JPS6039647B2 - ガンマ−ｌ−グルタミル−タウリンの単離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の基本となる特許出願（特顔昭４７−７７９８９
）は上皮小体から抽出可能であり、我々がリトラロンと
呼んだ、現在に至るまで未知の濃縮物または混合物の製
剤に関する。

本製剤は非常に価値ある生物学的性質を有する（参照：
ドイツ国出願、ＤＯＳ ＮＯ．２２３４８３２）。上記
発明をさらに発展させたものとして、我々はリトラロン
と名付けた濃縮物の活性成分が今日に至るまで未知であ
ったミクロベフ。

チドのガンマ−Ｌーグルタミル−夕ウリンであることを
発見した。本発明は特顔昭４７−７７９８９に係わる特
許出願で保護した方法をさらに発展させたもので、上皮
４・体抽出物からこの新規な活性成分を純粋に分離する
方法に関する。

侍厭昭４７−７７９８９によれば、０甫乳動物の上皮小
体またはその組織培養もしくは細胞培養を有利には粉末
状態で水でもしくは無機イオン含有水溶液で抽出し、つ
いでこの炉過抽出物を蛋白質沈殿剤で処理し、この沈殿
をゲル炉過し、このようにして得られた濃縮物を使用す
ることにあった。

本発明によれば、この濃縮物から分光光度計による検出
により第２のピーク（分画Ｂ）を選択し、これをイオン
交換力ラムクロマトグラフィにより精製し、これにより
得られた濃縮物は高電圧を使用した約１．８のｐＨ値に
適切に調整した亀気泳動にかけられる。最後にクロマト
グラフィ方法によりこの化学的に純粋な物質が単離され
る。イオン交換カラムクロマトグラフィはＤｏｗｅｘ５
０（ＤｏｗＣｈｅｍ．、ＵＳＡ）のタイプの樹脂、また
は他の適当な樹脂を用いて有利に遂行される。

本発明によって応用した蚤気泳動の過程ではガンマ−Ｌ
−グルタミル−タウリンは陽極方向に移動する。

本発明の最終単離工程であるクロマトグラフィ分離は便
宜上、ペーパークロマトグラフィ法、またはセルローズ
・力ラムクロマトグラフィ法によって行なわれる。

単離を必要とするアミノ酸誘導体の検出はこの段階でニ
ンヒドリンによって都合よく行なわれる。このようにし
て、純粋な活性成分は乾燥上皮小体粉末に対し１０〜１
００００■者の濃度で得られる。主としてこの精製のい
ずれの分画も治療目的に応用することができる。この純
粋生成物の元素分析および分子量は実験式Ｃ７日，４Ｎ
２０６Ｓおよび次に示す元素組成と非常に良く一致する
：Ｃ＝３３．０７％ Ｈ＝５．５５％ Ｎ＝１１．０２％ ○＝３７．７５％ Ｓ＝１２．６１％ 分子量＝２５４．２７ 次の構造に関するバンド特性値は赤外吸収法（ＫＢｒ錠
剤）で指定される：ひ（〇Ｈ）、し（ＮＨ３十）：３６
００−２４００Ｃの一１レ（ＮＨ）ニ３３Ｉ５肌‐１〃
（ＣＯ）カルボキシル基から 化学結合の振動＝１７５８ｃｍ‐１ レ（ＣＯ）アミドカルボニル（１）＝１６６２ｃｍ‐１
６（Ｎ＆十）＝１５７触れ‐１レ（Ｓ。

３‐）ニＩ２９６〜Ｉ。

３Ｉ仇‐１ガンマ−Ｌ−グルタミル−夕ウリンのＮＭＲ
値： ・化学シフトは次のとおり：４．１５（ｔ、１、
℃Ｈ）、３．１２（ｍ、２、ＩＣＨ）、３．６５（ｍ、
２、で−）、２．７〜２．１（ｍ、４、３ＣＨ２、およ
び℃仏）。

本化合物は結晶学的データ（エチルアルコール−水混合
物、８０％／Ｖから結晶化）：基礎セルダィメンション
（ワィセンベルグの写真方法によって測定）：ａ＝６．
６３Ａ ｂ＝７．８７Ａ Ｃ＝７．８７△ ８二１０１０ この結晶は単斜晶系で、空間群Ｐ２，である。

○洩り定値：１．５５タ弧‐３Ｄ計算値：１．５５２タ
ｃ双‐３ ０ＫＯ中の系不在：ｋ＝か十１ 分解点：２２３〜２２６つ０（補正） 水鍵物中で加水分解後、グルタミン酸がァミ／酸分析計
で、タウリンが薄層クロマトグラフィ法でそれぞれ同定
される。

活性成分含有量の雌規模での測定は次の方法、アルカリ
メトリ−、スルホ基の測定、ニンヒドリン反応を基礎と
するバンスラィク法および光学的測定のひとつをとって
行なわれる。

より少量の測定には、光学密度測定をともなうクロマト
グラフィ的定量方法および露気泳動速度に基づく測定が
適当である。生物学的測定は後で論ずることにする。

上皮小体から単離した純粋生成物は製薬学的に十分に安
定である。

７０００で８日間、恒温槽内でこの物質を保温した後も
、分解の徴候は全く観察されなかった（融点、光学密度
、薄層クロマトグラフイ、ペーパー・クロマトグラフイ
）。

この単離活性成分は好気大生活圏的−遺伝学的−順応系
（ＡＣＡＳ）の侵害と直接に間接に関連ある病理学的変
化に対し、広範囲な治療効果と予防効果を有する。

（上皮４・体の発育と地球上の生活の発展とは生物進化
の過程で緊密に同時発生している。）ＡＧＡＳの観念を
明らかにするため、この系を形成する最も重要な組織お
よび器官を列挙しよう：‘ａ’生体および大生活圏とし
ての雰囲気の間の境界を形成する生物学的界面（皮膚と
他の皮膚構造、角膜と結膜、口と０困頭腔、気道と肺）
；【ｂ’骨格系と四肢（管状骨と海綿骨、球関節、滑液
膜、骨格筋組織）：【ｃ’地球上のイオン・バランスの
調節に関与する器官（経上皮移送系、腸織および啓小管
）：【ｄ｝ 固形食の非集成用に要した槽生歯（歯床と
一緒に、そして歯根によって固定）。

‘ｅ｝ 地上の聴力、膿覚および音形成器官。

本発明に従って製造した化合物は上記系の器官、乃至そ
の組織に対し、生物学的に適切な、乃至治療学的影響を
働かせる。上述のこととは別に、ＡＣＡＳ系との関連で
、次の機能もこの化合物の能力範囲に属する：放射線保
護効果、傷病回復促進効果、一般的間葉織活性効果、粘
膜および皮膚感染および汚染の増加した危険に対する保
護（湿った粘膜のリゾチーム生成、気道中の有毛上皮の
発育、等）：皮膚のウイルス性および病菌性感染に対す
る増加した保護。

地上生活の有効に増加した効果（例えば気象および激し
い一日の変化、傷害の増大した危険）に対して、この化
合物は糖・性皮膚性ステロイド群によってひきおこされ
た末梢組織損害の同時予防による、適応症候群の安定化
の方向に作用する（例えば結合、乃至骨床等の損害）。

免疫恒常性の発達（自己および非自己細胞の増加した認
識）。本発明に従って製造した化合物はその活性を、ビ
タミンＡ代謝の譲導を受け、より極性の性格のビタミン
Ａ代謝産物の生成により、部分的に直接行使する。

この活性は上皮小体ホルモンにより腎小管の２５−ヒド
ロキシーコレカルシフェロールー１ーアルフアーヒドロ
キシラーゼ酵素に行使した活性と同じである。この解明
により、この化合物の広範囲の、変異性の生化学的、薬
理学的および治療学的活性が理解できるであろう。風
ビタミンＡ形質の効果 【ａ｝ 薬理学的および生化学的効果： ラットの軟骨中に、乃至はヒナ胎児の眼水晶体中に、肝
および肺の組織中に標示した硫酸塩の結合増大効果：ラ
ットの軟骨中での標示隣結合増大効果；コンドロィチジ
ン硫酸促進効果の合成：ラットおよび犬におけるコルチ
ゾーン投与によりひきおこされた傷害回復乃至減少した
傷害回復の有利影響する効果；肥満細胞類粒減少増加効
果；ラットおよびニワトリにおける実験的ビタミン不足
症、乃至ビタミン過多症の場合のビタミンＡ相乗効果：
ラットにおけるストレス債湯綬天０効果：追跡性元素入
れ代り左右効果（シリコン、銅、亜鉛、マンガン、蟹石
）；上皮形成促進効果；アルカリ性燐酸酵素活性増大効
果：ビタミンＡの局在効果により誘導されたポケットの
形成に作用する効果；投与応答曲線乃至は高投与を用い
る前駆信号の変化の非常に平板な経過。

‘ｂ｝ 臨床治療効果： 乾性角結膜炎：ショーグレン症侯群；乾性鼻咽喉炎；オ
ッェーナ：慢性気管支炎；結合気管支炎；滋臓線維症：
小児肺病性向：歯周症；ウイルス性および病菌性歯原因
の伝染に対する皮膚および粘膜の増大した素因；手術傷
害および粘膜の負傷の場合における傷害回復の有利に鋤
らく効果；大腸ビラン（ｅｒｏｓｌｏｃｏｌｉ）：掻洋
症（ｐｍｒＭｓ ｐｒｏｕｐ）；味覚および喚覚の障害
。

‘Ｂ｝ ビタミンＡ形質不在の効果 【ａ’薬理学的および生化学的効果： 一過性血糖減少効果；燐酸尿増加、血清燐酸塩水準減少
効果；放射線保護効果；不活性動物の迷路テストでゴー
ルを探す時間が短縮される；実験的弗素沈着症およびカ
ドミウム中毒緩和効果：実験的エジプト豆中毒症状減少
効果；ヒスタミン鋭敏症減少効果；賢の環状アデノシン
ーモノ燐酸塩排出増大効果：肝チロジンーアミノートラ
ンスフアラーゼ酵素活性増大効果。

｛ｂー 臨床治療効果； 比較的緩和な照射障害；白斑：精神エネルギー化効果；
更年期老人状態およびムネスチック（ｍｎｅｓｔｉｃ）
機能有利影響効果：ケロイド素因：強直性脊椎炎；磨滅
原因の歩行器官症：硬性眼底；類殿粉症：斑状硬皮症；
繊維乳頭症。

本発明方法に従って製造したガンマ−Ｌ−グルタミルー
タウリンでの治療期間は非常に異なる。

化学的に純粋な活性物質５仏夕を１日に３回経口投与す
れば、患者の何人かは２週間後にはすでに症状が消失す
る（例えば乾性鼻咽喉炎の場合）、ある疾患の改善には
１〜２ケ月が必要である（例えば歯周炎、ショーグレン
症侯群）、一方他の疾患の場合には３〜６ケ月の治療期
間が必要である（例えば強直性脊椎症）。本発明に従っ
て得たガンマ−Ｌ−グルタミルータウリンからはこの活
性物質単独または他との組合せの形で予防薬、美容薬、
または獣医学的薬剤が容易に製造可能である。

この純粋な活性物質からのその服用量は５０〜５００ナ
ノグラム／体重である。１日の服用量：３回／日。

１銭は活性成分を２〜２０り夕、好ましくは１０仏タ含
有しており、生物学的に不活性の担体（例えばミルク糖
、デンプン）、または錠剤化する際の通常の助剤物質（
例えばＰＶＰ、ゼラチン、タルク、ステアリン酸マグネ
シウム、ェアロジル等）と混和される。

非常に少量の投与量を考慮に入れて、錠剤中で活性物質
の同等な分散を得るためには、額粒化する前に活性成分
を溶液の形で錠剤物質に混合し、ニーダー機により均一
な混合物を調製するのが得策である。非常に低い活性成
分含量は本薬剤を大きな実験室規模で調製することを可
能にする。この活性成分は安定であるから、短かし、効
能期間満了日を指定することなく市場化できる。デーポ
ー錠剤で、それぞれ特効化された （ｓｐａｎｓｕｌｅｄ）ものの活性成分含量は２０〜３
０１ミクログラムでなければならない。

注射用製剤の都合のよい投与量はアンプル当り活性成分
５〜１０ミクログラムである。

非経口適用は筋肉内、皮下、または静脈内に可能である
。活性成分は与えられた濃度で組織乃至細胞壁損傷活性
を有し、同様に浸出液の形で応用可能である。次の実施
例は本発明をさらに詳細に具体化するためのものであっ
て、これにより本発明を制限するものではない。実施例
１ 天然製品からガンマ−Ｌーグルタミルータウリンの製造
凍結乾燥し、粉砕した上皮小体粉末１０夕をアウルバッ
ハの方法により脱脂する：上皮小体粉末を無水アセトン
２５地と室温で充分に混合し、この懸濁物をガラスフィ
ルター（Ｇ４）で炉過する。

この炉過した上皮小体粉末を再び室温でクロロホルムと
充分に燭拝し、この懸濁物をガラスフィルター上でもう
１回炉遇する。この操作を繰返す。炉過物質を新らしい
アセトン２５Ｍに懸濁し、ガラスフィルター上で充分に
圧炉過する。得られた上皮小体粉末を室温下に真空乾燥
する。出発物質のグリース含有量により、７〜９夕の脱
脂した上皮４・体乾燥粉末が得られる。この脱脂した上
皮４・体乾燥粉末１０夕を３０００て蒸留水１００ｍ‘
で３回抽出する。

１回の抽出時間を１時間とする。

それぞれの抽出工程の間で、この上皮小体を水溶液から
高速度実験用遠心分離器て分離する。上燈液を窒素雰囲
気中で冷蔵庫内で３〜５℃の温度で次の工程まで保つ。

この水抽出物はニンヒドリン陽性、ビュウレット陽性お
よびトリクロロ酢酸陽性である。次の操作で、この水性
抽出物を一緒にし、５０％／Ｖトリクロロ酢酸水溶液を
最終のトリクロロ酢酸濃度が１５％になるように連続婿
拝しながら鷹加する。

沈殿のある水溶液を３〜５℃で２時間放置し、トリクロ
ロ酢酸を添加して生成した沈殿を遠心分離して除去する
。

この炉過溶液はトリクロロ酢酸を添加しても全然沈殿し
ない。過剰のトリクロロ酢酸を室温下に水性エーテルで
抽出を連続して行なって除去する。

トリクロロ酢酸を完全に除去するには、一般に１７〜１
８回の抽出を必要とする。時として２０〜２５回の抽出
が必要である。最終抽出後、ｐＨ値は４．５〜５でなけ
ればならない。水相のエーテル分をガラス・フィルター
・ポンプにより減圧下（窒素雰囲気、約１５〜２０側Ｈ
ｇ、３０００以下）に蒸発して除去する。

この操作は約６時間かかる。この工程では水も一部分蒸
発するので、このエーテル除去により容量の減少がおこ
る。エーテルの除去はにおいで確認する。

この水溶液を凍結乾燥し、この物質が吸湿性であるから
よく密封できる容器中で保存する。

脱脂前の上皮小体粉末の重量と比較して、収率は出発物
質のグリース含有量によるが約１０〜１５％である。こ
こで得られた凍結乾燥した物質はセフアデックスＧ−１
５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅ
ｎ；粒子径９０〜１２０ｋ）上で下降技法によるゲル炉
過にかけられる。

溶出ダイヤグラムは２８加川で測定した消滅によって決
定される。

この方法により、全部で７個のピーク（Ａ〜Ｇ）が得ら
れる。このゲル炉週の特性値は次のとおりである：試料
のはかり込み：蒸留水１０の‘に凍結乾燥物質５．１夕
を溶解。

カラム直径：４．８５伽 カラム高さ：１４９Ｃの 流速：０．７８の【／分 分画サイズ：７．８のと／試験管 ピークＢが活性成分を含む。

試験管１０４までの溶出液量は８１４Ｍである。ピーク
Ｂの全量は１８８ｍ‘である。分画Ｂは凍結乾燥される
。

この方法で出発物質約５夕を用いて０．４３〜０．５３
９が得られる。ゲル炉過の同定：与えられた環境下にゲ
ル炉週を遂行するとき、活性物質は（０．６７±０．６
２）×Ｖ。

の容量で熔出液中に現われる。Ｖ。は無機イオンが溶出
液中に現われる（塩化物反応陽性は硝酸銀で検出された
とき）ときの容量を意味する。この凍結乾燥Ｂピークは
ついでイオン交換クロマトグラフィにかけられる。

凍結乾燥ピークＢの３０１の９をｐＨ１．８の蟻酸−酢
酸の混合物（緩衝液の調製：氷酢酸８６泌および蟻酸２
５ｗ‘（８群容量％）を蒸留水で１０００の‘に稀釈す
る。）に溶液濃度が３０％になるように溶解する。つい
で力ラムクロマトグラフィのため、Ｄｏｗｅｘ樹脂５０
× ２（ＤｏｗＣｈｃｍｉｃａｌ、ＵＳＡ）充填の１３
２×１伽寸法のカラムに予めｐＨＩ．８の蟻酸−酢酸の
混合物を通して平衡状態にしたのち、上の溶液を通す。
流速：１３の‘／ｈｒ、分画サイズ：４の‘、この分画
は２８触れでの消滅値に基づいて検出される。このよう
にして、Ａから１までの９個の熔出ピークが得られる：
活性成分はピークＤ、ＥおよびＦに発見される。この３
個のピークの均一港出液を凍結乾燥し、物質７．９夕が
得られ、これは出発物質として供したゲル炉過ピークＢ
の２．６２％に相当する。イオン交換クロマトグラフィ
によって得られた凍結乾燥ピークはワットマンＭＭ紙、
２２ｃｍ中、州１．８および１５００Ｖ、９０分の紙電
気泳動にかけられる。活性成分はニンヒドリン陽性であ
り、出発線から陽極方向に均一に移動する。

露気泳動を終ったら、適当な移動速度のニンヒドリソ腸
性ストリップを切取り、新しいペーパー・クロマトグラ
フィ用紙上に、そのクロマトグラフィ展開方向が電気縁
動移動方向とは反対になるように縫い合せる。

室温下にｎーブチルアルコール：ピリジン：氷酢酸：水
＝１５：１０：３：１２の混合液中で６鼠時間にわたり
Ｔ舵奪ペーパー・クロマトグラフィを行なってさらに精
製する。ワットマン水仙ペーパーを使用する。この展開
条件における純粋化合物のＲｆ値は０．１９である。

ｐＨ値６．５でペーパー電気泳動したときのシスティン
酸の移動度に関連する上記化合物の相対移動度は０．７
４である。塩酸で加水分解後にこの生成物はグルタミン
酸とタウリンを含有する。この単離生成物は力ルボキシ
ベプチダーゼにより加水分解されない。Ｍ；２５４．２
７ 分析：Ｃ７日，４Ｎ２０６Ｓ 追加の関係 本発明は特許請求の範囲に記載したガンマ−Ｌーグルタ
ミルタウリンの単離方法である。

これに対して原発明たる特許第擬４２２６号｛袴公昭５
４−１６５６５号｝の発明は、幅乳動物の単離された上
皮づ・体（ｐａｒａｔｈＭｏｊｄｇｌａＭ）を乾燥し、
粉砕し、必要に応じ脱水し、また必要に応じ水で抽出し
、このようにして得られた溶液を凍結乾燥することを特
徴とする、新しいリトラロンホルモンを含むホルモン濃
縮物あるいは混合物の製造法。従って、本発明は原発明
の構成に欠くことができない事項の主要部をその構成に
欠くことができない事項の主要部としている発明であっ
て、上皮小体抽出物から新規活性成分を分離する方法を
目的とする点において、本発明は原発明と同一の目的を
達成するものであり、而して特許法第３１条第１項の規
定による追加の関係を有するものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 上皮小体（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｇｌａｎｄ）
   またはその組織培養もしくは細胞培養を有利には粉末形
   態において水または無機イオンを含有する水溶液で抽出
   し、この濾過抽出液から蛋白質を除き、凍結乾燥した後
   、この生成物を水に溶解し、この溶液をゲル濾過にかけ
   、分光光度計で検出して有利に選択した主成分を含有す
   る分画を凍結乾燥し、この凍結乾燥生成物を水に溶解し
   、得られた溶液をイオン交換カラムクロマトグラフイに
   より精製し、この主成分濃縮物を電気泳動にかけ、最後
   にクロマトグラフイ法によりガンマ−Ｌ−グルタミル−
   タウリンを単離することを特徴とする、ガンマ−Ｌ−グ
   ルタミル−タウリンの単離方法。