白质进行工程化。构建编码鸡HER3(基于序列Genbank登录号：DQ358720)的跨膜和细胞外区域的质粒和将来自人HER3的单个结构域交换至鸡构架中但使用人信号序列的变体：
-鸡Her3：AA1-25人，AA26-642鸡(SEQ ID NO：2)
-嵌合鸡Her3-人结构域1：AA1-206人，AA207-642鸡(SEQ ID NO：5)
-嵌合鸡Her3–人结构域2：AA1-25人，AA26-206鸡，AA207-328人，AA329-642鸡(SEQID NO：6)
-嵌合鸡Her3–人结构域4：AA1-25人，AA26-495鸡，AA496-642人(SEQ ID NO：7)
合成产生HER3编码片段，将其克隆入pcDNA3.1(Invitrogen)。利用鸡或嵌合HER3构建体瞬时转染HEK293(DSMZ)细胞。使用山羊抗-hHER3多克隆抗体(R&D systems)确认构建体的表面表达。将纳米抗体与瞬时转染的细胞一起温育，使用抗-c-myc和山羊抗-小鼠-PE检测结合。结合研究的结果示于图2中。概括而言，纳米抗体17B05、17E08、18B05、18F05和04C07(表位组1和2)识别人结构域1，而纳米抗体18E08和18G11(表位组3)结合人结构域2。纳米抗体17C08(表位组4)识别结构域1和结构域2。三种纳米抗体(21B02、21F06和23F05(表位组5))显示鸡交叉反应性，由此相应的表位不能被定位至特定的人HER3结构域。
结构域1参与配体结合，而参与HER二聚化的二聚化环位于结构域2中(Baselga和Swain,2009Nature Reviews Cancer第9卷,p463-475)。因此，纳米抗体结合结构域1的作用模式可与配体结合的抑制相关并且纳米抗体结合结构域2的作用模式可与阻断HER二聚化相关。
实施例9：FACS中测定纯化的纳米抗体的HRG1-β1竞争能力
在FACS竞争性实验中，使用利用hHER3转染的中国仓鼠卵巢细胞(CHO FlpIn,Invitrogen)测定纯化的HER3-特异性纳米抗体的HRG1-β1竞争能力。将每一种纳米抗体的系列稀释物(从600nM降至0.03nM)和0.8nM HRG1-β1-EGF(R&D systems,#396-HB)添加至细胞(2x105)中，在4°C下温育90分钟。在用FACS缓冲液洗涤细胞后，使用山羊抗-HRG ECD(R&Dsystems)和驴抗-山羊PE(JacksonImmunoResearch Laboratories)进行检测。除不竞争的纳米抗体18E08和18G11以及在600nM的纳米抗体浓度时仅部分阻断(75%)的纳米抗体17C08外，纳米抗体显示与HRG1-β1-EGF完全竞争对HER3的结合。获得的IC50值示于表C-8中。属于表位组3以及在较低程度上也属于组4的纳米抗体的较低的HRG1-β1阻断能力与它们对结构域2的结合以及阻断HER转磷酸化(作为作用模式)一致。
表C-8：通过FACS测定的HRG1-β1-EGF与各种抗-HER3纳米抗体对用HER3转染的CHO细胞的竞争的IC50值以及它们的95%置信区间。NA：不适用的
IC50(nM) CI95
04C07 4.26 3.13-5.81
17B05 33.4 29.04-38.40
17C08 部分竞争 NA
17E08 75.9 64.94-88.73
18B05 16.15 11.80-22.09
18E08 无竞争 NA
18F05 20.11 15.63-25.88
18G11 无竞争 NA
21B02 13.29 9.09-19.44
21F06 10.1 7.44-13.71
23F05 9.44 8.20-10.88
对照MAb1 9.4 7.5-11.8
对照MAb2 67.2 46.4–97.3
实施例10：纯化的纳米抗体对HER3、Akt和ERK1/2磷酸化的抑制
为了测定单价纳米抗体在抑制配体诱导的HER3磷酸化和下游信号转导中的效力，如下文中中所述在基于细胞的测定中测试纳米抗体。
MCF-7细胞中配体诱导的pHER3(phosphoHER3)的抑制(基于细胞的电化学发光测定(ECLA))：对MCF-7细胞(ATCC HTB 22)进行血清饥饿，在37°C,5%CO2下用无血清培养基中的纳米抗体(系列稀释物，起始浓度666nM)预温育60分钟。用50ng/ml HRG1-β1EGF结构域(R&D Systems,#396-HB)刺激细胞10分钟，弃去上清液，在冷NP-40裂解缓冲液(1%NP-40,20mM Tris,pH8.0,137mM NaCl,10%甘油,2mM EDTA,蛋白酶抑制剂混合物组III(Calbiochem),磷酸酶抑制剂混合物组II(Calbiochem))中裂解细胞。用PBS,pH7.4,0.05%Tween20中的3%的阻断A(MSD)封闭MA600096孔板(MSD,#L15XB)，用HER3特异性捕获抗体(R&D Systems,#MAB3481)涂覆板。加入细胞裂解物，在室温(RT)下温育2小时。生物素化的抗-磷酸酪氨酸抗体(R&D Systems,#BAM1676)和硫标记链霉抗生物素蛋白试剂(MSD,#R32AD)用于检测(表C-9)。
10.1下游信号转导(pAkt/pERK1/2）的抑制：
用纳米抗体预温育MCF-7细胞，如上所述刺激所述细胞。按照制造商的说明书在Phospho-Akt(Ser473)Whole Cell Lysate试剂盒(MSD,#K151CAD)和Phospho-ERK1/2WholeCell Lysate试剂盒(MSD,#K111DWD)测试细胞裂解物(表C-10)。
10.2EGFR/HER3和HER2/HER3转磷酸化的抑制：
对MDA MB468(ATCC HTB 132)和CHO HER2/HER3细胞进行血清饥饿，如上所述测试所述细胞(利用50ng/ml HRG1-β1EGF结构域刺激MDA MB468；利用100ng/ml HRG1-β1EGF结构域刺激CHOHER2/HER3细胞)。在pHER3ECLA中测试细胞裂解物(表C-9)。
表C-9纯化的纳米抗体对HRG1-β1依赖性HER3磷酸化的抑制
纳米抗体 MCF-7(IC50M) CHO-HER2/HER3(IC50M) MDA-MB468(IC50M)
04C07 1.07E-09 2.407E-09 6.68E-09
17B05 5.34E-09 1.18E-09 2.79E-08
18B05 5.18E-09 3.87E-09 3.00E-08
18F05 1.53E-09 3.03E-09 1.80E-08
17E08 4.51E-09 8.01E-10 2.46E-08
18E08 6.39E-08 <50% 1.01E-07
18G11 1.03E-08 2.13E-08 7.03E-09
05A09 9.12E-08 <50% 1.28E-07
34C07 1.89E-08 3.53E-08 1.07E-08
21B02 4.88E-08 <50% 9.99E-08
21F06 6.789E-09 1.447E-08 7.94E-09
23F05 1.77E-08 7.63E-08 2.41E-08
34A04 3.02E-08 1.34E-07 2.205E-08
17C08 8.98E-08 <50% 5.38E-08
<50%=低于50%的抑制
表C-10：HRG1-β1诱导的pAKT和pERK1/2的抑制
纳米抗体 pAkt(IC50M) pERK1/2(IC50M)
04C07 1.09E-08 2.79E-08
17B05 7.83E-09 2.36E-09
18B05 6.02E-09 <50%
18F05 8.04E-09 8.98E-08
17E08 5.78E-09 2.78E-09
18E08 5.69E-08 <50%
18G11 1.38E-07 <50%
05A09 2.898E-07 <50%
34C07 4.99E-08 1.00E-07
21B02 6.90E-08 <50%
21F06 2.31E-08 1.11E-07
23F05 4.648E-08 <50%
34A04 6.255E-08 3.13E-07
17C08 7.24E-07 <50%
<50%=低于50%抑制
纯化的纳米抗体在MCF-7细胞、分别表达EGFR/HER3(MDA MB468)或HER2/HER3(CHOHER2/HER3)的细胞中有力地抑制HRG1-β1诱导的HER3磷酸化，除在CHO HER2/HER3细胞中显示低于50%的pHER3的抑制的18E08、05A09、21B02和17C08外。PI3激酶途径(pAkt)的抑制可利用所有纳米抗体检测到。在更低的程度上，通过pERK1/2的下游信号转导可被纳米抗体阻断。
实施例9和10中描述的数据表明组3的纳米抗体阻断HER3的转磷酸化但不阻断配体结合。
实施例11：纯化的纳米抗体的迁移阻断能力
在下列测定中评估纳米抗体抑制HRG1-β1依赖性细胞迁移的能力。在纳米抗体(系列稀释物；始于666nM)存在的情况下，将A431细胞(CRL 1555)接种在HTS Fluoroblok 96孔板插入物(BD Falcon#351164)中。将培养基+500nM HRG1-β1细胞外结构域(R&D Systems,#377-HB)添加至底部孔中。用CalceinAM对迁移的细胞染色，通过板读数器检测荧光。可鉴定抑制配体依赖性癌细胞迁移的纳米抗体(表C-11)。
表C-11：HRG1-β1诱导的细胞迁移的抑制
纳米抗体 IC50M
04C07 6.52E-09
17B05 3.04E-09
18B05 <50%
18F05 1.52E-07
17E08 5.76E-08
18E08 <50%
21B02 <50%
21F06 4.00E-08
23F05 3.68E-07
04F10 无作用
17C08 无作用
18G11 6.79E-08
34C07 1.37E-07
<50%=低于50%的抑制
实施例12：形式化的纳米抗体的产生
多特异性的结构要求是将两个或更多个结合结构域融合在一起，具有允许对不同靶表位的同时结合的充足柔性和/或将具有不同作用模式(阻断配体结合和阻断HER二聚化)的结合结构域组合在一个分子中。
将结合不同表位的纳米抗体组合在一个分子中以及融合于抗-白蛋白结合性纳米抗体以增加分子的半衰期。在纳米抗体构建块之间插入GS-接头。两个HER3-特异性纳米抗体构建块的结合(同时无熵的显著丢失)增强了对靶的结合亲和力，从而导致更高的效力和/或更高的特异性。抗原上被靶向的表位的仔细选择和使得结合结构域具有最大柔性的接头的最佳设计导致靶的两个或更多个关键位点的阻断。选择的形式化的纳米抗体的氨基酸序列示于表A-2。
实施例13：单价纳米抗体17B05的HER1-HER3异二聚化阻断能力的分析
为了测定单价纳米抗体在抑制EGFR配体诱导的HER3磷酸化中的效力，如下所述在基于细胞的测定中测试纳米抗体。
CHO EGFR/Her3细胞中EGFR配体诱导的pHER3(phosphoHER3)的抑制(基于细胞的电化学发光测定(ECLA))：对CHO EGFR/Her3进行血清饥饿，在37°C,5%CO2下用无血清培养基中的纳米抗体或EGFR抗体西妥昔单抗(系列稀释物，起始浓度666nM或167nM)预温育60分钟。分别用100ng/ml rhTGFα(R&D Systems,#239-A)、EGF(Sigma#E-9644)或rh表皮调节素(R&D Systems,#1195EP)刺激细胞10分钟，弃去上清液，在冷NP-40裂解缓冲液(1%NP-40,20mM Tris,pH8.0,137mM NaCl,10%甘油,2mM EDTA,蛋白酶抑制剂混合物组III(Calbiochem),磷酸酶抑制剂混合物组II(Calbiochem))中裂解细胞。用PBS,pH7.4,0.05%Tween20中的3%的阻断A(MSD)封闭MA600096孔板(MSD,#L15XB)，用HER3特异性捕获抗体(R&D Systems,#MAB3481)涂覆板。加入细胞裂解物，在室温(RT)下温育2小时。生物素化的抗-磷酸酪氨酸抗体(R&D Systems,#BAM1676)和硫标记链霉抗生物素蛋白试剂(MSD,#R32AD)用于检测(表C-12)。
单价纳米抗体17B05能够有力地阻断EGFR配体诱导的HER3磷酸化，而结构域II粘合剂18G11和34C07不能阻断EGFR配体诱导的HER3磷酸化。
表C-12：EGFR配体诱导的HER3磷酸化的抑制
<50%=低于50%的抑制
实施例14：具有延长的半衰期(HLE)的多价亲代HER3-特异性纳米抗体的产生
为了产生阻断HRG对HER3的结合并且还阻断HER3的异二聚化的半衰期延长的纳米抗体产物，将单价先导小组纳米抗体(4C07、17C08、18G11、21F06、34C07和17B05)形式化成双价和多价分子。
为了延长半衰期，选择将构建体融合于抗-HSA纳米抗体ALB11。使用文库法产生所有可能的纳米抗体1-35GS-纳米抗体2-9GS-ALB11组合。将多价纳米抗体在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达为c-myc,His6-标记的蛋白质。通过逐步添加甲醇进行纳米抗体表达的诱导。将具有分泌的纳米抗体的澄清培养基用作用于固定金属亲和层析(IMAC)的起始材料，随后脱盐，产生至少90%的纯度，如通过SDS-PAGE评估的。使用20nM HRG和0.05nMHER3-Fc在HRG-阻断alphascreen中测试纯化的多价亲代HER3-特异性纳米抗体。结果表明最佳纳米抗体构建块决定形式化的纳米抗体的效力(表C-13)。纳米抗体21F06是该测定中效力最高的单价构建块(IC501.35E-11M)并且所有包含21F06作为构建块的构建体具有5.69E-12M至5.77E-11M的IC50。
实施例15：在细胞测定中具有ALB11HLE的多价亲代纳米抗体的HRG诱导的信号转 导阻断能力的分析
为了测定多价纳米抗体在抑制配体诱导的HER3磷酸化以及EGFR/Her3和Her2/Her3转磷酸化中的效力，如下所述在基于细胞的测定中测试纳米抗体。MCF-7细胞中配体诱导的pHER3(phosphoHER3)的抑制(基于细胞的电化学发光测定(ECLA))：对MCF-7细胞(ATCCHTB 22)进行血清饥饿，在37°C,5%CO2下用无血清培养基中的纳米抗体(系列稀释物，起始浓度666nM或167nM)预温育60分钟。用50ng/ml HRG1-β1EGF结构域(R&D Systems,#396-HB)刺激细胞10分钟，弃去上清液，在冷NP-40裂解缓冲液(1%NP-40,20mM Tris,pH8.0,137mMNaCl,10%甘油,2mM EDTA,蛋白酶抑制剂混合物组III(Calbiochem),磷酸酶抑制剂混合物组II(Calbiochem))中裂解细胞。用PBS,pH7.4,0.05%Tween20中的3%的阻断A(MSD)封闭MA600096孔板(MSD,#L15XB)，用HER3特异性捕获抗体(R&D Systems,#MAB3481)涂覆板。加入细胞裂解物，在室温(RT)下温育2小时。生物素化的抗-磷酸酪氨酸抗体(R&D Systems,#BAM1676)和硫标记链霉抗生物素蛋白试剂(MSD,#R32AD)用于检测(表C-14)。EGFR/HER3和HER2/HER3转磷酸化的抑制：如上所述血清饥饿和处理MDA MB468(ATCC HTB 132)和CHOHER2/HER3细胞(用50ng/ml HRG1-β1EGF结构域刺激MDA MB468；用100ng/ml HRG1-β1EGF结构域刺激CHO HER2/HER3细胞)。在pHER3ECLA中测试细胞裂解物(表C-14)。
具有Alb11的多价亲代纳米抗体在MCF-7细胞以及表达HER2/HER3的细胞(CHOHER2/HER3)和表达EGFR/HER3的细胞(MDA-MB468)中有力地抑制HRG1-β1诱导的HER3信号转导。
实施例16：细胞测定中具有ALB11HLE的多价亲代纳米抗体的EGFR-HER3异二聚化 阻断能力的分析
测试包含17B05(作为一个构建块)、Alb11和第二HER3纳米抗体(04C07、18G11,21F06、34C07或17B05)的多价亲代纳米抗体的阻断EGFR配体诱导的Her3磷酸化的能力。所有含17B08多价亲代纳米抗体在CHO EGFR/HER3细胞中有力地阻断TGFα诱导的pHER3，如对于单价17B05所显示的。
对CHO EGFR/HER3细胞进行血清饥饿，在37°C,5%CO2下用无血清培养基中的纳米抗体或EGFR抗体西妥昔单抗(系列稀释物，起始浓度166.7nM)预温育60分钟。用100ng/mlrhTGFα(R&D Systems,#239-A)刺激细胞10分钟，弃去上清液，在冷NP-40裂解缓冲液(1%NP-40,20mM Tris,pH8.0,137mM NaCl,10%甘油,2mM EDTA,蛋白酶抑制剂混合物组III(Calbiochem),磷酸酶抑制剂混合物组II(Calbiochem))中裂解细胞。用PBS,pH7.4,0.05%Tween20中的3%的阻断A(MSD)封闭MA600096孔板(MSD,#L15XB)，用HER3特异性捕获抗体(R&D Systems,#MAB3481)涂覆板。加入细胞裂解物，在室温(RT)下温育2小时。生物素化的抗-磷酸酪氨酸抗体(R&D Systems,#BAM1676)和硫标记链霉抗生物素蛋白试剂(MSD,#R32AD)用于检测(表C-15)。
表C-15：具有Alb11HLE和17B05的多价亲代纳米抗体对TGFα诱导的HER3磷酸化抑制
<50%=低于50%的抑制
实施例17：具有ALB11HLE的多价亲代纳米抗体对HER3内化的诱导
使用MCF-7和MALME-3M细胞评估HER3-特异性纳米抗体对HER3内化的作用。将细胞以105个细胞/ml的浓度接种在6孔板中，在37°C下于细胞培养箱中温育2天。随后，在添加或不添加5μMHSA(Sigma,A8763)的情况下添加100nM纳米抗体，将细胞在4°C或37°C温育2小时。将具有对照MAb1的孔和不具有任何纳米抗体或MAb的孔分别用作阳性和阴性对照。在洗涤细胞后，收获它们，用抗-HER3(R&D systems,#AF234)和驴抗-山羊-PE(JacksonImmunoResearch Laboratories)进行染色。使用FACS阵列(Becton Dickinson)测量样品，通过将在37°C条件下获得的HER3表面表达的信号与4°C下的阴性对照条件的所述信号相比较来测定百分比内化。单价纳米抗体都不能诱导HER3内化，而二价17B05诱导17.8%的内化。二价18G11、34C07、4C07和21F06诱导60-70%的内化，其略微高于阳性对照MAb1(57%内化)。双互补位构建体对HER3内化的诱导依赖于它们各自的组成。当21F06存在于构建体中时未观察到内化。在不具有21F06的构建体中，仅当17B05或04C07位于N末端位置时才观察到内化(40-70%)。在两种细胞系中获得了相同的结果。
实施例18：序列优化
将纳米抗体4C07、17B05、21F06、18G11和34C07进一步用于序列优化。这是其中将亲代纳米抗体序列进行突变以产生与人VH3-JH种系共有序列更同一的纳米抗体序列的过程。除所谓的标志残基外，以使蛋白质结构、活性和稳定性保持不变的方式将FR中的纳米抗体与人VH3-JH种系共有序列之间不同的特定氨基酸改变成人对应物。还将亲代纳米抗体氨基酸序列与纳米抗体的骆驼IGHV种系氨基酸序列(鉴定为来自针对骆驼IGHV种系的纳米抗体的BlastP分析的最高命中(top hit))进行比对，在某些情况下，引入朝向骆驼种系的突变以增强纳米抗体的稳定性，这被定义为骆驼源化(llamanisation)。此外，改变翻译后修饰(PTM，如脱酰胺作用、异构化、甲硫氨酸氧化)的潜在位点以保证化学稳定性。在两轮中进行分析，在第一轮中，评估基本变体上的单突变和组合突变。基于这些结果，将可接受的置换组合于第二轮变体，进一步表征该变体。
为了人源化目的可置换04C07中的6个氨基酸残基。在序列优化过程中，构建4个04C07形式(基本形式和3个另外的变体)。基本变体(HER3MS0042)包含4个置换：A14P、A74S、K83R和Q108L。除了这些变化外，还将A46E和L93A置换引入另外的变体，并且在所述变体中研究所述置换。在大肠杆菌中表达构建体，通过IMAC和脱盐进行纯化。
使用alphascreen评估纯化的分子的HRG阻断能力。还使用Lightcycler(Roche)在热偏移测定(thermal shift assay)中测试变体的热稳定性。在该测定中，在宝石橙存在的情况下在不同的pH下温育纳米抗体变体，使用温度梯度。当纳米抗体开始变性时，宝石橙结合并且测量的荧光突然增加。可测定特定pH下的熔化温度。结果概述于C-16中。
表C-16：04C07的第一轮序列优化变体的结果
基本变体在HRG阻断alphascreen中具有与亲代04C07纳米抗体相似的效力，这意味着位置14、74、84和108上的突变是可接受的。在变体HER3MS0043(A46E)和HER3MS0044(L93A)中观察到降低至1/4至1/3的效力，如果将它们组合，这将使效力降至1/18。所有变体对稳定性具有正面影响，因为获得了比亲代04C07纳米抗体更高的Tm值。翻译后修饰位点的分析显示位置N101上的脱酰胺作用(于40°C下贮存4周后22-29%脱酰胺，在pH9和25°C下贮存3天后9-14%脱酰胺)。制备了N101X的文库，将其转染入大肠杆菌，在竞争性FMAT中测试包含纳米抗体的周质裂解物的HRG阻断能力以及它们在重组HER3上的解离率。所有测试的变体提供99-100%的阻断和为亲代04C07纳米抗体的2-3倍的解离率。选择变体N101G和N101S用于进一步表征。于40°C下贮存4周形成6.6%的焦谷氨酸，这是可接受的，并且不需要位置1上的氨基酸置换。在第二轮序列优化中产生4个变体。它们是基本变体与置换A46E、N101G或N101S的组合(表C-17)。置换A46E的引入导致在HRG竞争性alphascreen中显著的效力降低，然而MCF7细胞的pHER3阻断测定在另一方面增加了稳定性，因为观察到4.5°C的Tm增加。这些结果与第一轮序列优化结果是一致的。N101至G或S的突变使效力降低至1/6至1/5，以及使Tm降低1.5-2°C。选择变体HER3MS00129和HER3MS00130用于进一步表征，因为形式化可在单价形式中掩盖它们更低的效力。基于AbM定义，HER3MS00129的构架区中的百分比构架同一性为95.5%，HER3MS00130的为94.4%。
表C-17：04C07的第二轮序列优化变体的结果
为了人源化/骆驼源化目的可置换21F06中的5个氨基酸残基，为了化学稳定性目的可分析5个氨基酸置换。在序列优化过程中，构建4个21F06形式(基本形式和3个另外的变体)。基本变体(HER3MS0046)包含4个置换：A14P、A74S、K83R和Q108L。除了这些变化外，还将G40A和D44E置换引入另外的变体，并且在所述变体中研究所述置换。在大肠杆菌中表达构建体，通过IMAC和脱盐进行纯化。使用alphascreen评估纯化的分子的HRG阻断能力。还使用宝石橙和应用温度梯度在热偏移测定中测试变体的热稳定性。当纳米抗体开始变性时，宝石橙结合并且测量的荧光突然增加。可测定特定pH下的熔化温度。结果概述于表C-18中。
表C-18：第一轮序列优化中21F06人源化变体的结果
所有测试的变体在HRG阻断alphascreen中具有与亲代21F06抗体相似的效力，意味着位置14、40、44、74、84和108上的突变是可接受的。G40A置换导致增加的Tm值，这表明其对纳米抗体的稳定性具有正效应。为了处理2个潜在的异构化位点和一个Met氧化位点，制备了其中对氨基酸D54、G55、M100b、D101和S102进行了随机化的文库。在TG1中转化文库，挑选单个克隆，将其生长在96孔板中。制备周质提取物，对其进行测序和筛选。所测试的变体以及21F06亲代都在HRG竞争性FMAT实验中提供完全阻断并且解离率分析也不能区分此类变体与21F06亲代(6.2E-4–8.3E-4)。选择(基于原始和置换的氨基酸的相似特征)一些变体来进行纯化以及测试它们的热稳定性。结果示于C-19中。
表C-19：第一轮序列优化中21F06化学稳定性变体的Tm结果
ID 突变 pH 7下的Tm(°C)
HER3MS21F06 亲代(P) 64
HER3MS00088 P+D54Y-Q108L 60.7/61.06
HER3MS00089 P+D54E-Q108L 61.1/61.9
HER3MS00090 P+G55A-Q108L 54.8
HER3MS00091 P+M100bF-Q108L 56.1/56.8
HER3MS00092 P+M100bY-Q108L 56.9/57.3
HER3MS00093 P+M100bL-Q108L 60.7
HER3MS00094 P+D101Q-Q108L 62.3
HER3MS00095 P+D101E-Q108L 60.3/60.7
HER3MS00096 P+S102D-Q108L 50.3
HER3MS00097 P+S102E-Q108L 55.7
HER3MS00098 P+S102T-Q108L 65.2
在40°C下贮存4周后，翻译后修饰位点的分析显示14%的焦谷氨酸，并且在位置1上未引入置换。在室温下用10mM H2O2处理3小时后观察到13%的单氧化的物质。M100b置换是需要的，基于筛选数据和M与L之间的物理相似性选择突变M100bL。在施加的脱酰胺条件下(40°C下进行4周或在pH9和25°C下进行3天)亲代21F06的贮存在位置N73上诱导了20%的脱酰胺。然而，在25°C下贮存3周后，百分比脱酰胺仅为3.2。包含基本突变A74S的21F06变体的分析显示略微更高的脱酰胺百分比：在施加的脱酰胺条件(在pH9和25°C下进行3天)贮存后37.1%脱酰胺，在25°C下贮存3周后4.9%脱酰胺。得出结论：将A74S保持用于在第二轮序列优化中进一步表征，因为其与人抗体相比较增加了构架同一性的百分比，并且可在DSP/USP过程中将脱酰胺保持被控制，因为在25°C条件下仅观察到低于5%的脱酰胺部分。最后，对于D54观察到12.9%的脱酰胺，基于筛选数据和D与E之间的物理相似性选择了突变D54E。
制备第二轮21F06序列优化变体HER3MS00122，其组合了置换A14P、G40A、D44E、A74S、K83R和Q108L。该变体和亲代21F06在使用MCF7细胞的HRG alphascreen竞争性测定中以及在pHER3阻断测定中产生相似的IC50并且显示相同的Tm值。21F06变体HER3MS00122在根据AbM定义的构架区中具有91%的构架同一性。
基于这些结果，选择了HER3MS00122作为终序列优化的21F06纳米抗体。
为了人源化目的可置换18G11中的5个氨基酸残基，为了化学稳定性目的可分析4个氨基酸置换。在该情况下，制备包含突变K83R和Q108L的基本变体。然后，构建了在位置44、61、64、74、75和77上具有26=64个排列的基本变体的微小文库。未研究突变H93A，因为该突变靠近CDR3，这增加了人源化影响纳米抗体的效力的机会。
在TG1中转化文库，挑选单个集落，将其生长在96孔板中。制备周质提取物，测定其序列，就与生物素化的亲代18G11竞争对重组HER3-Fc的结合对其进行筛选。亲代18G11纳米抗体与其基本变体HER3MS0050在alphascreen中显示相同的效力(IC503.2E-9M)和相同的72°C的Tm。置换W75K是不可耐受的，因为观察到HER3结合的完全丧失。测试33个独特的竞争物在重组HER3-ECD上的解离率。大多数克隆在为亲代18G11的2倍kd的范围内(kd 6.2-7.7E-4s-1)，只有3个变体显示2-3倍的解离率。结果表明置换E64K、T74S、A77T、K83R、Q108L对18G11的效力或稳定性没有影响，然而在置换R44Q存在的情况下观察到28%的效力的降低。然而，R44Q置换使Tm值升高约4°C，表明分子的稳定性得到增强。
翻译后修饰位点的分析显示在于40°C下贮存4周后在位置1上形成12.3%的焦谷氨酸，但该水平不需要E1的置换。在于40°C下贮存4周后未检测到位置95上的异构化变体，仅在氨基酸M99和M102上观察到显著的氧化：在施加氧化(在室温下使用10mM H2O2进行3小时)后30-40%的单氧化变体。制备2个置换文库来处理这些Met氧化位点(M99X和M102X)。在TG1中转化文库，挑选单个集落，将其生长在96孔板中。制备周质提取物，对其进行测序，就与生物素化的亲代18G11竞争结合重组HER3-Fc对其进行筛选。随后，在重组HER3-ECD的解离率筛选中测试18个独特竞争物。16个克隆显示与亲代18G11相同的kd值(6.10E-4s-1)。选择7个变体用于纯化以及在MCF7细胞中表征它们阻断pHER3信号转导的能力，使用热偏移测定表征它们的稳定性。结果示于表C-20中。基于效力、稳定性以及亮氨酸和甲硫氨酸的相似物理性质，选择了置换M99L和M102L在第二轮序列优化中进行测试。
表C-20：第一轮序列优化中的18G11变体的结果
在第二轮18G11序列优化中，制备了2个变体：为了人源化和化学稳定性目的组合了选择的置换。两个变体之间唯一的差别为R44Q的存在/不存在。两个变体都显示了与亲代纳米抗体相比较约6°C的Tm值的增加(表C-21)。最后，选择18G11变体HER3MS00211，因为R44Q突变的不存在导致略微更好的效力。根据AbM定义(参见Antibody Engineering,第2卷，Kontermann&Dübel(Eds),Springer Verlag Heidelberg Berlin,2010)获得的构架区的百分比构架同一性为87.6。
表C-21：第二轮序列优化中的18G11变体的结果
为了人源化目的可置换34C07中的7个氨基酸残基。在该情况下，制备包含K83R和Q108L的基本变体。随后构建具有分布在6个可变位置上的7个另外独特的突变的基本变体的微小文库(25x 3=96个排列)。未研究突变H93A，因为该突变靠近CDR3，这增加了人源化可影响纳米抗体的效力的机会。在TG1中转化文库，挑选单个集落，将其生长在96孔板中。制备周质提取物，测定其序列，就与生物素化的亲代34C07竞争结合重组HER3-Fc对其进行筛选。测试12个独特的竞争物在重组HER3-ECD上的解离率。大多数克隆在为亲代34C07的2倍kd的范围内(kd 3.7E-4–3.9E-4s-1)。突变W75K在34C07竞争性alphascreen中显示低于40%的抑制以及为亲代34C07的94倍的解离率。置换G19R、V23A、V71R、A74S、V84P和V84A不影响对HER3的结合。
翻译后修饰位点的分析显示在于40°C下贮存4周后42%的焦谷氨酸形成。因此，在第二轮序列优化中分析置换E1D对纳米抗体效力的影响。未鉴定出氧化(在室温下使用10mMH2O2进行3小时)、脱酰胺(在40°C进行4周)或Asp异构化(在40°C下进行4周)，因此为了化学稳定性目的不需要置换另外的氨基酸。
在第二轮序列优化中制备4个构建体。它们全都包含置换G19R、V23A、V71R、A74S、K83R和Q108L，但对于E1D、V84A和V84P是不同的(表C-22)。在大肠杆菌中表达构建体，通过IMAC和脱盐进行纯化。使用34C07竞争性alphascreen表征纯化的分子，在HRG刺激的MCF7细胞中在HER3-ECD和pHER3阻断测定中进行解离率分析。结果概述于表C-22中。
表C-22：第二轮序列优化中的34C07变体的结果
确认了所研究的置换不显著影响结合。此外，pHER3阻断、解离率和Tm对于所有测试的变体和亲代34C07纳米抗体是相似的。最终的变体为HER3MS00123和HER3MS00127(包含E1D突变以免纳米抗体N末端地位于多价构建体中)。基于AbM定义，HER3MS00123的构架区中百分比构架同一性为89.9%，对于HER3MS00127为88.8%。
为了人源化目的可转换17B05中的6个氨基酸残基，并且为了化学稳定性目的可分析两个氨基酸置换。在该情况下，制备包含突变A74S、K83R和Q108L的基本变体。随后，制备包含基本突变和3个被研究的另外突变(I73N、F79Y和R93A)的组合的9个构建体。
在大肠杆菌中表达构建体，通过IMAC和脱盐进行化。使用alphascreen测试纯化的分子阻断HRG对HER3-Fc的结合的能力，HER3-ECD上的解离率以及使用热偏移测定测试稳定性。结果概述于C-23中。
表C-23：第一轮序列优化中的17B05变体的结果
当将置换R93A引入构建体时，在HRG阻断alphascreen中观察到效力降低至至少1/9，然而其它置换产生与亲代17B05相比较相似的IC50。该观察得到解离率数据的确认。大多数置换也对Tm值具有小的正效应。
翻译后修饰位点的分析显示在于40°C下贮存4周后形成25%的焦谷氨酸。因此，在第二轮序列优化中分析置换E1D对纳米抗体效能的影响。未鉴定出氧化(在室温下使用10mMH2O2进行3小时)或Asn脱酰胺(在40°C下进行4周)，因此对于化学稳定性目的不需要置换另外的氨基酸。
在第二轮序列优化中制备4个构建体。它们全都包含置换I73N、F79Y、A74S、K83R和Q108L，但对于E1D、S84A和S84P是不同的(表C-24)。在大肠杆菌中表达构建体，通过IMAC和脱盐进行纯化。在HER3-Fc上使用HRG竞争性alphascreen表征纯化的分子，在MCF7细胞中在HER3-ECD和pHER3阻断测定中进行解离率分析。结果概述于表C-24中。
表C-24：第二轮序列优化中的17B05变体的结果
确认了所研究的置换不显著影响结合和HRG竞争。此外，对于pHER3阻断的IC50，所有测试的变体和亲代17B05纳米抗体是相似的。S84P的引入对Tm具有正效应。最终的变体成为HER3MS00119和HER3MS00121(包含E1D突变以免纳米抗体N末端地位于多价构建体中)。基于AbM定义，HER3MS00119的构架区中百分比构架同一性为89.9%，对于HER3MS00121为88.8%。
实施例19：具有HLE的多价序列优化的HER3-特异性纳米抗体的产生和表达水平分 析
组合了阻断HRG对HER3的结合的序列优化的纳米抗体(21F06、04C07和17B05)、阻断HER3异二聚化的纳米抗体(17B05)和结合HER3的结构域II的纳米抗体HER3(18G11)。ALB半衰期延长位于中间(Nb1-ALB-Nb2)或位于C末端位置(Nb1-Nb2-ALB)。利用两个9GS接头或两个35GS接头连接不同构建块。在毕赤酵母中将构建体产生为无标记蛋白质，通过MEPhypercell或蛋白A亲和层析，然后进行脱盐来纯化所述蛋白质。进行拷贝数筛选，基于小规模培养预测具有最多拷贝数的克隆的表达产率(表C-25)。几乎未观察到纳米抗体构建块的位置和接头长度对预测的产率的影响。
表C-25：具有ALB11HLE的纯化的多价序列优化的抗-HER3纳米抗体的表达水平分析的结果
实施例20：具有ALB11HLE的多价序列优化的纳米抗体对HER3内化的诱导
如先前实施例中所述，使用MCF-7和MALME-3M细胞评估具有HLE的HER3-特异性多价序列优化的纳米抗体对HER3内化的影响。当21F06存在于多价构建体中时，未观察到内化。在不具有21F06的构建体中，仅当17B05或04C07存在于N末端位置时才观察到内化(36-71%)。两个细胞系中的结果是相同的(表C-26)。构建体HER3MS00209由连接于ALB11的序列优化的17B05组成并且未显示内化。这些结果与利用亲代多价构建体获得的结果相似，表明选择的多价小组包含具有不作用模式的分子。还在内化测定中测试了两个对照抗体，它们都诱导HER3的内化。
实施例21：在细胞测定中具有ALB11HLE的多价序列优化的纳米抗体对HRG诱导的 pHER3和下游信号转导的抑制
为了测定多价序列优化的纳米抗体在抑制配体诱导的HER3磷酸化以及EGFR/HER3和HER2/HER3转磷酸化中的效力，如下所述在基于细胞的测定中测试纳米抗体。
MCF-7细胞中配体诱导的pHER3(phosphoHER3)的抑制(基于细胞的电化学发光测定(ECLA))：对MCF-7细胞(ATCC HTB 22)进行血清饥饿，在37°C,5%CO2下用无血清培养基中的纳米抗体(系列稀释物，起始浓度666nM或167nM)预温育60分钟。用50ng/ml HRG1-β1EGF结构域(R&D Systems,#396-HB)刺激细胞10分钟，弃去上清液，在冷NP-40裂解缓冲液(1%NP-40,20mM Tris,pH8.0,137mM NaCl,10%甘油,2mM EDTA,蛋白酶抑制剂混合物组III(Calbiochem),磷酸酶抑制剂混合物组II(Calbiochem))中裂解细胞。用PBS,pH7.4,0.05%Tween20中的3%的阻断A(MSD)封闭MA600096孔板(MSD,#L15XB)，用HER3特异性捕获抗体(R&D Systems,#MAB3481)涂覆板。加入细胞裂解物，在室温(RT)下温育2小时。生物素化的抗-磷酸酪氨酸抗体(R&D Systems,#BAM1676)和硫标记链霉抗生物素蛋白试剂(MSD,#R32AD)用于检测(表C-27)。
21.1EGFR/HER3和HER2/HER3转磷酸化的抑制：
如上所述对MDA MB468(ATCC HTB 132)和CHO HER2/HER3细胞进行血清饥饿和进行处理(利用50ng/ml HRG1-β1EGF结构域刺激MDA MB468；利用100ng/ml HRG1-β1EGF结构域刺激CHO HER2/HER3细胞)。在pHER3ECLA中测试细胞裂解物(表C-27)。
具有Alb11的多价序列优化的纳米抗体在MCF-7细胞以及表达HER2/HER3的细胞(CHO HER2/HER3)或表达EGFR/HER3的细胞(MDA-MB468)中有力地抑制HRG诱导的HER3信号转导。另外，下游信号转导被有力地抑制。Alb11不消除所测试的形式中的效力。
21.2下游信号转导(pAkt/pERK1/2)的抑制：
下游信号转导(pAkt/pERK1/2)的抑制：MCF-7细胞中配体诱导的pAKT和pERK(phosphoAkt,phosphor ERK)的抑制(基于细胞的电化学发光测定(ECLA))：对MCF-7细胞(ATCC HTB 22)进行血清饥饿，在37°C,5%CO2下用无血清培养基中的纳米抗体(系列稀释物，起始浓度666nM或167nM)预温育60分钟。用50ng/ml HRG1-β1EGF结构域(R&D Systems,#396-HB)刺激细胞10分钟，弃去上清液，在冷NP-40裂解缓冲液(1%NP-40,20mM Tris,pH8.0,137mM NaCl,10%甘油,2mM EDTA,蛋白酶抑制剂混合物组III(Calbiochem),磷酸酶抑制剂混合物组II(Calbiochem))中裂解细胞。按照制造商的说明书，在Phospho-Akt(Ser473)Whole Cell Lysate试剂盒(MSD,#K151CAD)和Phospho-ERK1/2Whole Cell Lysate试剂盒(MSD,#K111DWD)中测试细胞裂解物(表C-28)。
形式化的序列优化的纳米抗体能够有力地阻断HRG-诱导的HER3的下游信号转导。
表C-28：HRG诱导的pAKt和pERK的抑制
实施例22：在细胞测定中具有ALB11HLE的多价序列优化的纳米抗体的HER1-HER3 异二聚化阻断能力的分析
为了测定多价序列优化的纳米抗体在抑制EGFR配体诱导的HER3磷酸化中的效力，如下所述在基于细胞的测定中测试纳米抗体。
CHO EGFR/HER3细胞中EGFR 配体诱导的pHER3(phosphoHER3)的抑制(基于细胞的电化学发光测定(ECLA))：对CHO EGFR/HER3进行血清饥饿，在37°C,5%CO2下用无血清培养基中的纳米抗体(系列稀释物，起始浓度666nM或167nM)预温育60分钟。用100ng/ml rhTGFα(R&D Systems,#239-A)刺激细胞10分钟，弃去上清液，在冷NP-40裂解缓冲液(1%NP-40,20mM Tris,pH8.0,137mM NaCl,10%甘油,2mM EDTA,蛋白酶抑制剂混合物组III(Calbiochem),磷酸酶抑制剂混合物组II(Calbiochem))中裂解细胞。用PBS,pH7.4,0.05%Tween20中的3%的阻断A(MSD)封闭MA600096孔板(MSD,#L15XB)，用HER3特异性捕获抗体(R&D Systems,#MAB3481)涂覆板。加入细胞裂解物，在室温(RT)下温育2小时。生物素化的抗-磷酸酪氨酸抗体(R&D Systems,#BAM1676)和硫标记链霉抗生物素蛋白试剂(MSD,#R32AD)用于检测(表C-29)。
包含17B05作为构建块的多价序列优化的纳米抗体有力地抑制EGFR配体诱导的HER3磷酸化。对于多价纳米抗体214(HER3MS00214)观察到部分抑制，所述抗体不包含17B05作为构建块。
表C-29：EGFR配体诱导的HER3磷酸化的抑制
*部分抑制
实施例23：具有ALB11HLE的多价序列优化的纳米抗体的迁移阻断能力
在下列测定中评估形式化序列优化的纳米抗体抑制HRG1-β1依赖性细胞迁移的能力。在纳米抗体(系列稀释物；始于666nM)存在的情况下将A431细胞(CRL 1555)接种在HTSFluoroblok 96孔板插入物(BD Falcon#351164)中。将培养基+500nM HRG1-β1细胞外结构域(R&D Systems,#377-HB)添加至底部孔中。用CalceinAM对迁移的细胞染色，通过板读数器检测荧光。纳米抗体HER3MS00135、HER3MS00212和HER3MS00215有力地抑制A431细胞迁移(表C-30)。所有测试的形式化的序列优化的纳米抗体有力地阻断配体诱导的细胞迁移。
表C-30：HRG诱导的A431细胞迁移的抑制
构建体 IC50(M)
HER3MS00135 2.09E-10
HER3MS00209 1.46E-08
HER3MS00212 4.46E-09
HER3MS00213 7.09E-10
HER3MS00214 8.54E-11
HER3MS00215 9.75E-09
实施例24：具有HLE的多价序列优化的HER3-特异性纳米抗体的HER3特异性
通过测量具有HLE的多价HER3-特异性纳米抗体对涂覆在ELISA板上的Fc-HER1(R&D Systems,344-ER)、Fc-HER2(R&D Systems,1129-ER)和Fc-HER4(R&D Systems,1131-ER)的结合能力来评估它们的脱靶结合。测试纳米抗体的系列稀释物(始于500nM的浓度)，使用生物素化的ALB-特异性纳米抗体02H05和链霉抗生物素蛋白-HRP(Dako,P0397)进行检测。将对Fc-HER3(R&D Systems,348-RB)的结合用作HER3-特异性纳米抗体的阳性对照。将多克隆抗体抗-HER1(R&D Systems,AF231)、抗-HER2(R&D Systems,AF1129)、抗-HER3(R&DSystems,AF234)和抗-HER4(R&D Systems,AF1131)用作涂覆在板上的HER的质量对照。图3A至3D中的结果显示多价序列优化的纳米抗体结合HER3(图3B)但不结合其它HER蛋白(图3A、3C和3D)。
实施例25：具有HLE的多价序列优化的HER3-特异性纳米抗体的物种交叉反应性
通过FACS测量具有HLE的多价序列优化的HER3-特异性纳米抗体对于以人HER3、小鼠HER3或猕猴HER3转染的中国仓鼠卵巢Flp-In细胞的结合能力来分析此类分子的物种交叉反应性。将始于1μM的浓度的系列稀释物与细胞一起温育，使用生物素化的ALB-特异性纳米抗体02H05和链霉抗生物素蛋白-PE(BD Pharmingen,554061)进行检测。当将对人HER3的结合与对小鼠HER3或猕猴HER3的结合相比较时，获得的EC50值最大差别4.4倍，这表明人、小鼠和猕猴HER3之间的交叉反应性(表C-31)。
实施例26：具有ALB11HLE的多价序列优化的HER3-特异性纳米抗体对血清白蛋白 的结合
使用Biacore通过表面等离子体共振技术测定3个具有ALB11半衰期延长的多价序列优化的HER3-特异性纳米抗体对人、小鼠和猕猴血清白蛋白的结合亲和力。通过胺偶联(对于激活，使用EDC/NHS；对于灭活，使用盐酸乙醇胺)将人血清白蛋白(Sigma#A3782)、猕猴血清白蛋白(内部产生)和小鼠血清白蛋白(Sigma,#A3559)共价结合于传感器芯片表面。以45μl/分钟的流速注射纳米抗体2分钟以使能够结合芯片结合的抗原。随后，以相同流速将结合缓冲液送至芯片上，以使结合的纳米抗体自发解离。根据获得的不同纳米抗体的传感图计算动力学参数kon-值(ka)、koff-值(kd)和KD(表C-32)。
表C-32：多价序列优化的HER3-特异性纳米抗体的动力学参数
实施例27：人癌细胞系中pHER3和下游信号转导的抑制.
形式化的序列优化的纳米抗体在人癌细胞中有力地抑制pHER3和下游信号转导，如对于MCF-7(上文中实施例21)和其它细胞系如BxPC3(胰腺癌细胞系)和BT-474(乳腺癌细胞系)所显示的。
17B05和形式化的纳米抗体(包括序列优化的17B05(HER3MS00119)作为构建块)在EGFR/HER3驱动的(在BxPC3细胞中)以及HER2/HER3(BT-474,过表达Her2的细胞系)细胞系中抑制HER3信号转导。
对BxPC3(ATCC CRL-1687)和BT-47(ATCC HTB-20)细胞进行血清饥饿，在37°C,5%CO2下用纳米抗体(系列稀释物，起始浓度167nM)预温育60分钟。用100ng/ml HRG1-β1EGF结构域(R&D Systems,#396-HB)刺激细胞10分钟，弃去上清液，在4°C下于冷RIPA裂解缓冲液(1%NP-40(Nonidet P40),0.5%(V/V)脱氧胆酸钠,0.1%(V/V)SDS,50mM Tris/HCl,pH 7.5,150mM NaCl,5mM EDTA,蛋白酶抑制剂混合物组III(Calbiochem),磷酸酶抑制剂混合物组II(Calbiochem))中裂解细胞45分钟。离心后，将4x样品缓冲液(Biorad#161-0791)添加至上清液中，通过SDS-PAGE(Criterion XT预制胶,4-12%,Bis Tris,Biorad#345-0125)，然后通过WB分析样品。检测抗体：pHER3Tyr1289(Cell Signaling#4791)、pHER3pTyr1197(CellSignaling#4561)、pAkt(Ser473)(Cell Signaling#4060)、pERK1/2(Thr202/Thr204)(CellSignaling#9101)、HER3(Millipore#05-390)、Akt(Cell Signaling#9272)、EKR1/2(CellSignaling#4695)。
结果示于图5A和5B中，以及图6A至6C中。图5显示形式化的序列优化的纳米抗体对BT-474乳腺癌细胞的pHER3和下游信号转导的抑制：图5A)：泳道1-6纳米抗体HER3MS00135(0、0.65、2.7、10、42、167nM)，泳道7-12纳米抗体HER3MS00212(0、0.65、2.7、10、42、167nM)，泳道13-18纳米抗体HER3MS00215(0、0.65、2.7、10、42、167nM)，泳道19未处理的、未刺激的细胞。图5B)：泳道7-12纳米抗体HER3MS00119(0、0.65、2.7、10、42、167nM)。图6显示形式化的序列优化的纳米抗体对BxPC3乳腺癌细胞的pHER3和下游信号传导的抑制：图6A)：泳道13-18纳米抗体HER3MS00119(0、0.65、2.7、10、42、167nM)，泳道19-24HER3MS00135(0、0.65、2.7、10、42、167nM)。图6B)泳道1-6HER3MS00213(0、0.65、2.7、10、42、167nM)、7-12HER3MS00214(0、0.65、2.7、10、42、167nM)。图6C)：泳道1-6HER3MS00209(0、0.65、2.7、10、42、167nM)，泳道7-12HER3MS00212(0、0.65、2.7、10、42、167nM)，泳道13-18HER3MS00215(0、0.65、2.7、10、42、167nM)，泳道19未处理的、未刺激的细胞，泳道20-24无关对照纳米抗体(0.65、2.7、10、42、167nM)。
实施例28：A549体内模型：形式化的序列优化的纳米抗体对肿瘤生长的抑制
为了评估形式化的序列优化的纳米抗体的功效，在裸小鼠中建立人肺癌的A549异种移植物模型，并且在多个剂量上评估肿瘤生长的抑制。T细胞缺乏裸/裸小鼠(源于NIH的outbread,白化病背景的6周龄雌性小鼠)购自Charles River实验室(Wilmington,MA)，用于异种移植物研究。将A549细胞(ATCC,CCL-185)生长在培养基(RPMI,10%FBS；L-谷氨酰胺,37°C,5%CO2)。在右侧腹上用100μl PBS中的5E+6个细胞皮下注射小鼠。监测最初肿瘤生长和体重。13天后，肿瘤达到174mm3的平均体积，将小鼠随机分入10个小组。每三天分别用1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg的纳米抗体HER3MS00135、HER3MS00212或HER3MS00215给小鼠腹膜内给药一次。将Alb11用作对照(10mg/kg)。将PBS用作媒介物对照。处理持续时间为20天。每周记录两次肿瘤体积和体重。利用单因素方差检验，随后利用Dunnett’s事后比较分析相对于对照的百分比体重数据。利用重复测量ANOVA(Repeated Measures ANOVA)，然后利用事后Bonferrioni成对比较(α=0.05)分析肿瘤体积数据。
每一个对照和处理组的中值肿瘤体积示于图7A至7C(分别对于HER3MS00135、HER3MS00212和HER3MS00215)。
与用PBS媒介物对照或Alb11处理的肿瘤相比较，纳米抗体的施用导致人肺癌异种移植物模型的显著的剂量依赖性肿瘤生长抑制。

Claims (13)

1.蛋白质或多肽，其包含至少两个各自特异性结合SEQ ID NO：1所示的人HER3的免疫球蛋白单可变结构域(ISV)，其中所述蛋白质或多肽包含：
a)为17B05-样序列的ISV，其中所述17B05-样序列包含：
i)CDR1，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列LNAMA(SEQ ID NO：58)；
ii)CDR2，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列
GIFGVGSTRYADSVKG(SEQ ID NO：88)；和
iii)CDR3，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列SSVTRGSSDY(SEQ ID NO：118)；
和
b)为21F06-样序列的ISV，其中所述21F06-样序列包含：
i)CDR1，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列LNAMG(SEQ ID NO：67)；
ii)CDR2，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列
AIDWSDGNKDYADSVKG(SEQ ID NO：97)；和
iii)CDR3，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列
DTPPWGPMIYIESYDS(SEQ ID NO：127)，
或者其中所述21F06-样序列包含：
i)CDR1，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列LNAMG(SEQ ID NO：67)；
ii)CDR2，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列
AIDWSEGNKDYADSVKG；和
iii)CDR3，其由如下氨基酸序列组成：氨基酸序列
DTPPWGPLIYIESYDS。
2.权利要求1的蛋白质或多肽，已为其提供了增加的半衰期。
3.权利要求2的蛋白质或多肽，已通过进一步在蛋白质或多肽中包含结合血清蛋白的肽或结合单元来为其提供了增加的半衰期。
4.权利要求3的蛋白质或多肽，其还包含针对人血清白蛋白的ISV。
5.权利要求1的蛋白质或多肽，其选自SEQ ID NO：282或SEQ ID NO:199。
6.权利要求1的蛋白质或多肽，其中所述17B05-样序列是SEQ ID NO：13并且所述21F06-样序列是SEQ ID NO：22。
7.权利要求1的蛋白质或多肽，其中所述17B05-样序列：
i)是SEQ ID NO:13；
和其中：
ii)根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108上的氨基酸残基的一个或多个选自下表中提及的标志残基：
其中，当44至47为GLEW时，在非人源化的VHH序列中，位置108总是Q，所述非人源化的VHH序列也在位置103上包含W。
8.权利要求1或7的任一项的蛋白质或多肽，其中所述21F06-样序列：
i)是SEQ ID NO:22；
和其中；
ii)根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108上的氨基酸残基的一个或多个选自下表中提及的标志残基：
其中，当44至47为GLEW时，在非人源化的VHH序列中，位置108总是Q，所述非人源化的VHH序列也在位置103上包含W。
9.与权利要求1至8任一项的蛋白质或多肽竞争对SEQ ID NO:1所示的HER3的结合的方法，包括使蛋白质或多肽与权利要求1至8的任一项的蛋白质或多肽竞争对SEQ ID NO：1所示的HER3的结合。
10.编码权利要求1至8的任一项的蛋白质或多肽的核酸。
11.包含权利要求1至8的任一项的蛋白质或多肽的药物组合物。
12.权利要求1至8的任一项的蛋白质或多肽用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
13.权利要求12的用途，其中所述癌症为乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、脑癌、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、头颈癌、子宫颈癌和/或食道癌。
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112013004012B1 (pt) 2010-08-20 2021-03-23 Novartis Ag Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao receptor her3, seu uso e composição farmacêutica
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
HUE031828T2 (en) 2011-06-23 2017-08-28 Ablynx Nv Procedures for Predicting, Detecting, and Reducing Aspiration Protein Interference in Assays Containing Immunoglobulin Variable Single Domain
EP3590538A1 (en) * 2011-12-05 2020-01-08 Novartis AG Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3)
MA38164B1 (fr) 2012-11-08 2018-11-30 Hoffmann La Roche Protéines de liaison à l'antigène anti-her3/her4 se liant à la boucle en épingle à cheveux beta
CA2884431A1 (en) * 2012-11-08 2014-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
ES2768900T3 (es) 2014-04-03 2020-06-24 Merck Patent Gmbh Combinaciones de agentes terapéuticos contra cáncer
CA2944895A1 (en) 2014-05-14 2015-11-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-her3 antibodies binding to the beta-hairpin of her3
MX2016014926A (es) 2014-05-16 2017-05-09 Ablynx Nv Dominios variables de inmunoglobulina mejorados.
CN110642952B (zh) * 2014-08-14 2021-05-25 上海生物制品研究所有限责任公司 抗her3抗体、其制法及其应用
WO2016038609A1 (en) * 2014-09-08 2016-03-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-her3 antibodies and uses of same
AU2015313811A1 (en) 2014-09-08 2017-04-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for treating cancer resistant to a tyrosine kinase inhibitor (TKI)
CA3007644A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing or preventing growth of tumors resistant to egfr and/or erbb3 blockade
US11307205B2 (en) 2016-09-19 2022-04-19 University Of Southern California Non-radioactive cytotoxicity assays
IL302613A (en) 2017-09-08 2023-07-01 Maverick Therapeutics Inc Binding proteins are activated under limited conditions
WO2019185164A1 (en) * 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Holdings Pte. Ltd. Her3 antigen-binding molecules
CN114390938A (zh) 2019-03-05 2022-04-22 武田药品工业有限公司 受约束的条件性活化的结合蛋白
EP4117730A1 (en) 2020-06-24 2023-01-18 Sapreme Technologies B.V. Conjugate of saponin and single-domain antibody, pharmaceutical composition comprising said conjugate, therapeutic use thereof
WO2021259507A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Sapreme Technologies B.V. Conjugate of a single domain antibody, a saponin and an effector molecule, pharmaceutical composition comprising the same, therapeutic use of said pharmaceutical composition
JP2023541763A (ja) 2020-06-24 2023-10-04 サプリーム テクノロジーズ，ベー．フェー． Ｖｈｈを含むａｄｃ又はａｏｃと、サポニン又はリガンド－サポニンコンジュゲートとを含む組み合わせ
KR20230043116A (ko) 2020-06-24 2023-03-30 사프렘 테크놀로지스 비.브이. 단일 도메인 항체, 사포닌 및 이펙터 분자의 접합체, 이를 포함하는 약학적 조성물, 상기 약학적 조성물의 치료 용도
KR20230145038A (ko) 2021-02-09 2023-10-17 메디링크 테라퓨틱스 (쑤저우) 컴퍼니, 리미티드 생물활성 물질 접합체, 이의 제조방법 및 이의 용도
WO2023121447A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Sapreme Technologies B.V. Conjugate of a single domain antibody, a saponin and an effector molecule, pharmaceutical composition comprising the same, therapeutic use of said pharmaceutical composition
GB202211100D0 (en) * 2022-07-29 2022-09-14 Stam Jord Cornelis Lysosomal degradation
WO2024133935A1 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Ablynx Nv Protein-based conjugation carriers
WO2024170756A1 (en) 2023-02-17 2024-08-22 Ablynx N.V. Polypeptides binding to the neonatal fc receptor

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101674846A (zh) * 2007-02-16 2010-03-17 梅里麦克制药股份有限公司 ErbB3抗体及其用途

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
EP0640130B1 (en) 1992-05-08 1998-04-15 Creative Biomolecules, Inc. Chimeric multivalent protein analogues and methods of use thereof
CA2137558A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Wayne A. Marasco Method of intracellular binding of target molecules
WO1994004678A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Casterman Cecile Immunoglobulins devoid of light chains
ATE198490T1 (de) 1993-06-09 2001-01-15 Unilever Nv Verfahren zur herstellung von fusionsproteinen, die scfv fragmente enthalten, in transformierten schimmelpilzen
US6091639A (en) 1993-08-27 2000-07-18 Kabushiki Kaisha Toshiba Non-volatile semiconductor memory device and data programming method
JPH10501681A (ja) 1994-02-22 1998-02-17 ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート 核酸送達システムならびにその合成および使用方法
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
WO1998022141A2 (en) 1996-11-19 1998-05-28 Sangstat Medical Corporation Enhanced effects for hapten conjugated therapeutics
AU2152299A (en) 1997-10-27 1999-05-24 Unilever Plc Multivalent antigen-binding proteins
BR9907241A (pt) 1998-01-26 2000-10-17 Unilever Nv Biblioteca de expressão, processo para preparar a mesma, uso de uma fonte não imunizada de sequências de ácido nucleico, e, processos para preparar fragmentos de anticorpos e, para preparar um anticorpo
EP1469883A2 (en) 1998-02-19 2004-10-27 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for regulating lymphocyte activation
GB9824632D0 (en) 1998-11-10 1999-01-06 Celltech Therapeutics Ltd Biological compounds
DE60013767T3 (de) 1999-01-19 2009-07-09 Unilever N.V. Verfahren zur herstellung von antikörperfragmenten
PT1240337E (pt) 1999-12-24 2007-01-31 Genentech Inc Métodos e composições para prolongar as meias-vidas de eliminação de compostos bioactivos
US6926898B2 (en) 2000-04-12 2005-08-09 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2001090190A2 (en) 2000-05-26 2001-11-29 National Research Council Of Canada Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
US6741957B1 (en) 2000-07-21 2004-05-25 Daimlerchrysler Corporation Analytical tire model for vehicle durability and ride comfort analysis
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
CA2433877C (en) 2001-01-17 2014-11-18 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
EP1377306A1 (en) 2001-03-09 2004-01-07 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
US20070160576A1 (en) 2001-06-05 2007-07-12 Genentech, Inc. IL-17A/F heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
DE60237282D1 (de) 2001-06-28 2010-09-23 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
AU2002355477B2 (en) 2001-08-03 2008-09-25 Medical Research Council Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies
US7371849B2 (en) 2001-09-13 2008-05-13 Institute For Antibodies Co., Ltd. Methods of constructing camel antibody libraries
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
KR100599789B1 (ko) 2001-12-03 2006-07-12 삼성에스디아이 주식회사 방열효율이 향상된 플라즈마 디스플레이 장치 및 그 제조방법
WO2003050531A2 (en) 2001-12-11 2003-06-19 Algonomics N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
JP4323317B2 (ja) 2001-12-21 2009-09-02 フラームス・インテルウニフェルシタイル・インステイチュート・フォール・ビオテヒノロヒー・ヴェーゼットウェー（ヴェーイーベー・ヴェーゼットウェー） 可変領域配列のクローニング方法
WO2003055527A2 (en) 2002-01-03 2003-07-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Immunoconjugates useful for treatment of tumours
DK1517921T3 (da) 2002-06-28 2006-10-09 Domantis Ltd Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf
US20080241166A1 (en) * 2002-06-28 2008-10-02 Domantis Limited Ligands that bind a receptor
US7004940B2 (en) 2002-10-10 2006-02-28 Ethicon, Inc. Devices for performing thermal ablation having movable ultrasound transducers
EP2336179A1 (en) 2002-11-08 2011-06-22 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
BRPI0316092B8 (pt) 2002-11-08 2021-05-25 Ablynx Nv anticorpos de domínio único direcionados contra o fator de necrose tumoral alfa e usos para os mesmos
US7993864B2 (en) 2002-12-03 2011-08-09 Ucb Pharma S.A. Assay for identifying antibody producing cells
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
EP1578842B1 (en) 2002-12-31 2009-10-07 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
EP2390270A1 (en) * 2003-01-10 2011-11-30 Ablynx N.V. Therapeutic polypeptides, homologues thereof, fragments thereof and for use in modulating platelet-mediated aggregation
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
PT1639011E (pt) * 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
MXPA06000347A (es) 2003-07-08 2006-03-28 Genentech Inc Polipeptidos heterologos il-17 a/f y usos terapeuticos de los mismos.
AU2003264053A1 (en) 2003-08-12 2005-03-10 William M. Yarbrough Treatment for acne vulgaris and method of use
US20060263353A1 (en) 2003-08-20 2006-11-23 Lawson Alastair D G Methods for obtaining antibodies
US20050279676A1 (en) 2004-06-21 2005-12-22 Izzy Zuhair A Fluid filter assembly for a dispensing faucet
US20060008601A1 (en) 2004-06-25 2006-01-12 Zeik Douglas B Flexible laminate having an integrated pressure release valve
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
CA2583017A1 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenerative neural diseases such as alzheimer's disease
GB0425569D0 (en) 2004-11-19 2004-12-22 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1844073A1 (en) 2005-01-31 2007-10-17 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
EP2322553A3 (en) 2005-02-14 2011-11-16 Wyeth LLC Interleukin-17F antibodies and other IL-17F signaling antagonists and uses therefor
MX342271B (es) 2005-05-18 2016-09-21 Ablynx Nv Nanobodiestm (nanocuerpos) mejorados contra el factor alfa de necrosis del tumor.
US7807162B2 (en) 2005-05-20 2010-10-05 Ablynx N.V. Single domain VHH antibodies against von Willebrand factor
US20090252681A1 (en) * 2005-10-11 2009-10-08 Ablynx N.V. Nanobodies and Polypeptides Against EGFR and IGF-IR
CA2624781A1 (en) * 2005-10-11 2007-04-19 Ablynx N.V. Nanobodies tm and polypeptides against egfr and igf-ir
AR056857A1 (es) * 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
WO2007112940A2 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Ablynx N.V. Albumin-derived amino acid sequence, use thereof for increasing the half-life of therapeutic proteins and of other therapeutic compounds and entities, and constructs comprising the same
CA2649009A1 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Ablynx N.V. Dp-78-like nanobodies
TW200815469A (en) 2006-06-23 2008-04-01 Astrazeneca Ab Compounds
EP2040995A1 (en) 2006-06-26 2009-04-01 Aida Centre, S.L. Blister package integrating rfid based tags
GB0612928D0 (en) 2006-06-29 2006-08-09 Ucb Sa Biological products
CA2666599A1 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
CN101646689A (zh) 2006-09-08 2010-02-10 埃博灵克斯股份有限公司 具有长半衰期的血清清蛋白结合蛋白
US7833527B2 (en) 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
US20100034194A1 (en) 2006-10-11 2010-02-11 Siemens Communications Inc. Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks
EP2086998B1 (en) 2006-10-11 2011-12-07 Ablynx N.V. Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the ph, compounds comprising the same, and use thereof
GB0620729D0 (en) 2006-10-18 2006-11-29 Ucb Sa Biological products
EP2097449A1 (en) 2006-12-05 2009-09-09 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
US7790676B2 (en) 2007-03-28 2010-09-07 Zymogenetics, Inc. Soluble IL-17RA/RC fusion proteins
AU2008287195A1 (en) 2007-07-06 2009-02-19 Emergent Product Development Seattle, Llc Binding peptides having a C-terminally disposed specific binding domain
JP2011504740A (ja) 2007-11-27 2011-02-17 アブリンクス エン．ヴェー． ヘテロ二量体サイトカイン及び／又はこれらの受容体に指向性を有するアミノ酸配列、並びにこれを含むポリペプチド
EP2238156B1 (en) 2008-01-29 2014-10-01 Ablynx N.V. Methods to stabilize proteins and polypeptides
WO2009127691A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
US20090317400A1 (en) 2008-05-05 2009-12-24 Krzysztof Masternak Anti-IL 17A/IL-17F Cross-Reactive Antibodies and Methods of Use Thereof
US8790642B2 (en) 2008-08-29 2014-07-29 Genentech, Inc. Cross-reactive and bispecific anti-IL-17A/F antibodies
WO2010034443A1 (en) 2008-09-29 2010-04-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against human il 17 and uses thereof
BRPI1013688A8 (pt) 2009-03-05 2017-02-14 Abbott Lab Proteínas de ligação de il-17.
MX2011011729A (es) 2009-05-05 2012-04-10 Novimmune Sa Anticuerpo anti il-17f y metodos de uso de los mismos.
CN102905727B (zh) 2009-10-30 2016-12-07 詹森生物科技公司 Il-17a拮抗剂
HUE046670T2 (hu) 2010-01-15 2020-03-30 Kirin Amgen Inc Anti IL-17RA ellenanyag kiszerelés és terápiás rendek pikkelysömör kezelésére
US8965476B2 (en) 2010-04-16 2015-02-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Tissue penetration device
ES2660770T3 (es) 2010-10-08 2018-03-26 Novartis Ag Métodos para el tratamiento de psoriasis usando antagonistas de IL-17
KR20180019247A (ko) 2010-11-05 2018-02-23 노파르티스 아게 Ｉｌ-１７ 길항제를 사용한 류마티스성 관절염의 치료 방법
LT2663577T (lt) 2011-01-14 2017-07-25 Ucb Biopharma Sprl Antikūnas, surišantis il-17a ir il-17f
TWI439451B (zh) 2011-03-24 2014-06-01 Hoffmann La Roche 雜環胺衍生物
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
CA2853114A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Abbvie Inc. Bispecific immunobinders directed against tnf and il-17
JP6007310B2 (ja) 2012-04-05 2016-10-12 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ヒトｔｗｅａｋ及びヒトｉｌ１７に対する二重特異性抗体並びにその使用
AR090626A1 (es) 2012-04-20 2014-11-26 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-baff-anti-il-17 biespecificos
CU24300B1 (es) 2013-02-08 2017-12-08 Novartis Ag Anticuerpos anti-il-17a útiles en el tratamiento de trastornos autoinmunes e inflamatorios
CL2015001213A1 (es) 2015-05-07 2015-07-10 Pontificia Universidad Católica De Chile Método ex vivo para predecir respuesta a un tratamiento inmunomodulador en pacientes con enfermedad inflamatoria, el cual comprende la cuantificación de las razones entre las concentraciones de citoquinas seleccionadas de ifn-gamma/il-17f, il17f/il-10, il-17f/ifn-gamma e il-10/il17f; y kit para llevar a cabo el método.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101674846A (zh) * 2007-02-16 2010-03-17 梅里麦克制药股份有限公司 ErbB3抗体及其用途

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Publication number Publication date
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