DK172763B1 - Isoleret interleukin-1 (IL-1) inhibitor eller forstadiepolypeptid dertil, isoleret DNA-molekyle, som koder derfor, vektor o - Google Patents

Description

i DK 172763 B1

’ OPFINDELSENS OMRÅDE

Denne opfindelse angår en isoleret interleukin-1 inhibitor (IL-li), som er i stand til at inhibere interleukin-1 (IL-1), eller et forstadiepolypeptid, som kan omdannes til en 5 sådan inhibitor. Endvidere angår opfindelsen et isoleret DNA-molekyle, der koder for interleukin-1 inhibitoren eller forstadiepolypeptidet, en rekombinant DNA-vektor og en re-kombinant værtscelle, der omfatter dette DNA-molekyle, og en fremgangsmåde til fremstilling af interleukin-1 inhibi-10 toren eller forstadiepolypeptidet. Desuden angår opfindelsen anvendelsen af interleukin-1 inhibitoren til fremstilling af et farmaceutisk præparat til inhibering af interleukin-1 samt et farmaceutisk præparat omfattende interleukin-1 inhibitoren.

15 OPFINDELSENS BAGGRUND

interleukin-1 molekyler er en proteinklasse, der produceres af talrige celletyper, inklusive monocytter og visse makrofager. Denne klasse omfatter mindst to 17-18 kilodalton 20 proteiner, der er kendt som interleukin-1 alfa og interleukin-1 beta. Disse proteiner har vigtige fysiologiske virkninger på flere forskellige målceller, der er involveret i de inflammatoriske og immunologiske svar. Proteinerne er co-mitogener (med phytohæmaglutinin) for T-celler, de får 25 både fibroblaster og chondrocytter til at udskille latent collagenase, og de forøger endothelcellernes overfladeadhæsive kraft for neutrofiler. Endvidere virker de på hypothalamus som pyrogener, de stimulerer katabolisme af muskelprotein, og de får hepatocytter til at syntetisere en pro-30 teinklasse, der er kendt som "akut-fase-reaktanter". Inter-leukin-lere (IL-1) er tydeligvis en vigtig del af en organismes svar på infektion og skade på kroppen.

2 DK 172763 B1 På trods af deres normalt gavnlige virkninger har der imidlertid vist sig situationer, hvor virkningerne af IL-1 er skadelige. IL-1 kan f.eks. forøge collagenase-niveauet i et 5 gigtplaget led og har vist sig impliceret som mediator for både immunpatologiske akutte og kroniske stadier af rheumatoid arthritis. IL-1 kan være ansvarlig for ændret en-dothelcelle-funktion, styring af leukocytters og lymfocytter kemotaxi og vandring ind i det synoviale væv, induce-10 ring af kapillærvævsproliferation og stimulering af roakro-fagakkumulation i det synoviale væv under den akutte fase af denne sygdom. I vævsdestruktionsfasen er IL-1 involveret som en mediator i induktionen af vævsskade ved at stimulere frigivelse af enzymer fra fibroblaster og chondrocytter.

15 For stor produktion af IL-1 er endvidere blevet påvist i psoriasispatienters hud, og høje niveauer af IL-1 kan findes i synovialvæsken hos patienter med psoriatisk arthritis. IL-1, der frigives af celler i det inflammatoriske synovium ved psoriatisk arthritis, kan mediere vævsdestrukti-20 on ved at stimulere enzymfrigivelse fra andre celler. Ledpatologien ved Reiters syndrom svarer til den, der ses ved psoriatisk arthritis og ved rheumatoid arthritis. IL-1 har vist sig at være involveret som en mediator for vævsdestruktion i disse 3 forskellige former for inflammatorisk 25 arthritis. Endvidere kan IL-1 findes i synovialvæsken hos osteoarthritis-patienter. Frigivelse af IL-1 fra chondrocytter har vist sig involveret i destruktion af arthritis-bindevæv ved denne sygdom.

IL-1 kan også gøre autoimmune sygdomme mere alvorlige. For 30 eksempel er nedsat IL-1 produktion blevet beskrevet fra perifere blodlegemer hos personer, som lider af systemisk lupus erythematosus. Endvidere kan nogle af ændringerne i B-lymfocytfunktion være relateret til abnormaliteter i IL-1 produktion eller IL-1 tilgængelighed.

3 DK 172763 B1

For stor IL-1 produktion har vist sig i perifere monocytter hos seleroderma-patrenter, og IL-1 har vist sig at være impliceret som et muligt fibrosisagens ved stimulering af f ibroblasters collagenproduktion. Den vævsskadende mekanisme 5 i dermatomyositis kan evt. også involvere cellemedieret immunitet, og IL-1 er derfor muligvis involveret som mediator i denne patofysiologiske proces.

Akut og kronisk interstitiel lungesygdom er karakteriseret ved at lungefibroblaster, som kan være stimuleret af IL-1, 10 producerer for meget collagen. Nylige undersøgelser på en dyremodel af lungehypertension indikerer, at IL-1 kan være ansvarlig for induktion af endothelcelleændringer, som resulterer i forsnævring af lungearterier. Det er denne forsnævring, som fører til lungehypertension og yderligere se-15 kundær skade. IL-1 inhibitorer kan derfor være nyttige til behandling af disse lungesygdomme.

I nylige undersøgelser er det beskrevet, at IL-1 er i stand til direkte at skade beta-cellerne i de Langerhanske øer, som er ansvarlige for insulinproduktionen. IL-1 skade i 20 cellerne antages nu at være et primært forhold i den akutte fase af juvenil diabetes mellitus.

Monocyt- og makrofaginfiltration i nyrerne dominerer i mange former for akut og kronisk glomerulonephritis. IL-1 frigivelse fra disse celler kan måske resultere i lokal ophob-25 ning af andre inflammatoriske celler, hvilket til sidst fører til inflammatorisk skade og fibrotisk reaktion i nyrerne.

Det er blevet vist, at krystallerne, som findes i væv eller væsker ved gigt og pseudogigt, direkte kan stimulere makro-30 fager til at frigive IL-1. IL-1 kan derfor tænkes at være en vigtig mediator i den inflammatoriske cyklus ved disse sygdomme.

4 DK 172763 B1 IL-1 er i stand til at inducere tab af calcium fra knoglerne og er muligvis ansvarlig for osteoporose, som ses ved inflammatoriske ledsygdomme.

Keratinocytter fra patienter med psoriasis frigiver store 5 mængder af IL-1. Denne mediator kan muligvis være ansvarlig for den sekundære celleproliferation og akkumulation, som sker i huden hos patienter med denne sygdom.

IL-1 er en af de vigtige endogene pyrogener og er muligvis ansvarlig for inducering af udtalt grad af feber, som ses 10 ved visse infektiøse sygdomme, såsom sygdomme med akut feber fremkaldt af bakterier eller virus.

Sarcoidosis karakteriseres af granulomatøse læsioner i mange forskellige organer i kroppen. IL-1 har vist sig at være i stand til at inducere granuloma-dannelse in vitro og er 15 muligvis involveret i denne proces i patienter med sarcoidosis.

Overskud af IL-1 produktion er blevet påvist i perifere mo-nocytter ved både Crohn's sygdom og ulcerativ colitis. Lokal IL-1 frigivelse i tarmen er muligvis en vigtig mediator 20 til stimulering af den inflammatoriske cyklus ved disse sygdomme.

Visse lymfomatyper er karakteriseret ved feber, osteoporose og endog sekundær arthritis. Overskud af IL-1 frigivelse er blevet påvist i nogle lymfomaceller in vitro og er muligvis 25 ansvarlig for nogle af de kliniske manifestationer ved disse sygdomstegn. Desuden er IL-1 produktion fra visse ondartede lymfocytter muligvis ansvarlig for nogle af feberreaktionerne, akutf ase-respons og cachexia-reaktioner, som ses ved leukæmi.

30 IL-1 frigivelse fra astrocytter i hjernen tænkes at være ansvarlig for at inducere den fibrosis, som kan fremkomme efter skade på hjernen som følge af vaskulær okklusion.

5 DK 172763 B1 C. Anvendelse, af en IL-1 inhibitor I disse og andre omstændigheder, hvor IL-1 har en skadelig virkning, er der tydeligvis klinisk behov for en Inhibitor af IL-1 funktionen. Da IL-1 er et co-mitogen for T-celler, 5 er det centralt placeret i udviklingen af autoimmunsygdomme og andre immunsygdonune. Ved systemisk indgivelse kunne IL-1 hæmmere således være anvendelige immunhæmmende midler. Lokal anvendt kunne sådanne IL-1 hæmmere tjene til at forhindre vævsbeskadelse i et inflammatorisk led og på andre in-10 flammatoriske steder. Til forhindring af vævsødelæggeIse kan visse IL-1 hæmmere faktisk vise sig mere effektive, når de gives i forbindelse med collagenasehæmmere.

Terapeutisk indgriben mod IL-1 virkningen kan være mulig på syntese- eller sekretionsniveau eller ved målcellens bin-15 ding af eller respons på proteinet. IL-1 syntetiseres af monocytter/makrofager og andre celler som svar på lipopoly~ saccharider, komplementfragmenter og virus. Ethvert molekyle, som blokerer binding af disse inducerende agenter til produktionsceller eller som med deres virkninger interfere-20 rer på disse cellers fysiologi, kan tjene som en regulator af IL-1 funktionen. IL-1 udskilles ikke af et traditionelt sekretionssystem, eftersom man har isoleret mRNA-molekyler, som koder for mindst to 30 kd forstadier af proteinerne, men som ikke indeholder en hydrofob signalsekvens. Frigi-25 velse af det aktive protein fra det inaktive forstadie kræver sandsynligvis proteolyse af dette forstadie. En inhibitor af frigivelsen af IL-1 eller IL-l-typer fra deres forstadier kunne teoretisk regulere IL-1 virkningen. IL-1 virker sandsynligvis på målceller via en klassisk receptor-30 medieret reaktionsvej, skønt receptoren endnu ikke er blevet isoleret. Det kan således være, at et molekyle, som interfererer med IL-l's binding til dets receptorer, eller som ned-regulerer disse receptorer, også kunne regulere IL-1 virkningen. Eftersom de intracellulære forhold, som føl-35 ger efter receptorbindingen af IL-1 desuden endnu ikke er fuldt forstået, er det muligt, at der eksisterer midler, * DK 172763 B1 € som kan interferere med de cellulære svar på andre receptormedierede forhold, og som derfor blokerer IL-1 virkningen. Af de ovenfor anførte grunde har man søgt efter proteiner og små molekyler, som er i stand til at hæmme IL-1 på 5 en eller flere af disse måder.

SAMMENFATNING AF OPFINDELSEN

Ifølge nærværende opfindelse har man overraskende fundet mindst to IL-1 inhibitorproteiner med IL-1 hæmmende egenskaber. Disse molekyler er blevet opnået i ren form, hvil- 10 ket vil gøre det muligt for en fagmand at bestemme deres aminosyresekvens. Et præparat af celler, der producerer disse proteiner, er yderligere blevet karakteriseret, og et mRNA, som fører til dets syntese, er blevet karakteriseret.

Endelig er der blevet udviklet antisera, som vil lette 15 screeningen af cDNA-ekspressionsbiblioteker for de gener, som koder for disse inhibitorer. Disse reagenser vil tilsammen gøre det muligt at klone cDNA, som koder for IL-1 inhibitorerne. Disse gener vil derefter gøre det muligt at lave storskalaproduktion af IL-1 inhibitorer, der er egnede 20 til brug i farmaceutiske formulationer, der er anvendelige til at behandle patofysiologiske forhold, som medieres af IL-1.

Det er et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe oprensede former af IL-1 inhibitorer, som er akti-25 ve mod IL-l-alfa eller IL-l-beta eller en kombination heraf. Det er et yderligere formål ifølge den foreliggende opfindelse at tilvejebringe disse inhibitorer i oprenset form for at muliggøre bestemmelse af deres aminosyresekvens. Det er et yderligere formål at tilvejebringe aminosyresekven-30 serne af visse IL-1 inhibitorer. Yderligere er det også et af opfindelsens formål at identificere biologisk aktive analoger af IL-1 inhibitorer med forbedrede eller ækvivalente egenskaber.

Det er endvidere et formål for den foreliggende opfindelse 35 at tilvejebringe et rekombinant-DNA system til produktion 7 DK 172763 B1 af IL-1 inhibitorer, som heri beskrevet. Et yderligere formål for opfindelsen omfatter tilvejebringelsen af oprensede former af IL-1 inhibitorer, som vil være værdifulde som farmaceutiske præparater ved at udvise aktivitet mod IL-1.

5 Yderligere formål og fordele ved opfindelsen vil dels blive fremført i den efterfølgende beskrivelse, dels være åbenbare ud fra beskrivelsen eller kunne erfares ud fra praktisering af opfindelsen. Formålene og fordelene kan forstås og vil kunne opnås ved hjælp af de midler og kombinationer 10 heraf, som særlig påpeges i de tilhørende patentkrav.

Til opnåelse af formålene og i overensstemmelse med formålene ifølge den foreliggende opfindelse beskrives IL-1 inhibitorer, som udviser hæmmende aktivitet mod IL-1. De foretrukne inhibitorer er blevet isoleret i en ren form fra 15 monocyt-konditioneret medium med monocytter, der er dyrket på IgG-belagte plader.

Foretrukne inhibitorer ifølge den foreliggende opfindelse er 1, 2 og 3. Inhibitorerne 1 og 2 er proteiner, der ved SDS-PAGE løber ved positioner, der er karakteristiske for 20 22-23 kD proteiner og eluerer ved henholdsvis 52 mM og 60 mM NaCl fra en Mono Q FPLC-søjle under specificerede betingelser. Inhibitor 3 er et protein, der ved SDS-PAGE løber ved en position, der er karakteristisk for et 20 kD protein og eluerer ved 48 mM NaCl fra en Mono Q FPLC-søjle under de 25 specificerede betingelser. For endvidere at opnå formålene ifølge den foreliggende opfindelse beskrives farmaceutiske sammensætninger, der indeholder mindst én af de aktive bestanddele, en IL-1 inhibitor ifølge den foreliggende opfindelse eller dens biologisk aktive analog som her beskrevet.

30 For endvidere at opnå formålene ifølge den foreliggende opfindelse beskrives et rekombinant-DNA system til fremstilling af disse IL-1 inhibitorer og deres analoger. En fore-trukken udførelsesform af dette system omfatter mindst én cDNA-klon eller dens syntetiske ækvivalent, der koder for 35 mindst én IL-1 inhibitor, sammen med vektorer eller celler, 8 DK 172763 B1 der udgør et ekspressionssystem, der er i stand til at udtrykke IL-1 inhibitorerne, som her beskrevet. Der tilvejebringes også antisera til identificering af disse cDNA-kloner. Endvidere tilvejebringes ekspressionssystemer til 5 at producere disse IL-1 inhibitorer under anvendelse af disse cDNA-kloner, deres analoger eller andre DNA-sekven-ser, der koder for disse inhibitorer.

Således tilvejebringes ifølge opfindelsen en isoleret in-terleukin-1 inhibitor (IL-Ii), som er i stand til at inhi-10 bere interleukin-1 (IL-1), eller et forstadiepolypeptid, som kan omdannes til en sådan inhibitor, hvilken inhibitor eller forstadiepolypeptid er særegen ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

Endvidere tilvejebringes ifølge opfindelsen et isoleret 15 DNA-molekyle, der koder for en interleukin-1 inhibitor (IL-li), som er i stand til at inhibere interleukin-1 (IL-1), eller for et forstadiepolypeptid, som kan omdannes til en s&dan inhibitor, hvilket DNA-molekyle er særegent ved det i krav 12's kendetegnende del angivne.

20 Ifølge opfindelsen tilvejebringes også en rekombinant DNA-vektor, som er særegen ved, at den omfatter det ovenfor definerede DNA-molekyle, og en rekombinant værtscelle, som er særegen ved det i krav 21's kendetegnende del angivne.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes også en fremgangsmåde til 25 fremstilling af en interleukin-1 inhibitor (IL-li) eller et forstadiepolypeptid ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er særegen ved, at interleukin-1 inhibitoren eller forstadiepolypeptidet produceres i en rekombinant værtscelle som defineret ovenfor under egnede betingelser for eks-30 pression af det deri indeholdte DNA-molekyle og dannelse af IL-li eller et forstadiepolypeptid.

Desuden omfatter opfindelsen anvendelsen af en interleukin-1 inhibitor (IL-li) ifølge opfindelsen til fremstilling af et farmaceutisk præparat til inhibering af interleukin-1 9 DK 172763 B1 samt et farmaceutisk præparat, som er særegent ved, at det omfatter en interleukin-1 inhibitor (IL-li) ifølge opfindelsen.

KORT BESKRIVELSE AF FIGURERNE

5 Figurerne la og lb viser proteinprofilen fra Mono Q kromatografi af to metabolisk-mærkede monocytsupernatanter. Cellerne blev dyrket på plader belagt med IgG (la) eller føtal kalveserum (lb).

Figur 2a viser sølvfarvede geler af fraktioner fra områder-10 ne, som er vist i figurerne la og lb.

Figur 2b er et autoradiogram af de i figur 2a viste geler.

Figurerne 3a, b og c viser data på den oprensede IL-li fra eksempel 1. Figur 3a viser kromatografiresultaterne med radioaktivitetsmønsteret lagt hen over. Figur 3b viser sølv-15 farvede geler, der er kørt på prøver af de fraktioner, der vises i figur 3a. Figur 3c viser autoradiogrammer af gelerne i figur 3b.

Figur 4a og b viser resultaterne af gelfiltreringskromato-grammer af Mono Q-oprenset IL-li.

20 Figurerne 5a og b viser Western analyse af muse-antisera.

Figur 6 viser konstruktionen af plasmid pSVXVPL21L-li.

Figur 7 viser konstruktionen af plasmid pMK-SGE:IL-li.

Figurerne Ba-d viser data på iL-li-alfa. Figurerne 8a og 8b viser kromatografidata. Figur 8c viser en sølvfarvet gel, 25 der er kørt med prøver af fraktioner, som vist i figur 8b.

Figur 8d viser et autoradiogram.

Figurerne 9a og 9b viser data på IL-li-beta. Figur 9a viser kromatografidata. Figur 9b viser resultater fra SDS-PAGE.

10 DK 172763 B1

Figur 10 viser resultater for IL-li-alfa peptidseparation.

Figur 11 viser resultater for IL-li-beta peptidseparation.

Figur 12a er et fotografi af gelen med GT10-IL-li-2A fordøjet med FcoRI efter elektroforese ifølge eksempel 6.

5 Figur 12b viser resultater fra et autoradiogram af et Southern blot af gelen vist i figur 12a.

Figur 13 viser en del af DNA-sekvensen af det proteinkodende område af lambda GTlO-IL-li-2A og den forudsagte amino-syresekvens ifølge eksempel 6.

10 Figur 14 viser nukleotidsekvensen af GT10-IL-li-2A.

Figur 15 viser et peptid, der blandt andet omfatter en IL- li-sekvens og en sekretorisk ledersekvens.

BESKRIVELSE AF DE FORETRUKNE UDFØRELSESFORHER

Der vil nu i detaljer blive henvist til de for tiden fore-15 trukne udførelsesformer for opfindelsen, hvilket sammen med de efterfølgende eksempler tjener til at forklare principperne for opfindelsen.

A. Inhibitor fra humane monocytter

Som ovenfor anført angår den foreliggende opfindelse IL-1 20 inhibitorer, som er blevet isoleret i en ren form. IL-1 inhibitorerne ifølge den foreliggende opfindelse hidrører fortrinsvis fra medium konditioneret med humane monocytter, hvor monocytterne er dyrket på IgG-belagte beholdere. Endvidere omfatter opfindelsen i alt væsentligt oprensede IL-1 25 inhibitorer af en hvilket som helst oprindelse, som er biologisk ækvivalente til inhibitoren, der hidrører fra medium konditioneret med humane monocytter.

Med det i beskrivelsen og kravene anvendte udtryk "biologisk ækvivalent" menes sammensætninger ifølge den forelig- 11 DK 172763 B1 gende opfindelse, som er i stand til at forhindre IL-1 virkning på en lignende måde, men ikke nødvendigvis i samme grad, som den naturlige IL-1 inhibitor, der isoleres fra monocytter. Med udtrykket "i alt væsentligt homolog", som 5 anvendt her i beskrivelsen og kravene, menes en større grad af homologi med den native IL-1 inhibitor, der er isoleret fra monocyt-konditioneret medium, end den, som udvises af hvilke som helst tidligere beskrevne IL-1 inhibitorer. Graden af homologi er fortrinsvis over 70%, mere fortrinsvis 10 over 805% og endnu mere fortrinsvis over 90%. En særlig foretrukken gruppe af inhibitorer er over 95% homologe med den native inhibitor. Den beskrevne procentuelle homologi beregnes som procenten af aminosyrerester, der findes i den mindre af de to sekvenser, som passer med identiske amino-15 syrerester i den sekvens, der sammenlignes med, når 4 huller i en længde på 100 aminosyrer kan indføres for at lette denne sammenpasning som beskrevet af Dayhoff, M.D., i Atlas of Protein Seguence and Structure bd. 5, s. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., 20 der specifikt inkorporeres heri ved denne reference.

De foretrukne IL-1 inhibitorer ifølge den foreliggende opfindelse hidrører fra monocyt-konditioneret medium og er for første gang blevet isoleret i en ren form. Betegnelserne "ren form" eller "oprenset form" som her anvendt under 25 henvisning til de heri beskrevne IL-1 inhibitorer skal betyde en præparation, som er i alt væsentligt fri for andre proteiner, som ikke er IL-1 inhibitorproteiner. IL-1 inhibitorerne i følge den foreliggende opfindelse er fortrinsvis mindst 90% rene og mere fortrinsvis 95% rene.

30 Mindst 3 oprensede IL-1 inhibitorer er blevet isoleret ved fremgangsmåderne ifølge eksemplet. Disse omfatter inhibitor 1, inhibitor 2 og inhibitor 3. Inhibitor 1 opfører sig som et 22-23 kD molekyle ved SDS-PAGE roed et omtrentligt iso-elektrisk punkt på 4,8 og eluerer fra en Mono Q FPLCsøjle 35 ved ca. 52 mM NaCl i Tris-puffer, pH 7,6. Inhibitor 2 er 12 DK 172763 B1 også et 22-23 kD protein, pl=4,8, men eluerer fra en Mono Q søjle ved 60 mM NaCl. Inhibitor 3 er et 20 kD protein og eluerer fra en Mono Q søjle ved 48 mM NaCl. Inhibitorerne 1, 2 og 3 er immunologisk og funktionelt beslægtede. Ved at 5 have opnået disse inhibitorer i oprenset form er det blevet muligt for opfinderne at opnå deres aminosyresekvenser. Under anvendelse af de oprensede inhibitorer, som her beskrives for førte gang, og fremgangsmåder, som beskrevet i og af ABI Protein Sequencer tekniske manualer leveret med ABI 10 Protein Sequencer, kan en væsentlig del af aminosyresekven-serne af disse inhibitorer udledes.

Eksempel 3 viser aminosyresekvensresultater for 3 former af IL-1 inhibitorer, nemlig IL-li-X, IL-li-alfa og IL-li-beta.

Opfinderne har beskrevet mindst et antistof mod en IL-1 in-15 hibitor. Andre polyklonale og monoklonale antistoffer mod denne og andre IL-1 inhibitorer kan fremstilles ved fremgangsmåder, der er kendte for en fagmand. Et bestemt po-lyklonalt antistof beskrives i eksempel 4.

B. Rekombinantinhibitor 20 1. Generelt

En fremgangsmåde med rekombinant DNA til fremstilling af en IL-1 inhibitor er nu beskrevet. I en udførelsesform ifølge opfindelsen fungerer det aktive sted på en måde, der er biologisk ækvivalent til funktionen af den native IL-1 in-25 hibitor, der isoleret fra mennesker. En naturlig eller syntetisk DNA-sekvens kan anvendes til at styre produktionen af IL-1 inhibitorerne. Denne metode omfatter: (a) Præparation af en DNA-sekvens, der er i stand til at styre en værtscelle til at producere et protein, der har 30 IL-1 inhibitor-aktivitet.

(b) Kloning af DNA~sekvensen i en vektor, der er i stand til at blive overført til og replikeret i en værtscelle, 13 DK 172763 B1 hvilken vektor indeholder operationelle elementer, der kræves for at udtrykke DNA-sekvensen.

(c) Overføring af vektoren, der indeholder den syntetiske DNA-sekvens og operationelle elementer, til en værtscelle, 5 der er i stand til at udtrykke det DNA, der koder for IL-1 inhibitoren.

(d) Dyrkning af værtscellerne under betingelser, der er egnede for amplifikation af vektoren og ekspression af inhibitoren.

10 (e) Høst af inhibitoren.

(f) Inhibitoren får mulighed for at antage en aktiv tertiær struktur, hvorved den besidder IL-1 inhibitor-aktivitet.

2. DNA-sekvenser DNA-sekvenser til brug ved denne fremgangsmåde diskuteres 15 dels i eksempel 5, dels i eksempel 6. Det skal forstås, at disse sekvenser omfatter syntetiske og naturlige DNAsekven-ser. De naturlige sekvenser omfatter yderligere cDNA eller genomiske DNA-segmenter.

I eksempel 6 tilvejebringer en molekylær klon af DNA, der 20 koder for et protein, som er identisk til det, som isoleres ifølge eksempel 1-3. 1 eksempel 6 blev en plaque, GT10- IL-li-2A, isoleret fra et GTlO-bibliotek. Fagen i denne plaque blev opformeret, og DNA'et blev isoleret og fordøjet med FcoRI. Et EcoRI-fragment på 1850 basepar bærer den kodende 25 sekvens for IL-1 inhibitor. Figur 13 viser den delvise DNA-sekvens af EcoRI-fragmentet.

I lyset af de belæringer, der her medtages, og kendte fremgangsmåder, vil andre syntetiske polynukleotidsekvenser være tilgængelige for en fagmand. Som eksempel på fagområdets 30 nuværende status med hensyn til polynukleotidsyntese henvises man til Matteucci, M.D., og Caruthers, H.H., i J. Am.

14 DK 172763 B1

Chem. Soc. 103, 3185 (1981) og Beaucage, S.L., og Ca- ruthers, M.H., i Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981), og til instruktionerne, der leveres sammen med et ABI oligonukleo-tidsynteseapparat, hvilke referencer medtages specifikt ved 5 henvisning.

Disse syntetiske sekvenser kan være identiske med de naturlige sekvenser, der er beskrevet i større detaljer nedenfor, eller de kan indeholde forskellige nukleotider. Hvis de syntetiske sekvenser indeholder nukleotider, der er for-10 skellige fra de, der findes i de naturlige DNA-sekvenser ifølge opfindelsen, skal det forstås, at i én udførelsesform vil disse forskellige sekvenser stadig kode for et po-lypeptid, som har den samme primære struktur som IL-li, der er isoleret fra monocytter. I en alternativ udførelsesform 15 vil den syntetiske sekvens, der indeholder forskellige nukleotider, kode for et polypeptid, som har den samme biologiske aktivitet som den her beskrevne IL-li.

DNA-sekvensen kan endvidere være et fragment af en naturlig sekvens, dvs. et fragment af et polynukleotid, som forekom-20 mer i naturen, og som er blevet isoleret og oprenset for første gang ifølge den foreliggende opfindelse. I én udførelsesform er DNA-sekvensen et restriktionsfragment, der er isoleret fra et cDNA-bibliotek.

I en alternativ udførelsesform isoleres DNA-SeKvensen fra 25 et humant genombibliotek. Et eksempel på et sådant bibliotek, der er anvendeligt i denne udførelsesform, beskrives af Lawn et al., i Cell: bd. 5: 1157~1174 (1978), der specifikt medtages her ved reference.

I en foretrukken version af denne udførelsesform skal det 30 forstås, at den naturlige DNA-sekvens vil opnås ved en fremgangsmåde, der omfatter: (a) præparation af et human cDNA-bibliotek fra celler, fortrinsvis monocytter, der er i stand til at frembringe en IL-1 inhibitor, i en vektor, og en celle, der er i stand 15 DK 172763 B1 til at amplificere og udtrykke det hele eller en del af dette cDNA, (b) undersøgelse af det humane DNA-bibliotek med mindst én probe, der er i stand til at binde til IL-1 inhibitor-genet 5 eller dets proteinprodukt, (c) identifikation af mindst én klon, der indeholder genet, der koder for inhibitoren, ved hjælp af klonens evne til at binde mindst en probe for genet eller dets proteinprodukt, (d) isolering af genet eller en del af genet, som koder f 10 or inhibitoren og fra de{n) udvalgte klon eller kloner, og (e) kobling af genet eller egnede fragmenter deraf til operationelle elementer, der er nødvendige for at bevare og udtrykke genet i en værtscelle.

De naturlige DNA-sekvenser, der er brugbare i den foregåen-15 de fremgangsmåde, kan også identificeres og isoleres ved en fremgangsmåde, der omfatter: (a) fremstilling af et humant genoroisk DNA-bibliotek, der fortrinsvis opformeres i en recArecBC B. coll vært, (b) undersøgelse af human genom-DNA-biblioteket med mindst 20 én probe, der er i stand til at binde til et IL-1 inhibitor-gen eller dets proteinprodukt, (c) identifikation af mindst en klon, der indeholder genet, som koder for inhibitoren ved hjælp af klonens evne til at binde til mindst én probe for genet eller dets proteinpro- 25 dukt, (d) isolering af genet, der koder for inhibitoren fra den (de) identificerede klon(er), og (e) kobling af genet eller egnede fragmenter deraf til operationelle elementer, der er nødvendige for at bevare og 30 udtrykke genet i en værtscelle.

16 DK 172763 B1

Ved isolering af en naturlig DNA-sekvens, der er egnet til brug ved den ovenfor anførte fremgangsmåde, foretrækkes det at identificere de to restriktionssteder, som er lokaliseret i eller tættest ved endedelene af det hensigtsmæssige 5 gen eller sektioner af genet. DNA-segmentet, der indeholder det hensigtsmæssige gen, fjernes derefter fra resten af det genomiske materiale under anvendelse af passende restrik" tionsendonukleaser. Efter udskæring rekonstrueres 3'- og 5'-enderne af DNA-sekvensen og af alle exonforeningssteder-10 ne for at tilvejebringe hensigtsmæssige DNA-sekvenser, der er i stand til at kode for den N- og C-terminale ende af IL-1 inhibitorproteinet, og hvorved man er i stand til at fusionere DNA-sekvensen til dens operationelle elementer.

3. Vsktorer 15 (a) Mikroorganismer, navnlig E. coli

Vektorerne, som det påtænkes at anvende ved den foreliggende opfindelse, omfatter hvilke som helst vektorer, hvori en DNA-sekvens kan indsættes som ovenfor diskuteret, sammen med hvilke som helst foretrukne eller krævede operationelle 20 elementer, hvilken vektor derefter kan overføres til en værtscelle og replikeres i en sådan celle. Foretrukne vektorer er de, hvis restriktionssteder er veldokumenterede, og som indeholder de operationelle elementer, der foretrækkes eller kræves for transkription af DNA-sekvensen. Man 25 kan dog også forestille sig visse udførelses former af den foreliggende opfindelse, som anvender for tiden uopdagede vektorer, som kunne indeholde en eller flere af de heri beskrevne cDNA-sekvenser. Det foretrækkes navnlig at alle disse vektorer har nogle eller alle af følgende egenskaber: 30 (1) indeholder et minimalt antal sekvenser fra værtsorga nismen, (2) bevares og formeres stabilt i den ønskede vært, (3) er i stand til at være til stede i et højt antal kopier i den ønskede vært, (4) indeholder en regulatorisk promoter, der er således lokaliseret, at den fremmer transkrip-35 tionen af genet af interesse, (5) har mindst én DNA- 17 DK 172763 B1 sekvensmarkør, der koder for en selekterbar egenskab, der er til stede på en del af plasmidet adskilt fra det sted, hvor DNA-sekvensen vil blive indføjet, og (6) en DNA-sekvens, der er i stand til at terminere transkriptionen.

5 I forskellige foretrukne udførelsesformer indeholder disse kloningsvektorer, der indeholder og er i stand til at udtrykke DNA-sekvenserne ifølge den foreliggende opfindelse, forskellige operationelle elementer. De her omtalte "operationelle elementer" omfatter mindst én promotor, mindst én 10 Shine-Dalgarno sekvens og initiatorcodon og mindst en ter-minatorcodon. Disse "operationelle elementer” omfatter også mindst en operator, mindst en ledersekvens for proteiner, der skal eksporteres fra det intracellulære rum, mindst et gen for et regulatorprotein og hvilke som helst andre DNA-15 sekvenser, der er nødvendige og foretrukne for hensigtsmæssig transkription og efterfølgende translation af vektor-DNA.

Visse af disse operationelle elementer kan være til stede i hver af de foretrukne vektorer ifølge den foreliggende 20 opfindelse. Det skal forstås, at ethvert yderligere operationelt element, som måtte kræves, kan tilføjes til disse vektorer under anvendelse af fremgangsmåder, der er kendt for en fagmand, specielt i lyset af de her anførte belæringer.

25 Det er i praksis muligt at konstruere hver af disse vektorer på en måde, som tillader dem at blive let isoleret, samlet og udskiftet med hinanden. Dette letter samlingen af talrige funktionelle gener fra kombinationer af disse elementer og det kodende område af DNA-sekvenserne. Mange af 30 disse elementer vil endvidere være anvendelige i mere end en vært. Det skal desuden forstås, at vektorerne specielt i de foretrukne udførelsesformer vil indeholde DNA-sekvenser, der er i stand til at fungere som regulatorer ("operatorer"), og andre DNA-sekvenser, der er i stand til at kode 35 for regulerende proteiner.

18 DK 172763 B1 (i) Regalatøtex

Disse regulatorer vil i én udførelsesform tjene til at forhindre ekspression af DNA-sekvensen under tilstedeværelse af visse miljøbetingelser og vil ved andre miljøbetingelser 5 tillade transkription og efterfølgende ekspression af proteinet, der er kodet for af DNA-sekvensen. Det foretrækkes navnlig, at der indsættes regulatoriske segmenter i vektoren, således at ekspressionen af DNAsekvensen ikke vil ske, eller vil ske i meget reduceret omfang i fravær af f.eks.

10 isopropylthio-beta-D-galactosid. I denne situation kan de transformerede mikroorganismer, der indeholder DNA-sekvensen, dyrkes til en ønsket tæthed forud for initiering af ekspressionen af IL-li. I denne udførelsesform induceres ekspressionen af det ønskede protein ved til det mikrobiel-15 le miljø at tilsætte et stof, som er i stand til at forårsage ekspression af DNA-sekvensen efter at den ønskede tæthed er blevet opnået.

Ekspressionsvektorerne må indeholde promotorer, som kan an-20 vendes af værtsorganismen til ekspression af dets egne proteiner. Medens lactosepromotorsystemet er almindeligt anvendt, er også andre mikrobielle promotorer blevet isoleret og karakteriseret, hvorved det bliver muligt for en fagmand at anvende dem til ekspression af det rekombinerede IL-li.

25 (iii) Transkriptionsterminator

De her foreslåede transkriptionsterminatorer tjener til at stabilisere vektoren. Især foreslås i den foreliggende opfindelse anvendelse af de sekvenser, der er beskrevet af Rosenberg, M. og Court, D. i Ann. Rev. Genet, bd.13: 319~ 30 353 (1979), der specifikt medtages her ved reference.

19 DK 172763 B1 (iv) Ikke-translaterede sekvenser

Det bemærkes, at i den foretrukne udførelsesform kan det også være ønskeligt at rekonstruere 3'- eller 5'-enden af det kodende område for at tillade inkorporering af 3'eller 5 5'-ikke-translaterede sekvenser i gentranskriptet. Blandt disse ikke-translaterede sekvenser er de mRNAstabiliseren-de, som de er identificeret af Schmeissner, U., McKenney, K., Rosenberg, M. og Court, D. i j.Mol.Biol. bd. 176: 39-53 (1984), hvilken reference specifikt medtages her ved denne 10 henvisning.

(v) Ribosombindingssteder

Den mikrobielle ekspression af fremmede proteiner kræver visse operationelle elementer, som omfatter, men ikke er begrænset til ribosombindingssteder. Et ribosombindingssted 15 er en sekvens, som et ribosom genkender og bindes til ved begyndelsen af proteinsyntesen som anført i Gold, L. et al., Ann. Rev. Microbio. bd. 35, 557-580, eller Marquis, D.M. et al., Gene bd.42, 175-183 (1986), hvilke referencer begge specifikt medtages her ved denne henvisning. Et fore-20 trukkent ribosombindingssted er GAGGCGCAAAAA (ATG).

(vi) Ledersekvens oo translationel kobler.

Det foretrækkes endvidere, at DNA, der koder for en hensigtsmæssig sekretorisk leder(signal)sekvens, er til stede ved S'-enden af DNA-sekvensen som anført af Watson, M.E. i 25 Nucleic Acids Res. bd.12, 5145-5163, hvilken reference specifikt medtages her ved denne henvisning, hvis proteinet skal udskilles fra cytoplasmaet. DNA'et for ledersekvensen må være i en position, som tillader produktion af et fusionsprotein, i hvilket ledersekvensen er umiddelbar nærlig-30 gende til og covalent bundet til inhibitoren, dvs. der må ikke være nogen transkriptions- eller translationstermine-ringssignaler mellem de to DNA-kodende sekvenser. Tilstedeværelsen af ledersekvensen er delvis ønsket for en eller flere af følgende grunde. For det første kan ledersekvensen 20 DK 172763 B1 lette værtens processering af IL-li. Ledersekvensen kan specielt styre spaltningen af det initielle translationsprodukt ved hjælp af en lederpeptidase til fjernelse af ledersekvensen og efterlade et polypeptid roed den aminosyre-5 sekvens, som har potentiel proteinak~ tivitet. For det andet kan tilstedeværelse af ledersekvensen lette oprensning af IL-li ved at styre proteinet ud af cellecytoplasmaet. I visse arter af værtsmikroorganismer vil tilstedeværelsen af en passende ledersekvens tillade transport af det fuldstæn-10 dige protein til det periplasmatiske rum, som det er tilfældet hos nogle E. coli. I visse E. coli, Saccharomyces og stammer af Bacillus og Pseudomonas vil den hensigtsmæssige ledersekvens tillade transport af proteinet gennem cellemembranen og ud i det extracellulære medium. I denne situa-15 tion kan proteinet oprenses fra det extracellulære protein.

For det tredie kan ledersekvensen i tilfældet med nogle proteiner fremstillet ved den foreliggende opfindelse være nødvendig for at lokalisere det fuldstændige protein i et miljø, hvor det kan folde til indtagelse af dets aktive 20 struktur, hvilken struktur besidder den hensigtsmæssige proteinaktivitet.

I en foretrukken udførelsesform for den foreliggende opfindelse er en yderligere DNA-sekvens lokaliseret umiddelbart forud for DNA-sekvensen, som koder for IL-1 inhibitoren.

25 Den yderligere DNA-sekvens er i stand til at fungere som en translationel kobler, dvs. det er en DNA-sekvens, som koder for et RNA, som tjener til at anbringe ribosomer umiddelbart nærliggende til ribosombindingsstedet for inhibitorR-NA'et, til hvilket det støder op. I en udførelsesform for 30 den foreliggende opfindelse kan translationskobleren afledes under anvendelse af DNA-sekvensens

TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG

samt fremgangsmåder, der er kendt for en fagmand med kendskab til translationelle koblere.

21 DK 172763 B1 (vii) Translationsterminator

De her foreslåede translationsterminatorer tjener til at stoppe translationen af mRNA. De kan enten være naturlige, som beskrevet af Kohli, J., Mol. Gen. Genet, bd.182, 5 430439, eller syntetiserede, som beskrevet af Pettersson, R.F., Gene bd.24, 15-27 (1983), hvilke referencer specifikt medtages her ved denne henvisning.

(viii) Selekterbar markør

Det foretrækkes endvidere, at kloningsvektoren indeholder 10 en selekterbar markør, såsom en resistensmarkør eller anden markør, som forårsager ekspression af en selekterbar egenskab af værtsmikroorganismen. I én udførelses form for den foreliggende opfindelse medtages genet for ampicillinresi-stens i vektoren, medens det i andre plasmider er genet for 15 tetracyclinresistens eller genet for chloramphenicolresi-stens, der medtages.

En sådan resistensmarkør eller anden selekterbar markør har tildels til hensigt at lette selektionen af transformanterne. Tilstedeværelsen af en sådan selekterbar markør i klo-20 ningsvektoren kan endvidere være brugbar til at afholde kontaminerende mikroorganismer fra at formere sig i dyrkningsmediet. I denne udførelses form ville en ren kultur af de transformerede værtsmikroorganismer kunne opnås ved at dyrke mikroorganismerne under betingelser, som kræver den 25 inducerede fænotype for at overleve.

De her diskuterede operationelle elementer udvælges rutinemæssigt af en fagmand i lyset af tidligere litteratur og de her indeholdte belæringer. Generelle eksempler på disse operationelle elementer fremføres i B. Lewin, Genes, Wiley 30 & Sons, New York (1983), hvilken reference specifikt medta ges her ved denne henvisning. Forskellige eksempler på egnede operationelle elementer kan findes for de ovenfor diskuterede vektorer og kan tydeliggøres ved gennemgang af 22 DK 172763 B1 publikationerne, der omtaler de basale egenskaber ved de førnævnte vektorer.

Efter syntese og isolering af alle nødvendige og ønskede komponentdele af den ovenfor diskuterede vektor samles vek-5 toren ved fremgangsmåder, som er almindeligt kendte for en fagmand på området. Samling af sådanne vektorer antages af være inden for arbejdsopgaverne for en fagmand inden for området og kan således udføres uden unødige forsøg. Lignende DNA-sekvenser er f.eks. blevet ligeret til hensigtsmæs-10 sige kloningsvektorer som fremført af Maniatis et al. i Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984), hvilken reference specifikt medtages her ved denne henvisning.

Ved konstruktion af kloningsvektorerne ifølge den forelig-15 gende opfindelse skal det endvidere bemærkes, at der i hver vektor kan indsættes multiple kopier af DNA-sekvensen og dens vedhæftede operationelle elementer. I en sådan udførelsesform vil værtsorganismen producere større mængder pr. vektor af den ønskede IL-1 inhibitor. Antallet af multiple 20 kopier af DNA-sekvensen, som kan indsættes i vektoren, er kun begrænset af evnen af den resulterende vektor til, på grund af dens størrelse, at blive overført til og replike-ret og transkriberet i en passende værtscelle.

(b) Andre mikroorganismer. Vektorer, der er egnede til an-25 vendelse i andre mikroorganismer end E. coli påtænkes ligeledes til brug ved den foreliggende opfindelse. Sådanne vektorer er beskrevet i tabel 1. Desuden er visse foretrukne vektorer diskuteret nedenfor.

23 DK 172763 B1

Tabel 1

Transkrlp-

Tran- tionel

He gu1e- akrip- mRNA- startsted RS-bin reda pro- tlona- atabl- fi leder- dlngs- v»rt motorer Inducere terminator Heering peptid Markør Alid Z coll Lac1.Tac2 IPTC rmB6 ompA8 bla11 amplcillin14

Lambda pL forøget rmC7 lambda ompA12 tetra-

Trp5 tempe- int9 phoS cyklln14· 15 ratur trp^ chloraephe- IAA-tlleet- nlcol16 nlng eller tryptofan-tømnlng

Bacillus ‘alpha- C.coll rm B.amy Kanr 2* B.amy amylase17 rm BT.T28 neutral Camr 29 neutral •sub- protease21 protease tillson18 B.amy alpha- B.amy *p-4319 amylase22 alpha- spac-I2® IPTG B.subt. amyla- subtlllsln23 se22

Pseudo- Trp IAA-tI1- phospho- sulfon- Trp monas (E.coll) setnlng llpase C28 amid38 (E.coll)

Lac eller exo- strep- (E.coll) tryptofan- toxin A29 tomycln38

Tac tømning

(E.coll) IPTC

Ger Gal I31, Glucose Cyc 1 Inver- Ura 337 1032 tømning Una tese3® Leu 238 og galac- sur phos-

Adh I33, tose Alpha- phatase3® II34 Glucose- faktor Alpha- His 3

Pho 5 tømning Sac 2 faktor Tap 1

Phosphat-tømnlng “Ikke reguleret 24 DK 172763 B1 1. Backman, K. , Ptasnne, M., og Gilbert, W., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 13, 4174-4178 (1976).

2. de Boer, H.A., Comstock, L.J., og Vasser, M., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983).

5 3. Shimatake, H., og Rosenberg, M., Nature 292, 128-132 (1981) 4. Derom, C., Gheysen, D., og Fiers, W., Gene 17, 15-51 (1982) .

5. Hallewell, R.A., og Entage, S., Gene 9, 27-47 (1980).

10 6. Grosius, J., Dull, T.J., Sleeter, D.D., og Holler, H.F., J. Mol. Biol. 148, 107~127 (1981).

7. Normanly, J., Ogden, R.C., Horvath, S.J., og Abelson, J., Nature 321, 213-219 (1986).

8. Belasco, J.G., Nilsson, G., von Gabain, A., og Conen, 15 S.N., Cell 46, 245-251 (1986).

9. Schmelssner, W., McKenney, K., Rosenberg, M., og Court, D., J. Mol. Biol. 176, 39-53 (1984).

10. Mott, J.E., Galloway, J.L. , og Platt, T. , EMBO J. 4, 1887-1891 (1985).

20 11. Koshland, D., og Botstein, D., Cell 20, 749-760 (1980).

12. Mowa, N.R. , Nakamura, K., og Inouye, M. , J. Mol. Biol.

143, 317-328 (1980).

13. Surin, B.P., Jans, D.A., Fimmel, A.L., Shaw, D.C., Cox, G.B., og Rosenberg, M., J. Bacterid. 157, 772-778 ( 1984).

25 14. Sutcliffe, J.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3737 — 3741 (1978).

15. Peden, K.W.C., Gene 22, 277-280 (1983).

25 DK 172763 B1 16. Alton, N.K., og Vapnek, D., Nature 282, 864-869 (1979).

17. Yang, M. , Galizzi, A., og Henner, D., Nuc. Acids Res.

11(2), 237-248 (1983).

18. Wong, S.-L., Price, C.W., Goldfarb, D.S., og Doi, R.M., 5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1184-1188 (1984).

19. Wang, P.-Z., og Doi, R.M., J. Biol. Chem. 259, 8619-8625 (1984).

20. Lin, C.-K, Quinn, L.A., Rodriquez, R.L., J. Cell Bio-chem. Suppl. 9B, 198 (1985).

10 21. Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, C., Banner, C.,

Nagle, J., og Filpula, D., J. Bact. 159(3), 811-819 (1984).

22. Palva, I., Sarvas, M., Lehtovaara, P., Sibazkov, M., og Kaariainen, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5582-5586 (1982).

15 23. Wong, S.-L., Pricee, C.W., Goldfarb, D.S., og Doi, R.H., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81, 1184-1188 (1984).

24. Sullivan, M.A., Yasbin, R.E., og Young, F.E., Gene 29, 21-46 (1984).

25. Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, C., Banner, C., 20 Nagle, J., og Filpula, D., J. Bact. 159(3), 811-819 (1984).

26. Yansura, D.G., og Henner, D.J., PNAS 81, 439-443 (1984).

27. Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H., og Heyneker, H.L., Biotechnology, 161-165 (1984).

25 28. Lory, S., og Tai, P.C., Gene 22, 95-101 (1983).

29. Liu, P.V., J. Infect. Dis. 130 (suppl.), 594-599 (1974).

26 DK 172763 B1 30. Wood, D.G., Hollinger, M.F., og Tindol, M.B., J. Bact.

145, 1448-1451 (1981).

31. St.John, T.P., og Davis, R.W., J. Mol. Biol. 152, 285-315 (1981).

5 32. Hopper, J.E., og Rowe, L.B., J. Biol. Chem. 253, 7566- 7569 (1978).

33. Denis, C.L., Ferguson, J., og Young, E.T., J. Biol.

Chem. 258, 1165-1171 (1983).

34. Lutsdorf, L. , og Megnet, R., Arche. Biochem. Biophys.

10 126, 933-944 (1968).

35. Meyhack, B., Bajwa, N., Rudolph, M., og Hinnen, A., EMBO J. 6, 675-680 (1982).

36. Watson, M.E., Nucleic Acid Research 12, 5145-5164 ( 1984 ) .

15 37. Gerband, C., og Guerineau, M., Curr. Genet. 1, 219-228 (1980) .

38. Hinnen, A., Hicks, J.B., og Fink, G.R., Proc. Natl. A-cad. Sci. USA 75, 1929-1933 (1978).

39. Jabbar, M.A., Sivasubramamian, N., og Nayak, D.P., 20 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2019-2023 (1985).

(i) Pseudomonas-vektorer

Som kloningsvektorer i værter af slægten Pseudomonas foretrækkes adskillige vektorplasmider, som autonomt replikerer i et bredt udsnit af Gram-negative bakterier. Visse af dis-25 se er beskrevet af Tait, R.C., Close, T.J., Lundquist, R.C., Hagiya, M. , Rodriguez, R.L., og Kado, C.I., i Biotechnology, maj 1983, s.269-275; Panopoulos, N.J., i Genetic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers,

New York, New York, s.163-185 (1981) og Sakagucki, K., i 27 DK 172763 B1

Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 31-45 (1982), hvilke referencer specifikt inkorporeres heri ved disse henvisninger.

I en særlig foretrukken udførelsesform anvendes plasmidet 5 RSF1010 og derivater deraf som beskrevet af Bagdasarian, M., Bagdasarian, M.M., Coleman, S., og Timmis, R.N., i Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Timmis, K.N. og Puhler, A. (red.), Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), hvilken reference specifikt 10 inkorporeres heri ved denne henvisning. Fordelene ved RSF1010 er, at det er et relativt lille plasmid, der forekommer i højt kopital, og som let transformeres til og bevares stabilt i både E. coli og Pseudomonas-arter. I dette system foretrækkes det at anvende Tac-ekspressionssystemet 15 som beskrevet for Escherichia, eftersom E. coli trp-promo-toren synes at blive let genkendt af Pseudomonas RNA-polymerase som fremført af Sakagucki, K., i Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 31-45 (1982) og af Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H., og Hey-20 neker, H.L., i Biotechnology, Feb. 1984, 161-165, hvilke referencer specifikt inkorporeres heri ved denne henvisning. Transkriptionel aktivitet kan yderligere maksimeres ved at kræve udskiftning af promotoren med f.eks. en E. coli eller P. aeruginosa trp-promotor. Desuden vil også lacl-25 genet fra E. coli blive medtaget i plasmidet for at indvirke på reguleringen.

Translation kan kobles til translationsinitiering for hvilke som helst Pseudomonas-proteiner, så vel som til initieringssteder for et hvilket som helst af de højt udtrykte 30 proteiner af den type, der vælges til frembringelse af in-tracellulær ekspression af inhibitoren.

I de tilfælde, hvor restriktion-minus-stammer af Pseudomo-nas-værtsarter ikke er tilgængelige, er transformationsef-fektiviteten med plasmidkonstruktioner, der er isoleret fra 35 E. coli, dårlig. Derfor er det ønskeligt at føre Pseudomo- 28 DK 172763 B1 nas-kloningsvektoren gennem en r* m+ stanune af en anden art forud for transformation af den ønskede vært, som fremført af Bagdasarian, M. et al., Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, s. 411-422, Timmis og Puhler 5 (red.), Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), hvilke referencer specifikt inkorporeres heri ved denne henvisning.

(ii) eecJ.I

Endvidere omfatter et foretrukket ekspressionsystem i vær-10 ter af slægten Bacillus anvendelse af plasmid pUBHO som kloningsmediet. Som i andre værtsvektorsystemer er det muligt i Bacillus at udtrykke IL-li ifølge den foreliggende opfindelse som enten et intracellulært eller et secerneret protein. De foreliggende udførelsesformer omfatter begge 15 systemer. Færgevektorer, som replicerer i både Bacillus og E. coli er tilgængelige til konstruktion og undersøgelse af forskellige gener, som beskrevet af Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S., og Shivakumar, A.G., i Genetic Engineering, bd. 2, Setlow og Hollander (red.). Plenum Press, New 20 York, New York, s. 115-131 (1980), hvilken reference specifikt inkorporeres heri ved denne henvisning. Signalsekvensen for alfa-amylase er med henblik på ekspression og sekretion af IL-li fra fl. subtilis fortrinsvis koblet til det kodende område af proteinet. For syntese af intracellulær 25 inhibitor kobles den transportable DNA-sekvens translatio-nelt til ribosombindingsstedet for alfa-amylase-lederse-kvensen.

Transkription af hvilken som helst at disse konstruktioner styres fortrinsvis af alfa-amylase-promotoren eller et de-30 rivat deraf. Dette derivat indeholder RNA-polymerase-genkendelsessekvensen fra den native alfa-amylase-promotor, men inkorporerer desuden lac-operatorområdet. Lignende hybridpromotorer, der er konstrueret ud fra penicillinasegen-promotoren og lac-operatoren, har vist sig at fungere i fla-35 cillus-værter i en regulerbar form som anført af Yansura, 29 DK 172763 B1 D.G., og Henner i Genetics and Biotechnology of Bacilli, Ganesan, A.T., og Hoch, J.A., (red.) Academic Press, s.

249-263 (1984), hvilken reference specifikt inkorporeres heri ved denne henvisning, lacl-genet fra E. coli medtages 5 også i plasmidet for at indvirke på reguleringen.

(iii) Cl ostridium-vektorer

En foretrukken konstruktion for ekspression i Clostridium er i plasmid pJU12, beskrevet af Squires, C.H., et al., i J. Bacteriol. 159, 465-471 (1984), hvilken reference speci-10 fikt inkorporeres heri ved denne henvisning, hvilket plasmid overføres til C. perfringens ved metoden ifølge He-efner, D.L., et al., som beskrevet i J. Bacteriol. 159, 460-464 (1984), hvilken reference specifikt inkorporeres heri ved denne henvisning. Transkription styres af promoto-15 ren for tetracyclinresistensgenet. Translation kobles til Shine-Dalgarno-sekvenserne af dette samme tetr-gen på en måde, der er strengt analog til de ovenfor opridsede producerer for vektorer, der er egnede til brug i andre værter.

(iv) SærY-ektorei: 20 Bevaring af fremmed DNA, der er introduceret i gær, kan udføres på forskellige måder som beskrevet af Botstein, D., og Davis, R.W., i The Molecular Biology of the Yeast Sac-charomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathern, Jones og Broach (red. ), s. 607-636 (1982), hvilken reference 25 specifikt inkorporeres heri ved denne henvisning. Et foretrukket ekspressionssystem til brug med værtsorganismer af slægten Saccharomyces har IL-li-genet på 2 μη plasmidet. Fordelene ved 2 μιη cirklen omfatter relativt højt kopiantal og stabilitet, når den indføres i cir° stammer. Disse vek-30 torer inkorporerer fortrinsvis replikationsstartstedet og mindst en antibiotisk resistensmarkør fra pBR322 for at tillade replikation og selektion i E. coli. Endvidere indeholder plasmidet fortrinsvis 2 mikron sekvensen og gær-LEU2-genet for at tjene de samme formål i LEU2-defekte mu-35 tanter af gær.

30 DK 172763 B1

Hvis rekombinant-IL-l-inhibitorerne i sidste instans skal udtrykkes i gær, foretrækkes det, at kloningsvektoren først overføres til Escherichia coli, hvor vektoren får lov til at replikere, og hvorfra vektoren opnås og oprenses efter 5 ampiifikation. Vektoren overføres derefter til gær for endelig ekspression af IL-1 inhibitoren.

(c) Pattedyrceller cDNA'et fra IL-1 inhibitoren kan tjene som gen for ekspression af inhibitoren i pattedyrceller. Den skulle have en 10 sekvens, som vil være effektiv til at binde ribosomer, som det er beskrevet af Kozak i Nucleic Acids Research 15, 8125-8132 (1987), hvilken reference specifikt inkorporeres heri ved denne henvisning, og skulle have kodende kapacitet for en ledersekvens (se afsnit 3(a)(vi)) til at styre det 15 modne protein ud af cellen i en modnet form. DNA-restriktionsfragmentet, der bærer den fuldstændige cDNA-sekvens, kan indsættes i en ekspressionsvektor, som har en transkriptionel promotor og en transkriptionel enhancer, som beskrevet af Guarente, L., i Cell 52, 303-305 (1988) og 20 Kadonaga, J.T., et al. i Cell 51, 1079-1090 (1987), hvilke referencer begge specifikt inkorporeres heri ved denne henvisning. Promotoren kan være regulerbar som i plasmid pMSG (Pharmacia Cat. No. 27450601), hvis konstitutiv ekspression af inhibitoren er skadelig for cellevækst. Vektoren bør ha-25 ve et fuldstændigt polyadenyleringssignal som beskrevet af Ausubel, F.M., et al. i Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987), hvilken reference specifikt inkorporeres heri ved denne henvisning, således at mRNA'et, der transkriberes fra denne vektor, modnes korrekt. Vektoren 30 vil endelig have replikationsstartstedet og mindst en markør for antibiotisk resistens fra pBR322 for at tillade re-plikation og selektion i E. coli.

For at selektere en stabil cellelinie, som producerer IL-1 inhibitoren, kan ekspressionsvektoren bære genet for en se-35 lekterbar markør, såsom en resistensmarkør, eller bære et 31 DK 172763 B1 komplementært gen for en cellelinie, der har et krav, såsom dihydrofolatreduktase (dhfr) genet til transformation af en dhfr- cellelinie som beskrevet af Ausubel et al., se ovenfor. Alternativt kan et separat plasmid, der bærer en se-5 lekterbar markør, cotransformeres med ekspressionsvektoren.

4. Vartscelier/transformation

Den således opnåede vektor overføres til en passende værtscelle. Disse værtsceller kan være mikroorganismer eller pattedyrceller.

10 (a) Mikroorganismer.

Det antages, at der kan vælges en hvilken som helst mikroorganisme, der har evne til at optage exogent DNA og udtrykke disse gener og tilknyttede operationelle elementer.

Efter at en værtsorganisme er blevet udvalgt, overføres 15 vektoren til værtsorganismen under anvendelse af fremgangsmåder, som er velkendte for en fagmand. Eksempler på sådanne fremgangsmåder kan findes i Advanced Bacterial Genetics af R.w.Davis et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980), hvilken reference specifikt inkor-20 poreres heri ved denne henvisning. Det foretrækkes i én udførelsesform at transformationen foregår ved lave temperaturer, eftersom temperaturreguleringen er påtænkt som et middel til regulering af genekspressionen ved anvendelsen af operationelle elementer som ovenfor omtalt. I en anden 25 udførelsesform vil der, for at sikre passende styring af de fremmede gener, kræves regulering af saltkoncentrationerne under transformationen, hvis osmolære regulatorer er blevet indsat i vektoren.

Det foretrækkes, at værtsmikroorganismen er fakultativt 30 anaerob eller aerob. Særlige værter, som kan være at foretrække til anvendelse i denne fremgangsmåde, omfatter gær og bakterier. Specifikke gærarter omfatter arter af slægten Saccharomyces, navnlig Saccharomyces cerevisiae. Speficikke bakterier omfatter arter af slægterne Bacillus, Escherichia 32 DK 172763 B1 og Pseudomonas, navnlig Bacillus subtilis og Escherichia col i. Yderligere værtsceller er noteret i tabel I, ovenfor.

(b) Pattedyrceller

Vektoren kan indføres i pattedyreeller i kultur ved adskil-5 lige metoder, såsom calciumphosphat:DNA-copræcipitering, elektroporation eller protoplastfusion. Den foretrukne metode er copræcipitation med calciumphosphat som beskrevet af Ausubel et al., se ovenfor.

Der eksisterer mange stabile celletyper, som lader sig 10 transformere og som er i stand til at transkribere og translatere cDNA-sekvensen, modne IL-li-forstadiet og secernere det modne protein. Celletyper kan imidlertid være variable med hensyn til eventuel glycosylering af secernerede proteiner og post-translationel modifikation af amino-15 syreresterne. De ideelle celletyper er de, der producerer en rekombinant-IL-1 -inhibitor, som er identisk med det naturlige molekyle.

5. Dyrkning af manipulerede celler Værtscellerne dyrkes under betingelser, som er hensigtsmæs-20 sige for ekspression af IL-1 inhibitoren. Disse betingelser er generelt specifikke for værtscellen og bestemmes let af en fagmand i lyset af den publicerede litteratur vedrørende vækstbeingelserne for sådanne celler og belæringerne heri.

F.eks. findes information om dyrkningsbetingelser for bak-25 terier i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udg. , Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, hvilken reference specifikt inkorporeres heri ved denne henvisning. Lignende information vedrørende dyrkning af gær og pattedyrceller kan fås fra Pollack, R., Mammalian Cell 30 Culture, Cold Spring Habor Laboratories (1975), hvilken reference specifikt inkorporeres heri ved denne henvisning.

De nødvendige betingelser for regulering af ekspressionen af DNA-sekvensen, der afhænger af de operationelle elemen- 33 DK 172763 B1 ter, aom er indsat i eller til stede i vektoren, vil være virksomme i transformations- og dyrkningsstadierne. I én udførelsesform dyrkes celler til høj tæthed under tilstedeværelse af hensigtsmæssige reguleringsbetingelser, som hæm-5 mer ekspressionen af DNA-sekvensen. Når optimal celletæthed nærmer sig, ændres miljøbetingelserne til sådanne, som er hensigtsmæssige for ekspression af DNAsekvensen. Det skal således forstås, at produktionen af IL1 inhibitor vil ske i en tidsperiode, der følger efter væksten af værtscellerne 10 til nær optimal tæthed, og at den resulterende IL-1 inhibitor høstes nogen tid efter, at de regulatoriske betingelser, som er nødvendige for dens ekspression, blev induceret .

6. Oprensning 15 (a) IL-1 produceret fra mikroorganismer I en foretrukken udførelsesform ifølge den foreliggende opfindelse oprensedes den rekombinante IL-1 inhibitor efter høst og før dens antagelse af aktiv struktur. Denne udførelsesform foretrækkes, eftersom opfinderne antager, at 20 indvinding af et højt udbytte af gen-foldet protein lettes, hvis proteinet først er oprenset. I en foretrukken, alternativ udførelsesform kan IL-1 inhibitoren imidlertid tillades at foldes påny for at antage dens aktive struktur forud for oprensning. I endnu en anden foretrukken, 25 alternativ udførelsesform er IL-1 inhibitoren til stede i dens genfoldede, aktive tilstand efter indvinding fra dyrkningsmediet .

Under visse omstændigheder vil IL-1 inhibitoren indtage dens korrekte, aktive struktur efter ekspression i værtsmi-30 kroorganismen og transport af proteinet gennem cellevæggen eller membranen eller til det periplasmatiske rum. Dette vil generelt ske, hvis DNA, der koder for en hensigtsmæssig ledersekvens, er blevet koblet til det DNA, der koder for de rekombinerede protein. Hvis IL-1 inhibitoren ikke indta- 34 DK 172763 B1 ger dens korrekte, aktive struktur, vil enhver disulfidbin-ding, som er blevet dannet og/eller enhver ikkecovalent interaktion, som er foregået, først blive ødelagt ved denaturering og af reducerende midler, f.eks. guanidiniumchlgrid 5 og beta-mercaptoethanol, før IL-1 inhibitoren tillade?, af indtage dens aktive struktur efterfulgt af fortynding og oxidation af disse midler under kontrollerede betingelser.

Til oprensning forud for og efter genfoldning anvendes nogle kombinationer af de efterfølgende trin fortrinsvis: ani-10 onbytningskromatografi (MonoQ eller DEAE-Sepharose), gel-filtreringskromatografi (superose), chromatofokusering (MonoP) og hydrofob interaktionskromatografi (octyl- eller phenyl-Sepharose). Af særlig værdi or antistofaffinitets-kromatografi under anvendelse af IL-li-specifikke monoklo-15 nåle antistoffer (beskrevet i eksempel 3).

(b) IL-li produceret fra pattedyrceller IL-li produceret fra pattedyrceller kan oprenses fra konditioneret medium ved trin, som vil omfatte ionbytningskromatografi og immunoaffinitetskromatografi under anvendelse af 20 monoklonale antistoffer beskrevet i eksempel 3. Det vil være åbenbart for en fagmand, at forskellige modifikationer og variationer kan udføres i processerne og produkterne ifølge den foreliggende opfindelse. Det tilsigtes således, at den foreliggende opfindelse dækker modifikationer og va-25 riationer af opfindelsen, forudsat at de falder inden for omfanget af de tilhørende krav og hvad der svarer til disse.

Det skal forstås, at anvendelse af læren ifølge den foreliggende opfindelse overfor et specifikt problem eller mil-30 jø vil være inden for en fagmands muligheder i lyset af de heri givne anvisninger. Eksempler på produkter ifølge den foreliggende opfindelse og repræsentative fremgangsmåder til deres isolering og fremstilling gives i det følgende.

35 DK 172763 B1

De efterfølgende eksempler illustrerer forskellige for tiden foretrukne udførelsesformer af den foreliggende opfindelse. De i disse eksempler refererede publikationer inkorporeres specifikt ved disse henvisninger.

5 EKSEMPLER

Eksempel 1

Proteinfremstilling A. Materialer

Hank's balancerede saltopløsning (HBS) og RPMI blev købt 10 fra Mediatech, Washington, D.C. Lymphoprep blev opnået fra Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, N.Y. Human IgG, MTT, kanin-antiserum mod prostaglandin E 21 ammo-niumbicarbonat, dithiothreitol, fuldstændig og ufuldstændig Freund's adjuvanter, hypoxanthin, aroinopterin og thymidin 15 blev indkøbt fra Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. C3H/HeJ-mus blev købt fra Jackson Labs, Bar Harbor, Maine. BALB/c-mus og P3-myelomaceller blev opnået fra dr. John Kappier og dr. Phillippa Marrack ved National Jewish Center for Immunology and Respiratory Medicine (NJC/IRM), Denver, 20 Colorado. Rekombinant human IL-1 blev opnået fra Cistron Biotechnology, Pine Brook, N.J. Oprenset fytohæmagglutinin blev købt fra Wellcome Diagnostics, Research Triangle Park, N.C. Human forhudfibroblaster fra primærkulturer blev opnået fra dr. Richard Clark ved NJC/IRM, Denver, Colorado. Mo-25 noklonale museantistoffer mod kanin IgG blev købt fra AIA Reagents, Aurora, Colorado. Lavt-methionin-RPMI blev fremstillet under anvendelse af et "Seleet-Amine kit" fra GIBCO Laboratories, Grand Island, N.Y. [^S] -methionin, dipheny-loxazol og [*^C]-iodeddikesyre blev opnået fra DuPont-NEN, 30 Chicago, Illinois. Føtal kalveserum blev købt fra HyClone Laboratories, Logan, Utah. Mono-Q- og Superose-12-søjler blev købt fra Pharmacia Inc., Piscataway, N.J. C4-reversfasesøjler blev opnået fra Synchrom Inc., Lafayette, Indiana. C8-reversfasesøjler blev opnået fra Applied Biosy 36 DK 172763 B1 stems Inc., Foster City, California. Acetonitril og poly-ethylenglycol 8000 blev købt fra J.T.Baker Chemical Co., Fhillipsburg, N.J. Trifluoreddikesyre og quanidinhydrochlo-rid blev opnået fra Pierce Chemicals, Rockford, Illinois.

5 Endoproteinase Lys C blev opnået fra Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana. Mikrotitreringsplader-ne til brug for PGE 2 ELISA var "Nunc-Immuno Plate I" opnået fra Intermountain Scienti~ fic Corporation, Bountiful,

Utah. Pladerne, der blev anvendt til hybridomaproduktion 10 var fra Costar, Cambridge, Massachusetts.

B. Fremstilling af monocvt IL-1 inhibitor

Humane leukocytter blev opnået fra normale donorer ved leu-koforese, blev resuspenderet i Hank's balancerede saltopløsning (HBSS) med 1 del pakkede celler til 1 del HBSS med 15 underlag af Lymphoprep og blev centrifugeret ved 400 x g i 30 minutter ved stuetemperatur. Den mononukleære fraktion blev udtaget (typisk opnåedes 4-5 x 10 9 celler pr. donor), vasket i HBSS uden Ca++ eller Mg++, suspenderet i serumfrit RPMI og udsået på petriskåle, der var belagt med normalt, 20 humant IgG, hvorfra LPS var fjernet ved kromatografi over Sephadex G200 (6 x 10 7 celler i 10 ml pr. 100 mm skål).

Alle reagenser indeholder mindre end 10 pg/ml LPS. Cellerne blev dyrket 24-48 timer og det resulterende konditionerede medium udgjorde den rå IL-1 inhibitorsupernatant (IL-li-25 supernatant). Typisk gav cellerne fra én donor et udnytte på 700-900 ml rå IL-li supenatant.

C. Analyser for IL-1 inhibitoren

To IL-1 analyser er blevet anvendt rutinemæssigt til påvisning af IL-li. Thymocytter (1 x 10 6 celler fra 4-6 uger 30 gamle C3H/HeJ-mus) reagerede på 1,0 enheder/ml rekombinant human-IL-1 plus 1 mikrogram/ml fytohæmagglutinin ved at proliferere halvt-maksimalt, målt ved 3 H-thymidin-inkorporering eller optagelse af tetrazoliumsaltet MTT (Mosmann, T. , J. Immunol. Methods 65, 55-61 ( 1983)) efter 3 35 dages stimulering. Rå IL-li supernatant hæmmer fuldstændig 37 DK 172763 B1 denne proliferative reaktion ved 1/10 fortynding. Humane hudfibroblaster (1 x 10 5 celler pr. brønd i en plade med 96 brønde) reagerede typisk overfor 0,5 enheder/ml rekombi-nant, human IL-1 ved efter 6 timers stimulering at udskille 5 ca. 50 000 pg/ml PGE 21 som kan måles ved ELISA. Denne analyse er lige så følsom overfor IL-li som thymocytanalysen.

D. Metabolisk mærkning af IL-1 inhibitoren IL-li blev mærket metabolisk ved at dyrke de mononukleære leukocytter i 48 timer på IgG-belagte plader (som beskrevet 10 i B) i serumfri RPMI, der kun indeholdt 0,75 mikrogram/ml kold methionin (15 mikrogram/ml er normal), og til hvilke der var tilsat 0,5 mCi ^^S-methionin (1151 Ci/mmol) pr. 107 celler. Kontrolmærkning blev udført på identisk måde med undtagelse af, at pladerne blev belagt med føtal kalveserum 15 i stedet for IgG. Prøver med sådanne kontrolsupernatanter viste, at meget lidt IL-li blev udskilt, når cellerne blev dyrket på plader belagt med føtal kalveserum.

E. Oprensning af IL-1 inhibitorproteinet Rå IL-li supernatanter blev indstillet til 1,0 M natri-20 umchlorid, blev inkuberet på is i 1 time og centrifugeret ved 10.000 rpm i 15 minutter. Supernatanterne, som indeholdt hele inhibitoraktiviteten men kun 20% af det initiel-le protein, blev derefter dialyseret indgående ved 40C mod 0,025 M Tris, pH 7,6, der indeholdt 0,1% sucrose 25 (Abufferen) til gradientfraktionering af proteiner på en Mono-Q-anionbytningssøjle. Efter dialyse blev de inhibitor-holdige opløsninger igen centrifugeret ved 10 000 rpm i 15 minutter og derefter ført gennem 0,22 mikron nylonfiltre. Supernatanterne blev typisk hældt sammen med 10 ml superna-30 tant, der var fremstillet på lignende måde efter metabolisk mærkning, og blev sat på Mono Q-Superose (Pharmacia FPLC)-søjler med lejevoluminer på enten 1,0 ml eller 8,0 ml, blev vasket med A-buffer indtil OD 280 af afløbet gik tilbage til basislinien og blev omhyggeligt kromatograferet under 35 anvendelse af en liniær natriumchloridgradient (0,025 M til 38 DK 172763 B1 0,10 M) i puffer A. Søjlefraktioner blev opsamlet og analyseret for radioaktivitet og bioaktivitet. Prøver af hver fraktion blev også underkastet elektroforese på reduceret 12,5% SDS-PAGE, blev farvet med sølv, blev gennemvædet med 5 diphenyloxazol, blev tørret og lagt på film til opnåelse af autoradiografiske data. Figur la viser proteinprofilen efter Mono Q kromatografi af 40 ml rå IL-li supernatant blandet med 3 ml metabolisk mærket ILli supernatant. Overlejret vises radioaktivitetsmængden, som er fundet i 50 mikroliter 10 af hver fraktion, såvel som IL-li bioaktiviteten målt i PGE2-produktionsanalysen. To mere radioaktive og en mindre radioaktiv form vises, som perfekt korrelerer med tre toppe af bioaktivitet. Figur lb viser den tilsvarende kromatografi af 15 ml rå IL-li supernatant blandet med 3 ml superna-15 tant fra monocytter, der er metabolisk mærkede på plader, der er belagt med føtal kalveserum (FCS) i stedet for JgG. Niveauerne af de tre ovenfor omtalte radioaktive former er markant formindsket. Figur 2a viser sølvfarvede geler, som er kørt på fraktionerne fra områderne af interesse i kroma-20 tografierne, som er vist i figur la og lb. Bemærk, at fraktionerne af topradioaktivitet og -bioaktivitet i figur la (fraktioner 52 og 59) begge viser et større bånd ved 22 kD (markeret med pile) på SDS-PAGE. Den tredie form (fraktion 48 i figur la) viser et band ved 20 kD på SDS-PAGE. Gelfil-25 treringseksperimenter på rå IL-li har vist, at det aktive molekyle har en molekylvægt på 18-25 kD. Figur 2b er et autoradiogram af gelerne, som er vist i figur 2a. Det kan let ses, at proteinbåndene ved 20 og 22 kD er de vigtigste radioaktive former i disse fraktioner.

30 Opsummering af disse resultater viser, at den metaboliske mærkning af monocytter, der er udsået på petriskåle, som er belagt med IgG, resulterer i radioaktive former, som kun dannes dårligt, hvis cellerne udsås på skåle, der er belagt med FCS. Disse inducerede radioaktive former co-35 kromatograferer perfekt på Mono Q med adskillige former med IL-li bioaktivitet, og geler og resulterende autoradiogram- 39 DK 172763 B1 mer viser, at de tre vigtigste inducerede molekyler er proteiner med den for IL-li forudsagte molekylvægt.

IL-li-molekylerne blev yderligere oprenset til sekvensbestemmelse på to måder. Først blev Mono-Q-fraktionerne med 5 topbioaktivitet og -radioaktivitet sat på en C4-reversfasesøjle og elueret med en H20/0,l% TFA x acetoni-tril/0,1% TFA gradient. Eftersom IL-li-molekylet var radioaktivt mærket, blev prøverne fra hver fraktion direkte talt for radioaktivitet og blev også analyseret ved SDS-PAGE ef-10 terfulgt af autoradiografi. Figur 3a viser et sådant kroma-togram med overlejret radioaktivt mønster. De sølvfarvede geler køres på prøver fra hver fraktion (figur 3b) og efterfølgende autoradiogrammer af gelerne (figur 3c) viser, at IL-li-molekylet findes i fraktionerne 32-36. Disse frak-15 tioner blev tørret og sekvensbestemt. Alternativt blev Mono-Q topfraktioner tørret med Speed Vac, blev resuspenderet i 0,4 ml 0,05M NH4HCO3 og blev direkte kromatograferet to gange på en 10 x 300 mm Sepharose 12 gelfiltreringssøjle (Pharmacia FPLC), der var ækvilibreret i den samme puffer, 20 som vist i fig. 4a og 4b. Fraktioner blev opsamlet, og prø ver af hver fraktion blev undersøgt for radioaktivitet og bioaktivitet og blev analyseret ved sølvfarvning og autora-diografering efter SDS-PAGE. Passende fraktioner blev derefter tørret på en Speed Vac og sekvensbestemt.

25 Eksempel 2

Foreslået sekvensbestemmelse af IL-li-inhibitoren

Forud for sekvensbestemmelse blev prøverne opløst i 6 M gu-anidin-HCl, pH 8,6, blev reduceret i 4 timer ved 37 °C under N2 med 100 gange molært overskud af dithiothreitol i f 30 orhold til protein og blev alkyleret i 1 time med 400 gan ges overskud af ^C-iodeddikesyre. I dette tilfælde blev reaktionsblandingerne afsaltet på en C8-reversfasesøjle, blev elueret og delvis tørret. N-terminale sekvenser bestemmes under anvendelse af en Applied Biosystems Protein 35 Sequencer. Til opnåelse af indre sekvenser kan prøver, som 40 DK 172763 B1 kan være blevet reduceret og alkyleret, nedbrydes med cyan-bromid eller proteolytiske enzymer under anvendelse af fremgangsmåder, der er kendte for en fagmand. Reaktionsprodukter tørres, opløses i 0,1% TFA/H2O, og peptider separe-5 res under anvendelse af en CB-reversfasesøjle.

Eksempel 3

Oprensning og sekvensbestemmelse af arterne af IL-1 inhibitorer.

A. IL-li-X. IL-li-a og IL-li-b former 10 Mono Q oprensningen af IL-li opløser den biologiske aktivitet i 3 hovedformer som vist i figur la og beskrevet i eksempel 1, hvor topfraktionerne for denne aktivitet er 48, 52 og 59. SDS-PAGE på prøver af disse fraktioner, som vist i figur 2a, viser relevante former ved henholdsvis 20 kD, 15 22 kD og 22 kD. Western analyse af sådanne geler under an vendelse af muse-antisera, som omtalt i eksempel 4 nedenfor, farver alle tre former. Når IL-li er fra celler, der

•3 C

er metabolisk mærket med S-methionin under vækst på plader belagt med IgG, er hver af disse bånd radioaktive (som 20 vist i fig. 2b, autoradiogrammet af den ovenfor nævnte gel). Baseret på argumenterne som er nævnt i eksempel 1, nemlig at celler i parallelle forsøg, hvor cellerne er inkuberet på en ikke-inducerende måde, ikke producerer IL-li-bioaktivitet og ikke producerer disse radioaktive bånd, kan 25 vi konkludere, at disse 3 former forklarer den biologiske aktivitet. Vi har foreløbigt navngivet disse prøver henholdsvis IL-li-X, IL-li-a og IL-li-b.

B. Oprensning og sekvensbestemmelse af IL-li-X

Mono-Q-fraktioner, der indeholder IL-li-X og/eller IL-li-a, 30 blev yderligere oprenset ved reversfase-HPLC-kromatografi på en Synchropak RP-4 (C4) søjle, og radioaktive former blev sekvensanalyseret. Talrige forsøg på direkte sekvensbestemmelse af RP-HPLC-oprenset IL-li-a og IL-li-b er mis 41 DK 172763 B1 lykkedes, hvilket tyder på, at de er kemisk blokeret i deres N-terminale ende. En præparation af IL-li-a (IL-li-aB2p42) gav imidlertid følgende sekvens: 5 15 10 15 20

BPSGRKSSKMQAF_I£DVNQ

og efterfølgende præparationer af IL-li-X, der på tilsvarende måde er oprenset ved C4-RP-HPLC, har givet den samme 10 sekvens: 15 10 15 20

PrepKxF24 _________MQAF_ IE_VN_K_F

PrepKxF2 3 £ P__RK_LKMQAF_I

Disse er åbenbart en del af den sekvens, der blev fundet i 15 det første forsøg på at sekvensbestemme IL-li-a. Det er opfindernes konklusion, at de viste sekvensdata er N-terminus af det 20 kD molekyle, som blev kaldt IL-li-X.

I denne og alle efterfølgende sekvenser viser en understreget position enten en manglende evne til at identificere en 20 aminosyrerest, eller at der forekommer usikkerhed med hensyn til identifikation af aminosyreresten. Når to eller flere aminosyrerester anbringes I samme position, viser det, at mere end en aminosyre blev påvist ved dette sekvenseringstrin, og den rest, der mest sandsynligt er den kor-25 rekte, er øverst.

C. Frembringelse, oprensning oa sekvensbestemmelse af. eeBr. tider af IL-li-a oa IL-li-b.

Eftersom IL-li-a og IL-li-b tilsyneladende er kemisk blokerede i deres N-terminale ende blev peptider af hver type 30 frembragt ved endoproteinase-fordøjelse. Specielt blev Mono Q fraktioner, der indeholder enten IL-li-a eller ILli-b ført gennem en 4,6 x 250 mm C3-RP-HPLC-søjle (Zorbax Prote- 42 DK 172763 B1 in Plus), hvilket er et acceptabelt alternativ til C4søjlerne, som blev anvendt i alle de tidligere nævnte eksempler. Meget jævne gradienter (0,2% acetonitril pr. minut ved 0,5 ml/min) opløste IL-li-a (figur 8a, b) eller iL-li-b 5 (figur ga) fra den vigtigste radioaktive forurenende form, human-lysozym. Identiteten af de oprensede former blev bekræftet ved tilstedeværelsen af et enkelt radioaktivt 22 kD protein ved SDS-PAGE og efterfølgende autoradiogrammer (figurer Bc, d og gb). Proteinerne blev opsamlet med hånden 10 i siliconebehandlede glasrør og til hver tilsattes 25 ml af en 0,2% Tween-20 opløsning. De IL-li-holdige fraktioner blev derefter volumenreduceret på en Speed-Vac til 50 mi-kroliter, blev bragt op til 300 mikroliter ved tilsætning af 1% NH4HCO3 efterfulgt af tilsætningen af 1 mg endoprote-15 inase. I tilfældet med IL-li-a var det anvendte enzym End-oproteinase Lys C (Boehringer-Mannheim), medens IL-li-b blev spaltet med Endoproteinase Asp N (Boehringer-Mannheim) . Spaltning blev udført ved 37 °C i 16 timer og reaktionsblandingens volumen blev derefter reduceret til 50 20 ml på en Speed Vac.

I tilfældet med Il-li-a blev prøven kromatograferet direkte, medens IL-li-b prøven først blev reduceret ved tilsætning af 5 ml af 50 mM dithiothreitol i 2 M Tris, pH 8,0 omsat i 30 minutter ved 37 °C og derefter carboxymethyleret 25 ved tilsætning af 1,1 mikromol 3 H-iodeddikesyre i 10 ml ethanol (omsat i 30 minutter ved 37 °C i mørke).

Separationen af peptiderne blev udført på en 2,1 x 250 mm Brownlee Aquapore RP-300 (C8) søjle med lille rørvidde ved en strømhastighed på 100 mikroliter/min under anvendelse af 30 en Beckman HPLC udstyret med "microrørvidde hardware" og "mikrorørvidde"-kompatible pumper. En 200 min. 0-100% lini-ær gradient blev anvendt (H 2 0/0,1% TFA til acetoni- tril/0,1% TFA). Peptidseparationerne er vist i figur 10 og 11. Den opnåede sekvens information er som følger:

RaLysC-41 43 DK 172763 B1 15 10 MQAF_I_DVNQ£

RaLysC-53 5 1 5 10 15 20 25

K P

_FYL_NNQLVA_YLQGPNVNLEEQIDN_H R(xLysC-61 1 5

10 I Y

_FAT1RBH

RaLysC-31 1 5

F Y F Q E D

15 RaLysC-37 15 10 15 20

V N

G E S X T S

_QDET_LQLE AHR2£QL£Efi 20 RaLysC-35 15 10 15 20

___ETfiLQLEAV_ITDLLEN

RPAspN-51 15 10 15 20 25

25 Q K T F L G

dvneieey&rnnqlvasylqgpnvnl RPAspN-43 1 5 10

DEGVMVTKFYFQ

30 RPAspN-39 15 10 15

K

_PSGRKS£EMQAFR1!) 44 DK 172763 B1 ΗβΑ8ρΝ-25 1 5

DKRFAFIR

ΗβΑ8ρΝ-30 5 15 10

S L Q

D_£VHHLKK1S.

To af peptidsekvenserne er tydeligvis beslægtet med den, 10 som blev opnået tidligere fra IL-li-X. En af disse, RaLysC-41, er en IL-li-a sekvens, og den anden, RPAspN-51, er en IL-li-b sekvens, hvilket er argument for, at de tre former af IL-li i det mindste er tæt beslægtede proteiner, om ikke kemisk og/eller fysisk modificerede former af et enkelt op-15 rindeligt IL-li molekyle. Hvis de noterede sekvenser kombineres får man følgende sammensatte sekvenser som resultat: I.......AeLytC.il.......i i......................AeLvtCJJ......................

i..................I I.....................UMtf.U......................

i..............ILUUpfci...............]

|i JCIU 5KHQ»r»IS0«lt(}ltTrUIIIIIQlVAiYLQCH(VHUlSl0..S

I -MLysC-11-1

I.......UAtpN.4).......I

oicvKvurnqiD

I..............IULytC-35.17.............|

K

S

c ICC

BQDCTILQLEaV&QTDLLIII

I----ULy»C-*1-.-.| I---MAJ**· 25---1 o k t r a π i ui 45 DK 172763 B1

Disse sammensatte sekvenser ser ikke ud til at være til stede i andre kendte polypeptider, der er opregnet i den senest opdaterede Protein Identification Resource Database (PIR 16,0). Opfinderne tror, at disse sekvenser eller min-5 dre varianter deraf, repræsenterer en klasse af molekyler, som er i stand til at virke som IL-1 inhibitorer.

Eksempel 4

Fremstilling af antistoffer, der er specifikke for IL-1 inhibitoren 10 10 uger gamle BALB/c-mus blev injiceret subkutant med ILli, som var delvis oprenset (400 gange) fra rå supernatanter ved Mono Q-kromatografi, dialyseret mod PBS og emulgeret med fuldstændig Freunds adjuvans. Hver mus modtog IL-li, der var oprenset fra 5 ml rå supernatant. Musene fik en 15 boosterinjektion hver 2. uge med en ækvivalent mængde af IL-li, der var emulgeret med ufuldstændig Freunds adjuvans, og serumprøver blev samlet fra halerne 7 dage efter hver boosterinjektion. Antisera blev undersøgt for anti-lL-li aktivitet ved Western-analyse af transblot af iromunoge-20 net, der var kørt på SDS-PAGE, som vist i fig. 5a. Figur 5b viser, at alle musene dannede anti~lL-liantistoffer efter 3 injektioner med IL-li.

Eftersom monoklonale antistoffer vil være af stor værdi ved kloning af IL-li-genet fra et ekspressionsbibliotek, ved 25 oprensning af rekombinant IL-li-protein og ved undersøgelse af molekylets biologi påbegyndte vi fremstillingen af en samling af monoklonale antistoffer, der er specifikke for IL-li. Til fremstilling af B-cellehybridomaer blev de ovennævnte mus Injiceret intravenøst med samme mængde af IL-li 30 i salinopløsning 24 timer forud for fjernelse af milten. Splenocytter blev kradset ud af miltene i kold, balanceret saltopløsning (BSS), blev vasket 2 gange med BSS, blev n blandet med P3-myelomaceller i et forhold på 2 x 10 P3-

Q

celler pr. 10 milt-B-celler og blev centrifugeret ned.

35 Cellerne blev fusioneret ved dråbevis tilsætning af 1 ml 46 DK 172763 B1 varm, gasset (5% CO2) PEG 6000 (40% polyethylenglycol 6000 : 60% minimal-essentielmedium) til den tørre pellet. Fusionerede celler blev vasket med BSS og resuspenderet i 10 ml rigt medium (10% FBS), der indeholdt 2 x 105 peritonealcel-5 ler pr. ml, og pelleten blev forsigtigt brudt op under anvendelse af en 10 ml pipette. Volumeinet blev justeret til 20 ml ved tilsætning af flere peritonealceller i mediet, og cellerne blev udsået i plader med 96 brønde med 0,1 ml/brønd. Pladerne blev placeret i en gasinkubator og der-10 efter behandlet på følgende måde:

Dag 1 - Der tilsættes 3 x HAT (hypoxanthin, aminopterin, thymidin) i rigt medium til en slutkoncentration på 1 x

Dag 5 - mediet skiftes og erstattes med 200 mikroliter 1 x HAT i rigt medium.

15 Dag 10 - Kontrol for hybridvækst påbegyndes. Mediet skiftes og erstattes med 200 mikroliter 1 x HAT i rigt medium, der indeholder 1,5 x 10® peritonealceller pr. ml.

Når hybridceller er næsten sammenløbende i en brønd overføres supernatanterne til testning, og cellerne afskrabes 20 forsigtigt med en pipettespids og overføres til 1 ml dyrkningsbeholdere, der indeholder 1 x HAT i rigt medium plus 3 x 10® peritonealceller pr. ml.

Supernatanterne fra brønde med næsten sammenløbende celler blev undersøgt for anti-IL-li-aktivitet under anvendelse af 25 ELISA, hvor delvis oprenset IL-Ii (Mono-Q-oprenset materiale, identisk til det, der blev injiceret i musene) er bundet til mikrotiterbrøndene. Normal musesera og hyperimmun-antisera blev anvendt som henholdsvis de negative og positive kontroller. Positive supernatanter vil blive undersøgt 30 igen ved ELISA på plader, der er belagt med homogent oprenset il-li og ved immunopræcipitering af oprenset, metabolisk mærket IL-li. Positive celler vil derefter blive klonet ved begrænset fortynding og injiceret i pristanbehand-lede mus til dannelse af ascites. Store mængder af IL-li- 47 DK 172763 B1 specifikke antistoffer kan fremstilles af vævskultur eller ved massiv dannelse og opsamling af ascitesvæske i mus. Oprensning af disse antistoffer og tilhæftning af disse til uopløselige kugler vil frembringe affinitetsadsorbanser til 5 brug ved oprensning af det rekombinerede IL-li protein.

Eksempel 5

Kloning af IL-ll cDNA

Det blev vist, at monocytter, der var udsået på IgG-belagte petriskåle og dyrket i 24 timer under tilstedeværelse af 10 [^S]-methionin, producerede [^S]-IL-Ii, som kunne identi ficeres ved dets kromatografiske egenskaber på Mono Q.

For at bestemme, hvornår (i løbet af den 24 timer lange periode) IL-li var blevet produceret med maksimal hastighed,

7C

blev udpladede monocytter udsat for [S]-methionin 15 (pulsmærket) i en kort, 2-timers periode, på hvilket tidspunkt et stort overskud af umærket methionin blev tilsat og inkuberet i yderligere 2 timer. Mediet blev derefter opsamlet og analyseret for radioaktivt mærket IL-li. Denne procedure blev anvendt over for monocytter på forskellige 20 tidspunkter efter udpladning af IgG-belagte plader, og det blev fundet, at udsættelse af monocytter for (^SJ-methionin 15 timer efter udpladning producerede den maksimale mængde af [^^S]-IL-li, hvilket indikerer, at IL-li mRNA i monocytter havde dets maksimale niveau 15 timer ef-25 ter udpladning på IgG.

Friske monocytter blev derefter udsået på LPS-frit IgG som i eksempel IB. Efter inkubering i RPMI-medium i 15 timer ved 37 °C blev cellerne vasket med phosphatpufret salin, derefter lyseret med 4M guanidinium-thiocyanat; 25 mM na-30 trium-citrat, pH 7, 0,5% sarcosyl, 0,1M 2-mercaptoethanol.

Total RNA blev derefter isoleret fra dette lysat ved AGPC-metoden ifølge P. Chromczynski og N. Sacchi, som beskrevet i Analytical Biochemistry 162, 156-159 (1987).

48 DK 172763 B1

Poly A+ RNA blev isoleret ved oligo-dT-cellulosekromato-grafi ved fremgangsmåden ifølge Aviv, H. , og Leder, P.,

Proc. Natl. Acad. Sci USA 69, 1408-1412 (1972), udfældet med ethanol og opløst til en koncentration på 0,36 pg/μΐ. 1 5 pg poly-A+-RNA blev anvendt til fremstilling af cDNA ifølge Gubier, U., og Hoffman, B.J., Gene 25, 263-269 (1983).

cDNA'et blev inkorporeret i et lambda gtll ekspressionsbibliotek under anvendelse af FcoRI-linkere fra Boehringer Mannheim katalog nr. 988448 eller New England Bio Lab nr.

10 1070 og ifølge instruktioner givet af disse producenter.

Det resulterende bibliotek, som indeholder 106 uafhængige kloner, blev screenet på E. coli Y1090 rk“ (Promega Biotec) med et passende polyklonalt antistof mod IL-li, som beskrevet tidligere under anvendelse af screeningsbetingelser, 15 som beskrevet af R.A.Young og R.W.Davis, PNAS beskrevet tidligere under anvendelse af screeningsbetingelser, som beskrevet af R.A.Young og R.W.Davis, PNAS 80, 1194-1198 (1983). Positive signaler vil kunne påvises under anvendelse af biotinyleret, sekundært antistof (såsom gede-IgG mod 20 mus, Bethesda Research Labs) efterfulgt af et streptavidin-alkalisk phosphatase-konjugat (Bethesda Research Labs) som beskrevet af Bayer, E.A. og Wilchek, M. i Methods in Biochemical Analyses (1979) og Guesdon, J.L., Ternynch, T. og Avrameas, S., J. Histochem. Cytochem. 27, 1131-1138 (1979) 25 og ifølge producenternes instruktioner.

Eksempel 6

Fremstilling oa sekvensbestemmelse af genet, der koder for IL- li cDNA, der var fremstillet som beskrevet i eksempel 5, blev 30 inkorporeret i den klonende vektor lambda GT10. Dette cDNA blev først methyleret under anvendelse af EcoRI-methylase med S-adenosylmethionin som substratet, EcoRI-linkere blev påhæftet i en ligeringsreaktion og overskud af linkere blev fjernet ved fordøjelse med EcoRI-endonuklease og kromato- 49 DK 172763 B1 grafi på en CL6B-spinsøjle. Der blev udført en ligeringsreaktion, der indeholdt 0,124 mikrogram linkerbehandlet, størrelsesselekteret cDNA og 1 mikrogram EcoRI-skåret og phosphatasebehandlet lambda GT10, og produkterne af denne 5 ligeringsreaktion blev pakket under anvendelse af GIGAPACK GOLD pakningsekstrakter (Stratagene). Dette gav som udbytte et bibliotek på 1 x 107 enheder.

For at screene dette GTlO-bibliotek blev oligonukleotid (antisense) prober syntetiseret baseret på protein- og pep-10 tidsekvensen, som blev vist i eksempel 3. Sekvenserne af proberne og af deres korresponderende peptidsekvenser er som følgers

Probe ILlil-3 TTq TAC GTq CGN AAq 5'

Lys Met Gin Ala Phe 15 Probe ILlil-4 ττ£ AA§ ATq AA§ Gt£ Ct£ CT 5'

Lys Phe Tyr Phe Gin Glu Asp

Probe ILlil-5 TAC CAN TGN TTq AAq ATq AA 5'

Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe

Probe ILlil-6 CTq CAN TTq GTq TTq TG 5' 20 Asp Val Asn Gin Lys Thr

Probe ILlil-7 TTq GTq TTq TGN AAq AT 5'

Asn Gin Lys Thr Phe Tyr

Note: N = A, G, C og T.

Probe nr. ILlil-3 blev *^P-phosphoryleret i dens 5'-ende og 25 anvendt til screening af 3 x 105 plaques fra biblioteket.

Proben hybridiserede reproducerbart til 3 plaques, og blandt disse viste en plaque sig også at hybridisere til probe nr. ILlil-4. Denne plaque, GT10-ILH-2A blev dyrket, og DNA'et blev isoleret under anvendelse af Lambdasorb 30 (Promega) ifølge producentens instruktioner. GT10-IL11-2A er blevet deponeret hos American Type Culture Collection 50 DK 172763 B1 {ATCC) i Rockville, Maryland under accessionsnummer 40488.

DNA'et blev fordøjet med EcoRI, delt i 5 lige delmængder og underkastet elektroforese på en 1% agarosegel.

Efter elektroforese blev denne gel farvet med ethidiumbro-5 mid. Et fotografi af denne gel vises i figur 12a.

Banerne 6, 8, 10, 12 og 14 indeholder 5 delmængder fra Eco-Rl-fordøjelsen. Bane 5 indeholder en blanding af vildtype lambda DNA, der er skåret med Hindlll, og 0X17 4 RF DNA, skåret med Haelll (New England Biolabs), som er brugbare 10 som molekylvægtmarkører. Figur 12a viser, at GT10-ILli-2A indeholder et FcoRI-fragment, som er 1850 basepar langt.

For at demonstrere mere entydigt, at dette 1850 bp fragment bærer den kodende sekvens for IL-1 inhibitoren blev et Southern blot udført som følger. DNA-fragmenter i gelen, 15 som er vist i figur 12a, blev overført på nitrocellulose under anvendelse af standardmetoder. Nitrocellulosen blev derefter skåret længdevis i 5 strimler, således at hver strimmel indeholdt DNA fra banerne 6, 8, 10, 12 og 14.

Strimlerne blev hybridiseret individuelt til hver af de 5 20 oligonukleotidprober (se ovenfor), som var mærket i 5- •3 Π enden med P-phosphat. Oligonukleotidkoncentrationen var 1 pmol/ml, og hybridiseringstemperaturen var som følger.

Bane Probe Temperatur

6 ILlil-3 35 °C

25 8 ILlil-4 42 °C

10 ILlil-5 42 °C

12 ILlil-6 40 °C

14 ILlil-7 35 °C

Efter vask blev strimlerne passet sammen og klæbet til hin-30 anden for at gendanne det oprindelige nitrocelluloseark.

Dette blev autoradiograferet under tilstedeværelse af en intensitetsforøgende skærm ved -70 °C i 24 timer. Figur 12b er et fotografi af dette autoradiogram. Det tilvejebringer bevis for, at alle proberne hybridiserer specifikt til 1850 51 DK 172763 B1 bp fragmentet, hvilket beviser, at dette fragment bærer i alt væsentligt kodende sekvenser af IL-1 inhibitoren.

For at bestemme dets DNA-sekvens blev GT10-ILli-2A DNA fordøjet med EcoRI, underkastet elektroforese på en 1% agaro-5 segel og det 1850 bp store fragment blev isoleret. Dette fragment blev ligeret med EcoRI-fordøjet M13 mpl9 og transformeret i E. coli stamme JM109. Transformenter blev scree-net ved at søge efter dem, der manglede beta-galactosidaseaktivitet. Fem sådanne transformenter blev 10 isoleret, enkeltstrenget DNA blev fremstillet, og sekvensbestemmelse blev udført ifølge metoden af Sanger et al. DNA-sekvensen af 3 af transformanterne korresponderede med 3'-enden af mRNA'et, medens to transformanter tilvejebragte proteinkodende sekvens. I figur 13 vises DNA-sekvensen, som 15 blev opnået for det proteinkodende område af cDNA'et.

Figur 13 viser også den forudsagte aminosyresekvens. Amino-syresekvensen fra den første aminosyre alanin til den 29. aminosyre prolin og fra den 79. aminosyre isoleucin til slutningen er den hypotetiske aminosyresekvens. Den forud-20 sagte aminosyresekvens fra den 30. aminosyre prolin til den 78. aminosyre prolin stemmer overens med peptidsekvensen, som blev beskrevet i eksempel 3.

Eksempel 7

Sekvensbestemmelse af GT10-ILli-2A oa IL-li 25 En del af GT10-ILli-2A er blevet sekvensbestemt og vist i figur 14. DNA'et koder for et protein, som indeholder ami-nosyresekvenser, som er karakteristiske for IL-li (nukleotider 99-557). Det antages imidlertid, at der evt. sker adskillige modifikationer af dette protein før det ud-30 skilles til det extracellulose miljø. Disse modifikationer er måske eller måske ikke essentielle for, at proteinet har aktivitet som et IL-li.

52 DK 172763 B1 GT10-ILli-2A koder for mindst 32 aminosyrer N-terminalt (nukleotider 3-98) for den aminoterminale ende af den form for IL-li, som kendes som X. Det antages, at der blandt disse 32 aminosyrer er en sekretorisk ledersekvens, som 5 starter ved M, der kodes af nukleotider 24-26, styrer det native IL-11 til, det extracellulære miljø og som derefter fjernes af lederpeptidasen og muligvis andre peptidaser.

Det er for nærværende ukendt i hvilket omfang denne sekvens fjernes i alfa- og betaform af IL-li, men den N-terminale 10 ende af disse former antages at være tæt ved den N-terminale ende af formen X. Fjernelse af den sekretoriske ledersekvens er sandsynligvis nødvendig for at proteinet kan få en effektiv IL-li-aktivitet.

Nucleotiderne 349-351 af GT10-ILli-2A koder for en N-rest, 15 som er en del af et concensus-N-glykosyleringssted. På basis af deres følsomhed overfor fordøjelse med N-glycanase antages det, at alfa- og betaformerne af IL-li er glykosy-lerede. Eftersom form X ikke antages at være følsom overfor fordøjelse med dette enzym antages det, at det ikke er gly-20 kosyleret, skønt dette forbliver en mulighed, som let ville kunne demonstreres af en fagmand inden for fagområdet for sekvensbestemmelse af proteiner under anvendelse af den her givne information. Det antages, at glykosylering ved denne N-rest ikke er nødvendig for at proteinet kan vise effektiv 25 IL-li aktivitet.

Nukleotiderne 99-101 af GTlO-ILli-2A koder for et P (se figur 15), men intet P er blevet påvist ved denne position (den N-terminale ende) af formen X af IL-li. Det er muligt at denne rest er blevet modificeret i det modne protein.

30 Det antages, at modifikationen af denne rest ikke er essentiel for effektiv IL-li aktivitet.

De for nærværende ukendte N-terminale aminosyrerester af alfa- og betaformerne er ikke fuldstændig påviselige ved Edman-nedbrydning og vil sandsynligvis blive modificeret 35 efter fjernelse af nogle af de N-terminale rester af prote- 53 DK 172763 B1 inet, som koder for GT10-lLli-2A. Det antages, at denne modifikation ikke er essentiel for effektiv IL-li aktivitet.

Eksempel 8

Ekspression af aener, som koder for IL-li i dyreceller 5 Dyrecelle-ekspression af IL-li kræver følgende trin: a. Konstruktion af en ekspressionsvektor.

b. Valg af en værtscellelinie.

c. Introduktion af ekspressionsvektoren i værtscellerne.

d. Manipulation af rekombinante værtsceller med henblik på 10 forøgelse af ekspressionsniveauet af IL-li.

1. IL-li ekspressionsvektorer, der er beregnet for anvendelse i dyreceller, kan være af adskillige typer, inklusiv stærke konstitutive ekspressionskonstruktioner, eller inducible genkonstruktioner såvel som de typer, der er udformet 15 med henblik på ekspression i særlige celletyper. I alle tilfælde er promotorer og andre genregulerende områder såsom enhancere (inducible eller ikke-inducible) og polyade-nyleringssignaler placeret på passende områder i relation til cDNA-sekvenserne i de plasmidbaserede vektorer. Her 20 følger to eksempler på sådanne konstruktioner: (1) En konstruktion under anvendelse af en stærk konstitutiv promo-terregion kan fremstilles ved at anvende genkontrolsignaler fra abevirus 40 (SV40) i et arrangement, som det, der er fundet i plasmid pSV2CAT som beskrevet af Gorman et al. i 25 Mol. Cel. Biol. 2, 1044-1051 (1982), hvilken reference specifikt medtages her ved denne henvisning. Dette plasmid kan manipuleres på en måde, hvorved kodende sekvenser for chlo-ramphenicol-acetyltransferase (CAT) erstattes med IL-li cDNA ved hjælp af molekylærbiologiske metoder, som er stan-30 dard (Maniatis et al, se ovenfor), som vist i fig. 6. (2)

En inducibel genkonstruktion kan fremstilles ved at anvende 54 DK 172763 B1 plasmidet PMK, som indeholder promoterområdet for muse-metallothionein (MT-1) (Brinster et al., Cell 27, 228-231 (1981)). Dette plasmid kan anvendes som udgangsmateriale og skal manipuleres som vist i fig. 7 til frembringelse af en 5 metalindueibel genkonstruktion.

2. Et antal dyrecellelinier kan anvendes til ekspression af IL-li under anvendelse af de vektorer, som blevet beskrevet ovenfor, til fremstilling af aktivt protein. To potentielle cellelinier, som er blevet godt karakteriserede for deres 10 evne til at fremme fremmed genekspression, er Ltk- museceller og dhfr” celler fra ovarier af kinesiske hamstere (CHO-celler), skønt ekspression af IL-li ikke er begrænset til disse cellelinier.

3. Vektor-DNA kan indføres i disse cellelinier under anven-15 delse af et hvilket som helst af et antal af genoverførselsmetoder. Den her anvendte fremgangsmåde omfatter calci-umphosphat-DNA-præcipiteringsmetoden, som blev beskrevet af S.L.Graham og A.S.van der Eb (Virology 52, 456-467 (1973)), i hvilken ekspressionsvektoren for IL-li copræcipiteres med 20 en anden ekspressionsvektor, der koder for en selekterbar markør. I tilfældet med Ltk"-celletransfektion er den se-lekterbare markør et thymidinkinasegen, og selektionen foretages som beskrevet af Wigler et al. (Cell 16, 777-785 (1979)), og i tilfældet med dhfr” CHO-celler er den selek-25 terbare markør dihydrofolatreduktase (DHFR), hvor selektionen er beskrevet af Ringold et al. i J. Mol. Appl. Genet.

1, 155-175 (1981).

4. Celler, som udtrykker IL-li-genkonstruktionerne, skal dyrkes under betingelser, som vil forøge produktionsniveau- 30 et af IL-li. Celler, som bærer metallothioneinpromoterkon-struktionerne, kan nu dyrkes under tilstedeværelse af tungmetaller såsom cadmium, som vil føre til en 5-ganges forøget udnyttelse af MT-1 promotoren (Mayo et al., Cell 29, 99-108), hvilket efterfølgende fører til en tilsvarende 35 forøgelse af proteinniveauet af IL-li. Celler, som indehol- 55 DK 172763 B1 der IL-li-ekspressionsvektorer (enten SV40- eller MT-1-baserede) sammen med en DHFR-ekspressionsvektor kan tages gennem genamplifikationsprotokollen som beskrevet af Rin-gold et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 165-175 (1981), under 5 anvendelse af methotrexat, en kompetitiv antagonist af DHFR. Dette fører til flere kopier af DHFR-gener i cellerne og samtidigt hermed forøget antal kopier af IL-li-gener, som så på sin side kan føre til, at der produceres mere IL-li-protein af cellerne.

10 Eksempel 9

Oprensning af IL-li fra rekombinantrdvreceller

Eftersom IL-li forventes at blive udskilt fra celler ligesom det naturlige stof, antages det, at de ovenfor beskrevne fremgangsmåder til oprensning af det naturlige protein 15 vil tillade tilsvarende oprensning og karakterisering af rekombinant-proteinet.

Eksempel 10

Sekvensbestemmelse· af IL-li.

Den aminoterminale aminosyrerest af IL-li er blevet identi-20 ficeret adskillige gange ved direkte proteinsekvens-bestemmelse som en argininrest (R). Resultatet af sådan sekvensbestemmelse vises i eksempel 3. I modsætning hertil er den aminoterminale rest af IL-li, som forudsagt ud fra cDNA-sekvensen, en prolin-rest (P). Denne aminoterminale 25 rest svarer til nukleotiderne 85-87 i figur 13 og er omgivet med cirkler i figurerne 14 og 15. Denne tilsyneladende uoverensstemmelse mellem cDNA-sekvensen og den direkte proteinsekvens kan forklares ved at antage, at der er blevet indført en fejl i cDNA-sekvensen under den reverstranskrip-30 tase-katalyserede syntese ud fra dets mRNA. Det vil sige, at en CGA (arginin) codon, der var lokaliseret på mRNAet, hvor det ville kode for denne aminoterminale rest, kan vare blevet ændret under reverstranskriptase-reaktionen til en 56 DK 172763 B1 CCA (prolin) codon i cDNA'et. Denne type problem med revers transcriptase er tidligere blevet rapporteret i litteraturen, f.eks. B. D. Clark et al. i Nucleic Acids Research 14, 7897 (1986).

5 Opfinderne antager, at den korrekte aminosyresekvens af proteinet er som forudsagt af cDNA med undtagelse af, at den aminoterminale aminosyre er arginin i stedet for pro-lin-resten som vist i fig. 13-15. Opfinderne er af den opfattelse, at både DNA-sekvenserne og deres korresponderende 10 peptidsekvenser falder inden for rækkevidden af deres opfindelse, skønt den aminoterminale argininsekvens foretrækkes .

Eksempel 11

Et protein med sekvensen: 15 10 20

MEIXRGLRSHLITLLLFLFH

30 40

SETIXZPSGRKSSKMQAFRI

50 60

20 WDVNQKTFYLRNNQLVAGYL

70 80

QGPNVNLEEKIDVVPIEPHA

90 100

LFLGIHGGKMXLSXVKSGDE

25 110 120

TRLQLEAVNITDLSENRKQD

130 140

KRFAFI RSDSGPTTSFESAA

57 DK 172763 B1

150 160 XPGWFLXTAMEADQPVSLTN

170

MPDEGVMVTKFYFQEDE

5 hvor X er cystein, serin eller alanin, og Z er arginin eller prolin, er også en del af opfindelsen.

Claims (41)

1. 58 DK 172763 B1
2. 1. En isoleret interleukin-1 inhibitor (IL-li), som er i stand til at inhibere interleukin-1 (IL-1), eller et for-5 stadiepolypeptid, som kan omdannes til en sådan inhibitor, kendetegnet ved, at den eller det omfatter en aminosyrese-kvens, der er valgt blandt: (A) en aminosyresekvens, som er indkodet af nucleotid- 10 sekvensen: 10 20 i 30 40 50 60 GAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCA MEICRGLRSHLI 15 4 70 80 90 100 110 120 CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSETICXPSGRKS 20 130 140 150 160 170 180 GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFRIWDVNQKTFYLRN 190 200 210 220 230 240
3. 2. ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEKID 250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT 30 VVPIEPHALFLGIHGGKMCL 310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNITD 35 59 DK 172763 B1 370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAFIRSDSGP 5 430 440 450 460 470 480 CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEA 490 500 510 520 530 540
4. 10 ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQPVSLTNMPDEGVMVTKFY 550 4-560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG 15 F Q E D E * hvori S betyder C eller G, og X betyder R eller P; (B) en amlnosyresekvens, som er indkodet af kodeområdet 20 af sekvensen i (A) eller en portion af sekvensen i (A), der koder for en IL-li, som er i stand til at inhibere IL-1, eller et forstadiepolypeptid dertil? (C) hele eller et IL-l-inhiberende fragment af den føl-25 gende amlnosyresekvens: (U)(X) PSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRN NQLVAGYLQGPNVNLEEKI DVVPIEPHA LFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV 30 NITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSF ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDE GVMVTKFYFQEDE hvori (U) betyder ingenting, M eller omfatter en N-terminal 35 sekretionsledersekvens, som er i stand til at dirigere den i DK 172763 Bl 60 en celle dannede IL-li ud af cellen i forarbejdet form, og (X) betyder R eller P; eller (D) en aminosyresekvens, som er mindst 70 % homolog med 5 aminosyresekvensen i (C).
5. 2. Interleukin-1 inhibitor eller forstadiepolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den eller det omfatter en aminosyresekvens valgt blandt: 10 (i) hele eller et IL-l-inhiberende fragment af den følgende aminosyresekvens: (U) (X) PSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRN 15 NQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHA LFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV NITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSF ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDE GVMVTKFYFQEDE 20 hvori (U) betyder ingenting, M eller omfatter en N-terminal sekretionsledersekvens, som er i stand til at dirigere den i en celle dannede IL-li ud af cellen i forarbejdet form, og (X) betyder R eller P; eller 25 (ii) en aminosyresekvens, som er mindst 70 % homolog med aminosyresekvensen i (i).
6. 3. Interleukin-1 inhibitor eller forstadiepolypeptid 30 ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den eller det omfatter en aminosyresekvens, der er mindst 80 %, fortrinsvis mindst 90 %, og mere fortrinsvis mindst 95 %, homolog med aminosyresekvensen eller fragmentet deraf i krav 2(i). 61 DK 172763 B1
7. 4. Interleukin-1 inhibitor eller forstadiepolypeptid ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den omfatter den følgende aminosyresekvens: 5 (U)(X) PSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRN NQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHA LFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV NITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSF ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDE 10 GVMVTKFYFQEDE hvori (U) betyder ingenting eller M, og (X) betyder R eller P.
8. 5. Interleukin-1 inhibitor-forstadiepolypeptid ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det omfatter en N-terminal sekretionsleder, der har hele eller en del af den følgende aminosyresekvens:
9. 20 MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETIC.
10. 6. Interleukin-1 inhibitor eller forstadiepolypeptid ifølge et hvilket som helst af de forudgående krav, kendetegnet ved, at den eller det er produceret af en rekombinant 25 værtscelle.
11. 7. Interleukin-1 inhibitor eller forstadiepolypeptid ifølge krav 6, kendetegnet ved, at værtscellen er en bakteriecelle . 30
12. 8. Interleukin-1 inhibitor eller forstadiepolypeptid ifølge krav 7, kendetegnet ved, at værtscellen er Escherichia col i. 62 DK 172763 B1
13. 9. Interleukin-1 inhibitor eller forstadiepolypeptid ifølge krav 6, kendetegnet ved, at værtscellen er en pattedyrcelle.
14. 10. Interleukin-1 inhibitor eller forstadiepolypeptid ifølge krav 9, kendetegnet ved, at værtscellen er en CHO-celle.
15. 11. Interleukin-1 inhibitor eller forstadiepolypeptid 10 ifølge et hvilket som helst af de forudgående krav, kende tegnet ved, at den eller det er mere end 90 %, fortrinsvis mere end 95 % ren.
16. 12. Isoleret DNA-molekyle, der koder for en interleu-15 kin-1 inhibitor (IL-li), som er i stand til at inhibere interleukin-1 (IL-1), eller for et forstadiepolypeptid, som kan omdannes til en sådan inhibitor, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleinsyresekvens valgt blandt: 20 (A) 10 20 i 30 40 50 60 GAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCA ME I CRGLRSHLI 4- 25 70 80 90 100 110 120 CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSETICXPSGRKS 130 140 150 160 170 180
17. 3. GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFRIWDVNQKTFYLRN 190 200 210 220 230 240 ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG 35 NQLVAGYLQGPNVNLEEKID 63 DK 172763 B1 250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVPIEPHALFLGIHGGKMCL 5 310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNITD 370 380 390 400 410 420
18. 10 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAFIRSDSGP 430 440 450 460 470 480 CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG 15 TTSFESAACPGWFLCTAMEA 490 500 510 520 530 540 ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQPVSLTNMPDEGVMVTKFY 20 550 4-560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * hvori S betyder C eller G, og X betyder R eller P; 25 (B) kodeområdet af sekvensen (A) eller en portion af sekvensen i (A), der koder for en IL-li, som er i stand til at inhibere IL-1, eller et forstadiepolypeptid dertil; 30 (C) en sekvens, der er degenereret i kodeområdet af se kvensen i (A), eller en portion deraf, der koder for en IL-11, som er i stand til at inhibere IL-1, eller et forstadiepolypeptid dertil; 64 DK 172763 B1 (D) en sekvens, der koder for et polypeptid omfattende hele eller et IL-l-inhiberende fragment af den følgende ami-nosyresekvens: 5 (U) (X) PSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRN NQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHA LFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV NITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSF ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDE 10 GVMVTKFYFQEDE hvori (U) betyder ingenting, M eller omfatter en N-terminal sekretionsledersekvens, som er i stand til at dirigere den i en celle dannede IL-li ud af cellen i forarbejdet form, og 15 (X) betyder R eller P; eller (E) en sekvens, der koder for en aminosyresekvens, som er mindst 70 % homolog med aminosyresekvensen i (D).
19. 13. DNA-molekyle ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det omfatter en sekvens valgt blandt: (i) en nucleinsyresekvens, der koder for et polypeptid omfattende hele eller et IL-l-inhiberende fragment af den 25 følgende aminosyresekvens: (U)(X) PSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRN NQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHA LFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV NITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSF 30 ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDE GVMVTKFYFQEDE hvori (U) betyder ingenting, M eller omfatter en N-terminal sekretionsledersekvens, som er i stand til at dirigere den i 35 en celle dannede IL-li ud af cellen i forarbejdet form, og (X) betyder R eller P; eller 65 DK 172763 B1 (ii) en sekvens, der koder for en aminosyresekvens, som er mindst 70 % homolog med aminosyresekvensen i (i).
20. 14. DNA-molekyle ifølge krav 13, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleinsyresekvens, som koder for en aminosyresekvens, der er mindst 80 %, fortrinsvis mindst 90 %, og mere fortrinsvis mindst 95 %, homolog med aminosyresekvensen eller fragmentet deraf i krav 13(i). 10
21. 15. DNA-molekyle ifølge krav 12 eller 13, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleinsyresekvens, som koder for den følgende aminosyresekvens: 15 (U)(X) PSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRN NQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHA LFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV NITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSF ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDE 20 GVMVTKFYFQEDE hvori (U) betyder ingenting eller M, og (X) betyder R eller P.
22. 16. DNA-molekyle ifølge krav 12 eller 13, kendetegnet ved, at det omfatter en nucleinsyresekvens, som koder for en N-terminal sekretionsleder, der har hele eller en del af den følgende aminosyresekvens:
23. 30 MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETIC.
24. 17. DNA-molekyle ifølge krav 12 eller 13, kendetegnet ved, at det er det rekombinante DNA-molekyle GT10-ILli-2A. 66 DK 172763 B1
25. 18. Rekombinant DNA-vektor, kendetegnet ved, at den om fatter et DNA-molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 12-17.
26. 19. Vektor ifølge krav 18, kendetegnet ved, at den er en ekspressionsvektor og yderligere omfatter mindst ét regu-latorisk element, der behøves for ekspressionen af DNA-molekylet i en vært.
27. 20. Vektor ifølge krav 19, kendetegnet ved, at DNA- molekylet er i stand til at udtrykkes i bakterier eller i pattedyrceller.
28. 21. Rekombinant værtscelle, kendetegnet ved, at den om- 15 fatter et DNA-molekyle, der koder for en interleukin-1 inhibitor (IL-li), som er i stand til at inhibere interleukin-1 (IL-1), eller et forstadiepolypeptid, som kan omdannes til en sådan inhibitor, hvilket DNA-molekyle omfatter en nucle-insyresekvens valgt blandt: 20 (A) 10 20 i 30 40 50 60 GAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCA MEICRGLRSHLI 25 i 70 80 90 100 110 120 CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSETICXPSGRKS 30 130 140 150 160 170 180 GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFRIWDVNQKTFYLRN 190 200 210 220 230 240
29. 3. ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEKID 67 DK 172763 B1 250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVPIEPHALFLGIHGGKMCL 5 310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNITD 10 370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF IRSDSGP 430 440 450 460 470 480
30. 15 CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEA 490 500 510 520 530 540 ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT 20 DQPVSLTNMPDEGVMVTKFY 550 4-560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * 25 hvori S betyder C eller G, og X betyder R eller P; (B) kodeområdet af sekvensen (A) eller en portion af sekvensen i (A), der koder for en IL-li, som er i stand til at inhibere IL-1, eller et forstadiepolypeptid dertil; 30 (C) en sekvens, der er degenereret i kodeområdet af sekvensen i (A), eller en portion deraf, der koder for en IL-li, som er i stand til at inhibere IL-1, eller et forstadiepolypeptid dertil; 35 68 DK 172763 B1 (D) en sekvens, der koder for et polypeptid omfattende hele eller et IL-l-inhiberende fragment af den følgende ami-nosyresekvens: 5 (U)(X) PSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRN NQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHA LFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV NITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSF ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDE 10 GVMVTKFYFQEDE hvori (U) betyder ingenting, M eller omfatter en N-terminal sekretionsledersekvens, som er i stand til at dirigere den i en celle dannede IL-li ud af cellen i forarbejdet form, og 15 (X) betyder R eller P; eller (E) en sekvens, der koder for en aminosyresekvens, som er mindst 70 % homolog med aminosyresekvensen i (D). 20 22. Værtscelle ifølge krav 21, kendetegnet ved, at den er en bakteriecelle.
31. 23. Værtscelle ifølge krav 22, kendetegnet ved, at den er Escherichia coli. 25
32. 24. Værtscelle ifølge krav 21, kendetegnet ved, at den er en pattedyrcelle.
33. 25. Værtscelle ifølge krav 24, kendetegnet ved, at den 30 er en CHO-celle.
34. 26. Værtscelle ifølge et hvilket som helst af kravene 21-25, kendetegnet ved, at DNA-tnolekylet omfatter anden pro-motor-DNA end den native IL-li-promotor-DNA, operativt for- 35 bundet med nucleinsyresekvensen. 69 DK 172763 B1
35. 27. Fremgangsmåde til fremstilling af en interleukin-1 inhibitor (IL-li) eller et forstadiepolypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11, kendetegnet ved, at interleukin-1 inhibitoren eller forstadiepolypeptidet produce-5 res i en rekombinant værtscelle ifølge et hvilket som he.lst af kravene 23-28 under egnede betingelser for ekspression af det deri indeholdte DNA-molekyle og dannelse af IL-li eller et forstadiepolypeptid.
36. 28. Fremgangsmåde ifølge krav 27, kendetegnet ved, at den dannede IL-li eller det dannede forstadiepolypeptid høstes .
37. 29. Fremgangsmåde ifølge krav 27 eller 28, kendetegnet 15 ved, at DNA-molekylet omfatter anden promotor-DNA end._den native IL-li-promotor-DNA, operativt forbundet med nuclsin-syresekvensen.
38. 30. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af krave-20 ne 27-29, kendetegnet ved, at den rekombinante værtscelle dyrkes under egnede næringsbetingelser til at amplificere DNA-molekylet.
39. 31. Fremgangsmåde ifølge krav 28, kendetegnet ved, at 25 den omfatter det yderligere trin, at det høstede polypeptid kombineres med en farmaceutisk acceptabel bærer til dannelse af et farmaceutisk præparat.
40. 32. Anvendelse af en interleukin-1 inhibitor (IL-li) 30 ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til inhibering af interleukin-1.
41. 33. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter en interleukin-1 inhibitor (IL-li) ifølge et hvilket 35 som helst af kravene 1-11.