CN109045281B - 一种含精制蜂毒肽的组合物及其制备方法和制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蜂毒肽制剂，具体地说是一种蜂毒肽腔内涂液，其含有提纯后的蜂毒肽和生物可相容聚合物。本发明还提供了新的蜂毒肽的提纯方法，该方法提纯的蜂毒肽纯度高，起效快，过敏发生率低且稳定易储存。本发明还提供了蜂毒肽的新的治疗子宫内膜症的用途和新的制药用途。

Description

一种含精制蜂毒肽的组合物及其制备方法和制药用途

技术领域

本发明属于医药领域，是一种蜂毒肽组合物，具体地说是一种精制蜂毒肽的腔内(腹腔，关节腔，心包腔，胸腔，子宫腔等)用制剂，所述精制蜂毒肽中含有高纯度的蜂毒肽。本发明还涉及该精制蜂毒肽的提纯精制方法和蜂毒肽的新制药用途。

背景技术

蜜蜂毒(Bee Venom)简称蜂毒，是由工蜂毒腺产生后贮存于毒囊中，当蜜蜂受刺激时从螯针排出的一种毒液。蜂毒是一种成分复杂的混合物，主要包括多肽类、酶类、生物胺等功能性物质，多肽类物质是蜂毒的主要成分，约占干蜂毒的75％，包括蜂毒肽、蜂毒明肽、MCD-肽、心脏肽、赛卡晶、托肽品、蜂毒肽F和安度拉平等。蜂毒是一种透明的液体，具有特殊的芳香气味，味苦，呈酸性反应，pH值为5.0～5.5。比重为1.3，在常温下很快挥发。蜂毒极易溶于水，不溶于酒精。干燥蜂毒稳定性强，在严密封闭和干燥的条件下，作用能保持几年之久。而蜂毒溶液不稳定，容易污染杂菌和变质，在常温下通常只能保存几天。由于主要成分为肽类，蜂毒可被消化酶类和氧化物所破坏，在胃肠消化酶作用下，很快失去活性。

在我国，有关蜂毒医疗应用已有数千年的历史，近年关于蜂毒肽基础研究也十分活跃。蜂毒肽是蜂毒的主要成分，约占干蜂毒的50％。蜂毒肽包括蜂毒肽I和蜂毒肽Ⅱ。蜂毒肽I由25个氨基酸组成，蜂毒肽Ⅱ由27个氨基酸组成。蜂毒明肽是蜂毒中另一种主要多肽，约占蜂毒含量的2％，由18个氨基酸构成。MCD-肽是蜂毒中第三个主要多肽物质，由22个氨基酸组成，占蜂毒含量的3％。MCD-肽能使动物肥大细胞脱颗粒，释放组织胺和5—羟色胺，具有消炎作用。心脏肽具有保护心血管作用、有抗心律失常作用，由11个氨基酸组成。安度拉平具有很强的镇痛和抗炎作用，由105个氨基酸组成。我国蜂毒资源丰富，现代关于蜂毒的基础和临床研究也相当活跃。

因此，本发明要解决的技术问题之一，是开发一种不易过敏、稳定性好、易于储存和使用的蜂毒制剂。其含有精制后的蜂毒，蜂毒肽含量高，因杂质含量低而不易引起过敏，因为蜂毒肽纯度较高而易于储藏和使用。

本发明发明人还意想不到地发现了经过本发明精制方法精制后的含有较高纯度蜂毒肽的精制蜂毒，除了具有消炎止痛、抗病毒作用之外，还具有雌激素样作用，并且对子宫内膜异位症和子宫痉挛有治疗作用。

子宫内膜异位症(endometriosis)是指有活性的内膜细胞种植在子宫内膜以外的位置而形成的一种女性常见妇科疾病。内膜细胞本该生长在子宫腔内，但由于子宫腔通过输卵管与盆腔相通，因此使得内膜细胞可经由输卵管进入盆腔异位生长。

子宫内膜异位症患者常伴有不孕。在子宫内膜异位症患者中，不孕率40％～50％。可能是因为子宫内膜异位症常可引起输卵管周围粘连影响卵母细胞捡拾；也可能异位子宫内膜机能紊乱，卵巢病变影响排卵。所以经常伴有月经异常和痛经。

目前对于子宫内膜异位症的治疗方法，无论是药物疗法还是手术方法，都以抑制甚至消除卵巢功能为机制，并且疗法漫长且复杂。这些疗法对患者心理上产生巨大压力，并且治疗后易复发，进一步造成患者生理上的痛苦。

本发明人通过研究后意外发现，经过特殊步骤提纯精制的含有较高纯度蜂毒肽的蜂毒对于子宫内膜异位症具有优异的治疗效果，且在制成特殊形态的腔内涂敷液之后，只需要对腹腔进行涂抹，即可使子宫内膜萎缩，达到对子宫内膜异位症的治疗效果。该方法治疗效果优异且显效快速，且复发率小，同时纠正了病人的内分泌紊乱。

本发明人还发现经过特殊步骤提纯精制的含有高纯度蜂毒肽的蜂毒对于子宫肌肉痉挛具有缓解效果，和对子宫内膜异位症的治疗效果相似，本发明人发现上述治疗效果的机理在于精制蜂毒肽所具有的抗雌激素样效果。

发明内容

本发明提供了一种蜂毒肽的腔内制剂，在本发明的制剂中，该制剂中含有活性成分为精制后的蜂毒肽，此外还含有生物可相容性聚合物作为基质。

在本发明的上述制剂中，精制蜂毒肽中含有高纯度的蜂毒肽，生物可相容性聚合物基质为泊洛沙姆。

本发明中的蜂毒指的是蜜蜂受刺激时从螯针排出的一种毒液，所述蜜蜂为所有蜜蜂科昆虫，优选为意大利工蜂。所述刺激为所有通过气味、激素、场力、温度、电击等使蜜蜂受到外界刺激的行为，优选为使用电击。

本发明所使用泊洛沙姆可为所有市售类泊洛沙姆，优选泊洛沙姆P450。

本发明中，采用葡聚糖凝胶色谱柱来提纯蜂毒，所述提纯方法为G50柱结合G20柱和G10柱先后多次采用缓冲液提纯。

本发明的提纯精制方法中，最后得到的精品蜂毒肽纯度为≧45.3％。

蜂毒的获取

在适宜时段采取蜜蜂蜂毒。通过给与蜜蜂刺激，获取蜂毒。

蜂毒的获取可以选择温感适宜的季节、气候条件较好时进行，取毒人员通过使用金属网、玻璃板以及通过给予蜜蜂一定的刺激，特别是电击来获取蜂毒。

也可以通过直接购买市售蜂毒来获取蜂毒。市售的蜂毒产品一般是提取的蜂毒经过初步水溶过滤并冷冻干燥后的产品。

蜂毒肽的提纯和精制

步骤1)：将采集或者购买的粗蜂毒溶于水，去除水不溶性杂质；再加入乙醇进行沉淀，去除沉淀；向所得溶液中加入正丁醇进行萃取，并收集下层水相；向水相中加入乙醇进行二次沉淀，去除沉淀，得到粗蜂毒水溶液；

步骤2)：将粗蜂毒水溶液溶于甲酸缓冲液A(即0.01mol的pH值为3-4的甲酸铵-甲酸平衡缓冲液)中，用HPLC葡聚糖凝胶G50柱色谱分离，收集获得组分A；

步骤3)：组分A溶于甲酸缓冲液B(即0.01mol的pH值为4-5的甲酸铵-甲酸平衡缓冲液)中，并进行葡聚糖凝胶G20柱色谱分离，HPLC监控，收集获得组分B；以及

步骤4)：组分B用葡聚糖凝胶G10去盐，超滤，滤过液冷冻干燥得精制蜂毒肽后低温干燥保存，该精制蜂毒肽中所含蜂毒肽含量可达45.3％。

蜂毒肽制剂的配制

将提纯精制后的精制蜂毒，在-4℃至+4℃之间，优选0℃的环境下，加纯水配制成0.03mg％-2.0mg％的水溶液。

将市购的泊洛沙姆，在同样的温度条件下，加纯水配制成4.5％-29％(w/w)的水溶液。

将精制蜂毒水溶液和泊洛沙姆水溶液按照各种比例混合，配制成适宜腹腔涂抹的涂敷液制剂。

配制过程以注射剂标准配制。

本发明精制蜂毒中蜂毒肽的含量分析测定

1.标准曲线的制备:精密称取干操的蜂毒肽对照品2mg,(购自中检所，批号130584-2010012)，置于10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度、摇匀,在280nm处测吸光度,以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

2.样品测定:取葡聚糖凝胶G10中的流出液,定量稀释至0.6mg-lmg/mL,按前述方法测吸光度,根据标准曲线计算样品含量。

测定结果表明样品蜂毒肽含量至少为45.3％。申请人测试了六个批次，测试结果如表1。

表1：六批蜂毒原料纯化所得蜂毒肽纯度紫外检测结果

采用本发明的精制蜂毒肽的腹腔涂抹液在用于家兔子宫时，均显示了对于子宫内膜增长的抑制作用和子宫肌肉收缩的抑制作用，并且未产生过敏反应和其他不良反应。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明精制蜂毒肽的提纯精制过程图。

图2为本发明精制蜂毒肽在提纯精制过程中的首次HPLC流出图。

图3本发明精制蜂毒肽在提纯精制过程中的第二次HPLC流出图。

图4为使用了本发明精制蜂毒肽涂敷液的家兔子宫内膜图，其增长受到明显抑制。

图5为未使用本发明精制蜂毒肽涂敷液的家兔子宫内膜图，其增长未受到抑制。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述：

实施例1：市售购买蜂毒的获得

可于北京金林保健品公司杨蜂场处购得，其由意大利蜜蜂(Apis mellifera)的工蜂鳌针排出毒液，经取毒器收集，并经蒸馏水溶解过滤出去蜜蜂鳌针等不溶物之后，冷冻干燥成粉末状。

实施例2：从粗蜂毒中提纯精制蜂毒肽

材料的准备：葡聚糖凝胶G50、葡聚糖凝胶G20、葡聚糖凝胶G10：购自瑞典Pharmica公司；安捷伦1200HPLC；803GN超滤器、500M超滤膜：购自美国Merk Milipore公司。

准备试剂：乙醇、正丁醇、纯水、粗蜂毒(按照实施例1获得)

甲酸缓冲液的配制：配制甲酸缓冲液A(0.01mol/l，pH值为3-4的甲酸铵-甲酸缓冲液)；甲酸缓冲液B(0.01mol/l，pH值为4-5的甲酸铵-甲酸缓冲液)。

纯化精制步骤：

步骤1)：

取粗蜂毒溶于10-20倍(m/V)水中，待去除不溶性杂质后，再向溶液中加入0.5-2倍(V/V)95％乙醇沉淀。再去除沉淀,向去除了沉淀的溶液加入1-4倍(V/V)正丁醇萃取，收集下层水液。向收集的下层水液中再加入0.5-2倍(V/V)95％乙醇进行二次沉淀，去除沉淀后，所得的水溶液为粗蜂毒水溶液；

步骤2)：

步骤1得到的粗蜂毒溶于甲酸缓冲液A(0.0lmol/L、pH＝3-4的甲酸铵-甲酸平衡缓冲液)中，葡聚糖凝胶G50预先用上述甲酸缓冲液A浸泡平衡后装柱。粗蜂毒甲酸缓冲液A溶液湿法装柱，先用甲酸缓冲液A进行梯度洗脱。洗脱流速为15ml/h。洗脱液用部分收集器收集,得到洗脱液A(特定组分A)。在检测波长280nm下,洗脱液A(特定组分A)用紫外检测仪和记录仪连续记录获得四个主要吸收峰。HPLC表明:洗脱液A(特定组分A)在42min、32min、22min和12min处有4个主要色谱峰,积分面积百分比分别为积分面积百分比分别为46.12％、6.41％、6.51％和30.00％(液相图如图2)。洗脱液A(特定组分A)的4个蜂毒肽峰的积分面积百分比之和为89.04％。

步骤3)：

葡聚糖凝胶G20用甲酸缓冲液B浸泡平衡后装柱。将步骤2中所得洗脱液A(特定组分A)适当浓缩后以湿法装柱，用甲酸缓冲液B洗脱。所得洗脱液B(特定组分B)用紫外检测仪和记录仪连续记录获得二个吸收峰。HPLC表明:洗脱液B(特定组分B)处有4个主要色谱峰37min、32min、17min和14min,积分面积百分比分别为86.18％、8.45％、2.71％和1.85％(液相图如图2)。洗脱液B(特定组分B)的4个蜂毒肽峰的积分面积百分比之和为97.83％。

步骤4)：

步骤3所得洗脱液B(特定组分B)适当浓缩后湿法装柱葡聚糖凝胶G10，用纯水洗脱，去除前述操作步骤中所带入的小分子缓冲盐等，去盐之后得到的产物采用803GN超滤器和500M超滤膜进行超滤，滤过液冷冻干燥后得精制蜂毒肽。

将所得精制蜂毒肽在低温干燥密闭环境下贮藏，备用。

实施例3：UV检测对比：

材料和条件：

UV-2000分光光度计：上海分析器厂；对照品：从中检所购买的蜂毒肽，批号130584-2010012；检测波长：280nm。

制备标准曲线：

精密称取干燥的蜂毒肽对照品2mg，置于10mL容量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，分别取其中1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml对照品溶液，再分别用水定容至5ml容量瓶中，摇匀后，在280nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标回执标准曲线。

样品测定：精密称取精制的蜂毒肽定量稀释至0.6-1mg/ml，在280nm处测定吸光度，根据标准曲线计算样品含量，所得结果参见表1。

实施例4：本发明精制蜂毒肽腹腔涂敷液的制备

具体制备方法：

将实施例2中提纯精制后的精制蜂毒肽，在-4℃-4℃的操作温度下，加纯水配制成0.03-2.0mg/ml的水溶液。

将市购的各类泊洛沙姆，在表2的配比和温度下，加纯水配制成4.5％-29％(w/w)的水溶液。

将精制蜂毒水溶液和泊洛沙姆水溶液按照比例混合，配制成适宜腹腔涂抹的涂敷液制剂。

表2：蜂毒肽腹腔涂敷液的配比

实施例5：生物学测试：蜂毒肽涂敷剂对雌小鼠子宫肌收缩的抑制作用试验试验动物：

昆明种小鼠，50只，雌性，18-22周，体重180-220克。

药品和试剂：

实施例4中制备得到的蜂毒肽涂敷剂(制剂1)

试验内容：

50只小鼠按照每组10只分成5组，分别为1个空白对照组、一个阳性对照组和3个给药组。5组小鼠的给药方案分别如下：

A组(空白对照组)：每只小鼠按照0.1mg/10g小鼠体的剂量以腹腔注射的给药途径给予蒸馏水。给药频率为一天1次，连续给药3天。

B组(阳性对照组)：每只小鼠按照2.5mg/10g小鼠体重的剂量以腹腔注射的给药途径给予消炎痛。给药频率为一天1次，连续给药3天。

C组(单倍成人剂量给药组)：每只小鼠按照成人剂量(即0.1mg/10g体重)以阴道给予本发明实施例4的精制蜂毒涂敷液，给药频率为一天1次，连续给药3天。

D组(双倍成人剂量给药组)：每只小鼠按照双倍成人剂量(即0.2mg/10g体重)以阴道给予本发明实施例4的精制蜂毒涂敷液，给药频率为一天1次，连续给药3天。

E组(三倍成人剂量给药组)：每只小鼠按照三倍成人剂量(即0.3mg/10g体重)以阴道给予本发明实施例4的精制蜂毒涂敷液，给药频率为一天1次，连续给药3天。

5组中的每只小鼠同时以0.2mg/只的剂量皮下给予己烯雌酚，持续给药3天。

在第三天，在各组完成给药后，向所有小鼠静脉给予催产素0.2u/只，观察并记录此后30分钟内小鼠的扭动次数，按以下公式计算扭动发生率。

扭动发生率(％)＝(每组发生扭动的动物数/每组动物数)×100％

观察结果：

扭动次数和扭动发生率：E组极显著低于A组(p<0.01)；C组显著低于A组(p<0.05)；E组显著低于B组(p<0.05)。

结论：

实施例4的蜂毒肽腹腔涂敷液有明显拮抗催產素引起的小鼠子宫痛性痉挛收缩的效果，并且该效果和剂量有关。

实施例6：生物学测试：蜂毒肽涂敷液对兔子宫内膜的作用

药品和试剂：

实施例4中制备得到的蜂毒肽涂敷剂(制剂4)

试验动物：

健康非孕雌兔三只，体重1500-1800克

试验内容：

三只雌兔分为A、B、C三只，依照下表给予药物和实际

表3：雌兔给药方案

根据表2给药，给药结束后再经过24小时之后处死动物，取子宫内膜和腹膜，标号，保存在福尔马林中待观察。

结果：

实施例4的蜂毒肽涂敷液的兔子宫内膜明显变薄(图4)，显示出明显的去雌激素化效果。没有使用蜂毒肽涂敷液的兔子宫内膜没有明显变化(图5)

使用了和未使用实施例4的蜂毒肽涂敷液的子宫内膜图参见图4和图5。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种精制蜂毒肽组合物在制备治疗子宫内膜异位症的药物中的用途，其中所述精制蜂毒肽组合物由精制蜂毒肽、生物可相容性聚合物溶液制备而成；其中所述的精制蜂毒肽中含有的蜂毒肽至少为45.3％(以重量百分比计)，并以如下方法制备获得：

步骤1)：将市售购买或者人工自采的粗蜂毒溶于水，去除不溶性杂质后向溶液中加入乙醇进行沉淀，去除沉淀,再向溶液加入正丁醇萃取，收集下层水液，再向下层水液中加入乙醇进行二次沉淀，再次去除沉淀后得粗蜂毒水溶液；

步骤2)：将粗蜂毒水溶液溶于甲酸缓冲液A中，并进行葡聚糖凝胶G50柱色谱分离，HPLC监控，收集分离所得特定组分A；

步骤3)：将组分A溶于甲酸缓冲液B中，并进行葡聚糖凝胶G20柱色谱分离，HPLC监控，收集分离所得特定组分B；以及

步骤4)：将组分B用葡聚糖凝胶G10去盐，超滤，滤过液进行冷冻干燥后得精制蜂毒肽并低温干燥密闭保存；

上述步骤中的甲酸缓冲液A是：0.01mol/l的pH为3-4的甲酸铵-甲酸平衡缓冲液，甲酸缓冲液B是：0.01mol/l的pH为4-5的甲酸铵-甲酸平衡缓冲液。

2.根据 权利要求1的精制蜂毒肽组合物的用途，其中的生物可相容性聚合物是溶液浓度为4.5-29％的泊洛沙姆，其中的组合物可含有其他药物 辅料或药物赋形剂。

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