CN105814082A - 双特异性纳米抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含第一和第二免疫球蛋白单可变结构域(ISV)的双特异性多肽，其中所述第一ISV以低亲和力结合癌细胞表面上的第一靶标并且，当结合时抑制所述第一靶标的功能，并且所述第二ISV以高亲和力结合所述细胞表面上的第二靶标，并且其中所述第一靶标不同于所述第二靶标。本发明还公开了鉴定和制备它们的方法。

Description

双特异性纳米抗体
发明领域
本发明涉及包含第一、功能性的单可变结构域和第二、锚定免疫球蛋白的单可变结构域(ISV)的双特异性多肽，其中所述第一ISV以低亲和力结合癌细胞表面上的第一靶标并且，当结合时抑制所述第一靶标的功能，并且所述第二ISV以高亲和力结合所述细胞表面上的第二靶标，并且其中所述第一靶标不同于所述第二靶标。本发明还公开了用于鉴定和制备它们的方法。
背景
在历史上，癌症治疗的模态的主要问题是缺乏对癌细胞的特异性。癌症治疗的新时代以抗体开始，抗体可以赋予真正的特异和靶向治疗。已经在1997年批准了第一个单克隆抗体，即利妥昔单抗(rituximab)。单克隆抗体现在被广泛认为是治疗性分子，仅在美国就批准了23个，其中已经有9个在癌症领域。不幸的是，它们中没有一个能够作为单个药剂治愈癌症。尽管如此，当今最畅销的十种药物中的六种是单克隆抗体。该初步成功促使很多公司也开发基于单克隆抗体的疗法。然而，与进入临床研究的单克隆抗体的数量相比，批准的单克隆抗体治疗的比率下降。
各种癌细胞过表达参与恶性过程的靶标。HER2和FGFR是公知的实例。尽管如此，不是所有恶性细胞都过表达促进恶性疾病的靶标。此外，癌细胞在其表面上很少具有唯一的靶标。取而代之的是，与正常细胞相比，癌细胞具有基本上不同的靶标构成。实质上，正常和恶性细胞之间的很多差异仅是表达差异。这也是为什么诊断性生物标志物如此难以确认癌症的一个原因。考虑到治疗性抗体将不仅结合其在癌细胞上的同源靶标，而且也结合正常细胞上的，影响二者的功能，目前的癌症治疗遇到杀伤癌细胞而规避正常细胞的困难并不奇怪。这导致毒性和不需要的副作用。最常观察到的这些治疗的副作用包括恶心、腹泻、便秘、血凝结和伤口愈合的问题、高血压、胃肠穿孔、头晕、贫血、肺气肿、疼痛和疲乏。对于患者，这样的副作用可以影响日常生活。在最好的情况下，它们可能使患者不舒适，并且在最坏的情况下，使患者痛苦，影响他们坚持其治疗的能力，或使得治疗比它们本可以获得的效果差。这些副作用对患者以及社会二者都产生高的负担。因为副作用和毒性，很多临床试验甚至不得不停止。例如，GSK的抗体12F4的最初结果看起来非常有希望。然而，心血管事件使得需要停止临床研究。另一实例由CDP860对PDGFRβ的阻断提供，CDP860是改造的Fab’片段-聚乙二醇缀合物，其导致患有卵巢癌或结肠癌的患者中严重的积液，与增加的肿瘤血管体积相关(Jayson等人2005，JClinOncol23:973-981)。
通过增加抗体对于功能性靶标的亲和力，尝试减小毒性和副作用。因此，可以施用较低剂量的抗体，其会优先结合过表达这些靶标的癌细胞，但较少结合具有较少靶标的正常细胞。尽管在理论上，这会减小毒性和副作用，但是增加亲和力的主要缺点是由于靶标介导的内化后抗体的快速去除导致的降低的肿瘤穿透(Schmidt等人2008CancImmImm57(12)：1879–1890；Ackermann等人2008MolCancerTher2008；7:2233-2240)。
通过形成结合两个不同靶标的双特异性抗体进一步尝试减小毒性和不需要的副作用(参见综述：Kontermann，MAbs20124(2):182-97.doi：10.4161/mabs.4.2.19000.Epub2012年3月1日：利用双特异性抗体的双重靶向策略(Dualtargetingstrategieswithbispecificantibodies))。双特异性抗体基本上可以用于以两种方式双重靶向表面受体：(i)通过靶向在相同细胞上表达的细胞表面受体(通过顺式作用)，和(ii)用于重新靶向治疗活性部分，即，效应分子和效应细胞(通过反式作用)。在其最简单的顺式形式，与正常细胞相比，癌细胞可以被认为包含两个靶标的唯一组合。该靶标组合不如此存在于正常细胞上，而是各个单独的靶标存在于特定正常细胞类型上。仅提供各自结合特异靶标的两种单克隆抗体(mAbs)的混合物不会增加对癌细胞的特异性。因此猜测该缺点能够通过产生能够同时结合两个不同靶标的双特异性抗体来克服(参见例如Chames和Baty2009mAbsI:6539-549)。尽管已经成功产生了双特异性抗体，但是因为它们需要融合重链和轻链，其在实践中导致错误融合产物的过度表达，因此它们难以生产。因此已经建议了各种不同双特异性形式，大多数基于将单价片段合并，但其没有一个被批准。据信，单价片段缺乏常规抗体的所需高亲和力和长保留时间。MEHD7945A是对EGFR和Her3具有特异性的二合一Mab的实例，其目前在早期临床试验中被测试。两个臂都具有对EGFR(1.9nM)、和Her3(0.39nM)的高亲和力，但未显示同时结合两种受体。总之，很少有基于这样形式的候选物进入临床。基于此，提示开发新的形式。
除了形式之外，认为理想的是，双特异性抗体中的每个个体结合结构域应该结合促使恶化的靶标，从而挫败可能的单个靶标的冗余或抗性。例如，双特异性抗体可以结合相同受体上的两个表位。Jaenichen等人(2009)描述了一种双特异性纳米抗体，其中结构域结合CXCR4上的不同表位。而且已经产生对不同细胞具有两种功能性的双特异性，例如针对癌细胞靶向宿主免疫系统(反式形式)。该方法的最广泛使用的应用是在癌症免疫治疗中，其中已经改造了双特异性抗体，其同时结合细胞毒性细胞(使用受体-样CD3)和要被破坏的靶标如肿瘤细胞。尽管该方法通过破坏癌细胞增加了治疗效果，但是特异性问题仍然存在。
本领域的双特异性抗体具体设计为同时结合多个受体激活和下游信号传导通路。
将显而易见的是，仅几种病理，例如癌症类型，适用于该方法，因为不是所有疾病或异常细胞，例如恶性细胞过表达促进病理例如恶性疾病的靶标。
结合癌细胞表面靶标有时不足以递送有效治疗效果。近期，将细胞毒性化合物与单克隆抗体缀合(称为抗体-药物缀合物或ADC)的观点已经获得了极大的兴趣，以改善效力。对于细胞毒性的有效载荷的靶向递送，由于有效载荷的高毒性，对将肿瘤与正常细胞相区分的靶标的选择甚至比对于功能性阻断抗体的更至关重要。据我们所知，没有在ADC或放射免疫治疗(RIT)中使用双特异性抗体以改善肿瘤选择性的先例。
因此，存在改善空间。
发明概述
抗体治疗现在是医生与疾病尤其是癌症作斗争的医疗设备的重要部分。所有同时代存在的批准的抗体治疗依赖于单特异性抗体。然而，这些抗体中的很多的医疗用途严重地受其固有的、系统性毒性影响。该普遍毒性的潜在关键原因是它们的多向性结合模式：抗体结合其不仅在有病细胞，如癌细胞上的同源靶标，也结合在正常细胞上的同源靶标，导致当以高剂量施用时的毒性和不需要的副作用。
本领域需要更有效治疗，如癌症治疗，其相对于正常细胞，对有病细胞，如癌细胞具有较好的选择性和特异性，从而降低毒性和副作用。
本发明人猜想，抗体治疗相对于正常细胞对有病细胞例如癌细胞的特异性能够通过包含至少两个具有不同亲和力和功能性的亚单位的双特异性多肽显著增加。该设想不仅增加对于有病细胞的操作特异性，从而减小毒性和副作用，其还加宽可能的治疗性靶标的数量。优选地，这些亚单位或构建单元是免疫球蛋白单可变结构域(ISV)，如纳米抗体。所述双特异性多肽的第一ISV结合细胞表面上的第一靶标，但应该反直觉地对其靶标具有低亲和力，其使得该ISV在缺少另外的对细胞标志物的结合的情况下基本上失活。如果结合于靶标，第一ISV抑制其功能，如参与恶性过程的细胞表面受体(功能性ISV)。然而，所述第一ISV将仅在其得到第二ISV(锚定ISV)支持时才有效结合其靶标。所述双特异性多肽的第二ISV以高亲和力结合细胞表面上的第二靶标，其不同于第一靶标(锚定ISV)。如果结合于靶标，所述锚定ISV优选即使真的有，也有限量地抑制其功能。尽管第一靶标可以存在于正常细胞上，功能性ISV的低亲和力，以及随后不存在结合，正常细胞的功能将不受损或仅最低程度地受损。优选地，正常细胞的功能也仅稍微受锚定ISV的结合损害，因此特别开发该锚定ISV以最小化其对第二靶标的正常功能的影响。仅在表达两个靶标的细胞的情况下，锚定ISV以高亲和力结合并且由此使得功能性ISV有效干扰第一靶标的功能。该构思不仅增加对有病细胞，例如癌细胞的特异性，从而减小毒性和副作用，其还加宽可能的靶标的数量。
所述构思可广泛使用。然而，在该构思能够被证实之前，本发明人必须客服各种实际问题。
(1)如上文所述，通常筛选最高亲和力的抗体，同时低亲和力结合物(binder)将被抛弃。在这种情况下，不仅需要低亲和力结合物，这些低亲和力结合物必须在结合时同时阻碍其靶标的功能。因为结合不是直接的，所以测试其功能是有挑战性的。
(2)在锚定臂上，还必须确定和测试的是，高亲和力结合物对其靶标的功能仅具有最小的影响。
(3)必须建立的是，双特异性形式的两个构建单元，例如ISV的组合相互作用被正确读出(read-out)，区别于各个单个结合物的可能的加和效应。
本发明人通过特别地设计特定的筛选方法克服这些问题，所述方法将进一步在申请中变得清楚。
为了证实构思的通用性，本发明人使用对AML中的白血病干细胞的选择性靶向作为测试例，主要由于三个原因。
第一，因为靶标也广泛在正常细胞上表达，因此急性骨髓性白血病(AML)提供证明构思本身的可行性所需的靶标。第二，因为它们是大的相关受体家族的部分并且因此难以彼此区分，因此难以特异性结合选择的靶标。因此，如果利用选择的靶标证明构思的可行性，则可以可靠地设想构思对于其他靶标也有用。此外，存在对AML的明确医疗需求。
证明构思在AML中的可行性之后，本发明人还证实使用其他形式的构思的通用性，包括在细胞膜上的共定位未知的不相关靶标的组合。利用抗-CEA锚定ISV和抗-EGFR功能性ISV，显示增强的肿瘤选择性。该构思不仅可以用于癌症领域，也可用于其中靶标细胞相对正常细胞的特异性和选择性是有问题的所有领域(见前)。的确，本发明人证明使用抗-CD4功能性ISV和抗-CXCR4锚定ISV在HIV抑制方面增加150-倍的效力。双特异性靶向可以容易利用的另一领域是优先阻断或衔接正常细胞的亚类。作为实例，仅能够对特定的T细胞亚类(即与疾病过程相关的那些)特异性调节炎症和免疫通路可以提供较好的效力和较低的毒性。还证明了，参与炎症的也不同但密切相关的T细胞亚类可以通过由该方法阻断，即针对对于TH1细胞的白细胞介素受体12(IL-12R)，和对于TH17细胞的白细胞介素23受体23(IL-23R)的ISV用作功能性ISV并且抗-CD4ISV用作锚定ISV。
增加靶向肿瘤细胞的特异性和选择性～AML
白血病是骨髓和血液的恶性疾病，其特征为白血细胞的不受控积累。根据涉及的细胞类型(分别为髓样祖细胞或T和B淋巴细胞)，白血病分为骨髓性的或淋巴性的。根据临床表现和过程，白血病还分为慢性的或急性的。急性白血病是疾病的快速进展形式，其导致血液、骨髓和组织中不成熟、无功能细胞(胚细胞(blasts))的积累。骨髓常常不再能产生足够的正常红血细胞、白血细胞和血小板，导致贫血、降低的抵抗感染的能力和容易瘀伤和出血。慢性白血病进程较缓慢并且允许产生较多数量的功能性、更成熟细胞。白血病的诊断需要血液测试、骨髓活检和，在一些情况下腰椎穿刺。骨髓和/或血液的组织学、流式细胞术(免疫分型)、细胞化学和细胞遗传学(DNA分析)用于确定白血病的准确类型和亚型。存在四种主要类型的白血病：(1)急性淋巴性白血病(ALL，也称为急性淋巴性白血病或急性淋巴细胞性白血病)；(2)慢性骨髓性白血病(CML，也称为慢性粒细胞白血病、慢性髓细胞白血病或慢性髓性白血病)；(3)慢性淋巴性白血病(CLL，也称为慢性淋巴性白血病)。多毛细胞白血病(HCL)是慢性淋巴性白血病的稀有类型；和(4)急性骨髓性白血病(AML，也称为急性髓细胞白血病、急性髓性白血病，急性粒细胞白血病或急性非淋巴性白血病)。AML的特征是骨髓中髓样祖细胞("胚细胞")的异常增殖、减少的自毁率和细胞分化停滞。当母细胞失去其以正常方式分化和响应细胞增殖的正常调节剂的能力时，结果是频繁感染、出血和器官浸润。相对于正常健康细胞，白血病细胞被赋予异常存活优势，从而骨髓和外周血液变得逐渐由取代正常血液细胞的未成熟母细胞占据。AML是成人中最常见的恶性髓系疾病。在美国，在2009年期间：AML：12,810新发病例(大约90％为成人)；ALL：5,760；CML：5,050；CLL：～15,490新发病例；其他白血病：5,680。表现的中位年龄是70岁，并且相对于女性，该疾病更多影响男性，尽管儿科的AML也是普遍的。目前的治疗是侵略性的化疗。在50-80％的患者中完全缓解，但仍然有常见的轻微后遗症和复发。需要自体或异源干细胞移植来修复免疫力。AML与所有白血病的最低存活率相关。小于60岁的患者的5年存活率为30％，而大于65岁的患者的5年存活率小于10％。因此，存在明显的医疗需求。
猜测AML源自存在于骨髓中的CD34+CD38-未成熟白血病干细胞(LSC)。仅CD34+CD38-胚细胞或LSC能够在NOD/SCID小鼠中移植(engrafting)和建立AML。骨髓中的CD34+CD38-LSC可以逃避化疗引起的死亡。基质细胞可以保护AML细胞免于化疗引起的凋亡。因此，如果能够消除骨髓(BM)中AML白血病干细胞，治疗才能成功。
因此，选择性和有效靶向人AMLLSC需要与正常造血干细胞相比倾向于在AMLLSC上表达的细胞表面抗原，包括CD123、CD44、CLL-1、CD96、CD47、CD32、CXCR4、Tim-3和CD25。靶向CD44，CD123和CD47的单克隆抗体(mAbs)在异种移植模型中已经显示出针对AMLLSC的效力。
LSC的存在是医学研究中讨论的主题，因为很多研究尚未成功发现正常组织干细胞和癌症干细胞之间的相似性和差异。提出肿瘤干细胞作为不同的群体存留在肿瘤中，并且通过产生新肿瘤引起复发和转移。因此，靶向CSC(癌症干细胞)的具体治疗的开发为改善癌症患者，尤其是转移疾病的患者的存活和生活质量带来希望。
对于癌症干细胞的第一个确凿证据于1997在NatureMedicine上发表。Bonnet和Dick分离了表达特定表面标志物CD34，但缺少CD38标志物的白血病细胞亚群。作者确定，CD34+/CD38-亚群能够在组织学上与供体相似的NOD/SCID小鼠引发肿瘤。进一步证据来自组织学，肿瘤组织结构的研究。很多肿瘤非常异质的并且含有多种对于宿主器官天然的细胞类型。异质性通常通过肿瘤转移保持。这暗示，产生它们的细胞具有产生多种细胞类型的能力。换句话说，其具有多分化潜能，干细胞的经典特点。因为LSC会形成肿瘤的非常小的部分，这可能不必要选择特异作用于干细胞的药物。在人急性骨髓性白血病中，这些细胞的频率小于10,000个中1个。理论提示，常规化疗杀伤形成肿瘤主体(bulk)但不能产生新的细胞的分化的或分化中的细胞。导致其的LSC群体能够保持原样并且引起疾病的复发。
在当前的工作中，使用模型抗原CD123和CXCR4。尽管就我们目前所知，尚未报道CD123和CXCR4在CD34+/CD38-AMLLSC上的表达，但是有很多研究报道这些抗原中的每一个在AMLLSC中表达。
已经在不同AML患者中的AML胚细胞，以及在CD34+/CD38-亚群上证明CD123的表达。在其他白血病，例如，B急性淋巴细胞性白血病(B-ALL)中，其常常与CD34联合表达。91％的B-ALL患者中的胚细胞表达两种抗原，而11％一种也不表达。相比之下，发现骨髓正常前B-细胞表达CD123或CD34之一，但不表达其组合。(Hassanein等人2009，AmJClinPathol2009Oct；132(4):573-80：DistinctexpressionpatternsofCD123andCD34onnormalboneB-cellprecursors("hematogones")andBlymphoblasticleukemiablasts)。
类似地，已经表明CXCR4在AML胚细胞以及在CD34+/CD38-AMLLSC上的表达，但其也在正常造血干细胞中表达。已经发现CXCR4抑制剂普乐沙福(Plerixafor)是造血干细胞从骨髓移动到血流作为外周血干细胞的强力诱导剂。外周血干细胞迁移(其作为用于移植的造血干细胞的来源是重要的)通常使用G-CSF进行，但在约15至20％的患者中无效。G-CSF与普乐沙福的组合增加响应治疗并且产生足够的用于移植的干细胞的人的比例。该药物被批准用于具有淋巴瘤和多发性骨髓瘤的患者，并且在AML中使用普乐沙福的早期临床研究正在进行。
仅在CXCR4/CD123组合的情况下抑制CXCR4的双特异性纳米抗体会具有选择性靶向LSC以从骨髓释放到外周的潜力，在那里它们在AML患者中减轻后治疗的设定中变得对标准化疗易接近。不表达(或仅以非常低的水平表达)CD123的正常造血干细胞和祖细胞以及正常白血细胞将不受影响。
G-蛋白偶联受体(GPCR)CXCR4和其配体基质衍生因子-1(SDF-1/CXCL12)是在白血病细胞和骨髓(BM)微环境之间的相互沟通联系的重要参与者。CXCR4表达与具有和不具有突变的FLT3基因的AML患者中差的预后相关。集中从BM基质细胞和AML细胞分泌的CXCL12对于BM内AML细胞的存活和保留至关重要。在体外，显示CXCR4拮抗剂响应CXCL12，抑制AML细胞的迁移。此外，显示该拮抗剂抑制AML细胞的存活和克隆形成潜力，并且消除基质细胞对AML细胞中化疗引发的凋亡的保护效应。在体内，使用免疫缺陷小鼠模型，发现CXCR4拮抗剂诱导AML细胞和祖细胞迁移入血液循环中并且增强化疗的抗-白血病效果。尽管GPCR代表主要药物靶标中的一个，令人惊讶的是，癌症治疗的临床实践仅包括几种作用于GPCR-介导的信号传导的药物。虽然有GPCR可以通过调节致癌信号传导网络充当致癌基因和肿瘤抑制剂的认识，但是很少有靶向GPCR的药物用于癌症治疗。其中零星的实例是用于激素响应性前列腺和乳腺癌的内分泌治疗的金标准。
本发明人因此设计了一种CXCR4-IL3Ra双特异性抗体。该双特异性抗体具有选择性靶向LSC的潜能，因为IL3Ra(也称为CD123)是LSC的标志物。正常HSC和HPG以及正常白血细胞将不受CXCR4纳米抗体影响，因为这些细胞不表达或仅弱表达CD123。
在构思研究的初始体外证据中，具有CXCR4和CD123的不同内源表达水平的AML细胞系用于测试CXCR4-CD123双特异性的效力。在CXCR4-依赖性趋化测定中测试双特异性多肽的效力，比较仅表达CXCR4或CXCR4与第二受体的细胞系。与单价CXCR4纳米抗体相比，测量到前所未有的双特异性多肽的15-150倍的效力增加，但仅在表达两种靶标的细胞上。存在CXCR4纳米抗体在双特异性多肽中的的位置的明显效应，并且仅对于具有较低亲和力CXCR4纳米抗体观察到选择性效力增加。
尽管用具有不同表位和亲和力的两种不同的CXCR4纳米抗体测试该构思，但是仅具有较低效力(作为单价的，65nM)的CXCR4纳米抗体的组合显示增强作用。这将表明，亲和力是关键参数。
此外，改变为使用相同亲和力(1nM)的CD4纳米抗体的完全不同的锚导致150-倍的效力增加。因为CD4锚的表达水平在相同细胞上远高于CD123，所以似乎锚相对于功能性靶标的相对表达水平可以是获得的增强作用水平的另一决定因素。
增加靶向肿瘤细胞的特异性和选择性～EGFR
表皮生长因子受体(EGFR)是在很多正常人上皮来源的细胞中表达的ErbB酪氨酸激酶受体的成员，在细胞生长、分化和增殖中发挥重要作用。在皮肤中，其通常在表皮、皮脂腺和毛发毛囊上皮中表达，在那里，其在维持正常皮肤健康方面其很多重要作用。其常在多种实体肿瘤中过表达或异常调节，包括肠胃恶性肿瘤。异常调节的EGFR可以导致失控的细胞生长、增殖和血管生成，并且与较差的预后相关，其通过增加的转移潜能和较差的总体存活来显现。
已经表明EGFR参与肿瘤生长、转移和血管生成。此外，很多癌症表达EGFR，如膀胱癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌(例如、非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、头颈癌、肾癌和胆囊癌。靶向EGFR-介导的信号传导通路的药剂越来越成为治疗晚期肺癌、头颈癌和结直肠癌的治疗工具的一部分。在欧洲批准的EGFR抑制剂包括mAb帕尼单抗(panitumumab)和西妥昔单抗(cetuximab)，以及酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼(erlotinib)和吉非替尼(gefitinib)。尽管这些药物已经被证明在多种恶性肿瘤的治疗中有效，但是整个EGFR药剂类型与高发的皮肤学副作用(最常见皮疹)，和由于毒性导致的高的患者停止率相关。该可逆的病症需要介入大约三分之一的患者。在用靶向EGFR的mAb治疗的患有结直肠癌的患者中的80％–90％中报告了皮疹。在临床上，由于皮肤毒性，多至32％的医生报告了停止，并且76％报告了保持EGFR治疗(Melosky等人2009)。除了靶标-相关的毒性，由于肝和其他正常组织中的高EGFR表达，施用的剂量高，因为抗体最先浸润正常组织。利用目前可用的治疗靶向EGFR不是在所有患者中，或不是对所有癌症(例如，表达EGFR的癌症)都有效。因此，对于用于治疗表达EGFR的癌症和其他EGFR-相关的病理状态的改善的药剂存在需求。
第二，锚定靶标，使用癌胚抗原(CEA，也称为CEACAM5)。CEA是在很多肿瘤类型上表达的公知的肿瘤特异的抗原。其是已建立的对于胃肠道癌症肿瘤的相关标志物，还在乳腺癌和肺癌中发现。CEA是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的细胞表面糖蛋白，其在细胞粘附中发挥作用。可溶形式在癌症的血清中增加，并且用作生物标志物(正常血清CEA水平≤5ng/mL；升高的CEA水平>5ng/mL)。CEA表达限于灵长类，并且在正常组织中表达低，其中在肿瘤中表达可以达到比在健康组织中高60倍。然而，CEA由来自细胞表面的磷脂酶通过裂解其GPI-连接去除，其导致蛋白释放到血液循环中，用作池(sink)。
已经对于胃癌和结直肠癌，在原发肿瘤和腹膜转移中报道了EGFR和CEA的共表达，在大多数情况下CEA比EGFR具有更高的膜表达(Ito等人2013，Tiernan等人2013)。这使得CEA成为用作与EGFR组合用于以肿瘤选择性方式功能性阻断的锚的有用靶标。
因为亲合力增加依赖于表达在相同细胞上的两种膜蛋白，不预期可溶性CEA用作用于双特异性CEA纳米抗体的池。
在此情况下我们还表明仅在共表达两种受体的细胞上的利用对于EGFR和CEACAM5靶标组合的双特异性多肽的效力增强。
增加在炎症中靶向T细胞亚类方面的特异性和选择性
T细胞介导的免疫是产生抗原(Ag)-特异性T淋巴细胞从而消除病毒、细菌或寄生虫感染或恶性细胞的适应性过程。T细胞介导的免疫还可以涉及自身-Ag的异常识别，导致自身免疫性疾病。T细胞介导的免疫是适应性免疫系统的主要要素并且包括由幼稚T细胞导致的初级应答、激活的T细胞导致的效应功能、以及Ag-特异性记忆T细胞的存留。IL-12参与幼稚T细胞向Th1细胞的分化。IL-23诱导幼稚CD4+T细胞向高度致病性辅助T细胞的分化。.
IL-23和IL-12受体属于相同细胞因子受体家族。两种受体都是异二聚体，其中对于高亲和力结合配体和活性，需要两种亚单位。IL12Rβ1是两种异二聚体共享的共同受体，并且经由共享的40亚单位结合IL-12和IL-23二者。IL12Rβ2特异结合IL-12p35亚单位，并且因此对IL-12R特异。类似地，IL-23R是结合IL-23的p39亚单位的特异性亚单位。IL-12和IL-23细胞因子分别驱动Th1和Th17类型反应。在小鼠和人中，这些受体中每个的表达限于特定细胞类型。在IL12Rβ2由NK细胞和T细胞的亚类表达的同时，IL-23R的表达限于特定的T细胞亚类，少量B细胞和天然淋巴细胞。
IL-23通过诱导由记忆T细胞产生IL-17而促进慢性炎症。已经在多种人器官或组织中鉴定了由Th17细胞介导的炎症，包括眼、脑、皮肤、肝、结肠、肾、睾丸、关节和肺。很多由激活的Th17细胞诱导的细胞因子，如IL-22、IL-17、IFN-γ、TNF-α和IL-6在炎症疾病中发挥关键作用。这些细胞因子导致葡萄膜炎、自身免疫脑脊髓炎、银屑病、肝炎、炎性肠病、肾炎、睾丸炎、风湿性关节炎和哮喘的发生。
我们已经表明，在利用异源T细胞以及PBMC的测定中，CD4-IL-12Rβ2和CD4-IL-23R双特异性多肽显示以T细胞亚类-特异的方式的选择性功能性阻断。此外，显示双特异性多肽与CD4+T细胞亚类的选择性结合，而单价IL12Rβ2纳米抗体仅显示差的对CD4+和CD8+T细胞的结合。
关于亲和力，功能臂上的甚至非常低亲和力的纳米抗体在与高亲和力锚定CD4纳米抗体一起格式化(formatting)时产生效力增强。尽管对于具有快解离速率(>1.E-02)的纳米抗体，细胞结合不能总是准确测量，但是配体竞争表明范围为10-16nM之间的IC50的功能性阻断。
增加靶向HIV方面的的特异性和选择性～CXCR4和CD4
感染人免疫缺陷病毒(HIV)，如果未治疗，几乎总是导致感染的人死亡。HIV感染CD4+T-细胞并且导致感染的人中CD4+T-细胞数量的下降。当CD4+T细胞数量下降到低于决定性水平时，细胞介导的免疫实际上丢失，并且出现被多种机会性微生物感染，导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。因为HIV-感染的人不再能够抵御这些机会性感染，所以患者将最终死于这些感染中的一种。
目前没有可用的用于HIV/AIDS的疗法。然而，感染HIV的人可以通过多种抗-病毒治疗选择抑制病毒增殖。目前对于HIV感染的治疗由高活性抗逆转录病毒治疗，或HAART组成。HAART由多种抗病毒化合物的混合物的施用组成。然而，因为HIV容易突变，所以病毒常常对HAART混合物中的一种或多种化合物具有抗性。此外，HAART与多种副作用相关。因此，需要治疗HIV感染的新的疗法。
HIV-感染期间的关键事件是HIV进入CD4+T-细胞。一旦病毒进入T-细胞，病毒即绑架了T细胞复制机器产生另外的HIV拷贝，由此进一步感染。阻止HIV进入CD4+T-细胞提供用于治疗和预防HIV感染的重要治疗性选择。
HIV具有频繁突变的能力并且已经显示能够“向外突变(out-mutate)”，并且变得对很多抗病毒治疗方案有抗性，包括靶向HIV蛋白酶和HIV逆转录酶的抑制的方案。有趣的是，旨在阻断细胞进入的HIV“在周围突变(mutatearound)”治疗的选择更受限制。如果细胞进入点(例如，CXCR4)被药剂(例如，阻断抗体)阻断从而阻止HIV结合，则病毒不能容易地突变以找到另一进入点。此外，病毒不能容易地突变以移除药剂(例如，阻断抗体)。然而，基于阻止HIV进入细胞的治疗中的挑战是，由HIV用于进入细胞的受体也具有“天然”功能。施用阻止HIV结合的结合剂可以，例如导致组成型激活的受体或不能被激活的受体，因为受体的天然配体被阻止结合。本文中公开的免疫球蛋白单可变结构域和其多肽构建体克服了该挑战，因为在它们抑制HIV结合CXCR4同时，它们不阻止天然配体结合CXCR4(锚定ISV)。在不限于特定机制的同时，推测免疫球蛋白单可变结构域及其多肽构建体具有该能力，因为它们在HIV的结合位点选择性结合CXCR4，并且不在天然配体结合的位点结合。
HIV通过HIV衣壳表面上的糖蛋白，如gp120结合至CD4+T细胞上的受体，接着将病毒包膜与细胞膜相融合以及将HIV衣壳释放到细胞中来进入CD4+T-细胞。HIV通过gp120结合于细胞表面上的CD4和趋化因子受体，CXCR5或CXCR4之一，结合CD4+细胞。一旦gp120结合CD4蛋白，包膜复合体经历结构改变，将gp120的趋化因子结合结构域暴露并且让它们与靶趋化因子受体相互作用。gp120与CD4+T-细胞的该两个分支的连接促使病毒和细胞膜紧密在一起，使得膜融合并且随后病毒衣壳进入细胞。因此，阻止HIV结合gp120、CXCR4或CXCR5提供了治疗HIV导致的感染和预防HIV导致的感染的有力策略。
本发明人表明，双特异性CXCR4-CD4多肽同时结合CXCR4和CD4，导致强烈增加的对使用CXCR4的HIV1的中和效力。
由于其选择性，该双特异性纳米抗体可以在较长时间安全施用，导致改善的治疗。
附图简述
图1.1:模型系统的示例性表示。
图1.2：抗-IL-3Ra纳米抗体对细胞表达的IL-3Ra的结合。
图1.3：CXCR4纳米抗体对不同的表达CXCR4的细胞系(A、B)的结合，和对于CXCR4结合的配体置换(图片C、D)(14E2＝14E02)。
图1.4：CXCR4-IL-3Ra双特异性多肽对CXCR4–VLP和重组IL-3Ra胞外域的结合。
图1.5：不同细胞系上CXCR4和IL-3Ra的抗原表达水平，通过分别利用单克隆抗体抗-CXCR412G5和抗-IL-3Ra7G3的FACS确定。
图1.6：双特异性CXCR4-lL-3Ra纳米抗体对具有两种受体的不同相对表达水平的细胞的结合。描述了CXCR4纳米抗体281F12和14D09的双特异性多肽的代表性实例。
图1.7：对于4.6nM的构建体对JurkatE6-1和MOLM-13细胞系的结合的MCF信号。X表示抗-CXCR4构建单元，I表示抗-IL3Ra构建单元，X-I表示N末端的抗-CXCR4和C末端的抗-IL3Ra，I-X表示相反方向。
图1.8：不同的单价和双特异性CXCR4-IL3Ra多肽在JurkatE6-1和MOLM-13细胞系上的CXCL-12诱导的趋化测定中的滴度。14D09和281F12是抗-CXCR4构建单元；55A01和57A07是抗-IL3Ra构建单元。
图2.1：单价CD4纳米抗体的结合特性。
图2.2：ELISA中单价和双特异性CD4-CXCR4纳米抗体对病毒脂质颗粒(CXCR4-脂质)上的CXCR4相对空对照颗粒(空-脂质)的结合。
图2.3：选择的双特异性CXCR4-CD4多肽对在JurkatE6.1细胞上表达的细胞表达的CXCR4，和对共表达CXCR4和CD4的THP-1和MOLM-13细胞的结合分析。使用具有35GS接头的双特异性多肽。经由抗-标签抗体进行检测。
图2.4：对于JurkatE6.1和Molm-13细胞抑制CXCR4-CD4双特异性多肽的SDF-1介导的趋化作用。显示具有35GS-接头的双特异性CXCR4#2-CD4#8多肽。
图2.5：通过CXCR4-CD4纳米抗体抑制HIV1进入，MT-4细胞中的野生型NL4.3和AMD3100-抗性HIV1变体。
图3.1：用对照IL-12Rβ1抗体，多克隆IL-23R抗体，然后用二级抗-小鼠PE、抗-山羊PE、和APC标记的CD4抗体确定向TH1表型的激活的T细胞上IL12Rβ1、IL23R和CD4的表达水平。
图3.2：通过流式细胞术确定的IL23R(图片A)、IL12Rβ1(图片B)和CD4纳米抗体(图片C)对向TH17表型分化的T细胞的结合。在细胞因子混合物和重组IL-23的存在下，激活的T-细胞在PBMC混合物内向Th17细胞分化。
图3.4：CD4-IL12Rβ2、CD4-Il12Rβ1和CD4-IL23R双特异性的图的总览。
图3.5：FACS中，双特异性以及单价IL12R和IL23R纳米抗体在MOLM-13细胞上的剂量响应曲线。MOLM-13细胞上的CD4表达水平。(US，未染色，a-CD4，使用抗-人CD4APC检测。
图3.6：与其各自的单价纳米抗体相比，FACS中，双特异性CD4-IL12Rβ2、CD4-IL12Rβ1、和CD4-IL23R多肽在激活的T细胞上的剂量响应曲线。
图3.7：单价纳米抗体和双特异性多肽对分离的CD8+T细胞的结合分析。Cablys3用作不相关对照纳米抗体。通过抗-Flag检测进行检测。开始分别利用CD3和CD8的对照抗体显示T细胞标志物的表达水平，之后从人棕黄层分离CD8阳性细胞。
图3.8：纳米抗体对多色FACS实验中对于CD8+(深灰色)或CD4+(浅灰色)门控(gated)的TH1激活的细胞的结合。使用抗-flag-APC检测确定纳米抗体结合。
图3.9：通过双特异性多肽和单价纳米抗体阻断人T细胞中IL-12诱导的细胞因子产生功能。图片A–C；IL-12滴度图片D，B，D等。
图3.10：通过单价纳米抗体和双特异性多肽抑制人PBMC中IL-12依赖性的IFN-γ分泌。显示利用来自一个供体的T细胞获得的代表性图表。
图3.11：通过单价纳米抗体和双特异性多肽抑制人PBMC中IL-23依赖性的IL-17分泌。
图4.1：经由抗-Flag标签检测，通过流式细胞术确定的单价纳米抗体对仅表达EGFR的HER-14细胞，和表达EGFR和CEACAM5二者的LoVo细胞的结合分析。分别通过多克隆抗-人EGFR-PE抗-人CEACAM5/CD66e抗体(PE)检测的EGFR和CEACAM5在Lovo、HT-29、HeLa和Her14细胞上的表达。
图4.2：产生的EGFR-CEA双特异性多肽和单特异性纳米抗体的概况。
图4.3：分别通过对重组EGFR或CEACAM5的ELISA确定的格式化为双特异性EGFR-CEA多肽对靶标结合的影响。经由抗-flag-HRP二抗检测结合。
图4.4：通过流式细胞术的单特异性纳米抗体和双特异性多肽对EGFR+/CEA-HER-14细胞和EGFR+/CEA+LoVo细胞的结合分析。
图4.5:在EGFR+/CEA+LoVo细胞和EGFR+/CEA-Her14细胞上通过双特异性多肽和单特异性纳米抗体剂量依赖性抑制EGF-介导的EGFR酪氨酸磷酸化。数据表示一式两份的平均值+标准差。
发明描述
免疫球蛋白序列，例如由此衍生的抗体和抗原结合片段(例如免疫球蛋白单可变结构域或ISV)在研究和治疗应用中特别用于靶向它们各自的抗原。免疫球蛋白单可变结构域例如VHH或纳米抗体(Nanobodies)的产生可以包括实验动物如美洲驼的免疫接种，从免疫组织建立噬菌体文库，噬菌体展示的结合抗原的免疫球蛋白单可变结构域的选择和具有所期望的特异性的所述结构域及其改造构建体的筛选(WO94/04678)。或者，可以通过直接从天然或合成文库选择噬菌体展示的结合抗原的类似免疫球蛋白单可变结构域，并随后筛选具有所期望的特异性的所述结构域及其改造构建体来产生免疫球蛋白单可变结构域例如dAbs(Ward等人，Nature，1989，341：544-6；Holt等人，TrendsBiotechnol.，2003，21(11):484-490；以及例如WO06/030220、WO06/003388及其它DomantisLtd.的公开专利申请)。不幸的是，单克隆和/或重度改造的抗体的使用还有高的制造成本，并且与其他策略相比可能导致次优的肿瘤穿透。
定义:
a)除非另有说明或定义，使用的所有术语具有其在本领域中通常的含义，其对于本领域技术人员来说是清楚的。例如参考WO08/020079第46页段a)中提及的标准手册。
b)除非另有说明，术语“免疫球蛋白单可变结构域”或"ISV"用作一般术语包括但不限于分别地抗原结合结构域或片段，例如VHH结构域或VH或VL结构域。术语抗原结合分子或抗原结合蛋白可以交换使用，并且还包括术语纳米抗体。免疫球蛋白单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如VL-序列)，或重链可变结构域序列(例如VH-序列)；更特别地，它们可以是衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列或衍生自重链抗体的重链可变结构域序列。相应地，免疫球蛋白单可变结构域可以是结构域抗体，或者适合用作结构域抗体的免疫球蛋白序列，单结构域抗体，或者适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白序列，“dAbs”或者适合用作dAbs的免疫球蛋白序列，或者纳米抗体，包括但不限于VHH序列。本发明包括不同来源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驴、人和骆驼科动物的免疫球蛋白序列。免疫球蛋白单可变结构域包括完全是人的、人源化的，其它序列优化的或嵌合的免疫球蛋白序列。免疫球蛋白单可变结构域和免疫球蛋白单可变结构域的结构可视为-但不限于-由四个构架区或“FR’s”组成，其在本领域中以及在本文中分别称为“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3”或“FR3”；“构架区4”或“FR4”；构架区被三个互补决定区或“CDR’s”间隔开，所述三个互补决定区或“CDR’s”在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；“互补决定区3”或“CDR3”。应当注意术语纳米抗体(Nanobody或Nanobodies)是AblynxN.V.的注册商标，因此也分别被称为(或)。
c)除非另有说明，术语“免疫球蛋白序列”、“序列”、“核苷酸序列”和“核酸”如WO08/020079第46页段b)中所述。
d)除非另有说明，所有没有特别详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行或已经这样进行，这对于本领域技术人员来说是清楚的。例如再次参考本文提及的标准手册和一般背景技术以及其中所引用的其它参考文献；以及例如下述综述Presta,Adv.DrugDeliv.Rev.2006,58(5-6):640-56；Levin和Weiss,Mol.Biosyst.2006,2(1):49-57；Irving等,J.Immunol.Methods,2001,248(1-2),31-45；Schmitz等,Placenta,2000,21增刊A,S106-12,Gonzales等,TumourBiol.,2005,26(1),31-43，其中描述了蛋白质工程技术，例如亲和力成熟及其它提高蛋白质如免疫球蛋白的特异性及其它所需性质的技术。
e)氨基酸残基用标准的三字母或单字母氨基酸代码表示。参考发明名称为“ImmunoglobulinsinglevariabledomainsdirectedagainstIL-6RandpolypeptidescomprisingthesameforthetreatmentofdiseasesanddisordersassociatedwithIl-6mediatedsignalling”的AblynxN.V.的国际申请WO08/020079第48页表A-2。
f)为比较两个以上核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分比可以如WO08/020079(通过引用的方式将其合并入本文中)第49页段e)所述进行计算或确定，例如用[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸的数目]除以[第一核苷酸序列中核苷酸的总数目]并乘以[100％]，其中第二核苷酸序列中每个核苷酸的缺失、插入、取代或添加-与第一核苷酸序列相比-视为是单核苷酸(位置)的差异；或者使用适合的计算机算法或技术，也如WO08/020079(通过引用的方式合并入本文中)第49页段e)所述。
g)为了比较两个以上免疫球蛋白单可变结构域或其它氨基酸序列例如本发明的多肽等的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”(本文中也称为“氨基酸同一性”)的百分比可以如WO08/020079(通过引用的方式合并入本文中)第49和50页的段f)所述进行计算或确定，例如用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数目]除以[第一氨基酸序列中氨基酸残基的总数目]并乘以[100％]，其中第二氨基酸序列中每个氨基酸残基的缺失、插入、取代或添加-与第一氨基酸序列相比-视为是单个氨基酸残基(位置)的差异，即本文所定义的“氨基酸差异”；或者使用适合的计算机算法或技术，也如WO08/020079(通过引用的方式将其合并入本文中)第49和50页段f)所述。
而且，在确定两个免疫球蛋白单可变结构域之间的序列同一性程度时，本领域技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，如WO08/020079第50页所述。
还可以基于由Schulz等,PrinciplesofProteinStructure,Springer-Verlag,1978提出的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频度分析，由Chou和Fasman,Biochemistry13:211,1974和Adv.Enzymol.,47:45-149,1978提出的结构形成潜能分析，由Eisenberg等,Proc.Natl.AcadSci.USA81:140-144,1984；Kyte&Doolittle；JMolec.Biol.157:105-132,1981,和Goldman等,Ann.Rev.Biophys.Chem.15:321-353,1986提出的蛋白质疏水模式分析对本文所述的多肽应用任何氨基酸取代，通过引用的方式将它们的全文合并入本文。本文说明书和上述引用的一般背景技术中给出纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息。而且，为此目的，例如在Desmyter等,NatureStructuralBiology,Vol.3,9,803(1996)；Spinelli等,NaturalStructuralBiology(1996)；3,752-757；和Decanniere等,Structure,Vol.7,4,361(1999)中给出了美洲驼(llama)的VHH结构域的晶体结构。可以在上述引用的现有技术中找到关于在常规VH结构域中在这些位置上形成VH/VL界面和可能的骆驼源化取代的一些氨基酸残基的进一步的信息。
h)如果免疫球蛋白单可变结构域和核酸序列在其全长上具有100％的序列同一性(如文本所定义的)，那么将它们称为“完全相同”。
i)当比较两个免疫球蛋白单可变结构域时，术语“氨基酸差异”指与第二序列相比，第一序列的某个位置上单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应当理解两个免疫球蛋白单可变结构域可以包含一个、两个或更多个这种氨基酸差异。
j)当核苷酸序列或氨基酸序列被称为分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或者被称为“基本上由”另一个核苷酸或氨基酸序列“组成”时，其具有WO08/020079第51-52页段i)所给出的含义。
k)术语“以基本上分离的形式”具有WO08/020079第52和53页段j)所给出的含义。
l)术语“域”和“结合结构域”具有WO08/020079第53页段k)所给出的含义。
m)术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中可互换使用，具有WO08/020079第53页段l)所给出的含义。
n)如WO08/020079第53页段m)中进一步描述的，能与特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或者它的至少一部分、片段或表位)(特异性)结合，与其具有亲和力和/或对其具有特异性的氨基酸序列(例如本发明的抗体、多肽，或通常的抗原结合蛋白或多肽或其片段)被称为“拮抗剂”或“针对”所述的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。
o)术语“特异性”指特定的抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的ISV、纳米抗体或多肽)分子能结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。可以基于亲和力和/或抗体亲抗原性确定抗原结合蛋白的特异性。亲和力(由抗原与抗原-结合蛋白(KD或KD)解离的平衡常数表示)，是抗原决定簇(即靶标)，和抗原-结合蛋白(即ISV或纳米抗体)上的抗原-结合位点之间的结合强度的测量值：KD值越小，抗原决定簇和抗原-结合分子之间的结合强度越强(备选地，亲和力还可以表达为亲和力常数(KA)，其是1/KD)。如对于技术人员明确的(例如基于本文中进一步公开的)，亲和力可以以本身已知的方式确定，取决于研究的特定抗原。
亲合力是多肽的亲和力，即配体能够经由两个(以上)药效团(ISV)结合，其中多个相互作用协同增强"表观"亲和力。亲合力是本发明的多肽和相关抗原之间的结合强度的测量值。本发明的多肽能够经由其两个(以上)构建单元，如ISV或纳米抗体，结合于至少两个靶标，其中多个相互作用，例如第一构建单元，ISV或纳米抗体结合第一靶标并且第二构建单元，ISV，或纳米抗体结合第二靶标，协同增强"表观"亲和力。亲合力与抗原决定簇和抗原-结合分子上的其抗原结合位点之间的亲和力以及抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数量相关。例如，并且不受限制，含有两个以上构建单元，如针对细胞上不同靶标并且尤其是针对人CXCR4和人CD123的ISV或纳米抗体的多肽可以(并且通常将)以比包含在本发明中的多肽中的单个单体或单个构建单元，如，例如，单价ISV或纳米抗体高的亲合力结合。
在本发明中，当解离常数(KD)是10-9至10-12摩尔/升以下，并且优选为10-10至10-12摩尔/升以下并且更优选为10-11至10-12摩尔/升(即结合常数(KA)为109至1012升/摩尔以上，并且优选为1010至1012升/摩尔以上或更优选为1011至1012升/摩尔)时，表明单价抗原-结合蛋白(如本发明的构建单元、ISV、氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽)以高亲和力结合其抗原。
在本发明中，当解离常数(KD)是10-6至10-9摩尔/升以上，并且优选为10-6至10-8摩尔/升以上并且更优选为10-6至10-7摩尔/升(即结合常数(KA)为106至109升/摩尔以上，并且优选为106至108升/摩尔以上并且更优选为106至107升/摩尔)时，表明单价抗原-结合蛋白(如本发明的构建单元、ISV、氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽)以低亲和力结合其抗原。
中等亲和力可以定义为范围在高-低，例如10-8至10-10摩尔/升之间的值。
任何大于10-4摩尔/升的KD值(或任何低于104M-1升/摩尔的KA值)通常认为是非特异结合。
本发明的多肽包含第一和第二构建单元，例如第一和第二ISV，或第一和第二纳米抗体。优选为分别确定各个构建单元，例如ISV或纳米抗体的亲和力。换句话说，对于单价构建单元，ISV或纳米抗体，独立于由于其他构建单元，ISV或纳米抗体(其可能存在或可能不存在)导致的亲合力效应来确定亲和力。对于单价构建单元，ISV或纳米抗体的亲和力可以对单价构建单元，ISV或纳米抗体本身确定，即当所述单价构建单元，ISV或纳米抗体不包含在本发明的多肽中时。在备选方案中或此外，在不存在其他靶标时，单价构建单元，ISV或纳米抗体的亲和力可以对一个靶标确定。
抗原-结合蛋白对抗原或抗原决定簇的结合可以以本身已知的任何合适方法确定，包括例如，Scatchard分析和/或竞争结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定，和本领域中的本身已知的其不同变化形式；以及本文中提及的其他技术。
解离常数可以是实际或表面解离常数，如对于技术人员将是明显的。用于确定解离常数的方法对于技术人员将是明显的，并且例如包括本文中提及的技术。在此方面，还将明显的是，其可能不能测量大于10-4摩尔/升或10-3摩尔/升(例如，10-2摩尔/升)的解离常数。任选地，如还将对于技术人员明显的，(实际或表观)解离常数可以基于(实际或表观)结合常数(KA)，通过关系[KD＝1/KA]的方式计算。
亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常由KD或解离常数给出，其具有摩尔/升(或M)的单位。亲和力还可以表达为结合常数，KA，其等于1/KD并且具有(摩尔/升)-1(或M-1)的单位。在本说明书中，两个分子(如本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽和其预期靶标)之间的相互作用的稳定性将主要根据它们的相互作用的KD值表达；技术人员将明确，鉴于关系KA＝1/KD，通过其KD值指定分子相互作用的强度还可以用于计算相应KA值。KD-值也在热力学意义上表征分子相互作用的强度，因为通过公知关系DG＝RT.ln(KD)(等价地DG＝-RT.ln(KA))它与结合的自由能(DG)相关，其中R等于气体常数，T等于绝对温度并且ln表示自然对数。
被认为有意义的(例如特异的)的对于生物学相互作用的KD通常在10-10M(0.1nM)至10-5M(10000nM)的范围内。相互作用越强，其KD越低。
KD也可以表达为复合体的解离速率常数(表示为koff)与其结合速率(表示为kon)的比率(所以KD＝koff/kon和KA＝kon/koff)。解离速率koff具有单位s-1(其中s是秒的SI单位记号)。结合速率kon具有单位M-1s-1。结合速率可以在102M-1s-1至约107M-1s-1之间变化，接近对于生物分子相互作用的扩散限制的结合速率常数。通过关系t1/2＝ln(2)/koff，解离速率与给定分子相互作用的半衰期有关。解离速率可以在10-6s-1(接近具有多日的t1/2的不可逆复合体)至1s-1(t1/2＝0.69s)之间变化。
两个分子之间的分子相互作用的亲和力可以经由本身已知的不同技术测量，如公知的表面等离子共振(SPR)生物传感器技术(参见例如Ober等人，Intern.Immunology，13，1551-1559，2001)。如本文使用的术语"表面等离子共振"，是指允许通过检测生物传感器矩阵内的蛋白浓度的改变分析实时生物特异相互作用的光学现象，在传感器矩阵中，一种分子被固定在生物传感器芯片上，并且另一种分子在流动条件下经过固定的分子，得到kon，koff测量值和由此得到KD(或KA)值。这可以例如使用公知的BIAcore(R)系统(BIAcoreInternationalAB，GEHealthcare公司，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)进行。对于进一步描述，参见Jonsson，U.，等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；Jonsson，U.，等人(1991)Biotechniques11:620-627；Johnsson，B.，等人(1995)JMol.Recognit.8：125-131；和Johnnson，B.，等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
如果测量过程例如由与一种分子的生物传感器上包被层相关的假象某种程度上影响隐含的分子的固有结合亲和力，技术人员还将明确的是，测量的KD可以对应于表观KD。此外，如果一种分子含有多于一个用于其他分子的识别位点，可以测量表观KD。在此情况下，测量的亲和力不受两个分子的相互作用的亲合力影响。
可以用于评价亲和力的另一方法是Friguet等人的2-步骤ELISA(酶联免疫吸附测定)步骤(J.Immunol.Methods，77，305-19，1985)。该方法建立溶液相结合平衡测量并且避免与在支持物如塑料上的分子中的一种的吸附相关的假象。
然而，KD的精确测量可能是极为劳力密集的并且因此，经常确定表观KD值以评价两种分子的结合强度。应该注意，只要以连续的方式进行所有测量(例如保持测定条件不变)，表观KD测量可以用作真正KD的近似值，并且因此在本文件中，KD和表观KD应该被以相等的重要性或相关性处理。
最后，应该注意，在很多情况下，有经验的科学家可以判断其方便用于确定相对于一些参考分子的结合亲和力。例如，为了评价分子A和B之间的结合强度，可以例如使用参考分子C，其已知结合B并且适当地用荧光团或发色团基团或其他化学部分，如用于容易在ELISA或FACS(荧光激活的细胞分选)或其他形式(用于荧光检测的荧光团，用于光吸收检测的发色团，用于链霉亲和素介导的ELISA检测的生物素)中检测的生物素标记。通常，将参考分子C保持固定的浓度并且对于给定浓度或量的B改变A的浓度。作为结果，获得对应于A的浓度的IC50值，在该值，在不存在A的情况下对于C测量的信号减半。假如KDref(参考分子的KD)以及参考分子的总浓度cref是已知的，则对于相互作用A-B的表观KD可以从下式获得：KD＝IC50/(1+cref/KDref)。注意如果cref<<KDref，则KD≈IC50。假如对于比较的结合物的IC50的测量以连续的方式进行(例如保持cref固定)，则分子相互作用的强度或稳定性可以通过IC50评价，并且在本文中将该测量判断为等于KD或表观KD。
p)本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通常可以如WO08/020079第57页段o)所描述的以及本文所提及的那样定义，指例如由于氨基酸序列或化合物的降解和/或天然机制造成的序列或化合物的清除或隔离，所述序列、化合物或多肽在体内的血清浓度减少50％所花费的时间。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以用其本身已知的任何方式确定，例如通过药代动力学分析确定。适合的技术对本领域技术人员来说是清楚的，通常可以是如WO08/020079第57页段o)所描述的。如WO08/020079第57页段o)中还提及的，半衰期可以用参数例如t1/2-α,t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。例如可以参考下面的实验部分，以及标准手册，例如Kenneth,A等:ChemicalStabilityofPharmaceuticals:AHandbookforPharmacists和Peters等,Pharmacokineteanalysis:APracticalApproach(1996)。还可以参考"Pharmacokinetics",MGibaldi&DPerron,MarcelDekker出版,第2版修改版(1982)。术语“半衰期的增加”或“增加的半衰期”也如WO08/020079第57页段o)所定义的，特别指t1/2-β的增加，伴随或不伴随着t1/2-α和/或AUC或二者的增加。
q)关于靶标或抗原，术语靶标或抗原上的“相互作用位点”指靶标或抗原上的位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列段(stretch)，其是靶标或抗原的与配体、受体或其它结合配偶体的结合位点、催化位点、切割位点、变构相互作用位点、多聚化(例如同聚化或异二聚化)中涉及的位点；或者靶标或抗原的生物学作用或机制中涉及的靶标或抗原上的任何其它位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列段(stretch)。更通常地，“相互作用位点”可以是本发明的氨基酸序列或多肽能够结合并使得靶标或抗原(和/或涉及所述靶标或抗原的任何途径、相互作用、信号传导、生物学机制或生物学效应)被调节(如本文所定义的)的所述靶标或抗原上的任何位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列段(stretch)。
r)当免疫球蛋白单可变结构域或多肽与第一抗原以与所述氨基酸序列或多肽与第二靶标或多肽结合亲和力的至少10倍，例如至少100倍，其优选至少1000倍，至多可达10,000倍或更高的亲和力/抗体亲抗原性(如上所述的，适合地表达为KD值，KA值，Koff速率和/或Kon速率)结合，则将其称为相对于第二靶标或抗原而言对第一靶标或抗原是“特异的”。例如，第一抗原可以与靶标或抗原以比所述氨基酸序列或多肽与第二靶标或抗原结合的KD小至少10倍，例如小至少100倍，其优选小至少1000倍，例如10,000倍以下的KD值结合。优选地，当与第二靶标或抗原相比，免疫球蛋白单可变结构域或多肽对第一靶标或抗原是“特异的”时，它针对(如本文所定义的)所述的第一靶标或抗原，而不针对所述第二靶标或抗原。
s)术语“交叉阻断(cross-block)”、“被交叉阻断(cross-blocked)”和“交叉阻断的(cross-blocking)”在本文中可互换使用，指免疫球蛋白单可变结构域或多肽干扰天然配体与其一种或多种受体结合的能力。本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽能够干扰另一种化合物如天然配体与其靶标，例如CXCR4结合的程度，并且因此无论其是否可被称为根据本发明的交叉阻断，可以使用竞争性结合检测测定。一种特别适合的定量交叉阻断检测使用基于FACS-或基于ELISA的方法或Alphascreen，测量标记的(例如带His标记的或生物素化的)根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽及其它结合试剂之间就它们与靶标的结合而言的竞争。实验部分一般性地描述了用于测定结合分子是否交叉阻断或者能交叉阻断本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽的适合的基于FACS-、基于ELISA-或基于Alphascreen置换的检测。应当认识到所述检测可用于本文所描述的任何免疫球蛋白单可变结构域或其它结合试剂。因此，通常，根据本发明的交叉阻断氨基酸序列或其它结合剂是例如与上述交叉阻断检测中的靶标结合的，以使得在检测过程中以及在存在本发明的第二氨基酸序列或其它结合剂的条件下，所记录的根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽被0.01mM或更少量的待测的可能的交叉阻断试剂(交叉阻断试剂可以是另一种常规单克隆抗体例如IgG，经典单价抗体片段(Fab,scFv))和改造的变体(例如双抗体、三抗体、微抗体、VHHs、dAbs、VHs、VLs)的置换为最大理论置换(例如被需要被交叉阻断的非标记的(例如未标记的)免疫球蛋白单可变结构域或多肽置换)的60％-100％之间(例如在基于ELISA/Alphascreen的竞争检测中)或者80％-100％之间(例如在基于FACS的竞争检测中)。
t)如果所述VHH1型免疫球蛋白单可变结构域或1型VHH序列具有85％同一性(使用VHH1共有序列作为查询序列并且将具有标准设置(即，blosom62得分矩阵)的blast算法)用于VHH1共有序列(QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSS-DGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA),并且在位置50强制地具有半胱氨酸(即，C50)(使用Kabat编号)，则表明氨基酸序列如例如根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽是“VHH1型免疫球蛋白单可变结构域”或“1型VHH序列”。
u)如果氨基酸序列例如根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽对两个不同抗原或抗原决定簇(例如来自两个不同哺乳动物物种的血清白蛋白，例如人血清白蛋白和猕猴血清白蛋白)是特异的，那么将其称为对这些不同的抗原或抗原决定簇是“交叉反应的”。
v)如WO08/020079(通过引用合并入本文)第58和59页段q)所进一步描述的，根据Kabat等给出的VH结构域的通用编号(“Sequenceofproteinsofimmunologicalinterest”,USPublicHealthServices,NIHBethesda,MD,公布号91)对免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸残基进行编号，如Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Methods2000Jun23；240(1-2):185-195的文章(参见例如该出版物的图2)中应用于骆驼科动物的VHH结构域的那样，相应地，免疫球蛋白单可变结构域的FR1包含1-30位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的CDR1包含31-35位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR2包含36-49位的氨基酸，免疫球蛋白单可变结构域的CDR2包含50-65位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR3包含66-94位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的CDR3包含95-102位的氨基酸残基，免疫球蛋白单可变结构域的FR4包含103-113位的氨基酸残基。
w)所给出的附图、序列表和实验部分/实施例仅仅是进一步举例说明本发明，不应理解或解释为以任何方式限制本发明和/或所附权利要求的范围，除非本文另外明确指出。
x)半数最大抑制浓度(IC50)是化合物在抑制生物或生化功能方面的效应，例如药理学效应的测量。该定量测量表示半数抑制给定生物学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体、趋化作用、退行性变化、转移、侵入等)需要多少ISV或纳米抗体(抑制剂)。换句话说，其是物质的半数最大(50％)抑制浓度(IC)(50％IC，或IC50)。药物的IC50可以通过构建剂量响应曲线和检查不同浓度的拮抗剂如本发明的ISV或纳米抗体对逆转激动活性的影响来确定。可以通过确定抑制半数的激动剂的最大生物学响应所需的浓度对给定拮抗剂如本发明的ISV或纳米抗体计算IC50值。
术语半数最大有效浓度(EC50)是指在指定的暴露时间之后，诱导基线和最大值之间的半数的响应的化合物浓度。在本文中其用作多肽的、ISV的或纳米抗体的效力的测量值。分级的剂量响应曲线的EC50表示观察到其最大效应的50％的情况下化合物的浓度。浓度优选以摩尔单位表达。
在生物系统中，配体浓度的小的改变通常导致响应符合S形曲线函数的快速改变。随配体浓度增加而响应增加开始变缓处的拐点是EC50。这可以通过对最佳拟合线求导来从数学上确定。在多数情况下，依赖于图表来评估是方便的。在实施例部分提供EC50的情况下，设计实验以尽可能精确地反映KD。换句话说，EC50值因此可以被认为是KD值。术语"平均KD"涉及与至少1个，但优选多于1个，如至少2个实验中获得的平均KD值。术语"平均"是指数学术语"平均"(数据的总和除以数据中的项数)。
还涉及IC50，其是化合物的抑制(50％抑制)的测量值。对于竞争结合测定和功能性拮抗剂测定，IC50是剂量响应曲线的最常见概要测量。对于激动剂/刺激剂测定，最常见的概要测量是EC50。
双特异性多肽
本发明涉及特定多肽，也称为"本发明的多肽"，其包含或基本上由以下各项组成：(i)第一构建单元，其基本上由第一免疫球蛋白单可变结构域组成，其中所述第一免疫球蛋白单可变结构域以低亲和力结合细胞表面上的第一靶标，但当结合时损害或抑制所述第一靶标的功能(功能性ISV)；和(ii)第二构建单元，其基本上由第二免疫球蛋白单可变结构域组成，其中所述第二免疫球蛋白单可变结构域以高亲和力结合细胞表面的第二靶标，但当结合时优选仅最低限度地损伤或抑制所述第二靶标的功能(锚定ISV)。此外或备选地，所述第二靶标的功能优选对于细胞不是至关重要的，例如是冗余的。因此，抑制所述第二靶标("锚")的功能将导致有限的或可忽略的副作用和/或毒性。尽管如此，仅抑制正常细胞上的所述第二靶标(锚)的功能，即不抑制所述第一靶标的功能，与使用针对一个或两个靶标的高亲和力抗体的治疗相比，已经显著降低毒性和副作用。本发明的多肽提供比现有技术抗体更特异的肿瘤增殖抑制和肿瘤细胞阻止或杀伤。优选地，本发明的双特异性多肽包含至少两个结合部分，如例如两个构建单元、ISV或纳米抗体，其中至少第一结合部分(功能性ISV)对肿瘤相关抗原(例如，肿瘤细胞上表达的抗原，也称为‘肿瘤标志物’)特异。术语双特异性多肽、双特异性和双特异性抗体在本文中可替换地使用。
因此，本发明涉及多肽，其包含第一(功能性)和第二(锚定)免疫球蛋白单可变结构域(ISV)，
-其中所述第一ISV(功能性ISV)，以低亲和力结合第一靶标；
-所述第二ISV(锚定ISV)以高亲和力结合第二靶标；并且
其中所述第一靶标和所述第二靶标存在于细胞的表面上并且其中所述第一靶标不同于所述第二靶标，并且任选地所述第一构建单元(功能性构建单元或锚定ISV)和所述第二构建单元(锚定构建单元或锚定ISV)通过接头连接。
设计本发明的多肽以降低或削弱第一靶标对病症，例如恶性过程的贡献。术语"恶性过程"和"恶性病"在本文中可替换地使用。在本文中，恶性病是医学状况，尤其是肿瘤逐步变得更糟并且可能导致死亡的趋势。恶性病特征在于退行性变化、侵入和/或转移。因此本发明的多肽的药理学效应将最终归属于抑制或削弱所述细胞的退行性变化、侵入、转移、增殖、分化、迁移和/或存活中的至少一种，但优选多于一种。因此本发明的多肽的药理学效应将归属于增加或支持所述细胞的凋亡、细胞杀伤和/或生长停滞中的至少一种，但优选多于一种。特征为这些术语的现象在本领域中公知。
本发明的双特异性或多特异性多肽包含或基本上由至少两个构建单元，例如ISV组成，其中第一构建单元，例如第一ISV，在通过第二构建单元，例如第二ISV，结合其抗原，即第二靶标时，对其抗原，即第一靶标具有增加的亲和力。这样的增加的亲和力(表观亲和力)，由于亲合力效应，也称为‘条件性双特异性或多特异性结合’。这样的双特异性或多特异性多肽也称为‘本发明的条件结合的双特异性或多特异性多肽’。
将理解的是，第一构建单元和第二构建单元在多肽上的顺序(取向)可以根据本领域技术人员的需要选择，以及可能根据这些构建单元在多肽中的位置的相对亲和力，和该多肽是否包含接头，是设计选择的问题。然而，与其他取向相比，一些取向(有或没有接头)可以提供优选的结合特征。例如，第一和第二构建单元在本发明的多肽中的顺序可以是(从N-末端到C-末端)：(i)第一构建单元(例如第一ISV如第一纳米抗体)-[接头]-第二构建单元(例如第二ISV如第二纳米抗体)；或(ii)第二构建单元(例如第二ISV如第二纳米抗体)-[接头]-第一构建单元(例如第一ISV如第一纳米抗体)；(其中接头是任选的)。所有取向都包括在本发明中，并且含有提供所需结合特性的取向的多肽可以容易地通过常规筛选鉴定，例如如实施例部分举例说明的。
作为与相应单价ISV，例如纳米抗体相比，包含在双特异性多肽中的第一、功能性ISV，如纳米抗体的效力增加的结果，由第二、锚定ISV结合第二抗原增强所述至少两个ISV的第一、功能性ISV对于第一抗原的结合。
如本文中使用的，术语"效力"是药剂，如多肽、ISV或纳米抗体，其生物学活性的测量。药剂的效力可以通过本领域中已知的任何合适的方法，如例如实施例部分中所述的方法确定。基于细胞培养的效力测定常常是用于确定生物学活性的优选形式，因为它们测量药剂诱导的生理学响应，并且可以在相对短的时期产生结果。基于产物的作用机制，可以使用基于各种类型的细胞的测定，包括但不限于增殖测定、细胞毒性测定、报告基因测定、细胞表面受体结合测定和测量对功能上关键的蛋白或其他信号分子(如磷酸化蛋白、酶、细胞因子、cAMP等)的诱导/抑制的测定，全部是本领域中已知的。来自基于细胞的效力测定的结果可以表达为"相对效力"，如通过将本发明的双特异性多肽与对于相应参考单价ISV(例如仅包含一种ISV或一种纳米抗体，任选地进一步包含不相关纳米抗体，如Cablys(参见实施例部分)的多肽)获得的响应相比较来确定的。
表明当在给定测定中对于化合物，例如双特异性多肽所获得的响应比由参考化合物，例如相应单价ISV或纳米抗体导致的响应好(例如功能上好)至少2倍，但优选为至少3倍，如至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍，并且甚至更优选为甚至至少200倍，或甚至至少500倍，或甚至1000倍时，化合物，例如双特异性多肽，比参考化合物，例如相应单价或单特异性ISV或纳米抗体或包含相应单价或单特异性ISV或纳米抗体的多肽更具效力。
本发明的细胞尤其涉及哺乳动物细胞，并且优选为灵长类细胞并且甚至更优选为人细胞。细胞优选为癌细胞，其中所述癌症如本文中定义，其优选为白血病，并且甚至更优选为AML。
膜(也称为质膜或磷脂双层)围绕细胞的胞质，其是细胞的外边界，即膜是细胞的表面。该膜用于将细胞与外界环境分离和保护细胞并且大多由磷脂双层制成。该膜中嵌入的是多种蛋白分子，如通道、泵和细胞受体。因为膜是流体，蛋白分子可以在膜内移动。
第一构建单元(功能性构建单元)
如本文所述，本发明的多肽含有至少两个构建单元，如本发明的ISV或纳米抗体，其中第一构建单元，ISV或纳米抗体针对参与疾病或病症，如恶性病，并且尤其是参与白血病如AML的第一靶标，并且甚至更特别是针对人CXCR4。优选地，所述第一靶标对于有病细胞，例如癌细胞是独特的，例如所述第一靶标在正常细胞上不表达。然而，通常将不是这种情况。在多数情况中，所述第一靶标存在于正常和有病细胞，如癌细胞二者上。因此，为了增加对有病细胞，例如癌细胞的特异性和/或减小由于例如结合正常细胞导致的副作用和毒性，当第一和第二靶标二者都存在于细胞，其优选癌细胞(顺式形式)上时，这样的多肽中的第一构建单元，ISV或纳米抗体将结合所述第一靶标并且尤其是人CXCR4，与相应单体或单价构建单元，本发明的ISV或纳米抗体相比具有增加的亲合力。当结合第一靶标时，所述第一、功能性构建单元，ISV或纳米抗体将抑制所述第一靶标的功能。
靶标的功能涉及所述靶标诱导的可测量的生物或生化性质的任何改变，包括细胞的生理学改变如增殖、分化、退行性变化、侵入、转移、迁移、存活、凋亡、转运过程、代谢、运动性、细胞因子释放、细胞因子组成、第二信使、酶、受体等的改变。优选地，靶标的功能通过如上文所述的基于细胞培养的效力测定确定。
将理解的是，由于其低亲和力，在所有情况下，所述第一构建单元，ISV或纳米抗体的功能不能直接被测试或确定。尽管如此，本发明人证明可能测试削弱或抑制其同源靶标的功能的低亲和力结合物(参见实施例部分)。例如，本发明人使用之前鉴定的高亲和力成员的家族成员并且将其突变以减小亲和力。通过使用家族成员，确定的是，靶标上的相同表位被结合。如在本说明书中使用的术语"家族"是指具有相同长度(即它们在其序列内具有相同数量的氨基酸)并且其中位置8和位置106(根据Kabat编号)之间的氨基酸序列具有89％以上的氨基酸序列同一性的一组ISV、纳米抗体和/或VHH序列。在B细胞成熟过程期间，家族成员衍生自共同祖先。
当，设计本发明的多肽时，选择其本身低亲和力的第一构建单元，例如第一ISV，不考虑任何亲合力效应的影响。
因此本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV以1nM至200nM之间的平均KD值，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190nM、或200nM的平均KD值结合第一靶标。优选地，KD通过SPR确定。
在进一步的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中当作为单价测量时，所述第一ISV具有低亲和力。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV以1nM至200nM之间的EC50值，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200nM的平均EC50值结合细胞表面上的第一靶标。
因此本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述平均EC50在包含所述靶标1但基本上缺少所述靶标2的细胞上测量。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述平均KD在单价第一ISV上通过本领域中已知的任何技术，如例如SPR、FACS或ELISA(间接)确定。
本发明的第一ISV可以例如针对所述第一靶标，如，例如参与恶性病的受体酪氨酸激酶(RTK)或G-蛋白偶联受体(GPCR)，和特别是人CXCR4(OMIM162643)的第一抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象(在可用的情况下)。如果第一构建单元，如ISV或纳米抗体结合所述第一靶标，则所述第一靶标的功能被削弱或抑制。
本发明的第一靶标可以是已知参与恶性病的细胞的表面上的任何靶标，如细胞受体。
例如，受体酪氨酸激酶(RTK)和RTK-介导的信号传导通路参与肿瘤引发、维持、血管生成和血管增殖。已经鉴定了约20种不同RTK类型，其中最广泛研究的是：1.I型RTK(EGF受体家族)(ErbB家族)，2.II型RTK(胰岛素受体家族)，3.III型RTK(PDGF受体家族)，4.IV型RTK(FGF受体家族)，5.V型RTK(VEGF受体家族)，6.VI型RTK(HGF受体家族)，7.VII型RTK(Trk受体家族)，8.VIII型RTK(Eph受体家族)，9.IX型RTK(AXL受体家族)，10.X型RTK(LTK受体家族)，11.XI型RTK(TIE受体家族)，12.XII型RTK(ROR受体家族)，13.XIII型RTK(DDR受体家族)，14.XIV型RTK(RET受体家族)，15.XV型RTK(KLG受体家族)，16.XVI型RTK(RYK受体家族)，17.XVII型RTK(MuSK受体家族)。尤其是，靶标如表皮生长因子受体(EGFR)、血小板源生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、c-Met、HER3、丛蛋白、整联蛋白、CD44、RON和在参与通路如雷帕霉素(mTOR)通路的Ras/Raf/丝裂原-激活的蛋白(MAP)-激酶和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt/哺乳动物靶标的受体上。
此外，响应于生长因子在GPCR和其他受体之间发生紧密操作关系。GPCR信号传导可以在甾醇类、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)等的受体的信号传导之前、之后、与其平行或协同。在肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌和前列腺癌中，持续的GPCR刺激通过活化的自分泌和旁分泌环来促进。
存在两个主要的包括G蛋白偶联受体的信号传导通路：cAMP信号通路和磷脂酰肌醇信号通路，其二者都可以参与恶性病。当配体结合GPCR时，其引起GPCR的构象改变，这使它充当鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)。然后GPCR可以随后通过将其结合的GDP交换为GTP激活相关G-蛋白。G-蛋白的α亚单位，与结合的GTP一起，可以随后从β和γ亚单位解离以直接根据α亚单位类型(Gαs，Gαi/o，Gαq/11，Gα12/13)进一步影响细胞内信号传导蛋白或靶标功能性蛋白。因此，所述第一靶标的最终功能是信号传导，例如将信号从外部环境传输和处理到细胞内部，同时细胞作出反应。在癌细胞中，正常过程被改变。
优选地，第一靶标选自盘菌素结构域受体(DDR)，一种区别在于与以下各项同源的独特细胞外结构域的受体酪氨酸激酶：凝集素盘菌素I(CD167a抗原)、DDR2、ErbB-1、C-erbB-2、FGFR-1、FGFR-3、CD135抗原、CD117抗原、蛋白酪氨酸激酶-1、c-Met、CD148抗原、C-ret、ROR1、ROR2、Tie-1、Tie-2、CD202b抗原、Trk-A、Trk-B、Trk-C、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Notch受体1-4、FAS受体、DR5、DR4、CD47、CX3CR1、CXCR-3、CXCR-4、CXCR-7、趋化因子结合蛋白2、以及CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11。
因此，本发明涉及本发明的多肽，其中第一构建单元、ISV或纳米抗体抑制或削弱至少所述第一靶标的一个功能，其优选为多于一个，并且最优选为所有功能。
优选地，第一ISV针对所述第一靶标的相互作用位点，从而削弱所述第一靶标的功能。用于本发明的第一ISV结合的优选的相互作用位点是第一靶标上的配体结合位点。例如，本发明的抗-CXCR4ISV的结合可以抑制或替代同源配体即SDF-1(也称为CXCL12)对CXCR4的结合。此外，当第一靶标是结合对(例如，受体-配体结合对)的一部分时，免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以是这样的：它们与同源结合伙伴，例如，用于与CXCR4或HGF结合的SDF-1竞争结合c-Met，和/或是这样的：它们(完全或部分)中和同源结合伙伴与靶标的结合。此外，当配体，例如SDF-1与其他蛋白或多肽关联，如以形成蛋白复合体(例如，与CXCR4)时，在本发明的范围内的是，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽结合与其配体关联的受体，例如与CXCR4关联的SDF-1，条件是受体的功能被削弱。在所有这些情况中，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以以与本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽结合细胞靶标，例如其未关联状态的受体并且尤其是人CXCR4的亲和力和/或特异性相同或不同(即，高于或低于)的亲和力和/或特异性结合这样的关联的蛋白复合体，再次条件是第一靶标的功能被抑制。
因为多种细胞表面受体需要二聚化来激活，其优选的是，在此种情况下，本发明的第一ISV结合这些二聚化位点，如同源-或异源-二聚化位点，从而抑制或防止二聚化并且因此通过受体对信号转导。
此外，大多数受体以各种构象存在，例如松散构象容易结合底物，同时在结合底物时，构象改变，允许信号传导。因此，本发明的第一ISV还可以通过变构效应削弱第一靶标的功能。例如，第一ISV的结合阻止第一靶标构象改变，从而抑制信号传导。
有利地，因为本发明的双特异性构建体针对两个不同靶标，无意的二聚化和因此的信号传导被阻止。
还预期的是，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽通常将结合所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、其靶标的部分和片段；或至少结合含有一个以上与本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽结合于CXCR4并且尤其是人CXCR4的一个或多个抗原决定簇或一个或多个表位基本上相同的抗原决定簇或表位的CXCR4并且尤其是人CXCR4的那些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。再次，在这样的情况下，本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽可以以与本发明的免疫球蛋白单可变结构域结合(野生型)CXCR4的亲和力和特异性相同或不同(即，高于或低于)的亲和力和/或特异性结合这样的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段，条件是CXCR4的功能被抑制。
第一靶标的一种或多种功能的抑制可以通过本领域技术人员已知的任何合适的测定确定，如ELISA、FACS、Scatchard分析、Alphascreen、SPR、功能性测定等。
本发明的免疫球蛋白单可变结构域和多肽，和包含其的组合物的功效或效力，可以使用任何合适的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本身已知的动物模型、或其任意组合测试，取决于涉及的具体疾病或病症。合适的测定和动物模型将对于技术人员来说是明确的，并且例如包括配体置换测定(Burgess等人，CancerRes200666:1721-9)，二聚化测定(WO2009/007427A2，Goetsch，2009)，信号传导测定(Burgess等人，MolCancerTher9:400-9)，增殖/存活测定(Pacchiana等人，JBiolChem2010SepM110.134031)，细胞粘附测定(Holt等人，Haematologica200590:479-88)和迁移测定(Kong-Beltran等人，CancerCell6:75-84)，内皮细胞出芽测定(Wang等人，JImmunol.2009；183:3204-11)，和体内移植物模型(Jin等人，CancerRes.200868:4360-8)，以及用于以下实验部分和本文中引用的现有技术中的测定和动物模型。表达对所述第一靶标的抑制的方式是通过IC50。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV具有200nM至1nM之间，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200nM的IC50，例如在配体竞争测定、功能性细胞测定、如配体-诱导的趋化作用的抑制、Alphascreen测定等中确定。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV以例如相对于在缺少所述第一ISV的情况下的抑制，抑制天然配体对所述第一靶标，如例如SDF-1对CXCR4的结合达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％并且优选为95％或甚至100％。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV抑制药理学效应例如退行性变化、侵入、转移、增殖、分化、迁移和/或存活，其中所述第一靶标以约20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％并且优选为95％或甚至100％(例如相对于在缺少所述第一ISV的情况下的药理学效应)参与。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV增加所述细胞的凋亡、细胞杀伤和/或生长停滞，其中所述第一靶标以约20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％并且优选为95％或甚至100％(例如相对于在缺少所述第一ISV的情况下的增加)参与。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一ISV替代约20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％并且优选为95％以上的对于所述第一靶标的天然配体(例如相对于在缺少所述第一ISV的情况下的替代)。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第一ISV的情况下的抑制，所述第一ISV以约20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％并且优选为95％或甚至100％抑制所述第一靶标导致的信号传导，例如所述第一靶标的激酶活性。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第一ISV的情况下的抑制，所述第一ISV以约20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％并且优选为95％或甚至100％抑制所述第一靶标的二聚化。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中在趋化测定中例如相对于在缺少所述第一ISV的情况下的抑制，所述第一ISV抑制趋化作用达约20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％并且优选为95％或甚至100％。
第二构建单元(锚定构建单元)
本发明的第二构建单元、ISV、纳米抗体或VHH对其–第二--靶标具有高亲和力。本发明的第二构建单元、ISV或纳米抗体可以例如针对所述第二靶标的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象(在可应用的情况下)。针对它对其自身靶标的高亲和力选择第二构建单元，例如第二ISV、纳米抗体或VHH，不考虑任何亲合力效应的影响。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第二ISV以10nM至0.1pM之间的平均KD值，如以10nM以下的平均KD值，甚至更优选为以9nM以下，如小于8、7、6、5、4、3、2、1、0.5nM或甚至更小，如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM或甚至更小如小于0.4pM的平均KD值结合第二靶标。优选地，KD通过SPR确定。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第二ISV当以单价测量时具有高亲和力。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述平均KD通过表面等离子共振(SPR)在重组蛋白上测量。
本发明还涉及如本文所述的多肽，其中所述第二ISV以10nM至0.1pM之间的EC50值，如10nM以下的平均KD值，甚至更优选9nM以下，如小于8、7、6、5、4、3、2、1、0.5nM或甚至更小，如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM或甚至更小如小于0.4pM的平均KD值结合细胞表面上的第二靶标。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述平均EC50在包含所述靶标2但基本上缺少所述靶标1的细胞上测量。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述平均KD通过FACS、Biacore、ELISA，在单价第二ISV，如纳米抗体，或包含单价第二ISV，如纳米抗体的多肽上确定。
在实施例中已经表明，KD与EC50良好关联。
所述第二靶标可以是细胞上任何靶标，例如CD123(OMIM：308385)，条件是其不同于所述第一靶标。优选地，所述第二靶标对于所述有病细胞，例如癌细胞独特。例如，所述第二靶标在正常、健康细胞上不表达。然而，通常将不是该情况。在多数情况中，所述第二靶标将存在于正常和有病细胞，例如癌细胞上。尽管所述第二靶标的功能可能对于所述细胞不是至关重要的，但在正常细胞上抑制其功能可能导致一些毒性和副作用。本发明还涉及本发明的多肽中包含的高亲和力结合物，其不削弱或抑制或仅最低限度地削弱或抑制正常细胞的功能。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第二ISV结合所述第二靶标的变构位点。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第二ISV例如以单价基本上不或仅少量地抑制所述第二靶标的功能。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中在如例如，实验部分所述的在细胞上的Alphascreen测定、竞争ELISA或FACS中，所述第二ISV具有100nM至10μM之间，如200nM、500nM、1μM或5μM的IC50。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第二ISV的情况下的抑制，所述第二ISV以小于约50％，如40％、30％、或20％或甚至小于10％抑制天然配体对所述第二靶标的结合.
因此，本发明涉及如本文所述的多肽,，其中例如相对于在缺少所述第二ISV的情况下的抑制，所述第二ISV以小于约50％，如40％、30％、或20％或甚至小于10％抑制所述第二靶标的药理学效应。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第二ISV的情况下的替代，所述第二ISV以小于约50％，如40％、30％或20％或甚至小于10％替代所述第二靶标的天然配体。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第二ISV的情况下的抑制，所述第二ISV以小于约50％，如40％、30％或20％或甚至小于10％抑制所述第二靶标导致的信号传导。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中例如相对于在缺少所述第二ISV的情况下的抑制，所述第二ISV以小于约50％，如40％、30％或20％或甚至小于10％抑制所述第一靶标导致的二聚化。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中在趋化测定中，例如相对于在缺少所述第二ISV的情况下的抑制，所述第二ISV以小于约50％，如40％、30％或20％或甚至小于10％抑制趋化作用。
组合
为了增加特异性并且因此最小化副作用和/或毒性，第二、锚定靶标优选为肿瘤相关抗原(TAA)。TAA通常是特定肿瘤的细胞上表达，但通常在正常细胞中不表达的抗原。通常，TAA是通常仅在生物发育的特定点(如在胚胎发育期间)在细胞上表达并且不适宜地在目前的发育点在生物中表达的抗原，或是在现在表达抗原的器官的正常组织或细胞中不表达的抗原。作为第二、锚定靶标的优选的TAA包括MART-1、癌胚抗原("CEA")、gp100、MAGE-1、HER-2和LewisY抗原。
与正常造血干细胞相比优先表达在AMLLSC上，并且因此优选作为第二靶标的细胞表面抗原，包括CD123、CD44、CLL-1、CD96、CD47、CD32、CXCR4、Tim-3和CD25。
本发明的多肽内适于作为第二靶标的其他肿瘤相关抗原包括：TAG-72、Ep-CAM、PSMA、PSA、糖脂如GD2和GD3。
本发明的第二、锚定靶标还包括造血细胞分化抗原，即通常与集群分化(CD)分组相关的糖蛋白，如CD4、CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD45、CD52、和CD147；生长因子受体，包括ErbB3和ErbB4；和细胞因子受体，包括白细胞介素-2受体γ链(CD132抗原)；白细胞介素-10受体α链(IL-10R-A)；白细胞介素-10受体β链(IL-10R-B)；白细胞介素-12受体β-1链(IL-12R-β1)；白细胞介素-12受体β-2链(IL-12受体β-2)；白细胞介素-13受体α-1链(IL-13R-α-1)(CD213al抗原)；白细胞介素-13受体α-2链(白细胞介素-13结合蛋白)；白细胞介素-17受体(IL-17受体)；白细胞介素-17B受体(IL-17B受体)；白细胞介素21受体前体(IL-21R)；白细胞介素-1受体，I型(IL-1R-1)(CD121a)；白细胞介素-1受体，II型(IL-1R-β)(CDw121b)；白细胞介素-1受体拮抗剂蛋白(IL-1ra)；白细胞介素-2受体α链(CD25抗原)；白细胞介素-2受体β链(CD122抗原)；白细胞介素-3受体α链(IL-3R-α)(CD123抗原)。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第二、锚定靶标选自由以下组成的组：MART-1、癌胚抗原("CEA")、gp100、MAGE-1、HER-2、和LewisY抗原、CD123、CD44、CLL-1、CD96、CD47、CD32、CXCR4、Tim-3、CD25、TAG-72、Ep-CAM、PSMA、PSA、GD2、GD3、CD4、CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD45、CD52、和CD147；生长因子受体，包括ErbB3和ErbB4；和细胞因子受体，包括白细胞介素-2受体γ链(CD132抗原)；白细胞介素-10受体α链(IL-10R-A)；白细胞介素-10受体β链(IL-10R-B)；白细胞介素-12受体β-1链(IL-12R-β1)；白细胞介素-12受体β-2链(IL-12受体β-2)；白细胞介素-13受体α-1链(IL-13R-α-1)(CD213al抗原)；白细胞介素-13受体α-2链(白细胞介素-13结合蛋白)；白细胞介素-17受体(IL-17受体)；白细胞介素-17B受体(IL-17B受体)；白细胞介素21受体前体(IL-21R)；白细胞介素-1受体，I型(IL-1R-1)(CD121a)；白细胞介素-1受体，II型(IL-1R-β)(CDw121b)；白细胞介素-1受体拮抗剂蛋白(IL-1ra)；白细胞介素-2受体α链(CD25抗原)；白细胞介素-2受体β链(CD122抗原)；白细胞介素-3受体α链(IL-3R-α)(CD123抗原)。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽1，其中所述第一、功能性靶标选自由以下组成的组：GPCRs、受体酪氨酸激酶、DDR1、盘菌素I(CD167a抗原)、DDR2、ErbB-1、C-erbB-2、FGFR-1、FGFR-3、CD135抗原、CD117抗原、蛋白酪氨酸激酶-1、c-Met、CD148抗原、C-ret、ROR1、ROR2、Tie-1、Tie-2、CD202b抗原、Trk-A、Trk-B、Trk-C、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Notch受体1-4、FAS受体、DR5、DR4、CD47、CX3CR1、CXCR-3、CXCR-4、CXCR-7、趋化因子结合蛋白2、和CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11；并且所述第二靶标选自由以下组成的组：MART-1、癌胚抗原("CEA")、gp100、MAGE-1、HER-2、和LewisY抗原、CD123、CD44、CLL-1、CD96、CD47、CD32、CXCR4、Tim-3、CD25、TAG-72、Ep-CAM、PSMA、PSA、GD2、GD3、CD4、CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD45、CD52、和CD147；生长因子受体，包括ErbB3和ErbB4；和细胞因子受体，包括白细胞介素-2受体γ链(CD132抗原)；白细胞介素-10受体α链(IL-10R-A)；白细胞介素-10受体β链(IL-10R-B)；白细胞介素-12受体β-1链(IL-12R-β1)；白细胞介素-12受体β-2链(IL-12受体β-2)；白细胞介素-13受体α-1链(IL-13R-α-1)(CD213al抗原)；白细胞介素-13受体α-2链(白细胞介素-13结合蛋白)；白细胞介素-17受体(IL-17受体)；白细胞介素-17B受体(IL-17B受体)；白细胞介素21受体前体(IL-21R)；白细胞介素-1受体，I型(IL-1R-1)(CD121a)；白细胞介素-1受体，II型(IL-1R-β)(CDw121b)；白细胞介素-1受体拮抗剂蛋白(IL-1ra)；白细胞介素-2受体α链(CD25抗原)；白细胞介素-2受体β链(CD122抗原)；白细胞介素-3受体α链(IL-3R-α)(CD123抗原)。
如本文中使用的"表皮生长因子受体"(EGFR，ErbB1，HER1)是指天然存在的或内源性哺乳动物EGFR蛋白并且指与天然存在的或内源的相应哺乳动物EGFR蛋白具有相同的氨基酸序列的蛋白(例如，重组蛋白、合成的蛋白(即，使用合成有机化学的方法生产))。因此，如本文中定义的，术语包括成熟EGFR蛋白、多态或等位基因变体和EGFR的其他同种型(例如，通过交替剪接或其他细胞过程产生)，和在前的修饰或未修饰的形式(例如，脂化的、糖基化的)。天然存在的或内源的EGFR包括野生型蛋白如成熟EGFR、多态或等位基因变体和在哺乳动物(例如，人、非人灵长类)中存在的其他同种型。例如，这样的蛋白可以从天然产生EGFR的来源回收或分离。这些蛋白和与天然存在的或内源的相应EGFR具有相同氨基酸序列的蛋白以相应哺乳动物的名称提及。例如，在相应哺乳动物是人的情况下，蛋白被指定为人EGFR。在本文所述的EGFR结合测定或EGFR激酶测定中，以约1[mu]M以下，约500nM以下，约100nM以下，约75nM以下，约50nM以下，约10nM以下或约1nM以下的IC50抑制EGF和/或TGFα与EGFR的结合的ISV(例如，纳米抗体)抑制结合。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述第一靶标(功能性靶标)和所述第二靶标(锚定靶标)选自由以下组成的组：
尤其是，本发明涉及根据本发明的多肽，其中所述第一靶标和所述第二靶标选自由以下组成的组:
-作为第一靶标的受体酪氨酸激酶和作为第二靶标的肿瘤相关抗原(TAA)；
-作为第一靶标的G蛋白偶联受体(GPCR)和作为第二靶标的造血细胞分化抗原；
-作为第一靶标的受体酪氨酸激酶和作为第二靶标的造血细胞分化抗原；
-作为第一靶标的G蛋白偶联受体(GPCR)和作为第二靶标的肿瘤相关抗原(TAA)；
-作为第一靶标的CXCR4和作为第二靶标的CD123；
-作为第一靶标的DR5和作为第二靶标的EpCam；
-作为第一靶标的DR4和作为第二靶标的EpCam；
-作为第一靶标的CD95和作为第二靶标的EpCam；
-作为第一靶标的CD47和作为第二靶标的CD123；
-作为第一靶标的CD47和作为第二靶标的EpCam；
-作为第一靶标的EGFR和作为第二靶标的CEA
-作为第一靶标的CD4和作为第二靶标的CXCR4
-作为第一靶标的IL12Rβ1和作为第二靶标的CD4
-作为第一靶标的IL12Rβ2和作为第二靶标的CD4，和
-作为第一靶标的IL23R和作为第二靶标的CD4。
本发明人还表明，第一靶标可以成为第二靶标并且反之亦然，这取决于各个ISV的亲和力和功能性质(参见例如结合CXCR4的ISV)。
本发明人还表明，第一和第二靶标的绝对拷贝数，以及细胞表面上第一靶标和第二靶标的比率，可以决定最终结合的特异性，以及因此的毒性和/或副作用。优选地，存在低数量的所述第一、功能性靶标拷贝。优选地，存在高数量的所述第二、锚定靶标的拷贝。甚至更优选地，在细胞表面数量上存在低的第一、功能性靶标与第二、锚定靶标的比率。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中在所述细胞的表面上，所述细胞包含1,000至40,000个拷贝之间，如10,000至20,000个拷贝之间的所述第一靶标。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述细胞在所述细胞的表面上包含40,000至100,000个拷贝之间，如60,000至80,000个拷贝之间的所述第二靶标。
因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述细胞包含所述第一、功能性靶标和所述第二、锚定靶标的0.01至0.9的比率，甚至更优选为0.2至0.8之间、0.3至0.7之间、0.4至0.6之间、如0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的比率，其优选为0.5的比率。
因此，本发明的多肽和组合物可以用于诊断、预防和治疗本发明的疾病和病症(本文也为“本发明的疾病和病症”)，其包括，但不限于癌症。术语"癌症"是指哺乳动物中通常特征为异常调控的细胞增殖或存活的病理状况。癌症的实例包括，但不限于，癌、神经胶质瘤、间皮瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、成胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤(包括意义不明的单克隆丙种球蛋白病、无症状和有症状的骨髓瘤)、前列腺癌症、和伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆管癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌癌、类癌癌症、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卡波济氏肉瘤、多中心卡斯尔曼病或AIDS-相关原发性渗出淋巴瘤、神经外胚层肿瘤、横纹肌肉瘤(对于其他癌症参见例如，Cancer,Principlesandpractice(DeVita、V.T.等人编辑1997))；以及上述癌症的任一种的任意转移、以及非癌适应征如鼻息肉病；以及本文所述的其他病症和疾病。尤其是，本发明的多肽和组合物可以用于诊断、预防和治疗参与EGFR介导的转移、趋化作用、细胞粘附、跨内皮迁移、细胞增殖和/或存活的疾病。特征为癌细胞表面上EGFR表达的癌症(表达EGFR的癌症)包括，例如、膀胱癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌(例如、非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、头颈癌、肾癌和胆囊癌。
对于免疫球蛋白单可变结构域的一般描述，对以下进一步描述，以及对本文引用的现有技术进行参考。然而在这点上，应该注意，本描述和现有技术主要描述所谓的“VH3类型”的免疫球蛋白单可变结构域(即，与VH3型的人生殖系序列如DP-47、DP-51或DP-29具有高度序列同源性的免疫球蛋白单可变结构域)，其形成本发明的优选方面。然而，应该注意，本发明在其最广泛的意义上覆盖任何类型的免疫球蛋白单可变结构域并且例如还涵盖属于所谓“VH4类型”的免疫球蛋白单可变结构域(即，与VH4型的人生殖系序列如DP-78具有高度序列同源性的免疫球蛋白单可变结构域)，如例如WO07/118670中所述的。
通常，免疫球蛋白单可变结构域(尤其是VHH序列和序列优化的免疫球蛋白单可变结构域)可以尤其特征为在一个以上的框架区序列(也如本文中进一步描述的)中存在以上“特征残基”(如本文所述)。
因此，通常，免疫球蛋白单可变结构域可以定义为具有(一般)结构的氨基酸序列(参见下式1)
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3。
在优选的方面，本发明提供包含至少一个为具有以下(一般)结构的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变结构域的多肽
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其中:
i)根据Kabat编号的位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108处的氨基酸残基中的至少一个选自下表A-1中提及的特征残基；并且其中:
ii)所述氨基酸序列与WO2009/138519中所示的免疫球蛋白单可变结构域中的至少一种(参见WO2009/138519中SEQIDNO：1至125)具有至少80％，更优选为90％，甚至更优选为95％氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度，不考虑形成CDR序列(在序列中用X表示)的氨基酸残基；并且其中:
iii)CDR序列通常如本文中进一步限定的(例如，可以以本文中提供的信息确定的组合中的CDR1、CDR2和CDR3，注意CDR定义根据Kabat编号体系计算)。
表A-1：VHHs中的标志残基
而且，这样的免疫球蛋白单可变结构域可以以任何适当的方式来自于任何适当的来源，例如可以是天然存在的VHH序列(即来自于适合的骆驼科动物种属，例如美洲驼)或者合成的或半合成的VHs或VLs(例如来自于人)。这种免疫球蛋白单可变结构域可以包括通过例如亲和力成熟(例如由合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、CDR移植、镶饰、组合来源于不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物进行PCR装配、以及本领域技术人员熟知的改造的免疫球蛋白序列的类似技术改变的“人源化的”或者其它“序列优化的”VHHs，“骆驼源化的”免疫球蛋白序列(特别是骆驼源化的重链可变结构域序列，即骆驼源化的VHs)，以及人VHs，人VLs，骆驼科动物的VHHs；或者前述任一种的任何适当的组合，如本文进一步描述的。如本文中所述，特别优选的本发明的免疫球蛋白单可变结构域的类型包含具有与天然存在的VHH结构域的氨基酸序列对应，但被“人源化(humanized)”的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变结构域，所述人源化即通过用在来自人类(例如上文指出的)的常规4-链抗体的VH结构域中的相应一个或多个位置处出现的氨基酸残基中的一个或多个替代所述天然存在的VHH序列(并且尤其是在框架序列中)的氨基酸序列中的一个以上氨基酸残基。这可以以技术人员将明确的本身已知的方式进行，例如基于本文中进一步的描述和本文引用的人源化方面的现有技术。再次，应该注意，本发明的这样的人源化的免疫球蛋白单可变结构域可以以本身已知的任何合适的方式获得并且因此不严格限于使用包含天然存在的VHH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。
另一特别优选的本发明的免疫球蛋白单可变结构域的类型包含具有对应于天然存在的VH结构域的氨基酸序列，但被“骆驼化(camelized)”的氨基酸序列的免疫球蛋白单可变结构域，所述骆驼化即通过用重链抗体的VHH结构域中的一个或多个相应位置处存在的氨基酸残基中的一个或多个替代来自常规4-链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个以上氨基酸残基。这可以以技术人员将明确的本身已知的方式，例如基于本文中所述进行。这样的“骆驼化”置换优选插入在VH-VL界面处形成和/或存在的氨基酸位置处，和/或在所谓的骆驼科特征残基处，如本文中定义的(还参见例如WO94/04678以及Davies和Riechmann(1994和1996))。优选地，用作用于产生或设计骆驼化免疫球蛋白单可变结构域的起始材料或起始点的VH序列优选为来自哺乳动物的VH序列，更优选为人类的VH序列，如VH3序列。然而，应该注意的是，本发明的这样的骆驼化的免疫球蛋白单可变结构域可以以任何本身已知的合适的方式获得，并且因此不严格限于使用包含天然存在的VH结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。
例如，又如本文中进一步描述的，“人源化”和“骆驼化”二者可以通过提供分别编码天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列进行，并随后以本身已知的方式，以这样的方式改变所述核苷酸序列中的一个以上密码子：新核苷酸序列分别编码本发明的“人源化”或“骆驼化”免疫球蛋白单可变结构域。该核酸可以随后以本身已知的方式表达，从而提供本发明所需的免疫球蛋白单可变结构域。备选地，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，可以分别设计本发明所需的人源化或骆驼化的免疫球蛋白单可变结构域的氨基酸序列，并随后使用本身已知的肽合成技术从头合成。此外，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，可以分别设计编码所需的本发明的人源化或骆驼化的免疫球蛋白单可变结构域的核苷酸序列，并随后使用本身已知的用于核酸合成的技术从头合成，这之后，因此获得的核酸可以以本身已知的方式表达，从而提供本发明所需的免疫球蛋白单可变结构域。
通常，包含或基本上由单个构建单元、单个免疫球蛋白单可变结构域或单个纳米抗体组成的蛋白或多肽在本文中将分别称为“单价”蛋白或多肽或称为“单价构建体”，或单价构建单元，单价免疫球蛋白单可变结构域或单价纳米抗体。包含或基本上由两种以上免疫球蛋白单可变结构域(如至少两种本发明的免疫球蛋白单可变结构域)组成的蛋白和多肽将在本文中称为“多价”蛋白或多肽或称为“多价构建体”，并且与本发明的相应单价免疫球蛋白单可变结构域相比，这些提供某些优势。从本文中进一步的描述，这样的多价构建体的一些非限制实例将变得明确。本发明的多肽是"多价的"，即包含两个以上构建单元或ISV，其中至少第一构建单元、ISV或纳米抗体和第二构建单元、ISV或纳米抗体不同，并且针对不同靶标，如抗原或抗原决定簇。含有至少两个构建单元、ISVs或纳米抗体(其中至少一个构建单元、ISV或纳米抗体针对第一抗原的本发明的多肽(即，针对第一靶标，如例如CXCR4)并且至少一个构建单元、ISV或纳米抗体针对第二抗原(即，针对不同于第一靶标的第二靶标，如例如CD123))，还将被称为本发明的“多特异性”多肽，并且该多肽中存在的构建单元、ISV或纳米抗体在本文中还将被称为是“多价形式”。因此，例如，本发明的“双特异性”肽是包含至少一个针对第一靶标(例如CXCR4)的构建单元、ISV或纳米抗体和至少一个针对第二靶标(即，针对不同于所述第一靶标的第二靶标，例如CD123)的其它构建单元、ISV或纳米抗体的多肽，而本发明的“三特异性”多肽是包含至少一个针对第一靶标(例如，CXCR4)的构建单元、ISV或纳米抗体，针对不同于所述第一靶标的第二靶标(例如CD123)的第二构建单元、ISV或纳米抗体和至少一个针对第三抗原(即，不同于第一和第二靶标二者)，如，例如，血清白蛋白等的其他构建单元、ISV或纳米抗体的多肽。如将从说明书明确的，在本发明的多特异性多肽可以包含至少针对第一靶标的第一构建单元、ISV或纳米抗体，针对第二靶标的第二构建单元、ISV或纳米抗体和任意数量的针对一个以上可以分别与第一和/或第二靶标相同或不同的靶标的构建单元、ISVs或纳米抗体的意义上，本发明不限于双特异性多肽。构建单元、ISVs或纳米抗体可以任选地经由接头序列连接。
因此，本发明还涉及三特异性或多特异性多肽，其包含或基本上由至少三个结合部分，如三个ISV组成，其中所述至少三个结合部分中的至少一个以低亲和力针对第一靶标，所述至少三个结合部分的至少一个部分以高亲和力针对第二靶标，和增加半衰期的至少第三结合部分，如例如白蛋白结合物。
如通过上述和本文的进一步描述变得清楚的那样，本发明的免疫球蛋白单可变结构域可以用做“结构单元”以形成本发明的多肽，例如通过适当地将它们与其它基团、残基、结构部分或结合单元组合，以形成本文所述的化合物或构建体(例如但不限于本文所描述的本发明的双/三/四/多价的和双/三/四多特异性的多肽)，其在一个分子内组合了一种或多种所希望的特性或生物学功能。
本发明的化合物或多肽通常可以通过下述方法制备：其包含至少一个将一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域与一个或多个另外的基团、残基、结构部分或结合单元任选地通过一个或多个适合的接头适当地连接的步骤，以提供本发明的化合物或多肽。本发明的多肽还可以通过下述方法制备：其通常包括提供编码本发明的多肽的核酸，以适当的方式表达所述核酸，回收表达的本发明的多肽的步骤。这种方法可以以本身已知的方式实施，其对于本领域技术人员来说是清楚的，例如基于在本文进一步描述的方法和技术。
由本发明的氨基酸序列开始，设计/选择和/或制备本发明的化合物或多肽的工艺在本文中也被称为本发明的所述氨基酸序列的“格式化”；作为本发明的化合物或多肽的一部分的本发明的氨基酸被称为“格式化的”或“格式形式的”本发明的所述化合物或多肽。本发明的氨基酸序列格式化方式的实例以及这种格式的实例在本文公开的基础上对本领域技术人员来说是清楚的；这种格式化的免疫球蛋白单可变结构域形成本发明的另一个方面。
例如，这种另外的基团、残基、结构部分或结合单元可以是一个或多个另外的免疫球蛋白单可变结构域，这样所述化合物或构建体是(融合)蛋白或(融合)多肽。在优选的但是非限制性的方面，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元是免疫球蛋白序列。更优选地，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元选自由结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域(ISV)、“dAb”’s、适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域、或纳米抗体组成的组。或者，这种基团、残基、结构部分或结合单元可以例如是化学基团、残基、结构部分，其本身可以具有或不具有生物学和/或药学活性。例如但不受其限制地，这种基团可以与一个或多个本发明的免疫球蛋白单可变结构域连接以提供本发明的氨基酸序列或多肽的“衍生物”，如本文进一步描述的。
包含一个或多个本文描述的衍生物或基本上由其组成，并且任选地进一步包含一个或多个任选地通过一个或多个接头连接的其它基团、残基、结构部分或结合单元的化合物或构建体也在本发明的范围内。优选地，所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单元是免疫球蛋白单可变结构域。在上述的化合物或构建体中，本发明的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域和一个或多个基团、残基、结构部分或结合单元可以直接彼此连接和/或通过一个或多个适合的接头或间隔子连接。例如，当一个或多个基团、残基、结构部分或结合单元是免疫球蛋白单可变结构域时，接头也可以是免疫球蛋白单可变结构域，以使获得的化合物或构建体是融合(蛋白)或融合(多肽)。
在本发明的一个特定的但非限制性的方面中，其将在本文中进一步描述，本发明的多肽与作为其来源的免疫球蛋白单可变结构域相比在血清中具有增加的半衰期(如本文进一步描述的)。例如，本发明的免疫球蛋白单可变结构域可以与一个或多个延长半衰期的基团或结构部分(例如PEG)连接(以化学方式或其它方式)，以提供具有增加的半衰期的本发明的氨基酸序列的衍生物。
在本发明的一个特定方面，本发明的化合物或本发明的多肽与本发明的相应氨基酸序列相比可以具有增加的半衰期。这种化合物和多肽的一些优选的但是非限制性的实例在本文进一步公开的基础上对本领域技术人员来说将会变得清楚，例如包括已经进行化学修饰以增加其半衰期(例如通过聚乙二醇化)的本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽；包含至少一个用于结合血清蛋白(例如血清白蛋白)的额外的结合位点的本发明的免疫球蛋白单可变结构域；或者包含至少一个与增加本发明氨基酸序列半衰期的结构部分(特别是至少一个氨基酸序列)连接的本发明的氨基酸序列的本发明的多肽。包含这种延长半衰期的结构部分或免疫球蛋白单可变结构域的本发明的多肽的实例在本文进一步公开的基础上对本领域技术人员来说将会变得清楚；例如包括但不限于其中本发明的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域适当地与一个或多个血清蛋白或其片段(例如(人)血清白蛋白或其适合的片段)或与一个或多个能结合血清蛋白的结合单元(例如能结合血清蛋白例如血清白蛋白(例如人血清白蛋白)、血清免疫球蛋白例如IgG、或转铁蛋白的结构域抗体、适合用作结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的免疫球蛋白单可变结构域、"dAb"’s、适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构域、或纳米抗体；参考本文的进一步描述和所提及的参考文献)连接的多肽；其中本发明的氨基酸序列与Fc部分(例如人Fc)或其适合的部分或片段连接的多肽；或其中本发明的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域适当地与一个或多个能结合血清蛋白的小蛋白或肽(例如但不限于WO91/01743,WO01/45746,WO02/076489,WO2008/068280,WO2009/127691和PCT/EP2011/051559中描述的蛋白和肽)连接的多肽。
通常，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽的半衰期优选是本发明的相应氨基酸序列本身的半衰期的至少1.5倍，其优选至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或大于20倍。例如，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽例如在人中可以具有比本发明的相应氨基酸序列本身增加大于1小时，其优选大于2小时，更优选大于6小时，例如大于12小时，或者甚至大于24,48或72小时的半衰期。
在本发明的优选的但是非限制性的方面，本发明的这种化合物或多肽例如在人中具有比本发明的相应氨基酸序列本身增加大于1小时，其优选大于2小时，更优选大于6小时，例如大于12小时，或者甚至大于24,48或72小时的血清半衰期。
在本发明的另一个优选的但是非限制性的方面，本发明的这种化合物或多肽表现出在人中至少约12小时，其优选至少24小时，更优选至少48小时，更优选至少72小时或更长的血清半衰期。例如，本发明的化合物或多肽可以具有至少5天(例如约5-10天)，其优选至少9天(例如约9-14天)，更优选至少约10天(例如约10-15天)，或者至少约11天(例如约11-16天)，更优选至少约12天(例如约12-18天或更长)，或者大于14天(例如约14-19天)的半衰期。
在本发明的特别优选但非限制性方面，本发明提供包含第一和第二免疫球蛋白单可变结构域(ISV)的本发明的多肽，其中所述第一ISV以低亲和力结合细胞表面上的第一靶标并且当结合时抑制所述第一靶标的功能；并且所述第二ISV以高亲和力结合所述细胞的表面上的第二靶标，并且优选最低限度地抑制所述第二靶标的功能，其中所述第一靶标不同于所述第二靶标；并且进一步包含一种以上(优选为一种)如本文所述的结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域，例如SEQIDNO：114或115的结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域(表B-4)。
多肽-药物缀合物(PDCs)
在一些实施方案中，将本发明的多肽与药物缀合形成多肽-药物缀合物(PDCs)。同时的抗体-药物缀合物(ADCs)在肿瘤学应用中使用，其中使用抗体-药物缀合物用于局部递送药物，如细胞毒剂或细胞生长抑制剂、毒素或毒素部分，允许将药物部分靶向递送至肿瘤，其可以允许较高功效、较低毒性等。这些ADC具有三种组分：通过(2)接头缀合于(3)毒素部分或毒素的(1)单克隆抗体。该技术的概述在Ducry等人，BioconjugateChem.，21:5-13(2010)，Carter等人，CancerJ.14(3):154(2008)和Senter，CurrentOpin.Chem.Biol.13:235-244(2009)中提供，其全部在此通过参考以其整体结合。PDCs还具有三种组分：通过(2)接头缀合于(3)药物，如毒素部分或毒素的(1)多肽。本领域技术人员将理解，ADC的技术、方法、手段等可等同用于PDC。
本发明提供本发明的多肽，其包含药物，如毒素或毒素部分。
药物，例如毒素部分或毒素可以使用任何合适的方法连接或缀合于多肽。通常，缀合通过共价连接于多肽进行，如本领域中已知的，并且通常依赖于接头，常常是肽连接。例如，药物，如毒素部分或毒素可以直接共价或通过合适的接头键合于多肽。合适的接头可以包括不可裂解或可裂解的接头，例如，可pH裂解的接头，其包含对于细胞酶(例如，细胞酯酶、细胞蛋白酶如组织蛋白酶B)的裂解位点。该可裂解的接头可以用于制备可以在多肽被内化后释放药物，如毒素部分或毒素的配体。如将由本领域技术人员理解的，每个多肽的药物部分数可以改变，这取决于反应条件，并且可以从1:1至10:1药物:多肽变化。如还将由本领域技术人员理解的，实际数量是平均数。可以使用多种用于将药物，如毒素部分或毒素连接或缀合于多肽的方法。选择的特定方法将取决于药物，如毒素部分或毒素和要连接或缀合的多肽。如果需要，含有末端功能基团的接头可以用于连接多肽和药物，例如毒素部分或毒素。通常，通过将含有反应性功能基团(或修饰以含有反应性功能基团)的药物，例如毒素部分或毒素与接头或直接与多肽反应，完成缀合。共价键通过将含有(或修饰以含有)在适当条件下可以与第二化学基团反应从而形成共价键的化学部分或功能基团的药物，例如毒素部分或毒素反应而形成。如果需要，可以使用任何合适的方法将合适的反应性化学基团添加于多肽或接头。(参见，例如，Hermanson，G.T.，BioconjunateTechniques，AcademicPress：SanDiego，CA(1996).)。很多合适的反应性化学基团组合是本领域中已知的，例如胺基团可以与亲电基团如甲苯磺酸根、甲磺酸根、卤代(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺基酯(NHS)等反应。巯基可以与马来酰胺、碘代乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5-巯基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等反应。醛功能性基团可以与含胺或酰肼分子偶联，并且叠氮化物基团可以与三价磷基团反应，形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺连接。合适的将活化基团引入分子的方法是本领域公知的(参见例如，Hermanson，G.T.，BioconjugateTechniques，AcademicPress：SanDiego，CA(1996))。
如下文所述，PDC的药物可以是任意数量的药剂，包括但不限于细胞生长抑制剂、细胞毒剂如化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物源的酶活性毒素、或其片段)，毒素部分、或提供放射性同位素(即，放射性缀合物)。在其他实施方案中，本发明还提供使用PDC的方法。
本发明中使用的药物包括细胞毒性药物，特别是用于癌症治疗的那些。这样的药物通常包括DNA损伤剂、抗-代谢物、天然产物和它们的类似物。细胞毒剂的示例性类型包括酶抑制剂如二氢叶酸还原酶抑制剂、和胸苷酸合成酶抑制剂、DNA插入剂、DNA断裂剂(cleaver)、拓扑异构酶抑制剂、蒽环类抗生素家族的药物、长春花药物、丝裂霉素、博来霉素、细胞毒性核苷、蝶啶家族的药物、diynenes、鬼臼毒素、多拉司他汀、美登素类化合物(maytansinoids)、分化诱导剂、和紫杉酚(taxol)。
这些类型的成员包括，例如，氨甲喋呤(methotrexate)、甲氨喋呤(methopterin)、二氯甲胺蝶呤(dichloromethotrexate)、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、美法仑(melphalan)、长春罗新(leurosine)、leurosideine、放线菌素(actinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、丝裂霉素C、丝裂霉素A、caminomycin、氨基蝶呤(aminopterin)、他利霉素(tallysomycin)、鬼臼毒素和鬼臼毒素衍生物如依托泊苷(etoposide)或磷酸依托泊苷、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、紫杉烷类，包括紫杉酚、泰索帝(taxotere)、视黄酸、丁酸、N8-乙酰基亚精胺、喜树碱(camptothecin)、卡奇霉素(calicheamicin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、烯二炔类、多卡霉素(duocarmycin)A、多卡霉素SA、卡奇霉素、喜树碱(camptothecin)、美登素类化合物(包括DM1)、单甲基-阿里他汀(auristatin)E(MMAE)、单甲基阿里他汀F(MMAF)、和美登素类化合物(DM4)以及它们的类似物。
药物，如毒素可以用作多肽-毒素缀合物并且包括细菌毒素如白喉毒素，植物毒素如蓖麻毒素，小分子毒素如格尔德霉素(Mandler等人(2000)J.Nat.CancerInst.92(19):1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028；Mandler等人(2002)BioconjugateChem.13:786-791)，美登素类化合物(EP1391213；Liu等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623)，和卡奇霉素(Lode等人(1998)CancerRes.58:2928；Hinman等人(1993)CancerRes.53:3336-3342)。毒素可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制发挥它们的细胞毒性和细胞抑制效应。
考虑本发明的多肽和一种以上小分子毒素，如美登素类化合物、多拉司他汀、阿里他汀、新月毒素(trichothecene)、卡奇霉素、和CC1065，以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。
可以缀合于本发明的多肽的其他药物，如抗肿瘤药剂包括BCNU、streptozoicin、长春新碱和5-氟尿嘧啶、美国专利号5,053,394、5,770,710中描述的总称为LL-E33288复合体的药剂家族、以及埃斯培拉霉素(美国专利号5,877,296)。
可以使用的药物，如酶活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-八叠球菌、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(PhytolacaAmericana)蛋白(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、泻果素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、米托洁林(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。参见，例如，WO93/21232，1993年10月28日公开。
本发明还考虑本发明的多肽和具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶如脱氧核糖核酸酶；DNase)之间形成的PDC。
为了选择性破坏肿瘤，本发明的多肽可以包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生产放射缀合的抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。
放射性或其他标记可以以已知方式结合入缀合物种。例如，肽可以生物合成或可以通过使用合适的氨基酸前体(包括例如，氟-19替代氢)的化学氨基酸合成来合成。标记如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111可以经由肽中的半胱氨酸残基连接。钇-90可以经由赖氨酸残基连接。IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57可以用于结合碘-123."免疫闪烁成像中的单克隆抗体"(Chatal，CRC出版社1989)详细描述了其他方法。
多肽-药物缀合化合物的产生可以通过ADC领域中的技术人员已知的任何技术完成。简言之，多肽-药物缀合化合物可以包括本发明的多肽作为抗体单元、药物和任选地连接药物和结合剂的接头。
确定药物或抗体-药物缀合是否发挥作用，例如对细胞的细胞生长抑制和/或细胞毒性效应的方法是已知的。通常，抗体药物缀合的效应，例如细胞毒性或抑制细胞的活性可以通过以下各项测量：在细胞培养培养基中将表达靶标蛋白的哺乳动物细胞暴露于抗体药物缀合物；培养细胞达约6小时至约5天的时期；并且测量细胞生存力。基于细胞的体外测定可以用于测量生存力(增殖)、细胞毒性、和抗体药物缀合物对凋亡(半胱天冬酶活化)的诱导。这些方法同样可用于PDC。
因此，本发明涉及本发明的多肽，其还包含药物，如毒素或毒素部分。
因此，本发明涉及缀合于药物，如毒素或毒素部分的根据本发明的多肽。
鉴于特异性，本发明的多肽也非常适于缀合于显像剂。用于缀合于抗体的合适的显像剂是本领域公知的，并且类似地可用于缀合于本发明的多肽。合适的显像剂包括但不限于优选为选自由以下组成的组的分子：有机分子、酶标记、放射性标记、有色标记、荧光标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、金属配合物、金属、胶体金、荧光标记、金属标记、生物素、化学发光物(chemiluminescent)、生物发光物(bioluminescent)、发色团和其混合物。
因此、本发明涉及根据本发明的多肽，其还包含显像剂，包括但不限于优选为选自由以下组成的组的分子：有机分子、酶标记、放射性标记、有色标记、荧光标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、金属配合物、金属、胶体金、荧光标记、金属标记、生物素、化学发光物、生物发光物、发色团和其混合物。
接头
在本发明的多肽中，两个以上构建单元、ISV或纳米抗体和任选地一个以上多肽一个以上其他基团、药物、药剂、残基、部分或结合单元可以直接彼此连接(如例如WO99/23221中所述)和/或可以通过一个以上合适的间隔区或接头，或其任意组合彼此连接。
用于多价和多特异性多肽的合适的间隔区或接头将对于技术人员是明确的，并且可以通常是本领域中用于连接氨基酸序列的任何接头或间隔区。优选地，所述接头或间隔区适于用于构建预期用于药用的蛋白或多肽。
一些特别优选的间隔区包括本领域中用于连接抗体片段或抗体结构域的间隔区和接头。这些包括上文引用的一般背景中提及的接头，以及例如本领域中用于构建双抗体(diabodies)或ScFv片段的接头(然而，就这一点，应该注意，在双抗体和ScFv片段中，使用的接头序列应该具有允许相关VH和VL结构域靠拢以形成完整的抗原-结合位点的长度、柔性程度和其他性质，对用于本发明的多肽的接头的长度或柔性没有特定限制，因为各个纳米抗体本身形成完整的抗原-结合位点)。
例如，接头可以是合适的氨基酸序列，并且尤其是1至50个之间，其优选为1至30个之间，如1至10个之间的氨基酸残基的氨基酸序列。这样的氨基酸序列的一些优选的实例包括gly-ser接头，例如类型(glyxsery)z的，如(例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3，如WO99/42077中所述的，和本文提及的在申请中由Ablynx描述的GS30、GS15、GS9和GS7接头(参见例如WO06/040153和WO06/122825)，以及铰链状区域，如天然存在的重链抗体或类似序列的铰链区(如WO94/04678中所述)。优选的接头在表B-5中描述。
一些其他特别优选的接头是多聚丙氨酸(如AAA)，以及接头GS30(WO06/122825中的SEQIDNO：85)和GS9(WO06/122825中的SEQIDNO：84)。
其他合适的接头通常包含有机化合物或聚合物，尤其是适于在用于药用的蛋白中使用的那些。例如，聚(乙二醇)部分已经被用于连接抗体结构域，参见例如WO04/081026。
包括在本发明的范围内的是，使用的一个或多个接头(尽管不是至关重要，因为其通常用于在ScFv片段中使用的接头)的长度、柔性程度和/或其他性质可以对本发明的最终多肽的性质具有一些影响，包括但不限于对趋化因子、或对于一种以上的其他抗原的亲和力、特异性或亲合力。基于本文公开的内容，任选地在一些有限的常规实验之后，技术人员将能够确定用于本发明的特定多肽的最佳的一种或多种接头。
例如，在包含针对第一和第二靶标的构建单元、ISV或纳米抗体的本发明的多价多肽中，接头的长度和柔性优选为这样：其允许存在于多肽中的本发明各个构建单元、ISV或纳米抗体结合于其同源靶标，例如各个靶标上的抗原决定簇。再次，基于本文公开的内容，在任选地在一些有限的常规实验后，技术人员将能够确定用于本发明的特定多肽的一个或多个最佳接头。
还在本发明的范围内的是，使用的一个或多个接头赋予本发明的多肽一种以上其他有利性质或功能性，和/或提供一个以上用于形成衍生物和/或用于连接功能基团(例如如本文所述用于本发明的纳米抗体的衍生物)的位点。例如，含有一个以上带电氨基酸残基的接头可以提供改善的亲水性质，而形成或含有小的表位或标签的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化的目的。再次，基于本文中公开的内容，任选地在一些有限的常规实验后，技术人员将能够确定用于本发明的特定多肽的最佳接头。
最后，当两个以上接头用于本发明的多肽时，这些接头可以相同或不同。再次，基于本文中的公开内容，任选地在一些有限的常规实验后，技术人员将能够确定用于本发明的特定多肽的最佳接头。
通常，为了容易表达和生产，本发明的多肽将是线性多肽。然而，在其最广泛的意义上，本发明不限于此。例如，当本发明的多肽包含三个以上构建单元、ISV或纳米抗体时，可能通过使用具有三个以上“臂”的接头连接它们，每个“臂”连接于构建单元、ISV或纳米抗体，从而提供“星形”构建体。尽管通常不优选，还可能使用环形构建体。
治疗和诊断组合物和用途
本发明提供包含本发明的多肽的组合物，其包括本发明的PDC，以及药用载体、稀释剂或赋形剂，提供使用本发明的多肽或组合物的治疗和诊断方法。根据本发明的方法，包括PDC的多肽可以用于体内治疗性和预防性应用、体内诊断应用等。本发明的多肽(包括PDC)的治疗性和预防性使用包括施用根据本发明的多肽(包括PDC)给接受者哺乳动物，如人。
对于施用于哺乳动物，至少90至95％均一性的基本上纯的多肽和PDC是优选的，并且对于药用，98至99％以上均一性是最优选的，特别是当哺乳动物是人时。一旦部分纯化或纯化至所需的均一性，多肽和PDC可以在诊断上或治疗上(包括体外地)或在开发和进行测定程序、免疫荧光染色方面等使用(Lefkovite和Pernis，(1979和1981)ImmunologicalMethods，第I和II卷，AcademicPress，NY)。
例如，本发明的多肽和PDC将通常用于预防、抑制或治疗疾病状态。例如，可以施用多肽或PDC以治疗、抑制或预防慢性炎症疾病、过敏性超敏反应、癌症、细菌或病毒感染、自身免疫病症(其包括但不限于I型糖尿病、哮喘、多发性硬化、类风湿性关节炎、幼年型类风湿关节炎、银屑病关节炎、脊椎炎{例如，强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis))、系统性红斑狼疮、炎性肠病{例如，克罗恩病(Crohn'sdisease)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis))、重症肌无力(myastheniagravis)和贝赫切特综合征(Behcet'ssyndrome)、银屑癣(psoriasis)、子宫内膜异位(endometriosis)和腹腔粘连{例如，腹部手术后)。多肽和PDC可用于治疗感染性疾病，其中被传染原感染的细胞含有比未感染细胞更高水平的细胞表面EGFR或其含有一种以上不存在于未感染细胞上的细胞表面靶标，如由感染原{例如，细菌、病毒)编码的蛋白。本发明的多肽和PDC将通常用于预防、抑制或治疗癌症。例如，可以施用多肽和PDC以治疗、抑制或预防癌症，所述癌症包括，但不限于，癌、神经胶质瘤、间皮瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、成胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤(包括意义不明的单克隆丙种球蛋白病、无症状和有症状的骨髓瘤)、前列腺癌症、和伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆管癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌癌、类癌癌症、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卡波济氏肉瘤、多中心卡斯尔曼病或AIDS-相关原发性渗出淋巴瘤、神经外胚层肿瘤、横纹肌肉瘤(对于其他癌症参见例如，Cancer,Principlesandpractice(DeVita、V.T.等人编辑1997))；以及上述癌症、以及非癌适应征如鼻息肉病的任一种的任意转移；以及本文所述的其他病症和疾病。
在目前的应用中，术语"预防"包括在引发疾病之前施用保护性组合物。"抑制"是指在诱发时间之后，但在疾病的临床症候之前施用组合物。"治疗"包括在疾病症状变得明显之后施用保护性组合物。治疗包括改善与疾病相关的症状，并且还阻止或延迟疾病的发病并且还减轻疾病的症状的严重度或频率。
可以用于评价本发明的多肽和PDC在预防、治疗或抑制疾病(例如，癌症)方面的功效的动物模型体系是可用的。癌症的合适的模型包括，例如，人癌症在动物模型，如SCID-hu黑素瘤模型中的异种移植物和原位模型(EpsteinJ，和Yaccoby，S.，MethodsMoIMed.773:183-90(2005)，TassoneP，等人，ClinCancerRes.11:4251-8(2005))，人肺癌的小鼠模型(例如，MeuwissenR和BernsA，GenesDev.CHECK:643-64(2005))，和转移癌症的小鼠模型(例如，KubotaJCellBiochem.56:4-8(1994))。
通常，本发明的多肽和PDC将以纯化的形式与药理学上适当的载体一起使用。通常，这些载体包括水溶液或醇/水溶液、乳状液或悬浮液，包括盐水和/或缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格(Ringer's)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸化的林格液。合适的生理学可接受的辅剂(如果为保持多肽-或PDC-复合体于悬浮液中所必需)，可以选自增稠剂如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。
静脉内媒介物包括流体和营养补充物和电解质补充物，如基于林格葡萄糖的那些。还可以存在防腐剂和其他添加剂，如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington'sPharmaceuticalSciences，第16版)。可以使用多种合适的制剂，包括延迟释放制剂。
本发明的多肽和PDC可以用作分开施用的组合物或与其他药剂联合。多肽和PDC可以与一种以上其他治疗或活性剂一起施用和或配制。当多肽或PDC与其他治疗剂一起施用时，多肽或PDC可以在施用其他药剂之前、与其同时或之后施用。通常，多肽或PDC和其他药剂以提供治疗效果的重叠的方式施用。
本发明的多肽和PDC可以与多种合适的共治疗剂共同施用(例如，以治疗癌症、炎症疾病或其他疾病)，所述共治疗剂包括细胞因子、止痛剂/退热剂、止吐剂和化疗剂。
因此本发明提供治疗癌症的方法，其包括向需要其的患者施用治疗有效量的本发明的多肽或PDC和化疗剂，其中化疗剂以低剂量施用。通常与本发明的多肽共同施用的化疗剂的量是正常施用给患者的单独化疗剂剂量的约80％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约20％、或约10％以下。因此，当化疗剂引起在较低剂量可以减小或缓解的有害或不希望的副作用时，共同治疗(cotherapy)特别有利。
药物组合物可以包括多种细胞毒性或其他药剂与本发明的多肽或PDC的"混合物"或甚至根据本发明的具有不同特异性的多肽和PDC，如使用不同靶标抗原或表位的选择的多肽或PDC的组合(不论它们在施用前是否合并)。
根据本发明的药物组合物的施用途径可以是任何合适的途径，如通常本领域普通技术人员已知的那些中的任一个。对于治疗，包括但不限于免疫治疗，本发明的多肽和PDC可以根据标准技术施用给任意患者。施用可以是任何合适的模式，包括肠胃外、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮、鞘内、关节内、经由肺途径，或此外，适当地，通过直接输注(例如，利用导管)。施用的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况，其他药物的共同施用，禁忌症和医生要考虑的其他参数。如指出的，施用可以是局部的(例如，通过肺施用(例如，鼻内施用)局部递送至肺，或直接局部注射入肿瘤)或系统性的。
可以将本发明的多肽和PDC冻干用于储存并在使用前在合适的载体中恢复。已经显示该技术对常规免疫球蛋白有效并且可以使用本领域已知的冻干和恢复技术。本领域技术人员将理解的是，冻干和恢复可能导致不同的抗体活性损失程度(例如常规免疫球蛋白，IgM抗体倾向于比IgG抗体具有更大的活性损失)并且使用水平可能必须上调以补偿。
可以施用含有多肽或PDC的组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗性应用中，足以实现选择的细胞群体的至少部分抑制、压制、调节、杀伤、或一些其他可测量的参数的量定义为"治疗有效剂量"。实现该剂量所需的量将取决于疾病的严重度和患者的一般健康状况，但通常范围从0.005至5.0mg的配体/千克体重，更通常使用0.05至2.0mg/kg/剂量的剂量。对于预防性应用，含有本发明的多肽和PDC或其混合物的组合物也可以以类似的或稍低的剂量施用，以预防、抑制或延迟疾病的发病{例如，维持缓解或静止、或预防急性期)。熟练的临床医生将能够确定适当的剂量给药间隔以治疗、抑制或预防疾病。当施用多肽或PDC以治疗、抑制或预防疾病时，其可以以例如，约10[mu]g/kg至约80mg/kg、约100[mu]g/kg至约80mg/kg、约1mg/kg至约80mg/kg、约1mg/kg至约70mg/kg、约1mg/kg至约60mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至约40mg/kg、约1mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约10[mu]g/kg至约10mg/kg、约10[mu]g/kg至约5mg/kg、约10[mu]g/kg至约2.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg的剂量，每天多至四次、每周两次、每周一次、两周一次、每一个月一次、或每两个月一次施用。
在特定实施方案中，以提供锚定靶标饱和或所需体内血清浓度的剂量施用本发明的多肽和PDC。熟练的医生可以例如通过滴定多肽和监测所述表达锚定靶标的细胞的游离结合位点数或多肽的血清浓度确定适当的剂量给药以实现饱和。包括施用治疗剂以实现靶标饱和或药剂的所需血清浓度的治疗方案在本领域中，特别是在肿瘤学领域中常见。
如果相对于治疗前存在的该症状，或相对于未用该组合物治疗的个体(人或模型动物)中的该症状或其他合适的对照，一个以上症状减少(例如，以至少10％或至少在临床评估得分的一分)，使用本文中所述的组合物进行的治疗或疗法被认为"有效"。症状将明显根据靶向的疾病或病症改变，但可以由普通临床医生或技术人员测量。该症状可以，例如，通过监测疾病或病症的一个以上生化指标的水平(例如，与疾病相关的酶或代谢物的水平、影响的细胞数等)，通过监测身体表现(例如，炎症、肿瘤大小等)，或通过可接受的临床评价尺度测量。疾病或病症症状以至少10％或以给定临床得分的一分以上的持续的(例如，一天以上，其优选更长)减少表明"有效"治疗。类似地，如果相对于未用组合物治疗的相似个体(人或动物模型)中的该症状，一个以上症状的发病或严重度被延迟、减少或消除，使用如本文所述组合物进行的预防是"有效的"。
含有根据本发明的多肽和/或PDC的组合物可以用于预防和治疗装置以帮助改变、失活、杀伤或去除哺乳动物中的选择靶标细胞群体。此外，配体和选择的多肽组库(repertoires)可以在身体外或在体外选择性使用以从异源细胞集合杀伤、减少或否则有效移除靶标细胞群体。可以将来自哺乳动物的血液与配体，例如抗体、细胞表面受体或其结合蛋白在体外组合，由此，不需要的细胞被杀伤或否则被从血液移除，用于根据标准技术返回哺乳动物。
因此，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明的多肽或PDC。
因此，本发明涉及递送预防性或治疗性多肽、PDC或显像剂至体内的特定位置、组织或细胞类型的方法，所述方法包括向受试者施用根据本发明的多肽。
因此，本发明涉及治疗需要其的受试者的方法，其包括施用根据本发明的多肽或PDC。
因此，本发明涉及根据本发明的多肽或PDC，其用于治疗需要其的受试者。
本说明书中说明和讨论的实施方案仅意在教导本领域技术人员本发明人已知的最佳方式以实现和使用本发明。如本领域技术人员根据上述教导理解的，在不偏离本发明的情况下，本发明的上述实施方案的改进和变化形式是可能的。因此要理解，在权利要求和其对等物的范围内，本发明可以除了如具体描述的之外实践。
现在将通过以下非限制性优选的方面、实施例和附图进一步描述本发明。
本申请中引用的所有参考文献(包括文献参考文献、公开的专利、公开的专利申请和共同待定的专利申请)，尤其是对于上文参考的教导，在此明确通过引用结合。
实验部分
实施例1优选用CXCR4-CD123双特异性多肽靶向白血病细胞
实施例1.1设计双特异性CXCR4和CD123多肽的实验安排
生成双特异性抗-CXCR4-CD123纳米抗体，我们旨在产生对于表达CXCR4和CD123受体二者的细胞(作为用于癌细胞的模型系统)上，但不在代表正常细胞的主要表达CXCR4的细胞上的CXCR4的高亲和力和高效力拮抗剂，全都为了最小化副作用或毒性。
为了达到该选择性，猜测的是一个臂上的抗-CXCR4纳米抗体(功能性ISV)需要是完全拮抗剂，但仅具有低至中等亲和力。另一臂上的抗-CD123纳米抗体用作(锚定ISV)以通过亲合力增加在共表达两种受体的细胞上的抗-CXCR4纳米抗体的亲和力和效力。同时结合2种膜受体将增加双特异性相对于单价纳米抗体的亲和力。对于CD123臂，纳米抗体优先是结合物，但其不影响其功能，再次为了最小化副作用或毒性。因此，不需要CD123受体的功能性阻断。图1.1中列出的模型系统用于研究双特异性CD123-CXCR4构建体的选择性功能，其以高亲合力结合表达两种受体的细胞(即白血病干细胞)，但对CXCR4+/CD123-细胞(即正常造血干细胞)仅具有低亲和力和效力。
各个需要获得增加的亲合力的纳米抗体的亲和力是之前未知的；当亲和力太高时，双特异性多肽将也结合仅表达一种受体的细胞，这是不希望的。为此我们对于与低至中等效力CXCR4纳米抗体组合的对IL3Rα具有不同亲和力的纳米抗体安排设计选择步骤。
实施例1.2:单价纳米抗体的生产
在大肠杆菌中生产单价CXCR4和CD123-特异性纳米抗体，并在表达载体pAX129中表达为C-末端连接的FLAG3，His6-标记的蛋白。对于单价CXCR4-构建单元和单价CD123-构建单元，氨基酸序列分别描述在表1和2中。通过IPTG诱导表达并且让其在37℃继续4h。在离心细胞培养物后，通过冻融沉淀制备周质提取物。使用固定化金属亲和层析(IMAC)从这些提取物中纯化纳米抗体并且将缓冲液换为D-PBS。纯度和完整性通过SDS-PAGE确认。
实施例1.3：抗-CD123特异性纳米抗体的特性
为了最小化潜在的副作用和/或毒性，其优选抗-CD123纳米抗体不影响也在正常细胞上表达的IL3Rα的功能。此外，为了避免由可能引入表位多样性造成的任何并发症，和保证构思验证(PoC)研究中功能/选择性的任何获得仅由相对亲和力(即单价构建单元的亲和力)限定，我们着手鉴别与相同表位结合但区别仅在于相对亲和力的纳米抗体。
实施例1.3.1抗-CD123纳米抗体对表达IL-3Rα的细胞的结合
在用pcDNA3.1-IL3Rα(NM_002183.2)转染的HEK293T细胞和未转染的细胞上分析结合于膜相关的人IL-3Rα的纳米抗体。通过使用IL-3Rα特异性抗体(R&DMAB301和BDPharminogen554528)，接着山羊抗-小鼠PE(JacksonImmunoResearch115-115-164)的FACS确认表面表达。简言之，让纳米抗体的系列稀释物在4℃在FACS缓冲液(PBS1X+10％FBS+0.05％叠氮化物)中结合30分钟。这之后，将细胞通过离心清洗并且用6.7nM抗-FLAG在4℃探测30分钟，以检测结合的纳米抗体。在4℃用抗-M13进行30分钟检测。将细胞清洗并与TOPRO3温育以对死细胞染色，然后将其在门控(gating)步骤中移除。然后经由BDFACSArray分析细胞。结果在图1.2中描述。
表明CD123纳米抗体55A01和57A07与Hek-IL-3Rα细胞的明确相互作用，同时缺乏对HEK293T-wt细胞的结合，确认纳米抗体对IL-3Rα的特异性(数据未显示)。
还在内源性表达IL-3Rα和IL-3Rβ链二者的白血病细胞，即Molm-13和THP-1细胞上评价CD123纳米抗体的结合。这些细胞具有远低于转染的HEK-IL-3Ra细胞的IL-3Rα表达水平，并且具有可能更具代表性的受体表达水平。由于对于该方案选择的克隆的较低效力，结合曲线就结合的饱和而言是不完全的。结合曲线和EC50值分别显示在图1.2和表3中。
结合研究确认，纳米抗体能够结合IL3Rα但不破坏IL3Rα与IL3Rβ伙伴的异二聚受体复合体，其满足逃避CD123受体信号传导的功能性阻断的前提。
实施例1.3.2CD123纳米抗体的亲和力确定
进一步经由表面等离子共振(SPR)以ProteOn研究CD123特异性纳米抗体的亲和力。进行重组IL-3Rα胞外域(SinoBiologicals)的固定直到761RU。以1μM的最高浓度，接着三倍滴度，施加纳米抗体，覆盖范围从1μM至4.1nM的5个进一步的浓度。然后将这些应用于单个注射循环，使用ProteOn’的特定一次(one-shot)动力学方法用于动力学分析。结合/解离数据的评价通过匹配1:1相互作用模型(Langmuir结合模型)进行。由于纳米抗体的低亲和力，很多克隆在1μM浓度未能显示饱和。对于CD123纳米抗体，获得的KD值与由细胞结合EC50值得到的表观亲和力良好关联(参见表3)。
实施例1.3.3抗-CD123纳米抗体与抗-CD123抗体7G3的竞争
功能性高亲和力人IL-3受体是由结合配体的α亚单位和β亚单位组成的异二聚体。β亚单位本身不结合配体IL-3，但对于IL-3对异二聚受体复合体的高亲和力结合是需要的。
不能评价Molm-13细胞上的配体置换，因为生物素化的配体产生太低的结合。因为在不存在IL-3Rβ的情况下IL-3对IL-3Rα仅具有低亲和力，所以转染的Hek-IL-3Rα细胞也不能使用。为了评价表位信息，在ELISA中的与IL-3Rα-特异性mAb7G3对IL-3Rα胞外域的竞争结合中分析CD123纳米抗体。抗-IL-3Rα特异性单克隆抗体7G3、CSL-360的人源化版本，之前在I期临床试验中显示缺乏功能性功效。
简言之，抗体7G3(BD，554527)以1ug/ml包被并以溶液中的酪蛋白(1％)封闭。加入纳米抗体和生物素化的-IL-3Rα胞外域[R&Dsystems，301-R3/CF]并使得经四小时达到平衡。然后清洗板并经由extravidin过氧化物酶检测结合IL-3Rα的7G3，之后显色并随后分析在OD450nm的吸光度。IC50值显示在表3中。
对CD123纳米抗体测试其与7G3抗体的竞争能力。两种抗-CD123纳米抗体，即55A01和57A07，结合与7G3相同的表位，但具有不同相对亲和力和效力(还参见表5)。随后，使用这些纳米抗体以与抗-CXCR4纳米抗体形成双特异性多肽(参见实施例1.5)。
实施例1.4:抗-CXCR4特异性纳米抗体的特性
在本实施例中，发明人着手鉴别和表征抗-CXCR4纳米抗体，其一方面具有低亲和力，并且另一方面仍然能够用作功能性拮抗剂。因为在功能上测试具有低至中等亲和力的纳米抗体(尤其是缺少任何必须由于低亲和力而非由于结合例如不相关表位导致的观察到的功能)是繁杂的，本发明人使用非常规的方法，其详述如下。
首先对一大系列可获得的抗-CXCR4纳米抗体评价其拮抗CXCR4信号传导的能力。在之前的研究中，已经鉴别了对CXCR4特异的功能性拮抗性纳米抗体。本发明人然后转向功能拮抗剂的具有较低亲和力的家族成员。
此外，本发明人观察到，在一些情况下纳米抗体在双特异性多肽中的位置可能减小亲和力。不受限于任何理论，猜测这可能是由于位阻。因此，通过将已知具有中等亲和力并且具有拮抗活性的纳米抗体，置于双特异性多肽的"不利"位置，亲和力和功能效应二者都能够被减小。这样，可以辨别第二纳米抗体对低亲和力抗-CXCR4纳米抗体的功能的亲合力效应。
实施例1.4.1低亲和力CXCR4纳米抗体的鉴别
对于CXCR4-IL-3Ra双特异性多肽的产生，需要具有低至中等亲和力的纳米抗体，其识别用于功能性阻断的正确表位。在之前的研究中，鉴别了对于CXCR4特异性的功能性拮抗性纳米抗体。然而，在那些之前的研究中，先导物选择和鉴别步骤期间的主要目的是鉴别高效力候选物，而非低亲和力克隆。因为之前研究的筛选级联关注于配体结合的阻断，所以这妨碍本研究中所需的具有正确表位但具有由于低亲和力造成的低效力的克隆的鉴别。在为了正确构象嵌入细胞膜的CXCR4的情况下，不能获得重组蛋白来源，以如对于IL-3Ra纳米抗体的通过SPR中的解离速率(off-rate)分析特异搜索低亲和力纳米抗体。
为了克服该问题，发明人集中于CXCR4纳米抗体的被证实具有配体功能性阻断CXCR4信号传导的家族成员。如由保守的CDR3区域限定的，纳米抗体14A02、14E02和14D09是相同家族的成员。在不同细胞测定中已经显示高亲和家族成员，CXCR4纳米抗体14A02，是有效的CXCR4功能拮抗剂，包括配体-诱导的趋化作用和对表达CXCR4的细胞中cAMP诱导的抑制(表4)。
实施例1.4.2CXCR4纳米抗体的结合分析
在不同细胞系上评价CXCR4纳米抗体对表达CXCR4的细胞的结合以评价EC50值。对于CXCR4，受体的正确构象和功能需要膜插入。因此在ELISA中表征CXCR4纳米抗体对于表达CXCR4的病毒脂质颗粒(lipoparticles)(VLP；MolecularIntegral)相对于对照脂质颗粒的结合。为此，以0.5U/孔在4℃包被VLP过夜，使用抗-myc抗体检测。在所有不同结合测定中，纳米抗体14D09总是显示比14A02低的结合亲和力，如EC50值的迁移所指示的。结果在图1.3中描述。
实施例1.4.3CXCR4纳米抗体的配体置换
在流式细胞术中，通过替代Caki-CXCR4细胞上的生物素化的SDF-1对CXCR4纳米抗体分析其与配体CXCL12(或SDF-1a)对受体结合的竞争能力。为此，将纳米抗体的系列稀释物与细胞上的30nM的生物素化的SDF-1(R&DSystemsFluorokine试剂盒)温育，其后使用extravidin-PE可视化配体结合。在该测定中使用的生物素-SDF-1竞争物浓度低于在剂量滴定中获得的EC50值，其中IC50值应该反映Ki。
该测定确认，家族成员14A09和14A02之间的表观亲和力的差异转化为配体竞争能力的相似的差异(图3，图片C)。以此种方式，我们确信，14D09(也称为14D9)纳米抗体是配体竞争剂并且其亲和力的改善可以导致更好的效力(当较低效力未能显示有效的SDF-1竞争时)。
在对Hek-CXCR4细胞的膜提取物的放射-配体置换测定中分析CXCR4纳米抗体。使用放射标记的配体的优势是增加的灵敏度，并且低的竞争剂浓度保证Ki值(即真实亲和力常数)的测定，而不是测量IC50值。这使得可能精确确定低亲和纳米抗体的效力，尽管它们可能不能达到完全置换。
为此，将转染以CXCR4的Hek293细胞的膜提取物与纯化的纳米抗体的系列稀释物和75pM的[125I]-CXCL12温育。在100nM冷的SDF-1的存在下确定非特异性结合。作为对照，包括完全封闭CXCR4纳米抗体238D4和281A6。测定进行三次，并且计算SDF-1抑制的平均百分数。
在图1.3中，图片D显示纳米抗体281F12仅具有Ki为27nM的中等效力，并且仅具有部分功效，而对照CXCR4纳米抗体238D4显示完全功效。这使得281F12成为合适的其他候选物，用于与IL-3Ra纳米抗体形成双特异性构建体。
表4列出低至中等亲和力的CXCR4纳米抗体，以及它们的各自家族成员的特性。
实施例1.5:双特异性多肽
在本实施例中，本发明人组合在之前的实验中鉴别和表征的，并且其特征在表5中总结的不同的抗-CXCR4和抗-CD123纳米抗体。随后对得到的双特异性多肽测试特异性。尤其是，制备八个构建体，其在表6中总结。
实施例1.5.1克隆、制备和物理表征
将IL3Rα和CXCR4纳米抗体克隆在制备载体pAX138中并表达为Myc-His6-标记的蛋白以构建双特异性多肽。构建CXCR4纳米抗体14D09(称为CXCR4#1)和281F12(称为CXCR4#2)以及IL-3Ra纳米抗体57A07(称为CD123#1和55A01(称为CD123#2)的全部八种组合(参见表6)。纳米抗体以重复的(GGGGS)7的弹性、长接头连接。使用含有适当的限制性位点的的引物，在分开的PCR反应中扩增个体纳米抗体，以产生N-末端片段和C-末端片段。随后将片段插入pAX138表达载体用于大肠杆菌生产。所有构建体的正确的核苷酸序列通过序列分析确认(参见表7，双特异性构建体)。随后将正确的构建体重新克隆入pAX205载体用于在毕赤酵母(Pichiapastoris)中产生作为Flag3-His6-标记的蛋白。通过用限制酶消化，线性化编码双特异性构建体的质粒，之后转化入毕赤酵母株X-33。进行毕赤酵母转化子的小规模测试表达以选择具有良好表达水平的克隆。为此，在24孔深孔板中进行各个构建体的4个克隆的4ml规模的表达。培养基中纳米抗体的表达通过SDS-PAGE评价。收集培养基级分并且用作用于使用NickelSepharoseTM6FF的固定金属亲和层析(IMAC)的起始材料。用250mM咪唑从柱上洗脱纳米抗体并且随后在Atoll(ATO002)上的SephadexG-25Superfine上相对于dPBS脱盐。纳米抗体的纯度和完整性通过SDS-PAGE和使用抗-VHH和抗-标签检测的蛋白质印迹验证。
单价CXCR4和IL-3Ra-特异性纳米抗体在大肠杆菌中生产并在表达载体pAX129中表达为C末端连接的FLAG3，His6-标记的蛋白，如实施例1.2中列出的。
实施例1.5.2CXCR4-IL-3Ra双特异性的表征
为了评价格式化为双特异性构建体是否影响个体纳米抗体的靶标结合能力，对双特异性纳米抗体分析对在ELISA中重组IL-3Ra(R&DSystems)和对CXCR4病毒脂质颗粒(IntegralMolecular)的结合。图1.4显示，CD123#1(57A07)和CD123#2纳米抗体的IL-3Ra结合能力保留在所有双特异性抗体中。然而，构建体与CXCR4#1或CXCR4#2之一的CXCR4结合仅在一个取向上，当CXCR4纳米抗体在N末端位置时，保留。其中CXCR4纳米抗体位于C末端的双特异性构建体显示对CXCR4-VLP的结合的50-100倍损失。
实施例1.5.3表达CXCR4和Il-3R的白血病细胞系
使用具有不同的CXCR4和CD123表达水平的白血病细胞系以及Jurkat细胞评价双特异性CXCR4-IL-3Ra多肽和它们的单价对应物的结合特性。利用抗-hCXCR4抗体12G5(R&DSystemsMAB170)和抗-hIL-3Ra抗体7G3(BDPharmingen，554527)，接着第二抗体山羊-抗-小鼠PE(JacksonImmunoResearch)，通过FACS分析确认靶标表达。
结果在图1.5中描述。
MOLM-13细胞和THP-1细胞具有不同的CXCR4和Il3Ra的相对表达水平，hIL3Ra在Molm-13中比在THP-1细胞中比CXCR4更高表达。U937细胞表达最高水平的CXCR4并且几乎没有IL-3Ra。
实施例1.5.4CXCR4-CD123的结合分析
在仅表达CXCR4的U937细胞上，和以不同比率表达两种靶标的MOLM-13和THP-1细胞上分析两种取向的双特异性多肽的结合。代表性的图表显示在图1.6中。以CXCR4-IL-3Ra取向，与单价CXCR4纳米抗体相比，双特异性纳米抗体的亲和力在Molm-13细胞上得到改善，其中EC50反映构建体中存在的各个单价IL-3Ra纳米抗体的那些。除了EC50值的迁移外，此外对于对CXCR4的亲和力被保持的双特异性抗体(CXCR4-IL-3Ra取向)，总的结合似乎增加。在Molm-13细胞上，CXCR4结合被强烈减少的构建体(IL-3Ra-CXCR4取向)的结合曲线与各个IL-3Ra纳米抗体重叠。这与Molm-13细胞中CD123相对于CXCR4更高的表达水平一致。
THP-1和MOLM-13细胞之间总荧光水平的差异表示，细胞上的两种抗原的相对表达水平似乎也增进CXCR4-IL-3Ra双特异性多肽的结合行为(图1.6)。
实施例1.5.5细胞系JurkatE6-1和MOLM-13的混合
评价双特异性多肽优先结合表达CXCR4和CD123二者的细胞，而不是单独表达CXCR4的细胞的能力。为此，进行利用双阳性(MOLM-13)和仅CXCR4的(JurkatE6-1)细胞的混合群体的FACS实验，模拟异源细胞群的现实状况。为了区别两种细胞群，在与纳米抗体温育前，根据制造商的使用说明将MOLM-13细胞用0.5μMCFSE(MolecularProbes，LifeTechnologies)标记并且将JurkatE6-1用0.5μMPKH26(Sigma-Aldrich)标记。在相同孔中以1:1比率混合两种细胞系后，将它们与6-倍系列稀释的不同双特异性多肽和相应单价构建单元温育。使用小鼠抗-FLAG(Sigma-Aldrich)，接着抗-小鼠IgG-APC(JacksonImmununoresearch)经由C-末端FLAG标签检测纳米抗体的剂量依赖性的结合，并用FACSCantoII(Becton，DickinsonandCompany)测量。作为对照，也在任一单独细胞系上评价纳米抗体结合。
作为IL3Ra-CXCR4取向的双特异性多肽的低亲和力的结果，对于这些构建体不能获得EC50值。因此，以一个纳米抗体浓度(4.6nM)对MOLM-13(CXCR4+/CD123+)相对于JurkatE6-1(CXCR4+/CD123-)细胞的结合之间进行直接比较。图1.7表明，对于IL3Ra-CXCR4(I-X)取向的双特异性构建体(其中对于CXCR4的亲和力受损)，观察到优先结合MOLM-13细胞。相反取向的构建体(其中CXCR4单价在N-末端和维持其亲和力)，以大约相同的水平结合JurkatE6-1和MOLM-13细胞二者，从而在该浓度显示对MOLM-13的结合的改善。
这可以表明，当前使用的CXCR4纳米抗体的亲和力(即EC50大约10nM)仍然太高而不能经由双特异性结合获得选择性的增加。为了实现该优先结合，结果提示，对于CXCR4的亲和力甚至可以更低，例如低至IL3Ra-CXCR4构建体的残余的结合水平。
实施例1.5.6CXCR4-介导的趋化作用的抑制
为了证实双特异性CXCR4-IL3Ra多肽是否对表达两种受体的细胞显示增加的亲和力和效力，进行CXCR4-依赖性的功能性测定。为此，进行对JurkatE6-1(CXCR4+/IL3Ra-)、和MOLM-13细胞(CXCR4+/IL3Ra+)的SDF-1a依赖性的趋化作用，以直接比较表达两种或仅一种受体的细胞。因为功能性阻断仅经由CXCR4介导，所以预期通过同时结合抗-IL3Ra 导致的亲合力转化为趋化作用的抑制方面的增加的效力。
对双特异性多肽，分析对内源性表达CXCR4的细胞上CXCL12-诱导的趋化作用的抑制。作为化学吸引剂，750pMSDF-1a的浓度用于Jurkat细胞系，100,000个细胞/孔，并且用于MOLM-13细胞系，500,000个细胞/孔。在各个板上，包括相应的单价CXCR4纳米抗体作为参考，允许计算各个板内双特异性多肽的倍数增加。作为另外的对照，包括单价纳米抗体的1:1混合物。不同构建体期间的代表性的图表显示在图1.8中。在表9中，显示各个IC50值(n＝3次实验的平均值)。
这些数据表明，对于CXCR4-IL-3Ra取向的双特异性多肽，在表达两种抗原的细胞上，对CXCR4功能的抑制效力明显增加，但在仅表达CXCR4的细胞上不是如此。当使用两种单价纳米抗体的混合物时，观察不到该增加，因此其依赖于连接纳米抗体以同时衔接靶标。纳米抗体CXCR4#2的双特异性构建体对Molm-13细胞的效力增强是12-15倍。似乎在两个IL-3Ra纳米抗体之间没有表观差异，提示较低构建单元的8nM亲和力已经足以用作锚定物。效力的增加对于CXCR4#1构建单元的双特异性构建体较不显著，其中与单价纳米抗体相比仅有较小的增加。CXCR4#1的效力高于对于CXCR4#2的效力(IC50，10nM相对于84nM)，这可以表明，格式化为双特异性抗体后，其太高而看不到改善。备选地，还可能的是，该纳米抗体结合CXCR4上不同的-较不利的-表位(其限制格式化潜力)。
不同构建体的代表性的图表在图1.8中显示。在表8中，显示IC50值(n＝2-3次实验)。
这些数据表明，双特异性抗体显示效力的增加，改善CXCR4纳米抗体抑制SDF-1诱导的对MOLM-13细胞的趋化作用的效力高达12-15倍。
实施例2:利用CD4-CXCR4双特异性多肽优先靶向T细胞
实施例2.1：用于格式化的单价纳米抗体的特性
之前利用人外周血淋巴细胞从免疫文库鉴别了一组CD4纳米抗体。除了其对T细胞的作用外，CD4还用作HIV1进入的主要受体。因此对于一组CD4纳米抗体，分析阻断与病毒gp120蛋白的相互作用的能力。简言之，在ELISA中对CD4纳米抗体分析与gp120蛋白竞争结合重组CD4的能力。简言之，将板用20ug/mL绵羊抗-gp120抗体包被。在室温捕获1ug/mL的HIV1gp120蛋白达1hr。将0.5μg/mL的生物素化的重组人CD4(Invitrogen)与500nM抗-CD4纳米抗体、或对照抗体小鼠抗-CD4mAbB-A1和F5(Diaclone)以及兔抗-CD4pAb(ImmunoDiagnosticInc)预温育1hr，之后将混合物转移至包被的平板并温育1hr。利用Extravidin-过氧化物酶缀合物进行结合的CD4的检测。图2.1表明仅发现一个克隆抑制与gp120的相互作用，即纳米抗体3F11。通过对MOLM-13细胞和人T-细胞的流式细胞术，使用抗-flag-标签的检测，表明细胞表达的CD4与3F11的结合，表观亲和力为0.76nM。纳米抗体CD4的特性在表2.1中。
表2.1单价CD4纳米抗体的特性。
实施例2.2双特异性CXCR4-CD4多肽的构建
将抗-CD4纳米抗体3F11的构建体(称为CD4#8)和抗-CXCR4纳米抗体282F12的构建体(称为CXCR4#2)克隆入制备载体pAX100。该载体衍生自pUC119并且含有LacZ启动子、卡那霉素抗性基因、多克隆位点、OmpA前导序列、C-末端c-myc标签和(His)6标签。因为两个靶标都充当HIV-1进入的共受体，所以预期它们在细胞表面上接近。由于此原因，产生具有不同长度的柔性间隔区的双特异性多肽，所述间隔区用于连接两个纳米抗体构建单元：分别为(Gly4SerGly4)(9GS)、(Gly4Ser)5(25GS)、和(Gly4Ser)7(35GS)。以两种取向产生双特异性构建体，得到8种不同双特异性构建体(表2.2)。所有构建体的正确的核苷酸序列通过序列分析确认(对于所有序列的概述，参见表10)。随后，将正确的纳米抗体构建体再克隆入pAX205载体，用于在毕赤酵母中产生为FLAG3-His6-标记的蛋白，如实施例1.2中描述的。
表2.2
实施例2.3双特异性CXCR4-CD4多肽的结合分析
为了评价格式化为双特异性构建体是否影响CXCR4#2纳米抗体对CXCR4的结合，对整组的双特异性多肽分析对病毒脂质颗粒(IntegralMolecular)上CXCR4的结合。简言之，在4℃将2个单位的空VLP和hCXCR4VLP在maxisorp板上包被过夜。在次日，将游离结合位点用PBS中的4％marvel脱脂牛奶在室温封闭2h。然后，在用PBS清洗平板3x后，将100nM、10nM、1nM和0nM的纯化的多肽加入至包被的孔中并在室温温育1h。在用PBS清洗3x后，结合的多肽用小鼠抗-c-myc(Roche，cat#11667149001)和兔抗-小鼠-HRP(DAKO，cat#P0260)抗体检测，二者都在室温1h。基于O.D.值确定结合并且与以下对照相比：不相关纳米抗体、未包被孔，母体单价构建单元和单克隆抗CXCR4抗体二者都来自R&D(克隆:12G5，cat#MAB170)。图2.1显示结合ELISA的结果。对于CD4#8纳米抗体观察到对于双特异性构建体的取向影响，并且仅在CXCR4纳米抗体置于N-末端位置的情况下，保留CXCR4结合。接头长度的改变不能克服该对CXCR4#2纳米抗体的靶标结合的损失，除了可能对于CD4#8-25GS-CXCR4#2构建体，其与C-末端位置具有CXCR4部分的两个其他双特异性抗体相比，似乎较少被削弱。
在流式细胞术中，对该组CXCR4-CD4双特异性多肽分析对具有两个靶标的不同相对表达水平的细胞系的剂量依赖性的结合。将细胞与Fc-封闭溶液(MiltenyiBioteccat#130-059-901)温育30分钟，之后用单克隆抗-CXCR4抗体12G5(R&D#MAB170)和单克隆抗-CD4抗体BA1(Diaclone#854030000)染色。用小鼠抗-c-myc(AbDSerotec，cat#MCA2200)和山羊抗-小鼠-PE(JacksonImmunoreseach，cat#115-115-171)抗体检测结合的多肽，二者都在4℃震荡30min。基于MCF值确定结合并与对照比较。
Jurkat细胞、THP-1细胞和Molm-13细胞上CD4和CXCR4的表达水平，以及双特异性多肽对Jurkat和Molm-13细胞的结合曲线在图2.3中显示。JurkatE6.1细胞显示不表达或低水平表达CD4的细胞的异源群体。单价纳米抗体CD4#8仅显示非常低的对这些细胞的结合水平，尽管EC50值与在THP-1和MOLM-13细胞上的相似(分别为1.1nM相对1.0nM相对0.7nM)。
在Jurkat细胞上，CXCR4-CD4纳米抗体具有与单价CXCR4#2相似的EC50值，与高CXCR4表达水平一致。纳米抗体比单价CXCR4纳米抗体具有稍高的荧光水平。对于双阳性THP1细胞，与两种单价抗体相比，观察到CXCR4-CD4双特异性纳米抗体的曲线的明显迁移，并且双特异性抗体达到远高于其的平台水平。然而，双特异性和单价抗体之间的EC50值的差异仅是中等的(0.67nM相对于1.0nM)。对于MOLM-13细胞，双特异性抗体的EC50值与CD4#8的相似，并且这里也观察到增加的平台水平。相反取向的、CD4-CXCR4双特异性的结合曲线与单价CD4#8纳米抗体重叠。
流式细胞术中该总荧光的增加可以代表加和结合(单独结合于各个靶标)，以及同时结合细胞表面上的两个靶标，但细胞结合测定不允许在这些结合模式之间进行区分。
实施例2.4：通过CXCR4-CD4双特异性抗体抑制CXCR4-介导的趋化作用
为了验证双特异性CXCR4-IL-3Ra多肽是否对表达两种受体的细胞显示增加的亲和力和效力，进行CXCR4-依赖性的功能性测定。因为MOLM-13细胞与CXCR4和CD123一起表达CD4，所以使用与对于CXCR4-CD123双特异性纳米抗体所述的相同实验设计(参见：实施例1.5.5)。
在Jurkat(CXCR4+/CD4低)、和Molm-13细胞(CXCR4++/CD4++)上确定该组双特异性CD4-CXCR4纳米抗体对CXCL12-诱导的趋化作用的剂量依赖性的抑制。作为参考，抗-CXCR4抗体12G5被包括在各个板上。代表性的实施例的结果显示在图2.4中，并且IC50值在表2.3中提供。与单价CXCR4#2纳米抗体相比，双特异性CXCR4#2-CD4#8构建体对双阳性细胞显示强烈的效力增强(～150-倍)，而CD4纳米抗体本身不具有任何作用。明显地，尽管由于不利位置导致其降低的对CXCR4的亲和力，但是相反取向的双特异性构建体能够阻断CXCR4功能，尽管该阻断是部分的。利用靶向CD4和CXCR4组合的纳米抗体观察到的大得多的效力增加，最可能与Molm-13细胞上CD4相对于CD123的更高相对表达水平相关。
表2.3：双特异性CXCR4-CD4多肽导致阻断SDF-1介导的趋化作用。
实施例2.5：HIV1感染测定中的CXCR4特异性
除了作为稳态趋化因子受体的生理学作用之外，CXCR4还用作T-嗜淋巴细胞的HIV株的共受体。为了进入宿主细胞，病毒gp120蛋白与CD4和共受体(其可以是CCR5或CXCR4之一)相互作用。HIV1株可以依赖于CCR5使用(R5)、CXCR4使用(X4)、或可以是双趋向性的(dual-tropic)，能够使用任一受体用于进入。
CD4或趋化因子共受体之一的调节是临床中测试的积极策略。预期CXCR4拮抗剂(例如AMD3100)通过抑制CXCR4在治疗晚期AIDS中的可能作用，因为在该疾病中X4HIV-1株较晚出现。为了确定CXCR4#2纳米抗体是否也能够阻断使用CXCR4的HIV1株的进入，利用CXCR4和CCR5特异性HIV克隆进行HIV-1感染测定。对使用CXCR4的(X4)HIV-1克隆NL4.3感染的MT-4细胞、或新鲜分离的PBMCs(CD4+/CXCR4+/CCR5+)、和使用CCR5的(R5)HIV-1株BaL感染的新鲜分离的PBMC(CD4+/CXCR4+/CCR5+)测试单价和双特异性CXC4-CD4纳米抗体的抑制效应的特异性。
实施例2.5.1HIV-1感染测定
通过测量不同HIV-1株在MT-4和U87细胞系的致细胞病变效应、或通过定量PBMC的培养上清中病毒p24抗原产生，确定整个组的双特异性CD4-CXCR4多肽和单价CXCR4#2和CD4#8纳米抗体的抗-HIV-1效力。
使用的病毒株是X4HIV-1克隆NL4.3、R5HIV-1株BaL、或R5/X4HIV-1HE株。在MT-4细胞或植物血细胞凝集素-刺激的来自不同健康供体的PBMC中进行感染。使用CXCR4的(X4)HIV-1克隆NL4.3获自国立卫生研究院NIAIDAIDS试剂项目(NationalInstitutesofHealthNIAIDAIDSReagentprogram)(Bethesda，MD)，使用CCR5的(R5)HIV-1株BaL获自医学研究委员会AIDS试剂项目(MedicalResearchCouncilAIDSreagentproject)(Herts，UK)。双趋向性(R5/X4)HIV-1HE株最初从Leuven大学医院的患者分离。MT-4细胞接种在96-孔板中并且U87细胞接种在24-孔板中。将纳米抗体以不同浓度与HIV-1一起加入并且将板维持在37℃，于10％CO2中。病毒导致的致细胞病变效应通过病毒感染的细胞培养物的每日微观评价来监测。在感染后的第4-5天，当在阳性对照(即，未处理的HIV-感染的细胞)中观察到强烈的致细胞病变效应时，经由四唑化合物MTS的原位减少，使用CellTiterAQueous一种溶液细胞增殖测定(Promega，Madison，WI)评价细胞存活力。在490nm用96-孔板读数器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)分光光度测量吸光度并且与四个细胞对照重复(没有病毒和药物的细胞)和四个病毒对照孔(没有药物的病毒感染的细胞)比较。对于来自剂量响应曲线的各个多肽计算IC50，即，以抑制HIV-诱导的细胞死亡达50％的药物浓度。从暴露于药剂的未感染的细胞的生存力的减少，确定各个多肽的CC50或50％细胞毒性浓度，如通过上文描述的MTS方法测量的。
通过密度离心，从健康供体分离外周血单核细胞(PBMCs)(Lymphoprep；NycomedPharma，ASDiagnostics，Oslo，Norway)并用植物血细胞凝集素刺激3天。将活化的细胞用PBS清洗并且如之前描述的进行病毒感染(Schols等人JExpMed1997；186:1383-1388)。在开始感染后8-10天，在培养上清中通过酶联免疫吸附测定检测病毒p24Ag(PerkinElmer，Brussels，Belgium)。
HIV1中和结果在表2.4中以IC50值描述。在NL4.3株感染的MT-4细胞中，CXCR4#2纳米抗体特异抑制经由CXCR4的抗-X4HIV1进入，但不结合CCR5。CD4#8纳米抗体有效阻断X4HIV1感染，具有与CXCR4单价抗体相似的IC50值。在该实施例中，CD4纳米抗体不仅用作锚，而且还促进功能性阻断。双特异性CXCR4#2-CD4#8多肽在抑制HIV-1X4病毒复制方面极为有效，特别是当在PHA-刺激的PBMC中评价时。对于具有最短接头的最佳双特异性CXCR4-CD4构建体的效力增加是单价CXCR4#2纳米抗体的250-320倍。具有减小的对于CXCR4的亲和力的相反取向的双特异性纳米抗体，在此功能性测定中活性较低。因此，双特异性CXCR4-CD4纳米抗体同时结合CXCR4和CD4二者导致对使用CXCR4的HIV1的中和的强烈增强效力。
表2.4：对于CXCR4-趋向性HIV1株NL4.3和CCR5-趋向性BaL的特异性。
实施例2.5.2特异性
CXCR4纳米抗体的效力对于进入取决于使用CXCR4的HIV1株是特异的。阻断仅一个HIV1共受体的一个可能劣势是，其可能引发最初未被靶向的HIV亚型的再次出现。在CCR5-依赖性的HIVBaL病毒的情况下，双特异性构建体中仅CD4纳米抗体促进PBMC中的病毒中和。因为CXCR4表达在PBMC上，所以在这些细胞中，双特异性抗体中的CXCR4纳米抗体可以用作锚以增强CD4纳米抗体的抑制效力。的确，具有最长接头的双特异性CXCR4-CD4对于BaL具有2.5nM的IC50值，相对于单价CD4#8大约200-倍增强，并且是比相反取向的构建体(其中CXCR4结合亲和力被削弱)更有效的感染抑制剂。对于CD4-CXCR4双特异性抗体，较长接头似乎导致更好的抑制，提示这有利于对作为锚的CXCR4的结合。
实施例2.5.3进入抑制剂抗性HIV-1NL4.3
为了证实CXCR4纳米抗体作为锚在双特异性多肽中的贡献，关于HIV感染的阻断，评价一组对CXCR4小分子抑制剂AMD3100有抗性的HIV1突变体、CXCR-4配体、或对照抗体12G2。此外，通过在IC90浓度的多肽的存在下培养NL4.3多次传代，产生病毒逃逸突变体用于阻断每个单价纳米抗体。这样鉴别的抗性病毒克隆用于测试双特异性多肽相对于单价多肽的效力。IC50值在表2.5中提供。
双特异性CXCR4-CD4纳米抗体对AMD3100抗性病毒的IC50值在图2.5中描述。单价CXCR4#2显示100-倍的效力损失，与AMD3100类似，而CD4效力不受影响。对于阻断AMD3100抗性病毒的感染，各个CXCR4-CD4双特异性纳米抗体保持效力低于1nM，是单价CD4构建单元的20倍好。对整组抗性病毒，CXC4#2-CD4#2多肽以0.3-1.1nM的IC50值保持强烈的中和效力。因此，CXCR4-CD4双特异性多肽似乎对不再结合靶标中的一个的突变体相对不敏感。综合这些结果表明，双特异性多肽在不同HIV株中具有宽的覆盖(参见表2.6)并且在阻断病毒感染方面具有一致的高效力，并且对双特异性CXCR4-CD4多肽的仅一个臂的功能已经足以在HIV进入中有效抑制这些化合物。
表2.5：MT-4细胞中纳米抗体针对进入抑制剂抗性HIV-1NL4.3变体的抗-HIV活性属性(profile)。
表2.6：MT-4细胞上纳米抗体针对不同HIV株的抗-HIV活性属性
实施例3：利用CD4-IL12Rβ2和CD4-IL23R双特异性多肽优先靶向T细胞亚类
实施例3.1：用于格式化的单价纳米抗体的特性
为了产生具有优先阻断特异性T细胞亚类的能力的双特异性多肽，将针对不同亚类-特异性白细胞介素受体的纳米抗体与针对CD4糖蛋白的纳米抗体组合。在功能性臂上，IL-12Rβ2用作用于TH1细胞亚类的标志物，并且IL-23R用作用于TH17细胞的标志物。两种受体都属于相同的白细胞介素12受体家族并且使用相同的共受体IL-12Rβ1以形成功能性异二聚体。由于该原因，还产生IL-12Rβ1和CD4的双特异性构建体，因为预期这些靶向两种T细胞亚类并且因此可以用作阳性对照。使用针对CD4糖蛋白的锚定纳米抗体，以提供亲合力并且阻止其他免疫细胞，如CD8+T细胞、B细胞、天然杀伤细胞和某些骨髓细胞上的受体阻断。
对于该实施例，针对CD4糖蛋白的纳米抗体3F11用作共同锚。该纳米抗体对细胞表达的人CD4特异，并且对重组CD4蛋白仅显示低的结合，并且用于产生CXCR4-CD4双特异性抗体(参见实施例2)。之前将对IL-23R、IL-12Rβ1和IL-12Rβ2特异的纳米抗体鉴定为配体竞争纳米抗体。为了鉴别具有用于格式化的足够低的亲和力的配体-竞争纳米抗体，来自具有多个家族成员的家族的单价纳米抗体，就结合动力学、与配体竞争的能力、和与原代细胞上的细胞表达的受体的结合方面进行表征。
实施例3.1.1SPR
使用表面等离子共振分析(BiacoreT100)，对人IL12Rβ1、IL12Rβ2和IL-23R胞外结构域的Fc-融合物(R&DSystems，#839-B1，#1959-B2，#1400-IR)以多循环动力学分析，确定纯化的纳米抗体的精确的结合亲和力。将传感芯片CM5用抗-hIgG抗体(GEHealthcare，BR-1008-39)固定，其后将受体以5μg/ml蛋白和120秒的接触时间捕获。使用的运行缓冲液是25℃的HBS-EP+(GEHealthcare，BR-1006-69)，流速是5ml/min。为了通过胺偶联固定，EDC/NHS用于活化并且乙醇胺HCl用于钝化(Biacore，胺偶联试剂盒)。以1.37nM至3μM的浓度范围评价纳米抗体。让纳米抗体结合2min并以45ml/min的流速解离15min。在注射之间，利用3min的3MMgCl2脉冲和2min稳定时期将表面再生。结合/解离数据的评价通过匹配1:1相互作用模型(Langmuir结合模型)通过BiacoreT100软件v2.0.3进行。解离速率和亲和力常数在表3.1中显示。
实施例3.1.2ELISA中对IL-12和IL-23结合的竞争
在竞争ELISA中在384-孔SpectraPlateHB微量滴定板(PerkinElmer)中包被的人IL-12(10nM，Peprotech#200-12B)上评价单价纳米抗体竞争IL12受体-Fc蛋白与IL-12的结合的能力。将游离结合位点用PBS中的1％酪蛋白阻断。将纳米抗体的系列稀释物与固定浓度的2nMIL12Rβ1-Fc或3nMIL12Rβ2-Fc之一温育1hr。竞争剂的浓度是基于剂量滴定实验，并且使用的终浓度<EC50值。使用HRP-缀合的山羊抗-hIgG抗体(1/3000，JacksonImmunoResearch，Cat#109-035-088)和随后在底物TMB(SDT试剂)的存在下的酶反应，检测IL12Rβ1-Fc或IL12Rβ2-Fc的残余结合。
类似的测定设计用于测量IL-23R和IL12Rβ1纳米抗体对IL-23的结合的竞争。20nM的人IL-23(eBioscience34-8239-82)的包被层用于与5nMIL-23R-Fc竞争，3nM的包被层用于2nMIL12Rβ1-Fc的竞争。IC50值显示在表3.1中。家族成员对各个IL12受体亚单位之间的配体竞争能力的差异与测量的KD值的差异良好地相关。
实施例3.1.3流式细胞术
在异二聚复合体的情况下，单价纳米抗体对它们的细胞表达的受体的剂量依赖性的结合，通过流式细胞术在来自不同健康供体的激活的人T细胞上确定。
使用人T细胞富集混合物(RosetteSep#15061)分离人T细胞并且用人T-活化剂CD3/CD28(Gibco-LifeTechnologies#11131D)预活化四天，并且用重组人IL-2(LifeTechnologies-Gibco#PHC0027)预活化一天以诱导TH1分化。常规地，T细胞标志物表面表达和活化状态通过FACS使用抗-CD3PE(eBioscience#12-0037-73)、抗-CD8-PE(BDBioscience#555367)、抗-CD45RO-PE(BDBioscience#555493)、抗-CD45RA-APC(BDBioscience#550855)抗-CD25-PE(BDBioscience#557138)和抗-CD69-PE(BDBioscience#557050)核实。IL12R表面表达通过FACS，使用IL12Rβ1抗体(R&DMAB839)，接着山羊抗-小鼠PE(JacksonImmunoResearch115-115-164)确认。IL23R的表达通过多克隆山羊抗-IL-23R(R&DAF1400)核实。CD4表面表达通过FACS使用APC-标记的抗-CD4(BDBioscience#345771)确认。在图3.1中显示以该方案用对照抗体激活的一个供体的T细胞上IL12Rβ1、IL23R和CD4的表达水平。对于IL12Rβ2，没有可市购的工具显示实质性结合。
因为IL23R的表达在T细胞池(pool)中非常低，因此在向Th17表型分化的细胞上，通过在细胞因子混合物和IL-23、重组IL-6(eBioscience#34-8069-82)、重组TGF-b1(R&D#240-B)、抗-人IL-4抗体(BD#554481)、重组IL-1b(BD#554602))和重组人IL-23(R&DSystems#219-IL-005)的存在下与PBMC孵育，并与板包被的OKT-3(eBioscience#16-0037-85)、PeliClusterCD28(Sanquin#M1650)共刺激，评价单价IL23R纳米抗体的结合。该步骤之后，获得低但可检测的IL23R表达水平。Th17分化方案的优化可以进一步增加这些表达水平。
单价纳米抗体的剂量依赖性的结合通过流式细胞术在各个Th1或Th17富集的T细胞群上评价。在4℃让抗体或纳米抗体的系列稀释物在FACS缓冲液(PBS，补充以10％FBS和0.05％叠氮化物)中结合30分钟。通过离心清洗细胞并在4℃用抗-FLAG抗体(SigmaF1804)探测30分钟，以检测结合的纳米抗体。在4℃利用山羊抗-小鼠IgG-PE(JacksonImmunoResearch#115-116-071)进行检测达30分钟。清洗细胞并与TOPRO3温育从而将死细胞染色，然后在门控步骤中将其移除。然后经由BDFACSArray分析细胞。
特异性纳米抗体结合曲线显示在图3.2和3.3中。在异二聚受体复合体的存在下，单价纳米抗体能够分别特异结合细胞表达的IL12Rβ1，IL12Rβ2(图3.2)。IL12Rβ1家族成员的结合亲和力的差异明确转化为不同的细胞结合表观亲和力，而两个IL12Rβ2家族成员对这些细胞的EC50值非常类似。在各个情况下，具有较快解离速率的纳米抗体通常达到较低的平台水平。由于其快解离速率，对于IL12Rβ1#31，就结合的饱和而言，结合曲线不完全。
在TH17-富集的群体中观察到具有最高亲和力的IL-23R和IL12Rβ1纳米抗体的特异结合，尽管荧光信号非常低(图3.3)。这可表明，表达IL23R的TH17细胞在T细胞池中的％对于获得低亲和力单价纳米抗体的剂量响应曲线仍然较低。
选择用于格式化为双特异性纳米抗体的IL-23R、IL-12Rβ1和IL-12Rβ2纳米抗体的特性提供于表3.1中。我们旨在选择具有不同解离速率的，属于相同家族，即在其CDR3区具有序列保守性的纳米抗体，从而靶标上的表位保守并且可以解决亲和力效应。理想地，选择具有解离速率>10-4s-1的纳米抗体，从而最大化由锚定纳米抗体提供的亲合力效应。两种选择的IL12Rβ2纳米抗体的序列在CDR1和CDR2区中有三个氨基酸的差异，并且显示由于解离速率的差异造成的KD和配体竞争能力的3.5倍的差异。两种选择的IL12Rβ1纳米抗体在CDR1和CDR3区具有六个氨基酸的差异，KD和配体竞争有6-7倍的差异。对于IL23R纳米抗体，证明鉴别解离速率具有本质差异的两种家族成员是不可行的。因此，对于该受体，选择来自不同家族的具有不同快速解离速率的两种配体竞争纳米抗体，因此其具有潜在的不同表位。尽管对于具有快解离速率(>1.E-02)的纳米抗体，细胞结合不能总是被精确测量，但是配体竞争测定表明，对于所有选择的单价纳米抗体，功能性阻断的IC50范围在10-16nM之间。
实施例3.2：双特异性纳米抗体的产生
双特异性CD4-IL-12Rβ2、CD4-IL-12Rβ1和CD-IL-23R多肽的格式化通过将用长的柔性(GGGGS)7接头连接的纳米抗体与构建单元在两种取向上基因融合进行。对于各个组合，将两种功能性阻断受体-特异的纳米抗体与一种抗-CD4纳米抗体，CD4#83F11组合(图3.4)。所有构建体的正确的核苷酸序列通过序列分析确认(对于所有序列的概览参见表12)。纳米抗体产生为flag3-His6-标记的蛋白，在毕赤酵母X-33中表达，并且使用标准亲和层析，接着尺寸排阻层析，从培养基纯化。确认所有蛋白无内毒素，用于在原代细胞上测定。
实施例3.3：双特异性纳米抗体的结合分析
实施例3.3.1格式化的影响
为了评价在格式化后，纳米抗体的取向是否影响对各个白细胞介素受体的结合和功能性，分析纯化的单价和双特异性纳米抗体用于与hIL-12Rβ1-Fc、hIL-12Rβ2-Fc或IL-23R-Fc融合体竞争配体结合(见上)。进行单价纳米抗体和双特异性抗体二者的剂量依赖性的抑制，以在用人IL-12包被的板上确定竞争的IC50值。类似地，进行用人IL-23包被的板上的竞争ELISA以评价IL-23R和IL-12Rβ1纳米抗体的双特异性抗体的功能性。IC50值显示在表3.2和3.3中。
在CD4的情况下，通过流式细胞术，比较单价纳米抗体和双特异性多肽对表达CD4但缺少IL12R和IL23R的MOLM-13细胞的结合，评价取向效应。通过FACS，使用抗-人CD4APC(BDBioscience，#53384)确认CD4表达。图3.5显示，格式化为双特异性多肽基本上不影响CD4构建单元对细胞表达的CD4的结合。双特异性多肽显示与单价CD4#8纳米抗体相当的结合，除了IL23R#19-CD4#8(BI#42)以外，其显示结合亲和力的小的降低。单价IL12Rβ2、IL12Rβ1和IL23R纳米抗体中没有一个结合MOLM-13细胞，确认不存在IL12和IL23受体表达。
实施例3.3.2特异性
在激活以增加IL12R的表达水平的人T细胞上评价双特异性多肽的剂量依赖性的结合。激活的T细胞显示IL12R抗原相对中等的表达水平，但非常高的CD4表达，反映在抗-CD4纳米抗体的高表观亲和力和高荧光信号中。对两个靶标受体的同时结合不是明显的，因为所有双特异性纳米抗体的结合曲线与单价CD4纳米抗体的那些重叠，得到类似的EC50值(图3.6)。
激活的T细胞的池包含CD4+T细胞和CD8+T细胞二者。为了确认抗-CD4纳米抗体的特异性和排除对CD4-阴性细胞的结合，评价对使用CD8+T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotech，130-096-495)从人PBMC中分离的细胞毒性CD8+T细胞(得到94％纯度的CD8+细胞)的结合。使用纳米抗体以250nM进行结合特异性实验。利用抗-CD4纳米抗体未观察到结合，而单价IL12Rb1#30不结合分离的CD8+T细胞(图3.7)。此外，双特异性多肽IL12Rβ1#30-CD4#8以与单价纳米抗体IL12Rβ1#30类似的水平结合这些细胞，而没有CD4锚的另外的作用。对于IL12Rβ2和IL23R纳米抗体获得类似的数据。这些结果表明，具有亚类-特异性受体的CD4的双特异性抗体不结合细胞毒性CD8+T细胞，但与CD4+T细胞特异相互作用。
为了阐明CD4-IL12R双特异性多肽是否优先结合T细胞池中的CD4+/IL12R+TH1细胞亚类，对于在多色FACS实验中对CD8(通过抗-huCD8PE-Cy7缀合的单克隆抗体(BD557746)检测或CD4(通过抗-huCD4alexaFluor488-缀合的多克隆抗体(R&DFAB8165G)检测)之一门控的激活的T细胞的池，分析纳米抗体结合。对于CD8+/CD4-门控的细胞的和对于CD4+门控的细胞的纳米抗体结合，使用抗-flag-APC(ProzymePJ255)检测来确定。在该实验中，使用如图3.6中显示的来自相同供体(D838)的TH1激活的T细胞。CD4#8纳米抗体显示对CD4+门控的群体的强烈结合，如通过高荧光水平(图3.8图片E，浅灰色峰)所示的，而对于CD8+群体(深灰色峰)仅观察到低的信号。注意到，CD4纳米抗体以小的程度与用于门控的抗-CD4多克隆Abs竞争，这可以导致CD4+和CD4-细胞的不完全分离。对于单价IL12Rβ1#30和IL12Rβ2#1纳米抗体，观察到对于CD4+和CD8+细胞两者的低荧光信号，表明纳米抗体微弱结合两种T细胞亚类。双特异性多肽IL12Rβ1#30-CD4#8和IL12Rβ2#1-CD4#8显示相对于CD8+亚类的对CD4+群体的优先结合，表明这些纳米抗体赋予CD4纳米抗体的特异性。
实施例3.4：双特异性多肽的功能性表征
实施例3.4.1：人T细胞中IL-12功能的细胞特异性阻断
以IL-12依赖性的功能性测定(抑制激活的人T细胞中IL-12介导的IFN-γ释放)，分析双特异性多肽同时衔接同一细胞上两个靶标的能力。因为该功能性阻断仅由IL12R介导，所以预期同时结合CD4纳米抗体导致的亲合力转化为双特异性抗体在抑制细胞因子释放方面的增加的效力。
将来自棕黄层的分离的人T细胞用人T-激活剂CD3/CD28(Gibco-LifeTechnologies#11131D)激活四天并用IL-2激活一天。为了分化为Th1亚型，在IL-12的存在下，在板包被的0.5μg/ml的CD3(eBioscience#16-0037-85)和溶液中的抗-CD28(1μg/mlPeliCluster，Sanquin#M1650)提供的共刺激的情况下培养T细胞。使用的配体浓度，0.2pM是基于使用浓度<EC50的剂量滴定实验。作为对于IL-12依赖性的信号传导的测量结果，72h后，在存在或不存在各个纳米抗体的情况下通过ELISA测量典型的Th1细胞因子IFN-γ的释放。
对两种取向的双特异性IL-12Rβ2-CD4和IL-12Rβ1-CD4多肽，以及相应单价纳米抗体，评价IL-12介导的IFNγ释放的剂量依赖性的阻断。IL-23R-CD4双特异性多肽用作阴性对照。双特异性IL12Rβ1-CD4、IL12Rβ2-CD4和IL23R-CD4多肽的代表性的图表显示在图3.9中，并且IC50值在表3.2中。与它们各自的单价IL12Rβ2纳米抗体相比，所有四种IL12Rβ2-CD4双特异性多肽显示在74-1100之间的IC50值的迁移(表3.3)，而双特异性CD4-IL23R多肽不阻断。此外对于IL12Rβ1-CD4双特异性抗体观察到～500-倍效力差异。尽管两种取向的双特异性构建体显示效力增强，但是CD4的N-末端位置的IL12Rβ2纳米抗体给出更强的增强。综合这些数据显示，IL12Rβ1-CD4和IL12Rβ2-CD4双特异性抗体二者显示在表达两种抗原的TH1细胞上效力的400-1000增加，以及CD4结合本身不妨碍。
为了验证双特异性多肽对TH1细胞的该选择性功能性是否在PBMC(其中也存在其他免疫细胞)中保持，使用激活的健康人PBMC进行相同测定。使用0.1pMIL-12将PBMC池内的T细胞向TH1亚型分化。在6天的温育期后，通过ELISA确定在存在或不存在各个纳米抗体的情况下的IFN-γ释放。双特异性多肽在PBMC中的IL12阻断的代表性的实例显示在图3.10中。此外，在基于PBMC的测定中，对于IL12Rb1-CD4和IL12Rb2-CD4双特异性抗体中的每一个观察到效力的明确增加，相对于各个单价纳米抗体，IC50值在10-50倍之间的迁移。测试来自两个不同供体的PBMC，具有类似的结果。单价CD4纳米抗体和CD4-IL23R双特异性多肽不具有作用，表明在PBMC的情况下，选择性功能性阻断也通过双特异性多肽以T细胞亚类-特异的方式获得。
实施例3.4.2：IL-23功能的细胞特异性阻断
为了验证靶向功能性IL23受体的双特异性多肽是否对共表达CD4和IL23R的细胞显示增加的亲和力和效力，测量纳米抗体抑制Th17型细胞因子IL17的IL23-依赖性的释放的能力。在该测定安排中，在可溶IL23的存在下培养人PBMC，以将T细胞分化为Th17表型。在溶液中存在重组人IL-23(eBioscience#14-8239)和PeliClusterCD28(Sanquin#M1650)的情况下，将细胞接种在OKT-3(eBioscience#16-0037-85)包被的平板上。在9天的温育期后，通过ELISA确定在存在或不存在各个纳米抗体的情况下的细胞因子(IL17)释放。
评价与各个单价纳米抗体相比，该组双特异性IL23R-CD4和IL12Rβ1-CD4多肽的剂量依赖性的抑制，在该情况下，IL12Rβ1-CD4特异性多肽用作阴性对照。图3.11显示，双特异性IL12Rβ1-CD4多肽以剂量依赖性的方式强烈抑制IL23介导的IL17释放，具有相对于单价IL12Rβ1纳米抗体500-1700-倍增强的效力(表3.3)。在该测定中对于CD4的C-末端位置中的IL12Rβ1构建单元具有优先。两种IL12Rβ1家族成员之间存在明显的效力差异，对应于不同结合动力学和亲和力，并且该差异在双特异性构建体的效力方面是保持的。对于IL12Rβ2-CD4双特异性多肽未观察到抑制，对于抗-CD4纳米抗体也未观察到，表明阻断是亚类特异的。
尽管不能对于所有纳米抗体都确定IC50值，但是对于IL23R和CD4的双特异性构建体，在单价纳米抗体和双特异性多肽之间也观察到效力的差异(图3.11，图片C)。单价纳米抗体的亲和力的差异反映在IL23功能性测定中单价纳米抗体的效力中，但该差异不像对于双特异性构建体的那样明显。IL23R纳米抗体不是家族成员，并且对于同时结合细胞膜上的CD4，纳米抗体IL23R#19的表位可能是比IL23R#20次优的。因为PBMC池中获得的Th17T细胞的％相当低，所以Th17分化方案的进一步优化可以进一步确证观察到的差异。此外，源自患有典型TH17炎性疾病如银屑病的患者的PBMC，可以提供更好的IL23响应。这些PBMC代表T细胞亚类的生理学混合物，IL23R和IL12R的表达水平在相关Th17疾病环境中可预期。
综上，这些结果表明，在利用异源T细胞以及PBMC的测定中，TH1-亚类特异性CD4-IL12Rβ2和TH17-亚类特异性CD4-IL23R多肽以T细胞亚类-特异的方式显示选择性功能性阻断。此外，显示双特异性多肽对CD4+T细胞亚类的选择性结合，而单价IL12Rβ2纳米抗体对CD4和CD8T细胞仅显示差的结合。
就亲和力而言，在与高亲和力锚定的CD4纳米抗体格式化时，甚至功能臂上的低亲和力纳米抗体产生2-3个对数(log)的效力增强。
表3.1：单价IL-12Rb2、IL-12Rb2和IL-23R-特异性纳米抗体的特性
表3.2：由一组单价和双特异性IL12Rb1-CD4、IL12Rb2-CD4和IL23R-CD4纳米抗体抑制IL-12功能。
表3.3：由一组单价和双特异性IL23R-CD4、IL12Rb1-CD4和IL12Rb2-CD4纳米抗体抑制IL-23功能。
实施例4：EGFR-CEA双特异性多肽
实施例4.1：用于格式化的单价纳米抗体的特性
之前的实施例表明，双特异性多肽的细胞特异的亲合力可以通过功能性测定的效力增加测量，其中当它们能够同时顺式衔接两个靶标时，双特异性多肽将特异阻断细胞上的受体功能。为了表明治疗窗口，对共表达两个靶标(“双阳性细胞”)的细胞，和代表正常细胞的仅表达功能性靶标(“单个-阳性细胞”)的细胞进行功能性细胞测定。
我们之前的实施例还表明，对于细胞特异的阻断，需要具有低亲和力和效力的单价功能性纳米抗体，以保证单特异性纳米抗体不足以对正常细胞有效。为了获得选择性，需要非常低的亲和力(其中双特异性抗体仅类似于锚)，表明在选择性和足够的功能性效力之间存在微妙的权衡。在本实施例中，我们还专注于功能性臂上的纳米抗体的亲和力效应，以确定是否存在对选择性阻断的阈亲和力。酪氨酸激酶受体EGFR用作功能性臂上的模型抗原，对其可获得重组蛋白以允许通过SPR精确确定亲和力和动力学参数。
第二靶标，癌胚抗原(CEA，也称为CEACAM5)，是在很多肿瘤类型上表达的公知的肿瘤特异的抗原。CEA是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的细胞表面糖蛋白，其在细胞粘附中发挥作用。其是胃肠道癌症的已确定的肿瘤-相关标志物并且也在乳腺癌和肺癌中发现。对于胃癌和结直肠癌，已经在原发肿瘤和腹膜转移中报道EGFR和CEA的共表达，在多数情况中CEA的膜表达比EGFR高(Ito等人2013，Tiernan等人2013)。这使得CEA成为可用的靶标以用作用于与EGFR组合的锚，用于以肿瘤-选择性方式功能性阻断。
针对EGFR的配体-阻断纳米抗体之前在内部产生并且由Roovers等人(2011)充分描述。纳米抗体7D12结合EGFR的细胞外结构域的结构域III上的配体结合位点，其与西妥昔单抗的表位重叠。对于HER14和A431细胞，报道的[125I]放射标记的7D12的亲和力分别是10.4和25.7nM。其家族成员7C12有5个氨基酸残基的差异。
为了评价亲和力效应，同时保证EGFR上的表位保持，产生一组具有减小的亲和力的EGFR7D12和7C12变体用于格式化。基于纳米抗体7D12与EGFR胞外域的共结晶结构(Schmitz等人，2013)，将7D12受体界面中的氨基酸用预期减小解离速率的残基以分步的方式置换(表4.1)。
在一个锚定臂上，使用名为NbCEA5的CEACAM5-特异性纳米抗体，其具有KD为0.3nM的高亲和力，由Cortez-Ramiras等人(2004)报道。已经描述由于将CDR区引入人支架，该纳米抗体的变体具有其亲和力的30-倍的减小(Vaneycken等人，2011)。产生具有很多氨基酸置换的两种纳米抗体以及另外的CEA变体，从而减少亲和力但维护足够高的纳米抗体表达(表4.2)。
就结合动力学、和对细胞表达的受体的结合而言，表征该组具有减小的亲和力的单价EGFR7D12变体和NbCEA5变体。
实施例4.1.1SPR
为了确定纯化的EGFR变体的准确结合亲和力，使用表面等离子共振分析(BiacoreT100)在直接固定的hEGFR细胞外结构域(SinoBiological，#10001-H08H)上进行多循环动力学分析。约1000RU的hEGFR固定在CM5传感芯片上。使用的运行缓冲液是25℃的HBS-EP+(GEHealthcare，BR-1006-69)，流速是5μl/min。对于通过胺偶联固定，使用EDC/NHS用于活化并且使用乙醇胺HCl用于失活(Biacore，胺偶联试剂盒)。在范围从1.37nM至3μM的浓度评价纳米抗体。让纳米抗体以45μl/min的流速结合2min并且解离15min。在注射之间，将表面用5sec脉冲的50mMNaOH和1min稳定期再生。通过匹配1:1相互作用模型(Langmuir结合模型)，由BiacoreT100软件v2.0.3进行结合/解离数据的评价。不满足对于1:1相互作用模型的验收准则的相互作用，使用异源配体匹配模型匹配。从得到的结合和解离速率常数ka和kd计算亲和力常数KD并且显示在表4.1中。引入限定的氨基酸置换明显降低EGFR纳米抗体的解离速率，同时结合速率类似。
使用类似的实验条件，在CM5传感芯片上的多至1000RU的直接固定的hCEACAM-5(R&DSystems，#4128-CM)获得纯化的CEA纳米抗体的结合亲和力。在注射之间，将表面用5sec脉冲的10mM甘氨酸-HClpH1.5和1min稳定期再生。结合/解离数据的评价通过匹配1:1相互作用模型(Langmuir结合模型)，由BiacoreT100软件v2.0.3进行。从得到的结合和解离速率常数ka和kd计算亲和力常数KD并且显示在表4.2中。观察到的NbCEA5纳米抗体(称为CEA#1)和人源化的变体(CEA#2)的亲和力与报道的值一致。
实施例4.1.2ELISA中对重组EGFR和CEACAM5蛋白的结合
显示在结合ELISA中，所有纯化的纳米抗体以剂量依赖的方式结合重组EGFR胞外域并且结合重组CEACAM5蛋白。简言之，0.25μg/ml的人EGFRECD(SinoBiological，Cat#10001-H08H)或0.125μg/ml重组人CEACAM5(R&DSystems，Cat#4128-CM)直接包被在384-孔SpectraPlate-HB微量滴定板(PerkinElmer)上。游离结合位点用PBS中的1％酪蛋白封闭。让纯化的纳米抗体的系列稀释物结合抗原1小时。使用HRP缀合的小鼠-抗-FLAGM2抗体(Sigma，Cat#A8592)和之后的在底物esTMB(SDT试剂，Cat#esTMB)的存在下的酶反应，检测纳米抗体结合。基于与不相关纳米抗体对照相比的OD值确定结合特异性。EC50值显示在表4.1和4.2中。
实施例4.1.3FACS结合
结肠癌细胞系LoVo和HT-29以不同相对表达水平共表达EGFR和CEA(图4.1)。因为与HT-29相比，LoVo细胞具有较高CEA水平，因此将LoVo细胞用于该组单价EGFR和CEA变体对细胞表达的受体的结合分析。通过流式细胞术对EGFR+/CEA+LoVo细胞，和对于HER14细胞，稳定表达人EGFR的小鼠NIH-3T3细胞，确认对细胞表达的EGFR和CEA的结合。如所述的，经由flag-标签特异的抗体检测结合的纳米抗体。结果显示在图4.1中。对于EGFR变体，未达到饱和，因此不能确定精确的EC50，但在迁移的曲线中可见解离速率的差异。通过缺少对HER14细胞的结合确认CEA纳米抗体的特异性(数据未显示)。
单价EGFR7D12变体和CEA变体的结合特性分别在表4.1和4.2中提供。对于EGFR-CEA双特异性纳米抗体的产生，选择解离速率具有差异，导致逐渐减小的KD值(范围在120-860nM之间)的四种EGFR变体。最高和最低亲和力EGFR变体之间解离速率的差距为8-倍。当在ELISA中测量时，由于具有快解离速率的纳米抗体在清洗期间解离，差异放大到～80-倍。与最高亲和力变体EGFR#1相比，变体EGFR#11具有两个氨基酸置换，而EGFR#33和EGFR#32具有三个氨基酸差异。对于锚定臂，除了原CEA纳米抗体(CEA#1)以外，也选择CEA变体#5用于格式化(具有四个氨基酸置换)，因为与原纳米抗体相比，该纳米抗体具有最大的解离速率差异。
表4.1：用于格式化的单价EGFR纳米抗体的结合特性
*指示值
表4.2：用于格式化的单价CEACAM5纳米抗体的特性
实施例4.2：双特异性多肽的产生
双特异性EGFR-CEA多肽的格式化是通过将用柔性35GS接头连接的纳米抗体，与以两种取向的两种构建单元基因融合来完成。将具有不同解离速率的四种不同的EGFR变体与分别具有0.5和3nM的KD值的两种不同CEA纳米抗体组合(图4.2)。此外，将每种纳米抗体与不相关对照纳米抗体(cAblys3，针对溶菌酶)一起构建，以保持单特异性参考分子中的化合价。所有构建体的正确的核苷酸序列通过序列分析确认(对于全部序列的概览参见表11)。在毕赤酵母中产生所有多肽为flag3-His6-标记的蛋白。使用标准亲和层析进行纯化。
实施例4.3：双特异性EGFR-CEA纳米抗体的结合分析
实施例4.3.1格式化的效应
为了验证格式化是否影响各个构建单元结合其各自靶标的能力，如上文所述的，通过结合ELISA的方式在重组EGFR胞外域或CEACAM5上评价纯化的双特异性纳米抗体的结合。包含EGFR-CEA的所有单特异性纳米抗体和双特异性多肽的EC50值显示在表4.3中。
对于所有EGFR-CEA双特异性抗体，CEA纳米抗体保持与各自的单价纳米抗体类似的结合。相反，EGFR纳米抗体对双特异性构建体中的位置敏感，并且仅在N-末端位置，与EGFR的相互作用被保留(图4.3)。对于这些构建体，测量的表观亲和力跟随对于单价纳米抗体观察到的亲和力的差异。当EGFR位于CEA纳米抗体的C-末端时，测量到～30倍低的结合亲和力。之前对于与针对不同表位的不同EGFR纳米抗体格式化的野生型7D12报道了对取向的类似的灵敏度(Roovers等人2011)。
实施例4.3.2结合特异性
通过流式细胞术在EGFR+/CEA-HER14和HeLa细胞，以及双阳性LoVo和HT-29细胞上，分别分析单特异性和双特异性EGFR-CEA纳米抗体构建体的结合特异性。EC50值在表4.3中提供。对于LoVo细胞的结果显示在图4.4中。
双特异性多肽以剂量依赖的方式有效结合细胞。与ELISA数据一致，在C-末端位置具有EGFR#1纳米抗体的双特异性多肽丢失了对HER14和LoVo细胞的基本结合亲和力。当比较单特异性EGFR纳米抗体时，不同EGFR变体之间解离速率的差异在细胞表达的EGFR上较不显著，尤其是当EGFR表达水平(如在LoVo和HeLa细胞上)不那么高时(图4.5)。在这些细胞上，具有最高亲和力的3个EGFR变体的构建体在2.5-5.5nM之间都具有非常类似的EC50值(表4.3)。
与各自的EGFR对照纳米抗体相比，在LoVo细胞上，EGFR-CEA取向的双特异性多肽显示增加的荧光水平和EC50值的微小迁移(图4.4图片A、B、C)，除了对EGFR具有最低亲和力的EGFR#32的双特异性抗体外。这里，双特异性构建体显示与各自的锚CEA#1或CEA#5对照纳米抗体实际上相同的结合，表明对EGFR臂没有促进作用(图4.4图片D)。这确认了用CXCR4-CD4和CXCR4-IL3Ra双特异性多肽获得的早期结果，其中仅当对各个靶标存在足够的结合时观察到荧光信号的增加。
表4.3：单特异性和双特异性EGFR-CEA双特异性纳米抗体的结合分析
实施例4.4:由双特异性EGFR-CEA多肽抑制EGFR功能
为了验证双特异性多肽是否能够通过同时衔接细胞表面的EGFR和CEA来增强EGFR纳米抗体的效力，在功能性EGFR测定中分析该组双特异性EGFR-CEA多肽和相应的单特异性纳米抗体。
在仅表达EGFR的HER14细胞，和EGFR+/CEA+LoVo细胞上评价EGFR磷酸化的剂量依赖性的抑制。因为功能性磷酸化仅经由EGFR介导，所以同时结合CEA纳米抗体造成的亲合力被预期转化为增加的以细胞特异的方式的对EGFR磷酸化的抑制。
简言之，将LoVo细胞一式两份以2×104细胞/孔，在补充以10％FCS的F12-K培养基中接种在96-孔培养板中。将HER14细胞一式两份接种在0.1％明胶包被的96-孔培养板中并在含有10％FBS/BS的DMEM培养基中生长24h。次日，将细胞在补充以0.1％FCS的培养基中血清饥饿24hrs并随后与纳米抗体温育，接着对于HER14用0.5nM并且对于LoVo细胞用1nM的重组人EGF(R&DSystems，cat#236-EG)刺激10分钟。EGF浓度基于在LoVo(EC50＝5.9ng/ml)和HER14细胞(EC50＝3.5ng/ml)中获得的EC50。在各个板中，包括抗-EGFRmAb西妥昔单抗(ErbituxMerck-Serono)和不相关对照纳米抗体作为参考。将单层用冰冷的dPBS淋洗两次，并随后在用1mMPMSF替代的冰冷RIPA缓冲液中裂解。使用Phospho(Tyr1173)/总EGFR全细胞裂解物试剂盒(MesoScaleDiscovery-K15104D)测量细胞裂解液中的EGF-依赖性的受体激活。将平板装载30μl的裂解物，在室温震荡温育1h并且根据制造商的方案处理。将板在SectorImager2400(MesoScaleDiscovery)上读数。使用式(2×p-蛋白)/(p-蛋白+总蛋白)×100计算磷-蛋白相对总蛋白的百分数。
代表性的图表显示在图4.6中，并且两次和三次的独立测定的平均IC50值列在表4.4中。纳米抗体显示EGFR磷酸化对两种细胞的剂量依赖性的抑制。对HER14细胞，所有EGFR-CEA双特异性多肽显示与相应单特异性对照相等的对EGFR磷酸化的抑制。单特异性EGFR对照之间的测量的效力差异符合单价EGFR构建单元的解离速率，IC50值分别为65-52-150-690nM(HER14)，和75-150-467-2333nM(LoVo)。
在EGFR+/CEA+LoVo细胞上，对于EGFR#1和EGFR#33与作为锚的CEA#1纳米抗体组合的构建体，观察到单特异性和双特异性EGFR-CEA多肽之间约5倍的效力差异。具有最低亲和力EGFR#32变体的构建体不能阻断EGFR功能，并且另外存在CEA纳米抗体不能增强其效力。
综合起来，这些结果表明，利用对于EGFR和CEACAM5靶标组合的双特异性多肽获得的效力增强仅仅是在共表达两种受体的细胞上。在磷酸化测定中，在LoVo细胞上观察到的EGFR-CEA双特异性多肽的相对小的效力增加可以与该细胞上CEA和EGFR表达的次优比率相关，但其还可能是，效力效应将在测量EGF的功能性响应，如增殖和存活的测定中更大。除了在一个时间点对受体磷酸化的效应(如在本测定中评价的)以外，纳米抗体可能对受体失活和降解动力学具有区分效应，这不在信号传导测定中评价。还可能的是，对于该实施例选择的纳米抗体就靶标上的表位而言具有空间限制，其可以限制对细胞表面上的两个靶标的同时衔接。
对于测试的当前组合观察到效力的增加，但针对其他表位的双特异性EGFR-CEA多肽可能在细胞特异的效力增强方面显示为更大。
表4.4：与单特异性对照纳米抗体相比，通过EGFR-CEA双特异性纳米抗体对EGF-介导的EGFR磷酸化的抑制。
*对于同一细胞系相对于各自的单特异性EGFR纳米抗体的IC50比率
表1：CXCR4构建单元
表2：CD123构建单元
表5：选择的纳米抗体的概述
表6：双特异性构建体的概述
57A07-14D09 55A01-14D09
57A07-281F12 55A01-281F12
14D09-57A07 14D09-55A01
281F12-57A07 281F12-55A01
表7：双特异性构建体(全部具有c-mycHIS6标签)
表10CXCR4-CD4序列
表11EGFR-CEA序列
表12CD4-IL12RCD4-IL23R序列
表13CXCR4-CD123
表B-4：本发明的白蛋白结合物序列
表B-5：本发明的接头序列
接头名称 SEQ ID NO： 氨基酸序列
5GS 117 GGGGS
6GS 118 SGGSGGS
9GS 119 GGGGSGGGS
10GS 120 GGGGSGGGGS
15GS 121 GGGGSGGGGSGGGGS
18GS 122 GGGGSGGGGSGGGGGGGS
20GS 123 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
25GS 124 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
30GS 125 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
35GS 126 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

Claims (23)

1.包含第一和第二免疫球蛋白单可变结构域(ISV)的多肽，其中
-所述第一ISV以10nM至200nM之间的平均KD值结合第一靶标；
-所述第二ISV以10nM至0.1pM之间的平均KD值结合第二靶标；并且
其中所述第一靶标和所述第二靶标存在于细胞表面上，并且其中所述第一靶标不同于所述第二靶标。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述细胞是有病细胞，优选为癌细胞。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽对所述第一靶标具有选自由以下组成的组的结合速率常数(Kon)：至少约102M-1s-1，至少约103M-1s-1，至少约104M-1s-1，至少约105M-1s-1，和至少约106M-1s-1，其优选通过表面等离子共振测量。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽对所述第一靶标具有选自由以下组成的组的解离速率常数(Koff)：至多约10-3s-1，至多约10-4s-1，至多约10-5s-1，和至多约10-6s-1，其优选通过表面等离子共振测量。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述多肽对所述第一靶标具有选自由以下组成的组的解离常数(KD)：至多约10-7M，至多约10-8M，至多约10-9M，至多约10-10M，至多约10-11M，和至多约10-12M，其优选通过表面等离子共振测量。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述第一ISV以10nM至200nM之间的平均KD值，如10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、或190nM的平均KD值结合第一靶标，其优选通过SPR测量。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述第一ISV抑制所述第一靶标的功能。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中所述第一ISV在趋化测定中抑制趋化作用达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％和优选为95％以上。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中所述第一ISV抑制所述细胞的退行性变化、侵入、转移、增殖、分化、迁移和/或存活。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中所述第一ISV增加所述细胞的凋亡、细胞杀伤和/或生长停滞。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，其中所述第二ISV以10nM至0.1pM之间的平均KD值，如以10nM以下的平均KD值，甚至更优选以9nM以下，如小于8、7、6、5、4、3、2、1、0.5nM或甚至更小，如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM、或甚至更小如小于0.4pM的平均KD值结合第二靶标，其优选通过SPR测量。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中所述第二ISV抑制天然配体对所述第二靶标的结合达小于约50％，如40％、30％、或20％或甚至小于10％，如小于5％。
13.包含第一和第二免疫球蛋白单可变结构域(ISV)的多肽，其中
-所述第一ISV以10nM至200nM之间的平均EC50值结合细胞表面上的第一靶标；
-所述第二ISV以10nM至0.1pM之间的平均EC50值结合所述细胞表面上的第二靶标；并且
其中所述第一靶标不同于所述第二靶标并且其中所述第一ISV抑制所述第一靶标的功能。
14.根据权利要求13所述的多肽，其中所述第一ISV以10nM至200nM之间的平均KD值，如10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、或190nM的平均EC50值结合细胞表面上的第一靶标。
15.根据权利要求13至14中任一项所述的多肽，其中所述第二ISV以10nM至0.1pM之间的平均EC50值，如10nM以下的平均EC50值，甚至更优选9nM以下，如小于8、7、6、5、4、3、2、1、0.5nM或甚至更小，如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM、或甚至更小如小于0.4pM的平均KD值结合细胞表面上的第二靶标。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的多肽，其中所述第一靶标和所述第二靶标以0.01至0.9，如0.2至0.8，0.3至0.7，0.4至0.6之间的比率，如0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的比率，存在于细胞表面上。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其还包含药物，如毒素或毒素部分。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其还包含显像剂，包括但不限于优选选自由以下组成的组的分子：有机分子、酶标记、放射性标记、有色标记、荧光标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、金属配合物、金属、胶体金、荧光标记、金属标记、生物素、化学发光物、生物发光物、发色团和其混合物。
19.药物组合物，其包含根据权利要求1至18中任一项所述的多肽。
20.将预防性或治疗性多肽、PDC或显像剂递送至体内特定位置、组织或细胞类型的方法，所述方法包括将根据权利要求1至18中任一项所述的多肽施用于受试者的步骤。
21.用于治疗需要其的受试者的方法，其包括施用根据权利要求1至17中任一项所述的多肽。
22.根据权利要求1至17中任一项所述的多肽，其用于治疗需要其的受试者。
23.根据权利要求1至17中任一项所述的多肽，其中所述第一靶标和所述第二靶标选自由以下组成的组：
-作为第一靶标的受体酪氨酸激酶和作为第二靶标的肿瘤相关抗原(TAA)；
-作为第一靶标的G蛋白偶联受体(GPCR)和作为第二靶标的造血细胞分化抗原；
-作为第一靶标的受体酪氨酸激酶和作为第二靶标的造血细胞分化抗原；以及
-作为第一靶标的G蛋白偶联受体(GPCR)和作为第二靶标的肿瘤相关抗原(TAA)。
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