CN113710229A - 用与抗炎剂连接的ecm亲和肽治疗炎症性和自身免疫性病症的方法和组合物 - Google Patents

用与抗炎剂连接的ecm亲和肽治疗炎症性和自身免疫性病症的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本公开涉及使用胶原蛋白结合肽(CBP)和vWF A3对抗炎剂进行胶原蛋白结合修饰工程以实现炎症疾病的靶向治疗。因此，本公开的实施方案涉及包含与细胞外基质(ECM)亲和肽可操作地连接的抗炎剂的组合物。还公开与血清蛋白和/或ECM亲和肽连接的细胞因子和抗炎剂，例如CD200。本公开其他方面涉及用于治疗对象的自身免疫或炎症病症的方法，其包括向对象施用本公开的组合物。

Description

用与抗炎剂连接的ECM亲和肽治疗炎症性和自身免疫性病症 的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年2月25日提交的美国临时专利申请第62/809,988号的优先权权益，将其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
I.发明领域
本发明一般地涉及医学领域。更特别地，它涉及涉及核苷酸构建体和蛋白质的组合物和方法，包括用于靶向发炎组织的工程抗炎剂。
II.背景
针对细胞因子及其受体的治疗显著改变了炎症和自身免疫疾病的结果，特别是在类风湿性关节炎(RA)和炎症性肠病(IBD)的抗TNF治疗中(1-5)。然而，目前批准的药物并不能完全治愈大多数患者，并且可能通过抑制全身免疫而产生显著的副作用(6-10)。为了提高治疗效果并且减少全身副作用，将药物有效递送到发炎区域是此类疾病的有前景的治疗策略。炎症组织释放一系列介质，这些介质会诱导增强渗透滞留(EPR)效应(11-12)。EPR效应是由于松散的内皮连接允许大分子和非功能性淋巴管外渗引起的，导致大分子在实体瘤和发炎组织内的滞留时间延长(11-15)。与肿瘤组织不同，发炎组织具有功能性淋巴系统，从其中排泄药剂(14-16)。目前，由于从炎症组织快速清除，因此没有有效方法来靶向炎症和自身免疫性疾病的发炎组织。因此，本领域需要直接靶向发炎组织的疗法。
发明内容
本公开涉及使用胶原蛋白结合肽(CBP)和vWF A3对抗炎剂进行胶原蛋白结合修饰工程以实现炎症疾病的靶向治疗。因此，本公开的实施方案涉及包含与细胞外基质(ECM)亲和肽可操作地连接的抗炎剂的组合物。本公开的方面还涉及与血清蛋白可操作地连接的抗炎剂和包含与血清蛋白可操作地连接的抗炎剂的组合物。本公开的其他方面涉及用于治疗对象的自身免疫性或炎症性病症的方法，其包括向对象施用本公开的组合物。
本公开的其他方面涉及用于减轻对象炎症的方法，其包括向对象施用包含与细胞外基质(ECM)亲和肽可操作地连接的抗炎剂的组合物。在一些实施方案中，炎症是由于自身免疫性或炎症性病症，并且其中自身免疫性或炎症性病症包括炎症性肠病、特发性肺纤维化、多发性硬化症、1型糖尿病或关节炎。
在一些实施方案中，与ECM亲和肽可操作地连接的抗炎剂包含与抗TNFα缀合的胶原蛋白结合结构域。在一些实施方案中，与ECM亲和肽可操作地连接的抗炎剂包含与IL-4可操作地连接的vWF-A3。在一些实施方案中，与ECM亲和肽可操作地连接的抗炎剂包含与抗TGF-β结合的胶原蛋白结合结构域。在一些实施方案中，将组合物进行全身施用。在一些实施方案中，将组合物进行局部施用。在一些实施方案中，与ECM亲和肽可操作地连接的抗炎剂的施用剂量比不用肽下局部施用的抗炎剂的最小有效剂量小至少20％。
在一些实施方案中，抗炎剂包含抗炎抗体。在一些实施方案中，抗炎抗体包含对如下特异的抗体：TNF-α、IL-1、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-12、IL-17A、IL-18、IFN-γ、GM-CSF、CD3、CD20、VLA-4、VLA-5、VCAM-1、TGF-β1、α4-整合素、α4β7-整合素、结缔组织生长因子、血小板衍生生长因子、纤溶酶原激活物抑制剂-1或胰岛素样生长因子结合蛋白。在一些实施方案中，抗体为抗TNF-α、抗IL-1、抗IL-5、抗IL-6、抗IL-6R、抗IL-12、抗IL-17A、抗IL-18、抗IFN-γ、抗GM-CSF、抗CD3、抗CD20、抗VLA-4、抗VLA-5、抗VCAM-1、抗TGF-β1、抗α4-整合素、抗α4β7-整合素、抗结缔组织生长因子、抗血小板衍生生长因子、抗纤溶酶原激活物抑制剂-1或抗胰岛素样生长因子结合蛋白抗体。在一些实施方案中，抗炎抗体是阻断抗体。在一些实施方案中，抗炎抗体是中和抗体。在一些实施方案中，抗炎抗体是拮抗性抗体。这些抗体中的一种或多于一种可从实施方案中具体排除。
在一些实施方案中，抗炎剂包含如下的抗原结合片段：抗TNF-α、抗IL-1、抗IL-5、抗IL-6、抗IL-6R、抗IL-12、抗IL-17A、抗IL-18、抗IFN-γ、抗GM-CSF、抗CD3、抗CD20、抗VLA-4、抗VLA-5、抗VCAM-1、抗TGF-β1、抗α4-整合素、抗α4β7-整合素、抗结缔组织生长因子、抗血小板衍生生长因子、抗纤溶酶原激活物抑制剂-1或抗胰岛素样生长因子结合蛋白抗体。抗原结合片段可以包含可变轻链区，所述可变轻链区包含来自抗TNF-α、抗IL-1、抗IL-5、抗IL-6、抗IL-6R、抗IL-12、抗IL-17A、抗IL-18、抗IFN-γ、抗GM-CSF、抗CD3、抗CD20、抗VLA-4、抗VLA-5、抗VCAM-1、抗TGF-β1、抗α4-整合素、抗α4β7-整合素、抗结缔组织生长因子、抗血小板衍生生长因子、抗纤溶酶原激活物抑制剂-1或抗胰岛素样生长因子结合蛋白抗体的CDR1、CDR2和CDR3，和/或包含可变重链区，所述可变重链区包含来自抗TNF-α、抗IL-1、抗IL-5、抗IL-6、抗IL-6R、抗IL-12、抗IL-17A、抗IL-18、抗IFN-γ、抗GM-CSF、抗CD3、抗CD20、抗VLA-4、抗VLA-5、抗VCAM-1、抗TGF-β1、抗α4-整合素、抗α4β7-整合素、抗结缔组织生长因子、抗血小板衍生生长因子、抗纤溶酶原激活物抑制剂-1或抗胰岛素样生长因子结合蛋白抗体的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，抗体包含阿达木单抗、赛妥珠单抗、英夫利西单抗、戈利木单抗、托珠单抗、利妥昔单抗、乌司奴单抗、那他珠单抗、维多珠单抗、苏金单抗或伊赛珠单抗。在一些实施方案中，抗炎剂包含源自如下的抗原结合片段：阿达木单抗、赛妥珠单抗、英夫利西单抗、戈利木单抗、托珠单抗、利妥昔单抗、乌司奴单抗、那他珠单抗、维多珠单抗、苏金单抗或伊赛珠单抗。抗原结合片段可以包含可变轻链区，所述可变轻链区包含来自阿达木单抗、赛妥珠单抗、英夫利西单抗、戈利木单抗、托珠单抗、利妥昔单抗、乌司奴单抗、那他珠单抗、维多珠单抗、苏金单抗或伊赛珠单抗的CDR1、CDR2和CDR3，和/或可变重链区，所述可变重链区包含来自阿达木单抗、赛妥珠单抗、英夫利西单抗、戈利木单抗、托珠单抗、利妥昔单抗、乌司奴单抗、那他珠单抗、维多珠单抗、苏金单抗或伊赛珠单抗的CDR1、CDR2和CDR3。源自完整抗体的抗原结合片段的实例包括微型抗体、scFv、嵌合抗原受体和双抗体。还预想源自如下中的一种或多于一种的二价或多特异性构建体：抗TNF-α、抗IL-1、抗IL-5、抗IL-6、抗IL-6R、抗IL-12、抗IL-17A、抗IL-18、抗IFN-γ、抗GM-CSF、抗CD3、抗CD20、抗VLA-4、抗VLA-5、抗VCAM-1、抗TGF-β1、抗α4-整合素、抗α4β7-整合素、抗结缔组织生长因子、抗血小板衍生生长因子、抗纤溶酶原激活物抑制剂-1或抗胰岛素样生长因子结合蛋白抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。这些抗体或抗原结合片段的一种或多于一种可从实施方案中具体排除。
在一些实施方案中，抗体包含抗TNF-α抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗IL-1抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗IL-5抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗IL-6抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗IL-6R抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗IL-12抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗IL-17A抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗IL-18抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗IFN-γ抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗GM-CSF抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗CD3抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗CD20抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗VLA-4抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗VLA-5抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗VCAM-1抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗TGF-β1抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗α4-整合素抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗α4β7-整合素抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗结缔组织生长因子抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗血小板衍生生长因子抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗纤溶酶原激活物抑制剂-1抗体。在一些实施方案中，抗体包含抗胰岛素样生长因子结合蛋白抗体。
在一些实施方案中，抗炎剂包含抗炎细胞因子多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自如下的多肽：IL-4、IL-1ra、IL-5、IL-10、IL-11、IL-23、IL-35、IL-36ra、IL-37、干扰素-β、TGF-β1、TNF受体I和TNF受体II。在一些实施方案中，细胞因子多肽源自人细胞因子多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽源自非人细胞因子多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽源自小鼠、狗、马、猪或山羊细胞因子多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自如下中的一种或多于一种的效应区：IL-4、IL-1ra、IL-5、IL-10、IL-11、IL-23、IL-35、IL-36ra、IL-37、干扰素-β、TGF-β1、TNF受体I和TNF受体II。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自IL-4的多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自IL-1ra的多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自IL-5的多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自IL-10的多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自IL-11的多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自IL-23、IL-35的多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自IL-36ra的多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自IL-37的多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自干扰素-β的多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自TGF-β1的多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自TNF受体I的多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含来自TNF受体II的多肽。这些抗炎多肽中的一种或多于一种可从实施方案中具体排除。在一些实施方案中，细胞因子多肽是人细胞因子多肽或源自人细胞因子多肽。
在一些实施方案中，细胞因子多肽包含SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:44的多肽或其片段，或具有与SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:44之一的氨基酸序列的多肽或其片段具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(或其中任何可衍生范围)的多肽。在一些实施方案中，抗炎剂包括SEQ IDNO:58或SEQ ID NO:59的多肽或其片段，或具有与SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59之一的氨基酸序列的多肽或其片段具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(或其中任何可衍生范围)的多肽。
在一些实施方案中，抗炎剂包含来自CD200的多肽。在一些实施方案中，CD200多肽包含CD200的胞外域。CD200(UniProt标识符O54901)是I型跨膜蛋白，其可通过与其受体CD200R1相互作用发挥免疫抑制功能。当从细胞表面裂解时，CD200的可溶性细胞外结构域仍然可结合CD200R并且激活CD200R。本公开的实施方案涉及包含至少或至多CD200的细胞外部分和血清蛋白例如血清白蛋白的多肽。多肽可用于本公开的方法实施方案。其他实施方案涉及包含至少或至多CD200的细胞外部分、血清白蛋白和ECM-亲和多肽的多肽。
在一些实施方案中，ECM-亲和肽包含胶原蛋白结合结构域。在一些实施方案中，多肽包含来自核心蛋白聚糖或血管性血友病因子(VWF)的胶原蛋白结合结构域。在一些实施方案中，ECM-亲和肽包含来自胎盘生长因子-2(PlGF-2)或CXCL-12γ的肽。在一些实施方案中，ECM亲和肽包含具有与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:52之一至少85％同一性的肽，或具有与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:47或SEQ IDNO:52之一的片段至少85％同一性的肽。在一些实施方案中，ECM-亲和肽包含具有与SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:52之一的氨基酸序列的肽具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(或其中可衍生的任何范围)的肽，或具有与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:52之一的氨基酸序列的肽的片段具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(或其中可衍生的任何范围)的肽。
在一些实施方案中，与细胞外基质(ECM)亲和肽可操作地连接的抗炎剂还包含与肽或试剂可操作地连接的血清蛋白。在一些实施方案中，血清蛋白与肽可操作地连接。在一些实施方案中，血清蛋白与肽通过肽键可操作地连接。在一些实施方案中，血清蛋白包括白蛋白。在一些实施方案中，抗炎剂邻近血清蛋白的氨基。在一些实施方案中，抗炎剂邻近血清蛋白的羧基。在一些实施方案中，ECM亲和肽邻近抗炎剂的氨基。在一些实施方案中，ECM亲和肽邻近抗炎剂的羧基。在一些实施方案中，血清蛋白邻近ECM亲和肽的氨基。在一些实施方案中，血清蛋白邻近ECM亲和肽的羧基。
当第一区域连接到第二区域的羧基末端时，第一区域邻近第二区域的羧基。在第一区域和第二区域之间可以有另外的中间氨基酸残基。因此，除非特别指明不具有中间氨基酸残基，否则这些区域不必紧邻。术语“邻近氨基”的类似定义在于，当第一区域连接到第二区域的氨基末端时，第一区域邻近第二区域的氨基。类似地，除非另有说明，否则第一区域和第二区域之间还可有中间氨基酸残基。在一些实施方案中，组合物包含邻近血清白蛋白的胶原蛋白结合结构域氨基-氨基和邻近血清白蛋白的IL-10多肽羧基。
在一些实施方案中，肽与抗炎剂和/或其他分子(例如血清蛋白)共价连接。在一些实施方案中，肽与抗炎剂通过双功能接头交联。可在肽和/或抗体序列之间插入接头，例如氨基酸或拟肽序列。在一个实施方案中，fynomer结构域在重(H)链或轻(L)链的氨基(NH2)-末端或羧基(C)-末端的最后一个氨基酸之后立即连接到重(H)链或轻(L)链。接头可具有一种或多于一种特性，包括灵活的构象、不能形成有序的二级结构或可促进或与任一结构域相互作用的疏水性或带电特性。通常在柔性蛋白质区域中发现的氨基酸的实例可包括Gly、Asn和Ser。例如，合适的肽接头可以是GGGSGGGS(SEQ ID NO:48)或(GGGS)n(SEQ ID NO:49)，其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(或其中可衍生出的任何范围)。其他接近中性的氨基酸，例如Thr和Ala，也可用于接头序列中。接头序列的长度可以在不显著影响融合蛋白的功能或活性的情况下变化(参见，例如，美国专利第6,087,329号)。在一个特定方面，肽和抗体重链或轻链通过具有约1个至25个氨基酸残基的肽序列连接。接头的实例还可包括化学部分和缀合剂，例如磺基-琥珀酰亚胺基衍生物(磺基-SMCC、磺基-SMPB)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)和酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)。接头的实例还包括线性碳链，例如CN(其中N＝1个至100个碳原子，例如N＝2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些实施方案中，接头可以是二肽接头，例如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)接头、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头或马来酰亚胺己酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(vc)接头。在一些实施方案中，接头是磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(smcc)。磺基-smcc缀合通过与巯基(硫醇，-SH)反应的马来酰亚胺基团发生，而其磺基-NHS酯对伯胺(如在赖氨酸和蛋白质或肽的N-末端发现的)具有反应性。此外，接头可以是马来酰亚胺基己酰基(mc)。在某些实施方案中，肽与抗炎剂通过肽键连接。肽可与抗炎剂的氨基或羧基末端连接。在一些实施方案中，肽与抗炎剂抗体的重链连接。在一些实施方案中，肽与抗炎剂抗体的轻链连接。在一些实施方案中，肽与抗炎剂的比率是约1:1至5:1。在一些方案实施中，肽与抗炎剂的比率是约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1(或其中可衍生的任何范围)。这些接头中的一个或多于一个可从实施方案中具体排除。
在一些实施方案中，组合物还包含与细胞外基质(ECM)亲和肽可操作地连接的第二抗炎剂。在一些实施方案中，组合物还包含与细胞外基质(ECM)亲和肽可操作地连接的第三抗炎剂、第四抗炎剂、第五抗炎剂或第六抗炎剂。
在一些实施方案中，自身免疫性或炎症性病症包括炎症性肠病、特发性肺纤维化、多发性硬化症、1型糖尿病、克罗恩病、牛皮癣、急性炎症、慢性炎症、神经炎症、关节炎、类风湿性关节炎、纤维化、感染、过敏、炎症治疗相关的不良事件和炎症治疗相关的炎症性疾病。这些病症中的一种或多于一种可从实施方案中具体排除。
在一些实施方案中，组合物进行全身施用。在一些实施方案中，组合物通过静脉注射施用。在一些实施方案中，组合物进行局部施用。在一些实施方案中，将组合物施用于炎症部位或邻近炎症部位。
在一些实施方案中，包含与肽可操作地连接的抗炎剂的组合物的施用剂量小于在不用肽下施用的抗炎剂的最小有效剂量。在一些实施方案中，包含与肽可操作地连接的抗炎剂的组合物的施用剂量小于在不用肽下通过相同施用途径施用的抗炎剂的最小有效剂量。在一些实施方案中，与肽可操作地连接的抗炎剂的施用剂量比不用肽下施用的抗炎剂的最小有效剂量小至少10％。在一些实施方案中，与肽可操作地连接的抗炎症剂的施用剂量比不用肽下施用的抗炎剂的最小有效剂量至少小10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％(或其中可衍生出的任何范围)。
在一些实施方案中，对象先前用抗炎剂、抗炎疗法或自身免疫疗法治疗过。在一些实施方案中，确定对象对先前治疗没有反应。在一些实施方案中，对象先前没有进行炎症性或自身免疫性疾病的治疗。在一些实施方案中，所述方法还包括施用另外的炎症或自身免疫疗法。在一些实施方案中，方法还包括施用与细胞外基质(ECM)亲和肽可操作地连接的第二抗炎剂。
如本文所用，术语“细胞因子多肽”是指多肽，其为细胞因子或其受体结合结构域并且保留部分细胞因子活性。
当提及包含氨基酸聚合物的基因产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。
术语“对象”、“哺乳动物”和“患者”可互换使用。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是小鼠、大鼠、兔、狗、驴或实验室试验动物，例如果蝇、斑马鱼等。
预想方法和组合物包括排除本文所述的任何实施方案。
如本文所用，术语“或”和“和/或”用于描述相互组合或相互排斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别预想x、y或z可从实施方案中具体排除。
在整个该说明书中，术语“约”根据其在细胞生物学领域中的简单和普通含义使用，以指示值包括用于确定值的装置或方法的误差的标准偏差。
与“包括”、“包含”或“特征在于”同义的术语“包含”是包容性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。短语“由……组成”排除未指定的任何元素、步骤或成分。短语“基本上由……组成”将所述主题的范围限制为指定的材料或步骤，以及不会对其基本和新颖特征产生实质性影响的材料或步骤。预想在术语“包含”的上下文中描述的实施方案也可在术语“由……组成”或“基本上由……组成”的上下文中实施。
特别预想的是，关于本发明的一个实施方案所讨论的任何限制可适用于本发明的任何其他实施方案。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法中，并且本发明的任何方法可用于生产或利用本发明的任何组合物。实施例中阐述的实施方案的方面也是可在不同实施例中的其他地方或申请中的其他地方例如在发明内容、具体实施方式、权利要求和附图说明中讨论的实施方案的上下文中实施的实施方案。
附图说明
下列附图构成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多于一幅并且结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。
图1A至图1B。CBP缀合提供对αTNF的胶原蛋白亲和力。(A)通过MALDI-TOF MS分析的WT-αTNF和CBP-αTNF。横坐标是质荷比(m/z)，纵坐标是双电荷离子的强度。(B)WT-αTNF和CBP-αTNF对I、II和III型胶原蛋白的结合亲和力通过ELISA进行分析(n＝3，平均值+SD)。
图2A至图2D。CBP-αTNF在发炎的爪子中积累。关节炎(CAIA)在右后爪中通过如下选择性地诱导：被动免疫抗胶原抗体，然后在右后足垫皮下注射LPS，在左后足垫皮下注射PBS。在注射LPS的第二天，将Cy7标记的CBP-αTNF和Cy7标记的WT-αTNF静脉注射到幼稚和CAIA小鼠中。注射有CBP-αTNF(A)和WT-αTNF(B)的小鼠关节炎或非关节炎爪中积累的代表性图像。(C)幼稚和CAIA小鼠(n＝3-4，平均值±SD)中关节炎爪(右后)与非关节炎爪(左后)的辐射效率比的变化。(D)注射CBP-αTNF的CAIA小鼠关节的代表性组织学图像(左图，H&E染色；右图，抗大鼠IgG的免疫组织化学染色)。
图3A至图3B。CBP-αTNF比WT-αTNF更有效地抑制关节炎的发展。关节炎通过如下诱导：被动免疫抗胶原抗体，然后腹膜内注射LPS。在LPS注射当天，将对照IgG、WT-αTNF或CBP-αTNF静脉注射到关节炎小鼠中。(A)关节炎评分代表来自六只小鼠的平均值+SE。*P<0.05，与对照相比(Dunnett多重比较检验)。#P<0.05，与各治疗组第8天的评分进行比较(Tukey多重比较检验)。(B)每个治疗组第8天关节的代表性H&E图像。如材料和方法中所述，滑膜增生和骨吸收的严重程度评分为0至4。使用Dunnett多重比较检验对对照组和αTNF治疗组之间的差异进行统计分析。
图4A至图4B。皮下注射CBP-αTNF也会在关节炎爪中积累并且抑制关节炎的发展。(A)关节炎在右后爪中通过如下选择性地诱导：被动免疫抗胶原抗体，然后在右后足垫皮下注射LPS，在左后足垫皮下注射PBS。LPS注射次日，Cy7标记的CBP-αTNF皮下注射于小鼠背部。注射有CBP-αTNF(用箭头表示)的小鼠的关节炎或非关节炎爪中积累的代表性图像。(B)关节炎在所有爪中通过如下诱导：被动免疫抗胶原抗体，然后腹膜内注射LPS。在注射LPS当天，皮下注射对照IgG、WT-αTNF或CBP-αTNF。关节炎评分代表来自五只小鼠的平均值+SE。#P<0.05，与各组第8天的评分进行比较(Tukey的多重比较检验)。
图5A至图5B。局部注射对关节炎发展的影响。关节炎通过如下诱导：被动免疫抗胶原抗体，然后腹膜内注射LPS。在LPS注射当天，(A)Cy7标记的PlGF-2123-144-αTNF和Cy7标记的WT-αTNF或(B)对照IgG、WT-αTNF和PlGF-2123-144-αTNF皮下注射至关节炎小鼠的左后爪。(A)WT-αTNF和PlGF-2123-144-αTNF在小鼠注射部位保留的代表性图像。(B)关节炎评分代表八只小鼠的平均值±SE。#P<0.05，与各组第6天的评分进行比较(Tukey的多重比较检验)。
图6A至图6E。A3-IL4在脊髓中积累并且降低EAE评分。通过ELISA测量A3-IL4对III型胶原(A)的亲和力以及IL-4和A3-IL4蛋白对IL-4Rα的亲和力(B)。显示[浓度]与[信号]的关系图(n＝4)。EAE通过如下诱导：皮下注射MOG35-55/CFA乳液，然后在免疫当天和第二天腹膜内注射PTX。在免疫后第14天，将DyLight 800标记的A3-IL4、A3蛋白(C)或Cy7标记的CBP-αTNF(D)静脉注射到幼稚或EAE小鼠中。注射后4小时收获脊髓并且测量荧光强度。(E)从EAE免疫后第14天起，每隔一天静脉注射正常形式的IL-4或A3-IL4。EAE的疾病评分代表平均值±SE(n＝3-5)。
图7A至图7C。A3蛋白和CBP缀合物在其他炎性疾病模型的发炎组织中的定位。(A)将DyLight 800标记的A3蛋白或Cy7标记的CBP-αTNF静脉注射至自发发展或未发展IBD的IL-10-/-×TLR-4-/-(DKO)小鼠或正常(C57BL/6)小鼠。注射后4小时收获结肠，并用于荧光成像(上部)和组织学分析(下部)。注射Cy7标记的CBP-αTNF的IBD发展的小鼠结肠用H&E和过碘酸-希夫(PAS)染色。此外，注射的抗体通过针对抗大鼠IgG的免疫组织化学(IHC)检测。(B)Cy7标记的CBP-αTGF或Cy7标记的αTGF在博来霉素滴注7天后静脉注射到幼稚小鼠或博莱霉素诱导的肺纤维化模型中。荧光注射后4小时收获肺，然后测量荧光强度。(C)将DyLight 800标记的A3蛋白静脉注射到I型糖尿病(T1D)自发发展的小鼠、环磷酰胺诱导的T1D小鼠和非糖尿病小鼠中。在荧光注射后15分钟收获胰腺，然后测量荧光强度。
图8A至图8D。白蛋白与IL-10融合提供FcRn结合并且导致LN积累。(A)wt IL-10和SA-IL-10的SDS-PAGE分析。(B)SA-IL-10与FcRn的结合分析。(C)脾细胞(i)或来自腘窝LN(ii)的单个细胞与SA、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10在冰上孵育30分钟。(i)中对于每种细胞类型(x轴)从左到右显示代表SA、SA-IL-10和CBD-SA-IL-10的结合％(y轴)的条形图。(ii)中对于每种细胞类型(x轴)从左到右分别显示代表SA和SA-IL-10的结合％(y轴)的条形图。通过用抗SA抗体和针对每个免疫细胞群的特异性标记物的抗体共染色来检测每种蛋白质与免疫细胞的结合。(D)静脉注射DyLight594标记的wt IL-10或SA-IL-10后腘窝LN的免疫荧光图像。T细胞和高内皮小静脉(HEV)分别用抗CD3或抗PNAd抗体染色。
图9A至图9B。白蛋白与IL-10融合提供延长的血液循环，CBD融合改善发炎关节的生物分布。(A)通过尾静脉注射向BALB/c小鼠施用wt IL-10、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10(各自相当于35μg IL-10)。在指定时间点收集血清。通过ELISA测量IL-10的血清浓度(平均值±SEM；n＝5)。IL-10的血浆半衰期使用两相指数衰减计算：MFI(t)＝Ae-αt+Be-βt。t1/2,α，快速清除半衰期；t1/2,β，缓慢清除半衰期。曲线下面积(AUC)由Graphpad Prism分析。(B)关节炎(CAIA)在右后爪中通过如下选择性地诱导：被动免疫抗胶原抗体，然后在右后足垫皮下注射LPS(定义为第3天)。在LPS注射后的第二天，将DyLight800标记的wt IL-10、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10静脉注射到CAIA小鼠中。注射后四小时，采集指定器官并且使用IVIS成像系统分析。(平均值±SEM；n＝4)。使用方差分析(ANOVA)与Tukey检验进行统计分析。*P<0.05；**P<0.01。(B)中对于每个器官(x轴)从左到右显示分别代表wt IL-10、SA-IL-10和CBD-SA-IL-10的分布％(y轴)的条形图。
图10A至图10D。融合白蛋白的IL-10比wt IL-10更有效地抑制关节炎的发展。(A)关节炎(CAIA)通过如下诱导：被动免疫抗胶原抗体，然后腹膜内注射LPS。在LPS注射当天，将PBS、wt IL-10、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10(相当于43.5μg IL-10)静脉注射到关节炎小鼠中。关节炎评分代表7只小鼠的平均值+SEM。(B)wt IL-10和CBD-SA-IL-10与αTNF-α抗体在用高剂量(1.5mg/小鼠)抗胶原抗体免疫的CAIA小鼠中的治疗效果的比较。关节炎评分代表6只至-7只小鼠的平均值+SEM。(C)每个治疗组第13天关节的代表性H&E组织学图像。比例尺，500μm。如材料和方法中所述，滑膜增生和骨吸收的严重程度评分为0到4。(D)施用途径SA-IL-10和CBD-SA-IL-10治疗效果的影响。关节炎评分代表6只至7只小鼠的平均值+SEM。使用方差分析(ANOVA)和Tukey检验进行统计分析。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图11A至图11D。融合白蛋白的IL-10显示出对建立的关节炎改善的治疗效果。DBA/1J雄性小鼠在尾基部皮下注射有牛胶原蛋白/CFA乳液。三周后，进一步注射牛胶原蛋白/IFA乳液作为增强剂。当关节炎评分变为2-4(定义为第0天)时，小鼠静脉注射有PBS、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10(每种相当于43.5μg IL-10)或200μg抗TNF-α抗体。在(A)中，在第3天向小鼠另外注射相同的治疗剂。(A和B)关节炎评分代表9只小鼠的平均值+SEM。(C和D)第16天关节的代表性H&E组织学图像。比例尺，500μm。如材料和方法中所述，滑膜增生和骨吸收的严重程度评分为0到4。使用方差分析(ANOVA)和Tukey检验(A和B)和双尾学生t检验(C和D)进行统计分析。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图12A至图12F。白蛋白融合的IL-10在LN中积累并且抑制Th17激活。关节炎(CAIA)通过如下诱导：被动免疫抗胶原抗体，然后腹膜内注射LPS(定义为第3天)。在LPS注射当天，将wt IL-10、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10静脉注射到关节炎小鼠中。使用ELISA测量LN中的IL-10水平和Th17相关细胞因子。(A)注射每种蛋白质后4小时IL-10水平的比较。(B)静脉注射后LN中wt IL-10或SA-IL-10的药代动力学。(平均值±SEM；n＝4)(C)各种LN中wt IL-10和SA-IL-10的AUC。关节引流(腘窝)LN(D)和非引流(宫颈)LN(E)中与Th17相关的细胞因子水平。(F)腘窝LN中的GM-CSF水平。(平均值±SEM；n＝7)。使用方差分析(ANOVA)和Tukey检验进行统计分析。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns：不显著。
图13A至图13C。白蛋白融合的IL-10抑制爪内的炎症反应。关节炎(CAIA)通过如下诱导：被动免疫抗胶原抗体，然后腹膜内注射LPS。在LPS注射当天(定义为第3天)，将PBS、wtIL-10、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10静脉注射到关节炎小鼠中。(A)在第11天从后爪中提取单个细胞，然后进行流式细胞术分析。图表描绘CD45+细胞、B细胞(CD45+淋巴细胞内的B220+细胞)、树突状细胞(CD45+淋巴细胞内的CD11c+细胞)、单核细胞(CD45+淋巴细胞内的CD11b+细胞)、粒细胞MDSC/中性粒细胞(Ly6G+Ly6C+CD11b+CD45+)、单核细胞MDSC(Ly6G-Ly6C+CD11b+CD45+)、巨噬细胞(F4/80+CD11b+CD45+)、M2巨噬细胞(CD206+F4/80+CD11b+CD45+)和M1巨噬细胞(MHC II+F4/80+CD11b+CD45+)。(平均值±SEM；n＝7)(B)第11天后爪中的细胞因子水平。(n＝5-7)(C)每个治疗组第14天关节的代表性H&E图像。比例尺，500μm。如材料和方法中所述，滑膜增生和骨吸收的严重程度评分为0到4。(平均值±SEM；n＝6-7)。除了(A)中的％CD11c+外，使用方差分析(ANOVA)和Tukey检验进行统计分析。为了分析(A)中的％CD11c+，采用Kruskal-Wallis检验，然后Dunn多重比较检验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图14A至图14B。CBD缀合提供对IL-10的胶原蛋白亲和力。(A)CBD-SA-IL-10的SDS-PAGE分析。(B)CBD-SA-IL-10与I型或III型胶原蛋白和FcRn的结合分析。
图15A至图15B。白蛋白融合的IL-10对脾脏(A)和LN(B)中免疫细胞群的影响。关节炎(CAIA)通过如下诱导：被动免疫抗胶原抗体，然后腹膜内注射LPS(定义为第3天)。在第3天和第6天，将PBS、wt IL-10或SA-IL-10静脉注射至小鼠。在最后一次注射后的第二天从脾脏和腘窝LN中提取单个细胞,然后进行流式细胞术分析。图表描绘如下的频率：活细胞内CD3+T细胞、活细胞内CD45+淋巴细胞、活细胞内CD11b+细胞、CD11b+细胞内CD11c+细胞、CD11c+细胞内CD86+细胞、粒细胞MDSC/中性粒细胞(CD11b+细胞内的Ly6G+Ly6C+)、单核细胞MDSC(CD11b+细胞内的Ly6G-Ly6C+)、巨噬细胞(CD11b+细胞内的F4/80+)、巨噬细胞内的CD86+细胞和M2巨噬细胞(CD11b+细胞内的CD206+F4/80+)。(平均值±SEM；n＝6-7)。使用方差分析(ANOVA)和Tukey检验进行统计分析，但以下图表除外。对于(A)中CD11b+细胞内的％CD11c+和(B)中CD11b+细胞内的％Ly6G+、Ly6C+的分析，采用Kruskal-Wallis检验，然后Dunn多重比较检验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图16A至图16B。白蛋白融合的IL-10对爪和血液中T细胞群的影响。关节炎(CAIA)通过如下诱导：被动免疫抗胶原抗体，然后腹膜内注射LPS(定义为第3天)。在LPS注射当天，将PBS、wt IL-10、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10静脉注射至小鼠。(A)在第11天从后爪中提取单个细胞，然后进行流式细胞术分析。图表描绘如下的频率：CD45+淋巴细胞内的NK1.1+CD3-NK细胞、CD45+淋巴细胞内的CD3+T细胞、CD45+淋巴细胞内的CD3+CD4+T细胞、CD3+CD4+T细胞的Treg(Foxp3+CD25+)、CD45+淋巴细胞内的CD3+CD8+T细胞、CD3+CD8+T细胞的效应记忆T细胞(CD62L-CD44+)、CD3+CD8+T细胞的中央记忆T细胞(CD62L+CD44+)、CD3+CD8+T细胞的PD-1+细胞。(B)在第11天从血液中提取淋巴细胞，然后进行流式细胞术分析。图表描绘如下的频率：CD45+淋巴细胞内的CD3+T细胞、CD45+淋巴细胞内的CD3+CD4+T细胞、CD3+CD4+T细胞内的Treg(Foxp3+CD25+)、CD45+淋巴细胞内的CD3+CD8+T细胞。(平均值±SEM；n＝5-7)。使用方差分析(ANOVA)和Tukey检验进行统计分析，但以下图表除外：对于(A)中如下的分析：CD45+细胞内的％NK1.1+、CD4+细胞内的％Foxp3+、CD8+细胞内的％CD44+/CD62L-、CD8+细胞内的％CD44+/CD62L+和CD8+细胞内的％PD-1+，采用Kruskal-Wallis检验，然后Dunn多重比较检验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图17A至图17B。白蛋白融合的IL-10的安全性评估。wt IL-10、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10静脉注射至健康BALB/c小鼠。(A)注射后两天，评估白细胞计数、红细胞计数、血小板计数、血液中血红蛋白的浓度和脾脏的重量。(B)使用生化分析仪评估血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、淀粉酶、血尿素氮(BUN)、血清钙、肌酸激酶(CK)、CO2、总胆红素(TBli)和总蛋白的浓度。(平均值±SEM；n＝5)。使用方差分析(ANOVA)和Tukey检验进行统计分析。*P<0.05；**P<0.01。
图18A至图18D。IL-4在SA融合后保持活性。(a)在还原和非还原条件下用考马斯蓝染色通过SDS-PAGE分析Wt IL-4和SA-IL-4。(b)SA-IL-4与来自LN和脾脏的新鲜分离的免疫细胞的结合，通过流式细胞术测量。(c)Wt IL-4和SA-IL-4活性测定。用指定浓度的wt IL-4或SA-IL-4体外培养T细胞后，通过流式细胞术分析T细胞中STAT6的磷酸化。(d)在存在wtIL-4或SA-IL-4下在Th17分化条件下分泌的IL-17浓度，通过ELISA测量。数据是平均值±SEM。两次实验重复。使用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。**P<0.01。
图19A至图19H。SA与IL-4的融合增加静脉注射后次级淋巴器官中IL-4的量。(a)通过SPR测量的SA-IL-4与FcRn的结合亲和力。(b)静脉注射的wt IL-4或SA-IL-4的血浆浓度。Wt IL-4 10μg(n＝4)或等摩尔SA-IL-4(n＝3)静脉注射至幼稚小鼠。1分钟至24小时后采集血液，并且通过ELISA测量IL-4的血浆浓度。(c-d)(c)肱和腰椎LN和(d)脾脏中IL-4的量随时间的变化。将40μg wt IL-4或等摩尔SA-IL-4静脉注射至幼稚小鼠。收获淋巴结和脾脏，并且通过ELISA检测IL-4的量(n＝5)。(e)注射后1小时测量LN和脾脏中的SA(P573K)-IL-4的量。重新呈现来自(c-d)的Wt IL-4和SA-IL-4数据。(f-g)静脉注射DyLight594标记的IL-4或SA-IL-4后1小时，腰椎LN的免疫荧光图像。T细胞和高内皮小静脉(HEV)分别用抗CD3或抗PNAd抗体染色。比例尺代表(g)200μm和(h)100μm。数据是平均值±SEM。两次实验重复。使用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。**P<0.01。
图20A至图20D。SA-IL-4防止急性期EAE疾病的进展和发展。C57BL/6髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的(a)疾病进展与(b)疾病发生率和(c)体重变化，所述小鼠从免疫后第8天起每隔一天如下注射一次，持续10天：腹膜内注射(i.p.)磷酸盐缓冲盐水(PBS)、腹膜内注射wt IL-4 10μg，或腹膜内注射或皮下注射(s.c.)SA-IL-4 10μg摩尔当量，或以FTY720 1mg/kg口服施用。每组n＝7。(d)脊髓的代表性组织学。通过免疫组织化学用抗髓鞘碱性蛋白抗体(棕色)检测髓鞘表达。箭头表示脱髓鞘。图表示通过盲法病理分析在每个治疗组中显示脱髓鞘的小鼠的百分比。两次实验重复。数据是平均值±SEM。使用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。**P<0.01。
图21A至图21H。SA-IL-4治疗抑制白细胞浸润到脊髓并且诱导引流LN中的免疫抑制细胞。小鼠经腹膜内注射有wt IL-4、SA-IL-4或PBS，或皮下注射有SA-IL-4，从免疫后第8天起每隔一天施用，持续10天，或从免疫后第8天起每天口服FTY720 1mg/kg体重。免疫后第17天，从引流的LN和脊髓中分离出细胞并且通过流式细胞术进行分析。(a-b)脊髓活细胞中(a)CD45+白细胞和(b)RoRγt+Th17细胞的频率。(c-g)在腰椎引流LN(dLN)中，分析如下的频率：(c)CD11b+CD45+细胞内的Ly6G+Ly6C+G-MDSCs，(d)CD11b+CD45+细胞内的Ly6G-Ly6C+M-MDSCs，(e)CD4+CD3+T细胞内的RoRγt+Th17细胞，(f)F4/80+CD11b+巨噬细胞内的CD86+M1巨噬细胞，(g)F4/80+CD11b+巨噬细胞内的CD206+M2巨噬细胞，以及(h)CD11b+CD45+细胞内的B220+B细胞。数据是平均值±SEM。实验进行一次。使用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。*P<0.05，**P<0.01。
图22A至图22P。SA-IL-4治疗激活PD-1/PD-L1轴并且降低T细胞中的整合素和细胞因子表达。MOG35-55诱导的EAE小鼠在免疫后第8天、第10天和第12天皮下注射有PBS、wt IL-4或SA-IL-4。在第13天分离脊髓和脾脏，并且分析(a-i)免疫细胞。(a)在脊髓的CD4+T细胞内四聚体+(识别MOG35-55)细胞的频率。在脾脏中，显示如下的频率：(b)四聚体+CD4+T细胞内的αLβ2整合素+细胞，(c)四聚体+CD4+T细胞内的α4β1整合素+细胞，(d)CD8+T细胞内的αLβ2整合素+细胞，和(e)CD8+T细胞内的α4β1整合素+细胞。(f)中央记忆(CM)CD44+CD62L+CD4+T细胞的PD-1的平均荧光强度(MFI)，(g)CM CD44+CD62L+CD8+T细胞的PD-1的MFI，(h)Ly6C+Ly6G-CD11b+M-MDS的PD-L1的MFI，(i)Ly6C+Ly6G-CD11b+M-MDSC的PD-L1+的频率，(j)Ly6C+Ly6G+CD11b+G-MDSC的PD-L1的MFI，(k)Ly6C+Ly6G+CD11b+G-MDSC的PD-L1+的频率，(l)四聚体+CD4+T细胞内IL-23R+细胞的频率。(m-n)在MOG蛋白存在下体外培养脾细胞3天。培养基中的(m)IL-17A、(n)IFNγ、(o)GM-CSF浓度通过ELISA进行分析。(p)在MOG35-55肽存在下体外培养脾细胞6小时。CD4+T细胞内的细胞因子表达通过流式细胞术表征。数据是平均值±SEM。实验进行一次。使用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。*P<0.05、**P<0.01。
图23A至图23K。EAE慢性期的SA-IL-4治疗降低临床评分并且防止免疫细胞浸润到脊髓。使用MOG35-55在C57BL/6小鼠中诱导EAE。腹膜内注射PBS、wt IL-4或SA-IL-4，其从免疫后第21天起，每隔一天注射一次，持续10天。显示(a)疾病进展和(b)体重变化(n＝6)。(c-d)皮下注射PBS、wt IL-4或SA-IL-4，其从免疫后第21天起，每隔一天注射一次，持续12天。显示(c)疾病进展和(d)体重变化(对于PBS和SA-IL-4，n＝8；对于其他治疗组，n＝7)。(e-h)在第34天，收集脊髓和脾脏，并且通过流式细胞术分析免疫细胞。图表表示如下的频率：(e)脊髓活细胞内CD45+细胞，(f)脊髓活细胞内CD4+CD3+CD45+T细胞，(g)脊髓活细胞内四聚体+(识别MOG35-55)RoRγt+CD4+Th17细胞，(h)脾脏四聚体+CD4+细胞内IL-23R+细胞。(i-j)在MOG蛋白存在下体外培养脾细胞3天。通过ELISA分析培养基中的(i)IL-17A、(j)GM-CSF的浓度。(k)在MOG35-55肽存在下体外培养脾细胞6小时。CD4+T细胞内的细胞因子表达通过流式细胞术表征。实验进行一次。数据是平均值±SEM。使用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。*P<0.05、**P<0.01。
图24。通过IVIS分析，注射的SA-IL-4在LN中的积累超过wt IL-4。DyLight800标记的wt IL-4和SA-IL-4在LN中的生物分布分析。静脉注射等量荧光的10μg wt IL-4或SA-IL-4。注射4小时后，收集腰椎LN并且通过IVIS体内成像系统(n＝6)成像。数据是误差±SEM。实验进行一次。使用学生t检验进行统计分析。
图25A至图25B。SA(P573K)突变为SA-IL-4降低血液浓度并且消除FcRn结合。小鼠静脉注射有40μg wt IL-4、SA-IL-4或SA(P573K)-IL-4。1小时后，收集血液并且通过ELISA测定血浆中的IL-4浓度。数据是平均值±SEM。(b)通过SPR测量的SA(P573K)-IL-4和FcRn的结合亲和力。无法测定结合亲和力。第一(1st)和第二(2nd)表示62.5nM浓度测试两次以验证可变性。两次实验重复。
图26。SA-IL-4的长期治疗抑制EAE疾病的发展和进展。腹膜内注射C57BL/6MOG35-55EAE小鼠的疾病进展，从用PBS或SA-IL-4(10μg，基于IL-4)(n＝8)免疫后第8天起每隔一天注射一次，持续16天。指示每个治疗组中每只小鼠发展EAE的小鼠数量。监测小鼠直至第24天。数据是平均值±SEM。两次实验重复。使用学生t检验进行统计分析。**P<0.01。
图27，FcRn结合对于SA-IL-4抑制EAE疾病的发展和进展至关重要。腹膜内注射C57BL/6MOG35-55 EAE小鼠的疾病进展，从用PBS或SA-IL-4(10μg，基于IL-4)(n＝6)免疫后第8天起，每隔一天注射一次。数据是平均值±SEM。
两次实验重复。使用学生t检验进行统计分析。**P<0.01。
图28A至图28B。SA-IL-4不影响脊髓和引流LN中巨噬细胞和树突细胞的数量。小鼠腹膜内注射有wt IL-4、SA-IL-4或PBS，或皮下注射有SA-IL-4，从免疫后第8天起，每隔一天注射一次，持续10天。从免疫后第8天起，每天口服施用FTY720 1mg/kg体重。免疫后17天，从引流LN(dLN)和脊髓中分离出细胞并且通过流式细胞术进行分析。分析如下的频率：(a)CD11b+细胞内的F4/80+巨噬细胞和(b)CD45+细胞内的CD11b+CD11c+DC。数据是平均值±SEM。实验进行一次。使用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。
图29A至图29O。SA-IL-4的血液和器官分析显示SA-IL-4是安全的。SA-IL-4的毒性分析。向幼稚小鼠静脉注射10μg wt IL-4或等摩尔SA-IL-4。2天后，(a-i)使用生化分析仪测试血清，(j-m)使用血液分析仪测试血液。通过在冻干之前和之后称重肺来确定肺水量。数据是平均值±SEM。实验进行一次。使用单因素方差分析与Tukey检验进行统计分析。
图30A至图30D。流式细胞术的门控策略。(A)再刺激(细胞因子表达)。(B)整合素表达。(C)MDSC。(D)CD45+和T细胞。
具体实施方式
提高药物对炎症和自身免疫疾病的治疗效果具有巨大的需求。一种可能的方法是将抗炎药物靶向发炎区域。由于脉管系统的低渗透性，胶原蛋白在大多数组织中是不可接近的，但由于脉管系统的高渗透性而暴露于发炎区域的血流中。本公开描述与ECM亲和肽缀合的ECM结合抗炎剂。一种这样的肽是胶原蛋白结合肽(CBP)。CBP缀合提供对抗TNFα抗体(αTNF)的胶原亲和力。CBP-αTNF在胶原抗体诱导的关节炎模型(实施例1)的发炎区域中积累。与未修饰的抗体相比，CBP-αTNF显著抑制关节炎的发展。此外，源自血管性血友病因子(vWF)A3域的胶原结合域与白细胞介素(IL)-4(A3-IL4)的融合使其能够在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的脊髓中检测到，这是静脉施用后的多发性硬化症模型(实施例1)。A3-IL4减少EAE的临床症状，而正常的IL-4则没有。在自发性炎症性肠病、博来霉素诱导的肺纤维化和I型糖尿病模型的发炎组织中可检测到胶原结合蛋白。总之，胶原亲和力使抗炎药物能够靶向发炎区域，表明治疗炎症和自身免疫疾病的新型临床转化方法。
III.抗炎剂
A.抗体
本公开的方面涉及抗炎抗体或其片段。术语“抗体”是指可与完整抗体竞争特异性结合靶抗原的任何同种型的完整免疫球蛋白或其片段，包括嵌合、人源化、完全人源化和双特异性抗体。如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换使用，是指作为动物免疫反应的一部分起作用的几类结构相关蛋白质中的任一种，包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM和相关蛋白质，以及包含保留抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。
术语“抗原”是指能够通过选择性结合剂例如抗体结合的分子或分子的一部分。抗原可具有一个或多于一个能够与不同抗体相互作用的表位。
术语“表位”包括能够通过与免疫球蛋白或T细胞受体结合而引发免疫反应的分子的任何区域或部分。表位决定簇可包括化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可具有特异性三维结构特征和/或特异性电荷特征。通常，对特定靶抗原特异的抗体将优先识别复杂混合物中靶抗原上的表位。
可使用本领域众所周知的许多不同表位作图技术来鉴定给定多肽的表位区域，这些技术包括：X射线晶体学、核磁共振波谱、定点诱变作图、蛋白质展示阵列，参见例如Epitope Mapping Protocols,(Johan Rockberg and Johan Nilvebrant,Ed.,2018)Humana Press,New York,N.Y。这种技术在本领域是已知的，并且描述于例如如下中：美国专利第4,708,871号；Geysen等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1984)；Geysen等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:178-182(1985)；Geysen等人.Molec.Immunol.23:709-715(1986)，参见例如Epitope Mapping Protocols,同上。另外，还可使用标准抗原性和亲水性图来预测和鉴定蛋白质的抗原性区域。
完整抗体通常由两条全长重链和两条全长轻链组成，但在某些情况下可包括较少的链，例如天然存在于骆驼科动物中的抗体可仅包含重链。本文公开的抗体可仅源自单一来源或可以是“嵌合的”，即抗体的不同部分可源自两种不同抗体。例如，可变区或CDR区可源自大鼠或鼠源，而恒定区源自不同的动物源，例如人。抗体或结合片段可在杂交瘤中通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解产生。除非另有说明，否则术语“抗体”包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白，其实例如下所述(Sela-Culang等人.FrontImmunol.2013；4:302；2013)。
术语“轻链”包括全长轻链及其片段，具有足够可变区序列以赋予结合特异性。全长轻链具有约25000道尔顿的分子量并且包括可变区结构域(本文缩写为VL)和恒定区结构域(本文缩写为CL)。轻链分为两类，鉴定为kappa(κ)和lambda(λ)。术语“VL片段”是指单克隆抗体的轻链片段，其包括全部或部分轻链可变区，包括CDR。VL片段还可包括轻链恒定区序列。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。
术语“重链”包括全长重链及其片段，具有足够可变区序列以赋予结合特异性。全长重链具有约50000道尔顿的分子量并且包括可变区结构域(本文缩写为VH)和三个恒定区结构域(本文缩写为CH1、CH2和CH3)。术语“VH片段”是指单克隆抗体的重链片段，包括全部或部分重链可变区，包括CDR。VH片段还可包括重链恒定区序列。重链恒定区结构域的数量将取决于同种型。VH结构域位于多肽的氨基末端，CH结构域位于羧基末端，CH3最靠近-COOH末端。抗体的同种型可以是IgM、IgD、IgG、IgA或IgE，并且由存在的重链定义，重链分为五类：μ链、δ链、γ链、α链或ε链。IgG有多种亚型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM亚型包括IgM1和IgM2。IgA亚型包括IgA1和IgA2。
抗体可以是任何同种型或分类的完整免疫球蛋白、嵌合抗体或对两种或多种抗原具有特异性的杂交抗体。它们也可以是片段(例如，F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等)，包括杂合片段。免疫球蛋白还包括天然、合成或基因工程蛋白，它们通过与特定抗原结合形成复合物而起到类似抗体的作用。术语抗体包括基因工程或其他修饰形式的免疫球蛋白，例如以下：
术语“单体”是指仅包含一个Ig单位的抗体。单体是抗体的基本功能单位。术语“二聚体”是指含有通过抗体重链恒定域(Fc，或可结晶片段区域)相互连接的两个Ig单元的抗体。复合物可通过连接(J)链蛋白来稳定。术语“多聚体”是指含有通过抗体重链恒定域(Fc区)相互连接的大于两个Ig单位的抗体。复合物可通过连接(J)链蛋白来稳定。
术语“二价抗体”是指包含两个抗原结合位点的抗体。两个结合位点可具有相同的抗原特异性或它们可以是双特异性的，这意指两个抗原结合位点具有不同的抗原特异性。
双特异性抗体是一类具有两个互补位的抗体，这些互补位具有针对两个或更多个不同表位的不同结合位点。在一些实施方案中，双特异性抗体可以是双互补位的，其中双特异性抗体可以特异性识别来自同一抗原的不同表位。在一些实施方案中，双特异性抗体可由称为“纳米抗体”的一对不同单域抗体构建。单域抗体来源于软骨鱼类和骆驼科动物并且对其进行修饰。可使用本领域技术人员常用的技术通过接头将纳米抗体连接在一起；这种选择和连接抗体的方法描述于如下中：PCT公开号WO2015044386A1、WO2010037838A2和Bever等人,Anal Chem.86:7875–7882(2014)，其各自具体通过引用整体并入本文。
双特异性抗体可构建为：完整的IgG、Fab'2、Fab'PEG、双链抗体或为scFv。双链抗体和scFv可在不用Fc区下仅使用可变域构建，可能会降低抗独特型反应的影响。双特异性抗体可通过多种方法产生，包括但不限于杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如，Songsivilai and Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)，其各自具体通过引用整体并入。
在某些方面，通过与结合不同抗原的VH和VL区对进行多聚化，抗原结合结构域可以是多特异性或异源特异性的。例如，抗体可以与(a)细胞表面抗原，(b)效应细胞表面上的Fc受体，或(c)至少一种其他成分结合或相互作用。因此，方面可包括但不限于双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性抗体或其抗原结合片段，其针对表位和其他靶标，例如效应细胞上的Fc受体。
在一些实施方案中，可以使用多特异性抗体并且使用本领域已知的常规方法通过短的柔性多肽链直接连接。一个这样的实例是双链抗体，其为二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，并且利用太短以致不能在同一链上的结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。接头功能适用于三链抗体、四链抗体和更高阶抗体多聚体的实施方案。(参见例如，Hollinger等人,ProcNatl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Polijak等人,Structure 2:1121-1123(1994)；Todorovska等人,J.Immunol.Methods 248:47-66(2001))。
与双特异性全抗体相反，双特异性双抗体也可以是有利的，因为它们可以容易地在大肠杆菌中构建和表达。可以使用噬菌体展示(WO94/13804)从文库中容易地选择具有适当结合特异性的双链抗体(和其他多肽，例如抗体片段)。如果双链抗体的一个臂保持不变，例如，具有针对蛋白质的特异性，则可制作文库，其中另一臂发生变化并且选择具有适当特异性的抗体。双特异性全抗体可通过如Ridgeway等人(Protein Eng.,9:616-621、1996)和Krah等人(N Biotechnol.39:167-173、2017)中所述的替代工程方法制备，其各自通过引用整体并入本文。
异缀合抗体由两种具有不同特异性的共价连接的单克隆抗体组成。参见例如，美国专利第6,010,902号，其通过引用整体并入本文。
以高特异性结合抗原表位的抗体分子的Fv片段部分在本文中称为“互补位”。互补位由与抗原表位接触以促进抗原识别的氨基酸残基组成。抗体的两个Fv片段中的每一个都由二聚化构型的两个可变域VH和VL组成。每个可变域的一级结构包括三个高变环，由框架区(FR)分隔并且在其两侧。高变环是来自任何哺乳动物的抗体分子中一级序列变异性最高的区域。术语高变环有时与术语“互补决定区(CDR)”互换使用。高变环(或CDR)的长度因抗体分子而异。来自给定哺乳动物的所有抗体分子的框架区具有高度的一级序列相似性/一致性。本领域技术人员可使用框架区的共有物来鉴定框架区和散布在框架区之间的高变环(或CDR)。高变环被赋予识别名称，其区分它们在多肽中的位置以及它们出现在哪个域上。VL域中的CDR标识为L1、L2和L3，其中L1出现在最远端，L3出现在最靠近CL域的位置。CDR也可命名为CDR-1、CDR-2和CDR-3。L3(CDR-3)通常是给定生物体产生的所有抗体分子中变异性最高的区域。CDR是在一级结构中线性排列的多肽链区域，并且由框架区彼此隔开。VL链的氨基末端(N末端)称为FR1。识别为FR2的区域出现在L1和L2高变环之间。FR3出现在L2和L3高变环之间，FR4区域最靠近CL结构域。VH链重复这种结构和命名法，其包括三个标识为H1、H2和H3的CDR。可变域或Fv片段(VH和VL)中的大部分氨基酸残基是框架区的一部分(约85％)。抗体分子的三维或三级结构使得框架区更位于分子内部并且提供大部分结构，其中CDR位于分子的外表面上。
已开发几种方法并且本领域技术人员可使用这些方法来鉴定构成这些区域中的每一个的确切氨基酸。这可使用多种多序列比对方法和算法中的任一种来完成，这些方法和算法鉴定构成框架区的保守氨基酸残基，因此鉴定长度可能不同但位于框架区之间的CDR。已开发三种常用的方法来鉴定抗体的CDR：Kabat(如下所述：T.T.Wu and E.A.Kabat,“AN ANALYSIS OF THE SEQUENCES OF THE VARIABLE REGIONS OF BENCE JONES PROTEINSAND MYELOMA LIGHT CHAINS AND THEIR IMPLICATIONS FOR ANTIBODYCOMPLEMENTARITY,”J Exp Med,vol.132,no.2,pp.211–250、Aug.1970)；Chothia(如下所述：C.Chothia et al.,“Conformations of immunoglobulin hypervariable regions,”Nature,vol.342,no.6252,pp.877–883、Dec.1989)；和IMGT(如下所述：M.-P.Lefranc等人,“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Ig superfamily V-like domains,”Developmental&ComparativeImmunology,vol.27,no.1,pp.55–77,Jan.2003)。这些方法各自包括用于鉴定构成可变区的氨基酸残基的独特编号系统。在大多数抗体分子中，实际接触抗原表位的氨基酸残基出现在CDR中，尽管在某些情况下，框架区内的残基有助于抗原结合。
本领域技术人员可使用多种方法中的任一种来确定抗体的互补位。这些方法包括：
1)基于抗体可变区氨基酸序列的化学性质和表位组成的抗体/表位结合相互作用的三级结构的计算预测。
2)氢-氘交换和质谱。
3)多肽片段化和肽图谱分析方法，其中从多肽的全长生成多个重叠的肽片段，并且评估这些肽对表位的结合亲和力。
4)抗体噬菌体展示文库分析，其中编码哺乳动物基因的抗体Fab片段由噬菌体以掺入噬菌体外壳的方式表达。然后允许该表达Fab的噬菌体群与已固定的抗原相互作用，或可通过不同的外源表达系统在其中表达。将未结合的Fab片段洗掉，从而仅留下附着在抗原上的特异性结合Fab片段。可容易地分离结合的Fab片段并且确定编码它们的基因。这种方法也可用于Fab片段的较小区域，包括Fv片段或特定的VH和VL结构域，视情况而定。
在某些方面，亲和力成熟的抗体通过其一个或多于一个CDR中的一个或多于一个修饰增强，与不具有那些改变的亲本抗体相比，这导致抗体对靶抗原的亲和力提高。某些亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的程序产生，例如Marks等人,Bio/Technology 10:779(1992)描述通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟，在噬菌体展示中采用的CDR和/或框架残基的随机诱变通过如下描述：Rajpal等人,PNAS.24:8466-8471(2005)和Thie等人,Methods Mol Biol.525:309-22(2009)，结合Tiller等人,Front.Immunol.8:986(2017)中说明的计算方法。
嵌合免疫球蛋白是来自不同物种的融合基因的产物；“人源化”嵌合体通常具有来自人免疫球蛋白的框架区(FR)，并且一个或多于一个CDR来自非人源。
在某些方面，重链和/或轻链的部分与来自另一特定物种或属于特定抗体类别或亚类的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性即可。美国专利第4,816,567号；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851(1984)。对于与嵌合抗体相关的方法，参见例如，美国专利第4,816,567号；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1985)，其各自具体通过引用整体并入本文。CDR移植描述于例如美国专利第6,180,370号、第5,693,762号、第5,693,761号、第5,585,089号和第5,530,101号中，其出于所有目的均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，使来自非人类物种的抗体多肽序列最小化可优化嵌合抗体功能并且降低免疫原性。来自非人抗体的非抗原识别区的特定氨基酸残基修饰为与人抗体或同种型中的相应残基同源。一个实例是“CDR移植”抗体，其中抗体包含来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的一个或多于一个CDR，而抗体链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。用于人类时，由来自非人类免疫球蛋白的轻链和重链可变区的CDR1、CDR2和部分CDR3组成的V区与人类抗体框架区接枝，用非人CDR取代天然存在的人抗体的抗原受体。在一些情况下，相应的非人残基替代人免疫球蛋白的框架区残基。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基以进一步改进性能。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。参见例如，Jones等人,Nature321:522(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593(1992)；Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma and Immunol.1:105(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23；1035(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428(1994)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-36(1988)。
体内抗体是细胞内定位的免疫球蛋白，其与细胞内抗原结合，而不是分泌抗体，后者在细胞外空间结合抗原。
多克隆抗体制剂通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体。为了产生多克隆抗体，宿主例如兔或山羊用抗原或抗原片段免疫，通常用佐剂免疫，并且如果需要偶联到载体上。随后从宿主的血清中收集针对抗原的抗体。多克隆抗体可针对抗原进行亲和纯化，使其具有单特异性。
单克隆抗体或“mAb”是指从来自独特亲本细胞的同质抗体群体中获得的抗体，例如，群体是相同的，不同之处是可以少量存在的天然发生的突变。每个单克隆抗体针对单个抗原决定簇。
1.功能抗体片段和抗原结合片段
a.抗原结合片段
某些方面涉及抗体片段，例如结合和/或中和炎症介质的抗体片段。术语功能性抗体片段包括保留与抗原特异性结合的能力的抗体的抗原结合片段。这些片段由可变区重链(VH)和/或轻链(VL)的各种排列构成；并且在一些实施方案中，包括恒定区重链1(CHl)和轻链(CL)。在一些实施方案中，它们缺少由重链2(CH2)和3(CH3)结构域构成的Fc区。抗原结合片段及其修饰的实施方案可包括：(i)由VL、VH、CL和CHl结构域构成的Fab片段类型；(ii)由VH和CHl结构域构成的Fd片段类型；(iii)由VH和VL结构域构成的Fv片段类型；(iv)单域片段类型，由单个VH或VL结构域构成的dAb(Ward,1989；McCafferty等人,1990；Holt et al.,2003)；(v)分离的互补决定区(CDR)区域。这些术语例如描述于如下中：Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY(1989)；Molec.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers,R.A.(ed.),New York:VCH Publisher,Inc.)；Huston等人,Cell Biophysics,22:189-224(1993)；Pluckthun and Skerra,Meth.Enzymol.,178:497-515(1989)和Day,E.D.,Advanced Immunochemistry,2d ed.,Wiley-Liss,Inc.New York,N.Y.(1990)；Antibodies,4:259-277(2015)。本段落中的引文均以引用方式并入。
抗原结合片段还包括从轻链可变区精确地保留至少或至多1个、2个或3个互补决定区(CDR)的抗体片段。包含CDR的序列与Fc区(或其CH2或CH3区)的融合包括在该定义的范围内，包括例如直接或间接与Fc区融合的scFv也包括在本文中。
术语Fab片段是指含有VL、VH、CL和CH1结构域的抗体的单价抗原结合片段。术语Fab'片段是指比Fab片段大的单克隆抗体的单价抗原结合片段。例如，Fab'片段包括VL、VH、CL和CH1结构域以及全部或部分铰链区。术语F(ab')2片段是指单克隆抗体的二价抗原结合片段，其包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab'片段。F(ab')2片段包括例如两个VH和VL结构域的全部或部分，并且可进一步包括两个CL和CH1结构域的全部或部分。
术语Fd片段是指单克隆抗体的重链片段，其包括全部或部分VH，包括CDR。Fd片段还可包括CH1区序列。
术语Fv片段是指单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括全部或部分VL和VH，并且不存在CL和CH1结构域。VL和VH包括例如CDR。单链抗体(sFv或scFv)是Fv分子，其中VL和VH区已通过柔性接头连接形成单一多肽链，从而形成抗原结合片段。单链抗体在国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号中详细讨论，其公开内容通过引用并入本文。术语(scFv)2是指二价或双特异性sFv多肽链，其在其C-末端包括寡聚化结构域，通过铰链区与sFv分开(Pack等人1992)。寡聚化结构域包含自缔合α-螺旋，例如亮氨酸拉链，其可以通过另外的二硫键进一步稳定。(scFv)2片段也称为“微型抗体”或“微抗体”。
单域抗体是仅包含VH或VL结构域的抗原结合片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接以产生二价域抗体。二价域抗体的两个VH区可靶向相同或不同的抗原。
b.片段结晶区，Fc
Fc区包含两个重链片段，包括抗体的CH2和CH3结构域。两个重链片段通过两个或多于两个二硫键和CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。如本文所用，术语“Fc多肽”包括源自抗体Fc区的天然和突变蛋白质形式的多肽形式。包含促进二聚化的铰链区的这种多肽的截短形式也包括在内。
2.具有抗体CDR和显示CDR的支架结构域的多肽
根据实施方案，使用抗原结合肽支架，例如互补决定区(CDR)来产生蛋白质结合分子。通常，本领域技术人员可确定在其上移植至少一个CDR的蛋白质支架的类型。众所周知，最佳的支架必须满足许多标准，例如：良好的系统发育保守性；已知的三维结构；小尺寸；很少或没有转录后修饰；和/或易于生产、表达和纯化。Skerra,J Mol Recognit,13:167-87(2000)。
蛋白质支架可来自但不限于：纤连蛋白III型FN3结构域(称为“单体”)、纤连蛋白III型结构域10、脂质运载蛋白、抗运载蛋白(anticalin)、金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z结构域、硫氧还蛋白A或具有重复基序的蛋白质，例如“锚蛋白重复序列”、“犰狳重复序列”、“富含亮氨酸的重复序列”和“三十四肽重复序列”。这种蛋白质描述于美国专利公开第2010/0285564号、第2006/0058510号、第2006/0088908号、第2005/0106660号和PCT公开号WO2006/056464中，其各自具体通过引用整体并入本文。也可使用源自蝎子、昆虫、植物、软体动物等的毒素的支架，以及神经元一氧化氮合酶(PIN)的蛋白质抑制剂。
B.细胞因子
细胞因子是一组在激发时释放细胞的蛋白质(只有很少的细胞因子在细胞膜上表达)。细胞产生的细胞因子可在非常低的浓度下影响附近的靶细胞或通过血液循环。它们在促进靶细胞的生长、分化和活化方面具有广泛的功能。许多细胞因子可靶向免疫细胞并且在免疫反应中发挥作用。根据结构和功能的差异，细胞因子可大致分为趋化因子、白细胞介素、生长因子、转化生长因子、集落刺激因子、肿瘤坏死因子和干扰素。
以下细胞因子可用作本公开的方法和组合物中的抗炎剂。虽然下面提供示例性序列，但也可以使用本领域已知的等同或同源蛋白质。
人IL-1ra:
Figure BDA0003314514520000281
小鼠IL-1ra:
Figure BDA0003314514520000282
人IL-4:
Figure BDA0003314514520000283
小鼠IL-4:
Figure BDA0003314514520000284
人IL-5:
Figure BDA0003314514520000285
小鼠IL-5:
Figure BDA0003314514520000291
人IL-10:
Figure BDA0003314514520000292
小鼠IL-10:
Figure BDA0003314514520000293
人IL-11:
Figure BDA0003314514520000294
小鼠IL-11:
Figure BDA0003314514520000295
人IL-23；p19亚基:
Figure BDA0003314514520000301
人IL-35；p35亚基:
Figure BDA0003314514520000302
小鼠IL-35；p35亚基:
Figure BDA0003314514520000303
人IL-36ra:
Figure BDA0003314514520000311
小鼠IL-36ra:
Figure BDA0003314514520000312
人IL-37:
Figure BDA0003314514520000313
小鼠IL-37:
Figure BDA0003314514520000314
人干扰素-β:
Figure BDA0003314514520000315
小鼠干扰素-β:
Figure BDA0003314514520000316
人TGF-β1:
Figure BDA0003314514520000321
小鼠TGF-β1:
Figure BDA0003314514520000322
人TNF受体I:
Figure BDA0003314514520000323
人TNF受体II:
Figure BDA0003314514520000324
小鼠TNF受体II:
Figure BDA0003314514520000325
C.CD200
本公开的实施方案涉及包含抗炎剂CD200的多肽和组合物。示例性CD200多肽氨基酸序列如下所示：
小鼠CD200胞外域由以下序列表示:
Figure BDA0003314514520000331
小鼠CD200-MSA融合蛋白(接头有下划线):
Figure BDA0003314514520000332
人CD200胞外域(UniProt标识符P41217)由以下序列表示:
Figure BDA0003314514520000341
示例性人CD200(小写)-人血清白蛋白(大写)融合蛋白(接头为大写并且加下划线)由以下表示:
Figure BDA0003314514520000342
小鼠CD200(小写)-CBD融合蛋白(大写)(接头为大写并且加下划线)由以下表示:
Figure BDA0003314514520000343
人CD200(小写)-CBD融合蛋白(大写)(接头为大写并且加下划线)由以下表示:
Figure BDA0003314514520000351
小鼠CD200(大写)-小鼠血清白蛋白(小写)-CBD(斜体下划线大写)融合蛋白由以下表示(接头为大写并且加下划线):
Figure BDA0003314514520000352
人CD200(大写)-人血清白蛋白(小写)-CBD(斜体下划线大写)融合蛋白由以下表示(接头为大写并且加下划线):
Figure BDA0003314514520000361
IV.ECM亲和肽
胶原蛋白是细胞外基质(ECM)蛋白，在正常组织和肿瘤组织两者中调节多种细胞生物学功能，例如增殖、分化和黏附(Ricard-Blum,Cold Spring Harb Perspect Biol 3:a004978、2011)。胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，几乎以28种异构体中的一种或多于一种形式存在于所有组织中(Ricard-Blum,Cold Spring Harb Perspect Biol3:a004978、2011)。血管亚内皮空间富含胶原蛋白。由于其在生理条件下的不溶性，血液中几乎不存在胶原蛋白(Dubois等人,Blood 107:3902-06、2006；Bergmeier and Hynes,ColdSpring Harb Perspect Biol 4:a005132、2012)。据报道，肿瘤血管系统由于异常结构而具有渗透性(Nagy et al.,British journal of cancer 100:865、2009)。因此，由于其渗漏的脉管系统，胶原蛋白暴露在肿瘤中(Liang等人,Journal of controlled release 209:101-109、2015；Liang等人,Sci Rep 6:18205、2016；Yasunaga等人,BioconjugateChemistry 22:1776-83、2011；Xu等人The Journal of cell biology 154:1069-80、2001；Swartz and Lund,Nat Rev Cancer 12:210-19)。此外，与正常组织相比，肿瘤组织含有增加量的胶原蛋白(Zhou等人J Cancer 8:1466-76,2017；Provenzano等人BMC Med 6:11、2008)。
血管性假血友病因子(vWF)是凝血因子，并且与I型和III型胶原蛋白以及血小板上的黏附受体GPIb结合(Lenting等人,Journal of thrombosis and haemostasis:JTH10:2428-37、2012；Shahidi Advances in experimental medicine and biology 906:285-306、2017)。当受伤时，内皮细胞下方的胶原蛋白暴露于血浆中，vWF-胶原蛋白结合引发血栓形成级联反应(Shahidi Advances in experimental medicine and biology 906:285-306、2017；Wu等人Blood99:3623-28、2002)。在报道的非细菌来源的蛋白质/肽中，vWFA结构域对胶原蛋白具有最高的亲和力(Addi等人,Tissue Engineering Part B:Reviews,2016)。特别是在A域内，vWF的A3域已报道为胶原蛋白结合域(CBD)(Ribba等人Thrombosisand Haemostasis 86:848-54、2001)。如上所述，本发明人预想具有vWF A3 CBD的融合蛋白即使在全身注射时也可由于通过渗漏的肿瘤血管系统暴露胶原蛋白而实现靶向细胞因子免疫疗法。
在一些实施方案中，ECM亲和肽包含来自核心蛋白聚糖的胶原蛋白结合域。在一些实施方案中，ECM亲和肽包含核心蛋白聚糖肽，例如源自牛的LRELHLNNNC(SEQ ID NO:1)或源自人的LRELHLDNNC(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方案中，ECM肽包含来自人核心蛋白聚糖的肽片段，其由以下氨基酸序列表示:
Figure BDA0003314514520000371
在一些实施方案中，ECM肽包含来自vWF的肽片段。在一些实施方案中，ECM肽包含源自人序列的vWF A1、残基1237-1458(成熟VWF的474-695)或其片段，其由以下氨基酸序列表示：
Figure BDA0003314514520000381
在一些实施方案中，ECM肽包含vWF A3的全部或片段，其由以下氨基酸序列表示:
Figure BDA0003314514520000382
在一些实施方案中，ECM肽包含vWF A3的全部或片段，其由以下氨基酸序列表示:
Figure BDA0003314514520000383
在一些实施方案中，ECM亲和肽是来自血管性血友病因子(vWF)的肽。人vWF的序列包括以下:
Figure BDA0003314514520000391
Figure BDA0003314514520000401
在一些实施方案中，肽来自vWF A3结构域。vWF A3结构域源自人序列、残基1670-1874(成熟vWF的907-1111)并且具有以下序列:
Figure BDA0003314514520000402
在一些实施方案中，ECM亲和肽包含来自PlGF-2的肽。PlGF-2具有以下序列:
Figure BDA0003314514520000411
示例性的PlGF-2 ECM亲和肽包括:RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHLCGDAVPRR(SEQ IDNO:9)、RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL(SEQ ID NO:10)、RRPKGRGKRRREKQRPTD(SEQ ID NO:11)、RRRPKGRGKRRREKQ(SEQ ID NO:12)、GKRRREKQ(SEQ ID NO:13)、RRRPKGRG(SEQ ID NO:14)和RRKTKGKRKRSRNSQTEEPHP(SEQ ID NO:15)。
在一些实施方案中，ECM亲和肽是来自CXCL-12γ的肽。CXCL-12γ的序列如下：CXCL-12γ:KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKGRREEKVGKKEKIGKKKRQKKRKAAQKRKN(SEQ ID NO:16)。示例性肽包括SEQ ID NO:12的全部或部分和以下肽：GRREEKVGKKEKIGKKKRQKKRKAAQKRKN(SEQ ID NO:17)。
ECM亲和肽可以是具有与ECM或CBD肽或上述肽的片段75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中任何可衍生范围)的肽。
接头序列可包含在抗炎剂-肽构建体中。例如，具有至少、至多或恰好如下个氨基酸的接头可将抗体和肽分开：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多(或其中任何可衍生范围)。
本公开的ECM亲和肽可对细胞外基质的一种或多于一种成分具有亲和力，例如纤连蛋白、胶原蛋白(I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和/或IV型胶原蛋白)、肌腱蛋白C、纤维蛋白原和纤维蛋白。在某些方面，ECM亲和肽对胶原蛋白具有亲和性。并且在其他方面，ECM亲和肽不结合纤连蛋白。
在一些实施方案中，本公开的ECM亲和肽和/或抗炎剂进一步连接至血清蛋白。血清蛋白包括例如白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原。球蛋白包括α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。白蛋白可以是小鼠、人、牛或任何其他同源白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白包括人血清白蛋白，其由ALB基因编码，并且示例为以下氨基酸序列:
Figure BDA0003314514520000421
在一些实施方案中，血清白蛋白包含具有以下序列的多肽:
Figure BDA0003314514520000422
在一些实施方案中，白蛋白包含具有以下序列的小鼠白蛋白:
Figure BDA0003314514520000431
相关实施方案包括通过甘氨酸丝氨酸肽接头(斜体大写和下划线)与小鼠血清白蛋白(MSA)(小写为MSA)连接的vWF A3(大写):
Figure BDA0003314514520000432
进一步相关的实施方案包括通过甘氨酸丝氨酸肽接头(斜体大写并且加下划线)与小鼠血清白蛋白(MSA)(小写为MSA)连接的vWF A3(大写)：通过甘氨酸丝氨酸肽接头(斜体大写并且加下划线)与人血清白蛋白(HSA)(小写为HSA)连接的vWF A3(大写):
Figure BDA0003314514520000441
V.蛋白质组合物
本公开的多肽或多核苷酸，例如ECM亲和肽、血清蛋白或细胞因子多肽可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50或多于50个变体氨基酸或核酸置换，或与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:66至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000或多于1000个连续的氨基酸或核酸，或其中可衍生的任何范围至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似、相同或同源。
本公开的多肽或多核苷酸，例如ECM亲和肽、血清蛋白或细胞因子多肽可包括SEQID NO:1至SEQ ID NO:66的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000或多于1000个连续的氨基酸，或其中可衍生的任何范围。
在一些实施方案中，本公开的多肽可以包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:66的氨基酸1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615(或其中任何可衍生范围)。
在一些实施方案中，本公开的多肽，例如ECM亲和肽、血清蛋白或细胞因子多肽可包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:66的至少、至多或恰好2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615个(或其中任何可衍生范围)连续氨基酸。
在一些实施方案中，多肽，例如ECM亲和肽、血清蛋白或细胞因子多肽可包含SEQID NO:1至SEQ ID NO:66的至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615个(或其中任何可衍生范围)连续氨基酸，其与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:66中的任一个至少、至多或恰好60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似、相同或同源。
本公开的多肽，例如ECM亲和肽、血清蛋白或细胞因子多肽可以是与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:66中的任一个至少、至多或恰好60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可衍生的任何范围)相似、相同或同源。
在一些方面，存在起始于如下位置的核酸分子或多肽：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:66中的任一个的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615，并且包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:66中任一个的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615个连续的核苷酸或氨基酸。
本公开的多肽和核酸可包括至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615个置换(或其中可衍生的任何范围)。
置换可在SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:66之一的氨基酸位置或核酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614或615。这些置换的一个或多于一个可从实施方案中具体排除。
具有与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:66中任一个至少、至少、或具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同一性的本公开的肽、多肽和蛋白质，例如ECM亲和肽、血清蛋白或细胞因子多肽，包括的片段或区段从如下氨基酸开始：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200(或其中可衍生的任何范围)，并且以如下氨基酸结尾：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204或205(或其中可衍生的任何范围)。
置换变体通常包含在蛋白质内的一个或多个位点处一种氨基酸与另一种氨基酸的交换，并且可设计成调节多肽的一种或多种特性，具有或不具有其他功能或特性的损失。置换可以是保守的，即，将一个氨基酸替换为一个形状和电荷相似的氨基酸。保守置换是本领域公知的并且包括例如如下的变化：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；甲硫氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。或者，置换可以是非保守的，使得影响多肽的功能或活性。非保守的变化通常涉及用化学上不同的残基替换残基，例如用极性或带电荷的氨基酸代替非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。这些置换的一个或多于一个可从实施方案中具体排除。
蛋白质可以是重组的，也可以是体外合成的。或者，可从细菌中分离非重组蛋白质或重组蛋白质。还预想可在组合物和方法中实施含有这种变体的细菌。因此，不需要分离蛋白质。
术语“功能等效密码子”在本文中用于指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的六个密码子，也指编码生物学等效氨基酸的密码子。
还将理解，氨基酸和核酸序列可包括另外的残基，例如另外的N-末端或C-末端氨基酸，或分别为5'或3'序列，但仍将基本上如本文公开的序列之一中所述，只要序列满足上述标准即可，包括在涉及蛋白质表达的情况下维持生物蛋白质活性。末端序列的增加特别适用于核酸序列，其可以例如包括位于编码区的5'或3'部分侧翼的各种非编码序列。
以下是基于改变蛋白质的氨基酸以创建等效甚至改进的第二代分子的讨论。例如，某些氨基酸可以替代蛋白质结构中的其他氨基酸，而不会显著丧失相互作用的结合能力。诸如酶催化结构域或相互作用组分的结构可以具有置换的氨基酸以维持这种功能。由于蛋白质的相互作用能力和性质决定该蛋白质的生物功能活性，因此可在蛋白质序列及其潜在的DNA编码序列中进行置换某些氨基酸，但仍产生具有类似特性的蛋白质。因此，本发明人预想可在基因的DNA序列中进行各种改变而不会明显损失其生物学效用或活性。
在其他实施方案中，多肽功能的改变意在通过引入一个或多于一个置换。例如，某些氨基酸可置换蛋白质结构中的其他氨基酸，目的是改变相互作用组分的相互作用结合能力。诸如例如蛋白质相互作用结构域、核酸相互作用结构域和催化位点的结构可具有置换的氨基酸以改变这种功能。由于蛋白质的相互作用能力和性质决定该蛋白质的生物功能活性，因此可在蛋白质序列及其潜在的DNA编码序列中置换某些氨基酸，但仍产生具有不同特性的蛋白质。因此，本发明人预想可在基因的DNA序列中进行各种改变，其中显著改变其生物学效用或活性。
在进行这种改变时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能方面的重要性是本领域普遍理解的(Kyte and Doolittle,1982)。认为氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其进而定义蛋白质与其他分子的相互作用，其他分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体和抗原等。
本领域还应理解，基于亲水性可有效地进行类似氨基酸的置换。美国专利第4,554,101号(通过引用并入本文)指出，蛋白质的最大局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性控制)与蛋白质的生物学特性相关。应理解，一个氨基酸可被另一个具有相似亲水性值的氨基酸置换，并且仍然产生生物学等效和免疫学等效的蛋白质。
如上所述，氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷和大小等。考虑到上述各种特性的示例性置换是众所周知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
在具体的实施方案中，本文所述的蛋白质的全部或部分也可根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成。各种自动合成器商购可得并且可根据已知方案使用。参见例如，Stewart and Young,(1984)；Tam等人,(1983)；Merrifield,(1986)；和Barany andMerrifield(1979)，各自通过引用并入本文。或者，可采用重组DNA技术，其中将编码肽或多肽的核苷酸序列插入表达载体中，转化或转染到合适的宿主细胞中并且在适合表达的条件下培养。
一个实施方案包括使用基因转移至细胞，包括微生物，以产生和/或呈递蛋白质。可将感兴趣蛋白质的基因转移到合适的宿主细胞中，然后在合适的条件下培养细胞。可采用实际上编码任何多肽的核酸。本文讨论重组表达载体以及其中包含的元件的产生。或者，待产生的蛋白质可以是通常由用于蛋白质生产的细胞合成的内源蛋白质。
VI.核酸
在某些实施方案中，本公开涉及编码本发明的蛋白质、多肽和肽的重组多核苷酸，例如与抗炎剂和/或其他分子可操作地连接的ECM亲和肽。因此，某些实施方案涉及编码与抗炎剂或其片段融合的ECM亲和多肽和/或ECM亲和多肽或其片段的核苷酸。
如在本申请中使用的，术语“多核苷酸”是指重组的或已经分离出不含总基因组核酸的核酸分子。术语“多核苷酸”包括寡核苷酸(长度为100个残基或更少的核酸)、重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体和病毒等。在某些方面，多核苷酸包括与其天然存在的基因或蛋白质编码序列基本上分离的调控序列。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链，并且可以是RNA、DNA(基因组、cDNA或合成)、其类似物或其组合。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于多核苷酸中。
在这方面，术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用于指编码蛋白质、多肽或肽(包括正确转录、翻译后修饰或定位所需的任何序列)的核酸。如本领域技术人员将理解的，该术语包括基因组序列、表达盒、cDNA序列和较小的工程化核酸区段，其表达或可适于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体。编码全部或部分多肽的核酸可包含编码本文所述或提及的一个或多于一个氨基酸序列的多核苷酸的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000或多于10000个核苷酸、核苷或碱基对(或其中可衍生的任何范围)的连续核酸序列，包括其间的所有值和范围。还预想特定多肽可由包含具有略微不同的核酸序列但仍然编码相同或基本相似的蛋白质的变体的核酸编码。
在特定实施方案中，本发明涉及分离的核酸区段和掺入编码本公开的多肽或肽的核酸序列的重组载体。术语“重组”可与多核苷酸或多肽结合使用，并且通常是指体外产生和/或操纵的多肽或多核苷酸，或者是这种分子的复制产物。
在其他实施方案中，本发明涉及分离的核酸区段和掺入编码本公开的多肽或肽的核酸序列的重组载体。
本公开中使用的核酸区段可与其他核酸序列组合，例如启动子、聚腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点和其他编码区段等，使得它们的总长度可显著变化。因此预想可使用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选地受在预期重组核酸方案中制备和使用的容易程度的限制。在一些情况下，核酸序列可以编码具有额外异源编码序列的多肽序列，例如以允许多肽的纯化、转运、分泌、翻译后修饰，或治疗益处，例如靶向或功效。如上所述，可向修饰的多肽编码序列添加标签或其他异源多肽，其中“异源”是指与修饰的多肽不同的多肽。
在某些实施方案中，本公开提供具有与本文公开的序列实质同一性的多核苷酸变体；使用本文描述的方法(例如，使用标准参数的BLAST分析)得到的本公开的包含与多核苷酸相比至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或高于99％、包括其间的所有值和范围的序列同一性的那些。
本公开还预想使用与所有上述多核苷酸互补的多核苷酸。
A.载体
本公开的多肽可由包含在载体中的核酸分子编码。术语“载体”用于指载体核酸分子，向其中可插入异源核酸序列以引入到其中可被复制和表达的细胞中。核酸序列可以是“异源的”，这意指它在引入载体的细胞或掺入其中的核酸的环境中是外来的，其包括与细胞或核酸中的序列同源但位于宿主细胞或核酸内通常不存在的位置的序列。载体包括DNA、RNA、质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技术人员将能够通过标准重组技术构建载体(例如Sambrook et al.,2001；Ausubel等人,1996，两者均通过引用并入本文)。除了编码本公开的多肽之外，载体可编码其他多肽序列，例如一种或多于一种其他细菌肽、标签或免疫原性增强肽。编码这种融合蛋白的有用载体包括pIN载体(Inouye等人,1985)、编码一段组氨酸的载体和pGEX载体，用于产生谷胱甘肽S-转移酶(GST)可溶性融合蛋白以供稍后纯化和分离或切割。
术语“表达载体”是指含有编码至少部分能够转录的基因产物的核酸序列的载体。在某些情况下，RNA分子随后翻译成蛋白质、多肽或肽。表达载体可包含多种“控制序列”，其指特定宿主生物中可操作连接的编码序列的转录和可能翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还可包含具有其他功能并且在本文中描述的核酸序列。
B.启动子和增强子
“启动子”是控制序列。启动子通常是核酸序列的一个区域，在该区域控制转录的起始和速率。它可包含调节蛋白和分子可以结合的遗传元件，例如RNA聚合酶和其他转录因子。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”是指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或方向以控制此序列的转录起始和表达。启动子可或不可与“增强子”结合使用，增强子是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调控序列。
自然地，使用有效指导DNA片段在选择用于表达的细胞类型或生物体中表达的启动子和/或增强子可以是重要的。分子生物学领域的技术人员通常知道启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达的用途(参见Sambrook等人,2001，通过引用并入本文)。采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的或可诱导的，并且在某些实施方案中可指导引入的DNA片段在特定条件下的高水平表达，例如重组蛋白或肽的大规模生产。
认为用于控制编码本发明多核苷酸的肽或蛋白质的表达的特定启动子不是关键的，只要它能够在靶细胞、优选细菌细胞中表达多核苷酸即可。当靶向人类细胞时，优选将多核苷酸编码区置于能够在人类细胞中表达的启动子附近并且在其控制下。一般而言，这种启动子可包括细菌、人类或病毒启动子。
C.起始信号和内部核糖体结合位点(IRES)
编码序列的有效翻译也可需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域的普通技术人员将能够容易地确定这一点并且提供必要信号。
在本发明的某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5'甲基化Cap依赖翻译的核糖体扫描模型，并且在内部位点开始翻译(Pelletier and Sonenberg,1988；Macejak and Sarnow,1991)。IRES元件可连接到异源开放阅读框。多个开放阅读框可一起转录，每个阅读框由一个IRES分隔，创建多顺反子信息。使用单个启动子/增强子转录单个信息可有效表达多个基因(参见美国专利第5,925,565号和第5,935,819号，通过引用并入本文)。
D.可选择和可筛选标记
在本发明的某些实施方案中，可通过在表达载体中编码可筛选或可选择标记在体外或体内鉴定含有本公开的核酸构建体的细胞。当转录和翻译时，标记赋予细胞可识别的变化，允许轻松识别含有表达载体的细胞。通常，可选择标记是赋予允许选择的特性的标记。正选择标记是其中标记的存在允许其选择的标记，而负选择标记是其中其存在阻止其选择的标记。正选择标记的实例是抗药性标记。
E.宿主细胞
如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语还包括它们的后代，即任何和所有后代。应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代可能不相同。在表达异源核酸序列的上下文中，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，并且其包括任何能够复制载体或表达载体编码的异源基因的可转化生物。宿主细胞可以并且已用作载体或病毒的受体。宿主细胞可“转染”或“转化”，这是指将外源核酸，例如重组蛋白编码序列转移或引入宿主细胞的过程。转化细胞包括原代对象细胞及其后代。
宿主细胞可来源于原核生物或真核生物，包括细菌、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，用于载体的复制或部分或全部核酸序列的表达。许多细胞系和培养物可用作宿主细胞，它们可通过美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，该组织是作为活培养物和遗传材料档案馆的组织(www.atcc.org)。
F.表达系统
存在包含至少部分或全部上述组合物的多种表达系统。可使用基于原核生物和/或基于真核生物的系统与本发明一起使用以产生核酸序列，或者它们的同源多肽、蛋白质和肽。许多这样的系统在商业上广泛可用。
昆虫细胞/杆状病毒系统可产生高水平的异源核酸片段的蛋白质表达，例如在美国专利第5,871,986号、第4,879,236号中描述的，两者均通过引用并入本文，并且可购买例如来自
Figure BDA0003314514520000631
的名称
Figure BDA0003314514520000632
2.0和来自
Figure BDA0003314514520000633
的BACPACKTM杆状病毒表达系统。
除了本发明公开的表达系统外，表达系统的其他实例包括
Figure BDA0003314514520000634
的完全控制可诱导哺乳动物表达系统，其涉及合成的蜕皮激素可诱导受体，或其pET表达系统，一种大肠杆菌表达系统。可诱导表达系统的另一实例可从
Figure BDA0003314514520000635
获得，它携带T-REXTM(四环素调节表达)系统，一种使用全长CMV启动子的可诱导哺乳动物表达系统。
Figure BDA0003314514520000636
还提供称为毕赤酵母表达系统的酵母表达系统，该系统设计用于在甲基营养型酵母毕赤酵母中高水平生产重组蛋白而。本领域技术人员会知道如何表达载体，例如表达构建体，以产生核酸序列或其同源多肽、蛋白质或肽。
VII.组合疗法
本公开的组合物和相关方法，特别是与抗炎剂和/或其他分子可操作地连接的ECM亲和肽的施用也可与另外疗法(例如本文所述的另外疗法)的施用或本领域已知的用于治疗自身免疫或炎症病症的其他传统疗法组合使用。
本文公开的治疗组合物和治疗可以以数分钟至数周的间隔在另一治疗或药剂之前、同时和/或之后进行。在将药剂单独应用于细胞、组织或生物体的实施方案中，通常会确保在每次递送之间没有很长的时间段，使得治疗剂仍将能够对细胞、组织或生物体发挥有利的组合作用。例如，在这样的情况下，预想可将细胞、组织或生物体与两种、三种、四种或多于四种试剂或治疗基本同时(即，在不到约一分钟内)接触。在其他方面，在给予另一种治疗剂或治疗之前和/或之后，一种或多于一种治疗剂或治疗可在如下时间内施用或提供：1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周或多于8周，以及其中可衍生的任何范围。
可采用治疗剂和治疗的各种组合方案。这种组合的非限制性实例如下所示，其中治疗剂例如本文公开的组合物是“A”，而第二药剂例如本文描述或本领域已知的另外的药剂或疗法是“B”：
Figure BDA0003314514520000641
在一些实施方案中，可使用不止一个疗程。预想可实施多个疗程。
VIII.治疗方法
本公开的组合物可用于体内、体外或离体施用。组合物的施用途径可以是例如皮内、皮下、静脉内、局部(local)、局部(topical)和腹膜内施用。
适合治疗的自身免疫病症或炎症病症可包括但不限于例如如下病症：糖尿病(例如1型糖尿病)、移植排斥、关节炎(类风湿性关节炎，例如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎症性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱导性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、斯蒂尔病、椎骨关节炎和全身性幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)、炎性过度增殖性皮肤病、银屑病如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑病，特应性，包括特应性疾病例如花粉热与约伯综合征，皮炎，包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎、和特应性皮炎、X连锁高IgM综合征、过敏性眼内炎性疾病、荨麻疹例如慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹、肌炎、多发性肌炎/皮肌炎、幼年性皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、硬皮病(包括系统性硬皮病)、硬化症例如系统性硬化症、多发性硬化(MS)例如脊髓-眼MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解型MS(RRMS)、进行性系统性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化、共济失调性硬化、视神经脊髓炎(NMO)、炎性肠病(IBD)(例如克罗恩病、自身免疫介导的胃肠道疾病、结肠炎例如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、显微镜结肠炎、胶原性结肠炎、息肉性结肠炎、坏死性小肠结肠炎、透壁性结肠炎和自身免疫性炎症性肠病)、肠道炎症、坏疽性脓皮病、结节性红斑、原发性硬化性胆管炎、呼吸窘迫综合征，包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、全部或部分葡萄膜炎症、虹膜炎、脉络膜炎、自身免疫性血液病、类风湿性脊柱炎、类风湿性滑膜炎、遗传性血管性水肿、脑膜炎等脑神经损伤、妊娠疱疹、妊娠性类天疱疮、阴囊瘙痒、自身免疫性卵巢早衰、自身免疫性疾病引起的突发性听力损失、IgE介导的疾病例如过敏反应与过敏性和特应性鼻炎、脑炎例如拉斯马森脑炎和边缘性和/或脑干脑炎、葡萄膜炎例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎、肾小球肾炎(GN)伴或不伴肾病综合征，例如慢性或急性肾小球肾炎例如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性或膜性增生性GN(MPGN)，包括I型和II型，以及快速进展性GN、增生性肾炎、自身免疫性多腺体内分泌功能衰竭、龟头炎，包括浆细胞性局限性龟头炎、龟头包皮炎、离心性环形红斑、持久性色素异常红斑、多形红斑、环状肉芽肿、光泽苔藓、硬化萎缩性苔藓、慢性单纯性苔藓、小棘苔藓、扁平苔藓、板层状鱼鳞病、表皮松解性角化过度、癌前角化病、坏疽性脓皮病、过敏状况和反应、过敏反应、湿疹，包括过敏性或特应性湿疹、皮脂缺乏性湿疹、出汗障碍性湿疹和水泡性掌跖湿疹，哮喘例如支气管哮喘、过敏性哮喘和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症，针对外来抗原如妊娠期胎儿ABO血型的免疫反应、慢性肺部炎性疾病、自身免疫性心肌炎、白细胞黏附缺陷、狼疮，包括狼疮性肾炎、狼疮性脑炎、小儿狼疮、非肾性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发性狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)，例如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE、新生儿狼疮综合征(NLE)和播散性红斑狼疮、青少年型(I型)糖尿病，包括儿童胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和成年发作糖尿病(II型糖尿病)和自身免疫性糖尿病。还考预想与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫反应、肉样瘤病、肉芽肿病，包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳肉芽肿、粒细胞缺乏症、血管炎，包括血管炎、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安)动脉炎)、中血管性血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)、显微镜下多动脉炎、免疫性血管炎、CNS血管炎、皮肤血管炎、过敏性血管炎、坏死性血管炎例如系统性坏死性血管炎、ANCA相关性血管炎例如变应性肉芽肿性血管炎或综合征(CSS)和ANCA相关性小血管炎、颞动脉炎、再生障碍性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、Coombs阳性贫血、Diamond-Blackfan贫血、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、阿狄森氏病、自身免疫性中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞渗出的疾病、CNS炎症性疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森病、多器官损伤综合征例如继发于败血症、创伤或出血的那些、抗原抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、白塞病/综合征、Castleman综合征、Goodpasture综合征、雷诺综合征、干燥综合征、Stevens-Johnson综合征、类天疱疮例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括慢性天疱疮、落叶状天疱疮、黏液天疱疮膜类天疱疮和红斑性天疱疮)、自身免疫性多内分泌疾病、赖特氏病或综合征、热损伤、先兆子痫、免疫复合物疾病例如免疫复合物肾炎、抗体介导的肾炎、多发性神经病、慢性神经病例如IgM多发性神经病或IgM介导的神经病，自身免疫性或免疫介导的血小板减少症，例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP，巩膜炎，例如特发性角化性巩膜炎、浅层巩膜炎，睾丸和卵巢的自身免疫性疾病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退，甲状旁腺机能减退，自身免疫性内分泌疾病，包括甲状腺炎例如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏病、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、特发性甲状腺功能减退、格雷夫氏病、多腺体综合征例如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)、副肿瘤综合征，包括神经副肿瘤综合征例如兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征、僵人或僵人综合征，脑脊髓炎例如过敏性脑脊髓炎或过敏性脑脊髓炎和实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)、实验性自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力例如胸腺瘤相关重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、眼阵挛或眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)以及感觉神经病、多灶性运动神经病、席汉氏综合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、狼疮样肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、淋巴细胞性间质性肺炎(LIP)、闭塞性细支气管炎(非移植)与NSIP、格林-巴利综合征、伯格氏病(IgA肾病)、特发性IgA肾病、线状IgA皮肤病、急性发热性嗜中性皮病、角层下脓疱性皮肤病、暂时性棘层松解性皮病、肝硬化例如原发性胆汁性肝硬化和肺硬变、自身免疫性肠病综合征、腹腔或腹腔疾病、乳糜泻(麸质肠病)、无反应性斯泼卢、特发性口炎性腹泻、冷球蛋白血症、偏头痛性侧索硬化症(ALS；葛雷克氏症)、冠状动脉疾病、自身免疫性耳病例如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力损失、多软骨炎例如难治性或复发性或复发性多软骨炎、肺泡蛋白沉积症、Cogan综合征/非梅毒性间质性角膜炎、贝尔氏麻痹、Sweet病/综合征、酒渣鼻自身免疫性、带状疱疹相关疼痛、淀粉样变性、非癌性淋巴细胞增多症、原发性淋巴细胞增多症，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症(例如，良性单克隆性丙种球蛋白病和意义不定的单克隆丙种球蛋白病，MGUS)，周围神经病，副肿瘤综合征、离子通道病例如癫痫、偏头痛、心律不齐、肌肉疾病、耳聋、失明、周期性麻痹和CNS通道病、自闭症、炎症性肌病、局灶性或节段性或局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、内分泌性眼病、葡萄膜视网膜炎、脉络膜视网膜炎、自身免疫性肝病、纤维肌痛、多发性内分泌衰竭、施密特氏综合征、肾上腺炎、胃萎缩、早老性痴呆、脱髓鞘疾病如自身免疫性脱髓鞘疾病和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、心肌梗塞后综合征、斑秃(alopecia greata)、全秃、CREST综合征(钙质沉着症、雷诺现象、食管运动功能障碍、硬皮病和毛血管扩张症)、男性和女性自身免疫性不孕症(例如，由于抗精子抗体导致)、混合性结缔组织病、恰加斯病、风湿热、复发性流产、农民肺、多形红斑、心脏切开后综合征、库欣综合征、养鸟人肺、变应性肉芽肿性血管炎、良性淋巴细胞性血管炎、Alport综合征、肺泡炎如变应性肺泡炎和纤维化性肺泡炎、间质性肺炎、输血反应、麻风、疟疾、寄生虫病如利什曼病、锥虫病(kypanosomiasis)、血吸虫病、蛔虫症、曲霉病、Sampter综合征、卡普兰综合征、登革热、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、弥漫性肺间质纤维化、肺间质纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、眼内炎、持久隆起性红斑、胎儿成红细胞增多症、嗜酸性筋膜炎、Shulman综合征、Felty综合征、丝虫病、睫状体炎如慢性睫状体炎、异慢性睫状体炎(heterochronic cyclitis)、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或Fuch's睫状体炎、过敏性紫癜、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、SCID、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、埃可病毒感染、脓毒症、内毒素血症、胰腺炎、甲状腺毒症、细小病毒感染、风疹病毒感染、接种后综合征、先天性风疹感染、EB病毒感染、流行性腮腺炎、伊文氏综合征、自身免疫性性腺衰竭、西登哈姆氏舞蹈病、链球菌感染后肾炎、血栓闭塞性脉管炎(thromboangitisubiterans)、甲状腺毒症、脊髓痨、脉络膜炎、巨细胞多肌痛、慢性过敏性肺炎、角结膜干燥症、流行性角膜结膜炎、特发性肾病综合征、微小病变性肾病、良性家族性和缺血-再灌注损伤、器官移植再灌注、视网膜自身免疫、关节炎症、支气管炎、慢性阻塞性气道/肺部疾病、硅肺、口疮、口疮性口炎、动脉硬化性疾病、无精子产生症(asperniogenese)、自身免疫性溶血、伯克病、冷球蛋白血症、杜普伊特伦氏挛缩、晶体过敏性眼内炎(endophthalmiaphacoanaphylactica)、过敏性肠炎、麻风结节性红斑、特发性面神经麻痹、慢性疲劳综合征、风湿热(febris rheumatica)、哈曼-里奇氏病、感音神经性耳聋、阵发性血红蛋白尿、性腺机能减退、局限性回肠炎、白细胞减少症、传染性单核细胞增多症、横贯性脊髓炎、原发性特发性黏液性水肿、肾变病、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa)、胰腺炎、急性多发性神经根炎(polyradiculitis acuta)、坏疽性脓皮病、Quervain甲状腺炎、获得性脾萎缩(acquired spenic atrophy)、非恶性胸腺瘤、白斑、中毒性休克综合征、食物中毒、涉及T细胞浸润的病症、白细胞黏附缺陷、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫反应、涉及白细胞渗出的疾病、多器官损伤综合征、抗原抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、过敏性神经炎、自身免疫性多内分泌腺病、卵巢炎、原发性黏液水肿、自身免疫性萎缩性胃炎、交感性眼炎、风湿性疾病、混合性结缔组织病、肾病综合征、胰岛炎、多内分泌功能衰竭、自身免疫性多腺体综合征I型、成人发病特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)、心肌病如扩张型心肌病、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、血色素沉着病、心肌炎、肾病综合征、原发性硬化性胆管炎、化脓性或非化脓性鼻窦炎、急性或慢性鼻窦炎、筛窦、额窦、上颌窦或蝶窦炎、嗜酸性粒细胞相关疾病如嗜酸粒细胞增多症、肺嗜酸性粒细胞浸润症(pulmonary infiltration eosinophilia)、嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏综合症、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、热带肺嗜酸性粒细胞增多症、支气管肺炎性曲霉病、曲霉肿或含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿、过敏反应、血清阴性脊椎关节炎(seronegative spondyloarthritides)、多内分泌自身免疫病、硬化性胆管炎、巩膜、巩膜外层、慢性皮肤黏膜念珠菌病、Bruton综合征、婴儿期短暂性低丙球蛋白血症、Wiskott-Aldrich综合征、共济失调毛细血管扩张综合征、血管扩张、与胶原病相关的自身免疫性疾病、风湿病、神经系统疾病、淋巴结炎、血压反应降低、血管功能障碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、肾缺血、脑缺血、伴随血管生成的疾病、过敏性超敏性疾病、肾小球肾炎、再灌注损伤、缺血性再灌注障碍、心肌或其他组织的再灌注损伤、淋巴瘤性气管支气管炎、炎症性皮肤病、具有急性炎症成分的皮肤病、多器官衰竭、大疱性疾病、肾皮质坏死、急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎症性疾病、眼眶炎性疾病、粒细胞输血相关综合征、细胞因子诱导的毒性、发作性睡病、急性重度炎症、慢性顽固性炎症、肾盂炎、动脉内膜增生、消化系统溃疡、心瓣炎、移植物抗宿主病、接触性超敏反应、哮喘气道高反应和子宫内膜异位症。
IX.药物组合物和方法
在一些实施方案中，向对象施用药物组合物。不同方面涉及向对象施用有效量的组合物。在一些实施方案中，可向对象或患者施用包含抗炎剂的组合物以治疗炎症和/或自身免疫。此外，这种化合物可与另外的治疗组合施用。
组合物可配制用于肠胃外施用，例如配制用于通过静脉内、经导管注射、动脉内注射、肌肉内、皮下或甚至腹膜内途径注射。通常，这种组合物可制成注射剂，例如液体溶液或悬浮液；也可制备适用于在注射前加入液体后制备溶液或悬浮液的固体形式；而且也可以将制剂乳化。根据本公开，这种制剂的制备对于本领域技术人员来说将是已知的。其他施用途径包括瘤内、瘤周、淋巴管内、炎症组织注射或淋巴结注射。在一些实施方案中，施用是全身性的。
还预想其他施用途径。例如，构建体和药剂可与载体联合施用。在一些实施方案中，载体是纳米颗粒或微粒。
颗粒可以具有可变尺寸的结构，并且以不同方式称为微球、微粒、纳米颗粒、纳米球或脂质体。这种颗粒制剂可通过构建体与颗粒的共价或非共价偶联形成。“颗粒”、“微粒”、“珠”、“微球”和语法等同物在本文中是指可施用于对象的小的离散颗粒。在某些实施方案中，颗粒的形状是基本上球形的。如本文所用，术语“基本上球形”是指颗粒的形状偏离球体不超过约10％。颗粒通常由基本上球形的核和任选的一层或多于一层组成。核的大小和组成可不同。除了核之外，颗粒可具有一层或多于一层以提供适合于感兴趣的应用的功能。如果存在，层的厚度可根据特定应用的需要而变化。例如，层可赋予有用的光学特性。
适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或含水丙二醇的制剂；和用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是易于注射的流体。它还应该在制造和储存条件下是稳定的，并且必须防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。
载体也可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可例如通过使用涂层如卵磷脂、在分散的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持。各种抗菌剂和抗真菌剂可以预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可延长可注射组合物的吸收。
无菌注射液通过将所需量的活性化合物与上面列举的各种其他成分一起加入适当的溶剂中来制备，根据需要，随后过滤灭菌。通常，分散体是通过将各种已灭菌的活性成分掺入包含基本分散介质和上述列举的那些所需的其他成分的无菌载体中来制备的。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末，加上来自先前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题并发症与合理的收益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。术语“药学上可接受的载体”是指涉及携带或运输化学试剂的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机酸或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐；等等。药学上可接受的盐包括由例如无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。
根据对象的状况，将一定会出现剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定个体对象的适当剂量。基于预期目标确定治疗或预防组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于对象的物理上离散的单位，每个单位包含预定量的组合物，经计算以产生上文讨论的与其施用相关的所需反应，即适当的途径和方案。根据治疗次数和单位剂量，待施用取决于所需的效果。组合物的精确量也取决于从业者的判断并且因每个人而异。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、施用途径、治疗的预期目标(缓解症状与治愈)以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。
配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式并且以治疗或预防有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，例如上述注射液的类型。
通常，对于成人(重约70公斤)，施用如下量的化合物：约0.1mg至约3000mg(包括其间的所有值和范围)，或约5mg至约1000mg(包括其间的所有值和范围)，或约10mg至100mg(包括其间的所有值和范围)。应理解，这些剂量范围仅作为示例，并且可根据技术人员已知的因素调整施用。
在某些实施方案中，施用至对象约、至少约或至多约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7.3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0.19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000毫克(mg)或微克(mcg)或μg/kg或微克/kg/分钟或mg/kg/min或微克/kg/小时或mg/kg/小时，或μM或mM的本文讨论的药剂。预想其中可衍生的任何范围。
可以根据需要或每隔1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时或24小时(或其中可衍生的任何范围)施用一剂或每天施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、或9次(或其中可衍生的任何范围)。可在出现病症之前或之后施用首剂。在一些实施方案中，在患者经历或表现出该病症的体征或症状后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时(或其中可衍生的任何范围)或1天、2天、3天、4天或5天(或其中可衍生的任何范围)，患者施用治疗方案的首剂。患者可持续治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或多于10天(或其中可衍生的任何范围)或直到症状消失或减轻，或感染症状消失或减轻后6小时、12小时、18小时或24小时或1天、2天、3天、4天或5天。
X.实施例
包括以下实施例以展示本公开的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表了发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，因此可认为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得同样或相似的结果。
实施例1：胶原蛋白结合修饰工程增强抗炎剂的功效
A.结果
1.CBP缀合提供对抗TNFα抗体(αTNF)的胶原亲和力
将抗TNFα抗体(αTNF)与磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)混合后，CBP与抗体共价交联。通过基质辅助激光解吸/电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱(图1A)计算至多5个CBP与抗体结合。为了检查CBP-缀合αTNF(CBP-αTNF)结合胶原蛋白的能力，通过ELISA测定CBP-αTNF和未修饰的αTNF(WT-αTNF)对I、II和III型胶原蛋白的结合活性。CBP-αTNF与所有测试类型的胶原蛋白结合，而WT-αTNF与胶原蛋白的结合信号处于无法检测的水平(图1B)。
2.CBP缀合使αTNF能够定位在关节炎模型的发炎爪中
通过体内生物分布分析确定通过与内源性胶原蛋白结合而在胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)模型的发炎爪中定位CBP-αTNF。通过如下选择性地在右后爪中诱导关节炎：被动免疫抗胶原抗体，然后在右后足垫皮下注射LPS。与其他爪相比，局部LPS注射在右后爪处诱发严重关节炎。在LPS注射的第二天，荧光标记的CBP-αTNF和WT-αTNF静脉注射到CAIA和幼稚小鼠中。在抗体注射前和注射后0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、24小时和48小时测量全身荧光水平。注射有CBP-αTNF和WT-αTNF的CAIA小鼠右后关节炎爪中的荧光水平在注射后立即增加，而幼稚小鼠在关节炎爪和非关节炎爪中的荧光水平几乎相同(图2A和图2B)。注射有CBP-αTNF的小鼠关节炎爪与非关节炎爪的水平比率高于WT-αTNF(图2C)。通过免疫组织化学在关节炎的主要发炎区域滑膜和血管翳中检测到注射的CBP-αTNF(图2D)。这些数据表明CBD-αTNF在全身注射后优先定位于发炎组织(即关节炎爪)，而不是其未修饰的形式。
3.CBP缀合增强αTNF在关节炎模型中的功效
本发明人接着检查CBP-αTNF在CAIA模型中的抗炎症功效。通过被动免疫抗胶原抗体，然后腹膜内注射LPS，在所有爪中诱导关节炎。在LPS注射当天，静脉注射对照IgG、WT-αTNF或CBP-αTNF。对照小鼠关节炎评分增加，WT-αTNF和CBP-αTNF评分降低(图3A)。CBP-αTNF治疗的小鼠的评分降低显著大于WT-αTNF治疗的小鼠。组织学观察发现CBP-αTNF显著抑制关节破坏(图3B)。本发明人进一步研究CBP-αTNF是否可以通过皮下途径注射显示疗效。甚至在CBP-αTNF皮下注射中也观察到类似的蓄积趋势和抑制功效(图4)。这些数据表明αTNF的CBP修饰提供比其未修饰形式更好的抗炎症功效。
4.局部注射ECM结合αTNF对关节炎的发展有很强的作用
为了评估局部治疗的治疗效力，本发明人以与先前描述的CBP缀合相同的方式将αTNF与源自胎盘生长因子2的混杂ECM结合肽(特别是PlGF-2123-144)结合(32、33)。PlGF-2123-144肽以高亲和力与多种ECM蛋白结合，因此它保留在注射部位。在CAIA小鼠左后足垫注射的PlGF-2123-144-缀合αTNF(PlGF-2123-144-αTNF)保留在注射部位，而WT-αTNF的信号在注射后迅速减弱(图5A)。为了对比功效，在CAIA小鼠的左后足垫皮下注射对照IgG、WT-αTNF或PlGF-2123-144-αTNF。在对照IgG处理的小鼠中，右后肢和左后肢的关节炎评分均增加。在该治疗方案中，WT-αTNF没有抑制评分。然而，即使在比WT-αTNF低100倍的剂量下，PlGF-2123-144-αTNF也几乎完全抑制治疗爪(左)的关节炎发展。有趣的是，PlGF-2123-144-αTNF并未抑制未经治疗的爪(右)的关节炎发展，表明其具有局部功效(图5B)。这些数据表明，药物在炎症部位的积累对于抑制炎症和最大限度地发挥抗炎药物的疗效至关重要。
5.源自vWF A3结构域的CBD蛋白可靶向实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中的发炎脊髓
IL-4是细胞因子，其诱导幼稚辅助T细胞(Th0)向Th2细胞分化。据报道，通过鞘内或鼻内给药将IL-4施用于中枢神经系统改善实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型(一种多发性硬化症小鼠模型)的临床症状和轴突形态。因此，为了通过静脉注射实现IL-4的EAE靶向，这是临床相关的注射途径，本发明人合成vWF A3结构域融合的IL-4(A3-IL4)蛋白。A3-IL4与胶原III结合，解离常数(Kd)为28.6nM(图6A)。vWF A3结构域与IL-4融合并未消除与其受体IL-4Rα的结合亲和力(图6B)。接着，通过与内源性胶原蛋白结合，vWF A3结构域蛋白在EAE模型发炎脊髓中的定位通过荧光成像来确定。在免疫后第14天，当靶组织发炎时，将荧光标记的A3或A3-IL4静脉注射到幼稚和EAE小鼠中。在EAE小鼠的脊髓中检测到A3和A3-IL4，但未在幼稚小鼠的脊髓中检测到A3和A3-IL4(图6C)。本发明人接着检测A3-IL4对EAE症状的治疗作用。从免疫后第14天第一次出现EAE症状时起，每隔一天静脉注射PBS、正常型IL-4、A3-IL4。A3-IL4降低平均疾病评分，而正常的IL-4没有显示任何治疗效果(图6E)。
6.A3蛋白和CBP缀合物也可靶向其他炎症疾病模型的发炎组织
为了探索胶原结合工程是否对炎症性疾病具有多种应用，在自发性炎症性肠病(IBD)、博来霉素诱导的特发性肺纤维化(IPF)和I型糖尿病(T1D)模型的发炎组织中通过荧光成像确定A3蛋白和CBP缀合抗体的定位。当靶组织发炎时，将荧光标记的A3、CBP-αTNF或CBP缀合抗TGF-β抗体(CBP-αTGF)静脉注射到EAE、IBD、IPF和T1D模型中，并且确定靶标组织的荧光水平。在IBD发育小鼠的结肠、自发性T1D和环磷酰胺诱导的T1D小鼠的胰腺中检测到A3，但在健康小鼠中未检测到A3(图7A和图7C)。类似地，在EAE模型的脊髓和IBD发展小鼠的结肠而不是健康小鼠的结肠中检测到CBP-αTNF(图6D和图7A)。组织病理学分析显示CBP-αTNF定位于IBD模型的结肠固有层，其中有浸润细胞(图7A)。此外，在IPF模型的肺中检测到CBP-αTGF，而未修饰的抗体则没有(图7B)。这些结果表明，胶原蛋白对抗体和细胞因子的亲和力使它们能够靶向发炎组织。
B.讨论
在这项研究中，证明将胶原结合亲和力与抗炎症抗体结合增强其在发炎组织中的保留及其治疗效力。静脉和皮下注射的CBP-αTNF在CAIA模型的发炎爪中积累。此外，CBP与抗体的缀合使其能够在EAE、IBD和IPF模型的多个炎症部位检测到。这表明胶原亲和力可靶向发炎部位并且广泛适用于各种炎症性疾病。这是因为胶原蛋白普遍并且大量存在于脉管系统周围，但仅当炎症组织中发生脉管系统的高渗透性时才暴露于血流中。因此，作为药物递送方法的胶原亲和性既不是组织、分子表达，也不是疾病特异性方法，而是一般的炎症特异性方法。更重要的是，在CAIA模型中，CBP-αTNF比未修饰的αTNF更有效地降低关节炎评分。αTNF治疗RA和IBD等炎症性疾病在大多数患者中并未表现出完全反应，并且可具有显著的副作用(6-10)。因此，CBP-αTNF具有实现炎症和自身免疫性疾病高级治疗的转化潜力。
为了评估其他胶原结合蛋白是否也可在全身注射后靶向炎症部位，本发明人使用vWF A3结构域重组蛋白。A3-IL4在脊髓中积累并且降低EAE模型中的疾病评分，而正常形式的IL-4则没有。靶向神经元IL-4信号传导预期成为阻止多发性硬化症残疾进展的新治疗策略(34)。虽然提出鞘内或鼻内途径使IL-4治疗通过血脑屏障，但该实施例表明为IL-4提供胶原蛋白结合能力，即使通过静脉途径也能够减少EAE模型中的临床症状。它还显示IBD和T1D模型发炎组织中A3蛋白的积累。本发明人使用用于自身抗体诱导的急性炎症的CAIA模型、用于自身免疫介导的慢性炎症的EAE模型、用于自发性炎症的IBD模型、用于伴随炎症的纤维化的IPF模型以及用于自发性T细胞介导的自身免疫性疾病的T1D作为主要炎症模型。这些数据表明，胶原结合抗体和细胞因子能够通过在炎症部位积累，在多种炎症性疾病中实现有效的抗体和细胞因子治疗。
本实施例显示局部注射PlGF-2123-144-αTNF在注射部位保留，在低剂量下显示出很强的治疗效果。然而，PlGF-2123-144-αTNF治疗仅在局部注射时有效，因为其混杂的ECM亲和力。用于炎症靶向治疗的胶原结合方法的主要转化优势是它可从全身递送途径靶向炎症部位。对于胶原结合抗炎药物的临床转化，使用来自vWF的A3结构域或来自核心蛋白聚糖的CBP的优势在于两者天然存在于人体内，限制免疫系统识别的可能性。此外，CBP可通过简单的化学反应与抗体缀合。该特征的优点是生产简单，因为可使用已优化生产的抗体。在该实施例中，本发明人已表明CBP能够缀合抗TNFα和抗TGFβ抗体。抗体的CBP共轭合成反应可在仅90分钟内使用类似于蛋白质聚乙二醇化的化学反应完成。相同的反应用于抗体-药物缀合物，例如在曲妥珠单抗-美坦新偶联物的生产中(35、36)。至于A3-IL4，鉴于细胞因子是小分子并且一般容易产生，本发明人选择重组融合而不是将A3与IL-4缀合。这些特征可促进胶原结合药物疗法的发展，以克服临床转化的障碍。
总之，发现胶原蛋白对抗体和细胞因子的亲和力使它们能够靶向炎症部位。此外，与其未修饰的形式相比，结合胶原蛋白的抗炎药物显示出高的治疗效果。这种工程化胶原结合药物的简单方法可具有作为炎症靶向治疗剂的临床转化潜力。
C.材料和方法
1.合成CBP缀合的抗体
大鼠抗小鼠TNF-α抗体(clone XT3.11、BioXcell)与20当量磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)在室温下反应30分钟。使用Zeba旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific)去除过量的磺基SMCC。然后加入30当量源自decorion的胶原结合序列肽(CBP，LRELHLNNNC)并且在室温下反应1小时以与C残基上的巯基部分缀合。肽已由Genscript合成，纯度>95％。
2.生产和纯化重组vWF A3结构域和A3融合IL-4蛋白
合成编码人vWF A3域残基Cys1670-Gly1874(成熟vWF的907-1111)、人vWF A3域和小鼠IL-4融合蛋白的序列，并且亚克隆到由Genscript提供的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)。为了进一步纯化重组蛋白，在N-末端增加编码6His的序列。悬浮适应的HEK-293F细胞常规维持在无血清FreeStyle 293表达培养基(Gibco)中。在转染当天，细胞以1×106个细胞/m的密度接种到新鲜培养基中。依次加入2μg/ml质粒DNA、2μg/ml线性25kDa聚乙烯亚胺(Polysciences)和OptiPRO SFM培养基(4％终浓度，Thermo Fisher)。在5％CO2存在下，在37℃下以135rpm的轨道振荡搅拌培养瓶。转染后6天，通过离心收集细胞培养基并且通过0.22μm过滤器过滤。将培养基装入HisTrap HP 5ml柱(GE Healthcare)，其使用
Figure BDA0003314514520000781
pure 25(GE Healthcare)。用洗涤缓冲液(20mM咪唑、20mM NaH2PO4、0.5M NaCl，pH 7.4)洗涤柱后，用500mM咪唑(20mM NaH2PO4、0.5M NaCl，pH 7.4)的梯度洗脱蛋白质。使用HiLoadSuperdex 200PG柱(GE Healthcare)用尺寸排阻色谱法进一步纯化洗脱液。所有纯化步骤均在4℃下进行。A3和A3-IL-4的表达使用抗His标签抗体(BioLegend)通过蛋白免疫印迹测定，并且蛋白质通过SDS-PAGE证实为纯度>90％。
3.检测CBP-αTNF或A3-IL4与胶原蛋白的结合
测量如先前(32)所述进行。96孔ELISA板(Greiner Bio One)用I、II和III型人胶原蛋白(PBS、Millipore Sigma各10μg/mL)在37℃包被过夜，然后用含1％BSA的PBS和0.05％Tween 20(PBS-T)在室温下封闭1小时。然后，用PBS-T洗涤孔，并且在室温下进一步与1μM CBP-αTNF、1μM未修饰的αTNF或0-740nM A3-IL4孵育1小时。用PBS-T洗涤3次后，用HRP缀合的抗大鼠IgG抗体检测抗体，室温孵育1小时(Jackson ImmunoResearch)。A3-IL4用抗小鼠IL-4的特异性抗体(R&D Systems)检测。洗涤后，通过测量450nm处的吸光度并且减去570nm处的吸光度，用四甲基联苯胺底物检测结合蛋白。
4.检测A3-IL4与其受体的结合
测量如先前(32)所述进行。96孔ELISA板(Greiner Bio One)用重组小鼠IL-4Rα蛋白(PBS，R&D System中各10μg/mL)在37℃下包被过夜，然后用含1％BSA的PBS和PBS-T在室温下封闭1小时。然后，用PBS-T洗涤孔并且在室温下进一步与0-740nM A3-IL4或IL-4孵育1小时。用PBS-T洗涤3次后，用抗小鼠IL-4的特异性抗体(R&D Systems)检测IL-4。洗涤后，通过测定450nm处的吸光度并且减去570nm处的吸光度，用四甲基联苯胺底物检测结合蛋白。
5.MALDI-TOF MS
抗体通过MALDI-TOF MS(Bruker Ultraflextreme MALDI TOF/TOF)分析。所有光谱均采用采集软件Bruker flexControlTM采集，并且采用分析软件Bruker flexAnalysisTM处理。首先，在作为溶剂的50:50乙腈:1％TFA中制备基质，α-氰基-4-羟基肉桂酸(Sigma-Aldrich)的饱和溶液。然后将PBS中的分析物(5μL,0.1mg/mL)和基质溶液(25μL)混合，并且将1μL的此混合物沉积在MTP 384研磨钢靶板上。使液滴在氮气流中干燥，从而形成均匀的样本/基质共沉淀物。使用高质量线性正模式方法对所有样本进行分析，其中在75％的激光强度下进行2500次激光发射。使用碳酸酐酶、磷酸化酶B和牛血清白蛋白的混合物在三个点外部校准测量值。
6.体内生物分布研究
TNFα抗体(克隆XT3.11、BioXcell)和抗TGF-β抗体(克隆1D11.16.8、BioXcell)与8当量的SM(PEG)24(Thermo Fisher Scientific)在室温下孵育30分钟。使用Zeba旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific)去除过量的SM(PEG)24。然后加入30当量Cy7标记的CBP([Cy7]LRELHLNNNC[COOH])，并且在室温下反应30分钟以缀合到C残基上的巯基部分。肽已由Genscript合成，纯度>95％。未反应的染料通过对PBS的透析去除。对于CBP未缀合的抗体，根据制造商的说明，使用磺基-Cy7 NHS酯(Lumiprobe)标记αTNF和αTGF。根据制造商的说明，使用DyLight 800NHS酯(Thermo Fisher Sientific)标记A3和A3-IL4。当模型小鼠的靶组织发生炎症时，静脉注射10μg至100μg的Cy7标记的WT-αTNF、WT-αTGF、CBP-αTNF和CBP-αTGF或DyLight 800标记的A3和A3-IL4。在以下条件下用Xenogen IVIS成像系统100(Xenogen)收获小鼠器官并且成像：f/stop：2；滤光片激发波长745nm；激发波长800nm；曝光时间：5秒；小分档。
7.小鼠胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)模型
通过在第3天腹膜内注射抗胶原抗体混合物(1.5mg/小鼠，Chondrex)，随后在第0天腹膜内注射LPS(50μg/小鼠，Chondrex)，在雌性Balb/c小鼠(7周龄)中诱导关节炎。在LPS注射当天，小鼠静脉内或背部皮下注射对照IgG(200μg/小鼠)、WT-αTNF(200μg/小鼠)或CBP-αTNF(200μg/小鼠)；或在左后足垫皮下注射有对照IgG(100μg/小鼠)、WT-αTNF(100μg/小鼠)或PlGF-2123-144-αTNF(1μg/小鼠)。如别处所述，每天对关节肿胀进行评分(31)。在第8天，后爪固定在10％中性福尔马林(Sigma-Aldrich)中，在Decalcifer II(Leica)中脱钙，然后提供给组织学分析。
8.实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型
通过在第0天用完全弗氏佐剂(200μg/小鼠，Hooke Laboratories)中的MOG35-55乳液进行免疫，随后在免疫当天和第二天施用PBS中的百日咳毒素(100ng/小鼠)，在雌性C57BL/6小鼠(13周龄)中诱导EAE。在免疫后第14天出现EAE症状时，重组小鼠开始用IL-4(Peprotech)1μg/小鼠或A3-IL4 1μg/小鼠(相当于0.4μg/小鼠，以摩尔计)治疗，每隔一天重复一次。每天根据以下等级对单个小鼠的疾病严重程度进行评分：0、无临床疾病；0.5、尾部无力；1、尾巴麻痹；2、后肢无力；3、后肢麻痹；3.5、前肢无力；4、前肢麻痹；或5、垂死或死亡。
9.炎症性肠病(IBD)的自发性结肠炎模型
IL-10-/-×TLR-4-/-(DKO)小鼠由Cathyn Nagler(The University of Chicago)友情提供。DKO小鼠自发发展结肠炎，并且表现出高发生率的直肠脱垂。在29周龄出现直肠脱垂的第一个迹象时，将小鼠用作发展IBD的小鼠进行成像分析。作为未发展IBD的对照，使用16周龄的DKO小鼠和遗传背景品系(C57BL/6)小鼠。
10.博来霉素诱导的特发性肺纤维化(IPF)模型
在雌性C57BL/6小鼠(9周龄)中通过鼻内滴注生理盐水中的100μg/小鼠博来霉素(Sigma-Aldrich)诱导伴有炎症的肺纤维化。在博莱霉素施用后第7天，当肺部发炎时，将小鼠用于成像分析。
11.I型糖尿病(T1D)的NOD小鼠模型
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠称为T细胞介导的自身免疫性胰岛素依赖型糖尿病的自发模型(37、38)。环磷酰胺可促进NOD小鼠的糖尿病发作(39)。为了成像分析，Balb/c小鼠用作非糖尿病对照，自然发展糖尿病NOD小鼠，糖尿病小鼠通过腹腔注射300mg/kg环磷酰胺(Sigma-Aldrich)来加速。血糖水平用作糖尿病发展的指标。
12.组织学分析和免疫组织化学
将来自CAIA小鼠的石蜡包埋关节组织和来自发展IBD的小鼠的结肠切成5μm厚，并且用H&E和/或PAS染色进行病理分析。关节炎模型的滑膜增生和骨吸收的严重程度根据先前报道的标准进行三级评估(0-2)，并且稍作修改如下：0、软骨和软骨下骨边缘区血管翳正常至最小浸润；1、边缘区轻度至中度浸润伴轻度皮质和髓质骨破坏；2、严重浸润伴关节结构完全或接近完全破坏。将每只小鼠的两只后爪的分数相加(每只小鼠的总分，0-4)。
根据标准程序进行免疫组织染色。简而言之，将切片在0.3％H2O2中孵育20分钟，用PBS缓冲的1％BSA封闭1小时，并且在4℃下与HRP缀合的抗大鼠IgG(JacksonImmunoResearch)孵育过夜，在室温下1小时，并且用二氨基联苯胺显色。
13.统计分析
使用GraphPad Prism软件进行统计分析，认为P<0.05具有统计学显著性。通过重复测量双因素方差分析评估关节炎评分随时间的变化，当认为相互作用显著时，在每个测量时间点使用Dunnett多重比较检验评估数据。为了比较CBP-αTNF与WT-αTNF的疗效，通过Tukey多重比较检验再次分析第8天的数据。对于CAIA模型中的组织学评分，采用Dunnett多重比较检验比较对照IgG注射组和αTNF治疗组之间的差异。
D.参考文献
在整个说明书中提及的以下参考文献和出版物，在它们提供对本文中阐述的那些的示例性程序或其他细节补充的范围内，通过引用具体并入本文。
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实施例2:工程化IL-10的增强淋巴结运输抑制类风湿性关节炎小鼠模型
类风湿性关节炎(RA)是主要的自身免疫性疾病。虽然使用白细胞介素10(IL-10)的临床试验已用作RA的潜在治疗方法，但其治疗效果有限，这可能是由于淋巴器官中的驻留不足，而淋巴器官主要发生抗原识别。在此，本发明人将IL-10设计为与血清白蛋白(SA)融合，而不与和与胶原蛋白结合域(CBD)融合。静脉注射后，SA-IL-10和CBD-SA-IL-10表现出比未修饰的IL-10更长的循环时间；此外，与未修饰的IL-10相比，SA融合导致淋巴结(LN)积累增强。静脉注射SA-IL-10和CBD-SA-IL-10治疗使爪中的免疫细胞组成恢复到正常状态，提高抑制性M2巨噬细胞的频率，并且保护关节形态。静脉注射SA-IL-10和CBD-SA-IL-10显示出与使用抗TNF-α抗体治疗相似的疗效。SA与IL-10的融合是实现LN积累和控制RA的简单但有效的工程策略。
类风湿性关节炎(RA)是自身免疫性疾病，目前通过使用炎症通路抑制剂进行治疗来控制。RA的病理特征是滑膜炎和关节破坏，引起剧烈疼痛和关节功能障碍(1、2)。虽然RA的致病抗原尚未完全阐明，但免疫细胞对胶原蛋白的识别起着关键作用。在RA的进展过程中，自身抗原特异性T细胞、特别是Th17细胞被激活并且产生炎性细胞因子，包括IL-17。关节中的炎性细胞因子例如TNF-α和IL-6，诱导巨噬细胞和中性粒细胞活化，作为炎症反应的介质。这些炎症细胞浸润关节并且引起各种炎症反应，包括激活破坏关节骨骼的破骨细胞(3)。目前RA治疗策略是对症的，考虑到许多炎症细胞因子参与RA进展，各种生物疗法，例如TNF-α的抗体或可溶性受体已开发并且批准用于临床(4)。
作为另一种类型的生物治疗剂，已研究施用抗炎症细胞因子用于治疗RA以诱导全身性抑制炎症或耐受。IL-10就是这样一种抗炎症细胞因子(5-7)，并且已经进行各种尝试以探索基于IL-10的自身免疫性疾病疗法(6-8)。然而，IL-10在自身免疫性疾病中的治疗效果仍然存在争议，可能是因为其循环半衰期短并且全身施用后其生物分布不受控制(8)。
本研究中，本发明人通过如下工程化IL-10：融合血清白蛋白(SA)以提供延长的血液循环，并且融合胶原蛋白结合域(CBD)以提供对发炎部位的结合亲和力，其中增强血管的通透性和将包括胶原蛋白在内的型细胞外基质蛋白暴露于来自血液的蛋白质(16、17)。因此，本发明人推断CBD与SA融合将增加针对SA融合细胞因子的炎症部位靶向。通过这样做，本发明人试图探索增强的血液循环和疾病部位脉管系统靶向是否协同改善IL-10对RA的治疗效果。然而，本发明人观察到，SA与IL-10融合不仅延长循环时间，而且还增加淋巴结(LN)中的积累。此处，使用小鼠中被动胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)模型和活性CIA模型，评估工程化IL-10对关节炎的抑制作用。本发明人发现，CBD融合增强发炎爪中的积累，而且SA与IL-10融合增强静脉注射后IL-10向LN的运输。SA融合的IL-10显著改善IL-10在两种小鼠RA模型中的抗炎症作用，其功能类似于TNF-α阻断。
A.白蛋白融合的IL-10与FcRn和APC结合并且在LN内积累
重组表达野生型(wt)小鼠IL-10、SA融合小鼠IL-10和CBD-SA融合IL-10，融合蛋白的分子量相应高于wt IL-10，其由SDS-PAGE确定；此外，大部分SA-IL-10和CBD-SA-IL-10在非还原条件下作为单体存在(图8A和图14A)。表面等离子体共振(SPR)分析表明SA-IL-10和CBD-SA-IL-10与新生儿Fc受体(FcRn)以微摩尔级Kd结合(图8B和图14B)。此外，CBD-SA-IL-10显示以纳摩尔级的Kd结合I型和III型胶原蛋白(图14B)。通过流式细胞术进一步评估这些蛋白质与脾细胞和从腘窝LN分离的单细胞的结合能力(图8C)。SA融合的IL-10在脾细胞和LN衍生细胞两者中均表现出对巨噬细胞和树突细胞的高度结合。静脉注射荧光标记的SA-IL-10后，与wt IL-10相比，在腘窝LN中观察到显著更高的荧光信号(图8D)。有趣的是，更高的荧光信号位于高内皮小静脉(HEV)周围，其中抗原呈递细胞(APC)驻留(18)。
B.白蛋白融合的IL-10显示血液循环延长，CBD融合导致发炎爪中的积聚
已知SA通过FcRn介导的血管内皮细胞循环显示长循环(19、20)。如预期的，与wtIL-10相比，SA-IL-10显示出显著延长的血液循环；CBD-SA-IL-10也具有与SA-IL-10相当的循环(图9A)。图9B代表静脉注射有DyLight800标记的蛋白质的小鼠主要器官的荧光信号。SA-IL-10和CBD-SA-IL-10在心脏、肺和脾脏中显示出比wt IL-10更高的信号，反映它们的长循环特性。此外，CBD-SA-IL-10治疗的小鼠发炎爪检测到的信号明显高于wt IL-10，而非发炎爪表现出的荧光在wt IL-10和CBD-SA-IL-10之间没有显著差异，表明CBD-SA-IL-10通过胶原亲和力的炎症靶向能力，如先前在其他情况下的研究中报道的(16、21)。
C.白蛋白融合的IL-10抑制关节炎的发展
评估工程化IL-10在被动胶原抗体诱发关节炎(CAIA)模型中的治疗效果(图10)。静脉注射SA-IL-10或CBD-SA-IL-10显著抑制关节炎的发展，而注射PBS或wt IL-10的小鼠爪中表现出严重炎症(图10A)。将CBD-SA-IL-10的治疗效果与用抗TNF-α抗体(αTNF-α)治疗进行比较，一种临床上用于治疗RA的抗体药物的小鼠模型，其中CBD-SA-IL-10诱导的CAIA抑制与αTNF-α相当(图10B)。组织学分析显示与PBS-或wt IL-10治疗相比，CBD-SA-IL-10和αTNF-α两者抑制关节破坏(图10C)。由于用CBD-SA-IL-10和αTNF-α治疗，组织学评分也显著降低(图10C)。还研究施用途径对治疗效果的影响，比较静脉内、局部(足底)和皮下(远距离、中背部)施用(图10D)。与图10A和图10B所示的静脉注射结果相比，CBD-SA-IL-10的足底注射对CAIA诱发相对较高的抑制作用，表明CBD-SA-IL-10通过胶原亲和力保留在发炎爪(图8B)。引人注目的是，SA-IL-10通过所有测试的施用途径对CAIA显示出相当高的抑制作用(图10D)。
作为第二种关节炎模型，活性胶原诱导关节炎(CIA)模型用于评估CBD-SA-IL-10和SA-IL-10对RA的治疗。与PBS治疗的CIA小鼠相比，CBD-SA-IL-10显著抑制临床评分的增加(图11A)，其治疗效果与αTNF-α治疗相当。关节的组织学和组织学评分也显示CBD-SA-IL-10抑制关节炎的形成(图11B)。重要的是，用CBD-SA-IL-10治疗的10只小鼠中有5只显示评分为1或更低，表明CBD-SA-IL-10的治疗效果高。在没有CBD结构域的情况下，与PBS相比，向CIA小鼠单次注射SA-IL-10诱发显著抑制关节炎的形成(图11C)。如组织学和组织学所示，大多数用PBS治疗的小鼠在爪处表现出严重的炎症(图11D)。相比之下，SA-IL-10治疗的小鼠在爪中表现出与幼稚小鼠几乎相同的状态，并且大多数小鼠表现出1或更低的组织学评分。总之，这些结果表明局部或静脉注射CBD-SA-IL-10并且甚至皮下注射SA-IL-10对炎症具有高度抑制作用。
D.白蛋白融合的IL-10在LN内积累后降低免疫活性
SA融合的IL-10对FcRn具有微摩尔亲和力(图8B)并且在静脉注射后在LN内积累(图8D)。接着，定量评估IL-10在LN中的含量及其药代动力学(图12A至图12C)。在CAIA小鼠体内静脉注射wt IL-10、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10后，使用ELISA检测不同时间点的LN中IL-10的浓度。与wt IL-10和CBD-SA-IL-10相比，在注射后4小时，SA-IL-10在关节引流(腘窝)LN、肠系膜LN中显示出显著更高的IL-10信号，在非引流(宫颈)LN中显示出相对较高的信号，CBD-SA-IL-10显示出比wt IL-10更高的积累(图12A)。SA-IL-10注射的小鼠也在注射后约1小时显示出LN中的IL-10浓度的峰值(图12B)，并且比wt IL-10高5-10倍的AUC(图12C)。这些数据表明，SA-IL-10在静脉注射后立即在LN内积累，并且与wt IL-10相比，在LN中的保留更高。
LN中SA-IL-10的高浓度和AUC可影响LN和其他次级淋巴器官中各种免疫细胞的表型。因此，通过流式细胞术分析脾和腘窝LN中的免疫细胞群(图15)。静脉注射SA-IL-10诱导脾中CD3+T细胞和CD45+淋巴细胞的频率显著降低(图15A)。此外，与PBS或wt IL-10相比，注射SA-IL-10后CD86+树突状细胞、粒细胞髓源性抑制细胞(G-MDSC)和CD86+M1巨噬细胞的频率降低，CD206+M2巨噬细胞的频率增加。在腘窝LN中观察到类似的趋势(图15B)。这些数据表明SA-IL-10抑制APC的活性并且同时激活免疫抑制性M2巨噬细胞。LN中APC的失活和IL-10的高积累可抑制Th17细胞的活性，这在RA的发展中起关键作用(22、23)。本发明人测量在LN中在关节引流(腘窝)和非引流(宫颈)LN中的Th17相关细胞因子(IL-17、IL-6和TGF-β)：与用wt IL-10、IL-17治疗相比，在腘窝LN中通过SA-IL-10治疗后显著降低，但通过CBD-SA-IL-10没有统计学显著性，并且宫颈LN中的水平没有通过IL-10变体统计学降低(图12D和图12E)。通过SA-IL-10的治疗降低GM-CSF在腘窝LN中的浓度，而wt IL-10没有(图12F)。
E.白蛋白融合的IL-10抑制爪中的炎症反应
接着，使用流式细胞术分析后爪中的免疫细胞群(图13A)。静脉注射SA-IL-10或CBD-SA-IL-10后，与PBS-或wt IL-10治疗组相比，CD45+免疫细胞的频率显著降低。在CD45+细胞内，B细胞和树突状细胞的频率变得与健康小鼠的水平相当，并且CD11b+细胞也显著降低至健康小鼠的水平。CD11b+细胞中，G-MDSC数量减少，巨噬细胞频率恢复到健康小鼠水平。此外，与PBS或wt IL-10治疗相比，注射SA-IL-10显著增加CD206+M2巨噬细胞的频率，甚至超过健康小鼠。爪中T细胞群的分析显示SA-IL-10抑制CAIA小鼠中CD4+细胞和Foxp3+Treg的变化(图16A)。此外，SA-IL-10抑制血液中Treg频率的降低(图16B)。反映免疫细胞群的这些变化，静脉注射SA-IL-10或CBD-SA-IL-10在爪中的各种炎性细胞因子显著降低，其水平与健康小鼠相当(图13B)。从组织学分析来看，与PBS治疗的小鼠相比，静脉施用SA-IL-10显著抑制爪中的炎症反应，并且减少关节病理(图13C)。
F.白蛋白融合IL-10显示在注射后无毒性
最后，进行安全性评估以调查工程化IL-10是否表现出任何不利影响。血液学分析仪测量的代表性血液参数和脾脏重量在治疗组之间没有显示任何显著变化(图17A)。还使用生化分析仪研究血清中的各种生化标志物(图17B)。对于工程化的IL-10治疗组中，除了淀粉酶(没有增加，而是略有下降)外，大多数标志物与PBS治疗组相比显示出相似的水平，表明工程化IL-10在全身施用后具有高的安全性。
G.讨论
目前对RA的治疗是基于对症治疗，通过缓解疼痛、控制滑膜炎和抑制关节损伤。中和炎性细胞因子、特别是TNF-α的抗体药物或竞争性可溶性受体，为RA患者提供高的治疗效果(4)。这些生物治疗药物主要作用于发炎的关节以捕获炎性细胞因子。然而，已知这些抑制性药物增加感染的风险，因为它们的靶点在免疫功能方面是多效性的，并且这些药物反复施用以在疾病部位提供抗炎症作用(24-27)。此外，抗体药物的施用还可引起中和抗药抗体的诱导，从而降低治疗效率(28)。因此，需要开发具有结构不同的分子类别和具有不同免疫抑制分子机制如耐受性的替代方法。
此处，本发明人探索通过使用工程化IL-10增强淋巴结运输来治疗RA的新方法，工程化IL-10是代表性的抗炎症细胞因子，将RA相关免疫细胞的表型调节至免疫抑制状态。已进行使用重组IL-10治疗包括RA在内的自身免疫性疾病的临床试验(6-8、29)。IL-10的缺点之一是其在血液中的半衰期短(8)。此处，本发明人将SA与IL-10基因融合，以延长其在血液中以及次级淋巴器官中的保留时间。此外，为了增强微血管系统具有高渗透性的炎症部位的结合，本发明人基因融合源自血液蛋白血管性血友病因子的CBD(16、17)。本发明人评估SA-IL-10和CBD-SA-IL-10两者，与wt IL-10相比，在两种模型中改善关节炎。CAIA是巨噬细胞和中性粒细胞介导的急性RA模型，而CIA是T细胞介导、特别是Th17介导的RA模型。鉴于RA在临床上是异质性疾病，并且模型相互补充，在两个模型中显示SA融合的IL-10抑制疾病的严重程度令人鼓舞。SA与IL-10的融合对于获得显著的治疗效果至关重要，这与临床上常用的治疗方法用αTNF-α抗体治疗相当。此外，据本发明人所知，该研究首次显示IL-10在CAIA模型中的治疗效果。
与wt IL-10相比，SA与IL-10融合导致静脉注射后LN内的积累增强，并且在LN中长时间保持高IL-10浓度(图12A)。迄今为止，LN运输SA或白蛋白结合纳米颗粒主要通过皮内或皮下施用实现，其中LN通过注射部位收集淋巴管下游的输入淋巴管进入(30-33)。在炎症细胞因子的生物分布研究的背景下，一篇论文显示在静脉注射到脾脏、肝脏和LN后，人SA融合的IL-2高度定位，其中存在表达IL-2受体的T细胞，但这种高度定位的确切机制尚未阐明(34)。此处，本发明人揭示静脉注射后SA融合的IL-10向LN中的运输增强，其中SA通过血管系统进入LN。CBD-SA-IL-10在LN中的积累比SA-IL-10少，这可能是由于与其他组织中的胶原结合。SA-IL-10和CBD-SA-IL-10对FcRn均表现出高结合亲和力(微摩尔Kd，正如预期的那样)(图8B和图14B)，其通过血管内皮细胞中表达的FcRn介导的循环对两种蛋白均提供延长的血液循环性能(图9A)。通过FcRn的IgG胞吞转运(从基底侧回到管腔侧)循环是公认的现象，而最近报道SA的相同现象(19、20)。此处，在LN中，分子运输看来是在另一个方向，从管腔到基底侧。有趣的是，组织学分析揭示SA-IL-10在LN的HEV周围的积累(图8D)。需要进一步的实验来揭示增强LN积累的更详细机制以及与FcRn的关系，例如LN积累分析使用突变SA融合的IL-10以消除FcRn结合。
SA-IL-10显示出与APC的高度结合(图8B)。在LN内积累后，SA-IL-10分子被驻留在LN内的APC吸收，导致抑制树突状细胞和M1巨噬细胞的活性和诱导M2巨噬细胞(图15)。M2巨噬细胞可改变LN中Th0细胞向Treg细胞的分化命运(35)。此外，LN中高浓度IL-10的免疫抑制环境可导致巨噬细胞向M2表型的进一步极化和Th17分化的抑制(36、37)，导致本发明人观察到的LN中IL-17、GM-CSF或其他细胞因子的减少(图12D和图12F)。GM-CSF是作为致病性Th17标志物的细胞因子，其抑制性抗体目前正在临床试验中进行测试(38)。因此，SA-IL-10治疗后GM-CSF的减少表明关节引流LN中的免疫激活降低。据报道，Th17细胞表达IL-10受体，并且IL-10结合抑制IL-17的表达和分泌(14、36)。因为Th17细胞抗原识别主要发生在淋巴组织中，SA-IL-10可直接与Th17细胞结合抑制IL-17通路。LN的这些变化也抑制免疫细胞、特别是G-MDSC和巨噬细胞向爪的浸润(图13A)，并且还诱导M2巨噬细胞的增加(图13A)，导致炎性细胞因子的减少(图13B)和抑制关节炎症(图10、图11和图13C)。
SA-IL-10在通过任何测试途径施用即静脉内、皮下(在远处)或足垫(局部)注射后诱导高抗炎症反应，表明SA-IL-10可在通过局部注射部位引流淋巴管摄取后全身进入LN，并且通过淋巴管通过胸导管返回体循环。皮下注射的高治疗效果表明SA-IL-10具有特殊的临床益处。静脉注射CBD-SA-IL-10还显示出对CAIA和CIA发展的抑制作用，其可与抗TNF-α抗体相当，抗TNF-α抗体是目前RA的标准生物治疗剂。然而，CBD-SA-IL-10的治疗效果低于使用SA-IL-10观察到的治疗效果，这对应于CBD-SA-IL-10的低LN运输(图12A)。CBD-SA-IL-10渗透到发炎组织后可在此与胶原蛋白结合，导致向发炎爪的积聚(图9B)，但这种胶原蛋白亲和力可干扰CBD-SA-IL-10的LN运输(16、39)。因此，SA融合是用于制备工程细胞因子以实现增强的LN运输的简单但有效的方法。
这项研究中，SA与IL-10的融合实现LN内的持久性增加，其中与自身免疫相关的免疫识别发展并且持续存在。结果，SA-IL-10抑制RA进展的主要炎症途径，但不抑制多效性炎症细胞因子例如TNF-α。此外，SA-IL-10在初步安全性评估中没有表现出任何显著的毒性(图17)。SA-IL-10在CIA和CAIA模型中均表现出显著的治疗效果。因此，数据表明SA-IL-10在临床应用中抑制RA的潜力，并且本发明人的发现更广泛地表明在其他自身免疫和炎症疾病中通过系统性致耐受性操纵LN来调节免疫的能力。
H.小鼠wt IL-10、SA-IL-10和CBD-SA-IL-10的氨基酸序列
Figure BDA0003314514520000931
I.材料和方法
1.研究设计
本研究旨在测试通过对FcRn的工程亲和力将抗炎症细胞因子靶向LN的策略。具体而言，本发明人在RA小鼠模型中测试通过血清白蛋白融合靶向抗炎症细胞因子IL-10的LN是否优于非靶向的wt IL-10和目前可用的抗炎症抗体治疗剂(αTNF-α)。为了评估wt IL-10、SA-IL-10和抗TNF-α抗体的功效，本发明人在被动CAIA模型和主动CIA模型中对关节炎症状和关节组织学进行评分。本发明人还测量生物分布和LN运输、LN和爪子内的免疫反应以及治疗后毒性的各个方面。统计方法不用于预先确定必要的样本大小，但基于试点试验的估计选择样本大小使得适当的统计试验会获取统计学上显著的结果。wt IL-10、SA-IL-10和CBD-SA-IL-10的生产由多个个体进行以确保可重复性。所有实验至少重复两次。对于动物研究，在第一次注射药物之前，将小鼠随机分为笼子内的治疗组，并且以相同方式进行治疗。用于计算统计量的n值在图例中指明。以盲法方式进行药物施用和病理分析。“统计分析”部分描述统计方法。
2.重组蛋白的生产和纯化
合成编码不含前肽的小鼠血清白蛋白(全血清白蛋白的25个至608个氨基酸)、小鼠IL-10、人VWF A3结构域残基Cys1670-Gly1874(成熟VWF的907-1111，本文称为CBD)和(GGGS)2接头的序列并且亚克隆到由Genscript提供的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)中。在C-末端添加编码6His的序列以进一步纯化重组蛋白。悬浮适应的HEK-293F细胞常规维持在无血清FreeStyle293表达培养基(Gibco)中。在转染当天，将细胞以1×106个细胞/mL的密度接种到新鲜培养基中。依次加入2μg/mL质粒DNA、2μg/mL线性25kDa聚乙烯亚胺(Polysciences)和OptiPRO SFM培养基(4％终浓度，Thermo Fisher)。在5％CO2存在下，在37℃下以135rpm的轨道摇动来搅动培养瓶。转染后7天，通过离心收集细胞培养基并且通过0.22μm过滤器过滤。将培养基装入HisTrap HP 5mL柱(GE Healthcare)，其使用
Figure BDA0003314514520000941
pure25(GE Healthcare)。用洗涤缓冲液(20mM NaH2PO4、0.5M NaCl，pH 8.0)洗涤柱后，用500mM咪唑(在20mM NaH2PO4、0.5M NaCl，pH 8.0)的梯度洗脱蛋白质。使用HiLoad Superdex200PG柱(GE Healthcare)使用PBS作为洗脱液，通过尺寸排阻色谱进一步纯化蛋白质。所有纯化步骤均在4℃下进行。通过SDS-PAGE证实表达的蛋白质纯度>90％。通过HEK-Blue TLR4报告细胞系测试纯化蛋白质的内毒素，证实内毒素水平小于0.01EU/mL。使用NanoDrop(Thermo Scientific)通过280nm处的吸光度确定蛋白质浓度。
3.检测与胶原蛋白和FcRn的结合
SPR测量使用Biacore X100仪器进行。在胶原蛋白结合实验中，重组人I型或III型胶原蛋白(Millipore Sigma)通过标准胺偶联方法(约1500共振单位(RU))固定在CM5传感器芯片上，并且用乙醇胺封闭。参考细胞也用乙醇胺封闭。结合试验在室温下进行，CBD-SA-IL-10的Kd值通过使用BIAevaluation软件(GE Healthcare)将1:1Langmuir结合模型拟合到数据来确定。在FcRn结合实验中，重组小鼠FcRn(Acro Biosystems)根据制造商的说明通过胺偶联固定在C1芯片(GE Healthcare)上约200RU。SA-IL-10或CBD-SA-IL-10在运行缓冲液(0.01M无水磷酸二氢钠，pH 5.8、0.15M NaCl)中以递减浓度在室温下以30μL/min流动。对于每个循环，传感器芯片都用PBS，pH 7.4再生。SA融合蛋白与FcRn的特异性结合通过与用作参考的非功能化通道进行比较来计算。SA-IL-10和CBD-SA-IL-10的Kd值通过使用BIAevaluation软件(GE Healthcare)将1:1Langmuir结合模型拟合到数据来确定。
4.小鼠
从杰克逊实验室获得7周龄的BALB/c雌性小鼠和8周龄的DBA/1J雄性小鼠。实验在芝加哥大学机构动物护理和使用委员会的批准下进行。
5.蛋白质与脾细胞或LN衍生细胞的结合
通过70-μm细胞过滤网轻轻破坏脾脏和腘窝LN，获得单细胞悬液。红细胞用脾细胞的ACK裂解缓冲液(Quality Biological)裂解。细胞计数并且重悬于补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素(均来自Life Technologies)的RPMI-1640中。1×105个细胞/孔接种在96孔微孔板中，并且用2μg/100μL SA、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10在冰上孵育30分钟。PBS洗涤4次后，将细胞与抗小鼠白蛋白抗体(abcam)在冰上进一步孵育20分钟。PBS洗涤3次后，将细胞与1μg/mL AlexaFluor 647标记的抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch)、抗B220(RA3-6B2、BioLegend)、抗CD3(145-2C11、BD Biosciences)、抗CD4(RM4-5、BD Biosciences)、抗CD8(53–6.7、BD Biosciences)、抗CD11c(HL3、BD Biosciences)、抗CD45(30-F11、BDBiosciences)和抗F4/80(T45-2342、BD Biosciences)抗体在冰上孵育20分钟。如下所述通过流式细胞术分析细胞。
6.蛋白质的血浆药代动力学
将IL-10、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10(相当于35μg IL-10)静脉注射到雌性BALB/c小鼠体内。在注射后1分钟、5分钟、10分钟和30分钟，以及1小时、4小时、8小时和24小时，将血样收集在低蛋白结合管中，然后在4℃下孵育过夜。根据制造商的方案，通过IL-10小鼠未包被ELISA试剂盒(Invitrogen)测量血清中的IL-10浓度。指数两相衰减(Y＝Ae-αt+Be-βt)拟合用于计算半衰期。快速清除半衰期，t1/2,α；缓慢清除半衰期，t1/2,β。使用Prism软件(v8、GraphPad)分析数据。
7.CAIA模型
在雌性BALB/c小鼠中，在第0天通过腹腔注射抗胶原抗体混合物(1.0mg/小鼠，Chondrex)，然后在第3天腹腔注射LPS(25μg/小鼠，Chondrex)，诱导关节炎。仅对于图3B-C，注射1.5mg/小鼠的抗胶原抗体混合物。第3天，小鼠经静脉、皮下(中背部)或足垫注射有PBS、wt IL-10、SA-IL-10、CBD-SA-IL-10(各自相当于43.5μg IL-10)或200μg大鼠抗小鼠TNF-α抗体(克隆XT3.11、Bio X Cell)，然后注射LPS。根据制造商的方案(Chondrex)每天对关节肿胀进行评分。在评分的最后一天，将后爪固定在10％中性福尔马林(Sigma-Aldrich)中，在Decalcifer II(Leica)中脱钙，然后提供组织学分析。将石蜡包埋的爪切成5μm厚并且用H&E染色。用全景数字载玻片扫描仪扫描图像并且用全景查看器软件进行分析。关节炎模型的滑膜增生和骨吸收的严重程度根据先前报道的标准进行三级评估(0-2)，并且稍作修改如下：0、软骨和软骨下骨边缘区血管翳正常至最小浸润；1、边缘区轻度至中度浸润伴轻度皮质和髓质骨破坏；2、严重浸润伴关节结构完全或接近完全破坏。将每只小鼠的两只后爪的分数相加(每只小鼠的总分，0-4)。以盲法方式进行组织病理学分析。
8.CIA模型
雄性DBA/1J小鼠(8周龄)用牛胶原/完全弗氏佐剂(CFA)乳剂(Hooke Kit,HookeLaboratories)在尾根部皮下注射来免疫。三周后，进行加强注射牛胶原/不完全弗氏佐剂(IFA)乳剂(Hooke Kit,Hooke Laboratories)。加强注射后，每天检查小鼠，并且根据制造商的方案(Hooke Laboratories)对关节肿胀进行评分。当总评分为2-4时(定义为第0天)，小鼠静脉注射有PBS、SA-IL-10、CBD-SA-IL-10(各自相当于43.5μg IL-10)，或200μg大鼠抗小鼠TNF-α抗体(克隆XT3.11、Bio X Cell)。最后一天评分时，收集后爪并且采用如上所述的组织学分析。
9.体内生物分布研究
为了制备荧光标记的蛋白质，wt IL-10、SA-IL-10和CBD-SA-IL-10与8倍摩尔过量的DyLight 800NHS酯(Thermo Fisher)在室温下孵育1小时，并且根据制造商的说明，通过Zebaspin旋转柱(Thermo Fisher)去除未反应的染料。BALB/c小鼠在第0天腹腔注射抗胶原抗体混合物(1.0mg/小鼠)，随后在第3天将10μg LPS注射至右后爪。第二天，静脉注射20μgDyLight 80标记的蛋白质。4小时后，在以下条件下使用Xenogen IVIS成像系统100(Xenogen)对从疾病模型中采集的器官进行成像：f/stop：2；滤光片激发波长745nm；激发波长800nm；曝光时间：5秒；小分档。称重每个器官以标准化来自每个器官的荧光信号。
10.LN显微镜
BALB/c小鼠静脉注射有DyLight594标记的wt IL-10(43.5μg)或SA-IL-10标记的等摩尔量染料。注射后24小时，收获腘窝LN并且在最佳切割温度(OCT)下在干冰中冷冻。通过冷冻切片获得组织切片(10μm)。组织在室温下用含2％多聚甲醛的PBS固定15分钟。用PBS-T洗涤后，将组织用PBS-T中的2％BSA在室温下封闭1小时。组织用抗小鼠CD3抗体(1:100、145-2C11、BioLegend)或抗小鼠外周淋巴结地址蛋白(PNAd)抗体(1:200、MECA79、BioLegend)和Alexa Fluor 488驴抗大鼠(1:400、Jackson ImmunoResearch)染色。将组织洗涤3次，然后用ProLong金抗褪色封固剂覆盖4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；ThermoFisher Scientific)。对于CD3染色使用IX83显微镜(Olympus)以10x的放大倍率成像，对于PNAd染色使用Leica SP8 3D激光扫描共聚焦显微镜以20x的放大倍率成像。图像使用ImageJ软件(NIH)进行处理。
11.LN药代动力学
将wt IL-10、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10(各自相当于35μg IL-10)静脉注射到CAIA小鼠体内。在注射后30分钟、1小时、4小时、8小时和24小时收集腘窝、肠系膜、宫颈LN，随后使用Lysing Matrix D和FastPrep-24 5G(MP Biomedical)以5000次/分钟的速度在T-PER组织蛋白提取试剂(Thermo Scientific)与cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche)中匀浆40秒。匀浆后，样本在4℃下孵育过夜。将样本离心(5000g，5分钟)，并且分别使用BCA检测试剂盒(Thermo Fisher)和IL-10小鼠未包被ELISA试剂盒(Invitrogen)分析总蛋白浓度和IL-10浓度。同时，使用小鼠未包被ELISA试剂盒(Invitrogen)或Ready-SET-Go！ELISA试剂盒(eBioscience)根据制造商的方案测量LN提取物中的细胞因子水平。为了检测GM-CSF，将wt IL-10或SA-IL-10(各自相当于35μg IL-10)以3天的间隔静脉注射两次到CAIA小鼠中。最后一次注射后的第二天，收集腘窝淋巴结用于检测GM-CSF。
12.流式细胞术
CAIA小鼠静脉注射有PBS、wt IL-10、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10(各自相当于43.5μg IL-10)。八天后，采集血液和后爪。用ACK裂解缓冲液(Quality Biological)裂解血液中的红细胞，然后进行抗体染色以进行流式细胞术。爪在补充有2％FBS、2mg/mL胶原酶D和40μg/mL DNase I(Roche)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中在37℃下消化60分钟。通过70μm细胞过滤网轻轻破碎获得单细胞悬液。使用针对以下分子的抗体：抗小鼠CD3(145-2C11,BD Biosciences)、CD4(RM4-5,BD Biosciences)、抗小鼠CD8α(53–6.7,BDBiosciences)、抗小鼠CD25(PC61,BD Biosciences)、抗小鼠CD45(30-F11,BDBiosciences)、CD44(IM7,BD Biosciences)、CD62L(MEL-14,BD Biosciences)、PD-1(29F.1A12,BD Biosciences)、NK1.1(PK136,BD Biosciences)、Foxp3(MF23,BDBiosciences)、F4/80(T45-2342,BD Biosciences)、MHC II(M5/114.15.2、BioLegend)、CD206(C068C2、BioLegend)、Ly6G(1A8、BioLegend)、Ly6C(HK1.4、BioLegend)、CD11b(M1/70、BioLegend)、CD11c(HL3,BD Biosciences)、B220(RA3-6B2、BioLegend)。使用FixableViability Dye eFluor455(eBioscience)根据制造商的说明进行可固定的活/死细胞区分。如无特殊说明，进行冰上染色20分钟，细胞内染色使用Foxp3染色试剂盒根据制造商说明书(BioLegend)进行。洗涤步骤后，细胞用特异性抗体在冰上染色20分钟，然后固定。所有流式细胞术分析均使用Fortessa(BD Biosciences)流式细胞仪进行，并且使用FlowJo软件(Tree Star)分析。
13.安全性评估
BALB/c小鼠静脉注射有PBS、wt IL-10、SA-IL-10或CBD-SA-IL-10(各自相当于43.5μg IL-10)。注射后两天，收集小鼠血样，使用COULTER Ac·T 5diff CP血液分析仪(Beckman Coulter)根据制造商的说明进行分析。还测量脾重。使用生物化学分析仪(AlfaWassermann Diagnostic Technologies)根据制造商的说明分析从注射蛋白质的小鼠收集的血清样本。
14.统计分析
使用Prism软件(v8、GraphPad)确定实验组之间的统计学显著差异。在使用单因素方差分析、然后Tukey的HSD事后检验的情况下，通过Brown-Forsythe检验发现组间差异相似。对于非参数数据，使用Kruskal-Wallis检验，然后使用Dunn多重比较检验。对于单个比较，使用双尾学生t检验。符号*、**、***和****分别表示P值小于0.05、0.01、0.001和0.0001；ns，没有显著性。
J.参考文献
在整个说明书中提及的以下参考文献和出版物，在它们提供对本文中阐述的那些的示例性程序或其他细节补充的范围内，通过引用具体并入本文。
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实施例3：白蛋白融合的IL-4通过FcRn在次级淋巴器官中的长期驻留改善实验性自身免疫性脑脊髓炎
多发性硬化症(MS)是常见并且严重的中枢神经系统脱髓鞘性自身免疫性疾病。尽管白介素(IL)-4抑制小鼠MS模型、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中病理学的发展，但IL-4尚未在临床上得到转化。此处，本发明人设计血清白蛋白(SA)和IL-4(SA-IL-4)的融合蛋白，以靶向主要发生抗原特异性T细胞启动的次级淋巴器官(SLO)。与野生型(wt)IL-4相比，SA-IL-4通过新生儿Fc受体(FcRn)结合在淋巴结(LN)和脾脏中显示出更长的积累和停留时间。与FTY720和wt IL-4相比，SA-IL-4的皮下施用阻止所有小鼠的EAE疾病发展，并且显示出更高的治疗效果。SA-IL-4阻止免疫细胞浸润到脊髓中，促进脊髓结构的维持和由此产生的神经功能。SA-IL-4降低抗原反应性CD4+T细胞中的整合素表达，表明细胞迁移能力受损。SA-IL-4增加在脊髓引流LN(dLN)中粒细胞样髓源性抑制细胞(一种关键的EAE疾病抑制因子)的数量和程序性死亡配体-1上的表达。SA-IL-4降低Th17细胞的数量，EAE疾病的致病细胞群。在EAE的慢性期，SA-IL-4也表现出显著的治疗效果，同时抑制免疫细胞向脊髓浸润，完全消除对脾脏髓鞘抗原的免疫反应。工程化SA-IL-4通过在SLO中的积累证明MS作为预防和治疗处理的转化前景。
多发性硬化症(MS)是潜在的致残性自身免疫性疾病，影响全球数百万人。自身反应性免疫细胞驻留在中枢神经系统(CNS)中，导致脱髓鞘，从而对白质造成局灶性损伤(1)。浸润到CNS中的淋巴细胞和巨噬细胞会导致轴突损伤。最近研究表明，在次级淋巴器官(SLO)中激活的Th17细胞迁移到脊髓和大脑，并且在MS的疾病发展和严重程度中发挥关键作用(20)。因此，抑制淋巴细胞迁移到CNS和在SLO中诱导免疫抑制微环境将为MS提供有效的治疗方法。FTY720和抗整合素α4抗体在临床上用于抑制淋巴细胞迁移(3,4)。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是被广泛接受的MS小鼠模型，反映疾病进展和发展机制的许多特征，包括淋巴细胞迁移到CNS和脱髓鞘。
A.SA-IL-4与免疫细胞结合并且抑制Th17分化
本发明人重组表达野生型(wt)小鼠IL-4和小鼠SA-融合小鼠IL-4(图18A)。SDS-PAGE揭示SA与IL-4融合使分子大小增加。当添加到来自LN和脾脏的新鲜分离的免疫细胞时，与其他免疫细胞相比，SA-IL4在体外优先结合抗原呈递细胞(APC)，例如巨噬细胞和树突细胞(DC)(图18B)。
IL-4受体在受刺激时在T细胞上表达(12)。SA-IL-4诱导T细胞中STAT6的下游磷酸化，EC50比wt IL-4高32倍。这表明wt IL-4在体外比SA-IL-4更有活性(图18C)。本发明人发现wt IL-4和SA-IL-4均抑制在Th17细胞分化培养基中培养的幼稚CD4+T细胞的Th17分化(图18D)。总之，结果表明本发明人成功制备出具有功能活性的SA-IL-4融合蛋白。
SA-IL-4在LN和脾脏中增加血液半衰期和SLO的持久性
表面等离子共振(SPR)分析表明SA-IL-4与FcRn结合的解离常数(KD)为385nM(图19A)。静脉(iv)注射SA-IL-4后血浆半衰期显著延长，与在几分钟内从血浆中清除的wt IL-4形成鲜明对比(图19B)。本发明人接着测试静脉注射的SA-IL-4是否使用幼稚小鼠在脾脏和LN中积聚。SA-IL-4在静脉注射后显著增加腰椎和肱动脉LN以及脾脏中IL-4的量(图2cd)。基于荧光的生物分布分析还显示，与wt IL-4相比，腰椎LN中SA-IL-4的积累增强(图24)。为了测试FcRn在LN的SA-IL-4积累中的参与，本发明人在与IL-4的融合中使SA的P573K点突变，这消除FcRn结合(图25A)(13)。与SA-IL-4相比，SA(P573K)突变降低了LN中IL-4的量，下降至wt IL-4相似的水平(图19E)。SA(P573K)-IL-4由于分子大小增加而具有比wtIL-4更长的血液半衰期，但由于FcRn结合受损而具有比SA-IL-4更短的血液半衰期(图25B)。总之，这些数据表明SA运输到LN需要FcRn结合。
静脉注射SA-IL-4后，LN的组织学显示与wt IL-4相比，腰椎LN中SA-IL-4的信号增加。SA-IL-4特别定位于包膜下空间，不与CD3+T细胞共定位(图19G)。更高的放大倍率显示SA-IL-4部分与高内皮场所共定位，这由外周节点地址蛋白+(PNAd+)细胞指示(19H)。脾脏中SA(P573K)-IL-4的量低于SA-IL-4(图19F)。总之，本发明人已表明SA与IL-4融合通过FcRn结合增加IL-4在LN和脾脏中的持久性。
B.SA-IL-4治疗在预防性治疗中大幅抑制EAE疾病的发展
本发明人接着在EAE急性期用SA-IL-4处理髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗原诱导的EAE(图20)。皮下注射(s.c.)或腹膜内注射(i.p.)SA-IL-4。本发明人选择皮下注射，因为临床上方便并且药物从注射部位吸收缓慢。腹膜内注射是作为静脉注射的替代完成的，因为在已发展EAE的小鼠中尾巴变得松弛，因此尾静脉注射变得困难。本发明人进一步比较SA-IL-4与FTY720的治疗效果，FTY720是临床批准的治疗MS的药物(芬戈莫德)，该药物在淋巴结中隔离淋巴细胞并且防止它们与靶组织中的自身抗原反应(3)。SA的皮下注射-IL-4完全抑制所有小鼠的疾病发展(图20A、图20B)。腹膜内注射的SA-IL-4和FTY720阻止7只小鼠中的4只发展EAE，并且抑制其余小鼠的疾病严重程度。与PBS治疗组相比，Wt IL-4治疗未显示EAE临床评分抑制，所有这些小鼠均发展疾病。使用体重变化作为健康的临床指标，观察到用PBS和wt IL-4治疗的小鼠体重显著减轻(图20C)。皮下注射有SA-IL-4的小鼠体重增加超过所有其他组，表明健康状况良好。腹膜内注射的SA-IL-4组平均体重增加，而FTY720治疗的小鼠保持其体重。本发明人接着分析脊髓脱髓鞘，这是EAE疾病的主要形态学表现(图20D)。重要的是，皮下注射有SA-IL-4的小鼠没有任何可检测到的脱髓鞘，表明防止脊髓损伤。所有wt IL-4治疗的小鼠都表现出脱髓鞘。然后，本发明人长期监测小鼠，直到第24天，其中SA-IL-4腹膜内注射抑制疾病的发展和进展(图26)。重要的是，SA(P573K)-IL-4没有抑制疾病评分(图27)。这些数据表明SA与IL-4的融合大幅提高IL-4关于EAE疾病抑制的治疗效果。
C.SA-IL-4治疗抑制免疫细胞浸润到脊髓并且在dLN中诱导免疫抑制环境
本发明人接着分析治疗后脊髓和dLN中的免疫细胞。引人注目的是，皮下注射SA-IL-4显著抑制免疫细胞浸润到CNS；在脊髓内检测到非常少的CD45+免疫细胞(图21A)。因此，在皮下注射SA-IL4的治疗组中几乎检测不到脊髓中的Th17细胞(图21B)。腹膜内注射SA-IL-4抑制7只小鼠中的4只的免疫细胞浸润，这与该组中EAE疾病的发生率相对应。如预期的，FTY720的施用还抑制免疫细胞浸润到脊髓中。与PBS治疗相比，wt IL-4对包括Th17在内的免疫细胞浸润到脊髓没有任何影响。
然后，本发明人分析腰椎dLN中的免疫细胞。SA-IL-4增加粒细胞样髓源性抑制细胞(G-MDSCs)，但减少单核细胞样MDSC(M-MDSC)(图21C和图21D)。与FTY720治疗相比，SA-IL-4治疗(腹膜内和皮下注射)也降低dLN中CD4+T细胞中Th17细胞的频率(图21E)。与PBS组相比，FTY720治疗趋于增加dLN中Th17细胞的频率，可能因为FTY720抑制抑制淋巴细胞从LN中流出。SA-IL-4治疗降低dLN中M1巨噬细胞的频率并且增加M2巨噬细胞(图21F)。Wt IL-4没有降低M1巨噬细胞的频率，但增加M2巨噬细胞。保持CD11b+细胞内巨噬细胞的频率(图28A)，以及CD45+细胞内DC的频率(补充图4b)。据报道，B细胞通过促进T细胞的再激活来促进诱导EAE(14)。与PBS和FTY720两者治疗组相比，SA-IL-4(皮下注射)降低B细胞的频率(图21H)。总之，这些数据表明，SA-IL-4治疗在dLN中产生免疫抑制环境并且防止免疫细胞浸润到脊髓。
D.SA-IL-4治疗降低抗原反应性CD4+T细胞上的IL-17相关细胞因子和整合素表达
本发明人接着分析脊髓中免疫细胞浸润减少和通过皮下注射SA-IL-4完全预防EAE疾病的分子机制。本发明人发现，dLN中MOG35-55反应性T细胞的数量在所有治疗组中均保持不变，表明SA-IL-4不改变抗原识别(图22A)。因此，发明人假设SA-IL-4改变T细胞功能。本发明人首先测试T细胞的迁移能力。据报道，IL-4降低(16)αLβ2和α4β1整合素的表达水平，即淋巴细胞迁移的关键黏附分子(15)。本发明人发现SA-IL-4治疗显著降低αLβ2整合素在MOG35-55反应性CD4+T细胞上的表达，但在总CD8+T细胞上没有表达(图22B-E)。CD4+T细胞，无论是在总CD8+T细胞上。因为αLβ2整合素对于Th17细胞浸润到脊髓中是必不可少的(15)，这表明下调整合素表达是SA-IL-4减少淋巴细胞向脊髓迁移的机制之一。
本发明人然后测试T细胞上的PD-1表达和MDSC上的PD-L1表达(图22F至图22K)，因为PD-1和PD-L1联合抑制T细胞活化(17)。引人注目的是，SA-IL-4而不是wt IL-4增加中枢记忆CD4+T细胞和中枢记忆CD8+T细胞上PD-1的表达(图22F和图22G)。此外，SA-IL-4而不是wt IL-4增加PD-1的表达水平和表达PD-L1的细胞在M-MDSC和G-MDSC两者上的频率(图22H至图22K)。这些数据表明T细胞抑制可通过MDSCs和PD-1/PD-L1轴来诱导。
本发明人接着分析Th17相关蛋白表达。IL-23是Th17功能的关键细胞因子。据报道，IL-4与APC结合并使IL-23和一致的Th17分化沉默(18)。本发明人发现SA-IL-4治疗降低MOG35-55反应性T细胞库中IL-23R+细胞的频率(图22L)。
本发明人接着用MOG蛋白重新刺激脾细胞(图22M,N)。培养物上清液的ELISA显示与PBS相比，用SA-IL-4治疗而不是wt IL-4治疗降低IL-17A表达(图22M)。IL-17表达的降低意味着SA-IL-4治疗组中MOG35-55反应性Th17细胞的数量和/或活性水平降低。IFNγ浓度保持不变，表明SA-IL-4对Th1细胞的影响很小(图22N)。SA-IL-4趋向于降低GM-CSF水平，GM-CSF据报道是EAE的致病细胞因子(19)(图22O)。本发明人接着在脾细胞的MOG35-55肽再刺激后通过流式细胞术检测T细胞内的细胞因子表达(图22P)。本发明人分析GM-CSF、IL-17、IFNγ和TNFα，它们都是EAE的致病细胞因子。与其他治疗相比，SA-IL-4降低CD4+T细胞区室中细胞因子表达细胞的频率。这些结果明显表明，与其他治疗组相比，SA-IL-4治疗的小鼠中的Th17细胞的致病性越来越少。总之，这些数据表明SA-IL-4调节SLO中的多种免疫细胞反应，并且通过阻止免疫细胞浸润，特别是T细胞浸润到脊髓中来抑制EAE疾病的发展。
E.SA-IL-4恢复在慢性期因EAE导致的瘫痪
为了确定SA-IL-4在EAE的慢性期是否具有治疗效果，本发明人设计涉及治疗已经达到严重瘫痪阶段的小鼠的实验。本发明人从诱导后第21天起开始腹膜内注射IL-4(图23A、图23B)。引人注目的是，即使在这个较晚的时间点施用，SA-IL-4而不是wt IL-4显示治疗功效。SA-IL-4而不是wt IL-4治疗的小鼠体重增加，表明疾病恢复。本发明人接着通过皮下注射测试SA-IL-4在慢性期中的作用，并且与口服FTY720治疗相比较(图23C和图23D)。结果，与其他治疗组相比，SA-IL-4治疗的小鼠临床评分趋于下降。与其他组相比，接受SA-IL-4治疗的小鼠体重增加。与PBS治疗的小鼠相比，FTY720和wt IL-4治疗的小鼠体重没有增加。
本发明人接着通过流式细胞术在诱导后第34天测试免疫细胞浸润到脊髓中(图23E至图23G)。与PBS和wt IL-4治疗相比，SA-IL-4和FTY720治疗降低脊髓浸润免疫细胞的数量，包括CD4+T细胞和MOG35-55反应性Th17细胞。与其他治疗组相比，SA-IL-4减少脾脏中MOG35-55反应性CD4+T细胞内表达IL-23R的细胞(图23H)。最后，用MOG蛋白进行脾细胞再刺激。培养上清液的ELISA显示，与PBS相比，SA-IL-4治疗组中IL-17A和GM-CSF浓度降低，但在wt IL-4和FTY720治疗后没有降低(图23I和图23J)。MOG35-55肽再刺激后的流式细胞分析表明，与其他治疗相比，SA-IL-4降低CD4+T细胞区室中细胞因子表达细胞的频率(图23K)。总之，这些结果表明SA-IL-4治疗对EAE慢性期具有有效的治疗效果。
F.SA-IL-4在全身注射后未表现出明显的毒性
为了测试SA-IL-4是否表现出任何副作用，本发明人使用生化分析仪分析血清，使用血液学分析仪分析血液(图29)。SA-IL-4治疗没有增加器官损伤标志物也没有改变血细胞计数(图29A至图29M)。SA-IL-4和wt IL-4诱导性脾肿大(图29N)。Wt IL-4诱导肺水肿，表现为肺中水含量增加，而SA-IL-4则没有(图29N)。这些证据表明SA-IL-4在全身施用后是安全的。
尽管目前临床上有多种MS治疗方法，但该疾病仍然没有得到很好解决。一些有效的疗法，例如使用FTY720(芬戈莫德)和抗α4整合素(那他珠单抗)抑制效应淋巴细胞浸润到病变组织中，这与免疫相关不良事件的风险相关(20)。IFNβ通过多种机制发挥作用，包括减少淋巴细胞迁移到CNS(21)。尽管IFNβ不如芬戈莫德有效(22)，但临床上使用IFNβ来调节MS的病理学(23)。此处，本发明人寻求探索一种疗法，其可将免疫反应从已知参与疾病病理学的Th17途径转变为使用IL-4的更具耐受性的表型，而不会产生副作用。此处，本发明人利用分子工程方法将IL-4靶向SLO，以改善对髓鞘抗原的潜在自身免疫反应。
这项研究中，皮下注射SA-IL-4阻止所有测试小鼠中EAE的发展。引人注目的是，SA-IL-4在早期和晚期时间点均通过治疗显著减少淋巴细胞浸润到脊髓中。dLN的分析表明，SA-IL-4增加M2巨噬细胞和G-MDSC，以及减少Th17细胞。然而，wt IL-4也增加M2巨噬细胞的数量，表明在这些实验条件下，IL-4介导的炎症巨噬细胞抑制不足以控制EAE。
据报道，IL-4维持并且增加MDSCs的免疫抑制特性(24)。G-MDSC是抑制EAE发展的关键群体(17)。G-MDSC表达PD-L1以诱导T细胞的功能抑制。另一方面，SA-IL-4治疗减少M-MDSC。M-MDSC对EAE的作用是有争议的，并且已报道致病作用(25)。有趣的是，SA-IL-4而不是wt IL-4增强PD-L1在SLO中G-MDSC和M-MDSC上的表达。同时，SA-IL-4而不是wt IL-4增强PD-1在SLO中CD4+和CD8+中央记忆T细胞上的表达。本发明人假设这种PD-1/PD-L1诱导作用是SA-IL-4治疗小鼠中的MDSC抑制致病性T细胞的机制，并且在SLO中观察到的这种现象证明SA融合赋予的SLO靶向能力的价值。
Th17细胞在EAE疾病的严重程度和发展中起着至关重要的作用(26)。与FTY720治疗相比，SA-IL-4治疗降低dLN中Th17细胞的频率。IL-4直接抑制幼稚T细胞分化为Th17细胞，如本发明人在图18D中所示。此外，可能存在通过APC介导的Th17抑制途径。IL-23由APC表达(26)并且产生致病性Th17细胞和诱导IL-17的表达(27)。据报道，IL-4通过使APC中的IL-23沉默来降低IL-17的表达(18)。因此，可能是SA-IL-4作用于APC以降低IL-23表达，从而阻止SLO中的致病性Th17细胞的产生。该模型与本发明人的数据一致，即SA-IL-4降低GM-CSF+介导的T细胞致病性，因为GM-CSF+是致病性Th17细胞的标志物。
此外，SA-IL-4治疗导致MOG反应性CD4+T细胞区室中的整合素表达降低。尽管免疫小鼠在治疗前已产生抗MOG反应，但SA-IL-4能够阻止自身免疫细胞迁移到CNS中。因此，SA-IL-4治疗并未改变抗原反应性T细胞的数量，而是使T细胞功能失活。总体而言，该数据表明SA-IL-4通过多种免疫途径在SLO中产生免疫抑制环境。
FTY720是FDA批准的抵抗MS药物之一，通过诱导淋巴细胞减少发挥作用，从而限制效应淋巴细胞向CNS疾病部位的迁移。这项研究中，皮下注射SA-IL-4显示出比FTY720更高的功效。SA-IL-4的这种改进是其临床转化潜力的有力证据。FTY720的缺点是它不能施用至受感染的患者。此外，在已批准的调节淋巴细胞迁移的MS疗法中，例如FTY720和整合素α4阻断，约翰·坎宁安病毒(JCV)活性的诱导可导致进行性多灶性白质脑病(PML)，最终可导致严重的不良事件，包括死亡。SA-IL-4仅降低抗原反应性CD4+T细胞上的整合素表达，但不降低CD8+T细胞上的整合素表达。这表明SA-IL-4对抗原反应性CD4+T细胞具有另外的迁移抑制作用，这可有助于抑制脊髓中的炎症。血液学研究表明，SA-IL-4不诱导淋巴细胞减少。这可以是超过已批准药物的另外优势，因为预计SA-IL-4不会强烈抑制针对传染病的免疫反应，因此SA-IL-4可对那些不适应用FTY720治疗的患者有用。SA-IL-4可能通过各种机制抑制自身免疫，这些机制与当前疗法无关。这项研究中，FTY720没有抑制dLN中Th17的发展，而SA-IL-4则抑制dLN中Th17的发展。因此，SA-IL-4可对当前治疗未获得足够治疗效果的患者有用。
皮内注射或皮下注射SA已很好地研究在注射部位-引流LN中的积聚(28)。此处，本发明人表明SA-IL-4在静脉注射后积聚在LN中，即来自血液而不是通过输入淋巴管。尽管先前对SA融合IL-2的生物分布研究表明，通过静脉注射，IL-2在脾脏、肝脏和LN中积累，但LN中的分子机制及其定位尚不清楚。组织学分析表明静脉注射的SA-IL-4在高内皮小静脉(HEV)周围积累并且共定位(30)。尽管通过FcRn的IgG转胞吞作用已得到很好研究，但直到最近，多个研究小组才报道通过FcRn结合的白蛋白转胞吞作用(31-33)。因为FcRn在LN中高度表达(34)，很可能静脉注射的SA-IL-4通过胞吞作用运输到LN。本研究中，SA(P573K)-IL-4实现与SA-IL-4相比在LN中的IL-4量低，类似于wt IL-4。这会表明FcRn结合在SA-IL-4从血液转运到LN中起重要作用。根据本发明人对SA-IL-4集中在APC所在的髓质腔周围的观察，本发明人假设SA-IL-4通过HEV进入，然后与DC和巨噬细胞结合，如本发明人在图18中所示。SA(P573K)-IL-4在图27中没有抑制疾病评分，这表明FcRn结合和随后增加的SLO持久性对于抑制EAE疾病症状至关重要。因此，本发明人认为SA-细胞因子融合免疫抑制分子的作用主要不是通过延长血液循环时间，而是通过延长SLO例如LN和脾脏中的循环时间。因此，SA融合细胞因子可被一个免疫细胞收集并且通过该细胞循环以刺激另一个免疫细胞。因此，血液循环寿命与SLO存在寿命没有直接关系。本发明人认为，该生物学发现可开辟LN分子运输的新研究领域，进一步研究将阐明详细的机制。
SA-IL-4在EAE的慢性期表现出治疗功效。先前已报道IL-4的鼻腔或腰部施用导致IL-4与神经元直接结合，以尝试在EAE中再生神经系统(9)。腹膜内注射SA-IL-4的治疗效果与先前报告中鼻腔施用wt IL-4的治疗效果相当。这表明SA-IL-4也可与神经元结合并且诱导再生。因为在EAE模型中血脑屏障被破坏，SA-IL-4可进入脊髓内的神经元。在未来研究中研究SA-IL-4对神经再生的直接影响将会很有趣。
SA-IL-4的皮下施用显示出比腹膜内注射更高的预防效果。该途径便于临床转化，通常显示从组织中缓慢释放。本发明人假设这种缓慢释放是抑制EAE发展的进一步促成因素。
全身注射SA-IL-4在血液生化分析和血液学分析中未表现出明显毒性。尽管本发明人已观察到脾肿大，但这通常是暂时的并且不认为是严重的毒性。wt IL-4诱导肺水肿，这将更令人担忧。然而，使用SA-IL-4未观察到肺水肿；这种差异可以是因为SA-IL-4对STAT6激活的活性减弱。这些结果表明在临床中通过SA-IL-4施用诱发不良事件的风险较低。
总之，工程化SA-IL-4通过FcRn结合证明在SLO中的持久性。SA-IL-4在全身注射后对EAE的多个阶段显示出显著的治疗效果，并且它调节EAE的关键免疫途径，例如减少Th17细胞和增加SLO中MDSC的G-MDSC和PD-L1表达。SA-IL-4通过利用不同于目前批准疗法的机制的新型生物学方法在预防和治疗用途中具有转化潜力。
G.wt IL-4和SA-IL-4的氨基酸序列
Figure BDA0003314514520001121
H.材料和方法
1.重组蛋白的生产和纯化
合成编码不含前肽的小鼠SA(全血清白蛋白的25至608个氨基酸)、小鼠IL-4和(GGGS)2接头的序列，并且亚克隆到由Genscript提供的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)。在C-末端添加编码6His的序列以进一步纯化重组蛋白。蛋白质的氨基酸序列见补充表1。悬浮适应的HEK-293F细胞常规维持在无血清FreeStyle 293表达培养基(Gibco)中。在转染当天，细胞以1×106个细胞/ml的密度接种到新鲜培养基中。依次添加2μg/ml质粒DNA、2μg/ml线性25kDa聚乙烯亚胺(Polysciences)和OptiPRO SFM培养基(4％终浓度，ThermoFisher)。在5％CO2存在下，在37℃下以135rpm的轨道摇动来搅动培养瓶。转染后7天，通过离心收集细胞培养基并且通过0.22μm过滤器过滤。将培养基装入HisTrap HP 5ml柱(GEHealthcare)，其使用
Figure BDA0003314514520001131
pure 25(GE Healthcare)。用洗涤缓冲液(20mM NaH2PO4、0.5MNaCl，pH 8.0)洗涤柱后，用500mM咪唑梯度(在20mM NaH2PO4、0.5M NaCl，pH 8.0)洗脱蛋白质。使用HiLoad Superdex 200PG柱(GE Healthcare)，使用PBS作为洗脱液，通过尺寸排阻色谱法进一步纯化蛋白质。所有纯化步骤均在4℃下进行。通过SDS-PAGE证实表达的蛋白质纯度>90％。通过HEK-Blue TLR4报告细胞系检测纯化蛋白的内毒素，证实内毒素水平低于0.01EU/ml。使用NanoDrop(Thermo Scientific)通过280nm处的吸光度确定蛋白质浓度。
2.小鼠
8周龄的C57BL/6雌性小鼠获自Charles River Laboratories。免疫前将小鼠圈养在芝加哥大学动物设施中至少1周。所有实验均得到芝加哥大学机构动物护理和使用委员会的批准。
3.蛋白质与脾细胞或LN衍生细胞的结合
通过70-μm细胞过滤网轻轻破坏脾脏或腘窝淋巴结，获得单细胞悬液。红细胞用脾细胞的ACK裂解缓冲液(Quality Biological)裂解。细胞计数并且重悬于补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素(均来自Life Technologies)的RPMI-1640中。将1×105个细胞/孔接种在96孔微孔板中，并且用2μg/100μl SA、SA-IL4在冰上孵育30分钟。用PBS洗涤4次后，将细胞与兔单克隆抗小鼠血清白蛋白抗体(克隆EPR20195 abcam)进一步在冰上孵育20分钟。PBS洗涤3次后，将细胞与1μg/ml AlexaFluor 647标记的抗兔IgG、抗B220、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD11c、抗CD45和抗F4/80抗体在冰上孵育20分钟。如下所述通过流式细胞术分析细胞。
4.通过流式细胞术分析STAT6磷酸化
使用EasySep小鼠CD4+T细胞分离试剂盒(干细胞)从C57BL/6小鼠的脾脏中纯化小鼠CD4+T细胞。纯化的CD4+T细胞(106个细胞/ml)在预包被有5μg/ml抗CD3抗体(克隆17A2、Bioxcell)的六孔板中活化并且补充有可溶性2μg/ml抗CD28抗体(克隆37.51、BioLegend)2天。培养基为含有10％热灭活FBS、1％青霉素/链霉素和50μM 2-巯基乙醇(Sigma Aldrich)的IMDM(Gibco)。培养2天后，用50ng/ml重组小鼠IL-2刺激活化的CD4+T细胞(Peprotech)3小时以诱导IL-4Rα表达。用IL-2刺激后，洗涤细胞并且在新鲜培养基中静置3小时。然后将细胞转移到96孔板中(50000个细胞/孔)。在37℃下将指定量的wt IL-4或SA-IL-4施加到CD4+T细胞持续15分钟以诱导STAT6磷酸化。细胞立即使用BD Phosflow Lyse/Fix缓冲液在37℃固定10分钟，然后在冰上用BD Phosflow Perm缓冲液III透化30分钟。细胞用AlexaFluor 647抗pSTAT6抗体(克隆J71-773.58.11，BD)染色，识别Tyr641的磷酸化。在黑暗中在室温(RT)下进行染色1小时。在BD LSR上获得细胞并且使用FlowJo(Treestar)分析数据。将pSTAT6+群体的平均荧光强度(MFI)对细胞因子浓度作图。使用Prism(v8，GraphPad)拟合剂量-反应曲线。
5.表面等离子体共振(SPR)
使用Biacore X100 SPR系统(GE Healthcare)进行SPR测量。根据制造商的说明，通过胺偶联将小鼠FcRn重组蛋白(Acro Biosystems)固定在C1芯片(GE Healthcare)上约200个共振单位(RU)。SA-IL4在运行缓冲液(0.01M无水磷酸二氢钠，pH 5.8，0.15M NaCl)中以降低的浓度以30μl/min流动。对于每个循环，传感器芯片都用PBS，pH 7.4再生。SA融合蛋白与FcRn的特异性结合通过与用作参考的非功能化通道进行比较来计算。使用BIAevaluation软件(GE Healthcare)将实验结果与Langmuir结合动力学拟合。
6.Th17细胞体外在培养物中分化
根据制造商的说明，使用EasySepTM小鼠幼CD4+T细胞分离试剂盒(STEMCELLTechnologies)从脾细胞中分离幼稚CD4+T细胞。将105个细胞接种于96孔板中并且培养3天。作为Th17诱导培养基，
通过IL-17Ready-Set-Go！小鼠未包被ELISA试剂盒(Invitrogen)根据制造商的方案测量培养基中的IL-17A浓度。使用Prism软件(v6,GraphPad)分析数据。
7.蛋白质的血浆药代动力学
将Wt IL-4或SA-IL-4(相当于10μg IL-4)静脉注射到雌性C57BL/6小鼠中。在注射后1分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和24小时，将血样收集在蛋白质低结合管中。通过IL-4Ready-Set-Go！小鼠未包被ELISA试剂盒(Invitrogen)根据制造商的方案，测量血浆中的IL-4浓度。
8.蛋白质的淋巴结和脾脏药代动力学
将Wt IL-4、SA-IL-4或SA(P573K)-IL-4(相当于40μg IL-4)静脉注射到健康的C57BL/6小鼠体内。在注射后1小时、4小时和24小时收集腰椎和肱动脉LN和脾脏，随后在T-PER组织蛋白提取试剂(Thermo Scientific)与cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche)中以5000次/分钟的速度使用Lysing Matrix D和FastPrep-24 5G(MP Biomedical)匀浆40秒。匀浆后，样本在4℃下孵育过夜。将样本离心(5000g，5分钟)，并且分别使用BCA检测试剂盒(Thermo Fisher)和IL-4小鼠未包被ELISA试剂盒(Invitrogen)分析总蛋白浓度和IL-4浓度。同时，使用小鼠未包被ELISA试剂盒(Invitrogen)或Ready-SET-Go！ELISA试剂盒(eBioscience)根据制造商的方案，测量LN提取物中的细胞因子水平。
9.LN中基于荧光的IL-4检测
为了制作荧光标记wt IL-4和SA-IL-4，蛋白质与8倍摩尔过量的DyLight800NHS酯(Thermo Fisher)在室温下孵育1小时，并且通过Zebaspin旋转柱(Thermo Fisher)根据制造商的说明去除未反应的染料。向幼稚C57BL/6小鼠静脉注射10μg DyLight 800标记的具有等效荧光的wt IL-4和SA-IL-4。4小时后，使用Xenogen IVIS成像系统100(Xenogen)在以下条件下对髂骨LN成像：f/stop：2；滤光片激发波长745nm；激发波长800nm；曝光时间：5秒；小分档。
10.免疫荧光
如上所述，用DyLight 594NHS酯(Thermo Fisher)对Wt IL-4和SA-IL-4进行荧光标记。静脉注射荧光标记的IL-4(wt IL-4为40μg，SA-IL-4的荧光量相同)后1小时，将小鼠处死。收获小鼠LN并且在PBS中的2％PFA中固定过夜，用PBS洗涤。在30％蔗糖溶液中孵育过夜后，将LN包埋入最佳切削温度化合物中。然后，使用低温恒温器切割5μm冰冻切片。然后在室温下用PBS中的2％BSA封闭切片，并且在室温下用以下一抗孵育2小时：10μg/ml仓鼠抗小鼠CD3ε抗体(克隆：145-2C11,BioLegend)和2.5μg/ml大鼠抗小鼠PNAd(克隆：MECA-79,BioLegend)抗体。用PBS-T洗涤后，将组织在室温下染色1小时，使用以下荧光标记的二抗：Alexa Fluor 647山羊抗仓鼠(1:400,Jackson ImmunoResearch)和Alexa Fluor 488驴抗大鼠(1:400,Jackson ImmunoResearch)。将组织洗3次，然后用ProLong金抗褪色封固剂与4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Thermo Fisher Scientific)覆盖。对于CD3染色使用IX83显微镜(Olympus)以10X放大倍率成像，而对于PNAd染色使用Leica SP8 3D激光扫描共聚焦显微镜以20X放大倍率成像。使用ImageJ软件(NIH)处理图像。
11.EAE模型
用完全弗氏佐剂(CFA)中的MOG35-55乳液在背侧皮下对9至12周龄的C57BL/6年轻雌性小鼠进行免疫，然后在免疫当天第一次、然后在第二天再次腹膜内注射PBS中的百日咳毒素(PTX)。MOG35-55/CFA乳液和PTX购自Hooke Laboratories。第一次免疫后，监测EAE的严重程度，并且从免疫后第8天起每天测量临床评分。临床评分由A.I.、M.N.或A.S.基于胡克实验室对治疗分组盲法的标准来确定。在100μl PBS中、每隔一天腹膜内或皮下(在鼠标背部)施用IL-4、SA-IL-4、PBS。每天口服施用FTY720(1mg/kg体重)。
12.脊髓组织学
收获EAE小鼠的胸椎和腰椎，并且在胸腰椎交界处切下。组织在2％PFA中固定过夜。PBS洗涤后，组织使用脱钙剂II(Leica Biosystem)脱钙过夜。然后，将组织包埋在石蜡中。石蜡包埋后，将块切成5mm的切片。脱蜡和复水后，组织切片用靶向修复液(S1699、DAKO)处理，并且在温度>95℃的蒸锅中加热20分钟。组织切片与抗小鼠aMBP、abcam ab40390)在室温在湿度室中一起孵育1小时。TBS洗涤后，将组织切片与生物素化的抗大鼠IgG(10mg/mL、Vector laboratories)在室温下孵育30分钟。抗原抗体结合采用Elite试剂盒(PK-6100、Vector Laboratories)和DAB(DAKO、K3468)系统检测。载玻片由EVOS FL Auto(LifeTechnologies)成像。
13.流式细胞术
EAE小鼠每隔一天、免疫后8天开始用PBS、wt IL-4或SA-IL-4(相当于10μg IL-4)处理。免疫后第13天、17天或34天，收获脊髓、脾脏和腰椎LN。脊髓组织在补充有2％FBS、2mg/ml胶原酶D(Sigma-Aldrich)和40μg/ml DNase I(Roche)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中在37℃下消化30分钟。通过70μm细胞过滤网轻轻破碎，获得单细胞悬液。对于脾脏，用ACK裂解缓冲液(Quality Biological)裂解血液中的红细胞，然后进行流式细胞术的抗体染色。使用针对以下分子的抗体：抗小鼠CD3ε(145-2C11,BD Biosciences)、CD4(RM4-5,BD Biosciences)、抗小鼠CD8α(53-6.7,BD Biosciences)、抗小鼠CD45(30-F11,BDBiosciences)、CD44(IM7,BD Biosciences)、CD62L(MEL-14,BD Biosciences)、F4/80(T45-2342,BD Biosciences)、CD86(GL1,BD Biosciences)、CD206(C068C2、BioLegend)、Ly6G(1A8、BioLegend)、Ly6C(HK1.4、BioLegend)、CD11b(M1/70、BioLegend)、CD11c(HL3,BDBiosciences)、B220(RA3-6B2、BioLegend)、PD-1(29F.1A12),BD Biosciences)、PD-L1(MIH7、BioLegend)、IL-23R(O78-1208,BD Biosciences)、整合素整合素αL(HI111,BDBiosciences)、整合素β2(M18/2,BD Biosciences)、整合素β1(HMb1-1,BD Biosciences)、整合素α4(R1-2,BD Biosciences)、GM-CSF(MP1-22E9,BD Biosciences)、IL-17(TC11-18H10.1、BD Biosciences)、IFNγ(XMG1.2,BD Biosciences)、TNFα(eBioscience,MP6-XT22)和RoRγt抗体(Q31-378,BD Biosciences)。对于检测识别MOG的T细胞，使用T-SelectI-Ab MOG35-55四聚体-PE(MBL International Corporation)或MOG38-49四聚体-PE(NIHTetramer Core Facility)。根据制造商的说明，使用Fixable Viability Dye eFluor 455(eBioscience)、Live/Dead Fixable Violet(eBioscience)或Live/Dead Fixable Aqua(eBioscience)对可固定的活/死细胞进行区分。在冰上进行染色20分钟。对于细胞内染色，使用Cytofix/Cytoperm(BD Bioscience)在4℃下固定细胞20分钟。对于透化，使用perm/wash缓冲液(BD Bioscience)，细胞在perm/wash缓冲液中在4℃下染色30分钟。洗涤步骤后，细胞在固定前在冰上用特异性抗体染色20分钟。所有流式细胞术分析均使用Fortessa(BD Biosciences)流式细胞仪进行，并且使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。
14.脾细胞的再刺激
从dLN和脾脏产生单细胞悬液。为了分析细胞因子的产生，将5x105个淋巴细胞和2x106个脾细胞接种在96孔圆底板中。用10μM MOG35-55肽(Genscript)刺激细胞。2小时后，按照制造商的方案添加GolgiPlug(brefeldin A)和GolgiStop(Monensin)以阻断细胞内细胞因子的分泌。添加GolgiPlug和GolgiStop后4小时，将细胞染色用于流式细胞术。对于固定，在4℃下使用Cytofix/Cytoperm(BD Bioscience)持续20分钟。对于透化，使用perm/wash缓冲液(BD Bioscience)，细胞在perm/wash缓冲液中在4℃下染色30分钟。对于3天的再刺激，将2.5x105个淋巴细胞或1x106个脾细胞接种在96孔圆底板中。用10μM MOG35-55(培养6小时，然后流式细胞术)或100μg/ml MOG蛋白(培养72小时)(Anaspec)刺激细胞。72小时后，收集上清液通过ELISA，使用Ready-Set-Go！试剂盒(Invitrogen)或LEGEND MAX小鼠GM-CSFELISA试剂盒(BioLegend)分析。
15.SA-IL-4的安全性评估
C57BL/6小鼠静脉注射有PBS、wt IL-4或SA-IL4(相当于10μg IL-4)。两天后，使用COULTER Ac·T 5diff CP血液分析仪(Beckman Coulter)根据制造商的说明分析从小鼠采集的血样。收获肺和脾脏并且称重。使用FreeZone 6台式冻干机(Labconco)在冷冻干燥过夜之前和之后通过称重测定肺中的水含量。使用生物化学分析仪(Alfa WassermannDiagnostic Technologies)根据制造商的说明分析从PBS、wt IL-4和SA-IL-4注射的小鼠收集的血清样本。
16.统计分析
使用Prism软件(v6,GraphPad)确定实验组之间的统计学显著差异。在使用单因素方差分析和Tukey的HSD事后检验的情况下，通过Brown-Forsythe检验发现组间差异相似。对于单个比较，使用双尾学生t检验。符号*和**分别表示P值小于0.05和0.01。
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尽管上文已经以一定程度的特定性或者参考一个或多于一个单独的实施方案描述了某些实施方案，但是本领域技术人员可在不脱离本发明范围的情况下对所公开的实施方案做出多种改变。此外，在适当的情况下，上述任何实施例的方面可与所描述的任何其他实施例的方面组合以形成具有相当或不同的特性并且解决相同或不同的问题的其他实施例。类似地，应理解，上述益处和优点可涉及一个实施方案或可涉及多个实施方案。对专利出版物或其他出版物的任何引用本文具体都是通过引用该出版物的公开内容并入。权利要求不应解释为包括手段加功能或步骤加功能的限制，除非在给定权利要求中分别使用短语“手段”或“步骤”明确叙述这种限制。

Claims (53)

1.一种组合物，其包含与细胞外基质(ECM)亲和肽可操作地连接的抗炎剂。
2.一种组合物，其包含与血清蛋白可操作地连接的抗炎剂。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗炎剂包含抗炎抗体。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述抗炎抗体包含特异性靶向TNF-α、IL-1、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-12、IL-17A、IL-18、IFN-γ、GM-CSF、CD3、CD20、VLA-4、VLA-5、VCAM-1、TGF-β1、α4-整合素、α4β7-整合素、结缔组织生长因子、血小板衍生生长因子、纤溶酶原激活物抑制剂-1或胰岛素样生长因子结合蛋白的抗体。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述抗体是人源化或嵌合抗体。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中所述抗体包含阿达木单抗、赛妥珠单抗、英夫利西单抗、戈利木单抗、托珠单抗、利妥昔单抗、乌司奴单抗、那他珠单抗、维多珠单抗、苏金单抗或伊赛珠单抗。
7.根据权利要求4或6所述的组合物，其中所述抗炎剂包含抗TNF-α抗体。
8.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述抗炎剂包含抗炎细胞因子多肽。
9.根据权利要求2或8所述的组合物，其中所述细胞因子多肽包含来自IL-4、IL-1ra、IL-5、IL-10、IL-11、IL-23、IL-35、IL-36ra、IL-37、干扰素-β、TGF-β1、TNF受体I和TNF受体II的多肽。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述细胞因子多肽包含来自IL-4的多肽。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述细胞因子多肽包含来自IL-10的多肽。
12.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述抗炎剂包含来自CD200的多肽。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中CD200多肽包含CD200的胞外域。
14.根据权利要求1或3至11中任一项所述的组合物，其中ECM亲和肽包含胶原蛋白结合结构域。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述多肽包含来自核心蛋白聚糖或血管性血友病因子(VWF)的胶原蛋白结合结构域。
16.根据权利要求1或3至10中任一项所述的组合物，其中ECM亲和肽包含来自胎盘生长因子-2(PlGF-2)或CXCL-12γ的肽。
17.根据权利要求1或3至16中任一项所述的组合物，其中ECM亲和肽包含与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:52之一具有至少85％同一性的肽，或与SEQID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:52之一的片段具有至少85％同一性的肽。
18.根据权利要求1或3至17中任一项所述的组合物，其中与细胞外基质(ECM)亲和肽可操作地连接的抗炎剂还包含与肽或抗炎剂可操作地连接的血清蛋白。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述血清蛋白与所述肽可操作地连接。
20.根据权利要求2或19所述的组合物，其中所述血清蛋白与所述肽通过肽键可操作地连接。
21.根据权利要求2或18至20中任一项所述的组合物，其中所述血清蛋白包括白蛋白。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物包含邻近血清白蛋白的胶原蛋白结合结构域氨基-氨基和邻近所述血清白蛋白的IL-10多肽羧基。
23.根据权利要求1或3至21中任一项所述的组合物，其中所述肽与所述抗炎剂共价连接。
24.根据权利要求1或3至23中任一项所述的组合物，其中所述肽与所述抗炎剂通过双功能接头交联。
25.根据权利要求1或3至23中任一项所述的组合物，其中所述肽与所述抗炎剂通过肽键连接。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的组合物，其中肽与所述抗炎剂或细胞因子多肽的比率是约1:1至5:1。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含与细胞外基质(ECM)亲和肽可操作地连接的第二抗炎剂。
28.一种用于治疗对象的自身免疫性或炎症性病症的方法，其包括向所述对象施用根据权利要求1至27中任一项所述的组合物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述自身免疫性或炎症性病症包括炎症性肠病、特发性肺纤维化、多发性硬化症、1型糖尿病、克罗恩病、牛皮癣、急性炎症、慢性炎症、神经炎症、关节炎、类风湿性关节炎、纤维化、感染、过敏、炎症治疗相关的不良事件和炎症治疗相关的炎症性疾病。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述自身免疫性或炎症性病症包括多发性硬化症。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述自身免疫性或炎症性病症包括类风湿性关节炎。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述组合物进行全身施用。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述组合物通过静脉注射施用。
34.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述组合物进行局部施用。
35.根据权利要求34所述的方法，其中将所述组合物施用至炎症部位或邻近炎症部位。
36.根据权利要求28至35中任一项所述的方法，其中包含与所述肽可操作地连接的抗炎剂的组合物的施用剂量小于不用所述肽下施用的抗炎剂的最小有效剂量。
37.根据权利要求28至35中任一项所述的方法，其中包含与所述肽可操作地连接的抗炎剂的组合物的施用剂量小于在不用肽下通过相同施用途径施用的抗炎剂的最小有效剂量。
38.根据权利要求37所述的方法，其中与所述肽可操作地连接的抗炎剂的施用剂量比不用肽下施用的抗炎剂的最小有效剂量小至少10％。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中所述对象先前用抗炎剂、抗炎疗法或自身免疫疗法治疗过。
40.根据权利要求39所述的方法，其中确定所述对象对先前治疗没有反应。
41.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中所述对象先前没有进行炎症性或自身免疫性疾病的治疗。
42.根据权利要求28至41中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用另外的炎症或自身免疫疗法。
43.根据权利要求28至42中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用与细胞外基质(ECM)亲和肽可操作地连接的第二抗炎剂。
44.一种用于减轻对象炎症的方法，其包括向所述对象施用包含与细胞外基质(ECM)亲和肽可操作地连接的抗炎剂的组合物。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述炎症是由于自身免疫性或炎症性病症引起的，并且其中所述自身免疫性或炎症性病症包括炎症性肠病、特发性肺纤维化、多发性硬化症、1型糖尿病、关节炎或类风湿性关节炎。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述自身免疫性或炎症性病症包括多发性硬化症。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述自身免疫性或炎症性病症包括类风湿性关节炎。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中与ECM亲和肽可操作地连接的抗炎剂包含与抗TNFα缀合的胶原蛋白结合结构域。
49.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中与ECM亲和肽可操作地连接的抗炎剂包含与IL-4可操作地连接的vWF-A3。
50.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中与ECM亲和肽可操作地连接的抗炎剂包含与抗TGF-β结合的胶原蛋白结合结构域。
51.根据权利要求44至50中任一项所述的方法，其中所述组合物进行全身施用。
52.根据权利要求44至50中任一项所述的方法，其中所述组合物进行局部施用。
53.根据权利要求52所述的方法，其中与所述ECM亲和肽可操作地连接的抗炎剂的施用剂量比不用肽下局部施用的抗炎剂的最小有效剂量小至少20％。
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