JP3192651B2

JP3192651B2 - インターロイキン―１インヒビター

Info

Publication number: JP3192651B2
Application number: JP50639389A
Authority: JP
Inventors: ハノン，チャールズ，エッチ．; エイゼンバーグ，ステファン，ピー．; トムプソン，ロバート，シー．; アレンド，ウィリアム，ピー．; ジョスリン，フェネック，ジー．; ソマー，アンドリアス
Original assignee: アムジェン，インコーポレーテッド; ザユニバーシティーオブコロラドファウンデーション
Priority date: 1988-05-27
Filing date: 1989-05-25
Publication date: 2001-07-30
Anticipated expiration: 2016-07-30
Also published as: NO20014783D0; NO905090L; JP2001029093A; AU3746989A; DK8591D0; HU893412D0; DK172763B1; DK8591A; BR8907457A; NO316122B1; HU222810B1; NO905090D0; WO1989011540A1; OA09631A; AU633831B2; FI905812A0; FI109206B; HU9803037D0; JPH03505279A; KR970002917B1

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景本出願は、同一発明者による米国特許出願第238,713
号、1988年８月31日出願、の一部継続出願であり、さら
にこの米国特許出願第238,713号は米国特許出願第199,9
15号、1988年５月27日出願、の一部継続出願である。

A.IL−１インターロイキン−１は単球およびいくつかのマクロ
ファージを含む多数の細胞型により生産されるタンパク
質の一クラスである。このクラスには少なくとも２種
の、インターロイキン−１アルファおよびインターロイ
キン−１ベータとして知られる17−18キロダルトンタン
パク質が包含される。これらのタンパク質は炎症および
免疫応答に関与する多数の様々な標的細胞に対して重要
な生理学的作用を及ぼす。このタンパク質はＴ−細胞に
対するコーマイトジェン（フィトヘマグルチニンととも
に作用する）であり、線維芽細胞および軟骨細胞の両者
に非活性型コラゲナーゼの分泌を引き起こさせそして好
中球に対する内皮細胞の表面粘着力を増加させる。さら
に、インターロイキン−１はパイロジェンとして視床下
部に作用し、筋肉タンパク質の異化作用を刺激し、そし
て肝細胞に「急性期反応体」として知られるある種のタ
ンパク質の合成を惹起させる。したがって、インターロ
イキン−１（IL−１）が感染および創傷に対する生体応
答の重要な一部であることは明白である。

B.IL−１の病理学的役割しかしながら、IL−１は通常は有益に作用するにも関
らず、IL−１の作用が有害となるような状況が明らかに
なった。例えば、IL−１は関節炎にかかった関節内での
コラゲナーゼレベルを増加させることができ、そして慢
性関節リウマチにおける急性期および慢性期の両方の免
疫病理のメジエーターとして関わっている。IL−１は内
皮細胞機能を変化させ、白血球およびリンパ球の滑膜組
織への化学走性および移動を指示し、毛細管増殖を誘導
し、そして本疾患の急性期の滑膜被覆におけるマクロフ
ァージの蓄積を刺激することができる。組織破壊の段階
では、IL−１は線維芽細胞および軟骨細胞からの酵素放
出を刺激することによって組織損傷におけるメジエータ
ーとして関与している。

さらに、乾癬患者の皮膚に於けるIL−１の過剰生産が
明らかとなっており、乾癬性関節炎患者の滑液中では高
レベルのIL−１が見出されうる。乾癬性関節炎で炎症を
起こした滑膜の細胞によって放出されたIL−１は、他の
細胞からの酵素放出を刺激することによって組織破壊を
媒介できる。ライター症候群の関節病理は乾癬性関節炎
および慢性関節リウマチでみられる病理と同様である。
IL−１はこれら３種の異なる炎症性関節炎形態における
組織破壊のメジエーターとして関わっている。さらに、
骨関節炎患者の滑液中にIL−１が見出されうる。軟骨細
胞によるIL−１の放出はこの疾患における関節軟骨の破
壊に関与している。

また、IL−１は自己免疫疾患を重くしうる。例えば、
全身性エリテマトーデスにかかった人物の末梢血液細胞
からのIL−１産生の減少が記載されている。さらに、Ｂ
リンパ球機能のいくつかの変化はIL−１生産またはIL−
１利用可能性の異常と関連しているのかもしれない。

硬皮症患者の末梢単球におけるIL−１の過剰生産が示
されており、線維芽細胞によるコラーゲン生産を刺激す
ることによって線維症を起こし得る物質としてIL−１が
関与している。また皮膚筋炎における組織損傷のメカニ
ズムも細胞性免疫に関わっている可能性があり、したが
ってIL−１はこのような病理生理学的過程にメジエータ
ーとして関わっているのであろう。

急性および慢性の間質性肺疾患はIL−１が刺激しうる
肺線維芽細胞による過剰なコラーゲン生産を特徴とす
る。肺高血圧症の動物モデルに関する最近の研究では、
肺動脈の狭窄をもたらす内皮細胞の変化がIL−１によっ
て誘導される可能性のあることが示される。肺高血圧症
およびさらに二次的な損傷を引き起こすのはこの狭窄で
ある。従って、IL−１インヒビターはこれらの肺疾患の
治療に有用であろう。

最近の研究で示されるように、IL−１はインスリンの
生産を担うランゲルハンス島のベータ細胞を直接的に害
することができる。現在その細胞に対するIL−１による
損傷が若年性糖尿病の急性期に於ける初発事象であると
の仮説がたてられている。

急性および慢性糸球体腎炎の多くの型においては、腎
臓に於ける単球およびマクロファージの浸潤が主にみら
れる。これらの細胞からのIL−１の放出が他の炎症性細
胞の局所的な蓄積を引き起こして、結局は腎臓における
炎症性損傷および線維形成反応をもたらす。

痛風および偽性痛風の組織または関節液中に見いださ
れる結晶はマクロファージによるIL−１放出を直接刺激
できることが示されている。したがって、IL−１はこれ
ら疾患の炎症性サイクルにおいて重要なメジエーターで
あろう。

IL−１は骨からのカルシウムの損失を惹起することが
でき、そして炎症性関節疾患にみられるオステオポロシ
スの原因であろう。

乾癬患者由来のケラチン細胞は大量のIL−１を放出す
る。このメジエーターはこの疾患患者の皮膚に生じる二
次的細胞増殖および蓄積の原因であろう。

IL−１は重要な内因性パイロジェンの一つであり、そ
して細菌またはウイルスによる急性の熱性病気のような
いくつかの感染性疾患でみられる著しい発熱を引き起こ
すのであろう。

サルコイドーシスは、身体の多数の様々な器官に於け
る肉芽腫性疾患を特徴とする。IL−１はインビトロで肉
芽腫形成を誘導しうることが示されており、サルコイド
ーシス患者のこのような過程に関与している可能性があ
る。

クローン病および潰瘍性大腸炎由来の末梢単球に於い
てはいずれもIL−１の過剰生産が示されている。腸内の
おける局所的なIL−１放出は、これら疾患の炎症性サイ
クルを刺激する重要なメジエーターであろう。

ある種のリンパ腫は、発熱、オステオポロシスおよび
さらに二次的な関節炎さえも特徴とする。いくつかのリ
ンパ腫細胞による過剰なIL−１の放出がインビトロで明
らかになっており、これら悪性腫瘍の臨床的な徴候のい
くつかの原因でありうる。また、一部の悪性リンパ球に
よるIL−１生産によって、白血球でみられる発熱、急性
期応答および悪液質の一部が引き起こされる可能性があ
る。

脳のアストロサイトによるIL−１放出が脳損傷後の血
管閉塞から生じうる線維症誘発の原因であると考えられ
る。

C.IL−１インヒビターの用途 IL−１が有害な作用を有する上記のようなまたは他の
状況に於いては、IL−１作用のインヒビターには明らか
に臨床上の用途が存在する。IL−１はＴ細胞に対するコ
ーマイトジェンであるため、自己免疫疾患および他の免
疫疾患の発症の主因である。したがって、全身に投与さ
れれば、IL−１インヒビターは有用な免疫抑制剤となり
得る。局所適用ではかかるIL−１インヒビターは、炎症
を起こした関節内や他の炎症部位における組織破壊を阻
止することができよう。事実ある種のIL−１インヒビタ
ーはコラゲナーゼインヒビターとともに投与された場
合、組織破壊を妨げるのにさらに効果的であろう。

合成、分泌、またはIL−１に対する標的細胞の結合あ
るいは応答のレベルで、IL−１作用に対する治療的介入
が可能であろう。IL−１はリボ多糖類、補体フラグメン
トおよびウイルスに応答して単球／マクロファージおよ
び他の細胞により合成される。これらの誘導因子が産生
細胞に結合するのを阻止する任意の分子、あるいはこれ
ら細胞の生理に及ぼすそれらの作用を妨害する任意の分
子がIL−１作用の調節物質として役立つであろう。IL−
１タンパク質の少なくとも２種の30kd前駆体をコードす
るmRNAが単離された、このものは疎水性シグナル配列を
含まないため、通常の分泌計によってはIL−１は分泌さ
れない。不活性前駆体からの活性タンパク質の放出には
おそらく前駆体のタンパク分解が必要である。１ないし
それ以上のIL−１を前駆体から放出することに対するイ
ンヒビターは、理論上にはIL−１の作用を制御するはず
である。IL−１はおそらく古典的なレセプター（そのよ
うなレセプターはまだ単離されていないが）を介する経
路によって標的細胞に作用する。したがって、レセプタ
ーへのIL−１の結合を妨げ、またはこのレセプターをダ
ウンレギュレートする分子は、IL−１の作用をも調節で
きよう。さらに、IL−１のレセプター結合に続いて細胞
内で生起する事象は未だ完全にはわからないが、レセプ
ターで媒介される他の事象に対する細胞の応答を妨げそ
してそれゆえにIL−１の作用を阻止しうる物質が存在す
る可能性がある。以上述べた理由から、上記様式の一ま
たはそれ以上でIL−１を阻害しうるタンパク質および小
分子が探索されている。

驚くべきことに、本発明者らはIL−１阻害性質を有す
る少なくとも２種のIL−１インヒビタータンパク質を見
出した。これらの分子は精製型で得られており、当業者
がそのアミノ酸配列を決定できよう。さらに、これらの
タンパク質を生産する細胞標品が特性決定されており、
そしてその合成をもたらすmRNAが特性決定されている。
最後に、これらインヒビターをコードする遺伝子に関す
るcDNA発現ライブラリーのスクリーニングを容易にする
であろう抗血清が開発されている。これらの物質を一緒
に用いることによってIL−１インヒビターをコードする
cDNAのクローニングが可能となろう。これらの遺伝子は
次にIL−１により媒介される病理生理学的症状の治療に
有用な医薬製剤における使用に適したIL−１インヒビタ
ーの大規模生産を可能にしよう。

発明の要約本発明は一般的にはIL−１インヒビター（“IL−1
i"）に関し、そしてより詳細には単球由来IL−１インヒ
ビターに関する。さらに、本発明はこれらインヒビター
の生物学的に活性な類似体にも関する。

本発明の目的は、IL−１αまたはIL−１β、またはそ
の組合せ物に対して活性な精製型IL−１インヒビターを
提供することにある。本発明のもう一つの目的は、これ
らのインヒビターを精製型で提供して、それらのアミノ
酸配列の決定を可能にすることである。さらに他の目的
は、特定のIL−１インヒビターのアミノ酸配列を提供す
ることである。さらに、このようなIL−１インヒビター
より強いかまたは同等な性質を有する生物学的に活性な
類似体を同定することも本発明の目的の一つである。

さらに、ここに述べたIL−１インヒビター生産のため
の組換えDNA系を提供することも本発明の目的である。
本発明のさらに他の目的には、IL−１に対して活性を示
す医薬製剤として価値があろう精製型IL−１インヒビタ
ーを提供することも包含される。

本発明の他の目的および利点は一部は以下の説明文中
で述べるが、また一部はその記述から明白であるかある
いは本発明の実施から学ぶことができよう。特に添付の
請求の範囲に示した手段およびその組合せによってこれ
ら目的および利点が実現され達成されよう。

これら目的を達成するために、そして本発明の目的に
したがって、IL−１に対して阻害活性を示すIL−１イン
ヒビターを開示する。好ましいインヒビターはIgG被覆
プレート上で増殖させた単球を用いる単球−馴化培地か
ら精製形で単離されている。

本発明の好ましいインヒビターには、1,2,および３が
ある。インヒビター１および２はSDS−PAGE上で22−23k
Daタンパク質に特徴的な位置に移動し、特定の条件下
で、Mono Q FPLCカラムからそれぞれ52mMおよび60mM Na
Clで溶出するタンパク質である。インヒビター３はSDS
−PAGEで2kDタンパク質に特徴的な位置に移動し、特定
の条件下でMono Q FPLCカラムから48mM NaClで溶出する
タンパク質である。さらに、目的を達成するために、そ
して本発明の目的にしたがって、活性成分の少なくとも
１種である本発明によるIL−１インヒビターまたは本文
に述べる生物学的に活性なその類似体を含有する医薬組
成物が開示される。

さらに、目的を達成するために、そして本発明の目的
にしたがって、これらのIL−１インヒビターおよびその
類似体を生成させるための組換えDNA系も開示される。
この系の好ましい態様には、本文中に開示されるIL−１
インヒビターを発現できる発現系を構成するベクターお
よび細胞とともに、少なくとも１種のIL−１インヒビタ
ーをコードする少なくとも一種のcDNAクローンまたはそ
の合成同等物が包含される。これらのcDNAクローンを同
定するのに用いられる抗血清も提供される。これらcDNA
クローンは、その類似体、またはこれらインヒビターを
コードする他のDNA配列を用いるこれらIL−１インヒビ
ター生産のための発現系も提供される。

図面の簡単な説明第1a図および第1b図は二種の代謝標識された単球上清
のMono Qクロマトグラフィーのタンパク質プロフィルを
示す。細胞はIgG（1a）またはウシ胎児血清（1b）を被
覆したプレート上で培養した。

第2a図は、第1a図および第1b図に示される領域からの
フラクションの銀染色ゲルを示す。

第2b図は、第2a図に示されるゲルのオートラジオグラ
ムである。

第3a,bおよびｃ図は実施例１の精製IL−1iに関するデ
ータを示す。第3a図は放射能パターンを重ねたクロマト
グラフィーデータを示す。第3b図は第3a図に示したフラ
クション試料に行った銀染色ゲルを示す。第3c図は第3b
図のゲルのオートラジオグラムを示す。

第4aおよび4b図は、Mono Q精製IL−1iのゲル濾過クロ
マトグラムの結果を示す。

第5aおよび5b図はマウス抗血清のウェスタン分析を示
す。

第６図はプラスミドpSVXVPL2IL−1iの作製を示す。

第７図はプラスミドpMK−SGE:IL−1iの作製を示す。

第8a−ｄ図はIL−1i−αに関するデータを示す。第8a
および8b図はクロマログラフィーデータを示す。第8c図
は第8b図に示されるフラクション試料に対して行った銀
染色ゲルを示す。第8d図はオートラジオグラムを示す。

第9aおよび9b図はIL−1i−βに関するデータを示す。
第9a図はクロマトグラフィーデータを示す。第9b図はSD
S−PAGEデータを示す。

第10図はIL−1i−αのペプチド分離データを示す。

第11図はIL−1i−βのペプチド分離データを示す。

第12a図は実施例６による電気泳動後にEcoR I消化し
たGT10−IL1i−2Aのゲルの写真である。

第12b図は第12a図に示されるゲルのサザンブロットの
オートラジオグラムデータを示す。

第13図は、実施例６によるラムダGT10−IL1i−2Aのタ
ンパク質コード領域のDNA配列および予想アミノ酸配列
の一部を示す。

第14図はGTl10−IL1i−2Aのヌクレオチド配列を示
す。

第15図は特にIL−1i配列および分泌リーダー配列を含
むペプチドを示す。

好ましい実施態様の記載ここでは現在好ましい本発明の実施態様に対する記載
を詳細に行うこととするが、この記述は以下の実施例と
一緒になって本発明の原理を説明するものである。

A.ヒト単球由来インヒビター前記したとおり、本発明は精製形で単離されているIL
−１インヒビターに関する。IgGで被覆した容器で単球
を増殖させたヒト単球馴化培地から、本発明のIL−１イ
ンヒビターを得ることが好ましい。さらに、本発明はヒ
ト単球含有培地由来インヒビターと生物学的に同等な任
意の起源の実質的に精製されたIL−１インヒビターを包
含する。

本明細書おおび請求の範囲を通じて用いられている
「生物学的に同等な」なる表現は、単球から単離された
天然型IL−１インヒビターと同様の様式でIL−１作用を
阻害することのできる（必ずしも同程度にというわけで
はない）本発明の組成物を意味する。本明細書および請
求の範囲を通じて用いられている「実質的に相同な」と
は、単球馴化培地から単離された天然型IL−１インヒビ
ターに対する、既に報告され任意のIL−１インヒビター
により示される以上の相同性の度合いを意味する。70％
以上の相同性の度合いが好ましく、80％以上がより好ま
しく、そして90％以上がさらにもっと好ましい。特に好
ましい一群のインヒビターは天然型インヒビターと95％
以上相同である。ここで述べた相同性のパーセンテージ
は、比較すべき配列内で同一のアミノ酸残基をそろえて
並べたふたつの配列の小さいほうにみられるアミノ酸残
基のパーセンテージとして算出される。この場合、Dayh
off,M.D.がAtlas of Protein Sequence and Structure
第５巻、124ページ（1972）、National Biochemical Re
search Foundation,Washington,D.C.（参考として詳細
にここに編入される）に示されるように、このような比
較のための配列を助けるために100アミノ酸の長さに４
個のギャップを導入することができる。

本発明の好ましいIL−１インヒビターは単球馴化培地
から得られ、初めて精製型で単離された。本出願の目的
にとって、本文中で開示されるIL−１インヒビターを指
すのに用いられる場合「純粋型」または「精製型」と
は、IL−１インヒビタータンパク質以外のタンパク質を
実質的に含まない標品を意味する。本発明のIL−１イン
ヒビターは少なくとも90％純粋であることが好ましく、
95％純粋であることがさらに好ましい。

実施例の方法により少なくとも３種類の精製IL−１イ
ンヒビターが単離されている。これらにはインヒビター
１、インヒビター２およびインヒビター３が包含され
る。インヒビター１はSDS−PAGEで22−23kDa分子と同様
の挙動を示し、約4.8の等電点を示し、そしてTris緩衝
液、pH7.6中52mM NaCl付近でMono Q FPLCカラムから溶
出する。インヒビター２も22−23kDaタンパク質でpI＝
4.8であるが、Mono Qカラムからの溶出は60mM NaClであ
る。インヒビター３は20kDaタンパク質で、48mM NaClで
Mono Qカラムから溶出する。インヒビター１、２および
３は免疫学的、機能的に関連性がある。これらのインヒ
ビターを精製型で得たことによって、本発明者らはそれ
らのアミノ酸配列を得ることができた。本文中で初めて
明らかに示された精製インヒビター、およびABIプロテ
インシークエンサーテクニカルマニュアル（ABI
Protein Sequencer）中に記載されたような方法を用い
て、これらのインヒビターのアミノ酸配列の実質的な割
合を推定することができる。

実施例３は３種のIL−１インヒビター、すなわちIL−
1i−Ｘ、IL−1i−αおよびIL−1i−βについて得られた
アミノ酸配列データを示す。

本発明者らはIL−１インヒビターに対して生成された
少なくとも１種の抗体を発現した。当業者に知られた方
法により、このIL−１インヒビターおよびその他のIL−
１インヒビターに対する別のポリクローナルおよびモノ
クローナル抗体を調製することができる。特定のポリク
ローナル抗体の一つを実施例４に説明する。

B.組換えインヒビター 1.概説 IL−１インヒビター製造のための組換えDNA法をここ
に示す。本発明の一実施態様に於ては、その活性部位は
ヒトから単離された天然型IL−１インヒビターと生物学
的に同等に機能する。インヒビター生産する指示するた
めに、天然または合成DNA配列を用いることができる。
この方法は以下を含んでなる：（ａ）宿主細胞に指示してIL−１インヒビター活性を有
するタンパク質を生産させることのできるDNA配列の調
製；（ｂ）例えばそのDNA配列を発現するのに必要な操作エ
レメントを含有するベクターのような、宿主細胞に移入
および複製されうるベクター中へのDNA配列のクローニ
ング；（ｃ）合成DNA配列および操作エレメントを含有するベ
クターのIL−１インヒビターをコードするDNAを発現し
うる宿主細胞への移入；（ｄ）ベクターの増幅およびインヒビターの発現に適し
た条件下での宿主細胞の培養；（ｅ）インヒビターの収穫；および（ｆ）得られたインヒビターに、活性型の３次構造をと
らせ、それによりIL−１阻害活性を有するものとなす。

2.DNA配列本方法における使用が意図されるDNA配列を、一部は
実施例５で、また一部は実施例６で検討する。これらの
配列は合成および天然のDNA配列を包含することが意図
される。天然型配列にはさらにcDNAまたはゲノムDNAセ
グメントが包含される。

実施例６は実施例１−３で単離されたものと同一のタ
ンパク質をコードするDNAの分子クローンを提供する。
実施例６に於ては、プラーク、GT10−IL−1i−2A、をGT
10ライブラリーから単離した。このプラーク内のファー
ジを増殖させ、そのDNAを単離しそしてEcoR Iで消化し
た。1850塩基対のEcoR IフラグメントはIL−１インヒビ
ターのコード配列を担持している。第13図はこのEcoR I
フラグメントの部分的なDNA配列を示す。

本分に含まれる教示および公知の方法に鑑みて、当業
者は他の合成ポリヌクレオチド配列を利用することがで
きよう。ポリヌクレオチド合成に関する業界の近況の例
として、Matteucci,M.D.およびCaruthers,M.H.,J.Am.Ch
em.Soc.103:3185（1985）およびBeaucage,S.L.およびCa
ruthers,M.H.,Tetrahedron Lett.22:1859（1981）、お
よびABIオリゴヌクレオチドシンセサイザーとともに供
給される使用説明書を示す。これらはそれぞれ参考とし
て詳細にここに編入される。

これら合成配列は以下に詳述する天然型配列と同一で
あってもよいし、また異なるヌクレオチドを含有するこ
ともできる。ある実施態様に於ては、もし合成配列が本
発明の天然型DNA配列中に見いだされるのとは異なるヌ
クレオチドを含有する場合、これらの異なる配列は単球
から単離されたIL−1iと同じ一次構造を有するポリペプ
チドをなおコードしていることが意図される。あるいは
また別の実施態様に於いては、異なるヌクレオチドを含
有する合成配列はここで述べたIL−1iと同じ生物活性を
有するポリペプチドをコードしていよう。

さらに、そのDNA配列は天然型配列のフラグメント、
すなわち天然に存在し、本発明者らによって初めて単離
および精製されたポリヌクレオチドのフラグメントであ
ってもよい。ある実施態様に於いては、そのDNA配列はc
DNAライブラリーから単離された制限フラグメントであ
る。

別の実施態様に於ては、そのDNA配列はヒトゲノムラ
イブラリーから単離される。この実施態様に有用なかか
るライブラリーの例は、Lawnら、Cell 15:1157−1174
（1978）により示され、この文献は参考としてここに詳
細に編入される。

この実施態様の好ましい形に於いては、天然型DNA配
列は以下からなる方法によって得られることが意図され
る。

（ａ）cDNAの全体または一部を増幅および発現すること
ができるベクターおよび細胞内でIL−１インヒビターを
生産しうる細胞、好ましくは単球からのヒトcDNAライブ
ラリーの調製；（ｂ）IL−１インヒビター遺伝子またはそのタンパク質
産物と結合することのできる少なくとも１種のプローブ
を用いるヒトDNAライブラリーの探索；（ｃ）クローンがインヒビター遺伝子またはそのタンパ
ク質産物に関する少なくとも１種のプローブと結合する
能力に基づく、インヒビターをコードする遺伝子を含有
する少なくとも１種のクローンの同定；（ｄ）選択したひとつのまたは複数のクローンからのイ
ンヒビターをコードする遺伝子またはその遺伝子の一部
分の単離；（ｅ）その遺伝子またはその遺伝子の好適なフラグメン
トを、当該遺伝子を宿主細胞内に維持しこれを発現する
のに必要な操作エレメントに結合させる。

上述の方法に有用な天然型DNA配列は、以下を含んで
なる方法によっても同定および単離することができる：（ａ）好ましくはrecArecBC E.coli宿主内で増幅され
る、ヒトゲノムDNAライブラリーの調製；（ｂ）IL−１インヒビター遺伝子またはそのタンパク質
産物と結合できる少なくとも１種のプローブを用いる、
ヒトゲノムDNAライブラリーの探索；（ｃ）クローンがインヒビター遺伝子またはそのタンパ
ク質産物に関する少なくとも１種のプローブと結合する
能力に基づく、インヒビターをコードする遺伝子を含有
する少なくとも１種のクローンの同定；（ｄ）同定された一つまたは複数のクローンからのイン
ヒビターをコードする遺伝子の単離；（ｅ）その遺伝子または遺伝子の好適なフラグメント
を、当該遺伝子を宿主細胞内に維持しこれを発現するの
に必要な操作エレメントに結合させる。

上記の方法での使用に適した天然型DNA配列の単離に
は、適当な遺伝子またはその遺伝子のセクションの末端
部の中およびそのもっとも近くにある二つの制限部位を
同定するのが好ましい。つぎに適当な制限エンドヌクレ
アーゼを用いて、適当な遺伝子を含有するDNAセグメン
トを残りのゲノム物質から切り出す。切り出し後、DNA
配列の３′および５′末端および任意のエキソン結合を
再構築して、IL−１インヒビタータンパク質のＮ−およ
びＣ−末端をコードでき、かつそのDNA配列をその操作
エレメントに融合させうる適当なDNA配列を提供する。

3.ベクター（ａ）微生物、特にE.コリ本発明での使用が意図されるベクターには、任意の好
ましいかまたは必要な操作エレメントとともに上記のDN
A配列を挿入することができる任意のベクター、そして
そのベクターは次に宿主細胞に移入されてその細胞内で
複製することができるベクターが包含される。好ましい
ベクターは、その制限部位がよく実証されており、かつ
DNA配列の転写に好ましいかまたは必要な操作エレメン
トを含有するベクターである。しかしながら、本発明の
ある種の実施態様は、ここに記載されるcDNA配列のひと
つまたはそれ以上を含有していよう現在未発見のベクタ
ーを使用することも想定している。特に、これらのベク
ターの全てが次の特徴のいくつかまたは全てを有するこ
とが好ましい。すなわち（１）宿主生物配列の最小数を
保有する、（２）所望の宿主中で安定に維持され増殖さ
れる、（３）所望の宿主中の多くのコピー数で存在でき
る、（４）関心のある遺伝子の転写を促進するために配
置された調節可能なプロモーターを有する、（５）DNA
配列が挿入される部分と別のプラスミドの一部分上に存
在する選択可能な特色をコードする少なくとも１種のマ
ーカーDNA配列を有する、および（６）転写を終止する
ことができるDNA配列。

種々の好ましい実施態様においては、本発明のDNA配
列を含有し発現することができるこれらのクローニング
ベクターは種々の操作エレメントを含有する。これらの
“操作エレメント”は、ここに考察されているように少
なくと１種のプロモーター、少なくとも１個のシャイン
−ダルガルノ配列および開始コドン、および少なくとも
１種の終止コドンを包含する。好ましくは、これらの
“操作エレメント”はまた少なくとも１種のオペレータ
ー、細胞内空間から搬出されるタンパク質のための少な
くとも１種のリーダー配列、調節タンパク質のための少
なくとも１種の遺伝子、およびベクターDNAの適切な転
写およびそれに続く翻訳に必要なまたは好ましい任意の
他のDNA配列をも包含する。

ある種のこれらの操作エレメントは本発明の好ましい
ベクターのそれぞれに存在できる。当業者に知られた方
法を使用して、特にここに記載の教示にかんがみて、必
要とされうる任意の付加的な操作エレメントをこれらの
ベクターに加えることも意図される。

実際、容易に単離し、組み立てそして相互交換が可能
な方法でこれらのベクターのそれぞれを構築することが
可能である。それによりこれらのエレメントおよびDNA
配列のコード領域の組合せからの数々の機能性遺伝子の
組立てが容易になる。さらに、これらのエレメントの多
くは１種以上の宿主に適用されよう。ある種の好ましい
実施態様においては、ベクターはレギュレーター（“オ
ペレーター”）として機能できるDNA配列、およびレギ
ュレータータンパク質をコードできる他のDNA配列を含
有することもさらに意図される。

（ｉ）レギュレーターひとつの実施態様においては、これらのレギュレータ
ーはある種の環境条件の存在下でDNA配列の発現を阻止
し、そして他の環境条件の存在下においてはDNA配列に
よりコードされるタンパク質の転写およびそれに続く発
現を可能にしよう。特に、調節セグメントを例えばイソ
プルピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドの非存在下でDNA
配列の発現が起こらないかまたは非常に減少した程度で
しか起こらないような様式でベクターに挿入するのが好
ましい。この状況において、DNA配列を含有する形質転
換微生物はIL−1iの発現開始前に所望の密度で増殖でき
る。この実施態様においては、所望のタンパク質の発現
は、所望の密度が達成された後にそのDNA配列の発現を
生じることができる物質を微生物の環境に添加すること
により誘導される。

（ii）プロモーター発現ベクターはそれ自体のタンパク質発現のために宿
主生物により使用されうるプロモーターを含有しなけれ
ばならない。ラクトースプロモーター系が一般に使用さ
れるが、他の微生物のプロモーターが単離され、特性決
定されており、それにより、当業者が組換えIL−1iの発
現のためにそれらを使用することが可能となった。

（iii）転写ターミネーターここで意図される転写ターミネーターは、ベクターを
安定化するのに役立つ。特にRosenberg,M.およびCourt,
D.,Ann.Rev.Genet.13:319−353（1979）（ここに参考文
献としてとり込まれる）に記載されている配列が本発明
における使用を意図される。

（iv）非翻訳配列好ましい実施態様においては、３′または５′非翻訳
配列を遺伝子転写物に組み込むのを可能にするためにコ
ード領域の３′または５′末端を再構築することも望ま
しかろうことが注目される。これら非翻訳配列中に包含
されるものは、ここに参考文献として編入されるSchmei
ssner,U.,McKenney,K.,Rosenberg,MおよびCourt,D.のJ.
Mol.Biol.176:39−53（1984）により同定されたmRNAを
安定化する配列である。

（ｖ）リボソーム結合部位外来タンパク質の微生物による発現はリボソーム結合
部位を包含するがそれらに限定されないある種の操作エ
レメントを必要とする。リボソーム結合部位は、Gold,
L.ら、Ann.Rev.Microbio.35:557−580またはMarquis,D.
M.ら、Gene 42:175−183（1986）に記載されるように、
タンパク質合成の開始においてリボソームが認識して結
合する配列である。これらの文献は参考としてここに編
入される。好ましいリボソーム結合部位はGAGGCGCAAAAA
（ATG）である。

（vi）リーダー配列および翻訳カプラーさらに、もしタンパク質が細胞質から排出される場合
は適切な分泌リーダー（シグナル）配列をコードするDN
AがWatson,M.E.によりNucleic Acids Res.12:5145−516
3に記載されているように（この文献は参考としてここ
にとり込まれる）DNA配列の５′末端に存在することが
好ましい。リーダー配列のDNAは、リーダー配列がイン
ヒビターにじかに隣接しかつ共有結合している融合タン
パク質の生産を可能にする位置になければならない、す
なわち２つのDNAコード配列の間には転写または翻訳終
止シグナルが存在してはならない。リーダー配列の存在
は一部には下記の理由のひとつまたはそれ以上のために
所望される。第一に、リーダー配列の存在はIL−1iの宿
主プロセシングを容易にしうる。特に、リーダー配列は
リーダーペプチダーゼによる最初の翻訳産物の切断を指
示し、リーダー配列を取り除き、そして有効なタンパク
質活性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを残
すことができる。第二に、リーダー配列の存在はIL−1i
を細胞の細胞質の外に導くことにより、そのタンパク質
の精製を容易にすることができる。宿主微生物のいくつ
かの種においては、適切なリーダー配列の存在により、
いくつかのエシェリヒア・コリ（E.coli）の場合におけ
るように、完成したタンパク質を細胞周辺腔へ移送する
のを可能にするであろう。ある種のE.coli、サッカロミ
セス（Saccharomyces）およびバチルス（Bacillus）お
よびシュードモナス（Pseudmonas）株の場合、適切なリ
ーダー配列により、タンパク質が細胞膜を通過して細胞
外の培地に入る移送が可能となろう。この状況におい
て、タンパク質は細胞外タンパク質から精製されうる。
第三に、本発明により精製されたいくつかのタンパク質
の場合、リーダー配列の存在は完成したタンパク質をそ
れが適切なタンパク質活性を有するその活性構造をとる
ために折り重なりうる環境に置くのに必要でありうる。

本発明のひとつの好ましい実施態様においては、付加
的なDNA配列が、IL−１インヒビターをコードするDNA配
列のすぐ前に位置している。この付加的なDNA配列は翻
訳カプラーとして機能できる。すなわちそのDNA配列はR
NAをコードしており、そのRNAは自分が連続するインヒ
ビターRNAのリボソーム結合部位に直接隣接してリボソ
ームの位置設定する役割をする。本発明のひとつの実施
態様においては、DNA配列TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGAC
AGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATGおよび翻訳カプラー
に関連した当業者に現在知られた方法を用いて翻訳カプ
ラーを誘導することができる。

（vii）翻訳ターミネーターここで意図される翻訳ターミネーターはmRNAの翻訳を
停止させるのに役立つ。それらはKohli,J.,Mol.Gen.Gen
et.182:430−439に記載されるような天然のものである
か、またはPettersson,R.F.,Gene 24:15−27（1983）に
記載されるような合成されたものであることができ、こ
れら両文献はここに参考文として編入される。

（viii）選択可能マーカーさらに、クローニングベクターは薬剤耐性マーカーま
たは宿主微生物により選択可能な特徴の発現を生じる他
のマーカーのような選択可能なマーカーを含有するのが
好ましい。本発明のひとつの実施態様においては、アン
ピシリン耐性遺伝子がベクターに包含される一方、他の
プラスミドにはテトラサイクリン耐性またはクロラムフ
ェニコール耐性用遺伝子が包含される。

かかる薬剤耐性または他の選択可能なマーカーは、一
部は形質転換体の選択を容易にすることが意図される。
さらに、クローニングベクター中におけるかかる選択可
能マーカーの存在は混入微生物が培地中で増殖するのを
阻止するのに有用でありうる。この実施態様において
は、形質転換された宿主微生物の純粋な培養物は、その
誘導された表現型が生存にとって必要であるような条件
のもとで微生物を培養することにより得られよう。

ここで考察されているように操作エレメントは先行文
献およびここに含まれる教示を考慮して当業者によりル
ーチンに選択される。これらの操作エレメントの一般的
例は、ここに参考として編入されるB.Lewin,Genes,Wile
y ＆ Sons,New York（1983）に記載されている。好適な
操作エレメントの種々の例は上記考察したベクターに見
い出され、前記ベクターの基本的特徴を論議している刊
行物を参照することにより明らかとなろう。

上記したベクターの必要かつ所望の全ての構成部分が
合成および単離されると、ベクターは当業者に一般に知
られている方法により組立てられる。かかるベクターの
組立ては、当業者が行なう職務の範囲内であると思わ
れ、そのようなものであるので、過度の実験を伴わずに
行なうことができる。例えば、Maniatis,T.ら、Molecul
ar Cloning:Cold Spring Harbor Laboratories,N.Y.（1
984）に記載されているように、同様のDNA配列が適切な
クローニングベクターに連結されており、この文献は参
考としてここに編入される。

本発明のクローニングベクター構築においては、DNA
配列およびそれに付随する操作エレメントの多数のコピ
ーを各ベクターに挿入できることにも注目すべきであ
る。かかる実施態様においては、宿主生物はベクター当
り、所望のIL−１インヒビターをより多量に生産しよ
う。ベクターに挿入されうるDNA配列の多コピーの数は
生じたベクターが、そのサイズゆえによる、適切な宿主
細胞に移され、複写されそして転写されるその能力によ
ってのみ限定される。

（ｂ）その他の微生物 E.coli以外の微生物中での使用に適するベクターも本
発明において意図される。かかるベクターを第１表に記
載する。さらに、ある種の好ましいベクターを下記に論
ずる。

（ｉ）シュードモナスベクター広範囲のグラム陰性細菌中で自律複製するいくつかの
ベクタープラスミドは、シュードモナス属の宿主中でク
ローニングベヒクルとして使用するのに好ましい。これ
らのある種のものは、Tait,R.C.,Close,T.J.,Lundquis
t,R.C.,Haqiya,M.,Rodriguez,R.L.およびKado,C.I.In B
iotechnology,May,1983,pp.269−275;Panopoulos,N.J.,
Genetic Engineering in the Plant Sciences,Praeger
Publishers,New York,New York,pp.163−185（1981）；
およびSakagucki,K.,Current Topic in Microbiology a
nd Immunology 96:31−45（1982）に記載されており、
各文献は参考としてここに編入される。

ひとつの特に好ましい構築方法は、Bagdasarian,M.,B
agdasarian,M.M.,Coleman,S.およびTimmis,K.N.,Plasmi
ds of Medical,Environmental and Commercial Importa
nce,Timmis,K.N.およびPuhler,A.（編）、Elsevier/Nor
th Holland Biomedical Press（1979）（ここに参考と
して編入される）に記載されているように、プラスミド
RSF1010およびその誘導体を使用することであろう。RSF
1010の利点は、それがE.coliおよびシュードモナスの両
種中に容易に形質転換されかつ安定的に維持される、比
較的に小さくコピー数の多いプラスミドであることであ
る。この系においては、エシェリヒアについて記載され
ている。Tac発現系を使用することが好ましいであろ
う。なぜならば、E.coli trpプロモーターは、Sakaguck
i,K.,Current Topics in Microbiology and Immunology
96:31−45（1982）およびGray,G.L.,McKeown,K.A.,Jon
es,A.J.S.,Seeburg,P.H.およびHeyneker,H.L.,Biotechn
ology,Feb.1984,pp.161−165（両文献は参考としてここ
に編入される）に記載されるようにシュードモナスRNA
ポリメラーゼにより容易に認識されると思われるからで
ある。転写活性はそのプロモーターを、例えばE.coliま
たはシュードモナス・エルギノーサ（P.aeruginosa）tr
pプロモーターと交換することを要求することにより、
さらに最大にすることができる。さらに、E.coliのlac
I遺伝子も調節を行うためにプラスミド中に包含されよ
う。

任意のシュードモナスタンパク質の翻訳開始ならびに
インヒビターの細胞内発現を惹起させるために選択され
た種類の多量に発現される任意のタンパク質の開始部位
に翻訳を結合できる。

宿主シュードモナス種の制限を欠く株が入手できない
場合、E.coliから単離されたプラスミド構築物での形質
転換効率は低い。したがって、Bagdasarian,M.ら、Plas
mids of Medical,Environmental and Commercial Impor
tance,pp.411−422,Timmis and Puhler（編）、Elsevie
r/North Holland Biomedical Press（1979）（参考とし
てここにとり込まれる）に記載されているように、所望
の宿主の形質転換前にシュードモナスクローニングベク
ターを、もうひとつの種のr^-m⁺に継代させることが望ま
しい。

（ii）バチルスベクターさらに、バチルス属の宿主において好ましい発現系に
は、クローニングベヒクルとしてのプラスミドpUB110の
使用が包含される。他の宿主ベクター系におけるよう
に、バチルス中で本発明のIL−1iを細胞内または分泌タ
ンパク質のいずれかとして発現させることが可能であ
る。本発明の態様には両方の系が包含される。バチルス
およびE.coliの両者の中で複製するシャトルベクター
は、Dubnau,D.,Gryczan,T.,Contente,S.およびShivakum
ar,A.G.,Genertic Engineering,Vol.2,SetlowおよびHol
lander（編）、Plenum Press,New York,New York,pp.11
5−131（1980）（参考としてここに編入される）に記載
されるように、種々の遺伝子の構築および検査に利用で
きる。B.サブチリスからのIL−1iの発現および分泌のた
めには、アルファアミラーゼのシグナル配列はそのタン
パク質のコード領域に結合されるのが好ましい。細胞内
インヒビターの合成には、移動性DNA配列がアルファア
ミラーゼリーダー配列のリボソーム結合部位に翻訳によ
り結合されよう。

これらの構築物のどちらかの転写は、アルファアミラ
ーゼプロモーターまたはその誘導体により指示されるの
が好ましい。この誘導体は天然型アルファアミラーゼプ
ロモーターのRNAポリメラーゼ認識配列を含有するが、l
acオペレーター領域も組み込んでいる。ペニシリナーゼ
遺伝子プロモーターおよびlacオペレーターから構築さ
れた同様のハイブリッドプロモーターは、参考としてこ
こに詳細に編入されるYansura,D.G.およびHennerのGene
tics and Biotechnology of Bacilli,Genesan,A.T.およ
びHoch,J.A.（編）、Academic Press,pp.249−263（198
4）に記載されるように調節可能な様式でバチルス宿主
中で機能することが示されている。またE.コリのlac I
遺伝子もプラスミド中に包含されて調節を行うであろ
う。

（iii）クロストリジウムベクタークロストリジウム中での発現に好ましい構築物の一つ
は、ここに参考として編入されるJ.Bacteriol.159:460
−464（1984）に記載のHeefner,D.L.らの方法によりC.
パーフリンジェンス中に形質転換された、ここに参考と
して編入されるSquires,C.H.ら、J.Bacteriol.159:465
−471（1984）に記載のプラスミドpJU12である。転写は
テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターにより指示
される。翻訳は、他の宿主中での使用に好適なベクター
に関して上記に大要を記載した方法に厳密に類似してい
る様式で、この同じtet^r遺伝子のシャイン−ダルガルノ
配列に結合される。

（iv）酵母ベクター酵母に導入された外来DNAの維持は、ここに参考とし
て編入されるBotstein,D.およびDavis,R.W.,The Molecu
lar Biology of the Yeast Saccharomyces,Cold Spring
Harbor Laboratory,Strathern,Jones and Broach
（編）、pp.607−636（1982）に記載されるいくつかの
方法により行うことができる。サッカロミセス属の宿主
生物で使用するのに好ましい発現系の一つは、２ミクロ
ンプラスミド上にIL−1i遺伝子を含有する。２ミクロン
サークルの利点にはcir^o株に導入された場合、比較的コ
ピー数が高いことおよび高い安定性が包含される。これ
らのベクターはE.コリ内における複写と選択を可能にす
るためにpBR322からの複製開始点および少なくともひと
つの抗生物質耐性マーカーを組み込むことが好ましい。
さらにこのプラスミドは、２ミクロン配列、および酵母
のLEU2欠損変異種において同じ目的を果すための酵母LE
U2遺伝子を有することが好ましいであろう。

組換えIL−１インヒビターを酵母中で最終的に発現さ
せることを意図する場合、クローニングベクターをはじ
めにE.コリ中に移入し、そこでベクターが複写され、そ
れから増殖の後ベクターを得て精製することが好まし
い。続いてベクターはIL−１インヒビターの最終的発現
のために酵母中に移入されよう。

（ｃ）哺乳動物細胞 IL−１インヒビターのcDNAは、哺乳動物細胞中におけ
るそのインヒビター発現のための遺伝子として役立つで
あろう。そのものはここに参考として編入されるKozak,
Nucleic Acids Research 15:8125−8132（1987）に記載
されているようなリボソーム結合に効率のよい配列を有
すべきであり、そして成熟タンパク質をプロセシングさ
れた形態で細胞の外に導くためのリーダー配列（３
（ａ）（vi）項参照）をコードする能力を有すべきであ
る。完全なcDNA配列を担持するDNA制限フラグメントを
転写プロモーターおよびここに参考として編入されるGu
arente,L.,Cell 52:303−305（1988）およびKadonaga,
J.T.ら、Cell 51:1079−1090（1987）に記載の転写エン
ハンサーを有する発現ベクターに挿入できる。もしイン
ヒビターの構成的発現が細胞の増殖にとって有害である
場合は、そのプロモーターはプラスミドpMSG（Pharmaci
a Cat.No.27450601）におけるようにして調節可能であ
ることができる。ベクターは、ここに参考として編入さ
れるAusubel,F.M.ら、Current Protocols in Molecular
Biology,Wiley（1987）に記載される完全なポリアデニ
ル化シグナルを有するべきであり、それによりこのベク
ターから転写されたmRNAが適切にプロセシングされる。
最後に、ベクターはE.コリ中において複製および選択が
可能であるために、pBR322からの複製開始点および少な
くともひとつの抗生物質耐性を有しよう。

IL−１インヒビターを生産する安定な細胞系を選択す
るためには、発現ベクターは薬剤耐性マーカーのような
選択可能なマーカーの遺伝子を担持するたまたは上記の
Ausubelらにより記載されるbhfr^-細胞系を形質転換する
ためのジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）遺伝子のよう
な欠失細胞系の相補遺伝子を担持することができる。ま
た選択可能なマーカーを担持する別のプラスミドを発現
ベクターと共に形質転換することもできる。

4.宿主細胞／形質転換このようにして得られたベクターを適切な宿主細胞に
移入する。これらの宿主細胞は微生物または哺乳動物細
胞であることができる。

（ａ）微生物外来DNAを取り込み、これらの遺伝子および付随する
操作エレメントを発現する能力を有する任意の微生物を
選択できると考えられる。宿主生物が選択された後、当
業者に一般に知られている方法を用いてベクターを宿主
生物に移入する。かかる方法の例は、ここに参考として
編入されるAdvanced Bacterial Genetics,R.W.Davis
ら、Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,Ne
w York（1980）に見い出されうる。ひとつの実施態様に
おいては、温度調節は、前記した操作エレメントの使用
による遺伝子発現を調節する手段と考えられるので、形
質転換は低い温度で起ることが好ましい。もうひとつの
実施態様においては、もし浸透圧調節剤がベクターに挿
入されている場合、形質転換中の塩温度を調節は外来遺
伝子の適切な制御を確実にするのに必要であろう。

宿主微生物は通性嫌気性または好気性であるのが好ま
しい。この方法において好ましく使用しうる特別の宿主
には酵母および細菌が包含される。詳細な酵母にはサッ
カロミセス属の酵母、特にサッカロミセス・セラビシエ
が包含される。詳細な細菌には、バチルス属、エシェリ
ヒア属およびシュードモナス属の細菌特にバチルス・サ
ブチリスおよびE.コリが包含される。他の宿主細胞は上
記第Ｉ表に記載されている。

（ｂ）哺乳動物細胞ベクターはリン酸カルシウム:DNA同時沈降法、エレク
トロポレーション、またはプロトプラスト融合法のよう
ないくつかの技法により培養中の哺乳動物細胞に導入で
きる。好ましい方法は上記のAusubelらにより記載され
ているリン酸カルシウムでの同時沈降である。

形質転換可能で、cDNA配列の転写および翻訳、前駆体
IL−1iのプロセシングおよび成熟タンパク質の分泌が可
能な多くの安定な細胞型が存在する。しかしながら、分
泌されたタンパク質のグリコシル化およびアミノ酸残基
の翻訳後修飾に関して、もしそれがあるとすれば、細胞
型によって異なる。したがって理想的な細胞型は天然型
分子と同一の組換えIL−１インヒビターを生産する細胞
型である。

5.遺伝子工学的に作出された細胞の培養宿主細胞をIL−１インヒビターの発現に適切な条件下
で培養する。これらの条件は宿主細胞に一般に特異的で
あり、かかる生物の増殖条件に関し刊行された文献およ
びここに含まれる教示を考慮して当業者により容易に決
定される。例えばここに参考として編入されるBergey's
Manual of Determinative Bacteriology,第８版,Willi
ams ＆ Wilkins Company,Baltimore,Marylandは細菌培
養に関する情報を含有する。酵母および哺乳動物細胞の
培養に関する同様の情報はここに参考として編入される
Pollack,R.Mammalian Cell Culture,Cold Spring Habor
Laboratories（1975）から得られうる。

ベクター中に挿入されるかまたは存在する任意の操作
エレメントの如何に応じてDNA配列の発現を調節するの
に必要な任意の条件は、形質転換および培養段階で有効
であろう。ひとつの実施態様においては、DNA配列の発
現を阻害する適切な調節条件の存在下で、細胞は高い密
度にまで増殖する。最適の細胞密度に近づいた場合、環
境条件をDNA配列の発現に適切な条件に変化させる。し
たがって、IL−１インヒビターの産生は宿主細胞の増殖
が最適密度付近になった後の時間帯に起り、そして生じ
たIL−１インヒビターは、時としてはその発現に必要な
調節条件が誘導された後に採取されるであろうことが意
図される。

6.精製（ａ）微生物から生成されたIL−1i 本発明の好ましい実施態様においては、組換えIL−１
インヒビターは採取の後でそれが活性構造をとる前に精
製される。発明者らは、タンパク質がはじめに精製され
る場合は再び折りたたまれタンパク質を高収率で回収す
るのが容易になると考えるので、この実施態様が好まし
い。しかしながら、ひとつの好ましい別の実施態様にお
いては、IL−１インヒビターは精製の前に再び折り重な
ってその活性構造をとることができる。さらに他の好ま
しい実施態様においては、IL−１インヒビターは培地か
ら回収される際そのふたたび折り重なった活性な状態で
存在する。

ある種の状況においては、IL−１インヒビターは宿主
微生物で発現されそしてそのタンパク質が細胞壁もしく
は膜を通ってまたは細胞周辺腔に移送される際に、その
適正な活性構造をとるであろう。もし適切なリーダー配
列をコードするDNAが組換えタンパク質をコードするDNA
に結合されている場合、これが一般に起こるであろう。
もしIL−１インヒビターが、その適正な活性構造をとら
ない場合、形成された任意のジスルフィド結合および／
または生じた任意の非共有相互作用は、例えば塩化グア
ニジウムおよびベータメルカプトエタノールのような変
性剤および還元剤ではじめに破壊され、次いで希釈およ
びこれらの薬剤の制御された条件下での酸化に続きIL−
１インヒビターがその活性構造をとることができよう。

再び折り重なる前および後の精製には、次の工程のい
くつかの組合せを使用することが好ましい。すなわち陰
イオン交換クロマトグラフィー（Mono QまたはDEAE−セ
ファロース）、ゲル濾過クロマトグラフィー（Superos
e）、等電点クロマトグラフィー（Mono P）、および疎
水性相互作用クロマトグラフィー（オクチルまたはフェ
ニルセファロース）である。特に価値のあるもののうち
では、IL−1i特異的モノクローナル抗体（実施例３に記
載）を使用する抗体アフィニティークロマトグラフィー
であろう。

（ｂ）哺乳動物細胞から生産されたIL−1i 哺乳動物細胞から生産されたIL−1iは、イオン交換ク
ロマトグラフィーおよび実施例３記載のモノクローナル
抗体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーを
包含する方法により馴化培地から精製されよう。種々の
改変および変更を本発明の方法および産物になしうるこ
とが当業者には明らかであろう。したがって本発明は、
添付の請求の範囲およびそれらと同等のものの範囲内に
入る限り本発明の改変および変更を包含することが意図
される。

本発明の教示を詳細な問題または環境に適用すること
は、ここに含まれる教示にかんがみて当業者の能力の範
囲内であろうことは理解されるべきである。本発明の産
物の例およびそれらの単離および製造についての代表的
な方法を下記に示す。

下記の実施例により本発明の種々の現在好ましい実施
態様を示す。この実施例中において提供される刊行物は
参考として編入される。

実施例実施例１タンパク質調製 A.材料ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）およびRPMIはMediatec
h,Washington,D.C.より購入した。LymphoprepはAccurat
e Chemical and Scientific Corp.,Westbury,N.Y.から
得た。ヒトIgG,MTT,ウサギ抗プロスタグランジンE₂抗血
清、重炭酸アンモニウム、ジチオトレイトール、完全お
よび不完全フロインドアジュバント、ヒポキサンチン、
アミノプテリンおよびチミジンはSigma Chemical Co.,S
t.Louis,Missouriから購入した。C3H/HeJマウスはJacks
on Labs,Bar Harbor,Maineから購入した。BALB/cマウス
およびP3ミエローマ細胞はNational Jewish Center for
Immunology and Respiratory Medicine（NJC/IRM）,De
nver,ColoradoのDrs.John KapplerおよびPhilippa Marr
ackから得た。組換えヒトIL−１はCistron Biotechnolo
gy,Pine Brook,N.J.から得た。精製されたフィトヘマグ
ルチニンはWellcome Diagnostics,Research Triangle P
ark,N.C.から購入した。初代培養のヒト包皮線維芽細胞
はNJC/IRM,Denver,ColoradoのDr.Richard Clarkから得
た。モノクローナルマウス抗−ウサギIgG抗体はAIA rea
gents,Aurora,Coloradoから購入した。低濃度メチオニ
ンRPMIはGIBCO Laboratories,Grand Island,N.Y.のSele
ct−Amineキットを使用してつくった。³⁵S−メチオニ
ン、ジフェニルオキサゾールおよび［¹⁴C］−ヨード酢
酸はDuPont−NEN,Chicago,Illinoisから得た。ウシ胎児
血清はHyClone Laboratories,Logan,Utahから購入し
た。Mono QおよびSuperose12カラムはPharmacia Inc.,P
iscataway,N.J.から購入した。C4逆相カラムはSynchro
m,Inc.,Lafayette,Indianaから得た。C8逆相カラムはAp
plied Biosystems,Inc.,Foster City,Californiaから得
た。アセトニトリルおよびポリエチレングリコール8000
はJ.T.Baker Chemical Co.,Phillipsburg,N.J.から購入
した。トリフルオロ酢酸およびグアニジン塩酸塩はPier
ce Chemicals,Rockford,Illinoisから得た。エンドプロ
ティナーゼLysCはBoehringer Mannheim Biochemicals,I
ndianapolis,Indianaから得た。PGE₂ELISAに使用したマ
イクロタイタープレートはIntermountain Scientific C
orporation,Bountiful,Utahから得たNunc−Immuno Plat
e Iであった。ハイブリドーマ産生に使用したプレート
はCostar,Cambridge,Massachusettsから得た。

B.単球IL−１ヒンヒビターの生成ヒト白血球は正常献血者のものを白血球泳動により得
て、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）中に詰まった細胞１
部に対しHBSS1部の割合で懸濁し、Lymphoprepを下に入
れて、室温で400×ｇにて30分間遠心した。単核細胞フ
ラクションを取り出し（代表的には４−５×10⁹細胞が
１人の献血者当り得られる）、Ca⁺⁺もMg⁺⁺も入っていな
いHBSS中で洗浄し、無血清RPMI中に懸濁しそしてSephap
ex G200でのクロマトグラフィーによりLPSを取り除いた
正常ヒトIgGを被覆してあるペトリ皿に塗布した（100mm
皿当り10ml中に６×10⁷細胞）。すべての試薬はLPSを10
pg/ml以下しか含有しなかった。細胞を24−48時間培養
し、生じた馴化培地は粗製IL−１インヒビター（IL−1
i）上清を構成した。代表的には、１人の献血者からの
細胞は700−900mlの粗製IL−1i上清を生じた。

C.IL−１インヒビターのアッセイ２種のIL−１アッセイがIL−1iの検出にルーチンに使
用されている。３日間の刺激の後、³H−チミジンとり込
みまたはテトラゾリウム塩MTTの取り込みにより測定し
て（Mosmann,T.,J.Immunol.Method,65:55−61（198
3））胸腺細胞（４−６週令のC3H/HeJマウスからの１×
10⁶細胞）は、組換えヒトIL−１の1.0ユニット/ml＋１
μg/mlのフィトヘマグルチニンに半最大増殖により応答
する。粗製IL−1i上清は1/10希釈でこの増殖性応答を完
全に阻害する。ヒト皮膚線維芽細胞（96ウェルプレート
で１ウェル当り１×10⁵細胞）は代表的には0.5ユニット
/mlの組換えヒトIL−１の６時間の刺激に対して、ELISA
により測定できる約50,000pg/mlのPGE₂を分泌して応答
する。このアッセイは胸腺細胞アッセイと同じ位にIL−
1iに対して感度がよい。

D.IL−１インヒビターの代謝的標識 IL−1iを、IgGで被覆したプレート（Ｂに記載）上0.7
5μg/mlの冷たいメチオニン（通常15μg/ml）だけを含
有し10⁷細胞当り0.5mCi³⁵S−メチオニン（1151 Ci/mモ
ル）を加えた無血清RPMI中で単核白血球を48時間培養す
ることにより代謝標識した。プレートがIgGでなくウシ
胎児血清で被覆されていることを除いては同一に対照標
識化を行った。細胞をウシ胎児血清で被覆したプレート
で培養した場合、かかる対照上清に関するアッセイで
は、ほとんどIL−1iを分泌しないことが示された。

E.IL−１インヒビタータンパク質の精製粗製IL−1i上清を塩化ナトリウム中で1.0Mにし、１時
間氷水でインキュベートし、10,000rpmで15分間遠心し
た。次に全てのインヒビター活性を含有するが最初のタ
ンパク質の20％だけである上清を、Mono Q陰イオン交換
カラムでタンパク質のグラジェント分画を行うために0.
1％スクロースを含有する0.025Mトリス、pH7.6（Ａ緩衝
液）で４℃にて長く透析した。透析に続いてインヒビタ
ーを含有する溶液を10,000rpmで15分間再度遠心し、次
に0.22μのナイロンフィルターに通した。上清は代謝標
識したものを同様に調製した上清10mlと通常いっしょに
してベッド容量1.0mlまたは8.0mlであるMono Q−Supero
se（Pharmacia FPLC）カラムに負荷し、流出物のOD₂₈₀
が基準値にもどるまでＡ緩衝液で洗浄しそして緩衝液Ａ
中の直線状塩化ナトリウムグラジェント（0.025−0.10
M）を使用して注意深くクロマトグラフィーした。カラ
ムフラクションを収集し、放射能および生物活性につい
て分析した。また各フラクションの試料は還元型12.5％
SDS−PAGEで操作し、銀染色し、ジフェニルオキサゾー
ルを浸透させ、乾燥しそしてフィルムの上に置いてオー
トラジオグラムデータを得た。第1a図は代謝標識したIL
−1i上清各3mlと混合した40mlの精製IL−1i上清のMono
Qクロマトグラフィーのタンパク質プロフィールを示
す。重ね合せたものは各フラクション50μ中に見られ
る放射能の最ならびにPGE₂産生アッセイで測定されたIL
−1iの生物活性である。生物活性の３つのピークと完全
に相関関係があるふたつの大きなおよびひとつの小さな
放射性種が示される。第1b図はIgGでなくウシ胎児血清
（FCS）を被覆したプレートで代謝標識した単球の上清3
mlと混合した粗製IL−1i 15mlの同様のクロマトグラフ
ィーを示す。上記した３種の放射性レベルは著しく減少
している。第2a図は第1aおよび1b図中で示したクロマト
グラフィー中の関心のある領域からのフラクションに対
して行った銀染色ゲルを示す。第1a図（フラクション52
および59）中のピーク放射能および生物活性フラクショ
ンは両方ともSDS−PAGEで22Kdで大きなバンド（矢印で
示す）を示すことに注目すべきである。第３の種（第1a
図中のフラクション48）はSDS−PAGEで20KDで１本のバ
ンドを示す。粗製IL−1iのゲル濾過実験は、活性分子が
18−25Kdの分子量を有することを示している。第2b図は
第2a図中に示したゲルのオートラジオグラムである。20
および22Kdでのタンパク質バンドがこれらのフラクショ
ンにおける主要な放射性種であることが容易にわかる。

これらの結果を要約すると、IgGを被覆したペトリ皿
に塗布した単球の代謝標識により放射性種を生じ、これ
はもしその細胞をFCS被覆ペトリ皿に塗布した場合には
わずかにしか生じないものであることを我々は示した。
これらの誘導された放射性種はIL−1i生物活性のいくつ
かの種とともにMono Qで完全に同時にクロマトグラフィ
ー移動し、そしてゲルおよび生じたオートラジオグラム
は３種の主要な分子がIL−1iの予測される分子量を有す
るタンパク質であることを示している。

IL−1i分子を配列決定するために２つの方法でさらに
精製した。第一にピーク生物活性および放射能を有する
Mono QフラクションをC4逆相カラムに負荷し、H₂O/0.1
％ TFA:アセトニトリル/0.1％ TFAグラジェントで溶出
した。IL−1i分子はトレース標識しただけなので、各フ
ラクションの試料は放射能を直接計数し、またSDS−PAG
Eで分析した後オートラジオグラフィーした。第3a図は
放射能パターンを重ね合わせたかかるクロマトグラフィ
ーを示す。各フラクションからの試料に対して行った銀
染色ゲル（第3b図）およびそれに続くゲルのオートラジ
オグラム（第3c図）は、IL−1i分子がフラクション32−
36に見出されることを示している。これらのフラクショ
ンを乾燥しそして配列決定した。別法として、ピークMo
no Qフラクションをスピードバック（Speed Vac）で乾
燥し0.4mlの0.05M NH₄HCO₃中に再懸濁しそして第4aおよ
び4b図に示されるように同じ緩衝液で平衡化した10×30
0mm Superose 12ゲル濾過カラム（Pharmacia FPCL）で
２回直接クロマトグラフィーした。フラクションを収集
し各試料の放射能および生物活性を検査し、銀染色によ
り分析しそしてSDS−PAGEをオートラジオグラフィーし
た。次に適当なフラクションをスピードバックで乾燥し
て配列決定した。

実施例２ IL−１インヒビターの提案された配列決定法配列決定に先立ち試料を6Mグアニジン−HCl,pH8.6中
に溶解し、N₂の下でタンパク質に対して100倍モル過剰
のジチオトレイトールで37℃にて４時間還元し、400倍
過剰の¹⁴Cヨード酢酸で１時間アルキル化した。その場
合、反応物はC8逆相カラムで脱塩し、溶出しそして部分
的に乾燥されよう。Ｎ末端配列はApplied Biosystems P
rotein Sequencerを用いて決定されよう。内部配列を得
るためには、還元されたアルキル化された試料は当業上
知られた方法を用いて臭化シアンまたはタンパク分解酵
素で消化されよう。反応物は乾燥し、0.1％ TFA/H₂Oに
溶解し、そしてペプチドはC8逆相カラムを用いて分離さ
れよう。

実施例３ IL−１インヒビター種の精製および配列決定 A.IL−1i−X,IL−1i−ａおよびIL−1i−ｂ種 IL−1iのMono Q精製により第1a図に示され、実施例１
（その活性ピークフラクションは48,52および59であ
る）に記載されているように生物学的活性が３つの主要
な種に分解される。第2a図に示されるように、これらの
フラクションの試料に対するSDS−PAGEによりそれぞれ2
0KD、22KD、および22KDにおいて関連する種が示され
る。下記実施例４に記載されるマウス抗血清を用いるか
かるゲルのウェスタン分析ではこれら３種全てが染色さ
れる。IgGを被覆したプレートで増殖している間に³⁵S−
メチオニンで代謝標識された細胞からIL−1iが調製され
た場合、各これらのバンドは放射性がある（上記ゲルの
オートラジオグラムで第2b図に示される）。実施例１で
論じた論理にもとずいて、すなわち非誘導条件下でイン
キュベートした平行細胞はIL−1i生物活性を産生せずま
たこれらの放射性バンドも産生しないので、我々はこれ
ら３種が生物活性の原因となるものであると結論するこ
とができる。我々はこれらの種をそれぞれIL−1i−X,IL
−1i−a,およびIL−1i−ｂと仮りに名づける。

B.IL−1i−Ｘの精製および配列決定 IL−1i−Ｘおよび／またはIL−1i−ａを含有するMono
QフラクションをSynchropak RP−４（C4）カラムでの
逆相HPLCクロマトグラフィーによりさらに精製し、そし
て放射性種を配列分析に用いた。RP−HPLC精製IL−1i−
ａおよびIL−1i−ｂを直接配列決定しようとする数々の
試みは失敗しており、このことはそれらのＮ末端が化学
的に遮断されていることを示す。しかしながら、IL−1i
−ａ（IL−1i−aB2p42）のひとつの調製物から下記の配
列：が得られ、そして次にC4RP−HPLCにより同様に精製され
たIL−1i−Ｘの調製物も同じ配列を生じた。

これらは明らかにIL−1i−ａを配列決定する最初の試
みにおいて見出された配列の一部である。示されている
配列データはIL−1i−Ｘと呼ぶ20KD種のＮ末端であると
いうのが発明者らの結論である。

これらおよびそれに続く全ての配列において、下線を
した位置は残基を同定できないかまたは同定される基に
ついてあいまいな点が存在することを示す。２つまたは
それ以上の残基がひとつの位置に置かれている場合、こ
のことは１個以上のアミノ酸が、その配列決定段階で検
出されたことを示し、そしてより正しそうに思われる残
基が上段にある。

C.IL−1i−ａおよびIL−1i−ｂのペプチドの生成、精
製、および配列決定 IL−1i−ａおよびIL−1i−ｂはそのＮ末端が明らかに
化学的に遮断されているので、各ペプチドはエンドプロ
ティナーゼ消化により生成させた。詳細には、IL−1i−
ａまたはIL−1i−ｂを含有するMono Qフラクションを前
実験全てにおいて使用されたC4カラムと許容できる代替
物である4.6×250mm C3−RP HPLCカラム（Zorbax Prote
in Plus）に通した。非常にゆるやかなグラジェント
（0.5ml/分で１分当り0.2％アセトニトリル）により主
要な挟雑放射性種であるヒトリゾチームからIL−1i−ａ
（第8a,b図）またはIL−1i−ｂ（第9a図）を分離した。
精製した種の同一性はSDS−PAGEおよびそれに続くオー
トラジオグラム（第8c,dおよび9b図）で単一の、放射性
の、22KDタンパク質の存在により確認された。タンパク
質をシリコーン処理したグラスチューブに手で収集しそ
してそれぞれに0.2％ツイーン−20溶液25mlを加えた。
次にIL−1i含有フラクションをスピードバックで50mlと
なるまで容量低下させ、１％ NH₄HCO₃の添加により300m
lとなし、次に1mgのエンドプロティナーゼを添加した。
IL−1i−ａの場合、使用した酵素はEndoproteinase Lys
C（Boehringer−Mannheim）であり、一方IL−1i−ｂはE
ndoproteinase AspN（Boehringer−Mannheim）により切
断した。切断は37℃で16時間行い、次に反応混合物の容
量をスピードバックにより50mlに減少させた。

IL−1i−ａの場合、試料を直接クロマトグラフィーに
かけたが、IL−1i−ｂ試料は初め2Mトリス、pH8.0中の5
0mMジチオトレイトール5mlの添加により還元し、37℃で
30分反応させ、次に10mlエタノール中の1.1μモル³H−
ヨード酢酸の添加によりカルボキシメチル化した（暗中
にて37℃で30分間反応）。ペプチドの分離はマイクロボ
アー設備およびマイクロボアーコンパチブルポンプを備
えたBeckman HPLCを用い、100ml/分の流速で2.1×250mm
Brownlee Aquapore RP−300（C8）ナローボアーカラム
で行った。200分の０−100％直線状グラジェントを用い
た（H₂O/0.1％ TFAからアセトニトリル/0.1％ TFAま
で）。ペプチドの分離を第10および11図に示す。得られ
た配列情報は次のとおりである。

ペプチド配列の２種は先にIL−1i−Ｘから得られたも
のと明らかに関連している。これらの一方であるRaLysC
−41はIL−1i−ａ配列でありそしてもう一方であるRbAs
pN−51はIL−1i−ｂ配列であり、このことは３種のIL−
1iがもし単一のもとのIL−1i分子の化学的および／また
は物理的改変形態でないならば、少くとも密接に関連し
たタンパク質であることを示している。列挙した配列を
合一すると、以下の複合配列が生ずる：これら複合配列は最も最近更新されたタンパク質同定
リソースデータベース（Protein Identification Resou
rce Database）（PIR 16.0）にリストされている他の既
知ポリペプチドには何ら存在しないと思われる。本発明
者らは、これら配列またはそのマイナーな変種はIL−１
インヒビターとして作用しうる種類の分子であると考え
る。

実施例４ IL−１インヒビター特異的抗体の調製 10週令BALB/cマウスに、粗製上清からMono Q−クロマ
トグラフィーにより部分精製（400倍）し、PBSで透析し
そして完全フロインドアジュバントで乳化したIL−1iを
皮下注射した。各マウスは粗製上清5mlから精製されたI
L−1iを与えられた。これらマウスには不完全フロイン
ドアジュバントで乳化した同量のIL−1iを２週間毎に追
加免疫し、そして各追加免疫の７日後に尻尾から血清試
料を採った。抗血清を第5a図に示されるように、SDS−P
AGEによるイムノゲンのウェスタントランスブロット分
析により抗−IL−1i活性について検査した。第5b図は、
すべてのマウスがIL−1iの３回注射後に抗−IL−1i抗体
を生成したことを示している。

モノクローナル抗体は発現ライブラリーからのIL−1i
遺伝子のクローニング、組み換えIL−1iタンパクの精
製、およびその分子の生物学の研究に非常に価値があろ
うから、我々はIL−1i特異的な一群のモノクローナル抗
体の製造を開始した。Ｂ細胞ハイブリドーマを生成させ
るには、前記マウスに食塩水中の同量のIL−1iを静脈注
射しそして24時間後に脾臓を摘出した。脾臓細胞を脾臓
から冷平衡塩類溶液（BSS）中にほぐして入れ、BSSで２
回洗浄し、脾臓Ｂ細胞10⁸個当りP3ミエローマ細胞２×1
0⁷個の割合でP3ミエローマ細胞と混ぜ合わせそして遠心
分離した。乾燥ペレットに温かい、ガス添加（５％ C
O₂）PEG 6000（40％ポリエチレングリコール6000:60％
最少必須培地）1mlを滴下することにより，細胞を融合
させた。融合した細胞をBSSで洗い、腹腔細胞２×10⁵/m
lを含有する富培地（10％ FBS）10ml中に再懸濁させそ
して10mlピペットを用いてペレットを緩やかにくずし
た。容量を培地中の腹腔細胞をさらに加えることにより
20mlに調整し、そして細胞を96ウェルプレートに0.1ml/
ウェルで塗布した。プレートをガスインキュベーター中
に入れ、そして次に下記様式で処理した。

第１日目−富培地中の３×HAT（ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）を最終濃度×１となるまで添
加、第５日目−富培地中の１×HAT 200μと置換すること
により培地変換、第10日目−ハイブリッド増殖についての検査開始。腹腔
細胞1.5×10⁶/mlを含有する富培地中の１×HAT 200μ
で置き代えることにより培地交換。

ハイブリッド細胞がウェル中でほとんど集密になった
ところで上清を検査のために移し、そして細胞をピペッ
トの先端で穏やかにかきとって富培地中の１×HATプラ
ス腹腔細胞３×10⁶/mlを含有する1mlの培養ウェルに移
した。

集密ウェルからの上清は、部分精製IL−1i（マウスに
注射されたと同一の、Mono Q−精製物質）をマイクロタ
イターウェルに結合させたELISAを用いて抗−IL−1i活
性について検査する。正常マウス血清および高度免疫抗
血清をそれぞれ陰性および陽性対照として用いる。陽性
上清は均質に精製されたIL−1iを被覆したプレートでの
ELISAおよび精製された代謝的に標識されたIL−1iの免
疫沈降により再検査されよう。次に陽性細胞を限界希釈
法によりクローン化しそしてプリスタン処置マウスに注
射して腹水を生成させる。組織培養または大量生成およ
びマウスの腹水液の収集により大量のIL−1i特異的抗体
を生産できる。これら抗体の精製およびそれらを不溶性
ビーズに付着させると、組み換えIL−1iタンパク質精製
のためのアフィニティ吸着剤が生成されよう。

実施例５ IL−1i cDNAのクローニング IgG被覆ペトリ皿に塗布しそして［³⁵S］−メチオニン
の存在下に24時間培養した単球はMono Qでのクロマトグ
ラフィーにより同定できる［³⁵S］−IL−1iを生成する
ことが示された。

いつ（24時間の期間中）IL−1iが最大割合で生成され
るか判定するために、塗布された単球を［³⁵S］−メチ
オニン（パルス）に短い、２時間の間曝露させたところ
で大過剰の未標識メチオニンを加えてさらに２時間イン
キュベートした。次に培地を収集して放射性標識された
IL−1iについて分析した。この操作をIgG被覆プレート
への塗布後種々の時点で単球に適用しそして、塗布15時
間後に単球を［³⁵S］−メチオニンに曝露させると最大
量の［³⁵S］−IL−1iを生成することが判明し、このこ
とは単球中のIL−1i mRNAがIgGへの塗布15時間後でその
最大レベルにあることを示している。

次に新鮮な単球を実施例1Bにおけるようにして得られ
たLPS不含IgGに塗布した。RPMI培地中37℃で15時間イン
キュベート後、細胞を燐酸緩衝食塩水で洗い、次に4Mグ
アニシニウムチオシアネート;25mMクエン酸ナトリウムp
H7,0.5％サルコシル,0.1M 2−メルカブトエタノールで
溶解させた。次に全RNAをP.ChomczynskiおよびN.Sacchi
のAnalytical Biochemistry,162:156−159（1987）記載
のAGPC法により、この溶解物から単離した。

ポリA⁺RNAをAviv,H.およびLeder,P.（1972）Proc.Nat
l.Acad.Sci.（USA）69:1408−1412の方法によりオリゴd
Tセルロースクロマトグラフィーにより単離し、エタノ
ール沈澱させそして0.36μg/μの濃度に溶解させた。
Gubler,U.およびHoffman,B.J.（1983）Gene 25:263−16
9記載の方法に従いポリA⁺RNAに対して１マイクログラム
を用いてcDNAを調製した。

このcDNAをBoehringer MannheimカタログNo.988448ま
たはNew England Bio Lab No.1070からのEcoR Iリンカ
ーを用いそして製造者の説明書に従い、ラムダgt11発現
ライブラリー中に組み込んだ。

10⁶個の独立したクローンを含有する生成するライブ
ラリーを、R.A.YoungおよびR.W.Davis［（1983）PNAS 8
0:1194−1198］により記載されるスクリーニング条件を
用いて、先に記載のIL−1iに対する適当なポリクローナ
ル抗体を用いてE.coli Y1090 rk^-（Promega Biotec）で
選抜した。陽性シグナルはBayer,E.A.およびWilchek,M.
（1979）によりMethods in Biochemical Analysisに、
およびGuesdon,J.L.Ternynch,T.およびAvrameas,S.（19
79）によりJ.Histochem,Cytochem.27:1131−1138に記載
されるようにして、および製造者の説明書に従い、ビオ
チニル化第２抗体（例えばヤギ抗−マウスIgG,Bethesda
Research Labs）に続いてストレプトアビジン−アルカ
リホスファターゼ接合体（Bethrsda Research Labs）を
用いて検出されよう。

実施例６ IL−1iをコードする遺伝子の調製および配列決定実施例５記載のようにして調製されたcDNAをクローニ
ングベクターラムダGT10に組み込んだ。このcDNAを、基
質としてＳ−アデノシル−メチオニンを用い、EcoR Iメ
チラーゼで初めにメチル化し、EcoR Iリンカーを連結反
応で結合させ、そして過剰のリンカーはEcoR Iエンドヌ
クレアーゼでの消化およびCL6Bスピンカラムでのクロマ
トグラフィーにより除去した。リンカー結合され、分子
量で選択されたcDNA 0.124μｇおよびEcoR I切断された
ホスファターゼ処理されたラムダGT10 1μｇを含有する
反応物で連結反応を行い、そしてこの連結反応の生成物
をGIGAPACK GOLDパッケージング抽出物（Stratagene）
を用いてパッケージした。それにより１×10⁷メンバー
のライブラリーが得られた。

このGT10ライブラリーを選抜するために、実施例３に
提示されるタンパク質およびペプチド配列に基づきオリ
ゴヌクレオチド（アンチセンス）プローブを合成した。
プローブの配列およびそれらの相当するペプチド配列は
次のとおりである。

プローブ＃IL1i1−３はその５′末端で³²P−ホスホリ
ル化されそしてライブラリーの３×10⁵プラークを選抜
するのに用いられた。このプローブは３個のプラークに
複製可能にハイブリダイズし、そしてそれらのうち１種
のプラークがプローブ＃IL1i1−４にもハイブリダイズ
することが示された。このプラークGT10−IL1i−2Aを培
養しそして製造者の説明書に従いLambdasorb（Promeg
a）を用いてDNAを単離した。GT10−IL1i−2AはAmerican
Type Culture Collection（ATCC）、Rockville,Maryla
ndに受託番号40488の下に寄託されている。このDNAをEc
oR Iで消化し、５等分し、そして１％アガロースゲルで
電気泳動した。

電気泳動後、このゲルをエチジウムブロマイドで染色
した。このゲルの写真を第12a図に示す。レーン6,8,10,
12および14はEcoR I消化からの５等分物を含有する。レ
ーン５は分子量マーカーとして有用なHind III切断野生
型ラムダDNAとHae III切断φ×174RF DNA（New England
Biolabs）の混合物を含有する。第12a図は、GT10−IL1
i−2Aが長さ1850塩基対のEcoR Iフラグメントを含有す
ることを示している。

この1850bpフラグメントがIL1インヒビターのコード
配列を担持することをもっと結論的に示すために、サザ
ンブロットを以下のようにして実施した。第12a図に示
されるゲル中のDNAフラグメントを標準的方法を用いて
ニトロセルロース上にブロットした。次にこのニトロセ
ルロースを各ストリップがレーン6,8,10,12および14か
らのDNAを含有するように５個のストリップに縦に切断
した。次にこれらストリップを、５′−末端で³²P−ホ
スヘートで標識した５個のオリゴヌクレオチドプローブ
（前出）のそれぞれにハイブリダイズさせた。オリゴヌ
クレオチド濃度は1pモル/mlでありそしてハイブリダイ
ゼーション温度は以下のとおりであった。

洗浄後、ストリップを並べ、テープでくっつけてもと
のニトロセルロースシートを再生した。これを増感スク
リーンの存在下に−70℃で24時間オートラジオグラフィ
ーした。第12b図はこのオートグラフの写真である。こ
れにより、全てのプローブが1850bpフラグメントに特異
的にハイブリダイズする証拠が提供され、このことはこ
のフラグメントがIL1インヒビターの実質的なコード配
列を担持することを証明している。

そのDNA配列を決定するために、GT10−IL1i−2A DNA
をEcoR Iで消化し、１％アガロースゲルで電気泳動しそ
して1850bpフラグメントを単離した。このフラグメント
をEcoR I消化M13 mp19と連結し、そしてE.coli株JM 109
中に形質転換した。形質転換体をβ−ガラクトシダーゼ
活性を欠くものについて探索することにより選抜した。
５種のかかる形質転換体を単離し、一本鎖DNAを調製
し、そしてSangerらの方法に従い配列決定した。３種の
形質転換体のDNA配列はmRNAの３′末端に相当するが、
２種の形質転換体はタンパク質コード配列を提供した。
第13図は、cDNAのタンパク質コード領域に関して得られ
たDNA配列を示す。

第13図はまた予想アミノ酸配列をも示す。第１番目の
アミノ酸アラニンから第29番目のアミノ酸プロリンまで
および第79番目のアミノ酸イソロイシンから末端までの
アミノ酸配列が仮説アミノ酸配列である。第30番目のア
ミノ酸プロリンから78番目のアミノ酸プロリンまでの予
想アミノ酸配列は実施例３記載のペプチド配列と一致す
る。

実施例７ GT10−IL−1I−2AおよびIL−1iの配列決定 GT10−IL1i−2Aの部分を配列決定しそして第14図に示
す。このDNAはIL−1iに特徴的なアミノ酸配列を含有す
るタンパク質をコードする（ヌクレオチド99−557）。
しかしながら、このタンパク質が細胞外環境中に分泌さ
れる前にいくつかの修飾がなされうると考えられる。こ
れらの修飾はそのタンパク質がIL−1iとしての活性を有
するのに必須であるかも知れないしないかも知れない。

GT10−IL1i−2AはＸとして知られるIL−1iの形態のア
ミノ末端に対してＮ末端である少くとも32個のアミノ酸
（ヌクレオチド３−98）をコードする。これら32個のア
ミノ酸中には、ヌクレオチド24−26によりコードされる
Ｍで始まり、新生IL−1iを細胞外環境方向へ指示しそし
て次にリーダーペプチダーゼおよび場合により他のペプ
チダーゼにより除去される分泌リーダー配列が包含され
ると考えられる。この配列がIL−1iのアルファおよびベ
ータ形態で除去される程度は現在知られていないが、こ
れら形態のＮ−末端はＸ形態のそれに近接していると考
えられる。分泌リーダー配列の除去は恐らくそのタンパ
ク質が有効なIL−1i活性を有するのに必要であろう。

GT10−IL1i−2Aのヌクレオチド349−351はコンセンサ
スＮ−グリコシル化部位の一部分であるＮ−残基をコー
ドする。それらがＮ−グリカナーゼで消化され易いこと
に基づき、IL−1iのアルファおよびベータ形態がグリコ
シル化されると考えられる。Ｘ形はこの酵素での消化を
受け易いとは考えられていないので、ここに提供される
情報を用いてタンパク配列決定分野で通常の技術を有す
る者により容易に示されうる可能性が残りはするが、そ
れはグリコシル化されないと考えられる。このＮ残基で
のグリコシル化はそのタンパク質が有効なIL−1i活性を
示すのに必要ではないと考えられる。

GT10−IL1i−2Aのヌクレオチド99−101はＰ（第15図
参照）をコードするが、IL−1iのＸ形のこの位置（Ｎ−
末端）ではＰは検出されていない。この残基が成熟タン
パク質では修飾されていることはありうる。この残基の
修飾は有効なIL−1i活性にとって必須要件ではないと考
えられる。

アルファ形とベータ形の現在知られていないＮ−末端
残基はエドマン分解によっては完全には検出できずそし
てGT10−IL1i−2Aによりコードされるタンパク質のＮ−
末端残基の幾つかの除去に続いて修飾されていそうであ
る。この修飾は有効なIL−1i活性にとって必須要件では
ないと考えられる。

実施例８ IL−1iをコードする遺伝子の動物細胞における発現 IL−1iの動物細胞発現は下記工程を必要とする。

a.発現ベクターの作製； b.宿主細胞系の選択； c.宿主細胞への発現ベクターの導入； d.IL−1iの発現レベルを高めるために組み換え宿主細胞
の操作。

1.動物細胞で使用するために設計されたIL−1i発現ベク
ターは強力な構成性発現作製物、誘導可能な遺伝子作製
物、ならびに特定の種類の細胞で発現させるために設計
されたものを含む幾つかの種類であることができる。す
べての場合においてプロモーターおよび他の遺伝子調節
領域例えばエンハンサー（誘導可能またはそうではな
い）およびポリアデニル化シグナルはプラスミドベクタ
ー中のcDNA配列に関して適当な位置に置かれる。かかる
作製物の２例は次のとおりである。（１）強力な構成性
プロモーター領域を用いる作製物は、ここに参考文献と
してとり込まれるGormanらのMol.Cel.Biol.2:1044−105
1,1982に記載されるプラスミドpSV2 CAT中に見られるそ
れのような配置におけるシミアンウイルス40（SV40）遺
伝子制御シグナルを用いて作られねばならない。このプ
ラスミドは第６図に示されるように標準的な分子生物学
的技法（Mamiatisら、前出）を用いてクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）コード配列に
代えてIL−1i cDNAが入るように操作されねばならな
い。（２）誘導可能な遺伝子作製物はマウスメタロチオ
ネイン（MT−１）プロモーター領域（Brinsterら,Cell
27:228−231,1981）を含有するプラスミドpMKを用いて
作られねばならない。このプラスミドは出発物質として
使用できそしてメタルにより誘導可能な遺伝子作製物を
生成させるために第７図に示されるようにして操作され
ねばならない。

2.活性タンパク質を生成させるためには、前記したベク
ターを用い多数の動物細胞系を使用してIL−1iを発現さ
せねばならない。外来遺伝子発現を促進させるそれらの
能力に関して充分に特性決定された２種の有効な細胞系
は、IL−1iの発現はこれら細胞系には限定されないが、
マウスLtk^-およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO）d
hfr^-細胞である。

3.ベクターDNAは多数の遺伝子移入技術の任意のものを
用いてこれら細胞系に導入されねばならない。ここで用
いられる方法にはS.L.Graham ＆ A.S.van der Eb（Viro
logy 52:456−467,1973）の燐酸カルシウム−DNA沈澱法
が包含され、そこではIL−1iの発現ベクターが選択可能
なマーカーをコードする第２の発現ベクターと同時沈澱
される。Ltk^-細胞トランスフェクションの場合、選択可
能なマーカーはチミジンキナーゼ遺伝子でありそしてそ
の選択はWigler,ら（Cell 16:777−785,1979）により記
載されており、CHO dhfr^-細胞の場合には選択可能なマ
ーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）でありその
選択はRingoldらによりJ.Mol.Appl.Genet.1:165−175,1
981に記載されている。

4.IL−1i遺伝子作製物を発現する細胞を次にIL−1i生産
レベルを高めるであろう条件下に増殖させねばならな
い。メタロチオネインプロモーター構築物を担持する細
胞はここでMT−１プロモーター（Mayoら,Cell 29:99−1
08）の利用を５倍高めそれによりIL−1iタンパク質レベ
ルを同じく増大させるカドミウムのような重金属の存在
下に増殖させることができる。DHFR発現ベクターと一緒
にIL−1i発現ベクター（SV40またはMT−１のいずれかに
基づく）を含有する細胞はDHFRの競合的拮抗体であるメ
トトレキセートを用い、Ringoldら（J.Mol.Appl.Genet.
1:165−175,1981）記載の遺伝子増巾プロトコルによっ
て採取できる。これにより細胞中に存在するDHFR遺伝子
のコピー数が増えそして同時にIL−1i遺伝子のコピーが
増え、それによりより多くのIL−1iタンパク質が細胞に
より生産されうる。

実施例９組み換え動物からのIL−1iの精製 IL−1iは天然物質と同様に細胞から分泌されると予想
されるので、天然のタンパク質の精製に関して前記した
方法により組み換えタンパク質を同様な精製および特性
決定ができることが予想される。

実施例10 IL−1iの配列 IL−1iのアミノ末端残基は直接タンパク質配列決定に
より数回アルギニン（Ｒ）として同定されている。かか
る配列決定の結果を実施例３に示す。これと反対に、cD
NAの配列により予測されるIL−1iのアミノ末端残基はプ
ロリン（Ｐ）である。このアミノ末端残基は第13図のヌ
クレオチド85−87に相当し、そして第14図および15図で
○で囲んである。cDNA配列と直接タンパク質配列の間の
この明らかな不一致は、cDNA配列における過誤がそのmR
NAからの逆転写酵素により触媒された合成期間中にとり
込まれたと想定することにより解決できる。すなわち、
mRNA上に存在し、そこでそのアミノ末端残基をコードし
ていようCGA（アルギニン）コドンは逆転写酵素反応中
にcDNA中のCCA（プロリン）コドンに変化されることが
できたであろう。この種の逆転写酵素問題は以前に例え
ば、B.D.ClarkらのNucleic Acids Research 14:7897（1
986）により文献で報告されている。

本発明者らは、アミノ末端アミノ酸が第13〜15図に示
されるプロリン残基の代りにアルギニンであることを除
いてはこのタンパク質の正確なアミノ酸配列はcDNAによ
り予測されるとおりであると考える。本発明者らは、ア
ミノ末端アルギニン配列が好ましいが、DNA配列および
それらの相当するペプチド配列の両方が本発明の範囲に
該当することを意図するものである。

実施例11 下記配列を有するタンパク質も本発明に包含される、
すなわち（式中Ｘはシステイン、セリンまたはアラニンでありそ
してＺはアルギニンまたはプロリンである）。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 15/00 ＺＮＡ (31)優先権主張番号２６６，５３１ (32)優先日昭和63年11月３日(1988．11．3) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (73)特許権者 999999999 ザユニバーシティーオブコロラドファウンデーションアメリカ合衆国コロラド州 80301, ボウルダー，ユニバーシティーアベニュ 1305 (72)発明者ハノン，チャールズ，エッチ. アメリカ合衆国コロラド州 80301, ボウルダー，ウィローレーン 6150 (72)発明者エイゼンバーグ，ステファン，ピー. アメリカ合衆国コロラド州 80302, ボウルダー，パノラマアベニュー 2325 (72)発明者トムプソン，ロバート，シー. アメリカ合衆国コロラド州 80303, ボウルダー，ルハイストリート 1820 (72)発明者アレンド，ウィリアム，ピー. アメリカ合衆国コロラド州 80207, デンバー，モントヴューブルバード 4157 (72)発明者ジョスリン，フェネック，ジー. アメリカ合衆国コロラド州 80220, デンバー，マゴハストリート 1900 (72)発明者ソマー，アンドリアスアメリカ合衆国カリフォルニア州 94518，コンコード，オークグローヴロード 117 (56)参考文献特表平２−500643（ＪＰ，Ａ) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，139（５），（1987），1541 −1545 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，139（５），（1987），1546 −1549 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，134（６），（1985），3882 −3886 ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，20, （1990），683−689 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，163, （1986），511−519

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】インターロイキン−１（IL−１）を抑制す
ることができるポリペプチドであり、該ポリペプチドの
アミノ酸配列の少なくとも一部を決定できるに足る程に
純粋である実質的に精製されたインターロイキン−１イ
ンヒビター（IL−ｉ）であって、該ポリペプチドが、（Ａ）下記のアミノ酸配列の全部を含むポリペプチドま
たは（式中（Ｕ）は存在しないかまたはＭであり、（Ｘ）は
ＲまたはＰである。）（Ｂ）（Ａ）に記載のアミノ酸配列に少なくとも約95％
相同であるポリペプチドを含む前記のIL−1i。
【請求項２】前記IL−1iが哺乳動物細胞に由来する請求
の範囲１記載のIL−1i。
【請求項３】前記IL−1iが単球から単離される請求の範
囲１記載のIL−1i。
【請求項４】前記IL−1iがヒト単球から単離される請求
の範囲３記載のIL−1i。
【請求項５】前記IL−1iが組換えDNA法により生産され
る請求の範囲１記載のIL−1i。
【請求項６】インターロイキン−１インヒビター（IL−
1i）をコードするDNA分子を含有する組換え宿主細胞に
おいてIL−1iポリペプチドを生産させることを含む、IL
−1iポリペプチドを製造する方法であって、該IL−1iが
インターロイキン−１（IL−１）を抑制することができ
るポリペプチドであり、ここで、該DNA分子が、（Ａ）（式中ＸはＣまたはＧである。）（Ｂ）（Ａ）の配列のコーディング領域、（Ｃ）（Ａ）の配列のコーディング領域において縮重し
ている配列、または（Ｄ）下記のアミノ酸配列に少なくとも95％相同である
ポリペプチドをコードする配列（式中（Ｕ）は存在しないかまたはＭであり、（Ｘ）は
ＲまたはＰである。）から選択される配列を含むものであり、そこに含まれる
前記DNA分子を発現して前記ポリペプチドを生産するの
に適した条件下で該ポリペプチドが生産される前記の方
法。
【請求項７】前記DNA配列がcDNAである請求の範囲６記
載の方法。
【請求項８】前記DNA配列が哺乳動物細胞に由来する請
求の範囲６記載の方法。
【請求項９】前記DNA配列がヒト単球細胞に由来する請
求の範囲８記載の方法。
【請求項１０】前記宿主細胞が微生物である請求の範囲
６記載の方法。
【請求項１１】前記微生物がE.coliである請求の範囲10
記載の方法。
【請求項１２】前記宿主細胞が哺乳動物細胞である請求
の範囲６記載の方法。
【請求項１３】前記哺乳動物細胞がCHO細胞である請求
の範囲12記載の方法。
【請求項１４】インターロイキン−１インヒビター（IL
−1i）をコードする単離されたDNAであって、該IL−1i
がインターロイキン−１（IL−１）を抑制することがで
きるポリペプチドであり、ここで、前記DNAが、（Ａ）（式中ＸはＣまたはＧである。）（Ｂ）（Ａ）の配列のコーディング領域、（Ｃ）（Ａ）の配列のコーディング領域において縮重し
ている配列、または（Ｄ）下記のアミノ酸配列に少なくとも95％相同である
ポリペプチドをコードする配列（式中（Ｕ）は存在しないかまたはＭであり、（Ｘ）は
ＲまたはＰである。）から選択される配列を含むものである前記のDNA。
【請求項１５】前記DNAが下記配列の99位から554位まで
の核酸を包含する請求の範囲14記載の単離されたDNA。
【請求項１６】下記の配列を有する組換えDNA分子GT10
−IL1i−2A。
【請求項１７】Mono Q−Superoseカラムにて、緩衝液Ａ
中の0.025−0.10Mの直線状塩化ナトリウムグラジエント
を使用して、ヒト白血球由来の単核細胞フラクションを
分離したときに流出してくる３つの生物活性ピークのう
ちの最初、２番目および３番目の生物活性ピークとして
流出し、SDS−PAGEで測定したときに、それぞれ、20K
D、22KDおよび22KDの分子量を有する、３種のインター
ロイキン−１インヒビターの少なくとも１つからなる、
請求項１記載の実質的に精製されたインターロイキン−
１インヒビター（IL−1i）。
【請求項１８】Mono Q−Superoseカラムにて、緩衝液Ａ
中の0.025−0.10Mの直線状塩化ナトリウムグラジエント
を使用して、ヒト白血球由来の単核細胞フラクションを
分離したときに流出してくる３つの生物活性ピークのう
ちの最初の生物活性ピークとして流出し、SDS−PAGEで
測定したときに、20KDの分子量を有するインターロイキ
ン−１インヒビターである、請求項17記載のインターロ
イキン−１インヒビター。
【請求項１９】Mono Q−Superoseカラムにて、緩衝液Ａ
中の0.025−0.10Mの直線状塩化ナトリウムグラジエント
を使用して、ヒト白血球由来の単核細胞フラクションを
分離したときに流出してくる３つの生物活性ピークのう
ちの２番目の生物活性ピークとして流出し、SDS−PAGE
で測定したときに、22KDの分子量を有するインターロイ
キン−１インヒビターである、請求項17記載のインター
ロイキン−１インヒビター。
【請求項２０】Mono Q−Superoseカラムにて、緩衝液Ａ
中の0.025−0.10Mの直線状塩化ナトリウムグラジエント
を使用して、ヒト白血球由来の単核細胞フラクションを
分離したときに流出してくる３つの生物活性ピークのう
ちの３番目の生物活性ピークとして流出し、SDS−PAGE
で測定したときに、22KDの分子量を有するインターロイ
キン−１インヒビターである、請求項17記載のインター
ロイキン−１インヒビター。
【請求項２１】前記DNAが下記配列の99位から554位まで
の核酸を包含する請求の範囲14記載の単離されたDNA。
【請求項２２】下記の配列を有する実質的に精製された
インターロイキン−１インヒビター。（式中Ｘはシステイン、セリンまたはアラニンであり、
そしてＺはアルギニンまたはプロリンである。）
【請求項２３】IL−1iが、組換え法で生産される非グリ
コシル化ポリペプチドである、請求の範囲１記載のIL−
1i。
【請求項２４】IL−1iが、ヒト細胞により生産されるIL
−1iとは異なるグリコシル化パターンを有するIL−1iを
生産するヒト細胞以外の宿主細胞により、組換え法で生
産されるものである、請求の範囲１記載のIL−1i。
【請求項２５】下記のアミノ酸配列に少なくとも95％相
同であるポリペプチドを含む請求項１記載のIL−1i。（式中（Ｕ）は存在しないかまたはＭであり、（Ｘ）は
ＲまたはＰである。）
【請求項２６】下記のアミノ酸配列に少なくとも99％相
同であるポリペプチドを含む請求項１記載のIL−1i。（式中（Ｕ）は存在しないかまたはＭであり、（Ｘ）は
ＲまたはＰである。）
【請求項２７】下記のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドを含む請求項１記載のIL−1i。
【請求項２８】宿主細胞が前記核酸配列を増幅するのに
適した栄養条件下で培養される請求項６記載の方法。
【請求項２９】前記の発現されたポリペプチドが回収さ
れる請求項６または28のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】IL−1i抑制活性を持つ化合物を生産する
ように回収ポリペプチドを改変する工程をさらに含む請
求項29記載の方法。
【請求項３１】回収ポリペプチドを製剤学的に許容され
る担体と組合わせて医薬組成物を形成する工程をさらに
含む請求項29または30のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】下記のアミノ酸配列からなる請求項１記
載のIL−1i。（式中（Ｕ）は存在しないかまたはＭである。）
【請求項３３】DNA分子が下記のアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする請求項６記載の方法。（式中（Ｕ）は存在しないかまたはＭである。）
【請求項３４】DNA分子が下記のアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする請求項14記載の単離されたDN
A。（式中（Ｕ）は存在しないかまたはＭである。）
【請求項３５】請求項14、15、21または34のいずれかに
記載のDNAを含むベクター。
【請求項３６】（Ａ）（式中ＸはＣまたはＧである。）（Ｂ）（Ａ）の配列のコーディング領域、（Ｃ）（Ａ）の配列のコーディング領域において縮重し
ている配列、または（Ｄ）下記のアミノ酸配列に少なくとも95％相同である
ポリペプチドをコードする配列（式中（Ｕ）は存在しないかまたはＭであり、（Ｘ）は
ＲまたはＰである。）から選択される配列を含むDNA分子を含有する組換え宿
主細胞。
【請求項３７】DNA分子が下記のアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードする請求項36記載の宿主細胞。（式中（Ｕ）は存在しないかまたはＭである。）
【請求項３８】下記配列の99位から554位までを含むDNA
分子を含有する組換え宿主細胞。（式中ＸはＣまたはＧである。）
【請求項３９】請求の範囲１〜５、17〜20、22〜27また
は32のいずれかに記載のIL−１インヒビターを含む、IL
−１を阻害するための医薬組成物。