JP2022521428A - 抗炎症剤に連結されたｅｃｍ親和性ペプチドを用いて炎症性状態および自己免疫状態を処置するための方法および組成物 - Google Patents

抗炎症剤に連結されたｅｃｍ親和性ペプチドを用いて炎症性状態および自己免疫状態を処置するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、炎症性疾患の標的指向型療法を達成するためにコラーゲン結合ペプチド(CBP)およびvWF A3を用いる抗炎症剤のコラーゲン結合改変の操作に関する。したがって、本開示の態様は、細胞外マトリックス(ECM)親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤を含む組成物に関する。血清タンパク質および/またはECM親和性ペプチドに連結されたサイトカインおよびCD200などの抗炎症剤も開示される。本開示のさらなる局面は、本開示の組成物を対象に投与する段階を含む、対象における自己免疫状態または炎症状態を処置するための方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2019年2月25日付で出願された米国特許仮出願第62/809,988号の優先権の恩典を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
I. 発明の分野
本発明は広くは、医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、炎症組織をターゲティングするために操作された抗炎症剤を含めて、ヌクレオチド構築体およびタンパク質を伴う組成物および方法に関する。
II. 背景
サイトカインおよびその受容体に対する治療法は、特に関節リウマチ(RA)および炎症性腸疾患(IBD)の抗TNF療法において、炎症性疾患および自己免疫疾患の転帰を劇的に変化させた(1-5)。しかしながら、現在の承認薬はほとんどの患者を完全に治癒させるわけではなく、全身性免疫を抑制することによって重大な副作用を有する可能性がある(6-10)。治療結果を増強し、全身性副作用を低減するために、炎症部位への効率的な薬物送達は、そのような疾患の有望な治療戦略である。炎症性組織は、増強された透過性および保持(EPR)効果を誘導する一連のメディエータを放出する(11-12)。EPR効果は、非機能性リンパ管および巨大分子の血管外遊出を可能にする緩い内皮結合に起因し、固形腫瘍および炎症組織内での巨大分子の長期保持をもたらす(11-15)。腫瘍組織とは異なり、炎症組織はそこから物質を排出する機能的なリンパ系を有する(14-16)。現在、炎症組織からの急速なクリアランスのために、炎症性疾患および自己免疫疾患の炎症組織をターゲティングする効果的な方法がない。それゆえ、炎症組織を直接ターゲティングする治療法が当技術分野において必要とされている。
本開示は、炎症性疾患の標的指向型療法を達成するためにコラーゲン結合ペプチド(CBP)およびvWF A3を用いる抗炎症剤のコラーゲン結合改変の操作に関する。したがって、本開示の態様は、細胞外マトリックス(ECM)親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤を含む組成物に関する。本開示の局面は同様に、血清タンパク質に機能的に連結された抗炎症剤および血清タンパク質に機能的に連結された抗炎症剤を含有する組成物に関する。本開示のさらなる局面は、本開示の組成物を対象に投与する段階を含む、対象における自己免疫状態または炎症状態を処置するための方法に関する。
本開示のさらなる局面は、細胞外マトリックス(ECM)親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤を含む組成物を、対象に投与する段階を含む、対象における炎症を低減するための方法に関する。いくつかの態様において、炎症は、自己免疫状態または炎症状態に起因し、ここで自己免疫状態または炎症状態は、炎症性腸疾患、特発性肺線維症、多発性硬化症、1型糖尿病、または関節炎を含む。
いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤は、抗TNFαにコンジュゲートされたコラーゲン結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤は、IL-4に機能的に連結されたvWF-A3を含む。いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤は、抗TGF-βにコンジュゲートされたコラーゲン結合ドメインを含む。いくつかの態様において、組成物は全身に投与される。いくつかの態様において、組成物は局所的に投与される。いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤の投与用量は、ペプチドなしで局所的に投与される抗炎症剤の最小有効用量よりも少なくとも20%少ない。
いくつかの態様において、抗炎症剤は、抗炎症性抗体を含む。いくつかの態様において、抗炎症性抗体は、TNF-α、IL-1、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-12、IL-17A、IL-18、IFN-γ、GM-CSF、CD3、CD20、VLA-4、VLA-5、VCAM-1、TGF-β1、α4-インテグリン、α4β7-インテグリン、結合組織成長因子、血小板由来成長因子、プラスミノゲン活性化因子阻害因子-1、またはインスリン様成長因子結合タンパク質に特異的な抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は、抗TNF-α抗体、抗IL-1抗体、抗IL-5抗体、抗IL-6抗体、抗IL-6R抗体、抗IL-12抗体、抗IL-17A抗体、抗IL-18抗体、抗IFN-γ抗体、抗GM-CSF抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗VLA-4抗体、抗VLA-5抗体、抗VCAM-1抗体、抗TGF-β1抗体、抗α4-インテグリン抗体、抗α4β7-インテグリン抗体、抗結合組織成長因子抗体、抗血小板由来成長因子抗体、抗プラスミノゲン活性化因子阻害因子-1抗体、または抗インスリン様成長因子結合タンパク質抗体である。いくつかの態様において、抗炎症性抗体は遮断抗体である。いくつかの態様において、抗炎症性抗体は中和抗体である。いくつかの態様において、抗炎症性抗体は拮抗抗体である。これらの抗体の1つまたは複数は、態様から特に除外されうる。
いくつかの態様において、抗炎症剤は、抗TNF-α抗体、抗IL-1抗体、抗IL-5抗体、抗IL-6抗体、抗IL-6R抗体、抗IL-12抗体、抗IL-17A抗体、抗IL-18抗体、抗IFN-γ抗体、抗GM-CSF抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗VLA-4抗体、抗VLA-5抗体、抗VCAM-1抗体、抗TGF-β1抗体、抗α4-インテグリン抗体、抗α4β7-インテグリン抗体、抗結合組織成長因子抗体、抗血小板由来成長因子抗体、抗プラスミノゲン活性化因子阻害因子-1抗体、または抗インスリン様成長因子結合タンパク質抗体の抗原結合断片を含む。抗原結合断片は、抗TNF-α抗体、抗IL-1抗体、抗IL-5抗体、抗IL-6抗体、抗IL-6R抗体、抗IL-12抗体、抗IL-17A抗体、抗IL-18抗体、抗IFN-γ抗体、抗GM-CSF抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗VLA-4抗体、抗VLA-5抗体、抗VCAM-1抗体、抗TGF-β1抗体、抗α4-インテグリン抗体、抗α4β7-インテグリン抗体、抗結合組織成長因子抗体、抗血小板由来成長因子抗体、抗プラスミノゲン活性化因子阻害因子-1抗体、もしくは抗インスリン様成長因子結合タンパク質抗体からのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む可変軽鎖領域ならびに/または抗TNF-α抗体、抗IL-1抗体、抗IL-5抗体、抗IL-6抗体、抗IL-6R抗体、抗IL-12抗体、抗IL-17A抗体、抗IL-18抗体、抗IFN-γ抗体、抗GM-CSF抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗VLA-4抗体、抗VLA-5抗体、抗VCAM-1抗体、抗TGF-β1抗体、抗α4-インテグリン抗体、抗α4β7-インテグリン抗体、抗結合組織成長因子抗体、抗血小板由来成長因子抗体、抗プラスミノゲン活性化因子阻害因子-1抗体、もしくは抗インスリン様成長因子結合タンパク質抗体からのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む可変重鎖領域を含みうる。いくつかの態様において、抗体は、アダリムマブ、セルトリズマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、トシリズマブ、リツキシマブ、ウステキヌマブ、ナタリズマブ、ベドリズマブ、セクキヌマブ、またはイキセキズマブを含む。いくつかの態様において、抗炎症剤は、アダリムマブ、セルトリズマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、トシリズマブ、リツキシマブ、ウステキヌマブ、ナタリズマブ、ベドリズマブ、セクキヌマブ、またはイキセキズマブに由来する抗原結合断片を含む。抗原結合断片は、アダリムマブ、セルトリズマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、トシリズマブ、リツキシマブ、ウステキヌマブ、ナタリズマブ、ベドリズマブ、セクキヌマブ、もしくはイキセキズマブからのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む可変軽鎖領域ならびに/またはアダリムマブ、セルトリズマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、トシリズマブ、リツキシマブ、ウステキヌマブ、ナタリズマブ、ベドリズマブ、セクキヌマブ、もしくはイキセキズマブからのCDR1、CDR2、およびCDR3を含む可変重鎖領域を含みうる。全抗体に由来する抗原結合断片の例としては、ミニボディ、scFv、キメラ抗原受容体、およびダイアボディが挙げられる。抗TNF-α抗体、抗IL-1抗体、抗IL-5抗体、抗IL-6抗体、抗IL-6R抗体、抗IL-12抗体、抗IL-17A抗体、抗IL-18抗体、抗IFN-γ抗体、抗GM-CSF抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗VLA-4抗体、抗VLA-5抗体、抗VCAM-1抗体、抗TGF-β1抗体、抗α4-インテグリン抗体、抗α4β7-インテグリン抗体、抗結合組織成長因子抗体、抗血小板由来成長因子抗体、抗プラスミノゲン活性化因子阻害因子-1抗体、または抗インスリン様成長因子結合タンパク質抗体の1つまたは複数に由来する二価または多重特異性構築体も企図される。いくつかの態様において、抗体はヒト化されている。いくつかの態様において、抗体はキメラ抗体である。これらの抗体または抗原結合断片の1つまたは複数は、態様から特に除外されうる。
いくつかの態様において、抗体は抗TNF-α抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗IL-1抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗IL-5抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗IL-6抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗IL-6R抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗IL-12抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗IL-17A抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗IL-18抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗IFN-γ抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗GM-CSF抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗CD3抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗CD20抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗VLA-4抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗VLA-5抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗VCAM-1抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗TGF-β1抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗α4-インテグリン抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗α4β7-インテグリン抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗結合組織成長因子抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗血小板由来成長因子抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗プラスミノゲン活性化因子阻害因子-1抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は抗インスリン様成長因子結合タンパク質抗体を含む。
いくつかの態様において、抗炎症剤は、抗炎症性サイトカインポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、IL-4、IL-1ra、IL-5、IL-10、IL-11、IL-23、IL-35、IL-36ra、IL-37、インターフェロン-β、TGF-β1、TNF受容体I、およびTNF受容体IIからのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、ヒトサイトカインポリペプチドに由来する。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、非ヒトサイトカインポリペプチドに由来する。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、マウス、イヌ、ウマ、ブタまたはヤギサイトカインポリペプチドに由来する。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、IL-4、IL-1ra、IL-5、IL-10、IL-11、IL-23、IL-35、IL-36ra、IL-37、インターフェロン-β、TGF-β1、TNF受容体I、およびTNF受容体IIの1つまたは複数からのエフェクタ領域を含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、IL-4からのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、IL-1raからのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、IL-5からのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、IL-10からのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、IL-11からのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、IL-23、IL-35からのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、IL-36raからのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、IL-37からのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、インターフェロン-βからのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、TGF-β1からのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、TNF受容体Iからのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、TNF受容体IIからのポリペプチドを含む。これらの抗炎症ポリペプチドの1つまたは複数は、態様から特に除外されうる。いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、ヒトサイトカインポリペプチドであるか、またはヒトサイトカインポリペプチドに由来する。
いくつかの態様において、サイトカインポリペプチドは、SEQ ID NO:18～44のうちのポリペプチドもしくはその断片を含むか、またはSEQ ID NO:18～44のうちの1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはその断片と少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (もしくはその中で導出可能な任意の範囲)の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの態様において、抗炎症剤は、SEQ ID NO:58もしくは59のポリペプチドまたはその断片を含むか、あるいはSEQ ID NO:58もしくは59の1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片と少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、抗炎症剤は、CD200からのポリペプチドを含む。いくつかの態様において、CD200ポリペプチドは、CD200の細胞外ドメインを含む。CD200 (UniProt識別番号O54901)は、その受容体であるCD200R1との相互作用を通じて免疫抑制機能を発揮できるI型膜貫通タンパク質である。細胞の表面から切断された場合でも、CD200の可溶性細胞外ドメインはCD200Rに結合して活性化することができる。本開示の態様は、CD200の少なくともまたは多くとも細胞外部分および血清アルブミンなどの血清タンパク質を含むポリペプチドに関する。ポリペプチドは、本開示の方法の態様において有用である。さらなる態様は、CD200の少なくともまたは多くとも細胞外部分、血清アルブミン、およびECM親和性ポリペプチドを含むポリペプチドに関する。
いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドは、コラーゲン結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、デコリンまたはフォンヴィルブランド因子(VWF)からのコラーゲン結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドは、胎盤成長因子-2 (PlGF-2)またはCXCL-12γからのペプチドを含む。いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドは、SEQ ID NO: 1～17、47、もしくは52のうちの1つと少なくとも85%同一であるペプチドまたはSEQ ID NO: 1～17、47、もしくは52のうちの1つの断片と少なくとも85%同一であるペプチドを含む。いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドは、SEQ ID NO: 1～17、47、もしくは52のうちの1つのアミノ酸配列を有するペプチドと少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の配列同一性を有するペプチドまたはSEQ ID NO: 1～17、47、もしくは52のうちの1つのアミノ酸配列を有するペプチドの断片と少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の配列同一性を有するペプチドを含む。
いくつかの態様において、細胞外マトリックス(ECM)親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤は、該ペプチドまたは該剤に機能的に連結された血清タンパク質をさらに含む。いくつかの態様において、血清タンパク質は、該ペプチドに機能的に連結されている。いくつかの態様において、血清タンパク質は、ペプチド結合を通じて該ペプチドに機能的に連結されている。いくつかの態様において、血清タンパク質は、アルブミンを含む。いくつかの態様において、抗炎症剤は、血清タンパク質のアミノ近位にある。いくつかの態様において、抗炎症剤は、血清タンパク質のカルボキシ近位にある。いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドは、抗炎症剤のアミノ近位にある。いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドは、抗炎症剤のカルボキシ近位にある。いくつかの態様において、血清タンパク質は、ECM親和性ペプチドのアミノ近位にある。いくつかの態様において、血清タンパク質は、ECM親和性ペプチドのカルボキシ近位にある。
第1の領域が第2の領域のカルボキシ末端に結合している場合、第1の領域は第2の領域のカルボキシ近位にある。第1の領域と第2の領域との間にさらに介在するアミノ酸残基がありうる。したがって、介在するアミノ酸残基を有しないと特に指定されない限り、それらの領域は直接隣接している必要はない。「アミノ近位」という用語は、第1の領域が第2の領域のアミノ末端に結合している場合、第1の領域が第2の領域のアミノ近位にあるという点で同様に定義される。同様に、特に明記しない限り、第1の領域と第2の領域との間にさらに介在するアミノ酸残基がありうる。いくつかの態様において、組成物は、血清アルブミンタンパク質のアミノ-アミノ近位(amino-amino proximal)のコラーゲン結合ドメインと、血清アルブミンタンパク質のカルボキシ近位のIL-10ポリペプチドとを含む。
いくつかの態様において、ペプチドは、抗炎症剤および/または血清タンパク質などの他の分子に共有結合している。いくつかの態様において、ペプチドは、二官能性リンカーを通じて抗炎症剤に架橋結合されている。アミノ酸またはペプチド模倣配列などのリンカーが、ペプチドおよび/または抗体配列の間に挿入されうる。1つの態様において、ファイノマードメインが重(H)鎖または軽(L)鎖のアミノ(NH2)末端またはカルボキシ(C)末端の最後のアミノ酸の直後で重(H)鎖または軽(L)鎖につながっている。リンカーは、可動性の立体構造、規則正しい二次構造を形成できないこと、またはいずれかのドメインを促進し、もしくはいずれかのドメインと相互作用しうる疎水性もしくは荷電性を含む1つまたは複数の特性を有しうる。可動性のタンパク質領域において通常見られるアミノ酸の例としては、Gly、AsnおよびSerが挙げられうる。例えば、適当なペプチドリンカーはGGGSGGGS (SEQ ID NO:48)または(GGGS)n (SEQ ID NO:49)でありえ、式中n = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10 (またはその中で導出可能な任意の範囲)である。ThrおよびAlaなどの、他のほぼ中性のアミノ酸もリンカー配列において用いられうる。リンカー配列の長さは、融合タンパク質の機能または活性に有意な影響を与えることなく変化しうる(例えば、米国特許第6,087,329号を参照のこと)。特定の局面において、ペプチドおよび抗体の重鎖または軽鎖は、約1～25アミノ酸残基を有するペプチド配列によってつながれている。リンカーの例としては、スルホ-スクシンイミジル誘導体(スルホ-SMCC、スルホ-SMPB)、スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)、グルタル酸ジスクシンイミジル(DSG)および酒石酸ジスクシンイミジル(DST)などの、化学部分およびコンジュゲーション剤(conjugating agent)も挙げられうる。リンカーの例としては、CN (ここでN=1～100の炭素原子、例えば、N=2、3、4、5、6、7、8、9、または10)などの、線状炭素鎖がさらに挙げられうる。いくつかの態様において、リンカーは、バリン-シトルリン(val-cit)、フェニルアラニン-リジン(phe-lys)リンカー、またはマレイミドカプロン-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル(vc)リンカーなどの、ジペプチドリンカーであることができる。いくつかの態様において、リンカーは、スルホスクシンイミジル-4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(smcc)である。スルホ-smccコンジュゲーションは、スルフヒドリル(チオール, --SH)と反応するマレイミド基を介して行われるが、そのスルホ-NHSエステルは一級アミン(リジンおよびタンパク質またはペプチドのN末端に見られる)に対して反応性である。さらに、リンカーはマレイミドカプロイル(mc)でありうる。いくつかの態様において、ペプチドは、ペプチド結合を通じて抗炎症剤に連結されている。ペプチドは、抗炎症剤のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結されうる。いくつかの態様において、ペプチドは、抗炎症性抗体の重鎖に連結されている。いくつかの態様において、ペプチドは、抗炎症性抗体の軽鎖に連結されている。いくつかの態様において、ペプチドと抗炎症剤との比は、約1:1～5:1である。いくつかの態様において、ペプチドと抗炎症剤との比は、約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、もしくは20:1 (またはその中で導出可能な任意の範囲)である。これらのリンカーの1つまたは複数は、態様から特に除外されうる。
いくつかの態様において、組成物は、細胞外マトリックス(ECM)親和性ペプチドに機能的に連結された第2の抗炎症剤をさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、細胞外マトリックス(ECM)親和性ペプチドに機能的に連結された第3、第4、第5、または第6の抗炎症剤をさらに含む。
いくつかの態様において、自己免疫状態または炎症状態は、炎症性腸疾患、特発性肺線維症、多発性硬化症、1型糖尿病、クローン病、乾癬、急性炎症、慢性炎症、神経炎症、関節炎、関節リウマチ、線維症、感染症、アレルギー、炎症治療に関連する有害事象、および炎症治療に関連する炎症性疾患を含む。これらの状態の1つまたは複数は、態様から特に除外されうる。
いくつかの態様において、組成物は全身に投与される。いくつかの態様において、組成物は静脈内注射によって投与される。いくつかの態様において、組成物は局所的に投与される。いくつかの態様において、組成物は、炎症部位に投与されるか、または炎症部位に隣接して投与される。
いくつかの態様において、ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤を含む組成物の投与用量は、ペプチドなしで投与された抗炎症剤の最小有効用量よりも少ない。いくつかの態様において、ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤を含む組成物の投与用量は、同じ投与経路によりペプチドなしで投与された抗炎症剤の最小有効用量よりも少ない。いくつかの態様において、ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤の投与用量は、ペプチドなしで投与された抗炎症剤の最小有効用量よりも少なくとも10%少ない。いくつかの態様において、ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤の投与用量は、ペプチドなしで投与された抗炎症剤の最小有効用量よりも少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、または70% (またはその中で導出可能な任意の範囲)少ない。
いくつかの態様において、対象は、抗炎症剤、抗炎症療法、または自己免疫療法で以前に処置されている。いくつかの態様において、対象は、以前の処置に非応答性であると決定されている。いくつかの態様において、対象は、炎症性疾患についても自己免疫疾患についても以前に処置されていない。いくつかの態様において、本方法は、追加の炎症療法または自己免疫療法を施すことをさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、細胞外マトリックス(ECM)親和性ペプチドに機能的に連結された第2の抗炎症剤の投与をさらに含む。
本明細書において用いられる「サイトカインポリペプチド」という用語は、サイトカインまたはその受容体結合ドメインであって、サイトカイン活性の一部分を保持しているポリペプチドをいう。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、アミノ酸の重合体を含む遺伝子産物をいう場合、本明細書において互換的に用いられる。
「対象」、「哺乳動物」および「患者」という用語は互換的に用いられる。いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ロバ、またはミバエ、ゼブラフィッシュなどのような臨床試験動物である。
本方法および組成物は本明細書において記述される態様のいずれかの除外を含むことが企図される。
本明細書において用いられる場合、「または」および「および/または」という用語は、複数の構成要素を組み合わせて、または互いに排他的に記述するために利用される。例えば、「x、y、および/またはz」は、「x」のみ、「y」のみ、「z」のみ、「x、y、およびz」、「(xおよびy)またはz」、「xまたは(yおよびz)」または「xまたはyまたはz」をいうことができる。x、y、またはzが態様から特に除外されうることが特に企図される。
本出願の全体を通じて、「約」という用語は、値にはその値を決定するために利用される装置または方法に対しての誤差の標準偏差が含まれることを示すために、細胞生物学の分野におけるその平易で通常の意味にしたがって用いられる。
「含む(including)」、「含有する(containing)」または「によって特徴付けられる」と同義である「含む(comprising)」という用語は、包括的または自由形式であり、さらなる、引用されていない要素または方法の段階を除外するものではない。「からなる」という語句は、指定されていない任意の要素、段階、または成分を除外する。「から本質的になる」という語句は、記述された主題の範囲を、特定の材料または段階およびその基本かつ新規の特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。「含む(comprising)」という用語の文脈のなかで記述された態様はまた、「からなる(consisting of)」または「から本質的になる(consisting essentially of)」という用語の文脈のなかで実施されうることが企図される。
本発明の1つの態様に関して論じられた任意の制限が、本発明の他の任意の態様に適用されうることが特に企図される。さらに、本発明の任意の組成物が本発明の任意の方法において用いられてもよく、本発明の任意の組成物を作出または利用するために本発明の任意の方法が用いられてもよい。実施例に記載された態様の局面はまた、異なる実施例中の他所にまたは本出願中の他所に、例えば発明の概要、態様の詳細な説明、特許請求の範囲、および図の凡例の説明に論じられている態様の文脈において実施されうる態様である。
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明のある種の局面をさらに実証するために含められている。本発明は、これらの図面の1つまたは複数を本明細書に提示した具体的な態様の詳細な説明と併せて参照することによってよりよく理解されうる。
図1A～B．CBPコンジュゲーションは、αTNFに対するコラーゲン親和性をもたらした。(A) MALDI-TOF MSによって分析されたWT-αTNFおよびCBP-αTNF。横座標は質量対電荷比(m/z)であり、縦座標は二重荷電イオンの強度である。(B) コラーゲンI型、II型、およびIII型へのWT-αTNFおよびCBP-αTNF結合親和性をELISAによって分析する(n=3, 平均 + SD)。 図2A～D．炎症を起こした足に蓄積したCBP-αTNF。関節炎(CAIA)は、抗コラーゲン抗体の受動免疫、続いて右後足蹠にLPSおよび左後足蹠にPBSを皮下注射することにより、右後足に選択的に誘発された。LPS注射の翌日に、Cy7標識CBP-αTNFおよびCy7標識WT-αTNFをナイーブマウスおよびCAIAマウスに静脈内注射した。CBP-αTNF (A)およびWT-αTNF (B)を注射したマウスの関節炎または非関節炎の足における蓄積の代表的な画像。(C) ナイーブマウスおよびCAIAマウス(n = 3～4、平均±SD)における関節炎の足(右後部)と非関節炎の足(左後部)の放射効率比の変化。(D) CBP-αTNFを注射したCAIAマウスでの関節の代表的な組織像(左, H&E染色; 右, 抗ラットIgGに対する免疫組織化学染色)。 図2-1の説明を参照のこと。 図3A～B．CBP-αTNFはWT-αTNFよりも効果的に関節炎の発症を抑制した。関節炎は、抗コラーゲン抗体の受動免疫、続いてLPSの腹腔内注射により誘発された。LPS注射の日に、対照IgG、WT-αTNF、またはCBP-αTNFを関節炎マウスに静脈内注射した。(A) 関節炎スコアは、6匹のマウスの平均 + SEを表す。＊ P<0.05, 対照と比較して(ダネットの多重比較検定)。＃P<0.05, 各処置群の8日目のスコアと比較して(テューキーの多重比較検定)。(B) 各処置群での8日目の関節の代表的なH&E画像。材料および方法に記述されているように、骨吸収および滑膜過形成の重症度は0から4のスコアが付された。統計分析は、対照群とαTNF処置群との差異についてダネットの多重比較検定を用いて実施された。 図4A～B．CBP-αTNFの皮下注射も関節炎の足に蓄積し、関節炎の発症を抑制した。(A) 関節炎は、抗コラーゲン抗体の受動免疫、続いて右後足蹠にLPSおよび左後足蹠にPBSを皮下注射することにより、右後足に選択的に誘発された。LPS注射の翌日に、Cy7標識CBP-αTNFをマウスの背中に皮下注射した。CBP-αTNFを注射したマウスの関節炎または非関節炎の足における蓄積(矢印で示される)の代表的な画像。(B) 関節炎は、抗コラーゲン抗体の受動免疫、続いてLPSの腹腔内注射により全ての足に誘発された。LPS注射の日に、対照IgG、WT-αTNF、またはCBP-αTNFを皮下注射した。関節炎スコアは、5匹のマウスの平均 + SEを表す。＃P<0.05, 各群の8日目のスコアと比較して(テューキーの多重比較検定)。 図5A～B．関節炎の発症に及ぼす局所注射の効果。関節炎は、抗コラーゲン抗体の受動免疫、続いてLPSの腹腔内注射により誘発された。LPS注射の日に、(A) Cy7標識PlGF-2123～144-αTNFおよびCy7標識WT-αTNFまたは(B) 対照IgG、WT-αTNF、およびPlGF-2123～144-αTNFを関節炎マウスの左後足に皮下注射した。(A) WT-αTNFおよびPlGF-2123～144-αTNFによるマウスの注射部位における滞留の代表的な画像。(B) 関節炎スコアは、8匹のマウスの平均±SEを表す。＃P<0.05, 各群の6日目のスコアと比較して(テューキーの多重比較検定)。 図6A～E．A3-IL4が脊髄に蓄積し、EAEスコアを低減させた。コラーゲンIII型に対するA3-IL4の親和性(A)およびIL-4Rαに対するIL-4とA3-IL4タンパク質との間の親和性(B)をELISAによって測定した。[濃度] vs [シグナル]のグラフが示されている(n = 4)。EAEはMOG35～55/CFA乳濁液の皮下注射、続いて免疫日および翌日のPTXの腹腔内注射により誘発された。免疫後14日目に、DyLight 800標識A3-IL4、A3タンパク質(C)またはCy7標識CBP-αTNF (D)をナイーブマウスまたはEAEマウスに静脈内注射した。注射4時間後に脊髄を採取し、蛍光強度を測定した。(E) EAE免疫後14日目から、正常型IL-4またはA3-IL4を1日おきに静脈内注射した。EAEの疾患スコアは平均±SEを表す(n = 3～5)。 図7A～C．他の炎症性疾患モデルの炎症組織におけるA3タンパク質およびCBPコンジュゲートの局在。(A) DyLight 800標識A3タンパク質、またはCy7標識CBP-αTNFを、IBDを自然発症したもしくは発症しなかったIL-10-/- × TLR-4-/- (DKO)マウス、または正常(C57BL/6)マウスに静脈内注射した。結腸を注射4時間後に採取し、蛍光イメージング(上)および組織学的分析(下)のために提供した。Cy7標識CBP-αTNFを注射したIBD発症マウスの結腸をH&Eおよび過ヨウ素酸シッフ(PAS)で染色した。さらに、注入した抗体を、抗ラットIgGに対する免疫組織化学(IHC)によって検出した。(B) Cy7標識CBP-αTGFまたはCy7標識αTGFを、ナイーブマウスまたはブレオマイシン注入7日後のブレオマイシン誘発肺線維症モデルに静脈内注射した。蛍光注射4時間後に肺を採取し、次に蛍光強度を測定した。(C) DyLight 800標識A3タンパク質を、I型糖尿病(T1D)自然発症マウス、シクロホスファミド誘発T1Dマウス、および非糖尿病マウスに静脈内注射した。蛍光注射15分後に膵臓を採取し、次に蛍光強度を測定した。 図8A～D．IL-10へのアルブミン融合はFcRn結合を提供し、LN蓄積をもたらした。(A) wt IL-10およびSA-IL-10のSDS-PAGE分析。(B) SA-IL-10のFcRnへの結合分析。(C) 脾臓細胞(i)または膝窩LNからの単一細胞(ii)を、SA、SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10とともに氷上で30分間インキュベートした。各細胞型(x軸)について(i)に示されているのは、左から右に、SA、SA-IL-10、およびCBD-SA-IL-10の%結合(y軸)を表すバーである。各細胞型(x軸)について(ii)に示されているのは、左から右に、それぞれSAおよびSA-IL-10の%結合(y軸)を表すバーである。免疫細胞への各タンパク質の結合は、抗SA抗体および各免疫細胞集団の特定のマーカーに対する抗体で共染色することによって検出された。(D) DyLight594標識wt IL-10またはSA-IL-10の静脈内注射後の膝窩LNの免疫蛍光画像。T細胞および高内皮細静脈(HEV)は、それぞれ抗CD3抗体または抗PNAd抗体で染色された。 図9A～B．IL-10へのアルブミン融合は長期の血液循環を提供し、CBD融合は炎症を起こした関節への生体内分布を改善した。(A) wt IL-10、SA-IL-10、またはCBD-SA-IL-10 (各35μgのIL-10に相当)を尾静脈注射によりBALB/cマウスに投与した。示された時点で血清を収集した。IL-10の血清中濃度をELISAによって測定した(平均 ± SEM; n = 5)。IL-10の血漿中半減期は、2相指数関数的減衰を用いて計算された: MFI (t) = Ae-αt + Be-βt. t1/2, α, 速いクリアランス半減期; t1/2, β, 遅いクリアランス半減期。曲線下面積(AUC)はGraphpad Prismによって分析された。(B) 関節炎(CAIA)は、抗コラーゲン抗体の受動免疫、続いて右後足蹠にLPSを皮下注射(3日目として定義)することにより、右後足に選択的に誘発された。LPS注射の翌日に、DyLight800標識wt IL-10、SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10をCAIAマウスに静脈内注射した。注射4時間後に、示された臓器を採取し、IVISイメージングシステムを用いて分析した。(平均 ± SEM; n = 4)。統計分析は、テューキーの検定で分散分析(ANOVA)を用いて行われた。＊P < 0.05; ＊＊P < 0.01。各臓器(x軸)について(B)に示されているのは、左から右に、それぞれwt IL-10、SA-IL-10、およびCBD-SA-IL-10の%分布(y軸)を表すバーである。 図10A～D．アルブミン融合IL-10は、wt IL-10よりも効果的に関節炎の発症を抑制した。(A) 関節炎(CAIA)は、抗コラーゲン抗体での受動免疫、続いてLPSを腹腔内注射することにより誘発された。LPS注射の日に、PBS、wt IL-10、SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10 (43.5μgのIL-10に相当)を関節炎マウスに静脈内注射した。関節炎スコアは、7匹のマウスの平均 + SEMを表す。(B) 高用量(1.5 mg/マウス)の抗コラーゲン抗体で免疫したCAIAマウスにおけるwt IL-10およびCBD-SA-IL-10とαTNF-α抗体との治療効果の比較。関節炎スコアは、6～7匹のマウスの平均 + SEMを表す。(C) 各処置群における13日目の関節の代表的なH&E組織像。スケールバー, 500μm。材料および方法に記述されているように、骨吸収および滑膜過形成の重症度は0から4のスコアが付された。(D) SA-IL-10およびCBD-SA-IL-10の治療効果に及ぼす投与経路の影響。関節炎スコアは、6～7匹のマウスの平均 + SEMを表す。統計分析は、テューキーの検定で分散分析(ANOVA)を用いて行われた。＊P < 0.05; ＊＊P < 0.01; ＊＊＊P < 0.001; ＊＊＊＊P < 0.0001。 図11A～D．アルブミン融合IL-10は、確立された関節炎に対して改善された治療効果を示した。DBA/1J雄性マウス尾の付け根にウシコラーゲン/CFA乳濁液を皮下注射した。3週間後に、追加免疫としてウシコラーゲン/IFA乳濁液をさらに注射した。関節炎スコアが2～4になったら(0日目と定義)、マウスにPBS、SA-IL-10もしくはCBD-SA-IL-10 (各43.5μgのIL-10に相当)、または200μgの抗TNF-α抗体を静脈内注射した。(A)では、同じ処置を3日目にマウスにさらに注射した。(AおよびB) 関節炎スコアは、9匹のマウスの平均 + SEMを表す。(CおよびD) 16日目の関節の代表的なH&E組織像。スケールバー, 500μm。材料および方法に記述されているように、骨吸収および滑膜過形成の重症度は0から4のスコアが付された。統計分析は、(AおよびB)の場合にはテューキーの検定ならびに(CおよびD)の場合には両側スチューデントのt検定で分散分析(ANOVA)を用いて行われた。＊P < 0.05; ＊＊P < 0.01; ＊＊＊P < 0.001。 図12A～F．アルブミン融合IL-10は、LN内に蓄積し、LNにおけるTh17活性化を抑制した。関節炎(CAIA)は、抗コラーゲン抗体の受動免疫、続いてLPSを腹腔内注射(3日目として定義)することにより誘発された。LPS注射の日に、wt IL-10、SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10を関節炎マウスに静脈内注射した。LNにおけるIL-10レベルおよびTh17関連サイトカインを、ELISAを用いて測定した。(A) 各タンパク質の注射4時間後のIL-10レベルの比較。(B) 静脈内注射後のLNにおけるwt IL-10またはSA-IL-10の薬物動態(平均 ± SEM; n = 4) (C) さまざまなLNにおけるwt IL-10およびSA-IL-10のAUC。関節流入領域(膝窩) LN (D)および非流入領域(頸部)LN (E)におけるTh17関連サイトカインレベル。(F) 膝窩LNにおけるGM-CSFレベル。(平均 ± SEM; n = 7) 統計分析は、テューキーの検定で分散分析(ANOVA)を用いて行われた。＊P < 0.05; ＊＊P < 0.01; ＊＊＊P < 0.001; ＊＊＊＊P < 0.0001; ns; 有意ではない。 図12-1の説明を参照のこと。 図13A～C．アルブミン融合IL-10は足内の炎症応答を抑制した。関節炎(CAIA)は、抗コラーゲン抗体の受動免疫、続いてLPSを腹腔内注射することにより誘発された。LPS注射の日(3日目として定義)に、PBS、wt IL-10、SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10を関節炎マウスに静脈内注射した。(A) 11日目に後足から単一細胞を抽出し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。グラフは、CD45+細胞、B細胞(CD45+リンパ球内のB220+細胞)、樹状細胞(CD45+リンパ球内のCD11c+細胞)、単球(CD45+リンパ球内のCD11b+細胞)、顆粒球MDSC/好中球(Ly6G+ Ly6C+ CD11b+ CD45+)、単球MDSC (Ly6G- Ly6C+ CD11b+ CD45+)、マクロファージ(F4/80+ CD11b+ CD45+)、M2マクロファージ(CD206+ F4/80+ CD11b+ CD45+)、およびM1マクロファージ(MHC II+ F4/80+ CD11b+ CD45+)の頻度を描く。(平均 ± SEM; n = 7) (B) 11日目の後足におけるサイトカインレベル。(n = 5～7) (C) 各処置群における14日目の関節の代表的なH&E画像。スケールバー, 500μm。材料および方法に記述されているように、骨吸収および滑膜過形成の重症度は0から4のスコアが付された(平均 ± SEM; n = 6～7)。統計分析は、(A)での%CD11c+を除きテューキーの検定で分散分析(ANOVA)を用いて行われた。(A)での%CD11c+の分析の場合、クラスカル・ワリス検定とそれに続くダンの多重比較検定を利用した。＊P < 0.05; ＊＊P < 0.01; ＊＊＊P < 0.001; ＊＊＊＊P < 0.0001。 図13-1の説明を参照のこと。 図14A～B．CBDコンジュゲーションはIL-10へのコラーゲン親和性をもたらした。(A) CBD-SA-IL-10のSDS-PAGE分析。(B) CBD-SA-IL-10のI型またはIII型コラーゲンならびにFcRnへの結合分析。 図14Aの説明を参照のこと。 図15A～B．脾臓(A)およびLN (B)における免疫細胞集団に及ぼすアルブミン融合IL-10の効果。関節炎(CAIA)は、抗コラーゲン抗体の受動免疫、続いてLPSを腹腔内注射(3日目として定義)することにより誘発された。3日目および6日目に、PBS、wt IL-10、またはSA-IL-10をマウスに静脈内注射した。最後の注射の翌日に脾臓および膝窩LNから単一細胞を抽出し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。グラフは、生細胞内のCD3+ T細胞、生細胞内のCD45+リンパ球、生細胞内のCD11b+細胞、CD11b+細胞内のCD11c+細胞、CD11c+細胞内のCD86+細胞、顆粒球MDSC/好中球(CD11b+細胞内のLy6G+ Ly6C+)、単球MDSC (CD11b+細胞内のLy6G- Ly6C+)、マクロファージ(CD11b+細胞内のF4/80+)、マクロファージ内のCD86+細胞、およびM2マクロファージ(CD11b+細胞内のCD206+ F4/80+の頻度を描く。(平均 ± SEM; n = 6～7) 統計分析は、以下のグラフを除きテューキーの検定で分散分析(ANOVA)を用いて行われた。(A)でのCD11b+細胞内の%CD11c+および(B)でのCD11b+細胞内の%Ly6G+, Ly6C+の分析の場合、クラスカル・ワリス検定とそれに続くダンの多重比較検定を利用した。＊P < 0.05; ＊＊P < 0.01; ＊＊＊P < 0.001; ＊＊＊＊P < 0.0001。 図15Aの説明を参照のこと。 図16A～B．足および血液中のT細胞集団に及ぼすアルブミン融合IL-10の効果。関節炎(CAIA)は、抗コラーゲン抗体の受動免疫、続いてLPSを腹腔内注射(3日目として定義)することにより誘発された。LPS注射の日に、PBS、wt IL-10、SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10をマウスに静脈内注射した。(A) 11日目に後足から単一細胞を抽出し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。グラフは、CD45+リンパ球内のNK1.1+ CD3- NK細胞、CD45+リンパ球内のCD3+ T細胞、CD45+リンパ球内のCD3+ CD4+ T細胞、CD3+ CD4+ T細胞のTreg (Foxp3+ CD25+)、CD45+リンパ球内のCD3+ CD8+ T細胞、CD3+ CD8+ T細胞のエフェクタ記憶T細胞 (CD62L- CD44+)、CD3+ CD8+ T細胞の中央記憶T細胞 (CD62L+ CD44+)、CD3+ CD8+ T細胞のPD-1+細胞の頻度を描く。(B) 11日目に血液からリンパ球を抽出し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。グラフは、CD45+リンパ球内のCD3+ T細胞、CD45+リンパ球内のCD3+ CD4+ T細胞、CD3+ CD4+ T細胞のTreg (Foxp3+ CD25+)、CD45+リンパ球内のCD3+ CD8+ T細胞の頻度を描く(平均 ± SEM; n = 5～7) 統計分析は、以下のグラフを除く: (A)でのCD45+細胞内の%NK1.1+、CD4+細胞内の%Foxp3+、CD8+細胞内の%CD44+/CD62L-、CD8+細胞内の%CD44+/CD62L+およびCD8+細胞内の%PD-1+の分析のためにテューキーの検定で分散分析(ANOVA)を用いて行い、クラスカル・ワリス検定とそれに続くダンの多重比較検定を利用した。＊P < 0.05; ＊＊P < 0.01; ＊＊＊P < 0.001。 図16Aの説明を参照のこと。 図17A～B．アルブミン融合IL-10の安全性評価。wt IL-10、SA-IL-10、またはCBD-SA-IL-10を健常BALB/cマウスに静脈内注射した。(A) 注射2日後に、白血球数、赤血球数、血小板数、血中ヘモグロビン濃度および脾臓の重量を評価した。(B) アラニントランスアミナーゼ(ALT)、アミラーゼ、血中尿素窒素(BUN)、血清カルシウム、クレアチンキナーゼ(CK)、CO2、総ビリルビン(TBli)および血清中の総タンパク質の濃度を、生化学分析器を用いて評価した。(平均 ± SEM; n = 5) 統計分析は、テューキーの検定で分散分析(ANOVA)を用いて行われた。＊P < 0.05; ＊＊P < 0.01。 図17Aの説明を参照のこと。 図18A～D．IL-4はSAの融合後も活性を保持する。(a) wt IL-4およびSA-IL-4を、クマシーブルー染色を用い還元および非還元条件下でSDS-PAGEにより分析した。(b) フローサイトメトリーによって測定された、LNおよび脾臓から新たに単離された免疫細胞へのSA-IL-4の結合。(c) wt IL-4およびSA-IL-4活性アッセイ。T細胞におけるSTAT6のリン酸化を、示された濃度のwt IL-4またはSA-IL-4を用いインビトロでT細胞を培養した後にフローサイトメトリーによって分析した。(d) ELISAによって測定された、wt IL-4またはSA-IL-4の存在下でのTh17分化条件下で分泌されたIL-17濃度。データは平均±SEMである。2つの実験的複製。統計分析は、テューキーの検定で一元配置分散分析を用いて実施された。＊＊P < 0.01。 図19A～H．IL-4へのSA融合は、静脈内注射後の二次リンパ器官におけるIL-4の量を増加させた。(a) SPRによって測定されたFcRnへのSA-IL-4の結合親和性。(b) 静脈内注射されたwt IL-4またはSA-IL-4の血漿中濃度。wt IL-4 10μg (n = 4)または等モルのSA-IL-4 (n = 3)をナイーブマウスに静脈内注射した。1分から24時間後に採血し、IL-4の血漿中濃度をELISAによって測定した。(c～d) (c) 上腕LNおよび腰LNならびに(d) 脾臓における経時的なIL-4量。40μgのwt IL-4または等モルのSA-IL-4をナイーブマウスに静脈内注射した。LNおよび脾臓を採取し、IL-4の量をELISAによって試験した(n = 5)。(e) 注射1時間後にLNおよび脾臓におけるSA(P573K)-IL-4量を測定した。(c～d)からのwt IL-4およびSA-IL-4データが再提示されている。(f～g) DyLight594標識IL-4またはSA-IL-4の静脈内注射1時間後の腰LNの免疫蛍光画像。T細胞および高内皮細静脈(HEV)を、それぞれ抗CD3抗体または抗PNAd抗体によって染色した。スケールバーは、(g) 200μmおよび(h) 100μmを表す。データは平均±SEMである。2つの実験的複製。統計分析は、テューキーの検定で一元配置分散分析を用いて実施された。＊＊P < 0.01。 図19-1の説明を参照のこと。 図20A～D．SA-IL-4は、急性期におけるEAE疾患の進行および発症を防ぐ。免疫後8日目から10日間1日おきに腹腔内に(i.p.)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、i.p.にwt IL-4 10μg、またはi.p.もしくは皮下に(s.c.) SA-IL-4 10μgモル当量を注射した、あるいはFTY720 1 mg/kgを経口投与により投薬した、C57BL/6ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスにおける(b) 発病率および(c) 体重変化を伴う(a) 疾患進行。n = 7/群。(d) 代表的な脊髄組織像。ミエリン発現は、抗ミエリン塩基性タンパク質抗体を用いた免疫組織化学検査によって検出された(褐色)。矢印は脱髄を示す。グラフは、盲検病理分析によって各処置群で脱髄を示したマウス%を表す。2つの実験的複製。データは平均±SEMである。統計分析は、テューキーの検定で一元配置分散分析を用いて実施された。＊＊P < 0.01。 図20-1の説明を参照のこと。 図21A～H．SA-IL-4処置は、脊髄への白血球の浸潤を阻害し、流入領域LNにおいて免疫抑制細胞を誘導する。マウスに免疫後8日目から10日間1日おきにwt IL-4、SA-IL-4もしくはPBSをi.p.注射しまたはSA-IL-4をs.c.注射し、あるいはFTY720 1 mg/kg体重を免疫後8日目から毎日経口投与した。免疫17日後に、流入領域LNおよび脊髄からの細胞を単離し、フローサイトメトリーによって分析した。(a～b) 脊髄における生細胞内の(a) CD45+白血球および(b) RoR□t+ Th17細胞の頻度。(c～g) 腰流入領域LN (dLN)において、(c) CD11b+CD45+細胞内のLy6G+Ly6C+ G-MDSC、(d) CD11b+CD45+細胞内のLy6G-Ly6C+ M-MDSC、(e) CD4+CD3+ T細胞内のRoR□t+ Th17細胞、(f) F4/80+CD11b+マクロファージ内のCD86+ M1マクロファージ、(g) F4/80+CD11b+マクロファージ内のCD206+ M2マクロファージ、および(h) CD11b+CD45+細胞内のB220+ B細胞の頻度を分析した。データは平均±SEMである。実験は1回実施した。統計分析は、テューキーの検定で一元配置分散分析を用いて実施された。＊P < 0.05, ＊＊P < 0.01。 図22A～P．SA-IL-4処置は、PD-1/PD-L1軸を活性化し、T細胞におけるインテグリンおよびサイトカインの発現を減少させる。MOG35～55誘発EAEマウスに、免疫後8、10および12日目にPBS、wt IL-4またはSA-IL-4をs.c.注射した。13日目に脊髄および脾臓を分離し、(a～i) 免疫細胞を分析した。(a) 脊髄におけるCD4+ T細胞内の四量体+ (MOG35～55を認識する)細胞の頻度。脾臓において、(b) 四量体+ CD4+ T細胞内のαLβ2インテグリン+細胞、(c) 四量体+ CD4+ T細胞内のα4β1インテグリン+細胞、(d) CD8+ T細胞内のαLβ2インテグリン+細胞、および(e) CD8+ T細胞内のα4β1インテグリン+細胞が示されている。(f) 中央記憶(CM) CD44+CD62L+CD4+ T細胞のPD-1の平均蛍光強度(MFI)、(g) CM CD44+CD62L+CD8+ T細胞のPD-1のMFI、(h) Ly6C+Ly6G-CD11b+ M-MDSCのPD-L1のMFI、(i) Ly6C+Ly6G-CD11b+ M-MDSCのPD-L1+の頻度、(j) Ly6C+Ly6G+CD11b+ G-MDSCのPD-L1のMFI、(k) Ly6C+Ly6G+CD11b+ G-MDSCのPD-L1+の頻度、(l) 四量体+ CD4+ T細胞内のIL-23R+細胞の頻度。(m～n) 脾細胞をMOGタンパク質の存在下、インビトロで3日間培養した。培地中の(m) IL-17A、(n) IFNγ、(o) GM-CSF濃度をELISAによって分析した。(p) 脾細胞をMOG35～55ペプチドの存在下、インビトロで6時間培養した。CD4+ T細胞内のサイトカイン発現を、フローサイトメトリーによって特徴付けた。データは平均±SEMである。実験は1回実施した。統計分析は、テューキーの検定で一元配置分散分析を用いて実施された。＊P < 0.05, ＊＊P < 0.01。 図22-1の説明を参照のこと。 図23A～K．EAEの慢性期におけるSA-IL-4処置は、臨床スコアを低下させ、脊髄への免疫細胞の浸潤を防ぐ。EAEは、MOG35～55を用いてC57BL/6マウスにおいて誘発された。PBS、wt IL-4またはSA-IL-4を免疫後21日目から10日間1日おきにi.p.注射した。(a) 疾患の進行および(b) 体重の変化が示されている(n = 6)。(c～d) PBS、wt IL-4またはSA-IL-4を免疫後21日目から12日間1日おきにs.c.注射した。(c) 疾患の進行および(d) 体重の変化が示されている(PBSおよびSA-IL-4の場合はn=8; 他の処置群の場合はn=7)。(e～h) 34日目に、脊髄および脾臓を収集し、免疫細胞をフローサイトメトリーによって分析した。グラフは、(e) 脊髄における生細胞内のCD45+細胞、(f) 脊髄における生細胞内のCD4+CD3+CD45+ T細胞、(g) 脊髄における生細胞内の四量体+ (MOG35～55を認識する) RoRγt+CD4+ Th17細胞、(h) 脾臓における四量体+CD4+細胞内のIL-23R+細胞の頻度を表す。(i～j) 脾細胞をMOGタンパク質の存在下、インビトロで3日間培養した。培地中の(i) IL-17A、(j) GM-CSF濃度をELISAによって分析した。(k) 脾細胞をMOG35～55ペプチドの存在下、インビトロで6時間培養した。CD4+ T細胞内のサイトカイン発現をフローサイトメトリーによって特徴付けた。実験は1回実施した。データは平均±SEMである。統計分析は、テューキーの検定で一元配置分散分析を用いて実施された。＊P < 0.05, ＊＊P < 0.01。 図23-1の説明を参照のこと。 注射されたSA-IL-4は、IVISによって分析され、wt IL-4よりも多くLNに蓄積する。LNにおけるDyLight 800標識wt IL-4およびSA-IL-4の生体内分布分析。等量の蛍光とともに10μgのwt IL-4またはSA-IL-4を注射4時間後i.v.注射し、腰LNを採取し、IVISインビボイメージングシステムによって画像化した(n = 6)。データは平均±SEMである。実験は1回実施した。統計分析は、スチューデントのt検定を用いて実施された。 図25A～B．SA-IL-4に対するSA(P573K)変異は、血中濃度を低下させ、FcRn結合を無効化する。マウスに40μgのwt IL-4、SA-IL-4、またはSA(P573K)-IL-4をi.v.注射した。1時間後、採血し、血漿中のIL-4濃度をELISAによって決定した。データは平均±SEMである。(b) SPRによって測定されたSA(P573K)-IL-4およびFcRnの結合親和性。結合親和性を決定することができなかった。1stおよび2ndは、バラツキを検証するために62.5 nMの濃度を2回試験したことを意味する。2つの実験的複製。 SA-IL-4の長期的処置は、EAE疾患の発症および進行を抑制する。PBSまたはSA-IL-4 (IL-4を基準に10μg)を免疫後8日目から16日間1日おきにi.p.注射したC57BL/6 MOG35～55 EAEマウスでの疾患進行(n=8)。各処置群における総マウスあたりのEAE発症マウスの数が示されている。マウスを24日目までモニターした。データは平均±SEMである。2つの実験的複製。統計分析は、スチューデントのt検定を用いて実施された。＊＊P < 0.01。 FcRn結合は、SA-IL-4がEAE疾患の発症および進行を抑制するために重要である。PBSまたはSA-IL-4 (IL-4を基準に10μg)を免疫後8日目から1日おきにi.p.注射したC57BL/6 MOG35～55 EAEマウスでの疾患進行(n=6)。データは平均±SEMである。2つの実験的複製。統計分析は、スチューデントのt検定を用いて実施された。＊＊P < 0.01。 図28A～B．SA-IL-4は、脊髄および流入領域LNにおけるマクロファージおよび樹状細胞の数に影響を与えなかった。マウスに免疫後8日目から10日間1日おきにwt IL-4、SA-IL-4もしくはPBSをi.p.注射し、またはSA-IL-4をs.c.注射した。FTY720 1 mg/kg体重を、免疫後8日目から毎日経口投与した。免疫17日後に、流入領域LN (dLN)および脊髄からの細胞を分離し、フローサイトメトリーによって分析した。(a) CD11b+細胞内のF4/80+マクロファージ、および(b) CD45+細胞内のCD11b+ CD11c+ DCの頻度を分析した。データは平均±SEMである。実験は1回実施した。統計分析は、テューキーの検定で一元配置分散分析を用いて実施された。 図29A～O．SA-IL-4の血液および臓器分析により、SA-IL-4は安全であることが明らかにされた。SA-IL-4の毒性分析。10μgのwt IL-4または等モルのSA-IL-4をナイーブマウスにi.v.注射した。2日後、(a～i) 血清を、生化学分析器を用いて試験し、(j～m) 血液を、血液分析器を用いて試験した。肺水分量を、凍結乾燥前後の肺の重量を量ることによって決定した。データは平均±SEMである。実験は1回実施した。統計分析は、テューキーの検定で一元配置分散分析を用いて実施された。 図29-1の説明を参照のこと。 図30A～D．フローサイトメトリーのゲーティング戦略。(A) 再刺激(サイトカイン発現)。(B) インテグリン発現。(C) MDSC。(D) CD45+およびT細胞。 図30Aの説明を参照のこと。 図30Aの説明を参照のこと。 図30Aの説明を参照のこと。
詳細な説明
炎症性疾患および自己免疫疾患に対する薬物の治療効果を増強することには、非常に大きな需要がある。考えられるアプローチの1つは、抗炎症薬を炎症部位にターゲティングすることである。コラーゲンは、大部分の組織において脈管構造の透過性が低いためにアクセス不能であるが、炎症部位においては脈管構造の過透過性のために血流に露出される。本開示は、ECM親和性ペプチドにコンジュゲートされたECM結合性抗炎症剤について記述する。そのようなペプチドの1つはコラーゲン結合ペプチド(CBP)である。CBPコンジュゲーションは、抗TNFα抗体(αTNF)に対するコラーゲン親和性をもたらした。CBP-αTNFは、コラーゲン抗体誘発関節炎モデルの炎症部位に蓄積した(実施例1)。関節炎の発症は未改変抗体と比較して、CBP-αTNFにより有意に抑制された。さらに、インターロイキン(IL)-4へのフォンヴィルブランド因子(vWF) A3ドメイン融合(A3-IL4)に由来するコラーゲン結合ドメインにより、静脈内投与後、多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の脊髄において検出することができるようになった(実施例1)。A3-IL4はEAEの臨床症状を低減したが、通常のIL-4は低減しなかった。コラーゲン結合タンパク質は、自発的炎症性腸疾患、ブレオマイシン誘発性肺線維症、およびI型糖尿病モデルの炎症組織において検出可能であった。まとめると、コラーゲン親和性により、抗炎症薬を炎症部位にターゲティングすることが可能になることから、炎症性疾患および自己免疫疾患を処置するための臨床的に技術移転の新たなアプローチが実証される。
III. 抗炎症剤
A. 抗体
本開示の局面は、抗炎症性抗体またはその断片に関する。「抗体」という用語は、標的抗原への特異的結合についてインタクトな抗体と競合できる任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン、またはその断片をいい、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および二重特異性抗体を含む。本明細書において用いられる場合、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は互換的に用いられ、IgG、IgD、IgE、IgA、IgMおよび関連タンパク質を含めて、動物の免疫応答の一部として機能する構造的に関連するタンパク質のいくつかのクラスのいずれか、ならびに抗原結合活性を保持する抗体CDRドメインを含むポリペプチドをいう。
「抗原」という用語は、抗体などの、選択的結合剤によって結合されうる分子または分子の一部分をいう。抗原は、異なる抗体と相互作用することができる1つまたは複数のエピトープを保有しうる。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に結合することによって免疫応答を誘発することができる分子の任意の領域または部分を含む。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基などの化学的に活性な表面基を含み、特定の三次元構造特性および/または特定の電荷特性を有しうる。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、複合混合物内の標的抗原上のエピトープを選択的に認識する。
所与のポリペプチドのエピトープ領域は、X線結晶構造解析、核磁気共鳴分光法、部位特異的変異誘発マッピング、タンパク質ディスプレイアレイを含む、当技術分野において周知である多くの異なるエピトープマッピング技法を用いて同定することができ、例えば、Epitope Mapping Protocols, (Johan Rockberg and Johan Nilvebrant , Ed., 2018) Humana Press, New York, N.Yを参照されたい。そのような技法は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第4,708,871号; Geysen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1984); Geysen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182 (1985); Geysen et al. Molec. Immunol. 23:709-715 (1986に記述されている。例えば、Epitope Mapping Protocols, 前記を参照されたい。さらに、タンパク質の抗原性領域は、標準的な抗原性および疎水性プロットを用いて予測および同定することもできる。
インタクトな抗体は一般に、2本の全長重鎖および2本の全長軽鎖で構成されるが、場合によっては、重鎖のみを含みうるラクダ科動物に天然に存在する抗体のような、より少ない鎖を含みうる。本明細書において開示される抗体は、単一の供給源のみに由来しうるか、または「キメラ」でありえ、すなわち、抗体の異なる部分が2つの異なる抗体に由来しうる。例えば、可変領域またはCDR領域は、ラットまたはマウス供給源に由来しうるが、定常領域はヒトなどの、異なる動物供給源に由来する。抗体または結合断片は、ハイブリドーマにおいて、組換えDNA技法によって、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生されうる。特に指示のない限り、「抗体」という用語は、その誘導体、変種、断片、およびムテインを含み、その例は以下に記述されている(Sela-Culang et al. Front Immunol. 2013; 4: 302; 2013)。
「軽鎖」という用語は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する全長軽鎖およびその断片を含む。全長軽鎖は、25,000ダルトン前後の分子量を有し、可変領域ドメイン(本明細書においてVLと略される)、および定常領域ドメイン(本明細書においてCLと略される)を含む。カッパ(κ)およびラムダ(λ)と特定される、軽鎖の分類が2つある。「VL断片」という用語は、CDRを含む、軽鎖可変領域の全部または一部を含むモノクローナル抗体の軽鎖の断片を意味する。VL断片は、軽鎖定常領域配列をさらに含むことができる。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。
「重鎖」という用語は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する全長重鎖およびその断片を含む。全長重鎖は、50,000ダルトン前後の分子量を有し、可変領域ドメイン(本明細書においてVHと略される)、および3つの定常領域ドメイン(本明細書においてCH1、CH2、およびCH3と略される)を含む。「VH断片」という用語は、CDRを含む、重鎖可変領域の全部または一部を含むモノクローナル抗体の重鎖の断片を意味する。VH断片は、重鎖定常領域配列をさらに含むことができる。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに依存するであろう。VHドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、CHドメインはカルボキシ末端にあり、CH3は-COOH末端に最も近い。抗体のアイソタイプは、IgM、IgD、IgG、IgA、またはIgEであることができ、5つの分類: それぞれミュー(μ)、デルタ(δ)、ガンマ(γ)、アルファ(α)、またはイプシロン(ε)鎖が存在する重鎖により定義される。IgGは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含むが、これらに限定されない、いくつかのサブタイプを有する。IgMサブタイプはIgM1およびIgM2を含む。IgAサブタイプはIgA1およびIgA2を含む。
抗体は、任意のアイソタイプもしくは分類の全免疫グロブリン、キメラ抗体、または2つもしくはそれ以上の抗原に対する特異性を有するハイブリッド抗体であることができる。それらはまた、ハイブリッド断片を含む断片(例えば、F(ab')2、Fab'、Fab、Fvなど)でありうる。免疫グロブリンは、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する、天然タンパク質、合成タンパク質、または遺伝子操作されたタンパク質も含む。抗体という用語は、以下のような、遺伝子操作された、または他の方法で改変された形態の免疫グロブリンを含む。
「単量体」という用語は、Igユニットを1つだけ含む抗体を意味する。単量体は抗体の基本的な機能単位である。「二量体」という用語は、抗体重鎖の定常ドメイン(Fc領域または断片結晶化可能な領域)を介して互いに結合した2つのIgユニットを含む抗体を意味する。複合体は、連結(J)鎖タンパク質によって安定化されうる。「多量体」という用語は、抗体重鎖の定常ドメイン(Fc領域)を介して互いに結合した2つ超のIgユニットを含む抗体を意味する。複合体は、連結(J)鎖タンパク質によって安定化されうる。
「二価抗体」という用語は、2つの抗原結合部位を含む抗体を意味する。2つの結合部位は、同じ抗原特異性を有してもよく、またはそれらは二重特異性であってもよく、2つの抗原結合部位が異なる抗原特異性を有することを意味する。
二重特異性抗体は、2つまたはそれ以上の異なるエピトープに対する異なる結合部位を有する2つのパラトープを持つ抗体のクラスである。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、バイパラトピックであることができ、ここで、二重特異性抗体は、同じ抗原からの異なるエピトープを特異的に認識しうる。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、「ナノボディ」と称される一対の異なる単一ドメイン抗体から構築することができる。単一ドメイン抗体は、軟骨魚類およびラクダ科動物から供給され、改変されている。ナノボディは、当業者にとっては通常の技法を用いリンカーによって一緒に連結されうる; ナノボディの選択および連結のためのそのような方法は、PCT公開番号WO2015044386A1、同番号WO2010037838A2、およびBever et al., Anal Chem. 86:7875-7882 (2014)に記述されており、それらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に具体的に組み入れられる。
二重特異性抗体は、IgG全体、Fab'2、Fab'PEG、ダイアボディとして、または代わりにscFvとして構築することができる。ダイアボディおよびscFvは、可変ドメインのみを用いFc領域なしで構築できるため、抗イディオタイプ反応の影響を低減できる可能性がある。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の連結を含むが、これらに限定されない、種々の方法によって産生されうる。例えば、Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)を参照されたく、それらはそれぞれ参照によりその全体が具体的に組み入れられる。
ある種の局面において、抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合するVHおよびVL領域対と多量体化することにより、多重特異的または異種特異的でありうる。例えば、抗体は、(a) 細胞表面抗原、(b) エフェクタ細胞の表面上のFc受容体、または(c) 少なくとも1つの他の成分に結合するか、またはそれらと相互作用しうる。したがって、局面には、エピトープにおよびエフェクタ細胞上のFc受容体などの他の標的に向けられる、二重特異性、三重特異性、四重特異性、および他の多重特異性抗体またはそれらの抗原結合断片が含まれうるが、これらに限定されることはない。
いくつかの態様において、多重特異性抗体は、当技術分野において公知の常法を用いて、使用され、短い可動性のポリペプチド鎖を介して直接連結されうる。そのような例の1つは、VHおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖で発現され、同鎖上のドメイン間の対合を可能にするには短すぎ、それによってドメインを別鎖の相補的ドメインと対合させ、2つの抗原結合部位を作出する二価の、二重特異性抗体であるダイアボディである。リンカー機能性は、トリアボディ、テトラボディ、およびさらに高次の抗体多量体の態様に適用可能である。(例えば、Hollinger et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Polijak et al., Structure 2:1121-1123 (1994); Todorovska et al., J. Immunol. Methods 248:47-66 (2001)を参照のこと)。
二重特異性全抗体とは対照的に、二重特異性ダイアボディもまた、大腸菌(E. coli)において容易に構築および発現されうるため、有利でありうる。適切な結合特異性のダイアボディ(および抗体断片などの他のポリペプチド)は、ライブラリからのファージディスプレイ(WO94/13804)を用いて容易に選択することができる。ダイアボディの一方の腕部が一定に保たれている場合、例えば、タンパク質に対する特異性が保たれている場合、他方の腕部を変化させ、適切な特異性の抗体を選択するライブラリが作出されうる。二重特異性全抗体は、Ridgewayら(Protein Eng., 9:616-621, 1996)およびKrahら(N Biotechnol. 39:167-173, 2017)に記述されているように代替の操作方法によって作出されてもよく、それらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
ヘテロコンジュゲート抗体は、異なる特異性を有する2つの共有結合したモノクローナル抗体で構成されている。例えば、参照により全体が本明細書に組み入れられる米国特許第6,010,902号を参照されたい。
抗原のエピトープに高い特異性で結合する抗体分子のFv断片の部分は、本明細書において「パラトープ」といわれる。パラトープは、抗原のエピトープと接触して抗原認識を促進するアミノ酸残基からなる。抗体の2つのFv断片の各々は、二量体化された構成での、2つの可変ドメインVHおよびVLで構成されている。可変ドメインの各々の一次構造は、フレームワーク領域(FR)により区切られ、隣接される3つの超可変ループを含む。超可変ループは、任意の哺乳動物からの抗体分子間で一次配列の変動性が最も大きい領域である。超可変ループという用語は、「相補性決定領域(CDR)」という用語と互換的に用いられることがある。超可変ループ(またはCDR)の長さは、抗体分子によって異なる。所与の哺乳動物からの全ての抗体分子のフレームワーク領域は、高い一次配列類似性/コンセンサスを有する。フレームワーク領域のコンセンサスは、フレームワーク領域と、フレームワーク領域の間に散在する超可変ループ(またはCDR)の両方を識別するために当業者によって使用されうる。超可変ループには、ポリペプチド内での位置と、それらが発生するドメインを区別する識別名が付けられている。VLドメイン中のCDRは、L1、L2、およびL3として識別され、L1が最遠位端に存在し、L3がCLドメインの最も近くに存在する。CDRには、CDR-1、CDR-2、およびCDR-3という名前も付されうる。L3 (CDR-3)は一般に、所与の生物によって産生される全ての抗体分子の中で最も変動性の高い領域である。CDRは、一次構造において直線的に配置され、フレームワーク領域によって互いに分離されたポリペプチド鎖の領域である。VL鎖のアミノ末(N末)端はFR1と名付けられている。FR2として識別される領域は、L1とL2超可変ループの間に存在する。FR3はL2とL3超可変ループの間に存在し、FR4領域はCLドメインに最も近い。この構造および命名法が、H1、H2およびH3として識別される3つのCDRを含むVH鎖に対して繰り返される。可変ドメイン、またはFv断片(VHおよびVL)におけるアミノ酸残基の大部分は、フレームワーク領域の一部(およそ85%)である。抗体分子の三次元または三次構造は、フレームワーク領域が分子のより内部にあり、分子の外面にCDRを備えた、構造の大部分を提供するようなものである。
これらの領域の各々を構成する正確なアミノ酸を特定するために、いくつかの方法が開発されており、当業者によって用いられうる。これは、フレームワーク領域を構成する保存されたアミノ酸残基を特定する、いくつかの複数の配列アライメント方法およびアルゴリズムのいずれかを用いて行われ、それゆえ、長さが異なりうるが、フレームワーク領域間に位置するCDRを特定することができる。抗体のCDRの特定のために、一般的に使用される3つの方法が開発されている: Kabat (T. T. Wu and E. A. Kabat, 「AN ANALYSIS OF THE SEQUENCES OF THE VARIABLE REGIONS OF BENCE JONES PROTEINS AND MYELOMA LIGHT CHAINS AND THEIR IMPLICATIONS FOR ANTIBODY COMPLEMENTARITY」, J Exp Med, vol. 132, no. 2, pp. 211-250, Aug. 1970に記述の通り); Chothia (C. Chothia et al., 「Conformations of immunoglobulin hypervariable regions」, Nature, vol. 342, no. 6252, pp. 877-883, Dec. 1989に記述の通り); およびIMGT (M.-P. Lefranc et al., 「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」, Developmental & Comparative Immunology, vol. 27, no. 1, pp. 55-77, Jan. 2003に記述の通り)。これらの方法は各々、可変領域を構成するアミノ酸残基の特定のための固有の付番システムを含む。大部分の抗体分子において、抗原のエピトープと実際に接触するアミノ酸残基はCDRに存在するが、場合によっては、フレームワーク領域内の残基が抗原結合に寄与する。
当業者は、抗体のパラトープを決定するために、いくつかの方法のいずれかを用いることができる。これらの方法は以下を含む。
1) 抗体可変領域のアミノ酸配列の化学的性質およびエピトープの組成に基づく抗体/エピトープ結合相互作用の三次構造の計算による予測。
2) 水素-重水素交換および質量分析
3) ポリペプチドの全長から複数の重複するペプチド断片を作出し、これらのペプチドのエピトープに対する結合親和性を評価する、ポリペプチド断片化およびペプチドマッピングアプローチ。
4) 哺乳動物の抗体Fab断片コード遺伝子が、ファージのコートに組み込まれるようにバクテリオファージによって発現される抗体ファージディスプレイライブラリ分析。次に、このFab発現ファージの集団が、固定化されているか、または異なる外因性発現系によって発現されうる抗原と相互作用させられる。非結合Fab断片は洗い流され、それによって特異的結合Fab断片のみが抗原に付着したままになる。結合Fab断片は容易に単離することができ、それらをコードする遺伝子を決定することができる。このアプローチは、必要に応じてFv断片または特定のVHおよびVLドメインを含むFab断片のさらに小さな領域にも用いることができる。
ある種の局面において、親和性成熟抗体は、それらの改変を保有しない親抗体と比較して、標的抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす、その1つまたは複数のCDRにおける1つまたは複数の改変で増強される。ある種の親和性成熟抗体は、標的抗原に対するナノモルまたはピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当技術分野において公知の手順により産生され、例えば、Marks et al., Bio/Technology 10:779 (1992)には、VHおよびVLドメインシャッフリングによる親和性成熟が記述されており、ファージディスプレイにおいて利用されるCDRおよび/またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発が、Tiller et al., Front. Immunol. 8:986 (2017)に実証されている計算方法と組み合わせてRajpal et al., PNAS. 24: 8466-8471 (2005)およびThie et al., Methods Mol Biol. 525:309-22 (2009)により記述されている。
キメラ免疫グロブリンは、異なる種に由来する融合遺伝子の産物である; 「ヒト化」キメラは一般に、ヒト免疫グロブリンからのフレームワーク領域(FR)を有し、1つまたは複数のCDRは非ヒト供給源からのものである。
ある種の局面において、重鎖および/または軽鎖の部分は、別の特定の種からのまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する対応配列と同一または相同であるが、鎖の残部は、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、および所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片における対応配列と同一または相同である。米国特許第4,816,567号; およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)。キメラ抗体に関する方法については、例えば、米国特許第4,816,567号; およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1985)を参照されたく、それらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に具体的に組み入れられる。CDRグラフト化は、例えば、米国特許第6,180,370号、同第5,693,762号、同第5,693,761号、同第5,585,089号、および同第5,530,101号に記述されており、これらは全て、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、非ヒト種からの抗体ポリペプチド配列を最小化することで、キメラ抗体機能が最適化され、免疫原性が低減される。非ヒト抗体の非抗原認識領域からの特定のアミノ酸残基は、ヒト抗体またはアイソタイプにおける対応残基と相同であるように改変される。1つの例は「CDRグラフト化」抗体であり、ここで該抗体は、特定の種からのまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する1つまたは複数のCDRを含むが、抗体鎖の残部は、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同である。ヒトにおいて用いるためには、非ヒト免疫グロブリンからの軽鎖および重鎖変動領域の両方のCDR1、CDR2、および部分的CDR3で構成されるV領域が、ヒト抗体フレームワーク領域でグラフト化され、ヒト抗体の天然抗原受容体を非ヒトCDRに置き換える。場合によっては、対応する非ヒト残基がヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域残基に置き換わる。さらに、ヒト化抗体は、性能をさらに精緻化するために、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含みうる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含みうる。例えば、Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992); Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol. 1:105 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23; 1035 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428 (1994); Verhoeyen et al., Science 239:1534-36 (1988)を参照されたい。
イントラボディは、細胞外空間中の抗原に結合する分泌抗体とは対照的に、細胞内抗原に結合する細胞内に局在する免疫グロブリンである。
ポリクローナル抗体調製物は、通常、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含む。ポリクローナル抗体を産生するために、ウサギまたはヤギなどの宿主を、一般にアジュバントとともに、必要に応じて、担体に結合させて、抗原または抗原断片で免疫する。その後、抗原に対する抗体を宿主の血清から回収する。ポリクローナル抗体を抗原に対してアフィニティー精製し、それを単一特異性にすることができる。
モノクローナル抗体または「mAb」は、唯一の親細胞からの均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、例えば、集団は、少量で存在しうる天然変異を除いて同一である。各モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基に対するものである。
1. 機能的抗体断片および抗原結合断片
a. 抗原結合断片
ある種の局面は、炎症性メディエータに結合するおよび/または炎症性メディエータを中和する抗体断片などの、抗体断片に関する。機能的抗体断片という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の抗原結合断片を含む。これらの断片は、可変領域重鎖(VH)および/または軽鎖(VL)のさまざまな配置で構成されており; いくつかの態様において、定常領域重鎖1 (CHl)および軽鎖(CL)を含む。いくつかの態様において、それらは、重鎖2 (CH2)および3 (CH3)ドメインで構成されるFc領域を欠いている。抗原結合断片およびその改変の態様は、以下を含みうる: (i) VL、VH、CL、およびCHlドメインで構成されるFab断片タイプ; (ii) VHおよびCHlドメインで構成されるFd断片タイプ; (iii) VHおよびVLドメインで構成されるFv断片タイプ; (iv) 単一のVHまたはVLドメインで構成される単一ドメイン断片タイプdAb (Ward, 1989; McCafferty et al., 1990; Holt et al., 2003); (v) 単離された相補性決定領域(CDR)領域。そのような用語は、例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R. A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989)およびDay, E. D., Advanced Immunochemistry, 2d ed., Wiley-Liss, Inc. New York, N.Y. (1990); Antibodies, 4:259-277 (2015)に記述されている。この段落での引用は全て参照により組み入れられる。
抗原結合断片は、軽鎖可変領域からの正確に、少なくとも、または多くとも1つ、2つ、または3つの相補性決定領域(CDR)を保持する抗体の断片も含む。Fc領域(またはそのCH2もしくはCH3領域)へのCDR含有配列の融合は、例えば、本明細書に含まれるFc領域に、直接的または間接的に融合されたscFvを含めて、この定義の範囲内に含まれる。
Fab断片という用語は、VL、VH、CLおよびCH1ドメインを含む抗体の一価の抗原結合断片を意味する。Fab'断片という用語は、Fab断片よりも大きいモノクローナル抗体の一価の抗原結合断片を意味する。例えば、Fab'断片は、VL、VH、CLおよびCH1ドメインならびにヒンジ領域の全部または一部を含む。F(ab')2断片という用語は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された2つのFab'断片を含むモノクローナル抗体の二価の抗原結合断片を意味する。F(ab')2断片は、例えば、2つのVHおよびVLドメインの全部または一部を含み、2つのCLおよびCH1ドメインの全部または一部をさらに含むことができる。
Fd断片という用語は、CDRを含む、VHの全部または一部を含むモノクローナル抗体の重鎖の断片を意味する。Fd断片は、CH1領域配列をさらに含むことができる。
Fv断片という用語は、VLおよびVHの全部または一部を含み、CLおよびCH1ドメインのない、モノクローナル抗体の一価の抗原結合断片を意味する。VLおよびVHは、例えば、CDRを含む。一本鎖抗体(sFvまたはscFv)は、VL領域およびVH領域が可動性のリンカーによりつながれて、抗原結合断片を形成する、単一のポリペプチド鎖を形成するFv分子である。一本鎖抗体は、国際特許出願公開番号WO 88/01649ならびに米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号に詳細に論じられており、それらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。(scFv)2という用語は、ヒンジ領域によってsFvから分離された、C末端にオリゴマー化ドメインを含む二価または二重特異性のsFvポリペプチド鎖を意味する(Pack et al. 1992)。オリゴマー化ドメインは、自己会合性a-ヘリックス、例えば、ロイシンジッパーを含み、これをさらなるジスルフィド結合によってさらに安定化することができる。(scFv)2断片は、「ミニ抗体」または「ミニボディ」としても公知である。
単一ドメイン抗体は、VHまたはVLドメインのみを含む抗原結合断片である。場合によっては、2つまたはそれ以上のVH領域がペプチドリンカーで共有結合されて、二価ドメイン抗体を作出する。二価ドメイン抗体の2つのVH領域は、同じまたは異なる抗原を標的としうる。
b. 断片結晶化可能領域Fc
Fc領域は、抗体のCH2およびCH3ドメインを含む2つの重鎖断片を含む。2つの重鎖断片は、2つまたはそれ以上のジスルフィド結合によっておよびCH3ドメインの疎水性相互作用によって一緒に保持されている。本明細書において用いられる「Fcポリペプチド」という用語は、抗体のFc領域に由来するポリペプチドの天然型およびムテイン型を含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含むそのようなポリペプチドの切断型が含まれる。
2. 抗体CDRおよびCDRを提示する足場ドメインを有するポリペプチド
相補性決定領域(CDR)などの、抗原結合ペプチド足場は、態様にしたがってタンパク質結合分子を作出するために用いられる。一般に、当業者は、少なくとも1つのCDRをグラフト化するタンパク質足場のタイプを決定することができる。足場は、最適には、良好な系統発生的保存; 公知の三次元構造; 小さいサイズ; 転写後修飾がほとんどもしくは全くない; 生成、発現、および精製することが容易であるなどの、いくつかの基準を満たさなければならないことが知られている。Skerra, J Mol Recognit, 13:167-87 (2000)。
タンパク質足場は、フィブロネクチンIII型FN3ドメイン(「モノボディ」として知られる)、フィブロネクチンIII型ドメイン10、リポカリン、アンチカリン、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のプロテインAのZドメイン、チオレドキシンAまたは「アンキリンリピート」、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」および「テトラトリコペプチドリピート」などの繰り返しモチーフを有するタンパク質から供給することができるが、これらに限定されることはない。そのようなタンパク質は、米国特許出願公開第2010/0285564号、同第2006/0058510号、同第2006/0088908号、同第2005/0106660号、およびPCT公開番号WO2006/056464に記述されており、それらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に具体的に組み入れられる。サソリ、昆虫、植物、軟体動物などからの毒素に由来する足場、およびニューロンNO合成酵素のタンパク質阻害剤(PIN)も用いられうる。
B. サイトカイン
サイトカインは、細胞が興奮時に放出する一群のタンパク質である(細胞膜に発現されるサイトカインはごくわずかである)。細胞によって産生されるサイトカインは、近くの標的細胞にまたは血液循環を通じて非常に低濃度で影響を与えることができる。それらは、標的細胞の成長、分化、および活性化を促進する上で幅広い機能を有する。多くのサイトカインは免疫細胞を標的とし、免疫応答において役割を果たしうる。構造的および機能的な違いに基づいて、サイトカインは、ケモカイン、インターロイキン、成長因子、形質転換成長因子、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、およびインターフェロンに大きく分類されうる。
以下のサイトカインは、本開示の方法および組成物において抗炎症剤として用いられうる。例示的な配列を以下に提供するが、当技術分野において公知の同等または相同のタンパク質も用いられうる。
ヒトIL-1ra:
Figure 2022521428000001
マウスIL-1ra:
Figure 2022521428000002
ヒトIL-4:
Figure 2022521428000003
マウスIL-4:
Figure 2022521428000004
ヒトIL-5:
Figure 2022521428000005
マウスIL-5:
Figure 2022521428000006
ヒトIL-10:
Figure 2022521428000007
マウスIL-10:
Figure 2022521428000008
ヒトIL-11:
Figure 2022521428000009
マウスIL-11:
Figure 2022521428000010
ヒトIL-23; p19サブユニット:
Figure 2022521428000011
p40サブユニット:
Figure 2022521428000012
ヒトIL-35; p35サブユニット:
Figure 2022521428000013
Ebi3サブユニット:
Figure 2022521428000014
マウスIL-35; p35サブユニット:
Figure 2022521428000015
Ebi3サブユニット:
Figure 2022521428000016
ヒトIL-36ra:
Figure 2022521428000017
マウスIL-36ra:
Figure 2022521428000018
ヒトIL-37:
Figure 2022521428000019
マウスIL-37:
Figure 2022521428000020
ヒトインターフェロン-β:
Figure 2022521428000021
マウスインターフェロン-β:
Figure 2022521428000022
ヒトTGF-β1:
Figure 2022521428000023
マウスTGF-β1:
Figure 2022521428000024
ヒトTNF受容体I:
Figure 2022521428000025
ヒトTNF受容体II:
Figure 2022521428000026
マウスTNF受容体II:
Figure 2022521428000027
C. CD200
本開示の態様は、抗炎症剤CD200を含むポリペプチドおよび組成物に関する。例示的なCD200ポリペプチドアミノ酸配列を以下に示す。
マウスCD200細胞外ドメインは、以下の配列によって表される。
Figure 2022521428000028
マウスCD200-MSA融合タンパク質(リンカーには下線が引かれている):
Figure 2022521428000029
ヒトCD200細胞外ドメイン(UniProt識別番号P41217)は、以下の配列によって表される。
Figure 2022521428000030
例示的なヒトCD200 (小文字)-ヒト血清アルブミン(大文字)融合タンパク質(リンカーは大文字で下線が引かれている)は、以下によって表される。
Figure 2022521428000031
マウスCD200 (小文字)-CBD融合タンパク質(大文字) (リンカーは大文字で下線が引かれている)は、以下によって表される。
Figure 2022521428000032
ヒトCD200 (小文字)-CBD融合タンパク質(大文字) (リンカーは大文字で下線が引かれている)は、以下によって表される。
Figure 2022521428000033
マウスCD200 (大文字)-マウス血清アルブミン(小文字)-CBD (イタリック下線大文字)融合タンパク質は、以下によって表される(リンカーは大文字で下線が引かれている)。
Figure 2022521428000034
ヒトCD200 (大文字)-ヒト血清アルブミン(小文字)-CBD (イタリック下線大文字)融合タンパク質は、以下によって表される(リンカーは大文字で下線が引かれている)。
Figure 2022521428000035
IV. ECM親和性ペプチド
コラーゲンは細胞外マトリックス(ECM)タンパク質であり、正常組織と腫瘍組織の両方で増殖、分化、および接着などの、種々の細胞生物学的機能を調節する(Ricard-Blum, Cold Spring Harb Perspect Biol 3:a004978, 2011)。コラーゲンは哺乳動物の体内で最も豊富なタンパク質であり、ほぼ全ての組織において28のアイソフォームのうちの1つまたは複数として存在する(Ricard-Blum, Cold Spring Harb Perspect Biol 3:a004978, 2011)。血管の内皮下腔はコラーゲンが豊富である。生理学的条件下で不溶性のため、コラーゲンは血液内にほとんど存在しない(Dubois et al., Blood 107:3902-06, 2006; Bergmeier and Hynes, Cold Spring Harb Perspect Biol 4:a005132, 2012)。腫瘍脈管構造は、異常な構造のために透過性であると報告されている(Nagy et al., British journal of cancer 100:865, 2009)。したがって、その漏出性脈管構造により、コラーゲンは腫瘍中で露出されている(Liang et al., Journal of controlled release 209:101-109, 2015; Liang et al., Sci Rep 6:18205, 2016; Yasunaga et al., Bioconjugate Chemistry 22:1776-83, 2011; Xu et al. The Journal of cell biology 154:1069-80, 2001; Swartz and Lund, Nat Rev Cancer 12:210-19)。また、腫瘍組織は、正常組織と比較して増加した量のコラーゲンを含有する(Zhou et al. J Cancer 8:1466-76, 2017; Provenzano et al. BMC Med 6:11, 2008)。
フォンヴィルブランド因子(vWF)は血液凝固因子であり、I型コラーゲンとIII型コラーゲンの両方、および血小板上の接着受容体GPIbに結合する(Lenting et al., Journal of thrombosis and haemostasis:JTH 10:2428-37, 2012; Shahidi Advances in experimental medicine and biology 906:285-306, 2017)。損傷時に、内皮細胞下のコラーゲンが血漿に露出され、vWF-コラーゲン結合が血栓形成カスケードを開始する(Shahidi Advances in experimental medicine and biology 906:285-306, 2017; Wu et al. Blood 99:3623-28, 2002)。報告されている非細菌起源のタンパク質/ペプチドの中で、vWF Aドメインがコラーゲンに対して最も高い親和性を有する(Addi et al., Tissue Engineering Part B: Reviews, 2016)。特にAドメイン内で、vWFのA3ドメインがコラーゲン結合ドメイン(CBD)であると報告されている(Ribba et al. Thrombosis and Haemostasis 86:848-54, 2001)。上記のように、本発明者らは、vWF A3 CBDとの融合タンパク質により、全身注射の場合であっても腫瘍の漏出性脈管構造によるコラーゲンの露出のため、標的サイトカイン免疫療法が実現されうると考えた。
いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドは、デコリン由来のコラーゲン結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドは、ウシに由来するLRELHLNNNC (SEQ ID NO:1)またはヒトに由来するLRELHLDNNC (SEQ ID NO:2)などのデコリンペプチドを含む。
いくつかの態様において、ECMペプチドは、以下のアミノ酸配列:
Figure 2022521428000036
によって表される、ヒトデコリン由来のペプチド断片を含む。
いくつかの態様において、ECMペプチドは、vWF由来のペプチド断片を含む。いくつかの態様において、ECMペプチドは、ヒト配列、残基番号1237～1458 (成熟VWFの残基番号474～695)に由来するvWF A1またはその断片を含み、それはアミノ酸配列
Figure 2022521428000037
によって表される。
いくつかの態様において、ECMペプチドは、以下のアミノ酸配列:
Figure 2022521428000038
によって表されるvWF A3の全部または断片を含む。
いくつかの態様において、ECMペプチドは、以下のアミノ酸配列:
Figure 2022521428000039
によって表されるvWF A3の全部または断片を含む。
いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドは、フォンヴィルブランド因子(vWF)由来のペプチドである。ヒトvWFの配列は以下:
Figure 2022521428000040
Figure 2022521428000041
を含む。
いくつかの態様において、ペプチドは、vWF A3ドメイン由来である。vWF A3ドメインはヒト配列、残基番号1670～1874 (成熟vWFの残基番号907～1111)に由来し、以下の配列:
Figure 2022521428000042
を有する。
いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドは、PlGF-2由来のペプチドを含む。PlGF-2は以下の配列:
Figure 2022521428000043
を有する。
例示的なPlGF-2 ECM親和性ペプチドは、以下:
Figure 2022521428000044
を含む。
いくつかの態様において、ECM親和性ペプチドは、CXCL-12γ由来のペプチドである。CXCL-12γの配列は以下: CXCL-12γ:
Figure 2022521428000045
である。例示的なペプチドは、SEQ ID NO:12の全部または一部および以下のペプチド:
Figure 2022521428000046
を含む。
ECM親和性ペプチドは、上記のECMもしくはCBDペプチドまたはそれらのペプチドの断片と75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)の同一性を有するペプチドでありうる。
リンカー配列が抗炎症剤-ペプチド構築体に含まれうる。例えば、少なくとも、多くとも、または正確に3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個もしくはそれ以上(またはその中で導出可能な任意の範囲)のアミノ酸を有するリンカーがその抗体およびペプチドを分離しうる。
本開示のECM親和性ペプチドは、フィブロネクチン、コラーゲン(I型コラーゲン、III型コラーゲン、および/またはIV型コラーゲン)、テネイシンC、フィブリノゲン、ならびにフィブリンなどの細胞外マトリックスの1つまたは複数の成分に対して親和性を有しうる。ある種の局面において、ECM親和性ペプチドはコラーゲンに対して親和性を有する。および他の局面において、ECM親和性ペプチドはフィブロネクチンに結合しない。
いくつかの態様において、本開示のECM親和性ペプチドおよび/または抗炎症剤は、血清タンパク質にさらに連結される。血清タンパク質は、例えば、アルブミン、グロブリン、およびフィブリノゲンを含む。グロブリンは、アルファ1グロブリン、アルファ2グロブリン、ベータグロブリン、およびガンマグロブリンを含む。アルブミンは、マウス、ヒト、ウシ、または他の任意の相同アルブミンタンパク質でありうる。いくつかの態様において、アルブミンは、ALB遺伝子によりコードされ、以下のアミノ酸配列:
Figure 2022521428000047
により例示されるヒト血清アルブミンを含む。いくつかの態様において、血清アルブミンは、以下の配列:
Figure 2022521428000048
を有するポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、アルブミンは、以下の配列:
Figure 2022521428000049
を有するマウスアルブミンを含む。
関連する態様は、マウス血清アルブミン(MSA) (小文字はMSAである)とグリシンセリンペプチドリンカー(イタリック大文字および下線付き)を通じて連結されたvWF A3 (大文字):
Figure 2022521428000050
を含む。
さらに関連する態様は、マウス血清アルブミン(MSA) (小文字はMSAである)とグリシンセリンペプチドリンカー(イタリック大文字および下線付き)を通じて連結されたvWF A3 (大文字)を含む。ヒト血清アルブミン(HSA) (小文字はHSAである)とグリシンセリンペプチドリンカー(イタリック大文字および下線付き)を通じて連結されたvWF A3 (大文字):
Figure 2022521428000051
V. タンパク性組成物
ECM親和性ペプチド、血清タンパク質、またはサイトカインポリペプチドなどの、本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50個またはそれ以上の変種アミノ酸または核酸置換を含み、あるいはSEQ ID NO:1～66の、少なくとも、または多くとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個もしくはそれ以上またはその中で導出可能な任意の範囲の連続するアミノ酸または核酸と少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%類似、同一、または相同でありうる。
ECM親和性ペプチド、血清タンパク質、またはサイトカインポリペプチドなどの、本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1～66の、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個もしくはそれ以上またはその中で導出可能な任意の範囲の連続するアミノ酸を含みうる。
いくつかの態様において、本開示のポリペプチドは、SEQ ID NO:1～66のアミノ酸1から2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615まで (またはその中で導出可能な任意の範囲)を含みうる。
いくつかの態様において、ECM親和性ペプチド、血清タンパク質、またはサイトカインポリペプチドなどの、本開示のポリペプチドは、SEQ ID NO:1～66の少なくとも、多くとも、または正確に2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615個(またはその中で導出可能な任意の範囲)の連続するアミノ酸を含みうる。
いくつかの態様において、ECM親和性ペプチド、血清タンパク質、またはサイトカインポリペプチドなどの、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1～66のいずれか1つと少なくとも、多くとも、または正確に60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%類似、同一、または相同であるSEQ ID NO:1～66の少なくとも、多くとも、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615個(またはその中で導出可能な任意の範囲)の連続するアミノ酸を含みうる。
ECM親和性ペプチド、血清タンパク質、またはサイトカインポリペプチドなどの、本開示のポリペプチドは、SEQ ID NO:1～66の1つと少なくとも、多くとも、または正確に60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100% (またはその中で導出可能な任意の範囲)類似、同一、または相同でありうる。
いくつかの局面において、SEQ ID NO:1～66のいずれかの位置番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、または615から始まる、かつSEQ ID NO:1～66のいずれかの2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、または615個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸を含む核酸分子またはポリペプチドが存在する。
本開示のポリペプチドおよび核酸は、少なくとも、多くとも、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615個(またはその中で導出可能な任意の範囲)の置換を含みうる。
置換は、SEQ ID NO:1～66の1つのアミノ酸位置番号または核酸位置番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、または615にありうる。これらの置換の1つまたは複数は、態様から特に除外されうる。
SEQ ID NO:1～66のいずれか1つと少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の同一性を有するか、少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の同一性を有するか、または70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%の同一性を有するECM親和性ペプチド、血清タンパク質、またはサイトカインポリペプチドなどの、本開示のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、アミノ酸位置番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200 (またはその中で導出可能な任意の範囲)から始まる、かつアミノ酸位置番号10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、もしくは205 (またはその中で導出可能な任意の範囲)で終わる断片またはセグメントを含む。
置換変種は、典型的には、タンパク質内の1つまたは複数の部位での1つのアミノ酸と別のアミノ酸との交換を含み、他の機能または特性を失ってかまたは失うことなく、ポリペプチドについての1つまたは複数の特性を修飾するように設計されてもよい。置換は保存的であってもよく、すなわち、1つのアミノ酸が、類似の形状および電荷のアミノ酸に置換されてもよい。保存的置換は当技術分野において周知であり、これには、例えば、アラニンのセリンへの、アルギニンのリジンへの、アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの、アスパラギン酸のグルタミン酸への、システインのセリンへの、グルタミンのアスパラギンへの、グルタミン酸のアスパラギン酸への、グリシンのプロリンへの、ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの、イソロイシンのロイシンまたはバリンへの、ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの、リジンのアルギニンへの、メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの、フェニルアラニンのチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの、セリンのトレオニンへの、トレオニンのセリンへの、トリプトファンのチロシンへの、チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの、および、バリンのイソロイシンまたはロイシンへの変化が含まれる。あるいは、置換はポリペプチドの機能または活性が影響を受けるように非保存的であってもよい。非保存的変化は、典型的には、非極性アミノ酸または非荷電アミノ酸の代わりに極性アミノ酸または荷電アミノ酸を用いておよびその逆など、1つの残基を化学的に異なる残基に置換することを含む。これらの置換の1つまたは複数は、態様から特に除外されうる。
タンパク質は、組換えであってもまたはインビトロで合成されてもよい。あるいは、非組換えまたは組換えタンパク質を細菌から単離してもよい。そのような変種を含有する細菌を、組成物および方法のなかで実践できることも考えられる。結果的に、タンパク質は単離されなくてもよい。
「機能的に等価なコドン」という用語は、アルギニンまたはセリンに対する6種類のコドンなどの、同じアミノ酸をコードするコドンをいうように、本明細書において用いられ、同様に、生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドンもいう。
アミノ酸および核酸の配列は、タンパク質の発現が関与している生物学的タンパク質活性の維持を含む上記の基準を満たす限り、それぞれ、さらなるN末端もしくはC末端アミノ酸、または5'もしくは3'配列などのさらなる残基を含むこともあり、それでも本質的には、本明細書において開示されている配列の1つに記載の通りでありうることも理解されると考えられる。末端配列の付加は核酸配列に特に当てはまり、例えば、コード領域の5'部分または3'部分のいずれか一方に隣接する種々の非コード配列を含むことができる。
以下は、等価なまたは場合によっては改善された、第二世代の分子を作製するためにタンパク質のアミノ酸を変化させることに基づく考察である。例えば、ある特定のアミノ酸を、相互作用結合能をさほど失わないようにタンパク質構造中の他のアミノ酸の代わりに用いることができる。例えば、酵素触媒ドメインまたは相互作用成分などの構造は、そのような機能を維持するために置換されたアミノ酸を有しうる。タンパク質の機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能および性質であることから、タンパク質配列の中に、およびその基礎となるDNAコード配列の中にある特定のアミノ酸置換を施し、それでも、類似の特性を有するタンパク質を産生させることができる。このように、遺伝子のDNA配列において、その生物学的有用性または活性をさほど失わないように種々の変化を施すことができるものと本発明者らは企図している。
他の態様において、1つまたは複数の置換を導入することによってポリペプチドの機能の改変が意図される。例えば、ある特定のアミノ酸を、相互作用成分の相互作用結合能を改変することを意図してタンパク質構造中の他のアミノ酸の代わりに用いることができる。例えば、タンパク質相互作用ドメイン、核酸相互作用ドメイン、および触媒部位などの構造は、そのような機能を改変するために置換されたアミノ酸を有しうる。タンパク質の機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能および性質であることから、タンパク質配列の中に、およびその基礎となるDNAコード配列の中にある特定のアミノ酸置換を施し、それでも、異なる特性を有するタンパク質を産生させることができる。このように、遺伝子のDNA配列において、その生物学的有用性または活性をかなり変化させるように種々の変化を施すことができるものと本発明者らは企図している。
そのような変化を加える場合、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮してもよい。タンパク質に相互作用生物機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指数の重要性は、一般的に当技術分野において理解されている(Kyte and Doolittle, 1982)。アミノ酸の相対的な疎水性親水性指標の特徴が、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、さらには、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが容認されている。
同様に、親水性に基づいて有効に同類のアミノ酸の置換がなされることも当技術分野において理解される。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,554,101号は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性が、タンパク質の生物特性と相関すると述べている。1つのアミノ酸を、類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換することができ、それでもなお、生物学的に等価かつ免疫学的に等価なタンパク質を作製することができると理解される。
上記で概説した通り、アミノ酸の置換は一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づく。前述のさまざまな特徴を考慮に入れた例示的置換は周知であり、アルギニンおよびリジン; グルタミン酸およびアスパラギン酸; セリンおよびトレオニン; グルタミンおよびアスパラギン; ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。
特定の態様において、本明細書において記述されるタンパク質の全部または一部を、従来の技術にしたがって溶液中でまたは固体支持体上で合成することもできる。各種の自動合成機が市販されており、それらを公知のプロトコルにしたがって用いることができる。例えば、Stewart and Young, (1984); Tarn et al., (1983); Merrifield, (1986); およびBarany and Merrifield (1979)を参照されたく、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、これを適切な宿主細胞に形質転換または形質移入し、これを発現に適した条件の下で培養する組換えDNA技術を使用することもできる。
1つの態様では、タンパク質の産生および/または提示のための、微生物を含めた細胞への遺伝子移入の使用を含む。関心対象のタンパク質に対する遺伝子を適切な宿主細胞に移入し、引き続いて適切な条件下での細胞の培養を行うことができる。実質的にすべてのポリペプチドをコードする核酸を、使用することができる。組換え発現ベクターの作製、およびそのベクターに含まれる要素は、本明細書において論じられている。あるいは、産生されるタンパク質は、タンパク質の産生に用いられる細胞によって通常合成される内因性タンパク質であってもよい。
VI. 核酸
ある種の態様において、本開示は、抗炎症剤および/または他の分子に機能的に連結されたECM親和性ペプチドなどの、本発明のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドに関する。それゆえ、ある種の態様は、ECM親和性ポリペプチドおよび/または抗炎症剤もしくはその断片に融合されたECM親和性ポリペプチドもしくはその断片をコードするヌクレオチドに関する。
本出願において用いられる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、組換えであるか、または、全ゲノム核酸がない状態で単離されているかのいずれかの核酸分子をいう。「ポリヌクレオチド」という用語の範囲内に含まれるのは、オリゴヌクレオチド(長さが100残基またはそれ未満の核酸)、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む、組換えベクターである。ポリヌクレオチドは、ある局面において、天然の遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に単離されている、調節配列を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖(コーディングもしくはアンチセンス)または二本鎖であってよく、RNA、DNA(ゲノム、cDNAもしくは合成)、その類似体、またはその組み合わせであってよい。ポリヌクレオチドのなかにさらなるコーディングまたは非コーディング配列が存在してもよいが、存在しなくてもよい。
この点において、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸」という用語は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸(適切な転写、翻訳後修飾または局在化に必要とされる任意の配列を含む)をいうように用いられる。当業者に理解される通り、この用語はゲノム配列、発現カセット、cDNA配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および変異体を発現するかまたは発現するように適合されうる、遺伝子操作されたもっと小さな核酸セグメントを包含する。ポリペプチドの全部または一部をコードする核酸は、本明細書において記述または参照される1つまたは複数のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、以下の間の全ての値および範囲を含む10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000、またはそれ以上(またはその中で導出可能な任意の範囲)のヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基対の連続核酸配列を含むことができる。また、特定のポリペプチドは、わずかに異なる核酸配列を有するが同じまたは実質的に類似のタンパク質をコードする変種を含む核酸によってコードされうることも考えられる。
特定の態様において、本発明は、本開示のポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸配列を組み込んだ単離された核酸セグメントおよび組換えベクターに関する。「組換え」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと組み合わせて用いることができ、一般に、インビトロにおいて産生および/もしくは操作されているポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはそのような分子の複製産物であるポリペプチドもしくはポリヌクレオチドをいう。
他の態様において、本発明は、本開示のポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸配列を組み込んだ単離された核酸セグメントおよび組換えベクターに関する。
本開示において用いられる核酸セグメントは、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなどのような、他の核酸配列と組み合わせてもよく、したがってその全長はかなり変化することがある。それゆえ、ほぼすべての長さの核酸断片を使用することができ、その全長は精製の容易さによっておよび意図された組換え核酸プロトコルにおける用途によって制限されることが好ましいものと考えられる。場合によっては、核酸配列は、例えば、ポリペプチドの精製、輸送、分泌、翻訳後修飾を可能にするための、またはターゲティングもしくは有効性などの治療的有用性を可能にするための、さらなる異種コード配列を有するポリペプチド配列をコードすることができる。先に論じられる通り、タグまたは他の異種ポリペプチドを、修飾されたポリペプチドをコードする配列に付加することができ、「異種」とは、修飾されたポリペプチドと同じものではないポリペプチドをいう。
ある種の態様において、本開示は、本明細書において開示される配列と実質的同一性を有するポリヌクレオチド変種を提供し; 該変種は、本明細書において記述される方法(例えば、標準パラメータによるBLAST解析)を用い本開示のポリヌクレオチド配列と比べて、以下の間の全ての値および範囲を含む少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%、またはそれ以上の配列同一性を含む。
本開示は同様に、上記の全てのポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドの使用を企図する。
A. ベクター
本開示のポリペプチドは、ベクターに含まれる核酸分子によってコードされてもよい。「ベクター」という用語は、異種核酸配列を、複製され発現されうる細胞へ導入するために、挿入できる担体核酸分子をいうように用いられる。核酸配列は「異種」であってよく、これは文脈中で、ベクターが導入されている細胞にとって、または核酸配列が組み入れられる核酸にとって核酸配列が異質であることを意味し、これには、細胞中または核酸中の配列と同種であるが、しかし、通常は見出されない、宿主細胞内または核酸内のある位置における配列が含まれる。ベクターにはDNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス)、ならびに人工染色体(例えば、YAC)が含まれる。当業者は、標準的な組換え技術(例えば、ともに参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996)を通じてベクターを構築するのに必要なものを十分に持っていると考えられる。本開示のポリペプチドをコードすることに加えて、ベクターは、1つまたは複数の他の細菌ペプチド、タグ、または免疫原性増強ペプチドなどの他のポリペプチド配列をコードすることができる。そのような融合タンパク質をコードする有用なベクターは、pINベクター(Inouye et al., 1985)、一続きのヒスチジンをコードするベクター、ならびに後の精製および分離または切断のためのグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)可溶性融合タンパク質の作出で用いるための、pGEXベクターを含む。
「発現ベクター」という用語は、転写されうる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターをいう。場合によっては、次にRNA分子をタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳する。発現ベクターは、特定の宿主生物において機能的に連結されたコード配列の転写およびおそらく翻訳にとって必要な核酸配列をいう種々の「制御配列」を含みうる。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、その上他の機能も果たしかつ本明細書において記述される、核酸配列を含んでもよい。
B. プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は制御配列である。プロモーターは、典型的には、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である。これには、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子などの、調節タンパク質および分子が結合しうる遺伝要素を含めてもよい。「機能的に配置された」、「機能的に連結された」、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが核酸配列との関連で、その配列の転写開始および発現を制御するのに正しい機能的位置および/または方向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関わるシス作用調節配列をいう「エンハンサー」とともに用いられてもまたは用いられなくてもよい。
当然、発現用に選択された細胞型または生物においてDNAセグメントの発現を効率的に指令するプロモーターおよび/またはエンハンサーを用いることが重要でありうる。分子生物学の当業者は、タンパク質を発現させるためにプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組み合わせを用いることを一般的に承知している(参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 2001を参照のこと)。用いられるプロモーターは構成的、組織特異的、または誘導的であってよく、ある種の態様において、組換えタンパク質またはペプチドの大規模産生などの特定条件の下で、導入されたDNAセグメントの高レベル発現を指令しうる。
本発明のペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、標的細胞、好ましくは細菌細胞においてポリヌクレオチドを発現できる限り、決定的に重要であるものとは考えられない。ヒト細胞が標的とされる場合、ポリヌクレオチドコード領域を、ヒト細胞において発現されうるプロモーターの近傍かつ制御下に位置付けることが好ましい。一般的に言えば、そのようなプロモーターは細菌プロモーター、ヒトプロモーター、またはウイルスプロモーターのいずれかを含みうる。
C. 開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位(IRES)
特異的開始シグナルもコード配列の効率的な翻訳に必要とされうる。これらのシグナルには、ATG開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを提供する必要がありうる。当業者は容易にこれを決定して、必要なシグナルを提供することができるであろう。
本発明のある種の態様において、内部リボソーム進入部位(IRES)要素を用いて、多重遺伝子の、または多シストロン性の伝達暗号を作製する。IRES要素は、5'メチル化Cap依存的翻訳のリボソーム走査モデルを迂回して、内部部位で翻訳を開始することができる(Pelletier and Sonenberg, 1988; Macejak and Sarnow, 1991)。IRES要素は異種の読み取り枠に連結させることができる。IRESによって各々が隔てられた多数の読み取り枠をともに転写し、多シストロン性の伝達暗号を作製することができる。単一のプロモーター/エンハンサーを用いて多数の遺伝子を効率的に発現させ、単一の伝達暗号を転写させることができる(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,925,565号および同第5,935,819号を参照のこと)。
D. 選択可能およびスクリーニング可能なマーカー
本発明のある種の態様において、本開示の核酸構築体を含む細胞は、発現ベクターの中にスクリーニング可能または選択可能なマーカーをコードすることによってインビトロまたはインビボで同定することができる。転写され翻訳される場合、マーカーは同定可能な変化を細胞に付与し、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする。一般的に、選択可能なマーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択可能なマーカーは、マーカーが存在することでその選択が可能になるものであるのに対し、陰性選択可能なマーカーは、マーカーが存在することでその選択が妨害されるものである。陽性選択可能なマーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
E. 宿主細胞
本明細書において用いられる場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という用語は互換的に用いることができる。これらの用語の全てが、任意のおよび全ての次世代のその子孫も含む。故意または偶然の変異により全ての子孫が同一ではないことがあると理解されると考えられる。異種核酸配列を発現するという文脈において、「宿主細胞」とは、原核細胞または真核細胞をいい、これには、ベクターを複製できるかまたはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現できる、任意の形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞はベクターまたはウイルスのレシピエントとして、使用されることができかつ使用されている。宿主細胞は「形質移入」または「形質転換」されてもよく、それらは組換えタンパク質をコードする配列などの、外因性の核酸が宿主細胞に移入または導入される過程をいう。形質転換細胞には、初代被験細胞およびその子孫が含まれる。
宿主細胞は、ベクターの複製または核酸配列の一部もしくは全部の発現のために、細菌、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む、原核生物または真核生物に由来しうる。多数の細胞株および培養物が宿主細胞として使用可能であり、それらは、生きている培養物および遺伝物質のアーカイブとして機能する組織であるアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection; ATCC)から入手することができる(www.atcc.org)。
F. 発現システム
先に論じた組成物の少なくとも一部または全部を含む多数の発現システムが存在する。原核生物および/または真核生物に基づくシステムを本発明で用いるために使用して、核酸配列、またはその同源のポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生することができる。そのような多くのシステムが市販されており、広く使用可能である。
昆虫細胞/バキュロウイルスシステムは、ともに参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,871,986号、同第4,879,236号に記述されているように、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現をもたらすことができ、例えば、INVITROGEN(登録商標)からMAXBAC(登録商標) 2.0の名称で、およびCLONTECH(登録商標)からBACPACK(商標) BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEMの名称で購入することができる。
本発明の開示される発現システムに加え、発現システムの他の例としては、合成エクダイソン誘導性受容体またはそのpET発現システム、つまり大腸菌発現システムを含む、STRATAGENE(登録商標)のCOMPLETE CONTROL□ Inducible Mammalian Expression Systemが挙げられる。誘導性発現システムの別例はINVITROGEN(登録商標)から入手可能で、T-REX(商標) (テトラサイクリン調節発現)システム、つまり全長CMVプロモーターを用いた誘導性の哺乳動物発現システムを有するものである。INVITROGEN(登録商標)は、メチロトローフ酵母ピチアメタノリカ(Pichia methanolica)における組換えタンパク質の高レベル産生のために設計された、Pichia methanolica Expression Systemと呼ばれる酵母発現システムも提供している。当業者なら、発現構築物などのベクターを発現させる方法、核酸配列、またはその同源のポリペプチド、タンパク質、もしくはペプチドを産生する方法を承知していると考えられる。
VII. 併用療法
本開示の組成物および関連する方法、特に抗炎症剤および/または他の分子に機能的に連結されたECM親和性ペプチドの投与も、本明細書において記述されるさらなる治療法などの、さらなる治療法の投与と組み合わせてまたは自己免疫もしくは炎症状態の処置のための当技術分野において公知の他の従来の治療法と組み合わせて用いられうる。
本明細書において開示される治療用組成物および処置は、数分間から数週間に及ぶ間隔だけ、別の処置または薬剤に先行し、同時進行し、および/または後続しうる。薬剤が細胞、組織または生物に別々に適用される態様において、一般的に、治療剤がなお細胞、組織または生物に対して好都合な併用効果を奏することができうるように各送達時点同士の間の重要な期間を過ぎないことが確実にされるであろう。例えば、そのような場合、細胞、組織または生物が2、3、4種類またはそれ以上の薬剤または処置と実質的に同時に(すなわち、約1分未満以内に)接触されうることが企図される。他の局面において、1種類または複数種の治療剤または処置が、別の治療剤の投与または処置の実施の前および/または後の1分間、5分間、10分間、20分間、30分間、45分間、60分間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、22時間、23時間、24時間、25時間、26時間、27時間、28時間、29時間、30時間、31時間、32時間、33時間、34時間、35時間、36時間、37時間、38時間、39時間、40時間、41時間、42時間、43時間、44時間、45時間、46時間、47時間、48時間、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間もしくは8週間以内にまたはそれ以上の範囲内で、およびその中で導出可能な任意の範囲内で投与または提供されうる。
治療剤および処置のさまざまな併用レジメンが利用されうる。そのような併用の非限定的な例を以下に示すが、ここで、治療剤、例えば本明細書において開示される組成物は「A」であり、本明細書において記述または当技術分野において公知の第2の薬剤、例えばさらなる薬剤または治療は「B」である。
Figure 2022521428000052
いくつかの態様において、2つ以上の治療過程が利用されうる。複数過程が実施されうることが企図される。
VIII. 治療方法
本開示の組成物は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボ投与のために用いられうる。組成物の投与経路は、例えば、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、局所投与、局部投与、および腹腔内投与でありうる。
処置に適した自己免疫状態または炎症状態は、糖尿病(例えば、1型糖尿病)、移植片拒絶、関節炎(急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風または痛風関節炎、急性痛風関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節炎などの関節リウマチ、II型コラーゲン誘発関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、脊椎関節炎、および全身性若年発症関節リウマチ、変形性関節症、慢性関節炎進行性関節炎、変形性関節炎、多発性慢性関節炎、反応性関節炎、および強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、尋常性乾癬などの乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬、および爪の乾癬、干し草熱やジョブ症候群などのアトピー性疾患を含むアトピー、接触性皮膚炎を含む皮膚炎、慢性接触性皮膚炎、剥離性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状湿疹、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、原発性刺激性接触皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎、x連鎖性高IgM症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、慢性アレルギー性蕁麻疹および慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹などの蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、強皮症(全身性強皮症を含む)、全身性硬化症などの硬化症、脊椎光学MS、原発性進行性MS(PPMS)、再発寛解型MS(RRMS)などの多発性硬化症(MS)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症、運動失調性硬化症、視神経脊髄炎(NMO)、炎症性腸疾患(IBD)(例えば、クローン病、自己免疫介在性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、膠原性大腸炎、多発性大腸炎、壊死性腸炎などの大腸炎、および自己免疫性炎症性腸疾患)、腸の炎症、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、成人または急性呼吸窮迫症候群(ARDS)を含む呼吸窮迫症候群、髄膜炎、ブドウ膜の全部または一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液障害、関節リウマチ、関節リウマチ、遺伝性血管浮腫、髄膜炎のような脳神経損傷、妊娠性ヘルペス、妊娠性類天疱瘡、陰嚢掻痒症、自己免疫性早期卵巣不全、自己免疫状態による突然の難聴、アナフィラキシーやアレルギー性およびアトピー性鼻炎などのIgE媒介性疾患、ラスムッセン脳炎や大脳辺縁系および/または脳幹脳炎などの脳炎、前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、または自己免疫性ブドウ膜炎などのブドウ膜炎、原発性GNなどの慢性または急性糸球体腎炎などのネフローゼ症候群を伴うまたは伴わない糸球体腎炎(GN)、免疫介在性GN、膜性GN(膜性腎症)、特発性膜性GNまたは特発性膜性腎症、I型およびII型を含む膜性または膜性増殖性GN(MPGN)、および急速進行性GN、増殖性腎炎、自己免疫性多腺内分泌不全、亀頭包皮炎、プラズマ細胞性亀頭炎、亀頭包皮炎を含む亀頭包皮炎、環状紅斑遠心性紅斑、色素異常性固定紅斑、多形紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、ビダール苔癬、脊髄苔癬、扁平苔癬、層状魚鱗癬、表皮剥離性角質増殖症、前癌性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー状態および反応、アレルギー反応、アレルギー性またはアトピー性湿疹、汗疱状湿疹、発汗異常性湿疹、および水疱性掌蹠湿疹を含む湿疹、気管支喘息などの喘息、気管支喘息、および自己免疫性喘息、T細胞の浸潤と慢性炎症反応を伴う状態、妊娠中の胎児A-B-O血液型などの外来抗原に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、ループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループスおよび円板状エリテマトーデス、脱毛症ループス、皮膚SLEまたは亜急性皮膚SLEなどの全身性エリテマトーデス(SLE)、新生児エリテマトーデス症候群(NLE)、および播種性エリテマトーデスを含むループス、小児インスリン依存性糖尿病(IDDM)を含む若年発症(I型)糖尿病、および成人発症糖尿病(II型糖尿病)ならびに自己免疫性糖尿病などの状態を含みうるが、これらに限定されることはない。サイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅延性過敏症、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、無顆粒球症血管炎、大血管炎(リウマチ性多発筋痛および巨細胞(高安)動脈炎を含む)を含む血管炎、中血管炎(川崎病および結節性多発動脈炎/結節性多発動脈炎を含む)、顕微鏡的多発動脈炎、免疫血管炎、中枢神経系血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、壊死性血管炎などの壊死性血管炎、およびチャーグ-ストラウス血管炎または症候群(CSS)などのANCA関連血管炎およびANCA関連小血管炎、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイヤモンドブラックファン貧血、溶血性貧血または自己免疫性溶血性貧血(AIHA)を含む免疫性溶血性貧血、アディソン病、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球の血管外遊病を伴う疾患、CNS炎症性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、敗血症、外傷または出血に続発するものなどの多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病/症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡や皮膚類天疱瘡、天疱瘡(尋常性天疱瘡、葉状天疱瘡、粘液膜性天疱瘡、紅斑性天疱瘡を含む)などの類天疱瘡、自己免疫性多腺性自己免疫症候群、ライター病または症候群、熱傷、子癇前症、免疫複合体腎炎などの免疫複合体障害、抗体介在性腎炎、多発性神経障害、IgM多発性神経障害またはIgM介在性神経障害などの慢性神経障害、慢性または急性ITPを含む特発性血小板減少性紫斑病(ITP)などの自己免疫性または免疫性血小板減少症、特発性強膜炎、上強膜炎などの強膜炎、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)などの甲状腺炎、または亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患、特発性甲状腺機能低下症、バセドウ病、自己免疫性多腺症候群(または多腺内分泌障害症候群)などの多腺症候群、ランバート-イートン筋無力症候群またはイートン-ランバート症候群、スティッフパーソン症候群またはスティッフパーソン症候群などの神経学的腫瘍随伴症候群を含む腫瘍随伴症候群、アレルギー性脳脊髄炎またはアレルギー性脳脊髄炎などの脳脊髄炎および実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)、実験的自己免疫性脳脊髄炎、胸腺腫関連重症筋無力症などの重症筋無力症、小脳変性症、神経筋無力症、オプソクローヌスまたはオプソクローヌスミオクローヌス症候群(OMS)、および感覚神経障害、多巣性運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ性間質性肺炎(LIP)、閉塞性細気管支炎(非移植)vs NSIP、ギランバレー症候群、バーガー病(IgA腎症)、特発性IgA腎症、線状IgA皮膚症、急性熱性好中球性皮膚症、角膜下膿疱性皮膚症、一過性棘棘性皮膚症、原発性胆汁性肝硬変や肺単肝硬変などの肝硬変、自己免疫性腸症症候群、セリアック病またはセリアック病、セリアックスプルー(グルテン腸症)、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症(ALS;ルーゲーリック病)、冠状動脈疾患、自己免疫性内耳疾患(AIED)などの自己免疫性耳疾患、自己免疫性難聴、難治性または再発性または再発性多発性軟骨炎などの多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、コーガン症候群/非梅毒間質性角膜炎、ベル麻痺、スウィート病/症候群、酒さ自己免疫、帯状疱疹に伴う痛み、アミロイドーシス、非癌性リンパ球増加症、モノクローナルB細胞リンパ球増加症を含む原発性リンパ球増加症(例えば、良性単クローン性免疫グロブリン血症および重要性が不明な単クローン性免疫グロブリン血症、MGUS)、末梢神経障害、腫瘍随伴症候群、てんかんなどのチャネロパチー、片頭痛、不整脈、筋肉障害、難聴、失明、周期性四肢麻痺、および中枢神経系のチャネロパチー、自閉症、炎症性ミオパチー、巣状または分節性または巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、内分泌眼症、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝障害、線維筋痛症、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、自己免疫性脱髄性疾患や慢性炎症性脱髄性多発神経障害などの脱髄性疾患、ドレスラー症候群、円形脱毛症、全頭脱毛症、CREST症候群(石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、手指硬化症)、および毛細血管拡張症)、男性と女性の自己免疫性不妊症、例えば、抗精子抗体による、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性流産、農夫肺、多形紅斑、心臓切開後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、アレルギー性肺炎や線維性肺炎などの肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソーマ症、住血吸虫症、回虫症などの寄生虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心筋内線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、慢性循環炎、異時性循環炎、虹彩毛様体炎(急性または慢性)、またはフックの循環炎などの循環炎、ヘノッホシェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症、SCID、後天性免疫不全症候群(AIDS)、エコーウイルス感染症、敗血症、内毒素血症、膵炎、甲状腺中毒症、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染症、エプスタインバーウイルス感染症、おたふく風邪、エヴァンス症候群、自己免疫性腺不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞性多発性筋痛、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小変化型腎症、良性家族性および虚血再灌流傷害、移植臓器再灌流、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道/肺疾患、珪肺症、口内炎、
アフタ性口内炎、動脈硬化性疾患、精子形成欠如、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、アレルギー性腸炎、結節性紅斑、特発性顔面麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ熱、ハマンリッチ病、感音難聴、血色素尿症発作、性腺機能低下症、局所性腸炎、白血球減少症、伝染性単核球症、横断性脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感性眼炎、肉芽腫性精巣炎、膵炎、皮膚多発根炎、壊疽性膿皮症、ケルバン病性甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、白斑、毒素性ショック症候群、食中毒、T細胞の浸潤を伴う状態、白血球接着不全症、サイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅延性過敏症に関連する免疫応答、白血球の血管外遊走を伴う疾患、多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多内分泌腺症候群、卵胞炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多腺性自己免疫症候群、多腺性自己免疫症候群I型、成人発症の特発性副甲状腺機能低下症(AOIH)、拡張型心筋症などの心筋症、表皮水疱症(EBA)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、篩骨、前頭、上顎、または蝶形骨副鼻腔炎、好酸球増加症などの好酸球関連障害、肺浸潤性好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増加症、気管支肺炎性アスペルギルス症、アスペルギルス症、または好酸球を含む肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、自己免疫性多内分泌腺症候群、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ブルートン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病、リウマチ、神経疾患に関連する自己免疫疾患、リンパ節炎、血圧反応の低下、血管機能障害、組織損傷、心血管虚血、痛覚過敏、腎虚血、脳虚血、および血管新生を伴う疾患、アレルギー性過敏症、糸球体腎炎、再灌流傷害、虚血性再灌流障害、心筋または他の組織の再灌流傷害、リンパ腫性気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性成分を伴う皮膚病、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性疾患、眼球および眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発毒性、ナルコレプシー、急性重篤な炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、移植片対宿主病、接触過敏症、喘息性気道過敏症、ならびに子宮内膜症に関連する免疫応答も企図される。
IX. 薬学的組成物および方法
いくつかの態様において、薬学的組成物は、対象に投与される。異なる局面は、対象に組成物の有効量を投与することを伴う。いくつかの態様において、抗炎症剤を含む組成物は、炎症および/または自己免疫を処置するために対象または患者に投与されうる。さらに、そのような化合物は、さらなる処置と組み合わせて投与することができる。
組成物は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、静脈内、経カテーテル注射、動脈内注射、筋肉内、皮下、または腹腔内経路を介した注射用に製剤化することができる。典型的には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製することができる; 注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するために用いるのに適した固体形態も調製することができる; および、調製物を乳化することもできる。そのような製剤の調製は、本開示に照らして当業者に公知であろう。他の投与経路は、腫瘍内、腫瘍周囲、リンパ内、炎症組織への注射、またはリンパ節への注射を含む。いくつかの態様において、投与は全身性である。
他の投与経路も企図される。例えば、構築体および薬剤は、担体と関連して投与されうる。いくつかの態様において、担体はナノ粒子またはマイクロ粒子である。
粒子は、可変寸法の構造を有することができ、ミクロスフェア、マイクロ粒子、ナノ粒子、ナノスフェア、またはリポソームとしてさまざまに知られている。そのような粒子状製剤は、構築体の粒子への共有結合または非共有結合によって形成することができる。本明細書における「粒子」、「微粒子」、「ビーズ」、「ミクロスフェア」、および文法上の同等物とは、対象に投与可能な小さな個別の粒子を意味する。ある種の態様において、粒子は形状が実質的に球形である。本明細書において用いられる「実質的に球形」という用語は、粒子の形状が球から約10%を超えて逸脱しないことを意味する。粒子は、通常、実質的に球形のコアおよび任意で1つまたは複数の層からなる。コアは、サイズおよび組成が異なりうる。コアに加えて、粒子は、関心対象の用途に適切な機能を提供するために、1つまたは複数の層を有しうる。層の厚さは、存在する場合、特定の用途の必要性に応じて異なりうる。例えば、層は有用な光学特性を与えうる。
注射用の使用に適した薬学的形態としては、滅菌された水性の溶液または分散液; ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む配合物; および滅菌注射用液剤または分散剤の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、該形態は、滅菌していなければならず、容易に注射されうる程度に流動性でなければならない。また、製造および保存の条件下で安定であるのがよく、微生物、例えば細菌および真菌の夾雑作用から保護されていなければならない。
また、担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど)、その適当な混合物ならびに植物油を含む溶媒または分散媒でありうる。適正な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されうる。微生物の作用の抑制は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされうる。多くの場合、等張性剤、例えば糖類、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、該組成物中における吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされうる。
滅菌注射用液剤は、必要とされる量の活性化合物を、上記に列挙した種々のその他の成分を必要に応じて有する適切な溶媒中に組み込んだ後、ろ過滅菌することにより調製される。一般的に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、ベースの分散媒および上記に列挙したもののうちの必要とされるその他の成分を含む滅菌媒体に組み込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製用の滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥手法であり、これにより、活性成分に加えてさらなる所望の成分の粉末が、先に滅菌ろ過したその溶液から得られる。
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される」という用語は、化合物、物質、組成物および/または投薬形態が、正しい医学的判断の範囲内において、人間および動物の組織との接触に適しており、過度な毒性、刺激、アレルギー応答または問題となる他の合併症がなく、妥当な便益/リスク比と釣り合っていることをいう。「薬学的に許容される担体」という用語は、化学剤の担持または輸送に関与する薬学的に許容される物質、組成物または媒体、例えば液状または固形の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材を意味する。
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物を、存在している酸部分または塩基部分をその塩形態に変換させることにより修飾した本開示の化合物の誘導体をいう。薬学的に許容される塩の例としては、非限定的に、アミンなどの塩基性残基の鉱酸または有機酸の塩; カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられる。薬学的に許容される塩としては、例えば非毒性の無機酸または有機酸で形成される親化合物の慣用的な非毒性の塩または第4級アンモニウム塩が挙げられる。薬学的に許容される塩を、塩基性部分または酸性部分を含む親化合物から、慣用的な化学的方法によって合成してもよい。
対象の状態に応じて投薬量におけるいくらかの変動が必然的に生じる。投与を担う人は、任意の事象において個々の対象に適切な用量を決定する。治療用または予防用組成物の有効量は、意図された目的に基づいて決定される。「単位用量」または「投薬量」という用語は、対象における使用に適した物理的に独立した単位をいい、各単位は、その投与、すなわち適切な経路およびレジメンを伴って上記に論考した所望の応答がもたらされるように計算された所定量の該組成物を含む。投与される量は、処置回数および単位用量の両方に従って所望される効果に依存する。また、該組成物の厳密な量は実務者の判断にも依存し、各個体に固有である。用量に影響を及ぼす要素としては、対象の身体の状態および臨床状態、投与経路、意図される処置目的(症状の緩和か治癒か)、ならびに具体的な組成物の効力、安定性および毒性が挙げられる。
液剤は、製剤化されたら、投薬製剤に適合する様式で、治療的または予防的に有効であるような量で投与される。製剤は、種々の剤形で、例えば上記の型の注射用液剤で容易に投与される。
典型的には、ヒト成人(およそ70キログラムの体重)に対して、約0.1 mg～約3000 mg (その間のあらゆる値および範囲を含む)、または約5 mg～約1000 mg (その間のあらゆる値および範囲を含む)、または約10 mg～約100 mg (その間のあらゆる値および範囲を含む)の化合物が投与される。このような投薬量範囲は一例にすぎないこと、および投与は、当業者に公知の要素に応じて調整されうることが理解されよう。
ある種の態様において、対象は、およそ下記の量、少なくともおよそ下記の量、または多くともおよそ下記の量の本明細書において論じられる薬剤を投与される：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000ミリグラム(mg)もしくはマイクログラム(mcg)もしくはμg/kgもしくはマイクログラム/kg/分もしくはmg/kg/分もしくはマイクログラム/kg/時もしくはmg/kg/時、またはμMもしくはmM。その中で導出可能な任意の範囲が企図される。
投薬は頓用で行なわれうるか、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18もしくは24時間毎に(あるいはその中で導出可能な任意の範囲)または1日に1、2、3、4、5、6、7、8、9回もしくはそれ以上(あるいはその中で導出可能な任意の範囲)行なわれうる。投薬は、病状の徴候の前または後に最初に行なわれてもよい。いくつかの態様において、患者は、レジメンの初回投薬を、該患者が病状の徴候または症状を起こすかまたは示してから1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12時間後(あるいはその中で導出可能な任意の範囲)または1、2、3、4または5日後(あるいはその中で導出可能な任意の範囲)に行なわれる。患者は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10日間もしくはそれ以上(あるいはその中で導出可能な任意の範囲)、または病状の症状が消失もしくは低減されるまで、または感染の症状が消失もしくは低減してから6、12、18もしくは24時間後または1、2、3、4もしくは5日後まで、処置されうる。
X. 実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい態様を実証するために含めている。当業者には、以下の実施例に開示した手法が、本発明者が、本開示の実施において充分に機能を果たすと見出した手法であり、したがって、その実施のための好ましい形態を構成しているとみなされうることが認識されよう。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みると、開示している具体的な態様において、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく多くの変更が行なわれうるが、それでもなお同様または類似の結果が得られることが認識されるはずである。
実施例1: コラーゲン結合改変の操作によって抗炎症剤の効力が増強された
A. 結果
1. CBPコンジュゲーションは、抗TNFα抗体(αTNF)に対するコラーゲン親和性をもたらした
抗TNFα抗体(αTNF)をスルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)と混合した後に、CBPを抗体に共有結合的に架橋した。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析によって計算した場合に、最大5つのCBPが抗体に結合された(図1A)。CBPコンジュゲーションされたαTNF (CBP-αTNF)がコラーゲンに結合する能力を調べるために、I、II、およびIII型コラーゲンに対するCBP-αTNFおよび未改変αTNF (WT-αTNF)の結合活性をELISAによって決定した。CBP-αTNFは、試験した全ての型のコラーゲンに結合したが、WT-αTNFのコラーゲンへの結合シグナルは、検出不能なレベルであった(図1B)。
2. CBPコンジュゲーションによってαTNFを関節炎モデルの炎症性の足に局在化させることができた
内因性コラーゲンへの結合を通じたコラーゲン抗体誘発関節炎(CAIA)モデルの炎症性の足におけるCBP-αTNFの局在を、インビボでの生体内分布分析によって決定した。関節炎は、抗コラーゲン抗体の受動免疫、続いて右後足蹠にLPSを皮下注射することにより、右後足に選択的に誘発された。局所LPS注射は、他の足と比較して右後足に重度の関節炎を誘発した。LPS注射の翌日に、蛍光標識されたCBP-αTNFおよびWT-αTNFをCAIAおよびナイーブマウスに静脈内注射した。全身の蛍光レベルを、抗体注射前と注射後0.5、1、2、4、6、24、および48時間で測定した。CBP-αTNFおよびWT-αTNFを注射したCAIAマウスの関節炎の右後足の蛍光レベルは注射直後に増加したが、ナイーブマウスの蛍光レベルは関節炎および非関節炎の足の両方でほぼ同じであった(図2Aおよび2B)。非関節炎の足に対する関節炎の足でのレベルの比率は、WT-αTNFよりもCBP-αTNFを注射されたマウスの方が高かった(図2C)。注入されたCBP-αTNFは、免疫組織化学によって関節炎の主要な炎症部位である滑膜およびパンヌスで検出された(図2D)。これらのデータは、CBD-αTNFが、その未改変の形態よりも、全身注射後に炎症を起こした組織(すなわち、関節炎の足)に選択的に局在することを示している。
3. CBPコンジュゲーションは関節炎モデルにおけるαTNFの効力を増強した
次に、本発明者らは、CAIAモデルにおけるCBP-αTNFの抗炎症効力について調べた。関節炎は、抗コラーゲン抗体の受動免疫とそれに続くLPSの腹腔内注射により全ての足において誘発された。LPS注射の日に、対照IgG、WT-αTNF、またはCBP-αTNFを静脈内注射した。関節炎スコアは対照マウスにおいて増加し、スコアはWT-αTNFおよびCBP-αTNFによって低減した(図3A)。CBP-αTNF処置マウスのスコア低減は、WT-αTNF処置マウスよりも有意に大きかった。組織学的観察により、関節破壊がCBP-αTNFによって有意に抑制されたことが明らかにされた(図3B)。本発明者らはさらに、CBP-αTNFが皮下経路を介した注射によって効力を示しうるかどうかを調査した。CBP-αTNFの皮下注射においてさえも、同様の蓄積傾向および阻害効力が観察された(図4)。これらのデータは、αTNFのCBP改変が、その非改変型よりも優れた抗炎症効力を提供することを示している。
4. ECM結合αTNFの局所注射は関節炎の発症に強い影響を及ぼした
局所療法の治療有効性を評価するために、本発明者らは、既述されたCBPコンジュゲーションと同じ方法で、胎盤成長因子2 (具体的には、PlGF-2123～144)に由来する乱交雑(promiscuous) ECM結合ペプチドとαTNFをコンジュゲーションした(32, 33)。PlGF-2123～144ペプチドは、複数のECMタンパク質に高い親和性で結合するため、注射部位に保持される。CAIAマウスの左後足蹠に注射されたPlGF-2123～144コンジュゲーションαTNF (PlGF-2123～144-αTNF)は注射部位に保持されたが、WT-αTNFからのシグナルは注射後に急速に低減した(図5A)。効力を比較するために、対照IgG、WT-αTNF、またはPlGF-2123～144-αTNFをCAIAマウスの左後足蹠に皮下注射した。関節炎スコアは、対照IgG処置マウスの右後肢と左後肢の両方で増加した。WT-αTNFは、この処置レジメンでのスコアを抑制しなかった。しかしながら、PlGF-2123～144-αTNFは、WT-αTNFより100倍低い用量でさえも、処置した足(左)において関節炎の発症をほぼ完全に抑制した。興味深いことに、PlGF-2123～144-αTNFは未処置の足において関節炎の発症を抑制せず(右)、その局所的な効力を示すものであった(図5B)。これらのデータは、炎症部位における薬物の蓄積が炎症を抑制し、抗炎症薬の効力を最大化するために重要であることを示唆している。
5. vWF A3ドメインに由来するCBDタンパク質は、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおいて炎症を起こした脊髄をターゲティングすることができる
IL-4は、ナイーブヘルパーT細胞(Th0)のTh2細胞への分化を誘導するサイトカインである。髄腔内または鼻腔内投与による中枢神経系へのIL-4の適用は、多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおいて臨床徴候および軸索形態を改善することが報告されている。したがって、臨床的に関連する注射経路である静脈内注射からのIL-4のEAEターゲティングを達成するために、本発明者らは、vWF A3ドメイン融合IL-4 (A3-IL4)タンパク質を合成した。A3-IL4は、28.6 nMの解離定数(Kd)でコラーゲンIIIに結合した(図6A)。IL-4へのvWF A3ドメイン融合は、その受容体であるIL-4Rαに対する結合親和性を無効化しなかった(図6B)。次に、内因性コラーゲンへの結合を通じたEAEモデルの炎症脊髄におけるvWF A3ドメインタンパク質の局在を蛍光イメージングによって決定した。標的組織が炎症を起こした免疫後14日目に、蛍光標識されたA3またはA3-IL4をナイーブマウスおよびEAEマウスに静脈内注射した。A3およびA3-IL4は、EAEマウスの脊髄で検出されたが、ナイーブマウスの脊髄では検出されなかった(図6C)。次に、本発明者らは、EAE症状に及ぼすA3-IL4の治療効果を調べた。最初のEAE症状が現れた免疫後14日目から、PBS、正常型IL-4、およびA3-IL4を1日おきに静脈内注射した。A3-IL4は平均疾患スコアを低減させたが、正常なIL-4はいずれの治療効果も示さなかった(図6E)。
6. A3タンパク質およびCBPコンジュゲートは、他の炎症性疾患モデルの炎症組織を標的にすることもできる
コラーゲン結合操作が炎症性疾患にさまざまな用途を有するかどうかを調べるために、A3タンパク質およびCBPコンジュゲーション抗体の局在を、自然発症炎症性腸疾患(IBD)、ブレオマイシン誘発性特発性肺線維症(IPF)、およびI型糖尿病(T1D)モデルの炎症組織において蛍光イメージングにより決定した。標的組織が炎症を起こした時点で、蛍光標識A3、CBP-αTNF、またはCBPコンジュゲーション抗TGF-β抗体(CBP-αTGF)をEAE、IBD、IPF、およびT1Dモデルに静脈内注射し、標的組織における蛍光レベルを決定した。A3は、IBDを発症したマウスの結腸、ならびに自然発症T1Dおよびシクロホスファミド誘発性T1Dマウスの膵臓において検出されたが、健常なマウスのそれらにおいては検出されなかった(図7Aおよび7C)。同様に、CBP-αTNFはEAEモデルの脊髄、およびIBD発症マウスの結腸において検出されたが、健常なマウスのそれらにおいては検出されなかった(図6Dおよび7A)。組織病理学的分析により、CBP-αTNFは、浸潤細胞が存在するIBDモデルの結腸固有層に局在していることが明らかにされた(図7A)。また、CBP-αTGFはIPFモデルの肺において検出されたが、未改変の抗体は検出されなかった(図7B)。これらの結果は、抗体およびサイトカインに対するコラーゲン親和性を導入することで、それらを炎症組織にターゲティングすることが可能になることを示唆している。
B. 考察
本研究では、抗炎症性抗体にコラーゲン結合親和性を導入することで、炎症組織でのその保持およびその治療有効性が増強されることが実証された。静脈内および皮下注射されたCBP-αTNFは、CAIAモデルの炎症を起こした足に蓄積された。また、抗体へのCBPコンジュゲーションにより、EAE、IBD、およびIPFモデルの複数の炎症部位において抗体を検出することが可能とされた。これは、コラーゲン親和性が炎症部位をターゲティングすることができ、さまざまな炎症性疾患に広く適用できることを示唆している。これは、コラーゲンが脈管構造の周囲に普遍的かつ豊富に存在するが、炎症性組織では脈管構造の過透過性が発生した場合にのみ血流に露出されるためである。したがって、薬物送達方法としてのコラーゲン親和性は、組織、分子発現アプローチでも、疾患特異的アプローチでもなく、むしろ一般的な炎症特異的アプローチである。さらに重要なことに、CBP-αTNFは、CAIAモデルにおいて未改変のαTNFよりも効果的に関節炎スコアを低減させた。RAおよびIBDなどの炎症性疾患のαTNFは、大部分の患者において完全寛解を示さず、重大な副作用を及ぼしうる(6-10)。それゆえ、CBP-αTNFは、炎症および自己免疫疾患の先進治療を達成するための技術移転の可能性を秘めている。
他のコラーゲン結合タンパク質も全身注射後に炎症部位をターゲティングすることができるかどうかを評価するために、本発明者らは、vWF A3ドメイン組換えタンパク質を用いた。 A3-IL4はEAEモデルにおいて脊髄に蓄積し、疾患スコアを低減したが、正常型のIL-4はそうでなかった。ニューロンのIL-4シグナル伝達をターゲティングすることは、多発性硬化症における障害の進行を止めるための新しい治療戦略であると期待されている(34)。血液脳関門を通過するためにIL-4処置の場合には髄腔内または鼻腔内経路が提唱されているが、本実施例では、IL-4にコラーゲン結合能力を提供することで、静脈内経路を介してもEAEモデルにおいて臨床症状を低減することが可能とされることを実証する。また、IBDおよびT1Dモデルの炎症組織におけるA3タンパク質の蓄積も示す。本発明者らは、自己抗体誘発性急性炎症のCAIAモデル、自己免疫媒介性慢性炎症のEAEモデル、自然発症炎症のIBDモデル、炎症を伴う線維症のIPFモデル、および自然発症T細胞媒介性自己免疫疾患のT1Dを主要な炎症モデルとして用いた。これらのデータは、コラーゲン結合性の抗体およびサイトカインが、炎症部位に蓄積することにより、複数の炎症性疾患において効率的な抗体およびサイトカイン療法を達成できることを示唆している。
本実施例は、PlGF-2123～144-αTNFの局所注射液が注射部位に保持され、低用量で強力な治療効力を示したことを示す。しかしながら、PlGF-2123～144-αTNF療法は、その乱交雑なECM親和性のため、局所注射した場合にのみ効果的である。炎症標的療法のためのコラーゲン結合アプローチの主な技術移転上の利点は、全身送達経路から炎症部位をターゲティングできるということである。コラーゲン結合抗炎症薬の臨床技術移転の場合、利点は、vWFのA3ドメインまたはデコリンのCBPを用いることで、どちらも人体に自然に存在するため、免疫系の認識の可能性が限定されるということにある。また、CBPは簡単な化学反応で抗体にコンジュゲートさせることができる。この特徴の利点は、産生が既に最適化されている抗体で機能することが可能であるという点で、産生が簡単なことである。本発明者らは、本実施例において、CBPが抗TNFα抗体と抗TGFβ抗体の両方をコンジュゲートできることを示した。抗体のCBPコンジュゲーション合成反応は、タンパク質のPEG化に類似した化学反応を用いて、わずか90分で行うことができる。同じ反応が、トラスツズマブエムタンシンの産生においてなど、抗体薬物コンジュゲートにおいて用いられる(35, 36)。A3-IL4に関しては、サイトカインが小分子であり、一般に生成が容易であることを考えて、本発明者らは、A3をIL-4とコンジュゲートさせるのではなく、組換え融合することを選択した。これらの特徴は、臨床技術移転への障壁を克服するためのコラーゲン結合性薬物療法の開発を促進しうる。
結論として、抗体およびサイトカインにコラーゲン親和性を導入することにより、それらが炎症部位をターゲティングすることが可能になることが見出された。さらに、コラーゲン結合性抗炎症薬は、その未改変型と比較して高い治療効力を示した。操作されたコラーゲン結合性薬物のこの単純なアプローチは、炎症を標的とした治療法としての臨床技術移転の潜在性を秘めている可能性がある。
C. 材料および方法
1. CBPコンジュゲーション抗体の合成
ラット抗マウスTNF-α抗体(クローンXT3.11, BioXcell)を20当量のスルホ-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)とともに室温で30分間インキュベートした。Zebaスピン脱塩カラム(Thermo Fisher Scientific)を用いて、過剰なスルホSMCCを除去した。次に、デコリオン(decorion)に由来するコラーゲン結合性配列ペプチド(CBP, LRELHLNNNC) 30当量を添加し、C残基のチオール部分へのコンジュゲーションのために室温で1時間反応させた。ペプチドはGenscriptによって95%超の純度で合成されていた。
2. 組換えvWF A3ドメインおよびA3融合IL-4タンパク質の産生および精製
ヒトvWF A3ドメイン残基Cys1670～Gly1874 (成熟vWFの907～1111)、ならびにヒトvWF A3ドメインおよびマウスIL-4融合タンパク質をコードする配列を、合成し、Genscriptによって哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(+)にサブクローニングした。組換えタンパク質のさらなる精製のために、6 Hisをコードする配列を、N末端に付加した。懸濁液に適合したHEK-293F細胞は、無血清FreeStyle 293発現培地(Gibco)中で日常的に維持された。トランスフェクションの日に、細胞を1×106個の細胞/mlの密度で新鮮培地に接種した。2μg/mlのプラスミドDNA、2μg/mlの線形25 kDaポリエチレンイミン(Polysciences)、およびOptiPRO SFM培地(終濃度4%, Thermo Fisher)を順次添加した。培養フラスコを5% CO2の存在下、37℃、135 rpmで軌道振盪することにより撹拌した。トランスフェクション6日後、細胞培地を遠心分離によって回収し、0.22μmフィルタでろ過した。AKTA pure 25 (GE Healthcare)を用いて、培地をHisTrap HP 5 mlカラム(GE Healthcare)に負荷した。洗浄緩衝液(20 mMイミダゾール, 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4)によるカラムの洗浄後に、500 mMイミダゾール(20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4中)の勾配でタンパク質を溶出させた。溶出溶液を、HiLoad Superdex 200PGカラム(GE healthcare)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製した。全ての精製段階は4℃で実行された。A3およびA3-IL-4の発現は、抗Hisタグ抗体(BioLegend)を用いたウエスタンブロッティングにより決定され、該タンパク質はSDS-PAGEによって90%超の純度であると確認された。
3. コラーゲンタンパク質へのCBP-αTNFまたはA3-IL4結合の検出
測定を既述のように実施する(32)。96ウェルELISAプレート(Greiner Bio One)をI型、II型、およびIII型ヒトコラーゲン(PBS中で各10μg/mL, Millipore Sigma)とともに37℃で終夜コーティングした後に、0.05% Tween 20を有するPBS (PBS-T)中1%のBSAによるブロッキングを室温で1時間行った。次に、ウェルをPBS-Tで洗浄し、1μM CBP-αTNF、1μM未改変αTNF、または0～740 nM A3-IL4とともに室温で1時間さらにインキュベートした。PBS-Tでの3回洗浄の後、ラットIgGに対するHRPコンジュゲート抗体(Jackson ImmunoResearch)により、室温で1時間インキュベートして抗体を検出した。A3-IL4を、マウスIL-4に対する特異抗体(R&D Systems)によって検出した。洗浄後、結合したタンパク質をテトラメチルベンジジン基質により、570 nmでの吸光度を差し引いて450 nmでの吸光度の測定によって検出した。
4. A3-IL4のその受容体への結合の検出
測定を既述のように実施する(32)。96ウェルELISAプレート(Greiner Bio One)を組換えマウスIL-4Rαタンパク質(PBS中で各10μg/mL, R&D Systems)とともに37℃で終夜コーティングした後に、PBS (PBS-T)中1%のBSAによるブロッキングを室温で1時間行った。次に、ウェルをPBS-Tで洗浄し、0～740 nM A3-IL4またはIL-4とともに室温で1時間さらにインキュベートした。PBS-Tでの3回洗浄の後、マウスIL-4に対する特異抗体(R&D Systems)によってIL-4を検出した。洗浄後、結合したタンパク質をテトラメチルベンジジン基質により、570 nmでの吸光度を差し引いて450 nmでの吸光度の測定によって検出した。
5. MALDI-TOF MS
抗体をMALDI-TOF MS (Bruker Ultraflextreme MALDI TOF/TOF)によって分析した。全てのスペクトルを取得ソフトウェアBruker flexControl(商標)で収集し、分析ソフトウェアBruker flexAnalysis(商標)で処理した。最初に、マトリックスの飽和溶液であるα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(Sigma-Aldrich)を、溶媒として水中50:50のアセトニトリル:1% TFA中で調製した。次に、PBS中の分析物(5μL, 0.1 mg/mL)およびマトリックス溶液(25μL)を混合し、その混合物1μLをMTP 384グランドスチールターゲットプレートに被着させた。液滴を窒素ガス流中で乾燥させた結果、均一なサンプル/マトリックス共沈物が形成された。全てのサンプルを、75%のレーザー強度で2500回のレーザーショットを用いた高質量線形ポジティブモード法を使って分析した。測定結果を、炭酸脱水酵素、ホスホリラーゼB、およびウシ血清アルブミンの混合物を用いて3点で外的に較正した。
6. インビボでの生体内分布研究
抗TNFα抗体(クローンXT3.11, BioXcell)および抗TGF-β抗体(クローン1D11.16.8, BioXcell)を8当量のSM(PEG)24 (Thermo Fisher Scientific)とともに室温で30分間インキュベートした。Zebaスピン脱塩カラム(Thermo Fisher Scientific)を用いて、過剰なSM(PEG)24を除去した。次に、30当量のCy7標識CBP ([Cy7]LRELHLNNNC[COOH])を添加し、C残基のチオール部分へのコンジュゲーションのために室温で30分間反応させた。ペプチドはGenscriptにより95%超の純度で合成された。未反応の色素は、PBSに対する透析によって除去された。CBP非コンジュゲーション抗体については、製造元の指示にしたがいスルホ-Cy7 NHSエステル(Lumiprobe)を用いてαTNFおよびαTGFを標識した。製造元の指示にしたがいDyLight 800 NHSエステル(Thermo Fisher Sientific)を用いて、A3およびA3-IL4を標識した。モデルマウスの標的組織が炎症を起こした時点で、10～100μgのCy7標識WT-αTNF、WT-αTGF、CBP-αTNFおよびCBP-αTGF、またはDyLight 800標識A3およびA3-IL4を静脈内注射した。マウスの臓器を採取し、Xenogen IVIS Imaging System 100 (Xenogen)を用い以下の条件下で画像化した: f/ストップ: 2; 光学フィルタ励起745 nm; 励起800 nm; 露出時間: 5秒; 小ビニング。
7. マウスコラーゲン抗体誘発関節炎(CAIA)モデル
関節炎は、-3日目に抗コラーゲン抗体カクテル(1.5 mg/マウス, Chondrex)を腹腔内注射した後、0日目にLPS (50μg/マウス, Chondrex)を腹腔内注射することにより雌性Balb/cマウス(7週齢)において誘発された。LPS注射の日に、マウスの背中に、対照IgG (200μg/マウス)、WT-αTNF (200μg/マウス)、もしくはCBP-αTNF (200μg/マウス)を静脈内もしくは皮下注射し; または左後足蹠に、対照IgG (100μg/マウス)、WT-αTNF (100μg/マウス)、もしくはPlGF-2123～144-αTNF (1μg/マウス)を皮下注射した。関節の腫れを、他所に記述されているように毎日スコア化した(31)。8日目に、後足を10%中性ホルマリン(Sigma-Aldrich)中で固定し、Decalcifer II (Leica)中で脱灰し、次いで組織学的分析に供した。
8. 実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデル
EAEは、0日目に完全フロイントアジュバント中のMOG35～55の乳濁液(200μg/マウス, Hooke Laboratories)で免疫し、続いて免疫当日および翌日にPBS中の百日咳毒素(100 ng/マウス)を投与することにより雌性C57BL/6マウス(13週齢)において誘発された。EAE症状が現れた免疫後14日目に、(モル基準で0.4μg/マウスに等価な) 1μg/マウスの組換えマウスIL-4 (Peprotech)または1μg/マウスのA3-IL4の処置を開始し、1日おきに繰り返した。個々のマウスを、以下のスケールに基づき疾患の重症度について毎日スコア化した: 0, 臨床疾患なし; 0.5, 尾虚弱; 1, 尾麻痺; 2, 後肢虚弱; 3, 後肢麻痺; 3.5, 前肢虚弱; 4, 前肢麻痺; または5, 瀕死もしくは死。
9. 炎症性腸疾患(IBD)の自然発症大腸炎モデル
IL-10-/- × TLR-4-/- (DKO)マウスは、Cathyn Nagler (シカゴ大学)から親切にも提供していただいた。DKOマウスは自発的に大腸炎を発症し、直腸脱の発生率が高い。直腸脱の最初の兆候が現れた29週齢時に、マウスを画像分析のためにIBD発症マウスとして用いた。非発症IBD対照として、16週齢のDKOマウスおよび遺伝的背景系統(C57BL/6)マウスを用いた。
10. ブレオマイシン誘発性特発性肺線維症(IPF)モデル
炎症を伴う肺線維症は、生理食塩水中100μg/マウスのブレオマイシン(Sigma-Aldrich)の鼻腔内注入により雌性C57BL/6マウス（9週齢）において誘発された。ブレオマイシン投与後7日目に肺が炎症を起こしたら、マウスを画像分析のために用いた。
11. I型糖尿病(T1D)のNODマウスモデル
非肥満性糖尿病(NOD)マウスは、T細胞を介した自己免疫インスリン依存性糖尿病の自発的モデルとして公知である(37, 38)。シクロホスファミドは、NODマウスにおいて糖尿病の発症を促進しうる(39)。画像分析のため、非糖尿病対照、自然発症糖尿病NODマウスおよび300 mg/kgのシクロホスファミド(Sigma-Aldrich)の腹腔内注射が加速する糖尿病マウスとしてBalb/cマウスを用いた。血糖値を糖尿病発症の指標として用いた。
12. 組織学的分析および免疫組織化学
CAIAマウスのパラフィン包埋関節組織およびIBD発症マウスの結腸を、5μmの厚さにスライスし、病理学的分析のためにH&Eおよび/またはPASで染色した。関節炎モデルの骨吸収および滑膜過形成の重症度を、以前に報告された基準にしたがい、次のようにわずかな変更を加えて3段階評価(0～2)によりスコア化した: 0, 軟骨および辺縁帯の軟骨下骨におけるパンヌスの正常から最小限の浸潤; 1, 軽度の皮質および髄質の骨破壊を伴う辺縁帯の軽度から中等度の浸潤; 2, 関節構造の完全またはほぼ完全な破壊に関連する重度の浸潤。両方の後足のスコアを各マウスについて合計した(マウスあたりの合計スコア, 0～4)。
免疫組織染色は、標準的な手順にしたがって実施された。簡単に説明すると、切片を0.3% H2O2中で20分間インキュベートし、PBS緩衝1% BSAで1時間ブロッキングし、室温で1時間、4℃で終夜HRP標識抗ラットIgG (Jackson ImmunoResearch)ととともにインキュベートし、ジアミノベンジジンで視覚化した。
13. 統計分析
GraphPad Prismソフトウェアを用して統計分析を実施し、P < 0.05を統計的に有意と見なした。経時的な関節炎スコアの変化を、反復測定二元配置分散分析によって評価し、相互作用が有意であると見なされた場合、測定の各時点でダネットの多重比較検定を用いてデータを評価した。CBP-αTNFの効力をWT-αTNFと比較するために、8日目のデータをテューキーの多重比較検定によって再度分析した。CAIAモデルの組織学的スコアについては、ダネットの多重比較検定を用いて、対照のIgG注射群とαTNF処置群の差異を比較した。
D. 参考文献
以下の参考文献および本明細書の全体を通して参照される刊行物は、本明細書において記載されるものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
Figure 2022521428000053
Figure 2022521428000054
Figure 2022521428000055
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実施例2: 操作されたIL-10のリンパ節輸送の増強によって関節リウマチのマウスモデルが抑制される
関節リウマチ(RA)は主要な自己免疫疾患である。インターロイキン-10 (IL-10)を用いた臨床試験は、潜在的なRA処置として実施されているが、抗原認識が主に行われるリンパ器官での滞留が不十分な可能性があるため、その治療効果は限られている。本明細書で、本発明者らは、コラーゲン結合ドメイン(CBD)の融合有りおよび無しで血清アルブミン(SA)との融合体としてIL-10を操作した。SA-IL-10およびCBD-SA-IL-10は、静脈内注射後、未改変のIL-10よりも長い循環時間を示した; さらに、SA融合は、未改変のIL-10と比較してリンパ節(LN)蓄積の増強につながった。静脈内SA-IL-10およびCBD-SA-IL-10処置は、足での免疫細胞組成を正常な状態に戻し、抑制性M2マクロファージの頻度を高め、関節の形態を保護した。静脈内SA-IL-10およびCBD-SA-IL-10は、抗TNF-α抗体による処置と同様の効力を示した。IL-10へのSA融合は、LN蓄積およびRA制御を実現するための単純であるが、効果的な操作戦略である。
関節リウマチ(RA)は自己免疫疾患であり、現在、炎症経路の阻害剤による処置によって制御されている。RAの病理学的特徴は滑膜炎と関節破壊であり、これらは激痛および関節機能障害を引き起こす(1, 2)。RAの原因抗原は完全には解明されていないが、免疫細胞によるコラーゲン認識が重要な役割を果たしている。RAの進行中に、自己抗原特異的T細胞、特にTh17細胞が活性化され、IL-17を含む炎症性サイトカインを産生する。関節内の、TNF-αおよびIL-6などの、炎症性サイトカインは、炎症応答のメディエータとしてマクロファージおよび好中球の活性化を誘導する。これらの炎症細胞は関節に浸潤し、関節内の骨を破壊する破骨細胞の活性化を含むさまざまな炎症応答を引き起こす(3)。RA処置の現戦略は対症療法的であり、多くの炎症性サイトカインがRAの進行に関与していることを考慮して、抗体またはTNF-αの可溶性受容体などの、さまざまな生物学的治療法が開発され、臨床使用が承認されている(4)。
別のタイプの生物学的治療法として、寛容または炎症の全身抑制を誘発するようにRAを処置するため抗炎症性サイトカインの投与が研究されている。IL-10はそのような抗炎症性サイトカインの1つであり(5-7)、IL-10に基づく自己免疫疾患治療法を探索するためにさまざまな試みが実施されている(6-8)。しかしながら、自己免疫疾患におけるIL-10の治療効果は、おそらく循環半減期が短く、全身投与後の生体内分布が制御されていないため、依然として議論の余地がある(8)。
本研究において、本発明者らはIL-10を操作して、血清アルブミン(SA)の融合により、長期にわたる血液循環を提供し、コラーゲン結合ドメイン(CBD)の融合により、血管の透過性が増強されかつコラーゲンを含む細胞外マトリックスタンパク質が血液からのタンパク質に露出されている炎症部位への結合親和性を提供した(16, 17)。したがって、本発明者らは、SAへのCBD融合がSA融合サイトカインに炎症部位ターゲティングを付加するものと推論した。これを行うことにより、本発明者らは、増強された血液循環および疾患部位の脈管構造ターゲティングが相乗作用して、RAに及ぼすIL-10の治療効果を改善するかどうかを探索しようとした。しかしながら、本発明者らは、IL-10へのSA融合が循環時間を増強するだけでなく、リンパ節(LN)における蓄積も増強することを観察した。本明細書で、操作されたIL-10による関節炎の抑制効果は、マウスにおける受動的コラーゲン抗体誘発関節炎(CAIA)モデルおよび能動的CIAモデルを用いて評価された。本発明者らは、CBD融合が炎症を起こした足での蓄積を増強することを見出し、IL-10へのSA融合が静脈内注射後のIL-10のLNへの輸送を増強することをさらに見出した。SA融合IL-10は、2つのマウスRAモデルにおけるIL-10の抗炎症効果を大幅に改善し、TNF-α遮断と同様に機能した。
A. アルブミン融合IL-10はFcRnおよびAPCに結合し、LN内に蓄積する
野生型(wt)マウスIL-10、SA融合マウスIL-10、およびCBD-SA融合IL-10は組換えにより発現され、融合タンパク質の分子量は、SDS-PAGEによって決定した場合にwt IL-10に対するよりも、それに応じて高かった; さらに、SA-IL-10およびCBD-SA-IL-10の大部分は、非還元条件下で単量体として存在した(図8Aおよび14A)。表面プラズモン共鳴(SPR)分析により、SA-IL-10およびCBD-SA-IL-10がマイクロモルオーダーのKdで新生児Fc受容体(FcRn)に結合することが明らかにされた(図8Bおよび14B)。さらに、CBD-SA-IL-10は、ナノモルオーダーのKdでI型およびIII型コラーゲンに結合することが示された(図14B)。膝窩LNから単離された脾細胞および単細胞へのこれらのタンパク質の結合能を、フローサイトメトリーによってさらに評価した(図8C)。SA融合IL-10は、脾細胞とLN由来細胞の両方でマクロファージおよび樹状細胞への高い結合を示した。蛍光標識されたSA-IL-10の静脈内投与後、wt IL-10と比較して膝窩LN内で有意に高い蛍光シグナルが観察された(図8D)。興味深いことに、より高い蛍光シグナルは、抗原提示細胞(APC)が存在する高内皮細静脈(HEV)の周囲に位置していた(18)。
B. アルブミン融合IL-10は長期にわたる血液循環を示し、CBD融合は炎症を起こした足での蓄積につながる
SAは、血管内皮細胞でFcRnを介した再生利用を介して長い循環を示すことが知られている(19, 20)。予想通り、SA-IL-10はwt IL-10と比較して有意に長期にわたる血液循環を示した; CBD-SA-IL-10はまた、SA-IL-10と同等の循環を有していた(図9A)。図9Bは、DyLight800標識タンパク質を静脈内注射されたマウスの主要な器官からの蛍光シグナルを表す。SA-IL-10およびCBD-SA-IL-10は、その長い循環特性を反映し、心臓、肺および脾臓においてwt IL-10のものよりも高いシグナルを示した。さらに、CBD-SA-IL-10で処置したマウスの炎症を起こした足からはwt IL-10よりも有意に高いシグナルが検出されたが、炎症を起こしていない足ではwt IL-10とCBD-SA-IL-10の間で有意差のない蛍光が示され、他の状況での以前の研究において報告されているように、コラーゲン親和性を通じたCBD-SA-IL-10の炎症ターゲティング能力を示すものであった(16, 21)。
C. アルブミン融合IL-10は関節炎の発症を抑制する
受動的コラーゲン抗体誘発関節炎(CAIA)モデルにおける操作されたIL-10の治療効果を評価した(図10)。SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10の静脈内注射は関節炎の発症を有意に抑制したが、PBSまたはwt IL-10を注射したマウスは足での重度の炎症を示した(図10A)。CBD-SA-IL-10の治療効果を、RA処置のために臨床的に使用されている抗体薬のマウスモデルである抗TNF-α抗体(αTNF-α)による処置と比較し、ここではCBD-SA-IL-10がαTNF-αと同等のCAIA抑制を誘導した(図10B)。組織学的分析により、CBD-SA-IL-10およびαTNF-αの両方がPBSまたはwt IL-10処置と比較して関節破壊を抑制したことが明らかにされた(図10C)。組織学的スコアも、CBD-SA-IL-10およびαTNF-αでの処置により有意に減少した(図10C)。静脈内投与、局所(足蹠)投与、および皮下(遠位部位、背中央)投与を比較して、治療効力に及ぼす投与経路の影響についても調べた(図10D)。CBD-SA-IL-10の足蹠注射は、図10Aおよび図10Bに示されるその静脈内注射の結果と比較してCAIAに対して比較的高い抑制効果を誘導し、コラーゲン親和性を介しての、炎症を起こした足でのCBD-SA-IL-10の滞留を示唆していた(図8B)。驚くべきことに、SA-IL-10は、試験した全ての投与経路によりCAIAに対して非常に高い抑制効果を示した(図10D)。
第2の関節炎モデルとして、能動的コラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルをRA処置に対するCBD-SA-IL-10およびSA-IL-10の評価のために用いた。CBD-SA-IL-10は、PBSで処置したCIAマウスと比較して臨床スコアの増加を有意に抑制し(図11A)、その治療効果はαTNF-α処置と同等であった。関節の組織像および組織学的スコアも、CBD-SA-IL-10による関節炎確立の抑制を明らかにした(図11B)。重要なことに、CBD-SA-IL-10で処置された10匹のマウスのうち5匹が1またはそれ以下のスコアを示し、CBD-SA-IL-10の高い治療効果を示唆していた。CBDドメインがない場合、CIAマウスへのSA-IL-10の単回注射は、PBSと比較して関節炎の確立の有意な抑制を誘導した(図11C)。PBSで処置された大部分のマウスは、組織像および組織学的スコアによって示されるように、足に重度の炎症を示した(図11D)。対照的に、SA-IL-10で処置したマウスは、ナイーブマウスとほぼ同一の足の状態を示し、大部分のマウスは1またはそれ以下の組織学的スコアを示した。まとめると、これらの結果は、CBD-SA-IL-10の局所投与または静脈内投与により、さらにはSA-IL-10の皮下投与により非常に高い炎症抑制効果を示している。
D. アルブミン融合IL-10は、LN内に蓄積後に免疫活性を低減する
SA融合IL-10は、FcRnに対してマイクロモルの親和性を示し(図8B)、静脈内注射後にLN内での蓄積を示した(図8D)。次に、LNにおけるIL-10の量およびその薬物動態を定量的に評価した(図12A～C)。CAIAマウス内にwt IL-10、SA-IL-10、またはCBD-SA-IL-10を静脈内注射した後、ELISAを用いさまざまな時点でのLN内のIL-10濃度を検出した。SA-IL-10は注射4時間後に、wt IL-10およびCBD-SA-IL-10と比較して、関節流入領域(膝窩) LN、腸間膜LNにおいて有意に高いIL-10シグナルおよび非流入領域(頸部) LNにおいて比較的高いシグナルを示し、CBD-SA-IL-10はwt IL-10よりも高い蓄積を示した(図12A)。SA-IL-10を注射したマウスはまた、注射後1時間前後でIL-10濃度のピークを示し(図12B)、LN内でwt IL-10よりも5～10倍高いAUCを示した(図12C)。これらのデータは、SA-IL-10が静脈内注射後すぐにLN内に蓄積し、wt IL-10と比較してLN内でより高い滞留を示したことを示唆している。
LNにおけるSA-IL-10の高い濃度およびAUCは、LNおよび他の二次リンパ器官におけるさまざまな免疫細胞の表現型に影響を与えうる。それゆえ、脾臓および膝窩LNにおける免疫細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した(図15)。SA-IL-10の静脈内注射は、脾臓におけるCD3+ T細胞およびCD45+リンパ球の頻度の有意な減少を誘導した(図15A)。さらに、CD86+樹状細胞、顆粒球骨髄由来サプレッサー細胞(G-MDSC)、およびCD86+ M1マクロファージの頻度は減少し、CD206+ M2マクロファージの頻度はPBSまたはwt IL-10と比較してSA-IL-10の注射後に増加した。同様の傾向が膝窩LN内で観察された(図15B)。これらのデータは、SA-IL-10がAPCの活性を抑制し、同時に免疫抑制性M2マクロファージを活性化したことを示唆している。LNにおけるAPCの非活性化、およびIL-10の高蓄積は、RAの発症に重要な役割を果たすTh17細胞の活性を抑制する可能性がある(22, 23)。本発明者らは、関節流入領域(膝窩)および非流入領域(頸部) LNのLNにおけるTh17関連サイトカイン(IL-17、IL-6およびTGF-β)を測定し、wt IL-10による処置と比較したところ、IL-17はSA-IL-10による処置後に膝窩LNにおいて統計的に低減されたが、CBD-SA-IL-10によっては統計的に低減されず、頸部LNにおけるレベルはいずれのIL-10変種によっても統計的に低減されなかった(図12Dおよび12E)。SA-IL-10による処置は膝窩LN中のGM-CSFの濃度を低減させたが、wt IL-10は低減させなかった(図12F)。
E. アルブミン融合IL-10は足での炎症応答を抑制する
次に、フローサイトメトリーを用いて後足における免疫細胞集団を分析した(図13A)。SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10の静脈内注射後、CD45+免疫細胞の頻度はPBSまたはwt IL-10で処置した群と比較して有意に減少した。CD45+細胞内で、B細胞および樹状細胞の頻度は健常マウスでのレベルに匹敵するようになり、CD11b+細胞も健常マウスのレベルまで著しく減少した。CD11b+細胞のなかでは、G-MDSC集団が低減し、マクロファージの頻度が健常マウスのレベルまで回復した。さらに、CD206+ M2マクロファージの頻度は、PBSまたはwt IL-10処置と比較してSA-IL-10の注射によって有意に増加し、健常マウスの頻度を上回ってさえいた。足におけるT細胞集団の分析により、SA-IL-10がCAIAマウスでのCD4+細胞およびFoxp3+ Tregの変化を抑制したことが明らかにされた(図16A)。さらに、SA-IL-10は、血中のTreg頻度の減少を抑制した(図16B)。免疫細胞集団におけるこれらの変化を反映して、足におけるさまざまな炎症性サイトカインは、SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10の静脈内注射によって有意に減少し、そのレベルは健常マウスでのものと同等であった(図13B)。組織学的分析から、SA-IL-10の静脈内投与は、PBS処置マウスと比較して足での炎症応答を有意に抑制し、関節病変を低減させた(図13C)。
F. アルブミン融合IL-10は注射後に毒性を示さない
最後に、安全性評価を実施して、操作されたIL-10が何らかの悪影響を示すかどうか調べた。血液分析器によって測定された代表的な血液パラメータおよび脾臓重量は、処置群間で有意な変化を示さなかった(図17A)。血清中のさまざまな生化学的マーカーも、生化学分析器を用いて調べた(図17B)。操作されたIL-10処置群では、アミラーゼ(これは増加せず、むしろわずかに減少した)を除く、大部分のマーカーがPBS処置群と比較して同様のレベルを示し、操作されたIL-10が全身投与後に高い安全性を保有することを示している。
G. 考察
RAの現在の処置は、痛みを和らげ、滑膜炎を制御し、関節の損傷を抑制することによる対症療法に基づいている。炎症性サイトカイン、特にTNF-αを中和する抗体薬または競合する可溶性受容体は、RAを有する患者に高い治療効力をもたらした(4)。これらの生物学的製剤は主に炎症性関節に作用して炎症性サイトカインを捕捉する。しかしながら、これらの阻害薬は、その標的が免疫機能において多面発現性であり、これらの薬が疾患部位でその抗炎症効果を提供するために繰り返し投与されるため、感染のリスクを高めることが知られている(24-27)。さらに、抗体薬の投与はまた、治療効率を低下させる中和性の抗薬物抗体の誘導を引き起こしうる(28)。それゆえ、構造的に異なる分子クラスを有し、寛容などの異なる免疫抑制分子機構を有する代替アプローチの開発が望まれている。
本明細書で、本発明者らは、代表的な抗炎症性サイトカインであり、免疫抑制状態に向けてRA関連免疫細胞の表現型を調節する操作されたIL-10を用い、リンパ節輸送の増強を通じてRAを処置するための新しいアプローチを探求している。RAを含む自己免疫疾患を処置するために、組換えIL-10を用いた臨床試験は既に実施されている(6-8, 29)。IL-10の欠点の1つは、その血中半減期が短いことである(8)。本明細書で、本発明者らは、SAをIL-10に遺伝的に融合させて、血液中、さらには二次リンパ器官中でのその滞留を引き伸ばした。さらに、微小血管系が過透過性である炎症部位での結合を増強するために、本発明者らは、血液タンパク質フォンヴィルブランド因子に由来するCBDを遺伝的に融合させた(16, 17)。本発明者らは、2つのモデルにおける関節炎の改善について、wt IL-10と比較してSA-IL-10およびCBD-SA-IL-10の両方を評価した。CAIAはマクロファージおよび好中球を介した急性RAモデルであるのに対し、CIAはT細胞、特にTh17を介したRAモデルである。RAが診療所では不均一な疾患であり、それらのモデルが互いに補完し合うことを考えると、SA融合IL-10が両方のモデルで疾患の重症度を抑制することを示すのは励みになる。IL-10へのSA融合は、診療所で一般的な治療法であるαTNF-α抗体による処置に匹敵する顕著な治療効果を得るために重要である。さらに、本発明者らの知る限り、本研究は、CAIAモデルにおけるIL-10の治療効果を示す最初の研究である。
IL-10へのSA融合はwt IL-10と比較して、静脈内注射後のLN内での蓄積の増強をもたらし、長期間にわたりLN中で高いIL-10濃度を維持した(図12A)。これまでのところ、SAまたはアルブミン結合ナノ粒子のLN輸送は、主に皮内投与または皮下投与によって達成されており、ここでLNは注射部位の収集リンパ管下流の輸入リンパ管を介してアクセスされる(30-33)。炎症性サイトカインの生体内分布研究との関連で、ある論文には、IL-2受容体発現T細胞が存在する脾臓、肝臓およびLNへの静脈内注射後のヒトSA融合IL-2の高い局在が示されたが、この高局在の正確な機構は解明されていない(34)。本明細書で、本発明者らは静脈内注射後、SAが血液脈管構造を介してLNに侵入するSA融合IL-10のLNへの輸送の増強を明らかにする。CBD-SA-IL-10は、おそらく他の組織中のコラーゲンへの結合のために、SA-IL-10よりもLNでの蓄積が少ないことを示した。SA-IL-10およびCBD-SA-IL-10の両方ともFcRnに対して高い結合親和性(予想通り、マイクロモルKd)を示し(図8Bおよび14B)、これにより血管内皮細胞において発現されるFcRnによって媒介される再生利用を介して両方のタンパク質に長期にわたる血液循環特性が提供される(図9A)。FcRnを介したIgGの経細胞質輸送(基底側から内腔側への)を介した再生利用は、十分に確立された現象であるが、SAに対する同じ現象がつい最近になって報告された(19, 20)。ここで、LNでは、分子輸送は反対の方向、内腔側から基底側へのようである。興味深いことに、組織学的分析により、LNのHEVを取り巻くSA-IL-10の蓄積が明らかにされた(図8D)。LN蓄積の増強のさらに詳細な機構およびFcRnとの関係を明らかにするには、FcRn結合を無効化するために変異SA融合IL-10を用いたLN蓄積分析のような、さらなる実験が必要とされる。
SA-IL-10はAPCへの高い結合を示す(図8B)。SA-IL-10分子は、LN内での蓄積後、LN内に存在するAPCにより取り込まれ、樹状細胞およびM1マクロファージ活性の抑制ならびにM2マクロファージの誘導をもたらす(図15)。M2マクロファージは、LN内でのTh0細胞からTreg細胞への分化の運命を変えうる(35)。さらに、LN中の高濃度のIL-10による免疫抑制環境は、マクロファージのM2表現型へのさらなる極性化とTh17分化の抑制を引き起こし(36, 37)、本発明者らが観察したLNにおけるIL-17、GM-CSFまたは他のサイトカインの減少をもたらしうる(図12Dおよび12F)。GM-CSFは病原性Th17のマーカーであるサイトカインであり、その阻害抗体は現在、臨床試験で試験されている(38)。したがって、SA-IL-10処置によるGM-CSFの減少は、関節流入領域LNにおける免疫活性化の減少を示す。Th17細胞はIL-10受容体を発現すると報告されており、IL-10結合はIL-17の発現および分泌を抑制する(14, 36)。Th17細胞の抗原認識は主にリンパ組織で行われるため、SA-IL-10はTh17細胞に直接結合してIL-17経路を抑制しうる。LNにおけるこれらの変化はまた、免疫細胞、特にG-MDSCおよびマクロファージの足への浸潤を抑制し(図13A)、またM2マクロファージの増加を誘発し(図13A)、炎症性サイトカインの減少(図13B)および関節の炎症の抑制(図10、11、および13C)を引き起こした。
SA-IL-10は、試験した経路、すなわち静脈内、皮下(遠位部位)または足蹠(局所)注射のいずれかによる投与後に高い抗炎症応答を誘発し、SA-IL-10が局所注射部位の流入領域リンパ管による取り込み後に全身的にLNに侵入し、リンパ管を通過し胸管を介して体循環に戻りうることを示唆している。皮下注射による高い治療効果は、SA-IL-10の特定の臨床的利益を示唆している。静脈内CBD-SA-IL-10は、RAの現在の標準的な生物学的治療法である抗TNF-α抗体に匹敵する、CAIAおよびCIAの発症に対する抑制効果も示す。しかしながら、CBD-SA-IL-10の治療効果は、SA-IL-10で観察されたものよりも低く、これはCBD-SA-IL-10のより低いLN輸送に対応する(図12A)。CBD-SA-IL-10は、炎症組織に浸透した後に炎症組織中のコラーゲンに結合する可能性があり、これにより炎症を起こした足への蓄積が引き起こされる(図9B)が、しかしそのようなコラーゲン親和性は、CBD-SA-IL-10のLN輸送を妨げうる(16, 39)。それゆえ、SA融合は、増強されたLN輸送を達成するために操作されたサイトカインを調製するための単純であるが、効果的な方法である。
本研究では、IL-10へのSA融合により、自己免疫関連の免疫認識が発現かつ持続するLN内での持続性の増加が達成された。その結果、SA-IL-10はRA進行の主な炎症経路を抑制したが、TNF-αなどの多面発現性炎症性サイトカインを阻害することはなかった。さらに、SA-IL-10は予備的な安全性評価で顕著な毒性を示さなかった(図17)。SA-IL-10は、CIAモデルとCAIAモデルの両方で顕著な治療効果を示した。それゆえ、データから、RAの抑制における臨床応用のためのSA-IL-10の可能性が示唆され、本発明者らの知見は、他の自己免疫および炎症性疾患におけるLNの全身寛容原性操作を通じて免疫を調節する能力をより広く示唆している。
H. マウスwt IL-10、SA-IL-10およびCBD-SA-IL-10のアミノ酸配列
Figure 2022521428000057
I. 材料および方法
1. 研究デザイン
本研究は、FcRnに対する操作された親和性を通じて抗炎症性サイトカインをLNにターゲティングする戦略を試験するためにデザインされた。具体的には、本発明者らは、血清アルブミン融合による抗炎症性サイトカインIL-10のLNターゲティングが、RAのマウスモデルにおいて非ターゲティングwt IL-10および現在利用可能な抗炎症性抗体治療用物質(αTNF-α)よりも優れているかどうかを試験した。wt IL-10、SA-IL-10および抗TNF-α抗体の効力を評価するために、本発明者らは、受動的CAIAモデルおよび能動的CIAモデルの両方において関節炎の症状および関節組織像をスコア化した。本発明者らはまた、生体内分布およびLN輸送、LNおよび足内の免疫応答ならびに処置後の毒性のさまざまな側面を測定した。必要なサンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使われなかったが、適切な統計的検定によって統計的に有意な結果を得ることができるようにパイロット実験からの推定に基づいてサンプルサイズを選択した。wt IL-10、SA-IL-10およびCBD-SA-IL-10の産生は、再現性を確保するために複数人によって実施された。全ての実験は少なくとも2回繰り返された。動物実験では、最初の薬物注射の直前にマウスをケージ内の処置群にランダムに分け、同じ方法で処置した。統計値を計算するために使用されるn値は、図の凡例に示されている。薬物投与および病理学的分析は、盲検法で実施された。統計的手法は「統計分析」のセクションに記述されている。
2. 組換えタンパク質の産生および精製
プロペプチドを有しないマウス血清アルブミン(全血清アルブミンのアミノ酸番号25～608)、マウスIL-10、ヒトVWF A3ドメイン残基Cys1670～Gly1874 (本明細書においてCBDといわれる、成熟VWFの番号907～1111)、および(GGGS)2リンカーをコードする配列を合成し、Genscriptによって哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(+)にサブクローニングした。組換えタンパク質のさらなる精製のために、6 Hisをコードする配列を、C末端に付加した。懸濁液に適合したHEK-293F細胞は、無血清FreeStyle 293発現培地(Gibco)中で日常的に維持された。トランスフェクションの日に、細胞を1×106個の細胞/mLの密度で新鮮培地に接種した。2μg/mLのプラスミドDNA、2μg/mLの線形25 kDaポリエチレンイミン(Polysciences)、およびOptiPRO SFM培地(終濃度4%, Thermo Fisher)を順次添加した。培養フラスコを5% CO2の存在下、37℃、135 rpmで軌道振盪することにより撹拌した。トランスフェクション7日後、細胞培地を遠心分離によって回収し、0.22μmフィルタでろ過した。AKTA pure 25 (GE Healthcare)を用いて、培地をHisTrap HP 5 mlカラム(GE Healthcare)に負荷した。洗浄緩衝液(20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 8.0)によるカラムの洗浄後に、500 mMイミダゾール(20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 8.0中)の勾配でタンパク質を溶出させた。溶出液としてPBSを用いHiLoad Superdex 200PGカラム(GE Healthcare)を使ったサイズ排除クロマトグラフィーでタンパク質をさらに精製した。全ての精製段階は4℃で実行された。タンパク質の発現は、SDS-PAGEによって90%超の純度であると確認された。精製されたタンパク質は、HEK-Blue TLR4受容体細胞株を介してエンドトキシンについて試験され、エンドトキシンレベルは0.01 EU/mL未満であると確認された。NanoDrop (Thermo Scientific)を用いて280 nmでの吸光度からタンパク質濃度を決定した。
3. コラーゲンおよびFcRnへの結合の検出
SPR測定は、Biacore X100機器を用いて実行された。コラーゲン結合実験では、組換えヒトI型またはIII型コラーゲン(Millipore Sigma)を標準的なアミンカップリング法(およそ1500共鳴単位(RU))によってCM5センサーチップに固定化し、エタノールアミンでブロッキングした。参照セルもエタノールアミンでブロッキングした。結合アッセイを室温で実行し、CBD-SA-IL-10のKd値を、BIAevaluationソフトウェア(GE Healthcare)を用いて1:1ラングミュア結合モデルをデータに適合させることによって決定した。FcRn結合実験では、組換えマウスFcRn (Acro Biosystems)を、製造元の指示にしたがいC1チップ(GE Healthcare)にアミンカップリングを介しておよそ200 RU固定化した。SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10を室温にて30μL/分でランニング緩衝液(0.01 M一塩基性無水リン酸ナトリウム, pH 5.8, 0.15 M NaCl)中において濃度を減少させながら流した。センサーチップをサイクルごとにPBS, pH 7.4で再生した。FcRnへのSA融合タンパク質の特異的結合を、参照として用いた非機能化チャネルと比較することによって計算した。BIAevaluationソフトウェア(GE Healthcare)を用い1:1ラングミュア結合モデルをデータに適合させることによってSA-IL-10およびCBD-SA-IL-10のKd値を決定した。
4. マウス
7週齢のBALB/c雌性マウスおよび8週齢のDBA/1J雄性マウスを、Jackson Laboratoryから入手した。実験は、シカゴ大学の施設内動物管理使用委員会の承認を得て実施された。
5. 脾細胞またはLN由来細胞へのタンパク質の結合
70μmの細胞ストレイナを通して脾臓および膝窩LNを穏やかに破壊することによって、単細胞懸濁液を得た。赤血球を脾細胞用のACK溶解緩衝液(Quality Biological)で溶解した。細胞をカウントし、10% FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシン(全てLife Technologiesから)を補充したRPMI-1640中に再懸濁した。1×105個の細胞/ウェルを96ウェルマイクロプレートに播種し、2μg/100μLのSA、SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10とともに氷上で30分間インキュベートした。PBSによる4回の洗浄後、細胞を抗マウスアルブミン抗体(abcam)とともに氷上で20分間さらにインキュベートした。PBSによる3回の洗浄後、細胞を1μg/mL AlexaFluor 647標識抗ウサギIgG (Jackson ImmunoResearch)、抗B220 (RA3-6B2, BioLegend)、抗CD3 (145-2C11, BD Biosciences)、抗CD4 (RM4-5, BD Biosciences)、抗CD8 (53-6.7, BD Biosciences)、抗CD11c (HL3, BD Biosciences)、抗CD45 (30-F11, BD Biosciences)および抗F4/80 (T45-2342, BD Biosciences)抗体とともに氷上で20分間インキュベートした。以下に記述するように、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
6. タンパク質の血漿薬物動態
IL-10、SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10 (35μgのIL-10に相当)を雌性BALB/cマウスに静脈内注射した。血液サンプルを注射後1分、5分、10分および30分、ならびに1時間、4時間、8時間および24時間の時点でタンパク質低結合チューブに回収し、その後に4℃で終夜インキュベーションを行った。血清中のIL-10濃度を、IL-10 Mouse Uncoated ELISAキット(Invitrogen)により製造元のプロトコルにしたがって測定した。指数二相減衰(Y = Ae-αt + Be-βt)フィッティングを用いて半減期を計算した。速いクリアランス半減期, t1/2,α; 遅いクリアランス半減期, t1/2,β。Prismソフトウェア(v8, GraphPad)を用いてデータを分析した。
7. CAIAモデル
関節炎は、0日目に抗コラーゲン抗体カクテル(1.0 mg/マウス, Chondrex)の腹腔内注射、続いて3日目にLPS (25μg/マウス, Chondrex)の腹腔内注射により雌性BALB/cマウスにおいて誘発された。図3B～Cの場合のみ、1.5 mg/マウスの抗コラーゲン抗体カクテルを注射した。3日目、LPS注射前にマウスにPBS、wt IL-10、SA-IL-10、CBD-SA-IL-10 (各43.5μgのIL-10に相当)、または200μgのラット抗マウスTNF-α抗体(クローンXT3.11, Bio X Cell)を静脈内に、皮下(背中央)に、または足蹠を介して注射した。関節の腫れを、製造元のプロトコル(Chondrex)にしたがって毎日スコア化した。スコア化の最終日に、後足を10%中性ホルマリン(Sigma-Aldrich)中で固定し、Decalcifer II (Leica)中で脱灰し、次いで組織学的分析に供した。パラフィン包埋した足を5μmの厚さにスライスし、H&Eで染色した。Pannoramicデジタルスライドスキャナで画像をスキャンし、Pannoramic Viewerソフトウェアを用いて分析した。関節炎モデルの骨吸収および滑膜過形成の重症度を、以前に報告された基準にしたがい、次のようにわずかな変更を加えて3段階評価(0～2)によりスコア化した: 0, 軟骨および辺縁帯の軟骨下骨におけるパンヌスの正常から最小限の浸潤; 1, 軽度の皮質および髄質の骨破壊を伴う辺縁帯の軽度から中等度の浸潤; 2, 関節構造の完全またはほぼ完全な破壊に関連する重度の浸潤。両方の後足のスコアを各マウスについて合計した(マウスあたりの合計スコア, 0～4)。組織病理学的分析は盲検法で実施された。
8. CIAモデル
雄性DBA/1Jマウス(8週齢)を、尾の付け根にウシコラーゲン/完全フロイントアジュバント(CFA)乳濁液(Hooke Kit, Hooke Laboratories)を皮下注射して免疫した。3週間後、ウシコラーゲン/不完全フロイントアジュバント(IFA)乳濁液(Hooke Kit, Hooke Laboratories)の追加抗原注射を実施した。追加抗原注射後、マウスを毎日検査し、製造元のプロトコル(Hooke Laboratories)にしたがって関節の腫れをスコア化した。2～4の合計スコアを示した時点で(0日目と定義)、マウスにPBS、SA-IL-10、CBD-SA-IL-10 (各43.5μgのIL-10に相当)、または200μgのラット抗マウスTNF-α抗体(クローンXT3.11, Bio X Cell)を静脈内注射した。スコア化の最終日に、後足を収集し、上記のように組織学的分析を利用した。
9. インビボでの生体内分布研究
蛍光標識タンパク質を作出するために、wt IL-10、SA-IL-10およびCBD-SA-IL-10を8倍モル過剰のDyLight 800 NHS ester (Thermo Fisher)を用いて室温で1時間インキュベートし、未反応の色素をZebaspinスピンカラム(Thermo Fisher)により製造元の指示にしたがって除去した。BALB/cマウスを0日目に抗コラーゲン抗体カクテル(1.0 mg/マウス)により腹腔内注射し、続いて3日目に10μgのLPSを右後足に注射した。翌日、20μgのDyLight 800標識タンパク質を静脈内注射した。4時間後、疾患モデルから採取した臓器を、Xenogen IVIS Imaging System 100 (Xenogen)を用い以下の条件下で画像化した: f/ストップ: 2; 光学フィルタ励起745 nm; 励起800 nm; 露出時間: 5秒; 小ビニング。各臓器からの蛍光シグナルを正規化するために、各臓器の重さを量った。
10. LN顕微鏡検査
BALB/cマウスに、等モル量の色素で標識されたDyLight594標識wt IL-10 (43.5μg)またはSA-IL-10を静脈内注射した。注射24時間後、膝窩LNを採取し、最適切断温度(OCT)コンパウンドとともにドライアイス中で凍結した。凍結切片によって組織スライス(10μm)を得た。組織をPBS中2%のパラホルムアルデヒドにより室温で15分間固定した。PBS-Tで洗浄した後に、組織をPBS-T中の2%のBSAにより室温で1時間ブロッキングした。組織を抗マウスCD3抗体(1:100, 145-2C11, BioLegend)または抗マウス末梢リンパ節アドレッシン(PNAd)抗体(1:200, MECA79, BioLegend)およびAlexa Fluor 488ロバ抗ラット(1:400, Jackson ImmunoResearch)で染色した。組織を3回洗浄した後、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI; Thermo Fisher Scientific)を有するプロロングゴールド褪色防止用封入剤(Prolong gold antifade mountant)で覆った。CD3染色には倍率10倍でのイメージングにIX83顕微鏡(Olympus)を用い、PNAd染色には倍率20倍でのLeica SP8 3Dレーザー走査共焦点顕微鏡を用いた。ImageJソフトウェア(NIH)を用いて画像を処理した。
11. LN薬物動態
wt IL-10、SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10 (各35μgのIL-10に相当)をCAIAマウスに静脈内注射した。膝窩、腸間膜、頸部のLNを注射後30分、ならびに1、4、8および24時間の時点で収集し、その後、cOmplete(商標)プロテイナーゼ阻害剤カクテル(Roche)を有するT-PER組織タンパク質抽出試薬(Thermo Scientific)中5000ビート/分で40秒間Lysing Matrix D and FastPrep-24 5G (MP Biomedical)を用いてホモジナイズした。ホモジナイゼーション後、サンプルを4℃で終夜インキュベートした。サンプルを遠心分離し(5000 g, 5分)、総タンパク質濃度およびIL-10濃度を、それぞれBCAアッセイキット(Thermo Fisher)およびIL-10 Mouse Uncoated ELISAキット(Invitrogen)を用いて分析した。同時に、Mouse Uncoated ELISAキット(Invitrogen)またはReady-SET-Go! ELISAキット(eBioscience)を製造元のプロトコルにしたがい用いて、LN抽出物中のサイトカインレベルを測定した。GM-CSFの検出のため、wt IL-10またはSA-IL-10 (各35μgのIL-10に相当)をCAIAマウスに3日間隔で2回静脈内注射した。最後の注射の翌日、GM-CSFの検出のために膝窩LNを収集した。
12. フローサイトメトリー
CAIAマウスにPBS、wt IL-10、SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10 (各43.5μgのIL-10に相当)を静脈内注射した。8日後、血液および後足を採取した。血中の赤血球をACK溶解緩衝液(Quality Biological)で溶解した後に、フローサイトメトリー用の抗体染色を行った。2% FBS、2 mg/mLコラゲナーゼDおよび40μg/mL DNase I (Roche)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM)中で足を37℃で60分間消化した。70μmの細胞ストレイナを通して穏やかに破壊することによって、単細胞懸濁液を得た。以下の分子に対する抗体を用いた: 抗マウスCD3 (145-2C11, BD Biosciences)、CD4 (RM4-5, BD Biosciences)、抗マウスCD8α(53-6.7, BD Biosciences)、抗マウスCD25 (PC61, BD Biosciences)、抗マウスCD45 (30-F11, BD Biosciences)、CD44 (IM7, BD Biosciences)、CD62L (MEL-14, BD Biosciences)、PD-1 (29F.1A12, BD Biosciences)、NK1.1 (PK136, BD Biosciences)、Foxp3 (MF23, BD Biosciences)、F4/80 (T45-2342, BD Biosciences)、MHC II (M5/114.15.2, BioLegend)、CD206 (C068C2, BioLegend)、Ly6G (1A8, BioLegend)、Ly6C (HK1.4, BioLegend)、CD11b (M1/70, BioLegend)、CD11c (HL3, BD Biosciences)、B220 (RA3-6B2, BioLegend)。固定可能な生/死細胞の識別は、Fixable Viability Dye eFluor 455 (eBioscience)を製造元の指示にしたがって用い実施した。別段の指示がない限り、染色は氷上で20分間行い、細胞内染色はFoxp3染色キットを製造元の指示(BioLegend)にしたがって用い実施した。洗浄段階の後、固定前に氷上で20分間、細胞を特異抗体で染色した。全てのフローサイトメトリー分析は、Fortessa (BD Biosciences)フローサイトメーターを用いて行い、FlowJoソフトウェア(Tree Star)を用いて分析した。
13. 安全性評価
BALB/cマウスにPBS、wt IL-10、SA-IL-10またはCBD-SA-IL-10 (各43.5μgのIL-10に相当)を静脈内注射した。注射2日後、マウスから収集した血液サンプルを、製造元の指示にしたがってCOULTER Ac・T 5diff CP血液分析器(Beckman Coulter)を用い分析した。脾臓の重量も測定した。タンパク質を注射したマウスから収集した血清サンプルを、製造元の指示にしたがってBiochemistry Analyzer (Alfa Wassermann Diagnostic Technologies)を用い分析した。
14. 統計分析
実験群間の統計的有意差は、Prismソフトウェア(v8, GraphPad)を用いて決定された。一元配置分散分析とそれに続くテューキーのHSD事後検定を用いた場合、群間の分散はブラウンフォーサイス検定によって類似していることが分かった。ノンパラメトリックデータの場合、クラスカル・ワリス検定とそれに続くダンの多重比較検定を用いた。単一比較の場合、両側スチューデントのt検定を用いた。記号＊、＊＊、＊＊＊および＊＊＊＊は、それぞれ0.05、0.01、0.001および0.0001未満のP値を示す; ns, 有意ではない。
J. 参考文献
以下の参考文献および本明細書の全体を通して参照される刊行物は、本明細書において記載されるものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
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Figure 2022521428000059
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実施例3: FcRnを介した二次リンパ器官におけるアルブミン融合IL-4の長期滞留は、実験的自己免疫性脳脊髄炎を改善する
多発性硬化症(MS)は、中枢神経系の一般的かつ重篤な脱髄性自己免疫疾患である。インターロイキン(IL)-4は、マウスMSモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の病態の発現を抑制するが、IL-4は臨床的に技術移転されていない。本明細書で、本発明者らは、血清アルブミン(SA)とIL-4の融合タンパク質(SA-IL-4)を操作して、抗原特異的T細胞プライミングが主に行われる二次リンパ器官(SLO)をターゲティングする。SA-IL-4は、新生児Fc受容体(FcRn)結合を介して、野生型(wt) IL-4と比較して、リンパ節(LN)および脾臓でより高い蓄積および滞留時間を示した。SA-IL-4の皮下投与は、全てのマウスでEAE疾患の発現を予防し、FTY720およびwt IL-4と比較して高い治療効力を実証した。SA-IL-4は、脊髄への免疫細胞の浸潤を防ぎ、脊髄構造の維持とその結果としての神経機能を促進する。SA-IL-4は、抗原反応性CD4+ T細胞におけるインテグリン発現を減少させ、細胞遊走能力の障害を示していた。SA-IL-4は、脊髄流入領域LN (dLN)において、EAE疾患の主要なサプレッサーである顆粒球様骨髄由来サプレッサー細胞の数および該細胞上のプログラム死リガンド-1の発現を増加させた。SA-IL-4は、EAE疾患の病原性細胞集団であるTh17細胞の数を減少させた。EAEの慢性期では、SA-IL-4は、脊髄への免疫細胞浸潤の阻害と脾臓におけるミエリン抗原に対する免疫応答の完全な抑止を伴う、顕著な治療効果も示した。操作されたSA-IL-4は、SLOにおける蓄積を介した予防的処置と治療的処置の両方としてのMSの技術移転の可能性を実証している。
多発性硬化症(MS)は、世界中で数百万人に影響を与えている潜在的に障害を引き起こす自己免疫疾患である。自己反応性免疫細胞は中枢神経系(CNS)に帰巣し、脱髄を引き起こし、その結果、白質に限局性の損傷を引き起こす(1)。CNSに浸潤したリンパ球およびマクロファージは軸索損傷を引き起こす。最近の研究では、二次リンパ器官(SLO)で活性化されたTh17細胞が脊髄および脳に移動し、MSの疾患発症および重症度に重要な役割を果たすことが示されている(20)。したがって、リンパ球のCNSへの移動を阻害し、SLOに免疫抑制微小環境を誘導することで、MSに効果的な治療法が提供されよう。FTY720および抗インテグリンα4抗体は、リンパ球移動を阻害するために診療所において用いられている(3,4)。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、広く受け入れられているMSマウスモデルであり、CNSへのリンパ球移動および脱髄を含めて、疾患の進行および発症機構の多くの特徴を反映している。
A. SA-IL-4は免疫細胞に結合し、Th17分化を阻害する
本発明者らは、野生型(wt)マウスIL-4およびマウスSA融合マウスIL-4を組換え発現させた(図18A)。SDS-PAGEにより、IL-4へのSA融合によって分子サイズが増加したことが明らかにされた。LNおよび脾臓から新たに単離された免疫細胞に添加されると、SA-IL4は他の免疫細胞と比較して、インビトロでマクロファージおよび樹状細胞(DC)などの、抗原提示細胞(APC)に選択的に結合した(図18B)。
IL-4受容体は、刺激されるとT細胞に発現される(12)。SA-IL-4は、wt IL-4よりも32倍高いEC50でT細胞におけるSTAT6の下流リン酸化を誘導した。これは、wt IL-4がインビトロでSA-IL-4よりも活性であることを示唆している(図18C)。本発明者らは、wt IL-4およびSA-IL-4の両方が、Th17細胞分化培地中で培養されたナイーブCD4+ T細胞のTh17分化を阻害することを見出した(図18D)。まとめると、この結果から、本発明者らが機能的に活性なSA-IL-4融合タンパク質を成功裏に作出したことが実証される。
SA-IL-4は、血中半減期およびSLOでの残留性をLNと脾臓の両方で増加させる。
表面プラズモン共鳴(SPR)分析は、SA-IL-4が385 nMの解離定数(KD)でFcRnに結合することを示した(図19A)。SA-IL-4の静脈内(i.v.)注射後の血漿中半減期は、数分以内に血漿から除去されたwt IL-4とは対照的に著しく延長された(図19B)。次に、本発明者らは、ナイーブマウスを用いて、静脈内注射されたSA-IL-4が脾臓およびLNに蓄積するかどうかを試験した。SA-IL-4は、腰LNと上腕LNの両方においておよび脾臓において静脈内注射後にIL-4の量を大幅に増加させた(図2cd)。蛍光に基づく生体内分布分析はまた、wt IL-4と比較して腰LNにおけるSA-IL-4蓄積の増強を示した(図24)。LNにおけるSA-IL-4蓄積でのFcRnの関与を試験するために、本発明者らは、FcRn結合を抑止する、IL-4への融合におけるSAのP573K点突然変異を作出した(図25A) (13)。SA(P573K)変異は、SA-IL-4と比較してLNにおけるIL-4量を減少させ、wt IL-4と同様のレベルにまで低下させた(図19E)。SA(P573K)-IL-4は、分子サイズの増加によりwt IL-4と比較して血中半減期が長いものの、FcRn結合の障害によりSA-IL-4よりも短い(図25B)。まとめると、これらのデータは、LNへのSA輸送にはFcRn結合が必要とされることを示唆している。
SA-IL-4の静脈内注射後に、LNの組織像は、wt IL-4と比較して腰LNにおけるSA-IL-4のシグナルの増加を示した。SA-IL-4は、CD3+ T細胞と共局在することなく、特に被膜下腔に局在した(図19G)。より高い倍率から、SA-IL-4が、末梢リンパ節アドレッシン+ (PNAd+)細胞によって示される高内皮細静脈と部分的に共局在することが明らかにされた(図19H)。脾臓中のSA(P573K)-IL-4の量はSA-IL-4よりも低かった(図19F)。まとめると、本発明者らは、IL-4へのSA融合がFcRn結合を通じてLNおよび脾臓内でのIL-4の残留性を増加させることを示した。
B. SA-IL-4処置は、EAE疾患の発症を予防的処置において強力に抑制する
次に、本発明者らは、EAEの急性期において、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)抗原誘発性EAEをSA-IL-4で処置した(図20)。SA-IL-4を皮下(s.c.)または腹腔内(i.p.)に注射した。本発明者らは、皮下注射を選択した。というのは、それが臨床的に好都合であり、薬物が注射部位からゆっくりと吸収されるためである。腹腔内注射を静脈内の代わりに行った。というのは、EAEを発症したマウスでは尾が弛緩し、尾静脈注射が困難になるためである。本発明者らはさらに、SA-IL-4の治療効果をFTY720と比較した。FTY720は、MSを処置するための臨床承認薬(フィンゴリモド)であり、LN内のリンパ球を隔離してそれらが標的組織内の自己抗原と反応するのを防ぐ(3)。SA-IL-4の皮下注射は、全てのマウスにおいて疾患の発症を完全に抑制した(図20A、B)。腹腔内注射したSA-IL-4、およびFTY720は、7匹中4匹のマウスにおいてEAEの発症を防ぎ、残りのマウスでは疾患の重症度を抑制した。wt IL-4処置はPBS処置群と比較してEAE臨床スコア抑制を示さず、そのマウスの全てが疾患を発症した。健常の臨床指標として体重変化を用い、PBSおよびwt IL-4で処置したマウスは体重を著しく減少させることが観察された(図20C)。SA-IL-4を皮下注射されたマウスは、他の全群よりも体重が増え、良好な健康状態を示すものであった。腹腔内SA-IL-4群は平均して体重が増えたが、FTY720処置マウスはその体重を維持した。本発明者らは次に、EAE疾患の主な形態学的徴候である脊髄の脱髄を分析した(図20D)。重要なことに、SA-IL-4を皮下注射されたマウスには、検出可能ないずれの脱髄もなく、脊髄の損傷の予防を実証していた。全てのwt IL-4処置マウスは脱髄を示した。本発明者らは次に、24日目までマウスを長期間モニターしたところ、SA-IL-4腹腔内注射が疾患発症および進行を抑制した(図26)。重要なことに、SA(P573K)-IL-4は疾患スコアを抑制しなかった(図27)。これらのデータは、IL-4へのSA融合がEAE疾患抑制に及ぼすIL-4の治療効果を強力に改善することを示唆している。
C. SA-IL-4処置は、脊髄への免疫細胞浸潤を抑制し、dLNにおいて免疫抑制環境を誘導する
本発明者らは次に、処置後の脊髄およびdLNにおける免疫細胞を分析した。驚くべきことに、SA-IL-4の皮下注射は、CNSへの免疫細胞の浸潤を有意に抑制した; 脊髄内で検出されたCD45+免疫細胞はごくわずかであった(図21A)。ゆえに、脊髄におけるTh17細胞は皮下SA-IL4処置群においてほとんど検出できなかった(図21B)。SA-IL-4の腹腔内注射は、7匹中4匹のマウスにおいて免疫細胞浸潤を抑制し、これはその群におけるEAE疾患の発生率に対応している。FTY720の投与は、予想通り、脊髄への免疫細胞の浸潤も抑制した。wt IL-4は、PBS処置と比較して、脊髄へのTh17を含む免疫細胞の浸潤に対するいずれの影響も示さなかった。
本発明者らは次に、腰dLNにおける免疫細胞を分析した。SA-IL-4は、顆粒球様骨髄由来サプレッサー細胞(G-MDSC)を増加させたが、単球様MDSC (M-MDSC)を低減させた(図21C、D)。dLNにおけるCD4+ T細胞内のTh17細胞の頻度も、FTY720処置と比較して、(腹腔内および皮下の両方の) SA-IL-4処置によって低減された(図21E)。FTY720処置は、おそらくFTY720がLNからのリンパ球の流出を阻害するため、PBS群と比較してdLNにおけるTh17細胞頻度を増加させる傾向があった。SA-IL-4処置は、dLNにおいてM1マクロファージの頻度を低減させ、M2マクロファージを増加させた(図21F)。wt IL-4は、M1マクロファージの頻度を減少させなかったが、M2マクロファージを増加させた。CD11b+細胞内のマクロファージの頻度(図28A)、およびCD45+細胞内のDCの頻度(補足図4b)が維持された。B細胞はT細胞の再活性化を促進することによってEAEの誘導を促進すると報告されている(14)。SA-IL-4 (皮下)は、PBSおよびFTY720処置群の両方と比較して、B細胞の頻度を減少させた(図21H)。まとめると、これらのデータは、SA-IL-4処置がdLNにおいて免疫抑制環境を作出し、脊髄への免疫細胞の浸潤を防ぐことを実証している。
D. SA-IL-4処置は、抗原反応性CD4+ T細胞でのIL-17関連サイトカインおよびインテグリン発現を減少させる
本発明者らは次に、SA-IL-4の皮下注射による脊髄での免疫細胞浸潤の減少および完全なEAE疾患予防の分子機構を分析した。本発明者らは、dLNにおけるMOG35～55反応性T細胞の数が全ての処置群において維持されたことを見出し、SA-IL-4は抗原認識を変化させないことが示唆された(図22A)。したがって、本発明者らは、SA-IL-4がT細胞の機能性を変化させると仮定した。本発明者らは最初に、T細胞の移動能力を試験した。リンパ球移動に重要な接着分子であるαLβ2およびα4β1インテグリンの発現レベル(15)は、IL-4によって減少すると報告されている(16)。本発明者らは、SA-IL-4処置がMOG35～55反応性CD4+ T細胞上のαLβ2インテグリン発現を有意に減少させたが、総CD8+ T細胞では減少させなかったことを見出した(図22B～E)。α4β1インテグリンの発現は、MOG35～55反応性CD4+ T細胞でも、総CD8+ T細胞でも有意に変化しなかった。αLβ2インテグリンは脊髄へのTh17細胞の浸潤に不可欠であるため(15)、このことから、インテグリン発現の下方制御はSA-IL-4が脊髄へのリンパ球移動を減少させる機構の1つであることが示唆される。
本発明者らは次に、PD-1およびPD-L1の会合がT細胞の活性化を抑制するので、T細胞でのPD-1発現およびMDSCでのPD-L1発現を試験した(図22F～K) (17)。驚くべきことに、wt IL-4ではなくSA-IL-4は、中央記憶CD4+ T細胞および中央記憶CD8+ T細胞の両方でPD-1の発現を増加させた(図22F,G)。さらに、wt IL-4ではなくSA-IL-4は、M-MDSCおよびG-MDSCの両方でPD-L1の発現レベルおよびPD-L1発現細胞の頻度を増加させた(図22H～K)。これらのデータは、T細胞抑制がMDSCおよびPD-1/PD-L1軸を通じて誘導されうることを示唆している。
本発明者らは次に、Th17関連タンパク質の発現を分析した。IL-23はTh17機能性にとって重要なサイトカインである。IL-4はAPCに結合し、IL-23および一致したTh17分化をサイレンスすると報告されている(18)。本発明者らは、SA-IL-4処置がMOG35～55反応性T細胞レパートリー内のIL-23R+細胞の頻度を減少させることを見出した(図22L)。
次に、本発明者らは、脾細胞をMOGタンパク質で再刺激した(図22M,N)。培養上清のELISAから、PBSと比較して、wt IL-4処置ではなく、SA-IL-4処置でIL-17A発現の減少が明らかにされた(図22M)。IL-17発現の低減は、SA-IL-4処置群におけるMOG35～55反応性Th17細胞の数および/または活性レベルの減少を意味する。IFNγ濃度は維持されたことから、Th1細胞に及ぼすSA-IL-4の効果がほとんどないことが示唆された(図22N)。SA-IL-4は、EAEの病原性サイトカインであると報告されているGM-CSFのレベル減少の傾向があった(19) (図22O)。本発明者らは次に、脾細胞のMOG35～55ペプチド再刺激後にフローサイトメトリーによってT細胞内のサイトカイン発現を試験した(図22P)。本発明者らは、EAEの全病原性サイトカインであるGM-CSF、IL-17、IFNγおよびTNFαを分析した。SA-IL-4は、他の処置と比較して、CD4+ T細胞コンパートメント内のサイトカイン発現細胞の頻度を減少させた。これらの結果は、SA-IL-4処置マウスにおけるTh17細胞が、他の処置群と比較して病原性が少なくかつ低いことを強く示唆している。まとめると、これらのデータは、SA-IL-4がSLOにおける複数の免疫細胞応答を調節し、脊髄への、免疫細胞浸潤、特にT細胞浸潤を防ぐことでEAE疾患の発症を抑制することを示唆している。
E. SA-IL-4は慢性期のEAEによる麻痺を回復する
SA-IL-4がEAEの慢性期において治療効果を有するかどうかを決定するために、本発明者らは、重度麻痺の段階に既に到達したマウスを処置することを伴う実験をデザインした。本発明者らは、誘導後21日目からのIL-4の腹腔内注射を開始した(図23A,B)。驚くべきことに、SA-IL-4は、この遅い時点で投与された場合でも治療効力を実証したが、wt IL-4はそうでなかった。SA-IL-4処置マウスは体重が増加したが、wt IL-4処置マウスは体重が増加せず、疾患の回復を示すものであった。本発明者らは次に、皮下注射を介して慢性期におけるSA-IL-4の効果を試験し、経口FTY720治療と比較した(図23C,D)。その結果、SA-IL-4で処置されたマウスは、他の処置群と比較して臨床スコアの低下傾向があった。SA-IL-4を投与されたマウスは、他群と比較して体重が増加した。FTY720処置マウスおよびwt IL-4処置マウスは、PBS処置マウスと比較して体重が増加しなかった。
本発明者らは次に、フローサイトメトリーによって誘導後34日目に脊髄への免疫細胞浸潤を試験した(図23E～G)。SA-IL-4およびFTY720処置は、PBSおよびwt IL-4処置と比較して、CD4+ T細胞およびMOG35～55反応性Th17細胞を含む、脊髄浸潤免疫細胞の数を減少させた。SA-IL-4は他の治療群と比較して、脾臓におけるMOG35～55反応性CD4+ T細胞内のIL-23R発現細胞を減少させた(図23H)。最後に、MOGタンパク質による脾細胞の再刺激を実施した。培養上清のELISAにより、PBSと比較して、SA-IL-4処理群においてIL-17AおよびGM-CSF濃度の低下が明らかにされたが、wt IL-4およびFTY720処置後はそうでないことが明らかにされた(図23I,J)。MOG35～55ペプチド再刺激後のフローサイトメトリー分析から、SA-IL-4が他の処置と比較してCD4+ T細胞コンパートメント内のサイトカイン発現細胞の頻度を減少させることが示された。(図23K)。まとめると、これらの結果は、SA-IL-4処置がEAE慢性期に強力な治療効果を及ぼすことを示唆している。
F. SA-IL-4は全身注射後に顕著な毒性を示さなかった
SA-IL-4が何らかの悪影響を示すかどうかを試験するために、本発明者らは、生化学分析器を用いて血清を分析し、血液分析器を用いて血液を分析した(図29)。SA-IL-4処置は臓器損傷マーカーを増加させず、血球数も変化させなかった(図29A～M)。SA-IL-4およびwt IL-4は脾腫を誘発した(図29N)。wt IL-4は、肺の水分含量の増加によって示される肺水腫を誘発したが、SA-IL-4は誘発しなかった(図29N)。これらの証拠は、SA-IL-4が全身投与後に安全であることを示唆している。
いくつかのMS処置が現在、診療所において利用可能であるが、この疾患はまだ十分に対処されていない。FTY720 (フィンゴリモド)および抗α4インテグリン(ナタリズマブ)によるような、いくつかの効果的な治療法は、免疫関連の有害事象のリスクに関連する、病変組織へのエフェクタリンパ球の浸潤を阻害する(20)。IFNβは、CNSへのリンパ球移動の低減を含む、複数の機構によって機能する(21)。IFNβはフィンゴリモドほど効果的ではないが(22)、IFNβはMSの病状を調節するのに臨床的に利用されている(23)。本明細書で、本発明者らは、疾患の病状に関与することが知られているTh17経路から離れるように、IL-4を用いてさらに寛容原性の高い表現型に向けて、悪影響なく、免疫応答を形作ることができる治療法を探求しようとしている。本明細書で、本発明者らは分子操作手法を利用して、IL-4をSLOにターゲティングし、ミエリン抗原に対する根本的な自己免疫応答を改善した。
本研究において、SA-IL-4の皮下注射は、試験した全てのマウスにおいてEAEの発症を予防した。驚くべきことに、SA-IL-4は、初期と後期の両方の時点での処置により、脊髄へのリンパ球の浸潤を強力に低減させた。dLNの分析により、SA-IL-4はM2マクロファージおよびG-MDSCを増加させ、ならびにTh17細胞を減少させることが明らかにされた。しかしながら、wt IL-4はM2マクロファージの数も増加させ、IL-4を介した炎症性マクロファージの抑制がこれらの実験条件下でEAEを制御するには不十分であることを示唆している。
IL-4はMDSCの免疫抑制特性を維持および増加させることが報告されている(24)。G-MDSCは、EAEの発症を抑制する重要な集団である(17)。G-MDSCはPD-L1を発現して、T細胞の機能的抑制を誘導する。その一方で、M-MDSCはSA-IL-4処置により減少した。EAEに対するM-MDSCの役割については議論の余地があり、病原性の影響が報告されている(25)。興味深いことに、SA-IL-4はSLOにおいてG-MDSCとM-MDSCの両方でPD-L1の発現を増強したが、wt IL-4は増強しなかった。同時に、SA-IL-4はSLOにおいてCD4+およびCD8+中央記憶T細胞の両方でPD-1の発現を増強したが、wt IL-4は増強しなかった。このPD-1/PD-L1誘導効果はSA-IL-4処置マウスでのMDSCが病原性T細胞を抑制する機構であると本発明者らは考えており、SLOでのこの現象の観察は、SA融合によって付与されるSLOターゲティング能の価値を立証している。
Th17細胞は、EAE疾患の重症度および発症に重要な役割を果たす(26)。SA-IL-4処置は、FTY720処置と比較して、dLNにおけるTh17細胞の頻度を低減させた。IL-4は、本発明者らが図18Dに示したように、Th17細胞へのナイーブT細胞の分化を直接阻害する。さらに、APCを介したTh17阻害経路の可能性がある。IL-23はAPCにより発現され(26)、病原性Th17細胞を作出し、IL-17の発現を誘導する(27)。IL-4はAPCにおけるIL-23のサイレンシングを通じてIL-17の発現を低減させると報告されている(18)。したがって、SA-IL-4がAPCに作用してIL-23の発現を低下させ、それによってSLOでの病原性Th17細胞の作出をブロックしている可能性がある。このモデルは、GM-CSF+が病原性Th17細胞のマーカーであるため、GM-CSF+を介したT細胞の病原性をSA-IL-4が低下させるという本発明者らのデータと一致している。
さらに、SA-IL-4処置により、MOG反応性CD4+ T細胞コンパートメントでのインテグリン発現の減少が引き起こされた。免疫されたマウスは処置前に抗MOG応答を既に開始していたが、SA-IL-4は自己免疫細胞のCNSへの移動を防ぐことができた。それゆえ、SA-IL-4処置は、抗原反応性T細胞の数を変化させるのではなく、T細胞機能を不活性化した。全体として、このデータは、SA-IL-4が複数の免疫経路を通じて作用し、SLOにおける免疫抑制環境を作出することを示している。
FTY720は、MSに対するFDA承認薬の1つであり、リンパ球減少症の誘発を通じて機能し、かくしてエフェクタリンパ球のCNS疾患部位への移動を制限する。皮下投与されたSA-IL-4は本研究においてFTY720よりも高い効力を示した。SA-IL-4によるこの改善は、臨床技術移転のその可能性の強力な証拠である。FTY720には、感染した患者には投与できないという欠点がある。また、FTY720およびインテグリンα4遮断などの、リンパ球移動を調節するMSの承認された治療法の中で、ジョンカニンガムウイルス(John Cunningham virus; JCV)活性の誘導は、進行性多巣性白質脳症(PML)をもたらし、これが最終的には死を含む重篤な有害事象を引き起こしうる。SA-IL-4は、抗原反応性CD4+ T細胞でのみインテグリン発現を減少させたが、CD8+ T細胞では減少させなかった。これは、SA-IL-4が抗原反応性CD4+ T細胞に対してさらなる移動抑制効果を及ぼし、これが脊髄における炎症抑制に寄与しうることを示唆している。血液学研究から、SA-IL-4がリンパ球減少症を誘発しなかったことが示された。これは承認薬に勝るさらなる利点でありうる。というのは、SA-IL-4は感染症に対する免疫応答を強力に抑制するとは予想されず、したがってSA-IL-4はFTY720による処置に適していない患者に役立ちうる可能性があるためである。SA-IL-4は、現在の治療法と重複しないさまざまな機構を通じて自己免疫を抑制する可能性が高い。本研究において、FTY720はdLNにおけるTh17の発生を抑制しなかったが、SA-IL-4は抑制した。したがって、SA-IL-4は、現在の処置では十分な治療効果が得られない患者に有用でありうる。
SAの皮内または皮下注射は、注射部位-流入領域LNに蓄積することが十分に研究されている(28)。本明細書で、本発明者らは、SA-IL-4が静脈内注射後に、すなわち輸入リンパ管を介するのではなく血液から、LN内に蓄積することを示した。以前にSA融合IL-2の生体内分布研究により、静脈内注射を通じてIL-2の脾臓、肝臓およびLN蓄積が示された(29)が、分子機構およびLN内でのその局在は不明であった。組織学的分析により、静脈内注入されたSA-IL-4は、高内皮細静脈(HEV)の周囲に蓄積し、共局在することが示されている(30)。FcRnを通じたIgG経細胞質輸送は十分に研究されているが、FcRn結合を通じたアルブミンの経細胞質輸送が複数の研究グループによって報告されたのはごく最近のことである(31-33)。FcRnはLNにおいて高度に発現されるため(34)、静脈内注射されたSA-IL-4は経細胞質輸送によってLNに輸送された可能性が高い。本研究で、SA(P573K)-IL-4は、wt IL-4と同様に、SA-IL-4と比較してLNにおいていっそう少ない量のIL-4を達成した。これは、FcRn結合がSA-IL-4の血液からLNへの輸送に重要な役割を果たしていることを示唆している。APCが存在する髄質空間の周りに集中するSA-IL-4の本発明者らの観察から、本発明者らは、本発明者らが図18において示したように、SA-IL-4がHEVを通って侵入し、次にDCおよびマクロファージに結合すると仮定する。SA(P573K)-IL-4は、図27における疾患スコアを抑制しなかったことから、FcRn結合とそれに続くSLOでの持続性の増加が、EAE疾患の症状を抑制するために重要であることが示される。したがって、本発明者らは、SA-サイトカイン融合免疫抑制分子が、主に血液循環時間を引き延ばすことによってではなく、LNおよび脾臓などの、SLOにおけるリサイクル時間を引き延ばすことによって機能すると考えている。したがって、SA融合サイトカインは1つの免疫細胞により収集され、その細胞により再生利用されて別の免疫細胞を刺激することができる。したがって、血液循環の寿命は、SLOの存在の寿命に直接関係していない。本発明者らは、この生物学的知見がLN分子輸送の新しい研究分野を開くことができると信じており、さらなる研究は詳細な機構を明らかにするであろう。
SA-IL-4はEAEの慢性期に治療効力を示した。IL-4の経鼻投与または腰部投与は、EAEにおいて神経系を再生する試みのなかで、ニューロンへのIL-4の直接結合をもたらすことが以前に報告されている(9)。腹腔内注射されたSA-IL-4の治療効果は、以前の報告で経鼻投与されたwt IL-4と同等であった。これは、SA-IL-4がまた、ニューロンに結合し、再生を誘導しうることを示唆している。EAEモデルでは血液脳関門が破壊されているため、SA-IL-4は脊髄内のニューロンにアクセスできうる。今後の研究において神経再生に及ぼすSA-IL-4の直接的効果を研究することは興味深いであろう。
SA-IL-4の皮下投与は、腹腔内投与のものよりも高い予防効果を示した。この経路は臨床技術移転に好都合であり、一般的に組織からの持続放出を示す。本発明者らは、この持続放出がEAE発症の抑制のさらなる要因であったと想定している。
全身注射されたSA-IL-4は、血液生化学分析および血液学分析において明らかな毒性を示さなかった。本発明者らは脾腫を観察したが、これは通常一過性であり、重大な毒性とは見なされない。wt IL-4は肺水腫を誘発したが、これはもっと気がかりであろう。しかしながら、SA-IL-4では肺水腫は観察されなかった; この差異は、STAT6活性化に対するSA-IL-4の活性の低下が原因でありうる。これらの結果は、診療所でのSA-IL-4投与による有害事象誘発のリスクが低いことを示している。
結論として、操作されたSA-IL-4は、FcRn結合を通じてSLOにおける持続性を実証した。SA-IL-4は、全身注射後にEAEの複数の段階で顕著な治療効果を示し、Th17細胞の減少ならびにSLOにおけるMDSCによるG-MDSCおよびPD-L1発現の増加のような、EAEの主要な免疫経路を調節する。SA-IL-4は、現在承認されている治療法とは異なる機構を利用した新しい生物学的手法を通じて、予防的使用と治療的使用の両方で技術移転の可能性を秘めている。
G. wt IL-4およびSA-IL-4のアミノ酸配列
Figure 2022521428000062
H. 材料および方法
1. 組換えタンパク質の産生および精製
プロペプチドを有しないマウスSA (全血清アルブミンのアミノ酸番号25～608)、マウスIL-4、および(GGGS)2リンカーをコードする配列を合成し、Genscriptによって哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(+)にサブクローニングした。組換えタンパク質のさらなる精製のために、6 Hisをコードする配列を、C末端に付加した。タンパク質のアミノ酸配列を補足表1に示す。懸濁液に適合したHEK-293F細胞は、無血清FreeStyle 293発現培地(Gibco)中で日常的に維持された。トランスフェクションの日に、細胞を1×106個の細胞/mlの密度で新鮮培地に接種した。2μg/mlのプラスミドDNA、2μg/mlの線形25 kDaポリエチレンイミン(Polysciences)、およびOptiPRO SFM培地(終濃度4%, Thermo Fisher)を順次添加した。培養フラスコを5% CO2の存在下、37℃、135 rpmで軌道振盪することにより撹拌した。トランスフェクション7日後、細胞培地を遠心分離によって回収し、0.22μmフィルタでろ過した。AKTA pure 25 (GE Healthcare)を用いて、培地をHisTrap HP 5 mlカラム(GE Healthcare)に負荷した。洗浄緩衝液(20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 8.0)によるカラムの洗浄後に、500 mMイミダゾール(20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 8.0中)の勾配でタンパク質を溶出させた。溶出液としてPBSを用いHiLoad Superdex 200PGカラム(GE Healthcare)を使ったサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質をさらに精製した。全ての精製段階は4℃で実行された。発現されたタンパク質は、SDS-PAGEによって90%超の純度であると確認された。精製されたタンパク質は、HEK-Blue TLR4受容体細胞株を介してエンドトキシンについて試験され、エンドトキシンレベルは0.01 EU/mL未満であると確認された。NanoDrop (Thermo Scientific)を用いて280 nmでの吸光度からタンパク質濃度を決定した。
2. マウス
8週齢のC57BL/6雌性マウスを、Charles River Laboratoriesから入手した。免疫前に少なくとも1週間シカゴ大学の動物施設にマウスを収容した。全ての実験は、シカゴ大学の施設内動物管理使用委員会の承認を得て実施された。
3. 脾細胞またはLN由来細胞へのタンパク質の結合
70μmの細胞ストレイナを通して脾臓または膝窩リンパ節を穏やかに破壊することによって、単細胞懸濁液を得た。赤血球を脾細胞用のACK溶解緩衝液(Quality Biological)で溶解した。細胞をカウントし、10% FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシン(全てLife Technologiesから)を補充したRPMI-1640中に再懸濁した。1×105個の細胞/ウェルを96ウェルマイクロプレートに播種し、2μg/100μlのSA、SA-IL4とともに氷上で30分間インキュベートした。PBSによる4回の洗浄後、細胞をウサギモノクローナル抗マウス血清アルブミン抗体(クローンEPR20195 abcam)とともに氷上で20分間さらにインキュベートした。PBSによる3回の洗浄後、細胞を1μg/ml AlexaFluor 647標識抗ウサギIgG抗体、抗B220抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD11c抗体、抗CD45抗体および抗F4/80抗体とともに氷上で20分間インキュベートした。以下に記述するように、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
4. フローサイトメトリーによるSTAT6リン酸化の分析
EasySepマウスCD4+ T細胞分離キット(Stem Cell)を用いて、C57BL/6マウスの脾臓からマウスCD4+ T細胞を精製した。精製されたCD4+ T細胞(106個の細胞/ml)を、5μg/ml抗CD3抗体(クローン17A2, Bioxcell)でプレコーティングされ、可溶性2μg/ml抗CD28抗体(クローン37.51, BioLegend)を補充された6ウェルプレート中で2日間活性化した。培地は、10%熱不活化FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび50μM 2-メルカプトエタノール(Sigma Aldrich)を含有するIMDM (Gibco)であった。2日間の培養後、活性化CD4+ T細胞を50 ng/ml組換えマウスIL-2 (Peprotech)で3時間刺激して、IL-4Rα発現を誘導した。IL-2での刺激後、細胞を洗浄し、新鮮な培地中で3時間静置した。細胞を次に、96ウェルプレートに移入した(50,000個の細胞/ウェル)。示された量のwt IL-4またはSA-IL-4をCD4+ T細胞に37℃で15分間適用して、STAT6リン酸化を誘導した。細胞を、BD Phosflow Lyse/Fix緩衝液を用いて37℃で10分間直ちに固定し、次にBD Phosflow Perm Buffer IIIにより氷上で30分間透過処理した。Tyr641のリン酸化を認識するAlexaFluor 647抗pSTAT6抗体(クローンJ71-773.58.11, BD)で細胞を染色した。染色は暗所中にて室温(RT)で1時間実施した。細胞をBD LSRで取得し、FlowJo (Treestar)を用いてデータを分析した。pSTAT6+集団の平均蛍光強度(MFI)をサイトカイン濃度に対してプロットした。Prism (v8, GraphPad)を用いて、用量反応曲線を適合させた。
5. 表面プラズモン共鳴(SPR)
SPR測定は、Biacore X100 SPRシステム(GE Healthcare)で行った。マウスFcRn組換えタンパク質(Acro Biosystems)を製造元の指示にしたがって、C1チップ(GE Healthcare)上にアミンカップリングを介しておよそ200共鳴単位(RU)固定化した。SA-IL4を30μL/分でランニング緩衝液(0.01 M一塩基性無水リン酸ナトリウム, pH 5.8, 0.15 M NaCl)中において濃度を減少させながら流した。センサーチップをサイクルごとにPBS, pH 7.4で再生した。FcRnへのSA融合タンパク質の特異的結合を、参照として用いた非機能化チャネルと比較することによって計算した。BIAevaluationソフトウェア(GE Healthcare)を用いラングミュア結合速度論に実験結果を適合させた。
6. 培養下インビトロでのTh17細胞分化
製造元の指示にしたがってEasySep(商標) Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies)を用い、脾細胞からナイーブCD4+ T細胞を単離した。105個の細胞を96ウェルプレートにプレーティングし、3日間培養した。Th17誘導培地として、
IL-17 Ready-Set-Go! Mouse Uncoated ELISAキット(Invitrogen)により製造元のプロトコルにしたがって培地中のIL-17A濃度を測定した。Prismソフトウェア(v6, GraphPad)を用いてデータを分析した。
7. タンパク質の血漿薬物動態
wt IL-4またはSA-IL-4 (10μgのIL-4に相当)を雌性C57BL/6マウスに静脈内注射した。血液サンプルを注射後1分、10分、30分、1時間、2時間、4時間および24時間の時点でタンパク質低結合チューブに回収した。血漿中のIL-4濃度を、IL-4 Ready-Set-Go! Mouse Uncoated ELISAキット(Invitrogen)により製造元のプロトコルにしたがって測定した。
8. タンパク質のリンパ節および脾臓薬物動態
wt IL-4、SA-IL-4またはSA(P573K)-IL-4 (40μgのIL-4に相当)を健常なC57BL/6マウスに静脈内注射した。腰および上腕のLNならびに脾臓を注射後1時間、4時間および24時間で収集し、その後、cOmplete(商標)プロテイナーゼ阻害剤カクテル(Roche)を有するT-PER組織タンパク質抽出試薬(Thermo Scientific)中5000ビート/分で40秒間Lysing Matrix D and FastPrep-24 5G (MP Biomedical)を用いてホモジナイズした。ホモジナイゼーション後、サンプルを4℃で終夜インキュベートした。サンプルを遠心分離し(5000 g, 5分)、総タンパク質濃度およびIL-4濃度を、それぞれBCAアッセイキット(Thermo Fisher)およびIL-4 Mouse Uncoated ELISAキット(Invitrogen)を用いて分析した。同時に、Mouse Uncoated ELISAキット(Invitrogen)またはReady-SET-Go! ELISAキット(eBioscience)を製造元のプロトコルにしたがい用いて、LN抽出物中のサイトカインレベルを測定した。
9. LNにおける蛍光に基づくIL-4検出
蛍光標識されたwt IL-4およびSA-IL-4を作出するために、タンパク質を8倍モル過剰のDyLight 800 NHS ester (Thermo Fisher)を用いてRTで1時間インキュベートし、未反応の色素をZebaspinスピンカラム(Thermo Fisher)により製造元の指示にしたがって除去した。同等の蛍光を有する10μgのDyLight 800標識wt IL-4およびSA-IL-4をナイーブC57BL/6マウスへ静脈内注射した。4時間後、腸骨LNを、Xenogen IVIS Imaging System 100 (Xenogen)を用い以下の条件下で画像化した: f/ストップ: 2; 光学フィルタ励起745 nm; 励起800 nm; 露出時間: 5秒; 小ビニング。
10. 免疫蛍光
上記のように、wt IL-4およびSA-IL-4をDyLight 594 NHSエステル(Thermo Fisher)で蛍光標識した。蛍光標識IL-4 (wt IL-4の場合には40μgおよびSA-IL-4の場合には同じ蛍光量)の静脈内注射1時間後に、マウスを殺処理した。マウスLNを採取し、PBS中2%のPFA中で終夜固定し、PBSで洗浄した。30%スクロース溶液中での終夜インキュベーションの後に、LNを最適切断温度(Optimum Cutting Temperature)コンパウンド中に包埋した。次に、クリオスタットを用いて5μmの凍結切片を切断した。次に切片をPBS中2%のBSAによりRTでブロッキングし、以下の一次抗体とともにRTで2時間インキュベートした: 10μg/mlのハムスター抗マウスCD3ε抗体(クローン: 145-2C11, BioLegend)抗体および2.5μg/mlのラット抗マウスPNAd (クローン: MECA-79, BioLegend)抗体。PBS-Tで洗浄した後に、組織を、以下の蛍光標識二次抗体を用いてRTで1時間染色した: Alexa Fluor 647ヤギ抗ハムスター(1:400, Jackson ImmunoResearch)およびAlexa Fluor 488ロバ抗ラット(1:400, Jackson ImmunoResearch)。組織を3回洗浄した後、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI; Thermo Fisher Scientific)を有するプロロングゴールド褪色防止用封入剤(Prolong gold antifade mountant)で覆った。CD3染色には倍率10倍でのイメージングにIX83顕微鏡(Olympus)を用い、PNAd染色には倍率20倍でのLeica SP8 3Dレーザー走査共焦点顕微鏡を用いた。ImageJソフトウェア(NIH)を用いて画像を処理した。
11. EAEモデル
9～12週齢のC57BL/6幼若雌性マウスの背側の側腹にMOG35～55の完全フロイントアジュバント(CFA)乳濁液を皮下免疫し、続いて最初は免疫日に、次いで再び翌日に、PBS中の百日咳毒素(PTX)の腹腔内投与を行った。MOG35～55/CFA乳濁液およびPTXはHooke Laboratoriesから購入した。最初の免疫に続いて、EAEの重症度をモニターし、免疫化後8日目から毎日臨床スコアを測定した。臨床スコアは、処置群分けに対して盲検下でHooke Laboratories基準に基づきA.I.、M.N.またはA.S.によって決定された。IL-4、SA-IL-4、PBSを1日おきに、PBS 100μl中で腹腔内または皮下に(マウス背中に)投与した。FTY720 (1 mg/kg体重)を毎日経口投与した。
12. 脊髄の組織像
EAEマウスの胸椎および腰椎を採取し、胸腰椎接合部で切断した。組織を2% PFA中で終夜固定した。PBS洗浄後、Decalcifier II (Leica Biosystem)を用いて組織を終夜脱灰した。次に、組織をパラフィン中に包埋した。パラフィン包埋後、ブロックを5 mmの切片に切断した。脱パラフィンおよび再水和後、組織切片を標的回復溶液(S1699, DAKO)で処理し、蒸器中95℃超の温度で20分間加熱した。組織切片を抗マウスaMBP、abcam ab40390)とともに、湿度チャンバ中RTで1時間インキュベートした。TBS洗浄後、組織切片をビオチン化抗ラットIgG (10 mg/mL, Vector laboratories)とともにRTで30分間インキュベートした。抗原-抗体結合は、Eliteキット(PK-6100, Vector Laboratories)およびDAB (DAKO, K3468)システムによって検出された。スライドはEVOS FL Auto (Life Technologies)によって画像化された。
13. フローサイトメトリー
EAEマウスを免疫8日後から開始して、1日おきにPBS、wt IL-4、またはSA-IL-4 (10μgのIL-4に相当)で処置した。免疫13、17または34日後に、脊髄、脾臓、および腰のLNを採取した。2% FBS、2 mg/mLコラゲナーゼD (Sigma-Aldrich)および40μg/ml DNase I (Roche)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で脊髄組織を37℃で30分間消化した。70μmの細胞ストレイナを通して穏やかに破壊することによって、単細胞懸濁液を得た。脾臓の場合、血中の赤血球をACK溶解緩衝液(Quality Biological)で溶解した後に、フローサイトメトリー用の抗体染色を行った。以下の分子に対する抗体を用いた: 抗マウスCD3ε(145-2C11, BD Biosciences)、CD4 (RM4-5, BD Biosciences)、抗マウスCD8α(53-6.7, BD Biosciences)、抗マウスCD45 (30-F11, BD Biosciences)、CD44 (IM7, BD Biosciences)、CD62L (MEL-14, BD Biosciences)、F4/80 (T45-2342, BD Biosciences)、CD86 (GL1, BD Biosciences)、CD206 (C068C2, BioLegend)、Ly6G (1A8, BioLegend)、Ly6C (HK1.4, BioLegend)、CD11b (M1/70, BioLegend)、CD11c (HL3, BD Biosciences)、B220 (RA3-6B2, BioLegend)、PD-1 (29F.1A12, BD Biosciences)、PD-L1 (MIH7, BioLegend)、IL-23R (O78-1208, BD Biosciences)、IntegrinインテグリンαL (HI111, BD Biosciences)、インテグリンβ2 (M18/2, BD Biosciences)、インテグリンβ1 (HMb1-1, BD Biosciences)、インテグリンα4 (R1-2, BD Biosciences)、GM-CSF (MP1-22E9, BD Biosciences)、IL-17 (TC11-18H10.1, BD Biosciences)、IFNγ(XMG1.2, BD Biosciences)、TNFα(eBioscience, MP6-XT22)、およびRoRγt抗体(Q31-378, BD Biosciences)。MOG認識T細胞の検出の場合、T-Select I-Ab MOG35～55 Tetramer-PE (MBL International Corporation)またはMOG38～49 Tetramer-PE (NIH Tetramer Core Facility)を用いた。固定可能な生/死細胞の識別は、Fixable Viability Dye eFluor 455 (eBioscience)、Live/Dead Fixable Violet (eBioscience)、またはLive/Dead Fixable Aqua (eBioscience)を製造元の指示にしたがって用い実施した。染色は氷上で20分間行った。細胞内染色の場合、Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience)を用いて4℃で20分間細胞を固定した。透過処理の場合、パーマ(perm)/洗浄緩衝液(BD Bioscience)を用い、細胞をパーマ/洗浄緩衝液中4℃で30分間染色した。洗浄段階の後、固定前に氷上で20分間、細胞を特異抗体で染色した。全てのフローサイトメトリー分析は、Fortessa (BD Biosciences)フローサイトメーターを用いて行い、FlowJoソフトウェア(Tree Star)を用いて分析した。
14. 脾細胞の再刺激
単細胞懸濁液をdLNおよび脾臓から作出した。サイトカイン産生の分析のために、5×105個のリンパ球および2×106個の脾細胞を96ウェル丸底プレートにプレーティングした。細胞を10μM MOG35～55ペプチド(Genscript)で刺激した。2時間後、GolgiPlug (ブレフェルジンA)およびGolgiStop (モネンシン)を製造元のプロトコルにしたがって添加し、細胞内サイトカインの分泌をブロックした。GolgiPlugおよびGolgiStopの添加から4時間後に、フローサイトメトリー用に細胞を染色した。固定の場合、Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience)を4℃で20分間使用した。透過処理の場合、パーマ/洗浄緩衝液(BD Bioscience)を使用し、細胞をパーマ/洗浄緩衝液中4℃で30分間染色した。3日間の再刺激の場合、2.5×105個のリンパ球または1×106個の脾細胞を96ウェル丸底プレートにプレーティングした。細胞を10μM MOG35～55 (6時間培養、続いてフローサイトメトリーの場合)または100μg/ml MOGタンパク質(72時間培養の場合) (Anaspec)で刺激した。72時間後、Ready-Set-Go! Kit (Invitrogen)またはLEGEND MAXマウスGM-CSF ELISAキット(BioLegend)を用いたELISAによる分析のために上清を収集した。
15. SA-IL-4の安全性評価
C57BL/6マウスにPBS、wt IL-4、またはSA-IL4 (10μgのIL-4に相当)を静脈内注射した。2日後、マウスから収集した血液サンプルを、製造元の指示にしたがってCOULTER Ac・T 5diff CP血液分析器(Beckman Coulter)を用い分析した。肺および脾臓を採取し、秤量した。肺の水分含量は、FreeZone 6 Benchtop Freeze Dryer (Labconco)を用いて終夜凍結乾燥の前および後に秤量することにより決定された。PBS、wt IL-4、およびSA-IL-4を注射したマウスから収集した血清サンプルを、製造元の指示にしたがってBiochemistry Analyzer (Alfa Wassermann Diagnostic Technologies)を用い分析した。
16. 統計分析
実験群間の統計的有意差は、Prismソフトウェア(v6 GraphPad)を用いて決定された。一元配置分散分析とそれに続くテューキーのHSD事後検定を用いた場合、群間の分散はブラウンフォーサイス検定によって類似していることが分かった。単一比較の場合、両側スチューデントのt検定を用いた。記号＊および＊＊は、それぞれ0.05および0.01未満のP値を示す。
I. 参考文献
Figure 2022521428000063
Figure 2022521428000064
Figure 2022521428000065
ある種の態様を、ある程度具体的に、または1つもしくは複数の個々の態様を参照しながら上記に説明したが、当業者であれば、本開示の態様に対して、本発明の範囲を逸脱することなく数多くの変形を行なうことができよう。さらに、同等または異なる特性を有し、同じまたは異なる問題に対処するさらなる実施例を形成するために、適切な場合は上記の任意の実施例の諸局面を記載の任意のその他の実施例の諸局面と組み合わせてもよい。同様に、上記の有益性および利点は一態様に関連していてもよく、いくつかの態様に関連していてもよいことは理解されよう。特許出願公開公報または他の刊行物に対する言及はいずれも、該公開公報/刊行物の開示内容の参照により本明細書に具体的に組み入れられる。特許請求の範囲は、ミーンズ-プラス-ファンクション限定またはステップ-プラス-ファンクション限定を、所与の請求項にそれぞれ、語句(1つまたは複数)「～のための手段(means for)」または「～のための段階(step for)」を用いて明示していない限り、かかる限定を含むと解釈されるべきでない。

Claims (53)

  1. 細胞外マトリックス(ECM)親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤を含む、組成物。
  2. 血清タンパク質に機能的に連結された抗炎症剤を含む、組成物。
  3. 抗炎症剤が抗炎症性抗体を含む、請求項1記載の組成物。
  4. 抗炎症性抗体が、TNF-α、IL-1、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-12、IL-17A、IL-18、IFN-γ、GM-CSF、CD3、CD20、VLA-4、VLA-5、VCAM-1、TGF-β1、α4-インテグリン、α4β7-インテグリン、結合組織成長因子、血小板由来成長因子、プラスミノゲン活性化因子阻害因子-1、またはインスリン様成長因子結合タンパク質を特異的に標的とする抗体を含む、請求項3記載の組成物。
  5. 前記抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項3記載の組成物。
  6. 前記抗体が、アダリムマブ、セルトリズマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、トシリズマブ、リツキシマブ、ウステキヌマブ、ナタリズマブ、ベドリズマブ、セクキヌマブ、またはイキセキズマブを含む、請求項4または5記載の組成物。
  7. 抗炎症剤が抗TNF-α抗体を含む、請求項4または6記載の組成物。
  8. 抗炎症剤が抗炎症性サイトカインポリペプチドを含む、請求項1または2記載の組成物。
  9. 前記サイトカインポリペプチドが、IL-4、IL-1ra、IL-5、IL-10、IL-11、IL-23、IL-35、IL-36ra、IL-37、インターフェロン-β、TGF-β1、TNF受容体I、およびTNF受容体IIからのポリペプチドを含む、請求項2または8記載の組成物。
  10. 前記サイトカインポリペプチドが、IL-4からのポリペプチドを含む、請求項9記載の組成物。
  11. 前記サイトカインポリペプチドが、IL-10からのポリペプチドを含む、請求項9記載の組成物。
  12. 抗炎症剤が、CD200からのポリペプチドを含む、請求項1または2記載の組成物。
  13. CD200ポリペプチドが、CD200の細胞外ドメインを含む、請求項12記載の組成物。
  14. ECM親和性ペプチドが、コラーゲン結合ドメインを含む、請求項1または3～11のいずれか一項記載の組成物。
  15. 前記ポリペプチドが、デコリンまたはフォンヴィルブランド因子(VWF)からのコラーゲン結合ドメインを含む、請求項14記載の組成物。
  16. ECM親和性ペプチドが、胎盤成長因子-2 (PlGF-2)またはCXCL-12γからのペプチドを含む、請求項1または3～10のいずれか一項記載の組成物。
  17. ECM親和性ペプチドが、SEQ ID NO: 1～17、47、もしくは52のうちの1つと少なくとも85%同一であるペプチドまたはSEQ ID NO: 1～17、47、もしくは52のうちの1つの断片と少なくとも85%同一であるペプチドを含む、請求項1または3～16のいずれか一項記載の組成物。
  18. 細胞外マトリックス(ECM)親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤が、該ペプチドまたは該剤に機能的に連結された血清タンパク質をさらに含む、請求項1または3～17のいずれか一項記載の組成物。
  19. 血清タンパク質が、前記ペプチドに機能的に連結されている、請求項18記載の組成物。
  20. 血清タンパク質が、ペプチド結合を通じて前記ペプチドに機能的に連結されている、請求項2または19記載の組成物。
  21. 血清タンパク質が、アルブミンを含む、請求項2または18～20のいずれか一項記載の組成物。
  22. 血清アルブミンタンパク質のアミノ-アミノ近位(amino-amino proximal)にあるコラーゲン結合ドメインと、血清アルブミンタンパク質のカルボキシ近位にあるIL-10ポリペプチドとを含む、請求項21記載の組成物。
  23. 前記ペプチドが、抗炎症剤に共有結合している、請求項1または3～21のいずれか一項記載の組成物。
  24. 前記ペプチドが、二官能性リンカーを通じて抗炎症剤に架橋結合されている、請求項1または3～23のいずれか一項記載の組成物。
  25. 前記ペプチドが、ペプチド結合を通じて抗炎症剤に連結されている、請求項1または3～23のいずれか一項記載の組成物。
  26. ペプチドと抗炎症剤またはサイトカインポリペプチドとの比が、約1:1～5:1である、請求項1～25のいずれか一項記載の組成物。
  27. 細胞外マトリックス(ECM)親和性ペプチドに機能的に連結された第2の抗炎症剤をさらに含む、請求項1～26のいずれか一項記載の組成物。
  28. 請求項1～27のいずれか一項記載の組成物を対象に投与する段階を含む、対象における自己免疫状態または炎症状態を処置するための方法。
  29. 自己免疫状態または炎症状態が、炎症性腸疾患、特発性肺線維症、多発性硬化症、1型糖尿病、クローン病、乾癬、急性炎症、慢性炎症、神経炎症、関節炎、関節リウマチ、線維症、感染症、アレルギー、炎症治療に関連する有害事象、および炎症治療に関連する炎症性疾患を含む、請求項28記載の方法。
  30. 自己免疫状態または炎症状態が、多発性硬化症を含む、請求項29記載の方法。
  31. 自己免疫状態または炎症状態が、関節リウマチを含む、請求項29記載の方法。
  32. 前記組成物が全身に投与される、請求項28～31のいずれか一項記載の方法。
  33. 前記組成物が静脈内注射によって投与される、請求項32記載の方法。
  34. 前記組成物が局所的に投与される、請求項28または29記載の方法。
  35. 前記組成物が、炎症部位に投与されるか、または炎症部位に隣接して投与される、請求項34記載の方法。
  36. 前記ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤を含む組成物の投与用量が、該ペプチドなしで投与された該抗炎症剤の最小有効用量よりも少ない、請求項28～35のいずれか一項記載の方法。
  37. 前記ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤を含む組成物の投与用量が、同じ投与経路により該ペプチドなしで投与された該抗炎症剤の最小有効用量よりも少ない、請求項28～35のいずれか一項記載の方法。
  38. 前記ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤の投与用量が、該ペプチドなしで投与された該抗炎症剤の最小有効用量よりも少なくとも10%少ない、請求項37記載の方法。
  39. 対象が、抗炎症剤、抗炎症療法、または自己免疫療法で以前に処置されている、請求項28～38のいずれか一項記載の方法。
  40. 対象が、以前の処置に非応答性であると決定されている、請求項39記載の方法。
  41. 対象が、炎症性疾患についても自己免疫疾患についても以前に処置されていない、請求項28～38のいずれか一項記載の方法。
  42. 追加の炎症療法または自己免疫療法を施すことをさらに含む、請求項28～41のいずれか一項記載の方法。
  43. 細胞外マトリックス(ECM)親和性ペプチドに機能的に連結された第2の抗炎症剤の投与をさらに含む、請求項28～42のいずれか一項記載の方法。
  44. 細胞外マトリックス(ECM)親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤を含む組成物を対象に投与する段階を含む、対象における炎症を低減するための方法。
  45. 炎症が、自己免疫状態または炎症状態に起因し、該自己免疫状態または炎症状態が、炎症性腸疾患、特発性肺線維症、多発性硬化症、1型糖尿病、関節炎、または関節リウマチを含む、請求項44記載の方法。
  46. 自己免疫状態または炎症状態が、多発性硬化症を含む、請求項45記載の方法。
  47. 自己免疫状態または炎症状態が、関節リウマチを含む、請求項45記載の方法。
  48. ECM親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤が、抗TNFαにコンジュゲートされたコラーゲン結合ドメインを含む、請求項44～47のいずれか一項記載の方法。
  49. ECM親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤が、IL-4に機能的に連結されたvWF-A3を含む、請求項44～47のいずれか一項記載の方法。
  50. ECM親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤が、抗TGF-βにコンジュゲートされたコラーゲン結合ドメインを含む、請求項44～47のいずれか一項記載の方法。
  51. 前記組成物が全身に投与される、請求項44～50のいずれか一項記載の方法。
  52. 前記組成物が局所的に投与される、請求項44～50のいずれか一項記載の方法。
  53. ECM親和性ペプチドに機能的に連結された抗炎症剤の投与用量が、該ペプチドなしで局所的に投与された該抗炎症剤の最小有効用量よりも少なくとも20%少ない、請求項52記載の方法。
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