CN116987202A - 一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents
一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白及其制备方法与应用，涉及基因工程技术领域。一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。经过体外细胞验证，该融合蛋白具有比商品化胶原蛋白更明显的抑制炎症的效果，同时能够发挥明显的修护舒缓功效，可有效抗炎护肤，安全性高，避免了激素类抗炎产品长期使用所造成的皮肤屏障受损的问题。
Description
技术领域
本申请涉及基因工程技术领域，特别涉及一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
胶原蛋白（Collagen，COL）是细胞外基质的主要组成成分，是体内含量最多、分布最广的蛋白质之一。其中，Ⅰ型胶原蛋白是以胶原纤维的形式发挥作用的，除了作为组织支持物赋予组织柔韧性，起到抗撕裂的保护作用外，对细胞、组织乃至整个机体的生理和病理过程也有影响。Ⅲ型胶原蛋白广泛存在于人体结缔组织中，如皮肤、肺、肝、肠和血管系统中，并且经常与Ⅰ型胶原分布在相同位置，Ⅲ型胶原蛋白对于心血管系统、肠和皮肤中正常Ⅰ型胶原纤维的生成是必不可少的；在皮肤中，Ⅲ型胶原可促进成纤维细胞生长及成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白，从而维持和修复皮肤弹性。目前，市场上销售的相关蛋白产品大多为动物组织中提取而非人源，可能无法与人体相容，会导致免疫排斥和过敏症状，同时具有潜在的携带病原体危害人体的风险，而重组人源蛋白大多为表达单一的胶原蛋白，大多数护肤产品中多添加人源化胶原蛋白，无法起到有效抗炎护肤的功效，而传统抗炎产品多为添加了激素来类抑制炎症，长时间使用还会造成皮肤屏障受损，损伤皮肤。
发明内容
本申请的主要目的是提供一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有的蛋白产品抗炎护肤功效不足的技术问题。
为实现上述目的，本申请提出了一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。
可选地，所述融合蛋白是经毕赤酵母表达的人胶原蛋白与人白细胞介素37的融合蛋白。
可选地，所述融合蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达经过3次重复后的人源化Ⅰ×Ⅲ型胶原蛋白结构域片段和IL-37成熟肽片段所得。
可选地，所述连接肽片段为（GGGGS）3。
可选地，所述人源化Ⅰ×Ⅲ型胶原蛋白结构域片段为将如Seq ID NO.1所示的人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段和如Seq ID NO.2所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如Seq ID NO.3所示。
可选地，所述IL-37成熟肽片段的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示。
本申请还提出了一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列和毕赤酵母表达质粒pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-Col-IL37；
制备GS115感受态细胞，并将所述重组质粒pPIC9K-Col-IL37电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌；
将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清；
将所述诱导上清纯化后，获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col-IL37。
可选地，所述依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列和毕赤酵母表达质粒pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-Col-IL37的步骤，包括：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K上的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得重组质粒pPIC9K-Col-IL37。
可选地，所述将所述重组质粒pPIC9K-Col-IL37电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
将所述重组质粒pPIC9K-Col-IL37与所述GS115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混匀后，转移至无菌EP管中，经30°C静置孵育1h-2h后，涂布于MD固体平板，再经30℃倒置培养2d-5d，直至长出单菌落；
刮下所述MD固体平板上的His+转化子并进行稀释后，涂布于含有G418的YPD平板上，经30℃倒置培养至单菌落出现，再挑取所述YPD平板的单菌落转移至含YPD培养基的96孔培养板中，于30℃继续培养，以筛选重组酵母工程菌。
可选地，所述将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清的步骤，包括：
挑取所述重组酵母工程菌接种于BMGY诱导培养基中，在30ºC、220rpm的条件下培养24h至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；
以3000rpm的转速离心10min后，收集菌体，重新接种于BMGY诱导培养基中，使OD600nm吸光值达到2.0，并在30ºC、220rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，诱导后，离心收集诱导上清。
可选地，所述将所述诱导上清纯化后，获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col-IL37的步骤，包括：
将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col-IL37。
本申请还提出了一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白在护肤品中的应用，采用上述具有抗炎舒缓活性的融合蛋白作为护肤品中的抗炎活性成分。
本申请基于基因重组技术，异源表达后获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其中，氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该融合蛋白的核苷酸序列进行优化设计，核苷酸序列如Seq ID NO.6所示，使该融合蛋白更易在表达系统中表达。不仅解决了天然蛋白分子量较大，难以从动物组织中异源提取，加工性较差，且蛋白纯度较低，成本较高，相关蛋白产品功效性有限的问题，而且能够减少对人体的排斥反应，规避潜在的携带病原体的风险，同时保留了天然蛋白的优良生物学性能。经过体外细胞验证，该融合蛋白具有比商品化胶原蛋白更明显的抑制炎症的效果，同时能够发挥明显的修护舒缓功效，可有效抗炎护肤，安全性高，避免了激素类抗炎产品长期使用所造成的皮肤屏障受损的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本申请实施例所述的阳性转化子鉴定的电泳结果示意图；
图2为本申请实施例所述的诱导上清的SDS-PAGE电泳结果示意图；
图3为本申请实施例所述的融合蛋白纯化的SDS-PAGE电泳结果示意图；
图4为本申请实验例所述的融合蛋白的促细胞增殖活性示意图；
图5为本申请实验例所述的融合蛋白的相对细胞存活率曲线示意图；
图6为本申请实验例所述的TNFα和IL-6的抑制率的结果示意图；
图7为本申请实验例所述的细胞脱颗粒染色示意图；
图8为本申请实验例所述的细胞脱颗粒率示意图。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
序列表说明（序列表内容单独提供）：
Seq ID NO.1所示为本申请实施例中人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.2所示为本申请实施例中人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.3所示为本申请实施例中胶原蛋白融合肽的氨基酸序列；
Seq ID NO.4所示为本申请实施例中IL-37成熟肽片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.5所示为本申请实施例中融合蛋白的氨基酸序列；
Seq ID NO.6所示为本申请实施例中融合蛋白的核苷酸序列；
Seq ID NO.7所示为本申请实施例中连接肽片段的氨基酸序列。
人白细胞介素1家族成员7（IL-1F7），又称IL-37，是人白细胞介素1（IL-1）家族中唯一发挥抑炎功能的细胞因子，在抑制先天性免疫中发挥关键作用。IL-37共分为5类亚型，即IL-37 a-e，但五种异构体在机体的不同区域表达，从生物的组织细胞或体液中提取难度较大，含量较低。市场上销售的相关蛋白产品大多为动物组织中提取而非人源，可能无法与人体相容，会导致免疫排斥和过敏症状，同时具有潜在的携带病原体危害人体的风险，而重组人源蛋白大多为表达单一的胶原蛋白，大多数护肤产品中多添加人源化胶原蛋白，无法起到有效抗炎护肤的功效，而传统抗炎产品多为添加了激素来类抑制炎症，长时间使用还会造成皮肤屏障受损，损伤皮肤。
针对上述现有的蛋白产品所存在的技术问题，本申请的实施例提供了一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。
本申请基于基因重组技术，异源表达后获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其中，氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该融合蛋白的核苷酸序列进行优化设计，核苷酸序列如Seq ID NO.6所示，使该融合蛋白更易在表达系统中表达。不仅解决了天然蛋白分子量较大，难以从动物组织中异源提取，加工性较差，且蛋白纯度较低，成本较高，相关蛋白产品功效性有限的问题，而且能够减少对人体的排斥反应，规避潜在的携带病原体的风险，同时保留了天然蛋白的优良生物学性能。经过体外细胞验证，该融合蛋白具有比商品化胶原蛋白更明显的抑制炎症的效果，同时能够发挥明显的修护舒缓功效，可有效抗炎护肤，安全性高，避免了激素类抗炎产品长期使用所造成的皮肤屏障受损的问题。
作为本申请的一种可实施方式，所述融合蛋白是经毕赤酵母表达的人胶原蛋白与人白细胞介素37的融合蛋白。
本申请利用毕赤酵母异源表达蛋白，稳定且可分泌至胞外易于纯化，同时具有将异源蛋白进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能。人白细胞介素37具有独特的双重抑炎机制，既能入核调控基因转录，又可通过结合细胞表面受体传导抑炎信号，通过抑制促炎细胞因子的表达在机体调节炎症反应过程中发挥至关重要的作用，在自身免疫性疾病、内毒素血症、肝炎、肥胖、红斑狼疮和类风湿性关节炎等疾病中均发挥独特的抗炎作用。因此，本申请利用基因工程技术表达人胶原蛋白与人白细胞介素37的融合蛋白，拓宽了胶原蛋白的应用范围，解决了IL-37提取难度大的问题，使该胶原蛋白与人白细胞介素37的融合蛋白具有修护舒缓功效的同时也能发挥明显的抗炎功效。
作为本申请的一种可实施方式，所述融合蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达经过3次重复后的人源化Ⅰ×Ⅲ型胶原蛋白结构域片段和IL-37成熟肽片段所得。
本申请通过毕赤酵母表达胶原蛋白与人白细胞介素37的融合蛋白序列，通过对胶原蛋白成熟肽三螺旋区进行蛋白疏水性分析，选择Ⅰ型胶原蛋白结构域片段和Ⅲ型胶原蛋白结构域片段，并经过3次重复后，以连接肽片段连接人源化Ⅰ×Ⅲ型胶原蛋白结构域片段和IL-37成熟肽片段，使其整合成融合蛋白，即得到具有抗炎舒缓功效的融合蛋白。
作为本申请的一种可实施方式，所述连接肽片段为（GGGGS）3。
具体的，连接肽片段的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，如Seq ID NO.7所示，通过一段柔性连接肽即可将人源化Ⅰ×Ⅲ型胶原蛋白结构域片段和IL-37成熟肽片段进行连接，整合成融合蛋白。
作为本申请的一种可实施方式，所述人源化Ⅰ×Ⅲ型胶原蛋白结构域片段为将如Seq ID NO.1所示的人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段和如Seq ID NO.2所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如Seq IDNO.3所示。
在具体应用中，人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段源于人源Ⅰ型胶原蛋白序列，人源Ⅰ型胶原蛋白序列参考：UniProt P02452序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02452），人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段源于人源Ⅲ型胶原蛋白序列，人源Ⅲ型胶原蛋白序列参考：UniProtP02461序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02461）。通过对人源Ⅰ型胶原蛋白和人源Ⅲ型胶原蛋白成熟肽三螺旋区进行蛋白疏水性分析，分别选择如Seq ID NO.1所示的人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段以及如Seq ID NO.2所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段，并将人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段和人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连构成新的胶原蛋白融合肽，氨基酸序列如Seq ID NO.3所示。
作为本申请的一种可实施方式，所述IL-37成熟肽片段的氨基酸序列如Seq IDNO.4所示。
在具体应用中，IL-37成熟肽片段源于人源白介素37序列，人源白介素37序列参考：UniProt：Q9NZH6-2序列（https://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZH6-2），所选择的IL-37成熟肽片段的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示。
本申请的实施例还提供了一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S10、依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列和毕赤酵母表达质粒pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-Col-IL37。
在具体应用中，委托通用生物（安徽）股份有限公司依据如Seq ID NO.6所示的优化后的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K上的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得重组质粒pPIC9K-Col-IL37。
具体的，在这一步中，使用QuickCut Sac Ⅰ对重组质粒pPIC9K-Col-IL37进行酶切线性化，酶切体系（50μL）包括重组质粒pPIC9K-Col-IL37（10μg-15μg），Quick Cut Sac I（10μL），10×Quick Cut buffer（5μL），在37℃下酶切5h，使重组质粒pPIC9K-Col-IL37线性化；
酶切结束后，需通过乙醇回收酶切重组质粒pPIC9K-Col-IL37，具体方式为：加入0.1倍体积3 M NaAc（pH 5.2）和2.5倍体积无水乙醇，在-20℃下放置过夜；再在4℃，13000rpm的条件下离心20 min，弃上清；加入700μL的75%乙醇进行漂洗，再在4℃、13000rpm的条件下离心20min，弃上清；倒置于超净台吸水纸上约10min，尽量去除水分和残留乙醇，再用20μL双蒸水重新溶解重组质粒pPIC9K-Col-IL37，并取1μL稀释10倍后，用one-drop检测核酸浓度。
S20、制备GS115感受态细胞，并将所述重组质粒pPIC9K-Col-IL37电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌。
在具体实施过程中，GS115感受态细胞为毕赤酵母感受态细胞，制备时，将GS115菌株平板划线后挑取单菌落接种于20mL YPD固体培养基，在30℃、225rpm的条件下培养24h；再以1：1000的接种比例转接于50mL YPD液体培养基，并在30℃、225 rpm的条件下培养至OD600nm吸光值为1.3-1.5；再将菌液转入无菌50mL离心管中，在4℃、1500 rpm的条件下离心5min，弃上清后收集菌体；再用50mL预冷的无菌超纯水重悬菌体沉淀，并在4℃、1500rpm的条件下离心5min，弃上清后，再用50mL预冷的无菌超纯水重悬菌体沉淀；在4℃、1500rpm的条件下离心5min，弃上清后，再用40mL预冷的无菌1M山梨醇重悬细胞沉淀；再在4℃、1500rpm的条件下离心5min，弃上清后，用100μL-150μL预冷的无菌1M山梨醇重新悬浮细胞沉淀，温和旋转混匀，置于冰上，待用，得到GS115感受态细胞；
取100μL的GS115感受态细胞与10μL酶切线性化后的重组质粒pPIC9K-Col-IL37混合，移入预冷的电转化杯中，立即冰浴5min，上电转仪，选择电转仪的酵母模式，进行电击，然后立即向电转杯中加入1mL预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀后，将混合物转移到无菌EP管中，在30℃培养箱静置孵育1h-2h后，取孵育的100μL-200μL的菌液涂布于MD固体平板，室温静置10min，再经30℃培养箱倒置培养2d-5d，直至长出单菌落；
向MD固体平板表面加入2mL无菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的His+转化子，并转移到50mL离心管中，以无菌水稀释成105cells/ml浓度的细胞悬液（用分光光度计计数，1OD600≈5×107cells/ml），并涂布于含有0.5mg/mL G418的YPD平板上，经30℃倒置培养3d-4d后至单菌落出现；再挑取所述YPD平板的单菌落转移至含200μL YPD培养基的第一块96孔培养板中，于30℃继续培养；48h后，吹匀菌液，每孔吸取10μL菌液转移至第二块96孔培养板（含190μL YPD）；继续培养24h后，吹匀菌液，每孔吸取10μL菌液转移至第三块96孔培养板；24h后，吹匀第三块96孔培养板中菌液，并吸取1μL分别点在含有1mg/mL、2mg/mL和4mg/mL G418的YPD平板上继续培养；阳性转化子若能在含4mg/mL高浓度G418的平板上生长，则说明该阳性转化子含有多拷贝的目的基因，经过这一步筛选可得到可高效表达的重组酵母工程菌。
具体的，在这一步中，所用的培养基的配方如下：
YPD固体培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，并含有2％琼脂；
YPD液体培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；
MD固体培养基：YNB无氨基酸氮源13.4g/L；生物素0.4mg/L；葡萄糖20g/L，并含有2％琼脂。
在具体应用中，筛选阳性转化子后，再对阳性转化子进行鉴定，取上述第一块96孔培养板剩余菌液50μL，沸水浴中煮沸10min，再在液氮中冻存30min后，再在沸水浴中煮沸10min，经过反复冻融后，以12000rpm的转速离心5min，取上清作为PCR模板，通过PCR扩增鉴定目的基因是否整合到酵母染色体上；
其中，检测引物为：
上游引物：5’AOX1(5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’)；
下游引物：3'AOX1(5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)；
PCR条件：98℃预变性5min，98℃热变性50s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃复性10min；
对扩增的产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果在1600bp附近有明显条带片段（实际约1630bp），如图1所示，其中，泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1-12：单菌落PCR产物。表明目的基因成功整合到酵母染色体上，为阳性菌落。
S30、将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清。
在具体实施过程中，挑取所述重组酵母工程菌单菌落接种于BMGY诱导培养基中，在30℃、220rpm的条件下培养至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；
以3000rpm的转速离心10min后，收集菌体，重新接种于等体积的BMGY诱导培养基中，使OD600nm吸光值达到2.0，并在30ºC、220rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，诱导后24h、48h、72h、96h分别取菌液样品，离心收集诱导上清。
在具体应用中，收集诱导上清后，对诱导上清进行鉴定，取40μL诱导上清，加入10μL 5×的蛋白上样缓冲液（250mM的Tris-HCl，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇），置于100℃沸水中煮10min，然后每孔取10μL加入SDS-PAGE蛋白胶中，设定电压为80V，用考马斯亮蓝染色液（0.1％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，10％冰醋酸）进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液（10％醋酸，5％乙醇）进行脱色。经SDS-PAGE电泳分析的结果如图2所示，其中，泳道M：蛋白Marker。可观察到37kDa左右有明显的特异性条带出现。说明本申请制备的含融合蛋白的真核表达载体pPIC9K-Col-IL37的重组酵母工程菌经诱导能产生37kDa左右的融合蛋白，与预测分子量基本一致，表明目的蛋白成功表达并分泌到胞外。
S40、将所述诱导上清纯化后，获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col-IL37。
在具体实施过程中，使用阳离子交换介质（层析填料为千纯产SP Purose 6 HighPerformance，装载于GE Akta层析系统），以NaH2PO4缓冲液（25Mm，pH 4.0）平衡层析柱至电导率值及A280吸光值不变，设置样品上样流速为5mL/min，检测紫外A280吸光值，当其上升时，开始接样；待上样结束后，再以NaH2PO4缓冲液平衡阳离子层析介质，直至紫外A280吸光值和导电电导率值降至最低且不再变化，停止接样；再以含NaCl（1M）的NaH2PO4缓冲液洗脱并收集对应的蛋白，透析后，即得到具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col-IL37。
通过SDS-PAGE检测，含NaCl（1M）的NaH2PO4缓冲液可明显洗脱目的蛋白，检测结果如图3所示，其中，泳道M：蛋白Marker。
具体的，在这一步中，采用Bradford法检测获得的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col-IL37的含量。将待测蛋白样品先使用Onedrop法对浓度进行预估，再使用PBS或超纯水稀释浓度至BSA对照溶液线性浓度范围（0mg/mL-0.1mg/mL）内；分别取0.0mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL的BSA对照溶液及稀释后蛋白样品溶液40μL置96孔板中，每组进行2个平行；向每孔中加入200μL酸性染色液，混匀，静置10min；在595nm的波长处测定吸光度，同时以“0mg/mL”作为空白，以BSA对照品溶液浓度与其相应的吸光度计算线性回归方程，线性回归方程R2大于0.99，检测成立；根据线性回归方程计算出处理后待测蛋白样品的蛋白浓度，并乘以稀释倍数，即得蛋白质浓度。经检测，本申请获得的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白溶液中蛋白浓度为0.4mg/mL。
本申请的实施例还提供了一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白在护肤品中的应用，采用上述具有抗炎舒缓活性的融合蛋白作为护肤品中的抗炎活性成分。
下面结合具体实施例对本申请上述技术方案进行详细说明。
实施例1
一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K上的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得重组质粒pPIC9K-Col-IL37；
将所述重组质粒pPIC9K-Col-IL37与所述GS115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混匀后，转移至无菌EP管中，经30°C静置孵育1h-2h后，涂布于MD固体平板，再经30℃倒置培养2d-5d，直至长出单菌落；
刮下所述MD固体平板上的His+转化子并进行稀释后，涂布于含有G418的YPD平板上，经30℃倒置培养至单菌落出现，再挑取所述YPD平板的单菌落转移至含YPD培养基的96孔培养板中，于30℃继续培养，以筛选重组酵母工程菌；
挑取所述重组酵母工程菌接种于BMGY诱导培养基中，在30ºC、220rpm的条件下培养24h至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；
以3000rpm的转速离心10min后，收集菌体，重新接种于BMGY诱导培养基中，使OD600nm吸光值达到2.0，并在30ºC、220rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，诱导后，离心收集诱导上清；
将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col-IL37。
实验例1
对本申请的融合蛋白Col-IL37进行促细胞增殖试验。参考《中国药典》2020版（三部）附录“3528”。本法系依据融合蛋白Col-IL37对小鼠胚胎成纤维细胞（BALB/c 3T3 细胞）的生长具有刺激作用，BALB/c 3T3细胞的生长状况因不同的融合蛋白Col-IL37生物学活性的差异，以此检测体外促细胞增殖的生物学活性。
1.1试验材料：
完全细胞培养液：加入10%胎牛血清的1640培养液（含双抗），4℃保存；
无血清培养基：1640培养液（含双抗），4℃保存；
消化液：0.25%胰蛋白酶；
PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌；
噻唑蓝（MTT）溶液：称取MTT粉末0.10g，加PBS 20ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存；
BALB/c 3T3细胞（购自武汉普诺赛）；
样本：实施例1的融合蛋白Col-IL37、商品化胶原蛋白（购自索莱宝）、BSA（购自索莱宝）以PBS（pH7.4）溶解稀释至0.5mg/mL。
1.2具体实施方法：
将BALB/c 3T3细胞株用完全细胞培养液于37℃、5%二氧化碳的条件下培养，控制细胞浓度为1.0×105cells/mL-5.0×105cells/mL，传代后24h-36h用于生物学活性测定；弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全细胞培养液配成5.0×105cells/ml- 8.0×105cells/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5%二氧化碳的条件下培养；24h后换成PBS缓冲液，于37C、5%二氧化碳条件下培养24h；制备的细胞培养板弃去PBS缓冲液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μL，于37℃、5%二氧化碳条件下培养64h-72h；每孔加入MTT溶液20μL，于37℃、5%二氧化碳条件下培养5h。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO 100μL，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
1.3数据处理：
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。测定结果如图4所示。
由图4可以看出，融合蛋白Col-IL37与商品化胶原蛋白促BALB/c 3T3细胞增殖比活性值差异不大。
实验例2
对本申请的融合蛋白Col-IL37进行体外细胞毒性试验。参考医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验（GB/T 16886.5-2017）。通过细胞形态学观察和MTT法测量细胞毒性，通过量化样品中活细胞与死细胞的数量，测量细胞代谢活性来评估细胞毒性。
2.1试验材料：
完全细胞培养液：加入10%胎牛血清的DMEM培养液（含双抗），4℃保存；
无血清培养基：DMEM培养液（含双抗），4℃保存；
消化液：0.25%胰蛋白酶；
PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌；
噻唑蓝（MTT）溶液：称取MTT粉末0.10g，加PBS 20mL使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存；
小鼠巨噬细胞RAW264.7（购自中国医学科学院细胞培养中心）；
样本：实施例1的融合蛋白Col-IL37、商品化胶原蛋白（购自索莱宝）。
2.2小鼠巨噬细胞用完全细胞培养液于37℃、5% CO2的条件下培养，控制细胞浓度在1.0×105cells/mL，传代后24h-36h后弃去培养瓶中的培养液；消化处理后用完全细胞培养液收集细胞并配成5.0×105cells/mL细胞悬液；接种细胞悬液于96孔细胞板中，每孔100μL，培养24h；待细胞长成单层后，吸出原培养基，分别加入100μL不同浓度的试验样品稀释液（100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.56%、0.78%）、空白对照（培养基）、和阴性对照（PBS缓冲液），每组做6个复孔，置于37℃、5%CO2的条件下培养；24h后，取出96孔细胞板，在显微镜下做细胞形态学观察，然后吸除液体，每孔加入50μL MTT（1 mg/mL），置CO2培养箱中培养2h，弃去MTT溶液，每孔加入100μL DMSO溶液；振荡平板，在酶标仪上以570 nm测量吸光度（参比波长650 nm）。
2.3数据处理：
计算细胞存活率，与细胞对照组相比，当细胞存活率低于空白对照组时，样品具有细胞毒性。反之，则无细胞毒性。统计方法：均数±标准差(x±s)；存活率（%）=（实验组OD570均值/空白对照组OD570均值）×100%。得到相对细胞存活率曲线如图5所示。
由图5可见，与阴性对照组相比，相对细胞存活率＞90%，且无显著性差异（P>0.05）；细胞形态与阴性对照组相比无明显变化；选择平均细胞存活率均高于90%以上的最高剂量组，即10 μg/mL。
实验例3
测定本申请的融合蛋白Col-IL37的抗炎效果。
TNF-α是在肿瘤验证微环境中发现的一种炎性细胞因子，主要由单核/巨噬细胞分泌，可以启动慢性炎症反应。TNF-α通过激活核转录因子κB (NF-κB)和活化蛋白1 (AP-1)两种炎症信号通路调节炎症反应，是重要的炎症因子，并参与某些自身兔疫疾病的病理损伤；IL-6是一种多效的细胞因子，在受伤反应、感染、免疫应答、炎症以及造血中都有重要作用。在脂多糖的刺激下能够诱导不同组织细胞中IL-6的转录，主要包括单核细胞和巨噬细胞等。IL-6的诱导需要CAAT增强子结合蛋白（CAAT enhancer- binding protein, C/EBP）和核转录因子κB （NF-κB）的相互作用。IL-6的过量产生和IL-6信号通路的失调可导致炎症的发展，表明IL-6在人类细胞因子网络中起着重要作用。
脂多糖（LPS）能够引发小鼠巨噬细胞RAW264.7较强烈的炎症反应，表现为炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA水平的表达上调及细胞因子分泌水平的升高。通过LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7促炎分化模型的建立，以酶联免疫法（ELISA）来研究IL-37和TSG-6在体外抑制炎症的作用效果。
3.1试验材料：
小鼠巨噬细胞RAW264.7（购自中国医学科学院细胞培养中心）；
试剂：脂多糖（购自Sigma）、DMEM培养基（高糖型）、0.25%胰酶、FBS、双抗、PBS、MTT、DMSO、TNF-α和IL-6 ELISA检测试剂盒（购自R＆D）；
样本：实施例1的融合蛋白Col-IL37、商品化胶原蛋白（购自索莱宝）、地塞米松（购自国药）。
3.2具体实施方法：
将处于对数生长期的RAW264.7细胞重悬后稀释至1×105cells/mL的细胞悬液，并向96孔板内每孔加入100μL细胞悬液，四周每孔加入200μL PBS作为保湿孔，放置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24h；观察RAW264.7细胞的形态、密度以及分布是否均匀，以确定是否满足后续试验的需求；再吸弃全部培养液，后续使用的培养液均为不含FBS的DMEM基础培养基；针对不同组别加入含不同成分的DMEM培养液0.9mL，具体分组见下表1，每组3个复孔，并在37℃、5%CO2的培养箱培养6h；预处理后空白对照组加入0.1ml DMEM培养液，其余各组加入0.1mL含10μg/mL LPS的DMEM培养液，在37℃、5%CO2培养箱培养24h；分别刺激后24h收集细胞培养上清液；通过ELISA试剂盒检测细胞因子TNF-α和IL-6的水平，操作步骤参照试剂盒公司提供的产品说明书进行。
表1
3.3数据处理和分析：
所有实验结果均重复3次，且表示为平均值±标准差，采用SPSS 22.0对抗炎活性数据进行单因素方差分析（S-N-K检测）和多重比较。TNF-α和IL-6抑制率的计算公式：抑制率（%）=（1-T/C）×100%，其中，T：受试物TNF-α和IL-6含量平均值；C：阴性对照TNF-α和IL-6含量平均值。
TNFα和IL-6的含量检测结果以及抑制率如下表2和图6所示。
表2
由表2和图6可以看出，阴性对照与空白对照相比，TNFα含量和IL-6含量显著上调表达；阳性对照与阴性对照相比，TNFα含量抑制率为49.3%，IL-6含量抑制率为38.8%；融合蛋白Col-IL37可以显著抑制TNFα和IL-6分泌的效果，并且抑制效果与剂量呈正相关；而商品化胶原蛋白对TNFα和IL-6分泌无显著抑制作用，无法发挥抗炎功效。
实验例4
对本申请的融合蛋白Col-IL37进行体外抗衰功效评价。本法系依据受试物对大鼠嗜碱性细胞白血病细胞的脱颗粒有抑制作用，细胞受到刺激后会以胞吐形式将细胞内的颗粒释放到细胞处，在细胞膜周围可明显看到。通过脱颗粒细胞数的占比可以评价样品抑制细胞脱颗粒的作用，加入受试物能使细胞脱颗粒细胞数目明显下降，以此检测受试物的舒缓功效。
4.1试验材料：
大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞株RBL-2H3（由安徽医科大学提供）；
试剂：胎牛血清、DMEM培养液（含双抗）、0.25%胰蛋白酶、PBS缓冲液、噻唑蓝（MTT）溶液、C48/80（购自Sigma）、中性红染色液；
样本：实施例1的融合蛋白Col-IL37、商品化胶原蛋白（购自索莱宝）。
4.2具体实施方法：
按1.5×105个/孔的接种密度接种大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞至24孔板，并在37℃、5%CO2的培养箱中孵育过夜，待24孔板中细胞铺板率达到40%-60%时进行给药；按不同分组配制不同受试物的工作液及阳性对照工作液，具体分组如下表3所示，空白对照组给药量为1mL，其他组每孔给药量为900μL，每组设3个复孔，在37℃、5%CO2的培养箱中继续培养2h；给药2 h后，按照分组加入100μL相应的受试物工作液和100μL配制的阳性对照工作液（100μg/mL的C48/80母液），并摇动孔板，使得孔内液体混匀，然后将孔板置于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养45 min；细胞培养结束后，进行终止反应，将24孔板放置在0℃冰水浴中冷浸10 min，于倒置显微镜下观察细胞形态并拍照；每孔加入1%的中性红染液1 mL，混匀，于37℃的培养箱中染色30min，弃去染液，PBS缓冲液清洗2-3次，倒置显微镜下观察细胞脱颗粒情况，并计算细胞脱颗粒百分率，脱颗粒率=脱颗粒细胞数/所有细胞数×100%。
表3
4.3试验结果：
染色观察结果如图7所示，随机选取3个视野计算细胞脱颗粒率，计算结果如图8所示。
由图7和图8可以看出，相比于商品化胶原蛋白，加入融合蛋白Col-IL37能够使细胞脱颗粒数目明显下降，并且融合蛋白Col-IL37剂量越高，细胞脱颗粒数目下降越明显，说明融合蛋白Col-IL37具有较好的舒缓功效；而商品化胶原蛋白与C48/80母液相比，细胞脱颗粒率并无明显变化。
以上所述仅为本申请的可选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是在本申请的发明构思下，利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (12)
1.一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SeqID NO.5所示，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是经毕赤酵母表达的人胶原蛋白与人白细胞介素37的融合蛋白。
3.根据权利要求1所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达经过3次重复后的人源化Ⅰ×Ⅲ型胶原蛋白结构域片段和IL-37成熟肽片段所得。
4.根据权利要求3所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽片段为（GGGGS）3。
5.根据权利要求3所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其特征在于，所述人源化Ⅰ×Ⅲ型胶原蛋白结构域片段为将如Seq ID NO.1所示的人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段和如Seq IDNO.2所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如Seq ID NO.3所示。
6.根据权利要求3所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白，其特征在于，所述IL-37成熟肽片段的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列和毕赤酵母表达质粒pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-Col-IL37；
制备GS115感受态细胞，并将所述重组质粒pPIC9K-Col-IL37电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌；
将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清；
将所述诱导上清纯化后，获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col-IL37。
8.根据权利要求7所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列和毕赤酵母表达质粒pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K-Col-IL37的步骤，包括：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K上的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得重组质粒pPIC9K-Col-IL37。
9.根据权利要求7所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述重组质粒pPIC9K-Col-IL37电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
将所述重组质粒pPIC9K-Col-IL37与所述GS115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混匀后，转移至无菌EP管中，经30°C静置孵育1h-2h后，涂布于MD固体平板，再经30℃倒置培养2d-5d，直至长出单菌落；
刮下所述MD固体平板上的His+转化子并进行稀释后，涂布于含有G418的YPD平板上，经30℃倒置培养至单菌落出现，再挑取所述YPD平板的单菌落转移至含YPD培养基的96孔培养板中，于30℃继续培养，以筛选重组酵母工程菌。
10.根据权利要求7所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清的步骤，包括：
挑取所述重组酵母工程菌接种于BMGY诱导培养基中，在30ºC、220rpm的条件下培养24h至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；
以3000rpm的转速离心10min后，收集菌体，重新接种于BMGY诱导培养基中，使OD600nm吸光值达到2.0，并在30ºC、220rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，诱导后，离心收集诱导上清。
11.根据权利要求7所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述诱导上清纯化后，获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col-IL37的步骤，包括：
将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得具有抗炎舒缓活性的融合蛋白Col-IL37。
12.一种具有抗炎舒缓活性的融合蛋白在护肤品中的应用，其特征在于，采用如权利要求1-6任一项所述的具有抗炎舒缓活性的融合蛋白作为护肤品中的抗炎活性成分。
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