ES2964168T3 - Anticuerpo anti-interleucina 22 (IL-22) y usos del mismo - Google Patents

Anticuerpo anti-interleucina 22 (IL-22) y usos del mismo Download PDF

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Abstract

Se proporcionan nuevas moléculas de unión de origen humano, particularmente anticuerpos humanos así como fragmentos, derivados y variantes de los mismos que reconocen antígenos tales como proteínas endógenas nativas asociadas con la respuesta inmune, trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias, trastornos metabólicos, función vascular, enfermedades neurodegenerativas. o tumores. Más particularmente, se proporciona un autoinmunosoma humano y el correspondiente depósito de anticuerpo monoclonal. Además, se describen composiciones farmacéuticas, kits y métodos para su uso en diagnóstico y terapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo anti-interleucina 22 (IL-22) y usos del mismo
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales humanos nuevos, así como a fragmentos, derivados y variantes de los mismos que reconocen a la interleucina 22 (IL-22). Además, la presente invención se refiere a los anticuerpos para uso en inmunoterapia de trastornos autoinmunes y autoinflamatorios, así como neoplasias malignas. Más específicamente, la presente invención se refiere a autoanticuerpos monoclonales anti-IL-22 aislados de células B derivadas de sujetos afectados con una tolerancia central y/o periférica dañada o pérdida de auto-tolerancia típicamente debido a una mutación en un gen implicado en la regulación inmune.
Antecedentes de la invención
Las respuestas inadecuadas del sistema inmune pueden causar síntomas estresantes en el organismo involucrado. Las respuestas inmunes exageradas a sustancias desconocidas o estados físicos que normalmente no tienen un efecto significativo en la salud de un animal o de un humano pueden provocar alergias con síntomas que van desde reacciones leves, tal como irritaciones de la piel, hasta situaciones potencialmente mortales, tales como un shock anafiláctico o varios tipos de vasculitis. Las respuestas inmunes a los antígenos endógenos pueden causar trastornos autoinmunes tales como lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica autoinmune idiopática, anemia perniciosa, diabetes mellitus tipo 1, enfermedades cutáneas con ampollas y diferentes tipos de artritis.
Las respuestas inmunes ocurren de manera coordinada, involucran a varias células y requieren comunicación mediante moléculas de señalización como las citocinas entre las células involucradas. Esta comunicación puede verse influenciada o inhibida, por ejemplo, mediante la interceptación de las señales o el bloqueo de los respectivos receptores.
Las citocinas son proteínas, péptidos y glicoproteínas solubles secretadas que actúan como reguladores humorales en concentraciones de nanomolares a picomolares y se comportan como hormonas clásicas en el sentido de que actúan a nivel sistémico y que, ya sea bajo condiciones normales o patológicas, modulan las actividades funcionales de células y tejidos individuales. Las citocinas se diferencian de las hormonas en que no son producidas por células especializadas organizadas en glándulas especializadas, es decir, que no existe un único órgano o fuente celular para estos mediadores, ya que son expresados por prácticamente todas las células involucradas en la inmunidad innata y adaptativa, tal como células epiteliales, macrófagos, células dendríticas (CD), células asesinas naturales (NK) y especialmente por las células T, entre los que destacan los linfocitos T cooperadores (Th). En este momento, se han definido subclases de células T, Th1, Th2, Th17 e iTreg dependiendo del espectro específico de las citocinas expresadas y de las respectivas respuestas inmunológicas moduladas por ellas.
En este respecto, los principales productos de citocinas de las células Th1 son IFN-gamma, linfotoxina alfa e interleucina 2 (IL-2). Las células Th1 medían las respuestas inmunes contra patógenos intracelulares y son responsables de algunas enfermedades autoinmunes (Mosmann et al., Annu. Rev. Immunol. 7 (1989), 145-173; Paul and Seder, Cell 76 (1994), 241-251). Las células Th2 producen principalmente IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13, IL-25 y anfirregulina. Las células Th2 median las respuestas inmunes contra parásitos extracelulares y participan en la autoinmunidad y las alergias como asma, diabetes mellitus tipo 1, esclerosis múltiple (EM) y artritis reumatoide (AR); véase, por ejemplo, Mosmann et al. (1989) y Paul and Seder, (1994),supra.
Algunos linfocitos, como los subconjuntos de células T gamma delta y las células T asesinas naturales (NKT), producen citocinas Th1 y Th2. Los principales productos de las células reguladoras inducidas (iTreg) son IL-10, IL-35 y TGF-beta. Las células iTreg participan en la tolerancia inmune, la homeostasis de los linfocitos y la regulación de las respuestas inmunes.
Los principales productos de citocinas de las células Th17 son IL-17 e IL-22; Las células Th17 median las respuestas inmunes contra bacterias y hongos extracelulares y también participan en la mediación de la inflamación y en enfermedades autoinmunes como la psoriasis. Zhu and Paul, Blood 112 (2008), 1557-1569; Shevach, Immunity 25 (2006), 195-201). Este espectro de actividades fisiopatológicas de producción de citocinas tiene un estrecho paralelo con subconjuntos de células T gamma delta.
Dependiendo de sus respectivas funciones, las citocinas se pueden clasificar en tres categorías funcionales: regular las respuestas inmunes innatas, regular las respuestas inmunes adaptativas y estimular hematopoyesis. Debido a sus actividades pleiotrópicas dentro de las tres categorías dichas, por ejemplo, en relación con la activación, proliferación, diferenciación, reclutamiento u otras respuestas fisiológicas de las células, por ejemplo, la secreción de proteínas característica de la inflamación por parte de las células diana, se ha descubierto que las alteraciones de la señalización celular mediadas por la producción de citocinas reguladas de manera aberrante son la causa de muchos trastornos asociados con una respuesta inmune defectuosa, por ejemplo, inflamación y cáncer. En la inflamación y las enfermedades autoinmunes son fundamentales las citocinas IL-17A e IL-17F, IL-22, IL-12, IL-23 y los subtipos de IFN-alfa e IFN-omega. Excepto IL-12, IL-23 e IFNs, dichas citocinas se expresan mediante el subconjunto de células T efectoras Th17, que tienen funciones bien descritas en varios trastornos autoinmunes y alérgicos y en inmunología tumoral.
Las respuestas de Th17 no reguladas se asocian con inflamación crónica y condiciones inmunopatológicas graves. Estudios en modelos de animales y tejidos de pacientes afectados han confirmado la implicación de la vía Th17 en enfermedades inflamatorias crónicas como Acné vulgar; Artritis como Artritis gotosa, Lupus eritematoso sistémico (SLE), Osteoartritis, Artritis psoriásica, Artritis reumatoide (AR); Asma; Enfermedad celíaca; Enfermedad de Crohn (CD); Prostatitis crónica; Dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica); Diabetes mellitus tipo 1; Glomerulonefritis; Hipersensibilidades; Miocarditis; Esclerosis múltiple; Enfermedades inflamatorias del intestino; Enfermedad inflamatoria pélvica; Polimiositis; Psoriasis (PS); Sarcoidosis; Vasculitis; Cistitis intersticial o en inflamación que se produce debido a una lesión por reperfusión o rechazo de un trasplante. IL-17A induce la producción de citocinas, quimiocinas y metaloproteínas de matriz proinflamatorias. Esto provoca la infiltración de células inflamatorias y la destrucción de la matriz extracelular. Además de IL-17A, la citocina relacionada IL-17F, que puede heterodimerizarse con IL-17A, ha sido implicada recientemente en la patogénesis de RAy CD.
IL-22, una tercera citocina relacionada con Th-17 (Zenewicz and Flavell, Eur. J. Inmunol. 38 (2008), 3265-3268) es una citocina que actúa principalmente sobre las células epiteliales. En la piel, media la proliferación de queratinocitos y la hiperplasia epidérmica y juega un papel central en las enfermedades inflamatorias, como la psoriasis. IL-22 es un producto característico de las células Th17, también secretado en niveles funcionalmente significativos por otras células inmunes, especialmente las células asesinas naturales (NK) que expresan NKp44/NKp46 y las células inductoras de tejido linfoide después de la estimulación con IL-23. La interleucina-22 (IL-22) es un miembro de la familia IL-10 de citocinas antiinflamatorias que medía la inmunidad epitelial. La expresión de IL-22 está aumentada en la mucosa del colon inflamada en individuos con enfermedad inflamatoria intestinal. Importantemente IL-22 no sirve para la comunicación entre las células inmunes. Actúa principalmente sobre las células epiteliales y, por ejemplo, hepatocitos, donde favorece la defensa antimicrobiana, la regeneración y la protección contra daños e induce reactivos de fase aguda y algunas quimiocinas (Wolk et al., Semin. Inmunopatol. 32 (2010), 17-31).
IL-23 es una citocina clave en la promoción de la inflamación crónica, secretada por células inflamatorias activadas como macrófagos y células dendríticas (véase para revisión Langrish et al., Immunological Reviews 202 (2004), 96 105; Ferraccioli and Zizzo, Discov. Med. 60 (2011), 413-24; para más información Langrish et al., J. Exp. Med. 201 (2005), 233-40; Vaknin-Dembinsky et al., J. Neuroimmunol. 195 (2008), 140-145; Melis et al., Ann. Rheum. Dis. 69 (2010), 618-23). Inicialmente, se encontró que la IL-23 jugaba un papel en el apoyo a la expansión y el mantenimiento de las células Th17 (Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 278 (2003), 1910-1914; Weaver et al., Annu. Rev. Immunol. 25 (2007), 821-852). Sin embargo, se demostró que tiene múltiples efectos sobre la respuesta inmune, incluida la restricción de la actividad (acumulación intestinal) de las células T reguladoras positivas para Foxp3 (Barnes and Powrie, Immunity 31 (2009), 401-411; Izcue et al., Immunity28 (2008), 559-570; Ahern. Immunity 33 (2010), 279-88) e inducir la expresión de citocinas tipo Th17 a partir de fuentes distintas a las células T (Buonocore et al., Nature 464 (2010), 1371-1375; Morrison et al., Immunology 133 (2011), 397-408). Contribuye a la inflamación, por ejemplo, en psoriasis y enfermedades inflamatorias intestinales (véase publicacionessupray Duvallet et al., Ann. Med. 43 (2011), 503-511). La IL-23 está compuesta por dos subunidades, p19 y p40; la última subunidad se comparte con IL-12.
IL-17A, IL-22, oncostatina M, TNF-alfa e IL-1alfa son citocinas potentes producidas por la infiltración a la piel de células inmunes y/o queratinocitos y estas inducen inflamación cutánea. Boniface et al., J. Immunol. 178 (2007), 4615-4622; Nograles et al., Br. J. Dermatol. 159 (2008), 1092-1102; Guilloteau et al., J. Immunol. 184 (2010), 5263-5270).
Los enfoques terapéuticos recientes para las enfermedades inflamatorias crónicas como AR y PS graves implican el bloqueo del factor de necrosis tumoral a (TNF-a). Si bien este método es muy eficaz en algunos casos, muchos pacientes son "no respondedores". Además, una neutralización sostenida del TNF-a puede aumentar la susceptibilidad a las infecciones microbianas, lo que destaca la necesidad de enfoques terapéuticos alternativos y más específicos. Hasta ahora, la modulación de la función y/o diferenciación de las células Th-17 ha tenido más éxito con anticuerpos monoclonales para IL-12 p40, que se dirigen tanto a IL-12 (un heterodímero de p35 y p40) como a IL-23 (un heterodímero de p19 y p40, un factor de crecimiento de las células Th17). Estos anticuerpos, ustekinumab y ABT-874, que se dirigen a IL-12 p40, han tenido éxito en la psoriasis en placas crónica de moderada a grave y CD. (Miossec et al., N. Engl. J. Med. 361 (2009), 888-898, Steinman, Nat. Inmunol. 11 (2010), 41-44).
La forma más factible de controlar los efectos biológicos de las células Th17 y las células con propiedades relacionadas, por ejemplo, las células T gamma delta productoras de IL-17, sería atacarlas y seleccionara las citocinas efectoras que producen. Este novedoso enfoque permitiría un bloqueo de IL-22 en PS y de IL-17A (e IL-17F) en RAy CD, dejando intactos los otros brazos no patogénicos para combatir patógenos y, en el caso de IL-22, para ejercer sus funciones reparadoras de tejidos y antimicrobianas. Además, en algunos pacientes inicialmente respondedores, la eficacia del fármaco anti-TNF disminuye con el tiempo. Por tanto, los casos graves que no responden a la monoterapia podrían requerir una terapia combinada con dos o más fármacos biológicos. Se han desarrollado anticuerpos monoclonales contra IL-17A para aplicación clínica. Están en marcha ensayos de fase 2 de un anticuerpo monoclonal contra IL-17A (AIN457) para PS, CD y artritis psoriásica. Hasta ahora, los inhibidores de IL-22 se han probado solamente en modelos preclínicos de enfermedades autoinmunes (Miossec et al., N. Engl. J. Med. 361 (2009), 888 898, Steinman, Nat. Inmunol. 11 (2010), 41-44).
Debido a respuestas inmunes a anticuerpos desconocidos como los anticuerpos de ratón en humanos (respuesta HAMA; Schroff et al., Cancer Res. 45 (1985), 879-885; Shawler et al., J. Immunol. 135 (1985), 1530-1535), en los enfoques terapéuticos actuales se utilizan principalmente versiones humanizadas de anticuerpos (Chan et Carter, Nature Reviews Immunology 10 (2010), 301-316; Nelson et al., Nature Reviews Drug Discovery 9 (2010), 767-774). Una aproximación para obtener tales anticuerpos fue trasplantar las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en un marco completamente humano, un proceso conocido como humanización de anticuerpos (Jones et al, Nature 321 (1986), 522-525.). Esta aproximación a menudo se complica por el hecho de que las CDR de ratón no se transfieren fácilmente a un dominio variable de un marco humano, lo que da como resultado una menor afinidad del anticuerpo humanizado sobre su anticuerpo murino parental. Por lo tanto, a menudo se requieren experimentos de mutagénesis adicionales y elaborados, para aumentar la afinidad de los anticuerpos así diseñados. Otra aproximación para lograr anticuerpos humanizados es inmunizar ratones cuyos genes de anticuerpos innatos han sido reemplazados por genes de anticuerpos humanos y aislar los anticuerpos producidos por estos animales. Sin embargo, este método todavía requiere la inmunización con un antígeno, lo que no es posible con todos los antígenos debido a la toxicidad de algunos de ellos. Además, este método se limita a la producción de ratones transgénicos de una cepa específica.
Otro método es utilizar bibliotecas de anticuerpos humanos, tales como presentación de fagos, como se describe, por ejemplo, para la generación de anticuerpos específicos de IL-13 en la aplicación internacional WO 2005/007699. Aquí, los bacteriófagos están diseñados para mostrar fragmentos scFv/Fab humanos en su superficie mediante la inserción de un gen de anticuerpo humano en la población de fagos. Desafortunadamente, este método también tiene una serie de desventajas, incluida la limitación del tamaño de la secuencia de proteínas para la presentación polivalente, el requisito de la secreción de las proteínas, es decir, fragmentos de anticuerpos scFv/Fab, de bacterias, los límites de tamaño de la biblioteca, número limitado de posibles anticuerpos producidos y probados, una proporción reducida de anticuerpos con hipermutaciones somáticas producidas por inmunización natural y que todas las proteínas codificadas por fagos son proteínas de fusión, lo cual puede limitar la actividad o accesibilidad para la unión de algunas proteínas. De manera similar, la aplicación de patente Europea EP 0616 640 A1 describe la producción de autoanticuerpos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos mostrados en fagos. Las bibliotecas de fagos se generan a partir de humanos no inmunizados en este respecto (véase, por ejemplo, Ejemplo 1; página 16, líneas 43-51; Ejemplo 2, en la página 17, párrafo [0158], líneas 57-58). Sin embargo, también los métodos descritos en esta aplicación de patente adolecen de las desventajas generales mencionadas anteriormente de los anticuerpos generados a partir de bibliotecas de fagos, en comparación con los anticuerpos producidos y madurados en un mamífero, es decir, cuerpo humano. US 2005/042220 A1 y US 2003/099649 A1, ambos describen el aislamiento de anticuerpos anti-IL-22 monoclonales de rata y policlonales de pollo. Kisand Kai et al.: "Chronic mucocutaneous candidiasis in APECED or thymoma patients correlates with autoimmunity to Th17-associated cytokines", The Journal of Experimental Medicine, Rockefeller University Press, EE. UU. describen la presencia de actividad de anticuerpos anti-IL-22 en sueros de pacientes APECED o timoma. Sin embargo, de nuevo ninguno de estos documentos describe anticuerpos monoclonales humanos anti-IL-22 aislados.
En vista de lo anterior, todavía existe la necesidad de compuestos nuevos y adicionales, como moléculas de unión de alta especificidad, que sean tolerables en humanos ya sea para monoterapia o para enfoques combinatorios.
La solución a este problema la proporcionan las realizaciones de la presente invención como están caracterizadas en las reivindicaciones y divulgadas en la descripción e ilustradas en los Ejemplos más adelante.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a las realizaciones como se caracterizan en las reivindicaciones y en general a los anticuerpos de seres humanos afectados con una tolerancia central y/o periférica alterada o pérdida de auto-tolerancia que puede deberse o estar asociada con una génesis alterada o desregulada de la auto-tolerancia, preferiblemente causada por un trastorno autoinmune monogénico. Una fuente particularmente adecuada de autoanticuerpos de acuerdo con la presente invención son los humanos que tienen un trastorno asociado con una mutación en el genAIRE(Regulador autoinmune) tal como el síndrome de poliendocrinopatía autoinmune tipo 1 (APS1) (Peterson et al., Nat. Rev. Immunol. 8 (2008), 948-957).
La presente invención se basa generalmente en los sorprendentes hallazgos de que los pacientes con Síndrome de poliendocrinopatía autoinmune tipo 1 (APS1) proporcionan una fuente de autoanticuerpos monoclonales a proteínas que solas o en combinación son responsables por y/o asociadas con enfermedades autoinmunes o autoinflamatorias en las que las respectivas citocinas u otras moléculas como se indicó anteriormente están fuertemente implicadas en el inicio y mantenimiento de las respuestas inmunes patogénicas, tales como lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis, Diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) u otras como se indica en detalle anteriormente y a continuación.
La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales neutralizantes de alta afinidad a IL-22. Por lo tanto, se proporcionan anticuerpos humanos monoclonales (mAbs, o MABs) contra IL-22, los cuales se describirán en detalle a continuación, derivados de la respuesta inmune humoral naturalmente madura de un sujeto predeterminado, las cuales se consideran terapias seguras y eficaces para los trastornos en los que están implicadas estas citocinas.
En particular, se proporcionan anticuerpos anti-IL-22 así como fragmentos de unión al antígeno de los mismos, los cuales demuestran las características de unión inmunológica y/o las propiedades biológicas como se describe para los anticuerpos ilustrados en los Ejemplos. Cuando esté presente, el término "características de unión inmunológica" u otras características de unión de un anticuerpo con un antígeno, en todas sus formas gramaticales, se refiere a la especificidad, afinidad, reactividad cruzada y otras características de unión de un anticuerpo.
Naturalmente, la presente invención se extiende a líneas celulares productoras de anticuerpos y células recombinantes. La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas, ensayos de diagnóstico y kits que comprenden los anticuerpos aislados de acuerdo con la presente invención y a métodos terapéuticos basados en los mismos. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
Breve descripción de las figuras
Figura 1:
Capacidades neutralizantesin vitrodel anticuerpo recombinante 30G1 de la presente invención.
A: Capacidades neutralizantes frente a IL-22 humano. IC50 para el anticuerpo recombinante 30G1 es 2.5 ng/ml y para el anticuerpo comparativo 35G11 es 4 ng/ml utilizando 0.5 ng/ml de IL-22. Los anticuerpos comparativos recombinantes 41D11 y 51G4 no son neutralizantes en las concentraciones probadas. B: Capacidades neutralizantes frente a IL-22 de ratón. IC50 para el anticuerpo recombinante 30G1 es 1.5 ng/ml utilizando 0.3 ng/ml de IL-22 de ratón. Los anticuerpos comparativos recombinantes 35G11, 41D11 y 51G4 no son neutralizantes en las concentraciones probadas.
Figura 2:
Se clonaron secuencias de IL-22 de longitud completa (34-179 aa), truncada N-terminalmente (74-179 aa) o truncada C-terminalmente (34-116 aa) en fusión con luciferasa de luciérnaga en su C-terminal utilizando el vector de expresión de mamíferos pPK-CMV-F4 (PromoCell GmbH, Heidelberg; Alemania). Después de la transfección en células HEK 293, se utilizaron extractos de proteína crudos como antígeno en un ensayo de inmunoprecipitación. La figura muestra que los anticuerpos recombinantes específicos para IL-22 se unen a IL-22 de longitud completa de manera más eficaz, lo que indica el predominio de epítopes conformacionales. Unidades de luz-UL.
Figura 3:
Secuencias de aminoácidos de la región variable, es decir, cadena pesada y cadena ligera kappa/lambda (VH, VL) del anticuerpo humano específico de IL-22 de la presente invención: Anticuerpo 30G1 específico de IL-22: IgG1, kappa (VH3, G1m17; VK3, Km3 o Km1,2). El marco (FR) y las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) se indican con las CDRs subrayadas. Debido a la estrategia de clonación, la secuencia de aminoácidos en el N-terminal de la cadena pesada y la cadena ligera puede contener potencialmente alteraciones inducidas por el cebador en FR1, los cuales sin embargo no afectan sustancialmente la actividad biológica del anticuerpo. Para proporcionar un anticuerpo humano de consenso, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la clona original se alinean y se sintonizan de acuerdo con las secuencias de la región variable de la línea germinal humana pertinentes en la base de datos; véase, por ejemplo, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) alojado en el MCR Center for Protein Engineering (Cambridge, Reino Unido).
Figura 4:
Estudioin vivode lesión psoriasiforme Imiquimod anti-IL22. Protocolo experimental y cronograma del tratamiento con anticuerpos anti-IL22 e imiquimod (IMQ) de ratones C57BL/6J. Edad al afeitado es de 9 semanas, fecha de nacimiento del control no tratado: a las 10 semanas. A: Tablas que indican la composición del tratamiento de los cuatro grupos de animales. B: Cantidades del control y del anticuerpo anti-IL22 aplicadas a los animales. C: Línea de tiempo experimental. Se realizaron experimentos respectivos con el anticuerpo anti-IL-2230G1. Vas=Vaselina
Figura 5:
Puntuaciones clínicas de enrojecimiento en ratones C57BL/6J durante un período de 5 días (puntuación ciega en una escala de 0-4). Forma gráfica de las puntuaciones - las líneas sólidas (roja/rosa) son ratones IgG IMQ, las líneas de puntos (azul) son anti-IL-22 IMQ, todos los ratones no tratados con IMQ obtienen una puntuación consistente de 0.
Figura 6:
Puntuaciones clínicas de dureza en ratones C57BL/6J durante un período de 5 días (puntuación en una escala de 0 4). Forma gráfica de las puntuaciones - las líneas sólidas (rojas/rosas) son ratones IgG IMQ, las líneas de puntos (azul) son anti-IL-22 IMQ, todos los ratones no tratados con IMQ obtienen una puntuación consistente de 0
Figura 7:
Puntuaciones clínicas acumuladas (enrojecimiento dureza escamas) en ratones C57BL/6J durante un período de 5 días (puntuados en una escala de 0-4, totalizados). Forma gráfica de las puntuaciones - las líneas sólidas (rojas/rosas) son ratones IgG IMQ, las líneas de puntos (azul) son anti-IL-22 IMQ, todos los ratones no tratados con IMQ obtienen una puntuación consistente de 0
Figura 8:
Mediciones clínicas del grosor de la piel en ratones C57BL/6J durante un período de 5 días (promedio de 2 mediciones, representadas como un aumento de veces en comparación con el punto de tiempo del día 0). Forma gráfica de las puntuaciones - las líneas sólidas (rojas/rosas) son ratones IgG IMQ, las líneas de puntos (azul) son anti-IL-22 IMQ. Figura 9:
Día 4 del tratamiento. A: Vaselina Control de IgG. B: IMQ Control de IgG. C: Vaselina anti-IL-22. D: IMQ anti-IL-22
Figura 10:
Día 5 del tratamiento. A: Vaselina Control de IgG. B: IMQ Control de IgG. C: Vaselina anti-IL-22. D: IMQ anti-IL-22
Figura 11:
Desarrollo del peso de los animales durante el experimento a partir del día 0. A: desarrollo de peso en todos los grupos experimentales. B: desarrollo de peso en el grupo IMQ solo sin controles de Vaselina. No significativo (ns) en todos los puntos de tiempo.
Figura 12:
Los ratones que recibieron IgG IMQ tienen una piel significativamente más gruesa el Día 4 en comparación con anti-IL-22 IMQ. El grosor de la espalda de los animales se muestra en mm a lo largo del tiempo. * p<0.5 (anova de 2 vías; todos los demás puntos temporales ns)
Figura 13:
El tratamiento con aIL-22 (30G1) reduce significativamente la puntuación clínica de la psoriasis en ratones tratados con IMQ. El enrojecimiento, dureza y escamas de las placas se evaluaron de acuerdo con la puntuación del Índice de gravedad y área de psoriasis (PASI). A cada una de las tres características de un psoriásico se le asignó un número del 0 al 4, siendo 4 el peor. *** p<0.001 (anova de 2 vías) en (A) y (B). (C) ns en todos los puntos de tiempo (anova de 2 vías).
Figura 14:
Los ratones que recibieron a-IL-22 IMQ tuvieron una gravedad clínica significativamente diferente (reducida) en el Día 4 y el Día 5, especialmente en el eritema de la piel (puntuado a ciegas) y la dureza. ***p<0.001 (anova de 2 vías) Figura 15:
Los ratones que recibieron IMQ tuvieron bazos significativamente más grandes en comparación con los ratones tratados con vaselina. No hay diferencias significativas entre los ratones tratados con IgG IMQ y anti-IL-22 IMQ. A: peso del bazo en los diferentes grupos de tratamiento y de control; Prueba t no apareada de dos colas. B: Descripción general del tamaño del bazo de los diferentes grupos de tratamiento y de control.
Figura 16:
Las células de los ganglios linfáticos (GL) de ratones tratados con IMQ son menos viables que las de los ratones tratados con Vaselina. La viabilidad de las células de los GL es significativamente diferente entre los ratones tratados con IgG IMQ y anti-IL-22 IMQ; Prueba t no apareada de dos colas, ** p<0.005.
Figura 17:
El número total de células de los GL vivas viables es significativamente diferente entre los ratones tratados con IgG IMQ y anti-IL-22 IMQ. Prueba t no apareada de dos colas; **p<0.005.
Figura 18:
Estudioin vivode lesión psoriasiforme IQM anti-IL22 (30G1). Protocolo experimental y cronograma que detalla la administración de anticuerpos anti-IL22 pre y post (24 horas después) de la inducción con IMQ en ratones C57BL/6J. Edad al afeitado de 9 semanas, Fecha de nacimiento del control no tratado: a las 10 semanas. A: Tablas que indican la composición del tratamiento de los grupos de animales A al G. B: Cantidades del control y del anticuerpo anti-IL22 aplicadas a los animales. C: Línea de tiempo experimental. Vas=Vaselina. Estim GL = estimulación de los ganglios linfáticos. Los datos clínicos del animal #19 se excluyeron del análisis debido a una pérdida de peso grave. Las indicaciones que se muestran aquí son las mismas que para los experimentos que se muestran en la Figura 4.
Figura 19:
La administración del anticuerpo 30G1 de aIL-22 ejemplar reduce significativamente el engrosamiento de la piel en ratones tratados con imiquimod; se puede observar un efecto terapéutico implicado por la puntuación clínica reducida de la psoriasis en ratones que reciben el anticuerpo IL-2230G1 después de la inducción con IMQ. Las líneas de las gráficas están numeradas en la figura para una mejor legibilidad.
Figura 20:
Estudioin vivode lesión psoriasiforme anti-IL22 (30G1) IMQ. Protocolo experimental y cronograma que detalla la administración de anticuerpos anti-IL22 post (24 horas después) de la inducción con IMQ en ratones C57BL/6J - con un mayor número de animales probados. Subfiguras A, B y C como se describe anteriormente para la Figura 19.
Figura 21:
La administración del anticuerpo 30G1 aIL-22 ejemplar reduce significativamente el engrosamiento de la piel en ratones inducidos con IMQ, incluso si se administra "terapéuticamente" - 24 horas después de la inducción con IMQ en lugar de antes de la inducción con IMQ. Se pudo observar una diferencia significativa en el grosor de la piel entre los grupos tratados con IgG IMQ y aIL-22 iMq en el Día 4. A: Duplicar las mediciones en mm del grosor de la piel en la espalda de los animales tratados. B: cambio de veces en el grosor de la piel de dichos animales. Las líneas de las gráficas están numeradas en la figura para una mejor legibilidad.
Figura 22:
La administración del anticuerpo aIL-2230G1 ejemplar reduce significativamente la puntuación de psoriasis clínica del eritema cutáneo en ratones inducidos con IMQ, incluso cuando se administra "terapéuticamente". (A-C) Se pudo observar una diferencia significativa en el eritema de la piel entre los grupos tratados con IgG IMQ y aIL IMQ en los días 4 y 5. Enrojecimiento (A), Escamas (B) y dureza (C) de las placas se evaluaron de acuerdo con la puntuación del Índice de gravedad y área de psoriasis (PASI). A cada una de las tres características de un psoriásico se le asignó un número del 0 al 4, siendo 4 el peor. ** p<0.01, * p<0.05 (anova de 2 vías) en (A). (B) y (C) ns en todos los puntos de tiempo (anova de 2 vías). (D) Se pudo observar una diferencia significativa en la puntuación clínica acumulada el Día 4. Las líneas de las gráficas están numeradas en la figura para una mejor legibilidad; Las líneas 1 y 2 son concurrentes con el eje X.
Figura 23:
Efecto dependiente de la dosis del anticuerpo 30G1 anti-IL-22 ejemplar de la presente invención en la psoriasis inducida por IMQ. Se administraron tres dosis diferentes - 200 |jg, 2o |jg y 2 |jg después de la inducción con IMQ. (A) eritema de la piel y (B) la dureza de las placas se evaluó como se describe en las Figuras anteriores. (C) y (D) muestran los valores para el respectivo aIL-22 o el tratamiento de control. (E) muestra las puntuaciones acumuladas para los diferentes tratamientos. El anticuerpo anti-IL22 ejemplar de reacción cruzada de ratón de la presente invención 30G1 muestra indicaciones de dependencia de la dosis, demostrando ser menos eficaz cuando se titula hasta 1/100 de la dosis inicial.
Figura 24:
Mapeo de epítopes. Unión diferencial de aIL-22 MAB 30G1 ejemplar de la presente invención a distintos sitios de unión. Los experimentos de competencia cruzada muestran que los anticuerpos anti-IL-22 30G1, 35G11 y 41D11 compiten entre sí, pero no contra el anticuerpo 51G4, lo que indica también dos sitios de unión, uno para el primer grupo de anticuerpos y un segundo para el anticuerpo 51G4. (A). Los resultados para el anticuerpo 30G1 anti-IL-22 ejemplar de la presente invención se han verificado mediante experimentos sándwich de ELISA. (B). El anticuerpo 9A5 es un anticuerpo específico de MAGEA3 que es no reactivo con IL-17 e IL-22 y se utiliza en la presente como control negativo. (A, B).
Figura 25:
Resultados del análisis PepStar™ de las regiones de unión de los MABs a sus respectivos antígenos - IL-22. Todos los anticuerpos muestran patrones de unión muy débiles a los péptidos unidos a los microarreglos, lo que indica una falla en el reconocimiento de péptidos lineales derivados de su antígeno específico. Todos los anticuerpos anti-Il-22 probados parecen unirse preferentemente a epítopes conformacionales. Se muestran los resultados de unión preliminares para los anticuerpos anti-IL-22: (A) 30<g>1, (B) 35G11, (C) 41D11 y (D) 51G4. Eje X de izquierda a derecha: Péptidos numerados del 1 al 27 e IL-22 de longitud completa. Eje Y - distribución de intensidad de 10000 a 60000 en pasos de 10000.
Figura 26:
Resultados del análisis de afinidades de anticuerpos basado en ProteOn XPR36. Inyección de IL-22 en concentraciones de A1: 100 nM, A2: 33.33 nM, A3: 11.11 nM A4: 3.70 nM A5: 1.23 nM y A6: 0 nM (solo tampón de corrida). Los identificadores A1-A6 están precedidos por los prefijos L1 a L6 (L1A1, etc.). Se utilizaron las mismas concentraciones en las siguientes Figuras 27-28. Se hizo referencia a los datos utilizando las regiones entre puntos del chip sensor. Las superficies recubiertas con el anticuerpo aIL-22 ejemplar de la presente invención 30G1 y con el anticuerpo comparativo 35G11 muestran reacciones de unión del ligando específicas, dependientes de la concentración.
Figura 27:
Análisis detallado de los sensogramas relacionados con la unión de IL-22 al anticuerpo aIL-22 30G1 de la presente invención. (A) Los gráficos superpuestos para el ajuste de Langmuir y los datos experimentales de la reacción de unión indican un buen ajuste al modelo 1.1 de Langmuir. La gráfica de residuales (B) muestra una dispersión aleatoria en la que la magnitud del nivel de ruido indica un buen ajuste residual. La tabla debajo de las figuras muestra los parámetros cinéticos derivados de las curvas ajustadas para la asociación (ka), disociación (kd), Rmax y las disociaciones calculadas son constantes KD.
Figura 28:
Análisis detallado de los sensogramas relacionados con la unión de IL-22 al anticuerpo comparativo aIL-22 35G11 como se describe en la Figura 27.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere generalmente a un anticuerpo anti-IL-22 como se caracteriza en las reivindicaciones, el cual se ha obtenido originalmente mediante un método de aislamiento de autoanticuerpos monoclonales con una especificidad de antígeno deseada, en el que una célula B que expresa el anticuerpo monoclonal se aísla de una muestra obtenida de un mamífero que está afectado por una tolerancia central y/o periférica alterada, o una pérdida de auto-tolerancia, que es un trastorno típicamente asociado con una génesis de auto-tolerancia alterada o desregulada; véase Ejemplo 1.
Como se ilustra en los Ejemplos, los autoanticuerpos de la presente invención reconocen preferentemente sólo el antígeno humano o al menos preferentemente sobre el antígeno correspondiente de otras especies tales como ratones. Por lo tanto, en una realización de la presente invención, el anticuerpo es específico para el antígeno humano y preferiblemente no reconoce sustancialmente el antígeno correspondiente de otra especie tal como de origen murino, por ejemplo, ratones en el caso de un anticuerpo humano. Las características de unión tales como la especificidad y la afinidad de los anticuerpos de la presente invención se han probado en varios ensayos experimentales como se describe en detalle en los Ejemplos 7 y 8. Se podrían obtener indicaciones adicionales a partir de datos experimentalesin vivodentro de las pruebas del potencial terapéutico de anticuerpos ejemplares de la presente invención, por ejemplo, en inflamación de la piel tipo psoriasis inducida (Ejemplo 6). El anticuerpo 30G1 anti-IL-22 ejemplar de reacción cruzada de ratón ha mostrado un efecto terapéutico en este al reducir los síntomas clínicos de las lesiones psoriasiformes inducidas por IMQ.
Como se ha demostrado además para los anticuerpos de la presente invención, estos son capaces de neutralizar la actividad biológica de su proteína diana. En este contexto, el término "neutralizante" significa que el anticuerpo de la presente invención es capaz de intervenir con la actividad biológica de su proteína diana en un ensayo bioquímico o celular como puede evaluarse realizando el ensayo respectivo en presencia del anticuerpo del sujeto de la presente invención, en el que la actividad biológica de la proteína diana se reduce concomitantemente con el aumento del nivel del anticuerpo de la presente invención sometido al ensayo en comparación con la actividad biológica de la proteína sin la presencia del anticuerpo de la presente invención y en presencia de un compuesto, por ejemplo, un anticuerpo de control que se sabe que no afecta en ninguna forma la actividad biológica de la proteína diana. Dicho ensayo bioquímico ein vitrotambién se puede realizar utilizando un anticuerpo de referencia que se sabe que es capaz de neutralizar la actividad biológica de la proteína diana tal como se ha demostrado para el anticuerpo anti-IL-22 de la presente invención y sometiendo el anticuerpo candidato a la muestra de prueba, en el que se puede observar un efecto neutralizante aditivo resultante de la actividad combinada del anticuerpo de referencia y del candidato o se observa una competencia del anticuerpo candidato y del anticuerpo de referencia que puede determinarse marcando cualquiera de los dos anticuerpos. Por tanto, el anticuerpo de la presente invención es capaz de neutralizar la actividad biológica de IL-22.
Como se demuestra en los Ejemplos 4 y 6 adjuntos, las moléculas de unión, es decir, anticuerpos que se han identificado y clonado, los cuales muestran una actividad neutralizantein vitroparticularmente alta con bajas concentraciones inhibidoras (IC50) para la citocina IL-22 probada. En este respecto, se proporciona un anticuerpo con una alta afinidad por sus respectivas moléculas diana, es decir, IL-22, que muestra una ED50 en concentraciones inferiores a 100 ng/ml, preferiblemente inferiores a 10 ng/ml. Para obtener más detalles con respecto a la afinidad de unión de los anticuerpos de la presente invención, véase, por ejemplo, la sección "Características de unión" más adelante.
La presente invención ejemplifica tales moléculas de unión, es decir, anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos, que se caracterizan por comprender en su región variable, es decir, dominio de unión al menos la V<h>y V<l>de la región variable que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 3 de (Vh) (SEQ ID NO: 31) y (Vl) (SEQ ID NO: 33) - véase las secuencias de CDR ejemplares subrayadas en la Figura 3.
Por lo tanto, la presente invención se refiere generalmente a un anticuerpo humano y fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo reconoce un epítome conformacional de IL-22 y es capaz de neutralizar la actividad biológica de IL-22, y al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende en su cadena variable pesada (Vh) y cadena variable ligera (Vl) la secuencia de aminoácidos de la cadena Vh y Vl de SEQ ID No: 31 y 33 respectivamente.
Para proporcionar anticuerpos completamente humanos y fragmentos Fab nativos de los mismos, el anticuerpo humano de la presente invención preferiblemente comprende además una región constante C<h>y/o C<l>que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos de C<h>y C<l>establecidas en la Tabla 1 (SEQ ID NO.: 35, 37, 43, 45, 51, 53, 59, 61) o una secuencia de aminoácidos derivada del mismo con al menos un 60% de identidad.
En el caso de una secuencia derivada, dicha secuencia muestra al menos 60% de identidad, más preferiblemente (en el siguiente orden) al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, y lo más preferiblemente 95%, al menos 96-99% o incluso 100% de identidad con una secuencia del grupo que consiste en aquellas secuencias mencionadas anteriormente e identificadas en el Listado de Secuencias. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio, que deben introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr utilizando un algoritmo matemático, que es bien conocido por los expertos en la técnica. Las identidades a las que se hace referencia en la presente se determinarán utilizando los programas BLAST como se menciona más adelante en la presente.
Como se explicó anteriormente, se proporcionan anticuerpos completamente humanos para aplicaciones terapéuticas. Un fragmento del anticuerpo de unión al antígeno puede ser, por ejemplo, un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv), un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) o un fragmento F(ab')2.
Como se menciona en una realización preferida, la presente invención se refiere a anticuerpos sustancialmente completamente humanos, preferiblemente IgG que incluye al menos la cadena pesada constante I (Ch1) y la cadena ligera correspondiente de la región constante, es decir,<y>-1, Y-2, Y-3 o<y>-4 en combinación con lambda o kappa. En una realización preferible particular, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esas regiones constantes aisladas para los anticuerpos del sujeto ilustrados en los Ejemplos se utilizan como se representa en la Tabla 1 a continuación y en SEQ ID NOs: 34-37, 42-45, 50-53 y 58-61.
De acuerdo con lo anterior, en una realización la presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica para al menos la región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la presente invención. Normalmente, dicha región variable codificada por el polinucleótido comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) de la Vh y/o Vl de la región variable de dicho anticuerpo. Las regiones variables y constantes de los anticuerpos se describen con más detalle en la sección "Estructura de IgG" a continuación. En una realización preferida de la presente invención, el polinucleótido comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que tiene una secuencia polinucleotídica de la región Vh o Vl de un anticuerpo de la presente invención como se representa en la Tabla 1 a continuación. En este respecto, el experto en la técnica apreciará fácilmente que los polinucleótidos que codifican para al menos el dominio variable de la cadena ligera y/o pesada puede codificar el dominio variable de cualquiera de las cadenas de inmunoglobulina o sólo una de ellas.
Tabla 1: Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las regiones variable y constante (V<h>, V<l>, C<h>, C<l>) del anticuerpo específico de IL-22 de la presente invención 30G1 y de los anticuerpos a-IL-22 comparativos 35G11,41D11 y 51G4.
El experto en la técnica apreciará fácilmente que el dominio variable del anticuerpo que tiene el dominio variable descrito anteriormente se puede utilizar para la construcción de otros polipéptidos o anticuerpos de especificidad y función biológica deseadas. El experto en la técnica apreciará fácilmente que utilizando los dominios variables o CDRs descritos en la presente, se pueden construir anticuerpos de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en las aplicaciones de patente Europea EP 0451 216 A1 y EP 0549581 A1. Además, el experto en la técnica sabe que la afinidad de unión se aumentar realizando sustituciones de aminoácidos dentro de las CDRs o dentro de los bucles hipervariables (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) que se superponen parcialmente con los CDRs definidos por Kabat.
El polinucleótido de la invención que codifica para el anticuerpo descrito anteriormente puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, ARN o ADN o ARN producidos sintéticamente o una molécula de ácido nucleico quimérica producida recombinantemente que comprende cualquiera de esos polinucleótidos ya sea solos o en combinación. En una realización preferida, se proporciona un vector que comprende el polinucleótido anterior, opcionalmente en combinación con dicho polinucleótido que codifica para la región variable de la otra cadena de inmunoglobulina de dicho anticuerpo. Dichos vectores pueden comprender genes adicionales tales como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula hospedera adecuada y en condiciones adecuadas.
Preferiblemente, el polinucleótido de la invención está operativamente unido a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células procariotas o eucariotas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido en un ARNm traducible. Los expertos en la técnica conocen bien los elementos regulatorios que garantizan la expresión en células eucariotas, preferiblemente células de mamíferos. Normalmente comprenden secuencias reguladoras que garantizan el inicio de la transcripción y, opcionalmente, señales poli-A que garantizan la terminación de la transcripción y la estabilización de la transcripción. Los elementos regulatorios adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales y traduccionales y/o regiones promotoras heterólogas o naturalmente asociadas.
En este respecto, el experto en la técnica apreciará fácilmente que los polinucleótidos que codifican para al menos el dominio variable de la cadena ligera y/o pesada pueden codificar para los dominios variables de ambas cadenas de inmunoglobulina o de una sola cadena.
Asimismo, dichos polinucleótidos pueden estar bajo el control del mismo promotor o pueden controlarse por separado para su expresión. Los posibles elementos regulatorios que permiten la expresión en células hospedera procariotas comprenden, por ejemplo, el Pl, el promotor, lac, trp o tac en E. coli, y ejemplos de elementos regulatorios que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOX1 o GAL1 en levadura o el promotor de -C<m>V, -SV40, -RSV, potenciador de -CMV, potenciador de -SV40 o un intrón de globina en células de mamíferos y otros animales.
Además de los elementos que son responsables del inicio de la transcripción, dichos elementos regulatorios también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, río abajo del polinucleótido. Además, dependiendo del sistema de expresión utilizado, se pueden añadir secuencias líder, a la secuencia codificante del polinucleótido de la invención, que son capaces de dirigir el polipéptido a un compartimento celular o secretarlo al medio y son bien conocidas en la técnica. La secuencias líder se ensamblan en la fase apropiada con secuencias de traducción, iniciación y terminación, y preferiblemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida, o una porción de la misma, al espacio periplásmico o al medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar para una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación C- o N- terminal que imparte las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados tales como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) o pSPORT1 (GIBCO BRL).
Preferiblemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas, pero también se pueden utilizar secuencias de control para hospederos procarióticos. Una vez que el vector se ha incorporado al hospedero apropiado, el hospedero se mantiene en condiciones adecuadas para un alto nivel de expresión de las secuencias de nucleótidos y, según se desee, la recolección y purificación de las cadenas ligeras, cadenas pesadas y dímeros de cadenas ligeras/pesadas, o anticuerpos intactos, fragmentos de unión u otras formas de inmunoglobulina le siguen; véase, Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979).
Además, la presente invención se refiere a vectores, particularmente plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos utilizados convencionalmente en ingeniería genética que comprenden un polinucleótido que codifica para el antígeno o preferiblemente un dominio variable de una cadena de inmunoglobulina de un anticuerpo de la invención; opcionalmente en combinación con un polinucleótido de la invención que codifica para el dominio variable de la otra cadena de inmunoglobulina del anticuerpo de la invención. Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión y/o un vector de transferencia o direccionamiento de genes.
Se pueden utilizar vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adenoasociados, virus del herpes o virus del papiloma bovino, para la administración de los polinucleótidos o el vector de la invención en una población celular diana. Se pueden utilizar métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores virales recombinantes; véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1994). Alternativamente, los polinucleótidos y vectores de la invención se pueden reconstituir en liposomas para su administración a células diana. Los vectores que contienen los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, los dominios variables pesados y/o ligeros de las cadenas de inmunoglobulina que codifican para secuencias y secuencias de control de la expresión) pueden transferirse a la célula hospedera mediante métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de hospedero celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación se pueden utilizar para la transformación de otros hospederos celulares; véase Sambrook,supra.
Con respecto a lo anterior, la presente invención se refiere además a una célula hospedera que comprende dicho polinucleótido o vector. Dicha célula hospedera puede ser una célula procariótica o eucariota. El polinucleótido o vector de la invención que está presente en la célula hospedera puede integrarse en el genoma de la célula hospedera o puede mantenerse extracromosomalmente. La célula hospedera puede ser cualquier célula procariótica o eucariota, tal como una célula bacteriana, de insecto, fúngica, vegetal, animal o humana; las células huésped adecuadas y los métodos para la producción de los anticuerpos de la presente invención se describen con más detalle en la sección "Células huésped" a continuación.
Las moléculas de unión, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden utilizar directamente como agente terapéutico. Sin embargo, en una realización, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno que se proporciona en la presente invención está marcado o unido de manera detectable a un fármaco, en el que el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un radioisótopo, un fluoróforo, un péptido y un metal pesado. Los anticuerpos marcados o fragmentos de unión al antígeno de la presente invención se pueden utilizar para detectar dianas específicasin vivooin vitro,incluidos ensayosin vitrotipo "inmunoquímica/inmunomarcado".In vivopueden utilizarse de manera similar a las técnicas de obtención de imágenes de medicina nuclear para detectar tejidos, células u otro material que exprese el antígeno de interés. Las etiquetas, su uso en el diagnóstico y su acoplamiento a las moléculas de unión de la presente invención se describen con más detalle en la sección "etiquetas y diagnósticos" más adelante.
Además, la presente invención también se refiere a composiciones que comprenden a, los antes mencionados, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, el polinucleótido, el vector o la célula. En una realización, la composición es una composición farmacéutica y comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, las vías de administración y el régimen de dosificación se pueden tomar de la literatura correspondiente conocida por el experto en la técnica y se describen también con más detalle en las secciones "Vehículos farmacéuticos" y "Régimen de dosificación" más adelante.
Además de los ensayos bioquímicos y celularesin vitro,la utilidad terapéutica del anticuerpo de la presente invención se puede validar en modelos animales apropiados tales como psoraris, EII, candidasis; véase los Ejemplos 5 y 6 y el modelo de enfermedad inflamatoria intestinal EII (colitis DSS) en Wirtz et al, Nature Protocols 2 (2007), 541 - 546; para un modelo de Psoriasis (Imiquimod) en van der Fits et al, J Immunol 182 (2009), 5836-5845; para un modelo de esclerosis múltiple (encefalomielitis autoinmune experimental (EAE)) en Miller, SD and Karpus, w J, Current Protocols in Immunology 78 (2007.), 15.1.1-15.1.18 y en http://hookelabs.com/products/eae/; para un modelo de artritis reumatoide (artritis inducida por colágeno) en Julia J Inglis et al, Nature Protocols 3 (2008), 612 - 618.
En una realización, la composición farmacéutica comprende además un agente adicional útil para tratar una inflamación o un trastorno autoinmune, seleccionado del grupo que consiste en Fármacos Antiinflamatorios No Esteroideos (NSAIDs), Corticosteroides, Antihistamínicos y combinaciones de los mismos. Además, o alternativamente, en una realización adicional la composición farmacéutica comprende además un agente adicional útil para tratar una enfermedad relacionada con la inflamación, seleccionado del grupo que consiste en fármacos inmunosupresores y antiinflamatorios o "antirreumáticos".
En otra realización, la composición es una composición de diagnóstico y comprende además reactivos utilizados convencionalmente en métodos de diagnóstico basados en inmuno o ácidos nucleicos.
Además, la presente invención proporciona el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno antes mencionados para uso en el tratamiento o prevención de la progresión de un trastorno inflamatorio o autoinmune; para mejorar los síntomas asociados con la inflamación o un trastorno autoinmune; para diagnosticar o cribar a un sujeto para la presencia o para determinar el riesgo de un sujeto de desarrollar inflamación o un trastorno autoinmune.
En este respecto se pueden utilizar varias rutas de aplicación. En una realización de la presente invención se proporciona el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno antes mencionados, el cual está diseñado para administrarse por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, parenteral o como un aerosol.
Debido a la multitud de moléculas adecuadas en el tratamiento de, por ejemplo, trastornos asociados con la inflamación, la presente invención también proporciona varios métodos de tratamiento de dichos trastornos. En una realización, se proporciona un método para tratar un trastorno asociado con una inflamación o un trastorno autoinmune, cuyo método comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno antes mencionados. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
En una realización de este método, dicho trastorno se selecciona del grupo que consiste en Acné vulgar; Artritis como Artritis gotosa, Lupus eritematoso sistémico (SLE), Osteoartritis, Artritis psoriásica, Artritis reumatoide; Asma; Enfermedad celíaca; Prostatitis crónica; Dermatitis; Diabetes mellitus tipo 1; Glomerulonefritis; Hipersensibilidades; Miocarditis; Esclerosis múltiple; Enfermedades inflamatorias del intestino; Enfermedad inflamatoria pélvica; Polimiositis; Psoriasis; Sarcoidosis; Vasculitis; APS1; Cistitis intersticial o la inflamación se produce debido a una lesión por reperfusión o al rechazo de un trasplante; véasesupra.
Los métodos de tratamiento basados en el uso de un solo anticuerpo monoclonal específico para un epítope de un antígeno particular, que está relacionado o causa una enfermedad, pueden adolecer de varias deficiencias. Por ejemplo, las dificultades y probablemente la ineficiencia del tratamiento pueden deberse a la multiplicidad de mecanismos patogénicos que causan un trastorno específico que requiere el ataque de varios antígenos simultáneamente. Además, debe tenerse en cuenta la diversidad inherente de la población de pacientes en lo que respecta a, por ejemplo, polimorfismo, heterogeneidad de glicosilación o ligera desnaturalización de un antígeno determinado, ya sea en diferentes o en un solo paciente, lo que puede conducir, al menos, a una disminución de la eficacia de unión del anticuerpo monoclonal utilizado. Algunas de estas deficiencias pueden evitarse mediante, por ejemplo,cribados previos al tratamiento para determinar si el antígeno es inmunológicamente relevante para los pacientes que se pretende tratar y si hay cambios en el epítope en los pacientes en particular. Sin embargo, estos cribados a menudo se omiten debido a la urgencia del tratamiento o a restricciones de coste. Por lo tanto, la presente invención se refiere además a métodos basados en la aplicación de más de un tipo de molécula de unión a la vez a un paciente. Estas moléculas de unión pueden unirse específicamente a un antígeno en diferentes epítopes o cada una de las moléculas de unión aplicadas se une específicamente a otro antígeno relacionado con la enfermedad. En caso de que las moléculas de unión de la presente invención se dirijan (se unan específicamente) hacia un antígeno, su especificidad de unión se dirige hacia distintos epítopes de dicho antígeno. El uso de tales cócteles está previsto en particular para el tratamiento de pacientes que padecen trastornos autoinmunes como APS1, quienes, debido a la presencia de autoanticuerpos contra aproximadamente 3000 antígenos endógenos, a menudo no son susceptibles a la monoterapia con un determinado anticuerpo. En tales casos, se espera que la terapia de combinación con dos o más anticuerpos monoclonales de la presente invención con la misma o diferente especificidad de antígeno logre al menos cierto alivio de los síntomas.
En otra realización, la presente invención se refiere a un kit para el diagnóstico de un trastorno que se acompaña de la presencia de una proteína asociada al trastorno como se define en uno cualquiera de los péptidos reivindicados, comprendiendo dicho kit, los antes mencionados, anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, el polinucleótido, el vector o la célula, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones de uso. Asociado con los kits de la presente invención, por ejemplo, dentro de un contenedor que comprende el kit puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación por parte de la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana. Además, o alternativamente, el kit comprende reactivos y/o instrucciones para uso en ensayos de diagnóstico apropiados. Las composiciones, es decir, los kits de la presente invención son, por supuesto, particularmente adecuados para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de un trastorno que se acompaña de la presencia de un antígeno asociado a la inflamación definido anteriormente, en particular aplicable para el tratamiento de enfermedades como las mencionadas anteriormente.
En otra realización, la presente invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende uno cualquiera de, los descritos anteriormente, anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno, polinucleótidos, vectores o células de la invención y, opcionalmente, medios adecuados para la detección, tales como reactivos utilizados convencionalmente en métodos de diagnóstico basados en inmuno o ácidos nucleicos. Los anticuerpos de la invención son, por ejemplo, adecuados para uso en inmunoensayos en los que pueden utilizarse en fase líquida o unirse a un vehículo en fase sólida. Ejemplos de inmunoensayos que pueden utilizar el anticuerpo de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos en formato directo o indirecto. Ejemplos de tales inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA), el sándwich (ensayo inmunométrico), citometría de flujo y el ensayo de transferencia Western. Los antígenos y anticuerpos de la invención pueden unirse a muchos vehículos diferentes y utilizarse para aislar células unidas específicamente a estos. Ejemplos de vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nailon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Hay muchas etiquetas y métodos de etiquetado diferentes conocidos por las personas con habilidades ordinarias en la técnica. Ejemplos de los tipos de marcadores que pueden utilizarse en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes; véase también las realizaciones discutidas anteriormente en la presente.
En este contexto, la presente invención también se refiere a medios diseñados específicamente para este fin. Por ejemplo, se puede utilizar una matriz basada en proteínas o anticuerpos, la cual está, por ejemplo, cargada con ya sea antígenos derivados de la proteína asociada al trastorno mencionado y que contiene el antígeno asociado a la inflamación para detectar autoanticuerpos que pueden estar presentes en pacientes que padecen de enfermedades autoinmunes, en particular artritis, diabetes tipo I o APECED/APS1, o con anticuerpos o moléculas de unión al antígeno equivalentes de la presente invención que reconocen específicamente cualquiera de esos antígenos asociados a la inflamación. El diseño de inmunoensayos de microarreglos se resume en Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a microarreglos cargados con moléculas de unión o antígenos identificados de acuerdo con la presente invención.
Definiciones y realizaciones
A menos que se indique lo contrario, un término tal como se utiliza en la presente recibe la definición proporcionada en el Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revisado en 2000 y reimpreso en 2003, Is Bn 0198506732.
Cabe señalar que el término "un", o "uno, una" entidad se refiere a una o más de esta entidad; por ejemplo, se entiende que "un anticuerpo" representa uno o más anticuerpos. Como tal, los términos "un" (o "una, uno”), "uno o más" y "al menos uno" pueden utilizarse indistintamente en la presente.
Los términos "neutralizante" y "anticuerpo neutralizante", respectivamente, se utilizan como comúnmente en la técnica ya que se entiende que un anticuerpo reduce o suprime al menos alguna actividad biológica de un antígeno o de un microorganismo vivo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-17F de la presente invención es un anticuerpo neutralizante si, en cantidades adecuadas, suprime la actividad de la citocina, por ejemplo, en un ensayo como se describe en los Ejemplos. La neutralización se define comúnmente mediante concentraciones inhibidoras del 50% (IC 50) y puede evaluarse estadísticamente en función del área bajo la curva (AUC) de titulación de neutralización. En el caso de enfermedades tumorales, la neutralización se puede evaluar, por ejemplo, determinando la inhibición del crecimiento tumoral. Por ejemplo, se sabe que la secreción de interleucina-6 inducida por injertos oncogénicos es necesaria para la tumorogénesis y que los anticuerpos anti-IL-6 se pueden utilizar para la correspondiente terapia contra el cáncer; véase, por ejemplo, Ancrile et al., "Genes and development" 21 (2007), 1714-1719. La neutralización de un agente infeccioso tal como un virus se define como la pérdida de la infectividad mediante la reacción del virus o de su célula diana, por ejemplo, bloqueando el receptor del virus, lo que da como resultado la reducción de las células infectadas, lo que puede determinarse fácilmente en ensayos apropiados basados en células conocidos por el experto en la técnica. El experto en la técnica puede determinar fácilmente otras actividades biológicas que pueden ser "neutralizadas" por el anticuerpo de la presente invención.
Polinucleótidos:
El término "polinucleótido" pretende abarcar un ácido nucleico singular, así como ácidos nucleicos plurales, y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, como el que se encuentra en los ácidos peptídicos nucleicos (APN)). El término "ácido nucleico" se refiere a uno cualquiera o más segmentos de ácidos nucleicos, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Por ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, la cual ha sido eliminada de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica para un anticuerpo contenido en un vector se considera aislado para los fines de la presente invención. Ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARNin vivooin vitrode polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulatorio tal como un promotor, un sitio de unión a ribosomas o un terminador de la transcripción.
Como se utiliza en la presente, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consta de codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores transcripcionales, intrones y similares no forman parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes de la presente invención pueden estar presentes en una única construcción de polinucleótidos, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones polinucleotídicas separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un único vector puede codificar por separado para una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar para regiones codificantes heterólogas, ya sea fusionadas o no fusionadas a un ácido nucleico que codifica para una molécula de unión, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, sin limitación, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo.
En determinadas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso del ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido, normalmente puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción asociados operativamente con una o más regiones codificantes. Una asociación operable es cuando una región codificante de un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, está asociado con una o más secuencias regulatorias de tal manera que se coloque la expresión del producto génico bajo la influencia o el control de la(s) secuencia(s) regulatoria(s). Dos fragmentos de ADN (tal como una región codificante para un polipéptido y un promotor asociado al mismo) están "asociados operativamente" o "unidos operativamente" si la inducción de la función del promotor da como resultado la transcripción del ARNm que codifica para el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias regulatorias de la expresión para dirigir la expresión del producto génico ni interfieren con la capacidad del templado de ADN para transcribirse. Por lo tanto, una región promotora estaría operativamente asociada con un ácido nucleico que codifica para un polipéptido si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de la célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solamente en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden asociarse operativamente con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de la célula. En la presente se divulgan promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción.
Los expertos en la técnica conocen una variedad de regiones de control de la transcripción. Estos incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción que funcionan en células de vertebrados, tales como, pero no limitadas a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con el intrón-A), virus 40 de simio (el promotor temprano) y retrovirus (como el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen aquellas derivadas de genes de vertebrados como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovino y p-globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Otras regiones de control de la transcripción adecuadas incluyen promotores y potenciadores específicos del tejido, así como promotores inducibles por linfocinas (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas).
De manera similar, personas con habilidades ordinarias en la técnica conocen una variedad de elementos de control de la traducción. Estos incluyen, pero no se limitan a, sitios de unión a ribosomas, codones de inicio y terminación de la traducción y elementos derivados de picornavirus (en particular, un sitio de entrada a ribosomas interno, o IRES, también denominado secuencia CITE).
En otras realizaciones, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm), ARN de horquilla pequeña (ARNsh), ARN de interferencia pequeño (ARNip) o cualquier otro producto de ARN.
Las regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención pueden estar asociadas con regiones codificantes adicionales que codifican para péptidos secretores o señal, los cuales dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. De acuerdo con la hipótesis de la señal, las proteínas secretadas por células de mamíferos tienen un péptido señal o una secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena proteica en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Personas con habilidades ordinarias en la técnica son conscientes de que los polipéptidos secretados por células de vertebrados generalmente tienen un péptido señal fusionado en el N-terminal del polipéptido, el cual se escinde del polipéptido completo o "de longitud completa" para producir un polipéptido secretado o una forma "madura" del polipéptido. En determinadas realizaciones, el péptido señal nativo, por ejemplo, se utiliza un péptido señal de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que conserva la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está operativamente asociado con ella. Alternativamente, se puede utilizar un péptido señal de mamífero heterólogo, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder de tipo silvestre puede sustituirse con la secuencia líder del activador del plasminógeno tisular humano (TPA) o p-glucuronidasa de ratón.
Expresión:
El término "expresión", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un proceso mediante el cual un gen produce un bioquímico, por ejemplo, un ARN o polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula incluyendo, sin limitación, la desactivación del gen, así como tanto la expresión transitoria como la expresión estable. Incluye, sin limitación, la transcripción del gen en ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN de horquilla pequeña (ARNsh), ARN de interferencia pequeño (ARNip) o cualquier otro producto de ARN, y la traducción de dicho ARNm en polipéptido(s). Si el producto final deseado es un bioquímico, la expresión incluye la creación de ese bioquímico y cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico". Como se utiliza en la presente, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, ARN de interferencia pequeño (ARNip), un ARN mensajero producido por la transcripción de un gen o un polipéptido que se traduce a partir de una transcripción. Los productos génicos descritos en la presente incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glicosilación, la adición de lípidos, asociación con otras subunidades proteicas, escisión proteolítica y similares.
Se puede utilizar una variedad de sistemas vector/hospederos de expresión para contener y expresar secuencias de polinucleótidos. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN como bacteriófago recombinante, plásmido o cósmido; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales.
Para expresar el péptido, polipéptido o proteína de fusión (en lo sucesivo denominado "producto") en una célula hospedera, se puede utilizar un procedimiento como el siguiente. Un fragmento de restricción que contiene una secuencia de ADN que codifica para dicho producto puede clonarse en un plásmido recombinante apropiado que contiene un origen de replicación que funciona en la célula hospedera y un marcador seleccionable apropiado. El plásmido puede incluir un promotor para la expresión inducible del producto (por ejemplo, pTrc (Amann et al., Gene 69 (1988), 301 315.) y pETI Id (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif (1990), 6089. El plásmido recombinante puede introducirse en la célula hospedera, mediante ejemplo, electroporación y las células que contienen el plásmido recombinante pueden identificarse mediante la selección del marcador en el plásmido. La expresión del producto puede inducirse y detectarse en la célula hospedera utilizando un ensayo específico para el producto.
En algunas realizaciones, el ADN que codifica para el producto/péptido puede optimizarse para su expresión en la célula hospedera. Por ejemplo, el a Dn puede incluir codones para uno o más aminoácidos que son predominantes en la célula hospedera con respecto a otros codones para el mismo aminoácido.
Alternativamente, la expresión del producto puede realizarse mediante síntesisin vitrode la proteína en extractos libres de células que también son particularmente adecuados para la incorporación de aminoácidos modificados o no naturales para estudios funcionales; véase tambiéninfra.El usoin vitrode los sistemas de traducción puede tener ventajas sobre la expresión génicain vivocuando el producto sobreexpresado es tóxico para la célula hospedera, cuando el producto es insoluble o forma cuerpos de inclusión, o cuando la proteína sufre una rápida degradación proteolítica por proteasas intracelulares. Los sistemas de traducción libres de células más frecuentemente utilizados consisten en extractos de reticulocitos de conejo, germen de trigo yEscherichia coli.Todos se preparan como extractos crudos que contienen todos los componentes macromoleculares (ribosomas 70S u 80S, ARNt, aminoacil-ARNt sintetasas, factores de iniciación, elongación y terminación, etc.) necesarios para la traducción de ARN exógeno. Para garantizar una traducción eficiente, cada extracto debe complementarse con aminoácidos, fuentes de energía (ATP, GTP), sistemas regeneradores de energía (creatina fosfato y creatina fosfocinasa para los sistemas eucariotas, y fosfoenol piruvato y piruvato cinasa para el lisado deE. coli)y otros cofactores conocidos en la técnica (Mg2+, K+, etc.). Los sistemas de transcripción/traducción apropiados están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Promega Corporation, Roche Diagnostics y Ambion. es decir, Applied Biosystems (Anderson, C. et al., Meth. Enzimol. 101 (1983), 635-644; Arduengo, M. et al. (2007), The Role of Cell Free Rabbit Reticulocyte Expression Systems in Functional Proteomics in, Kudlicki, Katzen and Bennett eds., Cell-Free Expression Vol. 2007. Austin, Tx: Landes Bioscience, pp. 1-18; Chen and Zubay, Meth. Enzymol. 101 (1983), 674-90; Ezure et al., Biotechnol. Prog. 22 (2006), 1570-1577).
Células huésped:
En respecto a la presente invención, la célula hospedera puede ser cualquier célula procariota o eucariota, tal como una célula bacteriana, de insecto, fúngica, vegetal, animal o humana. Las células fúngicas preferibles son, por ejemplo, las del género Saccharomyces, en particular de la especie S.cerevisiae.El término "procariota" pretende incluir a todas las bacterias que pueden transformarse o transfectarse con moléculas de ADN o ARN para la expresión de un anticuerpo de la invención o las correspondientes cadenas de inmunoglobulina. Los hospederos procariotas pueden incluir bacterias gram negativas, así como bacterias gram positivas tales como, por ejemplo, E.coli, S. typhimurium, Serratia marcescensyBacillus subtilis.El término "eucariota" pretende incluir células de levadura, plantas superiores, insectos y preferiblemente de mamífero, más preferiblemente células HEK 293, NSO, CSO y CHO. Dependiendo del hospedero empleado en un procedimiento de producción recombinante, los anticuerpos o las cadenas de inmunoglobulina codificadas por el polinucleótido de la presente invención pueden estar glicosilados o no glicosilados.
Los anticuerpos de la invención o las cadenas de inmunoglobulina correspondientes también pueden incluir un residuo aminoácido de metionina inicial. Se puede utilizar un polinucleótido de la invención para transformar o transfectar al hospedero utilizando cualquiera de las técnicas comúnmente conocidas por las personas de habilidad ordinaria en la técnica. Además, los métodos para preparar genes fusionados, unidos operativamente y expresarlos en, por ejemplo, células de mamífero y bacterias son bien conocidos en la técnica (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Las construcciones genéticas y los métodos descritos allí se pueden utilizar para la expresión del anticuerpo de la invención o las correspondientes cadenas de inmunoglobulina en hospederos eucariotas o procariotas. En general, se utilizan vectores de expresión que contienen secuencias promotoras que facilitan la transcripción eficaz del polinucleótido insertado en relación con el hospedero. El vector de expresión normalmente contiene un origen de replicación, un promotor y un terminador, así como genes específicos que son capaces de proporcionar una selección fenotípica de las células transformadas. Las células fuente adecuadas para las secuencias de ADN y las células huésped para la expresión y secreción de inmunoglobulinas se pueden obtener de varias fuentes, tales como el American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas," Fifth edition (1985) Rockville, Maryland, EE.UU). Además, se pueden utilizar animales transgénicos, preferiblemente mamíferos, que comprenden células de la invención para la producción a gran escala del anticuerpo de la invención.
Los hospederos transformados pueden crecer en fermentadores y cultivarse de acuerdo con las técnicas conocidas en la técnica para lograr un crecimiento celular óptimo. Una vez expresados, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligeras y pesadas individuales u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención, pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares; véase, Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, NY (1982). El anticuerpo o su(s) cadena(s) de inmunoglobulina correspondientes de la invención pueden aislarse luego del medio de crecimiento, lisados celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y la purificación de, por ejemplo, los anticuerpos o cadenas de inmunoglobulina expresados de forma recombinante de la invención pueden ser por cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como aquellas que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, por ejemplo, contra la región constante del anticuerpo de la invención. Será evidente para los expertos en la técnica que los anticuerpos de la invención se pueden acoplar además a otras fracciones para, por ejemplo, focalización de fármacos y aplicaciones de imagenología. Dicho acoplamiento se puede realizar químicamente después de la expresión del anticuerpo o antígeno en el sitio de unión o el producto de acoplamiento se puede diseñar en el anticuerpo o antígeno de la invención a nivel del ADN. Luego, los ADNs se expresan en un sistema hospedero adecuado y las proteínas expresadas se recolectan y renaturalizan, si es necesario.
Se prefieren inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos alrededor de 90 a 95% de homogeneidad, y más preferiblemente 98 a 99% o más de homogeneidad, para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad según se desee, los anticuerpos se pueden entonces utilizar terapéuticamente (incluso extracorporalmente) o para desarrollar y realizar procedimientos de ensayo.
La presente invención también implica un método para producir células capaces de expresar un anticuerpo de la invención o su(s) cadena(s) de inmunoglobulina correspondientes que comprenden células genéticamente diseñadas con el polinucleótido o con el vector de la invención. Las células que se pueden obtener mediante el método de la invención se pueden utilizar, por ejemplo, para probar la interacción del anticuerpo de la invención con su antígeno.
Ensayos de ELISA:
Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para diversos antígenos incluyen los basados en colorimetría, quimioluminiscencia y fluorometría. Los ELISAs se han aplicado con éxito en la determinación de bajas cantidades de fármacos y otros componentes antigénicos en muestras de plasma y orina, no implican pasos de extracción y son sencillos de realizar. Los ELISAs para la detección de anticuerpos a antígenos proteicos suelen utilizar la unión directa de péptidos sintéticos cortos a la superficie plástica de una placa de microtitulación. Los péptidos son, en general, muy puros debido a su naturaleza sintética y a métodos eficientes de purificación mediante cromatografía líquida de alta resolución. Un inconveniente de los péptidos cortos es que normalmente representan epítopes lineales, pero no conformacionales o discontinuos. Para presentar epítopes conformacionales, se utilizan ya sea péptidos largos o la proteína nativa completa. La unión directa de los antígenos proteicos al soporte de poliestireno hidrofóbico de la placa puede provocar la desnaturalización parcial o total de la proteína unida y la pérdida de los epítopes conformacionales. Recubrir la placa con un anticuerpo, que media la inmovilización (ELISA de captura) de los antígenos, puede evitar este efecto.
Sin embargo, con frecuencia, las proteínas recombinantes sobreexpresadas son insolubles y requieren purificación bajo condiciones desnaturalizantes y renaturalización, cuando se van a analizar anticuerpos contra epítopes conformacionales. Véase, por ejemplo, Solicitud de patente EE.UU No- 20030044870 para un ELISA genérico utilizando proteínas de fusión recombinantes como proteínas de cubierta.
Moléculas de unión:
Una "molécula de unión" tal como se utiliza en el contexto de la presente invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de los mismos.
Anticuerpos:
Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan indistintamente en la presente. Un anticuerpo o una inmunoglobulina es una molécula que se une a una molécula de interés de la presente invención como se define anteriormente y a continuación, que comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada, y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras básicas de las inmunoglobulinas en los sistemas vertebrados se entienden relativamente bien; véase, por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988). Los términos "se une" y "reconoce" se utilizan indistintamente con respecto a la afinidad de unión de las moléculas de unión de la presente invención, por ejemplo, anticuerpos.
Cualquier anticuerpo o fragmento de inmunoglobulina que contenga estructura suficiente para unirse específicamente a las moléculas de interés, como se definen anteriormente y a continuación, se denomina indistintamente en la presente como "molécula de unión", "fragmento de unión" o "fragmento inmunoespecífico".
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, fragmentos inmunoespecíficos, variantes o derivados de los mismos de la invención incluyen anticuerpos humanos monoclonales y anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos de unión a epítope, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fvs unidos por puentes disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden el dominio Vl y Vh y fragmentos derivados de los mismos. Las moléculas CsFv son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Patente US 5,892,019. Como se discutirá con más detalle más adelante, el término "inmunoglobulina" comprende varias clases amplias de polipéptidos que pueden distinguirse bioquímicamente. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (y, m, a, 8, £) con algunas subclases entre ellas, (por ejemplo, Y1-Y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos) por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las moléculas de inmunoglobulina o anticuerpo de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo,IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, etc.) o subclase de la molécula de inmunoglobulina. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la técnica a la vista de la presente divulgación y, en consecuencia, están dentro del alcance de la presente invención. Todas las clases de inmunoglobulinas están claramente dentro del alcance de la presente invención; la siguiente discusión se dirigirá generalmente a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, una molécula de inmunoglobulina estándar comprende dos polipéptidos de cadena ligera idénticos con un peso molecular de aproximadamente 23,000 Dáltones y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos con un peso molecular de 53,000 a 70,000. Las cuatro cadenas normalmente están unidas mediante enlaces disulfuro en una configuración "Y" en el que las cadenas ligeras rodean las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continúan a través de la región variable. Como se desprende de la clasificación del anticuerpo anti-IL-22 ejemplar de la presente invención 30G1 enlistado en la Tabla 1 anterior, de la clase IgG1 y el anticuerpo comparativo 35G11 de la clase IgG4, los subtipos dominantes de los anticuerpos de la presente invención parecen ser IgG1 e IgG4, lo que posiblemente implica respuestas regulatorias de células T y/o epitelios en su inicio en estos estados de deficiencia de AlRE. Estos hallazgos se ven confirmados por la clasificación de los autoanticuerpos correspondientes encontrados en los ratones con deficiencia de AlRE descritos por Karner et al., en Clin. Exp. Inmunol. (2012); doi: 10.1111/cei.12024. Por consiguiente, en una realización preferida de la presente invención, los anticuerpos humanos de la presente invención son de tipo IgG, en particular IgG1 o IgG4.
Estructura de IgG:
Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (<k>, A). Cada clase de cadena pesada puede estar unida con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligera y pesada están unidas covalentemente entre sí, y las porciones de la "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan mediante hibridomas, células B o células huésped genéticamente diseñadas. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un N-terminal en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el C-terminal en la parte inferior de cada cadena.
Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se utilizan funcionalmente. En este sentido, se apreciará que los dominios variables tanto de las porciones de la cadena ligera (Vl) como la pesada (Vh) determinan el reconocimiento y la especificidad del antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor Fc, unión al complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se vuelven más distales del sitio de unión al antígeno o del amino terminal del anticuerpo. La porción Nterminal es una región variable y la porción C-terminal es una región constante; los dominios CH3 y CL en realidad comprenden el carboxilo terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente.
Como se indicó anteriormente, la región variable permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a epítopes en antígenos. Esto es, el dominio V<l>y el dominio V<h>, o subconjunto de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión al antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternario forma el sitio de unión al antígeno presente al final de cada brazo de la Y Más específicamente, el sitio de unión al antígeno está definido por tres CDRs en cada una de las cadenas V<h>y V<l>. Cualquier anticuerpo o fragmento de inmunoglobulina que contenga estructura suficiente para unirse específicamente a una molécula de interés de la presente invención se denomina en la presente indistintamente como un "fragmento de unión" o "fragmento inmunoespecífico".
En los anticuerpos que ocurren naturalmente, un anticuerpo comprende seis regiones hipervariables, a veces denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDRs" presentes en cada dominio de unión al antígeno, que son secuencias cortas y no contiguas de aminoácidos que están posicionados específicamente para formar el dominio de unión al antígeno a medida que el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un ambiente acuoso. Las "CDRs" están flanqueadas por cuatro regiones "marco" o "FRs" relativamente conservadas que muestran menos variabilidad intermolecular. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de hoja p y las CDRs forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de hoja p. Por lo tanto, las regiones marco actúan para formar un andamio que permite posicionar a las CDRs en la orientación correcta mediante interacciones no covalentes inter-cadenas. El dominio de unión al antígeno formado por las CDRs posicionadas define una superficie complementaria al epítope del antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítope cognado. Los aminoácidos que comprenden las CDRs y las regiones marco, respectivamente, pueden identificarse fácilmente para cualquier región variable de cadena pesada o ligera dada por una persona con hábilidades ordinarias en la técnica, ya que se han definido con precisión; véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E., et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, (1983); y Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917.
En el caso de que existan dos o más definiciones de un término que se utiliza y/o se acepta en la técnica, la definición del término tal como se utiliza en la presente pretende incluir todos esos significados, a menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso del término "región determinante de complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación de antígenos no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de polipéptidos de cadena tanto pesada como ligera. Esta región en particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services. "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917, donde las definiciones incluyen superposiciones o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. Sin embargo, se pretende que la aplicación de cualquiera de las definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo esté dentro del alcance del término como se define y utiliza en la presente. Los residuos de aminoácidos apropiados que abarcan las CDRs definidas por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a continuación en la Tabla 2 como una comparación. Los números exactos de residuos que abarcan una CDR particular van a variar dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprenden una región hipervariable o CDR particular del subtipo de anticuerpo IgG humano dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.
Tabla 2: Definiciones de CDR1
Kabatet al.También definió un sistema de numeración para secuencias de dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Una persona con habilidades ordinarias en la técnica puede asignar sin ambigüedades este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la secuencia misma. Como se utiliza en la presente, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services., "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones de residuos de aminoácidos específicos en un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo de la presente invención son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, que sin embargo es teórico y puede no aplicarse igualmente a cada anticuerpo de la presente invención.
Por ejemplo, dependiendo de la posición de la primer CDR, las siguientes CDRs podrían desplazarse en cualquier dirección.
En una realización, el anticuerpo de la presente invención no es IgM o un derivado del mismo con una estructura pentavalente. En particular, en aplicaciones específicas de la presente invención, especialmente uso terapéutico, las IgM son menos útiles que IgG y otros anticuerpos bivalentes o moléculas de unión correspondientes ya que las IgM debido a su estructura pentavalente y falta de maduración de afinidad a menudo muestran reactividades cruzadas inespecíficas y muy baja afinidad.
En una realización particularmente preferida, el anticuerpo de la presente invención no es un anticuerpo policlonal, es decir, consiste sustancialmente en una especie de anticuerpo particular en lugar de ser una mezcla obtenida de una muestra de inmunoglobulina plasmática.
Fragmentos de anticuerpos:
Los fragmentos de anticuerpos, incluidos los anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender la(s) región(es) variable(s) solas o en combinación con la totalidad o una parte de lo siguiente: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención fragmentos que se unen a una molécula de interés de la presente invención, comprendiendo dichos fragmentos cualquier combinación de región(es) variable(s) con una región bisagra, y dominios CH1, CH2 y CH3.
En una realización particularmente preferida de la presente invención, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos que ocurren naturalmente o fragmentos de unión, derivados y variantes de los mismos clonados de sujetos humanos, que se unen específicamente a IL-22, como se define en detalle a continuación, en las reivindicaciones y se muestra en los Ejemplos.
Opcionalmente, la región marco del anticuerpo humano se alinea y se adopta de acuerdo con las secuencias de la región variable de la línea germinal humana pertinentes en la base de datos; véase, por ejemplo, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) alojado en MRC Center for Protein Engineering (Cambridge, Reino Unido). Por ejemplo, los aminoácidos que se considera que se desvían potencialmente de la verdadera secuencia de la línea germinal podrían deberse a las secuencias del cebador de PCR incorporadas durante el proceso de clonación. Así, de acuerdo con la presente invención los términos "anticuerpo monoclonal humano", "autoanticuerpo monoclonal humano", "anticuerpo humano" y similares se utilizan para indicar una molécula de unión que se une a una molécula de interés de la presente invención, que es de origen humano, es decir, que se ha aislado de una célula humana tal como una célula B o hibridoma del mismo o cuyo ADNc que se ha clonado directamente a partir de ARNm de una célula humana, por ejemplo, una célula B de memoria humana. Un anticuerpo humano sigue siendo "humano" incluso si se realizan sustituciones de aminoácidos en el anticuerpo, por ejemplo, para mejorar las características de unión.
Los anticuerpos derivados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, tal como se describeinfray, por ejemplo, en la Patente US No. 5,939,598 de Kucherlapati et al., se indican como anticuerpos tipo humano para distinguirlos de los anticuerpos verdaderamente humanos de la presente invención.
Por ejemplo, el apareamiento de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos tipo humano, como los anticuerpos sintéticos y semisintéticos típicamente aislados de la presentación en fagos, no refleja necesariamente el apareamiento original tal como ocurrió en la célula B humana original. Por consiguiente, los fragmentos Fab y scFv obtenidos de bibliotecas de expresión recombinantes como se utilizan comúnmente en la técnica previa pueden considerarse como artificiales con todos los posibles efectos asociados sobre la inmunogenicidad y la estabilidad.
Por el contrario, la presente invención proporciona anticuerpos aislados madurados por afinidad de sujetos humanos seleccionados, que se caracterizan por su utilidad terapéutica y su tolerancia en el hombre.
Fragmentos de anticuerpos:
Como se utiliza en la presente, el término "porción de la cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina. Un polipéptido que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, un dominio bisagra (por ejemplo, región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3, o una variante o fragmento de los mismos. Por ejemplo, un polipéptido de unión para uso en la invención puede comprender una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra y un dominio CH2; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra y un dominio CH3, o una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En otra realización, un polipéptido de la invención comprende una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH3. Además, un polipéptido de unión para uso en la invención puede carecer de al menos una porción de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2). Como se estableció anteriormente, una persona con habilidades ordinarias en la técnica entenderá que estos dominios (por ejemplo, las porciones de la cadena pesada) pueden modificarse de modo que varíen en la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina que ocurre naturalmente.
En ciertos anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente, las porciones de la cadena pesada de una cadena polipeptídica de un multímero son idénticas a las de una segunda cadena polipeptídica del multímero. Alternativamente, los monómeros de la invención que contienen porciones de la cadena pesada no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un sitio de unión a diana diferente, formando, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o diacuerpo
En otra realización, los anticuerpos, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos divulgados en la presente están compuestos de una única cadena polipeptídica tal como scFv y deben expresarse intracelularmente (intracuerpos) para posibles aplicaciones terapéuticas y diagnósticasin vivo.
Las porciones de cadena pesada de un polipéptido de unión para uso en los métodos de diagnóstico y tratamiento divulgados en la presente pueden derivar de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una porción de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH1 derivado de una molécula de IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una región bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4.
Por tanto, como también se ejemplifica en los Ejemplos, en una realización la región constante del anticuerpo de la presente invención o parte del mismo, en particular el dominio CH2 y/o CH3, pero opcionalmente también el dominio CH1 es heterólogo a la región variable del anticuerpo nativo monoclonal humano aislado de acuerdo con el método de la presente invención. En este contexto, la(s) región(es) constante(s) heteróloga(s) son preferiblemente de origen humano en el caso de aplicaciones terapéuticas del anticuerpo de la presente invención, pero también podrían ser, por ejemplo, de origen de roedor en el caso de estudios con animales; véase también los Ejemplos.
Como se utiliza en la presente, el término "porción de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. Preferiblemente, la porción de la cadena ligera comprende al menos uno de una Vl o dominio CL.
Como se indicó anteriormente, las estructuras de las subunidades y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diversas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Tal como se utiliza en la presente, el término "dominio V<h>" incluye el dominio variable amino terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y el término "dominio CH1" incluye el primer dominio de región constante (más amino terminal) de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio CH1 es adyacente al dominio Vh y es amino terminal a la región bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina.
Como se utiliza en la presente, el término "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde alrededor del residuo 244 al residuo 360 de un anticuerpo utilizando esquemas de numeración convencionales (residuos 244 a 360, sistema de numeración Kabat; y residuos 231- 340, sistema de numeración de la UE; véase Kabat EAet al. op. cit).El dominio CH2 es único porque no está estrechamente apareado con otro dominio. Más bien, se interponen dos cadenas de carbohidratos ramificadas N-unidas entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 hasta el C-terminal de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 residuos.
Como se utiliza en la presente, el término "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 con el dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, lo que permite que las dos regiones de unión al antígeno N-terminal se muevan de forma independiente. Las regiones bisagra se pueden subdividir en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior; véase Roux et al., J. Immunol. 161 (1998), 4083.
Tal como se utiliza en la presente, el término "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace disulfuro o un puente con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas de IgG que ocurren naturalmente, las regiones CH1 y CL están unidas mediante un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas mediante dos enlaces disulfuro en las posiciones correspondientes a 239 y 242 utilizando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración de la UE).
Tal como se utilizan en la presente, los términos "unido", "fusionado" o "fusión" se utilizan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes más, por cualquier medio, incluida la conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión en marco" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos (ORFs) de polinucleótidos para formar un ORF continuo más largo, de una manera que mantenga el marco de lectura traslacional correcto de los ORFs originales. Por lo tanto, una proteína de fusión recombinante es una proteína sencilla que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORFs originales (cuyos segmentos normalmente no están unidos de esa manera en la naturaleza). Aunque el marco de lectura se hace continuo a lo largo de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar separados física o espacialmente mediante, por ejemplo, una secuencia enlazadora en marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican para las CDRs de una región variable de inmunoglobulina pueden fusionarse, en marco, pero estar separados por un polinucleótido que codifica para al menos una región marco de inmunoglobulina o regiones CDR adicionales, siempre que las CDRs "fusionadas" estén cotraducidas. como parte de un polipéptido continuo.
Características de unión:
Por "unión" o "reconocimiento", utilizados indistintamente en la presente, generalmente se entiende que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo se une a un epítope predeterminado a través de su dominio de unión al antígeno, y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión al antígeno y el epítope. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un epítope cuando se une a ese epítope, a través de su dominio de unión al antígeno más fácilmente que lo haría a un epítope aleatorio y no relacionado. El término "especificidad" se utiliza en la presente para calificar la afinidad relativa por la cual un determinado anticuerpo se une a un determinado epítope. Por ejemplo, se puede considerar que el anticuerpo "A" tiene una mayor especificidad para un epítope determinado que el anticuerpo "B", o se puede decir que el anticuerpo "A" se une al epítope "C" con una especificidad mayor que la que tiene para el epítope relacionado "D". Los epítopes no relacionados suelen formar parte de un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína o cualquier otro polipéptido específico), que puede usarse para la estimación de la especificidad de unión de una molécula de unión determinada. En este respecto, el término "unión específica" se refiere a la unión de un anticuerpo a un antígeno predeterminado con una Kd que es al menos dos veces menor que su Kd para la unión a un antígeno inespecífico. El término unión "altamente específica" como se utiliza en la presente significa que la K<d>relativa del anticuerpo para el epítope diana específico es al menos 10 veces menor que la K<d>para unir ese anticuerpo a otros ligandos.
Cuando está presente, el término "características de unión inmunológica" u otras características de unión de un anticuerpo con un antígeno, en todas sus formas gramaticales, se refiere a la especificidad, afinidad, reactividad cruzada y otras características de unión de un anticuerpo.
Por "unión preferencial", se entiende que la molécula de unión, por ejemplo, el anticuerpo se une específicamente a un epítope más fácilmente que a un epítope relacionado, similar, homólogo o análogo. Por tanto, un anticuerpo que "se une preferentemente" a un epítope dado se uniría más probablemente a ese epítope que a un epítope relacionado, incluso aunque dicho anticuerpo pueda reaccionar de forma cruzada con el epítope relacionado.
A modo de ejemplo no limitante, una molécula de unión, por ejemplo, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epítope preferentemente si se une a dicho primer epítope con una constante de disociación (K<d>) que es menor que la K<d>del anticuerpo para el segundo epítope. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer antígeno preferentemente si se une al primer epítope con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la K<d>del anticuerpo para el segundo epítope. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epítope preferentemente si se une al primer epítope con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la Kd del anticuerpo para el segundo epítope.
En otro ejemplo no limitante, una molécula de unión, por ejemplo, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epítope preferentemente si se une al primer epítope con una tasa de apagado (k(apagado)) que es menor que la k(apagado) del anticuerpo para el segundo epítope. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epítope preferentemente si se une al primer epítope con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la k(apagado) del anticuerpo para el segundo epítope. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epítope preferentemente si se une al primer epítope con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la k(apagado) del anticuerpo para el segundo epítope.
Una molécula de unión, por ejemplo, se puede decir que un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado divulgado en la presente se une a una molécula de interés de la presente invención, un fragmento o variante del mismos con una tasa de apagado (k(apagado)) menor o igual a 5 * 10-2 seg-1, 10-2 seg-1, 5 * 10-3 seg-1 o 10-3 seg-1. Más preferiblemente, se puede decir que un anticuerpo de la invención se une a una molécula de interés de la presente invención o a un fragmento o variante de la misma con una tasa de apagado (k(apagado)) menor o igual a 5 x 10-4 seg-1, 10-4 seg-1, 5 * 10-5 seg-1, o 10-5 seg-15*10-6 seg-1, 10-6 seg-1, 5 * 10-7 seg-1 o 10-7 seg-1.
Una molécula de unión, por ejemplo, se puede decir que un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, variante o derivado divulgado en la presente se une a una molécula de interés de la presente invención o a un fragmento o variante de la misma con una tasa de encendido (k(encendido)) mayor o igual a 103 M-1 seg-1, 5 * 103 M-1 seg1, 104 M-1 seg-1 o 5 * 104 M-1 seg1. Más preferiblemente, se puede decir que un anticuerpo de la invención se une a una molécula de interés de la presente invención o a un fragmento o variante de la misma con una tasa de encendido (k(encendido)) mayor o igual a 105 M-1 seg-1, 5 * 105 M-1 seg-1, 106 M-1 seg-1, o 5 * 106 M-1 seg-1 o 107 M-1 seg-1.
Una molécula de unión, por ejemplo, se dice que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia a un epítope determinado si se une preferentemente a ese epítope hasta el punto de bloquear, hasta cierto grado, la unión del anticuerpo de referencia con el epítope. La inhibición competitiva puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos de ELISA de competición. Se puede decir que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epítope dado en al menos 90%, al menos 80%, al menos 70%, al menos 60% o al menos 50%.
Como se utiliza en la presente, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de unión de un epítope individual con la CDR de una molécula de unión, por ejemplo, una molécula de inmunoglobulina; véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988) en las páginas 27-28. Como se utiliza en la presente, el término "avidez" se refiere a la estabilidad general del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, es decir, la fuerza de combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulinas con el antígeno; véase, por ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez está relacionada tanto con la afinidad de las moléculas de inmunoglobulina individuales en la población con epítopes específicos, y también con las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítope altamente repetitiva, como un polímero, sería una de gran avidez. La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antígeno se puede determinar experimentalmente utilizando cualquier método adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental Immunology, Paul, WE, Ed., Raven Press New York, NY (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company Nueva York, NY (1992), y los métodos descritos en el mismo. Las técnicas generales para medir la afinidad de un anticuerpo por un antígeno incluyen ELISA, RIA y resonancia de plasmón superficial. La afinidad medida de una interacción anticuerpo-antígeno particular puede variar si se mide en diferentes condiciones, por ejemplo, concentración de sal, pH. Por tanto, las mediciones de la afinidad y otros parámetros de unión al antígeno, por ejemplo, K<d>, IC50, se elaboran preferentemente con soluciones estandarizadas de anticuerpos y antígenos y un tampón estandarizado.
Moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Tal como se utiliza en la presente, el término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, específico para un antígeno, de reaccionar con un segundo antígeno; una medida de relación entre dos sustancias antigénicas diferentes. Por tanto, un anticuerpo tiene reactividad cruzada si se une a un epítope distinto de aquel que indujo su formación. El epítope de reactividad cruzada generalmente contiene muchas de las mismas características estructurales complementarias que el epítope inductor y, en algunos casos, puede encajar mejor que el original.
Por ejemplo, ciertos anticuerpos tienen cierto grado de reactividad cruzada, ya que se unen a epítopes relacionados, pero no idénticos, por ejemplo, epítopes con al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55%, y al menos 50% de identidad (calculada utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente) con un epítope de referencia. Se puede decir que un anticuerpo tiene poca o ninguna reactividad cruzada si no se une a epítopes con menos del 95%, menos del 90%, menos del 85%, menos del 80%, menos del 75%, menos del 70%, menos del 65%, menos del 60%, menos del 55% y menos del 50% de identidad (calculada utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente) con un epítope de referencia. Un anticuerpo puede considerarse "altamente específico" para un determinado epítope, si no se une a ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de ese epítope.
Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a una molécula de interés de la presente invención. Las afinidades de unión preferibles incluyen aquellas con una constante de disociación o K<d>menor que 5 * 10-2 M, 10-2 M, 5 * 10-3 M, 10-3 M, 5 * 10-4 M, 10-4 M, 5x *10-5 M, 10-5 M, 5 * 10-6 M, 10-6 M, 5 * 10-7 M, 10-7 M, 5 * 10-8 M, 10-8 M, 5 * 10-9 M, 10-9 M, 5 * 10-10 M, 10-10 M, 5 * 10-11 M, 10-11 M, 5 * 10-12 M, 10-12 M, 5 * 10-13 M, 10-13 M, 5 * 10-14 M, 10-14 M, 5 * 10-15 M, o 10-15 M. Normalmente, el anticuerpo se une con una constante de disociación (K<d>) de 10-7 M o menos a su antígeno predeterminado. Preferiblemente, el anticuerpo se une a su antígeno cognado con una constante de disociación (Kd) de 10-9 M o menos y aún más preferiblemente con una constante de disociación (K<d>) de 10-11 M o menos.
Modificaciones de anticuerpos:
La inmunoglobulina o sus ADNc codificantes pueden modificarse adicionalmente. Por tanto, en una realización adicional el método de la presente invención comprende uno cualquiera de los pasos de producir un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento Fab, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo de fusión, un anticuerpo marcado o un análogo de uno cualquiera de estos. Los métodos correspondientes son conocidos por el experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSHPress, Cold Spring Harbor, 1988. Como se discutió anteriormente, el anticuerpo de la invención puede existir en una variedad de formas además de anticuerpos completos; incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)2, así como en cadenas sencillas; véase, por ejemplo, aplicación internacional WO88/09344.
Los anticuerpos de la presente invención o su(s) cadena(s) de inmunoglobulina correspondiente(s) se pueden modificar adicionalmente utilizando técnicas convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo, utilizando deleciones, inserciones, sustituciones, adiciones, y/o recombinaciones de aminoácidos y/o cualquier otra modificación conocida en la técnica, ya sea sola o en combinación. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para introducir dichas modificaciones en la secuencia de ADN subyacente a la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina; véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). Las modificaciones del anticuerpo de la invención incluyen derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluidas modificaciones de la cadena lateral, modificaciones del esqueleto y modificaciones en los N- y C-terminales incluyendo acetilación, hidroxilación, metilación, amidación y la unión de fracciones de carbohidratos o lípidos, cofactores y similares. Asimismo, la presente invención abarca la producción de proteínas quiméricas que comprenden el anticuerpo descrito o algún fragmento del mismo en el amino terminal fusionado a una molécula heteróloga tal como un marcador o un fármaco. Las moléculas de unión al antígeno generadas de esta manera pueden utilizarse para la localización de fármacos a células que expresan las estructuras de superficie apropiadas de la célula y el tejido enfermos, respectivamente. Este direccionamiento y unión a las células podría ser útil para la administración de agentes terapéutica o diagnósticamente activos y la terapia génica/administración de genes. Las moléculas/partículas con un anticuerpo de la invención se unirían específicamente a células/tejidos que expresan el antígeno particular de interés y, por lo tanto, podrían tener uso diagnóstico y terapéutico.
Enfermedades y trastornos:
A menos que se indique lo contrario, los términos "trastorno" y "enfermedad" se utilizan indistintamente en la presente.
El término "trastorno autoinmune" como se utiliza en la presente es una enfermedad o trastorno que surge de y está dirigido contra los propios tejidos u órganos de un individuo o un cosegregado o manifestación de los mismos o una condición resultante de los mismos. Las enfermedades autoinmunes son causadas principalmente por la desregulación de las respuestas inmunes adaptativas y se forman autoanticuerpos o células T autorreactivas contra estructuras propias. Casi todas las enfermedades autoinmunes también tienen un componente inflamatorio. Las enfermedades autoinflamatorias son principalmente inflamatorias y algunas enfermedades autoinflamatorias clásicas son causadas por defectos genéticos en las vías inflamatorias innatas. En las enfermedades autoinflamatorias no se encuentran células T autorreactivas ni autoanticuerpos. En muchos de estos trastornos autoinmunes y autoinflamatorios, pueden existir una serie de marcadores clínicos y de laboratorio, que incluyen, pero no se limitan a, hipergammaglobulinemia, niveles elevados de autoanticuerpos, depósitos de complejos antígeno-anticuerpo en los tejidos, beneficio de los tratamientos con corticosteroides o inmunosupresores y agregados linfoides celulares en los tejidos afectados. Sin limitarse a una teoría sobre el trastorno autoinmune mediado por células B, se cree que las células B demuestran un efecto patogénico en las enfermedades autoinmunes humanas a través de una multitud de vías mecanicistas, incluyendo producción de autoanticuerpos, formación de complejos inmunes, activación dendrítica y de células T, síntesis de citocinas, liberación directa de quimiocinas y provisión de nido para la neo-linfogénesis ectópica. Cada una de estas vías puede participar en diferentes grados en la patología de las enfermedades autoinmunes.
Tal como se utiliza en la presente, un "trastorno autoinmune" puede ser una enfermedad específica de un órgano (es decir, la respuesta inmune se dirige específicamente contra un sistema de órganos tal y como el sistema endocrino, el sistema hematopoyético, la piel, el sistema cardiopulmonar, los sistemas gastrointestinales y hepáticos, el sistema renal, la tiroides, los oídos, el sistema neuromuscular, el sistema nervioso central, etc.) o una enfermedad sistémica que puede afectar múltiples sistemas de órganos (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide, polimiositis, síndrome de poliendocrinopatía autoinmune tipo 1 (APS1)/poliendocrinopatía autoinmune-candidiasisdistrofia ectodérmica (APECED) etc. Tales enfermedades preferibles incluyen trastornos reumatológicos autoinmunes (tales como, por ejemplo, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, esclerodermia, lupus tal como SLE y nefritis lúpica, polimiositis/dermatomiositis, crioglobulinemia, síndrome de anticuerpo antifosfolípido y artritis psoriásica), trastornos autoinmunes gastrointestinales y hepáticos (como, por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), gastritis autoinmune y anemia perniciosa, hepatitis autoinmune, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria y enfermedad celíaca), vasculitis (como, por ejemplo, vasculitis ANCA negativa y vasculitis asociada a ANCA, incluyendo vasculitis de Churg-Strauss, granulomatosis de Wegener y poliangitis microscópica), trastornos neurológicos autoinmunes (tales como, por ejemplo, esclerosis múltiple (MS), síndrome de opsoclono mioclono, miastenia gravis, neuromielitis óptica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y polineuropatías autoinmunes), trastornos renales (tales como, por ejemplo, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture y enfermedad de Berger), trastornos dermatológicos autoinmunes (tales como, por ejemplo, psoriasis, dermatitis atópica, urticaria, enfermedades del grupo del pénfigo, enfermedades penfigoides ampollosas y lupus eritematoso cutáneo), trastornos hematológicos (tales como, por ejemplo, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, púrpura post-transfusión y anemia hemolítica autoinmune), aterosclerosis, uveítis, enfermedades auditivas autoinmunes (tales como, por ejemplo, enfermedad del oído interno y pérdida de audición), enfermedad de Behcet, Síndrome de Raynaud, trasplante de órgano y trastornos endocrinos autoinmunes (como, por ejemplo, enfermedades autoinmunes relacionadas con la diabetes, como la diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM), enfermedad de Addison, enfermedad autoinmune de la tiroides (por ejemplo, Enfermedad de Graves y tiroiditis)) y enfermedades que afectan la generación de autoinmunidad como el síndrome de poliendocrinopatía autoinmune tipo 1 (APS1)/poliendocrinopatía autoinmune-candidiasis-distrofia ectodérmica (APECED), Miastenia gravis (MG/Timoma). Las enfermedades preferibles incluyen, por ejemplo, RA, IBD, incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, vasculitis asociada a ANCA, lupus, MS, síndrome de Sjogren, enfermedad de Graves, IDDM, anemia perniciosa, tiroiditis y glomerulonefritis, y APS 1. Aún más preferiblemente son RA, IBD, lupus y MS, y más preferiblemente RA, IBD, y el más preferible RA.
Los ejemplos específicos de otros trastornos autoinmunes como se definen en la presente, que en algunos casos abarcan los enumerados anteriormente, incluyen, pero no se limitan a, artritis (aguda y crónica, artritis reumatoide incluyendo artritis reumatoide de inicio juvenil y etapas tales como sinovitis reumatoide, gota o artritis gotosa, artritis inmunológica aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis inducida por colágeno tipo II, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriásica, enfermedad de Still, artritis vertebral, osteoartritis, artritis crónica progresiva, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva, artritis menopáusica, artritis por depleción de estrógeno y espondilitis anquilosante/espondilitis reumatoide), enfermedad linfoproliferativa autoinmune, enfermedades inflamatorias hiperproliferativas de la piel, psoriasis como psoriasis en placas, psoriasis en gota, psoriasis pustulosa y psoriasis de las uñas, atopia incluyendo enfermedades atópicas tales como fiebre del heno y síndrome de Job, dermatitis atópica, dermatitis alérgica y tóxica de contacto (aguda y crónica), dermatitis exfoliativa, dermatitis alérgica, urticaria, dermatitis herpetiforme, dermatitis numular, dermatitis seborreica, dermatitis no específica, síndrome de hiper IgM ligado a X, enfermedades inflamatorias intraoculares alérgicas, urticarias como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopática crónica, urticaria por frío, incluida la urticaria autoinmune crónica, miositis, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrólisis epidérmica tóxica, esclerodermia (incluida local y formas sistémicas de esclerodermia), esclerosis múltiple (MS), como MS espino-óptica, MS primaria progresiva (PPMS) y MS remitente recurrente (RRMS), esclerosis sistémica progresiva, aterosclerosis, arteriesclerosis, esclerosis diseminada, esclerosis atáxica, neuromielitis óptica (NMO), enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas autoinmunemente, inflamación gastrointestinal, colitis tal como colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colágena, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante y colitis transmural y enfermedad inflamatoria intestinal autoinmune), inflamación intestinal, pioderma gangrenoso, eritema nudoso, colangitis esclerosante primaria, síndrome de dificultad respiratoria, incluido síndrome de dificultad respiratoria agudo (ARDS), o de adulto, meningitis, inflamación de toda o parte de la úvea, iritis, coroiditis, trastornos hematológicos autoinmunes, enfermedad de injerto contra hospedero, angioedema como el angioedema hereditario, daño de los nervios craneales como en la meningitis, herpes gestacional, enfermedades del grupo penfigoide, enfermedad del grupo pénfigo, gestationis, prurito escrotal, insuficiencia ovárica prematura autoinmune, pérdida repentina de la audición debido a una enfermedad autoinmune, enfermedades mediadas por IgE como anafilaxia y rinitis alérgica y atópica, diversas formas de asma, Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (COPD), encefalitis como la encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbica y/o del tronco encefálico, uveítis, tal como uveítis anterior, uveítis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis faco antigénica, uveítis posterior o uveítis autoinmune, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis crónica o aguda como la GN primaria, GN inmunomediada, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN proliferativa membranosa o membranosa (MPGN), incluidas las de tipo I y II, y GN de progresión rápida (RPGN), nefritis proliferativa, insuficiencia endocrina poliglandular autoinmune, balanitis incluida balanitis circunscrita plasmocelular, balanopostitis, eritema anular centrífugo, eritema discrómico permanente, eritema multiforme, granuloma anular, liquen nítido, liquen escleroso y atrófico, liquen simple crónico, liquen espinuloso, liquen plano, hiperqueratosis epidermolítica, queratosis premaligna (por ejemplo, queratosis actínica), pioderma gangrenoso, afecciones y respuestas alérgicas, alergias alimentarias, alergias a fármacos, alergias a insectos, trastornos alérgicos raros como diversas formas de mastocitosis, reacciones alérgicas, eczema, incluido el eczema alérgico o atópico, eczema asteatótico, eczema dishidrótico, pustulosis palmoplantar, eczema vesicular palmoplantar, asma como asma bronquial, asma de bronquios y asma autoinmune, afecciones que implican infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, reacciones inmunes contra antígenos desconocidos como los grupos sanguíneos fetales A-B-0 durante el embarazo, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmune, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus eritematoso (LE), formas cutáneas tanto crónicas como agudas (como LE cutáneo crónico (CCLE), lupus eritematoso discoide (DLE), LE cutáneo subagudo (SCLE)) y formas sistémicas (como SLE), que incluyen nefritis lúpica, lupus cerebritis, lupus pediátrico, lupus no renal, lupus extrarrenal, síndrome de lupus neonatal (NLE), diabetes mellitus de inicio juvenil (Tipo I), incluida IDDM pediátrica, diabetes mellitus de inicio en la edad adulta (diabetes Tipo II), diabetes autoinmune, diabetes insípida idiopática, retinopatía diabética, nefropatía diabética, colitis diabética, trastorno diabético de las grandes arterias, respuestas inmunes asociadas con la hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis, incluyendo granulomatosis linfomatoide, agranulocitosis, vasculitis (incluyendo vasculitis de grandes vasos como polimialgia reumática y la arteritis de células gigantes (de Takayasu), vasculitis de vasos medianos como la enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nudosa/periarteritis nudosa, inmunovasculitis, vasculitis de CNS, vasculitis cutánea, vasculitis por hipersensibilidad, vasculitis necrotizante como vasculitis necrotizante fibrinoide y vasculitis necrotizante sistémica, vasculitis A CA negativa y vasculitis asociada a ANCA como el síndrome de Churg-Strauss (CSS), granulomatosis de Wegener y poliangeítis microscópica), vasculitis leucocitoclástica, arteritis temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmune, anemia Coombs positiva, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmune, incluida anemia hemolítica autoinmune (AIHA), anemia perniciosa (anemia perniciosa), enfermedad de Addison, anemia o aplasia pura de glóbulos rojos (PRCA), deficiencia de factor VIII, hemofilia A, neutropenia(s) autoinmune(s), citopenias como pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapédesis de leucocitos, trastornos inflamatorios del CNS, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, síndrome de lesión multiorgánica tales como aquellas secundarias a septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo, enfermedad antimembrana basal glomerular, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, motoneuritis, neuritis alérgica, enfermedad/síndrome de creencias, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, Síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide o pénfigo tal como el penfigoide ampolloso, penfigoide cicatricial (membrana mucosa), penfigoide cutáneo, pénfigo vulgar, pénfigo paraneoplásico, pénfigo foliáceo, pénfigo penfigoide de membrana mucosa y pénfigo eritematoso, epidermólisis ampollosa adquirida, inflamación ocular, preferiblemente inflamación ocular alérgica como conjuntivitis alérgica, enfermedad ampollosa lineal por IgA, inflamación conjuntival inducida por autoinmunidad, poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, lesión térmica debida a una afección autoinmune, preeclampsia, un trastorno por complejos inmunitarios como la nefritis por complejos inmunitarios, nefritis mediada por anticuerpos, trastornos neuro infamatorios, polineuropatías, neuropatía crónica como como polineuropatías IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (por ejemplo, como la desarrollada por pacientes con infarto al miocardio), incluida púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), púrpura post-transfusión (PTP), trombocitopenia inducida por heparina y trombocitopenia autoinmune o mediada por inmunidad incluyendo, por ejemplo, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), incluida ITP crónica o aguda, escleritis tal como ceratoscleritis idiopática, epiescleritis, enfermedades autoinmunes de los testículos y los ovarios, incluidas orquitis y ooforitis autoinmunes, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunes incluyendo tiroiditis tal como tiroiditis autoinmune, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto) o tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmune, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, enfermedad ocular de Grave (oftalmopatía u oftalmopatía asociada a la tiroides), síndromes poliglandulares tales como como síndromes poliglandulares autoinmunes, por ejemplo, tipo I (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), síndromes paraneoplásicos, incluidos síndromes paraneoplásicos neurológicos como síndrome miasténico de Lambert-Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, síndrome del hombre rígido o de la persona rígida, encefalomielitis tal como como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia gravis como la miastenia gravis asociada a timoma, degeneración cerebelosa, neuromiotonía, opsoclono o síndrome opsoclono mioclono (OMS), y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis crónica activa o hepatitis crónica activa autoinmune, neumonitis como la neumonitis intersticial linfoide (LIP), bronquiolitis obliterante (no de trasplante) versus NSIP, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), nefropatía por IgA idiopática, dermatosis por IgA lineal, dermatosis neutrofílica febril aguda, dermatosis pustulosa subcórneal, dermatosis acantolítica transitoria, cirrosis tal como cirrosis biliar primaria y neumonocirrosis, síndrome de enteropatía autoinmune, enfermedad celíaca o celiaquía, esprúe celíaco (enteropatía por gluten), esprúe refractario, esprúe idiopático, crioglobulinemia como crioglobulinemia mixta, esclerosis lateral amilotrófica (ALS; Enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad arterial coronaria, enfermedad autoinmune del oído tal como la enfermedad autoinmune del oído interno (AIED), pérdida auditiva autoinmune, policondritis tal como la policondritis refractaria o reincidente o recurrente, proteinosis alveolar pulmonar, queratitis como el síndrome de Cogan/queratitis intersticial no sifilítica, parálisis de Bell, enfermedad/síndrome de Sweet, rosácea autoinmune, dolor asociado a zoster, amiloidosis, una linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis monoclonal de células B (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y gammapatía monoclonal de significado indeterminado, MGUS), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica y canalopatías del CNS, autismo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis focal o segmentaria o focal segmentaria (FSGS), oftalmopatía endocrina uveoretinitis, coriorretinitis, trastorno hepatológico autoinmune, fibromialgia, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades desmielinizantes autoinmunes y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Dressler, alopecia areata, alopecia total, Síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia y telangiectasia), infertilidad autoinmune masculina y femenina, por ejemplo, debida a anticuerpos antiespermatozoides, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón del granjero, eritema multiforme, síndrome postcardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón del aficionado a las aves, angeítis granulomatosa alérgica, angeítis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción a transfusiones, lepra, malaria, enfermedades parasitarias tal como leishmaniasis, cipanosomiasis, esquistosomiasis, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, mediastinitis fibrosante, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, endoftalmitis, eritema elevado y diutinum, eritroblastosis fetal, faciitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis tal como la ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis (aguda o crónica) o ciclitis de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infección del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), SCID, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), infección por ecovirus, sepsis (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS)), endotoxemia, pancreatitis, tiroxicosis, infección por parvovirus, infección por el virus de la rubéola, síndromes post-vacunación, infección de rubéola congénita, infección por el virus de Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, insuficiencia gonadal autoinmune, corea de Sydenham, nefritis post-estreptocócica, tromboangitis ubiterana, tirotoxicosis, tabes dorsal, corioiditis, polimialgia de células gigantes, neumonitis por hipersensibilidad crónica, conjuntivitis, tal como catarro vernal, queratoconjuntivitis seca y queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía por cambios mínimos, lesión benigna familiar y por reperfusión de isquemia-reperfusión, reperfusión de órganos trasplantados, autoinmunidad retinal, inflamación de las articulaciones, bronquitis, enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias/pulmonar, silicosis, aftas, aftosas estomatitis, trastornos arterioscleróticos (insuficiencia vascular cerebral) como encefalopatía arteriosclerótica y retinopatía arteriosclerótica, aspermiogénesis, hemólisis autoinmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nudoso leproso, parálisis facial idiopático, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman-Rich, pérdida auditiva sensoneural, hemoglobinuria paroxística, hipogonadismo, ileítis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal, mixedema idiopático primario, nefrosis, oftalmía simpática (oftalmitis simpática), oftalmitis neonatal, neuritis óptica, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tireoiditis de Quervain, atrofia esplénica adquirida, timoma no maligno, timitis linfofolicular, vitíligo, síndrome de shock tóxico, intoxicación alimentaria, afecciones que implican infiltración de células T, deficiencia de adhesión de leucocitos, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, síndrome de lesión multiorgánica, enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, poliendocrinopatías autoinmunes, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrófica autoinmune, enfermedades reumáticas, enfermedad mixta del tejido conectivo, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, síndrome poliglandular autoinmune, incluyendo el síndrome poliglandular tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de inicio en la edad adulta (AOIH), miocardiopatía como la miocardiopatía dilatada, epidermólisis bullosa adquirida (EBA), hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis crónica o aguda, sinusitis etmoidal, frontal, maxilar o esfenoidal, sinusitis alérgica, un trastorno relacionado con los eosinófilos tal como eosinofilia, eosinofilia por infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, neumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica, aspergiloma, o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxia, espondiloartropatías, espondiloartritis seronegativas, enfermedad autoinmune poliendocrina, colangitis esclerosante, esclerótica, epiesclera, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de ataxia telangiectasia, angiectasia, trastornos autoinmunes asociados con enfermedades del colágeno, reumatismo como artrorreumatismo crónico, linfadenitis, reducción de la respuesta de la presión arterial, disfunción vascular, lesión tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral y enfermedades que acompañan a la vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, trastorno isquémico por reperfusión, lesión por reperfusión del miocardio u otros tejidos, traqueobronquitis linfomatosa, dermatosis inflamatorias, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, insuficiencia multiorgánica, enfermedades ampollosas, necrosis cortical renal, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales, síndromes asociados a la transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citocinas, narcolepsia, inflamación aguda grave, inflamación crónica intratable, pielitis, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulitis y endometriosis.
Etiquetas y diagnósticos:
Los agentes marcadores pueden acoplarse ya sea directa o indirectamente a los anticuerpos o antígenos de la invención. Un ejemplo de acoplamiento indirecto es mediante el uso de una fracción espaciadora. Además, los anticuerpos de la presente invención pueden comprender un dominio adicional, estando dicho dominio unido mediante enlaces covalentes o no covalentes. El enlace puede basarse en fusión genética de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica y descritos anteriormente o puede realizarse mediante, por ejemplo, entrecruzamiento químico como se describe, por ejemplo, en la aplicación internacional WO94/04686. El dominio adicional presente en la proteína de fusión que comprende el anticuerpo de la invención puede estar unido preferiblemente mediante un enlazador flexible, ventajosamente un enlazador polipeptídico, en el que dicho enlazador polipeptídico comprende aminoácidos plurales, hidrofílicos, unidos a péptidos de una longitud suficiente para como para abarcar la distancia entre el extremo C-terminal de dicho dominio adicional y el extremo N-terminal del anticuerpo de la invención o viceversa. El agente terapéutica o diagnósticamente activo puede acoplarse al anticuerpo de la invención o a un fragmento de unión al antígeno del mismo por diversos medios. Esto incluye, por ejemplo, proteínas de fusión de cadena sencilla que comprenden las regiones variables del anticuerpo de la invención acopladas mediante métodos covalentes, tales como enlaces peptídicos, al agente terapéutico o diagnósticamente activo. Otros ejemplos incluyen moléculas que comprenden al menos un fragmento de unión al antígeno acoplado a moléculas adicionales de forma covalente o no covalente, incluidas aquellas de la siguiente lista ilustrativa no limitante. Traunecker, Int. J. Cancer Surp. SuDP 7 (1992), 51-52, describe el reactivo biespecífico janusina en el que la región Fv dirigida a CD3 está acoplada a CD4 soluble o a otros ligandos como OVCA e IL-7. De manera similar, las regiones variables del anticuerpo de la invención pueden construirse en moléculas Fv y acoplarse a ligandos alternativos como los ilustrados en el artículo citado. Higgins, J. Infect. Disease 166 (1992), 198-202, describe un anticuerpo hetero-conjugado compuesto de OKT3 entrecruzado con un anticuerpo dirigido a una secuencia específica en la región V3 de GP120. Dichos anticuerpos hetero-conjugados también se pueden construir utilizando al menos las regiones variables contenidas en el anticuerpo de los métodos de la invención. Ejemplos adicionales de anticuerpos específicos incluyen los descritos por Fanger, Cancer Treat. Res. 68 (1993), 181-194 y por Fanger, Crit. Rev. Immunol. 12 (1992), 101-124. En la técnica se han descrito ampliamente conjugados que son inmunotoxinas que incluyen anticuerpos convencionales. Las toxinas se pueden acoplar a los anticuerpos mediante técnicas de acoplamiento convencionales o se pueden producir inmunotoxinas que contienen porciones de toxina proteica como proteínas de fusión. Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar de la manera correspondiente para obtener tales inmunotoxinas. Ilustrativos de tales inmunotoxinas son los descritos por Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 y por Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.
La proteína de fusión descrita anteriormente puede comprender además un enlazador escindible o un sitio de escisión para proteinasas. Estas fracciones espadadoras, a su vez, pueden ser insolubles o solubles (Diener et al, Science 231 (1986), 148) y pueden seleccionarse para permitir la liberación del fármaco desde el antígeno en el sitio diana. Ejemplos de agentes terapéuticos que pueden acoplarse a los anticuerpos y antígenos de la presente invención para inmunoterapia son quimiocinas, moléculas hospedadoras, fármacos, radioisótopos, lectinas y toxinas. Los fármacos con los que se pueden conjugar los anticuerpos y antígenos de la presente invención dependen del contexto de la enfermedad en la que se pretenda utilizar a las moléculas conjugadas. Por ejemplo, los anticuerpos específicos para dianas útiles en el tratamiento de enfermedades tumorales pueden conjugarse a compuestos a los que clásicamente se hace referencia como fármacos antineoplásicos tales como mitomicina C, daunorrubicina y vinblastina. Al utilizar anticuerpos o antígenos radioisotópicamente conjugados de la invención para, por ejemplo, la inmunoterapia tumoral, ciertos isótopos pueden ser más preferibles que otros dependiendo de factores tales como la distribución de leucocitos, así como la estabilidad y emisión. Dependiendo de la respuesta autoinmune, algunos emisores pueden ser preferibles a otros. En general, en inmunoterapia se prefieren los radioisótopos emisores de partículas a y p. Se prefieren emisores a de corto alcance y de alta energía, tales como 212Bi. Ejemplos de radioisótopos que pueden unirse a los anticuerpos o antígenos de la invención con fines terapéuticos son 125I, 131I, 90Y, 67Cu, 212Bi, 212At, 211Pb, 47Sc, 109Pd y 188Re. Otros agentes terapéuticos que pueden acoplarse al anticuerpo o antígeno de la invención, así como protocolos terapéuticosex vivoein vivo,son conocidos, o pueden determinarse fácilmente, por aquellos con habilidades ordinarias en la técnica. Ejemplos no limitantes de radionucleidos adecuados para el marcado son 198Au, 212Bi, 11C, 14C, 57Co, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 197Hg, 166Ho, 111In, 113m|n, 123I, 125I, 127I, 131I, 111In, 177Lu, 15O, 13N, 32P, 33P, 203Pb, 186Re, 188Re, 105Rh, 97Ru, 35S, 153Sm y 99mTc. Otras moléculas adecuadas para marcar son un tinte fluorescente o luminiscente, una partícula magnética, un metal y una molécula que puede detectarse mediante un paso secundario enzimático o de unión, como una enzima o una etiqueta peptídica. Las sondas fluorescentes comerciales adecuadas para uso como marcadores en la presente invención se enumeran en Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 8th Edition. Las partículas magnéticas adecuadas para uso en ensayos basados en partículas magnéticas (MPAs) pueden seleccionarse de materiales paramagnéticos, diamagnéticos, ferromagnéticos, ferromagnéticos y superparamagnéticos.
Los métodos generales de bioquímica celular y molecular, útiles para fines de diagnóstico se pueden encontrar en libros de texto estándar como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996). Los reactivos, medios de detección y kits para fines de diagnóstico están disponibles en proveedores comerciales tales como Pharmacia Diagnostics, Amersham, BioRad, Stratagene, Invitrogen y Sigma-Aldrich, así como en las fuentes dadas en una cualquiera de las referencias citadas en la presente, en particular la literatura de patentes.
Tratamiento y fármacos:
Como se utiliza en la presente, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en el que el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, tal como el desarrollo de una enfermedad autoinmune y/o una enfermedad auto inflamatoria. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos en necesidad del tratamiento incluyen aquellos que ya padecen la afección o trastorno, así como aquellos propensos a padecer la afección o trastorno o aquellos en quienes se debe prevenir la manifestación de la afección o trastorno.
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
Si no se indica lo contrario, los términos "fármaco", "medicina" o "medicamento" se utilizan indistintamente en la presente e incluirán, pero no se limitan a, todos los (A) artículos, medicinas y preparaciones para uso interno o externo, y cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a ser utilizadas para el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedades del hombre o de otros animales; y (B) artículos, medicinas y preparaciones (distintos de los alimentos) destinados a afectar la estructura o cualquier función del cuerpo del hombre o de otros animales; y (C) artículos destinados a ser utilizados como un componente de cualquier artículo especificado en las cláusulas (A) y (B). El término "fármaco", "medicina" o "medicamento" incluirá la fórmula completa de la preparación destinada para ser utilizada en el hombre o en otros animales que contenga uno o más "agentes", "compuestos", "sustancias" o "composiciones (químicas)" como y en algún otro contexto también otros excipientes farmacéuticamente inactivos como rellenos, desintegrantes, lubricantes, deslizantes, aglutinantes o que garanticen una fácil transportación, desintegración, desagregación, disolución y disponibilidad biológica del "fármaco", "medicina" o "medicamento" en un lugar previsto como diana dentro del cuerpo del hombre o de otros animales, por ejemplo, en la piel, en el estómago o el intestino. Los términos "agente", "compuesto" o "sustancia" se utilizan indistintamente en la presente e incluirán, en un contexto más particular, pero no limitado a todos los agentes farmacológicamente activos, es decir, agentes que inducen un efecto biológico o farmacológico deseado o que se investigan o prueban para determinar la capacidad de inducir tal posible efecto farmacológico mediante los métodos de la presente invención.
Ejemplos de "fármacos antirreumáticos" y fármacos inmunosupresores incluyen cloroquina, hidroxicloroquina, miocrisina, auranofm, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, infliximab (más metotrexato oral y subcutáneo), adalimumab, etc., azatioprina, D-penicilamina, sales de oro (oral), sales de oro (intramuscular), minociclina, ciclosporina, incluida ciclosporina A y ciclosporina tópica, tacrolimus, micofenolato de mofetilo, ciclofosfamida, proteína estafilocócica A (Goodyear and Silverman, J. Exp. Med., 197 (2003), 125-39), incluidas sus sales y derivados de los mismos, etc.
Ejemplos de "fármacos antiinflamatorios no esteroideos" o "NSAIDs" incluyen aspirina, ácido acetilsalicílico, ibuprofeno e ibuprofeno retardado, fenoprofeno, piroxicam, flurbiprofeno, naproxeno, ketoprofeno, naproxeno, tenoxicam, benorilato, diclofenaco, naproxeno, nabumetona, indometacina, ketoprofeno, ácido mefenámico, diclofenaco, fenbufeno, azapropazona, acemetacina, ácido tiaprofénico, indometacina, sulindac, tolmetina, fenilbutazona, diclofenaco y diclofenaco retardado, inhibidores de la ciclooxigenasa (COX)-2 como GR 253035, MK966, celecoxib (CELEBREX®; 4-(5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-IH-pirazol-1 -il), bencenosulfonamida y valdecoxib (BEXTRA®) y meloxicam (MOBIC®), incluidas sus sales y derivados de los mismos, etc. Preferiblemente, son aspirina, naproxeno, ibuprofeno, indometacina o tolmetina. Dichos NSAIDs se utilizan opcionalmente con un analgésico tal como codenina, tramadol y/o dihidrocodinina o un narcótico tal como morfina.
Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero", se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, por ejemplo, un paciente humano, para quien se desea diagnóstico, pronóstico, prevención o terapia.
Vehículos farmacéuticos:
Los vehículos y vías de administración farmacéuticamente aceptables se pueden tomar de la literatura correspondiente conocida por el experto en la técnica. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica; véase por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472, Vaccine Protocols. 2nd Edition by Robinson et al., Humana Press, Totowa, New Jersey, USA, 2003; Banga, Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems. 2nd Edition by Taylor and Francis. (2006), ISBN: 0-8493-1630-8. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se pueden formular mediante métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede realizarse de diferentes maneras. Los ejemplos incluyen la administración de una composición que contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable por métodos de vía oral, intranasal, rectal, tópica, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, subdérmica, transdérmica, intratecal e intracraneal. Las formulaciones en aerosol, tales como las formulaciones de espray nasal, incluyen soluciones acuosas purificadas u otras soluciones del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Preferentemente, tales formulaciones se ajustan a un pH y a un estado isotónico compatible con las membranas mucosas nasales. Composiciones farmacéuticas para administración oral, tales como moléculas de anticuerpos de dominio sencillo (por ejemplo, "nanobodies™") etc. también están previstos en la presente invención. Dichas formulaciones orales pueden estar en forma de tableta, cápsula, polvo, líquido o semisólido. Una tableta puede comprender un vehículo sólido, tal como gelatina o un adyuvante. Las formulaciones para administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio con un vehículo adecuado; véase también O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727-735. Puede encontrarse más orientación sobre las formulaciones que son adecuadas para diversos tipos de administración en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985) y las actualizaciones correspondientes. Para una breve revisión de los métodos de administración de medicamentos, véase Langer, Science 249 (1990), 1527-1533.
Régimen de dosificación:
El régimen de dosificación lo determinará el médico tratante y los factores clínicos. Como es bien conocido en la técnica médica, las dosis para cualquier un paciente depende de muchos factores, incluido el tamaño del paciente, superficie corporal, edad, el compuesto particular que se va a administrar, sexo, tiempo y vía de administración, salud en general y otros fármacos que se administren simultáneamente. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0.001 a 1000 |jg (o de ácido nucleico para la expresión o para la inhibición de la expresión en este intervalo); sin embargo, se prevén dosis por debajo o por encima de este intervalo ejemplar, especialmente considerando los factores antes mencionados. Generalmente, el régimen como administración regular de la composición farmacéutica debe estar en el intervalo de 1 jg a 10 mg de unidades por día. Si el régimen es una infusión continua, también debe estar en el intervalo de 1 jg a 10 mg de unidades por kilogramo de peso corporal por minuto, respectivamente. El progreso puede monitorearse mediante evaluaciones periódicas. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables como el oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluidos medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender agentes adicionales tales como agentes antitumorales y fármacos citotóxicos, dependiendo del uso previsto de la composición farmacéutica.
Además, puede ser deseable la coadministración o administración secuencial de otros agentes. Una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a esa cantidad del ingrediente activo suficiente para mejorar los síntomas o afección. La eficacia terapéutica y la toxicidad de dichos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población). La proporción de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50.
Preferiblemente, el agente terapéutico en la composición está presente en una cantidad suficiente para prevenir la inflamación o la supresión de la respuesta inmune.
Estas y otras realizaciones se describen y abarcan en la descripción y los ejemplos de la presente invención. Se puede recuperar literatura adicional de bibliotecas y bases de datos públicas sobre cualquiera de los materiales, métodos, usos y compuestos a emplear de acuerdo con la presente invención, utilizando, por ejemplo, dispositivos electrónicos. Por ejemplo, se puede utilizar la base de datos pública "Medline", que está alojada en el National Center for Biotechnology Information y/o la National Library of Medicine at the National Institutes of Health. El experto conoce otras bases de datos y direcciones web, como las del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI), que forma parte del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL), y también pueden obtenerse mediante motores de búsqueda de Internet. Una descripción general de la información de patentes en biotecnología y un estudio de las fuentes pertinentes de información sobre patentes útiles para la búsqueda retrospectiva y para conocimiento actual, se proporciona en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
La divulgación anterior describe en general a la presente invención. A menos que se indique lo contrario, un término tal como se utiliza en la presente recibe la definición proporcionada en el Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revisado en 2000 y reimpreso en 2003, Is Bn 0 19 850673 2. Se citan varios documentos a lo largo del texto de esta especificación. Las citas bibliográficas completas se pueden encontrar al final de la especificación inmediatamente antes de las reivindicaciones.
Ejemplos
Los Ejemplos 1 a 8 que siguen y las Figuras 1 a 27 correspondientes ilustran mejor la invención, pero no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención de ninguna manera. Se pueden encontrar descripciones detalladas de métodos convencionales, tales como los empleados en la presente, en la literatura citada; véase también “The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" Seventeenth Ed. ed. by Beers and Berkow (Merck & Co., Inc., 2003).
La práctica de la presente invención va a emplear, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica.
Los métodos de genética molecular e ingeniería genética se describen de forma general en las ediciones actuales de Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press); Clonación de ADN, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Síntesis de Oligonucleótidos (Gait ed., 1984); Hibridación de ácidos nucleicos (Hames and Higgins eds. 1984); Transcripción y Traducción (Hames and Higgins eds. 1984); Cultivo de células animales (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Vectores génicos de trasferencia para células de mamífero (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); y metodología recombinante de ADN (Wu, ed., Academic Press). Vectores génicos de trasferencia para células de mamífero (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., eds.); Células y enzimas inmovilizadas (IRL Press, 1986); Perbal, APractical Guide To Molecular Cloning (1984);treatise,Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y); Métodos inmunoquímicos en biología molecular y celular (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986). Los reactivos, vectores de clonación y kits para manipulación genética referidos en esta divulgación están disponibles de proveedores comerciales tales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, y Clontech. Las técnicas generales en cultivo celular y recolección de medios se describen en Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); y la suspensión de cultivo de células de mamífero (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251.
Material y métodos
E L IS A IL-22
Se recubrieron microplacas de 96 pocilios (Costar, EE. UU.) con IL-22 humana (ImmunoTools). Las placas se lavaron con PBS-T y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS que contenía BSA al 2% (Sigma,Buchs,Suiza). Se incubaron sueros de pacientes, medio acondicionado con células B o preparaciones de anticuerpos recombinantes durante 2 horas a temperatura ambiente. La unión de IgG humano al antígeno de interés se determinó utilizando un anticuerpo específico de Fc-gamma humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch, Europe Ltd., Cambridgeshire, Reino Unido) seguido de la medición de la actividad HRP utilizando una solución de sustrato TMB (TMB, Sigma,Buchs,Suiza).
Ejemplo 1: Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PMBC) de pacientes APECED/APS1
Como material de partida para la clonación de anticuerpos completamente humanos, se utilizaron linfocitos humanos obtenidos de la sangre periférica de 23 pacientes finlandeses voluntarios con poliendocrinopatía autoinmune candidiasis distrofia ectodérmica (APECED, OMIM 240300), también llamado síndrome de poliendocrinopatía autoinmune tipo 1 (APS1). Estos voluntarios fueron reclutados para la donación de sangre a través de la asociación finlandesa de pacientes APECED y Addison. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito y el estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Ética de Medicina de la Autoridad Conjunta de Helsinki y el distrito hospitalario de Uusimaa. APECED es un trastorno autosómico recesivo causado por mutaciones en el genAIRE(regulador autoinmune), ubicado en el cromosoma 21 (21q22.3) y APECED es prevalente en Finlandia (1/25,000) debido a un efecto fundador. Los pacientes APECED presentan diversas disfunciones endocrinas autoinmunes, que incluyen principalmente insuficiencia suprarrenal e hipoparatiroidismo, pero también hipogonadismo, diabetes mellitus, tiroiditis e hipofisitis. Otros síntomas principales son candidiasis mucocutánea crónica, alopecia y vitíligo (véase tambiénsupra).Dado que se ha reportado de una fuerte correlación entre los niveles de IgG específica al antígeno en el suero y la frecuencia de células B específicas al antígeno en la reserva de memoria de las células mononucleares de sangre periférica (Bernasconi et al. 2002, Lanzavecchia et al. 2006), los sueros de los pacientes se cribaron primero para detectar la presencia de autoanticuerpos contra las proteínas de interés (como IFN, IL-22) y luego se seleccionaron aquellos casos de APECED con titulación alta (> 1:5000) para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PMBC) como se indica. Se obtuvo sangre periférica heparinizada y se diluyó con dos volúmenes de 1x PBS a temperatura ambiente, y las células se superpusieron sobre Lympholyte H, se centrifugaron a 2000 rpm (805 rcf) a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las células se cosecharon en la interfase, se mezclaron en tampón de lavado, se centrifugaron a 1,500 rpm (453 rcf) durante 15 minutos a 4°C y se resuspendieron mediante movimientos suaves, con 10 ml de WB. A continuación, las células se centrifugaron a 1,000 rpm (201 rcf), 10 min a 4°C y se lavaron una vez más con WB. Luego las células se resuspendieron suavemente en un volumen apropiado de FBS en hielo. Se añadió FBS para ajustar el volumen para tener 20 mio/ml, después de lo cual se añadió lentamente 1 volumen de medio de congelación (80% de FBS (Hyclone, Thermo Scientific y 2% de DMSO, #154938, Sigma) mientras se agitaba, se resuspendió y se repartieron en alícuotas en crioviales que se mantuvieron en hielo. Los crioviales se colocaron en la caja Mr. Frosty y se transfirieron a un congelador a -80 °C durante un máximo de 5 días antes de su posterior procesamiento como se describe en el Ejemplo 2. Alternativamente, los crioviales se almacenaron en nitrógeno líquido.
Ejemplo 2: Clonación molecular de anticuerpos humanos específicos de IL-22.
Preferiblemente, los anticuerpos específicos de IL-22 se aislaron mediante clonación molecular de genes de inmunoglobulina obtenidos a partir de células unicelulares clasificadas derivadas de cultivos oligoclonales a corto plazo de células B de memoria activadas que producen los anticuerpos de interés.
Se aislaron células B de memoria a partir de PMBC derivadas de la sangre periférica de pacientes finlandeses voluntarios con APECED con un protocolo de un paso utilizando mAb anti-IgD humano conjugado con ficoeritrina, conjugado con APC, mAb anti-IgM humano. CD3, CD56, CD8 y conjugado con FITC mAb anti CD22 humano (Becton Dickinson, Basel, Suiza). La clasificación de las células se llevó a cabo utilizando un clasificador de células MoFlo XDP (Beckman Coulter). Se estimularon células B CD22- positivas- e IgM-, IgD negativas con sobrenadante que contenía EBV obtenido de células B95-8 (en medio de células B que contenía RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal al 10%). Las células se sembraron en medio IMDM suplementado con CpG 2006 a 10 células por pocillo en 30.000 PMBC alimentadoras irradiadas preparadas a partir de donadores voluntarios. Después de 10 a 14 días de estimulación, se cribaron los sobrenadantes de cultivo para detectar la presencia de anticuerpos específicos para la diana de interés (por ejemplo, IL-22). El proceso de cribado comprendió el cribado de la unión a fragmentos, péptidos o derivados de la molécula particular de interés, por ejemplo, mediante ELISA. Posteriormente se aísla el anticuerpo para el cual se detectó unión o la célula que produce dicho anticuerpo.
Las células individuales obtenidas de cultivos de células B de memoria reactivas a IL-22 se depositan en una placa de PCR de 96 pocillos, que contiene tampón de primera hebra (Invitrogen,LuBioScience,Suiza). El ADNc se prepara utilizando un cebador hexámero aleatorio (Invitrogen,LuBioScience,Suiza). La amplificación por PCR de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas se realiza de acuerdo con los protocolos estándar (Wardemann et al., Science 301, 2003, 1374-1377). Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas se amplifican mediante un método de PCR anidada. La primera ronda de PCR se realiza con cebadores específicos para la región constante de IgG y mezclas de cebadores específicos para todos los péptidos señal de las familias de regiones variables de Ig de cadena pesada y ligera (Wardemann et al., Science 301, 2003, 1374-1377). Posteriormente, se realiza una PCR anidada utilizando mezclas de cebadores específicas para las regiones J de inmunoglobulina y la región 5' del marco 1 de las familias de regiones variables de Ig de cadena pesada y ligera. Se lleva a cabo un análisis de secuencia para identificar los clones de anticuerpos individuales presentes en el cultivo de células B seleccionado. Posteriormente, las regiones pesada y ligera variables de Ig de cada clon de anticuerpo se clonan en vectores de expresión que proporcionan las regiones constantes de IgG1 humano, Ig-Kappa humano o Ig-Lambda humano. Tras la cotransfección de los vectores de expresión de Ig ligera y pesada en células HEK 293, se producen los clones de los anticuerpos. La identificación del clon de anticuerpo presumiblemente responsable de la reactividad de IL-22 del cultivo de células B parental se realiza tras volver a cribar los clones de anticuerpos recombinantes en IL-17/IL-22 y ELISA de control.
Para poder identificar y corregir discrepancias en la secuencia codificada por cebador en la región variable de Ig, se realiza una amplificación por PCR adicional utilizando un protocolo semi-anidado con 2 pares de cebadores específicos para una región conservada de las regiones constantes de Ig de la cadena pesada y ligera como cebadores 3' y mezclas de cebadores específicos para los péptidos señal de Ig como cebadores 5'. Los productos de PCR se clonan en el vector TOPO™ (Invitrogen,LuBioScience,Lucerna, Suiza). Se lleva a cabo la determinación de la secuencia de la región variable de Ig completa y la información se utiliza para diseñar cebadores específicos para la clonación de la secuencia auténtica del anticuerpo humano en vectores de expresión de anticuerpos. Esta aproximación permite la identificación de la secuencia completa del anticuerpo de la región variable de Ig tal como ocurrió en el paciente. Esta secuencia se utiliza para la producción recombinante de estos anticuerpos que luego se utiliza en los pasos de caracterización posteriores.
Ejemplo 3: Producción y purificación de anticuerpos.
La expresión génica transitoria de los anticuerpos humanos se logra mediante la transfección de vectores de expresión de anticuerpos en células de riñón embrionario humano 293-T o células de ovario de hámster chino (CHO) utilizando el método de Transfección con Polietilenimina (PEI, Polyscience Warrington, EE. UU.). Después de la transfección, las células se cultivan en medio libre de suero (OPTI-MEM I suplementado con GlutaMAX-I Gibco). Los sobrenadantes se recolectan después de 3 a 6 días de cultivo y la IgG se purifica utilizando columnas de proteína A (GE HealthCare, Suecia) en un dispositivo de cromatografía rápida líquida de proteínas (FPLC) (GE HealthCare, Suecia).
Ejemplo 4: Ensayos de neutralización basados en células in vitro.
Los ensayos de neutralización se realizan en líneas celulares que responden a la citocina estudiada, es decir, llevan el receptor necesario. La unión del ligando al receptor activa la vía de señalización correspondiente, la translocación de los factores de transcripción al núcleo y regula positivamente la transcripción del gen respondedor, la traducción y, si corresponde, la secreción del producto. La concentración de citocina utilizada se selecciona desde el comienzo de la parte lineal de la curva de dosis-respuesta para maximizar la sensibilidad del ensayo. Para probar la capacidad neutralizante de los anticuerpos, se preincuba la concentración óptima de la citocina diana con diluciones seriadas de suero, sobrenadante o muestras de anticuerpos purificados. Los resultados se expresan como título o concentración de anticuerpo que muestra el valor intermedio entre los controles positivos y negativos.
Ensayo de neutralización de IL-22
Se coincuban diluciones en serie de muestras de suero, sobrenadantes de cultivo o anticuerpos purificados con 0.5 ng/ml de IL-22 en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos a 37 °C. La línea celular Colo205 se añade después de 2 horas de coincubación a 3 * 104 células/pocillo en RPMI-1640 con 10% de FBS inactivado por calor. Después de la incubación a 37°C durante 16-20 h, los sobrenadantes se recolectan y se analizan para determinar la producción de IL-10 mediante ELISA. Los resultados se estiman a partir de gráficas de absorbancia de ELISA como el título de suero o sobrenadante o la concentración de anticuerpos que arrojan un valor intermedio entre los controles positivos y negativos. ED50 se define como la concentración o título necesario para reducir a la mitad la actividad de citocinas de la muestra de prueba.
Ejemplo 5: Validación de anticuerpos de los sujetos.
1. Protocolo para la inflamación de la piel tipo psoriasis inducida por imiquimod en modelos animales seleccionados
Se utilizaron modelos de ratón para analizar el efecto de los autoanticuerpos anti-IL-22 derivados de APECED y otros autoanticuerpos derivados de APECED sobre la inflamación de la piel similar a la psoriasis inducida por imiquimod. A los ratones C57Bl/6 se les afeitó la parte dorsal de la espalda bajo anestesia 48-72 horas antes del tratamiento. 24 horas antes o después de la aplicación de imiquimod, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal anti-IL-22 y otros autoanticuerpos derivados de APECED, con dosis adicionales a intervalos de 2 días. A los ratones de control se les inyectó control de Ig humano. Los ratones tratados recibieron una dosis tópica diaria de 62.5 mg de crema IMQ disponible comercialmente (5%) (Aldara; 3M Pharmaceuticals) durante 5 días consecutivos. Los ratones control fueron tratados con vaselina. Los ratones se calificaron diariamente utilizando un sistema de puntuación objetivo basado en el índice clínico de gravedad y área de psoriasis (PASI). El eritema, descamación y engrosamiento se puntuaron de forma independiente en una escala de 0 a 4: 0, ninguno; 1, leve; 2, moderado; 3, marcado; 4, muy marcado. Se pesaron los bazos y se estimularon las células T derivadas de ganglios linfáticos durante la noche para su análisis mediante citometría de flujo.
2. Induciendo EAE en ratones con deficiencia deAire,cotratados con anticuerpos anti-IL-7 y anti-IFN
Se utilizó un modelo de ratón AIRE'/_, en el cual se altera el potencial de codificación de la proteína Aire, lo que se predice que precipitaría la autoinmunidad, para investigar los efectos potencialmente protectores de anti-IL-22 y otros autoanticuerpos derivados de pacientes con APECED sobre la EAE (encefalitisautoinmuneexperimental) inducción por MOG35-55 Emulsión de CFA (fragmento inmunogénico deglicoproteína deoligodendrocitos demielina que induce una destrucción autoinmune de las células nerviosas que expresan MOG; adyuvante completo de Freund). Por ejemplo, el adyuvante completo de Freunds (CFA) jeringas prellenadas con la emulsión que contienen 1 mg de MOG35-55/ml y una emulsión de 2 mg de Mycobacterium tuberculosis muerta H37Ra/ml, se utilizaron en este respecto. Se pretrataron ratones hembra de control Aire-/- y tipo silvestre 24 horas antes del inicio de la inducción de EAE con inyección intraperitoneal de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-IL-7 y anti-IFN), con dosis adicionales a intervalos de 2 días. A los ratones de control se les inyectó inmunoglobulina de control. 24 horas después de la administración inicial de anticuerpos, mínimamente estresados (al menos 7 días de aclimatación, jaulas estáticas, ambiente tranquilo) a los ratones hembra Aire-/' y de control de tipo silvestre se les inyectó por vía subcutánea (parte superior e inferior de la espalda) con MOG35-55 emulsión de CFA para instigar la EAE. Dentro de las 2 horas, a los ratones tratados se les inyectó por vía intraperitoneal toxina pertussis para exacerbar la inducción de EAE, administrándose una dosis adicional de toxina pertussis subcutánea a las 22-26 horas. La inducción de EAE se calificó 7 días después del inicio y más allá utilizando la escala de observación clínica estándar de Hooke Lab, calificando la gravedad del fenotipo de EAE en una escala de 0-5. Un fenotipo con una puntuación de 0 no representa cambios obvios, y un fenotipo con una puntuación de 5 indica parálisis completa de la parte trasera y pata delanteras.
3. Protocolo para inducir EAE en modelos de ratón
Se utilizó un modelo de ratón para investigar el efecto de los autoanticuerpos anti-IL-22 y otros derivados de APECED tras la inducción de EAE por MOG35-55 (péptido MOG inmunogénico que precipita una destrucción autoinmune de las células nerviosas que expresan MOG) Emulsión CFA. Los ratones hembra Aire_/' y de control de tipo silvestre fueron pretratadas 24 horas antes del inicio de la inducción de EAE con inyección intraperitoneal de anticuerpos anti-IL-22, con dosis adicionales a intervalos de 2 días. A los ratones de control se les inyectó Ig de control. 24 horas después de la administración inicial de anticuerpos, mínimamente estresados (al menos 7 días de aclimatación, jaulas estáticas, ambiente tranquilo) a los ratones hembra Aire_/' y de control de tipo silvestre se les inyectó por vía subcutánea (parte superior e inferior de la espalda) con MOG35-55 Emulsión de CFA para instigar la EAE. Dentro de las 2 horas, a los ratones tratados se les inyectó por vía intraperitoneal toxina pertussis para exacerbar la inducción de EAE, administrándose una dosis adicional de toxina pertussis subcutánea a las 22-26 horas. La inducción de EAE se calificó 7 días después del inicio y posteriormente utilizando la escala de observación clínica estándar de Hooke Lab, calificando la gravedad del fenotipo de EAE en una escala de 0-5. Un fenotipo con una puntuación de 0 no representa cambios obvios, y un fenotipo con una puntuación de 5 indica parálisis completa de la parte trasera y pata delanteras.
4. Protocolo para inducir artritis inducida por colágeno en modelos de ratón
Se utilizó un modelo de ratón para investigar el efecto de anti-IL-22 y otros autoanticuerpos derivados de APECED tras la inducción de la artritis inducida por colágeno (CIA). Los ratones C57Bl/6 fueron pretratados con autoanticuerpos derivados de APECED inyectados por vía intraperitoneal 24 horas antes de la inducción de CIA, con dosis adicionales a intervalos de 2 días (se utilizó Ig como control). La artritis inducida por colágeno se instigó con inyección intradérmica (2 x inyecciones en la base de la cola) de colágeno de pollo tipo II (preparado 1: 1 con CFA) extraído del cartílago de esternón de pollo. Se inyectó por vía intradérmica un refuerzo adicional de colágeno tipo II de pollo 1:1 IFA 14 días después de la inducción. Los ratones fueron monitoreados y puntuados para detectar artritis todos los días empezando 2 semanas después de la inmunización primaria, con el inicio típico de la artritis ocurriendo entre 3 y 6 semanas post la inmunización, y se puntuó mediante monitorización clínica (puntuación de la hinchazón de la pata trasera utilizando calibradores), medición de anticuerpos anti-colágeno (ELISA utilizando placas recubiertas de colágeno), respuestas de células T (proliferación de células T en respuesta al colágeno de pollo según se determina utilizando la incorporación de [3H] timidina) o ELISA de citocinas.
5. Protocolo para inducir colitis DSS en modelos de ratón.
Se utilizaron modelos de ratón para analizar el efecto de anti-IL-22 y otros autoanticuerpos derivados de APECED tras la inducción de colitis DSS. Los ratones C57Bl/6 fueron pretratados con autoanticuerpos derivados de APECED inyectados por vía intraperitoneal 24 horas antes de la inducción de colitis DSS, con dosis adicionales a intervalos de 2 días. La colitis crónica DSS se indujo mediante ciclos de agua potable que contiene 2% de DSS durante 5 días, seguidos de 14 días de agua potable esterilizada en autoclave sin DSS; repetido durante 3 ciclos. Los ratones del control recibieron sólo agua potable esterilizada en autoclave. La inducción y la gravedad de la colitis inducida por DSS se midió mediante evaluación histológica (tinción con hematoxilina y eosina en secciones de parafina), cultivo de órganos de grosor completo (con recolección de sobrenadantes a las 24 horas para análisis de citocinas) o muestreo directo de tejido para qPCR o inmunotransferencia. Los ratones sometidos a colitis inducida por DSS también se pesaron diariamente para determinar el grado de pérdida de peso, ya que la colitis está fuertemente asociada con la emaciación.
La eficacia de los anticuerpos de origen humano contra citocinas u otras moléculas relevantes también se evaluará mediante los efectos de dichos anticuerpos, por ejemplo, anti-IL-22 sobre la inflamación en tejido humano injertado en cepas de ratones inmunodeficientes, tal como fue descrito pot Sagoo. et al., Sci Transl Med 3 (2011): 83ra42.
Ejemplo 6: Resultados de la inflamación de la piel tipo psoriasis inducida por imiquimod
En ratones tratados tópicamente con imiquimod para inducir inflamación de la piel tipo psoriasis (véase la Figura 4 para los cronogramas experimentales y el esquema de tratamiento), los anticuerpos 30G1 anti-IL-22 [HDMAB] derivados de APECED reducen significativamente las puntuaciones del índice de gravedad y área de psoriasis (PASI) en relación a los anticuerpos IgG de control. El eritema (enrojecimiento), descamación y engrosamiento (dureza) se puntuaron de forma independiente en una escala de 0 a 4: 0, ninguno; 1, leve; 2, moderado; 3, marcado; 4, muy marcado. Como se puede observar en las figuras 5, 6, 8-10, el tratamiento con imiquimod induce una inflamación de la piel tipo psoriasis como es medida por puntuaciones PASI de eritema (enrojecimiento), descamación y engrosamiento de la piel (dureza) en relación con los ratones tratados con anticuerpos de control. Los ratones tratados con HDMAB anti-IL-22 de la presente invención, tales como el anticuerpo 30G1 ejemplar, mostraron una disminución en las puntuaciones de las mediciones tanto acumuladas como individuales en comparación con los ratones tratados con IgG de control (compárense los datos indicados por líneas continuas (IgG IMQ) versus los datos indicados por líneas punteadas (aIL22 IMQ) en las Figuras 17, 18, 20, y la piel de la espalda que muestra lesiones extendidas y áreas de piel rojas (manchas) de animales tratados con IgG IMQ en las Figuras 20-21 (B) con una falta o menor extensión de tales lesiones en las espaldas de animales tratados con 30G1 anti-IL-22 e IMQ en las Figuras 20-21 (C) e IgG IMQ versus aIL22 IMQ entradas en las Tablas 18 y 19 a continuación). Además, el análisis de citometría de flujo de las células T derivadas de ganglios linfáticos mostró un estado reducido de activación efectora en ratones tratados con HDMAB anti-IL-22 en comparación con ratones tratados con IgG de control.
Después de 5 días de tratamiento con imiquimod, los ratones tratados con IgG humano de control mostraron puntuaciones clínicas medias de: enrojecimiento = 3.75 (puntuación de 0-4), dureza = 3 y escamas = 2.25, mientras que los ratones tratados con IMQ y anticuerpo anti-IL-2230G1 tenían puntuaciones de enrojecimiento = 1.75, dureza = 1.75 y escamas = 2; véanse las Tablas 3 y 4 a continuación. Estas parecen ser diferencias significativas. Los ratones tratados con IgG IMQ también mostraron un mayor engrosamiento de la piel en comparación con los ratones tratados con anti-IL-22 IMQ.
Tabla 3. Puntuaciones clínicas de enrojecimiento en ratones BL6 durante el período de 5 días. (Puntuado en ciego en la escala 0-4) Vas = Vaselina, IMQ = Imiquimod
Tabla 4. Puntuaciones clínicas de dureza en ratones BL6 durante el período de 5 días. (Puntuado en ciego en la escala 0-4)
Tanto los ratones tratados con IgG como con anti-IL-22 (30G1) mostraron síntomas de fiebre en el Día 2 del curso temporal y aumentaron el tamaño del bazo en el día 5 (véase Figura 15). Sin embargo, en el Día 1, los síntomas de fiebre en los ratones tratados con anti-IL-22 fueron mucho menores que en los ratones tratados con IgG humano de control. Estos datos indican que los anticuerpos anti-IL-22 de la presente invención, como se muestra, por ejemplo, con respecto al anticuerpo 30G1, reducen la gravedad de los síntomas clínicos de las lesiones psoriaformes inducidas por imiquimod en ratones C57.BL/6.
En el que el tratamiento con el anticuerpo anti-IL-2230G1 mostró un efecto terapéutico en los ratones tratados, lo que indica la reactividad cruzada de este anticuerpo hacia antígenos murinos además de humanos, los experimentos realizados de manera análoga con el anticuerpo ejemplar 24D3 anti-IL-17 específico humano no tuvieron ningún efecto sobre las lesiones psoriasiformes inducidas por imiquimod, validando la especificidad del anticuerpo 24D3 hacia el antígeno humano.
Además, para investigar la posible eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-IL-22 de la presente invención, se probó el anticuerpo ejemplar 30G1 en un ensayo de psoriasis inducida por imiquimod con la administración de anticuerpos tanto pre como post la inducción con imiquimod y en un segundo experimento solo post la inducción (véase Figura 18 para cronogramas experimentales y esquema de tratamiento).
El anticuerpo anti-IL-2230G1 derivado de APECED reduce significativamente las puntuaciones del índice de gravedad y área de la psoriasis (PASI) en relación con los anticuerpos IgG de control si se administra pre o post el tratamiento con IMQ. Los ratones tratados con HDMAB anti-IL-22 de la presente invención, tales como el anticuerpo 30G1 ejemplar, mostraron una disminución en el grosor de la piel como indicador de las puntuaciones del grosor de la piel en relación con los anticuerpos IgG de control en comparación con los ratones tratados con IgG de control en ambas situaciones de tratamiento profiláctico y terapéutico; véase las mediciones del grosor de la piel que se muestran en la Figura 38A (pre) para el tratamiento profiláctico y en la Figura 38B para el tratamiento terapéutico, 24 horas después de la inducción con IMQ. El efecto terapéutico se validó aún más en un segundo experimento con un mayor número de animales (véase la Figura 20 para los cronogramas experimentales y el esquema de tratamiento). Los ratones tratados con HDMAB anti-IL-22 de la presente invención, tales como el anticuerpo 30G1 ejemplar, mostraron una disminución tanto en las puntuaciones acumuladas como individuales de las mediciones en comparación con los ratones tratados con IgG de control; véase las Figuras 36 y 37. También se probó el efecto terapéutico del anticuerpo anti-IL-22 30G1ejemplar con reacción cruzada de ratón en relación con su dependencia de la dosis en la psoriasis inducida por IMQ. Se administraron tres dosis diferentes - 200 |jg, 20 |jg y 2 |jg - post la inducción con IMQ y se evaluaron el eritema de la piel y la dureza de las placas como se describió anteriormente. Como se puede observar en la Figura 23, el tratamiento con el anticuerpo 30G1 anti-IL-22 ejemplar muestra indicaciones de dependencia de la dosis en puntuaciones individuales y acumulativas, demostrando ser menos efectivo cuando se titula hasta 1/100 de la dosis inicial.
Posteriormente, se realizan pruebas adicionales, como la imagenología de tomografía de coherencia óptica (OCT) para medir el grosor epidérmico (Morsy et al., Arch. Dermatol. Res. 302 (2010), 105-111; Phillips et al., J. Biomed. Opt.
16 (2011), 040503.), aislamiento de a Rn de la piel del animal y análisis de la expresión génica en las muestras para, por ejemplo, la identificación de patrones de respuestas inflamatorias tisulares específicos de la enfermedad. Además, el análisis FACS se realiza en suspensiones de células individuales de la piel, sangre completa o sueros aislados de los animales, para la clasificación y/o caracterización fenotípica de diferentes tipos de células, tal como las DC (células dendríticas) dérmicas psoriásicas o poblaciones de células mononucleares de sangre periférica.
Ejemplo 7: Mapeo de epítopes de anticuerpos aIL-22 ejemplares
Como primer paso del mapeo, se examinó la unión diferencial de los MABs a-IL17 y a-IL-22 a distintos sitios de unión al antígeno para determinar el número de sitios de unión diferentes.
Para ello se han utilizado dos aproximaciones. En la primera aproximación, los MABs se expresaron con ya sea un Fc humano (hMAB) o de ratón (hmMAB) y se llevaron a cabo experimentos de competencia cruzada recubriendo placas con antígeno y detectando la unión de hmMAB en presencia de un gran exceso de MABs humanos. La detección de hmMABs unidos al ligando se realizó mediante un anticuerpo secundario conjugado con HRP dirigido contra la porción Fc del anticuerpo primario. Los resultados de la primera aproximación indican que el anticuerpo 30G1 de a-IL-22 de la presente invención compite con los anticuerpos 35G11 y 41D11 de a-IL-22 comparativos, pero no con el anticuerpo comparativo 51G4; véase la figura 24B.
En la segunda aproximación, se realizaron experimentos ELISA de sándwich, en los que los hmMABs se construyeron como en la primera aproximación, pero se llevaron a cabo experimentos de competencia cruzada recubriendo MABs humanos en placa, capturando el antígeno y detectando el antígeno unido a MAB humano con hmMABs; véase la Figura 24 C para los resultados. Esta segunda aproximación muestra nuevamente que los anticuerpos 30G1, 35G11 y 41D11 compiten entre sí, pero no 51G4, lo que confirma que los anticuerpos 30G1, 35G11 y 41D11 de a-IL-22 y el anticuerpo 51G4 de a-IL-22 se unen a dos sitios diferentes. Posteriormente, se intentó mapear las regiones de unión de los MABs a sus respectivos antígenos utilizando el análisis PepStar™. En la presente, se diseñaron péptidos superpuestos de 20 unidades (superposición de 15 aminoácidos) para cubrir IL-22, incluidas todas las variantes conocidas, los péptidos y el antígeno de longitud completa (como control positivo) se detectaron en un microarreglo y el microarreglo de péptidos se incubó con el anticuerpo primario seguido de un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia dirigido contra la porción Fc del anticuerpo primario. Para evitar falsos negativos causados por impedimento estérico, se insertó una fracción enlazadora hidrofílica optimizada entre la superficie del vidrio y la secuencia peptídica derivada del antígeno.
Los resultados del mapeo para a-IL-22 MAB 30G1 ejemplar se muestran en la Figura 25. Los antígenos de longitud completa co-punteados fueron generalmente bien reconocidos en el microarreglo de péptidos (columnas IL-22). No todos los MABs de a-IL-22 muestran una unión clara; sin embargo, a diferencia de los péptidos, debido a la orientación y el uso de lisinas de superficie para inmovilizar el antígeno, la baja intensidad de la señal o la falta de señal no necesariamente se correlaciona con una falta de unión. La intensidad de unión esperada que se observará tras unirse a un péptido específico está en el intervalo de 60,000. Todos los anticuerpos muestran patrones de unión muy débiles a los péptidos unidos a los microarreglos, lo que indica una falla en el reconocimiento de péptidos lineales derivados de su antígeno específico. Estos datos sugieren que los MABs de IL-22 se unen a epítopes conformacionales; véase la Tabla 26 en el Ejemplo 8 para obtener un resumen de las características de los anticuerpos.
Ejemplo 8: Mediciones de la afinidad de los anticuerpos mediante tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR)
Para la determinación de la afinidad de los anticuerpos de la presente invención, las mediciones de SPR se realizaron utilizando un ProteOn™ Instrumento XPR36, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BIO-RAD; Hercules CA, EE. UU). En primer lugar, se acopló simultáneamente IgG anti-humano en 5 superficies de la matriz de interacción 6 x 6 de un chip sensor GLC mediante química EDC/NHS, no se inmovilizó ningún anticuerpo en la sexta superficie, pero la superficie se trató con la misma activación y protocolo de desactivación que las otras cinco superficies. Los MABs (ligandos) que se iban a probar se inyectaron posteriormente en 6 canales del chip (en dirección vertical) y se capturaron simultáneamente con una eficiencia de captura y un porcentaje de actividad muy similares. Luego se giró el chip 90 grados y el analito para analizar se inyectó en dirección horizontal en diferentes concentraciones que oscilaban entre 100 nM y 1.23 nM, representando cada curva de asociación/disociación una concentración diferente (A1-Rojo, 100 nM, A2- Cian 33.33 nM, A3-Azul 11.11 nM, A4-Verde 3.70 nM, A5-Rosa 1.23 nM, A6-Naranja solo tampón de corrida) en las Figuras 44-46. Los sensogramas en la Figura 26 confirman la especificidad de unión del anticuerpo 30G1 anti-IL-22 ejemplar de la presente invención y del anticuerpo 35G11 comparativo a-IL-22 hacia IL-22. Se hizo referencia a los datos utilizando las regiones entre puntos entre los canales de flujo. Un análisis detallado de los sensogramas como se muestra en las Figuras 45 y 46 indica un buen ajuste de los datos obtenidos a un modelo de Langmuir 1:1. Los experimentos de unión se repitieron dos veces y los datos se representan como la media de dos experimentos independientes. Se demostró que las afinidades de los anticuerpos calculadas a partir de los datos de SPR estaban en el intervalo de picomolar, es decir, KD = 36.5 ± 1.5 pM y 39 ± 7 pM para el anticuerpo 30G1 de aIL-22 y el anticuerpo 35G11 de a-IL-22, respectivamente.
Las inyecciones de IL-22 mostraron en superficies con anticuerpos aIL-22 30G1 y 35G11 inmovilizados ninguna o, como mucho, mínima unión al ligando no específica comparable al canal de control sin anticuerpo de captura anti humano IgG inmovilizado en las superficies, pero tratado con 24D3 como ligando. En la fase de disociación se pudo observar un "aumento" en la respuesta que parece reflejar una asociación y disociación concurrentes durante esta fase. Las posibles causas de esto son la agregación del antígeno en la superficie del anticuerpo o el reclutamiento del antígeno desde el tubo del instrumento. Debido a los datos complejos en la fase de disociación, es imposible determinar con precisión kd y, por lo tanto, la cinética; sin embargo, la afinidad parece ser muy alta cuando se excluyeron la gran mayoría de los datos de "disociación", y ka oscila de alrededor de 3*10E+05 (17E3), se puede calcular sobre alrededor de 6 * 10E+05 1/Ms (24D3) a alrededor de 8 * 10E+05 1/Ms (9A2). No hay evidencia de un comportamiento no 1:1, es decir, no hay evidencia de un ligando heterogéneo.
Tabla 5: Sumario de las características del anticuerpo a-IL-2230G1 ejemplar de la presente invención, y de los anticuerpos comparativos 35G11, 41D11 y 51G4. Actividad agonística (EC50) contra: IL-22 h-humano, m-murino
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Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal humano anti-interleucina-22 (IL-22) o fragmento de unión a IL-22 del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a IL-22 del mismo reconoce un epítope conformacional y es capaz de neutralizar la actividad biológica de IL-22 y el anticuerpo o fragmento de unión a IL-22 del mismo comprende en su cadena variable pesada (Vh) y cadena variable ligera (Vl) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y 33, respectivamente.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que comprende una región constante Ch y/o Cl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos de Ch expuestas en SEQ ID NO.: 35, 43, 51 y 59 y las secuencias de aminoácidos de C<l>expuestas en SEQ ID NO.: 37, 45, 53 y 61 o una secuencia de aminoácidos con al menos 60% de identidad con el mismo.
3. Uno o más polinucleótidos que codifican para al menos las regiones variables del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1 o 2.
4. Uno o más vectores que comprenden el o los polinucleótidos de la reivindicación 3.
5. Una célula hospedera que comprende el o los polinucleótidos de la reivindicación 3 o el o los vectores de la reivindicación 4.
6. El anticuerpo o fragmento de unión a IL-22 del mismo de la reivindicación 1 o 2, el cual está marcado detectablemente o unido a un fármaco, preferiblemente en el que el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un radioisótopo, un fluoróforo y un metal pesado.
7. Una composición o kit que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a IL-22 del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 6, el o los polinucleótidos de la reivindicación 3, el o los vectores de la reivindicación 4 o la célula de la reivindicación 5.
8. La composición de la reivindicación 7, que es
(a) una composición farmacéutica y comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, que comprende además preferiblemente un agente adicional útil para tratar una inflamación o un trastorno autoinmune, seleccionado del grupo que consiste en fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDs), Corticosteroides, Antihistamínicos y combinaciones de los mismos, o
(b) una composición de diagnóstico y comprende además reactivos para uso en métodos de diagnóstico basados en inmuno o ácidos nucleicos.
9. El anticuerpo o fragmento de unión a IL-22 de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 6 para uso en el tratamiento o prevención de la progresión de una inflamación o un trastorno autoinmune; para la mejora de síntomas asociados con una inflamación o un trastorno autoinmune; para diagnosticar o cribar a un sujeto para la presencia o para determinar el riesgo de un sujeto para desarrollar una inflamación o un trastorno autoinmune, preferiblemente en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno son administrados por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, parenteral o como un aerosol.
10. El anticuerpo o fragmento de unión a IL-22 para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho trastorno se selecciona del grupo que consiste en Acné vulgar; Artritis como Artritis gotosa, Lupus eritematoso sistémico (SLE), Osteoartritis, Artritis psoriásica, Artritis reumatoide; Asma; Enfermedad celíaca; Prostatitis crónica; Dermatitis; Diabetes mellitus tipo 1; Glomerulonefritis; Hipersensibilidades; Miocarditis; Esclerosis múltiple; Enfermedades inflamatorias del intestino; Enfermedad inflamatoria pélvica; Polimiositis; Soriasis; Sarcoidosis; Vasculitis; Cistitis intersticial o la inflamación que ocurre debido a una lesión por reperfusión o rechazo de un trasplante.
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