PL164003B1 - Sposób wytwarzania inhibitorów interleukiny-1 PL - Google Patents

Abstract

1 . Sposób wytwarzania inhibitorów interleukiny-1 metoda rekombinantowego DNA przez przenoszenie wektora zawierajacego sekwencje DNA do komórki gospodarza, hodowanie komórki zawierajacej wlaczony do niej wektor zawierajacy sekwencje DNA 1 wyodrebnianie produktu, znamienny tym, ze hoduje sie komórke gospodarza zawiera- jaca wlaczony do niej wektor zawierajacy sekwencje DNA kodujaca bialko o aktywnosci inhibitora interleukiny-1, przy czym ta sekwencja DNA koduje bialko o nastepujacej sekwencji aminokwasów (U) (X) PS G RK S S RMQ A F R I WDV NQK T F Y L RN N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A L F L G I H G G K MC L S C V K S G D E T R L Q LEAV N I T D L S E N R KQD K R F A F I R S D S G P T T S F E S A A C P G W F L C T A M E A D O P V S L T N M P D E GVMVTKF YF QEDE gdzie (U) oznacza M lub jest nieobecne, a (X) oznacza P, wzglednie ta sekwencja DNA hydryzuje do DNA komplementarnego do sekwencji DNA zdefiniowanej powyzej. 11. Sposób wytwarzania inhibitorów interleukiny-1 metoda rekombinantowego DNA przez przenoszenie wek- tora zawierajacego sekwencje DNA do komórki gospodarza, hodowanie komórki zawierajacej wlaczony do niej wektor zawierajacy sekwencje DNA i wyodrebnianie produktu, znamienny tym, ze hoduje sie komórke gospodarza zawierajaca wlaczony do niej wektor zawierajacy sekwencje DNA kodujaca bialko o aktywnosci inhibitora interleukiny-1, przy czym ta sekwencja DNA koduje bialko o nastepujacej sekwencji aminokwasów: (U) (X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N N Q L V A G Y L O G P N V N L E E K I D V V P I E P H A L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F E S A A C P G W F L C T A M E A D Q PVSLTNMPDE G V M V T K F Y F QEDE gdzie (U) oznacza M lub jest nieobecne, a (X) oznacza R, wzglednie ta sekwencja DNA hydryzuje do DNA komplementarnego do sekwencji DNA zdefiniowanej powyzej. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania inhibitorów interleukiny-1.

A. IL-1

Interleukiny stanowią klasę białek produkowanych przez liczne typy komórek, łącznie z monocytami i niektórymi makrofagami. Klasa ta obejmuje co najmniej dwa 17-18 kilodaltonowe białka znane jako interleukrna-1 alfa i interleukina-1 beta. Białka te mają ważne fizjologiczne działanie na wiele róznycj komórek docelowych związanych ze stanami zapalnymi i reakcjami immunologicznymi. Białka te są ko-mitogenami (z fitohemaglutyniną) dla komórek T, pobudzają zarówno fibroblasty jak i chondrocyty do utajonego wydzielania kolagenazy i zwiększają powierzchniowe siły adhezywne komórek śródbłonkowych do neutrofilii. Ponadto działają na podwzgórze jako pirogeny, stymulują katabolizm białka mięśni i pobudzają hepatocyty do syntezy klasy białek znanych jako „ostre reagenty fazowe“. Tak więc, interleukiny-1 (IL-1) są w sposób oczywisty ważną częścią reakcji organizmu na infekcje i uszkodzenia.

B. Patologiczne role IL-1

Jednakowoż mimo ich normalnie korzystnego działania, ujawniły się okoliczności, w których działania IL-1 okazały się szkodliwe. Na przykład, IL-1 może zwiększać poziom kolagenazy w stawach artretycznych i implikuje się, że jest czynnikiem pośrednim zarówno w ostrych jak i przewlekłych stanach immunopatologii w gośćcowym zapaleniu stawów. IL-1 może być odpowiedzialny za zmianę funkcji komórki śródbłonkowej, kierując chemotaksję i migrację leukocytów i limfocytów do tkanki maziowej, pobudzając namnażanie się w naczynkach włoskowatych i stymulując gromadzenie się makrofagów w ściółce maziowej w ostrej fazie tej choroby. W fazie niszczenia tkanki, uważa się IL-1 za czynnik pośredniczący w wywoływaniu uszkodzenia tkanki poprzez stymulowanie uwalniania enzymów z fibroblastów i chondrocytów.

Ponadto, nadmierne wytwarzanie IL-1 uwidoczniło się w skórze pacjentów z łuszczycą, a wysokie poziomy IL-1 stwierdzono w płynie maziowym pacjentów z łuszczycowym zapaleniem stawów. IL-1 uwalniany przez komórki w zapalonej mazi przy łuszczycowym zapaleniu stawów może pośredniczyć w niszczeniu tkanki poprzez stymulowanie wydzielania enzymu z innych komórek. Nieprawidłowy staw z zespołem Reitera jest podobny do tego, który można zobaczyć w łuszczycowym zapaleniu stawu i w gośćcowym zapaleniu stawu. IL-1 uważa się za czynnik pośredniczący w tych trzech różnych formach zapalenia stawów. Ponadto IL-1 można znaleźć w płynie maziowym u pacjentów z patologicznym zapaleniem kostnostawowym. Uwalnianie IL-1 przez chondrocyty implikuje niszczenie chrząstki stawowej w tej chorobie.

IL-1 może również zwiększać ostrość chorób związanych z odpornością na składniki własnych tkanek. Na przykład, obniżone wytwarzanie IL-1 opisano z obwodowych komórkach krwi u osób cierpiących na układowy liszaj rumieniowaty. Ponadto, niektóre zmiany w działaniu limfocytu B może być związane z nieprawidłowościami w wytwarzaniu IL-1 lub dostępnością IL-1.

164 003

Nadmierne wytwarzanie IL-1 zostało wykazane w obwodowych monocytach pacjentów z twardziną skóry oraz uważa się IL-1 za ewentualny czynnik w zwłóknieniu poprzez stymulowanie wytwarzania kolagenu przez fibroblasty. Mechanizm uszkodzenia tkanki w grzybicy skóry może być również związany z odpornością, w której pośredniczą komórki, a zatem IL-1 może być związany jako czynnik pośredniczący w tych procesach fizjopatologicznych.

Ostra i przewlekła śródmiąższowa choroba płuc charakteryzuje się nadmiernym wytwarzaniem kolagenu przez fibroblasty płuc, co może być stymulowane przez IL-1. Ostatnie badania na modelu zwierzęcym nadciśnienia płucnego wskazują, że IL-1 może być odpowiedzialny za wywoływanie zmian komórki śródbłonkowej co może powodować zwężenie tętnic płucnych. Właśnie to zwężenie prowadzi do nadciśnienia płucnego i dalszych wtórnych uszkodzeń. Tak więc, inibitory IL-1 mogą być przydatne w leczeniu tych chorób płuc.

Ostatnie badania podają, ze IL-1 zdolne jest do bezpośredniego uszkadzania komórek beta w wysepkach Langerhansa. które są odpowiedzialne za wytwarzanie komórek przez IL-1 są głównym powodem ostrej fazy cukrzycy młodzieńczej.

Infiltracja monocytu i makrofagu w nerkach przeważa w wielu postaciach ostrego i przewlekłego zapalenia kłębków nerkowych. Uwalnianie IL-1 przez te komórki może powodować lokalne gromadzenie się innych komórek zapalnych, prowadząc ewentualnie do uszkodzeń po zapaleniu i zmian włóknistych w nerkach.

Wykazano, że kryształy znalezione w tkankach lub płynach w skazie moczanowej lubpseudoskazie moczanowej mogą bezpośrednio stymulować makrofagi do uwalniania IL-1. Zatem, IL-1 może być ważnym czynnikiem pośrednim w cyklu zapalnym w tych chorobach.

IL-1 zdolne jest do wywoływania strat wapna z kości i może być odpowiedzialne za zrzeszotnienie kości, co jest widoczne w chorobach zapalenia stawów.

Keratynocyty od pacjentów z łuszczycą uwalniają duże ilości IL-1. Ten czynnik pośredniczący może być odpowiedzialny za wtórne namnażanie komórek i gromadzenie się komórek, które występuje na skórze pacjentów z tą chorobą.

IL-1 jest jednym z ważnych wewnątrzpochodnych czynników gorączkotwórczych i może być odpowiedzialne za wywoływanie znacznej gorączki w niektórych chorobach infekcyjnych takich jak ostra gorączka wywołana bakteriami lub wirusami.

Sarkoidoza charakteryzuje się ziarniniakowymi uszkodzeniami wielu różnych organów w ciele. Pokazano, ze IL-1 jest zdolne do wywoływania tworzenia się ziarniniaków in vitro i może być związane z tym procesem u pacjentów z sarkoidozą.

Nadmierne wytwarzanie IL-1 wykazano w obwodowych monocytach zarówno w chorobie Crohna jak i owrzodzeniowym zapaleniu okrężnicy. Lokalne wydzielanie IL-1 w jelicie może być ważnym czynnikiem pośredniczącym w stymulowaniu zapalnego cyklu w tych chorobach.

Niektóre chłoniaki charakteryzują się gorączką, zrzeszotnieniem kości, a nawet wtórnym zapaleniem stawów. Nadmierne uwalnianie IL-1 wykazywane przez niektóre komórki chłoniaków in vitro mogą być odpowiedzialne za niektóre objawy kliniczne tych zjadliwości. Również wytwarzanie IL-1 przez niektóre złośliwe limfocyty może być odpowiedzialne za niektóre gorączki, ostrą fazę reakcji i wyniszczenie widoczne przy białaczce.

Uważa się, że IL-1 uwalniane przez astrocyty w mózgu odpowiedzialne są za włóknistość, która może powodować uszkodzenia mózgu na skutek okluzji naczyniowych.

C. Zastosowanie inhibitora dla IL-1

W tych i innych okolicznościach, w których IL-1 ma szkodliwe działanie, istnieje wyraźne kliniczne zapotrzebowanie na inhibitor działania IL-1. Ponieważ IL-1 jest ko-mitogenem dla komórek T, jest centralnym czynnikiem w rozwoju odporności na składniki własnych tkanek i innych chorób odpornościowych. Zatem systematycznie podawane inhibitory IL-1 mogą być przydatnymi środkami tłumiącymi odporność. Stosowane lokalnie, takie inhibitory IL-1 mogą służyć jako środki zapobiegające uszkodzeniom tkanki w stanach zapalnych stawów i w innych miejscach zapaleń. W rzeczywistości, w celu zapobiegania niszczeniu tkanki, pewne inhibitory IL-1 mogą być nawet bardziej skuteczne, gdy podawane są w połączeniu z inhibitorami kolagenazy.

Interwencja terapeutyczna przeciw działaniu IL-1 mogłaby być możliwa na etapie syntezy, wydzielania lub komórki docelowej wiążącej lub reagującej z białkiem. IL-1 syntezowane jest przez

164 003 monocyty/makrofagi i inne komórki w odpowiedzi na lipopolisacharydy, fragmenty uzupełniające i wirusy. Każda cząsteczka, która blokuje wiązanie tych środków do komórek produkujących lub która zakłóca ich oddziaływanie na fizjologię tych komórek mogłaby służyć za regulator działania IL-1. IL-1 nie jest wydzielane przez tradycyjny układ wydzielniczy ponieważ mRNA, które zostały wyodrębnione, kodują dla co najmniej dwóch 30 kd prekursorów białek, ale nie zawierają sekwencji sygnału hydrofobowego. Uwalnianie aktywnego białka z nieaktywnego prekursora prawdopodobnie wymaga proteolizy tego prekursora. Inhibitor uwalniania IL-1 lub kilku IL-1 z ich prekursorów teoretycznie może regulować działanie IL-1. IL-1 prawdopodobnie działa na komórki docelowe poprzez klasyczną ścieżkę receptor-czynnik pośredniczący, chociaż taki receptor nie został jeszcze wyodrębniony. Może tak być zatem, że cząsteczka, która zakłóca wiązanie IL-1 do jego receptorów lub obniża regulowanie tych receptorów, może również regulować działanie IL-1. Ponadto, chociaż wydarzenia wewnątrzkomórkowe następujące po związaniu receptora IL-1 nie są jeszcze w pełni zrozumiałe, możliwe jest, ze istnieją środki, które zakłócają reakcje komórkowe na inne zdarzenia, w których pośredniczy receptor, a zatem blokują działanie IL-1. Z powodów wyjaśnionych powyżej poszukiwane są białka lub małe cząsteczki zdolne do inhibitowania IL-1 w taki lub inny sposób.

Nieoczekiwanie, w pracach nad wynalazkiem, znaleziono co najmniej dwa białka inhibitory IL-1 o własnościach inhibitujących IL-1. Cząsteczki te otrzymano w postaci oczyszczonej, która umożliwia przeciętnemu fachowcowi oznaczyć ich sekwencję aminokwasową. Ponadto scharakteryzowano preparat komórkowy, który produkuje te białka oraz scharakteryzowano mRNA, które prowadzi do ich syntezy. W końcu opracowano przeciwsurowice, które ułatwiają skrining zbiorów ekspresji cDNA, dla genów kodujących dla tych inhibitorów. Razem z tymi reagentami pozwolą cDNA na kodowanie inhibitorów IL-1 do klonowania. Geny te z kolei umożliwiają w dużej skali wytwarzanie inhibitorów IL-1 odpowiednich do stosowania w preparatach farmaceutycznych przydatnych w leczeniu stanów fizjopatologicznych, w których czynnikiem pośredniczącym jest IL-1

Niniejszy wynalazek dotyczy inhibitorów IL-1 (,,IL-li“) w ogólności, a bardziej szczegółowo inhibitora IL-1 pochodzącego od monocytu. Ponadto wynalazek dotyczy biologicznie czynnych analogów tych inhibitorów.

Celem niniejszego wynalazku jest uzyskanie oczyszczonej postaci inhibitorów IL-1 aktywnych wobec IL-1a lub IL-1b lub ich kombinacji. Dalszym celem niniejszego wynalazku jest uzyskanie inhibitorów w postaci oczyszczonej, która umożliwiałaby określenie ich sekwencji aminokwasowej. Dalszym celem było uzyskanie sekwencji aminokwasowej pewnych inhibitorów IL-1. Ponadto identyfikacja biologicznie aktywnych analogów takich inhibitorów o polepszonych lub równorzędnych własnościach również stanowi przedmiot wynalazku.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest układ rekombinantowy DNA do wytwarzania opisanych tu inhibitorów IL-1. Dalszym przedmiotem wynalazku jest uzyskanie oczyszczonych postaci inhibitorów IL-1, które byłyby cenne jako preparaty farmaceutyczne inhibitujące aktywność IL-1.

Dodatkowe przedmioty i korzyści z wynalazku zostaną podane w dalszej części opisu, a część stanie się oczywista na podstawie dalszego opisu lub wyniknie z realizacji wynalazku. Przedmioty i cele można zrealizować i osiągnąć za pomocą środków i kombinacji, wykazanych zwłaszcza w załączonych zastrzeżeniach.

Do osiągnięcia przedmiotów i zgodnie z celami niniejszego wynalazku, inhibitory IL-1 zostały ujawnione. Wykazują one działanie inhibitujące przeciw IL-1. Korzystne inhibitory wyizolowano w oczyszczonej postaci z pożywki kondycjonowanej monocytami za pomocą monocytów hodowanych na płytkach powlekanych IgG.

Korzystnymi inhibitorami według wynalazku są 1,2 i 3. Inhibitory 1i 2 są białkami począwszy od charakterystycznych pozycji 22-23 kDa dla białek na pożywce SDS-PAGE i eluowanych przy 52 i 60 milimolach NaCl, odpowiednio, z kolumny Mono Q FPLC w wyszczególnionych warunkach. Inhibitor 3 jest białkiem począwszy od pozycji charakterystycznej o 20 kDa dla białka na pożywce SDS-PAGE i eluowanej przy 48 mM NaCl z kolumny Mono FPLC w wyszczególnionych warunkach. Dodatkowo, aby osiągnąć cele, przedmiotem wynalazku jest farmaceutyczna kompozycja

164 003 zawierająca co najmniej jeden składnik aktywny - inhibitor IL-1 według wynalazku lub jego biologicznie czynny analog ujawniony w niniejszym opisie.

Ponadto dla uzyskania celów wynalazku opracowano układ rekombinantowy DNA do tworzenia tych inhibitorów IL-1 i ich analogów. Korzystna postać tego układu obejmuje co najmniej jeden klon cDNA lub jego syntetyczny ekwiwalent kodujący co najmniej jeden inhibitor IL-1 wraz z wektorami i komórkami stanowiącymi układ ekspresji zdolny do ekspresji ujawnionych tu inhibitorów IL-1. Uzyskano również przeciwsurowice stosowane do identyfikacji tych klonów cDNA. Uzyskano również układy ekspresji do produkcji tych inhibitorów przy użyciu klonów cDNA, ich analogów lub innych sekwencji DNA do kodowania tych inhibitorów.

Zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania inhibitorów interleukiny-1 (IL—li) metodą rekombinantowego DNA obejmuje przenoszenie wektora zawierającego sekwencję DNA do komórki gospodarza, hodowanie komórki zawierającej włączony do niej wektor zawierający sekwencję DNA i wyodrębnianie produktu, a cechą tego sposobu jest to, ze hoduje się komórkę gospodarza zawierającą włączony do niej wektor zawierający sekwencję DNA kodującą białko o aktywności inhibitora IL-1, przy czym ta sekwencja DNA koduje białko o następującej sekwencji

amino kwasów:

(U) (X) psgrksskmqafriwdvnqktfylrn

nqlvagylqgpnvnleekidvvpiepha

LFLGI HGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV

NITDLSENRKODKRFAFIRSDSGPTTSF

ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDE

GVMVTKFYFQEDE

gdzie (U) oznacza M lub jest nieobecne, a (X) oznacza P lub R, względnie ta sekwencja DNA

hybrydyzuje do DNA komplementarnego do sekwencji DNA zdefiniowanej powyżej.

Korzystnie jako sekwencję DNA stosuje się cDNA, sekwencję polinukleotydu genomowego, sekwencję pochodzącą z komórek ssaka, zwłaszcza sekwencję pochodzącą z komórek monocytu ludzkiego, a jako komórkę gospodarza stosuje się mikroorganizm, zwłaszcza E. coli, komórkę ssaka, zwłaszcza komórkę jajnika chomika chińskiego, przy czym jako sekwencję DNA stosuje się tez polinukleotyd cDNA.

Krótki opis rysunków.

Fig. 1a i 1b przedstawiają profil białka z chromatografii Mono Q z dwoma supernatantami monocytowymi znakowanymi metabolicznie (^S-Met). Komórki hodowano na płytkach pokrytych IgG (1a) lub płodową surowicą cielęcą (1b).

Fig. 2a przedstawia barwione srebrem frakcje żeli z regionów wskazanych na fig. 1a i 1b.

Fig.2a przedstawia autoradiogram żeli pokazanych na fig.2a.

Fig.3a, b i c przedstawiają dane o oczyszczonym IL-li z przykładu I. Fig. 3a przedstawia chromatograficzne dane z nałożonym wzorem radioaktywności. Fig. 3b przedstawia żele barwione srebrem na próbkach frakcji przedstawionych na fig. 3a. Fig. 3c przedstawia autodiagramy żeli z fig. 3b.

Fig.4a i b przedstawiają wyniki chromatogramów z filtracji żelowej na kolumnie Mono Q oczyszczonego IL-il.

Fig. 5a i b przedstawiają analizę Westerna przeciwsurowic myszy.

Fig. 6 ilustruje budowę plazmidu pSVXVPI2IL-li.

Fig. 7 ilustruje budowę plazmidu pMK-SGE:IL-li.

Fig. 8 a-d przedstawiają dane o IL-li-α.

Fig. 8a i 8b przedstawiają dane chromatograficzne.

Fig. 8c przedstawia próbki żelu barwionego srebrem frakcji wskazanych na fig. 8b. Fig. 8d przedstawia autoradiogram.

Fig.9a i 9b przedstawiają dane o IL-li-β. Fig.9a przedstawia dane chromatograficzne. Fig.9b przedstawia dane SDS-PAGE.

Fig. 10 przedstawia dane o oddzieleniu peptydu IL-li-α.

Fig. 11 przedstawia dane o oddzieleniu peptydu IL-li-β.

Fig. 12a jest fotografią żelu z GT10-IL?li-2A trawionego za pomocą EcoRI po elektroforezie według przykładu VI.

164 003 Ί

Fig. 12b przedstawia dane z autoradioramu krążka Southerna żelu przedstawionego na fig. 12a.

Fig. 13 ilustruje część sekwencji DNA z regionu kodującego białko lambda GT10-ILli-2A oraz przewidywaną sekwencję aminokwasu według przykładu VI.

Fig. 14 ilustruje sekwencję nukleotydu GT10-ILli-2A.

Fig. 15 ilustruje peptyd zawierający między innymi sekwencję IL-li i sekwencję lidera wydzielniczego.

Opis szczegółowego wykonania, wraz z następującymi przykładami służy do wyjaśnienia podstaw wynalazku.

A. Inhibitor z ludzkich monocytów.

Jak zauważono powyżej, niniejszy wynalazek dotyczy inhibitorów IL-1, które wyizolowano w postaci oczyszczonej. Korzystnie inhibitory IL-1 według wynalazku pochodzą z kondycjonowanej pożywki monocytów ludzkich, w której monocyty hodowane są w naczyniach powleczonych IgG. Ponadto wynalazek obejmuje zasadniczo oczyszczone inhibitory IL-1 dowolnego pochodzenia, które biologicznie są równoważne inhibitorowi pochodzącemu z pożywki zawierającej ludzkie monocyty.

Przez „biologicznie równoważne stosowane w opisie i zastrzeżeniach, należy rozumieć kompozycje według wynalazku, które zdolne są do zapobiegania działaniu IL-1w sposób podobny, ale niekoniecznie w tym samym stopniu, co natywny inhibitor IL-1 wyizolowany z monocytów. Przez „zasadniczo homologiczny stosowany w dalszej części opisu i zastrzeżeniach patentowych, należy rozumieć stopień homologii z natywnym inhibitorem IL-1 wyizolowanym z pożywki kondycjonowanej monocytami przekraczający stopień homologii okazywany przez jakiekolwiek uprzednio omawiane inhibitory IL-1. Korzystnie stopień homologii ponad 70%, korzystniej ponad 80% a nawet bardziej korzystnie ponad 90%. Szczególnie korzystną grupę stanowią inhibitory mające ponad 95% homologii z inhibitorem natywnym. Opisywany stopień homologii oblicza się jako % reszt aminokwasów znalezionej w mniejszej z dwóch sekwencji, która ustawiona w szeregu z identycznymi resztami aminokwasów w sekwencji porównywanej, kiedy można wprowadzić cztery odstępy o długości 100 aminokwasów, dopomagając temu szeregowi jak podaje Dayhoff, M. D. w Atlas of Protein Sequence and Structure, tom. 5, str. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D. C. - odnośnik literaturowy podany w załączeniu.

Korzystne inhibitory IL-1 według wynalazku pochodziły z pożywki kondycjonowanej monocytami i po raz pierwszy zostały wyodrębnione w postaci oczyszczonej. Dla celów niniejszego wynalazku określenia czysta postać, oczyszczona postać stosowane w odniesieniu do ujawnionych tu inhibitorów, będzie oznaczało preparaty, które są zasadniczo wolne od innych białek nie będących inhibitorami IL-1. Korzystnie, inhibitory IL-1 według wynalazku mają czystość co najmniej 90%, a korzystnie 95%.

Wyodrębniono co najmniej trzy inhibitory IL-1 sposobami według przykładu. Obejmują one inhibitor 1, inhibitor 2 i inhibitor 3. Inhibitor 1 zachowuje się jak cząsteczka 22-23 kDa na pożywce SDS-PAGE z punktem izoelektrycznym 4,8 i eluowana jest z kolumny Mono Q FPLC przy stężeniu 52 mM (milimole) NaCl w buforze Tris, pH 7,6. Inhibitor 2 jest również białkiem o 22-23 kDa, pL = 4,8, ale eluowany jest z kolumny Mono Q przy 60 mM NaCl. Inhibitor 3 jest białkiem 20 kDa i eluuje z kolumny Mono Q przy 48 mM NaCl. Inhibitory 1, 2 i 3 są pokrewne immunologicznie i funkcjonalnie. Otrzymanie tych inhibitorów w postaci oczyszczonej umożliwiło uzyskanie ich sekwencji aminokwasowej. Stosując ujawnione tu po raz pierwszy oczyszczone inhibitory i metody takie jak opisane w i przez ABI Protein Sequencer, podręcznikach technicznych dostarczanych z ABI Protein Sequencer, można wydedukować istotną część aminokwasowej sekwencji tych inhibitorów.

Przykład 3 pokazuje dane o sekwencji aminokwasowej z trzech gatunków inhibitorów IL-1, mianowicie IL-li-X, IL-li-α oraz IL-li-β.

W pracach nad wynalazkiem odkryto, że powstaje co najmniej jedno przeciwciało przeciw inhibitorowi IL-1. Inne przeciwciała poliklonalne i monoklonalne przeciw temu i innym inhibitorom IL-1 można sporządzić znanymi sposobami. Jedno określone przeciwciało poliklonalne opisane jest w przykładzie 4.

164 003

B. Inhibitor rekombinantowy

1. Ogólnie

Obecnie ujawniono sposób rekombinantowego DNA do wytwarzania inhibitora IL-1. W jednym wykonaniu wynalazku, miejsce aktywne działa w sposób biologicznie równoważny w stosunku do natywnego inhibitora IL-1 wyizolowanego od człowieka. Można stosować naturalną lub syntetyczną sekwencję DNA w celu skierowania produkcji na wytwarzanie inhibitorów IL-1. Sposób ten obejmuje:

(a) sporządzenie sekwencji DNA zdolnej do skierowania komórki gospodarza ku produkcji białka mającego aktywność inhibitora IL-1, (b) klonowanie sekwencji DNA do wektora zdolnego do przeniesienia go do i replikowania w komórce gospodarza, przy czym taki wektor zawiera elementy operacyjne potrzebne do wyrażenia sekwencji DNA, (c) przeniesienie wektora zawierającego syntetyczną sekwencję DNA i elementy operacyjne do komórki gospodarza zdolnej do ekspresji DNA kodującego inhibitor IL-1, (d) hodowanie komórek gospodarza w warunkach odpowiednich do amplifikacji wektora i ekspresji inhibitora, (e) zbieranie inhibitora oraz (f) pozwolenie inhibitorowi na przyjęcie aktywnej struktury trzeciorzędowej, na skutek czego posiada inhibitorową aktywność IL-1.

2. Sekwencja DNA

Rozważne zastosowanie sekwencji DNA w tej metodzie omówiono w części w (przykładzie 51 w części) w przykładzie 6. Rozważa się, że sekwencje te obejmują syntetyczne i naturalne sekwencje DNA. Sekwencje naturalne obejmują dalej cDNA lub segmenty genomowego DNA.

Przykład 6 zapewnia molekularny klon DNA kodujący białko identyczne z tym, które wyodrębniono w przykładach 1-3. W przykładzie 6, płytka, GT10-ILli-2A została wyodrębniona ze zbioru GT10. W płytce tej reprodukowano fag a DNA wyodrębniono i trawiono za pomocą EcoRI. Fragment EcoRI i 1850 parach zasad niesie sekwencję kodującą dla inhibitora IL-1. Fig. 13 pokazuje częściową sekwencję DNA fragmentu EcoRI.

W świetle podanych tu informacji i znanych sposobów, można uzyskać inne syntetyczne sekwencje polinukleotydu. Jako przykład obecnego stanu techniki dotyczącego syntez polinukleotydu wymienić można prace Matteucci, M. D. i Caruthers, M. H. w J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981) oraz Beaucage, S. L. i Caruthers, M. H. w Tetrahedron Lett. 22:1859 (1981) i instrukcje dostarczane z urządzeniem do syntezy oligonukleotydów ABI.

Te sekwencje syntetyczne mogą być identyczne z sekwencjami naturalnymi opisanymi bardziej szczegółowo poniżej lub mogą zawierać różne nukleotydy. W jednym wykonaniu, jeśli syntetyczne sekwencje zawierają różne nukleotydy od znalezionych w sekwencjach naturalnego DNA według wynalazku, przyjmuje się, że te różne sekwencje będą również kodować polipeptyd, który ma tę samą główną strukturę co IL-1 i wyodrębniony z monocytów. W alternatywnym wykonaniu, syntetyczna sekwencja zawierająca różne nukleotydy będzie kodować polipeptyd, który ma taką samą aktywność biologiczną jak opisany tu IL-li.

Dodatkowo, sekwencja DNA może być fragmentem naturalnej sekwencji, tzn. fragmentem polinukleotydu, który pojawił się w naturze i który został wyodrębniony i oczyszczony po raz pierwszy przez twórców obecnego wynalazku. W jednym wykonaniu, sekwencja DNA jest restrykcyjnym fragmentem wyizolowanym ze zbioru cDNA.

W alternatywnym wykonaniu, sekwencja DNA została wyodrębniona z genomowego zbioru ludzkiego. Przykład takiego zbioru, przydatnego w tym wykonaniu, zawarty jest w publikacji Lawna i wsp. w Cell 15:1157-1174 (1978).

W korzystnej wersji tego wykonania, przyjmuje się, że sekwencja naturalnego DNA będzie otrzymywana metodą obejmującą:

(a) przygotowanie zbioru ludzkiego cDNA z komórek, korzkstnie monocjrtów, zdolnych do generowania inhibitora IL-1 w we0tórge órag komórki zdolnej do amplifikowania i ekspresji całego lub części tego cDNA,

164 003 9 (b) sondowanie zbioru ludzkiego DNA za pomocą co najmniej jednej sondy zdolnej do przyłączania do inhibitora IL-1 genu lub jego produktu białkowego, (c) identyfikowanie co najmniej jednego klonu zawierającego gen kodujący dla inhibitora z mocy zdolności tego klonu do wiązania co najmniej jednej sondy dla tego genu lub jego produktu białkowego, (d) wyodrębnienie genu lub części genu kodującej dla inhibitora z wybranego klonu lub klonów, (e) przyłączenie genu, lub jego odpowiedniego fragmentu, do elementów operacyjnych koniecznych do utrzymania i ekspresji genu w komórce gospodarza.

Naturalne sekwencje DNA stosowane w powyższym sposobie mogą być również identyfikowane i izolowane za pomocą metody obejmującej:

(a) sporządzanie zbioru ludzkiego genomowego DNA, korzystnie reprodukowanego w recArecBC E. coli jako gospodarzu, (b) sondowanie zbioru ludzkiego genomowego DNA za pomocą co najmniej jednej sondy zdolnej do wiązania do inhibitora IL-1 genu lub jego produktu białkowego, (c) identyfikowanie co najmniej jednego klonu zawierającego gen kodujący dla inhibitora z mocy zdolności tego klonu do wiązania co najmniej jednej sondy dla genu lHb jego produktu białkowego, (d) wyodrębnianie genu kodującego dla inhibitora z klonu (ów) zidentyfikowanych oraz (e) przyłączanie genu lub jego odpowiedniego fragmentu, do elementów operacyjnych koniecznych do utrzymania i ekspresji genu w komórce gospodarza.

Przy izolowaniu sekwencji naturalnego DNA odpowiedniej do użycia w wyżej wymienionej metodzie, korzystnie jest zidentyfikowanie dwóch miejsc restrykcyjnych na i najbliżej końcowych części odpowiedniego genu lub części genu. Segment DNA zawierający odpowiedni gen usuwa się z pozostałego materiału genomowego przy użyciu odpowiedniej endonukleazy restrykcyjnej. Po odcięciu końców 3' i 5'sekwencji DNA i rekonstrukcji jakichkolwiek zewnętrznych (exon) połączeń przeprowadzonej w celu uzyskania odpowiednich sekwencji DNA zdolnych do kodowania dla zakończenia N- i C- białka inhibitora IL-1 i zdolnych do fuzji sekwencji DNA do jej elementów operacyjnych.

3. Wektory.

(a). Mikroorganizmy, zwłaszcza E. coli.

Wektory przyjęte do stosowania w obecnym wynalazku obejmują dowolne wektory, do których można włączyć omówioną powyżej sekwencję DNA, wraz z dowolnymi korzystnymi lub potrzebnymi elementami operacyjnymi i który to wektor może być następnie przeniesiony do komórki gospodarza i replikowany w takiej komórce. Korzystnymi wektorami są te, których miejsca restrykcyjne są dobrze udokumentowane i które zawierają elementy operacyjne korzystne lub potrzebne do transkrypcji sekwencji DNA. Jednakowoż pewne wykonania obecnego wynalazku są również przewidywane, w których mogą być zastosowane jeszcze nie odkryte wektory, które mogłyby zawierać jedną lub kilka sekwencji cDNA tutaj opisanych. W szczególności korzystnie jest, żeby wszystkie te wektory miały niektóre lub wszystkie z następujących własności: (1) żeby posiadały minimalną liczbę sekwencji organizmu gospodarza, (2) żeby były trwale utrzymywane i reprodukowane u pożądanego gospodarza, (3) żeby były zdolne do występowania w wysokiej ilości kopii u pożądanego gospodarza, (4) żeby posiadały dający się regulować promotor umiejscowiony tak, aby aktywować transkrypcję interesującego genu, (5) żeby miały co najmniej jeden marker sekwencji DNA kodującej dla selektywnej cechy charakterystycznej obecnej w części plazmidu oddzielonej od tego, gdzie będzie wprowadzona sekwencja DNA i (6) żeby miały sekwencję DNA zdolną do zakończenia transkrypcji.

W różnych korzystnych wykonaniach, te klonujące wektory zawierające i zdolne do ekspresji sekwencji DNA według wynalazku zawierają różne elementy operacyjne. Wymienione elementy operacyjne, o których mówi się w opisie, obejmują co najmniej jeden promotor, co najmniej jedną sekwencję Shine-Dalgarno i kodon inicjator i co najmnej jeden kodon terminator (kończący). Korzystnie wymienione elementy operacyjne obejmują również co najmniej jeden operator, co najmniej jedną sekwencję lidera dla białek wysyłanych z przestrzeni wewnątrzkomórkowej, co najmniej jeden gen dla regulatora białka i dowolne inne sekwencje DNA konieczne lub korzystne dla odpowiedniej transkrypcji i w następstwie translacji wektora DNA.

164 003

Niektóre z tych elementów operacyjnych mogą być obecne w każdym z korzystnych wektorów według wynalazku. Przyjmuje się, że każdy dodatkowy potrzebny element operacyjny może być OoOany Oo tych wektorów za pomocą znanych sposobów, zwłaszcza w świetle zawartych tu informacji.

W praktyce możliwe jest skonstruowanie każdego z tych wektorów w sposób, który pozwala na ich łatwe wyodrębnianie, łączenie i wymianę. To ułatwia łączenie licznych genów funkcjonalnych z kombinacji tych elementów i regionu kodującego sekwencji DNA. Dalej, wiele z tych elementów nadaje się Oo stosowania u więcej niż jednego gospodarza. Ponadto, przyjmuje się, że wektory, w pewnych korzystnych wykonaniach, będą zawierały sekwencje DNA zdolne Oo funkcjonowania jako regulatory (operatory) i inne sekwencje DNA zdolne Oo kodowania Ola białek regulatora.

(i) Regulatory

Regulatory te, w jednym wykonaniu, będą służyły zapobieganiu ekspresji sekwencji DNA w obecności pewnych DanunnóD w otoczeniu i, w obecności innych warunków w otoczeniu, pozwolą na transkrypcję i następną ekspresję Ola kodowanego białka przez sekwencję DNA. W szczególności, korzystnie jest, żeby segmenty regulatorowe zostały wprowadzone Oo wektora i żeby nie pojawiła się ekspresja sekwencji DNA, lub aby pojawiła się w bardzo zmniejszonym zakresie, w obecności, na przykład, lzopnopylotio-bete-D-gelantozyOu. W tej sytuacji transformowane mikroorganizmy zawierające sekwencje DNA mogą rosnąć Oo pożądanej gęstości przed zapoczątkowaniem ekspresji IL-li. W tym wykonaniu, ekspresja pożądanego białka wywoływana jest dodaniem substancji Oo środowiska bakteryjnego zdolnej Oo powodowania ekspresji sekwencji DNA po osiągnięciu pożądanej gęstości.

(ii) Promotory

Wektory ekspresji muszą zawierać promotory, które mogą być użyte przez organizm gospodarza Ola ekspresji jego własnych białek. Mimo, że zwykle stosowany jest układ promotora laktozowego, wyodrębniono i scharakteryzowano inne promotory bakteryjne umożliwiając fachowcom użycie ich Oo ekspresji rekombinantowego IL-li.

(iii) Terminator transkrypcji

Rozważane tu terminatory transkrypcji służą Oo stabilizowania wektora. Do stosowania w obecnym wynalazku w szczególności przyjęto sekwencje opisane przez Rosenberga M i Courta J. w Ann. Rev. Genet. 13: 319-353 (1979).

(iv) Sekwencja nie ulegająca translacji

Należy zauważyć, że w korzystnym wykonaniu, może równeż być pożądana rekonstrukcja końca 3' i 5' regionu kodującego, ażeby pozwolić na włączenie 3' lub 5' nie poddanej translacji sekwencji Oo transkryptu genu. Między tymi nie poddanymi translacji sekwencjami, włączone są te, które stabilizują mRNA, tak jak zostały one zidentyfikowane przez Schmeissnera u., McKenneya K., Rosenberga M. i Courta D. w J. Mol. Biol. 176: 39-53.

(v) Miejsca przyłączania rybosomu

Bakteryjna ekspresja obcych białek wymaga pewnych elementów operacyjnych, które obejmują, chociaż nie są Oo nich ograniczone, miejsca przyłączania rybosomu. Miejsce przyłączania rybosomu jest sekwencją, którą rybosom rozpoznaje i przyłącza się Oo niego podczas zapoczątkowania syntezy białka jak podaje GolO L. i wsp. w Ann. Rev. Microbio. 35:557-580, lub Marquis D. M. i wsp. w Gene 42: 175-183/ (1986). Korzystnym miejscem przyłączania rybosomu jest GAGGCGCAAAAA(ATG).

(vi) Sekwencja lidera i translacyjny czynnik sprzęgający

Ponadto, jeśli białko ma być wydzielone z cytoplazmy, korzystnie jest, żeby DNA kodująca Ola odpowiedniej sekwencji lidma wydzielniczego (sygnał) było obecne przy końcu 5' sekwencji DNA, jak podaje Watson M. E. w Nucleic Acid Res. 12:5145-5163. DNA dla sekwencji liOma musi być w pozycji pozwalającej na produkowanie białka fuzyjnego, w którym sekwencja liOma jest bezpośrednio przyległa Oo i kowalencyjnie przyłączona Oo inhibitora, tzn., ze nie może być żadnych sygnałów kończących transkrypcję lub translację między dwoma kodującymi sekwencjami DNA. Obecność sekwencji lidera częściowo pożądana jest z jednego lub kilku powodów. Po pierwsze, obecność sekwencji lidma może ułatwić gospodarzowi przetwarzanie IL-li. W szczególności,

164 003 sekwencja lidera może kierować odszczepieniem początkowego produktu translacji za pomocą peptydazy lidera w celu usunięcia sekwencji lidera i pozostawienie polipeptydu z sekwencją aminokwasową, która ma silną aktywność białkową. Po drugie, obecność sekwencji lidera może ułatwiać oczyszczanie IL-li, poprzez kierowanie białka na zewnątrz cytoplazmy komórki. W niektórych gatunkach mikroorganizmów gospodarzy, obecność odpowiedniej sekwencji lidera pozwoli na transport kompletnego białka do przestrzeni okołoplazmowej, jak w przypadku niektórych E. coli. W przypadku pewnej E. coli, Saccharomyces i szczepów Bacillus i Pseudomonas, odpowiednia sekwencja lidera pozwoli na transport białka przez błonę komórkową do środowiska pozakomórkowego. W tej sytuacji białko może być oczyszczone z białka pozakomórkowego. Po trzecie, w przypadku niektórych białek sporządzonych według wynalazku, obecność sekwencji lidera może być konieczna do umiejscowienia skompletowanego białka w środowisku, gdzie może zostać sfałdowane dla przyjęcia jego budowy aktywnej, która posiada odpowiednią aktywność białkową.

W korzystnym wykonaniu obecnego wynalazku, dodatkową sekwencję DNA umieszcza się tuż przed sekwencją DNA, która koduje dla inhibitora IL-1. Dodatkowa sekwencja DNA jest zdolna do działania jako czynnik sprzęgający translacji, tzn. jest sekwencją DNA, która koduje RNA, które służy do umiejscowienia rybosomu w pozycji bezpośrednio przyległej do miejsca przyłączania rybosomu inhibitora RMA, z którym sąsiaduje. W jednym wykonaniu obecnego wynalazku, translacyjny czynnik sprzęgający może pochodzić z użycia sekwencji DNA TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG i sposobów znanych fachowcom dotyczących translacyjnych czynników sprzęgających.

(vii) Czynnik kończący translację (Terminator translacji)

Rozważane tu terminatory translacji służą do zatrzymania translacji mRNA. Mogą one być bądź naturalne jak opisał Kohli J. w Mol. Gen. Genet. 182:430-439, bądź syntezowane jak opisał Pettersson R. F. Gene 24:15-27 (1983).

(viii) Marker zdolny do selekcji

Ponadto korzystnie jest, gdy wektor klonowania zawiera marker zdolny do selekcji, taki jak marker odporny na leki lub inny marker, który powoduje ekspresję zdolnej do selekcji cechy charakterystycznej przez mikroorganizm gospodarza. W jednym wykonaniu obecnego wynalazku do wektora włączona jest odporność genu na ampicylinę, podczas gdy w innych plazmidach włączony jest gen dla odporności na tetracyklinę lub gen dla odporności na chloramfenikol.

Taka odporność na lek lub inny marker zdolny do selekcji zamierzona jest częściowo dla ułatwienia selekcji transformantów. Dodatkowo, obecność takiego markera zdolnego do selekcji w wektorze klonującym może być użyta do zatrzymania zanieczyszczonych mikroorganizmów od zwielokrotnienia w pożywce hodowlanej. W tym wykonaniu, czysta hodowla transformowanych mikroorganizmów gospodarza mogłaby być otrzymana przez hodowlę mikroorganizmów w warunkach, które wymagają wzbudzonego fenotypu dla przeżycia.

Omawiane tu elementy operacyjne dobiera się rutynowo sposobami znanymi fachowcom. Ogólne przykłady elementów operacyjnych podaje B. Lewin, Genes, Wiley and Sons, New York (1983). Różne przykłady odpowiednich elementów operacyjnych można było stwierdzić na wektorach omówionych powyżej i można było wyświetlić przez przegląd publikacji omawiających podstawowe cechy charakterystyczne wyżej wymienionych wektorów.

Po syntezie i wyodrębnieniu wszystkich potrzebnych i pożądanych części komponentów wyżej omówionego wektora, wektor składa się metodami ogólnie znanymi fachowcom. Składanie takich wektorów wchodzi w zakres obowiązków i zadań wykonywanych przez pracowników i może być wykonane bez zbędnego eksperymentowania. Na przykład podobne sekwencje DNA mogą być podwiązanie do odpowiednich wektorów klonujących, co podaje Maniatis i wsp. w Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984).

Przy konstruowaniu wektorów klonujących według wynalazku, należy dodatkowo zauważyć, że wielokrotne kopie sekwencji DNA i towarzyszących jej elementów operacyjnych można wprowadzić do każdego wektora. W takim wykonaniu organizm gospodarza powinien produkować większe ilości na wektor pożądanego inhibitora IL-1. Liczba zwielokrotnionych kopii sekwencji DNA, którą można wprowadzić do wektora jest ograniczona tylko zdolnością uzyskiwanego

164 003 wektora, z uwagi na jego wielkość, do przenoszenia do oraz replikowania i transkrybowania w odpowiedniej komórce gospodarza.

(b) Inne mikroorganizmy

Rozważano również w sposobie według wynalazku stosowanie wektorów odpowiednich do użycia w mikroorganizmach innych niż E. coli. Wektory takie opisano w tabeli 1. Ponadto, pewne korzystne wektory dyskutowane są poniżej.

tablica 1

Uspo- darz	Regulowane prorotory	IndUkior	Teimlnator transkryfpji	Stabilizacja MRNA	Trangkryp^jne miejsce startu i lider peptydu	Mrker	Miejsce przytaczanie RS
E cull	Lac1,lac2 lambda pL Trp(i) * * * 5	IPTG poduszona temneatura dodwile IAA lub wyczerpanie tryptofanu	rrnB5 rrnf.’	ατρΑθ lambda Int^ trplU	blaH om>Ai2 phoS	aapicrlin^l* tetracyklina^'^ cnloraam lenikar5
Bad Hus	*alta 17 amylaza subtl l i zyna^ soac-Γ5	IPTG	E coll rrn rrn Bt I2U		B.amy neutralna proteaza 21 B am alfaamlaza 27 B.subt. 23 subtylizyna’	Kan' 24 Ca»' 25	B.amy neutralna proteaza B.amy alfaamlaza 22
Pseudo- woias	lrpi7/E.coll/ Lec /E.cc^ll/ lac /E coli/	dcolOTte IAA lub wyrypanie tryptofanu IPTG			fosfolipaza c2U 29 egzotoksyna A	sulftnamldUG strrotcmy- cyna	Trp /E.c^ll./
Drożdże	Gal l’1. iu’2 Ad l’’ u’4 Pito 5	W^zerpOTie glukozy i galaktozy wyczerpanie giu<ozy wyzsrprnnle fosforku	Cyc 1 Una czymik alfa Sac 2		Inwertaza’6 kwasowa fosfataza’6 czynnik alfa	Ura Leu 258 His ’ Tap 1

nieregultwany (i) Wektory Pseudomonas

Kilka plazmidów wektorowych, które automatycznie replikują bakterie Gram ujemne w szerokim zakresie jest korzystnych przy stosowaniu jako nośniki klonowania w gospodarzu z rodzaju Pseudomonas. Niektóre z nich zostały opisane przez Taita R.C., Close T.J., Lundquista R.C., Hagiya M., Rodrigueza R.L. i Kado C.I. w Biotechnology, Maj 1983 str. 269-275; Panopoulosa N.J. w Genetic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New York, str. 163-185 (1981) oraz Sakagucki K. w Current Topic in Microbiology and Immunology 96; 31-45 (1982) -każda z tych publikacji wymieniona jest w załączniku.

Jedna szczególnie korzystna konstrukcja może wykorzystywać plazmid RSF1010 i jego pochodne, jak opisał Bagdasarian m., Bagdasarian M.M., Coleman S. i Timmis K.N. w Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Timmis K.N. and Puhler, A. wyd. Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979) - wymienione w załączonym wykazie publikacji. Korzystne cechy RSF1010 polegają na tym, że jest on stosunkowo małym plazmidem o wysokiej liczbie kopii, który jest łatwo transformowany do i trwale utrzymywany zarówno w E. coli jak i gatunkach Pseudomonas. W tym układzie byłoby korzystne użycie układu eksprecji Tac opisanego dla Escherichia, ponieważ wydaje się, że trp promotor E. coli jest łatwo rozpoznawany przez polimerazę RNA Pseudomonas, jak podaje Sakagucki K. w Current Topics in Mikrobiology and

Immunology 96: 31-45 (1982) oraz Gray G.L., McKeown K.A., Jones A.J.S., Seeburg P.H. i

Heyneker H.L. w Biotechnology, luty 1984, str. 161-165 - obie publikacje wymienione w załączniku. Aktywność transkrypcyjna może być dalej zwiększona do maksimum przez wymaganą wymianę promotora z np. promotorem trp E. coli lub P. aeruginosa. Dodatkowo, można by również włączyć gen lacI z E. coli do plazmidu dla uzyskania regulacji.

Translacja może być sprzężona z inicjacją translacji dla dowolnych białek Pseudomonas jak również z miejscami inicjacji dla każdego białka wybranego typu o wysokiej ekspresji, aby spowodować wewnątrzkomórkową ekspresję inhibitora.

164 003

W tych przypadkach, gdzie szczepy gospodarza z gatunku Pseuefomonas o minusowej restrykcji są niedostępne, wydajność transformacji konstruktów plazmidowych wyizolowanych z E. coli jest mała. Przeto pasaż klonującego wektora Pseudomonas przez r- m+ szczep innego gatunku przed transformacją pożądanego gospodarza jest pożądany, jak podaje Bagdasarian M i wsp. w Plasmids of Medical, Enykonmental and Commercial Importance, str. 411-422, Timmis and Puhler wyd., Elsevier/North Holland Biómedical Press (1979).

(ii) Wektory Bacillus

Poza tym, korzystny układ ekspresji w gospodarzu z gatunku Bacillus wiąże się z zastosowa niem plazmidu pUB110 jako nośnika klonowania. Jak w układzie wektorów w innych gospodarzach, możliwa jest w Bacillus ekspresja IL-li według wynalazku bądź jako białka wewnątrzkomórkowego bądź jako sekwencji. Obecne wykonania obejmują oba te systemy. Wektory czółenkowe, które replikują zarówno w Bacillus jsk i E.^li dostępne są dla konstruowania i testowania różnych genów co opisali Dubnau D., Gryczan T., Contente S. i Shivakumar A.G. w Genetic Engineering, tom 2, Setlow and Hollander wyd. Plenum Press, New York, New York, str. 115-131 (1980). Dla ekspresji i wydzielenia IL-1 i z B. Subtilis, sygnalną sekwencję alfa-amylazy, korzystnie sprzęga się z kodującym regionem białka. Dla inhibitora wewnątrzkomórkowego, przenośna sekwencja DNA będzie translacyjnie sprzężona z miejscem przyłączenia do rybosomu lidera sekwencji alraamylazy.

Transkrypcja któregokolwiek z tych kons^któw kierowana jest korzystnie przez promotor alfa-amylarowy lub jego pochodną. Pochodna ta zawiera sekwencję rozpoznawania RNA pólimcrazy naiwnego promotora alfa-amylaródegó, ale zawiera również region lac operatora. Podobne promotory hybrydowe skonstruowane z promotora genu penicylinazy i operatora lac jak pokazano działają w gospodarzach Bacillus w dający się regulować sposób - co podają Yansura D.G. i Henner w Genetics and Blóteohnologo of Bacilli, Ganesan A.T. i Hoch J.A. wyd. Academic Press, str. 249-263 (1984). Dla uzyskania efektu regulacji do plazmidu powinien również być włączony gen lacI z E. coli.

(iii) Wektory Clostridium

Jedną korzystną konstrukcją dla ekspresji w Clóstridium jest plazmid pJU12 opisany przez SąuiresaC.H. i wsp. w J. Bacterid. 159:465-471 (1984), transformowany do C. perfringens metodą Haefnera D.L. i wsp. opisaną w J. Bacteriol. 159: 460-464 (1984). Transkrypcja kierowana jest przez promotor genu odporności na tetracyklinę. Translacja jest sprzężona z sekwencjami ShineDalgarno tego samego genu tetr w sposób ściśle analogiczny z postępowaniami zarysowanymi powyżej dla wektorów odpowiednich do użycia w innych gospodarzach.

(iv) Wektory drożdży

Utrzymanie obcego DNA wprowadzonego do drożdży może być wykonane kilkoma drogami jak opisali Bótsteln D. i Davis R. W. w The Molecular Biológy of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Labo^ory, Strathern, Jones and Broach, wyd. str. 607-636 (1982). Jeden korzystny układ ekspresji stosowany z organizmami gospodarzy w rodzaju SaccharomyOcs jest miejscem zakotwiczenia genu IL-1 i na 2 mikronowym plazmidzie. Korzyści z 2 mikronowego okręgu obejmują stosunkowo wysoką liczbę kopii i trwałość, gdy zostaną wprowadzone do szczepów cir°. Wektory te korzystnie łączą w sobie początek replikacji i co najmniej jeden marker odporności na antybiotyk z pBR322 pozwalając na replikacją i selekcję w E. coli. Ponadto plazmid korzystnie będzie miał dwie mikronowe sekwencje i gen LEU2 drożdży do służenia tym samym celom w LEU2 wadliwych mutantów drożdży.

Jeżeli zakłada się, że rekombinant ιnhlbitcrZd IL-1 będzie na końcu poddany ekspresji w drożdżach, korzystnie byłoby przenieść najpierw wektor klonujący do Esoheriohia oóli, gdzie pozostawiono by wektor do replikowania i skąd wektor mógłby być otrzymany i oczyszczony po amplifikacja. Wektor mógłby być następnie przeniesiony do drożdży do końcowej ekspresji inhibitora IL-1.

(c) Komórki ssaka cDNA dla inhibitora IL-1 będzie służyć jako gen do ekspresji inhibitora w komórkach ssaka. Powinno ono mieć sekwencję, która będzie skuteczna przy wiązaniu rybosomów jak to opisuje Kozak w Nucleic Acids Research 15' 8125-8132 (1987) i powinno mieć zdolność kodowania dla

164 003 sekwencji lidera (patrz część 3/a//vi/) do kierowania dojrzałego białka na zewnątrz komórki w przerobionej postaci. Restrykcyjny fragment DNA niosący kompletną sekwencję cDNA może być wprowadzony do wektora ekspresji, który ma promotor transkrypcyjny i transkrypcyjny czynnik wzmacniający jak opisali Guarente 1. w Cel 52: 303-305 (1988) oraz Kadonaga J.T. i wsp. w Cell 51: 1079-1090 (1987). Promotor może być zdolny do regulowania jak w plazmidzie pMSG (Pharmacia Cat. No. 27 450601) jeśli konstytutywna ekspresja inhibitora jest szkodliwa dla wzrostu komórki. Wektor powinien mieć kompletny sygnał poliadenylacji jak opisał Ausubel F.M. i wsp. w Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987) tak, żeby mRNA transkrybowane w tym wektorze było prawidłowo przerabiane. W końcu, wektor będzie miał początek replikacji i co najmniej jeden marker odporności antybiotycznej z pBR322, ażeby pozwolić na replikację i selekcję w E. coli.

W celu wyselekcjonowania trwałej linii komórkowej, która produkuje inhibitor IL-1, wektor ekspresji może nieść gen dla markera zdolnego do selekcji, takiego jak marker odporności na lek lub nieść gen komplementarny dla wadliwej linii komórkowej, taki jak gen reduktazy dihydrofolanowej (dhfr) dla transformowania linii komórkowej dhfr^- jak opisał Ausubel i wsp. - powyżej. Alternatywnie, oddzielny plazmid niosący marker zdolny do selekcji może być wspólnie przenoszony wraz z wektorem ekspresji.

4. Komórki gospodarza/transformacja

Tak otrzymany wektor przenosi się do komórki odpowiedniego gospodarza. Takie komórki gospodarza mogą być mikroorganizmami lub komórkami ssaków.

(a) Mikroorganizmy

Przypuszcza się, że każdy mikroorganizm mający zdolność pobierania DNA pochodzącego z zewnątrz i ekspresji tych genów oraz towarzyszących elementów operacyjnych może zostać wybrany. Po wybraniu organizmu gospodarza, przenosi się do organizmu gospodarza wektor za pomocą znanych sposobów. Przykłady takich metod podaje R.W. Davis i wsp. w Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980). Korzystnie jest, w jednym wykonaniu, aby transformacja wystąpiła w niskiej temperaturze, ponieważ regulacja temperatury przyjęta jest jako środek do regulowania ekspresji genu poprzez użycie elementów operacyjnych ustalonych powyżej. W jednym wykonaniu, jeśli do wektora zostaną wprowadzone regulatory osmolarne, może być wymagana regulacja stężenia soli w trakcie transformacji ażeby zapewnić odpowiednie zwalczanie obcych genów.

Korzystnie, organizm gospodarza wybiera się dowolnie, spośród bakterii tlenowych i tlenowce i beztlenowych -beztlenowce. Szczególnymi gospodarzami, którzy mogą być preferowani do użycia w tej metodzie są drożdże i bakterie. Poszczególne drożdże obejmują rodzaj Saccharomyces, a zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae. Poszczególne bakterie obejmują rodzaje Bacillus, Eschericha i Pseudomonas, a zwłaszcza Bacillus subtilis i Escherichia coli. Dodatkowe komórki gospodarzy wyszczególniono powyżej w tabeli 1.

(b) Komórki ssaków

Wektor może być wprowadzony do komórek ssaków w hodowli prowadzonej różnymi technikami takimi jak współstrącanie fosforanem wapnia; DNA, elektroporacja lub fuzja protoplastów. Korzystnym sposobem jest współstrącanie z fosforanem wapnia jak opisał Ausubel i wsp. powyżej.

Istnieje wiele typów trwałych komórek, które są zdolne do transformacji i zdolne są do transkrypcji i translacji sekwencji cDNA, przerobu prekursora IL-li oraz wydzielania dojrzałego białka. Jednakowoż typy komórek mogą ulegać zmianom w odniesieniu do ewentualnie zachodzącej glikolizacji wydzielonego białka i posttranslacyjnej modyfikacji reszt aminokwasów. Tak więc idealnymi typami komórek są te, które produkują rekombinant inhibitora IL-1 identyczny z cząsteczką naturalną.

5. Hodowla komórek poddanych obróbce inżynieryjnej

Komórki gospodarzy hoduje się w warunkach odpowiednich dla ekspresji inhibitora IL-1. Warunki te są na ogół specyficzne dla komórki gospodarza i są łatwe do ustalenia przez fachowca na podstawie literatury dotyczącej warunków wzrostu dla takich komórek i na podstawie zawar164 003 tych tu publikacji. Na przykład, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, wyd. 8, Williams and Wilkins Company, Baltimore, Meryland, zawiera informacje o warunkach hodowli bakterii. Podobne informacje dotyczące hodowli drożdży i komórek ssaków można otrzymać z publikacji Pollach R., Mammalian Cell Culture, Cold Spring Habor Laboratories (1975).

Każde warunki konieczne do regulowania ekspresji sekwencji DNA, zależne od któregokolwiek z elementów operacyjnych wprowadzonych do lub obecnych w wektorze, mogą wpyłwać na etapy transformacji i hodowli. W jednym wykonaniu, komórki hodowane są do wysokiej gęstości w obecności odpowiednich warunków regulujących, które inhibitują ekspresję sekwencji DNA. Gdy uzyska się optymalną gęstość komórek warunki otoczenia zmienia się na odpowiednie dla ekspresji sekwencji DNA. Zakłada się, ze produkcja inhibitora IL-1 pojawi się w okresie czasu następującym po wzroście komórek gospodarza do prawie optymalnej gęstości, i że otrzymany w rezultacie inhibitor IL-1 będzie zbierany w pewnym czasie po wzbudzeniu regulujących warunków koniecznych dla jego ekspresji.

6. Occyssccznie (a) IL-li wyprodukowany przez mikroorganizmy

W korzystnym wykonaniu obecnego wynalazku rekombinantowy inhibitor IL-1 oczyszcza się po zbiorze i przed przyjęciem struktury aktywnej. To wykonanie jest korzystne ponieważ wynalazcy wierzą, że odzysk wydajnego ponownie sfałdowanego złożonego białka jest ułatwiony, jeśli białko jest najpierw oczyszczone. Jednakże, w jednym korzystnym, alternatywnym wykonaniu można pozwolić aby inhibitor IL-1 pofałdował się dla przyjęcia jego aktywnej struktury przed oczyszczeniem. W jeszcze innym korzystnym, alternatywnym wykonaniu, inhibitor IL-1 obecny jest w swojej ponownie pofałdowanej postaci aktywnej po odzyskaniu z pożywki hodowlanej.

W pewnych okolicznościach inhibitor IL-1 przyjmuje swoją właściwą, aktywną strukturę po ekspresji w mikroorganizmie gospodarza i transportu białka przez ściankę komórkową lub błonę komórkową lub do przestrzeni pozapłacowej. To na ogół będzie miało miejsce, jeśli DNA kodujące dla odpowiedniej sekwencji lidera zostanie przyłączone do DNA kodujcącgo dla białka rekombinantowego. Jeżeli inhibitor IL-1 nie przyjmuje swojej właściwej aktywnej struktury należy rozerwać jakiekolwiek wiązania dwusiarczkowe, które powstały i/lub jakiekolwiek oddziaływanie niekowalencyjne za pomocą środków denaturujących i redukujących, na przykład, chlorku guanidyny i beta-merkaptoetanolu, zanim pozostawi się inhibitor IL-1 do przyjęcia swojej aktywnej struktury po rozcieńczeniu i utlenieniu tych środków w kontrolowanych warunkach. Dla oczyszczania przed i po ponownym pofałdowaniu korzystnie stosuje się następujące etapy: aninowymienną chromatografię (Mono Q lub DEAE-Sepharose), filtracyjną chromatografię żelową (superose), chromatoogniskowanie (Monop) oraz chromatografię z oddziaływaniem hydrofobowym (oktylo lub fenylo sepharose). Szczególnie cenna będzie chromatografia wykorzystująca powinowactwo przeciwciał z użyciem monoklonalnych przeciwciał specyficznych wobec IL-li (opisana w przykładzie 3).

(b) IL-li produkowany w komórkach ssaka

IL-11 produkowany w komórkach ssaka będzie oczyszczany z kondycjonowanej powyżki za pomocą etapów, które obejmują chromatografię jonowymienną i chromatografii bazującej na immunopowinowactwie przy użyciu monoklonalnych przeciwciał opisanych w przykładzie 3.

Dla fachowców będzie oczywiste, ze można wykonać różne modyfikacje i zmiany w procesie i produktach według wynalazku. Tak więc, intencją obecnego wynalazku jest pokrycie modyfikacji i zmian tego wynalazku, jeśli wchodzą one w zakres wynalazku przedstawiony w zastrzeżeniach patentowych i ich równoważników.

Należy rozumieć, że w świetle wskazówek zawartych w niniejszym opisie zastosowanie wskazań niniejszego wynalazku do specyficznego problemu lub środowiska znajdzie się w zakresie możliwości fachowca o zwykłych kwalifikacjach w tej dziedzinie techniki. Przykłady produktów wytworzonych sposobem według wynalazku i reprezentatywne sposoby ich wyodrębniania i wytwarzania znajdują się poniżej.

Następujące przykłady ilustrują różne, obecnie korzystne, sposoby realizacji wynalazku. Publikacje podane w tych przykładach są wyraźnie włączone do niniejszego opisu jako odnośniki.

Przykład I. Otrzymywanie białka.

164 003

A. Materiały. Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) i RPMI zostały nabyte w Mediatech, Wasington, D. C. Lymphoprep otrzymano z Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, N. Y. Ludzka IgG, MTT, królicze przeciwciało przeciw prostaglandynie E2, wodorowęglan amonu, ditiotreitol, adiuwanty Freunda kompletny i niekompletny, hipoksantyna, aminopteryna i tymidyna, zostały nabyte w Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. Myszy C3H/HeJ nabyto w Jackson Labs, Bar Harbor, Maine. Myszy BALB/c i komórki szpiczaka P3 otrzymano od dr dr John Kappler i Philippa Marrack w National Jewish Center for Immunology and Respiratory Medicine (NCJ/IRM), Denver, Colorado. Rekombinantową ludzką IL-1 otrzymano z Cistron Biotechnology, Pine Brook, N. J. Oczyszczona fitohemaglutynina została nabyta w Wellcome Diagnostics, Research Triangle Park, N. C. Ludzkie fibroblasty napletka z hodowli pierwotnych otrzymano od dr Richarda Clarka w NJC/IRM, Denver, Colorado. Monoklonalne mysie przeciwciała przeciwkrólicze klasy IgG zostały nabyte w AIA reagents, Aurora, Colorado. Niskometioninowe RMPI otrzymano z wykorzystaniem zestawu Select-Amine z GIBCO Laboratories, Grand Island. N. Y. [³⁵S]-metioninę, difenylooksazol i kwas [1⁴C]-jodooctowy otrzymano z DuPontNEN, Chicago, Illinois. Płodowa surowica cielęca została nabyta w HyClone Laboratories, Logan, Utah. Kolumny Mono Q i Superose 12 zostały nabyte w Pharmacia, Inc., Piscataway, N. J. Kolumny C4 z odwróconymi fazami otrzymano z Synchrom, Inc., Lafayette, Indiana. Kolumny C8 z odwróconymi fazami otrzymano z Applied Biosystems, Inc., Foster City, California. Acetonitryl i glikol polietylenowy 8000 otrzymano z J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, N. J. Kwas trifluorooctowy (TFA) i chlorowodorek guanidyny otrzymano z Pierce Chemicals, Rockford, Illinois. Endoproteinazę Lys C otrzymano z Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana. Płytki do mikromiareczkowania używane do PGE2-ELISA były to: Nunc-Immuno Plate I i otrzymano je z Intermountain Scientific Corporation, Buntiful, Utah. Płytki używane do otrzymywania hybrydoma pochodziły z Costar, Cambridge, Massachusetts.

B. Wytwarzanie monocytowego inhibitora IL-1. Leukocyty ludzkie otrzymane od normalnych dawców na drodze leukoforezy zawiesza się ponownie w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) w stosunku 1 część zagęszczonych komórek na 1 część HBSS, nawarstwia się Lymphoprep i wiruje przy 400 X g w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej. Pobiera się frakcję komórek jednojądrzastych (typowo otrzymuje się 4-5 · 10⁹ komórek/dawcę), przemywa HBSS bez Ca⁺⁺ lub Mg⁺⁺, zawiesza w RPMI nie zawierającym surowicy i nanosi na płytki Petriego powleczone normalną ludzką IgG uwolnioną od LPS przy zastosowaniu chromatografii na Sephadex G200 (6· 10⁷ komórek w Dml na 100 mm płytkę). Wszystkie odczynniki zawierały mniej niż 10pg/ml LPS. Komórki hoduje się w ciągu 24-48 godzin, a powstałe kondycjonowane podłoże do supernatant stanowiący surowy inhibitor IL-1 (IL-li). Typowo, komórki od jednego dawcy dostarczają 700-900ml supernatantu stanowiącego surowy IL-li.

C. Testy do wykrywania inhibitora IL-1. Rutynowo używa się dwóch testów IL-1 do wykrywania IL-1. Tymocyty (1 · 10⁶ komórek z 4-6-tygodniowych myszy C3H/HeJ) odpowiadają na rekombinantową ludzką IL-1 z fitohemaglutyniną w stężeniu 1pg/ml wykazując proliferację, półmaksymalną, co mierzy się włączaniem [3H]-tymidyny lub pobieraniem soli tetrazoliowej MTT [T. Mosman, J. Immunol. Method, 65. 55-61 (1983)] po trzech dniach stymulacji. Supernatant stanowiący surowy IL-li całkowicie hamuje tę odpowiedź proliferacyjną w rozcieńczeniu 1/10. Ludzkie fibroblasty skóry (1 · 1()5 komórek/dołek w 96-dołkowej płytce) typowo odpowiadają na rekombinantową ludzką IL-1 przez wydzielanie, po upływie 6 godzin po stymulacji, PGE2 w stężeniu około 50000 pg/ml, co można zmierzyć w ELISA. Test ten jest czuły na IL-li w tym samym stopniu, co test tymocytowy.

D. Metaboliczne znakowanie inhibitora IL-1. IL-li znakuje się metabolicznie przez prowadzenie hodowli leukocytów jednojądrzastych w ciągu 48 godzin na płytkach powleczonych IgG (jak opisano w punkcie B) w RPMI nie zawierającym surowicy, a zawierającym niepromieniotwórczą metioninę w stężeniu tylko 0,75 pg/ml (normalne stężenie wynosi 15pg/ml) i do którego dodano 0,5 mCi [35S]-metioniny (1151 Ci/mmol) na 10⁷ komórek. Kontrolne znakowanie prowadzi się tak samo z tym wyjątkiem, ze płytki są powleczone płodową surowicą cielęcą zamiast IgG. Testy przeprowadzone z tymi kontrolnymi supernatantami pokazują, że bardzo niewiele IL-li wydziela się, gdy komórki hoduje się na płytkach powleczonych płodową surowicą cielęcą.

164 003

E. Oczyszczanie aianea mkabitora io-a . Supernatentyetanowiąorsąro v^y ϋ-l dopeOwadza aię chlorkiem sodowym Oo stężenia 1,0 M, inkubie na lodzie w ciągu godziny i wiruje przy 10000 obr/min w ciągu 15 minut. Supe-natanty, w których aktywność inhibitora zachowała się w całości, ale tylko 20% początkowej ilości białka, dializuje się następnie ekstensywnie w temperaturze 4°C wobec 0,025 M Tris, pH 7,6, zawierającego 0,1% sacharozy (bufor A) Oo gradientowego frakcjonowania białek na amonitowej kolumnie Mono Q. Po dializie roztwory zawierające inhibitor Di-uJe się ponownie przy 10000 obr/min w ciągu 15 minut, a następnie przeprowadza przez 0,22μ filtry nylonowe. Supe-natanty typowo łączy się z 10 ml podobnie otrzymanego supernatantu poddanego znakowaniu metabolicznemu i nanosi się na kolumny Mono Q-Superose (Pharmacia FPLC) o objętości złoża albo 1, albo 8 ml, przemyte bufo-rm A Oo powrotu wartości OD280 wycieku Oo linii podstawowej oraz ostrożnie poddaje chromatografii stosując liniowy gradient chlorku sodowego (0,025 Oo 0,10 M) w buforze A. Frakcje z kolumny zbiera się i analizuje pod względem promieniotwórczości i bioaktywności. Próbki każdej frakcji rozwija się również w zredukowanym 12,5% SDS-PAGE, poOOaje aa-wieniu srebrowemu, doprowadza Oo przeniknięcia przez nie Oifenylo oksazolu, suszy i przenosi na błonę fotograficzną w celu uzyskania danych autoraOiograficznycO. Figura la przedstawia profil białkowy chromatografii Mono Q 40 ml supernatantu stanowiącego surowy IL-li zmieszanego z 3 ml supr-natantu stanowiącego IL-li znakowany metabolicznie. Nakłada się wartości promieniotwórczości stwierdzone w 50 pl każdej frakcji i bioaktywności IL-li z pomiaru w teście tworzenia PGE2. Zostają wykazane dwie główne i jedna pomniejsza substancja promirnlotwe-cze, które doskonale odpowiadają trzem pikom aloaktywności. Figura 1b przedstawia podobny proces chromatograficzny 15 ml supe-natantu stanowiącego surowy IL-li zmieszanego z 3ml supe-natantu z nonocytew metabolicznie znakowanych na płytkach powleczonych płodową surowicą cielęcą (FCS) zamiast IgG. Poziom trzech promieniotwórczych substancji jest znacznie zmniejszony. Figura 2a przedstawia żele barwione srebrowe, na których rozwijano frakcje z regionów, o które chodzi, z procesów chromatograficznych przedstawionych na figurach 1a i 1b. Należy zauważyć, ze frakcje z piku promieniotwórczości i bioaktywności na figurze 1a (frakcje 52 i 59) obydwie przedstawiają główne pasmo o 22 kiloOaltonacO (wskazane strzałkami) w SDS-PAGE. Trzecia substancja (frakcja 48 na figurze la) wykazuje pasmo odpowiadające 20 kiloOaltonom w SDS-PAGE. Eksperymenzy z sączeniem żelowym surowego IL-li wskazują, że aktywna cząsteczka ma masę cząsteczkową 18-25 niloOaltoneD. Figura 2b jest autoraOiogramem żelów przedstawionych na figurze 2a. Można łatwo stwierdzić, że pasma białkowe o 20 i 22 kllo0altonac0 są głównymi substancji promieniotwórczymi w tych frakcjach.

Podsumowując te wyniki, wykazano, że znakowanie metaboliczne monocytów naniesionych na płytki powleczone IgG daje w wyniku substancje promieniotwórcze, które są wytwarzane w nieznacznym tylko stopniu, jeżeli komerki zostały naniesione na płytki powleczone FSC. Te indukowane substancje promieniotwórcze doskonale kochromatografują się z wieloma substancjami o bioaktywności IL-1i na Mono Q, a żele i powstałe autoraOiogramy wskazują, że trzy główne indukowane rodzaje cząsteczek są białkami o masie cząsteczkowej przewidywanej Ola IL-li.

Cząsteczki IL-li oczyszcza się dalej, Oo sekwencjonowania, na dwóch drogach. Najpierw, frakcje Mono Q z pikiem bioaktywności i promieniotwórczości nanosi się na kolumnę C4 z odwróconymi fazami i eluuje gradientem H2O/0,1% TFA:acetonitryl/0,1% TFA. Ponieważ cząsteczki IL-li zostały śladowo znakowane, próbki z każdej frakcji zlicza się bezpośrednio poO względem promieniotwórczości, a także analizuje za pomocą SDS-PAGE, a następnie autoradiografii. Figura 3a przedstawia c0-omatog-em z nałożonym rozkładem promieniotwórczości. Żele ba-Dione srebrowo, na których rozwijano próbki z każdej frakcji (figura 3b), a następnie eutorediogramy tych żelów (figura 3c)ponazują, ze cząsteczki IL-li znajdowane są we frakcjach 32-36. Te frakcje wysusza się i sekwencjonuje. Alternatywnie, frakcje piku Mono Q suszy się za pomocą Speed Vac, zawiesza ponownie w 0,4 ml 0,05 M HN4HCO3 i bezpośrednio chromatografie dwukrotnie na 10 X 300 mm kolumnie Oo sączenia żelowego Superose 12 (P0armacia FPLC) zrównoważonej tym samym buforem, jak przedstawiono na figurach 4a i 4b. Frakcje zbiera się i próbki z każdej frakcji bada się pod względem promieniotwórczości i bioaktywnej oraz przez barwienie s-rb-owe i autoradiografię żelów SDS-PAGE. Odpowiednie frakcje suszy się następnie za pomocą Speed Vac i sekwencjonuje.

164 003

Przykład II. Proponowane scOwencjónówanie inhibitora IL-1.

Przed sekdencjónówanlem próbki rozpuszcza się w 6 M guanidynie-HCl, pH 8,6, redukuje w ciągu 4 godzin w temperaturze 37°C w atmosferze azotu z zastosowaniem 100-krótnegó nadmiaru molowego dltlótreltólu w stosunku do białka i alkiluje w ciągu godziny z zastosowaniem 400krotnego nadmiaru kwasu [1⁴C]-Jodóoctówcgo. W tym przypadku mieszaniny reakcyjne mogłyby zostać cesólónc na kolumnie C8 z odwróconymi fazami, e^owane i częściowo wysuszone. Nkońcowe sekwencje określa się za pomocą sekdencera białkowego Applied Biosystems. W celu otrzymywania sekwencji wewnętrznych, próbki, które mogły zostać zredukowane i alkilowane należałoby strawić z zastosowaniem bromocyjanu lub enzymów proteolitycznych metodami znanymi fachowcom o zwykłych kwalifikacjach w tej dziedzinie techniki. Mieszaniny reakcyjne zostają osuszone, rozpuszczone w 0,1% TFA/H2O i rozdziela się peptydy z zastosowaniem kolumny C8 z odwróconymi fazami.

Przykład III. Oczyszczanie i sekwencjonówanle poszczególnych rodzajów inhibitora IL-1.

A. Rodzaje: IL-li-X, IL-li-a i IL-li-b. Oczyszczanie na Mono Q rozdziela aktywność biologiczną na trzy główne rodzaje, jak przedstawiono na figurze la 1 opisano w przykładzie I, gdzie frakcjami odpowiadającymi pikom tej aktywności były: 48, 52 i 59. SDS-PAGE próbek tych frakcji, jak przedstawiono na figurze 2a, ujawnia ódgówleemc rodzaje białka o, odpówieenlc 20,22 i 22 kllcyaltónaoh. Analiza tych żelów techniką Western, przy zastosowaniu mysich immunósurówic omówionych w przykładzie IV poniżej, ujawnia wszystkie trzy z tych rodzajów. Gdy IL-li otrzymuje się z komórek metabolicznych znakowanych [^Sj-metioniną przy wzroście na płytkach powleczonych IgG, każde z tych pasm jest promieniotwórcze (jak przedstawiono na figurze 2b, autoraeiógramic żelu powyżej wspomnianego). Na podstawie wywodu logicznego dyskutowanego w przykładzie I, a mianowicie tego, że komórki w warunkach nleineukującoch nie tworzą bioaktywności IL-li i nie tworzą tych pasm grómienictwźrczoch, można wyciągnąć wniosek, że te trzy rodzaje są odpowiedzialne za aktywność biologiczną. Zostały one tymczasowo nazwane, odpowiednio, IL-li-X, IL-li-a i IL-li-b.

B. Oczyszczanie i sekwencjonowanie IL-li-X. Frakcje Mono Q zawierające IL-li-X i/lub IL-li-a oczyszcza się dalej za pomocą chromatografii HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie Synchropak RP-4 (C4) i substancje promieniotwórcze poddaje analizie sekwencji. Liczne wysiłki ukierunkowane na bezpośrednie sekwencjónowanie IL-li-a i IL-li-b oczyszczonych za pomocą RP-HPLC nie powiodły się, co sugeruje, że są one chemicznie zablokowane na swoich N-końcach. Jednak jeden preparat IL-li-a (IL-li-aB2p42) dał następującą sekwencję:

10 15 20

BPSGBKSSKMąAF_ISDVHQ a następne preparaty IL- li-X, podobnie oczyszczone za pomocą C4 RP-HPLC, utworzyły tę samą sekwencję:

PrepKxF24 i

PrepKxF23

10 ____U Q A r

20 ν ν κ f

BP BK L K li Q A F I

Są one oczywiście częścią sekwencji znalezionej przy pierwszych wysiłkach se0wencjónówanla IL-li-a. Wnioskiem wynalazców jest, że te dane dotyczące sekwencji przedstawiają N-koniec substancji o 20 kllódaltonach zwanej IL-li-X.

164 003

W tych i wszystkich następnych sekwencjach pozycja podkreślona oznacza albo niemożność zidentyfikowania reszty, albo że istnieje niejasność co do zidentyfikowanej reszty. Gdy dwie (lub więcej) reszty są umieszczone w jednej pozycji, oznacza to, że wykryto więcej niż jeden aminokwas w danym etapie sekwencjonowania, a reszta prawdopodobnie bardziej prawidłowa jest na szczycie.

C. Tworzenie, oczyszczanie i sekwencjonowanie peptydów IL-li-a i IL-li-b. Ponieważ IL-li-a i IL-l i-b są w oczywisty sposób chemicznie zablokowane na swoich N-końcach, peptydy z każdego z nich tworzą się przez trawienie endoprotemazą. Konkretnie, frakcje Mono Q, zawierające albo IL-li-a albo IL-li-b przepuszcza się przez 4,6X250 mm kolumnę C3-RPHPLC (Zorbax Protein Plus), która jest dopuszczalną alternatywą dla kolumny C4 używanej we wszystkich poprzednich eksperymentach. Silnie stopniowane gradienty (0,2% acetonitrylu na minutę przy 0,5 ml/min) oddzielają IL-li-a (figura 8a, b) lub IL-li-b (figura 9a) od głównej zanieczyszczającej substancji promieniotwórczej, ludzkiego lizozymu. Identyczność oczyszczonych substancji potwierdza się na podstawie obecności pojedynczego, promieniotwórczego białka o 22 kilodaltonach w SDS-PAGE i następujących po tym autoradiogramach (figury 8c, d i 9b). Białka zbiera się ręcznie do silikonowych probówek szklanych i do każdej dodaje się 25 ml 0,2% roztworu Tween 20. Następnie zmniejsza się objętość frakcji zawierających IL-li za pomocą Speed-Vac do 50 ml, doprowadza do 300 ml dodatkiem 1% NH4HCO3, z następnym dodaniem 1 mg endoproteinazy. W przypadku IL-li-a użytym enzymem jest Endoproteinase Lys C (Boehringer-Mannheim), podczas gdy IL-li-b rozszczepia się stosując Endoproteinase Asp N (Boehringer-Mannheim). Rozszczepienie prowadzi się w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin, a następnie objętość mieszaniny reakcyjnej zmniejsza do 50 ml za pomocą Speed Vac.

W przypadku IL-li-a próbkę poddaje się chromatografii bezpośrednio, podczas gdy próbkę IL-li-b najpierw poddaje się redukcji przez dodanie 5 ml 50 mM ditiotreitolu w 2 M Tris, pH 8,0, prowadzi się reakcję w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C, karboksymetyluje się za pomocą dodania 1,1^mola kwasu [^{1 * 3 *}H]-jodooctowego w 10ml etanolu (reakcja w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C, w ciemności). Rozdzielenie peptydów przeprowadza się na 2,1 X 260 mm kolumnie, o wąskiej średnicy otworu, Brownlee Aquapore RP-300 (C8) przy szybkości przepływu 100 ml/min stosując Beckman HPLC wyposażoną w sprzęt o mikrośrednicy otworu i pompy zgodnie z mikrośrednicą otworu. Stosuje się 0-100% liniowy gradient (200 min) (HzO/0,1% TFA do acetonitrylu/0,1% TFA). Rozdziały peptydów przedstawiono na figurach 10 i 11. Otrzymana informacja jest następująca:

	1 5	10
B et ŁysC-41	U Q A Γ _ I	_ D ¥ N Q E
	1 5	10 15		20 K 25
B et LyeC-53	_ r Y L _ N	NQLVA_YLQC	Ρ N	UU 8 B£I i J
	1 5I	Y
B << LyeC-61	_ f A I T 8	HU
	1 5
B cK.Ły«C-31	r Υ Γ (j E D 1 5	10 v 15	N	20
	G S	S I T	S
B e<ŁyeC-37	_ o 0 r i _	L u I A 8 B 0 S 0	L G	K 0
	1 5	10 15		20
B ot LysC-35	___£ f I	m £ A f_I ł i	Ł Ł	8 H

to 15 20 25 •<J E T r L G

B p A»pN-51 DVNP2^PYĄBRKQLVASYLąGPNVBL

10 b p AepN-43 osGvurTEPYro ^{1 5} E ¹⁰ '5

B p AspN-39 _PSGBESSPUęAPBTO

5

B p AepN-25 ΟΕΒΓΑΡΙΒ

5 10

I

SI «

B p AepN-30 D _ Ε V t> H L K K I S

164 003

Dwie sekwencje peptydowe są w oczywisty sposób pokrewne otrzymanym wcześniej dla IL-li-X. Jedna z nich, RaLysC-41, jest sekwencją IL-li-a, a druga RbAspN-51, jest sekwencją IL-li-b, co dowodzi, ze trzy substancje IL-li są w końcu ściśle spokrewnionymi białkami, jeśli nie chemicznie i/lub fizycznie zmodyfikowanymi postaciami pierwotnej cząsteczki IL-11. Jeśli zestawi się wymienione sekwencje, wynikną z tego następujące sekwencje złożone:

ł-B ot LysC-411 ł-------B o< LysC-53-------4

I----B ji AspN-39—| |-----B p AepN-51---1 |-------IL-1 ot A2p42-|

C K P

BPSGBKSSKMQAFBISDVNQKTFYLBNNQLVASYLQGPNYNLE80ID N ł-B O/ LysC-3H |------fi β AspN-43-----4

DECVMVTKFYFQED |_-------------LysC-35,37------------t

N

S

G IGG

UODETBLQLEAVBOTDLLI N

I--B Ot LysC-61-1

1----B p AspN-254

D K B F A F I fi U V fi

Okazuje się, że te sekwencje złożone nie występują w innych znanych polipeptydach wymienionych w najbardziej aktualnej publikacji: Protein Identification Resource Database (PIR 16.0). Twórcy wynalazku uważają, że te sekwencje, lub ich nieznaczne warianty, reprezentują klasę cząsteczek zdolnych do działania jako inhibitory IL-1.

Przykład VI. Otrzymywanie przeciwciał swoistych wobec inhibitora IL-1.

Jednotygodniowym myszom Balb/c wstrzykuje się podskórnie IL-1 częściowo oczyszczony (400 X) z surowych supernatantów za pomocą chromatografii Mono Q, dializowany wobec PBS i zemulgowany z kompletnym adiuwantem Freunda. Każda mysz otrzymuje IL-li oczyszczony z 5 ml surowego supernatantu. Myszy otrzymują dawkę przypominającą co dwa tygodnie jako równoważną ilość IL-li zemulgowanego z niekompletnym adiuwantem Freunda. Po upływie siedmiu dni od każdej dawki przypominającej pobiera się próbki surowicy z ogona. Immunosurowice bada się pod względem aktywności przeciw IL-li analizując techniką Western przeniesione plamy immunogenu przeprowadzonego przez SDS-PAGE, jak przedstawiono na figurze 5a [analiza Westerna przy użyciu surowicy normalnej myszy (NMS) i mieszaniny przeciwsurowic wszystkich 5 myszy (M)]. Figura 5b [analiza Westerna przy użyciu oddzielnych próbek krwi wszystkich 5 myszy (A-E)] ukazuje, ze wszystkie myszy wytworzyły przeciwciała przeciw IL-li po trzech wstrzyknięciach IL-li.

Ponieważ przeciwciała monoklonalne będą bardzo wartościowe w klonowaniu genu IL-li ze zbioru ekspresyjnego, oczyszczaniu rekombinantowego białka IL-li i badaniu biologii cząsteczki, rozpoczęto proces tworzenia zespołu przeciwciał monoklonalnych swoistych wobec IL-li.

164 003

W celu tworzenia hybrydom komórek B powyższym myszom wstrzykuje się dożylnie tę samą ilość IL-li w roztworze soli na 24 godziny przed pobraniem śledzion. Splenocyty wyodrębnia się ze śledzion do zimnego zrównoważonego roztworu soli (BSS), przemywa dwukrotnie BSS, miesza z komórkami szpiczaka P3 w stosunku 2· 10⁷ komórek P3 na 10⁸ śledzionowych komórek B i odwirowuje. Dokonuje się fuzji komórek za pomocą wkroplenia 1 ml gorącego, gazowanego (5% CO2) PEG 6000 (40% glikol polietylenowy 6000:60% minimalne podłoże podstawowe) do suchego osadu. Komórki po fuzji przemywa się BSS 1 zawiesza ponownie w 10 ml bogatego podłoża (10% FBS) zawierającego 2· 10⁵ komórek otrzewnowych na ml 1 osad łagodnie rozbija 10 ml pipetą. Objętość uzupełnia się po 20 ml za pomocą dodania dalszej ilości komórek otrzewnowych w podłożu i komórki wprowadza na 96-dołkowe płytki w ilości 0,1 ml/dołek. Płytki umieszcza się w inkubatorze gazowym, a następnie działa na nie w następujący sposób.

Dzień 1 - Dodać 3 X HAT (hipoksantyna, aminopteryna, tymidyna) w bogatym podłożu do końcowego stężenia 1 X .

Dzień 5 - Zmienić podłoże, zastępując je 200^l 1 X HAT w bogatym podłożu.

Dzień 10-Rozpocząć sprawdzanie wzrostu hybryd. Zmienić podłoże, zastępując je 200pl 1 X HAT w bogatym podłożu zawierającym 1,5 · 10⁶ komórek otrzewnowych na ml.

Gdy komórki hybrydowe w dołku są bliskie zlewania się, supernatanty przenosi się do badania, komórki łagodnie zdrapuje się czubkiem pipety i przenosi do 1 ml dołków do hodowli zawierających 1 X HAT w bogatym podłożu +3· 10⁶ komórek otrzewnowych na ml.

Supernatanty z dołków, w których następuje zlewanie się, bada się pod względem aktywności przeciw IL-li, stosując ELISA, w której IL-li częściowo oczyszczony (materiał oczyszczony na Mono Q, taki sam, jaki wstrzykiwano myszom) związany jest z dołkami do mikromiareczkowania. Normalnych surowic mysich i hiperimmunizowanych surowic mysich używa się jako, odpowiednio, kontroli negatywnej i kontroli pozytywnej. Supernatanty pozytywne bada się ponownie, stosując ELISA na płytkach powleczonych oczyszczonym do jednorodności IL-li i przez immunoprecypitację oczyszczonego, metabolicznie znakowanego IL-li. Następuje klonuje się pozytywne komórki przez ograniczone rozcieńczanie i wstrzykuje myszom, które poddano działaniu prystanu w celu tworzenia wysięku. Duże ilości przeciwciał swoistych wobec IL-li można wytworzyć w hodowli tkankowej lub przez obfite tworzenie i zbieranie płynu wysiękowego od myszy. Oczyszczenie tych przeciwciał i przytwierdzenie ich do nierozpuszczalnych kuleczek pozwoli wytworzyć adsorbenty na drodze powinowactwa do oczyszczania rekombinantowego białka IL- li.

Przykład V. Klonowanie cDNA IL-li.

Wykazano, ze monocyty naniesione na płytki Petri'ego powleczone IgG i hodowane w ciągu 24 godzin w obecności [³⁵S]-metioniny wytwarzają [³⁵S]-IL-li, który można zidentyfikować na podstawie jego chromatograficznych właściwości na Mono Q.

W celu określenia, kiedy (podczas 24-godzinnego okresu) IL-li jest wytwarzany z maksymalną szybkością monocyty na płytkach eksponuje się na ^Sj-metioninę (impulsowo) w ciągu krótkiego, dwugodzinnego okresu, w którym to czasie dodaje się nie znakowaną metioninę w dużym nadmiarze i inkubuje w ciągu dodatkowych 2 godzin. Następnie zbiera się podłoże i analizuje pod względem promieniotwórczego IL-li. Ten sposób postępowania stosuje się do monocytów w różnym czasie od naniesienia na płytki powleczone IgG. Stwierdzono, że eksponowanie monocytów na [35S]-metioninę po upływie 15 godzin od naniesienia na płytki prowadzi do wytworzenia maksymalnej ilości ^SJ-IL-li, co wskazuje, że poziom mRNA IL-li jest w monocytach maksymalny po 15 godzinach od naniesienia na płytki z IgG.

Następnie nanosi się świeże monocyty na płytki z IgG nie zawierającą LPS, otrzymaną jak w przykładzie IB. Po inkubacji w podłożu RPMI w ciągu 15 godzin w temperaturze 37°C, komórki przemywa się roztworem soli buforowanym fosforanami, a następnie poddaje lizie z zastosowaniem 4 M tiocyjanianu guanidynowego, 25 mM cytrynianu sodowego, pH 7,0,5% sarkozylu, 0,1 M 2-merkaptoetanolu. Następnie wyodrębnia się z tego lizatu całkowity RNA metodą AGPC P. Chomczyńskiego i N. Sacchi opisaną w Analytical Biochemistry, tom 162, str. 156-159 (1987).

Poli A+RNA wyodrębnia się za pomocą chromatografii na oligo-dT-celulozie metodą H. Aviva i P. Ledera. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69, 1408-1412 (1972), wytrąca etanolem i rozpuszcza do stężenia 0,36^g/^l. 1 pg poli A⁺RNA używa się do otrzymania cDNA według U. Gublera i B. J. Hoffmana, Gene, 25, 263-169 (1983).

164 003 cDNA włącza się do ekspresyjnego zbioru Agt 11 stosując linkery EcoRI z katalogu Bóehringer Mannheim nr 988448 lub New England Bio Lab nr 1070 i instrukcje załączone przez tych wytwórców.

Powstały zbiór, zawierający 10⁶ niezależnych klonów, poddaje się screeningowi w E. coli Y1090rk^_ (Promega Biotec) z odpowiednim przeciwciałem poliklónalnym IL-li jak opisano poprzednio stosując warunki screeningu opisane przez R. A. Younga i R. W. Davisa [PNAS, 80, 1194-1198 (1983)]. Sygnały pozytywne wykrywa się stosując biotynolówanc drugie przeciwciało (takie jak kozia IgG przeciwmysia, Bethesda Research Labs), a następnie koniugat stragawieynafosfataza alkaliczna (Bethesda Research Labs), jak to opisali E. A. Bayer i M. Wilchek w Methods in Biochem^al Analysis, (1979), oraz J. L. Guesdon,, T. Ternynch i S. Avrameas w J. ^stochem. Cytochem., 27, 1131-1138 (1979), a także zgodnie z instrukcjami wytwórcy.

Przykład VI. Otrzymywanie i se0wencjcnowanle genu kodującego IL-li.

cDNA otrzymany jak opisano w powyższym przykładzie V włącza się do wektora klonującego

AGT10. Najpierw metyluje się ten cDNA stosując metylazę EcoRI z S-adenozylomctiónlną jako Substratem, przyłącza linkery EcoRI w reakcji ligówania i nadmiar linkerów usuwa za pomocą trawienia enecnukleazą EcoRI i chromatografię na kolumnie spinowej CL6B. Przeprowadza się reakcję ligowania przy zawartości 0,124pg zaopatrzonego w linkery, selekcjonowanego pod względem wielkości cDNA i 1 pg AGT10 przeciętego EcoRI i poddanego działaniu fosfatazy. Produkty tej reakcji ligowa^a upakowuje się stosując ekstrakty upakowujące GIGAPACK GOLD (Stratagene). Daje to zbiór składający się z 1· 10⁷ jego członków.

W celu screeningu tego zbioru GT10 syntetyzuje się sondy óligonuOleótydowc (antysensowne) na bazie sekwencji białkowych i pep^owych przedstawionych w powyższym przykładzie III. Sekwencje sond i odpowiadające im sekwencje pep^owe są jak następuje.

Sonda nr ILlil-3

Sonda nr ILU 1-4Sonda nr lLlil-5

Sonda nr ILlil-6

Sonda nr ILlil-7 ttJtacgtJcciiaa} 5*

L C b

Lys Let Gin Ala Phe

T T J A A θ A T J A A J G T J C T J C T 5*

Lys Pbe Tyr Phe Gin Glu Asp

TACCANTGSTljAAjATiAA 5* Lub

Uet Val Thr Lys Pbe Tyr Pbe

C T J C A Ν T T J G T J I I J T G b b b b

Asp Val Asn Gin Lys Thr

5'

TT*GtJtT?TGNAa}aT 5* li C C G

Asn Gin Lys Thr Phe Tyr

Uwaga: N = A, G, C i T.

Sondę nr IL-1i 1-3 fosforuje się ³²P na jej końcu 5' i stosuje do screeningu 3 · 10⁵ łysinek ze zbioru. Sonda hybrydyzowała w sposób odtwarzalny z 3 łysinkami. Jedna z nich, jak wykazano,

164 003 hybrydyzowała też z sondą nr IL-1 i 1-4. Tę łysinkę, GT10-IL-li-2A, poddaje się dalszej hodowli, a DNA wyodrębnia stosując Lambdasorb (Promega) zgodnie z instrukcjami wytwórcy. GT10-IL-li2A zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC) w Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym 40488. DNA trawi się EcoRI, dzieli na 5 równych próbek i poddaje elektroforezie w 1% żelu agarozowym.

Po elektroforezie żele te zabarwia się bromkiem etydyny. Fotografię tego żelu przedstawia figura 12a. Ścieżki 6, 8, 10, 12 i 14 zawierają pięć próbek z trawienia EcoRI. Ścieżka 5 zawiera mieszaninę DNA Λ typu dzikiego przeciętnego HindIII i RF DNA 0X174 przeciętego HaeIII (New England Biolabs), które są użyteczne jako markery masy cząsteczkowej.

Figura 12a pokazuje, że GT10-IL-li-2A zawiera fragment EcoRI o długości 1850 par zasad.

W celu wykazania bardziej rozstrzygająco, że ten fragment o 1850 parach zasad niesie sekwencję kodującą inhibitor IL-1, przeprowadza się blotting techniką Southerna jak następuje. Fragmenty DNA w żelu pokazane na figurze 12a przenosi się na nitrocelulozę z wykorzystaniem zwykłych metod. Następnie nitrocelulozę kroi się wzdłuż na pięć pasków zawierających DNA ze ścieżek 6, 8, 10 ,12 i 14. Paski następnie poddaje się indywidualnie hybrydyzacji z każdą z 5 sond oligonukleotydowych (powyżej), które zostały znakowane [³²P)-fosforanem na końcu 5'. Stężenie oligonukleotydów wynosi 1 pmol/ml, a temperatura hybrydyzacji jest następująca.

Ścieżka	Sonda	Temperatura
6	nr IL1i1 -3	35°C
8	nr IL111-4	42°C
1U	nr IL1i1-5	42°C
12	nr IL 1i 1-6	40°C
14	nr IL111-7	35°C

Po przemyciu paski uszeregowuje się i okleja taśmą w celu przywrócenia wyjściowego arkusza nitrocelulozy, z którym przeprowadza się autoradiografię w obecności ekranu intensyfikującego w temperaturze -70°C w ciągu 24 godzin. Figura 12b jest fotografią tego autoradiogramu. Dostarcza on danych, że wszystkie sondy hybrydyzują specyficznie z fragmentem o 1850 parach zasad, zapewniając, ze fragment ten niesie zasadniczą sekwencję kodującą inhibitor IL-1.

W celu określenia jego sekwencji DNA, DNA GT10-ILli-2A trawi się EcoRI, poddaje elektroforezie w 1% żelu agarozowym i wyodrębnia fragment o 1850 parach zasad. Liguje się go z M13 mp19 strawionym EcoRI i stosuje do transformacji E. coli szczep JM109. Transformanty poddaje się screeningowi ze zwróceniem uwagi na te z nich, którym brak aktywności βgalaktozydazy. Pięć takich tranformantów wyodrębnia się, otrzymuje jednoniciowy DNA i sekwencjonuje według Sangera i in. Sekwencja DNA trzech z tych tranformantów odpowiada końcowi 3' mRNA, podczas gdy dwa transformanty zapewniają sekwencję kodującą białko. Na figurze 13 przedstawiona jest sekwencja DNA, która została otrzymana z kodującego białko regionu cDNA.

Figura 13 przedstawia również przewidywaną sekwencję aminokwasów. Sekwencja od pierwszego aminokwasu alaniny do 29 aminokwasu proliny i od 79 aminowkasu izoleucyny do końca jest hipotetyczną sekwencją aminokwasów. Przewidywana sekwencja aminokwasów od 30 aminokwasu proliny do 78 aminokwasu proliny jest zgodna z sekwencją peptydową opisaną w przykładzie III.

Przykład VII. Sekwencjonowanie GT10-IL-1i-2A i IL-1i.

Część GT10-IL-li-2A została sekwencjonowana, co przedstawiono na figurze 14. DNA koduje białko zawierające sekwencję aminokwasów charakterystyczną dla IL-li (nukleotydy 99557). Tym niemniej jednak, uważa się, że w białku tym może zostać przeprowadzonych szereg modyfikacji przed wydzieleniem go do otoczenia zewnątrzkomórkowego. Te modyfikacje mogą, lub nie, być zasadnicze dla białka pod względem wykazywania przez nie aktywności jako IL-li.

GT10-ILli-2A koduje co najmniej 32 aminokwasy N-końcowe (nukleotydy 3-98) do końca aminowego postaci IL-li znanej jako X. Przyjmuje się, ze w skład tych 32 aminokwasów wchodzi sekwencja lidera wydzielniczego, która zaczyna się przy M kodowanej przez nukleotydy 24-26, kieruje powstający IL-li do otoczenia zewnątrzkomórkowego, a następnie zostaje usunięta przez peptydazę liderową, a ewentualnie inne peptydazy. Zakres, w którym ta sekwencja jest usuwana w

164 003 postaciach α i β IL-li, jest obecnie nieznany, ale oczekuje się, że N-koniec tych postaci jest bliski postaci X. Usunięcie sekwencji lidera wydzielniczego jest prawdopodobnie wymagane, aby białko skutecznie wykazywało aktywność IL-li.

^Μ^γΟγ 349-351 GT10-ILli-2A kodują N-resztę, która jest częścią zgodnego miejsca N-glikozylacji. Na podstawie jego podatności na trawienie N-glikanazą uważa się, że postacie α i β IL-li są glikozylowane. Ponieważ przyjmuje się, że postać X nie jest podatna na trawienie tym enzymem, uważa się, że nie jest ona glmozylowana, aczkolwiek ciągle pozostaje możliwość łatwego udowodnienia tego przez fachowca o zwykłych kwalifikacjach w tej dziedzinie techniki sekwencjonowania białka z wykorzystaniem dostarczonych w niniejszym opisie informacji. Uważa się, ze glikozylacja przy tej N-reszcie nie jest wymagana, by białko wykazywało skutecznie aktywność IL-li.

NukleotyOy 99-101 GT10-ILli-2A kodują P (patrz figura 15), ale nie wykryto P w tej pozycji (koniec N) postaci X IL-li. Możliwe, że ta reszta zostaje zmodyfikowana w dojrzałym białku. Uważa się, że modyfikacja tej reszty nie jest decydująca jeśli chodzi o skuteczną aktywność IL-li.

Obecnie nieznane reszty N-końca postaci α i β nie są w pełni wykrywalne na drodze degradacji Edmana i prawdopodobnie zostają zmodyfikowane po usunięciu pewnych N-końcowych reszt białka kodowanego przez GT10-ILli-2A. Uważa się, że modyfikacja ta nie jest istotna dla skutecznej aktywności IL-li.

Przykład VIII. Ekspresja genów kodujących IL-li w komerkach zwierzęcych.

Ekspresja IL-li w kome-kec0 zwierzęcych wymaga przeprowadzenia następujących etapów: a) konstrukcja wektora ekspresyjnego, b) wybór linii komerek-gospoOarzy, c) wprowadzenie

Dekto-e ekspresyjnego Oo komerrk-gospoOarzy, O) manipulowanie rekombinantowymi komórkaml-gospoOa-zaml w celu podwyższenia poziomu ekspresji IL-li.

1. Wektory ekspresyjne IL-li przeznaczone Oo użycia w komórkach zwierzęcych mogą być kilku typów, obejmując konstrukcje ekspresyjne silnie konstytutywne, konstrukcje genowe podatne na indukcję, jak również przeznaczone Oo ekspresji w określonych typach komórek. We wszystkich przypaOkach promotory i inne regiony regulatorowe genów, takie jak wzmacniacze (podatne na indukcję, lub niepodatne) i sygnały poliadenylacji są stosownie umiejscowione w odniesieniu Oo sekwencjo cDNA w Dekto-ach na bazie plazmidu. Dwa przykłady tego rodzaju konstrukcji są jak następuje: 1) Konstrukcja wykorzystująca silnie konstytutywny region regulatorowy powinna zostać wytworzona przy wykorzystaniu kontrolnych sygnałów genu małpiego wirusa 40 (SV40) w takim uporządkowaniu, jakie stwierdzono w plazmidzie pSV2CAT, jak opisali Gorman i in. w Mol. Cel. Biol., 2, 1044-1051 (1982), publikacji wyraźnie włączonej Oo niniejszego opisu jako odnośniki. Tym plazmidem można manipulować w taki sposób, że cDNA IL-li zastępuje sekwencje kodujące ecetylotnansfrrazę c0loramfenikolową (CAT), stosując standardowe techniki biologii molekularnej (Maniatis i in., wyżej), jak przedstawiono na figurze 6. 2) Konstrukcja genowa podatna na indukcję powinna zostać wytworzona z użyciem plazmidowego PMK, zawierającego region promotorowy mysiej metalotioneiny (MT-1) [Brinster i in., Cell, 27,228-231 (1981)]. Tego plazmidu można użyć jako materiału wyjściowego i powinno się nim tak manipulować, jak pokazano na figurze 7 w celu uzyskania konstrukcji genowej podatnej na indukcję metalem.

2. Można użyć pewnej ilości linii komórek zwierzęcych Oo ekspresji IL-li stosując wektory powyżej opisane w celu wytworzenia aktywnego białka. Dwiema potencjalnymi liniami komórkowymi, które zostały dobrze scharakteryzowane poO względem zdolności Oo promowania ekspresji obecgo genu są mysie komórki Ltk' i komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) dhfr”, chociaż ekspresja IL-li nie jest ograniczona Oo tych linii komórnoa7c0.

3. Wektor DNA powinien być wprowadzony Oo tych linii komórkowych przy zastosowaniu jakiejkolwiek z pewnej ilości technik przenoszenia genów. Metoda zastosowana w niniejszym opisie jest związana z techniką wytrącania DNA fosforanem wapniowym opisaną przez S. L. Grahama i A. S. van der Eba [Virology, 52, 456-467 (1973)], w której następuje koprecypitacja wektora ekspresyjnego IL-li z Orugim Dekto-em ekspresyjnym kodującym marker nadający się Oo selekcji. W przypadku transfekcji komórek Ltk' markerem nadającym się Oo selekcji jest gen kinazy tymidynowej, a selekcję przeprowadza się jak opisali Wigier i in., [Cell, 16, 777-785 (1979)].

164 003

W przypadku komórek CHO dhfr markerem nadającym się do selekcji jest reduktaza dihydrofolianowa (DHRF), przy czym selekcja jest opisana przez Ringolda i in., w J. Mol. Appl. Genet., 1. 165-175 (1981).

4. Komórki, które prze prowadzają zaspresję eonstrokcji kenowych IL-1 i, trzeba następnie hodować w warunkach, które podwyższa poziom wytwarzania IL-li. Komórki niosące konstrukcje z promotorem metalotioneiny można teraz hodować w obecności metali ciężkich, takich jak kadm, co prowadzi do pięciokrotnego zwiększenia użytkowania promotora MT-1 Mayo i in., (Cell. 29, 99-108), a następnie do porównywalnego wzrostu poziomu białka IL-li. Komórki zawierające wektory ekspresyjne IL-li (na bazie albo SV40,albo MT-1) wraz z wektorem ekspresyjnym DHFR można potraktować zgodnie z protokołem amplifikacji genów Ringolda i in., [ J. Mol. Appl. Genet., 1,165-175 (1981)] stosując metotreksat, kompetycyjnego antagonistę DHFR. Prowadzi to do większej ilości kopii genów DHFR obecnych w komórkach i współtowarzyszącej zwiększonej ilości kopii genów IL-li, co z kolei może prowadzić do zwiększonej ilości białka IL-li wytwarzanego przez komórki.

Przykład IX. Oczyszczanie IL-li z rekombinantowych komórek zwierzęcych.

Ponieważ sądzi się, że IL-li będzie wydzielana przez komórki podobnie do naturalnego materiału, oczekuje się, ze powyżej opisane metody oczyszczania naturalnego białka pozwolą na podobne oczyszczanie i charakteryzację białka rekombinantowego.

Przykład X. Sekwencja IL-li.

Aminokońcową resztę IL-li zidentyfikowano wielokrotnie przez bezpośrednie sekwencjonowanie białka jako argininę (R). Wynik takiego sekwencjonowania jest przedstawiony w przykładzie III. W przeciwieństwie do tego· aminokońcową resztą przewidywaną na podstawie sekwencj· cDNA jest prolina^). Ta aminokońcowa reszta odpowiada nukleotydom 85-87 na figurze 13 i jest zaznaczona na figurach 14 i 15. Tę oczywistą niezgodność między sewkencją cDNA a sekwencją białkową jako taką można wyjaśnić przez wzięcie pod uwagę, że błąd w sekwencji cDNA został wprowadzony podczas syntezy katalizowanej przez odwrotną transkryptazę z jego mRNA. To jest kodon CGA (argininy) umiejscowiony w mRNA tak, ze mógł kodować resztę aminokońcową mógł zostać zmieniony podczas reakcji odwrotnej transkrypcji na kodon CCA (proliny) w cDNA. O takim typie problemów z odwrotną transkryptazą donoszono w piśmiennictwie uprzednio, np.: B. D. Clark i in.. Nucccic Acids Reseeach, 14, 7897 S1986).

Twórcy wynalazku uważają, ze prawidłowa sekwencja aminokwasów omawianego białka jest przewidywana na podstawie cDNA z tym wyjątkiem, że aminokońcowym aminokwasem jest arginina zamiast reszty proliny wskazanej na figurach 13-15. Twórcy wynalazku przewidują, że obydwie sekwencje DNA i odpowiadające im sekwencje peptydowe znajdują się w zakresie wynalazku, aczkolwiek uprzywilejowana jest sekwencja z aminokońcową argininą.

164 003 płytka z FCS płytka z IgG

FIG. 2 a

164 003

00215

0D2g0 radioaktywność

FIG. 3b

FIG. 3c —* , <1 Λ, ^r»

KD 25 KD

164 003

164 003

FIG. 5a

Analiza Westerna żele barwione srebrem

FIG. 5b

A B C 0 Ę

164 003

Hmd IH

Trawienie Hpal Hmdtn i Hpol,

2jzolowame dużego fragmentu

FIG. 6

Hmd ΠΙ

Polilinker ma następujące miejsca restrykcyjne Hindin.Smal.Bglll, _Polllinker

Ligacja z polilinkerem syntetycznym 2 Transformacja E coli

tepego końca

0omotor

Trawienie EcoRI wprowadzanie koncow tępy dla wytworzenia tępych koncow

Oczyszczanie fragmentu ikb zawierającego promotor MT-1 miejsce BglD i HSV-1 tk kon.ec^\ Promotor

Jotępy koniec

Ifk

Mieszanie fragmentów 1 i 2 Ligacja Transformacja Ecoli Izolacja plazmidu DNA Sprawdzanie struktury przez trawienie restrykcyjne

164003 FIG. 7 (cd)

Promotor

Promotor

EcoRI —iEcoRI

Przecięcie EcoRI Oczyszczanie małego fragmentu (IL-1 i cDNA) drogą elektroforezy z użyciem zelu agarozowego

J Ligocja

Przecięcie

EcoRI

Łączenie pMK-SGE-2 przeciętego EcoRI i IL-1 i cDNA i ligocja Transformacja E coli i izolacja plazmidu Sprawdzanie obecności i orientacji fragmentu IL-1 i cDNA Promotor

164 003

FIG. 8c

FIG. 8b ' /

FIG. 8d

FIC 9b

164 003

FIG. 9o

FIG. 9b

X

3Η

374,00 88,00 12200 84,00 10600 75,00 83,00 71,00 50,00 76,00 77,00 58,00 69,00 141,00 89 00 111,00 7600 83 00 276,00 73,00 67,00 77,00 70,00

355 Γ 21,00 13 25,00 16 16,00 20 16,00 22 21,00 23 2100 25 32,00 27 37,00 28 23)00 30 33,00 34 16,00 37 26,00 38 38,00 39 2100 41 38,00 43 15,00 46 27,00 48 1600' 50 56,00 51 18,00 53 2300 54 1600 57 2300 58 2200 60 23,00 62

Peptyd

FIG. 11

Kolejność sekwencjonowam 51,43,39,25,30,50,28,41,48,54,27,46

F/G. 12A

6 8 10 12 14 |3S8:Bi3:2r

164 003

FIG. I2B

6 8 10 12 14

GCG Ala

TCA CAG AAT GGA AAT CTG

FIG. 27

13

54 CCT Pro

CAG Gin

AGG Arg

CCT CCG CAG

TCA CCT AAT CAC TCT

Ser

Gin Asn

Glv

Asn

Leu

Pro

Pro

Gin

Ser

Pro

Asn

His

Ser

81

108

CCT

CTT

CTG

ATC

ATT

CAG

AGA

CCG

ATC

TGC

CCA

CCC

TCT

GGG

AGA

AAA

TCC

AGC

Pro

Leu

Leu

Ile

ile

Gin

Arg

Pro

Ile

Cys

Pro

Pro

Ser

Gly

Arg

Lys-

Ser

Ser

13S

162

AAG

ATG

CAA

GCC

TTC

AGA

ATC

TGG

GAT

GTT

AAC

CAG

AAG

ACC

TTC

TAT

CTG

AGG

Lys

MET

Gin

Ala

Phe

Arg

Ile

Trp

Asp

Val

Asn

Gin

Lys

Thr

Phe

Tyr

Leu

Arg

189

216

AAC

AAC

CAA

CTA

GTT

GCT

GGA

TAC

TTG

CAA

GGA

CCA

AAT

GTC

AAT

TTA

GAA

GAA

asn

Asn

Gin

Leu

Val

Ala

Gly

Tyr

Leu

Gin

Gly

Pro

Asn

Val

Asn

Leu

Glu

Glu

243

270

AAG

ATA

GAT

GTG

GTA

CCC

ATT

GAG

CCT

CAT

GCT

CTG

TCT

TGG

GAA

TCC

ATG

GAG

I^Lys

Ile

Asp

Val

Val

Pro

I Ie

Glu

Pro

His

Ala

Leu

Ser

Trp

Glu

Ser

MET

niu

164 003

FIG. 14

20 * 30 40 50 60

GAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCA

MEICRGLRSHLI

80 90 lAo 110 120

CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCC£ACCCTCTGGGAGAAAATCCA T L L L F L F H S Ε Τ I C ® P S G R K S

130 140 150 160 170 180 GCAAGATGCAAGCCTTCAGKATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA S K M Q A F R I WDVNQKTFYLRN

190 200 210 220 230 240 ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEKID

250 260 270 2Θ0 290 300

TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT V V Ρ I Ε P , H A L F L G I HGGKHCL

310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNITD

370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF I RSDSGP

430 440 450 460 470 480 CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEA

490 500 510 520 530 540 ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQPVSLTNMPDEGVMVTKFY

550 *560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E *

164 003 ' Μ Ε I C R

S Ε Τ I C

W D V Ν Q

Q G Ρ Ν V

LFLGI

T R L Q L

K R F A F

C P G W F

Μ P D E G

	FIG.	15
G	L	R	s	10 H	L	I	T	L
®	P	S	G	30 R	K	S	s	K
R	’T	F	Y	50 L	R	N	N	Q
N	L	E	E	70 K	I	0	V	V
H	G	G	K	90 M	C	L	s	C
E	A	V	N	110 I	T	D	L	s
I	R	s	D	130 S	G	P	T	T
L	C	T	A	150 M	E	A	D	Q
V	M	V	T	170 K	F	Y	F	Q

L L F L F H

M Q A F R I

L V A G Y L

Ρ I Ε Ρ H A

100

V K S G D E

120

Ε N R K Q D

140

S F E S λ A

160

Ρ V S L T N

E D E

164 003

OOJBO radioaktywność bioakty wnoSć gradient NaCl

OOjto radioaktywność

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 10 000 zl

Claims (20)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzynia torów ioterleukiny-1 mytodą reOombinontbweno DNA przez przenoszenie wektora zawierającego sekwencję DNA Oo komórki gospodarza, hodowanie komórki zawierającej włączony Oo niej wektor zawierający sekwencję DNA i wyodrębnianie produktu, znamienny tym, ze hoduje się komórkę gospodarza zawierającą włączony Oo niej wektor zawierający sekwencję DNA kodującą białko o aktywności inhibitora interleukmy-1, przy czym ta sekwencja DNA koduje białko o następującej sekwencji aminokwasów:

   (U) (X) ?sgrksskmqafriwdvnqktfylrn

   NQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHA

   LFLGI HGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV

   NITDLSENRKODKRFAFI RSDSGPTTSF

   ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDE

   GVMVTKFYFQEDE gdzie (U) oznacza M lub jest nieobecne, a (X) oznacza P, względnie ta sekwencja DNA hydryzuje do DNA komplementarnego do sekwencji DNA zdefiniowanej powyżej.
2. 2 Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się cDNA.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako sekwencję DNA stosuje się sekwencję polinukleotydu genomowego.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się sekwencję pochodzącą z komórek ssaka.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się sekwencję pochodzącą z komórek monocytu ludzkiego.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się mikroorganizm.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako mikroorganizm stosuje się E. coli.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę ssaka.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako komórkę ssaka stosuje się komórkę jajnika chomika chińskiego.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się polinunlrotyO cDNA.
11. 11. Sposób wytwarzania inhibitorów metodą rrkombinentowrgo DNA przez przenoszenie wektora zawierającego sekwencję DNA do komórki gospodarza, hodowanie komórki zawierającej włączony Oo niej wektor zawierający sekwencję DNA i wyodrębnianie produktu, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza zawierającą włączony Oo niej wektor zawierający sekwencję DNA kodującą białko o aktywności inhibitora interleukiny-1, przy czym ta sekwencja DNA koduje białko o następującej sekwencji aminokwasów:

    (U) (X) PSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRN nqlvagylqgpnvnleekidvvpiepha LFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV NITDLSENRKODKRFAFI RSDSGPTTSF ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDE

    GVMVTKFYFQEDE gdzie (U) oznacza M lub jest nieobecne, a (X) oznacza R, względnie ta sekwencja DNA hydryzuje Oo DNA komplementarnego Oo sekwencji DNA zdefiniowanej powyżej.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się cDNA.
13. 13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się sekwencję polinukleotydu genomowego.

    164 003 3
14. 14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się sekwencję pochodzącą z komórek ssaka.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że jako sekwencję DNA stosuje się sekwencję pochodzącą z komórek monocytu ludzkiego.
16. 16. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się mikroorganizm.
17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako mikroorganizm stosuje się E. coli.
18. 18. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę ssaka.
19. 19. Sposób według zastrz. 18. znamienny tym, ze jako komórkę ssaka stosuje się komórkę jajnika chomika chińskiego.
20. 20. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, ze jako sekwencję DNA stosuje się polinukleotyd cDNA.