CN102146121A - 一种含有oxt拮抗剂药物的生产工艺 - Google Patents

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CN102146121A
CN102146121A CN2010105522137A CN201010552213A CN102146121A CN 102146121 A CN102146121 A CN 102146121A CN 2010105522137 A CN2010105522137 A CN 2010105522137A CN 201010552213 A CN201010552213 A CN 201010552213A CN 102146121 A CN102146121 A CN 102146121A
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fmoc
acid
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gly
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姚志勇
支钦
李新宇
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SHENZHEN CITY JIANYUAN PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
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SHENZHEN CITY JIANYUAN PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Abstract

本发明涉及以阿托西班为主药的一种治疗早产药物的生产工艺，包括合成以及制剂工艺。其固相合成的技术方案包括如下步骤：1)以氨基树脂为载体，脱保护；2)将Fmoc-Gly-OH的羧基与树脂的氨基相连，得到Fmoc-Gly-氨基树脂；3)依次固相合成序列剩余保护氨基酸；4)脱除半胱氨酸和巯基丙酸的侧链保护基；5)用碘进行固相环化；6)切割，得到阿托西班粗肽；7)精制，得到阿托西班纯品。该工艺具有反应操作简单、后处理容易、收率高、成本低等特点。本发明同时公开了一种阿托西班冻干粉针剂，其主要原料组成为：主药阿托西班，赋形剂，pH值调节剂和注射用水。该粉针剂具有分散度高，稳定性好等优点。

Description

一种含有OXT拮抗剂药物的生产工艺
技术领域：
本发明涉及一种含有OXT拮抗剂药物的生产工艺，尤其涉及阿托西班的一种固相合成法及其冻干粉针剂制剂工艺。
背景技术：
阿托西班是一种催产素类似物，为人工合成的环状多肽，是子宫内及蜕膜、胎膜上受体的催产素竞争性拮抗剂，在临床上使用其醋酸盐治疗早产。阿托西班可剂量相关性地抑制宫缩，并使环状肽催产素介导的前列腺素分泌减少，达到保胎的目的。
早产是围生儿死亡率和发病率的一个最重要原因，不包括致命的先天畸形。它是75％围产期死亡和50％儿童期神经失能的原因。最好的宫缩抑制剂应该是，对母亲和胎儿来说是安全的，能延长妊娠以使有足够的时间显著地降低早产，使胎儿成熟，从而减少围生儿死亡率和发病率。然而，目前宫缩抑制剂不符合这些要求。它们已被证明能显著地延迟分娩长达48小时，有助于肺糖皮质激素诱导成熟，但它们并没有使早产率显著性地降低。此外，他们有常见的副作用，导致母亲和胎儿的发病率和退出率很高，尤其是β-激动剂(第一线药物)。
阿托西班是妇产科药物中的一种突破产品，它是一种特定的催产素受体拮抗剂，用于推迟不足月分娩。在过去的几年，许多临床试验已经评估其疗效和安全性。阿托西班能快速地抑制宫缩，延长妊娠，而对母亲，胎儿和婴儿没有不良影响。因此阿托西班在临床上有很好的应用前景，具有很高的开发价值。
阿托西班的结构如下：
Figure BSA00000353949800011
分子式：C43H67N11O12S2
分子量：994.19
本方法提供了一种产率更高，环境污染更小以及制剂更稳定的生产工艺。
已上市的阿托西班注射液的处方包含有7.5mg/ml阿托西班，50.0mg/ml甘露醇，1mol/L盐酸调pH值至4.5。其稳定性差，只可于冰箱温度2℃～8℃保存。阿托西班冻干粉针剂克服了注射剂存在稳定性差的不足，具有分散度高，稳定性好等优点。该制剂质量稳定，疗效确切，利于患者接受。
发明内容：
本发明的目的在于提供阿托西班的一种固相合成法及一种冻干粉针剂，以克服现有技术上存在的缺陷和注射剂稳定性差的不足。本发明提供了一种高收率、低成本、环境污染小、有利于实现产业化的阿托西班固相合成方法，以及能改善制剂的稳定性、延长有效期、便于室温贮藏的冻干粉针剂。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
Fmoc：芴甲氧羰基
TBTU：O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯
HOBt：1-羟基苯骈三唑
DIEA：N，N-二异丙基乙胺
TFA：三氟醋酸
DCM：二氯甲烷
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
EDT：乙二硫醇
Water：水
Trt：三苯甲基
Et：乙基
tBu：叔丁基
Boc：叔丁氧羰基
Mpa：巯基丙酸
一种固相合成阿托西班的方法，包括以下步骤：
1)以氨基树脂为载体，脱保护；
2)将Fmoc-Gly-OH的羧基与树脂的氨基相连，得到Fmoc-Gly-氨基树脂；
3)依次固相合成序列剩余保护氨基酸；
4)脱掉半胱氨酸和巯基丙酸的侧链保护基；
5)用碘进行固相环化；
6)切割，得到阿托西班粗肽；
7)精制，得到阿托西班纯品。
本发明提供了一种固相合成阿托西班的方法，其氨基树脂为Rink Amide MBHA树脂，树脂替代度为0.8～1.2mmol/g。其保护氨基酸分别是Fmoc-Gly，Fmoc-Orn(Boc)，Fmoc-Pro，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Ile，Fmoc-D-Tyr(Et)，Mpa(Trt)-OH。其缩合试剂为TBTU/HOBt/DIEA。其保护氨基酸以及缩合试剂的投料量是2～5倍当量。其接氨基酸过程中的每一步都经Kaiser Test，颜色呈阴性则依次接保护氨基酸。其脱除半胱氨酸和巯基丙酸的侧链保护基的试剂是1％TFA/DCM。其环化试剂是I2，溶剂为DMF。其裂解试剂是按TFA∶EDT∶water＝95∶2.5∶2.5的体积比配制而成。其阿托西班纯品是粗肽经反相高效液相色谱法分离纯化而得，其色谱条件为：
色谱柱：Φ15cm
色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶(C18)10μm
上样量：≤30g目的肽/次
检测波长：230nm
流速：400ml/min
流动相：A：0.3％醋酸水溶液；B：乙腈
色谱条件：梯度程序见下表。
Figure BSA00000353949800031
本发明同时制备了一种含阿托西班药物的冻干粉针剂，其包括主药阿托西班、赋形剂、pH值调节剂与注射用水。
本发明同时制备了一种含阿托西班药物的冻干粉针剂，其赋形剂选自甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、氯化钠、山梨醇等；其pH值调节剂选自盐酸、冰醋酸、硫酸、乳酸、苹果酸、枸橼酸、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠等。
经过大量优化实验，本发明发现了最优选配方组成。其中，其赋形剂优选甘露醇和乳糖，pH值调节剂最优选盐酸，pH值最优选3.5-5.5。
另外，本发明还提供了制备含阿托西班药物的冻干粉针剂的方法。其工艺如下：
1  精密称取处方量的上述物料至灭菌容器中；
2  加入适量注射用水完全溶解；
3  用盐酸调节pH值至3.5至5.5之间；
4  注射用水定容；
5  活性碳吸附热原；
6  0.45μm微孔滤膜过滤；
7  0.22μm微孔滤膜过滤；
8  检查合格后灌装于西林瓶中，真空冷冻干燥、压塞、扎盖、出箱；
9  检查合格后贴签包装。
附图说明：
图1为本发明固相合成阿托西班的工艺流程图。
具体实施方式：
本发明包含但不局限于以下实施例。
实施例1：制备Fmoc-Gly-树脂
将100.00g Fmoc-Rink Amide MBHA resin加入到反应柱中，该树脂的替代度为1.0mmol/g。加入600mlDMF溶胀，然后加入DCM600ml/次洗涤3次，再加入DMF600ml/次洗涤3次。向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。保护氨基酸以及缩合试剂的投料量为3倍当量，称取Fmoc-Gly-OH89.19g及TBTU96.32g、HOBt40.54g、DIEA38.77g，加入DMF搅拌溶解，搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内，搅拌反应24小时。Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。反应完毕后，抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤3次，再用DCM600ml/次洗涤3次，抽干，倒出，放入真空干燥箱干燥12小时。取出称重，为104.16g，测定替代度为0.80mmol/g。
实施例2：制备Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂
将104.16g Fmoc-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM600ml/次洗涤3次，再加入DMF600ml/次洗涤3次。向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。称取Fmoc-Orn(Boc)-OH 113.63g及TBTU80.27g、HOBt33.78g、DIEA32.31g，加入DMF搅拌溶解。完全溶解后，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应4小时。取样，用DMF洗涤6次，Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤6次。
实施例3：制备Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂
向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。称取Fmoc-Pro-OH 84.35g及TBTU80.27g、HOBt33.78g、DIEA32.31g，加入DMF搅拌溶解。完全溶解后，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应3小时。取样，用DMF洗涤6次，KaiserTest检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤6次。
实施例4：制备Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂
向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH 146.43g及TBTU80.27g、HOBt33.78g、DIEA32.31g，加入DMF搅拌溶解。完全溶解后，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应6小时。取样，用DMF洗涤6次，Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤6次。
实施例5：制备Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂
向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。称取Fmoc-Asn(Trt)-OH 149.18g及TBTU80.27g、HOBt33.78g、DIEA32.31g，加入DMF搅拌溶解。完全溶解后，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应6小时。取样，用DMF洗涤6次，Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤6次。
实施例6：制备Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂
向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 99.38g及TBTU80.27g、HOBt33.78g、DIEA32.31g，加入DMF搅拌溶解。完全溶解后，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应4小时。取样，用DMF洗涤6次，Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤6次。
实施例7：制备Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂
向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。称取Fmoc-Ile-OH 91.85g及TBTU80.27g、HOBt33.78g、DIEA32.31g，加入DMF搅拌溶解。完全溶解后，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应4小时。取样，用DMF洗涤6次，Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤6次。
实施例8：制备Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂
向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。称取Fmoc-D-Tyr(Et)-OH 107.87g及TBTU80.27g、HOBt33.78g、DIEA32.31g，加入DMF搅拌溶解。完全溶解后，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应5小时。取样，用DMF洗涤6次，Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤6次。
实施例9：制备H-Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂
向玻璃反应柱内加入配制好的50％哌啶/DMF溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。称取H-Mpa(Trt)-OH 87.08g及TBTU80.27g、HOBt33.78g、DIEA32.31g，加入DMF搅拌溶解。完全溶解后，将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应3.5小时。取样，用DMF洗涤6次，Kaiser Test检测反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF600ml/次洗涤6次。
实施例10：制备H-Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂
向玻璃反应柱内加入配制好的1％TFA/DCM溶液600ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF600ml/次洗涤6次。
实施例11：环化
称取63.45g I2加入1350mlDMF中搅拌溶解，完全溶解后加入到反应柱内，氮气吹搅反应30min。反应完毕后，取样，用DMF洗涤6次，用Ellman反应检测巯基反应程度，直至反应完成。抽去反应液，用DMF1350ml/次洗涤3次，再用DCM1350ml/次洗涤3次，抽干，倒出。
实施例12：裂解
将环化后的树脂加入到圆底烧瓶中，加入配制好的裂解试剂(TFA∶EDT∶water＝95∶2.5∶2.5)2400ml，搅拌反应120min。过滤，树脂用TFA洗涤3次。合并滤液，缓慢沉降到24000ml的无水乙醚中。静置2h后开始离心，离心完毕后用无水乙醚2700ml/次离心洗涤6次，将得到的粗肽放入冰箱过夜，冷冻干燥，即得阿托西班粗品。
实施例13：纯化
色谱柱：Φ15cm
色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶(C18)10μm
上样量：≤30g目的肽/次
检测波长：230nm
流速：400ml/min
流动相：A：0.3％醋酸水溶液；B：乙腈
色谱条件：梯度程序见下表。
Figure BSA00000353949800071
将得到的粗肽减压干燥后加水3800ml溶解，溶液用0.45μm的微孔滤膜过滤。滤液按照纯化条件上样，收集目的峰溶液，并将收集的溶液浓缩，冷冻干燥，得目标产物，收率为70.5％。
实施例14：制备阿托西班冻干粉针剂
7.5mg/ml阿托西班，3％w/v甘露醇，用1mol/L盐酸调节pH为4.5，其制备工艺如下：
在无菌条件下，称取阿托西班37.5g，以及甘露醇150g，置于灭菌容器中，加处方量80％注射用水，搅拌使溶解，用冰醋酸调pH至4.5，加注射用水至5000ml，搅匀。加25g注射用活性炭搅拌30min，灭菌滤器相滤脱炭，用0.45μm微孔滤膜过滤，最后用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液检测合格后，灌装于7ml灭菌西林瓶内(5ml/瓶)，冷冻真空干燥，真空压塞，出箱，轧盖。使每瓶相当于37.5mg阿托西班。
由本实施例制得阿托西班冻干粉针剂(含阿托西班37.5mg)1000瓶，通过稳定性加速试验与动物血管刺激性、肌肉刺激性、溶血及过敏性实验，对其稳定性及临床用药安全性进行了考察。
稳定性加速试验：
分别将上市的一批供试品和按市售包装的一批样品放入温度为40±2℃、相对湿度为75％±5％的恒温恒湿箱中进行考察，分别在 0、1、2、3和6个月时取样测定，结果见表14-1和表14-2。
表14-1  上市对照品加速试验结果
Figure BSA00000353949800081
表14-2  自制样品加速试验结果
Figure BSA00000353949800082
通过表14-1和表14-2可以看出，经加速试验考察6个月，本发明制备的阿托西班冻干粉针剂与已上市的阿托西班注射液比较，外观色泽、酸度、溶液澄清度没有明显变化，而已上市的供试品的杂质增加、含量下降，表明本发明制备的阿托西班冻干粉针剂可于室温下保存，稳定性增加。
血管刺激性、肌肉刺激性、溶血及过敏性实验：
血管刺激性：
选取双耳无损伤的健康家兔6只，左侧耳缘静脉注射实施例14溶液1ml，右耳注射等容量5％葡萄糖溶液，每天1次，连续注射7天。
注射期间，每天定时观察耳缘静脉的刺激性反应。第8天处死家兔，取双侧耳缘静脉及周围组织，用甲醛固定，在距注射部位分别为110、215、315cm的近心端作常规组织切片，光镜下观察有无病理变化。观察指标及判断标准见表14-3。
表14-3  血管刺激性评分及判断标准
Figure BSA00000353949800091
结果显示，家兔耳缘静脉注射实施例14溶液的刺激性，与5％葡萄糖溶液比较无明显差异。肉眼观察，未见血管充血、周围组织水肿等炎症反应。组织切片检查，未见血管结构异常、内皮损伤、血栓形成及其它病理变化。其肉眼和光镜观察的血管、周围组织的累计得分均小于0.5，表明无刺激性。
肌肉刺激性：
取健康家兔6只，每只家兔左侧股四头肌内注射实施例14溶液1ml，右侧注射同体积生理盐水。注射后观察注射部位肌肉有无充血、水肿等反应，半数动物48h后(第3天)放血处死，纵向切开皮肤，肉眼观察两侧注射部位有无充血、水肿等反应，并取其组织做病理检查。然后按表14-4中的标准评价该药的刺激反应。余下动物继续观察14d，于第18天放血处死后重复上述操作，评价标准见表14-4。
表14-4  肌肉刺激反应评价标准
Figure BSA00000353949800101
结果表明，家兔左侧股四头肌内注射实施例14溶液后，肉眼观察注射部位肌肉无充血、水肿等反应，病理组织检查亦未见组织变性或坏死等明显性刺激反应，与生理盐水侧相比无显著差异。
对豚鼠的致敏作用：
选取健康豚鼠6只，每只腹腔注射实施例14溶液0.5ml，隔日注射1次，共注射3次。然后随机分为2组，分别在第1次给药后14或21天，静注实施例14溶液1ml。观察豚鼠有无兴奋不安、呼吸困难等过敏症状。
结果两组豚鼠均活动正常，未见呼吸异常等。
体外溶血性试验：
制备2％家兔红细胞悬液。取试管7支，按表14-5加入各种液体。将各试管轻轻摇匀，置37℃恒温水浴中孵育，观察0.5、1、2、3、6小时的结果。红细胞体外凝集与溶血的判断标准见表14-6。
表14-5  阿托西班溶液体外溶血试验加样表
表14-6  红细胞体外溶血与凝集试验判断标准
Figure BSA00000353949800111
结果，蒸馏水对照管在0.5小时完全溶血。生理盐水和各阿托西班溶液在6小时内均无溶血现象。轻轻振摇，生理盐水和各浓度阿托西班溶液管底沉积的红细胞均能完全分散，表明阿托西班溶液无红细胞凝集反应。
血管刺激性、肌肉刺激性、体外溶血性及过敏性实验表明，实施例14溶液无明显的刺激性、过敏性，也不会引起溶血反应。表明本发明制备的阿托西班冻干粉针剂安全性好，可供临床静脉注射与肌肉注射应用。
实施例15：制备阿托西班冻干粉针剂
7.5mg/ml阿托西班，3％w/v乳糖，用1mol/L盐酸调节pH为4.5，其制备工艺如下：
在无菌条件下，称取阿托西班37.5g，以及乳糖150g，置于灭菌容器中，加处方量80％注射用水，搅拌使溶解，用冰醋酸调pH至4.5，加注射用水至5000ml，搅匀。加25g注射用活性炭搅拌30min，灭菌滤器粗滤脱炭，用0.45μm微孔滤膜过滤，最后用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液检测合格后，灌装于7ml灭菌西林瓶内(5ml/瓶)，冷冻真空 干燥，真空压塞，出箱，轧盖。使每瓶相当于37.5mg阿托西班。
由本实施例制得阿托西班冻干粉针剂(含阿托西班37.5mg)1000瓶，通过稳定性加速试验与动物血管刺激性、肌肉刺激性、溶血及过敏性实验，对其稳定性及临床用药安全性进行了考察。
稳定性加速试验：
分别将上市的一批供试品和按市售包装的一批样品放入温度为40±2℃、相对湿度为75％±5％的恒温恒湿箱中进行考察，分别在0、1、2、3和6个月时取样测定，结果见表15-1和表15-2。
表15-1  上市对照品加速试验结果
表15-2  自制样品加速试验结果
Figure BSA00000353949800122
通过表15-1和表15-2可以看出，经加速试验考察6个月，本发明制备的阿托西班冻干粉针剂与已上市的阿托西班注射液比较，外观色泽、酸度、溶液澄清度没有明显变化，而已上市的供试品的杂质增加、含量下降，表明本发明制备的阿托西班冻干粉针剂可于室温下保存，稳定性增加。
血管刺激性、肌肉刺激性、溶血及过敏性实验：
血管刺激性：
选取双耳无损伤的健康家兔6只，左侧耳缘静脉注射实施例15溶液1ml，右耳注射等容量5％葡萄糖溶液，每天1次，连续注射7天。
注射期间，每天定时观察耳缘静脉的刺激性反应。第8天处死家兔，取双侧耳缘静脉及周围组织，用甲醛固定，在距注射部位分别为110、215、315cm的近心端作常规组织切片，光镜下观察有无病理变化。观察指标及判断标准见表15-3。
表15-3  血管刺激性评分及判断标准
Figure BSA00000353949800131
结果显示，家兔耳缘静脉注射实施例15溶液的刺激性，与5％葡萄糖溶液比较无明显差异。肉眼观察，未见血管充血、周围组织水肿等炎症反应。组织切片检查，未见血管结构异常、内皮损伤、血栓形成及其它病理变化。其肉眼和光镜观察的血管、周围组织的累计得分均小于0.5，表明无刺激性。
肌肉刺激性：
取健康家兔6只，每只家兔左侧股四头肌内注射实施例15溶液1ml，右侧注射同体积生理盐水。注射后观察注射部位肌肉有无充血、水肿等反应，半数动物48h后(第3天)放血处死，纵向切开皮肤，肉眼观察两侧注射部位有无充血、水肿等反应，并取其组织做病理检查。然后按表15-4中的标准评价该药的刺激反应。余下动物继续观察14d，于第18天放血处死后重复上述操作，评价标准见表15-4。
表15-4  肌肉刺激反应评价标准
Figure BSA00000353949800141
结果表明，家兔左侧股四头肌内注射实施例15溶液后，肉眼观察注射部位肌肉无充血、水肿等反应，病理组织检查亦未见组织变性或坏死等明显性刺激反应，与生理盐水侧相比无显著差异。
对豚鼠的致敏作用：
选取健康豚鼠6只，每只腹腔注射实施例15溶液0.5ml，隔日注射1次，共注射3次。然后随机分为2组，分别在第1次给药后14或21天，静注实施例15溶液1ml。观察豚鼠有无兴奋不安、呼吸困难等过敏症状。
结果两组豚鼠均活动正常，未见呼吸异常等。
体外溶血性试验：
制备2％家兔红细胞悬液。取试管7支，按表15-5加入各种液体。将各试管轻轻摇匀，置37℃恒温水浴中孵育，观察0.5、1、2、3、6小时的结果。红细胞体外凝集与溶血的判断标准见表15-6。
表15-5  阿托西班溶液体外溶血试验加样表
Figure BSA00000353949800142
表15-6  红细胞体外溶血与凝集试验判断标准
Figure BSA00000353949800151
结果，蒸馏水对照管在0.5小时完全溶血。生理盐水和各阿托西班溶液在6小时内均无溶血现象。轻轻振摇，生理盐水和各浓度阿托西班溶液管底沉积的红细胞均能完全分散，表明阿托西班溶液无红细胞凝集反应。
血管刺激性、肌肉刺激性、体外溶血性及过敏性实验表明，实施例15溶液无明显的刺激性、过敏性，也不会引起溶血反应。表明本发明制备的阿托西班冻干粉针剂安全性好，可供临床静脉注射与肌肉注射应用。

Claims (10)

1.一种固相合成阿托西班的方法，包括以下步骤：
1)以氨基树脂为载体，脱保护；
2)将Fmoc-Gly-OH的羧基与树脂的氨基相连，得到Fmoc-Gly-氨基树脂；
3)依次固相合成序列剩余保护氨基酸；
4)脱掉半胱氨酸和巯基丙酸的侧链保护基；
5)用碘进行固相环化；
6)切割，得到阿托西班粗肽；
7)精制，得到阿托西班纯品。
2.权利要求1所述的方法，其氨基树脂为Rink Amide MBHA树脂，树脂替代度为0.8～1.2mmol/g；其保护氨基酸分别是Fmoc-Gly，Fmoc-Orn(Boc)，Fmoc-Pro，Fmoc-Cys(Trt)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Ile，Fmoc-D-Tyr(Et)，Mpa(Trt)-OH；其缩合试剂为TBTU/HOBt/DIEA；其保护氨基酸以及缩合试剂的投料量是2～5倍当量。
3.权利要求1所述的方法，其接氨基酸过程中的每一步都经Kaiser Test，颜色呈阴性则依次接保护氨基酸。
4.权利要求1所述的方法，其脱除半胱氨酸和巯基内酸的侧链保护基的试剂是1％TFA/DCM。
5.权利要求1所述的方法，其环化试剂是I2，溶剂为DMF。
6.权利要求1所述的方法，其裂解试剂是按TFA∶EDT∶water＝95∶2.5∶2.5的体积比配制而成。
7.权利要求1所述的方法，其阿托西班纯品是粗肽经反相高效液相色谱法分离纯化而得，其色谱条件为：
色谱柱：Φ15cm
色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶(C18)10μm
上样量：≤30g目的肽/次
检测波长：230nm
流速：400ml/min
流动相：A：0.3％醋酸水溶液；B：乙腈
色谱条件：梯度程序见下表。 
Figure FSA00000353949700021
8.一种阿托西班冻干粉针剂，其特征在于所述制剂由主药阿托西班、赋形剂、pH调节剂与注射用水组成；其主药阿托西班的浓度优选0.1-75mg/ml。
9.权利要求8所述制剂，其赋形剂选自甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、氯化钠、山梨醇；优选1-10％w/v甘露醇和1-10％w/v乳糖。
10.权利要求8所述制剂，其pH值调节剂选自盐酸、冰醋酸、硫酸、乳酸、苹果酸、枸橼酸、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠等，调节pH为3.0至6.5之间；优选用1mol/L盐酸调pH为3.5-5.5。 
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